ΑΥΤΟΜΑΤΟΣ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΣΤΑΜΙΝΗΣ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΨΑΡΙΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΩΝ ΔΙΑΔΟΧΙΚΩΝ ΕΓΧΥΣΕΩΝ (SIA)

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΠΟ ΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΔΙΑΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ» ΑΥΤΟΜΑΤΟΣ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΣΤΑΜΙΝΗΣ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΨΑΡΙΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΩΝ ΔΙΑΔΟΧΙΚΩΝ ΕΓΧΥΣΕΩΝ (SIA) ΔΕΔΑ ΟΛΓΑ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ Π.Θ. ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Α.Π.Θ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2012

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΥΤΟΜΑΤΟΣ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΣ ΦΘΟΡΙΣΜΟΜΕΤΡΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΣΤΑΜΙΝΗΣ ΣΕ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΨΑΡΙΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΩΝ ΔΙΑΔΟΧΙΚΩΝ ΕΓΧΥΣΕΩΝ (SIA) ΔΕΔΑ ΟΛΓΑ ΒΙΟΧΗΜΙΚΟΣ Π.Θ. ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: ΛΕΚΤΟΡΑΣ Π.Δ.ΤΖΑΝΑΒΑΡΑΣ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΛΕΚΤΟΡΑΣ κ. Π.Δ. ΤΖΑΝΑΒΑΡΑΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ κ. Δ.Γ. ΘΕΜΕΛΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ κ. Ι.Ν. ΠΑΠΑΔΟΓΙΑΝΝΗΣ

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία αναπτύχθηκε μια μέθοδος για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε δείγματα τροφίμων, η οποία αυτοματοποιεί πλήρως την επίσημη μέθοδο, βελτιώνοντας ταυτόχρονα και τα αναλυτικά χαρακτηριστικά, όπως η εκλεκτικότητα. Η προτεινόμενη μέθοδος βασίζεται στην αυτόματη τεχνική της διαδοχικής έγχυσης του δείγματος σε ροή (Sequential Injection Analysis, SIA). Η εργασία απαρτίζεται από δύο μέρη, το θεωρητικό και το πειραματικό. Στο θεωρητικό μέρος, περιγράφονται αρχικά, οι βιογενείς αμίνες στα τρόφιμα. Δίνεται ιδιαίτερη έμφαση στην ισταμίνη και στην παρουσία της στα ψάρια, καθώς επίσης και στη σπουδαιότητα του προσδιορισμού της σε δείγματα τροφίμων. Στη συνέχεια καταγράφονται όλες οι αρχές που διέπουν τις τεχνικές FIA και SIA και επεξηγείται ακόμη η διαδικασία της παραγωγοποίησης. Στο τέλος παρουσιάζεται μια βιβλιογραφική ανασκόπηση των εργασιών που ανέπτυξαν και εφάρμοσαν μεθόδους προσδιορισμού της ισταμίνης σε υποστρώματα τροφίμων. Στο πειραματικό μέρος, παρουσιάζεται λεπτομερώς όλη η πειραματική διαδικασία για την ανάπτυξη της μεθόδου, συμπεριλαμβανομένων των πειραμάτων για την επιλογή όλων των παραμέτρων της και της εφαρμογής της στα πραγματικά δείγματα. Τέλος, γίνεται η εκτίμηση των αποτελεσμάτων. Το πειραματικό μέρος της εργασίας έλαβε χώρα στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, του τμήματος Χημείας, της Σχολής Θετικών Επιστημών του Αριστοτέλειου Πανεπιστήμιου Θεσσαλονίκης από τον Σεπτέμβριο του 2011 μέχρι τον Απρίλιο του 2012. Επιβλέπων της παρούσας μεταπτυχιακής διπλωματικής εργασίας ήταν ο Λέκτορας του Τμήματος κ. Παρασκευάς Δ. Τζαναβάρας. Τον ευχαριστώ θερμά, για το ενδιαφέρον θέμα που μου πρότεινε, για την πολύτιμη καθοδήγησή του από την πρώτη μέρα των πειραμάτων και σε όλη την διάρκεια τους. Τον ευχαριστώ ακόμη, για την καθημερινή παρουσία του, για τον ευχάριστο κλίμα στο εργαστήριο και για τις εύστοχες παρατηρήσεις του, σε όλη την πειραματική διαδικασία. Επίσης, πρέπει να αναφέρω την καθοριστικής σημασίας επιστημονική υποστήριξή του κατά την συγγραφή της εργασίας στην ολότητα της. Ιδιαίτερες ευχαριστίες χρωστώ στον Καθηγητή του Τμήματος κ. Δημήτριο Γ. Θεμελή, για την συνολική καθοδήγησή του, την αμέριστη συμπαράστασή του, σε όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών και κατά την εκπόνηση της διπλωματικής μου εργασίας. Τον ευχαριστώ ιδιαίτερα, αφού ήταν πάντα πρόθυμος να παρέχει το πλούσιο iii

επιστημονικό του υπόβαθρο και τις οξυδερκείς παρατηρήσεις του και τις πολύτιμες συμβουλές του. Ευχαριστώ τον Καθηγητή του Τμήματος κ. Ι.Ν. Παπαδογιάννη, μέλος της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, για τις ουσιαστικές παρατηρήσεις του στην εξέταση της παρούσας διπλωματικής εργασίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω την Υποψήφια Διδάκτωρ κα Καρακώστα Θεανώ, μου με εξοικείωσε με το περιβάλλον του εργαστηρίου και που ήταν οποιαδήποτε στιγμή πρόθυμη να μου παρέχει απλόχερα τη βοήθειά της. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τη μητέρα μου, τη γιαγιά μου και τον παππού μου, που με τον αφανή αγώνα τους, στηρίζουν κάθε μου προσπάθεια, κάθε μου επιθυμία και στέκονται πάντα στο πλευρό μου, το φίλο μου και όλους τους φίλους και φίλες μου για την ηθική τους συμπαράσταση. Δέδα Όλγα Θεσσαλονίκη, 2012 iv

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΕΦ. 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 ΚΕΦ. 2 ΒΙΟΓΕΝΕΙΣ ΑΜΙΝΕΣ 3 2.1. ΒΙΟΓΕΝΕΙΣ ΑΜΙΝΕΣ ΣΤΑ ΤΡΟΦΙΜΑ 4 ΚΕΦ. 3 ΙΣΤΑΜΙΝΗ 6 3.1 ΦΥΣΙΚΕΣ - ΧΗΜΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ 6 3.2. ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ 7 3.3. ΙΣΤΑΜΙΝΗ ΣΤΑ ΤΡΟΦΙΜΑ 8 3.4 ΙΣΤΑΜΙΝΗ ΣΤΑ ΨΑΡΙΑ 9 ΚΕΦ. 4 ΑΥΤΟΜΑΤΙΣΜΟΣ ΣΤΟ ΑΝΑΛΥΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 11 4.1. ΑΝΑΓΚΗ ΓΙΑ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΣΗ - ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ 12 4.2 ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΟΧΙΚΗΣ ΕΓΧΥΣΗΣ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΣΕ ΡΟΗ SIA 13 4.2.1. Ιστορική Αναδρομή 13 4.2.2. Βασικές Αρχές Λειτουργίας 14 4.2.3. Οργανολογία ενός Αναλυτή SIA 17 4.2.4. Τυπικά Στάδια Κύκλου Ανάλυσης με τη SIA 18 4.2.5 Αναχαίτιση Ροής σε Συστήματα SIA (STOPPED FLOW -SIA) 18 4.2.6. Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα SIA 20 ΚΕΦ. 5 ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗ 21 ΚΕΦ. 6 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ 24 6.1. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΣΤΑΜΙΝΗΣ ΜΕ FIA/SIA 24 6.2. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΣΤΑΜΙΝΗΣ ΜΕ ΑΛΛΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ 32 ΚΕΦ. 7 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 37 v

ΚΕΦ. 8 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ 39 ΚΕΦ. 9 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ - ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ 40 9.1. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ 40 9.2. ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ 41 ΚΕΦ. 10 ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ 43 ΚΕΦ. 11 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΣΤΑΜΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΗ ΜΕΘΟΔΟ SIΑ 44 ΚΕΦ. 12 ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΑΦΟΡΑΣ 47 ΚΕΦ. 13 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 48 13.1. ΑΡΧΗ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΧΗΜΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ 48 13.2. ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ 50 13.3. ΜΕΛΕΤΗ ΧΗΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ 53 13.4. ΑΝΑΛΥΤΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΜΕΘΟΔΟΥ 61 13.5. ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ 66 ΚΕΦ. 14 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 69 ΚΕΦ. 15 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 71 ΚΕΦ. 16 ABSTRACT 72 ΚΕΦ. 17 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 73 vi

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΙΝΑΚΩΝ Πίνακας 2.1. Βιογενείς αμίνες, που συναντούνται στα τρόφιμα και τα πρόδρομά τους αμινοξέα. 5 Πίνακας 3.1. Βαθμός διαταραχής ανάλογα με τη δόση ισταμίνης. 10 Πίνακας 6.1. Προσδιορισμός ισταμίνης με τις τεχνικές FIA/SIA. 30 Πίνακας 6.1 συνέχεια. Προσδιορισμός ισταμίνης με τις τεχνικές FIA/SIA. 31 Πίνακας 6.2. Προσδιορισμός ισταμίνης με τεχνικές HPLC. 34 Πίνακας 6.2 συνέχεια. Προσδιορισμός ισταμίνης με τεχνικές HPLC. 35 Πίνακας 6.3. Προσδιορισμός ισταμίνης με διάφορες τεχνικές. 36 Πίνακας 9.1. Αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν και τα χαρακτηριστικά τους. 40 Πίνακας 11.1. Αναλυτικά στάδια κύκλου ανάλυσης 46 Πίνακας 13.1. Αρχικές τιμές χημικών και οργανολογικών παραμέτρων. 51 Πίνακας 13.2. Μελέτη των χημικών και οργανολογικών παραμέτρων. 60 Πίνακας 13.3. Εκλεκτικότητα της προτεινόμενης μεθόδου. 63 Πίνακας 13.4. Ακρίβεια της προτεινόμενης μεθόδου. 65 Πίνακας 13.5. Ανάλυση πραγματικών δειγμάτων. 67 vii

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΧΗΜΑΤΩΝ Σχήμα 3.1. Ταυτομερείς μορφές ισταμίνης σε υδατικό διάλυμα. 6 Σχήμα 3.2. Μετατροπή ιστιδίνης σε ισταμίνη με αποκαρβοξυλάση ιστιδίνης. 6 Σχήμα 4.1. Τυπικό διάγραμμα ροής αναλυτή SIA. 16 Σχήμα 4.2. Αρχή λειτουργίας της SIA. 16 Σχήμα 4.3. Προφίλ ζώνης του δείγματος με εφαρμογή αναχαίτισης της ροής. 19 Σχήμα 4.4. Τυπικό γράφημα εφαρμογής αναχαίτισης της ροής σε ένα σύστημα SIA / FIA. 19 Σχήμα 5.1. Συντακτικός τύπος της ο φθαλαδιαλδεΰδης (ΟΡΑ). 23 Σχήμα 6.1. Σχηματική άποψη της διάταξης SIA-LOV για τον προσδιορισμό της ισταμίνης με χρήση εκλεκτικού ηλεκτροδίου. 25 Σχήμα 6.2. Σχηματική απεικόνιση της ηλεκτροχημικής κυψελίδας. 25 Σχήμα 6.3. Σχηματική απεικόνιση του διαγράμματος ροής για τον αμπερομετρικό προσδιορισμό της ισταμίνης. 26 Σχήμα 6.4. Η διάταξη FIA για τον προσδιορισμό της ισταμίνης. 28 Σχήμα 11.1. Οργανολογική διάταξη αναλυτή SIA για τον προσδιορισμό της ισταμίνης. 44 Σχήμα 11.2. Σχηματική απεικόνιση του κύκλου ανάλυσης για τον προσδιορισμό της ισταμίνης με την τεχνική SIA 45 Σχήμα 13.1. Μηχανισμός αντίδρασης της ισταμίνης με την ΟΡΑ. 48 viii

Σχήμα 13.2. Επίδραση της ακολουθίας ανάμιξης των ζωνών των αντιδραστηρίων και του δείγματος στην ευαισθησία και την εκλεκτικότητα της μεθόδου. 52 Σχήμα 13.3. Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας του ΝαΟΗ. 54 Σχήμα 13.4. Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της ΟΡΑ. 54 Σχήμα 13.5. Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας του H 3 PO 4. 55 Σχήμα 13.6. Επίδραση του χρόνου αντίδρασης με αναχαίτιση της ροής στο σπείραμα συγκράτησης. 56 Σχήμα 13.7. Επίδραση του όγκου του H 3 PO 4. 57 Σχήμα 13.8. Επίδραση του όγκου του δείγματος. 58 Σχήμα 13.9. Επίδραση του μήκους του σπειράματος αντίδρασης. 58 Σχήμα 13.10. Επίδραση του κλάσματος μάζας του τριχλωροξικού οξέος στην ευαισθησία της προτεινόμενης μεθόδου. 59 Σχήμα 13.11. Καμπύλη βαθμονόμησης για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε υδατικά διαλύματα. 61 Σχήμα 13.12. Διάγραμμα υπολοίπων (residuals) για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε υδατικά διαλύματα. 62 Σχήμα 13.13. Αντιπροσωπευτικές κορυφές για τον προσδιορισμό της ισταμίνης με την προτεινόμενη μέθοδο SIA. 63 Σχήμα 13.14. Σύγκριση της προτεινόμενης μεθόδου με μεθόδους αναφοράς ως προς τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε δείγματα ψαριών. 68 ix

ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ DAO Diamine Oxidase Οξειδάση της διαμίνης FDA Food and Drug Administration Οργανισμός Τροφίμων και Φαρμάκων FIA Flow Injection Analysis Ανάλυση με έγχυση του δείγματος σε συνεχή ροή FLD Fluorescence Detector Φθορισμομετρική Ανίχνευση GC Gas Chromatography Χρωμογραφία Αερίου HC Holding Coil Σπείραμα Παραμονής HIM Histamine Ισταμίνη HIS Histidine Ιστιδίνη HMT Histone Methyltransferase Ν-μεθυλοτρανσφεράση HPLC High-Performance Liquid Chromatography Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης IEC Ion Exchange Chromatography Χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής ITP Isotachophoresis Ισοταχοφόρηση IUPAC NBD-Cl NQS International Union of Pure and Applied Chemistry 4-Chloro-7-nitrobenzofurazan 1,2-Naphthoquinone-4- sulphonate Διεθνής Ένωση Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας OPA Phthaldialdehyde ο-φθαλαδιαλδεΰδη RC Reaction Coil Σπείραμα αντίδρασης SIA Sequential injection analysis Διαδοχική έγχυση του δείγματος σε ροή SI-LOV Sequential Injection Lab-On- Valve TCA Trichloroacetic acid Τριχλωροξικό οξύ TLC Thin layer chromatography Χρωματογραφία Λεπτής Στιβάδας ΜΑΟ Monoamine Oxidase Οξειδάση μονοαμίνης x

xi

ΚΕΦ. 1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η προσπάθεια για βελτιστοποίηση των ήδη υπαρχουσών αναλυτικών μεθόδων από άποψη ευαισθησίας, ακρίβειας, επαναληψιμότητας, μείωσης του χρόνου και του κόστους ανάλυσης και ταυτόχρονα μερικής ή ολικής αντικατάστασης του ανθρώπινου παράγοντα σε αναλύσεις ρουτίνας οδήγησε στην έρευνα για την αυτοματοποίηση των αναλυτικών τεχνικών. Η έρευνα αυτή είχε σαν αποτέλεσμα την εξέλιξη ενός σημαντικού κλάδου της αναλυτικής χημείας. Η τεχνική που κυριάρχησε αρχικά και μονοπώλησε την πρωτοκαθεδρία στην αυτοματοποιημένη ανάλυση ήταν αυτή της αεροδιαχωριζόμενης ροής. Όταν μερικά χρόνια αργότερα εμφανίστηκαν η τεχνική αναλύσεων με εισαγωγή του δείγματος σε συνεχή ροή (FIA) και η διαδοχική έγχυση του δείγματος σε ροή (SIA) οριοθετήθηκε μια νέα εποχή στις αυτοματοποιημένες μεθόδους αναλύσεων. Οι παραπάνω τεχνικές στηρίζονται στη χρησιμοποίηση μη διαχωριζόμενων ρευμάτων αντιδραστηρίων και δείγματος και εισήγαγαν σημαντικές βελτιώσεις, όπως η αυξημένη συχνότητα δειγματοληψίας και αναλύσεων, η άμεση λήψη αποτελεσμάτων, η ευελιξία της ανάλυσης και το μειωμένο κόστος ανάλυσης. Πάνω από όλα η ελεγχόμενη διασπορά της ζώνης του δείγματος σε συνδυασμό με τον επαναλήψιμο χρόνο από την εισαγωγή του δείγματος μέχρι την είσοδό του στον ανιχνευτή κατέστησαν δυνατή τη λήψη αξιόπιστων αποτελεσμάτων ακόμα και όταν στο σύστημα της αντίδρασης δεν έχει προλάβει να επιτευχθεί κατάσταση φυσικής και χημικής ισορροπίας. Στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία περιγράφεται η ανάπτυξη μιας αυτοματοποιημένης αναλυτικής μεθόδου για τον προσδιορισμό ισταμίνης, χρησιμοποιώντας τη διαδοχική έγχυση του δείγματος σε ροή (SIA). Η ισταμίνη είναι η πιο τοξική αμίνη που έχει ανιχνευτεί στα τρόφιμα. Στα ψάρια, η ισταμίνη παράγεται σε είδη της οικογένειας Scombroidae όπως ο τόνος και σχετίζεται με μία μη-μολυσματική μορφή τροφικής ασθένειας (scombroid poisoning). Με βάση τις συγκεντρώσεις που βρέθηκαν σε προϊόντα τροφίμων που σχετίζονται με την ισταμινική δηλητηρίαση, επίπεδα ισταμίνης πάνω από 500-1.000 mg / kg θεωρούνται δυνητικά επικίνδυνα για την ανθρώπινη υγεία. Η Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων των Η.Π.Α. για να διασφαλίσει την ασφαλή κατανάλωση των ψαριών της οικογένειας scombroid, καθιέρωσε ως αποδεκτό επίπεδο για την ισταμίνη αυτό των 5 mg / 100 g δείγματος. Στη διεθνή βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί πολλές μέθοδοι για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε δείγματα τροφίμων, οι οποίες κάνουν χρήση ευρείας γκάμας αναλυτικών τεχνικών (χρωματογραφία υγρού και αερίου, ηλεκτροφόρηση, χρωματογραφία λεπτής 1

στιβάδας κλπ.). Η πιο ευρέως διαδεδομένη διαχωριστική τεχνική για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε δείγματα τροφίμων είναι η χρωματογραφία υγρού υψηλής απόδοσης (HPLC). Ο αριθμός των εργασιών για τον προσδιορισμό της ισταμίνης με αυτόματες μεθόδους συνεχούς ροής (FIA / SIA) σε διάφορα υποστρώματα είναι περιορισμένος. Η επίσημη μέθοδος AOAC 977.13 βασίζεται στην αντίδραση της ισταμίνης με το αντιδραστήριο ο- φθαλαδιαλδεΰδη (OPA) σε ισχυρά αλκαλικό περιβάλλον, προς σχηματισμό ενός έντονα φθορίζοντος προϊόντος. Για την εξάλειψη των μειονεκτημάτων της, στην παρούσα διπλωματική εργασία, προτείνεται μια εναλλακτική λύση με πολλά πλεονεκτήματα για τον αυτοματοποιημένο προσδιορισμό της ισταμίνης. 2

ΚΕΦ. 2 ΒΙΟΓΕΝΕΙΣ ΑΜΙΝΕΣ Οι βιογενείς αμίνες είναι σημαντικές αζωτούχες ενώσεις στα φυτικά, μικροβιακά και ζωικά κύτταρα [1]. Eίναι μη πτητικές αλειφατικές, αλεικυκλικές και ετεροκυκλικές οργανικές βάσεις χαμηλού μοριακού βάρους που παράγονται και στα τρόφιμα από βακτήρια μέσω των ελεύθερων αμινοξέων [2]. Σύμφωνα με το κριτήριο κατά Smith [3,4], από τις ενώσεις που ορίζονται ως «βιογενείς αμίνες» εξαιρούνται εκείνες που έχουν καρβοξυλική ομάδα στο μόριό τους, ακόμη κι αν πρόκειται για βασικές αζωτούχες ενώσεις. Ορισμένα αμινοξέα αποκαρβοξυλιώνονται ενζυμικά προς CO 2 και πρωτοταγείς βιογενείς αμίνες [5]. Η γενική αντίδραση έχει ως εξής: R-CH(NH 2 )-COOH R-CH 2 NH 2 + CO 2. Τα ένζυμα που καταλύουν την αντίδραση αποκαρβοξυλίωσης καλούνται αποκαρβοξυλάσες και έχουν ως συνένζυμο φωσφορική πυριδοξάλη, η οποία δρα με μέσω της δημιουργίας βάσης Schiff. 3

2.1. ΒΙΟΓΕΝΕΙΣ ΑΜΙΝΕΣ ΣΤΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Οι βιογενείς αμίνες βρίσκονται φυσιολογικά σε όλα τα τρόφιμα, όπως φαίνεται στον Πίνακα 2.1, που περιέχουν πρωτεΐνες ή ελεύθερα αμινοξέα και στα οποία συντρέχουν εκείνες οι συνθήκες που επιτρέπουν μικροβιακή ή βιοχημική δραστηριότητα. Η συνολική ποσότητα των διάφορων βιογενών αμινών που σχηματίζονται, εξαρτάται σημαντικά από τη φύση των τροφίμων και τους μικροοργανισμούς που υπάρχουν σε αυτά. Βιογενείς αμίνες, σε σημαντικές ποσότητες, βρίσκονται σε ένα ευρύ φάσμα τροφίμων, συμπεριλαμβανομένων των ψαριών, του κρέατος και των υποπροϊόντων τους, των γαλακτοκομικών προϊόντων και ιδιαίτερα των τυριών, των αλκοολούχων ποτών όπως οι οίνοι και οι ζύθοι, των διάφορων φρούτων και λαχανικών, των ξηρών καρπών και της σοκολάτας [6]. Όλες οι παραπάνω ομάδες τροφίμων μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες: Στα τρόφιμα τα οποία υπόκεινται σε ζυμώσεις και σ αυτά που δεν υπόκεινται [5]. Οι βιογενείς αμίνες έχουν μελετηθεί εκτενώς στα τρόφιμα. Πολλές πληροφορίες σχετικά με σχηματισμό και την εμφάνιση των βιογενών αμινών σε τρόφιμα δίνονται σε πρόσφατα άρθρα επισκόπησης [7-9]. Οι βιογενείς αμίνες μπορεί να είναι ενδογενούς προέλευσης, σε χαμηλές συγκεντρώσεις σε τρόφιμα που δεν έχουν υποστεί ζύμωση, όπως φρούτα, λαχανικά, κρέας, γάλα και ψάρια. Αντίθετα, υψηλές συγκεντρώσεις έχουν βρεθεί σε τρόφιμα που έχουν υποστεί ζύμωση, ως αποτέλεσμα της μόλυνσης από μικροοργανισμούς που δρουν αποκαρβοξυλιώνοντας τα ελεύθερα αμινοξέα [8]. Για παράδειγμα στο κρασί, διάφορα αμινοξέα μπορούν να αποκαρβοξυλιωθούν με αποτέλεσμα τη δημιουργία ισταμίνης, τυραμίνης, πουτρεσκίνης, καδαβερίνης, και φαινυλαιθυλαμίνης, με τις τρεις πρώτες να είναι οι πιο συχνά απαντούμενες μορφές [1]. Η κατανάλωση τροφίμων, που περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις βιογενών αμινών μπορούν να προκαλέσουν μερικές ανεπιθύμητες ενέργειες όπως πονοκεφάλους, υπόταση ή υπέρταση, ναυτία, αίσθημα καρδιακών παλμών και σε σοβαρές περιπτώσεις ενδοεγκεφαλική αιμορραγία ή ακόμα και θάνατο [1]. Η ποσότητα των βιογενών αμινών μπορεί επίσης να θεωρηθεί ως δείκτης του επιπέδου της μικροβιολογικής μόλυνσης στα τρόφιμα [10]. Για τους λόγους αυτούς, είναι σημαντικό να παρακολουθούνται τα επίπεδα βιογενών αμινών σε δείγματα τροφίμων [11]. 4

Πίνακας 2.1. Βιογενείς αμίνες, που συναντούνται στα τρόφιμα και τα πρόδρομά τους αμινοξέα. Πρόδρομο Αμινοξύ Ιστιδίνη Λυσίνη Τυροσίνη Τρυπτοφάνη Σερίνη Μεθειονίνη Αργινίνη Φαινυλαλανίνη Ασπαρτικό οξύ Γλουταμινικό οξύ Θρεονίνη Κυστεΐνη Ορνιθίνη Βιογενής Αμίνη Ισταμίνη Καδαβερίνη Τυραμίνη Τρυπταμίνη Αιθανολαμίνη Σπερμιδίνη / Σπερμίνη Αγματίνη / Πουτρεσκίνη 2-φαινυλαιθυλαμίνη β-αλανίνη γ-αμινο-βουτυρικό οξύ (GABA) 2-υδροξυ-προπυλαμίνη β-μερκαπτοαιθυλαμίνη Πουτρεσκίνη/ σπερμιδίνη 5

ΚΕΦ. 3 ΙΣΤΑΜΙΝΗ 3.1 ΦΥΣΙΚΕΣ - ΧΗΜΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ Η ισταμίνη σχηματίζει άχρωμους υγροσκοπικούς κρυστάλλους που λιώνουν στους 84 C. Διαλύεται εύκολα σε νερό ή αιθανόλη, αλλά όχι σε αιθέρα. Σε υδατικό διάλυμα η ισταμίνη υπάρχει σε δύο ταυτομερείς μορφές, όπως φαίνεται στο σχήμα 3.1. Η ισταμίνη έχει δύο βασικά κέντρα, την αλειφατική αμινομάδα και το άτομο αζώτου του ιμιδαζολικού δαχτυλίου που δεν είναι πρωτονιωμένο. Σε ουδέτερο ph, η αλειφατική αμινομάδα της ισταμίνης θα είναι πρωτονιωμένη (pk α 9,4), ενώ αντίθετα, το δεύτερο άτομο αζώτου του ιμιδαζολικού δακτυλίου όχι (pk α 5,8). Έτσι, η ισταμίνη απαντάται συνήθως ως φορτισμένο μονο-κατιόν. Η ισταμίνη προέρχεται από την αποκαρβοξυλίωση της ιστιδίνης, μια αντίδραση που καταλύεται από το ένζυμο αποκαρβοξυλάση της L-ιστιδίνης, όπως φαίνεται στο σχήμα 3.2. [12]. Σχήμα 3.1. Ταυτομερείς μορφές ισταμίνης σε υδατικό διάλυμα [12]. Σχήμα 3.2. Μετατροπή ιστιδίνης σε ισταμίνη με αποκαρβοξυλάση ιστιδίνης [12]. 6

3.2. ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ Η ισταμίνη συμμετέχει στην τοπική ανοσολογική απόκριση καθώς επίσης και στη ρύθμιση της φυσιολογικής λειτουργίας του εντέρου, ενώ δρα και ως νευροδιαβιβαστής [12]. Φυσιολογικά, υπάρχει σε όλους τους ιστούς του σώματός μας και παράγεται - όπως αναφέρθηκε και παραπάνω - από το αμινοξύ ιστιδίνη. Αποθήκες ισταμίνης είναι το δέρμα, ο γαστρεντερικός σωλήνας και οι πνεύμονες [13]. Η ισταμίνη αυξάνει τη διαπερατότητα των τριχοειδών αγγείων στα λευκά αιμοσφαίρια και σε ορισμένες πρωτεΐνες, διευκολύνοντας την εξουδετέρωση παθογόνων οργανισμών των μολυσμένων ιστών [12]. Ως μέρος της ανοσολογικής απάντησης σε παθογόνα, προκαλεί τη φλεγμονώδη αντίδραση. Η δράση της ισταμίνης ασκείται δια μέσου τριών διαφορετικών υποδοχέων, Η1, Η2, και Η3. Η δράση της ισταμίνης, κυρίως στους Η1-υποδοχείς, έχει ως αποτέλεσμα τις κλινικές εκδηλώσεις των αλλεργικών νόσων. Προκαλεί τοπικό οίδημα, ερυθρότητα του προσώπου και πονοκέφαλο. Το τοπικό οίδημα έπειτα γίνεται κόκκινο και στη συνέχεια δημιουργείται φυσαλίδα. Επίσης προκαλεί υπερλειτουργία των εξωκρινών αδένων (ιδρωτοποιών, γαστρικών κλπ.) [13]. 7

3.3. ΙΣΤΑΜΙΝΗ ΣΤΑ ΤΡΟΦΙΜΑ Η ισταμίνη είναι η πιο τοξική αμίνη που έχει ανιχνευτεί στα τρόφιμα π.χ. ψάρια, τυρί, προϊόντα κρέατος και οίνους [6]. Η τοξικότητά της εξαρτάται από διάφορους παράγοντες όπως [5]: α) τη συγκέντρωσή της στο τρόφιμο που καταναλώνεται. β) την ύπαρξη αμινών οι οποίες δρουν ως υποκινητές / ενισχυτές της τοξικότητας της ισταμίνης, όπως η τυραμίνη (η οποία παρεμποδίζει τη ΜΑΟ), η τρυπταμίνη (η οποία παρεμποδίζει τη DAO) και η 2-φαινυλαιθυλαμίνη η οποία παρεμποδίζει τις ΗΜΤ και DAO). γ) τη δράση των αμινοξειδασών π.χ. ΜΑΟ και DAO δ) τη δράση και διαθεσιμότητα της Ν-μεθυλοτρανσφεράσης (ΗΜΤ), η οποία μεθυλιώνει την ισταμίνη, μετατρέποντάς την σε Ν-μεθυλοϊσταμίνη και η οποία με τη σειρά της οξειδώνεται από τη ΜΑΟ. ε) τη λήψη ορισμένων φαρμάκων όπως αντιϊσταμινικά και φάρμακα κατά της ελονοσίας, τα οποία παρεμποδίζουν τη δράση των ενζύμων μεταβολισμού της ισταμίνης. στ) από τη φυσική κατάσταση του κάθε ατόμου. Εκτός από την τοξικότητα, βασικός λόγος για τον προσδιορισμό της ισταμίνης στα τρόφιμα είναι η χρησιμοποίηση της ως δείκτες ποιότητας. Μερικές από τις βασικές εφαρμογές της ανάλυσης της ισταμίνης είναι: ο έλεγχος ποιότητας των πρώτων υλών, των ενδιάμεσων και των τελικών προϊόντων, η παρακολούθηση της διαδικασίας της ζύμωσης, ο έλεγχος διαδικασιών, η έρευνα και η ανάπτυξη. 8

3.4 ΙΣΤΑΜΙΝΗ ΣΤΑ ΨΑΡΙΑ Στα ψάρια, η ισταμίνη παράγεται σε είδη της οικογένειας Scombroidae όπως ο τόνος και το σκουμπρί, στη σαρδέλα και στις ρέγγες [14-16]. Η υψηλή περιεκτικότητα σε ισταμίνη σε αυτά τα είδη, εξηγείται από τα υψηλά επίπεδα ελεύθερης ιστιδίνης [17]. Στα ψάρια, συγκεκριμένα βακτήρια είναι ικανά να παράγουν ισταμίνη χρησιμοποιώντας ένζυμα μη σχετιζόμενα με αυτά που βρέθηκαν σε ζώα. Σαν αποτέλεσμα έχει προσδιοριστεί μία μημολυσματική μορφή τροφικής ασθένειας (scombroid poisoning), η οποία οφείλεται αποκλειστικά στην παραγωγή της ισταμίνης από βακτήρια σε χαλασμένα ψάρια και σχετικά προϊόντα [18-22]. Ο χρόνος εμφάνισης του συγκεκριμένου είδους δηλητηρίασης κυμαίνεται από μερικά λεπτά έως 3 ώρες μετά από την κατανάλωση του τροφίμου που περιέχει ισταμίνη σε επίπεδα άνω του 0,1 % [23]. Τα πιο συνηθισμένα συμπτώματα της δηλητηρίασης αυτής είναι ζάλη, λιποθυμία, φαγούρα, αίσθημα καύσου στο στόμα και η ανικανότητα κατάποσης. Τα θύματα συνήθως ανακάμπτουν μέσα σε 8 ώρες [2,21]. Η τοξικότητα της ισταμίνης στα ψάρια οφείλεται στην αλληλεπίδρασή της με δύο τύπους υποδοχέων, Η1 και Η2, της κυτταρικής μεμβράνης σε ανθρώπους και ζώα. Επιφέρει διαστολή στα περιφερειακά αγγεία, τα τριχοειδή αγγεία και τις αρτηρίες, προκαλώντας έτσι υπόταση, εξάψεις και πονοκεφάλους. Οι συσπάσεις που προκαλούνται από την ισταμίνη στους εντερικούς λείους μύες, στις οποίες μεσολαβούν οι Η1 υποδοχείς, μπορεί να είναι υπεύθυνες για τις κράμπες στην κοιλιακή χώρα, τη διάρροια και τους εμετούς [20]. Με βάση τις συγκεντρώσεις που βρέθηκαν σε προϊόντα τροφίμων που σχετίζονται με την ισταμινική δηλητηρίαση, επίπεδα ισταμίνης πάνω από 500-1.000 mg / kg θεωρούνται δυνητικά επικίνδυνα για την ανθρώπινη υγεία. Στον Πίνακα 3.1 φαίνεται ο βαθμός της διαταραχής, ανάλογα με τη δόση της ισταμίνης. Ακόμη λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με την τοξική δόση άλλων βιογενών αμινών. Για παράδειγμα, χαμηλότερες τιμές, της τάξης των 100-800 mg / kg για τυραμίνη και 30 mg / kg για φαινυλαιθυλαμίνη έχουν αναφερθεί ως τοξικές [6]. Για την εκτίμηση των τοξικών επιπέδων των βιογενών αμινών, πρέπει να εξεταστεί η ποσότητα των τροφών που καταναλώνονται, η παρουσία άλλων αμινών σε τρόφιμα ή άλλα διατροφικά συστατικά, και η χρήση αλκοόλ και φαρμάκων. Μια επιπλέον ανησυχία προέκυψε σχετικά με τη χρήση νιτρωδών αλάτων σε ψυχράκαπνιστά προϊόντα, αφού δευτερογενείς αμίνες όπως η πουτρεσκίνη και η καδαβερίνη αντιδρούν με τα νιτρώδη άλατα και σχηματίζουν καρκινογόνες ουσίες [6,20,24,25]. 9

Πρόσφατα, η Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων των Η.Π.Α. (US-FDA) για να διασφαλίσει την ασφαλή κατανάλωση των ψαριών της οικογένειας scombroid, καθιέρωσε ως αποδεκτό επίπεδο για την ισταμίνη αυτό των 5 mg / 100 g δείγματος, (κανονισμός 21CFR123). Παράλληλα συνέστησε τη χρήση και άλλων στοιχείων για να κρίνει τη φρεσκότητα των ψαριών, όπως την παρουσία άλλων βιογενών αμινών που συνδέονται με την αποσύνθεση τους [26]. Αντίθετα, στην Ευρωπαϊκή Ένωση η μέγιστη επιτρεπτή μέση περιεκτικότητα των ψαριών που ανήκουν στις οικογένειες Scombridae και Scomberesocidae σε ισταμίνη είναι 10 mg / 100 g [25,27,28]. Πίνακας 3.1. Βαθμός διαταραχής ανάλογα με τη δόση ισταμίνης, [28]. Ήπια δηλητηρίαση 8-40 mg Μέτριας έντασης διαταραχές 70-1,000 mg Σοβαρά περιστατικά 1,500-4,000 mg 10

ΚΕΦ. 4 ΑΥΤΟΜΑΤΙΣΜΟΣ ΣΤΟ ΑΝΑΛΥΤΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ Η έννοια της «αυτοματοποίησης», όπως αυτή έχει οριστεί από την Επιτροπή Αναλυτικής ορολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC) [29], παρερμηνεύεται συχνά από πολλούς αναλυτικούς χημικούς, πιθανότατα γιατί ο ορισμός καθαυτός συμπεριλαμβάνει στη διατύπωσή του ορισμούς άλλων εννοιών, οι διαφορές των οποίων δεν είναι ούτε αυτές πλήρως κατανοητές. Για να δοθεί, επομένως ο ορισμός της «αυτοματοποίησης» κρίνεται σκόπιμο να δοθούν αρχικά οι ορισμοί όλων εκείνων των εννοιών που μπορεί να συγχέονται μεταξύ τους [30,31]. Σύμφωνα, λοιπόν, με την Επιτροπή Αναλυτικής ορολογίας της Διεθνούς Ένωσης Καθαρής και Εφαρμοσμένης Χημείας (IUPAC), «μηχανισμός» ονομάζεται ο κατάλληλος συνδυασμός των εξαρτημάτων, ένα τουλάχιστον από τα οποία έχει την δυνατότητα να παράγει έργο ή μπορεί να κινείται. Μια «μηχανή» είναι μια διάταξη που αποτελείται από έναν οι περισσότερους μηχανισμούς. Οι μηχανισμοί αυτοί είναι σε θέση να εκτελούν μια ή περισσότερες λειτουργίες. Σύμφωνα πάντα με την IUPAC με τον όρο «μηχανοποίηση» ορίζεται η χρησιμοποίηση μηχανών για την αντικατάσταση, βελτίωση, επέκταση και συμπλήρωση της ανθρώπινης προσπάθειας. Τα όργανα χωρίζονται σε δύο κατηγορίες. Τα «επιστημονικά όργανα», που είναι συσκευές που χρησιμοποιούνται για την παρατήρηση, μέτρηση ή έλεγχο μιας ιδιότητας που αντικαθιστά, επεκτείνει ή συμπληρώνει την ανθρώπινη ικανότητα, και τα «αναλυτικά όργανα», συσκευές που χρησιμοποιούνται για την εκτέλεση μιας αναλυτικής μεθόδου. Τα όργανα είναι δυνατό να αποτελούνται από έναν ή περισσότερους μηχανισμούς. «Αυτοματοποίηση», συνεπώς, καλείται η συνδυασμένη χρήση μηχανών και οργάνων με σκοπό την αντικατάσταση, τη βελτίωση, την επέκταση και τέλος την συμπλήρωση της ανθρώπινης προσπάθειας στην πραγματοποίηση μιας δεδομένης διεργασίας, κατά την οποία ένα τουλάχιστον βασικό στάδιο εκτελείται όχι από ανθρώπινη παρέμβαση αλλά από ένα σύστημα «ανάδρασης» (ανατροφοδότησης, feedback). Το σύστημα ανάδρασης είναι μια μηχανική ή ηλεκτρονική διάταξη που συνδυάζει την λήψη πληροφοριών, από διάφορους αισθητήρες, και την αποστολή εντολών τροποποιώντας τις επιμέρους λειτουργίες των οργάνων με σκοπό την παραγωγή συγκεκριμένου έργου. 11

4.1. ΑΝΑΓΚΗ ΓΙΑ ΑΥΤΟΜΑΤΟΠΟΙΗΣΗ - ΠΛΕΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Οι ολοένα αυξανόμενες απαιτήσεις για γρήγορες, αξιόπιστες και οικονομικές αναλύσεις πολλών και ταυτόχρονα διαφορετικής φύσεως δειγμάτων (βιολογικών, βιομηχανικών, γεωργικών, κλινικών, φαρμακευτικών και άλλα) κατέστησαν τις τελευταίες δεκαετίες επιτακτική την ανάγκη ανάπτυξης αυτοματοποιημένων αναλυτικών τεχνικών. Για τον λόγο αυτό δεν είναι λίγες οι ερευνητικές ομάδες, που έχουν στρέψει το ερευνητικό τους ενδιαφέρον προς την κατεύθυνση αυτή [31]. Οι στόχοι, που έπρεπε να επιτευχθούν, ήταν πολλοί, με αρχικό πάντα γνώμονα την αντικατάσταση της χειροκίνητης διαδικασίας. Ο σημαντικότερος ίσως λόγος που οδήγησε στην ανάπτυξη αυτοματοποιημένων τεχνικών ήταν η απελευθέρωση του ανθρώπινου δυναμικού από αναλύσεις ρουτίνας. Αυτό θα επέφερε σημαντικά οφέλη. Θα οδηγούσε όχι μόνο στον μεγαλύτερο δυνατό αριθμό αναλύσεων, αλλά και στην μεγαλύτερη ασφάλεια του προσωπικού, μιας και η έκθεσή του σε επικινδύνους και τοξικούς διαλύτες θα περιοριζόταν, με τον τρόπο αυτό, σημαντικά. Πολύπλοκες μεθοδολογίες μπορούν πλέον να πραγματοποιούνται σε σύντομο χρονικό διάστημα και με λιγότερο κοπιαστικές και επίπονες προκατεργασίες του δείγματος αλλά και πολύ πιο οικονομικά. Ο μεγάλος αριθμός αναλύσεων οδηγεί στην μείωση του κόστους τις κάθε επιμέρους ανάλυσης και το πλεονέκτημα αυτό γίνεται ακόμα σημαντικότερο όταν τα προς ανάλυση δείγματα είναι πολύτιμα ή περιορισμένης ποσότητας. Η ανάγκη για άμεση λήψη αναλυτικών αποτελεσμάτων και η βελτίωση της αναλυτικής διαδικασίας οδήγησαν και αυτές με τη σειρά τους στην αυτοματοποίηση των αναλυτικών διεργασιών. Ο περιορισμός της ανθρώπινης δράσης στις αναλύσεις οδηγεί στην εξάλειψη τυχαίων ή συστηματικών σφαλμάτων, που προέρχονται από τον ανθρώπινο παράγοντα, βελτιώνοντας, έτσι, την ακρίβεια και την επαναληψιμότητα των μετρήσεων. 12

4.2 ΤΕΧΝΙΚΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΟΧΙΚΗΣ ΕΓΧΥΣΗΣ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΣΕ ΡΟΗ SIA 4.2.1. Ιστορική Αναδρομή Η τεχνική των Aυτόματων Aναλύσεων με Έγχυση του Δείγματος σε Συνεχή Ροή (Flow injection analysis FIA) ανακαλύφθηκε κάπου στα μέσα του 1974 όταν οι Ruzicka και Hansen δούλευαν πάνω στην ανάπτυξη ενός αισθητήρα αερίων για τον προσδιορισμό ατμών αμμωνίας. Οι ερευνητές είχαν κατασκευάσει ένα κατάλληλο ηλεκτρόδιο, η αρχή λειτουργίας του οποίου βασιζόταν στη μέτρηση της μερικής πιέσεως του αερίου ύστερα από ανάμειξη του δείγματος με κινούμενο ρεύμα NaOH με την βοήθεια μιας περισταλτικής αντλίας. Η ανάμειξη των ρευμάτων γινόταν αμέσως πριν τον ανιχνευτή και οι παραγόμενοι ατμοί NH 3 ανιχνεύονταν στη συνέχεια από το ηλεκτρόδιο. Το πρόβλημα, όμως, ήταν η πολύ αργή απόκριση του αισθητήρα για δείγματα διαφορετικών συγκεντρώσεων. Σε μία στιγμή εκνευρισμού οι ερευνητές, με τη χρήση μιας απλής σύριγγας, εισήγαγαν απευθείας στο ρεύμα NaOH μια ποσότητα δείγματος ορισμένης συγκέντρωσης και προς μεγάλη τους έκπληξη παρατήρησαν την καταγραφή μιας κορυφής, η οποία ήταν επαναλήψιμη και ανάλογη της συγκεντρώσεως του προς ανάλυση συστατικού [32]. Χωρίς ακόμα να έχουν συνειδητοποιήσει την σημαντικότητα της ανακάλυψης τους, δημοσιεύουν στα 1975 την πρώτη τους εργασία [33] και μερικά χρόνια αργότερα δίνουν τον ορισμό της FIA στο πρώτο τους βιβλίο [34]. Σύμφωνα με τους ερευνητές, «Η FIA είναι μια τεχνική που βασίζεται στην έγχυση ενός υγρού δείγματος σε συνεχές, μη διακοπτόμενο, κινούμενο ρεύμα κατάλληλου υγρού. Το εγχυόμενο δείγμα σχηματίζει μια ζώνη, που οδηγείται στον ανιχνευτή, ο οποίος μετρά τη συνεχή μεταβολή μιας φυσικοχημικής παραμέτρου του δείγματος, καθώς αυτό διέρχεται από την κυψελίδα συνεχούς ροής». Με τον ορισμό αυτόν ορίστηκε από την πρώτη στιγμή η πρώτη βασική αρχή της FIA, που δεν είναι άλλη από την έγχυση του δείγματος σε μη διακοπτόμενο ρεύμα ροής. Παρόλαυτά, στην δεύτερη έκδοση, ο ορισμός της νέας τεχνικής διατυπώνεται ξανά από τους ερευνητές όπως παρακάτω: «FIA ονομάζεται η συλλογή πληροφοριών μέσω της βαθμίδωσης της συγκέντρωσης που δημιουργείται όταν μια αυστηρά καθορισμένη ζώνη δείγματος εγχυθεί και διασπαρθεί σε ένα μη διακοπτόμενο ρεύμα μεταφορέα» [32]. Η δεύτερη αυτή διατύπωση δεν αναιρεί την προηγούμενη αλλά δρα συμπληρωματικά της πρώτης, εισάγοντας και τη δεύτερη αρχή της FIA, που είναι η αυστηρά καθορισμένη και ελεγχόμενη διασπορά της ζώνης του δείγματος. Αυτή η αρχή, 13

συνεπώς δίνει τη δυνατότητα στον χρήστη για λήψη αποτελεσμάτων πριν ακόμα ολοκληρωθεί η αντίδραση και φτάσει σε κατάσταση, τόσο φυσικής όσο και χημικής, ισορροπίας. Οι βασικές αρχές της FIA είναι συνεπώς [31, 35]: 1. Ο αυστηρά καθορισμένος όγκος δείγματος, ο οποίος εγχύεται σε ρεύμα κατάλληλου μεταφορέα ή αντιδραστηρίου 2. Η συνεχής και μη διακοπτόμενη ροή των διαλυμάτων 3. Η ελεγχόμενη και επαναλήψιμη διασπορά της ζώνης του δείγματος. 4. Ο επαναλήψιμος χρόνο παραμονής του δείγματος στο σύστημα. Μια δεκαετία περίπου μετά την εισαγωγή της FIA στην πραγματικότητα της χημικής ανάλυσης, η αυξανόμενη απαίτηση κυρίως από τους χώρους της βιομηχανίας και της κλινικής χημείας για μια αυτοματοποιημένη τεχνική, με πιο απλά και ανθεκτικά μηχανικά μέρη, τα οποία να μην έχουν αυξημένες απαιτήσεις για συντήρηση αλλά ταυτόχρονα να δίνουν αξιόπιστες και γρήγορες μετρήσεις, οδήγησε στην γέννηση της «Τεχνικής της Διαδοχικής Έγχυσης του δείγματος σε Ροή» (Sequential Injection analysis, SIA) [36]. Η τεχνική αυτή αποτελεί ουσιαστικά τη δεύτερη γενιά της FIA, και ήρθε να επιλύσει τις δυσχέρειες και τα προβλήματα αυτής. Τα προβλήματα αυτά ήταν : 1. Η κατανάλωση μεγάλων όγκων αντιδραστηρίου, λόγω της συνεχούς λειτουργίας του οργάνου 2. Η συχνά απαιτούμενη βαθμονόμηση του συστήματος 3. Το υψηλό πολλές φορές κόστος συντήρησης των μηχανικών τμημάτων του συστήματος, όπως οι περισταλτικές αντλίες, αλλά και των αναλώσιμων τμημάτων, όπως τα κανάλια ροής που με το πέρασμα του χρόνου φθείρονται. 4. Η ανάγκη χρησιμοποίησης πολλών καναλιών και πολλές φορές περίπλοκων διατάξεων για την ανάμιξη των διαλυμάτων και την αντίδραση τους. 4.2.2. Βασικές Αρχές Λειτουργίας Από την αρχή έγινε κατανοητό ότι η νέα τεχνική ανήκει στην οικογένεια της FIA καθώς διέπεται από τις ίδιες αρχές (έγχυση δείγματος και αντιδραστηρίου, ελεγχόμενη διασπορά και επαναλήψιμος χρόνος από τη στιγμή της έγχυσης του δείγματος μέχρι την έξοδό του.) Η επιτυχία της νέας αυτής τεχνικής βασίζεται στον ακριβή έλεγχο τον δύο κινητικών διεργασιών που συμβαίνουν ταυτόχρονα, καθώς μετακινείται το δείγμα μέσα 14

στο κανάλι. Οι διεργασίες αυτές είναι από τη μία η φυσική διασπορά των ζωνών του δείγματος και τον αντιδραστηρίων και από την άλλη η χημική διεργασία σχηματισμού των προϊόντων, τα οποία οδηγούνται προς τον ανιχνευτή. Το επιπλέον χαρακτηριστικό της SIA που την διακρίνει από την FIA είναι η δυνατότητα αντιστροφής της ροής του δείγματος και του αντιδραστηρίου με τη βοήθεια της αντλίας και της βαλβίδας επιλογής πολλαπλών θέσεων, έτσι ώστε να μπορούν να πραγματοποιηθούν διάφορες χημικές αντιδράσεις, χωρίς να απαιτείται ο επανασχεδιασμός του πολλαπλού τμήματος ανάμειξης και αντιδράσεων, που απαιτείται στη FIA. Η καρδία επομένως του αναλυτή είναι η βαλβίδα πολλαπλής επιλογής. Οι περιφερειακές θύρες της βαλβίδας είναι συνδεδεμένες με τους περιέκτες των δειγμάτων, των αντιδραστηρίων και το σύστημα ανίχνευσης, ενώ η κεντρική θύρα συνδέεται μέσω ενός σπειράματος παραμονής (holding coil - HC) με κατάλληλη αντλία, με τη βοήθεια της οποίας μπορούμε να επιλέξουμε τη φορά της ροής των διαλυμάτων. Όταν η αντλία λειτουργεί προς τη μια κατεύθυνση αναρροφώνται, μέσω της βαλβίδας, συγκεκριμένοι όγκοι δείγματος και αντιδραστηρίων από τον εκάστοτε περιέκτη και οδηγούνταιστοιβάζονται στο σπείραμα παραμονής. Στη συνέχεια θέτουμε την αντλία σε λειτουργία, προς την αντίθετη κατεύθυνση αυτή τη φορά, και οι στοιβαγμένες ζώνες προωθούνται μέσω της ανάλογης θύρας της βαλβίδας προς το σύστημα ανίχνευσης. Η χημική αντίδραση πραγματοποιείται με διέλευση των ζωνών δια μέσω κατάλληλου σπειράματος, στο οποίο λαμβάνει χώρα επικάλυψη των ζωνών και σχηματισμός του επιθυμητού προϊόντος. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η μείωση κατανάλωσης όγκου δείγματος και αντιδραστηρίων και συνεπώς η μείωση του όγκου των παραγόμενων αποβλήτων. Ένα τυπικό διάγραμμα ροής SIA καθώς και η αρχή λειτουργίας της τεχνικής δίνονται στα σχήματα 4.1 και 4.2 αντίστοιχα. 15

Σχήμα 4.1. Τυπικό διάγραμμα ροής αναλυτή SIA. Σχήμα 4.2. Αρχή λειτουργίας της SIA [37]. (A) Έγχυση καθορισμένου όγκου δείγματος. (B)Έγχυση καθορισμένου όγκου αντιδραστηρίου - σχηματίζονται ευδιάκριτες ζώνες. (Γ) Έγχυση του διαλύματος του μεταφορέα ή δεύτερου διαλύματος αντιδραστηρίου (Δ) Αναστροφή της ροής - προώθηση προς τον ανιχνευτή. (E) Ανίχνευση καταγραφή κορυφής. 16

Συνοψίζοντας μπορούμε να πούμε ότι η SIA είναι μια τεχνική συνεχούς ροής που πραγματοποιείται με απόλυτα επαναλήψιμο χειρισμό των ζωνών του δείγματος και των αντιδραστηρίων σε συνθήκες μη θερμοδυναμικής ισορροπίας. 4.2.3. Οργανολογία ενός Αναλυτή SIA Τα βασικά τμήματα από τα οποία αποτελείται ένας αναλυτής SIA είναι: 1. Αντλία. Με τη βοήθεια της αντλίας πραγματοποιείται η αναρρόφηση των ζωνών των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων και στη συνέχεια, με αλλαγή της φοράς λειτουργίας της, πραγματοποιείται η προώθησή τους προς τον ανιχνευτή. Η λειτουργία της καθορίζεται από το κατάλληλο λογισμικό. Η λειτουργία της πρέπει να είναι πλήρως επαναλήψιμη και ακριβής. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων οι αντλίες που χρησιμοποιούνται σε συστήματα SIA είναι είτε περισταλτικές είτε τύπου σύριγγας. Μειονέκτημα των περισταλτικών αντλιών είναι ότι δεν είναι εφικτό να δώσουν ροές τελείως απαλλαγμένες από παλμούς, ενώ οι σωλήνες που χρησιμοποιούνται φθείρονται σχετικά εύκολα και δεν επιτρέπουν τη χρήση όλου του φάσματος των διαλυτών. Αντίθετα, οι αντλίες τύπου σύριγγας έχουν το μειονέκτημα της καθορισμένης χωρητικότητας, με αποτέλεσμα να απαιτείται περιοδικό ξαναγέμισμά τους με το διάλυμα του μεταφορέα. 2. Βαλβίδα πολλαπλής επιλογής. Έχουν συνήθως 6-10 θέσεις. Βασικό χαρακτηριστικό που πρέπει να διακρίνει μια βαλβίδα είναι οι μικροί νεκροί όγκοι ώστε να αποφεύγεται επιπλέον διασπορά των ζωνών όταν δεν είναι επιθυμητή. Η λειτουργία της βαλβίδας καθορίζεται και αυτή ηλεκτρονικά από το εγκατεστημένο λογισμικό στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. 3. Σπείραμα παραμονής (holding coil). Το σπείραμα αυτό τοποθετείται μεταξύ της αντλίας και της βαλβίδας επιλογής. Σε αυτό οδηγούνται και στοιβάζονται διαδοχικά και με τη σειρά που επιθυμεί ο χρήστης οι ζώνες των δειγμάτων και των αντιδραστηρίων πριν την προώθηση τους στον ανιχνευτή. Η χωρητικότητα του σπειράματος αυτού θα πρέπει να είναι ικανή, ώστε να αποτρέπεται η είσοδος των ζωνών δείγματος και αντιδραστηρίου στο διάλυμα του μεταφορέα και να αποφεύγεται η επιμόλυνσή του. 4. Σύστημα ανίχνευσης. Πρακτικά χρησιμοποιούνται όλα τα διαθέσιμα συστήματα ανίχνευσης τα οποία μπορούν να λειτουργήσουν σε συνθήκες συνεχούς ροής. 5. Λογισμικό ελέγχου. Η απαραίτητη χρήση κατάλληλου λογισμικού ελέγχου αποτελεί βασική διαφορά μεταξύ των τεχνικών FIA και SIA. Με το λογισμικό αυτό ελέγχονται 17

πλήρως όλες οι απαραίτητες λειτουργίες του αναλυτή (εισαγωγή δειγμάτων και αντιδραστηρίων, σειρά ανάμιξης, παροχές όγκου κ.α.). 4.2.4. Τυπικά Στάδια Κύκλου Ανάλυσης με τη SIA Ένας τυπικός κύκλος ανάλυσης με την τεχνική της SIA περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια: 1. Προώθηση του διαλύματος του μεταφορέα προς τον ανιχνευτή (πλήρωση του σπειράματος συγκράτησης, του σπειράματος αντίδρασης και της κυψελίδας του ανιχνευτή) μέχρι λήψη σταθερής γραμμής βάσης. 2. Αναρρόφηση καθορισμένου όγκου δείγματος στο σπείραμα παραμονής. 3. Αναρρόφηση καθορισμένων όγκων διαλυμάτων αντιδραστηρίων στο σπείραμα παραμονής. 4. Προώθηση του μίγματος της αντίδρασης προς τον ανιχνευτή (ενδέχεται να εφαρμοστεί αναχαίτιση της ροής, πριν ή εντός του ανιχνευτή κατά περίπτωση). 5. Καταγραφή των σημάτων 6. Προώθηση του προϊόντος της αντίδρασης στα απόβλητα. 4.2.5 Αναχαίτιση Ροής σε Συστήματα SIA (STOPPED FLOW -SIA) Με την τεχνική της αναχαίτισης της ροής παρέχεται στο χημικό σύστημα περισσότερος χρόνος προκειμένου να εξελιχθεί η αντίδραση, χωρίς την επίδραση της αξονικής διασποράς στις ζώνες του δείγματος και των αντιδραστηρίων. Στόχοι της εφαρμογής της τεχνικής της αναχαίτισης της ροής είναι: 1. Η αύξηση της ευαισθησίας ενός προσδιορισμού σε περιπτώσεις αργών αντιδράσεων. 2. Η αύξηση της εκλεκτικότητας άρση παρεμποδίσεων υποστρώματος. 3. Η κινητική θεωρητική μελέτη των αντιδράσεων. 4. Η ανάπτυξη μεθόδων ταυτόχρονων προσδιορισμών με κινητική διαφοροποίηση. Στα σχήματα 4.3 και 4.4 δίνονται αντίστοιχα η αρχή της τεχνικής και τα τυπικά λαμβανόμενα καταγραφήματα. Στην περίπτωση α) ευνοείται ο σχηματισμός του προϊόντος της αντίδρασης με το χρόνο αναχαίτισης. Στην περίπτωση β) η αντίδραση είναι ανεξάρτητη του χρόνου αναχαίτισης και τέλος στην περίπτωση γ) το προϊόν της αντίδρασης αρχίζει να αποικοδομείται κατά τον χρονικό διάστημα αναχαίτισης της ροής. 18

Σχήμα 4.3. Προφίλ ζώνης του δείγματος με εφαρμογή αναχαίτισης της ροής [38]. Σχήμα 4.4. Τυπικό γράφημα εφαρμογής αναχαίτισης της ροής σε ένα σύστημα SIA / FIA [39]. 19

Η αναχαίτιση της ροής μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε πριν είτε μέσα στην κυψελίδα του ανιχνευτή. Αναχαίτιση της ροής μέσα στον ανιχνευτή δίνει τη δυνατότητα στον αναλυτή να παρακολουθήσει την πορεία εξέλιξης της αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο παρέχοντας τη δυνατότητα εξαγωγής συμπερασμάτων που αφορούν στο μηχανισμό της αντίδρασης. Με αναχαίτιση της ροής πριν τον ανιχνευτή απλά παρατείνεται ο χρόνος αντίδρασης. Η προσέγγιση αυτή επιλέγεται σε περιπτώσεις επίδρασης της ακτινοβολίας των οπτικών ανιχνευτών στην αντίδραση. 4.2.6. Πλεονεκτήματα Μειονεκτήματα SIA Τα βασικά πλεονεκτήματα της SIA σε σχέση με την FIA είναι: 1. Είναι οργανολογικά απλούστερη από τη FIA, αφού ανεξαρτήτως από τον αριθμό των διαλυμάτων, χρησιμοποιείται μια και μόνο βαλβίδα πολλαπλής επιλογής, μια μονοκαναλική αντλία και μόνο ένα κανάλι ροής. Όλες δηλαδή οι απαραίτητες διεργασίες για τον προσδιορισμό γίνονται σε μονοκαναλικό σύστημα. 2. Η κατανάλωση των αντιδραστηρίων και των δειγμάτων καθώς και οι όγκοι των παραγόμενων αποβλήτων είναι σημαντικά μικρότεροι αφού τα αντιδραστήρια εισάγονται μέσω της βαλβίδας σε αυστηρά καθορισμένους όγκους και δεν ρέουν συνεχώς. 3. Οι βασικές γεωμετρικές παράμετροι ενός συστήματος SIA, δηλαδή οι όγκοι και οι ταχύτητες ροής, μπορούν εύκολα να μεταβάλλονται με τη βοήθεια κατάλληλου λογισμικού. Τα κυριότερα μειονεκτήματα της τεχνικής SIA, ως προς την πρόδρομή της, FIA, αφορούν το κόστος της οργανολογίας και της απόκτησης του απαραίτητου λογισμικού. Επίσης, είναι σχετικά δύσκολη η εφαρμογή πολύπλοκων χημικών συστημάτων που απαιτούν πολλαπλά στάδια αντιδράσεων, καθώς και τεχνικές προκατεργασίας όπως η εκχύλιση υγρού [40]. 20

ΚΕΦ. 5 ΠΑΡΑΓΩΓΟΠΟΙΗΣΗ Ως παραγωγοποίηση (derivatization) καλείται κάθε πορεία τροποποίησης μιας ένωσης με χημικές ή φυσικές μεθόδους υπό κατάλληλες συνθήκες [41], ώστε να δημιουργηθεί μια νέα ένωση, συνήθως με δομή παρόμοια με αυτήν της αρχικής (παράγωγο), κατάλληλη για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό της με συνήθεις και καθιερωμένες μεθόδους χημικής ανάλυσης. Το γενικό σχήμα μιας αντίδρασης παραγωγοποίησης είναι: Α (αρχική ένωση) + R (αντιδραστήριο) P (παράγωγο) Πιο συγκεκριμένα, κατά την παραγωγοποίηση, που δεν είναι τίποτα άλλο παρά ένα επιπλέον στάδιο προκατεργασίας του δείγματος, μια συγκεκριμένη δραστική ομάδα της ένωσης συμμετέχει στην αντίδραση παραγωγοποίησης με αποτέλεσμα την μετατροπή της ένωσης σε ένα παράγωγο, το οποίο διαφέρει από την αρχική ένωση ως προς διάφορες φυσικές ή χημικές ιδιότητες, (π.χ. τη δραστικότητα, τη διαλυτότητα, την πολικότητα, το σημείο ζέσεως, το σημείο τήξεως, την ικανότητα φθορισμού, φωσφορισμού κ.α.). Οι νέες χαρακτηριστικές ιδιότητες που αποκτά το παράγωγο, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του. Στην παραγωγοποίηση καταφεύγει συχνά ο αναλυτικός χημικός όταν η υπό μελέτη ένωση είναι μη επαρκώς σταθερή, όταν δεν είναι πτητική ή επαρκώς πτητική και τέλος όταν δεν είναι επαρκώς ανιχνεύσιμη με το σύστημα ανίχνευσης που είναι διαθέσιμο. Με την παραγωγοποίηση αίρονται οι παραπάνω δυσκολίες στην ανάλυση, καθώς, αυξάνεται η πτητικότητα των μη πτητικών ενώσεων, ελαττώνεται η πτητικότητα των πολύ πτητικών ενώσεων, εξουδετερώνονται ή παρακάμπτονται οι πολικές ομάδες των μορίων, αυξάνεται η ανιχνευσιμότητα, και η σταθερότητα των ενώσεων καθώς και η ευαισθησία της ανάλυσης. Στη βιβλιογραφία υπάρχει αναφορά σε μεγάλο αριθμό εργασιών που έχουν χρησιμοποιήσει την παραγωγοποίηση ως στάδιο προκατεργασίας των δειγμάτων πριν την ανάλυσή τους. Στις περισσότερες εργασίες τα αντιδραστήρια παραγωγοποίησης είναι εμπορικά διαθέσιμα, ενώ σε λίγες περιπτώσεις γίνεται αναφορά στην οργανική σύνθεση των αντιδραστηρίων αυτών πριν τη χρήση τους [42]. Η παραγωγοποίηση, παρά τα πολύ σημαντικά πλεονεκτήματα που προσφέρει στη χημική ανάλυση, δεν παύει να αποτελεί ένα επιπλέον στάδιο προκατεργασίας του δείγματος. Δεν είναι λίγοι οι ερευνητές που έχουν δηλώσει ότι η παραγωγοποίηση είναι στις περισσότερες των περιπτώσεων αναγκαίο κακό [42], καθώς βασικός στόχος μιας 21

σύγχρονης αναλυτικής μεθόδου είναι να πραγματοποιείται ο προσδιορισμός με όσο το δυνατό λιγότερα στάδια προκατεργασίας του δείγματος. Είναι φανερό, ότι η εισαγωγή ενός επιπλέον σταδίου προκατεργασίας, αυξάνει την αβεβαιότητα των αποτελεσμάτων μιας ανάλυσης. Ακόμα μεγαλύτερη είναι η αβεβαιότητα αυτή, όταν τα στάδια της παραγωγοποίησης και ο χειρισμός όλων των διαλυμάτων της γίνονται από κάποιον άνθρωπο. Στην περίπτωση αυτή θα πρέπει να συνυπολογίσει κανείς όλα εκείνα τυχαία και στατιστικά σφάλματα, που εισάγονται στην ανάλυση λόγω του ανθρώπινου παράγοντα. Επιπλέον, κατά την ανάπτυξη και βελτιστοποίηση μιας αντίδρασης παραγωγοποίησης, υπάρχουν πάρα πολλές παράμεροι, που πρέπει να μελετηθούν και να βελτιστοποιηθούν ώστε να πετύχουμε τελικά τη μεγαλύτερη δυνατή ευαισθησία και εκλεκτικότητα προσδιορισμού. Οι παράμετροι που μελετώνται συνήθως είναι η θερμοκρασία, ο χρόνος αντίδρασης, το ph, ο χρησιμοποιούμενος διαλύτης, η συγκέντρωση του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης και της ένωσης που θέλουμε να παραγωγοποιήσουμε και τέλος η συγκέντρωση όλων εκείνων των ενώσεων, η παρουσία των οποίων μπορεί πολλές φορές να είναι απαραίτητη για την πραγματοποίηση της αντίδρασης ή την πορεία εξέλιξης της. Στο τελικό στάδιο της ανάλυσης, επιλέγονται και χρησιμοποιούνται εκείνες οι τιμές των παραμέτρων, οι οποίες προσδίδουν στη μέθοδο τη μεγαλύτερη εκλεκτικότητα, ακρίβεια και ευαισθησία [42]. Οι συχνότερα απαντημένες αντιδράσεις παραγωγοποίησης είναι οι αντιδράσεις ακυλίωσης, συλιλίωσης, αλκυκίωσης και εστεροποίησης [43]. Σε τι είδους αντίδραση παραγωγοποίησης θα προχωρήσει ένας αναλυτικός χημικός, εξαρτάται από την ελεύθερη ομάδα της ένωσης που θέλει να παραγωγοποιήσει, από την αναλυτική τεχνική που χρησιμοποιεί για τους προσδιορισμούς και τέλος από το είδος των δειγμάτων που πρόκειται να αναλυθούν. Οι αντιδράσεις παραγωγοποίησης, που πραγματοποιούνται ευκολότερα, είναι εκείνες στις οποίες υπάρχει ένα τουλάχιστον ευκίνητο άτομο υδρογόνου στο μόριο της ένωσης. Σε αυτές τις κατηγορίες ενώσεων ανήκουν οι ενώσεις που περιέχουν ελεύθερες αμινομάδες, ιμινομάδες, καβοξυλομάδες, σουλφυδρυλομάδες και υδροξυλομάδες. Καθώς η αντίδραση παραγωγοποίησης, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, είναι συνήθως μια σχετικά επίπονη διαδικασία (από τη μια λόγω του ότι μπορεί να αποτελείται από περισσότερα του ενός στάδια και από την άλλη γιατί ο ανθρώπινος παράγοντας επιβαρύνει την ανάλυση με σφάλματα), ήταν αναγκαία η αυτοματοποίησή της. Οι περισσότερες αυτοματοποιημένες αντιδράσεις παραγωγοποίησης χρησιμοποιούνται στη 22

χρωματογραφία. Εκεί το προς ανάλυση δείγμα παραγωγοποιείται είτε πριν τη χρωματογραφική στήλη (pre-column derivatization), για αύξηση της διαχωριστικής ικανότητας και ελάττωση του χρόνου διαχωρισμού, είτε μετά τη στήλη (post column derivatization) για αύξηση της ευαισθησίας και εκλεκτικότητας της ανάλυσης. Ιδιαίτερα σημαντική, όμως, ήταν η είσοδος της παραγωγοποίησης στις αυτοματοποιημένες αναλυτικές τεχνικές FIA και SIA [44]. Η ικανότητα, από τη μία, ανίχνευσης σχεδόν κάθε είδους μορίου μετά από παραγωγοποίηση του με κατάλληλο αντιδραστήριο παραγωγοποίησης και ο αυτοματισμός, από την άλλη, των τεχνικών αυτών, που εξαλείφει τις παρεμποδίσεις που προκύπτουν από τους ανθρώπινους χειρισμούς και αυξάνει στο μέγιστο δυνατό τον ρυθμό δειγματοληψίας και αναλύσεων, καθιστά τη σύζευξη αυτών ένα ιδιαίτερα χρήσιμο εργαλείο σε κάθε αναλυτικό εργαστήριο, τόσο για μεμονωμένες αναλύσεις, όσο και για αναλύσεις ρουτίνας. Η ο-φθαλαδιαλδεΰδη (ΟΡΑ) (σχήμα 5.1), με συστηματική ονομασία κατά IUPAC 1,2-δικαρβοξυλαλδεΰδη, είναι ένα γνωστό αντιδραστήριο παραγωγοποίησης το οποίο έχει χαμηλό γηγενή φθορισμό. Αντιδρά γρήγορα σε θερμοκρασία δωματίου και σε αλκαλικό ph (ph: 8 11), ενώ τα φθοροφόρα παράγωγα, συχνά, μπορεί να δώσουν δευτερεύουσες αντιδράσεις με άλλα μόρια του περιβάλλοντος, με αποτέλεσμα της μείωσης της έντασης ακτινοβολίας φθορισμού [45]. O H H Σχήμα 5.1. Συντακτικός τύπος της ο φθαλαδιαλδεΰδης (ΟΡΑ). ΜW = 134 g mol -1. O 23

ΚΕΦ. 6 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΕΠΙΣΚΟΠΗΣΗ 6.1. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΣΤΑΜΙΝΗΣ ΜΕ FIA/SIA Στη διεθνή βιβλιογραφία έχει αναφερθεί σχετικά περιορισμένος αριθμός εργασιών με αυτόματες μεθόδους συνεχούς ροής (FIA / SIA) για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε διάφορα υποστρώματα. Οι αρχές και τα βασικά αναλυτικά χαρακτηριστικά των μεθόδων αυτών δίνονται στον Πίνακα 6.1. Οι Amorim et al. περιέγραψαν την εφαρμογή εκλεκτικού ιοντικού ηλεκτροδίου ισταμίνης, για τον έλεγχο της φρεσκότητας των ψαριών [46]. Η ενεργή επιφάνεια του ηλεκτροδίου βασίστηκε σε μία κατάλληλα τροποποιημένη πολυμερική μεμβράνη. Το ηλεκτρόδιο ισταμίνης ήταν λειτουργικό σε εύρος ph 3,5-5,5 με κλίση 31,7 ± 1,3 mv dec - 1 και όριο ανίχνευσης 1,6 μmol L -1. Η σμίκρυνση του ηλεκτροδίου επέτρεψε τη χρήση του ως ανιχνευτή σε ένα σύστημα SI-lab-on-valve (Σχήμα 6.1), αλλά με ταυτόχρονη μείωση της διάρκεια ζωής του ηλεκτροδίου, από 10 μήνες σε περίπου 1 μήνα συνεχούς λειτουργίας. Οι βέλτιστες συνθήκες ροής επιτεύχθηκαν για όγκους έγχυσης δείγματος 70 μl κινούμενα προς την κυψελίδα ανίχνευσης με παροχή όγκου 12 μl s -1 για 20 s και ακολούθως με παροχή όγκου 15 μl s -1 για 50 s. Η ποτενσιομετρική ανάλυση της ισταμίνης στα διαφορετικά είδη ψαριών έδωσε αποτελέσματα παρόμοια με εκείνα που προκύπτουν με χρήση χρωματογραφικών μεθόδων. Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου περιλαμβάνουν το χαμηλό κόστος της ανάλυσης, την ταχύτητα και τη χρήση μικρού όγκου αντιδραστηρίων. Οι Akbari-Αdergani et al. ανέπτυξαν μια νέα ηλεκτροχημική μέθοδο FIA για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε δείγματα τόνου [47]. Η μέθοδος βασίζεται στην τεχνική της κυκλικής βολταμμετρίας με χρήση μίκρο-ηλεκτροδίου χρυσού σε διάταξη δίσκου (Σχήμα 6.2). Η μέθοδος που ανέπτυξαν είναι απλή, ακριβής και γρήγορη, με γραμμικότητα σε εύρος συγκεντρώσεων ισταμίνης 1,1-5555 pg ml -1 (r = 0,998) και όρια ανίχνευσης και ποσοτικού προσδιορισμού της τάξης των 0,35 και 1,16 pg ml -1 αντίστοιχα. Μειονεκτήματα της μεθόδου αποτελούν η περιορισμένη μελέτη της εκλεκτικότητας και η εφαρμογή της σε ένα μόνο δείγμα ψαριού. 24

Σχήμα 6.1. Σχηματική άποψη της διάταξης SIA-LOV για τον προσδιορισμό της ισταμίνης με χρήση εκλεκτικού ηλεκτροδίου [46]: C1 = μεταφορέας, Ρ = περισταλτική αντλία, SV = βαλβίδα επιλογής, HC = σπείραμα συγκράτησης, S = δείγμα, MSV = βαλβίδα επιλογής πολλών θέσεων, W = απόβλητα. Σχήμα 6.2. Σχηματική απεικόνιση της ηλεκτροχημικής κυψελίδας [47]. 25

Το 2009, οι A. Pietrzyk et al. ανέπτυξαν έναν πιεζοηλεκτρικό αισθητήρα, για τον εν-ροή προσδιορισμό της ισταμίνης σε υδατικά διαλύματα [48]. Ο αισθητήρας αποτελούνταν από ένα τυπικό σύστημα Pt/χαλαζία επικαλυμμένου με ένα φιλμ πολυμερούς μοριακής αποτύπωσης. Κάτω από προσεκτικά επιλεγμένες συνθήκες FIA, η κατώτερη τιμή του ορίου ανίχνευσης ήταν 5 nmol L -1 ισταμίνης, το οποίο είναι αρκετά χαμηλό για τον προσδιορισμό της σε βιολογικά δείγματα. Ο αισθητήρας είναι εκλεκτικός όσον αφορά πιθανές παρεμποδίζουσες ενώσεις παρόμοιας δομής, όπως τρυπταμίνη, ντοπαμίνη, και ιμιδαζολίο. Μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η μη εφαρμογή της σε πραγματικά δείγματα. Οι Ito et. al. πρότειναν ένα μίκρο-σύστημα FIA με ηλεκτροχημική ανίχνευση για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε δείγματα τροφίμων [49]. Η μέθοδος βασίζεται στην ενροή οξείδωση του προσδιοριζόμενου συστατικού από το ένζυμο οξειδάση της ισταμίνης ακινητοποιημένου σε κατάλληλα σφαιρίδια. Το παραγόμενο H 2 O 2 ανιχνεύονταν αμπερομετρικά σε + 0,6 V με τη χρήση φιλμ Pt/Ti ως ηλεκτροδίου εργασίας (Σχήμα 6.3). Η γραμμικότητα της προτεινόμενης μεθόδου εκτείνονταν σε εύρος 1-1000 μmol L -1 ισταμίνης, ενώ τα αποτελέσματα από την εφαρμογή της στην ανάλυση δειγμάτων φρέσκου τόνου ήταν σε καλή συμφωνία με μέθοδο HPLC. Σχήμα 6.3. Σχηματική απεικόνιση του διαγράμματος ροής για τον αμπερομετρικό προσδιορισμό της ισταμίνης [49]. 26

Σε παρόμοια αρχή βασίζεται και η μέθοδος που πρότειναν οι Tani et. al. [50]. H βασική διαφορά είναι ότι το παραγόμενο Η 2 Ο 2 από την ενζυμική αντίδραση ανιχνεύονταν φασματοφωτομετρικά με τη μέθοδο της αμινο-αντιπυρίνης σε μήκος κύματος 530 nm. Το όριο ανίχνευσης ήταν 3 μmol L -1 και το εύρος προσδιορισμού 10-1000 μmol L -1. Η συχνότητα δειγματοληψίας ήταν 20 h -1. Τα αποτελέσματα από την εφαρμογή της μεθόδου στην ανάλυση δειγμάτων τροφίμων (σάλτσες ψαριών) ήταν σε καλή συμφωνία με μέθοδο αναφοράς HPLC. Εναλλακτικά, το παραγόμενο Η 2 Ο 2 από την αντίδραση της ισταμίνης με την οξειδάση της μπορεί να μετρηθεί και με την τεχνική της χημειοφωταύγειας και συγκεκριμένα με το κλασσικό σύστημα της λουμινόλης σε αλκαλικό περιβάλλον [51]. Η ακινητοποίηση του ενζύμου γίνονταν σε πολυμερικά σφαιρίδια τα οποία τοποθετούνταν σε διαφανή σωλήνα Teflon, ο οποίος έπαιζε και το ρόλο της κυψελίδας συνεχούς ροής. Η γραμμικότητα της μεθόδου κυμαίνονταν μεταξύ 0,1 και 50 μmol L -1 με συχνότητα δειγματοληψίας 30 h -1. Τέλος η εφαρμογή της μεθόδου περιλάμβανε ανάλυση δειγμάτων ψαριού. Ο ενζυμικός προσδιορισμός της ισταμίνης σε σύστημα FIA μπορεί να επιτευχθεί και με την κατασκευή κατάλληλα τροποποιημένου ηλεκτροδίου [52]. Ποιο συγκεκριμένα, οι Tagaki και Shikata ακινητοποίησαν το ένζυμο δεϋδρογονάση της ισταμίνης σε κατάλληλο πολυμερικό φιλμ και στη συνέχεια σε ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα. Σημαντικό χαρακτηριστικό του ηλεκτροδίου είναι η εκλεκτικότητά του έναντι άλλων βιογενών αμινών όπως η πουτρεσκίνη, η τυραμίνη και η καδαβερίνη. Το όριο ανίχνευσης της μεθόδου ήταν 5 μmol L -1, ενώ η γραμμικότητα εκτείνονταν μέχρι τα 600 μmol L -1. Μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η παρεμποδιστική δράση του ασκορβικού οξέος, ενώ επίσης δεν αναφέρεται η σταθερότητα του ηλεκτροδίου στην ανάλυση δειγμάτων ψαριών. Σε παρόμοιες αρχές βασίζεται και η μέθοδος των Niculescu et. al. [53]. Οι ερευνητές χρησιμοποίησαν το ένζυμο οξειδάση των αμινών και το ακινητοποίησαν είτε με προσρόφηση σε γραφιτικό ηλεκτρόδιο, είτε με χρήση ειδικά τροποποιημένων πολυμερικών φιλμ. Οι παραγόμενοι βιοαισθητήρες συνεχούς ροής δεν είχαν ιδιαίτερα ικανοποιητική σταθερότητα, καθώς έχαναν το 30 % της ενεργότητάς τους σε διάστημα μικρότερο των 10 ωρών. Επιπλέον, λόγο της χρήσης μη εκλεκτικού ενζύμου, οι αισθητήρες αποκρίνονταν σε όλες τις αμίνες με αποτέλεσμα να είναι απαραίτητη η εφαρμογή προκαταρκτικού σταδίου διαχωρισμού στην περίπτωση ανάλυσης πραγματικών δειγμάτων. 27

Μη ενζυμικός ηλεκτροχημικός προσδιορισμός της ισταμίνης σε σύστημα FIA μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση με ηλεκτρόδια από διαμάντι εμβολιασμένα με βόριο [54]. Ο αμπερομετρικός προσδιορισμός της ισταμίνης γίνονταν σε δυναμικό + 1,28 V. Το όριο ανίχνευσης ήταν 0,5 μmol L -1 και η γραμμικότητα εκτείνονταν ως τα 100 μmol L -1. Μειονεκτήματα της μεθόδου αποτελούν η μη εφαρμογή της σε πραγματικά δείγματα, ο μη έλεγχος της εκλεκτικότητας και τέλος η μη μελέτη της σταθερότητας του ηλεκτροδίου σε συνθήκες συνεχούς λειτουργίας. Σε παρόμοια αρχή βασίζεται και η μέθοδος των Carralero et. al. [55]. Η ισταμίνη προσδιορίζονταν αμπερομετρικά σε ηλεκτρόδιο υαλώδους άνθρακα κατάλληλα τροποποιημένου με νανοσωματίδια χρυσού. Η τροποποίηση του ηλεκτροδίου γίνονταν με ηλεκτροαπόθεση. Η απόδοση των ηλεκτροδίων δοκιμάστηκε σε συνθήκες συνεχούς ροής σε συστήματα FIA και HPLC. Το όριο ανίχνευσης ήταν 0,6 μmol L -1. Παρόλα αυτά, λόγο μειωμένης εκλεκτικότητας, το ηλεκτρόδιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για ανάλυση πραγματικών δειγμάτων μόνο μετά από διαχωρισμό με HPLC. Το φθορισμομετρικό προσδιορισμό της ισταμίνης σε δείγματα κρασιών σε σύστημα FIA προτείνουν οι Campo et. al. [56]. Η μέθοδος βασίζεται στην εν-ροή παραγωγοποίηση του προσδιοριζόμενου συστατικού με την ο-φθαλαλδεΰδη σε τρικαναλικό σύστημα (Σχήμα 6.4). Το όριο ανίχνευσης ήταν 30 μg L -1, η γραμμικότητα εκτείνονταν μέχρι τα 2000 μg L -1 και ο ρυθμός εγχύσεων ήταν 24 h -1. H χρήση χημειομετρικών μεθόδων βελτιστοποίησης δεν είχε σαν στόχο τη μέγιστη εκλεκτικότητα με αποτέλεσμα να απαιτείται εν-ροή κατεργασία των δειγμάτων μέσω ιοντοανταλλακτικής στήλης. Σχήμα 6.4. Η διάταξη FIA για τον προσδιορισμό της ισταμίνης [56]. 28

Τέλος, αποτελεσματική προσέγγιση για την αύξηση της εκλεκτικότητας της παραγωγοποίησης της ισταμίνης σε σύστημα FIA αποτελεί η σύζευξη της τελευταίας με την HPLC [57]. Συγκεκριμένα, οι García-Villar et. al. πρότειναν μια διάταξη FIA-HPLC για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε δείγματα κρασιού. Η αντίδραση παραγωγοποίησης της ισταμίνης με το αντιδραστήριο NQS λάμβανε χώρα εν-ροή με τη χρήση τρι-καναλικού συστήματος FIA, ενώ το μίγμα αντίδρασης εγχύονταν απευθείας στη χρωματογραφική στήλη. Η ανίχνευση γίνονταν φασματοφωτομετρικά στα 305 nm. Το όριο ανίχνευσης ήταν 0,22 mg L -1 και η γραμμικότητα εκτείνονταν μέχρι τα 66,7 mg L -1. 29

30

31

6.2. ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΣΤΑΜΙΝΗΣ ΜΕ ΑΛΛΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ Στη διεθνή βιβλιογραφία έχουν αναφερθεί πολλές μέθοδοι για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε δείγματα τροφίμων, οι οποίες κάνουν χρήση ευρείας γκάμας αναλυτικών τεχνικών (χρωματογραφία υγρού και αερίου, ηλεκτροφόρηση, χρωματογραφία λεπτής στιβάδας κλπ.). Όπως φαίνεται και από τους Πίνακες 6.2 και 6.3, η πιο ευρέως διαδεδομένη διαχωριστική τεχνική για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε δείγματα τροφίμων είναι η χρωματογραφία υγρού υψηλής απόδοσης (HPLC). Το βασικό "πρόβλημα" στην ανάλυση της ισταμίνης και γενικότερα των αλειφατικών αμινών με την τεχνική της HPLC έγκειται στο σύστημα ανίχνευσης. Οι αλειφατικές αμίνες γενικά, δεν έχουν χρωμοφόρες ενώσεις στα μόρια τους και για αυτό το λόγο η ανίχνευσή τους με τη φασματοφωτομετρία UV-vis μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο σε χαμηλά μήκη κύματος (<220 nm), συχνά με μειωμένη εκλεκτικότητα και ευαισθησία. Για το λόγο αυτό, μία δημοφιλής προσέγγιση μεταξύ των αναλυτικών χημικών είναι η παραγωγοποίηση της ισταμίνης, με στόχο τη βελτίωση της ανιχνευσιμότητας και κατ' επέκταση των αναλυτικών χαρακτηριστικών των σχετικών μεθόδων. Η διαδικασία της παραγωγοποίησης μπορεί να είναι είτε προ-, είτε μετά- στήλης (pre-column ή post-column) και πραγματοποιείται με τη χρήση ποικιλίας κατάλληλων αντιδραστηρίων, εκλεκτικών ως προς την πρωτοταγή αμινο-ομάδα. Τα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα των δύο αυτών τεχνικών παραγωγοποίησης είναι - σε γενικές γραμμές - γνωστά και καταγεγραμμένα στη διεθνή βιβλιογραφία και περιλαμβάνουν [58, 59]: 1. Η πλειοψηφία των μεθόδων παραγωγοποίησης προ-στήλης απαιτεί το χειρισμό της αντίδρασης από τον αναλυτή και τη γνώση και έλεγχο του ακριβούς χρόνου πραγματοποίησής της. Αντίθετα, κατά την παραγωγοποίηση μετά-στήλης η αντίδραση πραγματοποιείται αυτοματοποιημένα σε συνθήκες συνεχούς ροής. 2. Στην παραγωγοποίηση μετά-στήλης απαιτούνται ταχείες αντιδράσεις, ενώ αυτό δεν είναι απαραίτητο στην προ-στήλης παραγωγοποίηση, με αποτέλεσμα στην τελευταία περίπτωση να υπάρχει μεγαλύτερη δυνατότητα επιλογής χημικών συστημάτων. Αντίθετα, στην παραγωγοποίηση προ-στήλης σημαντικό ρόλο στην αποτελεσματικότητα της αναλυτικής διαδικασίας παίζουν η σταθερότητα των παραγώγων και τα πιθανά προϊόντα διάσπασης της περίσσειας του αντιδραστηρίου. 32

3. Τέλος, από οργανολογικής απόψεως, η παραγωγοποίηση μετά τη χρωματογραφική στήλη είναι πιο πολύπλοκη, καθώς απαιτούνται επιπλέον αντλίες, σπειράματα αντίδρασης, εν-ροή θερμοστάτες κλπ. Όσον αφορά στο διαχωρισμό των αμινών ή των παραγώγων τους, στη διεθνή βιβλιογραφία αναφέρονται συνήθως τρεις προσεγγίσεις: α) χρωματογραφία αντίστροφης φάσης (RP-HPLC), β) ιοντική χρωματογραφία (IEC) και γ) χρωματογραφία αντίστροφης φάσης ζεύγους ιόντων (IP-HPLC). H RP-HPLC είναι συγκριτικά η απλούστερη τεχνική και προσφέρει γρήγορους διαχωρισμούς και χαμηλό κόστος χρωματογραφικών στηλών. Ως μειονέκτημα, μπορεί να αναφερθεί η ανάγκη για εκτεταμένη προκατεργασία δείγματος, καθώς και ο σχετικά περιορισμένος χρόνος ζωής των στηλών. Η τεχνική της IP-HPLC δίνει τη δυνατότητα ανάλυσης πολικών αμινών, όπως η ισταμίνη, με χρήση στηλών αντίστροφης φάσης. Μειονεκτεί ως προς τον αυξημένο χρόνο εξισορρόπισης της στήλης και στο φαινόμενο μόνιμης τροποποίησης των χρωματογραφικών στηλών. Τέλος, η ανάλυση της ισταμίνης με ιοντική χρωματογραφία χαρακτηρίζεται από συγκριτικά μεγαλύτερους χρόνους ανάλυσης, αλλά πλεονεκτεί ως προς την απαίτηση για απλούστερη προκατεργασία δείγματος και μεγαλύτερη διάρκεια ζωής των στηλών σε αναλύσεις ρουτίνας πολύπλοκων υποστρωμάτων. 33

34

35

36

ΚΕΦ. 7 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Όπως έχει περιγραφεί αναλυτικά και στο θεωρητικό μέρος της διπλωματικής εργασίας, η ισταμίνη (HIM) είναι μία ουσία η οποία σχηματίζεται σε ορισμένα ψάρια, όπως ο τόνος, μετά το θάνατο τους, με τη δράση βακτηρίων. Τα επίπεδα της ισταμίνης που παράγονται στο ψάρι με τη διαδικασία αυτή, αποτελούν ένα δείκτη της αποσύνθεσης που συμβαίνει στο είδος αυτό των τροφίμων [75]. Εξαιτίας του πιθανού κινδύνου στην ανθρώπινη υγεία, ο Οργανισμός Τροφίμων και Φαρμάκων των Η.Π.Α. (FDA) έχει θεσπίσει ως όριο για την εμφάνιση τοξικότητας τα 500 mg/kg ισταμίνης και ως το ανώτατο επιτρεπτό ισταμίνης στα ψάρια τα 50 mg/kg [76]. Ανάμεσα στις πολυάριθμες μεθόδους και τεχνικές που αναφέρονται στη διεθνή βιβλιογραφία για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε δείγματα ψαριών, η επίσημη μέθοδος AOAC 977.13 έχει αποδειχθεί ως εκ των πιο αξιόπιστων και αποτελεσματικών, λόγω των πολυάριθμων διεργαστηριακών μελετών, και έχει καθιερωθεί ως μέθοδος αναφοράς για τις διεθνείς αρχές [77]. Η μέθοδος AOAC 977.13 βασίζεται στην αντίδραση της HIM με το αντιδραστήριο ο-φθαλαδιαλδεΰδη (OPA) σε ισχυρά αλκαλικό περιβάλλον, προς σχηματισμό ενός έντονα φθορίζοντος προϊόντος. Παρά τα πλεονεκτήματα της μεθόδου ως προς την αξιοπιστία και ακρίβεια, υπάρχουν και αρκετά μειονεκτήματα: 1) είναι μια μη αυτοματοποιημένη διαδικασία (batch), όπου όλα τα βήματα της ανάλυσης απαιτούν ανθρώπινο χειρισμό, 2) ο χρόνος της αντίδρασης είναι αυστηρά καθορισμένος (ακριβώς 4 λεπτά) και επιτυγχάνεται μέσω όξυνισης του μίγματος της αντίδρασης και 3) δεν έχει επαρκή εκλεκτικότητα, κυρίως όσον αφορά στην ιστιδίνη (HIS), απαιτώντας ένα χρονοβόρο στάδιο προκατεργασίας του δείγματος το οποίο βασίζεται σε εκχύλιση στερεάς φάσης. Εξαιτίας λοιπόν των πολλά υποσχόμενων αναλυτικών χαρακτηριστικών της αντίδρασης μεταξύ HIM και OPA, έχουν αναφερθεί πολλές μεταγενέστερες μελέτες οι οποίες είχαν σαν βασικό σκοπό τη βελτίωση της επίσημης μεθόδου, κυρίως ως προς την εκλεκτικότητά της. Για παράδειγμα, οι Valcarcel et. al., στηρίχθηκαν στη χρήση Σύγχρονης Φθορισμομετρίας Παραγώγων (Derivative Synchronous Fluorescence Spectrometry), υποστηρίζοντας ότι πέτυχαν επαρκή εκλεκτικότητα στην αντίδραση της HIM-OPA, ώστε να αποφύγουν το στάδιο καθαρισμού της επίσημης μεθόδου [78]. Παρόλο που η εκλεκτικότητα προς την ιστιδίνη ήταν 40:1, ο λόγος αυτός δεν είναι ικανοποιητικός για να καλύψει περιπτώσεις πραγματικών δειγμάτων όπου αναμένεται 37

μεγαλύτερη περίσσεια ιστιδίνης. Μία από τις πιο υποσχόμενες μελέτες πάνω στην αντίδραση HIM-OPA, πραγματοποιήθηκε από ερευνητές του FDA, οι οποίοι αυτοματοποίησαν την μέθοδο AOAC 977.13, χρησιμοποιώντας την τεχνική της Ανάλυσης με Έγχυση του Δείγματος σε Συνεχή Ροή (FI) [79,80]. Σύμφωνα με τα ευρήματά τους, χρησιμοποιώντας αυστηρώς καθορισμένες πειραματικές συνθήκες, (π.χ. χρόνο αντίδρασης 30-35 s και συγκεκριμένη συγκέντρωση ποσότητας OPA) η εκλεκτικότητα της μεθόδου για την βασική ουσία που πιθανώς να παρεμποδίζει, την ιστιδίνη, θα μπορούσε να βελτιωθεί δραματικά συγκρινόμενη με την κλασσική μέθοδο AOAC, εξαλείφοντας το στάδιο του καθαρισμού. Παρά τις σαφείς δυνατότητες της FI, όσον αφορά την αυτοματοποίηση, μέσω της δυνατότητας ακριβούς και επαναλήψιμου χειρισμού κινητικών αντιδράσεων, υπάρχει ακόμη περιθώριο για σημαντικές βελτιώσεις της επίσημης μεθόδου. Για παράδειγμα, οι Hungerford et. al. ρύθμισαν το πολύ στενό «παράθυρο της αντίδρασης» των 30-35 s, με κατάλληλους συνδυασμούς των παροχών όγκου και των μηκών του σπειράματος αντίδρασης. Οι λόγοι των παροχών όγκου των τριών καναλιών του διαγράμματος ροής της FI, διαδραματίζουν επίσης καίριο ρόλο στην τελική συγκέντρωση της ΟΡΑ, η οποία βρέθηκε ότι επίσης επηρεάζει την εκλεκτικότητα. Τέλος, είναι προφανές ότι οι διατάξεις τριών καναλιών FI είναι επιρρεπείς σε ανεπιθύμητες διακυμάνσεις υπό συνεχή λειτουργία, θέτοντας σε κίνδυνο την ακρίβεια των αναλύσεων. Στην παρούσα διπλωματική εργασία, προτείνεται μια εναλλακτική λύση με πολλά πλεονεκτήματα, επεκτείνοντας το έργο των ερευνητών του FDA για τον αυτοματοποιημένο προσδιορισμό της HIM. Όλα τα βήματα της αντίδρασης της HIM με την OPA αυτοματοποιήθηκαν σε μονοκαναλικό σύστημα SI [81]. Η οργανολογική διάταξη έχει απλοποιηθεί, είναι πιο ανθεκτική σε συνθήκες συνεχούς λειτουργίας, ο χρόνος αντίδρασης μπορεί να ελέγχεται αυστηρά, υπό συνθήκες αναχαίτισης ροής, μέσω υπολογιστή, η κατανάλωση των αντιδραστηρίων και η παραγωγή αποβλήτων έχει μειωθεί δραστικά, ενώ δεν υπήρξε κανένας συμβιβασμός όσον αφορά στην ευαισθησία και εκλεκτικότητα. 38

ΚΕΦ. 8 ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΑ Ο αυτόματος αναλυτής SIA που χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη της μεθόδου προσδιορισμού της ισταμίνης, αποτελείται από τα επιμέρους οργανολογικά τμήματα: 1. Αυτόματη βαλβίδα επιλογής 10 θέσεων (Valco, Ελβετία). 2. Περισταλτική αντλία (Gilson Miniplus3, Γαλλία). 3. Φθορισμομετρικό ανιχνευτή του οίκου Shimadzu, μοντέλο RF-551. Το σύστημα ροής αποτελούνταν από σωλήνες Teflon, εσωτερικής διαμέτρου 0.5 mm, εκτός αν αναφέρεται κάτι διαφορετικό. Το σπείραμα συγκράτησης (HC) είχε μήκος 300 cm και εσωτερική διάμετρο 0,7 mm. Η λειτουργία του αναλυτή ελέγχονταν μέσω ηλεκτρονικού υπολογιστή με κάρτα εισόδου / εξόδου (6025 Ε, National Instrument, Austin, TX). Ο έλεγχος του συστήματος και η λήψη των δεδομένων γινόταν με τη χρήση ενός λογισμικού LabVIEW 5.1.1. (National Instrument, Austin, TX). Το πρόγραμμα αναπτύχθηκε στο εργαστήριο αναλυτικής Χημείας, του τμήματος Χημείας του Α.Π.Θ. Τα λαμβανόμενα σήματα από το σύστημα ανίχνευσης καταγράφονταν και αποτιμούνταν με τη βοήθεια του λογισμικού Clarity Station for Windows (DataApex, Τσεχία). Ο επιπλέον συνήθης εργαστηριακός εξοπλισμός περιλάμβανε κατά τη διάρκεια της εργασίας: - αναλυτικό ζυγό του οίκου Sartorius, μοντέλο 1801 - πεχάμετρο του οίκου Orion, μοντέλο EA940 - λουτρό υπερήχων του οίκου Elma Transonic, μοντέλο 460/H - φυγόκεντρο του οίκου Hermle, μοντέλο Z230 - ομογενοποιητής Ultra-Turrax T25 (IKA-Werke) - φίλτρα σύριγγας 0,45 μm (Membrane Solutions) 39

ΚΕΦ. 9 ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ - ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ 9.1. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Όλα τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στο πειραματικό μέρος της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ήταν αναλυτικού βαθμού καθαρότητας και δίνονται στον Πίνακα 9.1. Ως διαλύτης αραίωσης χρησιμοποιήθηκε δις-απιονισμένο νερό, εκτός αν αναφέρεται κάτι διαφορετικό. Πίνακας 9.1. Αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν και τα χαρακτηριστικά τους. α/α Αντιδραστήριο CAS No M r Καθαρότητα Οίκος 1 Γλυκίνη 56-40-6 75.07 99.0% Fluka 2 ΗCl 7647-01-0 36.46 36.5-38.0% α Merck 3 Η 3 PO 4 7664-38-2 98.00 85% α Panreac 4 Ισταμίνη 51-45-6 111.15 97.0% Fluka 5 Ιστιδίνη 71-00-1 155.15 99% Merck 6 Καδαβερίνη 1476-39-7 175.10 99.0% Sigma 7 Κυστεϊνη 52-90-4 121.16 97% Merck 8 Μεθανόλη 67-56-1 32.04 99.9% Aldrich 9 ΝaOH 1310-73-2 40.00 98% Merck 10 ο-φθαλαδιαλδεΰδη 643-79-8 134.13 99.0% Merck 11 Πουτρεσκίνη 333-93-7 161.07 98% Aldrich 12 Σπερμιδίνη 124-20-9 145.25 98% Fluka 13 Σπερμίνη 71-44-3 202.34 99.0% Fluka 14 Τριχλωροξικό οξυ 76-03-9 163.39 99.0% Aldrich 15 Τρυπταμίνη 61-54-1 160.22 98% Fluka 16 Τυραμίνη 51-67-2 137.18 99% Fluka α Κλάσμα μάζας υγρών αντιδραστηρίων. 40

9.2. ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Το πυκνό πρότυπο διάλυμα της ισταμίνης (ΗΙΜ) είχε συγκέντρωση ποσότητας 10 mmol L -1 και παρασκευάζονταν καθημερινά με διάλυση ακριβώς ζυγισμένης ποσότητας του αντιδραστηρίου σε μεθανόλη. Τα διαλύματα εργασίας του προσδιοριζόμενου συστατικού είχαν συγκεντρώσεις ποσότητας από 0,5 15,0 μmol L -1 και παρασκευαζόταν από το πυκνό διάλυμα με κατάλληλες αραιώσεις σε δις-απιονισμένο νερό. Τo πυκνό διάλυμα της ο-φθαλαδιαλδεΰδης (OPA) είχε συγκέντρωση ποσότητας 10 mmol L -1. Παρασκευαζόταν με διάλυση ακριβώς ζυγισμένης ποσότητας του αντιδραστηρίου σε 0,5 ml μεθανόλης, ακολουθούμενη από αραίωση σε τελικό όγκο 10 ml με διςαπιονισμένο νερό. Το πυκνό διάλυμα του αντιδραστηρίου ήταν σταθερό για μία εβδομάδα εφόσον φυλάσσονταν στους 4 ο C προστατευμένο από το φως. Τα διαλύματα εργασίας της OPA είχαν συγκεντρώσεις ποσότητας από 0,05 1,0 mmol L -1 και παρασκευάζονταν από το πυκνό με κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισμένο νερό. Τα διαλύματα εργασίας παρασκευάζονταν σε καθημερινή βάση. Τo πυκνό διάλυμα της ιστιδίνης (HIS) είχε συγκέντρωση ποσότητας 10 mmol L -1. Παρασκευαζόταν με διάλυση ακριβώς ζυγισμένης ποσότητας του αντιδραστηρίου σε 1,0 ml μεθανόλης, ακολουθούμενη από αραίωση σε τελικό όγκο 10 ml με δις-απιονισμένο νερό. Το πυκνό διάλυμα του αντιδραστηρίου ήταν σταθερό για ένα μήνα εφόσον φυλάσσονταν στους 4 ο C προστατευμένο από το φως. Τα διαλύματα εργασίας της HIS και παρασκευάζονταν από το πυκνό με κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισμένο νερό. Τα διαλύματα εργασίας παρασκευάζονταν σε καθημερινή βάση. Τα διαλύματα των αμινοξέων (κυστεΐνη, γλυκίνη) και των βιογενών αμινών (καδαβερίνη, πουτρεσκίνη, σπερμιδίνη, σπερμίνη, τρυπταμίνη, τυραμίνη) που χρησιμοποιήθηκαν κατά την επικύρωση της εκλεκτικότητας της μεθόδου, παρασκευαζόταν με διάλυση ακριβώς ζυγισμένης ποσότητας των ενώσεων σε 10 ml δις-απιονισμένο νερού (c = 1.5 mmol L -1 ). Tα διαλύματα εργασίας του Η 3 PO 4 είχαν συγκεντρώσεις ποσότητας από 0,75 2,0 mol L -1 και παρασκευαζόταν καθημερινά από πυκνό διάλυμα του οξέος (c = 4,0 mol L -1 ) με κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισμένο νερό. 41

Tα διαλύματα εργασίας του ΝaOH είχαν συγκεντρώσεις ποσότητας από 0,05 0,2 mol L -1 και παρασκευαζόταν καθημερινά από πυκνό διάλυμα της βάσης (c = 2,0 mol L -1 ) με κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισμένο νερό. To διάλυμα εργασίας του HCl που χρησιμοποιούνταν ως μεταφορέας είχε συγκέντρωση ποσότητας 5 mmol L -1 και παρασκευαζόταν καθημερινά από πυκνό διάλυμα του οξέος (c = 1,0 mol L -1 ) με κατάλληλη αραίωση σε δις-απιονισμένο νερό. Το διάλυμα εργασίας του τριχλωροξικού οξέος (TCA) που χρησιμοποιήθηκε για την προκατεργασία των πραγματικών δειγμάτων είχε κλάσμα μάζας 5 % και παρασκευάζονταν σε δις-απιονισμένο νερό. 42

ΚΕΦ. 10 ΠΡΟΚΑΤΕΡΓΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Τα πραγματικά δείγματα που αναλύθηκαν ήταν δείγματα ψαριού που αγοράσθηκαν από τοπικά Σούπερ Μάρκετ και ήταν τα παρακάτω: 1. Τόνος σε κονσέρβα, μεσογειακής προέλευσης. 2. Τόνος σε κονσέρβα, Ταϊλάνδης. 3. Τόνος φρέσκος, ελληνικής προέλευσης. 4. Σαρδέλες σε κονσέρβα, Ιαπωνίας. 5. Σκουμπρί σε κονσέρβα, ελληνικής προέλευσης. Τα δείγματα κατεργάστηκαν με διάλυση ακριβώς ζυγισμένης ποσότητας του ψαριού σε 5% TCA (με αναλογία ψαριού / TCA 0,1 g ml -1 ). Συνολικά η διαδικασία προκατεργασίας των δειγμάτων περιελάμβανε τα κάτωθι στάδια: 1. Ζύγιση καθορισμένης ποσότητας του κάθε δείγματος και διάλυση του σε κατάλληλο όγκο TCA. 2. Ομογενοποίηση του διαλύματος με κατάλληλο ομογενοποιητή. 3. Εκχύλιση του προσδιοριζόμενου συστατικού σε λουτρό υπερήχων για 30 min. 4. Φυγοκέντριση του εκχυλίσματος για 15 min στις 4500 στροφές. 5. Διήθηση σε φίλτρα σύρριγας 0,45 μm. 6. Συλλογή του διηθημένου δείγματος για τον προσδιορισμό. 43

ΚΕΦ. 11 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΣΤΑΜΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΗ ΜΕΘΟΔΟ SIA Το βελτιστοποιημένο διάγραμμα ροής της SIA για τον προσδιορισμό της ισταμίνης δίνεται στο σχήμα 11.1. Η επιλεχθείσα ακολουθία δίνεται γραφικά στο σχήμα 11.2 και περιγράφεται αναλυτικά στον πίνακα 11.1. Οι βέλτιστες τιμές των κύριων χημικών και οργανολογικών παραμέτρων δίνονται στο σχήμα 11.2. Εν συντομία, συνολικοί όγκοι 50 μl NaOH, 50 μl διαλύματος ΟΡΑ και 70 μl δείγματος αναρροφούνταν στο σπείραμα συγκράτησης σύμφωνα με την ακολουθία του σχήματος 11.2. Στη συνέχεια οι ζώνες των αντιδραστηρίων και του δείγματος αφήνονταν να αντιδράσουν σε συνθήκες αναχαίτισης της ροής για 30 s. Στη συνέχεια εισάγονταν στο σπείραμα συγκράτησης 200 μl διαλύματος H 3 PO 4 ώστε να διακοπεί η αντίδραση και να σταθεροποιηθεί το παράγωγο. Το τελικό μείγμα προωθούνταν προς το φθοριμομετρικό ανιχνευτή με παροχή όγκου ίση με 0,6 ml min -1, μέσω κατάλληλου σπειράματος αντίδρασης (MC). Η ανίχνευση του προϊόντος της αντίδρασης γίνονταν σε μήκη κύματος 365 / 450 nm. Σχήμα 11.1. Οργανολογική διάταξη αναλυτή SIA για τον προσδιορισμό της ισταμίνης: C=HCl, PP=περισταλτική αντλία, HC=σπείραμα συγκράτησης, MPV=βαλβίδα επιλογής, R=OPA, Β=NaOH, S=δείγμα, RC=σπείραμα αντίδρασης, D=ανιχνευτής, W=απόβλητα 44

Σχήμα 11.2. Σχηματική απεικόνιση του κύκλου ανάλυσης για τον προσδιορισμό της ισταμίνης με την τεχνική SIA: S=ακολουθία του κύκλου ανάλυσης, P=περισταλτική αντλία, HC=σπείραμα συγκράτησης, Β=NaOH, R=OPA, S=δείγμα, VP=βαλβίδα επιλογής, ΜC=σπείραμα αντίδρασης, FL=φθορισμομετρικός ανιχνευτής. Ο συνολικός χρόνος ανάλυσης ήταν ίσος με 250 s αντιστοιχώντας σε ρυθμό ανάλυσης δειγμάτων 15 h -1. Σε κάθε περίπτωση πραγματοποιούνταν 3 επαναλαμβανόμενες εγχύσεις προτύπων ή δειγμάτων. Η ποσοτική αποτίμηση γίνονταν με βάση το ύψος των λαμβανόμενων κορυφών. 45

Πίνακας 11.1. Αναλυτικά στάδια κύκλου ανάλυσης 46

ΚΕΦ. 12 ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Ως μέθοδοι αναφοράς επιλέχθηκαν α) επίσημη μέθοδος κατά FDA (ΑΟΑC 977.13) [77] και β) η χρωματογραφία υγρού ιοντοανταλλαγής σε συνδυασμό με παραγωγοποίηση μετάστήλης (PCD). Όσον αφορά στις βασικές χημικές και οργανολογικές συνθήκες της δεύτερης, η παροχή όγκου της κινητής φάσης (5 mmol L -1 HNO 3 ) ήταν ίση με 1.0 ml min -1 (LC-9A, Shimadzu), η έγχυση του δείγματος (50 μl) γίνονταν με χρήση αυτόματου δειγματολήπτη (AS3000, Τhermo Scientific). H αναλυτική στήλη (150 4.0mm i.d., 7 mm, MetroSep C2, Metrohm) θερμοστατούνταν στους 60 o C. Τα αντιδραστήρια της PCD ήταν R A = 2 mmol L -1 OPA και R B = 5 mmol L -1 N-acetylcysteine + 100 mmol L -1 Ρ.Δ. βορικών ph = 10) ωθούμενα με παροχές όγκων 0,25 ml min -1 το καθένα (Minipuls3, Gilson). Η αντίδραση παραγωγοποίησης πραγματοποιούνταν μέσω της διέλευσης από ένα σπείραμα αντίδρασης μήκους 100 cm. H φθορισμομετρική ανίχνευση γίνονταν σε μήκη κύματος 340 / 460 nm (RF-551, Shimadzu). Τα εμβαδά των κορυφών αποτιμούνταν με τη χρήση του λογισμικού Clarity (DataApex). 47

ΚΕΦ. 13 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 13.1. ΑΡΧΗ ΠΡΟΤΕΙΝΟΜΕΝΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ ΧΗΜΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Η προτεινόμενη μέθοδος βασίζεται στην αντίδραση της ισταμίνης με την ΟΡΑ σε αλκαλικό περιβάλλον. Ο μηχανισμός της αντίδρασης δίνεται αναλυτικά στο σχήμα 13.1 [82, 83]. Σύμφωνα με την πορεία αντίδρασης του σχήματος 13.1, η ισταμίνη αντιδρά με την ΟΡΑ σε αλκαλικό περιβάλλον και τα προϊόντα της αντίδρασης εξαρτώνται από την αναλογία των αντιδρώντων. Παρουσία περίσσειας του αντιδραστηρίου, συνθήκη η οποία εφαρμόζεται στην αναλυτική χημεία, η ισταμίνη αντιδρά με δύο μόρια OPA δίνοντας το προϊόν SR 2 το οποίο φθορίζει αλλά δεν είναι σταθερό. Με οξίνιση του τελευταίου επιτυγχάνεται σταθεροποίηση του προϊόντος χωρίς σημαντικές απώλειες στην ένταση του φθορισμού. Για το λόγω αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό το τελευταίο στάδιο, καθώς επιτρέπει την εφαρμογή της αντίδρασης για αναλυτικούς σκοπούς σε μη αυτοματοποιημένες συνθήκες. Σχήμα 13.1. Μηχανισμός αντίδρασης της ισταμίνης με την ΟΡΑ [82,83]. 48

Αξίζει να σχολιαστεί ότι ο παραπάνω μηχανισμός διαφέρει σημαντικά από τον τυπικό μηχανισμό αντίδρασης της ΟΡΑ με πρωτοταγείς αμινο-ενώσεις. Ως γνωστόν η ΟΡΑ αντιδρά με πρωτοταγείς αμίνες σε αλκαλικό περιβάλλον, μόνο παρουσία πυρηνόφιλων ενώσεων (θειόλες, κυανιούχα ιόντα κλπ) προς σχηματισμό φθοριζόντων παραγώγων. Στην περίπτωση της ισταμίνης, η αντίδραση πραγματοποιείται απουσία πυρηνόφιλων ενώσεων, γεγονός που προσδίδει σημαντική εκλεκτικότητα ως προς ενώσεις όπως τα αμινοξέα, η αμμωνία κλπ [59]. Η παραπάνω συμπεριφορά είναι ιδιαίτερα σημαντική όσον αφορά την εφαρμογή του χημικού αυτού συστήματος για αναλυτικούς σκοπούς και ιδιαίτερα σε πολύπλοκα υποστρώματα όπως για παράδειγμα τα δείγματα τροφίμων. Η πιο σημαντική πιθανή παρεμπόδιση σε πιθανές εφαρμογές της αντίδρασης μεταξύ ισταμίνης και OPA για αναλυτικούς σκοπούς σε δείγματα ψαριών, είναι το αμινοξύ ιστιδίνη. Η ιστιδίνη εμφανίζει παρόμοια χημική συμπεριφορά με την ισταμίνη και αντιδρά με την ΟΡΑ ακόμα και απουσία πυρηνόφιλων ενώσεων. Επίσης συνυπάρχει στα πραγματικά δείγματα σε σημαντικές ποσότητες, καθώς η ισταμίνη προέρχεται από αποκαρβοξυλίωση της τελευταίας. Όπως έχει αναφερθεί και στο Κεφάλαιο 7, στη μέθοδο AOAC 977.13 για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε δείγματα ψαριών εφαρμόζεται στάδιο εκχύλισης στερεάς φάσης με χρήση ιοντοανταλλακτικής στήλης για την εξάλειψη της παρεμπόδισης της ιστιδίνης. Βασικοί στόχοι της παρούσας εργασίας ήταν: α) η ανάπτυξη, επικύρωση και εφαρμογή μιας αυτόματης μεθόδου SIA για τον προσδιορισμό της ισταμίνης σε δείγματα ψαριών με βάση την αντίδρασή της με την OPA σε συνθήκες ροής, απουσία πυρηνόφιλων ενώσεων. β) η επίτευξη της μέγιστης εκλεκτικότητας κυρίως όσον αφορά την ιστιδίνη. Η επιθυμητή εκλεκτικότητα επιτεύχθηκε με κινητική διαφοροποίηση των συστατικών μέσω αυστηρού ελέγχου βασικών παραμέτρων του συστήματος, όπως ο χρόνος αντίδρασης, η συγκέντρωση των αντιδραστηρίων κλπ. γ) η δυνατότητα ανάλυσης των πραγματικών δειγμάτων χωρίς το χρονοβόρο στάδιο εκχύλισης στερεάς φάσης της μεθόδου AOAC 977.13. δ) η ελαχιστοποίηση της κατανάλωσης αντιδραστηρίων και παραγωγής αποβλήτων στα πλαίσια των αρχών της «Πράσινης Αναλυτικής Χημείας». 49

13.2. ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΑ ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ Τα προκαταρκτικά πειράματα είχαν σαν στόχο τη διερεύνηση και επιβεβαίωση της δυνατότητας πραγματοποίησης της αντίδρασης μεταξύ ισταμίνης και OPA σε συνθήκες ροής σε σύστημα SIA. Η κύρια «πρόκληση» ήταν η αποτελεσματική αυτοματοποίηση όλων των σταδίων της αντίδρασης σε μονοκαναλικό σύστημα. Τα στάδια αυτά επιγραμματικά περιλαμβάνουν: α) αντίδραση της ισταμίνης με την ΟΡΑ σε αλκαλικό περιβάλλον για αυστηρά καθορισμένο χρονικό διάστημα β) εν-ροή οξίνιση του μίγματος αντίδρασης γ) εν-ροή φθορισμομετρική ανίχνευση Κατά τη διάρκεια των προκαταρκτικών πειραμάτων χρησιμοποιήθηκε σύστημα SIA και ακολουθία σταδίων παρόμοια με αυτά που δίνονται στα σχήματα 11.1 και 11.2. Οι αρχικές τιμές των χημικών και οργανολογικών παραμέτρων δίνονται συγκεντρωτικά στον πίνακα 13.1. Καθόλη τη διάρκεια των πειραμάτων η συγκέντρωση ποσότητας της ισταμίνης ήταν ίση με 10 μmol L -1. Παράλληλα, αναλύονταν και πρότυπα διαλύματα ιστιδίνης (1000 2000 μmol L -1 ) με σκοπό τη μελέτη της επίδρασης της κάθε παραμέτρου και στην εκλεκτικότητα της μεθόδου. H εκλεκτικότητα υπολογίζονταν με βάση συντελεστή S, σύμφωνα με την εξίσωση (1) [79, 80]: (1) Όπου Η(ΗΙΜ) και Η(HIS) τα ύψη των λαμβανόμενων σημάτων για την ισταμίνη (ΗΙΜ) και την ιστιδίνη (HIS) στις αντίστοιχες συγκεντρώσεις ποσότητας των συστατικών (c). 50

Πίνακας 13.1. Αρχικές τιμές χημικών και οργανολογικών παραμέτρων. Παράμετρος Αρχική τιμή c(hcl) ως μεταφορέας / mmol L -1 5,0 c(naoh) / mol L -1 0,1 c(opa) / mmol L -1 1,0 c(h 3 PO 4 ) / mol L -1 1,0 t(αντίδρασης) / s 30 V(H 3 PO 4 ) / μl 150 V(δείγμα) / μl 50 V(ΟΡΑ) / μl 50 V(NaOH) / μl 50 l(mc) / cm 90 λ em / λ ex / nm 365 / 450 Τα προκαταρκτικά πειράματα έδειξαν ότι το παραπάνω χημικό σύστημα μπορεί να αυτοματοποιηθεί αποτελεσματικά σε μονοκαναλικό σύστημα SIA. Ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο αποδείχθηκε ότι παίζει ο τρόπος ανάμιξης των ζωνών των αντιδραστηρίων και του δείγματος. Συγκεκριμένα, όπως φαίνεται στο σχήμα 13.2, δοκιμάστηκαν δύο διαφορετικές ακολουθίες ανάμιξης. Στην πρώτη εγχύονταν διαδοχικά 50 μl από το κάθε διάλυμα, ενώ στη δεύτερη οι ζώνες χωρίστηκαν σε επιμέρους τμήματα των 25 μl. Τα πειραματικά αποτελέσματα που δίνονται στο σχήμα 13.2 έδειξαν σημαντική βελτίωση της ευαισθησίας (τριπλασιασμός των σημάτων) του προσδιορισμού στη δεύτερη περίπτωση, προφανώς λόγω αποτελεσματικότερης ανάμιξης της ζώνης της ισταμίνης με τα αντιδραστήρια. Παράλληλα, η εκλεκτικότητα βελτιώθηκε κατά περίπου 40 %. Κατά συνέπεια, για τη συνέχεια των πειραμάτων επιλέχθηκε η δεύτερη ακολουθία ανάμιξης. 51

Σχήμα 13.2. Επίδραση της ακολουθίας ανάμιξης των ζωνών των αντιδραστηρίων και του δείγματος στην ευαισθησία και την εκλεκτικότητα της μεθόδου. 52

13.3. ΜΕΛΕΤΗ ΧΗΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΟΡΓΑΝΟΛΟΓΙΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ Η επίδραση των διάφορων χημικών και οργανολογικών παραμέτρων της μεθόδου μελετήθηκε μεταβάλλοντας μια παράμετρο τη φορά και διατηρώντας τις υπόλοιπες σταθερές, σύμφωνα με τις αρχικές τιμές του πίνακα 13.1. Η επιλογή της βέλτιστης τιμής κάθε παραμέτρου έγινε με βασικό κριτήριο την εκλεκτικότητα της μεθόδου ως προς την ιστιδίνη και δευτερευόντως την ευαισθησία για την ισταμίνη. Αναλυτικά, μελετήθηκε η επίδραση των παρακάτω παραμέτρων: α) της συγκέντρωσης ποσότητας του ΝαΟΗ β) της συγκέντρωσης ποσότητας της ΟΡΑ γ) της συγκέντρωσης ποσότητας του H 3 PO 4 δ) του χρόνου αντίδρασης (αναχαίτιση της ροής) ε) των όγκων του δείγματος και του H 3 PO 4 στ) του μήκους του σπειράματος αντίδρασης (MC) Σύμφωνα με το μηχανισμό της αντίδρασης της ισταμίνης με της ΟΡΑ (σχήμα 13.1), το πρώτο στάδιο απαιτεί ισχυρά αλκαλικό περιβάλλον. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν διαλύματα ΝαΟΗ. Η επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας του ΝαΟΗ μελετήθηκε σε εύρος 0,05 0,3 mol L -1. Όπως φαίνεται από τα πειραματικά αποτελέσματα του σχήματος 13.3, η εκλεκτικότητα (δευτερεύον άξονας) παρέμενε πρακτικά σταθερή σε εύρος συγκεντρώσεων ποσότητας 0,075 0,2 mol L -1. Σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις ποσότητας ΝαΟΗ παρατηρήθηκε μείωση της εκλεκτικότητας λόγω ισχυρής αντίδρασης και της ιστιδίνης, η οποία ευνοούνταν σε πιο αλκαλικό περιβάλλον. Όσον αφορά στην ευαισθησία της μεθόδου (πρωτεύον άξονας), παρατηρήθηκε σημαντική μη γραμμική αύξηση των λαμβανόμενων σημάτων για την ισταμίνη σε όλο το εύρος των μελετούμενων συγκεντρώσεων ποσότητας ΝαΟΗ, της τάξης των 300 % περίπου. Ως βέλτιστη επιλέχθηκε η τιμή των 0,2 mol L -1 συμβιβάζοντας την υψηλή εκλεκτικότητα και την ικανοποιητική ευαισθησία. Η συγκέντρωση ποσότητας του αντιδραστηρίου παραγωγοποίησης αποδείχθηκε ότι παίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην ευαισθησία όσο και στην εκλεκτικότητα της μεθόδου. Όπως φαίνεται στα πειραματικά αποτελέσματα του σχήματος 13.4, αύξηση της συγκέντρωσης 53

Σχήμα 13.3. Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας του ΝαΟΗ. Σχήμα 13.4. Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας της ΟΡΑ. 54

ποσότητας της ΟΡΑ σε εύρος 0,18 1,0 mmol L -1 είχε σαν αποτέλεσμα δραματική ελάττωση της εκλεκτικότητας της μεθόδου ( 285 %), καθώς σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις ΟΡΑ ευνοείται κινητικά η αντίδραση της ιστιδίνης. Αντίθετα, η ευαισθησία αυξάνονταν κατά περίπου 40 % για το ίδιο εύρος μεταβολής. Για τη συνέχεια των πειραμάτων επιλέχθηκε η συγκέντρωση ποσότητας των 0,25 mmol L -1, η οποία διασφαλίζει ικανοποιητική περίσσεια του αντιδραστηρίου για τον προσδιορισμό της ισταμίνης στα πραγματικά δείγματα σε επίπεδα των μmol L -1. Όπως έχει αναφερθεί στην παράγραφο 13.1, το τελευταίο στάδιο της αντίδρασης απαιτείται οξίνιση του προϊόντος με σκοπό της σταθεροποίησή του και την αύξηση της εκλεκτικότητας ως προς την ιστιδίνη. Σε αρχικό στάδιο δοκιμάστηκε συγκριτικά η επίδραση τριών οξέων HCl, HNO 3 και Η 3 PO 4 όλα σε συγκέντρωση ποσότητας 1,0 mol L -1. Τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν ότι με τα δύο πρώτα οξέα παρατηρείται μια βαθυχρωμική μετατόπιση του χρώματος του παραγώγου με ταυτόχρονη ελάττωση του φθορισμού. Αντίθετα, η χρήση Η 3 PO 4 έδωσε ικανοποιητικές τιμές τόσο για την εκλεκτικότητα όσο και για την ευαισθησία. Συγκεκριμένα, όπως φαίνεται και από τις πειραματικές τιμές του σχήματος 13.5, η μέγιστη εκλεκτικότητα επιτεύχθηκε για συγκέντρωση ποσότητας Η 3 PO 4 ίση με 1,0 mol L -1, η οποία επιλέχθηκε και για τη συνέχεια των πειραμάτων. Σχήμα 13.5. Επίδραση της συγκέντρωσης ποσότητας του H 3 PO 4. 55

Ο χρόνος αντίδρασης μεταξύ της ισταμίνης (και ιστιδίνης) με την ΟΡΑ σε αλκαλικό περιβάλλον αποτελεί μια ιδιαίτερα κρίσιμη παράμετρο τόσο για την ευαισθησία, όσο και για την εκλεκτικότητα της μεθόδου. Τη βασική αρχή για την επίτευξη μέγιστης εκλεκτικότητας αποτελεί η κινητική διαφοροποίηση στις αντιδράσεις των μελετούμενων ενώσεων με την ΟΡΑ. Η ισταμίνη αντιδρά με μεγαλύτερη ταχύτητα, με αποτέλεσμα να ευνοείται η μέτρηση σε σύντομο χρονικό διάστημα. Αυτό δεν ήταν πρακτικά δυνατό σε συνθήκες μη αυτοματοποιημένες, με αποτέλεσμα η μέθοδος AOAC 977.13 να μην έχει υψηλή εκλεκτικότητα ως προς την ιστιδίνη. Η επίδραση του χρόνου αντίδρασης μελετήθηκε σε συνθήκες αναχαίτισης της ροής του μίγματος αντίδρασης μέσα στο σπείραμα συγκράτησης και για εύρος 0 75 s. Τα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα 13.6. Για χρόνο αντίδρασης μεταξύ 0 35 s παρατηρείται αύξηση της εκλεκτικότητας καθώς υπερισχύει η αντίδραση μεταξύ ισταμίνης-ορα. Αντίθετα, περαιτέρω αύξηση του χρόνου αντίδρασης ευνοεί το σχηματισμό του παραγώγου ιστιδίνης-ορα με αποτέλεσμα δραματική μείωση της εκλεκτικότητας. Όσον αφορά στην ευαισθησία της μεθόδου, αύξηση του χρόνου αντίδρασης στο εύρος 0 75 s είχε σαν αποτέλεσμα σχεδόν γραμμική αύξηση των σημάτων της τάξης των 200 % περίπου. Η τιμή των 30 s επιλέχθηκε ως βέλτιστη. Σχήμα 13.6. Επίδραση του χρόνου αντίδρασης με αναχαίτιση της ροής στο σπείραμα συγκράτησης. 56

Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση των όγκων του Η 3 PO 4 και του δείγματος στην ευαισθησία και εκλεκτικότητα της μεθόδου. Ο όγκος του Η 3 PO 4 είναι σημαντική παράμετρος καθότι επηρεάζει την αποτελεσματική επικάλυψη των ζωνών και κατά συνέπεια την αποτελεσματική οξίνιση του μίγματος της αντίδρασης. Τα πειραματικά αποτελέσματα του σχήματος 13.7 δείχνουν ότι αποτελεσματική οξίνιση επιτυγχάνεται για όγκους Η 3 PO 4 μεγαλύτερους των 150 μl. Αντίθετα η ευαισθησία της μεθόδου παρουσιάζει μικρή μείωση της τάξης του 14 %. Ως βέλτιστος επιλέχθηκε ο όγκος των 200 μl. O όγκος του εγχυόμενου δείγματος μελετήθηκε σε εύρος 40 (2 20) 80 (2 40) μl. Η παράμετρος αυτή είναι σημαντική σε συστήματα SIA, καθώς επηρεάζει σημαντικά την ευαισθησία. Για εύρος μεταβολής του όγκου μεταξύ 40 και 70 μl παρατηρήθηκε γραμμική αύξηση τόσο της ευαισθησίας όσο και της εκλεκτικότητας της μεθόδου (σχήμα 13.8). Η τελευταία τιμή επιλέχθηκε ως βέλτιστη για τη συνέχεια των πειραμάτων. Η επόμενη παράμετρος που μελετήθηκε ήταν το μήκος του σπειράματος αντίδρασης (MC). Η σημασία της παραμέτρου αυτής έγκειται μόνο στην ικανοποιητική ανάμιξη του μίγματος της αντίδρασης με τη ζώνη του Η 3 PO 4, καθώς ο χρόνος παραγωγοποίησης καθορίζεται από το διάστημα αναχαίτισης της ροής. Τα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα 13.9. Σημειώνεται ότι η μελέτη της εκλεκτικότητας (δευτερεύον άξονας) έγινε σε δύο επίπεδα ιστιδινης (1000 και 2000 μmol L -1 ). Σχήμα 13.7. Επίδραση του όγκου του H 3 PO 4. 57

Όπως φαίνεται στο σχήμα 13.9, στην περίπτωση των 2000 μmol L -1 ιστιδίνης δεν υπήρχε ικανοποιητική εκλεκτικότητα για μήκη σπειράματος μικρότερα των 90 cm, λόγω μη ικανοποιητικής επικάλυψης των ζωνών και κατά συνέπεια μη επαρκούς οξίνισης. Η τιμή των 90 cm επιλέχθηκε ως βέλτιστη. Σχήμα 13.8. Επίδραση του όγκου του δείγματος. Σχήμα 13.9. Επίδραση του μήκους του σπειράματος αντίδρασης. 58

Η τελευταία παράμετρος που μελετήθηκε ήταν η επίδραση του διαλύτη του δείγματος στην ευαισθησία της μεθόδου. Η ισταμίνη εκχυλίζεται από τα πραγματικά δείγματα ψαριών με χρήση διαλυμάτων τριχλωροξικού οξέος (TCA). Η επίδραση του κλάσματος μάζας του TCA μελετήθηκε σε εύρος τιμών 0 5 %. Τα πειραματικά αποτελέσματα δίνονται στο σχήμα 13.10. Αύξηση του κλάσματος μάζας του TCA μέχρι την τιμή του 1 % είχε σαν αποτέλεσμα μικρή ελάττωση της ευαισθησίας της τάξης του 20 % περίπου. Αντίθετα, περαιτέρω αύξηση του κλάσματος μάζας στην τιμή του 5 % είχε σαν αποτέλεσμα τη δραματική μείωση της ευαισθησίας, προφανώς λόγω εξουδετέρωσης του ΝαΟΗ που είναι απαραίτητο για την πραγματοποίηση της αντίδρασης παραγωγοποίησης της ισταμίνης με την ΟΡΑ. Η τιμή των 0,5 % επιλέχθηκε ως διαλύτης της ισταμίνης για τη συνέχεια των πειραμάτων. Το συγκεκριμένο κλάσμα μάζας TCA είναι κατάλληλο για την προκατεργασία των δειγμάτων και προσφέρει υψηλή σταθερότητα της ισταμίνης [66]. Σχήμα 13.10. Επίδραση του κλάσματος μάζας του τριχλωροξικού οξέος στην ευαισθησία της προτεινόμενης μεθόδου. 59