ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ. Διπλωματική Εργασία

ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ Διπλωματική Εργασία «Φαρμακολογικές επιδράσεις επί των in vitro Οξέων Κυμάτων σε λεπτές τομές ιπποκάμπου επίμυος» Γιαννόπουλος Παναγιώτης Α.Μ. 1116 Πάτρα, Νοέμβρης 2009 1

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1.0.0 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 2.0.0 ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΣ 2.1.0 Γενικά 2.2.0 Μακροσκοπική και μικροσκοπική ανατομία του Ιπποκάμπου 2.3.0 Δομή και συνδέσεις του Ιπποκάμπου 2.3.1 Γενικά 2.3.2 Διατιτραίνουσα πορεία 2.3.3 Μονοπάτι Βρυωδών Ινών 2.3.4 Παράπλευρο συνδετικό/συνδεσμικό μονοπάτι Schaffer 2.3.5 CA1-Υπόθεμα-Ενδορινικός φλοιός 2.4.0 Νευροδιαβιβαστές του Ιπποκάμπου 2.5.0 Ρυθμοί του Ιπποκάμπου 2.6.0 Αυθόρμητα κύματα - Ρόλος 2.7.0 μ-υποδοχεασ ΟΠΙΟΕΙΔΩΝ 2.7.1 ΓΕΝΙΚΑ 2.7.2 Ο υποδοχέας των οπιοειδών τύπου «μ» 2.8.0 Μοριακοί Μηχανισμοί Δράσης του μ-υποδοχέα 2.8.1 Δράση επάνω στην αγωγιμότητα του καλίου 2.8.2 Δράση επάνω στην αδενυλική κυκλάση 2.8.3 Δράση επάνω στην απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών 2.8.4 Δράση επάνω στη φωσφολιπάση C και τα ρεύματα ασβεστίου 2.8.5 Πυρηνική σηματοδότηση 2.9.0 Κύκλος Ζωής του μ-υποδοχέα των Οπιοειδών 3.0.0 ΟΠΙΟΕΙΔΗ 3.1.0 ΓΕΝΙΚΑ 3.2.0 Μορφίνη 3.3.0 Fentanyl 4.0.0 ΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΟΠΙΟΕΙΔΩΝ ΜΟΡΦΙΝΗΣ ΣΕ ΕΓΚΕΦΑΛΙΚΕΣ ΤΑΛΑΝΤΩΣΕΙΣ IN VIVO ΚΑΙ ΣΕ SLICES 2

5.0.0 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 5.1.0 Μέθοδοι και υλικά 5.1.2 Γενικά στοιχεία των in vitro τομών εγκεφάλου 5.1.3 Παρασκευή Τομών Ιπποκάμπου 5.1.4 Διαλύματα και Φάρμακα 5.1.5 Καταγραφή και Ανάλυση Ηλεκτρικής Δραστηριότητας 5.2.0 Αποτελέσματα 5.2.1 Απεικόνιση της ηλεκτρικής δραστηριότητας και χρήση σχεδίων και γραφημάτων 6.0.0 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 7.0.0 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 3

1.0.0 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η παρούσα εργασία έχει ως σκοπό τη μελέτη της επίδρασης των αγωνιστών των υποδοχέων των οπιοειδών τύπου «μ» στη δραστηριότητα των in vitro οξύαιχμων κυμάτων (Sharp Waves) και των κυματισμών (Ripples) της εγκεφαλικής δομής του ιπποκάμπου. Οι τροποποιητές της από τους μ υποδοχείς των οπιοειδών εξαρτώμενης συναπτικής διαβίβασης που μελετήθηκαν είναι η Μορφίνη και η Fentanyl με το ρόλο που προσδίδουν, όπως θα αναλυθεί παρακάτω, στον υποδοχέα τους. Σύμφωνα με τις μελέτες του εργαστηρίου μας και άλλων, τα in vitro οξύαιχμα κύματα είναι ένα πρότυπο συγχρονισμένης ρυθμικής δραστηριότητας που δημιουργείται αυθόρμητα στον ιππόκαμπο χωρίς να έχει μεσολαβήσει επαγωγή μέσω φαρμάκου ή ηλεκτρικού ερεθισμού (Παπαθεοδωρόπουλος και Κωστόπουλος, 2002, Wu και συν., 2005, Maier και συν., 2003, Kubota και συν., 2003). Εικόνα 1 Η εικόνα 1 αποτελεί καταγραφή από ερεθισμό. Στην παρούσα εργασία οι καταγραφές είναι από ένα πρότυπο συγχρονισμένης ρυθμικής δραστηριότητας που δημιουργείται αυθόρμητα, δηλαδή χωρίς ερεθισμό (Stimulation). Χαρακτηριστική 4

είναι η εικόνα του κυκλώματος που διατηρείται μετά την κοπή των τομών του ιπποκάμπου. Στη συνέχεια μέσω του ενισχυτή καταγράφουμε την ανάλογη κυματομορφή. Παρατηρούμε επίσης τη στιβάδα των πυραμιδικών κυττάρων και την περιοχή CA1 όπου γίνονται κυρίως οι καταγραφές μας. Η in vitro αυτή ρυθμική δραστηριότητα έχει κοινά χαρακτηριστικά με τα in vivo οξύαιχμα κύματα που έχουν παρατηρηθεί κατά το στάδιο του βαθέως ύπνου στον ιππόκαμπο, καθώς και τα δύο εμφανίζουν συχνότητα (2-8 Hz), έντονο συγχρονισμό, ενώ επάνω στο βραδύ δυναμικό του πεδίου τους εμφανίζουν υψίσυχνη ταλάντωση συχνότητας 100-200 Hz (Ripples). Η δραστηριότητα των αυθόρμητων κυμάτων παρατηρείται μόνο σε τομές του κοιλιακού ιπποκάμπου (Ventral) και όχι του ραχιαίου ιππόκαμπου (Dorsal), οι οποίες διατηρήθηκαν σε κανονικές in vitro συνθήκες ηλεκτροφυσιολογικού πειράματος. Για την κατανόηση του μηχανισμού της επίδρασης των φαρμάκων στους διάφορους εγκεφαλικούς ρυθμούς, πολύ σημαντική είναι η συνεισφορά των in vitro πειραματικών προτύπων ρυθμικών πληθυσμιακών δραστηριοτήτων. Οι φέτες ιπποκάμπου (Slices) διευκολύνουν μιας υψηλής ευκρίνειας ηλεκτροφυσιολογία υπό τον όρο ότι το δίκτυο απεικονίζει in vitro την in vivo κατάσταση ρεαλιστικά (όσο το δυνατόν καλύτερα). Η Μορφίνη και η Fentanyl είναι 2 από τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα παυσίπονα παγκοσμίως, γεγονός που τα καθιστά αυτόματα «τροφή» έρευνας. Επιπρόσθετα, τα οποιοειδή αυτά έχουν αμνησιακή δράση και σε συνδιασμό με την τεκμηριωμένη πλέον σήμερα εμπλοκή των Οξύαιχμων κυμάτωνκυματισμών στις μνημονικές διαδικασίες είναι πολύ ενδιαφέρον να εξετασθεί η δράση τους στην εν λόγω δικτυακή δραστηριότητα του ιπποκάμπου. 5

2.0.0 ΙΠΠΟΚΑΜΠΟΣ 2.1.0 Γενικά Ο ιππόκαμπος είναι μια από τις πιο καλά μελετημένες δομές του εγκεφάλου. Οι κύριοι λόγοι για τους οποίους συμβαίνει αυτό είναι 3: Ι. Πρώτος λόγος είναι το γεγονός ότι αποτελεί μια δομή ξεχωριστή και αναγνωρίσιμη τόσο σε ανατομικό, όσο και σε ιστολογικό επίπεδο. Το ασυνήθιστο σχήμα του τον κάνει να μοιάζει με το θαλάσσιο ιππόκαμπο, από όπου και το όνομά του (στα αγγλικά Hippocampus). Λέγεται επίσης και κέρας του Άμμωνος (Ammon s horn), λόγω της ομοιότητάς του με τον αιγυπτιακό θεό Άμμωνα που έχει το κεφάλι ενός κριού. Η ιστολογία του ιπποκάμπου όμως είναι αυτή που τον κάνει τόσο ελκυστικό στους νευροεπιστήμονες. ΙΙ. Ο δεύτερος λόγος για τον οποίο ο ιππόκαμπος παρουσιάζει ενδιαφέρον είναι ότι νωρίς από τη δεκαετία του 1950 μέχρι και σήμερα έχει φανεί πως ο ρόλος του σε ανώτερες εγκεφαλικές διεργασίες, όπως αυτές της μνήμης και της μάθησης, είναι καθοριστικός. Νευροφυσιολογικές έρευνες παρατηρούν ότι ο ιππόκαμπος είναι απολύτως απαραίτητος για τη λειτουργία της βραχυπρόθεσμης λειτουργικής μνήμης και για την εδραίωση μακροχρόνιων μνημών στο φλοιό. Κοινό με τα παραπάνω αποτελεί η νόσος του Alzheimer στην οποία υπάρχουν βλάβες στον ιππόκαμπο νωρίτερα από άλλα μέρη του φλοιού (μετωπιαίοι λοβοί). Έτσι, η μνήμη είναι συνήθως η πρώτη λειτουργία η οποία διαταράσσεται στη νόσο. ΙΙΙ. Ο τρίτος λόγος για τη σημαντικότητα του ιπποκάμπου είναι ότι περιλαμβάνεται σε σοβαρές διανοητικές ασθένειες. Βλάβες του κοιλιακού ιπποκάμπου σε πειραματόζωα ( το ανάλογο του προσθίου τ μήματος του ιπποκάμπου στον άνθρωπο) προκαλούν συμπεριφορικές αλλαγές ανάλογες των συμπτωμάτων της σχιζοφρένειας (Daenen και συν., 2003), ενώ άλλες εργασίες αναφέρουν πως ο όγκος του πρόσθιου ιπποκάμπου σε ασθενείς με σχιζοφρένεια είναι συχνά ελαττωμένος (Pegues και συν., 2003). Ακόμα, φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε παθολογικές καταστάσεις που σχετίζονται με εγκεφαλική ισχαιμία και ανοξία καθώς και στην επιληπτογένεση, όπου παρουσιάζει τον χαμηλότερο επιληπτικό ουδό από οποιαδήποτε άλλη εγκεφαλική περιοχή. 6

Τέλος ενδεικτικό του ενδιαφέροντος της επιστημονικής κοινότητας και όχι μόνο είναι οι μελέτες του πανεπιστημιακού κολλεγίου του Λονδίνου (Maguire και συν., 2000) που έδειξε πως μέρος του ιπποκάμπου των οδηγών ταξί είναι μεγαλύτερο από ότι στο ευρύ κοινό και του πανεπιστήμιου της Ιντιάνας που σε μελέτη επίμυων πρότεινε ότι τα αρσενικά βρίσκουν καλύτερα τα ίχνη τους επειδή έχουν μεγαλύτερο ιππόκαμπο από τα θηλυκά. 2.2.0 Μακροσκοπική και μικροσκοπική ανατομία του Ιπποκάμπου Ο ιππόκαμπος ή ιπποκάμπειος σχηματισμός του επίμυος αποτελεί μια επιμήκη δομή σχήματος C συμμετρική ως προς την μέση γραμμή του εγκεφάλου, που εκτείνεται προσθιοραχιαία από το διαφραγματικό πυρήνα του πρόσθιου εγκεφάλου περνώντας πάνω και πίσω από το διεγκέφαλο μέχρι την αρχή του κροταφικού λοβού οπισθιοκοιλιακά. Το τμήμα του ιπποκάμπου πλησιέστερα προς τους πυρήνες του διαφράγματος αποτελεί τον διαφραγματικό (ραχιαίο) ιππόκαμπο στον αρουραίο και αντιστοιχεί στον οπίσθιο του ανθρώπου, ενώ το τμήμα προς τον κροταφικό (κοιλιακό) ιππόκαμπο αντιστοιχεί στον πρόσθιο του ανθρώπου (Εικόνα 2). A. B. Εγκέφαλος αρουραίου και δομή του ιπποκάμπου 7

Γ. Ανθρώπινος εγκέφαλος και χαρακτηριστικές δομές του Εικόνα 2 Στην εικόνα 2 παρατηρούμε στα Α, Β εγκέφαλο αρουραίου και τη δομή του ιπποκάμπου, ενώ στο Γ εγκέφαλο ανθρώπου και χαρακτηριστικές δομές του. Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός συγκροτείται από 6 διακριτές περιοχές που περιλαμβάνουν την οδοντωτή έλικα (Dentate Gyrus), τον ιππόκαμπο (Hippocampus) ο οποίος υποδιαιρείται σε 3 κύρια πεδία (CA1, CA2, CA3), το υπόθεμα (Subiculum), το προϋπόθεμα (Presubiculum), το παραϋπόθεμα (Parasubiculum) και τον ενδορινικό φλοιό (Entorhinal Cortex) που έχει δύο ή περισσότερες υποδιαιρέσεις. Το υπόθεμα, το προϋπόθεμα και το παραϋπόθεμα αναφέρονται συνήθως μαζί και ως υποθεματικό σύμπλοκο (Amaral και Witter, 1989). Η περιοχή C4 θεωρείται περιοχή της οδοντωτής έλικας που καλείται Hilus (Εικόνα 3). Εικόνα 3 8

Εμβρυολογικά, ο ιππόκαμπος είναι αρχικά τοποθετημένος ραχιαία του θαλάμου. Μεταναστεύει για να κατοικήσει δίπλα στον κροταφικό λοβό αφήνοντας την ψαλίδα του εγκεφάλου στην προγραμματισμένη πορεία του. Η οδοντωτή έλικα, ο ιππόκαμπος και το υπόθεμα αποτελούνται το κάθε ένα από τρία ευδιάκριτα στρώματα. Ο ιππόκαμπος και το υπόθεμα έχουν από ένα πυραμιδικό στρώμα, ένα μοριώδες στρώμα και ένα πολύμορφο στρώμα κυττάρων. Το πυραμιδικό στρώμα περιέχει τα κυτταρικά σώματα των πυραμιδικών κυττάρων. Το μοριώδες στρώμα αποτελείται από τους ακραίους δενδρίτες των πυραμιδικών κυττάρων μαζί με τους δενδρίτες που προέρχονται από πολλές διάφορες άλλες πηγές. Το πολύμορφο στρώμα περιέχει διάφορους διάμεσους νευρώνες συμπεριλαμβανομένων και των καλαθοειδών κυττάρων (Basket cells). Η οδοντωτή έλικα έχει μια κοκκιώδη στιβάδα κυττάρων, μια μοριώδη στιβάδα που αποτελείται από τους ακραίους δενδρίτες των κοκκιωδών κυττάρων και ένα πολύμορφο στρώμα. Τα πυραμιδικά κύτταρα είναι απαγωγοί νευρώνες και τα κοκκιώδη κύτταρα είναι διάμεσοι νευρώνες. Τα καλαθοειδή κύτταρα είναι ανασταλτικοί διάμεσοι νευρώνες των πυραμιδικών κυττάρων. Το υπόθεμα και ο ιππόκαμπος αποτελούνται κυρίως από τα πυραμιδικά κύτταρα, τα οποία είναι απαγωγοί νευρώνες που προβάλλουν σε διάφορες δομές (η εικόνα 4 δείχνει πυραμιδικά κύτταρα στη CA1 περιοχή του ιπποκάμπου). Εικόνα 4 : Πυραμιδικά στη CA1 περιοχή του ιπποκάμπου 9

Η οδοντωτή έλικα στέλνει τις προβολές της μόνο στον ιππόκαμπο. Το υπόθεμα στέλνει τις προβολές του στους διαφραγματικούς πυρήνες, τους πυρήνες του θαλάμου και τους απαγωγούς πυρήνες. Η μόνη τελική προβολή από τη CA3 είναι στο στρώμα πυρήνα των τελικών ραβδώσεων (Lateral Septal Nucleus). Ο ιπποκάμπειος σχηματισμός λαμβάνει προβολές από διάφορες δομές. Οι πληροφορίες από την τοξοειδή έλικα και άλλα μέρη του μεταιχμιακού συστήματος ταξιδεύουν μέσω του ενδορινικού φλοιού στη διατιτραίνουσα πορεία προς στην οδοντωτή έλικα. Επιπλέον, ο ιπποκάμπειος σχηματισμός λαμβάνει χολινεργικές προσαγωγές ίνες από τους πυρήνες του διαφράγματος και από τον αντίπλευρο ιπποκάμπειο σχηματισμό. Τα πυραμιδικά κύτταρα συγκεντρώνονται στη δέσμη ινών, που αναφέρεται ως ψαλίδα του εγκεφάλου (Fornix). Έτσι, ο ιπποκάμπειος σχηματισμός υπάρχει ως περιοχή για την ολοκλήρωση πολλών πληροφοριών. Ο αριθμός των κοκκιωδών κυττάρων της οδοντωτής έλικας στον αρουραίο είναι 600-1000Χ10 3, ενώ στον άνθρωπο είναι 9000Χ10 3. Στη CA3 τα πυραμιδικά κύτταρα στον αρουραίο είναι 160Χ10 3 και στον άνθρωπο 2300Χ10 3 και στην CA1 περιοχή τα πυραμιδικά κύτταρα του αρουραίου είναι 250Χ10 3, ενώ στον άνθρωπο είναι 4600Χ10 3. 1 2 3 4 Εικόνα 5 : Στοιχεία νευρώνων του ιπποκάμπειου σχηματισμού και χαρακτηριστικές περιοχές του. Στην εικόνα 5 περιλαμβάνονται στοιχεία νευρώνων του ιπποκάμπειου σχηματισμού καθώς και χαρακτηριστικές περιοχές του. 10

Αναλυτικότερα, περιλαμβάνονται το υπόθεμα, μέρος του ενδορινικού φλοιού, η οδοντωτή έλικα και οι περιοχές CA1-CA4. Ο κυρίως ιππόκαμπος είναι διαιρεμένος μέσα σε οριοθετημένη περιοχή (1) πυραμιδικό στρώμα (stratum pyramidale) (2) ακτινωτή στιβάδα (stratum radiatum) (3) μοριώδης-βοθριώδης στιβάδα (stratum lacunosum-moleculare). Τα γιγάντια πυραμιδικά κύτταρα στην περιοχή CA3 στέλνουν νευράξονες στα πυραμιδικά κύτταρα της CA1 διαμέσου της παράπλευρης δεσμίδας του Schaffer (Schaffer collaterals), σε άλλα CA3 πυραμιδικά κύτταρα στον αντίπλευρο ιπποκάμπειο σχηματισμό. Κοκκιώδη κύτταρα στην οδοντωτή έλικα στέλνουν βρυώδεις ίνες στα CA3 πυραμιδικά κύτταρα. Η είσοδος της διατιτραίνουσας πορείας φαίνεται σε όλες τις περιοχές του ιπποκάμπου και της οδοντωτής έλικας. 2.3.0 Δομή και συνδέσεις του Ιπποκάμπου 2.3.1 Γενικά Η ροή πληροφοριών μέσω του ιπποκάμπου προχωρά από την οδοντωτή έλικα στη CA3, στη CA1 και στο υπόθεμα, με τις πρόσθετες πληροφορίες εισαγωγής σε κάθε στάδιο και τα παραγόμενα αποτελέσματα σε κάθε ένα από τα δύο τελικά στάδια. Η CA2 περιοχή αντιπροσωπεύει πολύ μικρό τμήμα του ιπποκάμπου και η παρουσία της αγνοείται στους απολογισμούς της ιπποκάμπειας λειτουργίας, αν και είναι αξιοσημείωτο ότι αυτή η μικρή περιοχή φαίνεται να είναι ανθεκτική στις συνθήκες που προκαλούν κυτταρική βλάβη (επιληπτογένεση). Η διατιτραίνουσα πορεία, η οποία μεταφέρει πληροφορίες από τον ενδορινικό φλοιό και τον περιρρινικό φλοιό θεωρείται γενικά η κύρια πηγή εισαγωγής πληροφορίας στον ιππόκαμπο. Η στιβάδα ΙΙ του ενδορινικού φλοιού φέρνει προσαγωγές ίνες στην οδοντωτή έλικα και στην περιοχή CA3, ενώ η στιβάδα III του ενδορινικού φλοιού στην περιοχή CA1 και στο υπόθεμα. Τα κύρια μονοπάτια εξόδου του ιπποκάμπου είναι η διατιτραίνουσα πορεία, η τοξοειδής δέσμη και η ψαλίδα του εγκεφάλου, που όλες διέρχονται από την περιοχή CA1 και το υπόθεμα. Η είσοδος της διατιτραίνουσας πορείας από τη στιβάδα ΙΙ του ενδορινικού φλοιού φέρεται στην οδοντωτή έλικα και συνεχίζει στην περιοχή CA3 (και στα βρυώδη κύτταρα, που είναι τοποθετημένα στην πύλη της οδοντωτής έλικας, τα οποία στέλνουν έπειτα τις πληροφορίες στις απόμακρες περιοχές της οδοντωτής έλικας 11

όπου ο κύκλος επαναλαμβάνεται). Η περιοχή CA3 στέλνει τις συνδέσεις της στην περιοχή CA1 μέσω ενός συνόλου ινών που αποκαλούνται παράπλευρες ίνες του Schaffer. Εκτός από την περιοχή CA3, η περιοχή CA1 λαμβάνει προσαγωγές ίνες καθώς επίσης και από το στρώμα ΙΙΙ του ενδορινικού φλοιού και έπειτα προωθεί την πληροφορία στο υπόθεμα καθώς επίσης και στις προαναφερθείσες πορείες εξόδου του ιπποκάμπου. Το υπόθεμα είναι το τελικό στάδιο στο μονοπάτι συνδυάζοντας τις πληροφορίες από τη CA1 και από τη στιβάδα ΙΙΙ του ενδορινικού φλοιού. Είναι γενικά αποδεκτό ότι κάθε μια από αυτές τις περιοχές έχει μοναδικό λειτουργικό ρόλο στην επεξεργασία πληροφοριών του ιπποκάμπου αλλά μέχρι σήμερα η συμβολή κάθε περιοχής είναι ανεπαρκώς κατανοητή (Εικόνα 6). Εικόνα 6. Το ιπποκάμπειο ενδογενές τρισυναπτικό κύκλωμα Ο ιππόκαμπος σχηματίζει κυρίως ένα μονοκατευθυνόμενο κύκλωμα με εισαγωγή από τον ενδορινικό φλοιό που διαμορφώνει συνδέσεις με την οδοντωτή έλικα και τους πυραμιδικούς νευρώνες της CA3 διαμέσου της διατιτραίνουσας πορείας (διαχεόμενο πλευρικά και ενδιάμεσα). Οι νευρώνες της CA3 επίσης λαμβάνουν προσαγωγές ίνες από την οδοντωτή έλικα διαμέσου των βρυωδών ινών. Στέλνουν νευράξονες στα CA1 πυραμιδικά κύτταρα διαμέσου των παράπλευρων του Schaffer, όπως επίσης στα CA1 κύτταρα στον αντίπλευρο ιπποκάμπειο σχηματισμό. Οι νευρώνες της CA1 λαμβάνουν επίσης εισαγωγές κατευθείαν από το διατιτραίνον μονοπάτι και στέλνουν νευράξονες στο υπόθεμα. Αυτοί οι νευρώνες με τη σειρά τους 12

στέλνουν την κυρίως ιπποκάμπεια έξοδο πίσω στον ενδορινικό φλοιό, σχηματίζοντας ένα βρόχο. Αναλυτικότερα η κάθε πορεία έχει τα εξής χαρακτηριστικά : 2.3.2 Διατιτραίνουσα πορεία Η διατιτραίνουσα πορεία είναι η κύρια είσοδος του ιπποκάμπου. Οι νευράξονες της διατιτραίνουσας πορείας απορρέουν κυρίως από τα στρώματα ΙΙ και ΙΙΙ του ενδορινικού φλοιού (Εικόνα 6) με συνεισφορά και από τα βαθύτερα στρώματα ΙV και V. Νευράξονες από τα στρώματα ΙΙ/ΙV προβάλλουν στα κοκκιώδη κύτταρα της οδοντωτής έλικας και στα πυραμιδικά κύτταρα της CA3 περιοχής, ενώ παράλληλα νεαυράξονες από τα στρώματα ΙΙΙ/V προβάλλουν στα πυραμιδικά κύτταρα της CA1 περιοχής και στο υπόθεμα. Η διατιτραίνουσα πορεία μπορεί να διαχωριστεί σε έξω (πλευρικό) και ένδο (ενδιάμεσο) μονοπάτι, (LPP και MPP, αντιστοίχως), ανάλογα την περιοχή από την οποία πηγάζουν οι ίνες, την πλευρική ή την ενδιάμεση περιοχή του ενδορινικού φλοιού (LEC και MEC αντιστοίχως). Εικόνα 7 : Περιοχές του ενδορινικού φλοιού 2.3.3 Μονοπάτι Βρυωδών Ινών Οι βρυώδης ίνες είναι οι νευράξονες των κοκκιωδών κυττάρων της οδοντωτής έλικας. Επεκτείνονται από την οδοντωτή έλικα ως τα πυραμιδικά κύτταρα της CA3 περιοχής σχηματίζοντας την κύρια είσοδό της. Οι συνάψεις των βρυωδών ινών και των νευρώνων της CA3 είναι μεγάλες συναθροίσεις απολήξεων. Μεγάλος αριθμός κοκκιωδών κυττάρων μπορούν να κάνουν σύναψη σε ένα μοναδικό πυραμιδικό κύτταρο της CA3. Αυτό το μονοπάτι είναι εκτενώς μελετημένο σαν ένα μοντέλο για 13

τους λειτουργικούς ρόλους των υποδοχέων καϊνικού οξέος (Kainate) στη συναπτική πλαστικότητα. 2.3.4 Παράπλευρο συνδετικό/συνδεσμικό μονοπάτι Schaffer Αυτό το μονοπάτι προέρχεται από νευράξονες που προβάλλουν από τη CA3 περιοχή του ιπποκάμπου στη CA1 περιοχή. Κάθε νευράξονας προέρχεται από νευρώνες της CA3 στον ομόπλευρο ιππόκαμπο (Ipsilateral) ή σχηματίζει μια ισοδύναμη δομή στο αντίπλευρο ημισφαίριο (Contralateral). Αυτές οι ίνες ορίζονται ως συναθροισμένες ίνες, καθώς διασταυρώνονται από το ένα ημισφαίριο του εγκεφάλου στο άλλο. 2.3.5 CA1-Υπόθεμα-Ενδορινικός φλοιός Το μονοπάτι από τη CA1 περιοχή στο υπόθεμα και στον ενδορινικό φλοιό διαμορφώνει την κυρίως είσοδο από τον ιππόκαμπο. Παρόλα αυτά δεν είναι μια εντελώς μονοκατευθυνόμενη πορεία. Η σύνδεση CA1-υπόθεμα ακολουθεί ένα ακριβές ανατομικό σχέδιο. Το περιφερικό άκρο της CA1 περιοχής προβάλλει στο παρακείμενο άκρο του υποθέματος. Δηλαδή, τα κύτταρα που βρίσκονται πιο κοντά ανατομικά στη σύνδεση CA1-υπόθεμα συνάπτονται, καθώς και αυτά που βρίσκονται πιο μακριά συνάπτονται. Οι προβολές του ενδορινικού φλοιού ακολουθούν το ίδιο μοντέλο, με τα ακραία CA1/παρακείμενο υπόθεμα να προβάλλουν στον πλευρικό ενδορινικό φλοιό, ενώ τα εγγύς CA1/ακραίο υπόθεμα να λαμβάνουν εισαγωγές από τον ενδιάμεσο ενδορινικό φλοιό. Έτσι, δύο κοντινά βροχικά κυκλώματα βρίσκονται μέσα σε όλο το ιπποκάμπειο κύκλωμα. Αυτοί οι βρόχοι είναι ευρέως εξαπλωμένοι στο περιρινικό και μεταρινικό φλοιό καθώς ο περιρινικός φλοιός προβάλλει στον πλευρικό ενδορινικό φλοιό και δέχεται επαναλαμβανόμενες προβολές, ενώ ο μεταρινικός φλοιός προβάλλει και δέχεται εισόδους από τον ενδιάμεσο ενδορινικό φλοιό. 14

Εικόνα 8 2.4.0 Νευροδιαβιβαστές του Ιπποκάμπου Ένας μεγάλος αριθμός νευροδιαβιβαστών και νευροτροποποιητών έχουν μελετηθεί στον ιππόκαμπο (Πίνακας 1). Πίνακας 1 Glutamate Enkephalin Dynorphin Aspartate GABA Angiotensin Acetylcholine Norepinephrine Serotonin Adenosine Histamine Dopamine Somatostatin Cholecystokinin Vasoactive intestinal polypeptide Galanin Neuropeptide Y Corticotropin-releasing factor Substance P Πηγή: Nicoll (1988) 15

2.5.0 Ρυθμοί του Ιπποκάμπου Ο ιππόκαμπος κατέχει σημαντική θέση μεταξύ των διαφόρων δομών του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (Κ.Ν.Σ.) στην οργάνωση συγχρονισμένων ρυθμικών δραστηριοτήτων. Γενικά στον ιπποκάμπειο σχηματισμό καταγράφονται ορισμένοι τύποι συγχρονισμένων ταλαντώσεων των δυναμικών πεδίου οι οποίοι είναι γνωστοί ως εξής: A) Θήτα (θ) ρυθμός ή αργή ρυθμική δραστηριότητα (Rhythmic Slow Activity, RSA). Ο ρυθμός θήτα είναι ένα από τα πολλά χαρακτηριστικά κύματα στο ηλεκτροεγκεφαλογράφημα και εμφανίζεται ως περίπου ημιτονοειδής μορφή κανονικού εύρους, με μήκος κύματος 1,54 Α ο, πλάτος 1 mv και φάσμα συχνότητας μεταξύ 4-12 Ηz. Εικόνα 10 Συνδέεται με τις διάφορες καταστάσεις ύπνου και επαγρύπνησης (μια κατάσταση ανοικτού κυκλώματος) όπου όταν εξετάζεται με αυτόν τον τρόπο η συχνότητα είναι 4-8 Ηz και περιλαμβάνει πολλούς νευρώνες που πυροδοτούν συγχρόνως, πιθανώς στον ιππόκαμπο και τον ενδορινικό φλοιό. Παρατηρείται επίσης στις καταστάσεις της ήρεμης εστίασης, παραδείγματος χάριν στην περισυλλογή (Aftanas και Golosheykin, 2005) και εκδηλώνεται κατά τη διάρκεια βραχυπρόθεσμων εργασιών μνήμης (Vertes, 2005). Μερικοί προτείνουν ότι απεικονίζει την on line κατάσταση του ιπποκάμπου, μια ετοιμότητα για να υποβληθούν σε επεξεργασία τα εισερχόμενα σήματα (Buzsaki, 2002). Οι ρυθμοί θήτα είναι πολύ ισχυροί στους ιπποκάμπους τρωκτικών κατά τη διάρκεια της ανάκτησης μνήμης και της εκμάθησης και θεωρείται ζωτικής σημασίας στην επαγωγή της μακρυπρόθεσμης συναπτικής ενδυνάμωσης (Long Term Potentiation, LTP), ένα κυτταρικό πρότυπο της μάθησης και της μνήμης. Φαίνεται επίσης ότι χρησιμεύουν στη μάθηση του χωρικού προσανατολισμού (Buzsaki, 2005). Τεχνητά, η ηλεκτρική ή φαρμακολογική διέγερση του μέσου διαφραγματικού πυρήνα 16

και των διαγώνιων ζωνών Broca που προβάλλει στον ιππόκαμπο προκαλεί θήτα ρυθμούς (Manseau και συν., 2005). Εν κατακλείδι ο θ ρυθμός παρατηρείται στον ιππόκαμπο, τον περιβάλλοντα ενδορινικό φλοιό και το μέσο διαφραγματικό πυρήνα. Η γέννηση της ιπποκάμπειας RSA εξαρτάται από προσαγωγές συνδέσεις από τον μέσο διαφραγματικό πυρήνα και τον ενδορινικό φλοιό. Και οι δύο αυτές δομές φαίνεται να είναι σε θέση να οργανώνουν RSA, είτε μέσω των δικτυακών τους διασυνδέσεων, είτε λόγω ενδογενών κυτταρικών μηχανισμών. Ο ρυθμός θ αποτελείται από τους εξής δύο τύπους: 1. Ο τύπος Ι θ ρυθμού είναι ένας κανονικός θ ρυθμός με υψηλό βαθμό ρυθμικότητας που παρατηρείται κυρίως κατά το περπάτημα, την εξερεύνηση, την κολύμβηση, κατά τις αλλαγές στην στάση του σώματος και κατά την παρατήρηση αντικειμένων που κρατούν τα πρόσθια άκρα. Λέγεται και ρυθμός θ σχετιζόμενος με την κίνηση και στα τρωκτικά έχει συχνότητα 6,5-12 Ηz. Παρατηρείται επίσης και κατά το στάδιο REM του ύπνου. 2. Ο τύπος ΙΙ θ ρυθμού έχει συχνότητα 4-9 Ηz. Έχει παρατηρηθεί σε καταστάσεις απάντησης σε αισθητικά ερεθίσματα και κατά τη διάρκεια συναισθηματικής κινητικότητας. Τέλος έχουμε την εμφάνιση του Μεγάλου Μη Φυσιολογικού Πλάτους (Large Irregular Amplitude, LIA) που παρατηρείται κατά τη διάρκεια «αυτόματων» μηχανικών σχεδίων όπως η ακινησία και το μάσημα. Σημαντικό είναι ότι αυτή η ομάδα εκφορτίσεων απαντάται κατά τη διάρκεια των αρνητικών κορυφών των θ κυμάτων. Τα LIA μπορούν να βρεθούν και στα οξύαιχμα κύματα (Sharp Waves, βλέπε παρακάτω). Β) Γάμμα (γ) ρυθμός. Ο ρυθμός γ αποτελεί ένα σχέδιο κυμάτων του εγκεφάλου συνδεδεμένο με την αντίληψη, τη συνείδηση και καταστάσεις σαν αυτή της εξερεύνησης που οδηγούν και στην εμφάνιση του θ ρυθμού (σε μια κατάσταση ανοικτού κυκλώματος). Υπάρχει δηλαδή μια σύνδεση των δύο ρυθμών. Τα κύματα γάμμα παράγονται όταν εκφορτίζουν μάζες των νευρώνων, περίπου 40 φορές ανά sec (40 Ηz) αλλά συχνά μπορεί να είναι μεταξύ 26-70 Ηz και το πλάτος του είναι 50 mv. 17

Έρευνες έχουν δείξει ότι η γάμμα δραστηριότητα είναι συνεχώς παρούσα κατά τη διάρκεια της γρήγορης νεοφλοιικής δραστηριότητας χαμηλής τάσης (LVFA) η οποία εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας αφύπνισης και κατά τη διάρκεια του ενεργού ύπνου με τη γρήγορη κίνηση των ματιών (REM), καθώς και κατά την οπτική και ακουστική ανίχνευση χαρακτηριστικών γνωρισμάτων. Τα κύματα γάμμα συμμετέχουν επίσης στην υψηλότερη διανοητική δραστηριότητα. Εικόνα 11 Πειραματικά παράγονται από τονική εκπόλωση μεσολαβούμενη από χολινεργική (Buhl και συν., 1998) ή γλουταμινεργική (Whittington και συν., 1995) διέγερση καθώς και από ηλεκτρικό ερεθισμό όπως ένα συναπτικό τετανικό ερέθισμα in vitro (Traub και συν., 1996). Ειδικότερα, έχει καταγραφεί γ δραστηριότητα στην περιοχή CA1 του ιππόκαμπου και στην οδοντωτή έλικα όπου είναι πιο εμφανής στο hilus. Το πλάτος της μειώνεται απότομα έξω από την περιοχή της πύλης, αλλά εμφανίζει συγχρονισμό καθ όλο το μήκος του επιμήκη άξονα του ιπποκάμπου (Gray, 1994). Γ) Τα Οξύαιχμα Κύματα (Sharp Waves) είναι άλλη μία σημαντική δραστηριότητα του ιπποκάμπου. Απαντάται κατά τη διάρκεια του ύπνου βραδέων κυμάτων (Slow Wave Sleep). Επίσης λαμβάνουν χώρα κατά την ακίνητη κατάσταση της αφύπνισης, την πόση, την περιποίηση του προσώπου, τον αυτοκαθαρισμό και τη σίτηση καθώς και κατά τη μετάβαση των επίμυων από την εξερεύνηση του χώρου σε στασιμότητα (αλλά με παραμονή σε εγρήγορση). Το κύκλωμα με το οποίο δρουν είναι ένα κλειστό κύκλωμα. Έχουν την παρακάτω κυματομορφή, με διάρκεια μεταξύ 30-120 ms, συχνότητα μεταξύ 0,2-5 Ηz και πλάτος 3,5 mv (μεταξύ 1-4 mv). 18

Εικόνα 12 Η πρώτη μελέτη πάνω σε αυτό το σχέδιο του EEG έγινε από τον Jouvet (το ονόμασε EEG αιχμές) και καταγράφηκε από τον κροταφικό ιππόκαμπο γάτας σαν έναν υποφλοιώδες ηλεκτροφυσιολογικό συσχετισμό με τον βαθύ ύπνου. Η σπουδαιότητα της μελέτης των μηχανισμών των ιπποκάμπειων SPWs υπογραμίζεται από το γεγονός ότι έχουν καταγραφεί στους χιμπατζήδες και τους ανθρώπους. Δεν έχουν ποτέ παρατηρηθεί κατά τη διάρκεια των συμπεριφορών που συνδιάζονται με RSA σε ζώα (π.χ. περπάτημα, τρέξιμο). Τα αισθητικά ερεθίσματα καταστέλλουν τη συχνότητά τους σε ακίνητους αρουραίους. Η κατανόηση των φυσιολογικών χαρακτηριστικών των κανονικών SPWs είναι μια προϋπόθεση για το διαχωρισμό τους από τις σύντομες παροξυσμικές (Interictal) επιλεπτικές μορφές. Στους αρουραίους εντοπίζονται ευκολότερα στην ακτινωτή στιβάδα της CA1. Σε αυτό το βάθος το πλάτος μερικών SPWs είναι 3,5 mv. Η πολικότητα των SPWs της οριοθετημένης στιβάδας και της πυραμιδικής στιβάδας του αμμώνειου κέρατος και του πυραμιδικού και πολυμορφικού στρώματος του υποθέματος (περιοχές ΙΙ-ΙV) είναι θετική (Buzsaki, 1986). Σε κάποια ζώα θετικά SPWs έχουν καταγραφεί και στην πύλη της οδοντωτής έλικας. Τα μεγαλύτερα θετικά SPWs παρατηρήθηκαν στην πυραμιδική στιβάδα του υποθέματος. Οι μέγιστες αρνητικές τάσεις των SPWs συναντώνται στο στρώμα ΙΙΙ της ακτινωτής στιβάδας της CA1, στο διαυγές στρώμα της CA3, στο εσωτερικό τρίτο της μοριώδους στιβάδας της οδοντωτής έλικας και στη μοριώδη στιβάδα (στρώμα Ι) του υποθέματος. Η μεγαλύτερη αρνητική κορυφή παρατηρήθηκε στο διαχέων στρώμα της CA1 και η μικρότερη στην υποθεματική μοριώδη περιοχή. Τα σχεδιαγράμματα των SPWs στη CA1 και την οδοντωτή έλικα ταιριάζουν με τα σχεδιαγράμματα των προκαλούμενων δυναμικών ως απόκριση των παράπλευρων ερεθισμάτων των ινών Schaffer (Buzsaki, 1986). 19

Το πεδίο των SPWs είναι σταθερά συνδεδεμένο με σύγχρονες εκφορτίσεις ενός μεγάλου νευρωνικού πληθυσμού σε όλο τον ιππόκαμπο. Αυτές οι πληθυσμιακές «εκρήξεις» των κυττάρων που πυροδοτούν μπορούν εύκολα να μελετηθούν από ηλεκτρόδια χαμηλής αντίστασης (1-3 ΜΩ). Η απομόνωση ενός μόνο νευρώνα στην πυραμιδική στιβάδα είναι συνήθως δύσκολη επειδή πολλοί γειτονικοί νευρώνες εκφορτίζουν κατά τη διάρκεια των SPWs. Όταν απομονωθούν, οι πυραμιδικοί νευρώνες δεν πυροδοτούν απαραίτητα μαζί με κάθε μοναδικό SPW, όμως η συχνότητα της εκφόρτωσής τους είναι μεγαλύτερη κατά τη διάρκεια των SPWs παρά άλλες φορές. Ενδονευρώνες και κοκκιώδη κύτταρα αυξάνουν επίσης το βαθμό εκφόρτισής τους σε συνδιασμό με τα SPWs. Σαν κανόνας ισχύει ότι συχνά όλη η κυτταρική δραστηριότητα τερματίζεται ακολουθώντας την πληθυσμιακή έκρηξη για 100-500 ms. Το μέγεθος της καταστολής είναι ανάλογο του πλάτους των πληθυσμιακών εκρήξεων. Τα SPWs καταγράφονται ταυτοχρόνως από διαφορετικές περιοχές του ίδιου ιπποκάμπου ή και από τους δύο ιππόκαμπους (αριστερός και δεξιός) και υποδεικνύουν έναν υψηλού βαθμού συγχρονισμό κατά μήκος του επιμήκους και του εγκάρσιου άξονα του ιπποκάμπου. Μετρήσεις πλάτους από ταυτόχρονες καταγραφές ζευγών των χαρακτηριστικών των SPWs από CA1-CA3, και CA1-οδοντωτής έλικας δείχνουν αξιοσημείωτες συσχετίσεις (Buzsaki, 1986). Τα SPW στην CA1 απεικονίζουν συγχρονισμένα διεγερτικά μετασυναπτικά δυναμικά (EPSP) των πυραμιδικών κυττάρων των παράπλευρων Schaffer και της συνδετικής εισόδου, μαζί με ανασταλτικά μετασυναπτικά δυναμικά (IPSPs) παραγόμενα από ενδονευρώνες. Οι ενδονευρώνες πιθανότατα διεγείρονται από τις παράπλευρες Schaffer και από τους νευράξονες των πυραμιδικών νευρώνων της CA1. Στο υπόθεμα το διεγερτικό δίπολο μπορεί να παράγεται από την έξοδο της μοριώδους στιβάδας της CA1. Τα SPWs της οδοντωτής έλικας προτείνεται ότι αντανακλούν συγχρονισμένες διεγέρσεις από τους εγγύς δενδρίτες των κοκκιωδών κυττάρων από συνδετικά και συνδεσμικά μονοπάτια. Τα μεγάλα αρνητικά SPWs στην CA3 μπορεί να προκύπτουν από κοινές διεγέρσεις των πυραμιδικών νευρώνων διαμέσου των επαναλαμβανόμενων παράπλευρων νευραξόνων. Εναλλακτικά, μπορούν να απεικονίζουν συγχρονισμένες διεγέρσεις της CA3, κύτταρα από τις βρυώδης ίνες. 20

H ενεργοποίηση (30-120 ms) των πυραμιδικών κυττάρων της CA3 περιοχής διαδίδεται στη CA1 (Buzsaki, 1986), καθώς επίσης και στην οδοντωτή έλικα (Penttonen και συν., 1997). Βάση όλων των παραπάνω γίνεται η υπόθεση ότι τα SPWs εισάγονται εντός του ιπποκάμπου όταν η εξωτερική προσαγωγός δραστηριότητα προς τον ιππόκαμπο είναι αδύναμη ή μπλοκαρισμένη. Δ) Ο Κυματισμός (Ripples) είναι μια αυθόρμητη δραστηριότητα που μπορεί να εκλύεται από τα ίδια τα οξύαιχμα κύματα. Για τη μεταξύ τους σχέση έχουν γίνει εκτενείς μελέτες όμως το έρωτημα της αλληλοεξάρτησης Sharp waves-ripples παραμένει αναπάντητο. Σύμφωνα με τους O Keefe, Nadel (1978) και Buzsaki (1992) «Ripples» καλούνται οι γρήγορες ταλαντώσεις δικτύων στον ιππόκαμπο που κυμαίνονται από 150-250 Hz. Ο όρος ταλάντωση δικτύων υπονοεί δύο βασικά χαρακτηριστικά γνωρίσματα: 1) η συμπεριφορά διάφορων νευρώνων συνδέεται και 2) η δραστηριότητα είναι κυκλική. Οι Ripples έχουν ένα ιδιαίτερο σχέδιο αυθόρμητης δραστηριότητας στην ιπποκάμπια CA1 περιοχή με συναπτικές εκρήξεις 5-15 ημιτονοειδών κυμάτων στην πυραμιδική στιβάδα σε κύκλους χρονικής διάρκειας περίπου 5 msec (100-200 Hz). 0.04 0.02 2752.578 2752.641 10 Filtered mv 0.00-0.02-0.04 0.25 0.20 0.15 2 Field mv 0.10 0.05-0 -0.05 2752.45 2752.50 2752.55 2752.60 2752.65 2752.70 2752.75 2752.80 s Εικόνα 13 21

Στην εικόνα 13 παρατηρούμε τα Ripples (επάνω διάγραμμα) που δημιουργούνται ταυτόχρονα με τα Sharp Waves (κάτω διάγραμμα). Οι Ripples έχουν επίσης πολύ μικρό πλάτος, λιγότερο από 500 μv και συνήθως επισυμβαίνουν μαζί με τα Sharp Waves. Απαντώνται κατά τη διάρκεια του ύπνου βραδέων κυμάτων (Slow Wave Sleep) και πιστεύεται ότι αντιπροσωπεύουν τις αποθηκευμένες πληροφορίες που μεταφέρονται στο νεοφλοιό κατά τη διάρκεια της σταθεροποίησης της μνήμης. Το κύκλωμα με το οποίο δρουν είναι ένα κλειστό κύκλωμα (Buszaki και συν., 1983, Suzuki και Smith, 1987). Γεννώνται στην CA3 πυραμιδική στιβάδα και μέσω του θετικού διεγερτικού κυκλώματος των νευρώνων της περιοχής αναπτύσσουν αυθόρμητες σύγχρονες εκρήξεις δυναμικών ενέργειας και εν συνεχεία διαδίδονται στη CA1 (Draguhn και συν., 2000). Η συγκέντρωση των Ripples στην πυραμιδική στιβάδα περιορίζει τα ενδεχομένως περιληφθέντα στοιχεία κυκλώματος στην περισωματική αναστολή των CA1 πυραμιδικών κυττάρων ή τη συναπτική διέγερση των βασικών δενδριτών, οι οποίοι μπορούν να εμφανιστούν μέσω των παράπλευρων Schaffer και των συμφυόμενων ινών (Amaral και Witter, 1989). Ένας ρόλος για τις διεγερτικές εισόδους έχει αποκλειστεί από Ylinen και συν.(1995), ο οποίος βρήκε διαφορετικές τρέχουσες πηγές πυκνοτήτων για τα Ripples ενάντια της δράσης των παράπλευρων ή συμφυόμενων μονοπατιών Schaffer. Κατά συνέπεια, οι Ripples φαίνονται να περιλαμβάνουν κυρίως τη συναπτική αναστολή, αν και μπορούν να προκληθούν από τα οξύαιχμα κύματα (Buszaki και συν., 1992, Traub και Bibbig, 2000) που γεννώνται από την ενισχυτική είσοδο της ομόπλευρης ή της αντίπλευρης (ipsi-contralateral) CA3 περιοχής. Οι Ripples δεν περιορίζονται στη CA1 περιοχή. Όπως αναφέραμε παραπάνω, προκύπτουν από τα οξύαιχμα κύματα που δημιουργούνται στη CA3. Προς το ιπποκάμπειο μονοπάτι εξόδου, τα οξύαιχμα κύματα συνδεόμενα με τα Ripples ταξιδεύουν μέσου της CA1 και του υποθέματος μέσα στα βαθιά στρώματα (ΙΙ,ΙV) του ενδορινικού φλοιού όπου αποσπούν ένα SPW με το συνακόλουθο Ripple που καθυστερεί 5-30 msec σε σχέση με τη CA1 (Chrobak, 1994, Buszaki,1996). Παράλληλα, τα SPWs διεγείρουν τα κοκκιώδη κύτταρα της οδοντωτής έλικας, πιθανώς μέσω των διεγερτικών ενδονευρώνων στην πύλη των βρυωδών κυττάρων (Pentonen και συν., 1997). Έτσι, οι Ripples εμφανίζονται και στην οδοντωτή έλικα (Chrobak,Buszaki 1996, Ylinen και συν.1995). Τα SPWs με τα τοποθετημένα «επάνω» τους Ripples εμφάνιζονται επίσης συχνά αμφοτερόπλευρα ταυτόχρονα, όμως δεν έχει βρεθεί ακριβής συνοχή κύκλου με κύκλο μεταξύ των δύο ημισφαιρίων 22

(Buszaki και συν.1992, Chrobak,Buszaki 1996). Έτσι, αρχίζουν από τη CA3 και έπειτα ταξιδεύουν σε διπλή κατεύθυνση μέσα στην οδοντωτή έλικα, καθώς επίσης και μέσω του μονοπατιού εξόδου του ιπποκάμπου CA1-υπόθεμα-ενδορρινικός φλοιός. Τρεις πτυχές του παραπάνω σχεδίου διάδοσης είναι λειτουργικής σπουδαιότητας. 1. Τα Ripples αποτελούν ένα ισχυρό ιππόκαμπο-φλοιώδες σήμα παραγωγής στο οποίο αναμιγνύεται ένας εκτιμούμενος αριθμός κυττάρων 40.000-60.000 στον αρουραίο (Chrobak και Buszaki 1994,1996). 2. Τα παραγόμενα SPWs στη CA3 ενεργοποιούν τα κοκκιώδη κύτταρα της οδοντωτής έλικας τα οποία με τη σειρά τους προβάλλουν πίσω στην CA3 (Pentonen και συν., 1997). Αυτό μπορεί να προκαλέσει ένα θετικό σύστημα ανατροφοδότησης (Lisman, 1999). 3. Η διάδοση των συμπλόκων SPWs-Ripples είναι ένα μοναδικό σχέδιο, διαφορετικό από τη διάδοση των οδοντωτών αιχμών (Spikes) που παράγονται από τον ενδορινικό φλοιό, με σπάνια εκφόρτιση των κοκκιωδών κυττάρων και μιας CA1 διάβασης παραγωγής-εξόδου (Bragin και συν., 1995) ή από τις θ και γ ταλαντώσεις από τις οποίες τα κοκκιώδη κύτταρα της οδοντωτής έλικας λαμβάνουν ανασταλτικά δυναμικά (Buszaki και Eidelberg, 1981). Το πεδίο των Ripples εμπλέκει τη δράση ενδονευρώνων και πυραμιδικών κυτάρων, που δείχνουν μια πιο σταθερή σύζευξη φάσης και υψηλότερη πιθανότητα εκφόρτισης κατά τη διάρκειά τους. Ο Buszaki πρότεινε ότι τα Ripples γεννιούνται in vivo από μια γρήγορη συναπτική αλληλεπίδραση μεταξύ ενδονευρώνων και πυραμιδικών κυττάρων. Μελέτες από τον Draguhn και συν (1998) προτείνουν ένα διαφορετικό μηχανισμό για την παραγωγή των Ripples. Τα πειράματα στις φέτες (Slices) ιπποκάμπου του εγκεφάλου των αρουραίων αποκάλυψαν αυθόρμητη, γρήγορη ρυθμική δραστηριότητα σε όλα τα κύρια κυτταρικά στρώματα θυμίζοντας τα Ripples in vivo. Τα Slices διευκολύνουν μια υψηλή ανάλυση ηλεκτροφυσιολογίας και την εφαρμογή φαρμάκων χωρίς οποιεσδήποτε συστηματικές παρενέργειες και επομένως είναι ιδανικά για τη μελέτη του μηχανισμού σύζευξης των νευρικών δικτύων, υπό τον όρο ότι το κύκλωμα απεικονίζει in vitro την in vivo κατάσταση πραγματικά. Έχει βρεθεί ότι ότι οι ταλαντώσεις 200 Hz δεν θα μπορούσαν να εμποδιστούν από τους ανταγωνιστές των γλουταμινεργικών (διεγερτικές) ή των GABAεργικών (ανασταλτικές) συνάψεων. Ακόμα, διαπιστώνεται ότι η δραστηριότητα της 23

ταλάντωσης 150-200 Hz παρέμεινε ανεπηρέαστη απουσία εξωκυττάριων ιόντων ασβεστίου και έτσι δεν μπορεί να εξαρτάται από ένα κύκλωμα μόνο με χημικές συνάψεις. Προτείνεται (Draguhn και συν., 1998, Traub και συν., 1999) ότι οι ταλαντώσεις 200 Hz Ripples μπορεί να δημιουργούνται από ηλεκτρικά συνδεδεμένα δίκτυα των πυραμιδικών κυττάρων του ιπποκάμπου. 2.6.0 Αυθόρμητα κύματα - Ρόλος Οι δύο πόλοι του ιπποκάμπου έχει δειχθεί ότι εκτός από τις συνδέσεις (εισόδους, εξόδους ιπποκάμπειου σχηματισμού, νευρωνικά δίκτυα και άλλα χαρακτηριστικά) διαφέρουν και σε ανώτερες γνωστικές λειτουργίες όπως η μνήμη και η μάθηση. Στους επίμυες έχει δειχθεί ότι ο διαφραγματικός ιππόκαμπος παίζει σημαντικό ρόλο στις διαδικασίες της χωρικής μάθησης (Moser και Moser, 1998), ενώ ο κροταφικός στην αντίληψη της εσωτερικής κατάστασης του ζώου και τις συναισθηματικές διεργασίες όπως ο φόβος και το άγχος (Hock και Bunsey, 1998). Ενδεικτικά αναφέρουμε ότι σε κυτταρικό επίπεδο έχει δειχθεί πως η CA1 περιοχή του κροταφικού ιπποκάμπου έχει μειωμένη ικανότητα να δημιουργεί LTP σε σύγκριση με την αντίστοιχη περιοχή του διαφραγματικού (Παπαθεοδωρόπουλος και Κωστόπουλος 2000 α, 2000 β). Επίσης πρόσφατα στο εργαστήριό μας δείχθηκε ότι σε περιβάλλον ελεύθερο μαγνησίου ο κροταφικός ιππόκαμπος παρουσιάζει αυξημένη συχνότητα επιληπτοειδών εκφορτίσεων σε σχέση με το διαφραγμετικό ιππόκαμπο και ότι μόνο στον κροταφικό ιππόκαμπο παρατηρείται εμμένουσα δραστηριότητα μετά την επαναφορά των τομών σε TENY (τεχνητό εγκεφαλονωτιαίο υγρό), (Παπαθεοδωρόπουλος και συν., 2005). Οι λόγοι που κάνουν τον κροταφικό ιππόκαμπο πιο επιρρεπή είναι ακόμα άγνωστοι. Από τομές του κροταφικού ιπποκάμπου κατά την in vitro διατήρησή τους σε TENY έχει δειχθεί ότι οργανώνουν αυθόρμητα συγχρονισμένη περιοδική δραστηριότητα (2-8 Hz) (Παπαθεοδωρόπουλος και Κωστόπουλος 2002 α,β, Mayer και συν., 2003, Kubota και συν., 2003) παρόμοια με τα οξύαιχμα κύματα που παρατηρούνται in vivo και με ταυτόχρονη υψίσυχνη ταλάντωση (100-200 Hz). Ο διαφραγματικός ιππόκαμπος δεν παρουσιάζει τέτοια δραστηριότητα. Τα in vitro οξύαιχμα κύματα αναπτύσσονται σταδιακά κατά τις 3-4 ώρες της in vitro διατήρησης των τομών του κροταφικού. Η ανάπτυξη και η οργάνωσή τους εξαρτάται από τους 24

GABA A υποδοχείς, τους ΑΜΡΑ υποδοχείς του γλουταμινικού οξέος και τις ηλεκτρικές συνάψεις. Το δυναμικό πεδίο το οποίο συνιστά τα οξύαιχμα κύματα αντιστοιχεί σε συγχρονισμένα μετασυναπτικά ανασταλτικά δυναμικά (IPSPs) τα οποία δημιουργούνται μέσω του GABA A υποδοχέα και καταγράφονται στους πυραμιδικούς νευρώνες. Αυτό σημαίνει ότι για τη δημιουργία των in vitro οξύαιχμων κυμάτων είναι απαραίτητη η συγχρονισμένη ρυθμική ενεργοποίηση ενός πληθυσμού GABAεργικών ενδονευρώνων. Η ύπαρξη κοινών χαρακτηριστικών των in vivo και των in vitro οξύαιχμων κυμάτων μας δίνει τη δυνατότητα ως ένα βαθμό να θεωρούμε τα in vitro οξύαιχμα κύματα ως ανάλογο πειραματικό πρότυπο των in vivo οξύαιχμων κυμάτων. Γενικά, ισχύει μέχρι σήμερα ότι αυθόρμητη, συγχρονισμένη, ρυθμική δραστηριότητα δεν μπορεί να υπάρξει χωρίς φαρμακολογική επέμβαση ή ηλεκτρικό ερεθισμό. Συνεπώς τα αυθόρμητα κύματα αποτελούν πρότυπο συγχρονισμένης ρυθμικής δραστηριότητας η οποία δεν χρειαζεται πειραματική επαγωγή (Παπαθεοδωρόπουλος και Κωστόπουλος, 2002). 2.7.0 μ-υποδοχεασ ΟΠΙΟΕΙΔΩΝ 2.7.1 ΓΕΝΙΚΑ Για εκατοντάδες χρόνια ο άνθρωπος χρησιμοποιούσε παρασκευάσματα του φυτού papaver somniferum για την ανακούφιση του πόνου. Το 1803, ο Sertürner απομόνωσε ένα κρυσταλικό δείγμα του αλκαλοειδούς μορφίνη το οποίο αργότερα αποδείχθηκε υπεύθυνο για την αναλγητική δράση του ακατέργαστου οπίου. Οι αυστηρές δομικές και στερεοχημικές απαιτήσεις που έπρεπε να τηρούνται για την αναλγητική δράση της μορφίνης αλλά και άλλων οπιοειδών οδήγησαν στη θεωρία ότι παράγουν τα αποτελέσματά τους αλληλεπιδρώντας με συγκεκριμένο υποδοχέα (Beckett και Casey, 1954). Η ιδέα ότι πρέπει να υπάρχουν παραπάνω από ένας υποδοχέας οπιοειδών ήρθε να εξηγήσει τη διπλή δράση του συνθετικού οπιοειδούς Nalorphine (Ναλορφίνη), η οποία ανταγωνίζεται την αναλγητική δράση της Μορφίνης στον άνθρωπο, αλλά έχει επίσης αναλγητική δράση από μόνη της. Ο Martin (1967) συμπέρανε ότι η αναλγητική δράση της Nalorphine επάγεται από έναν υποδοχέα ο οποίος αργότερα θα ονομαστεί κ-υποδοχέας των οπιοειδών που είναι διαφορετικός από τον υποδοχέα της Μορφίνης. Οι πρώτες ενδείξεις για την ύπαρξη περισσότερων υποδοχέων 25

οπιοειδών προήλθαν από τα διαφορετικά προφίλ φαρμακολογικής δράσης των οπιοειδών Μορφίνη, Ketazocine και Ν-αλλιλνοεταζοκίνη. Η ύπαρξη του υποδοχέα των οπιοειδών τύπου «δ» προτάθηκε τελικά προκειμένου να εξηγήσει την in vitro δραστηριότητα των εγκεφαλίνων. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων 20 ετών έρευνας επάνω στα οπιοειδή, έχουν καθοριστεί με ακρίβεια 3 «κλασικοί» τύποι υποδοχέων: οι μ (ονομάστηκαν έτσι λόγω της εκλεκτικής τους πρόσδεσης με τη μορφίνη), κ (ονομάστηκαν έτσι λόγω της εκλεκτικής τους πρόσδεσης με την Ketocyclazocine) και δ (ονομάστηκαν έτσι λόγω του ότι αναγνωρίστηκαν σε ιστό vas deferens του ποντικού) υποδοχείς των οπιοειδών. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τους υποδοχείς αυτούς είναι 3 (ένα γονίδιο για κάθε τύπο υποδοχέα), έχουν σήμερα κλωνοποιηθεί και γνωρίζουμε πως κάθε υποδοχέας έχει υπότυπους. Το γονίδιο για τον μ-υποδοχέα βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6 στον άνθρωπο και στο χρωμόσωμα 1 στον αρουραίο, για τον κ-υποδοχέα βρίσκεται στο χρωμόσωμα 8 στον άνθρωπο και στο χρωμόσωμα 5 στον αρουραίο και για τον δ- υποδοχέα βρίσκεται στο χρωμόσωμα 1 στον άνθρωπο και στο χρωμόσωμα 5 στον αρουραίο. Έως σήμερα, έχουν αναγνωριστεί 3 υπότυποι για τον μ-υποδοχέα (μ 1, μ 2 και μ 3 ), 2 υπότυποι για το δ-υποδοχέα (δ 1 και δ 2 ) και 3 υπότυποι για τον κ-υποδοχέα (κ 1, κ 2 και κ 3 ). Υπάρχουν ενδείξεις πως οι υπότυποι κάθε κατηγορίας αποτελούν προΐόντα αναλλακτικού splicing. Πρόσφατα, χρησιμοποιώντας τεχνικές κλωνοποίησης από βιβλιοθήκες cdna αναγνωρίστηκε ένας νέος τύπος υποδοχέα που παρουσιάζει μεγάλο βαθμό ομολογίας με τους κλασικούς υποδοχείς για τα οπιοειδή. Ο υποδοχέας αυτός ονομάστηκε ORL1 (opioid receptor-like 1). Νέες φαρμακολογικές ενδείξεις πιθανολογούν την ύπαρξη και άλλων, λιγότερο καλά χαρακτηρισμένων υποδοχέων για τα οπιοειδή (ε, λ, ι, ζ). Οι 4 υποδοχείς των οπιοειδών ανήκουν στην υπεροικογένεια των υποδοχέων που ζευγαρώνουν με G-πρωτεΐνες και έχουν βασικά την ίδια δομή: αποτελούν διαμεμβρανικές πρωτεΐνες με ένα εξωκυττάριο υδρόφιλο αμινοτελικό άκρο, 7 υδρόφοβα διαμεμβρανικά τμήματα και ένα ενδοκυττάριο υδρόφιλο καρβοξυτελικό άκρο. Έχουν άμεση λειτουργική συσχέτιση με G-πρωτεΐνες, μέσω των οποίων επιτελούν τους μηχανισμούς δράσης τους όπως θα δούμε παρακάτω. 26

Εικόνα 14 Στην εικόνα 14 βλέπουμε έναν τυπικό υποδοχέα οπιοειδών. Κάθε μικρός κύκλος αντιπροσωπεύει ένα αμινοξύ. Οι πράσινες γραμμές δείχνουν την αρχή και το τέλος των διαμεμβρανικών ελίκων. Οι γκρι κύκλοι αντιπροσωπεύουν τις συντηρημένες θέσεις και στους 3 τύπους υποδοχέων, ενώ οι μαύροι κύκλοι αντιπροσωπεύουν τις συντηρημένες θέσεις σε όλους τους υποδοχείς της τάξης της ροδοψίνης που συνδέονται με G-πρωτεΐνες. Κάθε διαμεμβρανικό τμήμα συμβολίζεται με ένα λατινικό νούμερο. Στην αρχή και το τέλος κάθε έλικας υπάρχει αραβική αρίθμηση ξεκινώντας από το 1 και τελειώνοντας στο 25 (ανάλογα με το μήκος της έλικας). Τα νούμερα αυτά αναφέρονται στη θέση κάθε αμινοξέως μέσα στην έλικα. Για παράδειγμα, το ασπαρτικό οξύ στο διαμεμβρανικό τμήμα ΙΙΙ σημειώνεται ως III:08. Οι 3 τύποι υποδοχέων για τα οπιοειδή παρουσιάζουν 60% ομολογία αμονοξέων ο ένας με τον άλλο, ιδιαίτερα όσο αφορά τις διαμεμβρανικές τους έλικες. Όλοι διαθέτουν μία κοινή θέση-θύλακα πρόσδεσης για τα οπιοειδή η οποία βρίσκεται στις διαμεμβρανικές έλικες III-VII. Υπάρχουν όμως σημαντικές διαφορές στα εξωκυτταρικά τμήματα του κάθε τύπου υποδοχέα, πράγμα το οποίο παίζει μεγάλο ρόλο στην εκλεκτικότητα με τον προσδέτη. 27

Εικόνα 15: Μοντέλο θέσεων πρόσδεσης του αγωνιστή β-fna στον μ-υποδοχέα. Όπως και με τη Μορφίνη, οι θέσεις Tyr VI:19 και Cys VII:06 είναι πολύ σημαντικές στην πρόσδεση και μαζί με την Lys V:05 παίζουν πρωταρχικό ρόλο στον καθορισμό της συνάφειας με τον προσδέτη (β-fna β- funaltrexamine, Cys κυστεΐνη, Lys λυσίνη, TM διαμεμβρανικές έλικες, Tyr τυροσίνη, Kane και συν., 2006 ). 2.7.2 μ -ΥΠΟΔΟΧΈΑΣ Ο υποδοχέας των οπιοειδών τύπου «μ» αποτελεί μια πρωτεΐνη 65Kd περίπου και όπως έχουμε ήδη αναφέρει, μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί 3 υπότυποί του (μ 1, μ 2 και μ 3 ). Κάθε υπότυπος διαφέρει από τον άλλο σε μονοψήφιο αριθμό αμινιξέων. Αποτελεί τον κύριο υποδοχέα δράσης των ενδογενών και εξωγενών οπιοειδών (με εξαίρεση τον μ 3 υπότυπο ο οποίος δεν δεσμεύει τα ενδογενή οπιοειδή πεπτίδια). Είναι μέλος της υπεροικογένειας των πρωτεϊνών που συνδέονται με G-πρωτεΐνες (της τάξεως της ροδοψίνης) και ασκεί όλες τις δράσεις του μέσω της οικογένειας των ετεροδημερών G i /G 0 πρωτεϊνών, οι οποίες είναι ευαίσθητες στην τοξίνη του κοκκύτη (Pertussis Toxin, PTX). Έτσι, σε ενδοκυτταρικό επίπεδο η δράση του μ-υποδοχέα των οπιοειδών συνδέεται με την ενεργοποίηση και την αναστολή της αδενυλικής κυκλάσης, με την επίδραση σε διαύλους καλίου και ασβεστίου και με την ενεργοποίηση των φωσφολιπάσων A 2 και D όπως θα δούμε αναλυτικότερα παρακάτω. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι ο μ-υποδοχέας των οπιοειδών δύναται να συνδέεται και με ετεροδιμερή G q /G 11 που ασκούν τη δράση τους μέσω της ενεργοποίησης της φωσφολιπάσης C. 28

Μοριακές μελέτες έχουν δείξει πολλές θέσεις πρόσδεσης οπιοειδών με τα διαμεμβρανικά τμήματα του μ-υποδοχέα. Σχεδόν κάθε οπιοειδές καταλαμβάνει διαφορετική θέση πρόσδεσης μεταξύ των διαμεμβρανικών τμημάτων III έως VII (Εικόνα 15). Η κατάληψη μιας θέσης πρόσδεσης από ένα οπιοειδές μεταβάλλει τη στερεοδομή του υποδοχέα οδηγώντας έτσι σε ενεργοποίηση των G i /G 0 πρωτεϊνών και την προώθηση της ενδοκυττάριας σηματοδότησης. Το εξωκυτταρικό αμινοτελικό άκρο του μ-υποδοχέα περιέχει 5 θέσεις γλυκοζυλίωσης οι οποίες είναι ίδιες στον άνθρωπο και τον αρουραίο. Κατάλοιπα ασπαρτικού οξέως στα διαμεμβρανικά τμήματα II και III του υποδοχέα φαίνεται πως αντιδρούν με την πρωτονιωμένη αμινομάδα πολλών προσδετών και δύο καλά διατηρημένα κατάλοιπα κυστεΐνης φαίνεται να ενέχονται στη δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών στο εξωκυτταρικό τμήμα. Υπάρχουν επίσης θέσεις φωσφορυλίωσης για την πρωτεϊνική κινάση Α (PKA), την πρωτεϊνική κινάση C (PKC), καθώς και για την πρωτεϊνική κινάση εξαρτώμενη από το σύμπλεγμα ασβεστίου/καλμοδουλίνης (typeii Ca2+/calmodulindependent kinase, CaM kinase). Μια από αυτές τις θέσεις η οποία υπάρχει στο ενδοκυττάριο τμήμα του υποδοχέα παίζει σημαντικότατο ρόλο στην αλληλεπίδρασή του με την G-πρωτεΐνη. Εικόνα 16: Αγωνιστής των υποδοχέων των οπιοειδών (μωβ) συνδεδεμένος με μ-υποδοχέα (κόκκινο) 29

Ο μ-υποδοχέας των οπιοειδών αποτελεί τον περισσότερο διαδεδομένο υποδοχέα των οπιοειδών στον άνθρωπο και τον αρουραίο. Όπως και οι άλλοι 2 τύποι, απαντάται κυρίως προσυναπτικά και λιγότερο μετασυναπτικά στα σώματα, τους δενδρίτες και τις δενδριτικές άκανθες των νευρώνων του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος. Έτσι, στο κεντρικό νευρικό σύστημα του ανθρώπου και του αρουραίου εκφράζεται σχεδόν παντού στον αρχαιοφλοιό και το νεοφλοιό και πιο εκτεταμένα σε περιοχές όπως το ραβδωτό, πολλούς πυρήνες του θαλάμου, στη μέλαινα ουσία και τα βασικά γάγγλια, στις στιβάδες I και III του φλοιού, στην αμυγδαλή και στον ιπποκάμπειο σχηματισμό. Όπως θα δούμε παρακάτω, είναι ιδιαίτερα ενδιαφέρον ότι στον ιππόκαμπο οι υποδοχείς για τα οπιοειδή τύπου «μ» βρίσκονται σχεδόν αποκλειστικά στη μεμβράνη των GABAεργικών καλαθοειδών κυττάρων (PV-basket cells) που εκφράζουν παρβαλβουμίνη. Στη σπονδυλική στήλη απαντάται κυρίως στα οπίσθια κέρατα (ζελατινώδης ουσία του Rolando). Υπάρχει επίσης στη μεμβράνη κυττάρων του ανοσοποιητικού και του εντερικού συστήματος. Ο μ-υποδοχέας των οπιοειδών παρουσιάζει υψηλή συγγένεια για τα περισσότερα φυσικά και συνθετικά οπιοειδή, καθώς και για ενδογενή οπιοειδή όπως η β- ενδορφίνη, οι εγκεφαλίνες και οι δυνορφίνες. 2.8.0 Μοριακοί Μηχανισμοί Δράσης του μ-υποδοχέα Από τη δεκαετία του 50 ήταν ήδη γνωστό ότι τα οπιοειδή δρούν στο κεντρικό νευρικό σύστημα προκαλώντας αναλγησία, υπνηλία, μυοχάλαση, μείωση της αρτηριακής υπέρτασης κ.ά. μέσω υπερπόλωσης των νευρώνων και καταστολή του νευρικού συστήματος. Τα τελευταία 20 χρόνια όμως άρχισαν να γίνονται κατανοητοί οι επιμέρους κυτταρικοί μηχανισμοί οι οποίοι διέπουν τη δράση του μ-υποδοχέα των οπιοειδών. 2.8.1 Δράση επάνω στην αγωγιμότητα του καλίου Ο μ-υποδοχέας των οπιοειδών προκαλεί την ενεργοποίηση μιας μεγάλης ποικιλίας διαύλων καλίου με αποτέλεσμα την έξοδο ιόντων καλίου από το νευρώνα και την υπερπόλωση της μεμβράνης. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται αναστολή της νευρωνικής διεγερσιμότητας (Corbett και συν., 2006). Ο σημαντικότερος από αυτούς του διαύλους καλίου είναι ο GIRK (G protein-activated inwardly rectifying conductance, Kir3) ο οποίος ανοίγει με τη μεσολάβηση της β/γ υπομονάδας της G- 30

πρωτεΐνης. Ο τερματισμός του ρεύματος GIRK εξαρτάται από το οπιοειδές το οποίο δρα στον μ-υποδοχέα. Η ταχύτητα μείωσής του είναι μικρότερη όταν στον υποδοχέα δρουν αγωνιστές μεγάλης συνάφειας. Οι GIRK εκφράζονται ευρέως στον εγκέφαλο του ανθρώπου και των τρωκτικών. Πειράματα με knockout αρουραίους έχουν δείξει ότι οι δίαυλοι GIRK παίζουν ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στην αναλγητική δράση των οπιοειδών (Ikeda και συν., 2002). Επίσης, οι μεταλλαγμένοι GIRK παρουσιάζουν μειωμένη ικανότητα ζευγαρώματος με G-πρετεΐνες. Εκτός όμως από τους διαύλους GIRK, ο μ-υποδοχέας των οπιοειδών έχει βρεθεί ότι ενεργοποιεί διαύλους καλίου καθυστερημένης επαναπόλωσης, τασεοεξαρτώμενους διαύλους καλίου, τον ευαίσθητο στο ασβέστιο δίαυλο καλίου ΒΚ (Williams και συν., 2001), διαύλους ευαίσθητους στη δενδροτοξίνη και διάυλους M (Corbett και συν., 2006). 2.8.2 Δράση επάνω στην αδενυλική κυκλάση Τα τελευταία 20 χρόνια πολλές μελέτες επίδρασης των οπιοειδών στους νευρώνες έφεραν στην επιφάνεια διάφορες επιδράσεις οι οποίες είναι το αποτέλεσμα της αναστολής της αδενυλικής κυκλάσης και της επακόλουθης μείωσης του κυκλικού AMP (camp). Πρώτον, η μείωση του camp αυξάνει το κατώφλι ενεργοποίησης των διαύλων κατιόντων που ενεργοποιούνται από την υπερπόλωση της μεμβράνης (Ih). Με τον τρόπο αυτό, η ενεργοποίηση του μ-υποδοχέα από τα οπιοειδή αναστέλλει αποτελεσματικά το προς τα έσω κατιοντικό ρεύμα Ih (Ingram και Williams, 1994, Svoboda και Lupica, 1998). Το γεγονός αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της βηματοδοτικής ικανότητας του κυττάρου και τη μείωση του ρυθμού πυροδότησης δυναμικών ενέργειας από τους νευρώνες (Corbett και συν., 2006). Δεύτερον, η μείωση των επιπέδων του camp σε ορισμένους τύπους συνάψεων έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστών που εξαρτώνται από την πρωτεϊνική κινάση Α (PKA) (Williams και συν., 2001). Ο σημαντικός ρόλος των οπιοειδών στην πιο πάνω διαδικασία ενισχύεται από το εύρημα ότι κατά τον έντονο πόνο η απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών που εξαρτάται από την PKA είναι αυξημένη (Willis, 2001) και από το ότι η μορφίνη μέσω του μ- υποδοχέα αναστέλλοντας την από την PKA-εξαρτώμενη νευροδιαβίβαση αναστέλλει 31

τη δράση του βανιλοειδούς υποδοχέα 1 (TRPV1), ο οποίος είναι απαραίτητος στη διαδικασία του έντονου άλγους κατά τη φλεγμονή (Vetter etal 2006). Εικόνα17: δράση του μ-υποδοχέα των οπιοειδών σε διαύλους ιόντων 2.8.3 Δράση επάνω στην απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών Η αναστολή της απελευθέρωσης νευροδιαβιβαστών από τα οπιοειδή είχε αρχικά παρατηρηθεί το 1917 στο περιφερικό νευρικό σύστημα από τον Trendelenburg, ο οποίος παρατήρησε ότι η μορφίνη μείωνε τον περισταλτισμό στον ειλεό του χοίρου της Γουινέας. Μόλις το 1950 αποδείχθηκε πως το φαινόμενο αυτό οφειλόταν σε αναστολή απελευθέρωσης ακετυλοχολίνης. Αργότερα, αποδείχθηκε ότι η μορφίνη μπορεί να αναστέλλει την απελευθέρωση νοραδρεναλίνης από τις απολήξεις των μεταγαγγλιακών συμπαθητικών ινών. Σήμερα γνωρίζουμε ότι σε ολόκληρο σχεδόν το κεντρικό νευρικό σύστημα, οι μ- υποδοχείς είναι ικανοί να αναστέλλουν την απελευθέρωση πολλών νευροδιαβιβαστών, όπως το γλουταμικό οξύ, το GABA και τη γλυκίνη (Williams και συν., 2001). Αυτό πιθανολογείται πως επιτυγχάνεται τουλάχιστον μέσω 3 μηχανισμών: (α) την ενεργοποίηση των αγωγιμοτήτων διαύλων καλίου και την αναστολή της αγωγιμότητας διαύλων ασβεστίου (Williams και συν., 2001), (β) μέσω 32

της αναστολής της αδενυλικής κυκλάσης της οποίας ο ρόλος στην απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών είναι σημαντικός και (γ) με άμεσο τρόπο δρώντας απευθείας επάνω στο μοριακό μηχανισμό μετακίνησης-απελευθέρωσης του νευδιαβιβαστή (Williams και συν., 2001, Capogna και συν., 1993). Ανάλογα με την εντόπιση, τα οπιοειδή μπορούν να αναστείλουν την απελευθέρωση διεγερτικών ή ανασταλτικών νευροδιαβιβαστών. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η αναστολή της απελευθέρωσης GABA σε τοπικά κυκλώματα του ιπποκάμπειου σχηματισμού. Στα κυκλώματα αυτά τα οπιοειδή προκαλούν υπερπόλωση συγκεκριμένης υποκατηγορίας ενδονευρώνων (καλαθοειδή κύτταρα που εκφράζουν παρβαλβουμίνη, PV basket cells) συνταλώντας με τον τρόπο αυτό στη μείωση της διεγερσιμότητας των κυττάρων αυτών. Επιπρόσθετα, τα οπιοειδή αναστέλλουν την αυθόρμητη απελευθέρωση GABA πράγμα το οποίο υποδηλώνει την απευθείας δράση τους στην απόληξη του νευράξονα και τη μείωση της πιθανότητας απελευθέρωσης του GABA. 2.8.4 Δράση επάνω στη φωσφολιπάση C και τα ρεύματα ασβεστίου Ο μ-υποδοχέας των οπιοειδών τροποποιεί τη δράση της φωσφολιπάσης Cβ (PLCβ) μέσω των Gi/G0 και Gq πρωτεϊνών (Ueda και συν., 1995, Lee και συν., 1998). Παρότι ο ακριβής ρόλος της PLCβ ως απάντηση στη δράση των οπιοειδών δεν είναι αποσαφηνισμένος, τα knockout ποντίκια στο γονίδιο της PLCβ παρουσιάζουν ενισχυμένη αναλγησία μετά τη χορήγηση μορφίνης (Xie και συν., 1999). Λόγω του ότι η είσοδος ιόντων ασβεστίου προσυναπτικά είναι πολύ σημαντική για την απελευθέρωση νευροδιαβιβαστών, έχει μελετηθεί η σχέση πολλών τύπων τασεοεξαρτώμενων διαύλων ασβεστίου (voltage-dependent calcium channels, VDCCs) με τον μ-υποδοχέα διότι γνωρίζουμε πως οι δίαυλοι αυτοί αναστέλλονται άμεσα από τις β/γ υπομονάδες των Gi πρωτεϊνών (Herlitze και συν., 1996, Ikeda και συν., 2002). Παρόλο που δεν υπάρχουν ακόμα πολλές αποδείξεις για την αναστολή των VDDCs από τα οπιοειδή, σε VDCC-knockout ποντίκια οι αλγεινές αποκρίσεις είναι σε γενικές γραμμές ασθενέστερες (Saegusa και συν., 2000, Hatakeyama και συν., 2001). 33