Μέθοδοι Ελέγχου Παραγωγής Βιοδραστικών Ουσιών: Γένη βακτηρίων με βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον

ACHAIKI IATRIKI Volume 33, Issue 1, April 2014 Ερευνητική Μελέτη Research Study Μέθοδοι Ελέγχου Παραγωγής Βιοδραστικών Ουσιών: Γένη βακτηρίων με βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον Screening for Bioactive Compounds: Bacteria with Biotechnology interest ABSTRACT Screening for bioactive compounds: Bacteria with biotechnology interest Stavroula Mamouha 1, George Kanterakis 2, Ioanna Boutsikaki 2, Alexander L Savvides 1, Amalia D Karagouni 1 1 Faculty of Biology, Department of Botany, National and Kapodistrian University of Athens, Athens, Greece, 2 Sismanoglio General Hospital, Athens, Greece Introduction. The purpose of this work was to examine the proposed methods for detection of produced antibiotic compounds by environmental bacteria and choose the most appropriate method. Εnviromantal bacteria, especially bacteria that belong to the phylum of Actinobacteria are well known for being bioactive. They produce secondary metabolites in order to confront with other microorganisms sharing the same environment and because of their inability to move. Materials and methods. Diffusion of bioactive compound from wells, Cross Sreak Method and Agar Dilution Method were tested. The bioactive methods were tested against clinical, virulent strains such as Staphylococcus, Enterococcus, Nocardia, Mycobacterium, Proteus, Pseudomonas, Klebsiella and Escherichia. Bacteria were cultured on Mueller-Hinton Agar. Results. The selected method was Agar Diffusion Method. Results are expressed by measuring the inhibition zone on agar media. Bioactive compounds were active against Gram positive bacteria. Two strains of Staphylococcus, ten strains of Nocardia and six strains of Mycobacterium - other than tuberculosis were inhibited. Conclusions. Agar Diffusion Method is the most appropriate method for the specific bioassays. The bioactive compounds were active against Gram positive bacteria. Ach Iatr 2014; 33:21-30 Key words: Βioactive compounds, biotechnology, screening for bioactive compounds Correspondence: Mamouha Stavroula, Department of Botany, Faculty of Biology, University of Athens, Panepistimioupolis, Athens 15701, Greece, Tel.: +30 210 7274647, e-mail: smamouha@yahoo.com Submited 18-8-13, Revision accepted 13-10-13

22 ΑΧΑΪΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ Τόμος 33ος, Τεύχος 1, Απρίλιος 2014 Σταυρούλα Μαμούχα 1 Γεώργιος Καντεράκης 2 Ιωάννα Μπουτσικάκη 2 Αλέξανδρος Λ Σαββίδης 1 Αμαλία Δ Καραγκούνη-Κύρτσου 1 1 Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Βοτανικής Πανεπιστημίου Αθηνών 2 Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Βοτανικής, Μικροβιολογία, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Σισμανόγλειο Γενικό Νοσοκαμείο Αθήνας Αλληλογραφία: Σταυρούλα Μαμούχα, Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Βοτανικής, Μικροβιολογία, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, 157 73, Αθήνα Τηλ.: 210 7274647 Ε-mail: smamouha@yahoo.com Υποβλήθηκε 18-8-13 Αναθεωρημένη έγινε δεκτή 13-10-13 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Σκοπός: Στην παρούσα εργασία εξετάστηκαν βιβλιογραφικά προτεινόμενοι μέθοδοι ελέγχου βιοδραστικότητας και επιλέχθηκε η κατάλληλη για τις συγκεκριμένες βιοδοκιμές. Βιοδραστικοί μικροοργανισμοί απομονώθηκαν από χερσαία οικοσυστήματα. Οι οργανισμοί αυτοί λόγω εξελικτικής πίεσης παράγουν αντιμικροβιακές ουσίες που επιτρέπουν την επιβίωσή τους. Ο σκοπός της εργασίας ήταν η συγκριτική αξιολόγηση των μεθόδων ανίχνευσης παραγωγής βιοδραστικών ουσιών από βακτήρια. Υλικά και Μέθοδοι: Οι μέθοδοι που δοκιμάστηκαν ήταν η Μέθοδος Διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας από πηγαδάκια, η Μέθοδος Καθέτου Ενοφθαλμισμού και η Μέθοδος Διάχυσης σε Άγαρ. Ως μικροοργανισμοί δείκτες χρησιμοποιήθηκαν κλινικά, παθογόνα στελέχη (Staphylococcus, Enterococcus, Nocardia, Mycobacterium, Proteus, Pseudomonas, Klebsiella και Escherichia). O έλεγχος βιοδραστικότητας προσδιορίστηκε σε θρεπτικό υπόστρωμα Mueller-Hinton ύστερα από επώαση σε κατάλληλες συνθήκες ανάλογα με το μικροοργανισμό-δείκτη. Αποτελέσματα: Εφαρμόστηκαν οι βιβλιογραφικά προτεινόμενες μέθοδοι. Επιλέχθηκε η αξιολόγηση της βιοδραστικότητας με τη Μέθοδο Διάχυσης Βιοδραστικής ουσίας σε Άγαρ. Η δράση των βιοδραστικών ουσιών προσδιορίστηκε, μετρώντας τη διάμετρο της ζώνης αναστολής ανάπτυξης του κλινικού στελέχους. Αναστολή ανάπτυξης παρατηρήθηκε σε δύο στελέχη του γένους Staphylococcus, σε δέκα στελέχη του γένους Nocardia και σε έξι Mycobacterium - other than - tuberculosis. Συμπεράσματα: Η Μέθοδος Διάχυσης Βιοδραστικής ουσίας σε Άγαρ κρίθηκε ως η πλέον κατάλληλη μέθοδος για τις βιοδοκιμές. Οι βιοδραστικές ουσίες ήταν αποτελεσματικές έναντι των θετικών κατά Gram βακτηρίων, ενώ δεν παρατηρήθηκε αναστολή της ανάπτυξης των κατά Gram αρνητικών βακτηρίων που μελετήθηκαν. Αχ Ιατρ 2014; 33:21-30. Λέξεις κλειδιά: Αιτιοπαθογένεια, παθοφυσιολογία, προεκλαμψία, υπερτασική νόσος της κύησης ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι δευτερογενείς μεταβολίτες είναι προϊόντα μικροοργανισμών που αν και δεν είναι απαραίτητα για την ανάπτυξή τους, συμβάλλουν σημαντικά στην επιβίωσή τους. Πρόκειται για αντιβιοτικά, χρωστικές, τοξίνες, φερορμόνες, αναστολείς ενζύμων, αντικαρκινικές ουσίες, ουσίες για επιβίωση ή συμβίωση και ορισμένους παράγοντες ανάπτυξης. 19 Η μικροβιακή βιοτεχνολογία χρησιμοποιεί αυτούς τους μεταβολίτες στο χώρο της υγείας, της γεωργίας και της βιομηχανίας. Βιοδραστικοί μικροοργανισμοί έχουν απομονωθεί από χερσαία και υδάτινα οικοσυστήματα καθώς και από κλινικά δείγματα. Η βιοδραστικότητα των μικροοργανισμών

ACHAIKI IATRIKI Volume 33, Issue 1, April 2014 23 του εδάφους είναι γνωστή. Οι οργανισμοί αυτοί λόγω εξελικτικής πίεσης παράγουν αντιμικροβιακές ουσίες που επιτρέπουν την επιβίωσή τους. Περισσότερα από 120 ισχυρά αντιβιοτικά (kanamycin, gentamicin, cyclosporin A, adriamycine) προέρχονται από τέτοιου είδους βακτήρια ή μύκητες. 1 Τα τελευταία είκοσι χρόνια γίνονται έρευνες για νέα αντιβιοτικά που παράγονται από θαλάσσιους μικροοργανισμούς. Το 1966 ανακαλύφθηκε το πρώτο αντιβιοτικό από ένα βακτήριο θάλασσας. Βιοδραστικές ουσίες έχουν απομονωθεί από τις βιομεμβράνες που σχηματίζουν οι μικροοργανισμοί πάνω στους θαλάσσιους οργανισμούς αλλά και από επιφυτικά βακτήρια με σκοπό να αποτρέψουν τον αποικισμό άλλων βακτηρίων. 1-3 Τα έτη 1995-1998 πραγματοποιήθηκε έρευνα σε στελέχη Ακτινοβακτηρίων που απομονώθηκαν από την Ανταρκτική. 4 Το 60% των στελεχών παρήγαγε αντιμικροβιακές και αντιμυκητιακές ουσίες για φυτοπαθογόνα βακτήρια (Pseudomonas syringae p.v. tabaci, Xanthomonas campestris p.v. vesicatoriae) και μύκητες (Ascophyta melonis, Cladosporium fulvum, Cladosporium sp, Fusarium avenaceum) αντίστοιχα. Βιοδραστικά αποδείχτηκαν και στελέχη Ακτινοβακτηρίων που απομονώθηκαν από τη λίμνη Λακτοκ στην Ινδία. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της έρευνας, τα 21 στελέχη από τα 37 παρήγαγαν βιοδραστικές ουσίες. 5 Νέα αντιβιοτικά απομονώθηκαν και από κλινικά παθογόνους μικροοργανισμούς γένους Nocardiα. 6-8 Τα βακτήρια μετά την είσοδό τους στον άνθρωπο και τα ζώα, έχουν να ανταγωνιστούν όλα τα μικρόβια της φυσιολογικής χλωρίδας του σώματος. Για το λόγο αυτό έχουν μηχανισμούς άμυνας, που πολλές φορές υπερισχύουν έναντι των κοινών μικροοργανισμών. Από κλινικά στελέχη Ακτινοβακτηρίων απομονώθηκαν και αντιμυκητιακές ουσίες. Στη Γαλλία έγινε μια έρευνα σε 110 στελέχη κλινικών ακτινοβακτηρίων (91 στελέχη Streptomyces, 11 Nocardia asteroides sensus stricto, 3 Nocardia farcinica, 3 Nocardia nova, 1 Nocardia brasiliensis και 1 Nocardia otitidiscaviarum) και βρέθηκε ότι το 49% παρήγαγαν βιοδραστικές ουσίες με αντιμυκητιακή δράση. 9 Ορισμένες από τις βιβλιογραφικά προτεινόμενες μεθόδους ανίχνευσης βιοδραστικών ουσιών από μικροοργανισμούς είναι εξής: Α. Μέθοδος διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας από πηγα- δάκια (Well Diffusion Assay). 1,4,5,10 Σε τρυβλίο με θρεπτικό υλικό, συνήθως το Mueller Hinton Agar ενοφθαλμίζεται εναιώρημα του μικροοργανισμούδείκτη. Ανάλογα με τον αριθμό στελεχών που θα ελεγχθούν επιλέγεται και το μέγεθος του τρυβλίου. Ένα τετράγωνο τρυβλίο (35,6 35,6 cm) χωράει μέχρι και 81 πηγαδάκια διαστάσεων από 5,5 ως 4,5 mm. Β. Μέθοδος Διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας σε στερεό θρεπτικό υλικό (Agar Diffusion Assay). 4,11 Ακολουθείται η ίδια διαδικασία όπως και στην προηγούμενη μέθοδο με τη διαφορά ότι αντί για δημιουργία μικρών οπών τοποθετούνται τμήματα αποικιών από τον μικροοργανισμό που ερευνάται για παραγωγή βιοδραστικών ουσιών. Τα τμήματα αυτά πρέπει να αποτελούνται από βακτήρια που έχουν σχηματίσει σπόρους. Γ. Μέθοδος Κάθετου ενοφθαλμισμού του μικροοργανισμού-δείκτη (Cross streak method). 12,13 Μεμονωμένη αποικία του υπό εξέταση μικροοργανισμού ενοφθαλμίζεται κάθετα σε τρυβλίο και επωάζεται σε κατάλληλες συνθήκες. Όταν αναπτυχθεί, ενοφθαλμίζεται κάθετα στην αρχική ανάπτυξη του μικροοργανισμού ο μικροοργανισμός-δείκτης. Δ. Μέθοδος Κάθετου ενοφθαλμισμού για μύκητες (Cross streak method). 14 H μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται όταν ο μικροοργανισμός- δείκτης αναπτύσσεται τείνοντας να καλύψει όλη την επιφάνεια του τρυβλίου (πχ υφομύκητες). Αρχικά στο τρυβλίο αναπτύσσεται ο μικροοργανισμός που εξετάζεται για παραγωγή αντιβιοτικού. Όταν έχουν σχηματιστεί σπόρια, υποβάλλεται σε ακτινοβολία UV για 10 λεπτά και στη συνέχεια αντιδιαμετρικά καλλιεργείται ο μικροοργανισμός δείκτης. Ε. Μέθοδος με εφαρμογή ELISA. 15 Ο μικροοργανισμός δείκτης είναι διαλυμένος σε εναιώρημα όπου η συγκέντρωση του δείγματος μπορεί να καθοριστεί. Οι μέθοδοι αραίωσης μπορούν να αυτοματοποιηθούν και να χρησιμοποιηθούν πλάκες μικροτιτλοποίησης τύπου ELISA (microtiter plates) 96, 384 ή 1536 θέσεων. 16 Στα κελιά της πλάκας τοποθετούνται το υπό εξέταση στέλεχος και ο μικροοργανισμός-δείκτης μαζί με κατάλληλο θρεπτικό υπόστρωμα. Το δείγμα φωτομετρείται και υπολογίζεται η συγκέντρωση.

24 ΑΧΑΪΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ Τόμος 33ος, Τεύχος 1, Απρίλιος 2014 ΣΤ. Μέθοδος Διάχυσης Αντιβιοτικής ουσίας σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα-ποσοτική μέθοδος. 17,18 Σύμφωνα με αυτή τη μέθοδο, η βιοενεργή ουσία απομονώνεται και τοποθετείται συγκεκριμένη ποσότητα σε δισκία από διηθητικό χαρτί διαμέτρου 6 mm. Σε τρυβλίο ενοφθαλμίζεται εναιώρημα του μικροοργανισμού-δείκτη πυκνότητας 0,5 κλίμακας MacFarland (10 8 cfu ml -1 ) και τοποθετούνται τα δισκία με τη βιοενεργή ουσία. Ζ. Μέθοδος Διάχυσης Αντιβιοτικής ουσίας σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα - ποιοτική μέθοδος. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται στο Εθνικό Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών, στον τομέα Βοτανικής για την ανίχνευση δευτερογενών μεταβολιτών από στρεπτομύκητες εδάφους. Είναι η μέθοδος που εφαρμόστηκε στην παρούσα ερευνητική εργασία. Συνοπτικά, σε θρεπτικό υπόστρωμα εμβολιάζονται αποικίες του μικροοργανισμού που εξετάζεται για την παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών και επωάζονται μέχρι να σχηματιστούν σπόρια. Στη συνεχεία αναστέλλεται η ανάπτυξή τους με υπεριώδη ακτινοβολία και γίνεται επικάλυψη με εναιώρημα του μικροοργανισμού δείκτη αραιωμένο σε θρεπτικό υπόστρωμα. Τα στελέχη που εξετάστηκαν ήταν βακτήρια του γένους Streptomyces. Τα συγκεκριμένα βακτήρια παράγουν αντιβιοτικά οποία είναι δευτερογενείς μεταβολίτες που εμφανίζουν μεγάλη ποικιλομορφία όσον αφορά τη χημική τους δομή. 19,20 Περιλαμβάνουν αμινογλυκοσίδες, πολυκετίδια, μακρολιπίδια, β-λακτάμες, πεπτίδια, πολυένια, πολυαιθέρες, τετρακυκλίνες κ.α. Τα μόρια αυτά βοηθάνε στην επιβίωση, σποριογονία, παθογένεια, παραγωγή χρωστικών και αντιβιοτικών. 19 Εκτός της παραγωγής ουσιών με αντιμικροβιακή δράση, οι στρεπτομύκητες παράγουν πολλές άλλες βιοδραστικές ενώσεις οι οποίες είναι αντιμυκητιακές, αντιϊκές, αντικαρκινικές, αντιπαρασιτικές, εντομοκτόνες και ζιζανιοκτόνες (Πίνακας 1). Η παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών εξαρτάται από τη σύσταση των θρεπτικών υλικών (ανάλογα με την πηγή, π.χ. γλυκόζη ή γλυκερόλη, ακολουθείται συγκεκριμένη βιοχημική οδό), το ρυθμό ανάπτυξης του μικροοργανισμού και την επαγωγή ή καταστολή ενζύμων που συμμετέχουν στη μεταβολική οδό βιοσύνθεσής τους. Οι υπεύθυνες συνθετάσες κωδικοποιούνται στο χρωμοσωμικό DNA (λιγότερο συχνά στο πλασμιδιακό) υπό τη μορφή συνεργιώματος (οπερονίου). Σε αντίθεση με τους πρωτογενείς μεταβολίτες, δεν έχει μελετηθεί πλήρως η βιοσύνθεση των δευτερογενών. 19 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εξετάστηκε η βιοδραστικότητα δέκα έξι ενδογενών στελεχών του γένους Streptomyces τα οποία επιλέχθηκαν από την Τράπεζα στελεχών του εργαστηρίου Μικροβιολογίας, του Τομέα Βοτανικής, του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών (Ε.Κ.Π.Α.). Χρησιμοποιήθηκε επίσης ένα στέλεχος (Streptomyces chrestomyceticus) από τη Γερμανική Τράπεζα Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH ως θετικός μάρτυρας. Τα στελέχη Streptomyces είχαν απομονωθεί από επιβαρυμένο (εναπόθεση λημμάτων) γεωργικό χώμα του Μαραθώνα και της Καισαριανής. Οι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο δράσης βιοδραστικών ουσιών Ακτινοβακτηρίων ήταν θετικά και αρνητικά κατά Gram κλινικά στελέχη. Αναλυτικότερα, από ένα στέλεχος Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Methicillin- Resistant S. αureus (MRSA), Enterococcus faecalis, E. faecium, Vancomycin-Resistant enterococci (VRE), Nocardia sp, Mycobacterium - other than tuberculosis. M. tuberculosis complex, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis και Escherichia coli. Τα στελέχη αυτά επιλέχθηκαν από την Τράπεζα στελεχών του εργαστηρίου Μικροβιολογίας, του Γ.Ν.Α. Σισμανόγλειο. Ως μάρτυρες για την αναστολή βακτηρίων του γένους Staphylococcus χρησιμοποιήθηκαν δισκίο αντιβιοτικού ριφαμπικίνης συγκέντρωσης 5 μg δισκίο-1 και λινεζολίδης συγκέντρωσης 30 μg δισκίο -1, για το E. faecium η ριφαμπικίνη συγκέντρωσης 5 μg δισκίο -1, για τα Enterococcus sp η βανκομυκίνη συγκέντρωσης 30 μg δισκίο -1 ενώ για το (VRE) η γενταμυκίνη συγκέντρωσης 10 μg δισκίο -1. Για τα βακτήρια γένους Nocardia χρησιμοποιήθηκε δισκίο αντιβιοτικού αμοξικιλλίνη-κλαβουλανικό (AMC30) συγκέντρωσης 30 μg δισκίο -1. Για τα αρνητικά κατά Gram P. mirabilis, E. coli και P. aeruginosa χρησιμοποιήθηκε η σιπροφλοξανίνη συγκέντρωσης 5 μg δισκίο -1.

ACHAIKI IATRIKI Volume 33, Issue 1, April 2014 25 Πίνακας 1 Είδη του φύλου Actinobacteria που παράγουν αντιβιοτικά Είδος Αντιβιοτικό Δράση Ενδιαιτήματα Βιβλιογραφία Streptomyces noursei Nystatin Αντιμυκητιακή Έδαφος 21 Streptomyces nodosus Amphotericin Αντιμυκητιακή Έδαφος 22 Streptomyces natalensis Natamycin Αντιμυκητιακή Έδαφος 23 Streptomyces kanamyceticus Kanamycin,gentamicin Αντιμυκητιακή Έδαφος 24 Streptomyces xinghaiensis Reductiomycin Αντιβακτηριακή Έδαφος 25 Streptomyces fradiae Neomycin Αντιβακτηριακή Έδαφος 26 Streptomyces griseus Streptomycin Αντιβακτηριακή Έδαφος 27 Streptomyces rimosus Tetracycline Αντιβακτηριακή Έδαφος 28 Streptomyces orientalis Vancomycin Αντιβακτηριακή Έδαφος 29 Streptomyces mediterranei Rifamycin Αντιβακτηριακή Έδαφος 30 Streptomyces alboflavus Tetracycline Αντιβακτηριακή Έδαφος 28 Streptomyces alboniger Puromycin Αντιβακτηριακή Έδαφος 31 Streptomyces lincolnensis Lincomycin Αντιβακτηριακή Έδαφος 32 Streptomyces vendagensis Tetracycline Αντιβακτηριακή Έδαφος 28 Streptomyces platensis Migrastatin Αντικαρκινικά Έδαφος 33 Streptomyces hygroscopicus Rapamycin Αντιβακτηριακή Έδαφος 34 Streptomyces venezuelae Chloramphenicol Αντιβακτηριακή Έδαφος 35 Streptomyces aureofaciens Tetracycline Αντιβακτηριακή Έδαφος 28 Streptomyces avermitilis Avermectin Αντιβακτηριακή Έδαφος 36 Salinispora rifamycin B, SV Αντιμυκητιακή Θάλασσα 37 Nocardia. brasiliensis B a A, Brasil. b A, E c E Αντιβακτηριακή Α.Ο d 38 Nocardia. pseudobrasiliensis Νocardicyclins Αντιβακτηριακή Α.Ο 39 Nocardia transvalensis Transvalencin Α, Β Μ.Β.Κ. e Α.Ο 8 Nocardia sp. CS682 Nargenicin Αντιβακτηριακή Α.Ο 40 Micromonospora chinospora Kanamycin, gentamicin Αντιβακτηριακά Έδαφος 24 Micromonospora riseorubida Mycinamicin II Αντιβακτηριακή Έδαφος 41 a : Brasilinolide, b : brasilicardin, c : erythromycin Ε, d : ανθρώπινος οργανισμός, e : αντιμυκητιακή, αντιβακτηριακή, αντικαρκινική, ανοσοκατασταλτική. Οι μέθοδοι που δοκιμάστηκαν ήταν η Μέθοδος Διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας από πηγαδάκια, η Μέθοδος Καθέτου Ενοφθαλμισμού στο θρεπτικό υπόστρωμα και η Μέθοδος Διάχυσης Αντιβιοτικής ουσίας σε Στερεό θρεπτικό υλικό. Yπόστρωμα για τον έλεγχο βιοδραστικότητας χρησιμοποιήθηκε το Mueller Hinton Agar. Στη Μέθοδο διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας από πηγαδάκια, ενοφθαλμίστηκε στο τρυβλίο κλινικό στέλεχος για έλεγχο δράσης βιοδραστικών ουσιών υπό μορφή εναιωρήματος 0,5 κλίμακας MacFarland. Η επίστρωση του μικροοργανισμού έγινε με βαμβακοφόρο στυλεό σε τρεις κάθετες μεταξύ τους κατευθύνσεις. Στη συνέχεια με σωληνοειδές εξάρτημα διαμέτρου 10 mm απομακρύνθηκαν τμήματα θρεπτικού υποστρώματος και στις οπές που σχηματίστηκαν τοποθετήθηκε εναιώρημα σε υγρό θρεπτικό υλικό (20-50 μl υγρής καλλιέργειας) του μικροοργανισμού που εξετάστηκε για δράση βιοδραστικών ουσιών. Ακολούθησε επώαση (το τρυβλίο επωάζεται ανάστροφα) και έλεγχος για ζώνη αναστολής. Η μέθοδος δεν μπόρεσε να εφαρμοστεί σε όλες τις περιπτώσεις εξαιτίας των διαφορετικών χρόνων επωάσεων των μικροοργανισμών και απορρίφθηκε. Τα βακτήρια του γένους Streptomyces χρειάζονται 72 ώρες επώασης ενώ τα κλινικά στελέχη των γενών Staphylococcus, Enterococcus, Klebsiella,

26 ΑΧΑΪΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ Τόμος 33ος, Τεύχος 1, Απρίλιος 2014 Proteus, Pseudomonas 28-24 ώρες. Επιπλέον, στην περίπτωση του M. tuberculosis complex, η μέθοδος δεν μπόρεσε να εφαρμοστεί λόγω παρατεταμένου χρόνου επώασής του. Το υγρό θρεπτικό υλικό εξατμίστηκε πριν προλάβει να αναπτυχθεί το M. tuberculosis complex. Στη Μέθοδο Καθέτου Ενοφθαλμισμού στο θρεπτικό υπόστρωμα ενοφθαλμίστηκε με κρίκο αποικία βακτηριών του γένους Streptomyces. Το τρυβλίο επωάστηκε και όταν παρατηρήθηκε σποριογονία υποβλήθηκε για 10 λεπτά σε ακτινοβολία UV. Στη συνέχεια, κατά τον ίδιο τρόπο ενοφθαλμίστηκε εναιώρημα κλινικού στελέχους (0,5 κλίμακας MacFarland) προσέχοντας να μην έρθει σε επαφή με τον ήδη ανεπτυγμένο μικροοργανισμό-δείκτη και επωάστηκε σε κατάλληλες συνθήκες. Η μέθοδος απορρίφθηκε εξαιτίας των διαφορετικών διατροφικών απαιτήσεων των μικροοργανισμών και του ερπυσμού του στελέχους Proteus sp. Η μέθοδος που εφαρμόστηκε ήταν η Μέθοδος Διάχυσης βιοδραστικής ουσίας σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα. Έγιναν οι εξής χειρισμοί: Σε κάθε τρυβλίο εμβολιάσθηκαν έξι στελέχη Aκτινοβακτηρίων (Streptomyces sp) που εξετάστηκαν για παραγωγή βιοδραστικών ουσιών. Μετά την επώαση ακολούθησε ακτινοβόληση των τρυβλίων με υπεριώδη ακτινοβολία για 10 λεπτά. Στη συνέχεια τα τρυβλία εμβολιάσθηκαν με εναιώρημα κλινικού στελέχους για έλεγχο δράσης βιοδραστικών ουσιών. Το εναιώρημα με το μικροοργανισμό-δείκτη ετοιμάστηκε σύμφωνα με τις οδηγίες από τα Πρότυπα του Συμβουλίου Κλινικών Εργαστηρίων, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) ως εξής: Με αποστειρωμένο κρίκο εμβολιασμού επιλέχθηκαν 4-5 αποικίες από καθαρή καλλιέργεια και αραιώθηκαν σε 2 ml φυσιολογικό ορό μέσα σε γυάλινο αποστειρωμένο σωληνάριο. Το εναιώρημα (0,5 της κλίμακας MacFarland) χρησιμοποιείται στη συνέχεια της δοκιμασία. 10 Σημαντικό είναι να χρησιμοποιηθεί εντός 10 λεπτών από τη στιγμή που παρασκευάστηκε. Στην περίπτωση που μικροοργανισμός δείκτης ήταν κλινικό στέλεχος γένους Nocardia ή Mycobacterium, στο σωληνάριο προστέθηκαν γυάλινα σφαιρίδια για καλύτερη ανάδευση προκειμένου να διασπαστούν οι αποικίες των μικροβίων. Ακολούθησε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου και ξανά ανάδευση. Το τελικό εναιώρημα ήταν 1 της κλίμακας MacFarland. 42 Παράλληλα, παρασκευάστηκε θρεπτικό υπόστρωμα Μueller Ηinton ή Middlebrook 7H11 με μικρότερη συγκέντρωση (18 g l -1 ) για να διαχυθούν καλύτερα οι παραγόμενες βιοδραστικές ουσίες. Μετά την αποστείρωση του υποστρώματος, τοποθετήθηκε σε υδατόλουτρο 50 C και προστέθηκε ο μικροοργανισμός για τον έλεγχο δράσης βιοδραστικών ουσιών. Το θρεπτικό αυτό υπόστρωμα επιστρώθηκε στα τρυβλία που είχαν ακτινοβοληθεί με υπεριώδη ακτινοβολία. Τα τρυβλία παρέμειναν για λίγα λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ώστε να πήξει το θρεπτικό υπόστρωμα με τους μικροοργανισμούς για έλεγχο δράσης βιοδραστικών ουσιών και στη συνέχεια επωάσθηκαν, ανάλογα με τον μικροοργανισμό-δείκτη. Τα στελέχη S. aureus, S. epidermidis, Enterococcus και τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια σε θερμοκρασία 35-37 C για 18-20 ώρες, τα βακτήρια του γένους Nocardia στους 35-37 C για 72 ώρες και σε συνθήκες CO 2 5% ενώ τα βακτήρια του γένους Mycobacterium στους 35-37 C για 40 ημέρες, παρουσία οξυγόνου. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η δράση των βιοδραστικών ουσιών προσδιορίστηκε ποιοτικά, μετρώντας τη διάμετρο της ζώνης αναστολής ανάπτυξης του κλινικού στελέχους. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν δισκία αντιβιοτικών γνωστής συγκέντρωσης. Για το S. aureus η ζώνη αναστολής από τη λινεζολίδη ήταν 24 mm ενώ για το S. epidermidis ήταν 31 mm. Για το E. faecium η ζώνη αναστολής ανάπτυξης από τη ριφαμπικίνη ήταν 20 mm, για τα Enterococcus sp και E. faecalis η βανκομυκίνη δημιούργησε ζώνη αναστολής 28 mm και 34 mm αντίστοιχα ενώ για το (VRE) η γενταμυκίνη έδωσε ζώνη αναστολής 26 mm. Η αμοξικιλλίνηκλαβουλανικό δημιούργησε ζώνη αναστολής από 8-30 mm ανάλογα με το κλινικό στέλεχος γένους Nocardia. Για τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια το δισκίο σιπροφλοξανίνης (για τα P. mirabilis, E. coli και P. aeruginosa) δημιούργησε διάμετρο ζώνης αναστολής 26 mm, 20 mm και 20 mm αντίστοιχα ενώ για το στέλεχος K. pneumoniae η γενταμυκίνη είχε διάμετρο ζώνης αναστολής 16 mm. Παρατηρήθηκε ότι μόνο δυο στελέχη Streptomyces ήταν βιοδραστικά έναντι των κλινικών στελεχών S.

ACHAIKI IATRIKI Volume 33, Issue 1, April 2014 27 aureus και S. epidermidis. Αναλυτικότερα, το ένα στέλεχος δημιούργησε ζώνη αναστολής 20 και 50 mm στα αντίστοιχα κλινικά στελέχη ενώ το δεύτερο δημιούργησε ζώνη αναστολής 44 και 42 mm αντίστοιχα. Όσον αφορά τα κλινικά στελέχη του γένους Enterococcus παρατηρήθηκε ότι κανένα από τα ενδογενή, εδαφικά στελέχη του γένους Streptomyces αλλά ούτε και το πρότυπο στέλεχος S. chrestomyceticus DSM 40545 δεν ήταν βιοδραστικά έναντι των συγκεκριμένων κλινικών στελεχών. Η άλλη ομάδα κλινικών παθογόνων βακτηρίων που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο δράσης βιοδραστικών ουσιών ήταν κλινικά στελέχη του γένους Nocardia. Παρατηρήθηκε ότι τα περισσότερα στελέχη γένους Streptomyces προκάλεσαν αναστολή στην ανάπτυξη των κλινικών στελεχών του γένους Nocardia. Οι διάμετροι των ζωνών αναστολής ήταν από 14 mm έως 65 mm (πρότυπο στέλεχος S. chrestomyceticus DSM 40545) που ήταν και η μεγαλύτερη διάμετρος ζώνης αναστολής που παρατηρήθηκε. Επίσης, η βιοδραστικότητα ενδογενών εδαφικών στελεχών του γένους Streptomyces εξετάστηκε και έναντι κλινικών στελεχών του γένους Mycobacterium (Mycobacterium - other than tuberculosis- ΜΟΤΤ). Παρατηρήθηκε ότι δέκα τέσσερα από τα δέκα επτά στελέχη του γένους Streptomyces (συμπεριλαμβανομένου και του πρότυπου στελέχους S. chrestomyceticus DSM 40545) ήταν δραστικά έναντι των κλινικών στελεχών ΜΟΤΤ. Οι διάμετροι των ζωνών αναστολής ήταν από 12 mm έως 48 mm (S. chrestomyceticus DSM 40545). Η τελευταία ομάδα των θετικών κατά Gram κλινικών στελεχών που χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο δράσης των βιοδραστικών ουσιών ήταν τα στελέχη M. tuberculosis complex. Παρατηρήθηκε ότι κανένα στέλεχος γένους Streptomyces δεν ήταν βιοενεργό για τα συγκεκριμένα βακτήρια. Τα ενδογενή εδαφικά στελέχη γένους Streptomyces καθώς και το πρότυπο στέλεχος S. chrestomyceticus DSM 40545 ελέγχθηκαν και για τη δράση βιοδραστικών ουσιών έναντι αρνητικών κατά Gram κλινικών παθογόνων βακτηρίων στα οποία όμως δεν παρατηρήθηκε καμία αναστολή ανάπτυξης. Τα αποτελέσματα της εργασίας δίνονται στον Πίνακα 2. ΣΥΖΗΤΗΣΗ Τα ακτινοβακτήρια είναι μια μεγάλη ομάδα νηματοειδών, θετικών κατά Gram βακτηρίων με εξαίρεση εκείνα των γενών Acetobacterium, Butyrivibrio, Thermoanaerobacter. Είναι αερόβια με υψηλή ανα- Πίνακας 2. Συγκεντρωτικά αποτελέσματα βιοδραστοκότητας. α/α Στελέχη Streptomyces Staphylococcus sp Nocardia sp Mycobacterium other than tuberculosis 1 Streptomyces CAG 4/1-2 Streptomyces CAG 13/3 - - - 3 Streptomyces Μ 53-4 Streptomyces Μ 33 5 Streptomyces Μ 24-6 Streptomyces Μ 17-7 Streptomyces Μ 16-8 Streptomyces Μ 5 9 S. cyaneus ASE 19 - - - 10 S. collinus CAG 9-11 Streptomyces CAG 9/2-12 Streptomyces CAG 13/2-13 S. albidoflavus K 3 - - - 14 Streptomyces M 63 - - 15 Streptomyces Vol 3-16 Streptomyces Μ56 -

28 ΑΧΑΪΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ Τόμος 33ος, Τεύχος 1, Απρίλιος 2014 λογία βάσεων γουανίνης-κυτοσίνης (G+C) η οποία ποικίλει από 51% σε ορισμένα Corynebacteria εως τουλάχιστον 70% στα Streptomyces και Frankia. Εξαίρεση αποτελεί το παθογόνο Tropheryma whipplei με αναλογία G+C μικρότερη από 50% 36. Το όνομα ακτινομύκητες οφείλεται στο Actinomyces bovis, το πρώτο βακτήριο που μελετήθηκε και προκαλεί ακτινομυκήτωμα στις αγελάδες 13. Τα ενδιαιτήματά τους μπορεί να είναι το έδαφος (βιοξυγίανση, βιοέλεγχος), τα υδάτινα περιβάλλοντα και ο ανθρώπινος οργανισμός 36,43. Το βιοτεχνολογικό ενδιαφέρον των Ακτινοβακτηρίων αφορά κυρίως την παραγωγή βιοδραστικών ουσιών. Τα βιοδραστικά βακτήρια ανήκουν στην τάξη Actinomycetales. Έχουν απομονωθεί περισσότερες από 10000 ενώσεις με αντιμικροβιακή δράση 43. Το 50-60% έχει απομονωθεί από τα Streptomyces. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα βακτήρια από το θαλάσσιο περιβάλλον (παράγουν αντιβιοτικά, αντικαρκινικά, ένζυμα, αναστολείς ενζύμων κ.ά). 43 Στην παρούσα ερευνητική εργασία, εφαρμόστηκαν μέθοδοι ανίχνευσης βιοδραστικών ουσιών και εξετάστηκε η βιοδραστικότητα 16 βακτηριακών στελεχών Streptomyces έναντι κλινικών παθογόνων μικροοργανισμών. Όπως προαναφέρθηκε, η πηγή άνθρακα (π.χ. γλυκόζη ή γλυκερόλη) στην οποία αναπτύσσεται το στέλεχος Streptomyces επηρεάζει την παραγωγή των αντιβιοτικών, καθώς ανάλογα με τη διαθέσιμη πηγή οργανικής ένωσης ακολουθείται συγκεκριμένο βιοχημικό μονοπάτι. 19 Σήματα για την έκκριση δευτερογενών μεταβολιτών αποτελούν οι αλλαγές του pη και της θερμοκρασίας, η έλλειψη θρεπτικών συστατικών και η παρουσία ουσιών με ρόλο καταστολέα ή επαγωγέα. Οι μεταβολές αυτές επάγουν την έκφραση ρυθμιστικών γονιδίων με αποτέλεσμα τη χημική (δευτερογενής μεταβολισμός) και μορφολογική (μορφογένεση) διαφοροποίηση 19. Τα σήματα αυτά ελέγχουν την έκφραση γονιδίων που παράγουν θετικούς μεταγραφικούς παράγοντες δευτερογενούς μεταβολισμού. Όταν το θρεπτικό υλικό είναι επαρκές και συνεπώς δεν είναι απαραίτητη η έκκριση δευτερογενών μεταβολιτών, μια ρυθμιστική πρωτεΐνη σε ρόλο καταστολέα είναι δεσμευμένη στο DNA του μικροοργανισμού και εμποδίζει την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων. Τα υπεύθυνα γονίδια είναι τα εξής: - aphd. Γονίδιο υπεύθυνο για την παραγωγή στρεπτομυκίνης καθώς και πρωτεϊνών που προσδίδουν ανθεκτικότητα του στελέχους στο συγκριμένο αντιβιοτικό (πχ 6-φωσφοτρανσεράση της στρεπτομυκίνης) - strr. Ρυθμιστικό γονίδιο που συμμετέχει στο μεταβολικό μονοπάτι βιοσύνθεσης στρεπτομυκίνης - strb. Γονίδιο για αμινοτρανσφεράσες, παραγωγή στρεπτομυκίνης. Στην εργασία αυτή εξετάστηκε η βιοδραστικότητα βακτηρίων γένους Streptomyces. Δύο στελέχη Streptomyces ανέστειλαν την ανάπτυξη των βακτηρίων γένους Staphylococcus. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν και με άλλες, αντίστοιχες μελέτες 6,44,45. Καμία αναστολή ανάπτυξης δεν παρατηρήθηκε στα κλινικά στελέχη του γένους Enterococcus. Ωστόσο, υπάρχουν βιβλιογραφικές αναφορές σύμφωνα με τις οποίες έχουν απομονωθεί βιοδραστικές ενώσεις από βακτήρια γένους Streptomyces έναντι των βακτηρίων E. faecium, E. faecalis και VRE. 45 Όταν για τον έλεγχο δράσης βιοδραστικών ουσιών χρησιμοποιήθηκαν κλινικά στελέχη του γένους Nocardia, παρατηρήθηκε αναστολή ανάπτυξης σε δέκα από τα δέκα τρία κλινικά στελέχη του γένους Nocardia. Έχει παρατηρηθεί και από τους Omura και συνεργάτες (1976) αναστολή των στελεχών του γένους Nocardia από μεγάλο αριθμό στελεχών του γένους Streptomyces. Εξίσου μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει η διαπίστωση ότι τα εδαφικά στελέχη που ήταν βιοδραστικά έναντι των κλινικών στελεχών γένους Nocardia ήταν βιοδραστικά και για τα κλινικά στελέχη του γένους ΜΟΤΤ. Αυτό ίσως να οφείλεται στη φυλογενετική συγγένεια ανάμεσα στα δυο γένη (Mycobacterium και Nocardia). Συγκεκριμένα, στην περίπτωση των ΜΟΤΤ, παρατηρήθηκε αναστολή σε έξι από τα δώδεκα κλινικά στελέχη που εξετάστηκαν. Κανένα στέλεχος δεν προκάλεσε αναστολή ανάπτυξης του κλινικού μικροοργανισμού-δείκτη M. tuberculosis complex. Ωστόσο, σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα, κάποια είδη Streptomyces (Streptomyces padanus NRRL 30562) παράγουν αντιφυματικές ουσίες έναντι του M. tuberculosis complex Η37Rv (M. tuberculosis ATCC25618) και των πολυανθεκτικών στελεχών M. tuberculosis (Μultiple- Drug-Resistant-MDR-P). 45

ACHAIKI IATRIKI Volume 33, Issue 1, April 2014 29 Οι μελλοντικοί μας στόχοι αφορούν την απομόνωση μεμονωμένων βιοδραστικών ουσιών από τα στελέχη στρεπτομυκήτων τα οποία βρέθηκε να παράγουν ουσίες με αντιβακτηριδιακή δράση, την ταυτοποίηση αυτών και τον έλεγχο δράσης τους σε περισσότερα αρνητικά κατά Gram βακτήρια. REFERENCES 1. Ahmed N, Uzair B, Ayaz S, Viqar UA. Antibacterial activity of marine bacteria from Arabian Sea of Pakistan. The Internet Journal of Microbiology 2008; 4:1-10. 2. Kim TK, Hewavitharana AK, Shaw PN, Fuerst JA. Discovery of a new source of Rifamycin antibiotics in marine sponge Actinobacteria by phylogenetic prediction. Applied and Environmental Microbiology 2006; 72:2118-2125. 3. Xiao J, Zhang Q, Zhu Y, et al. Characterization of the sugar-o-methyltransferase LobS1 in lobophorin biosynthesis. Appl Microbiol Biotechnol 2013; 97:9043-9053. 4. Nedialkova D, Naidenova M. Screening the antimicrobial activity of Actinomycetes strains isolated from Antarctica. Journal of Culture Collections 2005; 4:29-35. 5. Shantikumar L, Baruah NC, Bora TC. Actinomycetes of Loktak Habitat: isolation and screening for antimicrobial activities. Biotechnology 2006; 2:217 221. 6. Speitling M, Nattewan P, Yazawa K, Mikami Y, Grun I. Demethyl mutactimycins, new anthracycline antibiotics from Nocardia and Streptomyces strains. Journal of Antibiotics 1998; 51:693-698. 7. Mikami Y, Komaki H, Imai TA. New antifungal macrolide component, Brasilinolide B, produced by Nocardia brasiliensis. Journal of Antibiotics 2000; 53:70-75. 8. Mukai A, Fukai T, Matsumoto Y, Ishikawa J, Hoshino Y. Transvalencin Z, a new antimicrobial compound with salicylic acid residue from Nocardia transvalensis IFM 10065. Journal of Antibiotics 2006; 59:366-369. 9. Lemriss S, Laurent F, Couble A, et al. Screening of nonpolyenic antifungal metabolites produced by clinical isolates of actinomycetes. Canadian Journal of Microbiology 2003; 49:669-674. 10. Parungao MM, Ebner BG, Villano F. Screening of antibiotic-producing Actinomycetes from marine, brackish and terrestrial sediments of Samal island, Philippines. Journal of Research in Science, Computing and Engineering 2007; 4:29-38. 11. Kakore CR, Mahadik KR, Kadam SS, Chopade BA. Isolation, characterization and antimicrobial activity of marine halophilic Actinopolyspora species AH1 from the west coast of India. Current Science 2004; 4:593-597. 12. Bhagabati P, Prakash G, Vishwanath PA. Studies on the antibacterial activity of the Actinomycetes isolated from the Khumbu Region of Nepal. (http://www. aehms.org/pdf/panday%20f.pdf) 13. Yadav J. Biochemical and genetic characterization of a Streptomyces sps from Everest region and chemical characterization of antibiotics produced there from. Research laboratory for biotechnology and biochemistry http://upendrats.blogspot.com/2007/07/ biochemical-and-genetic.html 14. Williston EH, Pari ZW, Youmans G. Plate methods for testing antibiotic activity of Actinomycetes against virulent human type tubercle Bacille. Journal of Bacteriology 1947; 54:563-568. 15. Devienne KF, Raddi ΜS. Screening for antimicrobial activity of natural products using a microplate photometer. Brazilian Journal of Microbiology 2002; 33:166-168. 16. Casey JT, O Cleirigh C, Walsh PK, O Shea DG. Development of a robust microtiter plate-based assay method for assessment of bioactivity. Journal of microbiological methods 2004; 58:327 334. 17. Schrey S, Erkenbrack E, Früh E, et al. Production of fungal and bacterial growth modulating secondary metabolites is widespread among mycorrhiza-associated streptomycetes. BMC Microbiol 2012; 12:164. 18. Al-Bari A, Abdul M, Sayeed MA, Rahman MS, Mossadik MA. Characterization and antimicrobial activities of a phthalic acid derivative produced by Streptomyces bangladeshiensis. A novel species collected in Bangladesh. Research Journal of Medicine and Medical Sciences 2006; 1:77-81. 19. Demain AL. Induction of microbial secondary metabolism. International Microbiology 1998; 1:259-264. 20. Kingston W. Streptomycin and the balance of credit for discovery. Journal of the history of medicine and allied sciences 2004; 59:441-462. 21. Fjærvik E, Zotchev SB. Biosynthesis of the polyene macrolide antibiotic nystatin in Streptomyces noursei. Applied microbiology and biotechnology 2005; 67:436-443. 22. Zotchev S, Caffrey P. Genetic analysis of nystatin and amphotericin biosynthesis. Methods in Enzymology. 2006; 459:243-258. 23. Farid M, Enshasy H, El-Sayed E. Optimization of the cultivation medium for natamycin production by Streptomyces natalensis. Journal of basic Microbiology 2000; 40:157-166. 24. Kharel MK, Subba B, Basnet DB, et al. A gene cluster

30 ΑΧΑΪΚΗ ΙΑΤΡΙΚΗ Τόμος 33ος, Τεύχος 1, Απρίλιος 2014 for biosynthesis of kanamycin from Streptomyces kanamyceticus: comparison with gentamicin biosynthetic gene cluster. Archives of biochemistry and biophysics 2004; 15:204-214. 25. Kumar KS, Anuradha S, Sarma GR, Venkateshwarlu Y, Kishan V. Screening, isolation, taxonomy and fermentation of an antibiotic producer Streptomyces xinghaiensis from soil capable of acting against linezolid resistant strains. Indian J Exp Biol 2012; 50:718-728. 26. Jnawali HN, Subba B, Liou K, Sohng JK. Functional characterization of kan B by complementing in engineered Streptomyces fradiae Deltaneo6::tsr. Biotechnology letters 2009; 31:869-875. 27. Distler J, Mansouri K, Piepersberg W. Streptomycin biosynthesis in Streptomyces griseus II. Adjacent genomic location of biosynthetic genes and one of two streptomycin resistance genes. FEMS microbiology letters 2006; 30:151-154. 28. Asagbra A, Abiodun S, Oyewole O. Solid-state fermentation production of tetracycline by Streptomyces strains using some agricultural wastes as substrate World journal of microbiology and biotechnology 2005; 21:107-114. 29. Banskota AH, Mcalpine JB, Sørensen D, et al. Genomic analyses lead to novel secondary metabolites. Part 3. ECO-0501, a novel antibacterial of a new class. Journal of Antibiotics 2006; 59:533-542. 30. Feng-Xu Ma, Jung Hun Kim, Sung Bae Kim, et al. Medium optimization for enhanced production of Rifamycin B by Amycolatopsis mediterranei S699: combining a full factorial design and a statistical approach. Process Biochemistry 2008; 43:954-960. 31. Abou-Zeid AA, Abou-Zeid AZ, Shaheen AB, Dewany AI. Fermentative production of puromycin by Streptomyces alboniger. Journal of Αpplied Chemistry and Biotechnology 2007; 23:837 845. 32. Choi D, Cho K. Effect of carbon source consumption rate on lincomycin production from Streptomyces lincolnensis. Journal of microbiology and biotechnology 2007; 14:532-539. 33. Lim SK, Ju J, Zazopoulos E, et al. Iso-migrastatin, migrastatin, and dorrigocin production in Streptomyces platensis is governed by a single biosynthetic machinery featuring an acyltransferase-less type I polyketide synthase. Journal of biological chemistry 2009; 284:29746-29756. 34. Chen X, Wei P, Fan L, et al. Generation of high-yield rapamycin-producing strains through protoplastsrelated techniques. Applied microbiology and biotechnology 2009; 83:507-512. 35. Izard T, Ellis J. The crystal structures of chloramphenicol phosphor - transferase reveal a novel inactivation mechanism. The EMBO Journal 2001; 19:2690-2700. 36. Ventura M, Canchaya C, Tauch A, et al. Genomics of Actinobacteria: tracing the evolutionary history of an ancient phylum. Microbiology and molecular biology reviews 2007; 71:495-548. 37. Tae Kyung K, Hewavitharana A, Shaw N, Fuerst J. Discovery of a new source of rifamycin antibiotics in marine sponge Actinobacteria by phylogenetic prediction. Applied and environmental microbiology 2006; 72:2118-2125. 38. Yasushi T, Hisayuki K, Katsukiyo Y, Yuzuru M. Brasilinolide A, a new macrolide antibiotic produced by Nocardia brasiliensis: producing strain, isolation and biological activity. Research Center for Pathogenic Fungi and Microbial Toxicoses 1997; 50:1036-1041. 39. Tanaka Y, Komaki H, Yazawa K, Mikami Y. Brasilinolide A, a new macrolide antibiotic produced by Nocardia brasiliensis: producing strain, isolation and biological activity. Research centre for pathogenic fungi and microbial toxicoses 1997; 50:1036-1041. 40. Sohng JK, Yamaguchi T, Seong CN, et al. Production, isolation and biological activity of nargenicin from Nocardia sp. CS682. Archives in pharmacal research 2008; 31:1339-1345. 41. Anzai Y, Iizaka Y, Li W, et al. Production of rosamicin derivatives in Micromonospora rosaria by introduction of D-mycinose biosynthetic gene with PhiC31-derived integration vector pset152. Journal of industrial microbiology and biotechnology 2009; 36:1013-1021. 42. Ambaye A, Kohner P, Wollan P, Roberts K, Cockerill FR. Comparison of agar dilution, broth microdilution, disk diffusion, E-test, and BACTEC radiometric methods for antimicrobial susceptibility testing of clinical isolates of the Nocardia asteroides complex Journal of Clinical Microbiology 1997; 35:847-852. 43. Manivasagan P, Venkatesan J, Sivakumar K, Kim SK. Marine actinobacterial metabolites: current status and future perspectives. Microbiol Res 2013; 168:311-332. 44. Omura S, Kitao C, Tanaka H, Oiwa R, Takahashi Y. A new antibiotic, asukamycin, produced by Streptomyces. Journal of Antibiotic (Tokyo) 1976; 29:876-881. 45. Zakia S, Rahman AA, Gafur MA. Identification and in vitro antimicrobial activity of a compound isolated from Streptomyces species. Pakistan Journal of Biological Sciences 2001; 12:1523-1525. 46. Castillo UF, Gary AS, Eugene JF, et al. Munumbicins, wide-spectrum antibiotics produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans. Microbiology 2002; 148:2675-2685.