Helicobacter pylori Αριθμός καταλόγου 404 1002 96 δοκιμές ανά κιτ Εγχειρίδιο Οδηγιών Παρακαλείσθε να εξοικειωθείτε με το περιεχόμενο του παρόντος ενημερωτικού εντύπου πριν από την πρώτη χρήση του προϊόντος. Οι μη επεμβατικές μέθοδοι περιλαμβάνουν δοκιμές ορών για αντισώματα κατά του H. pylori και δοκιμή απορρόφησης ουρίας κατά την οποία χρησιμοποιείται ραδιενεργός ουρία. Ο μηχανισμός πρόκλησης νόσου από το Η. pylori δεν είναι πλήρως γνωστός. Είναι πιθανή η επιβίωση του βακτηρίου αυτού στο γαστρικό βλεννογόνο για αρκετά χρόνια. Η παρουσία του Η. pylori είναι, επίσης, συνήθης σε άτομα που θεωρούνται υγιή, χωρίς κλινικά συμπτώματα της ασθένειας. ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Ο εν λόγω ανοσοπροσδιορισμός στοχεύει στην ποσοτική ανίχνευση των αντισωμάτων IgM κατά του ελικοβακτηριδίου του πυλωρού (Helicobacter pylori) στον ανθρώπινο ορό. Τα εν λόγω αντιδραστήρια προορίζονται αποκλειστικά για διαγνωστική χρήση in vitro. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΔΟΚΙΜΗΣ Το Helicobacter pylori έχει βρεθεί σε δείγματα βιοψίας γαστρικού επιθηλίου ασθενών που παρουσίαζαν ενεργή μορφή Β-γαστρίτιδας 1,2,3,4,5. Παρ' όλο που είναι άγνωστη η οδός της λοίμωξης, αναφορές έδειξαν σχέση μεταξύ λοίμωξης από H. pylori και χρόνια γαστρίτιδας 6,7. Έχει διαπιστωθεί ότι ενίοτε η παρουσία του H. pylori σχετίζεται με γαστρορραγία δωδεκαδακτυλικών έλκων 8. Έχει αναφερθεί επίσης πλήρης υποχώρηση της γαστρίτιδας ύστερα από εκρίζωση του μικροοργανισμού 9. Το H. pylori είναι μια gram-αρνητική, καμπυλωτή, ελικοειδής ράβδος πλάτους 0,2 έως 0,8 μm και μήκους 0,5 έως 5,0 μm. Αποικίζει το απώτερο τμήμα του βλεννώδους στρώματος και τον βλεννογόνο της εσωτερικής επιφάνειας των γαστρικών επιθηλιακών κυττάρων. Μπορεί επίσης να εντοπιστεί στον βλεννογόνο του μεσοκυττάριου χώρου των παρακείμενων επιθηλιακών κυττάρων. Η παρουσία του H. pylori μπορεί να ανιχνευτεί με επεμβατικές και μη επεμβατικές μεθόδους. Οι επεμβατικές μέθοδοι περιλαμβάνουν δοκιμή των δειγμάτων βιοψίας μέσω καλλιέργειας, ιστολογικής εξέτασης και δοκιμής ουρεάσης. Εξαιτίας της ανομοιογενούς κατανομής του H. pylori στον ιστό, συχνά προκύπτουν εσφαλμένα αρνητικά αποτελέσματα. ΒΑΣΙΚΗ ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Τα κιτ είναι ποσοτικοί προσδιορισμοί ELISA για την ανίχνευση ειδικών για το Η. pylori αντισωμάτων σε ανθρώπινο ορό. Μερικώς καθαρά αντιγόνα H. pylori ακινητοποιούνται στις κοιλότητες μιας πλάας μικροτίτλων και σε αυτές προστίθεται αραιωμένος ορός του ασθενή. Τα ειδικά κατά του H. pylori αντισώματα που βρίσκονται στον ορό, θα δεσμευτούν με το αντιγόνο στις κοιλότητες. Τα μη ειδικά αντισώματα απομακρύνονται με πλύση. Αντι-ανθρώπινο ενζυμικό συζυγές IgM προστίθεται στις κοιλότητες και δεσμεύεται με το σύμπλοκο αντισωμάτων-αντιγόνων. Το πλεονάζον ενζυμικό συζυγές απομακρύνεται με πλύση. Το χρώμα αναπτύσσεται με την προσθήκη ενζυμικού υποστρώματος. Η ένταση του χρώματος είναι ανάλογη με την ποσότητα των αντισωμάτων που υπάρχουν στο δείγμα ορού. ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΤΟΥ ΚΙΤ PLA H. pylori = Κοιλότητες καλυμένες με αντιγόνο - 96 κοιλότητες μικροτίτλων επιχρισμένες με αδρανοποιημένα αντιγόνα H. pylori. CAL 0-4 = Σετ βαθμονομητών - 5 φιαλίδια 1 ml που περιέχουν αντίστοιχα μηδέν, 12.5, 25, 50 και 100 μονάδες/ml αντισωμάτων IgM κατά του H. pylori σε ρυθμιστικό ανθρώπινο ορό. CTRL + - = Σετ μαρτύρων του 1 ml έκαστος. Θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες για τα αντισώματα IgM κατά του H. pylori σε ρυθμιστικό ανθρώπινο ορό. DIL SPE 10X = Συμπύκνωμα αραιωτικού δείγματος - 50 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού άλατος με Tween. Εγχειρίδιο Οδηγιών ELISA H. pylori σελίδα 1 67006BR_gr 04/2011
CONJ ENZ = Ενζυμικό συζυγές - 10 ml αντιανθρώπινων IgM αίγας συζευγμένων με ραφανιδικό συζυγές υπεροξειδάσης σε ρυθμιστικό διάλυμα TRIS/BSA. SUBS A TMB = Διάλυμα υποστρώματος Α - 8 ml TMB σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού άλατος με DMSO. SUBS B H2O2 = Διάλυμα υποστρώματος Β - 8 ml υπεροξειδίου του υδρογόνου σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού άλατος. BUF WASH 50X = Συμπύκνωμα πλύσης (50x) - 20 ml ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικού άλατος με Tween. SOLN STOPPING = Διάλυμα διακοπής της αντίδρασης - 6 ml H 2 SO 4 1N. Αποθηκεύστε όλα τα συστατικά του κιτ σε θερμοκρασία μεταξύ 2 και 8 C Οι βαθμονομητές, οι μάρτυρες και τα αραιωτικά του ορού περιέχουν ως συντηρητικό 0,09% αζίδιο του νατρίου. ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΟΣ ΕΠΙΠΡΟΣΘΕΤΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Συσκευή ανάγνωσης μικροπλακετών Συσκευή πλύσης μικροπλακετών Πιπέτες με δυνατότητα κατανομής 25, 50 και 100 μl Ογκομετρικές πιπέτες: 5 και 10 ml Βαθμονομημένοι κύλινδροι: 500 και 1000 ml Δοκιμαστικοί σωλήνες: 13 x 100 mm Πλαστική ταινία Απιονισμένο νερό ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Τα συστατικά του εν λόγω προïόντος περιέχουν υλικό ανθρώπινης προέλευσης το οποίο έχει υποβληθεί σε έλεγχο μέσω μεθόδων εγκεκριμένων από τη Διοίκηση Τροφών και Φαρμάκων (FDA) και ευρέθησαν μη αντιδρώντα στο επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας Β (HBsAg), στα αντισώματα για το HIV-I και 2 και το HCV. Ωστόσο, καμιά μέθοδος δεν μπορεί να εγγυηθεί κατά απόλυτο τρόπο την απουσία του ιού. Τα εν λόγω συστατικά ΔΕΝ έχουν υποβληθεί σε δοκιμασία για αντισώματα του HTLV-I ή του HTLV II. Γι αυτούς τους λόγους, τα συστατικά του παρόντος προïόντος συνιστάται να θεωρούνται ως δυνητικά λοιμογόνα και να υποβάλλονται σε χειρισμό με προφυλάξεις όμοιες με αυτές που λαμβάνετε για το χειρισμό δειγμάτων ασθενών. Ορισμένα αντιδραστήρια του παρόντος κιτ περιέχουν ως συντηρητικό αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του νατρίου ενδέχεται να αντιδράσει με τις υδραυλικές σωληνώσεις από μόλυβδο ή χαλκό και να παράγει εκρηκτικά αζίδια μετάλλων. Όταν απορρίπτετε τα εν λόγω αντιδραστήρια, πάντα ξεπλένετε με άφθονο νερό για την αποφυγή σχηματισμού αζιδίων. Το διμεθυλικό σουλφοξείδιο και το Η 2 SO 4 προκαλούν ερεθισμό στο δέρμα και τα μάτια. Αποφεύγετε επαφή με το δέρμα και τα μάτια. Φοράτε γάντια και προστατευτικά γυαλιά. Σε περίπτωση επαφής με το δέρμα ή τα μάτια, ξεπλένετε με νερό για τουλάχιστον 5 λεπτά. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Αραιωτικό διάλυμα δείγματος: Προσθέστε όλο το αραιωτικό συμπύκνωμα του δείγματος που περιέχεται στο φιαλίδιο σε περιέκτη 500mL. Ξεπλύνετε το φιαλίδιο με νερό για την απομάκρυνση των κρυστάλλων που ενδέχεται να έχουν καθιζάνει, προσθέστε 450 ml απιονισμένου νερού και αναμίξτε καλά. Διάλυμα πλύσης: Προσθέστε όλο το περιεχόμενο του συμπυκνωμένου υγρού πλύσης σε φιαλίδιο χωρητικότητας 1 λίτρου. Ξεπλύνετε το φιαλίδιο με νερό για την απομάκρυνση των κρυστάλλων που ενδέχεται να έχουν καθιζάνει, προσθέστε 980 ml απιονισμένου νερού και αναμίξτε καλά. Διάλυμα υποστρώματος: Εντός μίας ώρας από την προετοιμασία τους, αναμίξτε ίσες ποσότητες διαλύματος υποστρώματος Α και υποστρώματος Β. Προετοιμάστε μόνο την απαιτούμενη ποσότητα. Κάθε ταινία μικροκοιλοτήτων θα απαιτεί τουλάχιστον 800 μl διαλύματος υποστρώματος. Για παράδειγμα, για 6 ταινίες μικροκοιλοτήτων αναμίξτε 3,0 ml διαλύματος υποστρώματος Α με 3,0 ml διαλύματος υποστρώματος Β. Αποθηκεύστε σε σκοτεινό μέρος ή καλύψτε με αλουμινόχαρτο. Χρησιμοποιείστε το εντός 1 ώρας. Το διάλυμα πλύσης, το αραιωτικό διάλυμα δείγματος και τα ανοιχτά αντιδραστήρια του κιτ παραμένουν σταθερά για 60 ημέρες, εφόσον αποθηκεύονται σε θερμοκρασία από 2 έως 8 C. Εγχειρίδιο Οδηγιών ELISA H. pylori σελίδα 2 67006BR_gr 04/2011
ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΤΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Το δείγμα θα πρέπει να είναι ορός. Θα πρέπει να λαμβάνονται οι συνήθεις προφυλάξεις για τη φλεβοπαρακέντηση. Μη χρησιμοποιείτε αντιπηκτικά ή συντηρητικά. Μη χρησιμοποιείτε έντονα λιπαιμικά δείγματα ή δείγματα που έχουν υποστεί έντονη αιμόλυση. Ο ορός θα πρέπει να αποθηκεύεται σε θερμοκρασία μεταξύ 2 και 8 C για διάστημα μέχρι 10 ημερών. Για μεγαλύτερο διάστημα, ο ορός θα πρέπει να αποθηκεύεται σε θερμοκρασία -20 C. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ Κάθε δείγμα ορού θα πρέπει να αραιώνεται με το αραιωτικό διάλυμα δείγματος. Προσθέστε 25μL του δείγματος του ορού σε 5 ml αραιωτικού διαλύματος δείγματος. Αναμίξτε καλά. Οι μάρτυρες και οι βαθμονομητές παρέχονται προαραιωμένοι και είναι έτοιμοι προς χρήση. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγματα θα ρέπει να σταθεροποιούνται σε θερμοκρασία δωματίου (18 έως 25 C) πριν από την έναρξη του προσδιορισμού. Συγκεντρώστε τον επιθυμητό αριθμό ταινιών μικροκοιλοτήτων στη θήκη των ταινιών. 2. Πιπετάρετε 100 μl από κάθε βαθμονομητή, μάρτυρα και αραιωμένο δείγμα του ασθενή σε κάθε κοιλότητα. Οι βαθμονομητές και οι μάρτυρες είναι προαραιωμένοι και έτοιμοι προς χρήση. Καλύψτε την πλακέτα με πλαστική ταινία και επωάστε για μία ώρα σε θερμοκρασία μεταξύ 22 και 26 C. 3. Μεταγγίστε το περιεχόμενο των κοιλοτήτων και πλύνετε 3 φορές με 300 μl διαλύματος πλύσης. Στεγνώστε καλά μετά από κάθε φάση πλύσης. 4. Προσθέστε 100 μl ενζυμικού συζυγούς σε κάθε κοιλότητα. Καλύψτε την πλακέτα με πλαστική ταινία και επωάστε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία μεταξύ 22 και 26 C. 5. Προετοιμάστε το διάλυμα υποστρώματος. Για περισσότερες πληροφορίες, βλέπε ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ. 6. Μεταγγίστε το περιεχόμενο των κοιλοτήτων αι πλύνετε 3 φορές με 300 μl διαλύματος λύσης. Στεγνώστε καλά μετά από κάθε φάση πλύσης. 7. Προσθέστε 100 μl διαλύματος υποστρώματος σε κάθε κοιλότητα. Καλύψτε την πλακέτα με πλαστική ταινία και επωάστε για 10 λεπτά σε σκοτεινό μέρος, σε θερμοκρασία μεταξύ 22 και 26 C. 8. Αμέσως μετά την επώαση, προσθέστε σε κάθε κοιλότητα 50 μl διαλύματος διακοπής της αντίδρασης. Αναμίξτε τα αντιδραστήρια χτυπώντας ελαφρά την πλακέτα. 9. Μετρήστε την οπτική πυκνότητα κάθε κοιλότητας σε μήκος κύματος 450 nm. Η πλακέτα θα πρέπει να αναγνωστεί εντός 30 λεπτών μετά την πρόσθεση του διαλύματος διακοπής της αντίδρασης. Χρησιμοποιείτε χιλιομετρικό χαρτί για τη χάραξη της καμπύλης βαθμονόμησης και τον υπολογισμό των αποτελεσμάτων. ΈΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ Τηρώντας την ορθή εργαστηριακή πρακτική, η επεξεργασία των θετικών και των αρνητικών μαρτύρων θα πρέπει να γίνεται παράλληλα με αυτή των δειγμάτων των ασθενών. Η μη επίτευξη κατάλληλων τιμών για τους μάρτυρες μπορεί να αποτελεί ένδειξη για ανακριβείς χειρισμούς, ακατάλληλους χειρισμούς των δειγμάτων ή αλλοίωση των αντιδραστηρίων. Αρνητικός Θετικός Μηδενικός < 10 U/mL 40-70 U/mL < 0.2 mod ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Θετικό > 40 Αμφιλεγόμενο 36 40 Αρνητικό < 36 Οι ασθενείς με αμφιλεγόμενα αποτελέσματα θα πρέπει να υποβληθούν εκ νέου σε εξετάσεις ύστερα από 2 εβδομάδες και το δεύτερο δείγμα να υποβληθεί σε προσδιορισμό μαζί με το πρώτο. Εγχειρίδιο Οδηγιών ELISA H. pylori σελίδα 3 67006BR_gr 04/2011
ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ ΚΑΙ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ Κλινικές δοκιμές με τους προσδιορισμούς διεξήχθησαν σε τέσσερις κλινικές σε ασθενείς που παρουσίαζαν τυπικά κλινικά συμπτώματα γαστρίτιδας. Η δοκιμή των δειγμάτων βιοψίας που ελήφθησαν από τους εν λόγω ασθενείς διεξήχθη μέσω καλλιέργειας, δοκιμής ουρεάσης και/ή ιστολογικής χρώσης. Τα αποτελέσματα των προσδιορισμών GAP συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα της βιοψίας. Ευαισθησία (%) 93.8 Ειδικότητα (%) 82.0 Ακρίβεια (%) 89.3 Ασθενείς 109 ΟΡΘΟΤΗΤΑ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΙΔΙΑ ΔΟΚΙΜΗ Η ορθότητα των αποτελεσμάτων κατά την ίδια δοκιμή προσδιορίστηκε με τη δοκιμή 12 αντιγράφων τριών δειγμάτων ορού. Ενδεχόμενο θετικό αποτέλεσμα της δοκιμής δεν διακρίνει τον αποικισμό από την λοίμωξη από H. pylori και δεν αποτελεί ένδειξη παρουσίας γαστρεντερικής νόσου. Ενδεχόμενο αρνητικό αποτέλεσμα της δοκιμής δεν αποκλείει την παρουσία H. pylori. Ο αποικισμός ενδέχεται να υπάρχει αλλά στα πολύ πρώιμα στάδιά του ή ο τίτλος του αντισώματος ενδέχεται να είναι ιδιαίτερα χαμηλός για να ανιχνευτεί κατά τη δοκιμή. Άτομα ηλικίας άνω των 50 ετών έχουν μεγαλύτερη πιθανότητα λοίμωξης από το H. pylori στο παρελθόν και ενδέχεται να έχουν χαμηλά αλλά ανιχνεύσιμα επίπεδα ειδικών για το H. pylori αντισωμάτων χωρίς κλινικά συμπτώματα 10,11,12. Επιπλέον, η συχνότητα εμφάνισης της οροθετικότητας μπορεί να ποικίλλει ανά πληθυσμό 13. Οι προσδιορισμοί θα πρέπει να χρησιμοποιούνται μόνο για ασθενείς που έχουν αναφέρει κλινικά σημεία και συμπτώματα που σχετίζονται με τη γαστρίτιδα. Αυτές οι δοκιμές δεν θα πρέπει να εφαρμόζονται σε ασυμπτωματικούς ασθενείς. Μέσος όρος Τυπική απόκλιση Συντελεστής απόκλισης (%) 10.2 0.5 4.9 25.2 1.4 5.7 44.4 2.5 5.7 ΟΡΘΟΤΗΤΑ ΜΕΤΑΞΥ ΔΟΚΙΜΩΝ Η ορθότητα των αποτελεσμάτων μεταξύ δοκιμών προσδιορίστηκε με τη μέτρηση τριών δειγμάτων ορού σε δέκα ξεχωριστές δοκιμές, οι οποίες διεξήχθησαν από τέσσερις διαφορετικούς χειριστές. Μέσος όρος Τυπική απόκλιση 10.1 1.1 11.2 21.2 1.9 8.9 39.7 4.0 10.0 Συντελεστής απόκλισης (%) ΟΡΙΑ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Οι προσδιορισμοί είναι ποσοτικές δοκιμές για την ανίχνευση της παρουσίας των ειδικών για το H. Pylori αντισωμάτων και δεν προσδιορίζουν τον τίτλο του αντισώματος. Εγχειρίδιο Οδηγιών ELISA H. pylori σελίδα 4 67006BR_gr 04/2011
Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0)1 47 95 60 00 Fax : +33 (0)1 47 41 91 33 Bio-Rad Numbers: United States 1-800-227-1600 Australia 61-2-9914-2800 Austria 43-1-877-8901 Belgium 32-9-385-5511 Canada 905-712-2771 France 33-1-4960-6834 Germany 49-89-31884-0 Netherlands 31-318-540666 Hong Kong 852-2-789-3300 Italy 39-2-216091 Japan 81-3-5811-6266 New Zealand 64-9-443-3099 Spain 34-1-661-7085 Sweden 46-8-627-5000 Switzerland 41-1-809-5555 United Kingdom 44-1-442-232552 Biomerica, Inc. 17571 Von Karman Ave. Irvine, California 92614 USA Authorized Representative according to IVDD 98/79/ EC MDSS GmbH Schiffgraben 41 D-30175 Hannover, Germany 04/2011 SYMBOLS Storage Temperature Lot Code Expiration Manufacturer Authorized Representative Caution, see instructions For in vitro diagnostic use Catalog No. Distributor Εγχειρίδιο Οδηγιών ELISA H. pylori σελίδα 5 67006BR_gr 04/2011