Βιοαισθητήρες χρώµατος: ιεπιστηµονική µελέτη ανθικού µηνύµατος

Βιοαισθητήρες χρώµατος: ιεπιστηµονική µελέτη ανθικού µηνύµατος Σ. Ριζοπούλου, Επίκουρος Καθηγήτρια Ε.Κ.Π.Α., Τµήµα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.. Άγγλος, Ερευνητής Β, Ι.Τ.Ε., Ινστιτούτο Ηλεκτρονικής οµής και Laser Ι.Τ.Ε. Α. Αργυρόπουλος, Υποψήφιος ιδάκτωρ Βιολόγος Ε.Κ.Π.Α., Τµήµα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.. Γκίκας, Φοιτητής Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α., Τµήµα Βιολογίας Ε.Κ.Π.Α. Σ. Οικονόµου, Φοιτητής Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α., Τµήµα Βιολογίας Ε.Κ.Π.Α. Ε. Αντύπα, Υποψήφια ιδάκτωρ Βιολόγος Ε.Κ.Π.Α., Τµήµα Βιολογίας Ε.Κ.Π.Α. Α. Γαλούκα, Υποψήφια ιδάκτωρ Βιολόγος Ε.Κ.Π.Α., Τµήµα Βιολογίας Ε.Κ.Π.Α. Κ. Λέτσιος, Υποψήφιος ιδάκτωρ Χηµικός Ε.Κ.Π.Α., Τµήµα Χηµείας Ε.Κ.Π.Α. Φ. Κολίσης, Καθηγητής Ε.Μ.Π., Σχολή Χηµικών Μηχανικών Ε.Μ.Π. Κ. Φωτάκης, Καθηγητής, ιευθυντής Ινστιτούτου Ηλεκτρονικής οµής και Laser, Ι.Τ.Ε. Κ. Μεθενίτης, Επίκουρος Καθηγητής Ε.Κ.Π.Α., Τµήµα Χηµείας Ε.Κ.Π.Α. Σ. Κοΐνης, Επίκουρος Καθηγητής Ε.Κ.Π.Α., Τµήµα Χηµείας Ε.Κ.Π.Α. Σ. Μελετίου-Χρήστου, Λέκτορας Ε.Κ.Π.Α., Τµήµα Βιολογίας Ε.Κ.Π.Α. Περίληψη Μελετήθηκαν χρωστικές από άνθη αυτοφυών µεσογειακών φυτών. Χρώµα ως αίσθηση, ιδιότητα χρωστική και φυσική ουσία υπάρχει στους φυτικούς οργανισµούς, αλλά και ως ανέγγιχτη έννοια σε κείµενα της κλασσικής περιόδου στην Ελλάδα (σε θραύσµατα και σε κείµενα της αρχαιότητας). Το χρώµα αναγνωρίζεται µε τη συµβολή της επιστηµονικής έρευνας και αξιοποιείται. Σύµφωνα µε δεδοµένα από την βιβλιογραφία, δεν έχει γίνει ανάλογη µελέτη για την βιοποικιλότητα του χρώµατος στην χλωρίδα της Ελλάδας. Αντίθετα, διεθνώς εκδηλώνεται µεγάλο ενδιαφέρον για χρωστικές ουσίες και δηµοσιεύονται καινοτόµα ερευνητικά αποτελέσµατα που αναφέρονται σε άνθη των φυτών, ειδικά από περιοχές όπου υπάρχουν πληθυσµοί µικροί και απειλούµενοι. Εκχυλίσµατα ανθέων προτείνονται για εναλλακτική θεραπευτική αγωγή και προβάλλονται ως υγιεινή διατροφή, επειδή οι ιστοί τους περιέχουν πολυακόρεστα λιπαρά και αντιοξειδωτικές ουσίες. Επίσης, η άνθιση µελετάται ως παράµετρος κλιµατικής αλλαγής. Στην εργασία αυτή προσδιορίζονται χρωστικές ανθέων, µε αναφορά θέµατα βιοποικιλότητας και µηχανισµούς προσαρµογής των φυτών στο περιβάλλον, από διεπιστηµονική άποψη. Εισαγωγή Πεδίο έρευνας της εργασίας αποτελεί το χρώµα που φαίνεται στα άνθη των φυτών, τα οποία αποτελούν αναπόσπαστα στοιχεία έκφρασης των συναισθηµάτων των ανθρώπων στην καθηµερινή ζωή και στοιχεία πολιτισµού (Rhizopoulou 2004, Ierodiakonou 2005, Rhizopoulou 2005). Το θέµα άπτεται καινοτόµου µεθοδολογίας, επιστηµονικής έρευνας, παιδείας και ιστορίας της επιστήµης, συνάδοντας µε τον τίτλο «Παιδεία, έρευνα, τεχνολογία από το χθες στο αύριο». Έχει βρεθεί ότι το έγχρωµο των λουλουδιών είναι αποτέλεσµα συνδυασµού πολλών παραγόντων (Buchanan et al. 2000). To χρώµα στα άνθη σχετίζεται µε: α) χρωστικές, β) ph του χυµού που βρίσκεται στα χυµοτόπια των κυττάρων (Martinoie et al. 2007), γ) σύµπλοκα, πολυσθενή µεταλλικά ιόντα, δ) άλλες συγχρωστικές, ε) τη δοµή των ιστών και επιδερµικών κυττάρων (Εικόνες 1 και 2), στ) γονίδια (Mol et al. 1998) και ζ) την υδατική κατάσταση των ιστών (Rhizopoulou et al. 2006). Συνυφασµένη µε το χρώµα είναι η παρουσία επικονιαστών, οι οποίοι προσελκύονται, προστατεύονται και τρέφονται από τις παροχές του άνθους (κυρίως από το νέκταρ), ενώ παράλληλα συµβάλουν στη γονιµοποίηση των φυτών (Jones & Reithel 2001, Dyer et al. 2006, Hansen et al. 2007). 1

Εικόνα 1. Επιδερµικά κύτταρα σε πέταλα άνθους του φυτού Erodium. Foto1. Cells of the epidermis of flower petals from Erodium species. Εικόνα 2. Εγκάρσια τοµή πετάλων µε µεγάλους µεσοκυττάριους χώρους. Foto 2. Cross-section of a flower petal possesses large intercellular space. Ο χρωµατισµός των ανθέων οφείλεται κυρίως σε δύο τύπους χρωστικών, στα πλαστοχρωµικά καροτινοειδή και στα χυµοχρωµικά φλαβονοειδή (Καλαϊτζάκης 1995, Taiz & Zeiger 1998). Η πιο διαδεδοµένη οµάδα από τα φλαβονοειδή, οι ανθοκυανίνες (µε ιώδη, µενεξεδιά, ροζ, µοβ χρώµατα) επηρεάζονται από την υδατική κατάσταση των ιστών. Πέταλα ορισµένων ανθέων αλληλεπιδρούν µε την περιοχή της υπεριώδους ακτινοβολίας, η οποία ούσα αόρατη για τον άνθρωπο, δίνει ένα χρωµατικό µήνυµα σε οργανισµούς που διαθέτουν κατάλληλους αντιληπτικούς µηχανισµούς. Σηµειώνεται ότι το ανθρώπινο µάτι µπορεί να διακρίνει περί τα 200 χρώµατα. Ωστόσο, υπάρχει κάτι που δεν το βλέπουµε [Φύσις κρύπτεσθαι φιλεί, Ηράκλειτος, Περί φύσεως]. Η διερεύνηση και η τροποποίηση των φυσικών χρωστικών επιτρέπει ενδελεχή µελέτη των µηχανισµών και σε συσχέτιση µε την δοµή των ιστών µπορεί να προωθήσει την αξιοποίηση στο εξαιρετικά ενδιαφέρον πεδίο των βιοαισθητήρων. Με ευέλικτη οργανολογία και νέα µεθοδολογία για τον προσδιορισµό χρωστικών σε άθικτα πέταλα φυτών µε φασµατοσκοπικές τεχνικές διαφαίνεται η δυνατότητα ανάλυσης χρωστικών in situ, η οποία προωθεί εφαρµογές στο πεδίο, όπου µπορεί να προσεγγισθεί το «έγχρωµο» της χλωρίδας, 2

χωρίς να δρέψουµε άνθη. Με τον τρόπο αυτό, είναι δυνατόν να µελετηθούν χρωστικές ανθέων σε µικρούς πληθυσµούς απειλούµενων ή υπό εξαφάνιση ειδών, συνεισφέροντας έτσι σε θέµατα εξέλιξης και βιοποικιλότητας, αλλά και νέων φυσικών προϊόντων (Clegg & Durbin 2000). Παράλληλα, διερευνάται η ιστορία της µεθοδολογίας που ακολουθήθηκε για τον προσδιορισµό χρωµάτων στη φύση (Letsios et al. 2007), µέχρι σήµερα (από το χθες στο αύριο) και δίνεται έµφαση στο ρόλο της αρχαίας γνώσης που προϋπάρχει σε κείµενα (Benson 2000). Ταυτόχρονα, αναδεικνύεται η εικόνα του άνθους, µέσα από νέες και µη-αναγνώσιµες (ακόµη) εικόνες από τον φυσικό κόσµο, οι οποίες, µακροπρόθεσµα µπορεί να χρησιµοποιηθούν από εποπτικά µέσα εκπαίδευσης και διδασκαλίας (παιδεία), σε καινοτόµα σχεδιαστικά πρότυπα (έρευνα), στη διαφήµιση και την τέχνη. Μεθοδολογία Μελέτη του χρωµατισµού του άνθους, µε σύγχρονες τεχνικές ανάλυσης και επεξεργασίας εικόνων. Σύστηµα Ανάλυσης και Επεξεργασίας Έγχρωµης Ψηφιακής Εικόνας (Η/Υ µε λογισµικό Image pro-plus, κάρτα ψηφιοποίησης frame grabber, CCD colour camera υψηλής ανάλυσης, µικροσκόπιο Ζeiss και στερεοσκόπιο Nikon, έγχρωµη οθόνη υψηλής ανάλυσης, οθόνη παρατήρησης και έγχρωµος εκτυπωτής) συµβάλλει στη διατύπωση ανθικών προτύπων και τη δηµιουργία αρχείου. Επειδή το άνοιγµα της στεφάνης του άνθους βασίζεται σε µεγάλο βαθµό στη σπαργή των ιστών, ιδιαίτερη προσοχή δίνεται σε µετρήσεις του υδατικού περιεχοµένου των ιστών (µε Dew point psychrometer). Προσδιορίζονται ολικά λίπη, λιπαρά οξέα και κηροί. Για τον διαχωρισµό λιπαρών οξέων και τον ποσοτικό και ποιοτικό προσδιορισµό χρησιµοποιείται αέριος χρωµατογράφος (Hewlett Packard µοντέλο 5890, series II), µε ανιχνευτή ιονισµού φλόγας. Η επεξεργασία και η καταγραφή των αποτελεσµάτων γίνεται µε ηλεκτρονικό υπολογιστή που επικοινωνεί αµφίδροµα µε τον αέριο χρωµατογράφο µέσω του λογισµικού προγράµµατος HP ChemStations. Για την φασµατοσκοπία χρησιµοποιείται φασµατοφωτόµετρο UV-ορατού (Cary 3E), συνδεδεµένο µε Η/Υ, κυκλοφορητή ύδατος και θερµοστατούµενο πολλαπλό υποδοχέα κυψελίδων. Ταυτόχρονα µε την άνθιση των φυτικών ειδών γίνεται συγκριτική παρουσίαση µε φωτογραφίες στην ορατή και υπεριώδη περιοχή του φάσµατος. Η µεθοδολογία και οργανολογία για τον φασµατοσκοπικό χαρακτηρισµό χρωστικών σε πέταλα φυτών επεκτείνεται σε εφαρµογές πεδίου, µε µέτρηση φασµάτων απορρόφησης και φθορισµού σε άθικτα πέταλα µε οπτικές ίνες: Το κύριο χαρακτηριστικό της εν λόγω προσέγγισης µε µετρήσεις σε άθικτα πέταλα, από άνθη επάνω στο φυτό, προσφέρει τη δυνατότητα ανάλυσης in situ. Επιπλέον καθώς οι µετρήσεις δεν επεµβαίνουν στη δοµή του δείγµατος, καταστρέφοντας το ζωντανό υλικό, επιτρέπουν και τη χωροχρονική µελέτη χαρακτηριστικών, τα οποία ενδεχοµένως αντανακλούν µεταβολές της κατάστασης της ύλης και της συµπεριφοράς της όσον αφορά µεταβολές σε συνθήκες του περιβάλλοντος (φως, υγρασία, θερµοκρασία) και άλλους εξωτερικούς παράγοντες (καταπόνηση). Η µεθοδολογία αυτή συµπληρώνει τις εργαστηριακές φασµατοφωτοµετρικές αναλύσεις. Καταγράφεται το φάσµα απορρόφησης στο υπεριώδες και ορατό τµήµα του ηλεκτροµαγνητικού φάσµατος και παρέχεται η δυνατότητα χαρακτηρισµού των χρωστικών που απαντούν στα πέταλα φυτών. Εξετάζεται η δυνατότητα τεχνικών απεικονιστικής φασµατοσκοπίας που επιτρέπει την καταγραφή σε δύο διαστάσεις των χαρακτηριστικών απορρόφησης ή φθορισµού σε επιλεγµένες περιοχές µήκους κύµατος. Με τον τρόπο αυτό είναι δυνατή η απεικόνιση συγκεκριµένων χρωστικών, σε µήκος κύµατος µέγιστης απορρόφησης. Με φασµατοσκοπία απορρόφησης και ανάκλασης (Εικόνα 3), οι εργαστηριακές δοκιµές και µετρήσεις απορρόφησης διεξάγονται σε διαυγή διαλύµατα χρωστικών και βασίζονται σε µέτρηση της διερχόµενης από το διάλυµα ακτινοβολίας. Σε αντίθεση οι ακέραιοι φυτικοί ιστοί και εν προκειµένω τα πέταλα καθώς εµφανίζουν υψηλό δείκτη σκέδασης δεν επιτρέπουν µετρήσεις 3

Εικόνα 3. Φάσµατα ανάκλασης από έγχρωµους ιστούς. Foto 3: Spectra of reflection from various colorful tissues. διέλευσης. Σε αυτή την περίπτωση επιβάλλεται η λήψη µετρήσεων διάχυτης ανάκλασης από τις οποίες προκύπτουν τα φάσµατα απορρόφησης. Για την υλοποίηση των στόχων αναπτύχθηκε φορητό φασµατοφωτόµετρο οπτικών ινών. Αναφέρονται τα βασικά στοιχεία του (Εικόνα 4): πηγή λευκού φωτός (συνεχούς ή παλµικής λειτουργίας). Ανιχνευτική µονάδα (µικρού µεγέθους φασµατογράφος και ανιχνευτής CCD). Οπτικές ίνες α) µεταφοράς ακτινοβολίας στην επιφάνεια του δείγµατος και β) µεταφοράς της διάχυτης ανάκλασης από την µετρούµενη επιφάνεια στην ανιχνευτική διάταξη. Σύστηµα προσαρµογής των οπτικών ινών µε δυνατότητα µεταβολής στη γωνία πρόσπτωσης και /ή ανάκλασης σε σχέση µε την επιφάνεια του υπό µελέτη δείγµατος. Ηλεκτρονικό υπολογιστή (έλεγχος της λειτουργίας του συστήµατος, καταγραφή και ανάλυση δεδοµένων). Αξιολόγηση συστήµατος Εργαστηριακές µετρήσεις και µετρήσεις πεδίου Εικόνα 4. Φασµατοφωτοµετρία µε οπτικές ίνες. Foto 4. Laser spectrometry. 4

Σχήµα 1. Γραφική παρουσίαση άνθους (από την ερευνητική µας οµάδα). Figure 1. Presentation of a flower model (created by our research work). Από τα αποτελέσµατά µας διαφαίνεται ότι η άποψη «χρώµα = χρωστική» για ένα έγχρωµο άνθος (Σχήµα 1) πρέπει να ξαναµελετηθεί επισταµένως, εφόσον µια πολύ σηµαντική συνιστώσα της χρωµατικής έκφρασης παραλείπεται. Ο δυϊσµός του φωτός υπαγορεύει συνεργασία των χρωστικών (φωτόνιο) µε την επιφάνεια (κύµα). Από τo µικροανάγλυφο της επιφάνειας πετάλων (Rhizopoulou et al., submitted) προκύπτει κανονικότητα (στην επιφάνεια), η οποία θα µπορούσε να θεωρηθεί ως ένας φυσικός, φυτικός κρύσταλλος. Συχνότητες φωτονίων που «χάνονται» µέσα σε ένα φωτονικό κρύσταλλο µπορούν να ενισχύουν ένα χρωµατικό αποτέλεσµα (απόχρωση, χροιά) ή να δηµιουργούν ένα νέο. Ευχαριστίες: Η παρούσα εργασία διενεργείται στα πλαίσια έργου που συγχρηµατοδοτείται από το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταµείο και Εθνικούς Πόρους (ΕΠΕΑΕΚ ΙΙ) ΠΥΘΑΓΟΡΑΣ II (Κ.Α. 70/3/8036). Βιβλιογραφία Benson, J.L., Greek color theory and the four elements. A Cosmological Interpretation Massachusetts, 2000. Buchanan, B.B., Gruissem, W., Jones, R.J., Plant Molecular Biology Maryland, 2000. Clegg, Μ.T., Durbin, M.L., Flower color variation: a model for the experimental study of evolution. Proceedings National Academy Science, 97: 7016 7023, 2000. Dyer, A.G., Whitney, H.M., Arnold, S.E.J., Glover, B.J., Chittka, L., Bees associate warmth with floral colour. Nature, 442: 525, 2006. Hansen, DM, Olesen, J.M., Mione, T, Johnson, SD, Müller, CB., Coloured nectar: distribution, ecology and evolution of an enigmatic floral trait. Biological Reviews 82: 83 111, 2007. Jones, K.N., Reithel, J.S., Pollinator-mediated selection on a flower color polymorphism in experimental populations of Antirrhinum (Scrophulariaceae). American Journal of Botany, 88: 447 454, 2001. Ierodiakonou, K., Plato s Theory of colours in the Timaeus Rhizai. A Journal for Ancient Philosophy and Science, 2: 219 233, 2005. Καλαϊτζάκης, Ι., «Υδατάνθρακες και δευτερογενή φυτικά προϊόντα» Αθήνα, 1995. Letsios, C., Methenitis, C., Rhizopoulou, S., Anglos, D., Spectroscopic studies of anthocyanins from the red petals of Nerium oleander L., Proceedings 5th International Conference on Instrumental Methods of Analysis. Modern Trends and Applications,. 2007 Martinoia, E., Maeshima, M., Neuhaus, E.H., Vacuolar transporters and their essential role in plant metabolism. Journal of Experimental Botany, 58: 83 102, 2007. 5

Mol, J., Grotewold, E., Koes, R., How genes paint flowers and seeds, Trends of Plant Science, 3: 212 217, 1998. Rhizopoulou, S., Symbolic plant(s) of the Olympic Games. Journal of Experimental Botany, 55: 1601 1606, Oxford, 2004. Rhizopoulou, S., Plants as estimates of civilization, XVII International Botanical Congress, Vienna, 2005. Rhizopoulou, S., Ioannidi, E., Alexandredes, N., Argiropoulos, A., A study on functional and structural traits of the nocturnal flowers of Capparis spinosa L. Journal of Arid Environments, 66: 635 647, 2006. Ριζοπούλου, Σ., Flora Graeca. Νεύσις, τ.16, Αθήνα, 2007. Taiz, L., Zeiger, E., Plant Physiology, Massachusetts, 1998. Biosensors of Colour: An Interdisciplinary Approach to Flower Signal S. Rhizopoulou, Assistant Professor, Faculty of Biology, N.K.U.A. D. Anglos, Researcher B, Institute of Electronic Structure and Laser, F.R.T. Α. Argiropoulos, PhD Candidate, Faculty of Biology, N.K.U.A. D. Gikas, Undergraduate student, Faculty of Biology, N.K.U.A. S. Oikonomou, Undergraduate student, Faculty of Biology, N.K.U.A. Ε. Antipa, PhD Candidate, Faculty of Biology, N.K.U.A. A. Galouka, PhD Candidate, Faculty of Biology, N.K.U.A. Κ. Letsios, PhD Candidate, Faculty of Chemistry, N.K.U.A. F. Kolisis, Professor, School of Chemical Engineering, N.T.U.A. Κ. Fotakis, Professor, Head, Institute of Electronic Structure and Laser, F.R.T. Κ. Methenitis, Assistant Professor, Faculty of Chemistry, N.K.U.A. S. Κoinis, Assistant Professor, Faculty of Chemistry, N.K.U.A. S. Μeletiou - Christou, Lecturer, Faculty of Biology, N.K.U.A. Abstract The distribution of flower pigments in Mediterranean plants has been examined via an interdisciplinary research work that is related to the general goals of this symposium. Flower tissues have been used to extract and investigate pigments, while coloured petal surface in terms of light, hue, nuance and tone may be related to the original philosophical ideas about colour and light. To the best of our knowledge, colour biodiversity of the Greek flora has not been examined yet. In contrast, numerous results have been published by research teams in China, Japan, Israel, U.S.A., Germany, Netherlands; it seems likely that there has been an increasing interest for flower pigments. In fact, ingredients from floral tissues found in remedies and rescue therapies are used as antioxidants and useful diet constituents (with unsaturated fatty acids), nowadays. In addition, blossoming is considered to be an indicator for changing climatic conditions. The results of the present study indicate that floral tissues do exhibit a concentration of pigments and a surface topography. The aim of the present study is to explore the biodiversity of floral colours from native, Mediterranean plants. Acknowledgements: The project is co-funded by the European Social Fund and National Resources (EPEAEK II) PYTHAGORAS II (Κ.Α. 70/3/8036). 6