ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ ΤΗΣ L-DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΝΕΟΥ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ BCL2L12 ΣΤΟ ΓΑΣΤΡΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΟ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ (Περίληψη) ΚΟΡΜΠΑΚΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΧΗΜΙΚΟΣ ΑΘΗΝΑ 2009
H έρευνα ζυγσρημαηοδοηήθηκε: 75% της Δημόσιας Δαπάνης από την Ευρωπαϊκή "Ενωση Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο, 25% της Δημόσιας Δαπάνης από το Ελληνικό Δημόσιο Υπουργείο Ανάπτυξης Γενική Γραμματεία "Ερευνας και Τεχνολογίας, και από τον Ιδιωτικό Τομέα - ΕLΡΕΝ Α.Ε, στο πλαίσιο του Μέτρου 8.3 του Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα Γ" Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης. Έργο Π.ΕΝ.Ε.Δ. 2003 με κωδικό ΓΓΕΤ: 03ΕΔ 178
Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή: Σκορίλας Ανδρέας, Αναπλ. Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. (Επιβλέπων) Φραγκούλης Γ. Εμμανουήλ, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Σίδερης Διαμάντης, Αναπλ. Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή: Φραγκούλης Γ. Εμμανουήλ, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Σκορίλας Ανδρέας, Αναπλ. Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Σίδερης Διαμάντης, Αναπλ. Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Γουργιώτης Δημήτριος, Αναπλ. Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, Ε.Κ.Π.Α. Παπαδόπουλος Ιορδάνης, Αναπλ. Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, Ε.Κ.Π.Α. Βασιλακοπούλου Διδώ, Επίκ. Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α. Κλέτσας Δημήτριος, Διευθυντής Ερευνών, Ινστιτούτο Βιολογίας, ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος 3
ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΙΣΟΜΟΡΦΩΝ ΤΗΣ L-DOPA ΑΠΟΚΑΡΒΟΞΥΛΑΣΗΣ ΚΑΙ ΤΟΥ ΝΕΟΥ ΑΠΟΠΤΩΤΙΚΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ BCL2L12 ΣΤΟ ΓΑΣΤΡΙΚΟ ΚΑΡΚΙΝΟ Κορμπάκης Δημήτριος ΠΕΡΙΛΗΨΗ O καρκίνος του στομάχου αποτελεί μια κοινή κατηγορία νεοπλασιών, με συχνότητα εμφάνισης που ποικίλλει σημαντικά σε παγκόσμιο επίπεδο. Οι κακοήθεις όγκοι του στομάχου είναι συνήθως αδενοκαρκινώματα, τα οποία δύσκολα διαγιγνώσκονται σε πρώιμο στάδιο εξαιτίας της απουσίας ειδικών συμπτωμάτων. Η ανακάλυψη νέων καρκινικών δεικτών για έγκαιρη διάγνωση, πρόγνωση και πρόβλεψη ανταπόκρισης στις θεραπευτικές αγωγές είναι επιτακτική ανάγκη. Το γονίδιο DDC, εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 7p11 και κωδικοποιεί το ένζυμο L-Ντόπα αποκαρβοξυλάση (DDC, Ddc). Το γονίδιο της DDC παρουσιάζει διάφορα προτόντα εναλλακτικού ματίσματος, ένα εκ των οποίων είναι και το alt- DDC. Στο συγκεκριμένο μετάγραφο απαλείφονται τα εξώνια 10-15, ενώ εμφανίζεται ένα δέκατο εξώνιο εναλλακτικής νουκλεοδιτικής αλληλουχίας. Το μετάγραφο alt-ddc κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 338 aa και μοριακού βάρους 37,1 kda. Η μελέτη των επιπέδων mrna του γονιδίου DDC αποκάλυψε την αυξημένη έκφραση του γονιδίου σε νευροενδοκρινείς όγκους, όπως το φαιοχρωμοκύττωμα, το νευροβλάστωμα και το γαγγλιονευροβλάστωμα. Ταυτόχρονα, στο επίπεδο των πρωτετνών παρατηρήθηκε αυξημένη ενζυμική ενεργότητα της πρωτεΐνης DDC. Επιπλέον, υπερέκφραση του γονιδίου DDC σε επίπεδο mrna συναντάται σε διάσπαρτους καρκινικούς όγκους της περιτονατκής κοιλότητας. Το γονίδιο BCL2L12 (ΒCL2-like 12) εντοπίζεται στην χρωμοσωμική περιοχή 19q13.3 και αποτελεί ένα νέο μέλος της BCL2 οικογένειας των αποπτωτικών γονιδίων. Το γονίδιο διαθέτει ένα προτόν εναλλακτικού ματίσματος, στο οποίο λείπει το τρίτο εξώνιο. Η έκφραση του BCL2L12 σε επίπεδο mrna έχει αναλυθεί κυρίως σε νεοπλασίες του μαστού και του παχέος εντέρου και βρέθηκε να αποτελεί έναν στατιστικά σημαντικό μοριακό δείκτη πρόγνωσης. Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει στη μελέτη και την κλινική αξιολόγηση των ισομορφών mrna των γονιδίων DDC και BCL2L12 στον καρκίνο 4
του στομάχου. H πιθανή μελλοντική εφαρμογή τους, ως μοριακών δεικτών του γαστρικού καρκίνου, θα συμβάλλει στην καλύτερη πρόγνωση και σταδιοποίηση της νόσου, καθώς και στην επιλογή της καταλληλότερης συστηματικής χημειοθεραπευτικής αγωγής. Στα πλαίσια της παρούσας μελέτης, συλλέχθηκαν καρκινικά και φυσιολογικά δείγματα στομάχου, ενώ κατασκευάστηκε λεπτομερής βάση δεδομένων με κλινικοπαθολογικά στοιχεία για κάθε ασθενή. Ακολούθως, έλαβαν χώρα η σύνθλιψη και η ομογενοποίησή των δειγμάτων ιστού, η απομόνωση του ολικού RNA και ο έλεγχος της ποιότητάς του, καθώς και η σύνθεση του συμπληρωματικού DNA (cdna) με την μέθοδο της αντίστροφης μεταγραφής. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της έκφρασης διαφόρων ισομορφών mrna των γονιδίων DDC και BCL2L12, με τη μέθοδο της συμβατικής PCR. Σαυτόχρονα, αναπτύχθηκε μεθοδολογία πολλαπλής (multiplex) ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο (qreal-time PCR) με χρήση ανιχνευτών TaqMan, για τον σχετικό ποσοτικό προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης του εναλλακτικού μεταγράφου BCL2L12-Α στα δείγματα ιστού. Ακολούθησε εκτενής βιοστατιστική ανάλυση. Παράλληλα, από έναν αριθμό δειγμάτων στομάχου απομονώθηκε η ολική πρωτεΐνη και αφού προσδιορίστηκε η συγκέντρωσή της, με την μέθοδο Bradford, πραγματοποιήθηκε στύπωση Western και ανοσοεντοπισμός της πρωτεΐνης alt-ddc. H ειδικότητα του ειδικού αντισώματος διερευνήθηκε με φασματομετρία μάζας. Ο προσδιορισμός των επιπέδων mrna των δύο γονιδίων DDC και BCL2L12 στον καρκίνο του στομάχου, υπέδειξε την επακόλουθη μελέτη της απόκρισης της καρκινικής κυτταρικής σειράς του στομάχου, AGS, σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. H επίδραση αντικαρκινικών παραγόντων, όπως η φθοροουρακίλη, η λευκοβορίνη, η φθοροουρακίλη σε συνδυασμό με λευκοβορίνη, η ιρινοτεκάνη, η σιπλατίνη, το ετοποσίδιο και η ταξόλη, στη βιωσιμότητα των κυττάρων AGS μελετήθηκε με τη μέθοδο ΜTT. Ύστερα, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της έκφρασης σε επίπεδο mrna των γονιδίων BCL2L12 και DDC, καθώς και διαφόρων άλλων γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση (BCL2, BAX, FAS, BCLX). H έκφραση όλων των γονιδίων αναλύθηκε με συμβατική PCR και επιπρόσθετα στις περιπτώσεις των BCL2L12, DDC, BCL2 και BAX εφαρμόστηκε η μεθοδολογία ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (qreal-time PCR) με την τεχνική SYBR Green I. 5
Συνολικά, αναλύθηκαν 97 φυσιολογικά και καρκινικά δείγματα ιστών στομάχου. Τα σημαντικότερα αποτελέσματα αφορούν την αυξημένη, σε στατιστικά σημαντικό βαθμό, έκφραση του μετάγραφου BCL2L12-A στους καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τους παρακείμενους μη καρκινικούς. Ο προσδιορισμός έγινε τόσο με RT-PCR όσο και την αναπτυχθείσα για το σκοπό αυτό μέθοδο Multiplex TaqMan qreal-time PCR για το γονίδιο BCL2L12. Ακόμη, παρατηρήθηκε θετική σχέση με το σύστημα TNM και τον βαθμό διαφοροποίησης, ενώ κατά την ανάλυση επιβίωσης οι ασθενείς με αρνητικούς για την έκφραση του BCL2L12-Α καρκίνους επιβίωσαν για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα από εκείνους που παρουσιάζουν θετική έκφραση του BCL2L12-Α. Tα μετάγραφα νευρικού και μη νευρικού τύπου του γονιδίου DDC παρουσίασαν μικρές διαφοροποιήσεις μεταξύ των δειγμάτων ιστού. Το μετάγραφο alt-ddc δε βρέθηκε να εκφράζεται στην πλειονότητα των ιστών, ενώ παρουσίασε αυξημένη έκφραση στα καρκινικά δείγματα. Τα πειράματα ανοσοστύπωσης κατέδειξαν πως τα επίπεδα της πρωτεΐνης alt-ddc στο συγκεκριμένο τύπο ιστού ποικίλλουν και συσχετίζονται με τα αντίστοιχα επίπεδα mrna. H μελέτη της επίδρασης χημειοθεραπευτικών παραγόντων στα καρκινικά κύτταρα στομάχου AGS με τη συμβατική PCR αποκάλυψε σημαντικές μεταβολές στην έκφραση του γονίδιου BCL2L12. Ειδικά στην περίπτωση της ιρινοτεκάνης και της ταξόλης, παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων mrna του γονιδίου. Ακόμη μεγαλύτερες μεταβολές παρατηρήθηκαν στα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου DDC σχεδόν σε όλα τα φάρμακα που χρησιμοποιήθηκαν. Ιδιαίτερα οι επωάσεις των κυττάρων με φθοροουρακίλη και ιρινοτεκάνη επέφεραν μεγάλη μείωση των επιπέδων mrna του γονιδίου. Επιπλέον, οι μεθοδολογίες ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου (qreal-time PCR), για τα γονίδια DDC και BCL2L12 επιβεβαίωσαν την πλειονότητα των ευρημάτων της μεθόδου RT-PCR. Μέρος των παραπάνω αποτελεσμάτων δημοσιεύτηκαν στο διεθνές επιστημονικό περιοδικό με κριτές Tumor Biology (Korbakis D and Scorilas A, 30(2):100-7 2009). Εν κατακλείδι, τα ευρήματα της παρούσας εργασίας ανέδειξαν τη σημασία των γονιδίων BCL2L12 και DDC στη μελέτη του γαστρικού καρκίνου και προτείνουν την πιθανή εφαρμογή τους στη διάγνωση, την πρόγνωση και την ακριβέστερη σταδιοποίηση της νόσου, καθώς και στην επιλογή της καταλληλότερης χημειοθεραπευτικής αγωγής με μελλοντικό στόχο την αποτελεσματικότερη αντιμετώπισή της. 6