«Διερεύνηση ποικιλότητας αλλοιωγόνων μικροοργανισμών σε φιλέτα και ολόκληρη τσιπούρα υπό ψύξη με ανάλυση γονιδίου 16S rrna» Φ. Παρλαπάνη, Κ. Κορμάς, Ι. Μποζιάρης Τμ. Γεωπονίας Iχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος, Σχολή Γεωπονικών Επιστημών, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, Φυτόκο, 38446, Νέα Ιωνία, Βόλος Αθήνα 2012
Ξεκινώντας τη διερεύνηση... Ποια είναι η αρχική μικροβιακή ποικιλότητα των νωπών ιχθύων; Μεταβάλλεται κατά τη συντήρηση συνθήκες της αποθήκευσης (θερμοκρασία, ατμόσφαιρα), μικροβιακές αλληλεπιδράσεις ποιοι μ/οί επικρατούν στο τέλος της συντήρησης;
Πειραματική προσέγγιση Απομόνωση και καθαρισμός των μικροοργανισμών Χαρακτηρισμός των απομονωμένων βακτηρίων με τη χρήση κλασσικών δοκιμών (φαινοτυπικέςβιοχημικές δοκιμές όπως το ΑΡΙ system)...κλασσικά
Μικροβιακή ποικιλότητα ολόκληρης τσιπούρας Αρχική microbiota Microbiota αλλοίωσης στους 0οC Shewanella putrefaciens Shewanella putrefaciens 35,1 10,4 26,0 28,6 Flavobacterium sp. Acinetobacter sp. 75,0 25,0
Μικροβιακή ποικιλότητα φιλέτων τσιπούρας Αρχική microbiota Microbiota αλλοίωσης, Αέρας 0οC 10,53 Shewanella putrefaciens 19,05 Micrococcus sp. 89,47 38,10 42,86 Microbiota αλλοίωσης, MAP 0oC 18,75 25,00 56,25 mendocina Aeromonas salmonicida
Microbiota αλλοίωσης, Αέρας 5οC Microbiota αλλοίωσης, MAP 5οC 21,62 putida 5,56 Lactobaccilus sp. 40,54 Shewanella putrefaciens 37,84 94,44
Είναι όντως αυτά τα βακτήρια;.από το κλασσικό στο μοντέρνο... Καθαρή καλλιέργεια Ενίσχυση γονιδίου 16S rrna με 27fBAC και 907rBAC Καθαρισμός DNA με KIT MONTAGE PCR Αλληλούχιση Βάση δεδομένων (GEN BANK)
Μικροβιακή ποικιλότητα ολόκληρης τσιπούρας αλλά...μοριακά Αρχική microbiota 26,32 28,95 10,53 34,21 Macrococcus caseolyticus (GU197537) (99%) fragi(ab685683) (99%) Chryseobacterium shigense (FR872752) (99%) lurida (NR042199)/gessa rdii (KC171996) (99%) Μicrobiota αλλοίωσης 15,00 25,00 15,00 15,00 30,00 Psychrobacter cryohalolentis(eu 090718)(99%) Psychrobacter immobilis (HQ698589) (99%) veronii (JN167951)(99%) trivialis(hq82491 3) (99%) Shewanella morhuae (NR_041299)(99% )
...και στα φιλέτα... 19,05 Αρχική microbiota Macrococcus caseolyticus (GU197537) (99%) Μicrobiota αλλοίωσης, Αέρας 0οC 10,53 89,47 fragi(ab685 607) (99%) Shewanella morhuae (NR_041299) (99%) 38,10 42,86 (GU198122) (97%) Psychrobacter cryohalolentis(e U090718)(99%) Microbiota αλλοίωσης MAP 0 ο C 43,75 56,25 veronii (JN167951)(99 %) trivialis(hq82 4913) (99%)
Microbiota αλλοίωσης, Αέρας 5οC 21,62 78,38 fragi(ab685607) (99%) (JN642252)(99%) 4,35 13,04 Microbiota αλλοίωσης, ΜΑΡ 5oC Lactobacillus fuchuensis (JF756333) (99%) 21,74 17,39 43,48 Carnobacterium maltaromaticum (GQ304940) (100%) Vagococcus sp. MES18 (JX026029)(99 %) Shewanella putrefaciens(ab 681550) (99%) trivialis(hq824 913) (99%)
Μεσόγειος & Ελληνικά Αλιεύματα...μέχρι στιγμής Κυρίαρχοι στο χρόνο αλλοίωσης Αέρας 0 & 5oC ΜΑΡ 0οC & 5oC Lactic Acid Bacteria Brochothrix
και τώρα... Κλασσική Ολόκληρη τσιπούρα sp. Φιλέτο σε Αέρα 0oC 5oC sp. Φιλέτο σε ΜΑΡ 0oC 5oC Lactobacillus sp. Μοριακή Ολόκληρη τσιπούρα spp Psychrobacter immobilis /cryohalolentis Aeromonas (απευθείας εκχύλιση) Φιλέτο σε Αέρα 0oC fragi 5oC spp Φιλέτο σε ΜΑΡ 0oC veronii /trivialis 5oC Lactobacillus fuchuensis Carnobacterium maltaromaticum Vagococcus sp.
Επομένως... Οι μοριακές τεχνικές φαίνεται να συμπληρώνουν την πληροφόρηση που δίνουν οι κλασσικές, με αποτέλεσμα η εικόνα που λαμβάνεται πλέον (με κλασσικές & μοριακές τεχνικές) να είναι ικανοποιητικότερη της προηγούμενης (με κλασσικές τεχνικές μόνο) Με την απευθείας εκχύλιση DNA από τη σάρκα του ιχθύος είναι πιθανόν να ανευρεθούν μικροοργανισμοί οι οποίοι να αποτελούν μέρος της αλλοιωγόνου μικροβιακής σύνθεσης αλλά για κάποιο λόγο (π.χ. εκλεκτικότητα/επιλεκτικότητα θρεπτικών υλικών) πολλές φορές να διαφεύγουν των τεχνικών που χρησιμοποιεί η κλασσική μικροβιολογία Η ταυτοποίηση βακτηρίων με μοριακές τεχνικές πιο αληθής
...Ευχαριστίες «H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου».
Ευχαριστώ για την προσοχή σας