Η Υποκατάσταση των ιχθυελαιων με φυτικά ελαια επηρεαζει τη συσταση λιπαρων οξεων, την εκφραση των PPAR και τη φυσιολογια του ηπατος της τσιπούρας (Sparus aurata) Αντωνοπούλου Ε. 1, Καϊτετζίδου Ε. 1, Μπαστάκης Ε. 1, Μπαχαρίδης Π. 1, Φουντουλάκη Ε. 2 1 Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων, Τμήμα Βιολογίας, Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, eantono@bio.auth.gr 2 Ινστιτούτο Υδατοκαλλιεργειών, Ελληνικό Κέντρο Θαλάσσιων Ερευνών Περίληψη Η συνεχής αύξηση της παραγωγής των ιχθυοκαλλιεργειών σε συνδυασμό με την ταυτόχρονη μείωση των ιχθυελαίων από θαλάσσια αλιευμένα ψάρια υπαγορεύουν την ανάγκη υποκατάστασης των ιχθυελαίων με έλαια φυτικής προέλευσης χωρίς να επηρεάζεται η υγεία και η ποιότητα του τελικού προϊόντος. Στην παρούσα εργασία ερευνάται η μερική υποκατάσταση των ιχθυελαίων με σογιέλαιο, φοινικέλαιο και έλαιο ελαιοκράμβης στην τσιπούρα. Η σίτιση διήρκησε 5 ½ μήνες. Η υποκατάσταση με φυτικά έλαια δεν επηρέασε τη συγκέντρωση του ήπατος σε λίπος. Εντούτοις, επηρεάστηκε η σύσταση του ήπατος σε λιπαρά οξέα. Συγκεκριμένα, τα ψάρια που σιτίζονταν με φυτικά έλαια είχαν μειωμένες συγκεντρώσεις στα 20:5(n-3) και 22:6(n-3) λιπαρά οξέα στο ήπαρ, σε σχέση με τα ψάρια που σιτίζονταν με ιχθυέλαια. Η μερική υποκατάσταση των ιχθυελαίων με φυτικά έλαια φαίνεται να επηρεάζει την έκφραση των PPAR σε μεταγραφικό επίπεδο, με τον PPAR α να μειώνεται σημαντικά στα ψάρια που σιτίστηκαν με φυτικά έλαια. Επίσης διερευνάται η αποτελεσματικότητα των φυτικών ελαίων στη δραστικότητα ενζύμων σημαντικών στο μεταβολισμό, καθώς και η ενεργοποίηση των MAPK και της HSP70. Λέξεις κλειδιά: σιτηρέσιο, MAPK, HSP, CS, HOAD, LDH. SubstitutIon of fish oil with plant oils in the diet of the gilthead sea bream (Sparus aurata) affects hepatic fatty acid composition, PPAR expression and liver physiology Antonopoulou E 1., E. Kaitetzidou 1, E.G. Bastakis 1, P.K. Baharidis 1, E. Fountoulaki 2 1 Department of Zoology, School of Biology, Aristotle University of Thessaloniki, Greece, eantono@bio.auth.gr 2 Institute of Aquaculture, Hellenic Center for Marine Research Abstract The continued growth in aquaculture production together with the limited supplies of marine fish oils dictates that substitutes must be found that do not compromise fish health as well as product quality. In this study, the partial suitability of soy-, palm- and rapeseed oil (SO, PO and RO, respectively) as a replacement for fish oil (FO) in diets of gilthead sea bream was investigated. The duration of the experiment lasted 5 ½ months. Dietary plant oils had no major effect on liver lipid content. However, the fatty acid composition was affected, with the concentration of eicosapentaenoic acid [20:5(n-3)] was reduced significantly in sea bream liver of dietary plant oils compared to the FO liver. Similarly, the concentration of docosahexaenoic acid [22:6(n-3)] was significantly reduced in fish fed plant oils. The partial substitution of fish oil with plant oil appears to affect the PPAR expression on the transcription level, with PPAR alpha expression being significantly reduced in fish fed plant oils. In addition, the effectiveness of plant oil diet on the activity of enzymes with main role in cellular metabolism is also discussed, as well as the activation of MAPK and heat shock protein in the liver of treated fish. Keywords: diet, MAPK, HSP, CS, HOAD, LDH. 1. Εισαγωγή Tο υψηλό κόστος των ιχθυοτροφών και η ταυτόχρονη μείωση των ιχθυοαποθεμάτων καθιστούν επιτακτική την ανάγκη αντικατάστασης των ιχθυελαίων από έλαια φυτικής προέλευσης στα σιτηρέσια των ιχθύων, χωρίς όμως να επηρεάζεται η υγεία και η ποιότητα του τελικού προϊόντος. Η παρούσα εργασία αφορά στη μελέτη της φυσιολογίας και στις διαδικασίες του μεταβολισμού του ήπατος -1167-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ της τσιπούρας (Sparus aurata) έπειτα από μερική υποκατάσταση των ιχθυελαίων με τα ακόλουθα φυτικά έλαια: σογιέλαιο, φοινικέλαιο και έλαιο ελαιοκράμβης. Συγκεκριμένα, διερευνάται η σύσταση των λιπαρών οξέων στο ήπαρ καθώς και η έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων PPAR. Οι PPAR (υποδοχείς που ενεργοποιούνται από πολλαπλασιαστές υπεροξειδιοσωμάτων) ανήκουν στην οικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων και αποτελούν ρυθμιστές της ενεργειακής ομοιόστασης του οργανισμού. Πρόσφατα, κλωνοποιήθηκαν οι τρεις ισότυποι α, β και γ των PPAR στην τσιπούρα, Sparus aurata, με διαφορετική ιστοειδική έκφραση και με διακριτούς ρόλους (Leaver et al., 2005). Επίσης, διερευνάται η αποτελεσματικότητα των φυτικών ελαίων στη δραστικότητα σημαντικών ενζύμων στο μεταβολισμό. Τα ένζυμα αυτά είναι η κιτρική συνθετάση (CS) που συμμετέχει στον κύκλο του Krebs, η αφυδρογονάση του γαλακτικού οξέος (L-LDH) που συμμετέχει στην γλυκόλυση και η αφυδρογονάση του β-υδροξυάκυλο-coa (HOAD) που συμμετέχει στη β-οξείδωση των λιπαρών οξέων. Επίσης, για να διαπιστωθεί εάν η σίτιση με φυτικά έλαια αποτελεί στρεσογόνο ερέθισμα για το ήπαρ της τσιπούρας, εξετάστηκε η πιθανή εμπλοκή μελών της οικογένειας των μιτογόνων πρωτεϊνικών κινασών (MAPKs) εξαρτώμενες από βιοτικό και αβιοτικό στρες, οι οποίες εμπλέκονται σε πολλά κυτταρικά γεγονότα όπως είναι η αύξηση, η διαφοροποίηση αλλά και η απόπτωση, καθώς και των πρωτεϊνών θερμικού στρες HSP70 και 90. Οι τελευταίες, φαίνεται να επηρεάζονται και από διατροφικούς παράγοντες όπως τα λιπαρά οξέα (Samples, Pool & Lumb,1999), αλλά και από σίτιση με σογιάλευρο (Martin et al., 2003). 2. Υλικά και Μέθοδοι Χρησιμοποιήθηκαν τσιπούρες (Sparus aurata) αρχικού μέσου βάρους 100g, και μελετήθηκε η επίδραση της μερικής υποκατάστασης του ιχθυελαίου (FO) σε ποσοστό 70% στις τροφές, από τα ακόλουθα έλαια φυτικής προέλευσης: σογιέλαιο (SO), φοινικέλαιο (PO) και λάδι ελαιοκράμβης (RO). Η σίτιση διήρκησε 5 ½ μήνες και εκτελέστηκε στις εγκαταστάσεις του Ινστιτούτου Υδατοκαλλιεργειών στο ΕΛ.Κ.Θ.Ε. στον Αγ. Κοσμά. Η εκτροφή έγινε ανάλογα με το μέγεθος των ψαριών και τη θερμοκρασία. Τα ψάρια έμειναν νηστικά για δύο 24-ώρα πριν τη δειγματοληψία. Σε άμεσα παγωμένα δείγματα ήπατος έγιναν αναλύσεις της σύστασης σε λιπαρά οξέα με χρήση αέριας χρωματογραφίας. Η έκφραση των PPARs στο ήπαρ πέντε ατόμων ανά πειραματική δίαιτα μελετήθηκε με Real Time PCR, χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για την τσιπούρα. Ως εσωτερικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το 18S. Επίσης, προσδιορίστηκε η δραστικότητα (μmoles/min.g.wet.wt) και η ειδική δραστικότητα (μmoles/min.mg protein) των ενζύμων L-LDH, HOAD και CS σε δείγματα ήπατος πέντε ατόμων ανά δίαιτα. Η μέτρηση των δραστικοτήτων έγινε σύμφωνα με τους Passonneau & Lowry (1993), φασματοφωτομετρικά στα 340nm για τα πρώτα δύο ένζυμα και στα 412nm για τη CS. Για τον προσδιορισμό της ολικής πρωτεΐνης στα δείγματα χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Bradford, Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA). Η έκφραση των πρωτεϊνών στο ήπαρ αφού διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα SDS-πολυακρυλαμίδης και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της υπό εξέτασης πρωτεΐνης, χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα με ανοσοστύπωση κατά Western. Ακολούθησε πυκνομέτρηση των ζωνών με κατάλληλο λογισμικό. 3. Αποτελέσματα Η μελέτη της σύστασης του ήπατος σε λιπαρά οξέα έδειξε διαφορές ανάμεσα στα τέσσερα σιτηρέσια (Πίν. 1). Συγκεκριμένα, τα ψάρια που σιτίζονταν με τα φυτικά έλαια SO, PO και RO είχαν σημαντικά χαμηλές συγκεντρώσεις στα n-3 λιπαρά οξέα στο ήπαρ, σε σχέση με τα ψάρια που σιτίζονταν με ιχθυέλαια και συγκεκριμένα στα 20:5(n-3) και 22:6(n-3). -1168-
Πίνακας 1: Σύσταση λιπαρών οξέων του ήπατος της τσιπούρας που σιτίστηκε με ιχθυέλαια (FO), σογιέλαιο (SO), φοινικέλαιο (PO) ή με έλαιο ελαιοκράμβης (RO). Initial Population FO SO PO RO 14:00 3.91 4.17 1.76 2.01 1.56 15:00 0.33 0.94 0.55 0.91 0.72 16:00 15.19 17.75 14.41 20.74 12.58 16:1n-9 0.34 0.29 0.33 0.56 0.50 16:1n-7 5.55 5.52 2.46 3.01 2.17 16:2n-4 0.59 0.19 0.15 0.16 17:00 0.21 0.43 0.29 0.18 0.28 16:3n-3 0.67 0.19 0.15 0.19 17:1n-9 0.27 0.23 0.15 0.23 16:4n-3 0.11 0.65 0.17 0.11 0.14 18:00 2.9 6.14 5.54 5.53 4.85 18:1n-9 15.79 14.63±0.55 a 18.97±1.31 b 32.69±1.75 c 35.08±1.82 c 18:1n-7 2.59 3.13 2.19 1.91 2.63 18:2n-9 0.27 0.34 0.23 0.30 0.44 18:2n-6 11.62 8.50±0.79 a 31.32±0.81 d 14.60±1.67 b 17.80±0.59 c 18:3n-6 0.19 0.56 0.71 0.55 0.74 18:3n-3 1.81 0.94 3.32 0.78 4.12 18:4n-3 1.21 1.05 0.42 0.32 0.52 20:00 0.16 0.18 20:1n-9 2.55 1.21 0.81 1.00 1.36 20:1n-7 0.17 0.21 0.65 0.42 0.37 20:2n-9 0.63 0.33 0.77 0.61 0.40 20:2n-6 0.35 0.96 0.43 0.73 21:00 0.50 20:3n-6 0.15 0.42 0.72 20:4n-6 0.79 1.20±0.14 b 0.53±0.04 a 0.56±0.11 a 0.46±0.05 a 20:3n-3 0.24 0.28 0.31 20:4n-3 1.05 0.85 0.48 0.34 0.48 20:5n-3 5.33 8.96±0.31 b 2.93±0.01 a 2.82±0.33 a 2.62±0.20 a 22:1n-11 2.62 1.02 0.29 0.50 0.40 22:1n-9 0.74 0.27 0.23 0.30 22:3n-6 0.09 0.67 0.20 0.18 22:4n-6 0.24 0.36 0.13 22:5n-6 0.22 0.23 0.36 22:5n-3 3.17 6.16 2.89 2.15 2.08 22:6n-3 18.83 12.86±1.09 b 6.30±0.78 a 6.23±0.83 a 5.58±1.64 a 24:1n-9 0.81 0.59 0.46 0.48 0.63 Saturates 23.01 29.49±3.09 b 22.50±0.2 a 29.33±1.72 b 20.50±1.14 a Monounsaturates 30.98 26.81±0.49 a 26.21±0.55 a 41.14±0.97 b 43.39±1.61 b n-9 21.02 17.22±1.00 a 21.12±1.65 a 35.85±1.5 b 38.25±1.83 b n-6 13.13 11.24±0.91 a 34.02±0.87 d 16.22±1.57 b 19.85±0.29 c n-3 31.7 31.47±1.97 b 16.76±0.93 a 12.71±1.70 a 15.78±2.10 a n-3 HUFA 28.62 28.84±1.76 b 12.73±0.75 a 11.53±1.43 a 10.97±2.13 a n-3/n-6 2.42 2.81±0.16 c 0.49±0.03 a 0.78±0.08 b 0.66±0.07 ab -1169-
9 th Symposium on Oceanography & Fisheries, 2009 - Proceedings, Volume ΙΙ Οι PPAR α και β μειώθηκαν σημαντικά στα ψάρια που σιτίστηκαν με φυτικά έλαια, ανεξαρτήτως προέλευσης (Εικ. 1). Αντίθετα, ο PPAR γ παρουσίασε διαφορετικό πρότυπο μεταβολής (Εικ. 1). Συγκεκριμένα, η σίτιση με PO μείωσε σημαντικά τα επίπεδα της έκφρασής του σε σχέση με τη σίτιση με FO. Σημαντική αύξηση της έκφρασης των PPAR α και γ παρουσίασαν τα ψάρια που σιτίζονταν με RO σιτηρέσια σε σχέση με τα ψάρια που σιτίζονταν με PO. Εικ. 1: Έκφραση των PPAR α, β και γ μετά από 70% υποκατάσταση των ιχθυελαίων (FO) με έλαια φυτικής προέλευσης (SO, PO & RO). Η υποκατάσταση των ιχθυελαίων με φυτικά έλαια δεν επηρέασε τη δραστικότητα της L-LDH στο ήπαρ (Εικ. 2). Αντίθετα η σίτιση με RO επάγει τη δραστικότητα της HOAD. Ομοίως, η σίτιση τόσο με RO όσο και με SO επάγει τη δραστικότητα στο ένζυμο CS (Εικ. 2). Εικ. 2: Ειδική ενζυμική δραστικότητα της L-LDH, HOAD και CS στο ήπαρ της τσιπούρας μετά από υποκατάσταση των ιχθυελαίων (FO) με έλαια φυτικής προέλευσης (SO, PO & RO). -1170-
Η έκφραση της HSP70 δε φαίνεται να επηρεάζεται από τη σίτιση στο ήπαρ της τσιπούρας. Το ίδιο ισχύει και για την Pp38MAPK. 4. Συμπεράσματα Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας έδειξαν ότι η μερική υποκατάσταση των ιχθυελαίων με φυτικά έλαια επηρεάζει τη φυσιολογία του ήπατος. Συγκεκριμένα, το πρότυπο των λιπαρών οξέων, η έκφραση των PPAR, η δραστικότητα κάποιων μεταβολικών ενζύμων φαίνεται να διαφοροποιείται. Μάλιστα, ο PPAR α, ο οποίος εμπλέκεται στον καταβολισμό των λιπαρών οξέων και πιθανότατα λειτουργεί ως γενικός ρυθμιστής του ενεργειακού μεταβολισμού στο ήπαρ, μειώθηκε σημαντικά στα ψάρια που σιτίστηκαν με φυτικά έλαια, σε σχέση με εκείνα που σιτίστηκαν με FO. Η μείωση της έκφρασης του PPAR α μπορεί να συσχετιστεί με τη μείωση στα ω-3 λιπαρά οξέα 20:5(n-3) και 22:6(n-3) που βρέθηκε στα δείγματα ήπατος των ψαριών που σιτίζονταν με φυτικά έλαια, μιας και τα συγκεκριμένα λιπαρά οξέα φαίνεται να αποτελούν συνδέτες για τον PPAR α στα θηλαστικά. Σημαντική μείωση παρατηρείται και για τον PPAR β. Αντίθετα, η έκφραση του PPAR γ, που ελέγχει τη διαφοροποίηση του λιπώδους ιστού και επάγει τη δημιουργία λιπώδη κυττάρων επηρεάστηκε από το είδος του φυτικού ελαίου στην τροφή. Έτσι, η σίτιση με RO οδήγησε σε αύξηση του PPAR γ, σε αντίθεση με τη σίτιση με PO που μείωσε τα επίπεδα της έκφρασης του PPAR γ σε σχέση με τη σίτιση με FO. Επιπλέον, η σίτιση με SO δεν επηρέασε στατιστικά την έκφραση του PPAR γ. Συνεπώς, η έκφραση των PPAR ρυθμίζεται από διατροφικούς παράγοντες, υποδεικνύοντας τη σημασία των PPAR στη μεταβολική λειτουργία στα ψάρια. Επίσης, η υποκατάσταση με φυτικά έλαια δε φαίνεται να αποτελεί ιδιαίτερο στρεσογόνο ερέθισμα για το ήπαρ της τσιπούρας, μιας και δε φαίνεται να προάγει την έκφραση στρεσογόνων δεικτών. 5. Βιβλιογραφικές Αναφορές Leaver, M.J., Boukouvala, E., Antonopoulou, E., Diez, A., Favre-Krey, L., Tariq Ezaz, M., Bautista, J.M., Tocher, D.R. & Krey, G., 2005. Three peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) isotypes from each of two species of marine fish. Endocrinology 146 (7), 3150-3162. Martin, S.A.M.,Vilhelmsson, O., Me dale, F.,Watt, P., Kaushik, S. & Houlihan D.F., 2003. Proteomic sensitivity to dietary manipulations in rainbow trout. Biochemica et Biophysica Acta1651,17-29. Passonneau, J. V. & Lowry, O. H., 1993. Enzymatic analysis: a practical guide. The Humana Press Inc. pp. 120-128, 206-212. Samples B.L., Pool, G.L. & Lumb, R.H., 1999. Polyunsaturated fatty acids enhance the heat induced stress response in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) leukocytes. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology 123, 389-397. -1171-