ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ

ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

ΜΙΚΡΟΒΙΑΚΗ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ

ΒΙΟΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ : Ποικιλία των ζωντανών οργανισµών που προέρχονται από όλες τις φυσικές πηγές, συµπεριλαµβανοµένων της ατµόσφαιρας, χέρσου, θάλασσαςκαιάλλωνυδάτινωνσυστηµάτων. [ΟΡΓΑΝΙΣΜΟΣ ΗΝΩΜΕΝΩΝ ΕΘΝΩΝ ΓΙΑ ΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΉ ΠΟΙΚΙΛΟΤΗΤΑ (UNEP, 1992)] Η µικροβιακή ποικιλότητα περιλαµβάνει : Το περιβάλλον (οικοθέσεις) όπου απαντώνται οι µικροοργανισµοί Τη γενετική σύσταση των µικροοργανισµών Τον οικολογικό ή λειτουργικό ρόλο των µικροοργανισµών στο οικοσύστηµα

Τι και πόσα γνωρίζουµε γιατηµικροβιακή ποικιλότητα ; Ιστορικά ανθρωποκεντρική προσέγγιση της Μικροβιολογίας Εστίαση σε παθογόνους µικροοργανισµούς και καθαρές καλλιέργειες Περισσότερα από 500.000 είδη εντόµων είναι γνωστά Πολύ περιορισµένο ενδιαφέρον για το περιβάλλον Λιγότερα από 5.000 είδη προκαρυωτικών If we squeeze out any of these insects, we find hundreds or thousands of distinct microbial species. N. Pace 97

41.000 750.000 250.000

Όλα ξεκίνησαν από τον Bergey. 1923 - Bacterial Taxonomy: Bergey's Manual of Determinative Bacteriology γίνεται η πρώτη προσπάθεια περιγραφής της έννοιας του «είδους»

ΟΡΙΣΜΟΣ ΕΙ ΩΝ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ: Οµάδα µικροοργανισµών µε υψηλό βαθµό µορφολογικής οµοιότητας Όµως : Περιορισµένα µορφολογικά στοιχεία προς µελέτη, αλλαγή µορφολογίας υπό συνθήκες καταπόνησης B. anthracis B. japonicum

ΟΡΙΣΜΟΣ ΕΙ ΩΝ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Οµάδα µικροοργανισµών µε κοινέςµεταβολικές ικανότητες Όµως : Μεταφορά γονιδίων µεταβολισµού, επιλεκτική πίεση ΟΙΚΟΛΟΓΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ Οµάδα µικροοργανισµών µε κοινή οικοθέση και λειτουργία που διαχωρίστηκαν µε φυσική επιλογή Όµως : Προσαρµογή

ΟΡΙΣΜΟΣ ΕΙ ΩΝ ΠΑΡΑ ΕΙΓΜΑ Στελέχη του ίδιου είδους έχουν διαφορετικές µεταβολικές ιδιότητες και ρόλο όταν βρίσκονται σε διαφορετικά περιβάλλοντα : 5 100 Pseudomonas putida: Ξηρή βιοµάζα (g.l -1 ) 4 3 2 1 50 % αποικοδόµηση αργού πετρελαίου LF1 LF3 : µειούµενος βαθµός επιβάρυνσης ΒΚ : βιολογικός καθαρισµός Μάρτυρας : µη επιβαρυµένη περιοχή 0 LF1 LF2 LF3 BK Mάρτυρας 0

ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΚΡΙΤΗΡΙΑ ( ΑΝΑΠΤΥΣΣΟΝΤΑΙ ΤΟΜΕΙΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ & ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ) Οµάδα µε δυνατότητα ανταλλαγής γενετικού υλικού (οµόλογος γενετικός ανασυνδυασµός) µόνο µεταξύ των µελών της Όµως : Η συχνότητα και δυνατότητα ανταλλαγής µπορεί να επηρεάζεται από περιβαλλοντικές συνθήκες και ανθρωπογενή παρέµβαση

Αποµακρυσµένα φυλογενετικά είδη µπορούν να ανταλλάσσουν γενετικό υλικό κάτω από περιβαλλοντική πίεση π.χ. µεγάλη συχνότητα γονιδίων Pseudomonas σε Streptomyces και Bacillus σε περιβάλλοντα επιβαρηµένα µε H/C.για να φτάσουν σε αδιέξοδο τη δεκαετία του 70

οπότε συνέβη η «επανάσταση» του Woese (1977) Carl Woese Ένας χηµικός που ασχολούνταν µε την αποµόνωση συγγενικών ειδών και σύγκριση των 16S rrna αλληλουχιών, ανακαλύπτει : 1) Archaebacteria οορισµός ενός νέου βασιλείου Αρχαίοι Προκαρυωτικοί Οργανισµοί 2) Μελέτη φυλογενετικών σχέσεων

Γιατί 16S rrna? - Υψηλός βαθµός συντήρησης µέσα σε είδος - Τι σηµαίνει διαφοροποιήσεις αλληλουχίας? Α U C G

Τέτοιου είδους αλλαγές µπορούν να «ποσοτικοποιηθούν» (bioinformatics) και η σηµαντικότητά τους να παρασταθεί µε «κλαδιά»: ΕΙ ΟΣ : τιµή DNA DNA υβριδισµού > 70 % ή οµολογία 16S rrna γονιδίου > 97 % A B C D Ησυσχέτισηµεταξύ των κλαδιών µας δίνει το «δέντρο της ζωής»

Bacteria Archaea Eucarya

12

33

Bacteria, 2003 52 Phyla pre-1987 (12) since 1987 (14) (cultivated) since 1987 (26) none cultivated Rappé and Giovannoni. ARM, 57: 369-394, 2003

Analysis of microbial communities by cloning and sequencing of PCR amplicons amplified from community DNA or cdna DNA/RNA extraction Amplification of 16S/18S rdna Cloning of PCR products in competent E. coli cells Screening of white colonies for insert size by PCR with primers targeting insert flanking vector sequences Sequencing of representative clones Analysis of the DNA sequences by BLAST or by means of the ARB programme

Sargasso Sea (2004): 1.045 billion base pairs 1.2 million new genes 1.800 species 148 new phyla

Τα «εργαλεία» οδήγησαν στην έκρηξη του αριθµού των γνωστών ειδών και τη σχετική προσέγγιση της µικροβιακής ποικιλότητας: Πρόοδος της τεχνολογίας και συνδυασµός στην εφαρµογή : Μικροσκοπικών Κλασσικών µικροβιολογικών Βιοχηµικών και Μοριακών τεχνικών

Μικροσκοπικές τεχνικές Μικροσκοπία συνεστίασης (Confocal Laser Scanning Microscopy) χρησιµοποιείται για να αποδώσει τρισδιάστατα και λειτουργικά χαρακτηριστικά των φυσικών κοινωνιών Χρήση εξειδικευµένων µορίων ανιχνευτών (τεχνική FISH) για το είδος Methanosarcina barkeri (µειωµένη ένταση) και Methanoceta concili (έντονος φθορισµός) δίνει την εικόνα ενός «τοπογραφικού χάρτη» της µικροβιακής κοινωνίας στην επιφάνεια αποβλήτου

Μικροσκοπικές τεχνικές Μικροσκοπία προσπίπτοντος φθορισµού (epifluorescence) χρησιµοποιείται για να αποδώσει τη δοµή βιοµεµβρανών (biofilms) Χρήση χρώσης DAPI (4,6 diamidino-2-phenylindole) για την παρατήρηση σχηµατισµού βιοµεµβρανών (biofilm) ανοξείδωτη επιφάνεια σε διαφορετικά στάδια

Κλασσικές µικροβιολογικές τεχνικές : από τις αξενικές καλλιέργειες στην κατανόηση σχέσεων και αλληλεπιδράσεων Στήλη Winogradsky : δηµιουργία µικροπεριβαλλόντων λόγω κλίσης διαφορετικών υλικών

Κλασσικές µικροβιολογικές τεχνικές : από τις αξενικές καλλιέργειες στην κατανόηση σχέσεων και αλληλεπιδράσεων - ηθµοί νιτροκυτταρίνης σε πλέγµατα - τοποθέτηση στο έδαφος για ικανό χρονικό διάστηµα - ανάκτηση και µεταφορά σε τρυβλίο µε γενικού τύπου υπόστρωµα

Κλασσικές µικροβιολογικές τεχνικές : από τις αξενικές καλλιέργειες στην κατανόηση σχέσεων και αλληλεπιδράσεων Πολλές φορές ένας non - culturable µικροοργανισµός δεν αναπτύσσεται στο τρυβλίο γιατί είναι απαραίτητη η παρουσία και άλλων ειδών µικροοργανισµων Με τη µέθοδο αυτή εξασφαλίζεται η ταυτόχρονη παρουσία όλων των ειδών που υπήρχαν στο φυσικό περιβάλλον

Μεταβολικές αλληλεπιδράσεις Tyson et al (2002) Σε ανθρακορυχείο Αζωτοδεσµευτικό Leptospirillum Ferroplasma : χρησιµοποιεί το παραγόµενο άζωτο

Κλασσικές µικροβιολογικές τεχνικές : από τις αξενικές καλλιέργειες στην κατανόηση σχέσεων και αλληλεπιδράσεων Α 5 100 Β Ξηρή βιοµάζα (g.l -1 ) 4 3 2 1 50 % αποικοδόµηση αργού πετρελαίου 0 A B Γ CONSORTIUM 0 Γ Οι µικροοργανισµοί Α, Β, Γαυξάνονταιµε µικρότερη απόδοση και παρουσιάζουν χαµηλότερη αποικοδόµηση σε αξενικές καλλιέργειες Μικτές καλλιέργειες

Βιοχηµικές / Μοριακές τεχνικές : δυνατότητα εφαρµογής και για το 99 % των µικροοργανισµών που είναι αδύνατο να αποµονωθεί DNA ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ RNA mrna ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ πρωτεΐνη Λιπιδική σύσταση Ενζυµική ενεργότητα Πολυσακχαρίτες DGGE / TGGE gene libraries (16S rrna ήεπιλεγµένων γονιδίων) RFLP

Βιοχηµικές / Μοριακές τεχνικές : δυνατότητα εφαρµογής και για το 99 % των µικροοργανισµών που είναι αδύνατο να αποµονωθεί Λιπιδική σύσταση DNA RNA πρωτεΐνη Ενζυµική ενεργότητα Πολυσακχαρίτες Low Molecular Weight RNA RT PCR Microarrays

Βιοχηµικές / Μοριακές τεχνικές : δυνατότητα εφαρµογής και για εκείνο το 99 % των µικροοργανισµών που είναι αδύνατο να αποµονωθεί Λιπιδική σύσταση DNA RNA πρωτεΐνη Ενζυµική ενεργότητα Πολυσακχαρίτες PLFA FAME οµολογία δοµής και λειτουργίας ενζύµων

ιαστάσεις της ποικιλότητας της Escherichia coli µε µοριακές /βιοχηµικές τεχνικές:

Η εποχή των Meta Genomics Ανάκτηση DNA απευθείας από περιβαλλοντικά δείγµατα, χωρίς τη µεσολάβηση καλλιέργειας και χαρακτηρισµού στελεχών Τρεις στόχοι - Ολοκληρωµένη εικόνα ποικιλότητας - Ανακάλυψη νέων γονιδίων παραγωγής προϊόντων βιοτεχνολογικής αξίας - Κατανόηση βασικών λειτουργιών του κυττάρου (συσχέτιση γονιδιακής και λειτουργικής ποικιλότητας)

Craig Venter James D. Watson O Craig Venter για παράδειγµα, πήρε στατίνη για να µειώσει τα επίπεδα χοληστερόλης στο αίµα του λόγω του ότι διαθέτει το αλληλόµορφο E4 του γονιδίου APOE που είναι υπεύθυνο για την αύξηση του κινδύνου να εκδηλωθεί η ασθένεια του Alzheimer (Nature, 18 October 2007).

1. Αποµόνωση DNA από περιβαλλοντικά δείγµατα 2. Κατασκευή βιβλιοθήκης 3. Ανάλυση υο βασικές προσεγγίσεις : conventional small insert (<10kb) library Sequence DNA or RNA, look for genes with functions of interest large insert (cosmid or BAC) library (up to 200 kb), allows sampling of whole operons Perform functional screens: άµεσες δοκιµές για λειτουργικές ιδιότητες στον κλωνοποιηµένο ξενιστή Περιορισµοί: υνατότητα εντοπισµού γονιδίων µόνο µε υψηλή οµολογία προς τα ήδη γνωστά εν είναι πάντα εφικτή ηορθήµετάφραση των γονιδίων σε είδη που απέχουν φυλογενετικά

Παράδειγµα από θαλάσσιο οικοσύστηµα Μοριακές τεχνικές απέδειξαν ότι λιγότερο από το 1% των µικροοργανισµών στα θαλάσσια οικοσυστήµατα καλλιεργούνται στο εργαστήριο Gene sequencing από θαλάσσιο DNA αποκάλυψε νέα γονίδια που υποδηλώνουν παρουσία άγνωστων µέχρι σήµερα µεταβολικών οδών : Proteorhodopsin = rhodopsin-based photosynthesis in bacteria located on a 130 kb BAC Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea Beja et al. 2000 Expressed in E. coli (red) structure

Μελέτη της Μικροβιακής Ποικιλότητας : Πού, Πότε και Γιατί;

Μικροβιακή ποικιλότητα και Υγεία Φυσική χλωρίδα - Αναπτύσσεται σταδιακά µετά τη γέννηση - Αλλάζει κατά τη διάρκεια της ζωής - Αντικατοπτρίζει την ηλικία, τις διατροφικές συνήθειες και το περιβάλλον

Εξασφαλίζει φυσιολογική ανάπτυξη του ανοσοποιητικού συστήµατος Παρεµποδίζει την αύξηση παθογόνων µικροοργανισµών µέσω ανταγωνισµού (τροφή, χώρος κ.τ.λ) και παραγωγής αντιβιοτικών - E. coli παράγει βακτηριοσίνες : παρεµπόδιση αύξησης βακτηρίωνσυγγενώνειδών( π.χ. Salmonella ή Shigella) -ph στον κόλπο διατηρείται από ενδογενή βακτήρια στο 3,5-4,5 -Η φυσιολογική χλωρίδα στο έντερο εµποδίζει την αύξηση του Clostridium difficile. -Αλλαγές στους πληθυσµούς των ενδογενών βακτηρίων του στοµάχου επιτρέπουν στο C. difficile να αυξηθεί µε αποτέλεσµα την παραγωγή τοξινών που προκαλούν διάρροια

Μεταβολές των πληθυσµών των µικροβιακών κοινωνιών αποτελούν δείκτες και σχετίζονται µε : έλλειψη βιταµινών και µειωµένη απορρόφηση θρεπτικών συστατικών διάφορες µορφές καρκίνου (καρκίνος της µήτρας, νόσος του Crown)

Μικροβιακή ποικιλότητα και Γεωργία - Βακτήρια του εδάφους Συµβιωτική αζωτοδέσµευση (Rhizobium and Bradyrhizobium) Ελέυθερη αζωτοδέσµευση (Azotobacter, Azospirillum) Ενδοφυτική αζωτοδέσµευση (Gluconobacter diazotrophicus) Βιοέλεγχος φυτοπαθογόνων στα ριζικά συστήµατα Παρουσία ή απουσία σηµαντικών πληθυσµών του εδάφους αποτελεί δείκτη της «υγείας» του και της παραγωγικότητας, αφού επιδρούν άµεσα στην ανάπτυξη των καλλιεργούµενων φυτικών ειδών

Μικροβιακή ποικιλότητα και Γεωργία - Ερηµοποιηµένο έδαφος - Έδαφος εντατικής καλλιέργειας - Αµειψισπορά - Βιολογική καλλιέργεια Καλλιεργούµενα εδάφη µε υψηλή µικροβιακή ποικιλότητα : -Έχουν µικρότερες ενεργειακές απαιτήσεις εξαιτίας της ταχύτερης ανακύκλωσης των θρεπτικών συστατικών του εδάφους - Είναι περισσότερο «σταθερά» αφού το οργανικό υλικό µετατρέπεται ταχύτερα σε χουµικό υλικό - Παρουσιάζουν αυτάρκεια (λίπανση, αερισµός, υδατοχωρητικότητα)

ΓΤΟ Το Συµβούλιο των Υπουργών Γεωργίας της Ευρωπαϊκής Ένωσης θεσµοθέτησε ως επιτρεπόµενο όριο γενετικής τροποποίησης για τα οργανικά προϊόντα το 0,9%

Μικροβιακή Ποικιλότητα και Βιοεξυγίανση Βιοεπανόρθωση : εκµετάλλευση µικροοργανισµών µε αποδεδειγµένη βιοαποικοδοµητική δραστηριότητα έναντι πετρελαϊκών υδρογονανθράκων Μικροοργανισµοί που έχουν υποστεί επιλεκτική πίεση εµφανίζουν αυξηµένη βιοαποικοδοµητική ικανότητα έναντι : - Πετρελαϊκών υδρογονανθράκων - Πολυαρωµατικών και αλογονοµένων καταλοίπων - Εντοµοκτόνων - Φυτοφαρµάκων

Η µελέτη της µικροβιακής ποικιλότητας σε επιβαρυµένες περιοχές χρησιµοποιείται : 1. Ως δείκτης της πορείας βιοαποικοδόµησης στο 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 περιβάλλον (εκτίµηση της φάσης αποικοδόµησης του αποβλήτου) 2. Για τον εντοπισµό ειδώνπουσχετίζονταιµε αποικοδόµηση διαφορετικών τύπων αποβλήτων 3. Για τον προσδιορισµό του κυρίαρχου πληθυσµού σε κάθε φάση αποικοδόµησης, οοποίοςµπορεί να χρησιµοποιηθεί στη διαδικασία εµπλουτισµού του εδάφους µε στόχο την επιτάχυνση της φυσικής διαδικασίας

2, 3 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 4, 5 6, 7

Μικροβιακή Ποικιλότητα και Βιοτεχνολογία 1. Παραγωγή βιοενεργών ενώσεων - Περίπου το 80 % των αντιβιοτικών που διακινούνται από την παγκόσµια φαρµακοβιοµηχανία παράγονται από βακτήρια (Bacillus, Actinobacteria) - Αυξανόµενες ανάγκες εξαιτίας δηµιουργίας ανθεκτικών στελεχών - Ανάγκη για φυσικά «εντοµοκτόνα» και «ζιζανιοκτόνα» που δεν επιβαρύνουν το περιβάλλον

To 70% των γνωστών αντιβιοτικών παράγεται από στρεπτοµύκητες

Στόχος : ACTAPHARM (EU Project 2001 2004) ανάπτυξη µοριακών εργαλείων για τη σάρωση µεγάλου αριθµού περιβαλλοντικών δειγµάτων και τον εντοπισµό ενδιαιτηµάτων µε υψηλή ποικιλότητα πιθανών παραγωγών στελεχών σχεδιασµός ειδικών µορίων «ανιχνευτών» για τον εντοπισµό παραγωγών στελεχών σε γονιδιωµατικές βιβλιοθήκες από επιλεγµένα περιβάλλοντα επιλογή βιοχηµικών και χηµικών µεθόδων για την ανίχνευση νέων βιοενεργών ενώσεων σε καλλιέργειες παραγωγών στελεχών

Ένα σηµαντικό αποτέλεσµα : Το στέλεχος Streptomyces sp. Acta 1383 Πολυπαραγωγικό στέλεχος Αποµόνωση από ριζόσφαιρα του φυτού Ebenus sibthorpii στο δάσος της Καισαριανής Παράγει τρεις νέες βιοενεργές ενώσεις που ανήκουν στην οµάδα των fluostatins

mau A-Komponenten 120 100 B3 mau 200 175 DAD1 A, Sig=210 DAD1 B, Sig=230 DAD1 C, Sig=260 DAD1 D, Sig=280 DAD1 E, Sig=310 DAD1 F, Sig=360 DAD1 G, Sig=435 DAD1 H, Sig=500 80 60 mau 40 80 B-Komponenten 20 60 0 250 300 350 400 500 450 550 nm 40 A1 B2 20 150 0 250 mau B4 125 A3 350 400 450 500 800 600 75 C B1 400 200 50 0 200 250 300 350 400 450 500 550 nm 25 0 2 4 6 8 10 550 nm Prof. Dr. Hans Peter Fiedler 1000 100 300 C-Komponente 1200 12 HPLC-DAD ανάλυση 14 min

Το στέλεχος Streptomyces sp. Acta 1362 Αποµόνωση από ριζόσφαιρα του φυτού Pinus brutia από δάσος της Κρήτης Παράγει δύο νέα πολυκετίδια τα grecoketides A and B, που ανήκουνστηνοµάδα των naphthoquinones grecoketide A grecoketide B

Μικροβιακή ποικιλότητα και Βιοτεχνολογία 2. Παραγωγή θερµοσταθερών ενζύµων - Ένζυµα υψηλής απόδοσης από θερµόφιλους µικροοργανισµούς (Bacillus, Geobacillus) - υνατότητα χρήσης και εφαρµογών στη βιοµηχανία τροφίµων, χηµικών, απορρυπαντικών µε χαµηλό κόστος

ΠΥΘΑΓΟΡΑΣ ΙΙ (ΥΠΕΠΘ 2005 2006) Στόχος : ανάπτυξη στρατηγικής για τον εντοπισµό στελεχών µε δυνατότητα παραγωγής θερµοσταθερών ενζύµων (λιπάσες, αµυλάσες, ξυλανάσες) σχεδιασµός ειδικών µορίων «ανιχνευτών» για την επιλογή ακραίων περιβαλλόντων µε υψηλή βιοποικιλότητα των γενών Bacillus και Geobacillus επιλογή βιοχηµικών µεθόδων για τον έλεγχο της ποσότητας και σταθερότητας των παραγόµενων ενζύµων βελτιστοποίηση της παραγωγής σε επιλεγµένα στελέχη

Ανάλυση της µικροβιακής ποικιλότητας σε ακραία περιβάλλοντα Πλάκα Νέα Καµένη Παλαιά Καµένη

Μοριακή ανίχνευση γονιδίων ξυλανάσης σε θερµόφιλα στελέχη του γένους Geobacillus οκιµασία ανάπτυξης σε θρεπτικό υπόστρωµαπου περιέχει ξυλάνη ως µοναδική πηγή άνθρακα στους 60 ο C 400 bp

By which one sees an imperishable entity in all begins and undivided among the divided then that the knowledge is pure. But if one merely sees the diversity of things with their divisions and limitations, without the truth, then that knowledge is merely an ignorance The Bhagavad Gita, Chapter XVIII