Χρωµατογραφία µοριακής διήθησης, αρχές και εφαρµογές

Χρωµατογραφία µοριακής διήθησης, αρχές και εφαρµογές Γιώργος Μαργαρίτης Φοιτητής Φαρµακευτικού 2010 Γενικά για τη χρωµατογραφία Εισαγωγή Χρωµατογραφία ονοµάζουµε το σύνολο των τεχνικών που χρησιµοποιούνται για το διαχωρισµό των συστατικών ενός δείγµατος στις οποίες τα συστατικά κατανέµονται σε δύο µη αναµειγνυόµενες φάσεις, η µία από τις οποίες είναι στατική ενώ η άλλη κινητή (oρισµός κατά IUPAC). Οι δύο φάσεις βρίσκονται στη χρωµατογραφική στήλη, και ο διαχωρισµός αυτός βασίζεται στις διαφορές, που υπάρχουν σε ορισµένες ιδιότητες των συστατικών ενός µείγµατος, όπως είναι το σηµείο ζέσεως (για πτητικές ενώσεις), η πολικότητα, τα ηλεκτρικά φορτία (για ιοντικές ενώσεις), το µέγεθος των µορίων κ.α. Οι διαφορές αυτές διαφοροποιούν τη σχετική φυσικοχηµική συγγένεια κάθε συστατικού προς τις δύο φάσεις της χρωµατογραφικής στήλης. Έτσι, η κινητή (ή φέρουσα φάση), διερχόµενη µέσα από τη στατική, προκαλεί διαφορετική µετατόπιση πάνω σε αυτή των συστατικών του µείγµατος, τα οποία διαχωρίζονται µεταξύ τους και συνήθως εξέρχονται από τη στήλη σε διαφορετικές χρονικές στιγµές, από όπου ανιχνεύονται αν στην έξοδο της στήλης υπάρχει σύστηµα ανιχνεύσεως και µετρήσεως της ποσότητας καθενός συστατικού (δυνατότητα ποσοτικού προσδιορισµού των συστατικών). Στις χρωµατογραφικές τεχνικές η κινητή φάση είναι υγρή ή αέρια ή υπερκρίσιµου ρευστού ενώ η στατική στερεή ή υγρή ακινητοποιηµένη (πάνω σε στερεό φορέα). Ταξινόµηση χρωµατογραφικών τεχνικών Η ταξινόµηση των χρωµατογραφικών τεχνικών µπορεί να γίνει µε τα εξής κριτήρια: 1

1. Με βάση τη φύση της κινητής και της στατικής φάσης. Οι χρωµατογραφικές τεχνικές διαχωρίζονται σε: υγρή χρωµατογραφία (LC ή HPLC), αέρια χρωµατογραφία (GC) και χρωµατογραφία υπερκρίσιµων ρευστών (SFC) ανάλογα µε το αν η κινητή φάση είναι υγρή, αέρια ή υπερκρίσιµου ρευστού. Ακόµα οι τάξεις αυτές υποδιαιρούνται ανάλογα µε το αν η στατική φάση είναι στερεή ή υγρή ακινητοποιηµένη πάνω σε σταθερό φορέα. 2. Με βάση το µηχανισµό διαχωρισµού. Χωρίζονται σε πέντε τάξεις ανάλογα µε το µηχανισµό, µε τον οποίο τα συστατικά του µείγµατος κατακρατούνται από τη στατική φάση: Χρωµατογραφία προσροφήσεως, χρωµατογραφία ιονανταλλαγής, χρωµατογραφία κατανοµής, χρωµατογραφία µοριακού αποκλεισµού, χρωµατογραφία συγγένειας. 3. Με βάση τη φυσική µορφή της στατικής φάσης. Ταξινοµούνται σε χρωµατογραφία στήλης, όταν η στατική φάση συγκρατείται σε στήλη, µέσα από την οποία η κινητή φάση διαβιβάζεται µε πίεση ή ρέει λόγω βαρύτητας και σε επίπεδη χρωµατογραφία, όταν η στατική φάση είναι µια λωρίδα χάρτη ή µια στιβάδα στερεού επιστρωµένη σε υάλινη, ή από άλλο υλικό, πλάκα και η υγρή κινητή φάση διέρχεται µέσα από τη στατική µε τη βοήθεια τριχοειδών δυνάµεων ή βαρύτητας. 4. Με βάση τον τρόπο εισαγωγής και κίνησης του δείγµατος. Ταξινοµούνται σε µετωπική χρωµατογραφία, χρωµατογραφία εκτοπίσεως και χρωµατογραφία εκλούσεως. Κινητή φάση Στατική φάση Μηχανισµός Μορφή στατικής φάσης Τεχνική χρωµατογραφίας Στήλη Χρωµατογραφία προσροφήσεως σε στήλη Προσρόφηση Λεπτή στιβάδα σε πλάκα Χρωµατογραφία λεπτής στιβάδας Χάρτης Χρωµατογραφία προσροφήσεως σε χάρτη µε προσροφητική ουσία Στερεό Ιονανταλλαγή Στήλη Χρωµατογραφία ιοναναταλλαγής σε στήλη Υγρό Χάρτης Χρωµατογραφία ιονοανταλλαγής σε χάρτη µε ιονοανταλλάκτες Μοριακός αποκλεισµός Στήλη Υγρή στερεή χρωµατογραφία µοριακού αποκλεισµού (ή χρωµατογραφία µοριακής διήθησης ή χρωµατογραφία µοριακής διαπερατότητας) Εκλεκτική αντίδραση (συγγένεια) Στήλη Χρωµατογραφία συγγένειας Υγρό (σε στερεό φορέα) Κατανοµή Στήλη Χρωµατογραφία κατανοµής σε στήλη Χάρτης Χρωµατογραφία κατανοµής σε χάρτη Στερεό Προσρόφηση Στήλη Αέρια στερεή χρωµατογραφία Αέριο Μοριακός αποκλεισµός Υγρό (σε Κατανοµή στερεό φορέα ή σε τριχοειδή σωλήνα) Στήλη Αέρια στερεή χρωµατογραφία µοριακού αποκλεισµού Στήλη (πληρωµένη ανοικτή τριχοειδής) ή Πίνακας 1 Αέρια υγρή χρωµατογραφία ή απλώς αέρια χρωµατογραφία Tαξινόµηση των βασικών τεχνικών χρωµατογραφίας 2

Ιστορικά στοιχεία για την χρωµατογραφία Η χρωµατογραφία ανακαλύφθηκε και χρησιµοποιήθηκε για πρώτη φορά από το Ρώσο βοτανολόγο Mikhail Semyonovich Tsvet το 1903, προσπαθώντας να διαχωρίσει τις χρωστικές των φύλλων (χλωροφύλλες). Εκχυλίζοντας τα πράσινα µέρη των φύλλων µε πετρελαϊκό αιθέρα και διαβίβασε το εκχύλισµα µέσα σε στήλη από κονιοποιηµένο CaCO 3, οπότε τα συστατικά διαχωρίστηκαν σε έγχρωµες ζώνες. Η τεχνική ονοµάστηκε διεθνώς χρωµατογραφία (chromatography) από τις ελληνικές λέξεις χρώµα και γράφω, αν και τα χρώµατα είναι καθαρά συµπτωµατικά και δεν έχουν σχέση µε τις αρχές της τεχνικής. Γύρω στο 1930 και 1940 νέες χρωµατογραφικές τεχνικές αναπτύσσονται. Με βραβείο Νόµπελ τιµούνται το 1952 και οι Martin και Synge για την ανακάλυψη της χρωµατογραφίας κατανοµής. Η εργασία των τελευταίων προκαλεί ταχεία εξέλιξη στις χρωµατογραφικές τεχνικές. Ανακαλύπτεται η χρωµατογραφίας σε χάρτη, η αέρια χρωµατογραφία (GC) και η υγρή χρωµατογραφία υψηλής ποιότητας (HPLC). Από τότε η χρωµατογραφία αναπτύσσεται ραγδαία καθώς ανακαλύπτονται νέες τεχνικές και βελτιώνεται η ποιότητα των υπαρχόντων. Η χρωµατογραφία µοριακού αποκλεισµού (size exclusion chromatography) ανακαλύφθηκε από τους Grant Henry Lathe και Colin R. Ruthven το 1955 που δούλευαν στο Queen Charlotte s Hospital στο Λονδίνο. Ο όρος ωστόσο χρωµατογραφία διάχυσης σε gel (gel permeation chromatography) αναφέρθηκε για πρώτη φορά από το J.C. Moore το 1964 που δούλευε για την εταιρία Dow Chemical Company και ο ίδιος ανέπτυξε τη χρωµατογραφία διάχυσης σε gel. Ουσιαστικά η ίδια τεχνική (µε µικρές διαφόρες) είναι και η χρωµατογραφία µοριακής διήθησης (gel filtration chromatography). Η λειτουργία της χρωµατογραφίας µοριακής διήθησης Γενικά για τη χρωµατογραφία µοριακής διήθησης α) Για την ονοµασία της χρωµατογραφίας µοριακής διήθησης. Η χρωµατογραφία µοριακής διήθησης ή χρωµατογραφία διήθησης σε πηκτή (gel filtration chromatography) αναφέρεται αλλιώς και ως µοριακό κοσκίνισµα (molecular sieving) ή ακόµα και σαν χρωµατογραφία µοριακής διάχυσης ή χρωµατογραφία διάχυσης σε πηκτή (gel permeation chromatography) που αναφέρεται στην ίδια βασική τεχνική µε µικρές διαφορές (ο αγγλικός όρος permeation αποδίδειται µε τη λέξη διαπερατότητα σε κάποια βιβλία). Λόγω του µηχανισµού της χρωµατογραφίας αυτής οι δύο προηγούµενες σχεδόν ίδιες τεχνικές αναφέρονται ως χρωµατογραφία µοριακής απόκλισης (size exclusion chromatography SEC) ή και απλούστερα ως χρωµατογραφία πηκτής (gel chromatography). β) Η βασική λειτουργία της χρωµατογραφίας µοριακής διήθησης. Ο πρωταρχικός σκοπός της χρωµατογραφίας µοριακής διήθησης είναι ο ταχύς διαχωρισµός µορίων ανάλογα µε το µέγεθος. Η χρωµατογραφία µοριακής διήθησης είναι µια χρωµατογραφία στήλης µε στερεή στατική φάση (gel) και υγρή κινητή φάση (υδατικό ή άλλο διάλυµα οργανικής ουσίας). Ο διαχωρισµός ενώσεων µε µεγάλο µοριακό βάρος γίνεται κυρίως σε στήλες που έχουν σαν υλικό πλήρωσης διάφορα gels (πηκτές). Οι διάφορες ποικιλίες των gels διαχωρίζουν τα µόρια µε βάση το µοριακό τους µέγεθος, µε βάση τη 3

µέθοδο του κοσκινίσµατος (sieving) ή της διήθησης (filtration). Συνεπώς η χρωµατογραφία µοριακής διήθησης χρησιµοποιείται στη Βιοχηµεία ενώ η χρωµατογραφία διάχυσης σε πήκτη στην Αναλυτική Χηµεία από τους χηµικούς που ασχολούνται µε τα πολυµερή. Συνήθως στη χρωµατογραφία µοριακής διήθησης χρησιµοποιείται υδατικά διαλύµατα ενώ στη χρωµατογραφία διάχυσης σε πήκτη διαλύµατα µε οργανικό διαλύτη. Η προσρόφηση και τα ηλεκτρικά φορτία παίζουν σπουδαίο ρόλο σε αυτούς τους διαχωρισµούς. Τα gels έχουν πολύ ανοιχτά τρισδιάστατα επίπεδα πλέγµατα, που σχηµατίζονται µε διασταυρούµενους συνδυασµούς από µεγάλες αλυσίδες. Τα περισσότερα από αυτά τα gels, έχουν πολικές οµάδες ικανές να προσροφούν νερό η άλλους πολικούς διαλύτες. Μερικά επίσης από αυτά είναι ικανά να προσροφούν και µη πολικούς διαλύτες. Σε κάθε περίπτωση, η προσρόφηση αποτελεί άνοιγµα της δοµής ή διόγκωση και δηµιουργεί διάκενα µέσα στο gel. Αυτά τα διάκενα ή οπές έχουν κάποιο συγκεκριµένο εύρος διαµέτρων. Ανάλογα µε την έκταση των διασταυρούµενων δεσµών του gel υπάρχει ένα οριακό µέγεθος (exclusion limit) για το µόριο, που µπορεί να εισχωρήσει στο gel. Τα µεγαλύτερα µόρια διέρχονται από τη στήλη δίχως να επιβραδύνονται, γιατί δεν µπορούν να εισχωρίσουν στο gel. Τα µικρότερα όµως µόρια, εισχωρούν στο gel κατά ένα βαθµό που προσδιορίζεται από το µέγεθος τους. Με κατάλληλη εκλογή του gel (αναφέρονται παρακάτω είδη gel και τα χαρακτηριστικά τους) µπορούµε να διαχωρίσουµε µόρια που έχουν µοριακό βάρος από 1000 µέχρι µερικά εκατοµµύρια daltons. γ) Αποτελέσµατα της χρωµατογραφίας µοριακής διήθησης. Το αποτέλεσµα της χρωµατογραφίας µοριακής διήθησης είναι ο διαχωρισµός των µορίων µε βάση το µοριακό τους βάρος όπως φαίνεται στο σχεδιάγραµµα. Σχήµα 2 Ένα απλό σχήµα για τη παρουσίαση της λειτουργίας της χρωµατογραφίας µοριακής διήθησης. Περιγράφει πως τα µικρά µόρια εισχωρούν στις περισσότερες οπές του gel, τα µεσαία σε µερικές ενώ τα µικρά σε λίγες και κατά συνέπεια τα µεγάλα µόρια εξέρχονται πρώτα µε το υγρό έκλουσης τα µεσαία δεύτερα και τα µικρά τρίτα. 4

Σχήµα 3 Στα παραπάνω χρωµατογραφήµατα φαίνεται στον οριζόντιο άξονα ο όγκος του υγρού που εκλούεται από τη χρωµατογραφική στήλη ενώ στον κάθετο η ένταση του χρώµατος νινυδρίνης (ισοδυνάµου λευκίνης, σε nm). Τα σχεδιαγράµµατα αυτά δείχνουν το διαχωρισµό των αµινοξέων (που γίνεται συναρτήσει του όγκου έκλουσης) και σχετικών ενώσεων σε Dowex 50-Χ4 µε στήλη 0,9 x 150 cm. Log(MB) Ve / V0 Σχήµα 4 Γραφική παράσταση log (MB) συναρτήσει του λόγου Ve / V0 όπου Ve είναι ο εκλουόµενος όγκος προς τον αρχικό. Παρατηρούµε ότι η συνάρτηση είναι γραµµική και µπορεί να χρησιµοποιηθεί σαν καµπύλη αναφοράς για τον προσδιορισµό του µοριακοού βάρους µιας άγνωστης ένωσης. 5

Η τεχνική της χρωµατογραφίας µοριακής διήθησης Παρασκευή της στήλης. Οι στήλες gel παρασκευάζονται µε τον ίδιο τρόπο που παρασκευάζονται και οι στήλες ιοναναταλλαγής. Τα σωµατίδια του gel πρέπει πρώτα να διογκωθούν µε κατεργασία µε το διαλύτη, που διαρκή λίγες ώρες για gels µε πυκνούς διασταυρωµένους, και µία ή περισσότερες µέρες για gels µε αραιούς. Τα λεπτά σωµατίδια αφαιρούνται µε απόχυση. Το στρώµα του gel στηρίζεται στη στήλη σε ένα τεµάχιο υαλοβάµβακα ή σε ένα νάυλον δίχτυ. Το διογκωµένο gel εισάγεται στη στήλη µε µορφή ενός πυκνόρευστου υγρού και αφήνεται να ισορροπήσει, ενώ προσέχουµε να µην εισέλθουν φυσαλίδες αέρα στην κλίνη και η επιφάνεια του υγρού να µην κατέβει ποτέ κάτω από την επιφάνεια της κορυφής του gel. Λειτουργία της στήλης. Η εισαγωγή του δείγµατος σε µια στήλη gel πρέπει να γίνεται προσεκτικά για να αποφεύγονται οι διαταραχές. Επειδή στη χρωµατογραφία αυτή χρησιµοποιούνται µεγάλου όγκου δείγµατα, είναι δύσκολο ν αρχίζουµε την έκλουση χωρίς την προηγούµενη ανάµιξη του δείγµατος και του συστατικού έκλουσης. Πολλές φορές προσθέτουµε στο δείγµα µια ουσία που δεν προκαλεί διαταραχή της κλίνης, όπως είναι το χλωριούχο νάτριο, για να αυξάνει την πυκνότητά του. Η έκλουση γίνεται συνήθως µε σταθερή υδροστατική πίεση για να διατηρείται σταθερή η ταχύτητα ροής του φέροντος συστατικού. Ανίχνευση. Οι συνηθισµένες µέθοδοι ανίχνευσης περιλαµβάνουν την συλλογή και ανάλυση κλασµάτων, καθώς και τη συνεχή ροή του υγρού µέσα από κυψελίδες, στις οποίες µετράµε την απορρόφηση UV, το δείκτη διάθλασης ή τη ραδιενέργεια. Είδη Gels Sephadex. Για τις πρωτεΐνες και τα περισσότερα µεγάλα µόρια βιοχηµικού ενδιαφέροντος, το Sephadex είναι το πιο συνηθισµένο από τα gels. Το Sephadex παρασκευάζεται από τις δεξτράνες των πολυσακχαριτών, που παράγονται µε την επίδραση ενός βακτηριδίου στο καλαµοσάκχαρο. Κάθε µόριο γλυκόζης περιέχει τρεις υδροξυλοµάδες που δίνουν στην δεξτράνη ένα πολικό χαρακτήρα. Η αντίδραση των διασταυρώσεων συµπληρώνεται µε την επιχλωρυδρίνη. Με κατάλληλες συνθήκες µπορούµε να ελέγξουµε τον αριθµό των διασταυρούµενων δεσµών και κατά συνέπεια το µέγεθος των πόρων. Τα Sephadex gels είναι αδιάλυτα στο νερό και είναι σταθερά στις βάσεις, στα ασθενή οξέα και στα ήπια αναγωγικά και οξειδωτικά µέσα. Παρατεταµένη έκθεση του Sephadex στα HCl 0,1 Ν ή σε ισχυρά οξειδωτικά προκαλεί σπάσιµο των κόκκων του. Θερµοκρασίες πάνω από 120 C θα πρέπει επίσης να αποφεύγεται. Εκτός από το νερό στο οποίο συνήθως χρησιµοποιούνται τα Sephadex διογκώνονται στη γλυκόζη, στο διµεθυλοσουλφοξείδιο και στο φορµαµίδιο, αλλά όχι στο παγόµορφο οξικό οξύ, τη µεθανόλη και την αιθανόλη. Τα gels αυτά ταξινοµούνται ανάλογα µε το ποσό του ανακτούµενου νερού, που είναι µια συνάρτηση της χαλαρότητας της δοµής ή του αριθµού των διασταυρούµενων δεσµών. Bio-Gel. Μια χηµικά αδρανέστερη σειρά από gels, που ονοµάζεται Bio-Gel P, παρασκευάζεται από τον συµπολυµερισµό του ακρυλαµιδίου και του Ν,Ν µεθυλενο-δι- 6

ακρυλαµίδιου. Το πολυµερές αυτό είναι αδιάλυτο στο νερό και στους συνήθεις οργανικούς διαλύτες και χρησιµοποιείται σε µια περιοχή ph από 2 έως 11. Οι ισχυρές βάσεις µπορούν να υδρολύσουν τις αµινοµάδες. Ο αδρανής σκελετός από πολυακρυλαµίδιο ελαχιστοποιεί τη δυνατότητα προσρόφησης πολικών µορίων. Στο εµπόριο υπάρχουν 10 διαφορετικά είδη Bio-Gel P, διαφορετικού µοριακού βάρους που κυµαίνεται από 1.800 έως 400.000 daltons. Agarose. Για µοριακά βάρη πάνω από 500.000 daltons τα gels από agarose (Stepharose και Bio-Gel A) είναι τα πιο αποτελεσµατικά. Τα gels αυτά φτιάχνονται από µια πολύγαλακτο-πυρανόζη µε τη µορφή µαλακών σφαιριδίων που δεν µπορούν να αντέξουν σε µεγάλες πιέσεις. Πορώδες Γυαλί. Για µεγάλες πιέσεις η ακαµψία των σωµατιδίων του πορώδους γυαλιού είναι ένα σηµαντικό πλεονέκτηµα. Ανάλογα µε το µέγεθος των µορίων υπάρχουν στο εµπόριο πολλά είδη από πορώδες γυαλί, όπως το Porasil και το Bio-Glas. Styragel. Για διαχωρισµούς σε µη υδατικά διαλύµατα είναι απαραίτητο ένα gel που να διογκώνεται σε οργανικούς διαλύτες. Το Styragel είναι ένα άκαµπτο gel πολυστυρολίου µε διασταυρούµενους δεσµούς, που παρασκευάζονται µε διαφορετική διάµετρο πόρων, όπως τα άλλα gels. Είναι χρήσιµο σε θερµοκρασίες έως 150 C µε διάφορους οργανικούς διαλύτες όπως βενζόλιο, χλωροφόρµιο, κρεζόλη κτλ αλλά όχι µε νερό, ακετόνη ή αλκοόλες. Τα όρια διαχωρισµού µε Styragel, όσον αναφορά το µοριακό βάρος, κυµαίνονται από 1600 έως 40.000.000 daltons. Η ακαµψία του Styragel επιτρέπει την χρήση του σε µεγάλες πιέσεις σε στήλες µε µεγάλη απόδοση. Θεωρητικές αρχές της χρωµατογραφίας µοριακής διήθησης Η Ιδανική Διεργασία. Υποθέτουµε ότι στο εσωτερικό ενός σωµατιδίου του gel αποτελείται από οπές κωνικού σχήµατος, που όλες έχουν το ίδιο µέγεθος και σχήµα. Τα µεγάλα µόρια δεν εισέρχονται καθόλου στις οπές των σωµατιδίων του gel ή εισέρχονται στις κωνικές οπές, σε βάθος που εξαρτάται από το µέγεθος του µορίου. Τα µικρά µόρια ή τα απλά ιόντα κινούνται ελεύθερα σε όλα τα µέρη του εσωτερικού του gel. Συνεπώς, το διαθέσιµο κλάσµα του εσωτερικού όγκου του gel για ένα ορισµένο µόριο ποικίλει από 0 µέχρι 1 και είναι συνάρτηση του λόγου της διαµέτρου του µορίου ως προς τη διάµετρο των πόρων. Σε κάθε στήλη από gel υπάρχουν δύο διαλύτες εκείνος που βρίσκεται στο εσωτερικό του gel και έχει όγκο V i, και εκείνος που βρίσκεται εξωτερικά των σωµατιδίων του gel και έχει όγκο V 0. Υποθέτουµε ότι τα µόνα διαφορετικά χαρακτηριστικά της στήλης προκύπτουν από τη µεταβολή στο κλάσµα του διαθέσιµου όγκου V i για τα διαφορετικού µεγέθους µόρια. Για ένα πολύ µεγάλο µόριο που δεν εισέρχεται καθόλου στο εσωτερικού του gel, ισχύει η σχέση: V e = V 0, µε V e να είναι ο όγκος έκλουσης. Για τα µικρότερα µόρια που εισχωρούν στις κωνικές τοµές του gel ισχύει: V e = V 0 + KV i όπου Κ είναι ο συντελεστής κατανοµής που µπορεί να οριστεί µε πολλούς τρόπους. Το Κ είναι ο λόγος της µέσης συγκέντρωσης της ουσίας στο εξωτερικό του gel. Πρέπει να τονιστεί ότι στο διαθέσιµο για την ουσία τµήµα του εσωτερικού όγκου, η συγκέντρωση της ουσίας 7

είναι η ίδια και στο εξωτερικό τµήµα του εσωτερικού όγκου, η συγκέντρωση της ουσίας είναι η ίδια όπως και στο εξωτερικό τµήµα, ενώ στον υπόλοιπο εσωτερικό όγκο είναι µηδέν. Το Κ ορίζεται επίσης σαν το διαθέσιµο για την ουσία κλάσµα του εσωτερικού όγκου του διαλύτη, συναρτήσει µεγεθών που µετρούνται πειραµατικά δίνεται από τη σχέση, Κ = (V e V 0 ) / V i To V i µπορεί να προσδιοριστεί από το βάρους του στεγνού gel έστω α και το βάρος του ανακτώµενου νερού W R : V i = αw R Αν ο µοναδικός µηχανισµός ήταν το κοσκίνισµα θα έπρεπε το Κ να είχε τιµές µεταξύ 0 και 1. Μια ενδιαφέρουσα συνέπεια αυτού του µηχανισµού, είναι ότι στη χρωµατογραφία διήθησης µε gel ο όγκος έκλουσης είναι συνήθως µικρότερος από τον κενό όγκο της στήλης, ενώ στα άλλα είδη χρωµατογραφίας είναι πάντοτε µεγαλύτερος από τον κενό όγκο της στήλης λόγω του µηχανισµού συγκράτησης. Στη χρωµατογραφία διήθησης σε gel η συγκράτηση έχει αντικατασταθεί από την τυπική απόκλιση. Δυο ουσίες που έχουν τιµές Κ ίσες µε Κ α και Κ β θα έχουν όγκους έκλουσης V 0 + K α V i και V 0 + K β V i αντίστοιχα και θα διαχωριστούν λόγω της διαφοράς τους (Κ β Κ α ) V i. Αν οι ζώνες έκλουσης δε διευρύνονται από τον όγκο του δείγµατος που χρησιµοποιείται τότε ο µέγιστος όγκος του δείγµατος για πλήρη διαχωρισµό είναι: V s < (Κ β Κ α ) V i. Η διεργασία της διεύρυνσης των ζωνών έκλουσης στη χρωµατογραφία µοριακής διήθησης είναι η ίδια µε τη διεργασία που συµβαίνει σε όλα τα είδη χρωµατογραφίας. Για ιδανική απόδοση µιας στήλης µε gel, χρησιµοποιούνται οµοιόµορφα γεµισµένες στήλες µε µικρά σωµατίδια και µικρές ταχύτητες ροής. Μη ιδανικές συνθήκες. Στην ιδανική διεργασία της χρωµατογραφίας µοριακής διήθησης, έχουµε υποθέσει ότι όλοι οι διαχωρισµοί οφείλονται σε γεωµετρικούς παράγοντες. Η απλή θεωρία που στηρίζεται στη µερική απόκλιση, είναι µόνο µια προσέγγιση της πραγµατικής φύσης της διεργασίας. Υπάρχουν βέβαια και άλλοι µηχανισµοί εκτός από το κοσκίνισµα, που προξενούν απόκλιση από την ιδανική συµπεριφορά. Ο διαλύτης στο πρώτο προσροφητικό στρώµα της εσωτερικής επιφάνειας δεν είναι διαθέσιµος στις ουσίες, ανεξάρτητα από το µέγεθός τους. Αυτό εξηγεί φαινοµενικά γιατί πολλά µικρά µόρια έχουν τιµές Κ περίπου 0,9 αντί για 1 που ήταν αναµενόµενο. Άλλα µόρια έχουν τιµές Κ µεγαλύτερες από τη µονάδα, οφειλόµενες στις µονάδες προσρόφησης που τα επιβραδύνουν στις εσωτερικές επιφάνειες. Φαινόµενα προσρόφησης παρατηρούνται µε ουσίες που µπορούν να αντιδράσουν ή να σχηµατίσουν σύµπλοκα µε τις υδροξυλοµάδες του Sephadex, για παράδειγµα µε υδροξείδιο του νατρίου, µε τετραβοριούχο νάτριο, µε αρωµατικές και ετεροκυκλικές ενώσεις κ.α. Οι τιµές του Κ για ισχυρά προσροφήµενες ουσίες µπορούν να φτάσουν το 20. Ένας άλλος ακόµη µηχανισµός στη χρωµατογραφία µοριακής διήθησης φαίνεται να είναι η περιορισµένη διάχυση της ουσίας µέσα στους πόρους. Ρυθµός Ροής. Οι ψηλές, λεπτές χρωµατογραφικές στήλες έχουν αργότερους ρυθµούς ροής από ότι κοντύτερες µε µεγαλύτερες διαµέτρους. Ανάλογα όµως και µε το χρησιµοποιούµενο υλικό ο ρυθµός ροής αλλάζει. Σαν γενικός κανόνας, η ανάλυση (ποιότητα) µειώνεται µε την αύξηση του ρυθµού ροής. Υψηλότερη ανάλυση πετυχαίνουµε όταν ο ρυθµός ροής 8

διατηρείται µεταξύ 2 και 10 cm ανά ώρα. Με αύξηση της διαµέτρου της στήλης αυξάνεται και ο ρυθµός ροής. Αν όµως ο ρυθµός ροής είναι πολύ µικρός, η διάχυση θα µειώσει την ανάλυση. Γενικά ισχύει οι τύποι ότι: Γραµµικός ρυθµός ροής (cm/h) = [ογκοµετρικός ρυθµός ροής (ml/min) x 60] / [εµβαδόν διαµέτρου στήλης(cm 2 )] Υ = Ζ x 60 x Εφαρµογές της χρωµατογραφίας µοριακής διήθησης Η χρωµατογραφία µοριακής διήθησης έχει ως στόχο, όπως αναφέρθηκε, το ταχύ διαχωρισµό µορίων (κυρίως µακροµορίων) ανάλογα µε το µέγεθός τους. Εποµένως η χρωµατογραφία µοριακής διήθησης χρησιµοποιείται εν γένει από τη βιοχηµεία για το διαχωρισµό πρωτεϊνών, πεπτιδίων, νουκλεϊκών οξέων, πολυσακχαριτών, ενζύµων ορµονών κτλ. Από την Αναλυτική Χηµεία µπορεί να χρησιµοποιηθεί για το καθορισµό κατανοµής βάρους πολυµερών σε µείγµα µε πολυµερή. Μερικές εξειδικευµένες εφαρµογές της είναι οι ακόλουθες. Αφαλάτωση. Ένα από τα πιο κοινά προβλήµατα διαχωρισµού στη βιοχηµεία είναι η αφαίρεση αλάτων και µικρών µορίων από τα µακροµόρια. Η µεγάλη διαφορά στους συντελεστές κατανοµής γι' αυτό το διαχωρισµό κάνει δυνατή τη χρησιµοποίηση απλών στηλών µε µεγάλες ταχύτητες ροής. Για παράδειγµα, µε Sephadex G-25 ουσίες πού έχουν µοριακό βάρος πάνω από 5.000 daltons, εκλούονται σ' έναν όγκο V 0. Τα µικρότερα µόρια µε µοριακό βάρος κάτω από 1000 daltons, θα εκλούονται µετά τα µακροµόρια µε µια σειρά αντίστροφη µε το µέγεθος τους. Ένα από τα πλεονεκτήµατα αυτής της µεθόδου αφαλάτωσης είναι ότι τα µακροµόρια εκλούονται βασικά χωρίς αραίωση. Συµπύκνωση. Αραιά διαλύµατα µακροµορίων µε µοριακά βάρη πάνω από το όριο απόκλισης, µπορούν να συµπυκνωθούν χρησιµοποιώντας την υγροσκοπική φύση τού ξηρού gel. Το Sephadex G-200 προσροφά νερό σε εικοσαπλάσια ποσότητα από το βάρος του, αλλά προτιµούµε κυρίως το Sephadex G-25 πού ή δράση του είναι πιο ταχεία. Επειδή τα άλατα και τα µικρά µόρια απορροφούνται στην ίδια έκταση, όπως και το νερό, οι συγκεντρώσεις τους στον υπερκείµενο διαλύτη, µαζί µε την ιονική ισχύ και το ph του µακροµοριακού διαλύµατος, παραµένουν βασικά αµετάβλητα. Αυτό είναι ένα βασικό πλεονέκτηµα στο διαχωρισµό των πρωτεϊνών, πού µετουσιώνονται εύκολα από τις µεταβολές της σύστασης τού διαλύµατος και της θερµοκρασίας. Κλασµάτωση. Ο πλήρης διαχωρισµός ενός µείγµατος από συγγενείς ενώσεις (όσον άφορα το µοριακό βάρος) που έχουν µικρές διαφορές στις τιµές του Κ, απαιτεί µεγάλες στήλες, µικρές ταχύτητες ροής και µεγάλους χρόνους. Οπωσδήποτε, η κατανοµή των µοριακών βαρών σ' ένα περίπλοκο µείγµα είναι συνήθως µια επαρκής πληροφορία για να χαρακτηρίσουµε το δείγµα ή για να πάρουµε µια προσεγγιστική ιδέα της σύστασης του. Έχει παρατηρηθεί, και προβλέπεται από τη θεωρία, ότι ό όγκος έκλουσης σχετίζεται µε το µοριακό βάρος µ' έναν απλό τρόπο: V e = Α Β log(μβ) 9

Όπου ΜΒ είναι το µοριακό βάρος, Α και Β σταθερές, που οι τιµές τους προσδιορίζονται από τη γραφική παράσταση του V e έναντι του log(mb) για ορισµένα γνωστά συστατικά. Η εξίσωση αυτή αληθεύει για µια µεγάλη περιοχή µοριακών βαρών, αρκεί οι ουσίες να είναι συγγενείς. Οι τιµές των Α και Β πρέπει να προσδιορίζονται για κάθε στήλη, κάθε σειρά συνθηκών λειτουργίας και για διάφορες οµάδες συστατικών. Μερικά χαρακτηριστικά δείγµατα δίνονται στην ακόλουθη γραφικά παράσταση. Σχήµα 5 Γραφική παράσταση της σχέση µεταξύ του όγκου έκλουσης και των µοριακών βαρών πρωτεϊνών σε στήλη 2,5 x 50 cm και σε ph = 7,5. 10