ΧΑΡΟΚΟΠΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΙΑΙΤΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΛΕΤΗ

ΧΑΡΟΚΟΠΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΙΑΙΤΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΛΕΤΗ ΘΕΜΑ: Επίδραση συμπληρώματος διατροφής που περιέχει φυσικά εκχυλίσματα στις λειτουργίες μονοκυττάρων ΑΥΞΕΝΤΙΟΥ ΓΕΩΡΓΙΑ ΑΜ.: 4421422 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: ΕΛΙΣΑΒΕΤ ΦΡΑΓΚΟΠΟΥΛΟΥ, ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΣΜΑΡΑΓ Η ΑΝΤΩΝΟΠΟΥΛΟΥ ΤΖΩΡΤΖΗΣ ΝΟΜΙΚΟΣ ΑΘΗΝΑ, 2016 [1]

ΧΑΡΟΚΟΠΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΤΜΗΜΑ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΙΑΙΤΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΟΦΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΛΕΤΗ Επίδραση συμπληρώματος διατροφής που περιέχει φυσικά εκχυλίσματα στις λειτουργίες μονοκυττάρων ΑΘΗΝΑ, 2016 [2]

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή μελέτη εκπονήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος σπουδών «Εφαρμοσμένη ιαιτολογία ιατροφή» στο Χαροκόπειο Πανεπιστήμιο. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτρια της εργασίας κυρία Ελισάβετ Φραγκοπούλου, για τη συνολική καθοδήγηση, επίβλεψη και ηθική υποστήριξή της, χωρίς την βοήθεια της οποίας η ολοκλήρωση αυτής της μελέτης θα ήταν αδύνατη. Την ευχαριστώ για το αμείωτο ενδιαφέρον και συμπαράσταση της τόσο κατά την εκτέλεση του πειραματικού μέρους αλλά και κατά τη συγγραφή της μελέτης. Στον κύριο Νομικό οφείλω τις θερμές μου ευχαριστίες για την καθοδήγηση και την υποστήριξη σε όλη τη διάρκεια της εκπόνησης της παρούσας μελέτης. Θερμές ευχαριστίες οφείλω και στην κυρία Αντωνοπούλου για την καθοδήγηση και τις συμβουλές της. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους καθηγητές του Χαροκοπείου Πανεπιστημίου για τις γνώσεις που μου πρόσφεραν όλα αυτά τα χρόνια. Πολλές ευχαριστίες οφείλω στον κύριο Παναγιώτη Γεωργιάδη, Ερευνητή Β του ΙΒΦΧΒ του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών, για την συνολική του καθοδήγηση και υποστήριξη κατά τη διάρκεια των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Χημική Καρκινογένεσης του ΙΒΦΧΒ του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών. Θα ήθελα να ευχαριστήσω επίσης την κυρία Μαργαρίτα Μπεκύρου και την κυρία Κολοντή Ειρήνη από το Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών για την βοήθεια και την καθοδήγησή τους κατά τη διάρκεια των πειραμάτων στο ΕΙΕ. Ιδιαίτερες ευχαριστίες στην Υποψήφια ιδάκτορα Λαμπρινή Γαβριήλ για την βοήθεια της στα πειράματα, τις συμβουλές και την υποστήριξή της. Ευχαριστώ επίσης όλα τα μέλη του εργαστηρίου Βιοχημείας του Χαροκοπείου για την βοήθεια, τις συμβουλές και την καθοδήγησή τους, καθώς και για τις ατελείωτες ώρες που περάσαμε μαζί, τις άψογες σχέσεις και συνεργασία μας. Τέλος, ευχαριστώ από καρδιάς τους γονείς μου και τους παππούδες μου χωρίς την ηθική και οικονομική στήριξη των οποίων δε θα είχα τη δυνατότητα να πραγματοποιήσω τις μεταπτυχιακές μου σπουδές. [3]

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 6-8 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ... 9-11 Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο - ΕΛΕΥΘΕΡΕΣ ΡΙΖΕΣ, ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΑ ΚΑΙ ΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ 1.1 Τι είναι ελεύθερες ρίζες... 13-14 1.1.1Ενεργές μορφές οξυγόνου... 14-15 1.1.2Ενεργές μορφές αζώτου... 15-16 1.2 Πηγές ενεργών μορφών στο ανθρώπινο σώμα... 16-19 1.3 Αντιδράσεις δραστικών μορφών με βιομόρια... 20-22 1.4 Αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί οργανισμού... 22 1.4.1 Ενζυμικά αντιοξειδωτικά συστήματα... 22-24 1.4.2 Μη ενζυμικά αντιοξειδωτικά... 24 Ενδογενή αντιοξειδωτικά... 24-26 Εξωγενή- ιαιτητικά αντιοξειδωτικά... 26-28 1.4.3 Πρωτεΐνες δέσμευσης μετάλλων... 29 1.5 Τι είναι οξειδωτικό στρες και πως δημιουργείται... 29-30 1.6 είκτες οξειδωτικού στρες... 30-34 1.6.1Μέτρηση προϊόντων οξείδωσης μακρομορίων... είκτες υπεροξείδωσης λιπιδίων... 31-32 είκτες οξείδωσης DNA... 32-34 είκτες οξείδωσης πρωτεϊνών... 34 1.6.2 Μέτρηση δραστικότητας αντιοξειδωτικών ενζύμων... 34 1.6.3 Μέτρηση ενδογενών αντιοξειδωτικών... 34 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο ΙΑΤΡΟΦΗ ΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟ ΣΤΡΕΣ ΚΑΙ ΧΡΟΝΙΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ... 2.1 Οξειδωτικό στρες και καρκίνος... 35-36 2.1.1 ιατροφή αντιοξειδωτικά και καρκίνος... 36-37 2.2 Οξειδωτικό στρες και Σακχαρώδης ιαβήτης... 37-38 2.2.1 ιατροφή, αντιοξειδωτικά και διαβήτης... 38-39 [4]

2.3 Οξειδωτικό στρες και νευροεκφυλιστικές νόσοι... 39 2.3.1 Νόσος Alzheimer... 40 2.3.2 ιατροφή στην πρόληψη ή καθυστέρηση της εμφάνισης άνοιας και της νόσου Alzheimer... 40-41 2.4 Καρδιαγγειακά νοσήματα... 41 2.4.1 Οξειδωτικό στρες και αθηροσκλήρωση... 41-43 2.4.2 ίαιτα, αντιοξειδωτικά και καρδιαγγειακά... 43-44 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο Συμπληρώματα διατροφής με αντιοξειδωτικά για την πρόληψη οξειδωτικού στρες και χρόνιων νοσημάτων... 3.1 Συμπληρώματα διατροφής με αντιοξειδωτικές ενώσεις... 45 3.2 Ανασκόπηση της επίδρασης συμπληρωμάτων αντιοξειδωτικών στην πρόληψη χρόνιων νοσημάτων... 3.3 Ανασκόπηση της επίδρασης συμπληρώματος με αντιοξειδωτικά σε δείκτες οξειδωτικού στρες... Κλινικές μελέτες με συμπληρώματα αντιοξειδωτικών και επίδραση σε δείκτες οξειδωτικού στρες in vivo... Ex-vivo κλινικές μελέτες με συμπληρώματα αντιοξειδωτικών και επίδραση σε δείκτες οξειδωτικού στρες... 46-47 47 47-49 50-52 In vitro μελέτες με αντιοξειδωτικά συστατικά και επίδραση σε δείκτες οξειδωτικού στρες 52-54 3.4 Περιγραφή αντιοξειδωτικών συστατικών του συμπληρώματος της παρούσας μελέτης... 54-57 Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο -ΣΚΟΠΟΣ... 59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο - ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ... 59-67 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 ο - ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ... 68-82 Γ. ΣΧΟΛΙΑΣΜΟΣ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ... 82-86 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ... 86-94 [5]

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα φυσικά αντιοξειδωτικά συστατικά της δίαιτας (αντιοξειδωτικές βιταμίνες, ιχνοστοιχεία, φυτοχημικά), τα οποία υπάρχουν στα φρούτα, τα λαχανικά, τα βότανα, τα εκχυλίσματα φυτών και τα ποτά, έχει αποδειχθεί ότι μπορούν να προστατεύουν έναντι στο οξειδωτικό στρες και στην πρόληψη χρόνιων νοσημάτων. Τα συμπληρώματα διατροφής με φυσικά αντιοξειδωτικά συστατικά πιστεύεται ότι μπορούν να συμβάλουν στην πρόληψη χρόνιων ασθενειών, ωστόσο η δράση τους για τον υγιή πληθυσμό δεν έχει επιβεβαιωθεί. Προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι η χορήγηση συμπληρώματος διατροφής που περιέχει φυσικά εκχυλίσματα μειώνει την οξείδωση του DNA/RNA σε σχέση με το εικονικό σκεύασμα. Οι μελέτες που εξετάζουν τη δράση των συμπληρωμάτων με αντιοξειδωτικά συστατικά in vitro, συνεισφέρουν στην κατανόηση μηχανισμού γύρω από τον οποίο δρουν τα εξωγενή αντιοξειδωτικά. Βασικός σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει την επίδραση συμπληρώματος διατροφής με φυσικά εκχυλίσματα και βιταμίνες στις λειτουργίες των μονοκυττάρων U937. Το συμπλήρωμα που χρησιμοποιήθηκε (Mind-Master, LR Health & Beauty Systems) περιέχει Gel από Aloe, εκχύλισμα πράσινου τσαγιού, χυμό σταφυλιού και εκχύλισμα Polygonum cuspidatum το οποίο περιέχει ρεσβερατρόλη. Για να εκτιμηθεί η δράση του συμπληρώματος στην βιωσιμότητα των κυττάρων (κυτταροτοξικότητα) πραγματοποιήθηκε δοκιμασία MTT και για να εκτιμηθεί η οξειδωτική βλάβη στο DNA πραγματοποιήθηκε αλκαλική δοκιμασία κομήτη (Comet Assay) παρουσία του τετραβουτυλικού οξέος (t-booh). Αρχικά κατασκευάστηκαν καμπύλες ανάπτυξης των κυττάρων σε θρεπτικό υλικό παρουσία ή απουσία ορού και καμπύλη αναφοράς για τις συγκεντρώσεις κυττάρων ως προς την απορρόφηση με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα επωάστηκαν απουσία και παρουσία συμπληρώματος, αλόης και εικονικού σκευάσματος διαφορετικών ποσοτήτων και βρέθηκε η κατάλληλη συγκέντρωση συμπληρώματος και αλόης μέσω της δοκιμασίας ΜΤΤ η οποία δεν είναι κυτταροτοξική. Πραγματοποιήθηκαν δοσο-εξαρτώμενα με το t-booh ΜΤΤ και βρέθηκε ότι η κατάλληλη συγκέντρωση για την κυτταροτοξικότητα των κυττάρων είναι τα 400μΜ t- BOOH. Επιπλέον εξετάστηκε η δράση του t-booh στην οξείδωση του DNA με τη μέθοδο Comet, και βρέθηκε ότι η κατάλληλη συγκέντρωση t-booh για την πρόκληση οξειδωτικής βλάβης στο DNA είναι τα 250μΜ. Για να εξεταστεί η κυτταροτοξική και αντιοξειδωτική δράση του συμπληρώματος τα κύτταρα U937 επωάστηκαν με το συμπλήρωμα διατροφής και στη εκτέθηκαν σε t-booh. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε δοκιμασία ΜΤΤ και Comet Assay. Όπως φάνηκε από το ΜΤΤ το συμπλήρωμα δεν εμφάνισε κυτταροτοξική δράση στα κύτταρα. Η δοκιμασία ΜΤΤ με το συμπλήρωμα και την αλόη κάτω από συνθήκες οξειδωτικού στρες (400μΜ t-booh) έδειξε σημαντική αναστολή της δράσης του οξειδωτικού μέσου στις συγκεντρώσεις 0.1%, 0.06%, 0.02% Master Mind και 0.1%, 0.08%, 0.06%, 0.04%, 0.02% αλόης. Μετά από αλκαλική δοκιμασία Comet σε κύτταρα U937, φάνηκε ότι καμιά από τις συγκεντρώσεις συμπληρώματος και αλόης που δοκιμάστηκαν δεν προστατεύουν από τις επαγόμενες από t-booh βλάβες στο DNA. Τα πρόδρομα αυτά αποτελέσματα δείχνουν ότι τα συστατικά του συμπληρώματος διατροφής δεν είναι τοξικά για τα κύτταρα αλλά ούτε εμφανίζουν προστατευτική δράση έναντι της οξείδωσης του DNA όπως έδειξαν τα αποτελέσματα της κλινικής μελέτης πιθανώς λόγω των [6]

μικρών ποσοτήτων που χρησιμοποιήθηκαν στα in vitro πειράματα. Χρειάζονται επιπλέον πειράματα για την διερεύνηση των μηχανισμών δράσης και την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων. Λέξεις κλειδιά: οξειδωτικό στρες, αντιοξειδωτικά, συμπλήρωμα διατροφής, κύτταρα U937, Comet Assay ABSTRACT Natural antioxidants (antioxidant vitamins, minerals, phytochemicals), present in fruit, vegetables, herbs, plant and beverages, have been shown to protect against oxidative stress and prevent chronic diseases. Antioxidant supplements may have a beneficial effect on many chronic diseases, supporting evidence about their effect on healthy individuals is still ambiguous. Our previous studies showed that intervention on healthy volunteers with dietary supplement containing natural extracts reduces oxidation of DNA / RNA compared with placebo. Studies examining the effect of antioxidant supplementation in vitro, contribute to understanding the mechanism around which the exogenous antioxidants act. The objective of the present study was to evaluate the effect of a dietary supplement with natural extracts and vitamins to the functions of monocytes U937. The supplement used (Mind-Master, LR Health & Beauty Systems) contains Gel from Aloe, green tea extract, grape juice and Polygonum cuspidatum extract containing resveratrol. Viability of the supplement was assessed by the MTT assay. To evaluate the genoprotective effects of the supplement under conditions of oxidative stress, alkaline comet assay (Comet Assay) was performed in the presence of tert-butylhydroperoxide (t-booh). Firstly, cell growth curves were constructed on medium in the presence or absence of serum and curve for the cell concentration vs absorption by the MTT assay. Cells incubated in the absence and presence of different concentrations of the supplement, aloe vera and placebo, and the ideal concentration that was not cytotoxic was found by MTT assay. Dosedependent with t-booh MTTs were performed and results show that 400μΜ was the the appropriate concentration for cells cytotoxicity. Furthermore we examined the genotoxic effect of t-booh by the Comet Assay, and we found that the appropriate concentration for DNA oxidative damage was 250 μm. To examine the antioxidant and genoprotective effects of the antioxidant supplement, U937 cells were pretreated with the supplement in different concentrations and then exposed to t- BOOH. MTT assay was performed. DNA damage was assessed by the comet assay. As shown by the MTT the supplement has no cytotoxic effect on the cells. The MTT assay with supplement and aloe vera under conditions of oxidative stress (400mM t-booh) showed significant inhibition of the cytotoxic effect of t-booh at concentrations 0.1%, 0.06%, 0.02% Master Mind and 0.1%, 0.08%, 0.06%, 0.04%, 0.02% aloe vera. Alkaline Comet assay in U937 cells, show that supplement and aloe at the tested concentrations did not protect against t-booh induced DNA damage. So far results show that the components of the dietary supplement is not toxic to the cells and have no effect against oxidation of DNA, as shown by the results of the clinical trial, [7]

probably because of the small quantities used in in vitro experiments. Future experiments are needed to investigate the mechanisms of action and to evaluate these results. Keywords: oxidative stress, antioxidants, dietary supplement, U937 cells, Comet Assay [8]

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ADP: AP-1 ATP: BH 4 : Ca: CAT: CH: CM: CO 2 : Cu: 8-OHdG enos: FAD: Fe: FMN: GPx: GSH: GSSG: HCL: HDL: H 2 O: HPLC: Adenosine diphosphate, διφωσφορική αδενοσίνη Activator protein-1, πρωτεΐνη ενεργοποίησης-1 Adenosine triphosphate, τριφωσφορική αδενοσίνη Tetrahydrobiopterin, τετραϋδροβιοπτερίνη Calcium, ασβέστιο Catalase, καταλάση Cholesterol, χοληστερόλη Chylomicrons, χυλομικρά Carbon dioxide, διοξείδιο του άνθρακα Copper, χαλκός 8-hydroxy-2-deoxyguanosine, 8-υδροξυ-2 -δεοξυγουανοσίνη Endothelial nitric oxide synthase, ενδοθηλιακή συνθάση οξειδίου του αζώτου Flavin adenine dinucleotide, φλάβινο-αδένινο δινουκλεοτίδιο Iron, σίδηρος Flavin mononucleotide, φλάβινο-μονονουκλεοτίδιο Glutathione peroxidase, υπεροξειδάση της γλουταθειόνης Glutathione, γλουταθειόνη Glutathione disulfide, δισουλφίδιο γλουταθειόνης Hydrochloric acid, υδροχλωρικό οξύ High density lipoprotein, λιποπρωτεΐνη υψηλής πυκνότητας Water, νερό High performance liquid chromatography, υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης [9]

ICAM: IFN: IL: inos: LDL: LO: MDA: Mg: Mn: MPO: NAD(P)H: NF-κΒ: NOS: O 2 : ox-ldl: ox-plps PAF PLP: RNS: ROS: Se: SMC: Intracellular adhesion molecule, μόριο διακυτταρικής προσκόλλησης Interferon, ιντερφερόνη Interleukin, ιντερλευκίνη Inductive nitric oxide synthase, επαγόμενη συνθάση οξειδίου του αζώτου Low density lipoprotein, λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας Lipoxygenase, λιποοξυγονάση Malondialdehyde, μαλονδιαλδεΰδη Magnesium, μαγνήσιο Manganese, μαγγάνιο Myeloperoxidase, μυελοϋπεροξειδάση Nicotinamide-adenine (phosphate) dinucleotide, νικοτινάμιδο-αδένινο (φωσφορικό) δινουκλεοτίδιο Nuclear factor- kb, πυρηνικός μεταγραφικός παράγοντας-κβ Nitric oxide synthase, συνθάση οξειδίου του αζώτου Molecular oxygen, μοριακό οξυγόνο Oxidized low density lipoprotein, οξειδωμένη χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη Oxidized phospholipids, οξειδωμένα φωσφολιποειδή Platelet activating factor, παράγοντας ενεργοποίησης αιμοπεταλίων Phospholipids, φωσφολιποειδή Reactive nitrogen species, δραστικές μορφές αζώτου Reactive oxygen species, δραστικές μορφές οξυγόνου Selenium, σελήνιο Smooth muscle cells, λεία μυϊκά κύτταρα [10]

SOD: TBARS: t-booh TNF: VCAM: VLDL: XO: Zn: Superoxide dismutase, υπεροξειδική δισμουτάση Thiobarbituric acid reactive substances, αντιδραστικές ουσίες θειοβαρβιτουρικού οξέος Tert-butylhydroperoxide, τετραβουτυλικό οξύ Tumor necrosis factor, παράγοντας νέκρωσης όγκων Vascular adhesion molecule, μόριο αγγειακής κυτταρικής προσκόλλησης Very low density lipoproteins, λιποπρωτεΐνες πολύ χαμηλής πυκνότητας Xanthine oxidase, οξειδάση της ξανθίνης Zinc, ψευδάργυρος [11]

ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ [12]

Κεφάλαιο 1 ο Ελεύθερες ρίζες, αντιοξειδωτικά και οξειδωτικό στρες 1.1 Τι είναι ελεύθερες ρίζες Τα ηλεκτρόνια ενός ατόμου περιστρέφονται σε τροχιακά γύρω από τον πυρήνα του ατόμου. Ένα ατομικό τροχιακό περιέχει το μέγιστο δύο ηλεκτρόνια. Τα ηλεκτρόνια αυτά βρίσκονται ως ζεύγη στα τροχιακά και το κάθε ζεύγος έχει αντι-παράλληλη στροφορμή (spin). Εάν σε ένα τροχιακό υπάρχει μόνο ένα ηλεκτρόνιο τότε καλείται ασύζευκτο ηλεκτρόνιο. Ελεύθερη ρίζα ορίζεται ως ένα άτομο, μόριο ή ιόν το οποίο περιέχει ένα ή περισσότερα ασύζευκτα ηλεκτρόνια σε ένα τροχιακό, με δυνατότητα αυτοδύναμης ύπαρξης στο χώρο, ανεξάρτητα από την παρουσία άλλων μορίων. Η παρουσία του ασύζευκτου ηλεκτρονίου προσδίδει στις ρίζες σημαντικού βαθμού δραστικότητα με αποτέλεσμα να μπορούν να αντιδρούν εύκολα με τα γειτονικά τους μόρια δίνοντας ή λαμβάνοντας ηλεκτρόνια από αυτά και την έναρξη με τον τρόπο αυτό αλυσιδωτών αντιδράσεων οι οποίες συνεχίζονται μέχρι την παραγωγή ενός μη δραστικού προϊόντος. Οι ελεύθερες ρίζες έχουν μικρή διάρκεια ζωής. Στα βιολογικά συστήματα μπορούν να παραχθούν ποικιλία ελευθέρων ριζών με δραστικότητα ανάλογα με τη φύση του ατόμου/μορίου από το οποίο προέρχονται. Τελευταία χρησιμοποιούνται οι όροι ενεργές μορφές οξυγόνου (Reactive Oxygen Species, ROS) και ενεργές μορφές αζώτου (Reactive Nitrogen Species, RNS). Οι όροι ενεργές μορφές αζώτου και ενεργές μορφές οξυγόνου δεν περιλαμβάνουν μόνο ελεύθερες ρίζες αλλά και μόρια που δεν είναι ρίζες αλλά μπορούν εύκολα να μετατραπούν σε ρίζες πχ Η 2 Ο 2. [7,45] Όταν δύο ρίζες αντιδρούν ενώνουν τα ασύζευκτα ηλεκτρόνιά τους σχηματίζοντας ομοιοπολικό δεσμό μεταξύ τους σε αντιδράσεις που είναι κινητικά γρήγορες και οι οποίες οδηγούν στο σχηματισμό μη ριζών. πχ Ο 2 + ΝΟ = ΟΝΟΟ - Εναλλακτικά μια ρίζα μπορεί να αποσπάσει ένα υδρογόνο Η από δεσμούς C-H, O-H, S-H από άλλα μόρια μη ρίζες. Η αντίδραση αυτή είναι συνηθισμένη στα βιολογικά συστήματα. Τα μόρια που εμπλέκονται σε τέτοιες αντιδράσεις αποτελούν ενώσεις χαμηλού μοριακού βάρους όπως αντιοξειδωτικά, συμπαράγοντες ενζύμων, λιπίδια, πρωτεΐνες, νουκλεϊνικά οξέα και σάκχαρα. Από τις αντιδράσεις αυτές παράγονται νέες ρίζες και αυτές οδηγούν σε άλλες διαδοχικές αντιδράσεις, μέχρι την παραγωγή ενός μη δραστικού προϊόντος. Παράδειγμα: LH+ OH- L- + H 2 O L- + O 2 LOO- LOO- + LH L- + LOOH [13]

Άλλα παραδείγματα ελευθέρων ριζών αποτελούν οι ενεργές μορφές θείου όπως RS- οι οποίες σχηματίζονται από αμινοξέα, και η ρίζα CCL3- η οποία σχηματίζεται κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού του τετραχλωράνθρακα στο ήπαρ από τα ένζυμα του κυτοχρώματος P450.[7,17] 1.1.1 Ενεργές μορφές οξυγόνου Μοριακό οξυγόνο Το οξυγόνο αποτελεί από μόνο του διπλή ρίζα αφού περιέχει δύο ασύζευκτα ζεύγη ηλεκτρονίων σε δύο διαφορετικά τροχιακά. Τα ηλεκτρόνια αυτά έχουν ίδια στροφορμή (spin) και έτσι το οξυγόνο μπορεί να αντιδρά με μόνο ένα ηλεκτρόνιο κάθε φορά. Το γεγονός αυτό έχει ως αποτέλεσμα να περιορίζεται η δραστικότητά του.[7,45] Μονήρες μοριακό οξυγόνο Εάν ένα από τα ασύζευκτα ηλεκτρόνια του μοριακού οξυγόνου διεγερθεί και αλλάξει στροφορμή τότε σχηματίζεται το μονήρες μοριακό οξυγόνο 1 Ο 2. Το μονήρες οξυγόνο διαθέτει υψηλή ενέργεια και είναι ιδιαίτερα δραστικό αφού τα ηλεκτρόνια με αντίθετο spin μπορούν να αντιδράσουν γρήγορα με άλλα ζεύγη ηλεκτρονίων. Η διεγερμένη αυτή μορφή του οξυγόνου μπορεί να παραχθεί από διάφορες μεταβολικές οδούς όπως για παράδειγμα κατά την υπεροξείδωση των λιποειδών των μεμβρανών, καθώς και μέσω φωτοχημικών αντιδράσεων όπως φαίνεται στην παρακάτω αντίδραση:[45] Ο 2 hv 1 Ο 2 Ανιόν υπεροξειδίου Το ανιόν υπεροξειδίου σχηματίζεται με την προσθήκη ενός ηλεκτρονίου στο μοριακό οξυγόνο, το οποίο παραμένει με την προσθήκη αυτή με μόνο ένα ηλεκτρόνιο ασύζευκτο.[45] Ο 2 Ο 2. Στον οργανισμό παράγεται ιδιαίτερα στα λευκά αιμοσφαίρια γιατί χρησιμεύει στην καταστροφή των βακτηρίων, των ιών και των μυκήτων. Ωστόσο η παρουσία αυτών των ριζών μπορεί να γίνει επιβλαβής για τον οργανισμό γιατί το ανιόν υπεροξειδίου αποτελεί ρίζα με μεγάλη οξειδωτική ικανότητα καθώς και δυνητικό υποκινητή για την έναρξη αλυσιδωτών αντιδράσεων οι οποίες μπορούν να οδηγήσουν στην παραγωγή άλλων μορφών οξυγόνου όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το ανιόν υπεροξειδίου μπορεί επίσης να αντιδρά με οξείδιο του αζώτου παράγοντας έτσι πολλά είδη ενεργού αζώτου όπως για παράδειγμα το υπεροξυνιτρώδες. [7] Το ανιόν υπεροξειδίου δεν είναι λιποδιαλυτό μόριο και έτσι δεν διαχέεται μακριά από το χώρο παραγωγής του. [45] Υπεροξείδιο υδρογόνου [14]

Το υπεροξείδιο του υδρογόνου δεν είναι ρίζα αλλά θεωρείται ενεργή μορφή οξυγόνου. Έχει μικρή οξειδωτική ικανότητα αλλά μπορεί να μετατρέπεται σε μια πολύ δραστική ρίζα τη ρίζα υδροξυλίου με τις αντιδράσεις Fenton και Haber-Weiss μη ενζυμικά παρουσία ιόντων μετάλλων (Cu +, Fe 2+ ). Mπορεί να διαχέεται εύκολα διαμέσου των μεμβρανών των κυττάρων και να μετατρέπεται σε ρίζα υδροξυλίου μέσα στα διάφορα οργανίδια εντός του κυττάρου προκαλώντας βλάβες. [7,45] Αντίδραση Haber-Weiss O 2 + H 2 O 2 O 2 + H 2 O + OH Αντίδραση Fenton H 2 O 2 OH + OH - Fe 2+ Fe 3+ Ρίζα υδροξυλίου Η ρίζα υδροξυλίου είναι μια από τις πιο ισχυρές ρίζες η οποία μπορεί να επιτεθεί σε όλα τα μόρια του σώματος όπως υδατάνθρακες, πρωτεΐνες, λιποειδή και DNA. Οι ελεύθερες ρίζες υδροξυλίου έχουν πολύ μικρό χρόνο ημιζωής (10-9 s) και γι αυτό όταν παράγονται δρουν κοντά στο χώρο σχηματισμού τους αποσπώντας γρήγορα ηλεκτρόνια από τα γύρω μόρια. [136] Οι ρίζες υδροξυλίου παράγονται από τις αντιδράσεις Fenton και Haber-Weiss μη ενζυμικά παρουσία ιόντων μετάλλων (Cu +, Fe 2+ ) όπως αναφέρθηκε πιο πάνω καθώς και όταν το σώμα εκτίθεται στις ακτίνες γ, δηλαδή σε χαμηλού μήκους ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία. Οι ακτίνες αυτές διασπούν το νερό στο σώμα για να σχηματίσουν ρίζες υδροξυλίου: [45] H 2 O H. + OH Άλλες ενεργές μορφές οξυγόνου Ρίζες υπεροξειδίου ROO. και Ρίζες αλκοξειδίου RO. Η απλούστερη ρίζα υπεροξειδίου είναι η HOO., η οποία αποτελεί πρωτονιομένη μορφή του ανιόντος του υπεροξειδίου και καλείται ρίζα υδροϋπεροξειδίου. Η ρίζα υδροϋπεροξειδίου είναι υπεύθυνη για την έναρξη της υπεροξείδωσης των λιπιδίων. Οι ρίζες υπεροξειδίου ROO. και οι ρίζες αλκοξειδίου RO. σχηματίζονται κατά την αντίδραση των ριζών OH. και Ο 2. με οργανικά μόρια και κυρίως λιποειδή. [19,136] 1.1.2 Ενεργές μορφές αζώτου Μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ. ) Το ΝΟ είναι ένα μικρό μόριο με μικρή οξειδωτική ικανότητα και μεγάλη ικανότητα διάχυσης. Συντίθεται κατά την αντίδραση οξείδωσης της L- αργινίνης προς κιτρουλλίνη, που καταλύεται από το ένζυμο συνθετάση του ΝΟ (NOS). [15]

Αποτελεί σημαντικό μόριο μεταγωγής σήματος σε μεγάλο αριθμό φυσιολογικών διεργασιών όπως η νευρομεταβίβαση, η χαλάρωση των αγγείων και συμμετέχει επίσης στην ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης και στην αναστολή της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων. Σε μεγάλες συγκεντρώσεις μπορεί να μετατραπεί σε άλλες ενεργές μορφές αζώτου αντιδρώντας με το οξυγόνο ή το ανιόν υπεροξειδίου και να γίνει έτσι τοξικό για τα κύτταρα. [7] Υπεροξυ- νιτρώδες ανιόν (ΟΝΟΟ - ) Αποτελεί την πιο δραστική ρίζα αζώτου. Είναι ισχυρός οξειδωτικός παράγοντας και μπορεί να διαχέεται εύκολα διαμέσου των κυτταρικών μεμβρανών και να αντιδρά με βιομόρια όπως πρωτεΐνες και θειαλκοόλες, καταστρέφοντας ή τροποποιώντας τη λειτουργία τους, καθώς και με το CO 2 παράγοντας ασταθή προϊόντα (bonomini). Παράγεται από την αντίδραση του μονοξειδίου του αζώτου με το οξυγόνο ή το ανιόν υπεροξειδίου. Μπορεί να μετατρέπεται σε άλλες ενεργές μορφές αζώτου όπως ΝΟ 2 - και ΝΟ 2 +. [7,136] ΠΙΝΑΚΑΣ 1- Ενεργές μορφές οξυγόνου και αζώτου ROS ΟΝΟΜΑ RNS ΟΝΟΜΑ O 2 Οξυγόνο NO. Μονοξείδιο του αζώτου O 2 - Ανιόν υπεροξειδίου ONOO- Υπεροξυ-νιτρώδες ανιόν HO- Ρίζα υδροξυλίου HONO 2 Υπεροξυνιτρώδες οξύ H 2 O 2 Υπεροξείδιο του υδρογόνου NO 2 + Ιόν νιτρονίου RO. Ρίζα αλκοξειδίου NO 2 - Νιτρώδες ROO. Ρίζα υπεροξειδίου N 2 O 3 Τριοξείδιο του αζώτου HOCL Υποχλωριώδες οξύ NO 2. Ρίζα διοξειδίου του αζώτου 1.2 Πηγές ενεργών μορφών στο ανθρώπινο σώμα Ποικιλία ενεργών μορφών σχηματίζονται καθημερινά στο ανθρώπινο σώμα, οι οποίες προέρχονται από το εξωτερικό περιβάλλον (εξωγενείς πηγές) είτε παράγονται από διάφορες αντιδράσεις ενζυμικές ή μη μέσα στο σώμα (ενδογενείς πηγές). Εξωγενείς πηγές αποτελούν διάφοροι περιβαλλοντικοί παράγοντες όπως η έκθεση σε αιθαλομίχλη, χημικά, φάρμακα, όζον και ακτινοβολία. Οι ενδογενείς πηγές μπορεί να είναι ενδοκυττάριες ή εξωκυττάριες και αποτελούν οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις που καταλύονται από ένζυμα ή πραγματοποιούνται μη ενζυμικά παρουσία προ-οξειδωτικών μετάλλων καθώς και η διαφυγή ηλεκτρονίων από την αναπνευστική αλυσίδα. Σε κάποιες από αυτές τις αντιδράσεις οι ενεργές μορφές αποτελούν το κύριο προϊόν της αντίδρασης ενώ σε άλλες αποτελούν παραπροϊόντα των βιοχημικών αντιδράσεων. Μερικά από τα σημαντικότερα [16]

ένζυμα είναι τα μικροσωμιακά ένζυμα του κυτοχρώματος Ρ450, η οξειδάση της ξανθίνης, η μυελοϋπεροξειδάση, η λιποοξυγονάση, NAD(P)H και η οξειδάση και συνθετάση ΝΟ. [7,45,129] Αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων- Μιτοχόνδρια Στην αναπνευστική αλυσίδα τα ηλεκτρόνια μεταφέρονται με τελικό αποδέκτη το οξυγόνο για την παραγωγή ΑΤΡ μέσω της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Η διαδικασία πραγματοποιείται σε κλειστό κύκλωμα χωρίς την απελευθέρωση δραστικών ενδιάμεσων. Ωστόσο είναι πιθανό να διαφύγουν ηλεκτρόνια και το οξυγόνο να αναχθεί κατά ένα ηλεκτρόνιο προς Ο 2., και γι αυτό η αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων αποτελεί κύρια πηγή ενδοκυττάριων ROS. [7] Από πειράματα που έχουν γίνει σε απομονωμένα μιτοχόνδρια, εκτιμάται ότι υπάρχει διαρροή περίπου 2-3%. Η διαρροή ηλεκρονίων μπορεί να γίνει κατά τον κύκλο της ουβικινόνης σύμπλοκο ΙΙΙ) όπου η ύπαρξη της ελεύθερης ημικινόνης στο εσωτερικό της μεμβράνης επιτρέπει την τυχαία μεταφορά του ηλεκτρονίου στο Ο 2 και το σχηματισμό Ο 2., καθώς και στο σύμπλοκο Ι (NADH αφυδρογονάση). Η παραγωγή ROS επηρεάζεται από την οξειδοαναγωγική κατάσταση στο μιτοχόνδριο. [124,129]. Τα επίπεδα Ο 2 στο μιτοχόνδριο εξαρτώνται από τη δραστηριότητα του ενζύμου Mn-SOD ένζυμο στη μήτρα του μιτοχονδρίου που μετατρέπει Ο. 2 σε Η 2 Ο 2 και Ο 2. [129] Φαγοκυττάρωση- Αναπνευστική έκρηξη Κατά τη διαδικασία της φαγοκυττάρωσης ξένων ουσιών, βακτηρίων ή ιών, τα ενεργοποιημένα λευκά αιμοσφαίρια ( μονοκύτταρα, ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα, μακροφάγα). καταναλώνουν μεγάλες ποσότητες οξυγόνου για την παραγωγή Ο 2 μέσω του ενζύμου. οξειδάση του NADPH. Οι ρίζες Ο 2 είναι απαραίτητες στα κύτταρα αυτά για την παραγωγή άλλων τοξικών ενεργών μορφών οξυγόνου και αζώτου πχ Η 2 Ο 2 και ΟΝΟΟ- για την. καταστροφή των ξένων βακτηρίων ή άλλων οργανισμών. Επιπλέον οι ρίζες Ο 2 που παράγονται από τα ουδετερόφιλα αυξάνουν την ανοσολογική απόκριση, δρώντας ως χημειοπροσελκυστές άλλων ουδετερόφιλων. [124,129] Η μαζική παραγωγή των αντιμικροβιακών και ογκοκτόνων ROS σε ένα φλεγμονώδες περιβάλλον, παρουσία οξυγόνου ονομάζεται "αναπνευστική έκρηξη" και παίζει σημαντικό ρόλο άμυνας κατά των παθογόνων μικροοργανισμών. [7] NADPH οξειδάση: Βρίσκεται στη μεμβράνη των φαγοκυττάρων και καταλύει το σχηματισμό. Ο 2 από Ο 2, χρησιμοποιώντας ηλεκτρόνια που προέρχονται από το NADPH. Ανήκει στην οικογένεια ενζύμων ΝΟΧ. Είναι γνωστή ως ΝΟΧ 2 ή NADPH οξειδάση φαγοκυττάρων και αποτελεί πρωτεϊνικό σύμπλοκο που περιέχει μόρια αίμης. [43] Μυελοϋπεροξειδάση (MPO): H ΜΡΟ είναι μέλος της οικογένειας των αίμo- υπεροξειδάσων και εκφράζεται σε ουδετερόφιλα και μονοκύτταρα. Βρίσκεται στα κοκκία των φαγοκυττάρων, απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα και καταλύει την παραγωγή HOCL από Η 2 Ο 2 σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση: Η 2 Ο 2 + Cl - + H + HOCl + H 2 O Η μυελοϋπεροξειδάση είναι το μοναδικό ανθρώπινο ένζυμο που είναι γνωστό για την παραγωγή ΗΟCl, και ως εκ τούτου χλωριωμένα βιομόρια όπως η 3 χλωροτυροσίνη [17]

αποτελούν ειδικούς δείκτες των αντιδράσεων οξείδωσης που καταλύονται από το ένζυμο. Το ΗΟCl αποτελεί ένα από τα ισχυρότερα οξειδωτικά και ισχυρό αντιμικροβιακό παράγοντα. [127] Εκτός από ΗΟCl, το σύστημα μυελοϋπεροξειδάσης /H 2 O 2 /Cl μπορεί να δημιουργήσει μια σειρά από δευτερεύοντα οξειδωτικά, που μπορούν να συμμετέχουν σε οξειδωτικές αντιδράσεις με τελικό αποτέλεσμα υπεροξείδωση λιποειδών και οξείδωση της LDL, σχηματισμό προηγμένων τελικών προϊόντων γλυκοζυλίωσης και παραγωγή προϊόντων νίτρωσης. [125] Οξειδάση της ξανθίνης (ΧΟ) Μια άλλη βασική πηγή ενδοκυττάριων ROS είναι η οξειδοαναγωγάση της ξανθίνης, η οποία καταλύει την τελική αντίδραση αποικοδόμησης πουρινών σε δύο βήματα, μετατρέποντας την υποξανθίνη σε ξανθίνη και την ξανθίνη τελικά σε ουρικό οξύ. Η οξειδοαναγωγάση της ξανθίνης είναι μια σιδηρο- θειο- μολυβδαινο φλαβοπρωτεΐνη και υπάρχει κυρίως στο πλάσμα και στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Υφίσταται κυρίως στα κύτταρα ως αφυδρογονάση όπου λαμβάνει τα ηλεκτρόνια του υποστρώματος ανάγοντας το NAD + σε NADH. Κατά τη διάρκεια φλεγμονωδών καταστάσεων, η αφυδρογονάση της ξανθίνης μπορεί να μετατραπεί στην οξειδάση από μια μη αναστρέψιμη πρωτεολυτική επίθεση ή από αναστρέψιμη οξείδωση ομάδων θειόλης στο μόριό της. Ένα άλλο σήμα για το σχηματισμό της οξειδάσης της ξανθίνης είναι η ταλαντούμενη διατμητική τάση, μια κατάσταση που συναντάται συχνά σε θέσεις επιρρεπείς στο σχηματισμό αθηροσκληρωτικής βλάβης. [124] Η οξειδάση της ξανθίνης μεταφέρει ηλεκτρόνια από το οξυγόνο στα μόρια του υποστρώματος δημιουργώντας O - 2 και H 2 O 2. Ωστόσο, δεν είναι απαραίτητη η μετατροπή του ενζύμου σε οξειδάση για την παραγωγή ROS γιατί φαίνεται ότι το ένζυμο εμφανίζει μερική δραστηριότητα αφυδρογονάσης και μερική δραστηριότητα οξειδάσης υπό συνθήκες στις οποίες η αναλογία NADH / NAD + είναι αυξημένη, όπως στην υποξαιμία. [129] NOS - Συνθάσες του ΝΟ Οι συνθάσες ΝΟ είναι μια οικογένεια ενζύμων που καταλύουν την οξείδωση της L- αργινίνης και σε L-κιτρουλλίνη με ταυτόχρονη παραγωγή μονοξειδίου του αζώτου. Υπάρχουν 3 ισομορφές ενζύμων NOS οι οποίες είναι η νευρωνική (nnos), η ενδοθηλιακή (enos) και η επαγόμενη (inos). Τα μέχρι τώρα επιστημονικά δεδομένα ενοχοποιούν για την παραγωγή ενεργών μορφών οξυγόνου την ισομορφή enos. Η μορφή αυτή αποτελεί ένα ομοδιμερές μόριο, με κάθε μονομερές να αποτελείται από μία περιοχή αναγωγάσης (με θέσεις πρόσδεσης για NAD(P)H, FAD, FMN) και μία περιοχή οξειδάσης (με θέσεις πρόσδεσης για τετραϋδροβιοπτερίνη ΒΗ4, L-αργινίνη, ψευδάργυρο και αίμη). [7] Η τετραϋδροβιοπτερίνη ΒΗ 4 αποτελεί συμπαράγοντα του ενζύμου, η οποία δεσμεύεται κοντά στο μόριο της αίμης και μεταφέρει ηλεκτρόνια σε ένα γουανιδινο-άζωτο της L-αργινίνης, μετατρέποντάς το σε μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ). Απουσία του συμπαράγοντα (ΒΗ 4 ) ή του υποστρώματος (L-αργινίνη) οδηγεί σε οξείδωση του μοριακού οξυγόνου προς Ο 2. και Η 2 Ο 2 από το ένζυμο. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται NOS αποσύνδεση (NOS uncoupling).το [18]

φαινόμενο της αποσύνδεσης της enos στο ενδοθήλιο μπορεί να οδηγήσει σε οξειδωτικό στρες και δυσλειτουργία του ενδοθηλίου μέσω 3 μηχανισμών: [127] Α) Η παραγωγή ΝΟ μειώνεται, επιτρέποντας έτσι σε άλλες ενεργές μορφές που θα αντιδρούσαν κανονικά με το ΝΟ να επιτεθούν σε άλλα κύτταρα στόχους. Β) Με την παραγωγή Ο 2. συμβάλλοντας σε αύξηση οξειδωτικού στρες. Γ) Είναι πιθανό να συμβεί μερική αποσύνδεση του ενζύμου με αποτέλεσμα την παραγωγή. ΝΟ και Ο 2 ταυτόχρονα με αποτέλεσμα τη δραματική αύξηση του οξειδωτικού στρες. Λιποξυγoνάσες- LO Ένα άλλο σημαντικό σύστημα παραγωγής ενεργών μορφών οξυγόνου στον ανθρώπινο οργανισμό αποτελούν οι λιποξυγονάσες. Οι LO είναι διοξυγονάσες που περιέχουν σίδηρο και καταλύουν την στερεοειδική ενσωμάτωση μοριακού οξυγόνου σε πολυακόρεστα λιπαρά οξέα. Αποτέλεσμα της οξείδωσης είναι η δημιουργία βιολογικώς δραστικών λιπιδίων όπως προσταγλανδινών, θρομβοξάνων και λευκοτριένιων τα οποία συμμετέχουν σε φλεγμονώδεις αντιδράσεις και μπορούν να αυξήσουν την αγγειακή διαπερατότητα. Κατά τη διάρκεια βιοσύνθεσης λευκοτριενίων παράγονται ενεργές μορφές οξυγόνου. [7] Ορισμένες ισομορφές λιποοξυγονάσης πιστεύεται ότι προωθούν την αθηροσκλήρωση με την παραγωγή ROS και οξειδωτικά τροποποιημένων λιπιδίων, όπως οξειδωμένη λιποπρωτεΐνη χαμηλής πυκνότητας ( ox - LDL). [17] ΣΧΗΜΑ 1. Πηγές ROS, NOS στα κύτταρα [19]

1.3 Αντιδράσεις ελευθέρων ριζών με βιομόρια Μόλις σχηματιστούν οι ελεύθερες ρίζες επιτίθενται σε μακρομόρια του οργανισμού προκαλώντας αλυσιδωτές αντιδράσεις οι οποίες είναι καταστροφικές για το κύτταρο και τον οργανισμό. Ενοχοποιούνται για την οξειδωτική βλάβη του DNA, των πρωτεϊνών, και για την υπεροξείδωση των λιπιδίων των μεμβρανών και των λιποπρωτεϊνών. [7] Υπεροξείδωση λιπιδίων: Τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα που βρίσκονται στα φωσφολιποειδή των κυτταρικών μεμβρανών αλλά και η χοληστερόλη, αποτελούν στόχο των ROS και των RNS. Η διαδικασία υπεροξείδωσης των λιπιδίων αποτελείται από τρία στάδια: την έναρξη, τη διάδοση και τον τερματισμό. Οι ρίζες που ξεκινούν αυτές τις αντιδράσεις περιλαμβάνουν τη ρίζα υδροξυλίου, τη ρίζα αλκοξειδίου και υπεροξειδίου. [7] Οι ρίζες υπεροξειδίου που παράγονται, μόλις σχηματιστούν μετατρέπονται μέσω μιας διεργασίας κυκλοποίησης σε ενδο-υπεροξείδια ενώ τελικά προϊόντα της υπεροξείδωσης είναι η μαλονδιαλδεΰδη (MDA) και η 4-υδροξυ-2-νονενάλη (HNE). Η MDA έχει μεταλλαξιογόνο δράση στα κύτταρα των βακτηρίων και των θηλαστικών και είναι καρκινογόνος για τους επίμυες. Η ΗΝΕ έχει ήπια μεταλλαξιογόνο δράση αλλά φαίνεται να είναι το κύριο τοξικό προϊόντος της υπεροξείδωσης των λιπιδίων. Η εκτεταμένη οξείδωση λιπιδίων της μεμβράνης μπορεί να επηρεάσει τη ρευστότητα, τη διαπερατότητα και τη λειτουργικότητα της μεμβράνης. Η υπεροξείδωση των λιπιδίων σχετίζεται με καρκίνο, αθηροσκλήρωση και φλεγμονή. [137] Οξείδωση πρωτεϊνών: Οι ελεύθερες ρίζες οξειδώνουν αμινοξέα των πρωτεϊνών οδηγώντας σε διάσπαση πεπτιδικών δεσμών ή αλλαγές στη δομή τους με καταστροφικές συνέπειες για τη λειτουργία της πρωτεΐνης. Η οξείδωση της πρωτεΐνης εξαρτάται από το είδος των αμινοξέων που περιέχουν. Τα πιο ευάλωτα αμινοξέα στην οξείδωση είναι κυρίως αυτά που περιέχουν θειούχες ομάδες και ακόρεστους δεσμούς (πχ κυστεΐνη, μεθειονίνη). Κατά την οξείδωση παράγονται πρωτεϊνικά καρβονύλια με πολλούς διαφορετικούς μηχανισμούς και η συγκέντρωσή τους αποτελεί μέτρο της οξείδωσης των πρωτεϊνών από τις ελεύθερες ρίζες. [7,45] Οξειδωτική βλάβη στο DNA: Υπολογίζεται ότι καθημερινά σε ένα ανθρώπινο κύτταρο συμβαίνουν περίπου 2* 10 4 βλάβες στο DNA. Ένα σημαντικό ποσοστό από αυτές τις ζημιές προκαλείται από ελεύθερες ρίζες οξυγόνου. Η μόνιμη μεταβολή του γενετικού υλικού από αυτήν την «οξειδωτική βλάβη» των ελευθέρων ριζών μπορεί να οδηγήσει σε μεταλλάξεις, ενεργοποίηση ογκογονιδίων και άρα καρκινογένεση, χρωμοσωμικές ανωμαλίες και σε γήρανση. [137] Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί πάνω από 100 προϊόντα οξειδωτικής βλάβης του DNA. Οι βλάβες που μπορούν να προκληθούν από ROS περιλαμβάνουν βλάβες στη διπλή έλικα του DNA, βλάβες στην μονή έλικα (single- or double stranded DNA breaks), οξείδωση των βάσεων πουρίνης- πυριμιδίνης, μεταβολές στο σκελετό δεοξυριβοζης και βλάβες στις διασυνδέσεις (DNA cross-links). [137] Το πιο επικίνδυνο θεωρείται το πρώτο είδος βλάβης το οποίο μπορεί να προκαλέσει απόπτωση, αδρανοποίηση βασικών γονιδίων και χρωμοσωμικές ανωμαλίες. [12] [20]

Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου και κυρίως οι ρίζες υδροξυλίου αντιδρούν με τις βάσεις του DNA, είτε με αντιδράσεις προσθήκης υδροξυλίου, είτε με αφαίρεση υδρογόνου από την μεθυλομάδα της θυμίνης ή από τον σκελετό του σακχάρου της δεοξυριβόζης με αποτέλεσμα να προκύπτει αλλυλική ρίζα και ρίζα σακχάρου αντίστοιχα. Η αλληλεπίδραση των ριζών υδροξυλίου με το σάκχαρο της δεοξυριβόζης είναι υπεύθυνη για το σπάσιμο του φωσφοδιεστερικού δεσμού και επομένως σπάσιμο στην μονόκλωνη αλυσίδα του DNA. Οι τροποποιημένες βάσεις και οι ρίζες σακχάρων που παράγονται αντιδρούν περαιτέρω με αποτέλεσμα την δημιουργία μιας σειράς από τροποποιημένες βάσεις και σάκχαρα. Από όλα τα νουκλεοτίδια, η γουανίνη είναι η πιο επιρρεπής σε οξειδωτική βλάβη. Η ρίζα υδροξυλίου αντιδρά με την γουανίνη (βλ. Σχήμα 2) με αποτέλεσμα τον σχηματισμό 8- υδροξυγουανίνης. Η 8-υδροξυγουανίνη είναι το κύριο προϊόν οξειδωτικής βλάβης του γενετικού υλικού και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης της βλάβης του DNA. Η 8- υδροξυγουανίνη μπορεί να οδηγήσει σε μεταλλάξεις και καρκινογένεση. ΣΧΗΜΑ 2. Αντίδραση ρίζας υδροξυλίου με τη γουανίνη Ενεργές μορφές αζώτου (RNS), όπως το νιτρικό υπεροξείδιο και οξείδια του αζώτου, έχουν επίσης εμπλακεί σε βλάβη του DNA. Κατά την αντίδραση νιτρικού υπεροξειδίου με γουανίνη, σχηματίζεται 8-νιτρογουανίνη, η οποία θεωρείται δείκτης αυξημένης οξειδωτικής βλάβης του DNA. [137] Εκτός από το DNA του πυρήνα οξειδώτική βλάβη από ελεύθερες ρίζες μπορεί να προκληθεί και στο μιτοχονδριακό DNA, η οποία έχει συσχετιστεί με τη γήρανση και την ανάπτυξη καρκίνου σε διάφορους ιστούς, όπως του δέρματος. Το μιτοχονδριακό DNA επιπλέον, είναι πιο ευάλωτο σε οξειδωτική βλάβη από το πυρηνικό DNA επειδή, όπως έχει αναφερθεί, η αναπνευστική αλυσίδα στα μιτοχόνδρια αποτελεί πηγή παραγωγής δραστικών μορφών οξυγόνου. Η οξειδωτική βλάβη και οι μεταλλάξεις του μιτοχονδριακού DNA συμμετέχουν σε πολλαπλά στάδια της καρκινογένεσης όπως για παράδειγμα επαγωγή μεταλλάξεων σε μιτοχονδριακά γονίδια, και, ενδεχομένως, εισαγωγή μιτοχονδριακών μεταλλαγμένων γονιδίων στο πυρηνικό DNA. Η οξείδωση του RNA από ελεύθερες ρίζες οξυγόνου έχει επίσης αναφερθεί, αλλά δεν έχει μελετηθεί λεπτομερώς, όπως η οξείδωση DNA. Τόσο ριβοσωμικό RNA και αγγελιαφόρο RNA μπορούν να οξειδωθούν από ελεύθερες ρίζες οξυγόνου. [7] [21]

Όπως έχει αναφερθεί, οι ρίζες οξυγόνου μπορεί να προκαλέσουν πολλαπλές αλλοιώσεις στις βάσεις του DNA οι οποίες μπορούν να οδηγήσουν σε μεταλλάξεις. Ωστόσο, υπάρχουν ειδικοί και μη ειδικοί μηχανισμοί επιδιόρθωσης των τροποποιημένων βάσεων του DNA. [137] Οι διάφορες βλάβες που προκύπτουν ανιχνεύονται πολύ γρήγορα με επακόλουθη την ενεργοποίηση περίπλοκων οδών σηματοδότησης, γνωστή ως ανταπόκριση στη βλάβη του DNA. Η απάντηση αυτή κορυφώνεται με την ενεργοποίηση των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και την κατάλληλη οδό επιδιόρθωσης του DNA, ή, σε ορισμένες περιπτώσεις, την έναρξη των αποπτωτικών διαδικασιών. Η απάντηση στη βλάβη του DNA είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που εκτελείται μέσα από μια σειρά βημάτων. Η έκταση της βλάβης του DNA καθορίζει τη τύχη του κυττάρου: διακοπή του κυτταρικού κύκλου και την επιδιόρθωση του DNA ή ενεργοποίηση των αποπτωτικών οδών. [12] Τα τελικά επίπεδα των τροποποιημένων βάσεων του DNA είναι το αποτέλεσμα της ισορροπίας μεταξύ παραγωγής από τις ελεύθερες ρίζες και απομάκρυνσης από μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA. Άρα είναι σαφές ότι μειωμένη ικανότητα επιδιόρθωσης του DNA σχετίζεται με αυξημένες βλάβες και αυξημένο κίνδυνο για κάποια νόσο. [32] Ενδιαφέρον είναι το γεγονός, ότι η αποτελεσματικότητα των μηχανισμών επιδιόρθωσης μπορεί να ενισχυθεί μετά την έκθεση σε ελεύθερες ρίζες οξυγόνου επειδή η έκφραση πολλών ενζύμων επισκευής DNA αυξάνει ανάλογα με το οξειδωτικό στρες. [137] 1.4 Αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί οργανισμού Η συνεχής έκθεση στις βλαπτικές δράσεις των ελευθέρων ριζών έχει οδηγήσει τους οργανισμούς στην ανάπτυξη διάφορων προστατευτικών μηχανισμών. Το ανθρώπινο σώμα έχει αναπτύξει κάποια φυσικά συστήματα άμυνας όπως οι αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί ώστε να μειώνει την επιβλαβή δράση της συνεχούς παραγωγής ελευθέρων ριζών. Οι αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα, στην κυτταρική μεμβράνη, και στον εξωκυττάριο χώρο, και μπορούν να ταξινομηθούν ως ακολούθως. [102] 1.4.1 Ενζυμικά αντιοξειδωτικά συστήματα Τα αντιοξειδωτικά ένζυμα καταλύουν τη διάσπαση των παραγόμενων ελευθέρων ριζών στο ενδοκυττάριο περιβάλλον. Τα κυριότερα περιλαμβάνουν τις δισμουτάσες του υπεροξειδίου, την καταλάση και την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης. [7] ισμουτάσες υπεροξειδίου- Superoxide Dismutase-SOD Αποτελούν το σημαντικότερο ενζυμικό σύστημα του οργανισμού κατά του ανιόντος υπεροξειδίου. Καταλύουν την εξουδετέρωση του ανιόντος υπεροξειδίου σε υπεροξείδιο του υδρογόνου όπως φαίνεται στην ακόλουθη αντίδραση: 2O 2 - + 2H 2 + H 2 O 2 + O 2 Στο ενεργό κέντρο το ένζυμο περιέχει ένα οξειδοαναγωγικό μέταλλο. Η SOD καταστρέφει άμεσα και με υψηλή ταχύτητα αντίδρασης ρίζες ανιόντος υπεροξειδίου με διαδοχική οξείδωση και αναγωγή του μετάλλου. Υπάρχουν διάφορες ισομορφές του ενζύμου οι οποίες παρουσιάζουν παρόμοιες λειτουργίες αλλά διαφέρουν κυρίως ως προς τη φύση του μετάλλου στο ενεργό κέντρο, τη σύνθεση των αμινοξέων, τους συμπαράγοντες, τον αριθμό υπομονάδων και ως προς τη θέση τους στο κύτταρο. [17] [22]

Στον άνθρωπο απαντούν τρεις μορφές SOD, η μιτοχονδριακή Mn-SOD, η κυτταροπλασματική CuZn-SOD και η εξωκυττάρια SOD. Η CuZn-SOD φέρει στο ενεργό κέντρο ιόντα χαλκού και ψευδάργυρου και απαντάται κυρίως στο κυτταρόπλασμα αλλά και στο διάμεσο χώρο των μιτοχονδρίων. Η Mn-SOD αποτελεί ένα ομοτετραμερές το οποίο περιέχει από ένα άτομο μαγγανίου στο ενεργό κέντρο κάθε υπομονάδας. Βρίσκεται στη θεμέλια ουσία των μιτοχονδρίων και απομακρύνει τις ρίζες O 2 - που σχηματίζονται στη θεμέλια ουσία αλλά και στην εσωτερική μεμβράνη των μιτοχονδρίων. Η εξωκυττάρια SOD είναι μια τετραμερής γλυκοπρωτεΐνη, η οποία φέρει χαλκό και ψευδάργυρο στο ενεργό κέντρο και έχει υψηλή συγγένεια για ορισμένες γλυκοζάμινογλυκάνες όπως η ηπαρίνη. Η σύνθεσή της ρυθμίζεται από κυτοκίνες, αυξητικούς παράγοντες και προοξειδωτικά μόρια και όχι από την οξειδοαναγωγική κατάσταση του κυττάρου. [45,124] Καταλάση-CAT Η καταλάση είναι ένα ενδοκυττάριο αντιοξειδωτικό ένζυμο το οποίο είναι υπεύθυνο για την απομάκρυνση του υπεροξειδίου του υδρογόνου που παράγεται εντός του κυττάρου. Καταλύει την αντίδραση του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε νερό και μοριακό οξυγόνο σε δύο στάδια. Η αντίδραση είναι η εξής: 2Η 2 Ο 2 [...] 2Η 2 Ο + Ο 2 Το ένζυμο ενδοκυτταρικά εντοπίζεται στα υπεροξυσωμάτια και σε μικρότερο βαθμό στα μικροσωμάτια και στο κυτταρόπλασμα. Βρίσκεται σε πολλούς ιστούς/κύτταρα αλλά κυρίως στο ήπαρ και στα ερυθροκύτταρα και εξαρτάται από τον αιμικό σίδηρο. [17] Η CAT είναι πολύ αποτελεσματική σε υψηλού επιπέδου οξειδωτικό στρες, δηλαδή σε υψηλότερες συγκεντρώσεις Η 2 Ο 2. Το ένζυμο είναι ιδιαίτερα σημαντικό σε περιπτώσεις χαμηλής περιεκτικότητας του κυττάρου σε γλουταθειόνη ή σε μειωμένη δραστικότητα της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της ανοχής στο οξειδωτικό στρες και στην προσαρμοστική απόκριση των κυττάρων σε αυτό. [7] Υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης- GPxs Οι υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης καταλύουν την αναγωγή του υπεροξειδίου του υδρογόνου σε νερό και των οργανικών υπεροξειδίων στις αντίστοιχες αλκοόλες, χρησιμοποιώντας ως αναγωγική ουσία τη γλουταθειόνη σύμφωνα με την παρακάτω αντίδραση: H 2 O 2 + 2GSH ROOH + 2GSH 2H 2 O + GSSG ROH + 2H 2 O + GSSG Η γλουταθειόνη λειτουργεί ως υπόστρωμα για την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης και κατά την αντίδραση οξειδώνεται σε GSSG. Κάθε δύο μόρια γλουταθειόνης παρέχουν ένα υδρογόνο από τη δισουλφοδρυλική τους ομάδα για την αναγωγή του υπεροξειδίου του υδρογόνου ή του οργανικού υπεροξειδίου και έπειτα ενώνονται σχηματίζοντας ένα δισουλφιδικό δεσμό. Η οξειδωμένη γλουταθειόνη στη συνέχεια ανάγεται με τη δράση του ενζύμου αναγωγάση της γλουταθειόνης σε γλουταθειόνη ως εξής: [9] GSSG + NADPH + H + 2GSH + NADP + [23]

Στον άνθρωπο υπάρχουν τέσσερις διαφορετικές ισομορφές του ενζύμου (GPxs 1-4), οι οποίες εντοπίζονται σε διαφορετικές κυτταρικές τοποθεσίες αλλά όλες φέρουν στο ενεργό κέντρο κυστεΐνη συνδεδεμένη με σελήνιο. [7]Το σελήνιο είναι απαραίτητος συμπαράγοντας για τη δράση του ενζύμου γι' αυτό και η δράση του εξαρτάται από την επάρκεια της τροφής στο σελήνιο. [17] Οι υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα και τα μιτοχόνδρια όλων των κυττάρων, καθώς και στο πλάσμα. Αν και η αναγωγή του H 2 O 2 γίνεται και από την καταλάση, τα σχετικά επίπεδα GPxs και καταλάσης διαφέρουν από ιστό σε ιστό. Χαρακτηριστικά αναφέρεται ότι ο εγκέφαλος έχει πολύ χαμηλά επίπεδα δραστικότητας καταλάσης και υψηλά επίπεδα δραστικότητας GPxs, ενώ το ήπαρ έχει υψηλά επίπεδα και των δύο ενζύμων. [45] 1.4.2 Μη ενζυμικά αντιοξειδωτικά Τα μη ενζυμικά αντιοξειδωτικά μπορούν να εξουδετερώσουν αλυσιδωτές οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις όπως για παράδειγμα την αλυσιδωτή αντίδραση υπεροξείδωσης των λιπιδίων. Στις αντιδράσεις που συμμετέχουν μπορούν να λάβουν ηλεκτρόνιο από μια ρίζα ή να δώσουν ηλεκτρόνια για τον σχηματισμό ενός σταθερού παραπροϊόντος. Τα ίδια οξειδώνονται και σχηματίζεται η αντιοξειδωτική ρίζα η οποία μπορεί να αναγεννηθεί ή να αντικατασταθεί. Η αντιοξειδωτική ρίζα είναι σχετικά αδρανής και δεν αντιδρά με άλλα μόρια. Αποτελούν μικρά μόρια τα οποία μπορεί είτε να παράγονται στον οργανισμό ( ενδογενή αντιοξειδωτικά) είτε να προσλαμβάνονται από τη διατροφή (εξωγενή αντιοξειδωτικά). Επιπλέον μπορούν να είναι είτε υδροδιαλυτά πχ βιταμίνη C, GSH, είτε λιποδιαλυτά πχ βιταμίνη Ε, καροτενοειδή. [7] Ενδογενή αντιοξειδωτικά Γλουταθειόνη Η γλουταθειόνη είναι ένα τριπεπτίδιο και αποτελεί την κύρια αντιοξειδωτική θειόλη και κύριο ρυθμιστή της ενδοκυττάριας οξειδοαναγωγικής ομοιόστασης. Συντίθεται στο κυτταρόπλασμα από τα ένζυμα συνθετάση του διπεπτιδίου γ-γλουταμυλ-κυστεΐνη και συνθετάση γλουταθειόνης, και αποτελείται από τα αμινοξέα L- γλουταμινικό, L- κυστεΐνη και γλυκίνη. [103] Απαντά είτε στην ανηγμένη της μορφή ως GSH είτε στην οξειδωμένη GSSG. Συμμετέχει στις οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις μέσω της αναστρέψιμης οξείδωσης της ενεργού θειόλης της. Ο λόγος GSH/GSSG αποτελεί αξιόπιστο μέτρο του οξειδωτικού stress ενός οργανισμού. Η γλουταθειόνη δρα ως συνένζυμο πολυάριθμων ενζύμων που συμμετέχουν στην προστασία του κυττάρου όπως υπεροξειδάσες της γλουταθειόνης, τρανσφεράσες της γλουταθειόνης κ.α. εσμεύει άμεσα τη ρίζα υδροξυλίου και το μονήρες οξυγόνο και εξουδετερώνει το υπεροξείδιο του υδρογόνου και οργανικά υπεροξείδια με την καταλυτική δράση της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης. Παρουσιάζει επίσης την ικανότητα να επαναφέρει στην ενεργό τους μορφή σημαντικές αντιοξειδωτικές ουσίες όπως η βιταμίνη C και η βιταμίνη Ε άμεσα ή έμμεσα. [7,45] Ουρικό οξύ Το ουρικό οξύ αποτελεί προϊόν του μεταβολισμού των πουρινών και σημαντικό υδατοδιαλυτό αντιοξειδωτικό στα βιολογικά υγρά του σώματος (πχ πλάσμα) αλλά και εντός [24]

των κυττάρων. Ενεργεί ως δότης ηλεκτρονίων σε άλλες ουσίες με αποτέλεσμα την αναγωγή τους. Μπορεί να εκκαθαρίσει ελεύθερες ρίζες όπως η ρίζα υδροξυλίου, το μονήρες οξυγόνο, προϊόντα οξείδωσης της αίμης και υπεροξείδια όπως το υπεροξυ-νιτρώδες ανιόν (ΟΝΟΟ - ). Προστατεύει πρωτεΐνες από νίτρωση και μπορεί να δεσμεύει μεταβατικά μέταλλα όπως ο σίδηρος και ο χαλκός εμποδίζοντας έτσι την παραγωγή ριζών υδροξυλίου μέσω της αντίδρασης Fenton. [7,103] Το ουρικό οξύ μπορεί να εξουδετερώνει το υπεροξυ-νιτρώδες ανιόν, το οποίο σχηματίζεται από την αντίδραση του ΝΟ με τη ρίζα υπεροξειδίου, αντίδραση που λαμβάνει χώρα κυρίως στο αγγειακό ενδοθήλιο. Το υπεροξυ-νιτρώδες ανιόν (ΟΝΟΟ - ) είναι ικανό να επάγει τον κυτταρικό θάνατο ή την ανώμαλη λειτουργία των κυττάρων συμβάλλοντας έτσι σε διάφορες μορφές καρδιαγγειακών παθήσεων. Σε μελέτες in vitro παρατηρήθηκε αποκατάσταση των μειωμένων επιπέδων ΝΟ σε καλλιέργειες με υπεροξυνιτρώδες, όταν σε αυτές προστέθηκε ουρικό οξύ. Έτσι φαίνεται ότι αυξημένα επίπεδα ουρικού οξέος συνδέονται με ευνοϊκή απόκριση στο οξειδωτικό στρες σε άτομα με αθηροσκλήρωση ή καρδιαγγειακές παθήσεις. [107] Επιπλέον πειραματικά στοιχεία δείχνουν ότι η υπερουριχαιμία μπορεί να είναι ένας αντισταθμιστικός μηχανισμός για την αντιμετώπιση της οξειδωτικής βλάβης που σχετίζεται με την αθηροσκλήρωση και τη γήρανση στον άνθρωπο. [92] Α-Λιποϊκό οξύ Είναι ένα φυσικό συστατικό το οποίο λειτουργεί ως κυτταρικό αντιοξειδωτικό. Αναφέρεται και ως θειοκτικό οξύ και λαμβάνεται είτε από τη διατροφή μέσω ποικιλίας τροφίμων είτε παράγεται ενδογενώς από τον οργανισμό. Λειτουργεί ως συμπαράγοντας του συγκροτήματος της α- αφυδρογονάσης. Το διϋδρολιποϊκό οξύ, η ανηγμένη μορφή του λιποϊκού οξέος δρα στο σώμα ως αναγωγικός παράγοντας απαλείφοντας ελεύθερες ρίζες όπως η ρίζα υδροξυλίου από το περιβάλλον. Το λιποϊκό οξύ που λαμβάνεται μέσω της διατροφής ή εκείνο που παράγεται ενδογενώς ανάγεται στα κύτταρα σε διϋδρολιποϊκό οξύ από την αναγωγάση της γλουταθειόνης, την αφυδρογονάση του διϋδρολιπαμιδίου ή από την αναγωγάση της θειορεδοξίνης. Το διϋδρολιποϊκό οξύ δρα σε υδρόφιλο αλλά και σε λιπόφιλο περιβάλλον και έτσι εντοπίζεται και στην κυτταρική μεμβράνη αλλά και στο κυτταρόπλασμα. Οι αντιοξειδωτικές του λειτουργίες εκτός από την απομάκρυνση ελευθέρων ριζών περιλαμβάνουν και την αναγέννηση άλλων αντιοξειδωτικών όπως η βιταμίνη C, η βιταμίνη Ε και η γλουταθειόνη, και σχηματισμό χηλικών συμπλόκων με μέταλλα όπως ο χαλκός και ο σίδηρος. [7,137] Χολερυθρίνη Είναι το τελικό προϊόντος του καταβολισμού της αίμης. Η χολερυθρίνη είναι ένας ισχυρός αναγωγικός παράγοντας και φυσικό αντιοξειδωτικό. Βρίσκεται κυρίως σε εξωκυττάρια υγρά συνδεδεμένη με αλβουμίνη. Στο εσωτερικό των κυττάρων η χολερυθρίνη βρίσκεται κατά κύριο λόγο σε μεμβράνες και σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις γιατί υψηλότερες συγκεντρώσεις είναι τοξικές για τα κύτταρα. Μπορεί να αποτρέψει την οξείδωση πρωτεϊνών και λιποειδών και να απομακρύνει ρίζες υπεροξυλίου και υπεροξειδίου του υδρογόνου. [103,124] Συνένζυμο Q - Ουβικινόνη Η ουβικινόνη είναι ένα μικρό μόριο το οποίο συντίθεται στα κύτταρα και μεταφέρει ηλεκτρόνια στην αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων στα μιτοχόνδρια. Έχει αποδειχθεί ότι [25]

παρέχει υδρογόνα για την εξουδετέρωση υπεροξειδικών ριζών και επομένως αποτελεί μόριο με αντιοξειδωτικές ικανότητες. Είναι παρούσα σε μικρές ποσότητες στις λιποπρωτεΐνες και χρησιμοποιείται για την εξουδετέρωση λιποειδικών υπεροξειδίων. CoQH 2 + LOO- CoQH- + LOOH Η ρίζα CoQH- μπορεί να αναγεννηθεί σε CoQH 2 ηλεκτρονίων στα μιτοχόνδρια. [7] διαμέσου της αλυσίδας μεταφοράς Μέταλλα Πολλά από τα αντιοξειδωτικά ενζυμικά συστήματα διαθέτουν ως συμπαράγοντες ή προσθετικές ομάδες στο ενεργό κέντρο τους μέταλλα και ιχνοστοιχεία όπως ο χαλκός, το σελήνιο, ο σίδηρος και το μαγγάνιο, ο ψευδάργυρος. Επομένως αποτελούν αναπόσπαστο τμήμα της αντιοξειδωτικής δράσης των ενζύμων και συμμετέχουν έτσι στην αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού. Εντούτοις μερικά από αυτά (Cu, Fe) αποτελούν ισχυρά οξειδωτικά και για το λόγο αυτό βρίσκονται δεσμευμένα σε ειδικές πρωτεΐνες παραμένοντας ανενεργά. [124] Μελατονίνη Η μελατονίνη είναι μια νευροορμόνη που παράγεται από την υπόφυση με σημαντικές βιολογικές λειτουργίες και αντιοξειδωτικές ικανότητες. Μπορεί να δρα ως εκκαθαριστής ελευθέρων ριζών και να αντιδρά με ROS και NOS. εν εμφανίζει προοξειδωτικές ιδιότητες και επιπλέον μπορεί να διαχέεται μέσω των μεμβρανών και να διαπερνά τον εγκεφαλονωτιαίο φραγμό. [7] Εξωγενή - ιαιτητικά αντιοξειδωτικά Παρόλο που τα ενδογενή αντιοξειδωτικά του σώματος είναι πολύ αποτελεσματικά εντούτοις δεν είναι επαρκή. Έτσι είναι απαραίτητη η πρόσληψη εξωγενών αντιοξειδωτικών από τη διατροφή για την ενίσχυση του αντιοξειδωτικού αμυντικού συστήματος του οργανισμού. [14] Κύριες πηγές των αντιοξειδωτικών της διατροφής του ανθρώπου αποτελούν τα φυτικής προέλευσης τρόφιμα και ποτά, όπως τα φρούτα, τα λαχανικά, τα μπαχαρικά (κανέλλα, κουρκουμάς), το τσάι, ο καφές, η σοκολάτα, οι ξηροί καρποί, τα βότανα και το κόκκινο κρασί. Τα πιο γνωστά αντιοξειδωτικά της διατροφής είναι οι αντιοξειδωτικές βιταμίνες, βιταμίνη C, β- καροτένιο (βιταμίνη Α) και βιταμίνη Ε. Εκτός από αυτά χιλιάδες αντιοξειδωτικές ενώσεις βρίσκονται στα φυτά και είναι γνωστές ως φυτοχημικά. [7] Η ισορροπημένη διατροφή πλούσια σε ποικιλία φυτικής προέλευσης τροφίμων και ποτών συνδέεται με προώθηση της υγείας και με μείωση του κινδύνου για διάφορες ασθένειες που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες. [14] Τα κυριότερα αντιοξειδωτικά της διατροφής, οι πηγές και ο ρόλος τους στον οργανισμό περιγράφονται παρακάτω. Βιταμίνη C- Ασκορβικό οξύ Τα περισσότερα ζώα μπορούν να συνθέσουν ασκορβικό οξύ από γλυκόζη, αλλά στους ανθρώπους απουσιάζει ένα ένζυμο (οξειδάση της γουλονολακτόνης) που είναι απαραίτητο για τη σύνθεση και έτσι εξαρτάται από την πρόσληψη μέσω της διατροφής. [124] Είναι μια υδατοδιαλυτή βιταμίνη και συναντάται στα φρούτα (κυρίως εσπεριδοειδή, ακτινίδιο, φράουλες) και τα λαχανικά (λαχανάκια Βρυξελλών, μπρόκολο, ντομάτες, σπανάκι). [26]

Η βιταμίνη C χαρακτηρίζεται ως η μοναδική υδατοδιαλυτή βιταμίνη. Aποτελεί συμπαράγοντα πολλών ενζύμων σε αντιδράσεις υδροξυλίωσης και έτσι συμμετέχει στην σύνθεση κολλαγόνου, καρνιτίνης και πολλών νευροδιαβιβαστών πχ νορεπινεφρίνη, σεροτονίνη, και συμβάλλει στη φυσιολογική λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος. Επιπλέον παρουσιάζει αντιοξειδωτική δράση. Λειτουργεί ως αναγωγικός παράγοντας ή δότης ηλεκτρονίων σε υδατικά διαλύματα όπως είναι το αίμα και το εσωτερικό των κυττάρων εξουδετερώνοντας ενεργές μορφές οξυγόνου και αζώτου όπως οι ρίζες υδροξυλίου, υπεροξείδιο του υδρογόνου κ.α. Το ασκορβικό οξύ (ΑΗ 2 ) χρησιμοποιείται για την αναγέννηση της βιταμίνης Ε (α- τοκοφερόλης) από τη ρίζα της Ε. και σε αυτή τη διαδικασία παράγεται η ρίζα ασκορβικού οξέος (ΑΗ-) η οποία πρέπει να αναγεννηθεί. Η αναγέννηση της βιταμίνης C γίνεται από το NADH(νιασίνη), το διϋδρολιποϊκό οξύ, τη γλουταθειόνη και την θειορεδοξίνη. [61,7] Εντούτοις παρά την αντιοξειδωτική της δράση η βιταμίνη C μπορεί να δρα και ως προοξειδωτικός παράγοντας ανάγοντας μεταβατικά μέταλλα όπως τα ιόντα χαλκού και σιδήρου τα οποία στη συνέχεια συμμετέχουν στην παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου μέσω της αντίδρασης Fenton. Ωστόσο υπάρχουν αποδείξεις ότι η δράση του ασκορβικού οξέος ως προοξειδωτικό δεν παρατηρείται in vivo αλλά γενικά προστατεύει βιολογικά μόρια από την οξείδωση ακόμη και μετά από τη λήψη συμπληρωμάτων σιδήρου. [124] Η ισχυρή αντιοξειδωτική της δράση είναι έκδηλη στους πνεύμονες και στο φακό του ματιού. [45] Βιταμίνη Ε Η βιταμίνη Ε είναι λιποδιαλυτή και απαντά σε οκτώ διαφορετικές μορφές. Από αυτές η α- τοκοφερόλη είναι η πιο δραστική μορφή της βιταμίνης. Αποτελεί το πιο ισχυρό φυσικό αντιοξειδωτικό με κύρια αντιοξειδωτική δράση την προστασία των κυτταρικών μεμβρανών και λιποπρωτεϊνών του πλάσματος από την υπεροξείδωση των λιπιδίων. Φαίνεται ότι το ασκορβικό οξύ και η βιταμίνη Ε λειτουργούν μαζί ως αντιοξειδωτικές ουσίες σε μια κυκλικού τύπου αντίδραση. [45] Κατα την αντιοξειδωτική αντίδραση η α-τοκοφερόλη παρέχει το φαινολικό της υδρογόνο σε ένα λιπίδιο ή μια λιποειδική ή μη λιποειδική ρίζα υπεροξειδίου τερματίζοντας έτσι αλυσιδωτές αντιδράσεις οξείδωσης, και η ίδια μετατρέπεται σε ρίζα τοκοφερόλης η οποία στη συνέχεια αναγεννάτε με τη βοήθεια της βιταμίνης C, της ουβικινόνης και της γλουταθειόνης. Η α-τοκοφερόλη είναι απαραίτητη για την υγεία και μπορεί να προστατεύσει από καρδιαγγειακά, καρκίνο και άλλες παθήσεις. Η βιταμίνη Ε βρίσκεται τόσο σε φυτικά (πχ ελαιόλαδο, ηλιέλαιο) αλλά και σε ζωικά τρόφιμα (πχ κρέας, ψάρι, αυγό). [7] Φυτοχημικά Χημικές ενώσεις με αντιοξειδωτική δράση που βρίσκονται σε φυτικής προέλευσης τρόφιμα. Οι κυριότερες από αυτές είναι οι φαινολικές ενώσεις τα καροτενοειδή και φυτοστερόλες. Φαινολικές ενώσεις Πρόκειται για αρωματικές ενώσεις, φυσικά αντιοξειδωτικά τα οποία βρίσκονται σε φυτικά τρόφιμα. Τροφές πλούσιες σε φαινολικές ενώσεις είναι το τσάι, ο καφές, η σοκολάτα, το κακάο, οι ελιές, το σπανάκι και φρούτα όπως οι φράουλες και τα βατόμουρα. Οι φαινολικές ενώσεις ανάλογα με τη χημική τους δομή χωρίζονται σε φλαβονοειδή, φαινολικά οξέα, [27]

στιλβένια, κουμαρίνες και τανίνες. Τα φλαβονοειδή αποτελούν τη σημαντικότερη ομάδα των πολυφαινολών με περισσότερες από 4000 ενώσεις οι οποίες μπορούν να υποδιαιρεθούν σε 13 κατηγορίες. Το κοινό τους δομικό χαρακτηριστικό είναι η ομάδα διφαινυλοπροπανίου. Στην ομάδα των φαινολικών οξέων ανήκει το καφεϊκό οξύ που βρίσκεται στον καφέ. Από τα στιλβένια η πιο σημαντική ουσία είναι η ρεσβερατρόλη που βρίσκεται στα σταφύλια και το κόκκινο κρασί. [7] Η αντιοξειδωτική δράση των φαινολικών ενώσεων οφείλεται στην ικανότητά τους α) να αναστέλλουν οξειδωτικά ένζυμα, β) να δεσμεύουν ιόντα μετάλλων και γ) να δρουν ως δότες ηλεκρονίων αναστέλλοντας έτσι αλυσιδωτές αντιδράσεις. Παρουσιάζουν ευεργετικές επιπτώσεις στην υγεία του ανθρώπου οι οποίες περιλαμβάνουν την πρόληψη του καρκίνου, την πρόληψη στην εμφάνιση καρδιαγγειακών και άλλων παθολογικών διαταραχών. Εμφανίζουν όμως και προοξειδωτικό χαρακτήρα. [137] Καροτενοειδή Όπως και η βιταμίνη Ε τα καροτενοειδή είναι λιποδιαλυτά αντιοξειδωτικά που βρίσκονται κυρίως στις μεμβράνες των ιστών. Πρόκειται για χρωστικές ουσίες, πρόδρομα μόρια της βιταμίνης Α, που βρίσκονται κυρίως στα φυτά και σε μικροοργανισμούς. Είναι υπεύθυνα για το ερυθρό, το κίτρινο και το πορτοκαλί χρώμα των φρούτων και των λαχανικών. Στη φύση συναντούμε πάνω από 600 καροτενοειδή από τα οποία το πιο γνωστό είναι το β-καροτένιο. Άλλα σημαντικά καροτενοειδή είναι το λυκοπένιο (βρίσκεται στις ντομάτες), η λουτεΐνη, η β- κρυπτοξανθίνη, και η ζεαξανθίνη. [7] Η αντιοξειδωτική δράση των καροτενοειδών οφείλεται στο σύστημα συζευγμένων διπλών δεσμών στη δομή τους που τους δίνει την ικανότητα να μεταφέρουν ασύζευκτα ηλεκτρόνια, εξουδετερώνοντας έτσι ελεύθερες ρίζες όπως ρίζες υδροξυλίου, μονήρες οξυγόνο, οργανικά υπεροξείδια, και ρίζες ανιόντος υπεροξειδίου. Γενικά προτείνονται τρεις μηχανισμοί για τις αντιδράσεις των καροτενοειδών με τις ελεύθερες ρίζες: α) προσθήκη ρίζας, β) αφαίρεση υδρογόνου από τα καροτενοειδή και γ) αντίδραση μεταφοράς ηλεκτρονίων. [137] Το β- καροτένιο και το λυκοπένιο έχουν εξαιρετική ικανότητα την άμεση εξουδετέρωση μονήρες οξυγόνου στα μεμβρανικά συστήματα. Μπορούν να απορροφήσουν ενέργεια από το μονήρες οξυγόνο χωρίς να υποστούν καμιά χημική μετατροπή με την ταυτόχρονη επιστροφή του διεγερμένου οξυγόνου στην αρχική του κατάσταση. Τα καροτενοειδή στη συνέχεια απελευθερώνουν ενέργεια υπο τη μορφή θερμότητας και δε χρειάζεται να αναγεννηθούν. Το λυκοπένιο φαίνεται να είναι περισσότερο αποτελεσματικό στη εξουδετέρωση του μονήρους οξυγόνου από το β- καροτένιο, ενώ. [7] Σε επαρκώς υψηλές συγκεντρώσεις τα καροτενοειδή μπορούν να προστατεύσουν τα λιπίδια των μεμβρανών από υπεροξειδική βλάβη. Εντούτοις έρευνες δείχνουν ότι πιθανό τα καροτενοειδή να έχουν προοξειδωτική δράση σε υψηλές συγκεντρώσεις και κάτω από υψηλές πιέσεις οξυγόνου. [137] Σελήνιο Η αντιοξειδωτική δράση του σεληνίου συνδέεται με την παρουσία του ως συμπαράγοντας στην υπεροξειδάση της γλουταθειόνης και αναγωγάση της θειορεδοξίνης που βοηθούν στην προστασία του DNA και άλλων κυτταρικών συστατικών από την οξειδωτική βλάβη. Βρίσκεται κυρίως σε ζωικά τρόφιμα (πχ εντόσθια) αλλά και σε φυτικά (πχ δημητριακά). Η συγκέντρωση του σεληνίου στο έδαφος διαφέρει από περιοχή σε περιοχή περισσότερο από κάθε άλλο απαραίτητο ιχνοστοιχείο. [7] [28]

1.4.3 Πρωτεΐνες δέσμευσης μετάλλων Όπως έχει αναφερθεί μέταλλα όπως ο χαλκός και ο σίδηρος παρόλο που αποτελούν απαραίτητα συστατικά για τη σύνθεση αντιοξειδωτικών ενζύμων μπορούν να συμμετέχουν σε αντιδράσεις παραγωγής ελευθέρων ριζών με αποτέλεσμα την οξειδωτική βλάβη λιποπρωτεϊνών και άλλων συστατικών των κυττάρων προκαλώντας κυτταρική βλάβη. Για το λόγο αυτό βρίσκονται συνδεδεμένα με πρωτεΐνες και δεν κυκλοφορούν ελεύθερα ως ιόντα. Πρωτεΐνες δέσμευσης χαλκού και σιδήρου είναι για παράδειγμα η φερριτίνη η οποία δεσμεύει το σίδηρο, η σερουλοπλασμίνη η οποία δεσμεύει το χαλκό, η τρανσφερίνη και η αλβουμίνη η οποία δεσμεύει σίδηρο και χαλκό, οι οποίες αποτελούν μέρος του αντιοξειδωτικού συστήματος άμυνας του οργανισμού. [7] Οι μεταλλοθειονίνες είναι μια ομάδα πρωτεϊνών πλούσιων σε κατάλοιπα κυστεΐνης οι οποίες έχουν την ιδιότητα να συνδέουν διαφορετικά ιόντα μετάλλων. Έχουν ιδιαίτερη σημασία στην αντιμετώπιση της τοξικότητας των μετάλλων όπως ο χαλκός. [45] 1.5 Τι είναι οξειδωτικό στρες και πως δημιουργείται Οι ελεύθερες ρίζες αποτελούν προϊόντα του φυσιολογικού μεταβολισμού με δράσεις ευεργετικές ή βλαπτικές για τα κύτταρα και τους οργανισμούς. Οι ευεργετικές τους δράσεις παρατηρούνται σε χαμηλές συγκεντρώσεις και περιλαμβάνουν τη συμμετοχή τους στην άμυνα του οργανισμού για την καταπολέμηση των παθογόνων μικροοργανισμών από τα φαγοκύτταρα, στην κυτταρική απόκριση στο στρες, στην μεταγωγή σήματος, στην έκφραση γονιδίων, στην κυτταρική διαφοροποίηση, στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, στη φλεγμονή και στην απόπτωση. Οι βλαπτικές δράσεις των δραστικών μορφών οξυγόνου και αζώτου, παρατηρούνται σε μεγάλες συγκεντρώσεις και είναι γνωστές ως οξειδωτικό στρες. [7,45] Οξειδωτικό στρες ορίζεται ως η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ των προ-οξειδωτικών και αντι-οξειδωτικών μορίων υπέρ των προ-οξειδωτικών που οδηγεί σε βλάβη. [17] Το οξειδωτικό στρες συμβαίνει στα βιολογικά συστήματα όταν υπάρχει υπερπαραγωγή δραστικών ριζών οξυγόνου/αζώτου ή σε ανεπάρκεια ή αυξημένη απώλεια ενζυμικών ή μη ενζυμικών αντιοξειδωτικών. [45] Το οξειδωτικό στρες εμπλέκεται στην παθοφυσιολογία πολλών νοσημάτων όπως η νόσος Αλτσχάιμερ, Πάρκινσον, καρκίνος, άσθμα, αρτηριοσκλήρωση, νευροεκφυλιστική νόσος, υπέρταση, διαβήτης, ρευματοειδής αρθρίτιδα, γλαύκωμα καθώς και στη διεργασία της γήρανσης μεταξύ άλλων. [102] [29]

ΣΧΗΜΑ 3. Η ανισορροπία αντιοξειδωτικών/προοξειδωτικών οδηγεί σε ανάπτυξη οξειδωτικού στρες 1.6 είκτες οξειδωτικού στρες Κατά την υπεροξείδωση των λιπιδίων, την οξειδωτική βλάβη στο DNA και στις πρωτεΐνες παράγεται ποικιλία υποβαθμισμένων προϊόντων τα οποία χρησιμοποιούνται ως δείκτες για την εκτίμηση της οξειδωτικής βλάβης αλλά και του βαθμού προστασίας που παρέχουν τα αντιοξειδωτικά. [7] Ως δείκτης οξειδωτικού στρες επομένως ορίζεται ένα βιολογικό μόριο του οποίου η χημική δομή έχει τροποποιηθεί από δραστικές μορφές οξυγόνου και αζώτου. Η μέτρηση των δεικτών αυτών μπορεί να βοηθήσει στην πρόληψη παθολογικών καταστάσεων αλλά και στο σχεδιασμό παρεμβάσεων ανάλογα με το στάδιο της οξειδωτικής βλάβης. [23] Επιπρόσθετα τα αντιοξειδωτικά συστατικά στο αίμα όπως η βιταμίνη C, η βιταμίνη Ε, το β- καροτένιο και η γλουταθειόνη, καθώς και η ενεργότητα των αντιοξειδωτικών ενζύμων πχ SOD, μπορούν να μετρηθούν άμεσα για τον υπολογισμό της αντιοξειδωτικής ικανότητας του αίματος. Υπάρχουν πολλές μέθοδοι μέτρησης των δεικτών οξειδωτικού στρες, των αντιοξειδωτικών και των αντιοξειδωτικών ενζύμων που εφαρμόζονται κυρίως στον ορό, το πλάσμα και τα ούρα. Οι κυριότεροι δείκτες περιγράφονται παρακάτω. [7] 1.6.1 Μέτρηση προϊόντων οξείδωσης μακρομορίων είκτες υπεροξείδωσης λιποειδών TBARS [30]

Αποτελούν την παλαιότερη αλλά και την πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδο για τη μέτρηση του τελικού προϊόντος της υπεροξείδωσης των λιποειδών, μαλονδιαλδεΰδης (MDA). Σύμφωνα με τη μέθοδο η MDA σχηματίζει σύμπλοκο με δύο μόρια θειοβαρβιτουρικού οξέος και η ένωση αυτή απορροφά στα 532-535nm. Λαμβάνεται βιολογικό δείγμα το οποίο περιλαμβάνει θειοβαρβιτουρικό, τριχλωροοξικό και υδροχλωρικό οξύ, και έπειτα θερμαίνεται στους 50 C για 20 λεπτά. Στη συνέχεια αφού κρυώσει μετράται η απορρόφηση στο φασματοφωτόμετρο και οι τιμές απορρόφησης είναι ανάλογες της συγκέντρωσης MDA. Ένα από τα μειονεκτήματα της μεθόδου είναι ότι στο δείγμα υπάρχουν συστατικά τα οποία μπορούν και αυτά να αντιδράσουν με το αντιδραστήριο όπως για παράδειγμα άλλες αλδεΰδες, και έτσι να οδηγήσουν σε υπερεκτίμηση της συγκέντρωσης σε MDA. [7] Προσδιορισμός MDA με HPLC Επειδή η μέτρηση της MDA με τα TBARS δεν είναι τόσο ακριβής χρησιμοποιούνται πιο ευαίσθητες μέθοδοι όπως η HPLC, όπου μπορεί να γίνει διαχωρισμός της MDA από τα υπόλοιπα συστατικά με αποτέλεσμα πιο ακριβής μετρήσεις για τη συγκέντρωση της MDA. [23] F2-ισοπροστάνιο Τα ισοπροστάνια παράγονται από τη μη ενζυματική οξείδωση του αραχιδονικού οξέος από ROS. Το αραχιδονικό οξύ έχει 4 διπλούς δεσμούς και έτσι ανάλογα με το που προστίθεται το μόριο του οξυγόνου από τις ROS στο αραχιδονικό σχηματίζονται πολλές σειρές ισοπροστανίων όπου η κάθε σειρά μπορεί να έχει 16 στερεοϊσομερή. Συνολικά σχηματίζονται 64 ισομερή ισοπροστανίων από την οξείδωση του αραχιδονικού οξέος. Από τα ισοπροστάνια το F2-ισοπροστάνιο χρησιμοποιείται συνήθως ως δείκτης οξειδωτικού στρες in vivo. Μπορεί να μετρηθεί είτε από δείγμα ούρων είτε από πλάσμα μέσω 3 μεθόδων, ELISA, αέρια χρωματογραφία σε συνδυασμό με φασματοφωτομετρία μάζας και με υγρή χρωματογραφία σε συνδυασμό με φασματοφωτομετρία μάζας. Από αυτές η μέθοδος ELISA θεωρείται η λιγότερο ευαίσθητη και ειδική. [7,40] Συζυγή διένια Η αποδιάταξη των διπλών δεσμών στα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα από την λιποειδική ρίζα οδηγεί στο σχηματισμό συζυγών διενίων τα οποία αποτελούν σημαντικό δείκτη οξειδωτικού στρες. Για τον προδιορισμό τους χρησιμοποιείται φασματοφωτομετρική μέθοδος όπου μετράται η απορρόφηση στα 233nm η οποία είναι ανάλογη της συγκέντρωσης σε συζυγή διένια. [7,40] Ox-LDL Σημαντικός βιοδείκτης οξειδωτικού στρες που συνδέεται άμεσα με αυξημένο κίνδυνο για καρδιαγγειακά νοσήματα. Για τον προσδιορισμό της χρησιμοποιούνται ανοσολογικές μέθοδοι πχ ELISA. [7] Άλλες μέθοδοι περιλαμβάνουν την έκθεση απομονωμένης LDL σε ιόντα Cu2+ in vitro, όπου παράγεται συζευγμένο διένιο που απορροφά στα 234nm. Σε υψηλές συγκεντρώσεις παρατηρείται καθυστέρηση της οξείδωσης (lag time), η οποία αποτελεί μέτρο της αντίστασης [31]

της LDL στην οξείδωση. Ωστόσο η μέθοδος αυτή δε λαμβάνει υπόψη της αντιοξειδωτικούς και άλλους περιβαλλοντικούς παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την οξείδωση της LDL in vivo. [106] είκτες οξείδωσης DNA Η αξιολόγηση της οξειδωτικής βλάβης του γενετικού υλικού μπορεί να γίνει με δύο μεθόδους, τη μέτρηση της 8-OH-2 -δεοξυγουανοσίνη (8-OHdG) και με τη δοκιμασία comet. 8-OHdG Η 8-OH-2 -δεοξυγουανοσίνη (8-OHdG) είναι ο δείκτης που χρησιμοποιείται συνήθως για τη μέτρηση του οξειδωτικά τροποποιημένου DNA. Αποτελεί προϊόν της οξειδωτικά τροποποιημένης βάσης του DNA γουανίνης. Για τη μέτρηση των επιπέδων της στον οργανισμό μπορούν να χρησιμοποιηθούν ορός, πλάσμα, ούρα και ιστοί. Οι κυριότερες μέθοδοι μέτρησης σε βιολογικά δείγματα είναι ανοσολογικές (πχ ELISA) και χρωματογραφικές (πχ HPLC). Από αυτές η HPLC είναι η μέθοδος με τη μεγαλύτερη ακρίβεια και ευαισθησία αλλά επειδή είναι πολύ χρονοβόρα και πολύπλοκη στην κλινική πράξη χρησιμοποιείται πιο συχνά η μέθοδος ELISA. Η μέτρηση της 8-OHdG στα ούρα έχει βρεθεί ότι αντικατοπτρίζει το σύνολο της οξειδωτικής βλάβης στο σώμα. [7,119] Comet assay Η δοκιμασία Comet αποτελεί μια απλή, ευαίσθητη και γρήγορη μέθοδο για την αξιολόγηση της βλάβης ή της επιδιόρθωσης του DNA, που έχει τη δυνατότητα να ανιχνεύει τη διάσπαση των αλυσίδων του DNA σε μεμονωμένα ευκαρυωτικά κύτταρα, καθώς και σε μερικά προκαρυωτικά κύτταρα. [6] Η μέθοδος αυτή αναπτύχθηκε για πρώτη φορά από τους Ostling και Johanson το 1984 και αργότερα τροποποιήθηκε από τους Singh et al. το 1988. Η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε ευρέως τη δεκαετία του 1990, ενώ σήμερα αποτελεί μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική για την εκτίμηση της βλάβης/επιδιόρθωσης του γενετικού υλικού. Η κύρια βλάβη που ανιχνεύει είναι οι εγκοπές του DNA. Η δοκιμασία comet assay ονομάζεται επίσης και singlegel electrophoresis (SCGE), single cell gell assay (SCG) και micro gel electrophoresis. Ο όρος "κομήτης/comet" αφορά το μοντέλο της μετανάστευσης των βρόγχων και θραυσμάτων του πυρηνικού DNA μέσω της γέλης ηλεκτροφόρησης, η οποία σχηματίζει μια ουρά που συχνά μοιάζει με κομήτη. [48] Η δοκιμασία comet περιλαμβάνει: 1) ανάμειξη των κυττάρων με ένα εναιώρημα αγαρόζης χαμηλού σημείου τήξεως (low melting agarose) σε ένα γυάλινο slide μικροσκοπίου, 2) λύση των κυττάρων με απορρυπαντικό υψηλής συγκέντρωσης άλατος και 3) ηλεκτροφόρηση των αιωρούμενων λυμένων κυττάρων σε ένα συγκεκριμένο ph. Ανάλογα με τις συνθήκες του ph που γίνεται η ηλεκτροφόρηση των κυττάρων η δοκιμασία Comet μπορεί να ταξινομηθεί σε δύο τύπους: 1) ουδέτερο comet assay και 2) αλκαλικό comet assay. Στο ουδέτερο comet η ηλεκτροφόρηση των κυττάρων διεξάγεται σε ουδέτερο ph 7-8 και επιτρέπει την ανίχνευση εγκοπών στη δίκλωνη αλυσίδα του DNA ανεξάρτητα από την παρουσία βλάβης στη μονή αλυσίδα. Η δοκιμασία του αλκαλικού comet διεξάγεται σε ph 12.1-12.4 και επιτρέπει την ανίχνευση μονόκλονων και δίκλονων εγκοπών (strand breaks) στο DNA. [32]

Η ιδέα στην οποία βασίζεται η δοκιμασία comet είναι ότι το ακέραιο DNA διατηρεί μια εξαιρετικά οργανωμένη σύνδεση με τις πρωτεΐνες της μήτρας στον πυρήνα του κυττάρου (πυρηνοειδές). Όταν καταστραφεί, αυτή η οργάνωση διαταράσσεται. Οι επιμέρους κλώνοι του DNA χάνουν τη συμπαγή δομή τους με αποτέλεσμα να χαλαρώνουν και να μεταναστεύουν έξω από την κοιλότητα μέσα στην αγαρόζη, κατα τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης. Όταν εφαρμόζεται ηλεκτρικό πεδίο, το DNA, το οποίο έχει ένα συνολικό αρνητικό φορτίο, έλκεται προς τη θετικά φορτισμένη άνοδο. Το αρνητικά φορτισμένο DNA το οποίο περιέχει θραύσματα/εγκοπές είναι χαλαρό και τα σπασμένα άκρα είναι σε θέση να μεταναστεύουν προς την άνοδο. Αντίθετα η απουσία θραυσμάτων και ελεύθερων άκρων από το άθικτο DNA, εμποδίζει την μετανάστευση. Η έκταση της μετανάστευσης του DNA εξαρτάται άμεσα από τη βλάβη του DNA που υπάρχει στα κύτταρα. [27,98] Στο σχήμα 4 φαίνεται η δομή του πυρηνοειδούς άθικτου DNA και η δομή του «κομήτη» που αποτελείται από μια κυκλική κεφαλή που αντιστοιχεί στην άθικτη περιοχή του DNA που παραμένει στην κοιλότητα και μια ουρά του κατεστραμμένου DNA. [114] Το μέγεθος και το σχήμα του κομήτη και η κατανομή του DNA εντός του κομήτη συσχετίζονται με την έκταση της βλάβης του DNA. [48] ΣΧΗΜΑ 4. Δομή πυρηνοειδούς και κομήτη στο Comet Assay Τα πλεονεκτήματα της μεθόδου μεταξύ άλλων περιλαμβάνουν 1) μικρό αριθμό κυττάρων ανά δείγμα (10,000 κύτταρα ανα δείγμα), 2) εύκολη επεξεργασία, 3)υψηλή ευαισθησία αφού μπορεί να ανιχνεύσει ακόμα και χαμηλά επίπεδα βλάβης στο DNA 4)ανάλυση ζημιών στο DNA σε οποιαδήποτε φάση του κυτταρικού κύκλου, 5)ευέλικτη και φθηνή, 6)ανιχνεύει βλάβες τόσο σε διαιρούμενα κύτταρα όσο και σε μη διαιρούμενα κύτταρα. [6,131] Τα μειονεκτήματα του comet assay περιλαμβάνουν: 1) δε γίνεται διαχωρισμός των διαφόρων ειδών βλαβης στο DNA, 2) λαμβάνονται δεδομένα από ένα μόνο κύτταρο, 3)μικρό δείγμα, 4) τεχνική μεταβλητότητα. Ωστόσο, τα πλεονεκτήματα ξεπερνούν τα μειονεκτήματα γι αυτό και η μέθοδος χρησιμοποιείται ευρέως σε διάφορους ερευνητικούς τομείς, όπως είναι [33]

η γενετική τοξικολογία, βιοπαρακολούθηση των υδρόβιων οργανισμών, ραδιοβιολογία, σε μελέτες βιοπαρακολούθησης ανθρώπων, σε μελέτες για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής επίδρασης διαφόρων ενδογενών ή διατροφικών ενώσεων, δοκιμές γονοτοξικότητας, στην έρευνα για τη θεραπεία του καρκίνου, στη βασική έρευνα για την βλάβη και επισκευή του DNA και άλλες πολλές εφαρμογές. [6] είκτες οξείδωσης πρωτεϊνών Πρωτεϊνικά καρβονύλια Ο σχηματισμός των πρωτεϊνικών καρβονυλίων μπορεί να γίνει με α) άμεση οξείδωση πλευρικών αλυσίδων των αμινοξέων (πχ λυσίνης, θρεονίνης, αργινίνης, προλίνης), β) με εισαγωγή μιας ομάδας καρβονυλίου στις πρωτεΐνες λόγω αντίδρασης με αλδεΰδες προϊόντα υπεροξείδωσης λιπιδίων ή γ) λόγω αντιδράσεων γλυκοζυλίωσης ή γλυκοοξείδωσης. Τα πρωτεϊνικά καρβονύλια κυκλοφορούν στο αίμα για μεγάλο χρονικό διάστημα, σε σύγκριση με άλλα προϊόντα οξείδωσης, και έτσι αποτελούν κατάλληλους δείκτες οξείδωσης των πρωτεϊνών. [7,45] Ποικιλία μεθόδων είναι διαθέσιμες για την ανίχνευση των πρωτεϊνικών καρβονυλίων. Αυτές περιλαμβάνουν φασματοφωτομετρικές, την HPLC και την ELISA. Ωστόσο καμία από αυτές τις μεθόδους δε μπορεί να προσδιορίσει ποια αμινοξέα έχουν υποστεί οξειδωτική βλάβη και ποια είναι η πρωτεΐνη που έχει τροποποιηθεί. [119] 1.6.2 Μέτρηση δραστικότητας αντιοξειδωτικών ενζύμων Η μέτρηση της δραστικότητας των αντιοξειδωτικών ενζύμων όπως η GPx, SOD, CAT αποτελεί μέτρο της αντιοξειδωτικής ικανότητάς τους και βοηθά στην αξιολόγηση του αμυντικού συστήματος του οργανισμού. Για τη μέτρηση της ενεργότητας τους στον ορό ή το πλάσμα με υψηλή ακρίβεια είναι διαθέσιμα στο εμπόριο φασματοφωτομετρικά και φθορισμομετρικά κιτ. [7] 1.6.3 Μέτρηση αντιοξειδωτικών Κάτω από συνθήκες οξειδωτικού στρες τα μη ενζυμικά αντιοξειδωτικά όπως η γλουταθειόνη και οι αντιοξειδωτικές βιταμίνες (βιταμίνη Ε, C, καροτενοειδή) καταναλώνονται και έτσι τα επίπεδα τους στο αίμα μειώνονται. Έτσι η μέτρησή τους αποτελεί χρήσιμο εργαλείο για την αξιολόγηση της κατάστασης οξειδωτικού στρες στο σώμα. Όπως και στα αντιοξειδωτικά ένζυμα υπάρχουν διαθέσιμα κιτ για την ανάλυση της γλουταθειόνης και των αντιοξειδωτικών βιταμινών. Ωστόσο χρωματογραφικές μέθοδοι (πχ HPLC) έχουν μεγαλύτερη ακρίβεια κατα τη μέτρηση της α-τοκοφερόλης, ρετινόλης και β- καροτενίου. Για την ανάλυση της βιταμίνης C στον ορό μπορεί να χρησιμοποιηθεί και φασματοφθορισμομετρική μέθοδος. [7,119] [34]

ΣΧΗΜΑ 5. Δείκτες οξειδωτικού στρες Κεφάλαιο 2 ο - ιατροφή, οξειδωτικό στρες και χρονια νοσήματα Το οξειδωτικό στρες εμπλέκεται στην παθοφυσιολογία διαφόρων παθολογικών καταστάσεων οι οποίες περιλαμβάνουν την αθηροσκλήρωση, τη στεφανιαία νόσο, καρκίνο, νευρολογικές διαταραχές, διαβήτη, αρτηριακή υπέρταση, παγκρεατίτιδα, καρδιακή ανεπάρκεια, το σύνδρομο ισχαιμίας-επαναιμάτωσης, τη μη αλκοολική λιπώδη νόσο του ήπατος, την προεκλαμψία, ρευματοειδή αρθρίτιδα, το σύνδρομο επίκτητης ανοσοανεπάρκειας (AIDS), γλαύκωμα καθώς και στη διεργασία της γήρανσης. [45,102,136] Ενώ ορισμένες από αυτές τις ασθένειες μπορεί να προκαλούνται από οξειδωτική βλάβη των πρωτεΐνών, του DNA, και των λιπίδιων, σε άλλες μπορεί το οξειδωτικό στρες να είναι συνέπεια και όχι η αιτία της πρωτογενούς διαδικασίας. [145] 2.1 Οξειδωτικό στρες και καρκίνος Ο καρκίνος αποτελεί δεύτερη αιτία θανάτου παγκοσμίως μετά τα καρδιαγγειακά νοσήματα. Απο το 1950 έχει βρεθεί ότι το οξειδωτικό στρες πιθανό να εμπλέκεται στην καρκινογένεση. Υπάρχουν πολλοί προτεινόμενοι μηχανισμοί που εμπλέκουν το οξειδωτικό στρες με τον καρκίνο. Εκ των οποίων η πιο αποδεκτή είναι ότι η υπερβολική παραγωγή ελεύθερων ριζών επιδρά αρνητικά στα βιολογικά μακρομόρια, οδηγώντας σε ογκογένεση. [7] Η οξειδωτική βλάβη στο DNA θεωρείται ότι είναι ένας σημαντικός προαγωγός του καρκίνου. Υψηλής δραστικότητας ρίζες υδροξυλίου αλλά και άλλες ελεύθερες ρίζες, [35]

μπορούν να προκαλέσουν οξειδωτική βλάβη στο DNA, με αποτέλεσμα τη δημιουργία τροποποιημένων βάσεων πουρίνης και πυριμιδίνης. Η μόνιμη μεταβολή του γενετικού υλικού από την οξειδωτική βλάβη των ελευθέρων ριζών μπορεί να οδηγήσει σε μεταλλάξεις, ενεργοποίηση ογκογονιδίων και άρα καρκινογένεση. Επιπλέον, η μεθυλίωση του DNA μπορεί να επηρεάζεται από οξείδωση. Μελέτες έχουν δείξει ότι το DNA που έχει υποστεί οξειδωτική βλάβη τείνει να είναι υπομεθυλιωμένο. Η μεθυλίωση του DNA διαδραματίζει έναν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση των γονιδίων, και υπομεθυλιωμένο DNA έχει βρεθεί σε πολλά είδη καρκίνων. Εκτός από τις άμεσες βλάβες στο DNA από τις ελεύθερες ρίζες, οξειδωτική βλάβη σε λιπίδια και πρωτεΐνες όπως ένζυμα επισκευής DNA θα μπορούσε επίσης να οδηγήσει σε μεταλλάξεις του DNA. [7] Ένας σημαντικός παράγοντας στην ανάπτυξη του καρκίνου μπορεί να είναι οι μεταλλάξεις στο γονίδιο ρ53 (γονίδιο ογκο-καταστολής), μεταγραφικός παράγοντας που δρα για να παρεμποδίσει την κυτταρική διαίρεση. Εάν τα γονίδια p53 αδρανοποιούνται, τότε τα κύτταρα μπορούν να εισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο με κατεστραμμένο DNA. Περίπου 75% των καρκίνων του παχέος και το 90% των καρκίνων του δέρματος έχουν μεταλλάξεις στο γονίδιο ρ53. [145] Το οξειδωτικό στρες μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει διάφορους παράγοντες μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένου του ΝF-κΒ (πυρηνικός παράγοντας-κβ), ΑΡ-1 (ενεργοποιητής πρωτεΐνης-1), HIF-1α (υποξία παράγοντα-1α), PPAR-γ (περοξειζόμης proliferatoractivatedυποδοχέα-γ), β-κατενίνης / Wnt, και Nrf2 (πυρηνικός παράγοντας E2- συναφείςσυντελεστής 2). Η ενεργοποίηση αυτών των μεταγραφικών παραγόντων μπορεί να επηρεάσει την έκφραση πάνω από 500 γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων γονιδίων που ρυθμίζουν αυξητικούς παράγοντες, φλεγμονώδεις κυτοκίνες, χημειοκίνες, μόρια ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, και αντι-φλεγμονώδη μόρια, δείχνοντας ότι το οξειδωτικό στρες, η χρόνια φλεγμονή και ο καρκίνος είναι στενά συνδεδεμένα. [7] 2.1.1 ιατροφή, αντιοξειδωτικά και καρκίνος Η ενίσχυση της αντιοξειδωτικής άμυνας του οργανισμού μέσω της διατροφής έχει αποδεδειγμένα οφέλη στην πρόληψη κατά του καρκίνου. Επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι η κατανάλωση φυτοχημικών που βρίσκονται στα φρούτα και τα λαχανικά μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο διαφόρων καρκίνων. Μεταξύ των διαφόρων λαχανικών, τα σταυρανθή λαχανικά, όπως τα μπρόκολα σχετίζονται με μειωμένο κίνδυνο καρκίνου σε όργανα όπως του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, του προστάτη, και του μαστού. [2] Η μεσογειακή διατροφή συνδέεται με χαμηλότερο κίνδυνο καρκίνου. O μηχανισμός της εν λόγω προστασίας πιθανώς σχετίζεται περιεκτικότητα της σε μονοακόρεστα, ωμέγα-6, και ωμέγα-3 λιπαρά οξέα, με τις υψηλές ποσότητες φυτικών ινών, τα αντιοξειδωτικά συστατικά των φρούτων, των λαχανικών και του κρασιού. [53] To τσάι και ο καφές είναι πλούσια σε αντιοξειδωτικά συστατικά. Η ευεργετικές ιδιότητες του τσαγιού έχουν αποδοθεί στις φαινολικές ενώσεις που περιέχει και ιδιαίτερα στις κατεχίνες του πράσινου τσαγιού και τις θεαφλαβίνες (theaflavins) του μαύρου τσαγιού. Οι φαινολικές αυτές ενώσεις έχει φανεί ότι έχουν αντικαρκινικές ιδιότητες και μπορούν να μειώσουν τον [36]

κίνδυνο διαφόρων καρκίνων [34]. Η κατανάλωση καφέ σχετίζεται επίσης με μειωμένο κίνδυνο καρκίνου του ήπατος και χρόνιων παθήσεων του ήπατος. [82] Οι διαιτητικές ίνες έχουν προστατευτική δράση κατά του καρκίνου του παχέος εντέρου. Ωστόσο, η υψηλή κατανάλωση κόκκινου κρέατος, καπνιστά τρόφιμα, ή αλλαντικά, πιστεύεται ότι συμβάλλει στην καρκινογένεση. [21]. Μελέτες έχουν δείξει ότι το διαιτητικό λίπος διεγείρει την υπεροξείδωση λιπιδίων. Το γεγονός αυτό εξηγεί γιατί η υψηλή κατανάλωση διαιτητικού λίπους μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο για καρκίνο του μαστού. Έχει φανεί ότι η κατανάλωση κοτόπουλου και προϊόντων πλούσιων σε λιπαρά σχετίζεται με αυξημένα υπεροξείδια λιπιδίων στο πλάσμα, σε γυναίκες που διαγνώστηκαν με καρκίνο του μαστού. Επιπλέον το ζωικό λίπος, τα γαλακτοκομικά και τα γλυκά σχετίζονται με χαμηλά επίπεδα αντιοξειδωτικής ικανότητας ορού. [139] Η κατανάλωση αλκοόλ μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο καρκίνου του μαστού. Με βάση μια ανασκόπηση της βιβλιογραφίας, Seitz et al. [118] κατέληξε στο συμπέρασμα ότι ο κίνδυνος καρκίνου του μαστού μπορεί να αυξηθεί έως και κατά 4% στις γυναίκες που καταναλώνουν έως ένα ποτό την ημέρα. Επιπλέον, παρατήρησε ότι ο κίνδυνος αυξανόταν κατά 40-50% με βαριά κατανάλωση αλκοόλ (που ορίζεται ως τρεις ή περισσότερα ποτά την ημέρα). Με βάση αυτά τα ευρήματα, οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι γυναίκες δεν θα πρέπει να υπερβαίνουν το ένα ποτό την ημέρα, και εκείνες με αυξημένο κίνδυνο για ανάπτυξη καρκίνου του μαστού θα πρέπει να απέχουν από το αλκοόλ. Με ενδιαφέρον, οι γυναίκες μπορούν να λάβουν όλα τα οφέλη της μέτριας κατανάλωσης αλκοόλ με μόνο ένα ή δύο ποτά την εβδομάδα. Παρά το γεγονός ότι μέτρια κατανάλωση αλκοόλ σχετίζεται με την πρόληψη ορισμένων τύπων καρκίνου, μεγάλη κατανάλωση αλκοόλ σχετίζεται με αυξημένη κίνδυνο καρκίνου. Jung et al. [72] παρατήρησαν μια σχήματος J σχέση μεταξύ αλκοόλ κατανάλωσης και κινδύνου όλων των τύπων θανάτου από καρκίνο. Γενικά, συστήνεται διατροφή πλούσια σε αντιοξειδωτικά (αυξημένη κατανάλωση φρούτων και λαχανικών κάθε μέρα) και υψηλή σε φυτικές ίνες. Επιπλέον, αποφυγή των λιπαρών κρέατα και τα τρόφιμα υψηλής περιεκτικότητας σε χοληστερόλη, φαίνεται επίσης ευεργετική για την πρόληψη του καρκίνου. Η μέτρια κατανάλωση αλκοόλ είναι ωφέλιμη για τη μείωση του κινδύνου του καρκίνου, αλλά βαριά κατανάλωση αλκοόλ αυξάνει σημαντικά τον κίνδυνο καρκίνου. 2.2 Οξειδωτικό στρες και σακχαρώδης διαβήτης Ο σακχαρώδης διαβήτης αποτελεί σημαντικό πρόβλημα για τη δημόσια υγεία και υπολογίζεται ότι μέχρι το 2030 σε όλο τον κόσμο, 366 εκατομμύρια άνθρωποι θα πάσχουν από σακχαρώδη διαβήτη]. Ο σακχαρώδης διαβήτης χαρακτηρίζεται από σχετική ή απόλυτη ανεπάρκεια έκκρισης ινσουλίνης και / ή αντίσταση στην ινσουλίνη που οδηγεί σε χρόνια υπεργλυκαιμία μαζί με διαταραγμένο μεταβολισμό των υδατανθράκων, λιπιδίων, και πρωτεϊνών. Το οξειδωτικό στρες έχει ενοχοποιηθεί στην παθογένεση του σακχαρώδη διαβήτη, τόσο του Τύπου 1 αλλά και του Τύπου 2. Μελέτες δείχνουν ότι το οξειδωτικό στρες παίζει σημαντικό ρόλο στην συστηματική φλεγμονή, στην διαταραγμένη έκκριση ινσουλίνης από τα β-παγκρεατικά κύτταρα, στη διαταραγμένη χρησιμοποίηση γλυκόζης από τους [37]

περιφερικούς ιστούς, και στην ενδοθηλιακή δυσλειτουργία ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη. [7] Οι διαβητικοί ασθενείς έχουν αυξημένες συγκεντρώσεις δεικτών οξειδωτικού στρες στον ορό, στα ούρα και σε άλλα σωματικά υγρά, όπως F-2 ισοπροστάνια. Παράλληλα αυτό το αυξημένο οξειδωτικό στρες συνοδεύεται συχνά από μειωμένη αντιοξειδωτική ικανότητα, αφού έχει βρεθεί ότι οι διαβητικοί ασθενείς έχουν μειωμένα επίπεδα βιταμίνης C και α- τοκοφερόλης. Ασθενείς με διαβήτη έχουν αυξημένο κίνδυνο αθηροσκλήρωσης που εξηγείται εν μέρει από αυξημένη οξειδωση της LDL χοληστερόλης. Οι διαβητικές επιπλοκές μπορεί επίσης να εξηγηθούν από την αύξημένη βλάβη στο DNA που οφείλεται στο οξειδωτικό στρες. Επιπλέον η γλυκοζυλίωση των πρωτεϊνών οδηγεί στη συσσώρευση των επιπέδων προηγμένων τελικών προϊόντων γλυκοζυλίωσης (AGEs), τα οποία είναι γνωστό ότι είναι πηγές ελευθέρων ριζών και συνδέονται με την παρουσία επιπλοκών στον σακχαρώδη διαβήτη. Αυτά τα προϊόντα γλυκοζυλίωσης μπορεί να απελευθερώσουν άμεσα ρίζες υπεροξειδίου και υπεροξειδίου του υδρογόνου, ενεργοποιούν φαγοκύτταρα, και προκαλούν μείωση των επιπέδων γλουταθειόνης. [7,145] Ως εκ τούτου, μείωση του οξειδωτικoύ στρες μπορεί να μειώσει διάφορες επιπλοκές του διαβήτη, όπως καρδιομυοπάθεια, αμφιβληστροειδοπάθεια, νεφροπάθεια, και νευροπάθεια σε ασθενείς που πάσχουν από αυτή τη νόσο. Έτσι, το οξειδωτικό στρες έχει ταυτοποιηθεί ως ένας αιτιολογικός παράγοντας για αυξημένη νοσηρότητα και θνησιμότητα ασθενών με διαβήτη και η μείωση του μπορεί να είναι χρήσιμη για αποτρέποντας μερικές από τις επιπλοκές της ασθένειας. [7] 2.2.1 ιατροφή, αντιοξειδωτικά και διαβήτης Όπως και σε άλλα χρόνια νοσήματα η διατροφή παίζει καθοριστικό ρόλο τόσο στην πρόληψη όσο και στη βελτίωση του γλυκαιμικού προφίλ και μείωση του οξειδωτικού στρες ασθενών με σακχαρώδη διαβήτη. Μελέτη από τους Takahashi et al. [130] στην οποία συμμετείχαν 417 άνδρες ηλικίας 65 ετών και άνω με διαβήτη τύπου 2, έδειξε ότι η κατανάλωση 150 g λαχανικών ανά ημέρα μείωσε σημαντικά τα επίπεδα της HbA1c (γλυκοζυλιωμένη αιμοσφαιρίνη). Ωστόσο, οι συμμετέχοντες που κατανάλωναν 200 γραμμάρια ή περισσότερο ανά ημέρα είχαν όχι μόνο σημαντική μείωση της HbA1c αλλά και μείωση των επίπεδα τριγλυκεριδίων ορού. Μελέτη παρέμβασης από τους Hegde et al. [62], με 123 ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 ηλικίας 40 και 75 ετών, όπου 60 ασθενείς κατανάλωναν δύο φρούτα με λίγες θερμίδες (γλυκό λάιμ, μήλο, ή παπάγια) την ημέρα για ένα διάστημα 3 μηνών, ενώ 63 έλαβαν την καθιερωμένη διατροφή και φροντίδα, φάνηκε δραστική αύξηση στην (64%) σε βιταμίνη C πλάσματος και σημαντική μείωση των των επιπέδων μαλονδιαλδεϋδης στους ασθενείς που κατανάλωναν φρούτα. Οι συγγραφείς παρατήρησαν επίσης μια μείωση των επιπέδων HbA1c στους διαβητικούς ασθενείς που κατανάλωσαν φρούτα. Οι συγγραφείς κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι η τακτική κατανάλωση φρούτων μπορεί να μειώσει το οξειδωτικό στρες σε ασθενείς με διαβήτη τύπου 2. Σε άλλη μελέτη φάνηκε ότι η υψηλή κατανάλωση ξηρών καρπών σχετίζεται με μείωση του κινδύνου για καρδιαγγειακά σε γυναίκες με διαβήτη τύπου 2. [83] [38]

Η συσχέτιση μεταξύ οξειδωτικού στρες, διαβήτη, και κατανάλωσης μιας χορτοφαγική δίαιτας έχει επίσης αξιολογηθεί. Εβδομήντα δύο ασθενείς με διαβήτη τύπου 2 τυχαιοποιήθηκαν σε μια περιορισμένων θερμίδων χορτοφαγική δίαιτα ή μιας πρότυπης διαβητικής δίαιτας (και οι δύο δίαιτες περίπου 500 kcal / ημέρα). Οι ασθενείς που κατανάλωναν τη χορτοφαγική δίαιτα κατά τη διάρκεια 24 εβδομάδων, είχαν αυξημένη βιταμίνη C πλάσματος (16%), αυξημένη δραστηριότητα SOD (49%), και μειωμένα επίπεδα γλουταθειόνης (42%). Παρατηρήθηκε επίσης μείωση του σπλαχνικού λίπους που πιθανό να οφείλεται στο μειωμένο οξειδωτικό στρες των ασθενών που κατανάλωναν τη χορτοφαγική διατροφή. Πρόσθετα οφέλη για την υγεία που παρατίθενται σε αυτή τη μελέτη περιλαμβάνουν μείωση κατά 8% της LDL χοληστερόλης και αύξηση 5% της HDL χοληστερόλης στους ασθενείς με την χορτοφαγική δίαιτα. [73] Όσον αφορά την πρόληψη κατα του διαβήτη, μελέτη που βασίζεται σε πληθυσμό από την Κίνα δείχνει ότι η αυξημένη κατανάλωση φρούτων, λαχανικών και ψαριού συνδέεται με χαμηλό κίνδυνο ανάπτυξης διαβήτη τύπου 2, ενώ η κατανάλωση κρέατος και γαλακτοκομικών σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο. [150] Επιπλέον φαίνεται ότι η υψηλή κατανάλωση δημητριακών ολικής άλεσης σχετίζεται με 20-30% μείωση του κινδύνου για διαβήτη. Η χορτοφαγική δίαιτα φαίνεται ότι μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο ανάπτυξης σακχαρώδους διαβήτη σε μη διαβητικούς ασθενείς. Οι Tonstad et al. [133] μελέτησαν 15.200 άνδρες και 26.187 γυναίκες χωρίς διαβήτη. Μετά 2 χρόνια follow-up, οι ερευνητές παρατήρησαν ότι η χορτοφαγική διατροφή συσχετίστηκε με μια ουσιαστική και ανεξάρτητη μείωση της συχνότητας εμφάνισης του διαβήτη.αντίθετα με μια χορτοφαγικού τύπου δίαιτα, η κατανάλωση κόκκινου κρέατος και επεξεργασμένου κρέατος αυξάνει τον κίνδυνο διαβήτη. Οι Dierckx et al. [41] ανέφεραν ότι η διαιτητική χοληστερόλη και τα κορεσμένα λιπαρά συσχετίζονται θετικά με υπεροξείδια στο αίμα, ενώ συστήνουν την κατανάλωση πολυακόρεστων και μονοακόρεστων λιπαρών οξέων για την του οξειδωτικού στρες. Μελέτες έχουν δείξει ότι η μείωση της διαιτητικής πρόσληψης λίπους κατά 8% οδήγησε σε μείωση της HbA1c, αύξηση ασκορβικού πλάσματος, και μείωση στην μαλονδιαλδεϋδης. [8] 2.3 Οξειδωτικό στρες και νευροεκφυλιστικές νόσοι Το οξειδωτικό στρες συνδέεται άμεσα με τις νευροεκφυλιστικές νόσους (πχ νόσος Alzheimer, Parkinson και Huntington), οι οποίες εμφανίζονται κυρίως στον πληθυσμό των ηλικιωμένων. Το κεντρικό νευρικό σύστημα είναι ιδιαίτερα ευάλωτο στις οξειδωτικές βλάβες λόγω της υψηλής χρησιμοποίησης οξυγόνου, των υψηλών επιπέδων πολυακόρεστων λιπιδίων στις κυτταρικές μεμβράνες των νευρώνων, της παρουσίας οξειδοαναγωγικών δραστικών μετάλλων (πχ Cu, Fe) και του φτωχού αντιοξειδωτικού αμυντικού συστήματος των κυττάρων αυτών. Επιπρόσθετα οι νευρώνες είναι μεταμιτωτικά κύτταρα, τα οποία σταδιακά με την πάροδο του χρόνου συσσωρεύουν οξειδωτική βλάβη με αποτέλεσμα η βλάβη στη δομή και τη λειτουργία τους από το οξειδωτικό στρες να αυξάνεται όσο αυξάνεται η ηλικία και επομένως η εμφάνιση νευροεκφυλιστικών ασθενειών να συμβαίνει πιο συχνά σε άτομα μεγαλύτερης ηλικίας. Παράλληλα η νευροφλεγμονώδης διαδικασία που επάγεται εν μέρη από προφλεγμονώδης κυτταροκίνες, ενισχύει τα επίπεδα δραστικών μορφών αζώτου και οξυγόνου που έχουν νευροτοξικές ιδιότητες. [7,52,136] [39]

2.3.1 Νόσος Alzheimer Η Νόσος Alzheimer (AD) είναι μια νευροεκφυλιστική διαταραχή, η οποία αποτελεί την πιο κοινή μορφή άνοιας, που επηρεάζει περίπου 30 εκατομμύρια ανθρώπους σε όλο τον κόσμο. Κλινικά, χαρακτηρίζεται από μη αναστρέψιμη προοδευτική απώλεια μνήμης, και ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά που περιλαμβάνουν την παρουσία νευροϊνιδιακών συμπλεγμάτων, γεροντικές πλάκες (πλάκες β-αμυλοειδούς), και ατροφία του εγκεφάλου. Το κύριο συστατικό των γεροντικών πλακών είναι το β-αμυλοειδές, το οποίο παράγεται από την πρωτεολυτική διάσπαση της πρόδρομης πρωτεΐνης του αμυλοειδούς από τη δράση της β- και γ-σεκρετάσης. Πολλές in vitro και in vivo μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι το β- αμυλοειδές μπορεί να επάγει το οξειδωτικό στρες και είναι τοξικό για τους νευρώνες. Ένα άλλο στοιχείο που επιβεβαιώνει ότι οι εγκέφαλοι των ασθενών με νόσο Alzheimer είναι υπό αυξημένο οξειδωτικό στρες, υποστηρίζεται από το γεγονός ότι σε εξέταση εγκεφάλων με τη νόσο, έχουν βρεθεί αυξημένα επίπεδα προϊόντων υπεροξείδωσης λιπιδίων, πρωτεϊνών και DNA (ισοπροστανίων, μαλονδιαλδεΰδης, καρβονύλια, προηγμένα προϊόντα γλυκοζυλίωσης) μειωμένα επίπεδα πολυακόρεστων λιπαρών οξέων στις μεμβράνες των νευρώνων, σιδήρου, και διάφορων ενζύμων που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες. [7,145] Χρησιμοποιώντας ποντίκια, ο Pratico et al. [105] κατάφερε να δείξει ότι η υπεροξείδωση λιπιδίων προηγείται από τον σχηματισμό της πλάκας β- αμυλοειδούς, υποδηλώνοντας ότι η εγκεφαλική οξειδωτική βλάβη συμβάλλει στην παθογένεση της νόσου του Alzheimer. Αυξημένοι δείκτες υπεροξείδωσης λιπιδίων έχουν επίσης βρεθεί και στο πλάσμα ασθενών με νόσο Alzheimer. Σε μελέτη που πραγματοποιήθηκε από τους Puertas et al. [108], η οποία περιλάμβανε 46 ασθενείς με Alzheimer και 46 υγιείς, παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα θειοβαρβιτουρικού οξέος και πρωτεΐνικών καρβονυλίων αλλά και μειωμένα επίπεδα γλουταθειόνης στους ασθενείς με άνοια τύπου Alzheimer σε σχέση με τους υγιείς. Οι συγγραφείς πρότειναν ότι πιθανόν να υπάρχει ένα ελάττωμα στο αντιοξειδωτικό σύστημα άμυνας που είναι ανίκανο να ανταποκρίνεται σε αυξημένη παραγωγή ελευθέρων ριζών, οι οποίες μπορεί να οδηγήσουν σε οξειδωτική ζημίας και την ανάπτυξη παθολογικών μεταβολή που έχει ως αποτέλεσμα ο διαδικασία νευροεκφυλισμού σε ασθενείς με άνοια τύπου Alzheimer. Σε μια άλλη μελέτη, οι συγγραφείς παρατήρησαν επίσης αυξημένα επίπεδα μαλονδιαλδεϋδης στο πλάσμα των ασθενών με νόσο του Alzheimer σε σύγκριση με τους υγιείς. [56] 2.3.2 ιατροφή στην πρόληψη ή καθυστέρηση της εμφάνισης άνοιας και της νόσου Alzheimer Ο ρόλος της διατροφής στην πρόληψη ή καθυστέρηση της έναρξης της νόσου Alzheimer έχει διερευνηθεί τόσο σε επίπεδο θρεπτικών συστατικών όσο και σε επίπεδο διατροφικών προτύπων. Σε γενικές γραμμές, οι επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι η αυξημένη κατανάλωση ψαριών, φρούτων και λαχανικών και η μέτρια κατανάλωση κρασιού μπορεί να να μειώσει τον κίνδυνο για έκπτωση της γνωστικής λειτουργίας και άνοια. Μετα- ανάλυση που πραγματοποιήθηκε από τους Scarmeas et al [149], καταλήγει στο συμπέρασμα ότι διατροφή που χαρακτηρίζεται από υψηλή πρόσληψη φρούτων, λαχανικών, ψαριού, ξηρών καρπών και οσπρίων, και χαμηλότερη πρόσληψη κρεάτων, πλήρων γαλακτοκομικών και γλυκών σχετίζεται με χαμηλότερο κίνδυνο για έκπτωση της γνωστικής λειτουργίας και ε [40]

μειωμένο κίνδυνο για τη νόσο Alzheimer. Επιπλέον πρόσφατες προοπτικές μελέτες δείχνουν ότι η υψηλή προσκόλληση σε μια δίαιτα μεσογειακού τύπου σχετίζεται με πιο αργή γνωστική εξασθένηση, με πιο αργή εξέλιξη του Alzheimer, μειωμένο κίνδυνο για Alzheimer και μειωμένη θνησιμότητα από όλα τα αίτια σε ασθενείς με τη νόσο. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η τήρηση της Μεσογειακής διατροφής μπορεί να επηρεάσει όχι μόνο τον κίνδυνο για Alzheimer, αλλά και την εξέλιξη της άνοια και των συμπτωμάτων της. [121] Αρκετές επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι η μέτρια κατανάλωση του κόκκινου κρασιού σχετίζεται με χαμηλότερη συχνότητα εμφάνισης άνοιας και Alzheimer, λόγω των φαινολικών ενώσεων που περιέχει οι οποίες φαίνεται να έχουν μια νευροπροστατευτική δράση. [140] Η κουρκουμίνη, μια φαινολική αντιοξειδωτική ένωσηπου βρίσκεται στο Curcuma longa (κουρκουμάς ινδικό μπαχαρικό), μπορεί να έχει μια προστατευτική επίδραση κατά της νόσου του Alzheimer [24]. 2.4 Καρδιαγγειακά νοσήματα Τα καρδιαγγειακά νοσήματα αποτελούν κύρια αιτία θανάτου σε Ηνωμένες Πολιτείες, στη Ευρώπη και στην Ιαπωνία. Περιλαμβάνει διάφορες ασθένειες της καρδιάς και των αγγείων, οι οποίες είναι συνήθως δευτερεύοντες εκδηλώσεις που οφείλονται σε αθηροσκλήρωση, μία ασθένεια των αρτηριών που περιλαμβάνει τοπική πάχυνση του τοιχώματος του αγγείου. [145] 2.4.1 Οξειδωτικό στρες και αθηρoσκλήρωση Η αθηροσκλήρωση αποτελεί τo βασικό παθοφυσιολογικό μηχανισμό της πλειοψηφίας των καρδιαγγειακών νοσημάτων. [141] Πρόκειται για μια προοδευτική ασθένεια η οποία χαρακτηρίζεται από περιοχές ινώδους πάχυνσης του αρτηριακού τοιχώματος που συνοδεύονται από πλάκες λιπιδίων. [7] Θεωρείται ως μια χρόνια φλεγμονώδης νόσος και συνδέεται με πολλούς παράγοντες κινδύνου όπως είναι ο σακχαρώδης διαβήτης, η υπέρταση, το κάπνισμα, η ηλικία και η υπερλιπιδαιμία. Οι παράγοντες κινδύνου για αθηρoσκλήρωση όπως η υπερλιπιδαιμία, μπορούν να αυξήσουν την παραγωγή ελευθέρων ριζών από τα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα αλλά και από τα λεία μυϊκά κύτταρα (SMC) αυξάνοντας έτσι το οξειδωτικό στρες στα αγγεία. [141] Το οξειδωτικό στρες επιδρά στην αγγειακή λειτουργία με μια σειρά από παθογενετικούς μηχανισμούς οι οποίοι περιγράφονται παρακάτω. Η δυσλειτουργία του ενδοθηλίου αποτελεί αρχικό στάδιο για την αθηρογένεση και επηρεάζεται από τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου. Η ενδοθηλιακή δυσλειτουργία σχετίζεται με αυξημένο πάχος του αγγειακού τοιχώματος που προκαλείται από εναπόθεση λίπους (πλάκες λιπιδίων) σε περιοχές μέσα στο τοίχωμα των στεφανιαίων αρτηριών. Η αυξημένη αγγειακή παραγωγή ROS ευθύνεται για την οξείδωση της LDL χοληστερόλης η οποία μετατρέπεται σε ox-ldl. Κατά την οξείδωση της LDL παράγονται οξειδωμένα φωσφολιποειδή και ο PAF τα οποία έχουν έντονη αθηρογόνο δράση. Τα κλινικά στοιχεία δείχνουν ότι τα προϊόντα οξείδωσης των φωσφολιπιδίων (ox-pls) και ο PAF κατέχουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεση της αθηροσκλήρωσης. Τα ox-pls φαίνεται ότι αλληλεπιδρούν με τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα μονοκύτταρα, τα μακροφάγα, τα αιμοπετάλια, τα λεία μυϊκά κύτταρα και με την HDL προάγοντας την αθηροσκλήρωση. [30] [41]

Πηγές των ενεργών μορφών στα αγγεία περιλαμβάνουν την οξειδάση της ξανθίνης, τη λιποοξυγονάση, τη NADPH οξειδάση και την ΝΟS. Έχει αποδειχθεί ότι η μεταφορά ox-ldl από το ενδοθήλιο μέσα στο αγγειακό τοίχωμα είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη της πλάκας των λιπιδίων γι' αυτό και πιστεύεται ότι η ox-ldl έχει σημαντικό ρόλο στην έναρξη της αθηροσκλήρωσης. Η ox-ldl συγκεκριμένα προκαλεί άθροιση εστέρων χοληστερόλης στα μακροφάγα και έχει ενοχοποιηθεί και σε άλλους μηχανισμούς που πιθανόν να εμπλέκονται στην αθηροσκλήρωση όπως κυτταροτοξικές ή χημειοτακτικές δράσεις στα μονοκύτταρα και αναστολή της κινητικότητας των μακροφάγων. Επίσης, θεωρείται υπεύθυνη για την αύξηση της έκφρασης μορίων προσκόλλησης, η οποία οδηγεί σε προσκόλληση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, πχ μονοκύτταρων, μακροφάγων, Τ- λεμφοκυττάρων στο ενδοθήλιο. Αυτή η ενεργοποίηση του ενδοθηλίου οδηγεί στην απελευθέρωση προφλεγμονωδών κυτταροκινών, ιντερλευκινών, ιντερφερόνης και χημειοτακτικών παραγόντων. Το ενδοθήλιο γίνεται διαπερατό στα λιπίδια και στα κύτταρα του ανοσοποιητικού με αποτέλεσμα τα μακροφάγα να φαγοκυτταρώνουν την ox-ldl και να μετατρέπονται σε αφρώδη κύτταρα. Επιπρόσθετα προάγει την απελευθέρωση της ιντερλευκίνης-1 από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα μακροφάγα. Έχει προφλεγμονώδης και ανοσοδιεγερτικές ιδιότητες και είναι ικανή να προκαλέσει ακόμα και τον κυτταρικό θάνατο. [7,45] Ωστόσο η ox-ldl από μόνη της δεν μπορεί να εξηγήσει ολόκληρο τον μηχανισμό που συνδέει το οξειδωτικό στρες με την αθηροσκλήρωση. Ένας άλλος μηχανισμός εμπλέκει την ox-ldl και το μονοξείδιο του αζώτου ΝΟ γιατί η ενδοθηλιακή δυσλειτουργία που οδηγεί όπως έχει αναφερθεί σε αθηροσκλήρωση χαρακτηρίζεται από μειωμένη βιοδιαθεσιμότητα σε ΝΟ. Τα φυσιολογικά επίπεδα ΝΟ στα αγγεία προωθούν την αγγειοδιαστολή και αναστέλλουν τη δράση των κυτοκινών αλλά και την έκφραση μορίων προσκόλλησης που σχετίζονται με την αθηροσκληρωτική διαδικασία. Οι ελεύθερες ρίζες οξυγόνου προκαλούν άμεση μείωση της βιοδιαθεσιμότητας του ΝΟ γιατί το ανιόν υπεροξειδίου αντιδρά με το ΝΟ σχηματίζοντας υπεροξυνιτρώδες ανιόν, μια άλλη δραστική μορφή αζώτου. Οι ROS και το υπεροξυνιτρώδες ανιόν μπορούν και οξειδώνουν την τετραϋδροβιοπτερίνη, συμπαράγοντα της ενδοθηλιακής ΝΟ συνθάσης. Η μειωμένη βιοδιαθεσιμότητα ΝΟ που προκύπτει μπορεί να προκαλέσει αγγειοσυστολή, συσσώρευση αιμοπεταλίων και προσκόλληση ουδετερόφιλων στο ενδοθήλιο. [7] Επιπρόσθετα το οξειδωτικό στρες κυρίως μέσω του Η 2 Ο 2 μπορεί να αυξήσει τη φωσφορυλίωση της κινάσης της τυροσύνης γεγονός που οδηγεί σε πιο ισχυρή δέσμευση των ουδετερόφιλων στο ενδοθήλιο και σε μεταβολή της διαπερατότητας των αγγείων. Επίσης προάγει την παραγωγή μεταγραφικών παραγόντων όπως ο πυρηνικός παράγοντας NF-κΒ και τη πρωτεΐνη ενεργοποίησης -1 (ΑΡ-1) που συμμετέχουν στην έκφραση των μορίων προσκόλλησης όπως είναι αγγειακά μόρια κυτταρικής προσκόλλησης (VCAM-1), μόρια ενδοκυτταρικής προσκόλλησης (ICAM-1), E- σελεκτίνης και άλλων κυτοκινών. [141] Σύμφωνα με όλα τα παραπάνω συμπεραίνουμε ότι η αθηροσκλήρωση είναι μία νόσος που συνδέεται ισχυρά με το οξειδωτικό στρες. Έχει φανεί ότι οι βιταμίνες C και Ε όπως επίσης και άλλα αντιοξειδωτικά, μπορούν να αναστείλουν τη διαδικασία οξείδωσης για την πρόληψη των αρτηριοσκληρωτικών αλλοιώσεων. [7] [42]

ΣΧΗΜΑ 6. Ο σχηματισμός και η ανάπτυξη της αθηροσκληρωτικής πλάκας 2.4.2 ίαιτα, αντιοξειδωτικά και καρδιαγγειακά Τα φρούτα και τα λαχανικά μπορούν να ενισχύσουν την αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού απέναντι στο οξειδωτικό στρες και την αθηροσκληρωτική νόσο μειώνοντας τον κίνδυνο για καρδιαγγειακά νοσήματα. Τα αποτελέσματα από επιδημιολογικές μελέτες επιβεβαιώνουν ότι δίαιτα με υψηλή κατανάλωση φρούτων και λαχανικών μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο για στεφανιαία νόσο. Το 2003 ο ΠΟΥ συνιστά την ημερήσια πρόσληψη 400-500 g φρούτων και λαχανικών. Σε μια μεγάλη προοπτική μελέτη (EPIC, Crowe 2011), με τη συμμετοχή 313.074 ανδρών και γυναικών χωρίς προηγούμενο ιστορικό ισχαιμικής καρδιακής νόσου, οι συγγραφείς παρατήρησαν ότι τα άτομα που κατανάλωναν οκτώ μερίδες των φρούτων και λαχανικών την ημέρα (συνολικά 640 γραμμάρια φρούτων και λαχανικών ανά ημέρα) είχαν 22% χαμηλότερο κίνδυνο θανάτου από ισχαιμική καρδιακή νόσο από ότι οι άνθρωποι που κατανάλωναν λιγότερο από τρεις μερίδες φρούτων και λαχανικών την ημέρα (240 g των φρούτων και των λαχανικών) [33]. Μια άλλη μεγάλη μελέτη (INTERHEART STUDY, Iqbal 2008) στην οποία συμμετείχαν οι συμμετέχοντες από 52 χώρες κατέληξε επίσης στο συμπέρασμα ότι η υψηλή πρόσληψη φρούτων και λαχανικών μπορεί μειώσει τον κίνδυνο οξέος εμφράγματος του μυοκαρδίου. Επιπλέον φάνηκε ότι η δυτικού τύπου διατροφή, η οποία είναι πλούσια σε τηγανητά και αλμυρά σνακ, αυξάνει τον κίνδυνο οξέος εμφράγματος του μυοκαρδίου. Τα τηγανητά τρόφιμα περιέχουν υψηλές ποσότητες κορεσμένων λιπαρών οξέων που μπορούν στη συνέχεια να αυξήσουν τον κίνδυνο για καρδιαγγειακή νόσο. Ωστόσο, μια διατροφή πλούσια σε φρούτα και λαχανικά μειώνει τον κίνδυνο. [68] [43]

Eπισκόπηση παρεμβάσεων σε ανθρώπους που πραγματοποιήθηκε από τους Chong M et al, 2010 [26] δείχνει ότι τα φρούτα που περιέχουν σχετικά υψηλές συγκεντρώσεις ανθοκυανινών, και προκυανιδινών, όπως το ρόδι, τα σταφύλια, και τα μούρα, μπορούν να μειώσουν τον κίνδυνο καρδιαγγειακών παθήσεων, ιδιαίτερα λόγω της αντι-υπερτασικής ιδιότητάς τους και της ικανότητας τους για αναστολή της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων. Η κατανάλωση ψαριών τουλάχιστον δύο φορές την εβδομάδα μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο θανάτου από την οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου κατά 50%. Το ψάρι είναι πλούσια πηγή ωμέγα-3 λιπαρών οξέων, τα οποία έχουν πολλές ευεργετικές επιδράσεις, συμπεριλαμβανομένης της μείωσης του κινδύνου για καρδιακή προσβολή και την πρόληψη του σχηματισμού θρόμβων. [79] Αντίθετα με τη δυτικού τύπου δίαιτα η Μεσογειακή διατροφή έχει φανεί ότι μειώνει τον κίνδυνο για καρδιαγγειακά νοσήματα. H Μεσογειακή δίαιτα είναι πλούσια σε δημητριακά, φρούτα, λαχανικά, όσπρια και ξηρούς καρπούς, χρησιμοποιεί το ελαιόλαδο ως κύρια πηγή λίπους, και περιλαμβάνει μέτρια κατανάλωση των ψαριών, αυγών, γαλακτοκομικών προϊόντων και πουλερικών, ενώ περιέχει πολύ μικρές ποσότητες κόκκινου κρέατος, καθώς και μέτρια κατανάλωση κρασιού. Η μελέτη Lyon Diet Heart Study στην οποία συμμετείχαν ασθενείς που επέζησαν μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου, έδειξε ότι Μεσογειακή διατροφή μπορεί να προσφέρει μια εντυπωσιακή προστατευτική δράση σε αυτούς τους ασθενείς, όπως αποδεικνύεται από μια μείωση 50-70% του κινδύνου υποτροπής μετά από 4 χρόνια follow up. [37] Ο μηχανισμός προστασίας από αυτές τις ασθένειες στη μεσογειακή διατροφή μπορεί να σχετίζεται εν μέρει με την αντιοξειδωτική της δράση. [58] Η μέτρια κατανάλωση αλκοόλ, ειδικά κόκκινου κρασιού, επίσης, έχει καρδιοπροστατευτική δράση, επειδή το κόκκινο κρασί είναι πλούσιο σε αντιοξειδωτικά. Οι ξηροί καρποί είναι πλούσιοι σε φυτικές πρωτεΐνες, φυτικές ίνες, κάλιο, ασβέστιο, μαγνήσιο, βιταμίνη Ε, αντιοξειδωτικές φαινολικές ενώσεις, όπως η ρεσβερατρόλη, και αργινίνη. Επιδημιολογικές μελέτες δείχνουν ότι η κατανάλωση ξηρών καρπών μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο στεφανιαίας νόσου. Υψηλή κατανάλωση ποικιλίας ξηρών καρπών μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο για καρδιαγγειακή νόσο εως και 35%.[80] Η κατανάλωση ξηρών καρπών και φυστικοβούτυρου μια φορά την εβδομάδα μπορεί να μειώσει τον κίνδυνο στεφανιαίας νόσου, αλλά μεγαλύτερη μείωση του κινδύνου παρατηρήθηκε σε άτομα που κατανάλωναν ξηρούς καρπούς ή φυστικοβούτυρο μία έως τέσσερις φορές την εβδομάδα. [16] [44]

Κεφάλαιο 3 ο - Συμπληρώματα διατροφής με αντιοξειδωτικά για την πρόληψη οξειδωτικού στρες και χρόνιων νοσημάτων 3.1 Συμπληρώματα διατροφής με αντιοξειδωτικές ενώσεις Σύμφωνα με όσα αναφέρθηκαν στο Κεφάλαιο 2, η διατροφή, και συγκεκριμένα τα αντιοξειδωτικά που λαμβάνουμε από τη δίαιτα σχετίζονται με την πρόληψη χρόνιων νοσημάτων. Έτσι το ερευνητικό ενδιαφέρον από πολύ νωρίς στράφηκε στο ποια συγκεκριμένα αντιοξειδωτικά συστατικά της δίαιτας θα μπορούσε να λαμβάνονται συμπληρωματικά, για μείωση του κινδύνου γι αυτά τα νοσήματα αλλά και μείωση του οξειδωτικού στρες. Τα συμπληρώματα αντιοξειδωτικών αποτελούν ενώσεις οι οποίες λαμβάνονται είτε με εκχύλιση από το φυσικό τρόφιμο στο οποίο περιέχονται ή παρασκευάζονται με χημική σύνθεση. Περιλαμβάνουν συνήθως αντιοξειδωτικές βιταμίνες (βιταμίνη C, βιταμίνη Ε και β- καροτένιο), διάφορα βότανα με αντιοξειδωτική δράση (πχ ginseng, ginko biloba, aloe vera), αντιοξειδωτικές ουσίες φυτικών τροφίμων με αντιοξειδωτική δράση (πχ λυκοπένιο, ρεσβερατρόλη) και άλλα αντιοξειδωτικά συστατικά (πχ συνένζυμο Q, μελατονίνη, γλουταθειόνη). [7,101] Οι απόψεις για το αν ή όχι τα συμπληρώματα διατροφής μπορούν να προσφέρουν τα ίδια οφέλη για την υγεία όπως τα αντιοξειδωτικά των τροφίμων διίστανται. Παρόλο που στην αγορά κυκλοφορεί πλέον ποικιλία από συμπληρώματα αντιοξειδωτικών, η δράση τους δεν έχει ακόμα επιβεβαιωθεί. Αν και πολλά επιδημιολογικά δεδομένα δείχνουν ότι τα συμπληρώματα αντιοξειδωτικών μπορεί να έχουν ευεργετικά οφέλη σε ασθενείς με χρόνιες παθήσεις, ελεγχόμενες κλινικές δοκιμές δεν συμφωνούν με αυτά τα αποτελέσματα. [145] Η συστηματική χρήση των συμπληρωμάτων παρεμποδίζεται από διάφορους παράγοντες: την έλλειψη προοπτικών και ελεγχόμενων μελετών, τις μακροπρόθεσμες επιπτώσεις και τις δόσεις που απαιτούνται για κάθε είδος ασθενειών, καθώς και τα οφέλη που έχει η χρήση τους για τον υγιή πληθυσμό. [101] Ένα άλλο θέμα είναι ότι τα αντιοξειδωτικά μπορούν να δράσουν ως προ-οξειδωτικά εάν καταναλώνονται σε επίπεδα σημαντικά υψηλότερα από τις συνιστώμενες διαιτητικές προσλήψεις (RDI). Επιπλέον όπως έχει αναφερθεί στο Κεφάλαιο 1 οι ελεύθερες ρίζες αποτελού και προϊόντα του μεταβολισμού μας τα οποία χρειάζονται σε μικρές ποσότητες για τη φυσιολογική λειτουργεία. Έτσι η υπερβολική κατανάλωση αντιοξειδωτικών θα μπορούσε να έχει αντίθετα αποτελέσματα από τα επιθυμητά. Όπως και τα συμβατικά φάρμακα, τα συμπληρώματα διατροφής μπορεί να προκαλέσουν ανεπιθύμητες ενέργειες, αλληλεπιδράσεις με άλλα φάρμακα ή συμπληρώματα που πιθανό να οδηγήσουν σε αντίθετα αποτελέσματα από τα επιθυμητά. Ωστόσο, τα συμπληρώματα διατροφής μπορεί να είναι χρήσιμα σε ειδικές περιπτώσεις όπου η διατροφή είναι ανεπαρκείς όπως σε ασθενείς με διαταραχές του γαστρεντερικού συστήματος, άτομα με χαμηλά εισοδήματα, π.χ. άνθρωποι που δεν μπορούν οικονομικά να αγοράσουν μια ποικιλία από λαχανικά, φρούτα, ξηρούς καρπούς κλπ. [7,101] [45]

3.2 Ανασκόπηση της επίδρασης συμπληρωμάτων αντιοξειδωτικών στην πρόληψη χρόνιων νοσημάτων Παρά την πληθώρα των in vitro, και επιδημιολογικών δεδομένων που δείχνουν ότι η υψηλή πρόσληψη αντιοξειδωτικών από τα τρόφιμα είναι προστατευτικά έναντι χρόνιων νοσημάτων, πολλές κλινικές μελέτες έχουν αποτύχει να αποδείξουν οποιαδήποτε ευεργετική επίδραση των αντιοξειδωτικών συμπληρωμάτων. Επιπλέον, ορισμένες μελέτες έχουν δείξει δυσμενείς επιπτώσεις σε συγκεκριμένες υποομάδες του πληθυσμού. [71] Η προοπτική μελέτη, Health Professionals Study από τους Ascherio et al. [10], στην οποία συμμετείχαν 43.738 άντρες ηλικίας 40-75 ετών οι οποία δεν είχαν κάποιο καρδιαγγειακό νόσημα ή διαβήτη, μετά από 8 χρόνια follow up, ανέφεραν ότι συμπληρώματα με βιταμίνη Ε, βιταμίνη C, και καροτενοειδή δεν είχαν επίδραση στη μείωση του κινδύνου για εγκεφαλικό επεισόδειο. Παρόμοια μετα-ανάλυση 50 τυχαιοποιημένων κλινικών δοκιμών από τους Myung et al. [90], με 294.478 άτομα, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι δεν υπάρχουν στοιχεία που να υποστηρίζουν τη χρήση των βιταμινών και αντιοξειδωτικών συμπληρωμάτων για την πρόληψη των καρδιαγγειακών νοσημάτων. Συστηματική ανασκόπηση που πραγματοποιήθηκε από τους Bjelakovic et al. [15], η οποία περιλαμβάνει 78 κλινικές μελέτες στις οποίες συμμετείχαν 296.707 άτομα ασθενείς και υγιείς, αναφέρει ότι η λήψη συμπληρωμάτων με αντιοξειδωτικά δεν έχει καμία επίδαση για την πρόληψη κάποιου νοσήματος. Αντίθετα φάνηκε ότι συμπληρώματα με β-καροτένιο, και βιταμίνη Ε μπορεί να αυξάνουν τη θνησιμότητα. Τα συμπληρώματα με βιταμίνη C και σελήνιο δεν φάνηκε να αυξάνουν τη θνησιμότητα. Οι συγγραφείς καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι τα συμπληρώματα αντιοξειδωτικών δεν έχουν θέση στην πρωτεγενή ή στη δευτερογενή πρόληψη και πρέπει να θεωρούνται ως φάρμακα και θα πρέπει να λαμβάνονται υπό ιατρική επίβλεψη. Ελεγχόμενη, διπλά τυφλή κλινική μελέτη από τους Lin et al. (Women's Antioxidant Cardiovascular Study) [84], στην οποία συμμετείχαν 18171 γυναίκες και όπου η παρέμβαση είχε διάρκεια 9,5 χρόνια, κατέληξε στο συμπέρασμα ότι συμπλήρωμα με βιταμίνη C (500 mg ασκορβικού οξέος ημερησίως), βιταμίνη Ε (600 IU α-τοκοφερόλης ημερησίως) και β- καροτένιο (50 mg ημερησίως) δεν είχε κανένα συνολικό όφελος στην πρωτογενή πρόληψη της συνολικής συχνότητας εμφάνισης καρκίνου ή θνησιμότητας που σχετίζεται με τον καρκίνο. Η ίδια μελέτη έδειξε επίσης ότι η ημερήσια πρόσληψη συμπληρώματος αντιοξειδωτικών (βιταμίνες C και Ε, β-καροτένιο) δεν είχε κανένα όφελος στην πρόληψη καρδιαγγειακών νοσημάτων μεταξύ των γυναικών με υψηλότερο κίνδυνο καρδιαγγειακής νόσου [31]. Μια άλλη τυχιαοποιημένη, ελεγχόμενη κλινική δοκιμη, η SU.VI.MAX Study, η οποία περιλάμβανε 13.017 υγιείς ενήλικες (7876 γυναίκες ηλικίας 35-60 ετών και 5141 οι άνδρες ηλικίας 45-60 ετών), που λάμβαναν κάθε μέρα για 7,5 χρόνια μια κάψουλα με 120 mg ασκορβικού οξέος, 30 mg βιταμίνης Ε, 6 mg β-καροτένιου, 100 mg σεληνίου, 20 mg ψευδαργύρου, ή ένα εικονικό φάρμακο. Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι δεν υπήρχε καμία επίδραση του συμπληρώματος αντιοξειδωτικών στην ισχαιμική καρδιαγγειακή νόσο, υπήρχε μείωση της συνολικής συχνότητας εμφάνισης καρκίνου και θνησιμότητας από κάθε αίτιο στους άνδρες αλλά όχι στις γυναίκες. Οι συγγραφείς αποδίδουν το αποτέλεσμα στο ότι οι άνδρες που συμμετείχαν στη μελέτη είχαν χαμηλά επίπεδα ορού αντιοξειδωτικών [46]

και ιδιαίτερα β-καροτενίου και βιταμίνης C σε σχέση με τις γυναίκες όταν ξεκίνησε η μελέτη. [64] Το 2003 η υπηρεσία U.S. Preventive Services Task Force (USPSTF) των Η.Π.Α. κατέληξε στο συμπέρασμα ότι υπάρχουν ανεπαρκή αποδεικτικά στοιχεία για την ασφάλεια της πρόσληψης αντιοξειδωτικών βιταμινών (μόνες τους ή σε συνδυασμό) για την πρόληψη καρδιαγγειακής νόσου ή καρκίνου. Συστήνει κατά της λήψης β-καροτενίου (μόνο του ή σε συνδιασμό με άλλα συστατικά) γιατί υπάρχουν καλής ποιότητας δεδομένα ότι όχι μόνο δεν έχει κανένα όφελος αλλά μπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο για καρκίνο του πνεύμονα. [49] Πράγματι, μετα-ανάλυση 13 κλινικών μελετών που πραγματοποιήθηκε από τους Druesne- Pecollo et al., καταλήγει στο συμπέρασμα ότι συμπληρώματα με β-καροτένιο δεν έχουν καμία προστατευτική επίδραση στον καρίνο του πνεύμονα, του παγκρέατος, του στομάχου, του παχέος εντέρου, του προστάτη, του μαστού και του καρκίνου του δέρματος. Αντίθετα επιβεβαιώνεται ότι συμπληρώματα β-καροτενίου σε ημερήσια πρόσληψη 20-30 mg αυξάνουν τον κίνδυνο για καρκίνο του πνεύμονα και στομάχου. [44] Συμπερασματικά, με τα διαθέσιμα δεδομένα, δεν είναι δυνατή η σύσταση κάποιου συμπληρώματος με αντιοξειδωτικές βιταμίνες για την πρόληψη κάποιου χρόνιου νοσήματος. Το γεγονός ότι κάποια από αυτά μπορούν να προκαλέσουν κάποια βλάβη είναι ανησυχητικό. Πιθανό να υπάρχει κάποιο όφελος σε κάποιες υποομάδες του πληθησμού που παρουσιάζουν κάποια ανεπάρκεια. 3.3 Ανασκόπηση της επίδρασης συμπληρώματος αντιοξειδωτικών σε δείκτες οξειδωτικού στρες Παρόλο που οι περισσότερες κλινικές μελέτες αδυνατούν να δείξουν κάποιο όφελος από την συμπληρωματική πρόσληψη αντιοξειδωτικών στην πρωτογενή και δευτερογενή πρόληψη χρόνιων νοσημάτων, πολλές είναι οι μελέτες που εξετάζουν την επίδραση που έχουν σε δείκτες οξειδωτικού στρες. Όπως προαναφέρθηκε το οξειδωτικό στρες μπορεί να εμπλέκεται στην παθοφυσιολογία πολλών χρόνιων νοσημάτων είτε να είναι αποτέλεσμα αυτών. Έτσι πιστεύεται ότι η μείωση δεικτών του οξειδωτικού στρες μπορεί να βοηθήσει σε μείωση της οξειδωτικής βλάβης βιομορίων, ενίσχυση της αντιοξειδωτικής άμυνας του οργανισμού και κατα συνέπεια, πρόληψη χρόνιων ασθενειών. Επίσης πολλές μελέτες εξετάζουν τη δράση των συμπληρωμάτων με αντιοξειδωτικά συστατικά ex-vivo είτε in vivo, συνεισφέροντας έτσι στην κατανόηση του μηχανισμού γύρω από τον οποίο τα αντιοξειδωτικά είτε από τη διατροφή είτε από συμπληρώματα, εξουδετερώνουν τις ελεύθερες ρίζες. Παρακάτω γίνεται μια μικρή ανασκόπηση σε κλινικές μελέτες που μελέτησαν την επίδραση μίγματος αντιοξειδωτικών σε δείκτες οξειδωτικού στρες σε υγιή άτομα in vivo και ex-vivo, και σε μελέτες in vitro. Η αναζήτηση τους πραγματοποιήθηκε από το Pub Med. Κλινικές μελέτες με συμπληρώματα αντιοξειδωτικών και επίδραση σε δείκτες οξειδωτικού στρες in vivo Οι μελέτες που αναγράφονται στον παρακάτω πίνακα είναι τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες ελεγχόμενες με εικονικό σκεύασμα. Περιλαμβάνουν υγιείς εθελοντές διαφόρων ηλικιών [47]

στους οποίους χορηγήθηκαν διάφορα μείγματα αντιοξειδωτικών και εξετάστηκαν στη συνέχεια δείκτες οξειδωτικού στρες. Παρατηρούμε ότι στις περισσότερες μελέτες υπάρχει μείωση σε κάποιο από τους δείκτες αλλά και αύξηση είτε τις δραστικότητας αντιοξειδωτικών ενζύμων είτε αντιοξειδωτικών. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η λήψη συμπληρωμάτων με συνδυασμό αντιοξειδωτικών συστατικών είναι πιο αποτελεσματική στη μείωση του οξειδωτικού στρες σε σχέση με τη λήψη μιας μόνο ουσίας γιατί φαίνεται να έχουν μια συνεργιστική δράση. ΣΥΓΓΡΑΦΕΑΣ/ ΑΝΑΦΟΡΑ ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ Ν ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ ΕΙΚΤΕΣ ΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟΥ ΣΤΡΕΣ ΠΟΥ ΜΕΤΡΗΘΗΚΑΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Jacob et al, 2003/[70] Υγιείς άντρες ηλικίας 20-51 (39 μη καπνιστές και 38 καπνιστές 77 Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή εικονικού για 90 μέρες 272 mg βιταμίνης C 31 mg βιταμίνης Ε 400μg φυλλικού οξέος F2-ισοπροστάνιο Πρωτεϊνικά καρβονύλια TBARS Αύξηση ασκορβικού και α-τοκοφερόλης πλάσματος Μη στατιστικά σημαντική μείωση των δεικτών οξειδωτικής βλάβης Lucas Actis- Goretta et al, 2003/[4] Υγιείς άντρες και γυναίκες ηλικίας 31-48 ετών, μη καπνιστές 16 Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή εικονικού για 30 μέρες Βιταμίνη Ε, β- καροτένιο, σελήνιο, συνένζυμο Q10 MDA, TBARS Αύξηση α-τοκοφερόλης, β-καροτενίου και ουβικινόνης πλάσματος Στατιστικά σημαντική μείωση MDA και TBARS Marion Dietrich et al, 2002/[42] Καπνιστές 20-78 ετών 126 Τυχαιοποιημένη, διπλά-τυφλή ελεγχόμενη, με εικονικό φάρμακο Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή εικονικού για 2 μήνες Βιταμίνη C ή συνδιασμός βιταμίνης C, βιταμίνης Ε και α- λιποϊκού οξέος F2- ισοπροστάνιο Στην ομάδα με το συμπλήρωμα βιταμίνης C παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση του F2- ισοπροστάνιου του πλάσματος Jun Peng et al, 2000/ [99] Υγιείς εθελοντές μη καπνιστές ηλικίας 19-25 32 Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή placebo για 5 εβδομάδες Βιταμίνη C, α- τοκοφερόλη, β- καροτένιο, Β6, Β12, φυλλικό οξύ, εκχύλισμα κόκκων σταφυλιού, εκχύλισμα από γάλα γαϊδουράγκαθου ραστικότητα SOD, GPx MDA Πρωτεϊνικά καρβονύλια εν παρατηρήθηκε αλλαγή στη δραστικότητα SOD, GPx Αύξηση των αντιοξειδωτικών του πλάσματος Μείωση MDΑ και πρωτεϊνικών καρβονυλίων Monget AL et al, 1996/[88] 575 ηλικιωμένοι ηλικίας 65 με ιπλά-τυφλή ελεγχόμενη με εικονικό Αντιοξειδωτικές βιταμίνες και ιχνοστοιχεία (βιταμίνη Ε, ραστικότητα SOD, GPX Αντιοξειδωτικά Σημαντική αύξηση α- τοκοφερόλης, β- καροτενίου, βιταμίνης C, ψευδαργύρου και [48]

103 ετών φάρμακο Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή εικονικού για 6 μήνες βιταμίνη C, β- καροτένιο, ψευδάργυρος, σελήνιο) ορού σληνίου ορού Στατιστικά σημαντική αύξηση δραστικότητας GPx (P <0,01) και SOD (P <0,05) Stefanie B et al, 2014/[123] υπέρβαρα ή παχύσαρκα παιδιά και ηλικίας 10-18 ετών 44 ιπλά-τυφλή ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή εικονικού για 4 μήνες Βιταμίνη Ε, 400 IU, Βιταμίνη C, 500 mg Σελήνιο, 50 mg αντιοξειδωτική κατάσταση F2-ισοπροστάνιο και μεταβολίτες του Σημαντική επίδραση στην αντιοξειδωτική κατάσταση (αύξηση α- τοκοφερόλης πλάσματος, ασκορβικού οξέος πλάσματος, σεληνίου ορού) και στο οξειδωτικό στρες (μείωση 8-ισοπροσταγλανδίνης F2a) Karin Jacob et al, 2008/[75] Υγιείς άντρες και γυναίκες ηλικίας 19-27 ετών μη καπνιστές 23 Τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή μελέτη με εικονικό φάρμακο Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή εικονικού για 4 εβδομάδες χυμό τομάτας εμπλουτισμένος με βιταμίνη C Καροτενοειδή, βιαταμίνη C πλάσματος και ούρων, αντιοξειδωτική ικανότητα, θειοβαρβιτουρικό οξύ, TBARS και 8-επιπροσταγλανδίνη F2a, πρωτεϊνικά καρβονύλια Στατιστικά σημαντική αύξηση αντιοξειδωτικής ικανότητας ούρων και μείωση TBARS στο πλάσμα και στα ούρα L.Gabrihl et al, [81] Υγιείς άντρες και γυναίκες 58 Τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή μελέτη με εικονικό φάρμακο Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή εικονικού για 8 εβδομάδες Συμπλήρωμα Mind-Master, LR Health & Beauty Systems) με Gel από αλόη, εκχύλισμα πράσινου τσαγιού, χυμό σταφυλιού και εκχύλισμα Polygonum cuspidatum το οποίο περιέχει ρεσβερατρόλη. ραστικότητα GPX, Αντιοξειδωτικά ορού, TBARS, 8- υδραξυγουανίνη Στατιστικά σημαντική μείωση 8- υδροξυγουανίνης και άρα μείωση της οξειδωτικής βλάβης του DNA/RNA. [49]

Ex vivo κλινικές μελέτες με συμπληρώματα αντιοξειδωτικών και επίδραση σε δείκτες οξειδωτικού στρες Στον πίνακα που ακολουθεί περιλαμβάνονται 9 τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες, ελεγχόμενες με εικονικό συμπλήρωμα, οι οποίες εξετάζουν ex-vivo, την επίδραση μετά την κατανάλωση αντιοξειδωτικών από υγιή άτομα διαφόρων ηλικιών, στην οξειδωτική βλάβη στο DNA κυρίως με το Comet Assay αλλά και κύτταρα από τα άτομα αυτά. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι δύο μελέτες (Choi et al, Han Yao Huang et al.) οι οποίες έδωσαν στους εθελοντές αντιοξειδωτικές βιταμίνες C και Ε, μόνες τους ή σε συνδυασμό, σε ακριβώς ίδιες ποσότητες δεν είχαν καμία επίδραση στην οξειδωτική βλάβη στο DNA. Στις υπόλοιπες μελέτες είναι δύσκολο να γίνει σύγκριση γιατί χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικοί συνδυασμοί αντιοξειδωτικών. Ωστόσο οι περισσότερες μελέτες δείχνουν ότι υπάρχει μείωση στις βλάβες του DNA αλλά και άλλων δεικτών οξειδωτικού στρες που εξέτασαν. ΣΥΓΓΡΑΦΕΑΣ/ ΑΝΑΦΟΡΑ ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ Ν ΣΧΕ ΙΑΣΜΟΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ ΕΙΚΤΕΣ ΟΞΕΙ ΩΤΙΚΟΥ ΣΤΡΕΣ ΠΟΥ ΜΕΤΡΗΘΗΚΑΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Kantor et al,2013/[46] Υγιείς άντρες και γυναίκες ηλικίας 50-76 ετών 209 Τυχαία επιλογή πληθυσμού από προοπτική μελέτη Vital Study Συμπληρωματική χορήγηση συμπληρώματος αντιοξειδωτικών για 2 εβδομάδες Γλυκοζαμίνη (glucosamine, χονδροϊτίνη (chondroitin), έλαιο από ψάρι ( fish oil), methylsulfonylmethane (MSM), Q10, ginseng, ginkgo, saw palmetto 8-ισοπροστάνιο και PGF2α ούρων Αξιολόγηση της βλάβης και της ικανότητας επιδιόρθωσης του DNA των με το Comet assay. Στατιστικά σημαντική μείωση των συγκεντρώσεων PGF2α (χονδροϊτίνη, γλυκοζαμίνη) και μείωση στις βασική βλάβες στο DNA (Q10). You Jin Kim et al,2013/[77] Υγιείς άντρες και γυναίκες ηλικίας 25-69 ετών με χαμηλή πρόσληψη φρούτων και λαχανικών 89 Τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή εικονικού για 8 εβδομάδες Πολυβιταμινούχο συμπλύρωμα με διάφορα μέταλλα και φυτοχημικά συστατικά από εκχυλίσματα φρούτων, λαχανικών και φυτών (MP: Double X ) ( 14 βιταμίνες 693 μg RE Α, 200 IU D, 27,8 IU Ε, 55 μg K, 2 mg Β1, 2,4 mg Β2, 3 mg Β6, 2 μg Β12, 200 mg C, 26 mg νιασίνη, 60 μg βιοτίνης, 3 mg β- καροτένιο, 400 μg φολικού οξέος και 10 mg παντοθενικό οξύ) και εννέα μεταλλικά στοιχεία (700 mg ασβεστίου, 10 mg σιδήρου, 75 μg ιωδίου, 12 mg ψευδαργύρου, 1,5 mg χαλκού, 2 mg μαγγάνιο, 220 mg μαγνήσιο, 50 μg χρώμιο και 50 μg σελήνιο). Αξιολόγηση της βλάβης στο DNA σε κύτταρα PBMC με το comet assay. Στατιστικάσημαντική μείωση της βλάβης στο DNA (p = 0.006, tail intensity; p = 0.030, tail moment by comet assay). [50]

Marcelo Lima Ribeiro et al, 2007/[113] Υγιείς άντρες και γυναίκες ηλικίας 45-70 ετών, μη καπνιστές 80 Τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή μελέτη με εικονικό φάρμακο Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή εικονικού για 4 εβδομάδες Βιταμίνη Α, βιαμίνη Ε, βιταμίνη C Μίγμα βιταμινών και μετάλλων Αντίσταση DNA λεμφοκυττάρων στο H2O2 (μέθοδος Comet) Στατιστικά σημαντική μείωση της οξειδωτικής βλάβης στο DNA Susan J. Duthie et al.1996/[128] Υγιείς άντρες καπνιστές και μη ηλικίας 50-59 ετών 100 Τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή μελέτη με εικονικό φάρμακο Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή εικονικού για 20 εβδομάδες βιταμίνη C( 100 mg/day), βιταμίνη Ε (280 mg/day) και ΑΥκαροτένιο (25 mg/day) Αντίσταση DNA λεμφοκυττάρων στο H2O2 (μέθοδος Comet) Μέτρηση αντιοξειδωτικών πλάσματος. Αυξημένη αντίσταση λεμφοκυττάρων των δύο ομάδων (καπνιστές και μη) στην οξειδωτική βλάβη του DNA από Η 2 Ο 2 in vitro. Han-Yao Huang et al, 2000/[60] Υγιείς άντρες και γυναίκες, μη καπνιστές, ηλικίας 58 ετών (Μ.Ο) 184 Τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή μελέτη με εικονικό φάρμακο Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή εικονικού για 2 μήνες βιταμίνη C(500 mg/day), βιταμίνη Ε (α-τοκοφερόλη400 IU/day), ή μείγμα των δύο Μέτρηση 8- υδρογυγουανίνης ούρων Μη σημαντική επίδραση στην οξειδωτική βλάβη του DNA. Peter Møller et al,(2004)/[100] Υγιείς άντρες και γυναίκες, μη καπνιστές, ηλικίας 19-52 ετών 57 Τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή μελέτη με εικονικό φάρμακο Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή εικονικού για 3 εβδομάδες Χυμός φραγκοστάφυλου ή ποτό εμπλουτισμένο με ανθοκυανίνες (475-1000 ml χυμού ανα ημέρα με μέσο όρο ανθοκυανινών 397-365 g/d). Comet assay σε μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος (MNBC) εν υπήρχαν διαφορές μεταξύ των 3 ομάδων (εικονικού, ποτού με ανθοκυανίνες, χυμός φραγκοστάφυλο) σε οποιονδήποτε από τους δείκτες βλάβης του DNA (Strand breaks, Endo III sites, FPG sites) G.W. Davison et al, 2005/[35] Υγιείς άντρες μη καπνιστές ηλικίας Μ.Ο 22 ετών 14 Τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή μελέτη με εικονικό φάρμακο Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών ή εικονικού για 7 ημέρες 400 mg α-λιποϊκό οξύ, 200 mg Q10, 12 mg μαγγάνιο, 600 mg βιταμίνη C, 800 mg N- ακέτυλοκυστεΐνη, 400 μg σελήνιο, 400 IU α- τοκοφερόλη ανα ημέρα. Αλκαλικό Comet Assay σε λεμφοκύτταρα Η άσκηση αύξησε σημαντικά την οξειδωτική βλάβη στο DNA, ωστόσο τα αντιοξειδωτικά δεν είχαν καμιά επίδραση στη βλάβη αυτή. S.W. Choi et al, 2004/[25] Υγιείς άντρες και γυναίκες μη καπνιστές 12 Τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή μελέτη με Βιταμίνη C (500 mg), βιταμίνη Ε (400 IU) (είτε μόνες τους είτε σε Αλκαλικό Comet Assay σε λεμφοκύτταρα Καμία επίδραση στις βλάβες του DNA [51]

ηλικίας 23-47 ετών εικονικό φάρμακο (multiple crossover design) συνδιασμό) Συμπληρωματική χορήγηση αντιοξειδωτικών βιταμινών ή εικονικού για 4 μέρες με 10 μέρες wash out. Weisel T. et al, 2006/[144] Υγιείς άντρες 18 Παρέμβαση Συμπληρωματική χορήγηση χυμού ή εικονικού για 4 εβδομάδες. Χυμός μούρων εμπλουτισμένος με αβθοκυανίνες και πολυφαινόλες Αλκαλικό Comet Assay σε λεμφοκύτταρα Σημαντική μείωση της επαγόμενης από υπεροξείδιου του υδρογόνου οξειδωτικής βλάβης του DNA. Wilms L. C. et al, 2005/[146] Υγιείς γυναίκες μη καπνίστριες ηλικίας 21-29 ετών 8 Παρέμβαση Συμπληρωματική χορήγηση χυμού ή εικονικού για 4 εβδομάδες. Μίξη χυμού από μούρα και χυμού μήλου εμπλουτισμένα με κερκετίνη, 34 mg quercetin/1 και 1.5 mg quercetin/1 αντίστοιχα. Αλκαλικό Comet Assay σε λεμφοκύτταρα Σημαντική μείωση της επαγόμενης από υπεροξείδιου του υδρογόνου οξειδωτικής βλάβης του DNA. In vitro μελέτες με αντιοξειδωτικά συστατικά και επίδραση σε δείκτες οξειδωτικού στρες Στον παρακάτω πίνακα περιλαμβάνονται 7 μελέτες από το 2000 και μετά, οι οποίες εξετάζουν την επίδραση διαφόρων φυσικών αντιοξειδωτικών συστατικών (μείγματα ή όχι και σε διάφορες συγκεντώσεις) σε υγιή ανθρώπινα κύτταρα, στην επαγόμενη από οξειδωτικά βλάβη στο DNA. Σε όλες τις μελέτες η μέθοδος που χρησιμοποιείται είναι το Comet Assay με διάφορες τροποποιήσεις. Γενικά, φαίνεται ότι σε μια χαμηλή συγκέντρωση τα περισσότερα αντιοξειδωτικά μπορούν να μειώσουν την οξειδωτική βλάβη στο γενετικό υλικό. Αντίθετα, σε υψηλές συγκεντρώσεις μπορεί να λειτουργήσουν ως προοξειδωτικά με αντίθετα αποτελέσματα. [52]

ΣΥΓΓΡΑΦΕΑΣ/ ΑΝΑΦΟΡΑ ΕΙ ΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ ΑΝΤΙΟΞΕΙ ΩΤΙΚΩΝ ΠΑΡΕΜΒΑΣΗ ΜΕΘΟ ΟΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Benjamin J. Baechle et a, 2007/[13] Nora M. O'Brien et al, 2016/[94] Y.T. Szeto et al, 2002/[148] Κυτταρική σειρά από κύτταρα επιδερμίδας, A413NS Μονοκύτταρα U937 Ανθρώπινα λεμφοκύτταρα Πόσιμο, υγρό, πολυσυμπλήρωμα διατροφής με μίγμα φρούτων, λαχανικών, aloe vera, κατεχινών από πράσινο τσάι (VIBE Cardiac & Life, Eniva Nutraceuticals, Anoka, MN) Ρεσβερατρόλη, citroflavan-3-ol, τέσσερα εκχυλίσματα φυτών- πολυφαινόλες από κουκούτσι σταφυλιού, εκχύλισμα φύλλων ελιάς, bearberrys, εχινάτσια (echinacea purpurea) Κερκετίνη, καφεϊκό οξύ, Trolox και α- τοκοφερόλη Τα κύτταρα επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις VIBE (0% (control), 0.125%, 0.5%, 1%, 2%) για 30 λεπτά και μετά εκτέθεικαν σε ακτινοβολία UVR Προεπώαση κυττάρων με τα αντιοξειδωτικά συστατικά για 24 ώρες. Επώαση με 0,5mM ετοποσίδη (etoposide), 100 mm υπεροξείδιο του υδρογόνου, 400 mm tbooh. Προεπώαση κυττάρων για 30 min με διαφορετικές συγκεντρώσεις αντιοξειδωτικών. Επώαση για 5 min με και χωρίς 45Μ υπεροξείδιο του υδρογόνου. alkaline singlecell gel electrophoresis assay or comet assay alkaline singlecell gel electrophoresis assay or comet assay Comet assay with lysis before treatment Στατιστικά σημαντική μικρότερη ζημιά στο DNA στα κύτταρα που περιείχαν το συμπλήρωμα σε σχέση με το control. Τριπλάσια μείωση στο tail intensity στο 0,5% VIBE σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου χωρίς VIBE (p <0,001). Το εκχύλισμα από φύλλα ελιάς και τα bearberrys έδειξαν σημαντική μείωση του οξειδωτικού στρες από την οξειδωτική βλάβη του DNA από ετοποσίδη, ενώ οι πολυφαινόλες από κουκούτσι σταφυλιού και bearberrys έδειξαν προστασία από την επαγόμενη από H 2 O 2 και tbooh οξειδωτική βλάβη στο DNA. Προστασία έναντι οξειδωτικού στρες έδειξε η α-τοκοφερόλη και η κερκετίνη σε χαμηλές συγκεντρώσεις (3.1 Μ). Αντίθετα το καφεϊκό οξύ δεν προστατεύει, και σε υψηλή συγκέντρωση (100 Μ) προκάλεσε αύξηση της βλάβης του DNA. Σημαντικός ο ρόλος της κυτταρικής μεμβράνης στον περιορισμό της πρόσβασης αντιοξειδωτικων. J.P. Silva et al, 2008/[69] A.L.McCarthy et al, 2012/[1] κύτταρα PC12, μοντέλο νευρώνων Μονοκύτταρα U937 Φαινολικές ενώσεις: Κερκετίνη, λουτεολίνη, και ροσμαρινικό οξύ Εκχύλισμα από brewers spent grain (BSG) από μπύρα μαύρη και τύπου pale Επώαση για 1 ώρα με 200 μμ Τ- ΒΗΡ. Προσθήκη 50 μμ λουτεολίνης, 50 μμ κερκετίνης και 50 μμ ροσμαρινικού οξέος είτε συγχρόνως είτε 3 ώρες μετά την προσθήκη οξειδωτικού. Προεπώαση κυττάρων με εκχύλισμα τεσσάρων pale (Ρ1-Ρ4) και τεσσάρων μαύρων (Β1-Β4) BSG για 24 ώρες. Επώαση με οξειδωτικά H2O2 (50 μm for 30 min), SIN-1 (4 mm for Comet assay Comet assay Μείωση οξειδωτικής βλάβης (strand breaks) από λουτεολίνη και κερκείνη σε μεγαλύτερο βαθμό από το ροσμαρινικόοξύ, με το τελευταίο να εμπλέκεται σε ενδοκυττάριες οδούς που σχετίζονται με την επιδιόρθωση του DNA. Τα εκχυλίσματα από μαύρο BSG (Β1-Β4) προστατεύουν σημαντικά έναντι της οξειδωτικής βλάβης που προκαλείται από Η 2 Ο 2. Τα P2, Β2, Β3 και Β4 έδειξαν σημαντική προστασία έναντι SIN- 1. Κανένα από τα εκχυλίσματα δεν προστατεύουν από [53]

A. Quincozes- Santos et al, 2007/[110] κύτταρα C6 γλοιώματος Ρεσβερατρόλη 90 min), 4-NQO (2 mg/ml for 90 min) ή t-booh (400 lm for 60 min) Επώαση κυττάρων με (Ι) 1mM υπεροξείδιο του υδρογόνου για μισή ώρα (10-250 mm της ρεσβερατρόλης) και (II) υπεροξείδιο του υδρογόνου 0,1 ή 0,5 mm για 6 ώρες (10-100 mm της ρεσβερατρόλης) Comet assay βλάβες στο DNA που προκαλούνται από Τ- ΒΟΟΗ και 4-NQO. Η ρεσβερατρόλη ήταν σε θέση να αποτρέψει την οξειδωτική βλάβη στο DNA, που επάγεται στο μοντέλο Ι, σε όλες τις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν. Ωστόσο, στις 6 ώρες επώασης, η ρεσβερατρόλη εμπόδισε μερικώς τη βλάβη του DNA. Wilms L. C. et al, 2005[146] Ανθρώπινα λεμφοκύτταρα Κερκετίνη Επώαση κυττάρων με διαφορετικές συγκεντρώσεις κερκετίνης και στη συνέχεια έκθεση με 25Μ Η 2 Ο 2 για 1 ώρα Comet assay Στατιστικά σημαντική δοσοεξαρτώμενη μείωση της επαγόμενης από υπεροξείδιο οξειδωτικής βλάβης στο DNA 3.4 Περιγραφή αντιοξειδωτικών συστατικών συμπληρώματος της παρούσας μελέτης Το συμπλήρωμα που χορηγήθηκε στα κύτταρα περιείχε: Αντιοξειδωτικές βιταμίνες και Σελήνιο (βλ. Αντιοξειδωτικά της διατροφής σελ.) Χυμό σταφυλιού Το σταφύλι κατατάσσεται στα φρούτα με την υψηλότερη περιεκτικότητα σε φαινολικές ενώσεις. Οι φαινολικές ενώσεις βρίσκονται στους σπόρους, στη φλούδα αλλά και στο χυμό του σταφυλιού. Περίπου 100 γρ. φρέσκου φρούτου περιέχουν 200-300mg φαινολικών ενώσεων. [7] Οι πιο σημαντικές από αυτές τις ουσίες περιλαμβάνουν προανθοκυανιδίνες και ρεσβαρατρόλη, η οποία βρίσκεται στο σταφύλι και στο κόκκινο κρασί. Οι φαινολικές ενώσεις στο χυμό του σταφυλιού έχουν ισχυρή αντιοξειδωτική δράση και μπορούν να αναστέλλουν την οξείδωση της LDL χοληστερόλης, βοηθώντας έτσι στην πρόληψη των καρδιαγγειακών νοσημάτων. Επιπλέον, εκτός από την πρόληψη των καρδιαγγειακών, τα αντιοξειδωτικά συστατικά του σταφυλιού φαίνεται να έχουν ευεργετική δράση στην πρόληψη και άλλων ασθενειών που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες όπως ο σακχαρώδης διαβήτης, ο καρκίνος και οι νευροεκφυλιστικές ασθένειες. [93] Εκχύλισμα πράσινου τσαγιού Το πράσινο τσάι είναι πλούσιο σε φαινολικές ενώσεις που ονομάζονται κατεχίνες. Οι σημαντικότερες ουσίες του πράσινου τσαγιού περιλαμβάνουν την επικατεχίνη (ΕC), την επικατεχίνη-3-gallate (ECG), την επιγαλλοκατεχίνη (EGC) και την επιγαλλοκατεχίνη-3- gallate(egcg). Από αυτές η EGCG και η ECG έχουν την υψηλότερη ικανότητα δέσμευσης ελεύθερων ριζών. Το εκχύλισμα πράσινου τσαγιού σε συμπληρώματα περιέχει μεγάλες δόσεις από αυτές τις φαινολικές ενώσεις χωρίς να περιέχει τις ανεπιθύμητες δράσεις της καφεΐνης. [63] Αξίζει να σημειωθεί ότι οι κατεχίνες στο πράσινο τσάι, αν και σε μικρές ποσότητες, εμφανίζονται πολύ γρήγορα στο πλάσμα μετά την κατάποση. [14] Το πράσινο τσάι έχει πολλές ευεργετικές δράσεις για τον οργανισμό. Μπορεί να μειώσει το οξειδωτικό [54]

στρες και να ενισχύσει την αντιοξειδωτική άμυνα του οργανισμού με αποτέλεσμα να προστατεύει από καρδιαγγειακά και να βοηθά στην πρόληψη εμφάνισης καρκίνου. [7] Συμπληρωματική χορήγησή του συνδέεται με μείωση της βλάβης στο DNA που προκαλείται από το οξειδωτικό στρες. [14] Ρεσβερατρόλη Η ρεσβερατρόλη ανήκει στις φαινολικές ενώσεις. Πρόκειται για την ένωση 3,4,5- τριυδροξυστιλβένιο. Βρίσκεται παρούσα σε διάφορα φυτά, όπως στις ρίζες του φυτού Polygonum cupsidatum, στα σταφύλια, στα μούρα, στα φιστίκια και κυρίως στο κόκκινο κρασί. [36,115] Η ρεσβερατρόλη έχει κυρίως αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδης ιδιότητες. Πιστεύεται ότι μπορεί να καταστείλει παράγοντες που εμπλέκονται στην διαδικασία της αθηρογένεσης και να μειώσει τους παράγοντες κινδύνου για αθηροσκλήρωση. Φαίνεται επίσης ότι η αντιαθηροσκληρωτική επίδραση του κρασιού οφείλεται στην ρεσβερατρόλη. [104] Επιπρόσθετα, πρόσφατα επιστημονικά δεδομένα προσδίδουν αντιγηραντικές και αντικαρκινικές ιδιότητες στη ρεσβερατρόλη. Εντούτοις είναι απαραίτητη περαιτέρω έρευνα για την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα των συμπληρωμάτων ρεσβιρατρόλης. [120] L-καρνιτίνη Η L-καρνιτίνη είναι ένα μικρό υδατοδιαλυτό μόριο με σημαντικές δράσεις στο μεταβολισμό των θηλαστικών. Βρίσκεται στο σώμα υπο τη μορφή ελεύθερης καρνιτίνης, ως ακετυλο-lκαρνιτίνη και ως εστέρες καρνιτίνης. Περίπου 25% της καρνιτίνης του σώματος βιοσυντίθεται από τα αμινοξέα μεθειονίνη και λυσίνη στο ήπαρ και τα νεφρά, ενώ το υπόλοιπο ποσοστό λαμβάνεται από τη διατροφή, κυρίως από το κόκκινο κρέας και το γάλα. Το 99% της καρνιτίνης βρίσκεται εντός των κυττάρων (ενδοκυττάριο συστατικό). Οι υψηλότερες συγκεντρώσεις της ουσίας βρίσκονται στο ήπαρ και στους σκελετικούς μύες. Η καρνιτίνη δε μπορεί να μεταβολιστεί από το σώμα και αποβάλλεται ως έχει ή υπο τη μορφή ακετυλοκαρνιτίνης από τα ούρα. Κύριος ρόλος της L-καρνιτίνης στο σώμα είναι η μεταφορά των λιπαρών οξέων στη μήτρα των μιτοχονδρίων για τη β-οξείδωση και την παραγωγή ATP. Εκτός από το σημαντικό της ρόλο στο μεταβολισμό των λιπιδίων, η καρνιτίνη είναι επίσης ισχυρό αντιοξειδωτικό και έτσι μπορεί να προστατεύει τους ιστούς από την οξειδωτική βλάβη. [112] Έχει φανεί ότι η συμπληρωματική χορήγησή της, έχει ευεργετική δράση σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις που χαρακτηρίζονται από αυξημένο οξειδωτικό στρες όπως η στεφανιαία νόσος και η νόσος Alzheimer. [20] Τα συμπληρώματα καρνιτίνης πιστεύεται επίσης ότι μπορούν να αυξήσουν την αθλητική απόδοση και να βοηθήσουν στην απώλεια βάρους. [76] Συνένζυμο Q10 Ο ρόλος του συνενζύμου Q10 περιγράφεται στη σελ. 25-26. Κλινικές μελέτες με συμπληρώματα του συνενζύμου δείχνουν ότι είναι ευεργετικό στη θεραπεία της καρδιακής ανεπάρκειας και της υψηλής πίεσης του αίματος. Είναι εξαιρετικό αντιοξειδωτικό και σε δόση 150 mg μπορεί να μειώσει το οξειδωτικό στρες και να αυξήσει τη δραστικότητα αντιοξειδωτικών ενζύμων σε ασθενείς με στεφανιαία νόσο. Ωστόσο μπορεί να αλληλεπιδράσει με πολλά φάρμακα όπως η βαρφαρίνη και φάρμακα για τη μείωση της χοληστερόλης. [7] Aloe barbadensis Miller (Aloe Vera) [55]

Η Aloe Vera είναι κάκτος που φυτρώνει εύκολα σε ζεστά-ξηρά κλίματα. Ανήκει στην οικογένεια Aloeaceae και είναι γνωστή στη βιβλιογραφία με πολλά ονόματα όπως Aloe Barbadensis Miller. Το φυτό αυτό χρησιμοποιείται εδώ και χιλιάδες χρόνια για τις θεραπευτικές του ιδιότητες και η χρήση του αναφέρεται στους αρχαίους πολιτισμούς της Ινδίας, της Αιγύπτου, της Ελλάδας, της Ρώμης και της Κίνας. Το φυτό αποτελείται κυρίως από νερό σε περιεκτηκότητα 99-99.5%. Το υπόλοιπο 0,5-1,0% στερεό υλικό αναφέρεται ότι περιέχει πάνω από 200 διαφορετικές δραστικές ενώσεις όπως λιποδιαλυτές βιταμίνες, μέταλλα, ένζυμα, απλούς / σύνθετους πολυσακχαρίτες, φαινολικές ενώσεις, και οργανικά οξέα. Το ζελέ αλόης περιέχει εκτός των άλλων φαινολικές ενώσεις (ανθοκινόνες), αντιοξειδωτικές βιταμίνες (βιταμίνη C, E, A), βιταμίνες (Β1-θειαμίνη, Β2- ριβοφλαβίνη, φυλλικό, Β12), χολίνη, μέταλλα και ιχνοστοιχεία (χαλκός, ψευδάργυρος, μαγνήσιο κα), καθώς και αντιοξειδωτικά ένζυμα καταλάση και SOD. [5,142] Η αλόη έχει διάφορες φαρμακευτικές ιδιότητες όπως αντιμικροβιακές, αντικαρκινικές, αντιδιαβητικές, αντιφλεγμονώδης και αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Επιπλέον, βοηθά στη δυσκοιλιότητα και στις διαταραχές του γαστρεντερικού συστήματος.τα μέχρι σήμερα δεδομένα από κλινικές μελέτες υποστηρίζουν ότι η Aloe Vera μπορεί να μειώσει την LDL χοληστερόλη, να αυξήσει την HDL και να μειώσει τα επίπεδα γλυκόζης του αίματος. Ενδείκνυται επίσης για τη θεραπεία του έρπητα των γεννητικών οργάνων, τη θεραπεία της ψωρίασης αλλά και για ανκούφιση από τα εγκαύματα. [5,142] Η A. vera περιέχει σημαντικές ποσότητες αντιοξειδωτικών όπως έχει αναφερθεί πιο πάνω, και έτσι θεωρείται μια καλή πηγή φυσικών αντιοξειδωτικών. Την αντιοξειδωτική της δράση επιβεβαιώνουν πολλές μελέτες in vitro αλλά και in vivo κυρίως σε ζωϊκά μοντέλα. [111] In vitro μελέτη που πραγματοποιήθηκε από τους, έδειξε ότι το τζελ της αλόης είναι αποτελεσματικό στην εξουδετέρωση ελευθέρων ριζών DPPH, ABTS(3- αιθυλβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικό οξύ) και μονοξειδίου του αζώτου με δοσοεξαρτώμενη δράση. [116] Μελέτη σε ποντίκια στα οποία χορηγήθηκε εκχύλισμα φύλλων αλόης και στη συνέχεια εκτέθεικαν σε γ-ακτινοβολία έδειξε ότι η δραστικότητα των ενζύμων καταλάση και SOD του δέρματος και GSH στο ήπαρ και στο αίμα αυξήθηκε σημαντικά και η υπεροξείδωση λιπιδίων στο αίμα και στο ήπαρ μειώθηκε στα ποντίκια που έλαβαν την αλόη. [55] Μελέτη που πραγματοποιήθηκε από τους S. Kametani et al. [74], σε καρκινικά κύτταρα υποστηρίζει ότι η αντιοξειδωτική δράση του φυτού δεν οφείλεται σε ένα συστατικό αλλά στη συνεργιστική δράση των αντιοξειδωτικών συστατικών που περιέχει. Η αλόη φαίνεται να έχει χημειοπροληπτική δράση σε καρκινικά κύτταρα μέσω της ρύθμισης της δραστικότητας αντιοξειδωτικών ενζύμων αλλά και αντιοξειδωτικών σύμφωνα με μελέτη σε καρκινικά κύτταρα.[57] Η χρήση της εξωτερικά ή σε πόσιμο συμπλήρωμα θεωρείται ασφαλής. Εντούτοις δε συστήνεται η κατανάλωση της κατα την περίοδο της εγκυμοσύνης, του θηλασμού, σε κοιλιακό πόνο, σε σκωληκοειδίτιδα και σε εντερική απόφραξη. [5,142] Χολίνη Η χολίνη είναι ένα συστατικό που βρίσκεται σε ποικιλία τροφίμων τόσο σε ζωικές (πχ συκώτι, αυγό, βοδινό κρέας, γαρίδες, σολομός) όσο και σε φυτικές πηγές (πχ λαχανάκια Βρυξελλών, μπρόκολο, κουνουπίδι, βρώμη). Εκτός από τη διατροφή, η χολίνη μπορεί να συντεθεί ενδογενώς στο ήπαρ από φωσφατίδυλοαιθανολαμίνη. Πρόκειται για μια [56]

τεταρτοταγή αμίνη που αποτελεί συστατικό των φωσφολιπιδίων και του νευροδιαβιβαστή ακετυλοχολίνη. Επίσης συμμετέχει στο σχηματισμό του παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων, στην ηπατική έκκριση VLDL και δρα ως μεταφορέας μεθυλοομάδων μέσω της βεταΐνης (παράγωγο χολίνης). [39] Έλλειψη χολίνης μπορεί να οδηγήσει σε σοβαρές παθολογικές καταστάσεις. Έχει αποδειχθεί ότι τα συμπληρώματα χολίνης ενισχύουν τη σύνθεση και την απελευθέρωση ακετυλοχολίνης κατα τη νευρομυϊκή σύναψη. Επίσης φαίνεται ότι συμπληρώματα χολίνης μπορούν να προλάβουν τη μείωση ακετυλοχολίνης που παρατηρείται κατα την έντονη άσκηση (μαραθώνιος) και έτσι ενισχύουν την αθλητική απόδοση. [66] Συστατικά και διατροφική ανάλυση του συμπληρώματος Συστατικά: Gel από Aloe barbadensis Miller (ΗΠΑ/Μεξικό 36%), χυμός σταφυλιών από συμπύκνωμα, νερό, δεξτρόζη, μείγμα εκχυλισμάτων (εκχύλισμα πράσινου τσαγιού, εκχύλισμα Polygonum cuspidatum που περιέχει ρεσβερατρόλη), σταθεροποιητής (κόμμι ξανθάνης), L-καρνιτίνη, μείγμα βιταμινών (βιταμίνη B1, φυλλικό οξύ, βιταμίνη B12, βιταμίνη E), χρωστική ουσία: χλωροφύλλη από φυτικά εκχυλίσματα, μέσο οξύτητας (κιτρικό οξύ), φωσφορικός σίδηρος (III), συντηρητικό (σορβικό κάλιο), φυσικό άρωμα, γλυκαντική ουσία: στεβιο-γλυκοζίτες, συνένζυμο Q10, αντιοξειδωτικό (ασκορβικό οξύ), χολίνη, σεληνιώδες νάτριο. Πίνακας 2 - ιατροφική ανάλυση συμπληρώματος Συστατικά Ανά ανά ημερήσια % ΣΗΔ * 100 ml δόση (80ml) Φυσιολογική θερμιδική αξία (kj/kcal) 226/ 53 180,8/ 42,4 - Πρωτεΐνη < 0,1 g < 0,1 g - Υδατάνθρακες 13,1 g 10,48 g - Λιπαρά <0,1 g <0,1 g - Φυλλικό οξύ 250 µg 200 µg 100% Βιταμίνη E (α - ΤΕ) 15 mg 12 mg 100% ΒιταμίνηB1 1,38 mg 1,1 mg 100% Βιταμίνη B12 3,13 µg 2,5 µg 100% Σίδηρο 5,25 mg 4,2 mg 30% Σελήνιο 34,37 µg 27,5 µg 50% [57]

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ [58]

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4o ΣΚΟΠΟΣ Τα φυτοχημικά αντιοξειδωτικά συστατικά της δίαιτας, που βρίσκονται σε φρούτα, λαχανικά, βότανα, εκχυλίσματα φυτών και σε ποτά, συνδέονται με βελτίωση της αντιοξειδωτικής άμυνας του οργανισμού και με την πρόληψη χρόνιων νοσημάτων που σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες. Ωστόσο η κατανάλωση συμπληρωμάτων διατροφής με αυτά τα συστατικά δε φαίνεται να έχει τα ίδια αποτελέσματα. Οι μελέτες in vitro που γίνονται σε κύτταρα μας βοηθούν στην κατανόηση του μηχανισμού δράσης των αντιοξειδωτικών συστατικών. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί ο μηχανισμός της πιθανής προστατευτικής δράσης συμπληρώματος διατροφής με φυσικά εκχυλίσματα και βιταμίνες στις λειτουργίες μονοκύτταρων U937 κάτω από συνθήκες οξειδωτικού στρες. [59]

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Ο ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ 5.1 Καλλιέργεια μονοκυττάρων Χρησιμοποιήθηκε μια σταθερή κυτταρική σειρά ανθρώπινων μονοκυττάρων U937. Αυτή η κυτταρική σειρά απομονώθηκε από ένα διάχυτο ιστιοκυτταρικό λέμφωμα ενός άνδρα ασθενή 37 ετών και διατηρεί τα χαρακτηριστικά των μονοκυττάρων, τους Fc υποδοχείς (+) και άλλων καθιστώντας την ένα καλό μοντέλο για τη μελέτη τους στο εργαστήριο. Η μορφολογία των κυττάρων της κυτταρικής σειράς είναι πανομοιότυπη με αυτή των καρκινικών κυττάρων της υπεζωκοτικής συλλογής από την οποία η σειρά δημιουργήθηκε. Η ιστιοκυτταρική καταγωγή της σειράς φαίνεται από την ικανότητα της για παραγωγή λυσοζύμης και την έντονη δραστικότητα εστεράσης των κυττάρων. Τα U937 είναι μυελοειδούς καταγωγής και αποτελούν πρόδρομη μορφή μονοκυττάρων (προμονοκύτταρα). Μπορούν να μετατραπούν σε μονοκύτταρα με την επίδραση διαφόρων παραγόντων. Παράγουν μεγάλο αριθμό κυτταροκινών και χημειοκινών, είτε σε βασικά επίπεδα (IL-1, GM-CSF), είτε σε απόκριση διαφόρων ερεθισμάτων. Τα U937 χρησιμοποιούνται στο εργαστήριο ως κυτταρικό μοντέλο μελέτης της διέγερσης και της διαφοροποίησης των μονοκυττάρων σε μακροφάγα και για μελέτες αντικαρκινικής δράσης. Αντιδραστήρια Όργανα RPMI 1640 (Gibco BRL, Paisley, UK). Ορός εμβρύων μοσχου (NCS) (Gibco BRL, Paisley, UK). Το διάλυμα χωρίζεται σε αποστειρωμένους σωλήνες και φυλάσσεται στους 20 ο C. L-Γλουταμίνη (Sigma): Το διάλυμα συγκέντρωσης 200mM χωρίζεται σε αποστειρωμένους σωλήνες και φυλάσσεται στους 20 ο C. Πενικιλίνη-Στρεπτομυκίνη (Sigma). Το διάλυμα χωρίζεται σε αποστειρωμένους σωλήνες. και φυλάσσεται στους 20οC. ιάλυμα αιθανόλης 70% (v.v). οχεία καλλιέργειας 75 cm 2 και 25 cm 2. Αποστειρωμένα σιφώνια των 10 και 50 ml. Αυτόματες πιπέτες. Αποστειρωμένες γυάλινες πιπέτες Pasteur Αποστειρωμένοι πλαστικοί σωλήνες των 15 και 50 ml. Επωαστήρας κυττάρων ατμόσφαιρας CO 2 5% και σταθερής θερμοκρασία 37 ο C. Απαγωγός κάθετης νηματικής ροής, aura B4. Φυγόκεντρος HERMLE Z320. Trypan Blue: Αναδιαλύονται 0,4g στερεού trypan blue σε 100ml dh 2 O με 0,81g NaCL (0,81%) και 0,06g μονόξινο φωσφορικό κάλιο (0,06%) Μικροσκόπιο Αναλυτική πορεία: [60]

Τα κύτταρα, U937, καλλιεργήθηκαν σε μέσο που περιείχε RPMI 1640, 10% NCS, 2 mmol/ L γλουταμίνη, 0,1 g/l στρεπτομυκίνη, 105 units/l πενικιλλίνη σε δοχεία καλλιέργειας 25 cm 2 και 75 cm 2. Η επώαση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε επωαστήρα με 5% CO 2 και 95% υγρασία και θερμοκρασία 37 ο C. Κάθε 2-3 μέρες γινόταν αλλαγή στο μέσο καλλιέργειας. Η διαδικασία απαιτούσε φυγοκέντρηση στα 230g για 10 min στους 25 ο C, αναρρόφηση υπερκείμενου και αναδιασπορά σε νέο θρεπτικό υλικό με τελική συγκέντρωση 0.7 10 6 cells/ml. Η μέτρηση των κυττάρων πραγματοποιούνταν με χρώση Trypan Blue και μέτρηση των κυττάρων με το αιματοκυττόμετρο στο μικροσκόπιο. Για την μέτρηση πραγματοποιείται αραίωση 1:1 του διαλύματος των κυττάρων με το διάλυμα της χρωστικής. 5.2 ιέγερση των κυττάρων με t-βοοη Αντιδραστήρια - Όργανα RPMI 1640 (Gibco BRL, Paisley, UK). L-Γλουταμίνη (Sigma): Το διάλυμα συγκέντρωσης 200mM χωρίζεται σε αποστειρωμένους σωλήνες και φυλάσσεται στους 20 ο C. Πενικιλίνη-Στρεπτομυκίνη (Sigma). Το διάλυμα χωρίζεται σε αποστειρωμένους σωλήνες και φυλάσσεται στους 20 ο C. ιάλυμα αιθανόλης 70% (v.v). οχεία καλλιέργειας 75 cm 2 και 25 cm 2. Αποστειρωμένα σιφώνια των 10 και 50 ml. Αποστειρωμένοι πλαστικοί σωλήνες των 15 και 50 ml. Αυτόματες πιπέτες. Αποστειρωμένες γυάλινες πιπέτες Pasteur Επωαστήρας κυττάρων ατμόσφαιρας CO 2 5% και σταθερής θερμοκρασία 37 ο C. Απαγωγός κάθετης νηματικής ροής, aura B4. Φυγόκεντρος HERMLE Z320. Πλάκες καλλιέργειας κυττάρων 96 πηγαδιών (96 well plates) ιάλυμα tert-butyl hydroperoxide 5M (t-booh 5MindecaneSigma-Aldrich) Προετοιμασία συγκεντρώσεων t-booh: Για την παρασκευή των διαλυμάτων t-booh ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: Αραίωση του αρχικού διαλύματος 5M (t-booh 5MindecaneSigma-Aldrich) με DMSO για την παρασκευή διαλύματος αναφοράς 100mM (stock solution). Στη συνέχεια με αραιώσεις παρασκευάστηκαν οι συγκεντρώσεις 50mM, 100mM, 250mM, 400mM που χρειάστηκαν για τα πειράματα που ακολουθήθηκαν. Αναλυτική πορεία Τα κύτταρα, U937, καλλιεργήθηκαν στο μέσο ανάπτυξης. Κάθε 2-3 μέρες γινόταν αλλαγή στο μέσο καλλιέργειας. Όταν τα κύτταρα έφθαναν στον επιθυμητό αριθμό, απομακρύνονταν από το μέσο καλλιέργειας με φυγογκέντρηση στα 230g, για 10 λεπτά και τα κύτταρα αναδιασπείρονταν σε φρέσκο μέσο χωρίς ορό (SFM) και ακολουθούσε παραμονή σε αυτό το μέσο για 24 ώρες ώστε να επέλθει συγχρονισμός των κυττάρων. Μετά της 24 ώρες [61]

απομακρύνονταν το μέσο με φυγογκέντρηση στα 230 g, για 10 λεπτά και τα κύτταρα αναδιασπείρονταν σε φρέσκο μέσο χωρίς ορό (SFM). Στη συνέχεια τα κύτταρα τοποθετούνταν σε πιάτα 96 πηγαδιών σε συγκέντρωση 1,11*10 6 κύτταρα/ml/πηγάδι και τελικό όγκο 0,1 ml. Κάθε πηγάδι αποτελούσε διαφορετική συνθήκη διέγερσης είτε με t-booh είτε χωρίς, σε διάφορες συγκεντρώσεις εις διπλούν. Η επώαση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε για 1 ώρα. Στη συνέχεια πραγματοποιούνταν δοκιμασία ΜΤΤ ή Comet Assay. 5.3 Επώαση των κυττάρων με συμπλήρωμα Αντιδραστήρια Όργανα RPMI 1640 (Gibco BRL, Paisley, UK). L-Γλουταμίνη (Sigma): Το διάλυμα συγκέντρωσης 200mM χωρίζεται σε αποστειρωμένους σωλήνες και φυλάσσεται στους 20οC. Πενικιλίνη-Στρεπτομυκίνη (Sigma). Το διάλυμα χωρίζεται σε αποστειρωμένους σωλήνες και φυλάσσεται στους 20οC. ιάλυμα αιθανόλης 70% (v.v). οχεία καλλιέργειας 75 cm2 και 25 cm2. Αποστειρωμένα σιφώνια των 10 και 50 ml. Αποστειρωμένοι πλαστικοί σωλήνες των 15 και 50 ml. Αυτόματες πιπέτες. Αποστειρωμένες γυάλινες πιπέτες Pasteur Επωαστήρας κυττάρων ατμόσφαιρας CO 2 5% και σταθερής θερμοκρασία 37 ο C. Απαγωγός κάθετης νηματικής ροής, aura B4. Φυγόκεντρος HERMLE Z320. Πλάκες καλλιέργειας κυττάρων 96 πηγαδιών (96 well plates) RPMI 1640 (Gibco BRL, Paisley, UK). Συμπλήρωμα διατροφής (Mind-Master, LR Health & Beauty Systems) (αραίωση 1/100 σε PBS) Αλόε Βέρα 36% (αραίωση 1/100 σε PBS) Αναλυτική πορεία Τα κύτταρα, U937, καλλιεργήθηκαν στο μέσο ανάπτυξής με RPMI 1640. Κάθε 2-3 μέρες γινόταν αλλαγή στο μέσο καλλιέργειας. Όταν τα κύτταρα έφθαναν στον επιθυμητό αριθμό, απομακρύνονταν το μέσο καλλιέργειας με φυγογκέντρηση στα 250 g, για 10 λεπτά στους 25 ο C και αναδιασπείρονταν σε φρέσκο μέσο χωρίς ορό (SFM). Ακολουθούσε παραμονή σε αυτό το μέσο για 24 ώρες ώστε να επέλθει συγχρονισμός των κυττάρων. Μετά της 24 ώρες απομακρύνονταν το μέσο με φυγογκέντρηση στα 230 g, για 10 λεπτά στους 25 ο C και αναδιασπείρονταν σε φρέσκο μέσο χωρίς ορό (SFM) με συγκέντρωση 1,11*10 6 κύτταρα/ml. Στη συνέχεια τα κύτταρα μαζί με διάφορες συγκεντρώσεις συμπληρώματος και αλόης τοποθετούνταν σε πιάτα 96 πηγαδιών με τελικό όγκο 100μL/πηγάδι. Στη συνέχεια ακολουθούσε επώαση για 24 ώρες σε επωαστήρα κυττάρων. 5.4 οκιμασία πολλαπλασιασμού MTT. [62]

Αρχή μεθόδου Η μέθοδος MTT υπολογίζει την ζωτικότητα ή την κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από φάρμακα η άλλους τοξικούς παράγοντες. Στηρίζεται στην δραστικότητα των δεϋδρογονασών και των αναγωγασών των μιτοχονδρίων. Συγκεκριμένα μετρά τη δραστικότητα των μιτοχοδριακών ρεδουκτασών, οι οποίες λειτουργούν όταν τα κύτταρα είναι ζωντανά. Το κίτρινο MTT μετατρέπεται στην μωβ φορμαζάνη, όταν τα κύτταρα είναι ζωντανά. Χρησιμοποιείται οργανικός διαλύτης (ισοπροπανόλη) ούτως ώστε να διαλυθεί η στερεή μωβ φορμαζάνη και να δημιουργηθεί ένα έγχρωμο διάλυμα. Η απορρόφηση αυτού του διαλύματος μετράτε σε μήκος κύματος 500-600 nm. Αντιδραστήρια - Όργανα RPMI 1640 (Gibco BRL, Paisley, UK) χωρίς την χρωστική κόκκινο της φαινόλης. L-Γλουταμίνη (Sigma): Το διάλυμα συγκέντρωσης 200mM χωρίζεται σε αποστειρωμένους σωλήνες και φυλάσσεται στους 20 ο C. Πενικιλίνη-Στρεπτομυκίνη (Sigma). Το διάλυμα χωρίζεται σε αποστειρωμένους σωλήνες και φυλάσσεται στους 20 ο C. ιάλυμα αιθανόλης 70% (v.v). οχεία καλλιέργειας 75 cm 2 και 25 cm 2. Αποστειρωμένα σιφώνια των 10 και 50 ml. Αποστειρωμένοι πλαστικοί σωλήνες των 15 και 50 ml. Επωαστήρας κυττάρων ατμόσφαιρας CO 2 5% και σταθερής θερμοκρασία 37 ο C. Πλάκες καλλιέργειας κυττάρων 96 πηγαδιών (96 well plates) RPMI 1640 (Gibco BRL, Paisley, UK). Απαγωγός κάθετης νηματικής ροής, Bio Air aura B4. Φυγόκεντρος HERMLE Z320. Οξινισμένη ισοπροπανόλη: Η οξινισμένη προέκυψε από την προσθήκη 23,75 ml ισοπροπανόλη σε 1,25 ml HCl 2N. MTT: διαλύονται 2,5 mg σε 1ml θρεπτικό υλικό χωρίς ορό (SFM). Αναλυτική πορεία Τα κύτταρα, U937, καλλιεργήθηκαν σε μέσο ανάπτυξής RPMI1640. Κάθε 2-3 μέρες γινόταν αλλαγή στο μέσο καλλιέργειας. Όταν τα κύτταρα έφθαναν στο επιθυμητό αριθμό, απομακρύνονταν το μέσο καλλιέργειας και στη συνέχεια γινόταν προσθήκη SFM και ακολουθούσε παραμονή σε αυτό το μέσο για 24 ώρες ώστε να επέλθει συγχρονισμός των κυττάρων. Μετά από 24 ώρες απομακρύνονταν το μέσο και ακολουθούσε προσθήκη φρέσκου μέσου SFM σε 1,11*10 6 κύτταρα/ml. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν τα παρακάτω πειράματα: A) Καμπύλη ανάπτυξης κυττάρων παρουσία ή απουσία ορού Σε πιάτο 96 πηγαδιών με τελικό όγκο τοποθετήκαν 100μL/πηγάδι διαλύματος κυττάρων με SFM σε διάφορες συγκεντρώσεις και 20μL MTT διαλυμένου σε SFM. Ακολουθούσε επώαση για 2 ώρες σε επωαστήρα κυττάρων. Μετά την επώαση γινόταν προσθήκη 100μL οξινισμένης ισοπροπανόλης, αναδιαλύονταν οι κρυστάλλοι που δημιουργούνταν και ακολουθούσε φωτομέτρηση στα 570nm. Το πείραμα επαναλήφθηκε με επώαση των [63]

κυττάρων σε SFM και θρεπτικό υλικό με ορό για 0,24, 48,72 ώρες σε συγκέντρωση 1,11*10 6 κύτταρα/ml. B) Καμπύλη κυτταροτοξικότητας κυττάρων με t-booh Σε πιάτο 96 πηγαδιών με τελικό όγκο τοποθετήκαν 100μL/πηγάδι διαλύματος κυττάρων με SFM (1,11*10 6 κύτταρα/ml) και στη συνέχεια προστέθηκε διάλυμα t-booh σε συγκεντρώσεις 0μΜ, 50μΜ, 100μΜ, 250μΜ, 400μΜ, 650μΜ, 850μΜ, 1000μΜ. Ακολούθησε σε επώαση για 1 ώρα, προσθήκη 20μL MTT διαλυμένου σε SFM, επώαση για 2 ώρες, προσθήκη 100μL οξινισμένης ισοπροπανόλης, αναδιαλύονταν οι κρυστάλλοι που δημιουργούνταν και φωτομέτρηση στα 570nm. C) Καμπύλη κυτταροτοξικότητας κυττάρων με συμπλήρωμα και αλόη Σε πιάτο 96 πηγαδιών τοποθετήκαν 90μL/πηγάδι διαλύματος κυττάρων με SFM (1,11*10 6 κύτταρα/ml και 10mL συμπλήρωμα ή 36% αλόη αραιωμένα (1/100 σε PBS), σε διάφορες συγκεντρώσεις (0, 0.1%, 0.08%, 0.06%, 0.04%, 0.02%) και ακολουθούσε επώαση για 24 ώρες. Ακολούθως γινόταν προσθήκη 20μL MTT διαλυμένου σε SFM, επώαση για 2 ώρες, προσθήκη 100μL οξινισμένης ισοπροπανόλης, αναδιαλύονταν οι κρυστάλλοι που δημιουργούνταν και φωτομέτρηση στα 570nm. D) ΜΤΤ με t-booh και συμπλήρωμα/αλόη Σε πιάτο 96 πηγαδιών τοποθετήκαν 90μL/πηγάδι διαλύματος κυττάρων με SFM (1,11*10 6 κύτταρα/ml και 10mL συμπλήρωμα ή 36% αλόη αραιωμένα (1/100 σε PBS), σε διάφορες συγκεντρώσεις (0, 0.1%, 0.08%, 0.06%, 0.04%, 0.02%) και ακολουθούσε επώαση για 24 ώρες. Στη συνέχεια γινόταν προσθήκη t-booh 500μΜ και επώαση για 1 ώρα. Μετά την επώαση προσθέταμε 20μL MTT διαλυμένου σε SFM και ακολουθούσε επώαση για 2 ώρες σε επωαστήρα κυττάρων. Μετά την επώαση γινόταν προσθήκη 100μL οξινισμένης ισοπροπανόλης, αναδιαλύονταν οι κρυστάλλοι που δημιουργούνταν και ακολουθούσε φωτομέτρηση στα 570nm. 5.5 Αξιολόγηση της ζημιάς στο DNA με αλκαλικό Comet Assay Αρχή μεθόδου Η δοκιμασία Comet αποτελεί μια απλή, ευαίσθητη και γρήγορη μέθοδο για την αξιολόγηση της βλάβης ή της επιδιόρθωσης του DNA, όπως έχει αναφερθεί στο κεφάλαιο 1, η οποία έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως και σε μελέτες για την αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής επίδρασης διαφόρων ενδογενών ή διατροφικών ενώσεων. Η αξιολόγηση της αντιοξειδωτικής επίδρασης μιας ουσίας επιτυγχάνεται με αξιολόγηση της ικανότητάς της να προστατεύει από την επαγόμενη οξειδωτική βλάβη του DNA [29], η οποία προκαλείται από οξειδωτικά όπως υπεροξείδιο του υδρογόνου (H 2 O 2 ) ή το tert-butylhydroperoxide (t-βοοη) τα οποία είναι γνωστό ότι μπορούν να προκαλέσουν βλάβη στο DNA. [1] Η βασική αρχή της μεθόδου είναι εξαιρετικά απλή. Τα κύτταρα ενσωματόνονται σε αγαρόζη χαμηλού σημείου τήξεως. Ακολουθεί λύση των κυττάρων σε διάλυμα λύσης για την απελευθέρωση του DNA από τον πυρήνα και ηλεκτροφόρηση. Η ηλεκτροφόρηση επιτρέπει στα αδιάσπαστα τμήματα του DNA να παραμείνουν στην υπερελιγμένη κατλασταση στην οποία βρίσκονταν, ενώ το κατεστραμμένο DNA απομακρύνεται από την υπερελιγμένη [64]

κατάσταση και κατευθύνεται προς την άνοδο. Τέλος ακολουθεί χρώση του DNA και παρατήρηση σε μικροσκόπιο φθορισμού. Η εικόνα που λαμβάνεται μοιάζει με "κομήτη", με μια κεφαλή η οποία αποτελείται από άθικτο DNA και μια ουρά που περιέχει τα κατεστραμμένα ή σπασμένα κομμάτια του DNA. [96] Τα βασικά βήματα της δοκιμασίας οι οποίες απεικονίζονται και στο σχήμα (7). ΣΧΗΜΑ 7: Βασικά βήματα Comet Assay Comet scoring Κατα καιρούς έχουν χρησιμοποιηθεί διάφοροι τρόποι για την αξιολόγηση των κομητών. Χωρίζονται σε τρεις κύριες μεθόδους: οπτική βαθμολόγηση, ανάλυση εικόνας, ή αυτοματοποιημένα συστήματα ανάλυσης της απεικόνισης του κομήτη. Ωστόσο η πιο εύκολη μέθοδος και αυτή που χρησιμοποιείται συνήθως είναι η ανάλυση εικόνας. Ουσιαστικά, το μικροσκόπιο φθορισμού ενώνεται με μια κάμερα που συνδέεται με έναν υπολογιστή στον οποίο γίνεται επεξεργασία των κομητών με το κατάλληλο λογισμικό. Οι παραμέτροι που λαμβάνονται από τη μέτρηση του φθορισμού του DNA- κομήτη είναι το ποσοστό του DNA στην ουρά (% DNA tail), η ουρά στιγμής (tail moment), το μήκος της ουράς (tail length) και η αναλογία ουράς κεφαλιού (tail to head ratio). Ωστόσο το %DNA tail και tail moment είναι οι παράμετροι που χρησιμοποιούνται περισσότερο. [89] [65]

ΣΧΗΜΑ 8. Η δομή του «κομήτη»όπως λαμβάνεται από το Comet Assay. ΣΧΗΜΑ 9. Κύτταρα με διαφορετική βλάβη στο DNA όπως φαίνονται από παρατήρηση στο μικροσκόπιο με τη μέθοδο Comet Assay. Όσο μεγαλύτερη είναι η ουρά του «κομήτη», τόσο μεγαλύτερη είναι η ζημιά στο DNA. Αντιδραστήρια- ιαλύματα-όργανα RPMI 1640 (Gibco BRL, Paisley, UK). L-Γλουταμίνη (Sigma): Το διάλυμα συγκέντρωσης 200mM χωρίζεται σε αποστειρωμένους σωλήνες και φυλάσσεται στους 20 ο C. Πενικιλίνη-Στρεπτομυκίνη (Sigma). Το διάλυμα χωρίζεται σε αποστειρωμένους σωλήνες και φυλάσσεται στους 20 ο C. ιάλυμα αιθανόλης 70% (v.v). οχεία καλλιέργειας 75 cm 2 και 25 cm 2. Αποστειρωμένα σιφώνια των 10 και 50 ml. Αποστειρωμένοι πλαστικοί σωλήνες των 15 και 50 ml. Αυτόματες πιπέτες. Αποστειρωμένες γυάλινες πιπέτες Pasteur Επωαστήρας κυττάρων ατμόσφαιρας CO 2 5% και σταθερής θερμοκρασία 37 ο C. Απαγωγός κάθετης νηματικής ροής, aura B4. Φυγόκεντρος HERMLE Z320. Πλάκες καλλιέργειας κυττάρων 96 πηγαδιών (96 well plates). Γυάλινες πλάκες και pyrex. Συσκευή ηλεκτροφόρησης. Καλυπτρίδες και αντικειμενοφόρες πλάκες. Χαρτί χρωματογραφίας (Whitman TM 3MM) Μικροσκόπιο φθορισμού (NIKON Eclipse 400) με κάμερα (CCD-4230A video camera) ιάλυμα tert-butyl hydroperoxide 5M (t-booh 5MindecaneSigma-Aldrich) σε DMSO Συμπλήρωμα διατροφής (Mind-Master, LR Health & Beauty Systems) (αραίωση 1/100 σε PBS) Αλόη 36% (αραίωση 1/100 σε PBS) Lysis buffer (200mL, ph 10) με 100 ml NaCl 5M, 40ml EDTA 0,5M, 2 ml Tris 10mM και ρύθμιση ph στο 10 με NaOH 10M. Πριν τη χρήση προστίθενται 1% Triton. [66]

Electrophoresis buffer (3L ) με 90ml NaOH 10N, 6 ml EDTA 1,5 M και απεσταγμένο νερό μέχρι τα 3L. Neutralizing buffer (500 ml, ph 7.5) με 24.23g Tris 0,4M, απεσταγμένο νερό, ρύθμιση ph με HCL. Low melting agaroze 1% σε PBS. Απεσταγμένο νερό. PBS (135mmol/L NaCL, 2.5mmol/L KCL, ph 7.4) Αναλυτική πορεία Καλλιέργεια κυττάρων και επώαση με συμπλήρωμα ή αλόη για 24 ώρες. (βλ. σελ.) Προστίθενται στο plate των κυττάρων 5 μl διαλύματος tert-butyl hydroperoxide (tbooh) για τελική συγκέντρωση μέσα σε κάθε well 250μΜ. Επώαση για 1 ώρα στους 37 C. Για να σταματήσει η αντίδραση, το διάλυμα κυττάρων μεταφέρεται σε eppendorfs και πραγματοποιείται φυγοκέντρηση στις 200g για 5 λεπτά στους 4 C. Τα eppendorf τοποθετούνται προσεκτικά σε πάγο και παραλαμβάνεται το υπερκείμενο και στη συνέχεια προστίθενται 500 μl PBS παγωμένο. Φυγοκέντρηση 200g για 5 λεπτά στους 4 C. Παραλαμβάνεται το υπερκείμενο και προστίθενται 50 μl παγωμένο PBS έτσι ώστε τα κύτταρα να έχουν τελική συγκέντρωση 1* 10 5 κύτταρα/ 50 μl. 10 μl από το διάλυμα PBS-κυττάρων (2*10 4 κύτταρα) προστίθενται σε 130μL διαλύματος αγαρόζης χαμηλού σημείου τήξεως 1% σε PBS σε υδατόλουτρο 37 C. Μετά από ανάδευση 140 μl από το διάλυμα κυττάρων- αγαρόζης και επιστρώνονται σε δύο σημεία (70 μl το καθένα) σε αντικειμενοφόρο πλάκα προεπιστρωμένη με αγαρόζη (1% αγαρόζη σε ddη 2 Ο, ξήρανση για τουλάχιστο μια μέρα) και καλύπτονται αμέσως με καλυπτριδες. Οι αντικειμενοφόρες πλάκες τοποθετούνται σε κρύα γυάλινη πλάκα πάνω σε βρεγμένο χαρτί χρωματογραφίας (Whitman TM 3MM) και αφήνονται στο ψυγείο στους 4 C για 30 λεπτά. Αφαιρούνται προσεκτικά οι καλυπτρίδες από τις αντικειμενοφόρους πλάκες και τοποθετούνται σε κρύο γυάλινο pyrex. Καλύπτονται με το διάλυμα Lysis buffer στο οποίο έχει προστεθεί 1% Triton X- 100 και αφήνονται στο ψυγείο overnight. Αφαιρείται το διάλυμα με μια σύριγγα και οι πλάκες τοποθετούνται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης που βρίσκεται στο ψυγείο, όπου καλύπτονται με το διάλυμα ηλεκτροφόρησης (electrophoresis buffer) για 40 λεπτά στους 4 C. Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση (25V, 250mA) για 30 λεπτά. [67]

Αφαιρείται το διάλυμα ηλεκτροφόρησης και οι αντικειμενοφόρες πλάκες τοποθετούνται σε κρύο καθαρό pyrex όπου καλύπτονται με το διάλυμα neutralizing buffer για 10 λεπτά στο ψυγείο στους 4 C. Ξέπλυμμα με ddη2ο για 10 λεπτά στο ψυγείο στους 4 C. Οι πλάκες αφήνονται να στεγνώσουν σε χαρτί για τουλάχιστο μια μέρα πριν την παρατήρηση στο μικροσκόπιο. Την επόμενη μέρα προστίθενται σε κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα 1mL διαλύματος χρωστικής SYBR Gold (1 μl χρωστικής/10 ml TE buffer) και αφήνονται στο σκοτάδι για 30 λεπτά. Ακολουθεί παρατήρηση σε μικροσκόπιο φθορισμού (NIKON Eclipse 400) με κάμερα (CCD-4230A video camera) με ανάλυση 200x. Από κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα επιλέγονται και φωτογραφίζονται τυχαία 100 κύτταρα με τη βοήθεια του προγράμματος Comet Assay 5.0 (Perceptive Instruments, UK) Image Analysis Software. Για την επεξεργασία των αποτελεσμάτων για τη μέτρηση των παραμέτρων % DNA Tail και Tail Moment χρησιμοποιείται το πρόγραμμα Tritek Comet Score TM Freeware v 1.5 Software και με το OpenComet OpenComet, GNU General Public License version 3.0 (GPLv3). 5.6 Στατιστική ανάλυση Για τη στατιστική ανάλυση των δεδομένων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό SPSS 18.0 για τα Windows. Η κανονικότητα των ποσοτικών μεταβλητών αξιολογήθηκε με το στατιστικό τεστ Kolmogorov Smirnov. Οι ποσοτικές μεταβλητές παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση. Η στατιστική σημαντικότητα ανάμεσα στις διαφορετικές συνθήκες ελένχθηκε με test one way ANOVA. Σε όλες τις αναλύσεις ως επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας ορίστηκε το 5% (0.05). [68]

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 Ο ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 6.1 Κατασκευή της καμπύλης για την μέτρηση των κυττάρων με τη δοκιμασία ΜΤΤ Η κατασκευή της καμπύλης αναφοράς για τον προσδιορισμό του αριθμού κυττάρων των επόμενων πειραμάτων πραγματοποιήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ και τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχεδιάγραμμα 1. 0.5 0.45 y = 0,0338x + 0,0908 R² = 0,9889 0.4 0.35 ΑΠΟΡΡΟΦΗΣΗ 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 2 4 6 8 10 12 ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ (10 6 /ml) Σχεδιάγραμμα 1- Καμπύλη απορρόφησης-συγκέντρωσης κυττάρων 6.2 Aνάπτυξη των κυττάρων σε θρεπτικό υλικό παρουσία ή απουσία ορού Στο Σχεδιάγραμμα 2 και στον Πίνακα 3 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της ανάπτυξης των κυττάρων σε θρεπτικό υλικό παρουσία (ΘΥ) ή απουσία ορού (SFM). Η μέτρηση των κυττάρων έγινε με την χρήση της καμπύλης αναφοράς (Σχεδιαγραμμα 1), με την δοκιμασία ΜΤΤ στις 0, 24, 48 και 72 ώρες. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκε ένα πείραμα με οκταπλές μετρήσεις για σκοπούς επαναλυψιμότητας. [69]

5 ΚΑΜΠΥΛΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ 4.5 4 3.5 ΑΡΙΘΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (10 6 /ml) 3 2.5 2 1.5 1 0.5 SFM AVERAGE ΘΥ AVERAGE 0 0 24 48 72 ΧΡΟΝΟΣ (hours) Σχεδιάγραμμα 2 Καμπύλη αναπτυξης κυττάρων Πίνακας 3 Αποτελέσματα από την επώαση κυττάρων σε ΘΥ και SFM για 0, 24, 48, 72 ώρες ± την τυπική απόκλιση από τις 8 τιμές. ΧΡΟΝΟΣ (ώρες) ΑΡΙΘΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΘΥ (10 6 /ml) ΑΡΙΘΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ SFM (10 6 /ml) 0 1.29±0.08 2.97±0.2 24 2.19±0.08 3.67±0.27 48 2.52±0.2 4.35±0.3 72 2.07±0.11 4.66±0.09 Παρατηρούμε ότι ο αριθμός των κυττάρων που αναπτύσσονται με θρεπτικό υλικό εμπλουτισμένο με ορό αυξάνεται αναλογικά σε σχέση με το χρόνο. Το ίδιο φαίνεται και στην κυτταροκαλλιέργεια που αναπτύσσεται χωρίς ορό μέχρι όμως τις 48 ώρες. Από τις 48 ώρες και μετά τα κύτταρα συγχρονίζονται στο ίδιο στάδιο του κυτταρικού κύκλου και έτσι αναστέλλεται ο πολλαπλασιασμός τους. Έτσι φάνηκε ότι για τα οριστικά πειράματα είναι απαραίτητη η επώαση για 24-48 ώρες για να πετύχουμε τον συγχρονισμό των κυττάρων. Μετά τις 48 ώρες μέχρι και τις 72 ώρες παρατηρούμε μείωση στον αριθμό των κυττάρων. [70]

6.3 Επίδραση του t-booh στα κύτταρα (κυτταροτοξικότητα) Με σκοπό να μελετηθεί η επίδραση του t-booh στην βιωσιμότητα των κυττάρων τα κύτταρα επωάστηκαν 24 ώρες σε SFM στη συνέχεια επωάστηκαν για μια ώρα με το t-booh και μετρήθηκε ο αριθμός των κυττάρων με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Συγκεκριμένα πραγματοποιήθηκαν 2 ανεξάρτητα πειράματα με οκταπλές μετρήσεις με συγκεντρώσεις t-booh 50μΜ, 100μΜ, 250μΜ, 400μΜ, 650μΜ, 850μΜ και 1000μΜ. Και στα δύο πειράματα πραγματοποιήθηκε δοκιμασία ελέγχου (control) στην οποία προστέθηκε ίδια ποσότητα DMSO ( 1%) που ήταν ο διαλύτης του t-booh. Η κανονικότητα των τιμών εξετάστηκε με το στατιστικό test Kolmogorov- Smirnov και τα μεγέθη ήταν κανονικά (>0,05). Στον Πίνακα 5 και στο Σχεδιάγραμμα 3 φαίνονται τα αποτελέσματα από τον μέσο όρο όλων των τιμών των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. Όλες οι συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν είχαν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους (p<0.000). Πίνακας 5 Αποτελέσματα της επίδρασης του t-booh στον αριθμό των κυττάρων. Η τυπική απόκλιση αφορά όλες τις τιμές και των δύο πειραμάτων (N=16). ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ t-booh MEAN±STDEV (αριθμος κυττάρων 10 6 /ml) p value (σε σχέση με το control) 0μΜ(CONTROL) 1.6±0.16 p=1 50μΜ 1.48±0.14 p=0.342 100μΜ 1.43±0.15 p=0.000 250μΜ 1.15±0.29 p=0.000 400μΜ 0.88±0.23 p=0.000 650μΜ 0.65±0.07 p=0.000 850μΜ 0.58±0.2 p=0.000 1000μΜ 0.57±0.19 p=0.000 [71]

ΑΡΙΘΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (10 6 /ml) 2.00 1.80 1.60 1.40 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 * * * * * 0 50 100 250 400 650 850 1000 ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ t BOOH (μμ) Σχεδιάγραμμα 3 - Ο μέσος όρος του αριθμού κυττάρων των δύο πειραμάτων ως προς την συγκέντρωση t-booh. (*, p<0,000). Όσον αφορά τον αριθμό κυττάρων παρατηρούμε ότι το t-booh σε συγκεντρώση πάνω από το 250μΜ προκαλεί στατιστικά σημαντική μείωση (p= 0.000) των κυττάρων σε σχέση με το δείγμα ελέγχου (0μΜ). Σύμφωνα με τον μέσο όρο, στη συνέχεια υπολογίστηκε η επι τοις εκατό βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχεδιάγραμμα 4). Η επι τoις εκατό βιωσιμότητα υπολογίστηκε έναντι του ποσοστού βιωσιμότητας του δείγματος αναφοράς(control=100% Βιωσιμότητα), ως εξής: %βιωσιμότητα= (αριθμός κυττάρων συγκεκριμένης συγκέντρωσης t-booh/αριθμός κυττάρων στην καλλιέργεια ελέγχου) *100 Παρόμοια με τον αριθμό κυττάρων, η βιωσιμότητα μεταξύ των διάφορων συγκεντρώσεων βρέθηκε στατιστικά σημαντική (p<0.000). Η %βιωσιμότητα των συγκεντρώσεων 250μΜ, 400μΜ, 650μΜ, 850μΜ και 1000μΜ είχε στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το δείγμα ελέγχου 0μΜ. [72]

120 100 * % ΒΙΩΣΙΜΟΤΗΤΑ 80 60 40 * * * * 20 0 0 50 100 250 400 650 850 1000 ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ t BOOH (μμ) Σχεδιάγραμμα 4 - %Βιωσιμότητα κυττάρων σε σχέση με τη συγκέντρωση t-booh (*, p<0,000). Τα πάραπανω διαγράμματα δείχνουν ότι η τοξικότητα του t-booh στα κύτταρα είναι δοσοεξαρτώμενη. Συγκεκριμένα το ποσοστό βιωσιμότητας των κυττάρων U937 μετά από μία ώρα επώασης με t-booh ήταν αντιστρόφως ανάλογο της συγκέντρωσης του, με στατιστικά σημαντική μείωση της βιωσιμότητας σε συγκέντρωση πάνω από 250μΜ. Παρατηρούμε ότι σε σχέση με το δείγμα αναφοράς η χαμηλότερη συγκέντρωση 50μΜ προκαλεί κυτταροτοξικότητα (100-%βιωσιμότητα) της τάξης του 7,3%. Οι συγκεντρώσεις 50μΜ-100μΜ φαίνεται ότι προκαλούν πιο χαμηλή κυτταροτοξικότητα η οποία μένει περίπου σταθερή ενώ από το 250μΜ-650μΜ η κυτταροτοξικότητα αυξάνεται απότομα και φτάνει από το 28% μέχρι το 59%. Επίσης παρατηρούμε ότι στις συγκεντρώσεις 650μΜ-1000μΜ η κυτταροτοξικότητα παραμένει περίπου στα ίδια επίπεδα. Για τον έλεγχο της αντιοξειδωτικής ικανότητας του συμπληρώματος θέλαμε η συγκέντρωση του οξειδωτικού μέσου να προκαλεί κυτταροτοξικότητα της τάξης του 50% περίπου έτσι επιλέξαμε τα 400μΜ t-booh. 6.4 Επίδραση του συμπληρώματος διατροφής στα κύτταρα Η επίδραση του συμπληρώματος διατροφής στην καλλιέργεια κυττάρων εξετάστηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ. Επειδή η αλόη αποτελεί το κύριο συστατικό του συμπληρώματος (36% v.v), εξετάσαμε και την επίδραση που έχει από μόνη της στα κύτταρα. Επίσης, δοκιμάσαμε το εικονικό συμπλήρωμα (placebo), το οποίο περιείχε 3% αλόη και χρησιμοποιήθηκε στην κλινική μελέτη που κάναμε. οκιμάστηκαν διάφορες συγκεντρώσεις συμπληρώματος, αλόης και εικονικού σε διάφορες συγκεντρώσεις (με και χωρίς αραίωση των αρχικών διαλυμάτων) στην κυτταροτοξικότητα των κυττάρων U937. Πραγματοποιήθηκε δοκιμασία ελέγχου (control) απουσία κάποιας ουσίας σε όλα τα πειράματα. Επιπλέον, επειδή στα αρχικά [73]

πειράματα φάνηκε ότι το συμπλήρωμα στις πιο πυκνές συγκεντρώσεις είχε κάποια απορρόφηση λόγω του χρώματός του, μετρήθηκαν δείγματα χωρίς κύτταρα (μόνο με συμπλήρωμα) και αφαιρέθηκε η απορρόφηση που είχε. Η διαδικασία αυτή έγινε μόνο για τις πυκνές συγκεντρώσεις (10%, 8%) αφού στις πιο αραιές δεν είχε κάποια επίδραση στην απορρόφηση. Για σκοπούς επαναληψιμότητας πραγματοποιήθηκαν πολλαπλές μετρήσεις (Ν). Τα αποτελέσματα από όλες τις τιμές όπως εξετάστηκαν με το στατιστικό test Kolmogorov- Smirnov ακολουθούσαν την κανονική κατανομή (p>0.05). Στον Πίνακα 6 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από το μέσο όρο και της τυπικής απόκλισης όλων των τιμών για κάθε συγκέντρωση που δοκιμάστηκε. Πίνακας 6 Μέσος όρος ± την τυπική απόκλιση του αριθμού των κυττάρων όπως μετρήθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ για τις διάφορες συγκεντρώσεις του συμπληρώματος διατροφής (ΜΜ), την αλόης (ALOE) και του placebo (PL). ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ N (μετρήσεις) Αριθμος κυττάρων (10 6 /ml)± STDEV CONTROL 18 1.39±0.24 MM 10% 6 1.25±0.06 MM 8% 6 1.15±0.19 MM 0.1% 6 1.38±0.08 ΜΜ 0.08% 6 1.57±0.06 ΜΜ 0.06% 6 1.65±0.02 ΜΜ 0.04% 6 1.56±0.08 ΜΜ 0.02% 6 1.44±0.02 ΜΜ 0.01% 6 1.46±0.08 MM 0.008% 6 1.35±0.09 ALOE 0.1% 8 1.64±0.04 ALOE 0.08% 8 1.31±0.13 ALOE 0.06% 8 1.36±0.08 ALOE 0.04% 8 1.22±0.13 ALOE 0.02% 8 1.39±0.09 PL 10% 6 1.15±0.11 PL 8% 6 1.17±0.06 PL 6% 6 1.06±0.2 PL 4% 6 1.26±0.11 [74]

PL 2% 6 1.2±0.06 Στη συνέχεια υπολογίσαμε την %βιωσιμότητα σε σχέση με το δείγμα αναφοράς, ξεχωριστά για κάθε διάλυμα (ΜΜ, ALOE, PL). Τα αποτελέσματα της επι τοις εκατό βιωσιμότητας εικονίζονται στα Σχεδιαγράμματα 5,6,7. 140 120 * %ΒΙΩΣΙΜΟΤΗΤΑ 100 80 60 40 20 0 CONTROL PL 10 PL 8 PL 6 PL 4 PL 2 ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ PLACEBO (%V/V) Σχεδιάγραμμα 5 - %Βιωσιμότητα κυττάρων που επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις εικονικού σκευάσματος (*, p<0,000). * Σχεδιάγραμμα 6 - %Βιωσιμότητα κυττάρων που επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις συμπληρώματος διατροφής Master Mind (*, p<0,003) [75]

* * * Σχεδιάγραμμα 7 - %Βιωσιμότητα κυττάρων που επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις αλόης (*, p<0,000). Από τα παραπάνω διαγράμματα παρατηρούμε ότι υπάρχει στατιστικά σημαντική αύξηση στην επί τοις εκατό βιωσιμότητα των κυττάρων που επωάστηκαν με 10% Master Mind (p=0.003). Στατιστικά σημαντική αύξηση της βιωσιμότητας των κυττάρων φάνηκε επίσης και στα κύτταρα που επωάστηκαν με εικονικό σκεύασμα 4% (p=0.000). Αντίθετα, στατιστικά σημαντική μείωση της βιωσιμότητας βρέθηκε να προκαλούν οι συγκεντρώσεις 0.08%, 0.06% και 0.04% αλόης (p=0.000). Ωστόσο, απαιτείται μεγαλύτερος αριθμός πειραμάτων για να επαληθευτούν τα αποτελέσματα. Για τις υπόλοιπες συγκεντρώσεις συμπληρώματος, αλόης και εικονικού, παρατηρούμε ότι δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά στη βιωσιμότητα των κυττάρων, η οποία φαίνεται να παραμένει περίπου σταθερή, γεγονός που δείχνει ότι καμία συγκέντρωση δεν επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Για τα οριστικά πειράματα επιλέχθηκαν οι συγκεντρώσεις Master Mind και αλόης 0.08%, 0.06%, 0.04%, 0.2%. 6.5 Επίδραση του συμπληρώματος διατροφής και της αλόης στην κυτταροτοξικότητα που προκαλείται από t-booh Η επίδραση του συμπληρώματος/αλόης στην οξειδωτική δράση του t-booh εξετάστηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Συγκεκριμένα τα κύτταρα επωάστηκαν με το συμπλήρωμα/αλόη για 24 ώρες και στη συνέχεια με t-booh 400μΜ για μία ώρα. Πραγματοποιήσαμε 3 ανεξάρτητα πειράματα με οκταπλάσιες μετρήσεις το καθένα, στα οποία χρησιμοποιήθηκαν οι συγκεντρώσεις Master Mind και αλόης 0.08%, 0.06%, 0.04%, 0.2% (V/V). Παράλληλα πραγματοποιήθηκε δείγμα αναφοράς (Control) με μόνο τα κύτταρα και κύτταρα στα οποία προστέθηκε μόνο t-booh. Στο πείραμα 1 λόγω μη επαρκούς αριθμού κυττάρων απουσιάζουν οι συγκεντρώσεις 0.04% ΜΜ, 0.06% και 0.04% Αλόη. Από την απορρόφηση των κυττάρων στα 570nm και με βάση την καμπύλη αναφοράς υπολογίστηκε ο αριθμός των [76]

κυττάρων σε κάθε δείγμα. Τα αποτελέσματα από όλες τις τιμές όπως εξετάστηκαν με το στατιστικό test Kolmogorov-Smirnov ακολουθούσαν την κανονική κατανομή (p>0.05). Στη συνέχεια υπολογίσαμε τον μέσο όρο και την τυπική απόκλιση όλων των τιμών από τα τρία περάματα, τα αποτελέσματα των οποίων παρουσιάζονται στον Πίνακα 7. Πίνακας 7 Μέσος όρος του αριθμού κυττάρων από τα τρια πειράματα ± την τυπική απόκλιση. ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ N (μετρήσεις) ΑΡΙΘΜΟΣ ΚΥΤΤΑΡΩΝ (10 6 /ml) Control 24 1.43±0.22 Control + t-booh 400μΜ 24 1.15±0.19 MM t-booh 0.1% 24 1.39±0.29 MM t-booh 0.08% 24 1.19±0.13 MM t-booh 0.06% 24 1.39±0.19 MM t-booh 0.04% 16 1.23±0.14 MM t-booh 0.02% 24 1.29±0.16 Aloe t-booh 0.1% 24 1.52±0.27 Aloe t-booh 0.08% 24 1.52±0.4 Aloe t-booh 0.06% 16 1.66±0.28 Aloe t-booh 0.04% 16 1.59±0.21 Aloe t-booh 0.02% 24 1.43±0.17 Στη συνέχεια υπολογίστηκε η %βιωσιμότητα των κυττάρων σε σχέση με το δείγμα ελέγχου (control=100% βιωσιμότητα) και υπολογίστηκε το p value των διαφόρων συγκεντρώσεων σε σχέση και πάλι με το δείγμα ελέγχου. Τα αποτελέσματα εικονίζονται στο Σχεδιάγραμμα 8. [77]

* * * * ** * ** * * * * * * Σχεδιάγραμμα 8 Η επι τοις εκατό βιωσιμότητα των κυττάρων στις διάφορες συγκεντρώσεις αλόης/συμπληρώματος μετά από χορήγηση t-booh 400μΜ για 1 ώρα με τη δοκιμασία ΜΤΤ. (*, p σε σχέση με το t-booh,**,p σε σχέση με το control) Από το Σχεδιάγραμμα 8 παρατηρούμε ότι υπάρχει στατιστικά σημαντική μείωση περίπου κατά 20% της επί τοις εκατό βιωσιμότητας των κυττάρων που επωάστηκαν με 400μΜ t- BOOH (p=0.001). Παρόμοια αποτελέσματα έδειξαν οι συγκεντρώσεις Master Mind 0.08% και 0.04%, γεγονός που δείχνει ότι οι συγκεντρώσεις αυτές δεν έχουν κάποια αναστολή της οξειδωτικής δράσης του t-booh στα κύτταρα. Οι υπόλοιπες συγκεντρώσεις δεν είχαν στατιστικά σημαντική διαφορά με το δείγμα ελέγχου, άρα φαίνεται αναστέλλουν τη δράση του t-booh και επαναφέρουν τα κύτταρα στον αριθμό του δείγματος ελέγχου. Όταν οι διάφορες συγκεντρώσεις συμπληρώματος και αλόης συγκρίθηκαν με το δείγμα που είχε μόνο 400 μμ t-booη, επιβεβαιώθηκε ότι οι συγκεντρώσεις 0.1%, 0.06%, 0.02% Master Mind και 0.1%, 0.08%, 0.06%, 0.04%, 0.02% Αλόης, έχουν στατιστικά σημαντική διαφορά με το 400μΜ t-booh. Επομένως οι συγκεντρώσεις αυτές αναστέλλουν τη δράση του t-booh και έχουν προστατευτική δράση για τα κύτταρα. Στον Πίνακα 8 αναγράφονται τα p value της επί τοις εκατό βιωσιμότητας για κάθε συγκέντρωση συμπληρώματος και αλόης. [78]

Πίνακας 8 Οι τιμές επί τοις εκατό βιωσιμότητας ± την τυπική απόκλιση και τα p value για τις διάφορες συγκεντρώσεις συμπληρώματος και αλόης (όπου *=στατιστική σημαντικότητα) p value p value ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ %Βιωσιμότητα ± STDEV (σύγκριση σε σχέση με το control) (σύγκριση σε σχέση με το t- BOOH) Control 100±0.0 0.001* Control + t-booh 250μΜ 80.77±9.57 0.001 MM t-booh 0.1% 98.28±19.65 1.0 0.007* MM t-booh 0.08% 83.99±11.58 0.026 1.000 MM t-booh 0.06% 99.6±22.07 1.0 0.002* MM t-booh 0.04% 80.99±8.85 0.011 1.000 MM t-booh 0.02% 91.98±17.83 1.0 0.822 Aloe t-booh 0.1% 106.64±12.37 1.0 0.000* Aloe t-booh 0.08% 106.22±20.26 1.0 0.000* Aloe t-booh 0.06% 108.38±11.24 1.0 0.000* Aloe t-booh 0.04% 104.96±15.17 1.0 0.000* Aloe t-booh 0.02% 102.04±18.56 1.0 0.000* Τα παραπάνω αποτελέσματα για την αλόη δε συμβαδίζουν με το προηγούμενο πείραμα που έδειξε ότι η αλόη είχε κυτταροτοξική δράση στα κύτταρα. Περισσότερα πειράματα απαιτούνται για να επιβεβαιωθεί εάν η αλόη είναι όντως κυτταροτοξική ή αν υπήρξε κάποιο πειραματικό σφάλμα. 6.6 Επίδραση t-booh στην οξείδωση του DNA Η ικανότητα του t-booh για οξειδωτική βλάβη στο DNA μελετήθηκε με τη δοκιμασία Comet. Συγκεκριμένα τα κύτταρα επωάστηκαν χωρίς ορό για 24 ώρες, προστέθηκαν οι διαφορετικές συγκεντρώσεις t-booh (50μΜ, 100μΜ, 250μΜ και 400μΜ) και ακολούθησε επώαση για 1 ώρα. Η δοκιμασία Comet πραγματοποιήθηκε σε αλκαλικές συνθήκες (ph>12) ηλεκτροφόρησης των κυττάρων. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με δείγμα αναφοράς (control) παρουσία DMSO (<1%) που ήταν ο διαλύτης του t-booh. Πραγματοποιήθηκαν 2 ανεξάρτητα πειράματα με διπλές συνθήκες το καθένα. Για κάθε συνθήκη πραγματοποιήθηκε διπλή ηλεκτροφόρηση (2 πλακίδια) και μετρήθηκαν 50 κύτταρα από το κάθε πλακίδιο (100 κύτταρα ανά συνθήκη). Άρα συνολικά μετρήθηκαν 200 κύτταρα σε κάθε πείραμα. Τα αποτελέσματα αναφέρονται στην παράμετρο %DNA in tail, η οποία δείχνει το ποσοστό των θραυσμάτων του γενετικού υλικού στον πυρήνα του κυττάρου που έχουν μεταναστεύσει στην ουρά του κομήτη, δηλαδή εκφράζει τη βλάβη στο γενετικό υλικό που προκαλεί η χορηγούμενη ένωση. Στον Πίνακα 9 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από τη μέση τιμή των [79]

δύο πειραμάτων της παραμέτρου %DNA IN TAIL για κάθε συγκέντρωση. Η τυπική απόκλιση μεταξύ των τιμών κάθε συγκέντρωσης βρέθηκε πολύ μεγάλη γι αυτό τα αποτελέσματα παρουσιάζονται με το standard error. Όλες οι συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν είχαν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους (p=0.000). Στο Σχεδιάγραμμα 10 φαίνεται ο μέσος όρος του επί τοις εκατό DNA IN TAIL των δύο πειραμάτων για κάθε συγκέντρωση. Πίνακας 9 Αποτελέσματα από τη μέσο όρο της παραμέτρου %DNA IN TAIL από όλες τις τιμές κάθε συγκέντρωσης t-booh των δύο πειραμάτων ± std error. Όπου *=στατιστική σημαντικότητα. ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ t-booh N (κύτταρα που μετρηθήκαν) ΜΕΣΟΣ ΟΡΟΣ (%DNA IN TAIL ± STD ERROR) p value (σύγκριση σε σχέση με το control) CONTROL 400 7.25±0.54 50Μμ 400 10.01±0.63 0.268 100μΜ 400 19.3±1.09 0.000* 250μΜ 400 24.7±1.27 0.000* 400μΜ 400 34.49±1.34 0.000* 40.00 35.00 * %DNA IN TAIL 30.00 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 * * 0.00 CONTROL 50μΜ 100μΜ 250μΜ 400μΜ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ t BOOH Σχεδιάγραμμα 10 Αποτελέσματα της μελέτης των βλαβών που προκαλεί το t-booh στο DNA των κυττάρων U937. Μέσος όρος %DNA IN TAIL ± std error. Όπου *,p =0.000 Από τα αποτελέσματα παρατηρούμε ότι υπάρχει στατιστικά σημαντική αύξηση της οξειδωτικής βλάβης του γενετικού υλικού των κυττάρων σε σχέση με το δείγμα αναφοράς [80]

στις συγκεντρώσεις t-booh 100μM, 250μΜ και 400μΜ (p=0.000). Συγκεκριμένα το Comet Assay έδειξε ότι το δείγμα αναφοράς (control) είχε πολύ μικρή εμφάνιση θραυσμάτων DNA, η οποία συνεπάγεται ελάχιστη βλάβη στο γενετικό υλικό. Τα 50μΜ t-booh έδειξαν να υπάρχει κάποια αύξηση στη βλάβη στο DNA οποία όμως δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Αντίθετα, η παρουσία t-booh σε συγκέντρωση από 100μΜ μέχρι 400μΜ έδειξε ότι προκαλεί στατιστικά σημαντική αύξηση της βλάβης στο γενετικό υλικό και με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. ηλαδή παρατηρούμε ότι όσο αυξάνεται η συγκέντρωση αυξάνεται και η βλάβη στο DNA με ποσοστά %DNA IN TAIL της τάξης του 20%, 25 και 35% αντίστοιχα. Για τα οριστικά πειράματα επιλέχθηκε η συγκέντρωση 250μΜ t-booh επειδή η συγκέντρωση αυτή δεν συνδέεται με κυτταρικό θάνατο και τα ποσοστά βλάβης στο γενετικό υλικό είναι αρκετά για να επιτρέψουν την παρατήρηση της πιθανής προστατευτικής δράσης των συστατικών του συμπληρώματος. ΣΧΗΜΑ 10. Αντιπροσωπευτική φωτογραφία της βλάβης του DNA από 250μΜ t-booh. 6.7 Επίδραση του συμπληρώματος διατροφής και της αλόης στα επίπεδα βλαβών του γενετικού υλικού (DNA) με χρήση του Comet Assay Για τη διερεύνηση της προστατευτικής δράσης του συμπληρώματος και του εκχυλίσματος αλόης στα επίπεδα βλάβης του γενετικού υλικού που επάγονται από οξειδωτικό παράγοντα (250μΜ t-booh) εξετάστηκαν οι συγκεντρώσεις 0.08% και 0.02% (v/v), με τη μέθοδο Comet. Τα κύτταρα U937 μετά από 24ωρη επώαση σε θρεπτικό υλικό χωρίς ορό, επωάστηκαν για 24 ώρες με το συμπλήρωμα ή με αλόη, προστέθηκε 250μΜ t-booh και επωάστηκαν για μια ώρα. Η δοκιμασία Comet πραγματοποιήθηκε σε αλκαλικές συνθήκες (ph>12) ηλεκτροφόρησης των κυττάρων. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με δείγμα αναφοράς (control) παρουσία DMSO (<1%) που ήταν ο διαλύτης του t-booh και με δείγμα το οποίο περιείχε 250μΜ t-booh. Πραγματοποιήθηκαν 4 ανεξάρτητα πειράματα με διπλές συνθήκες το καθένα. Για κάθε συνθήκη πραγματοποιήθηκε διπλή ηλεκτροφόρηση (2 πλακίδια) και μετρήθηκαν 50 κύτταρα από το κάθε πλακίδιο (100 κύτταρα ανά συνθήκη). Συνολικά μετρήθηκαν 200 κύτταρα σε κάθε πείραμα. Τα αποτελέσματα αναφέρονται στην παράμετρο %DNA in tail. Στον Πίνακα 10 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από τη μέση τιμή των δύο πειραμάτων της παραμέτρου %DNA IN TAIL για κάθε συγκέντρωση. Η τυπική απόκλιση μεταξύ των [81]

τιμών κάθε συγκέντρωσης βρέθηκε πολύ μεγάλη γι αυτό τα αποτελέσματα παρουσιάζονται με το standard error. Όλες οι συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν είχαν στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ τους (p=0.000). Στο Σχεδιάγραμμα 11 εικονίζονται τα αποτελέσματα από τον μέσο όρο του επί τοις εκατό DNA IN TAIL των τεσσάρων πειραμάτων για κάθε συγκέντρωση. Πίνακας 10 Μέσος όρος όλων του %DNA IN TAIL των τιμών κάθε συγκέντρωσης από τα 4 πειράματα ± std error. Όπου *=στατιστική σημαντικότητα ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΕΙΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ/ΑΛΟΗΣ N (κύτταρα που μετρήθηκαν) %DNA IN TAIL ± std error p value (σε σχέση με το control) CONTROL 800 13.77±0.7 t-booh 800 21.27±0.81 0.000* MM t-booh 0.8% 800 20.76±0.76 0.000* MM t-booh 0.02% 800 21.92±0.85 0.000* ALOE t-booh 0.08% 800 20.97±0.85 0.000* ALOE t-booh 0.02% 800 21.18±0.83 0.000* * * * * * Σχεδιάγραμμα 10 Αποτελέσματα της μελέτης των βλαβών που προκαλεί το t-booh στο DNA των κυττάρων U937. Μέσος όρος %DNA IN TAIL ± std error. Όπου *,p =0.000 [82]