PLATELIA Aspergillus IgG 1 Πλακέτα

PLATELIA Aspergillus IgG 1 Πλακέτα 96 62783 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ IgG ΕΝΑΝΤΙ ΤΟΥ ΑΣΠΕΡΓΙΛΛΟΥ ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΟΡΟ Ή ΠΛΑΣΜΑ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ 881123 2013/11 1- ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το Platelia Aspergillus IgG είναι μια έμμεση ανοσοενζυμική τεχνική με μικροπλάκες για την ανίχνευση αντισωμάτων IgG έναντι του Ασπέργιλλου σε ανθρώπινο ορό ή πλάσμα. 2- ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗ ΧΡΗΣΗ Το Platelia Aspergillus IgG είναι μια δοκιμασία η οποία αν ερμηνευτεί βάσει των κλινικών και θεραπευτικών δεδομένων του ασθενή και εφαρμοστεί σε συνδυασμό με άλλες τεχνικές διάγνωσης, όπως οι ακτινολογικές, οι κυτταρολογικές, οι ανοσολογικές και οι μυκητολογικές εξετάσεις, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάγνωση παθολογιών που οφείλονται στον Ασπέργιλλο. 3- ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΝ Άτομα με ανοσολογική επάρκεια μπορεί να παρουσιάζουν διάφορες χρόνιες παθολογίες που οφείλονται στον Ασπέργιλλο, η διάγνωση των οποίων συχνά είναι δύσκολη. Η αιτία αλλεργικών εκδηλώσεων όπως το άσθμα και η αλλεργική βρογχοπνευμονική ασπεργίλλωση (ABPA), η οποία είναι ο πιο σοβαρός κλινικά τύπος 4, 8, είναι μια διαδικασία ευαισθητοποίησης σε μύκητες. Οι που πάσχουν από κυστική ίνωση αποτελούν έναν πληθυσμό εκτεθειμένο στον κίνδυνο της ABPA και παρακολουθούνται συχνά γι' αυτή τη διάγνωση 1, 2. Σε άτομα που έχουν εισπνεύσει πολύ μεγάλες ποσότητες σπορίων, μπορεί να εμφανιστεί εξωγενής κυψελίτιδα, οι πιο γνωστές μορφές της οποίας είναι η νόσος των πτηνοτρόφων και η νόσος «πνεύμονας των αγροτών». Το ασπεργίλλωμα αποτελεί την πιο τυπική μη αλλεργική χρόνια παθολογία που είναι αποτέλεσμα αποίκησης σε μια προϋπάρχουσα πνευμονική κοιλότητα (φυματίωση, εμφύσημα, σαρκοείδωση, καρκίνο του πνεύμονα) από μυκήλια μυκήτων που σχηματίζουν μια «Μπάλα Ασπέργιλλου» 4, 6, 10. Συγκριτικά με τις άλλες μη αλλεργικές παθολογίες, η χρόνια νεκρωτική ασπεργίλλωση αποτελεί μια πολύ σοβαρή εξελικτική θανατηφόρα μορφή. Στις διάφορες αυτές κλινικές εκδηλώσεις, είτε αλλεργικές είτε όχι, η διάγνωση της ασπεργίλλωσης είναι συχνά δύσκολη. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι τα κλινικά σημάδια μπορεί να υποδηλώνουν άλλες μυκητιακές, βακτηριακές, ιογενείς ή ακόμα και καρκινικές παθήσεις. Η ακτινολογική εξέταση, η οποία είναι χαρακτηριστική για το ασπεργίλλωμα, είναι λιγότερο χρήσιμη για άλλες μορφές ασπεργίλλωσης στις οποίες οι κλινικές και ακτινολογικές εξετάσεις αποτελούν μόνο κομμάτια της διαδικασίας της διάγνωσης. Οι βιολογικές παράμετροι και ιδιαίτερα οι ορολογικές αναλύσεις είναι απαραίτητες για την υποστήριξη αυτής της διάγνωσης 5. Συνεπώς, σε με κίνδυνο ασπεργιλλώματος -μια σοβαρή αλλά συχνά χωρίς κλινικά συμπτώματα μόλυνση- η παρακολούθηση των ορολογικών δεδομένων κρίνεται χρήσιμη. Η βέβαιη διάγνωση της ABPA βασίζεται σε πέντε κριτήρια που συμπεριλαμβάνουν την ορολογική ανίχνευση του αντισώματος κατά του Ασπέργιλλου 13. Το Platelia Aspergillus IgG, το οποίο είναι μια δοκιμασία για την ανίχνευση ανοσοσφαιρίνης G στοχευμένο κατά ενός ανασυνδυασμένου καθαρού αντιγόνου Ασπέργιλλου, αποτελεί ένα βοηθητικό εργαλείο για τη διάγνωση αυτών των χρόνιων μορφών ασπεργίλλωσης που εμφανίζονται σε άτομα με ανοσολογική επάρκεια 3. Επιπλέον, η παρουσία αντισωμάτων κατά του Ασπέργιλλου αναφέρθηκε πρόσφατα σε με ογκολογικές και αιματολογικές παθήσεις πριν από την ανοσοκαταστολή για μεταμόσχευση μυελού των οστών. Αυτές οι μελέτες υποστηρίζουν την ανίχνευση της αποικίας Ασπέργιλλου όταν ο ασθενής εισάγεται στο νοσοκομείο ή πριν από τη μεταμόσχευση σε που διατρέχουν κίνδυνο επιθετικής ασπεργίλλωσης μετά από την ανοσοκαταστολή. 4- ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Το PlateliaTM Aspergillus IgG είναι μια έμμεση ανοσοενζυμική τεχνική δύο σταδίων με μικροπλάκες που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση των αντισωμάτων IgG κατά του Ασπέργιλλου σε ανθρώπινο ορό ή πλάσμα. Δείγματα αραιωμένου ορού ή πλάσματος κατανέμονται στις κοιλότητες της μικροπλάκας που είναι ευαισθητοποιημένα με καθαρό ανασυνδυασμένο αντιγόνο Ασπέργιλλου 7. Μετά την επώαση στους 37 C, οι ταινίες πλένονται για να απομακρυνθούν τα υλικά που έχουν απομείνει. Το σύζευγμα (μονοκλωνικά αντισώματα αντί-ανθρώπινης IgG από ποντικούς σημαδεμένα με υπεροξειδάση) προστίθεται σε κάθε κοιλότητα της μικροπλάκας και επωάζεται στους 37 C. Αν υπάρχει IgG κατά του Ασπέργιλλου στο ανθρώπινο δείγμα σχηματίζεται ένα σύμπλεγμα: Αντίγονο Ασπέργιλλου - ανθρώπινο IgG κατά του Ασπέργιλλου - αντισώματα αντί-ανθρώπινης IgG από ποντικούς/υπεροξειδάση. Οι ταινίες πλένονται για να απομακρυνθούν τα υλικά που έχουν απομείνει. Για να εμφανιστούν τυχόν συμπλέγματα που έχουν σχηματιστεί κάνουμε χρήση χρωμογόνου που περιέχει υπόστρωμα υπεροξειδάσης και επωάζουμε σε θερμοκρασία δωματίου. Η ενζυμική αντίδραση διακόπτεται με την προσθήκη 1Ν θειικού οξέος. Για την ανάγνωση της οπτικής πυκνότητας χρησιμοποιείται ένα φασματοφωτόμετρο ρυθμισμένο στα 450/620 nm. 1

5- ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Τα αντιδραστήρια παρέχονται σε επαρκή ποσότητα για την πραγματοποίηση 96 μετρήσεων ή για έως και 9 τεστ. Για τις συνθήκες φύλαξης και για την ημερομηνία λήξης ανατρέξτε στις ενδείξεις στο κουτί. Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (+18-30 C) πριν από τη χρήση. Επαναφέρετε όλα τα αντιδραστήρια στους +2-8 C αμέσως μετά τη χρήση. Τοποθετήστε τις μη χρησιμοποιημένες ταινίες στην αρχική τους σακούλα και σφραγίστε την προσεκτικά. Μην αφαιρείτε το αφυγραντικό. Σήμανση Είδος αντιδραστηρίου Παρουσίαση R1 Μικροπλάκα: Μικροπλάκα - 96 κοιλότητες (12 ταινίες με 8 κοιλότητες η κάθε μία) ευαισθητοποιημένες με το καθαρό ανασυνδυασμένο αντιγόνο Ασπέργιλλου. 1 R2 Συμπυκνωμένο διάλυμα έκπλυσης (20x): Συμπυκνωμένο - Ρυθμιστικό διάλυμα TRIS-NaCl (ph 7,4) 1 x 70 ml διάλυμα - 2%Tween 20 έκπλυσης (20x) - Συντηρητικό: 0,04% ProClin 300 R3 Βαθμονομητής 0 Βαθμονομητής 0 AU/ml (έτοιμος προς χρήση): - Ρυθμιστικό διάλυμα Tris-NaCl που δεν περιέχει IgG κατά του Ασπέργιλλου 1 x 2,5 ml - Συντηρητικό: 0,15% ProClin 300 R4a Βαθμονομητής 10 Βαθμονομητής 10 AU/ml (έτοιμος προς χρήση): - Ανθρώπινος ορός που περιέχει αντισώματα κατά του Ασπέργιλλου - Συντηρητικό: : 0,15% ProClin 300 1 x 2,5 ml Βαθμονομητής 20 AU/ml (έτοιμος προς χρήση): R4b Βαθμονομητής 20 - Ανθρώπινος ορός που περιέχει αντισώματα κατά του 1 x 2,5 ml Ασπέργιλλου - Συντηρητικό: : 0,15% ProClin 300 R4c Βαθμονομητής 40 Βαθμονομητής 40 AU/ml (έτοιμος προς χρήση): - Ανθρώπινος ορός που περιέχει αντισώματα κατά του 1 x 2,5 ml Ασπέργιλλου - Συντηρητικό: 0,15% ProClin 300 R4d Βαθμονομητής 80 Βαθμονομητής 80 AU/ml (έτοιμος προς χρήση): - Ανθρώπινος ορός που περιέχει αντισώματα κατά του 1 x 2,5 ml Ασπέργιλλου - Συντηρητικό: : 0,15% ProClin 300 R6 Σύζευγμα Σύζευγμα (έτοιμο προς χρήση) - Μονοκλωνικά αντισώματα αντί-ανθρώπινης IgG από ποντικούς 1 x 26 ml σημαδεμένα με υπεροξειδάση - Ερυθρό της φαινόλης - Συντηρητικό: 0,3% ProClin 300 R7a R7b R9 R10 Αραιωτικό δείγματος 1 Αραιωτικό δείγματος 2 Χρωμογόνο TMB Ανασχετικό διάλυμα Διάλυμα αραιωτικού δείγματος 1 (έτοιμο προς χρήση): - Ρυθμιστικό διάλυμα Tris-NaCl, - 0,1% Tween 20, - Ερυθρό της φαινόλης, - Συντηρητικό: 0,151% ProClin 300 Διάλυμα αραιωτικού δείγματος 2 (έτοιμο προς χρήση): - Ρυθμιστικό διάλυμα Tris-NaCl, - 0,1% Tween 20, - Ιώδες βρωμοκρεζόλης, - Συντηρητικό: 0,151% ProClin 300 Διάλυμα χρωμογόνου TMB (έτοιμο προς χρήση) - 3,3,5,5 -τετραμεθυλοβενζιδίνη(< 0,1%) σε διάλυμα, H2O2 (<1,0%) Ανασχετικό διάλυμα (έτοιμο προς χρήση): - 1N διαλύματος θειικού οξέως 1 x 28 ml 1 x 26 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml 6- ΟΔΗΓΙΕΣ ΥΓΕΙΑΣ ΚΑΙ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ 1. Μόνο για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Μόνο για επαγγελματική χρήση. 3. Η χρήση αυτής της δοκιμασίας με δείγματα εκτός ανθρώπινου ορού ή πλάσματος δεν συνιστάται. 4. Οι βαθμονομητές R4a, R4b, R4c και R4d προέρχονται από ανθρώπινο ορό που βρέθηκε αρνητικός σε αντισώματα anti-hiv- 1, anti-hiv-2, anti-hcv και HBs με τη χρήση δοκιμών που φέρουν πιστοποίηση CE. Ωστόσο, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να αντιμετωπίζονται ως δυνητικά μολυσματικά. Όλες οι εξετάσεις πρέπει να γίνονται σύμφωνα με το πρότυπο σχετικά με τους παθογόνους παράγοντες που μεταδίδονται μέσω του αίματος OSHA, επίπεδο βιοασφάλειας 2 ή να γίνονται σύμφωνα με άλλες προσαρμοσμένες πρακτικές βιοασφάλειας. 2

5. Πρέπει να γίνεται χρήση προστατευτικού ρουχισμού, όπως εργαστηριακή ρόμπα, προστασία ματιών και προσώπου, γάντια μίας χρήσης (συνιστώνται γάντια κατασκευασμένα από συνθετικά υλικά χωρίς λατέξ), κιτ χειρισμού αντιδραστηρίων και δείγματα ασθενών σύμφωνα με το απαιτούμενο πρότυπο Ορθής εργαστηριακής πρακτικής (ΟΕΠ). Πλύνετε καλά τα χέρια σας μετά από την πραγματοποίηση της δοκιμασίας. 6. Μη χρησιμοποιείτε την πιπέτα με το στόμα. 7. Μην καπνίζετε, πίνετε ή τρώτε σε χώρους όπου γίνεται χειρισμός των δειγμάτων ή των κιτ αντιδραστηρίων. 8. Αποφύγετε να χύνετε τα δείγματα ή τα διαλύματα. 9. Οι επιφάνειες που έχουν λερωθεί από μολυσματικό υγρό που δεν περιέχει οξέα πρέπει να καθαρίζονται προσεκτικά με ένα αποτελεσματικό απολυμαντικό. Απολυμαντικά που μπορούν να χρησιμοποιηθούν είναι (μεταξύ άλλων) το διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου αραιωμένο σε περιεκτικότητα 10% (διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου 0,5%), αιθανόλη 70% ή Wescodyne Plus 0,5%. Το υλικό που θα χρησιμοποιηθεί για τον καθαρισμό πρέπει να απορριφθεί σε ένα ειδικό δοχείο για μολυσμένα απορρίμματα. ΠΡΟΣΟΧΗ: Ποτέ μην τοποθετείτε διαλύματα που περιέχουν διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου σε αποστειρωτή ατμού. 10. Αν το μολυσματικό υγρό είναι οξύ, οι λερωμένες επιφάνειες πρέπει να σκουπιστούν ή να ουδετεροποιηθούν με τη χρήση διττανθρακικού νατρίου και η επιφάνεια πρέπει να ξεπλυθεί και να στεγνωθεί. Σε περίπτωση που το μολυσματικό υγρό περιέχει βιολογικά επικίνδυνα υλικά, πλύνετε την επιφάνεια με ένα χημικό απολυμαντικό. 11. Απορρίψτε όλα τα δείγματα και τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμασία ως δυνητικά μολυσματικά. Τα επικίνδυνα χημικά και βιολογικά απορρίμματα πρέπει να καταστρέφονται σύμφωνα με τους κανονισμούς που ισχύουν. 12. Για συστάσεις αναφορικά με τους κινδύνους και τις προφυλάξεις που σχετίζονται με κάποια χημικά συστατικά αυτού του κιτ εξέτασης, ανατρέξτε στα εικονογραφήματα που αναφέρονται στις ετικέτες και στις πληροφορίες που παρέχονται στο τέλος των οδηγιών χρήσης. Το Δελτίο Δεδομένων Ασφαλείας διατίθεται στη διεύθυνση www.bio-rad.com. 7- ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟΥΣ ΧΡΗΣΤΕΣ 1. ΤΑ ΚΑΤΕΨΥΓΜΕΝΑ ΔΕΙΓΜΑΤΑ ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΑΠΟΘΗΚΕΥΤΕΙ ΥΠΟ ΑΓΝΩΣΤΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΟΔΗΓΗΣΟΥΝ ΣΕ ΨΕΥΔΩΣ ΘΕΤΙΚΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΛΟΓΩ ΜΥΚΗΤΙΑΚΩΝ Ή/ΚΑΙ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΜΟΛΥΝΣΕΩΝ. 2. Μη χρησιμοποιείτε το κιτ ή κάποιο από τα αντιδραστήριά του μετά την ημερομηνία λήξης. 3. Μην αναμειγνύετε ή συνδυάζετε αντιδραστήρια από συσκευασίες με διαφορετικό αριθμό παρτίδας κατά τη διάρκεια της ίδιας σειράς των εξετάσεων. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε διαφορετικές παρτίδες του διαλύματος έκπλυσης (R2, συμβολίζεται* ως 20x με πράσινο χρώμα), του Χρωμογόνου (R9, συμβολίζεται* ως TMB με τυρκουάζ χρώμα) και του ανασχετικού διαλύματος (R10, συμβολίζεται* ως 1Ν με κόκκινο χρώμα) από αυτές που παρέχονται στη συσκευασία αρκεί να χρησιμοποιείτε αντιδραστήρα που είναι ακριβώς αντίστοιχα και από την ίδια παρτίδα κατά τη διάρκεια της σειράς των εξετάσεων. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το διάλυμα έκπλυσης (R2 συμβολίζεται* ως 20x με πράσινο χρώμα) δεν μπορεί να αναμειχθεί με το διάλυμα έκπλυσης (R2 συμβολίζεται* ως 10x με μπλε χρώμα) που παρέχεται στα κιτ αντιδραστηρίων της Bio-Rad. * στην ετικέτα του φιαλιδίου 4. Πριν από τη χρήση περιμένετε 30 λεπτά για να αποκτήσουν τα αντιδραστήρια τη θερμοκρασία δωματίου (+18 έως +30 C). 5. Είναι προτιμότερο να χρησιμοποιείτε εξοπλισμό μίας χρήσης. Αν αυτό δεν είναι εφικτό, χρησιμοποιήστε γυάλινα δοχεία τα οποία έχουν πλυθεί και ξεπλυθεί σχολαστικά με αποσταγμένο νερό. 6. Ελέγξτε αν οι πιπέτες είναι ακριβείας και αν τα εργαλεία που χρησιμοποιείτε λειτουργούν σωστά. 7. Η ανασύσταση του αντιδραστηρίου R2 πρέπει να γίνεται με προσοχή για την αποφυγή τυχόν μόλυνσης. 8. Η ενζυμική αντίδραση είναι εξαιρετικά ευαίσθητη σε μέταλλα ή ιόντα μετάλλων. Συνεπώς κανένα μεταλλικό αντικείμενο δεν πρέπει να έρχεται σε επαφή με τα διάφορα διαλύματα που περιέχουν το σύζευγμα ή το διάλυμα υποστρώματος. 9. Όταν χρησιμοποιείτε τις πιπέτες στους βαθμονομητές και στα δείγματα, αλλάζετε το άκρο της πιπέτας για κάθε νέα κοιλότητα, προκειμένου να αποφευχθεί τυχόν μόλυνση. 10. Για να διασφαλίσετε ότι οι κοιλότητες έχουν καθαριστεί επαρκώς, επαναλάβετε το συνιστώμενο αριθμό καθαρισμών και βεβαιωθείτε ότι οι κοιλότητες γεμίζουν και αδειάζουν πλήρως. Ο καθαρισμός πρέπει να γίνεται με τη χρήση ενός πλυντηρίου μικροπλάκας. 11. Μην αφήνετε τη μικροπλάκα να στεγνώσει στο διάστημα μεταξύ του τέλους του καθαρισμού και της προσθήκης αντιδραστηρίων. 12. Μην χρησιμοποιείτε την ίδια φιάλη για το σύζευγμα και για το διάλυμα εμφάνισης. 13. Αποφύγετε την έκθεση του διαλύματος χρωμογόνου ή του διαλύματος εμφάνισης σε δυνατό φως κατά την αποθήκευση ή την επώαση. Βεβαιωθείτε ότι τα διαλύματα που περιέχουν χρωμογόνο δεν έρχονται σε επαφή με οξειδωτικούς παράγοντες. 14. Το χρωμογόνο (R9) πρέπει να είναι άχρωμο. Αν εμφανίσει μπλε απόχρωση σημαίνει ότι το αντιδραστήριο δεν είναι κατάλληλο για χρήση και πρέπει να αντικατασταθεί. 15. Αποφύγετε την επαφή του ανασχετικού διαλύματος με οποιοδήποτε οξειδωτικό παράγοντα, μέταλλο ή ιόν μετάλλου. 16. Μην τοποθετείτε το περισσευούμενο μη χρησιμοποιημένο σύζευγμα πίσω στην αρχική φιάλη. 3

8- ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ Μικροπλάκα (R1) Κάθε πλαίσιο που περιέχει 12 ταινίες είναι συσκευασμένο σε μια σακούλα. Κόψτε τη σακούλα με ένα ψαλίδι ακριβώς κάτω από την ένωση. Ανοίξτε τη σακούλα και αφαιρέστε το πλαίσιο. Τοποθετήστε το πλαίσιο που περιέχει τις μη χρησιμοποιημένες ταινίες στη σακούλα. Κλείστε τη σακούλα προσεκτικά και φυλάξτε τη σε θερμοκρασία +2-8 C. Μετά το άνοιγμα της σφραγισμένης σε κενό αέρος σακούλας, οι ταινίες που θα αποθηκευτούν σε αυτή στους +2-8 C θα είναι σταθερές για 8 εβδομάδες, αν η σακούλα έχει σφραγιστεί προσεκτικά. Ελέγξτε ότι υπάρχει ακόμα αφυγραντικό. Διάλυμα έκπλυσης (R2) Προετοιμάστε το διάλυμα έκπλυσης αραιώνοντας το συμπυκνωμένο διάλυμα 20 φορές σε αποσταγμένο νερό: 50 ml R2 σε 950 ml αποσταγμένου νερού. (Χρειάζονται 650 ml αραιωμένου διαλύματος έκπλυσης για ολόκληρη την πλάκα των 12 ταινιών χωρίς να υπολογίζεται ο νεκρός όγκος που χρειάζεται το πλυντήριο). Μετά από την αραίωση, το διάλυμα έκπλυσης μπορεί να διατηρηθεί για 14 ημέρες στους +2-30 C. Μόλις ανοιχτεί το συμπυκνωμένο διάλυμα έκπλυσης που είναι αποθηκευμένο στους +2-30 C, είναι σταθερό έως την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα, αν δεν υπάρχει μόλυνση. Βαθμονομητής 0 (R3), βαθμονομητής 10 (R4a), βαθμονομητής 20 (R4b), βαθμονομητής 40 (R4c), βαθμονομητής 80 (R4d): Οι βαθμονομητές είναι έτοιμοι προς χρήση. Τα αντιδραστήρια, αφού ανοιχτούν είναι σταθερά για 8 εβδομάδες αν διατηρούνται στους +2-8 C και δεν υπάρχει μόλυνση. Σύζευγμα (R6), Αραιωτικό δείγματος 1 (R7a), Αραιωτικό δείγματος 2 (R7b), διάλυμα χρωμογόνου TMB (R9): Τα αντιδραστήρια είναι έτοιμα προς χρήση. Τα αντιδραστήρια, αφού ανοιχτούν είναι σταθερά για 8 εβδομάδες αν διατηρούνται στους +2-8 C και δεν υπάρχει μόλυνση. Ανασχετικό διάλυμα (R10): Το αντιδραστήριο είναι έτοιμο προς χρήση. Μόλις ανοιχτεί το αντιδραστήριο που είναι αποθηκευμένο στους +2-8 C, είναι σταθερό έως την ημερομηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα, αν δεν υπάρχει μόλυνση. 9- ΔΕΙΓΜΑΤΑ 1. Αυτές οι εξετάσεις πραγματοποιούνται σε δείγματα ορού ή πλάσματος που έχουν ληφθεί από ηπαρίνη αιθυλενοδιαμινοτετραοξικού οξέος ή κιτρικό αντιπηκτικό. 2. Η δειγματοληψία, η επεξεργασία και η αποθήκευση αυτών των δειγμάτων αίματος πρέπει να γίνεται σύμφωνα με τις ακόλουθες οδηγίες: Πάρτε ένα δείγμα αίματος σύμφωνα με τους κανονισμούς που ισχύουν. Για ορό, αφήστε τον θρόμβο να σχηματιστεί πλήρως πριν από τη φυγοκέντρηση. Τα σωληνάρια πρέπει να είναι κλειστά. Μετά από τη φυγοκέντρηση, αφαιρέστε τον ορό ή το πλάσμα και αποθηκεύστε τα σε ένα κλειστό σωληνάριο. Αν η δοκιμασία πραγματοποιηθεί εντός 4 ημερών, τα δείγματα αποθηκεύονται στους +2-8 C. Αν η δοκιμασία δεν πραγματοποιηθεί εντός 4 ημερών, τα δείγματα καταψύχονται στους -20 C (ή -80 C). Δεν θα πρέπει να ψύξετε/αποψύξετε τα δείγματα περισσότερες από πέντε φορές. Μετά από την απόψυξη και πριν από την πραγματοποίηση της δοκιμασίας, τα δείγματα θα πρέπει να ομογενοποιηθούν με στροβιλισμό προσεκτικά.. 3. Τα αποτελέσματα δεν επηρεάζονται από δείγματα που περιέχουν 90 g/l αλβουμίνης ή 100 mg/l χολερυθρίνης, λιπαιμικά δείγματα που περιέχουν το ισοδύναμο 36 g/l τριελαΐνης (τριγλυκερίδιο) ή αιμολυμένα δείγματα που περιέχουν 10 g/l αιμοσφαιρίνης. 4. Μη θερμαίνετε τα δείγματα. 10-ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Εξοπλισμός που παρέχεται Ανατρέξτε στο κεφάλαιο ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Απαραίτητος εξοπλισμός που δεν παρέχεται 1. Αποστειρωμένο αποσταγμένο ή απιονισμένο νερό για την αραίωση του συμπυκνωμένου διαλύματος έκπλυσης. 2. Απορροφητικό χαρτί. 3. Γάντια μίας χρήσης. 4. Προστατευτικά γυαλιά. 5. Υποχλωριώδες νάτριο (Javel water) και διττανθρακικό νάτριο. 6. Πιπέτες ή πολυκάναλες πιπέτες, αυτόματες ή ημιαυτόματες, ρυθμιζόμενες ή σταθερές, που μπορούν να μετρούν και να παραδίδουν 10 έως 1000 μl, 1 ml, 2 ml και 10 ml. 7. Βαθμονομημένοι δοκιμαστικοί σωλήνες των 25 ml, 50 ml, 100 ml και 1000 ml. 8. Σωλήνες μίας χρήσης 9. Δοχείο για μολυσμένα απορρίμματα. 10. Αναδευτήρας Vortex. 11. Μικροπλάκα επώασης που μπορεί να ρυθμιστεί στους 37 C ± 1 C (*). 12. Ημιαυτόματο ή αυτόματο πλυντήριο μικροπλάκας (*). 13. Αναγνώστης μικροπλάκας εξοπλισμένος με φίλτρα 450 και 620 nm (*). (*) Αν το επιθυμείτε, μπορείτε να ζητήσετε περισσότερες πληροφορίες σχετικά με συσκευές που έχουν πιστοποιηθεί από το τεχνικό τμήμα μας. 4

Διαδικασίες ενζυμο-ανοσολογικών δοκιμασιών Να συμμορφώνονται με το ισχύον πρωτόκολλο. Να συμμορφώνονται με τις Ορθές εργαστηριακές πρακτικές: - Όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να βρίσκονται σε θερμοκρασία δωματίου (+18-30 C) για τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από τη χρήση. - Κάντε χρήση όλων των βαθμονομητών κάθε φορά που η δόση χρησιμοποιείται για την επαλήθευση της δοκιμασίας. Ακολουθήστε την παρακάτω διαδικασία: 1. Διαμορφώστε προσεκτικά το πλάνο για την κατανομή και αναγνώριση των βαθμονομητών και των δειγμάτων των ασθενών. 2. Προαραιώστε τα δείγματα για να τα δοκιμάσετε πριν από τη χρήση: στο 1/20, δηλαδή 10 μl ορού ή πλάσματος + 190 μl αραιωτικού δείγματος 1 (R7a). Η προαραίωση των δειγμάτων θα έχει ως αποτέλεσμα να αποκτήσουν κόκκινο χρώμα. 3. Αφαιρέστε το πλαίσιο και τις ταινίες (R1) από το προστατευτικό τους κάλυμμα. Τοποθετήστε τις μη χρησιμοποιημένες ταινίες στο κάλυμμά τους και σφραγίστε το. 4. Αδειάστε 190 μl αραιωτικού δείγματος 2 (R7b) στις κοιλότητες στις οποίες θα εισαχθούν τα δείγματα προς εξέταση, προσθέστε 10 μl δείγματος προαραιωμένου στο 1/20 και αναμείξτε τα ελαφρά μέσω αναρρόφησης, επαναλαμβάνοντας 2 ή 3 φορές. ΣΗΜ.: Σε αυτό το στάδιο της διαδικασίας η κατανομή μπορεί να ελεγχθεί, καθώς μετά από την προσθήκη των 10 μl του προαραιωμένου δείγματος, οι κοιλότητες που περιέχουν δείγματα αποκτούν γκρι χρώμα. Τα δοχεία που δεν περιέχουν δείγματα έχουν μπλε-βιολετί χρώμα. 5. Κατανέμετε τους έτοιμους προς χρήση βαθμονομητές κατά 200 μl ανά κοιλότητα, σύμφωνα με το πλάνο που ακολουθεί: - A1: Βαθμονομητής 0 (R3) - B1: Βαθμονομητής 10 AU/ml (R4a) - C1: Βαθμονομητής 20 AU/ml (R4b) - D1: Βαθμονομητής 40 AU/ml (R4c) - E1: Βαθμονομητής 80 AU/ml (R4d) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S4 S12 B R4a S5 C R4b S6 D R4c S7 E R4d S8 F S1 S9 G S2 S10 H S3 S11 6. Καλύψτε τη μικροπλάκα με μιααυτοκόλλητη μεμβράνη, πιέζοντας σε όλη την επιφάνεια για να βεβαιωθείτε ότι είναι σφιχτή. 7. Επωάστε αμέσως τη μικροπλάκα σε έναν στεγνό επωαστή μικροπλάκας για 60 ± 5 λεπτά στους 37 C (± 1 C). 8. Ετοιμάστε το αραιωμένο διάλυμα έκπλυσης (ανατρέξτε στο κεφάλαιο 8). 9. Αφαιρέστε την αυτοκόλλητη μεμβράνη. Αφαιρέστε τα περιεχόμενα από την κάθε κοιλότητα και τοποθετήστε τα σε ένα δοχείο (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο) για μολυσμένα απορρίμματα. 10. Πλύνετε τη μικροπλάκα 4 φορές χρησιμοποιώντας ένα πλυντήριο μικροπλάκας (με 800 μl αραιωμένου διαλύματος έκπλυσης). Μετά από την τελευταία πλύση, αναποδογυρίστε τη μικροπλάκα και χτυπίστε την ελαφρά πάνω απο απορροφητικό χαρτί για να απομακρύνετε όλο το υγρό που έχει απομείνει. 11. Ομογενοποιήστε τα περιεχόμενα του φιαλιδίου R6 αναποδογυρίζοντάς το πριν από τη χρήση του. Αν διαθέτετε πολυκάναλη πιπέτα, χρησιμοποιήστε μόνο τον όγκο που είναι απαραίτητος για την ολοκλήρωση της σειράς των εξετάσεων: χρειάζονται 3,5 ml για δύο ταινίες των 8 δοχείων. 12. Αδειάστε 200 μl συζεύγματος R6 σε κάθε κοιλότητα. 13. Καλύψτε τη μικροπλάκα με μιααυτοκόλλητη μεμβράνη, πιέζοντας σε όλη την επιφάνεια για να βεβαιωθείτε ότι είναι σφιχτή. 14. Επωάστε τη μικροπλάκα σε έναν στεγνό επωαστή μικροπλάκας για 60 ± 5 λεπτά στους 37 C (± 1 C). 15. Αφαιρέστε την αυτοκόλλητη μεμβράνη. Αφαιρέστε τα περιεχόμενα από την κάθε κοιλότητα και τοποθετήστε τα σε ένα δοχείο (που περιέχει υποχλωριώδες νάτριο) για μολυσμένα απορρίμματα. 16. Πλύνετε τη μικροπλάκα 4 φορές χρησιμοποιώντας ένα πλυντήριο μικροπλάκας (με 800 μl αραιωμένου διαλύματος έκπλυσης). Μετά από την τελευταία πλύση, αναποδογυρίστε τη μικροπλάκα και χτυπίστε την ελαφρά πάνω απο απορροφητικό χαρτί για να απομακρύνετε όλο το υγρό που έχει απομείνει. 17. Βρίσκοντας ένα σημείο μακριά από έντονο φως, αδειάστε γρήγορα 200 μl διαλύματος χρωμογόνου TMB (R9) σε κάθε κοιλότητα. 18. Επωάστε τη μικροπλάκα στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου (+18-30 C) για 30 ± 5 λεπτά. Μη χρησιμοποιείτε αυτοκόλλητη μεμβράνη κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου επώασης. 19. Προσθέστε 100 μl ανασχετικό διάλυμα (R10) σε κάθε κοιλότητα ακολουθώντας την ίδια διαδικασία για την προσθήκη υποστρώματος διαλύματος. Αναμείξτε καλά. 20. Καθαρίστε προσεκτικά το κάτω μέρος της κάθε μικροπλάκας. 21. Διαβάστε την οπτική πυκνότητα της κάθε μικροπλάκας στα 450 nm (φίλτρο αναφοράς στα 620 nm) εντός 30 λεπτών από την προσθήκη του ανασχετικού διαλύματος (πριν από την ανάγνωση, οι ταινίες θα πρέπει πάντα να αποθηκεύονται μακριά από άμεση έκθεση στο φως). 22. Πριν καταχωρίσετε τα αποτελέσματα, βεβαιωθείτε ότι η εκτύπωση της συσκευής ανάγνωσης αντιστοιχεί με το πλάνο κατανομής της μικροπλάκας. 5

11- ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ (ΚΡΙΤΗΡΙΑ ΕΓΚΥΡΟΤΗΤΑΣ) Χρησιμοποιείτε τους βαθμονομητές σε κάθε μικροπλάκα κάθε φορά που πραγματοποιείτε την εξέταση. Για να είναι έγκυρη η δοκιμασία, θα πρέπει να πληρούνται τα ακόλουθα κριτήρια: Τιμή οπτικής πυκνότητας: ΟΠ R4a > 0,200 Αναλογίες: ΟΠ R4a / ΟΠ R3 > 3,00 ΟΠ R4b / ΟΠ R4a > 1,20 ΟΠ R4c / ΟΠ R4b > 1,20 ΟΠ R4d / ΟΠ R4c > 1,00 12- ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Σχεδιασμός της καμπύλης βαθμονόμησης Η καμπύλη βαθμονόμησης ορίζεται με τη χρήση 5 σημείων (βαθμονομητές) 0, 10, 20, 40 και 80 AU/ml. Σχεδιάστε την καμπύλη βαθμονόμησης [ΟΠ = συνάρτηση (AU/ml)] μετρώντας την ΟΠ για τους βαθμονομητές R3, R4a, R4b, R4c και R4d στον κατακόρυφο άξονα (άξονα Y) και στη συνέχεια μετρήστε τις αντίστοιχες συγκεντρώσεις σε AU/ml στον οριζόντιο άξονα (άξονα X). Επιλέξτε μια διαδρομή που ενώνει τα σημεία. Καθορισμός της συγκέντρωσης των αντισωμάτων IgG έναντι του Ασπέργιλλου (AU/ml) των δειγμάτων που εξετάστηκαν. Για κάθε δείγμα που εξετάστηκε από το σχήμα της καμπύλης στην Ενότητα 12, μπορεί να υπολογιστεί η συγκέντρωση των αντισωμάτων IgG έναντι του Ασπέργιλλου. Ερμηνεία αποτελεσμάτων Δείγματα με συγκεντρώσεις μικρότερες από 5 AU/ml (C < 5) «αρνητικά» όσον αφορά την παρουσία του αντισώματος IgG έναντι του Ασπέργιλλου. Δείγματα με συγκεντρώσεις μεταξύ 5 και 10 AU/ml (5 C < 10) «ενδιάμεσα» όσον αφορά την παρουσία του αντισώματος IgG έναντι του Ασπέργιλλου. Δείγματα με συγκεντρώσεις μεγαλύτερες από ή ίσες με 10 AU/ml (C 10) «θετικά» όσον αφορά την παρουσία αντισώματος IgG έναντι του Ασπέργιλλου. Τα σημεία που χρησιμοποιούνται για το σχεδιασμό της καμπύλης βαθμονόμησης δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πραγματοποίηση μιας ακριβούς τιτλοδότησης για συγκεντρώσεις μεγαλύτερες των 80 AU/ml. Αν θέλετε να τιτλοδοτήσετε με ακρίβεια θετικά δείγματα με πολύ μεγάλες τιμές, θα πρέπει να ξεκινήσετε τη δοκιμασία από την αρχή και να πραγματοποιήσετε μια επιπλέον προαραίωση του δείγματος με την αραίωση του R7a: - Για δείγμα με τίτλο > 80 AU/ml και ΟΠ < 3,000: πρώτα προαραιώστε το δείγμα σε R7a στο 1/5. - Για δείγματα με τίτλο > 80 AU/ml και ΟΠ 3,000: πρώτα προαραιώστε το δείγμα σε R7a στο 1/60. Μετά από αυτήν την αρχική προαραίωση, ακολουθήστε τη διαδικασία που αναφέρεται στο κεφάλαιο 10 (προαραιώστε στο 1/20 μέσα σε R7a και στη συνέχεια αραιώστε στο 1/20 μέσα σε R7b). Ο τίτλος του θετικού δείγματος με πολύ υψηλή τιμή θα υπολογιστεί πολλαπλασιάζοντας τον τίτλο που υπολογίστηκε με τον συντελεστή της πρώτης προαραίωσης (δηλαδή: 5 ή 60 ανάλογα με την προαραίωση που πραγματοποιήσατε) Ένα ενδιάμεσο αποτέλεσμα μπορεί να επιβεβαιωθεί από ένα άλλο δείγμα που λήφθηκε από τον ασθενή εντός 2-3 εβδομάδων από την ημερομηνία του δείγματος που έδωσε ενδιάμεσο τίτλο. Κατά την ορολογική παρακολούθηση του ασθενή, συνιστούμε να εξετάζετε όλα τα δείγματα του ασθενή στην ίδια σειρά εξετάσεων για να εντοπίσετε τυχόν σημαντικές διαφοροποιήσεις στην τιτλοδότηση των αντισωμάτων IgG έναντι του Ασπέργιλλου. 13- ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ 1. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει τη διάγνωση ασπεργίλλωσης. Η ασπεργίλλωση μπορεί να διαγνωσθεί μόνο μετά από τη μελέτη των κλινικών, θεραπευτικών, ακτινολογικών, κυτταρολογικών, άμεσων μυκητολογικών και ορολογικών αποτελεσμάτων, ενώ κρίνεται απαραίτητη η ερμήνευση του κάθε στοιχείου ξεχωριστά και με προσοχή. 2. Σε άτομα με ανοσολογική επάρκεια που μπορεί να πάσχουν από ασπεργίλλωση, ένα δείγμα που λαμβάνεται όσο η ασθένεια του Ασπέργιλλου βρίσκεται σε αρχικό στάδιο μπορεί να δώσει αρνητικό αποτέλεσμα για την παρουσία του IgG έναντι του Ασπέργιλλου. Επομένως συνιστάται να πραγματοποιηθεί νέα δοκιμασία σε δείγμα που έχει ληφθεί δύο ή τρεις εβδομάδες αργότερα. 3. Η διαδικασία και η ερμήνευση των αποτελεσμάτων που περιγράφονται για τη δοκιμασία Platelia Aspergillus IgG πρέπει να παρακολουθούνται όταν τα δείγματα εξετάζονται για την παρουσία αντισωμάτων IgG έναντι του Ασπέργιλλου. Συνιστάται ο χρήστης του κιτ να διαβάσει το ένθετο προσεκτικά πριν από την πραγματοποίηση της δοκιμασίας. Κατά τη χρήση πιπετών στα δείγματα και στα αντιδραστήρια, τον καθαρισμό των μικροπλακών και τη χρονομέτρηση των σταδίων επώασης, θα πρέπει να ακολουθείται πιστά το πρωτόκολλο. 4. Αν τα δείγματα και τα αντιδραστήρια δεν προστεθούν όπως υποδεικνύεται, μπορεί να προκύψει ψευδώς αρνητικό αποτέλεσμα. Σε περίπτωση λάθους κατά τη διαδικασία, θα πρέπει να εξεταστεί ένα νέο δείγμα από τον ίδιο ασθενή. 5. Οι κοιλότητες που περιέχουν αρνητικά δείγματα ασθενών μπορεί να μολυνθούν από κοιλότητες που περιέχουν θετικά δείγματα ασθενών ή δείγματα ασθενών γενικότερα, αν τα περιεχόμενα μίας εκ των κοιλοτήτων υπερχειλίσουν σε μια άλλη λόγω αδέξιου χειρισμού της μικροπλάκας ή λόγω κακής χρήσης των πιπετών κατά την προσθήκη αντιδραστηρίων. 6. Τα ποσοστά επιτυχίας του Platelia Aspergillus IgG δεν αξιολογήθηκαν βάσει δειγμάτων ορού ή πλάσματος από νεογέννητα βρέφη ή παιδιατρικούς. 7. Η λειτουργία του Platelia Aspergillus IgG δεν σχεδιάστηκε για μη αυτόματη ανάγνωση ή/και για οπτικό προσδιορισμό των αποτελεσμάτων. 6

14-ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ Ο επιπολασμός του IgG έναντι του Ασπέργιλλου που μετρήθηκε με τη χρήση του τεστ Platelia Aspergillus IgG αξιολογήθηκε με τη χρήση ενός πλαισίου από 129 δείγματα από 64 Γάλλους που πάσχουν από κυστική ίνωση και παρουσιάζουν κίνδυνο μόλυνσης από Ασπέργιλλο. Από τα 129 δείγματα, τα 53 βγήκαν θετικά και τα 12 ενδιάμεσα, και ο επιπολασμός ήταν 53/129 = 41,1% [95% CI: 32,5-50,1%] θεωρώντας ότι τα ενδιάμεσα αποτελέσματα ήταν αρνητικά και 65/129 = 50,4% [95% CI: 41,4-59,3%] θεωρώντας ότι τα ενδιάμεσα αποτελέσματα ήταν θετικά. Όσον αφορά τους, από τους 64 που εξετάστηκαν, οι 29 είχαν τουλάχιστον ένα θετικό δείγμα και οι 5 είχαν τουλάχιστον ένα ενδιάμεσο δείγμα χωρίς θετικά και ο επιπολασμός ήταν 29/64 = 45,3% [95% CI: 32,8-58,3%] θεωρώντας ότι τα ενδιάμεσα αποτελέσματα ήταν αρνητικά και 34/64 = 53,1% [95% CI: 40,2-65,7%] θεωρώντας ότι τα ενδιάμεσα αποτελέσματα ήταν θετικά. 15-ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΕΠΙΔΟΣΕΩΝ Α. Έρευνες αναπαραγωγιμότητας Ακρίβεια εντός μίας δοκιμασίας (επαναληψιμότητα): Για την αξιολόγηση της επαναληψιμότητας εντός της δοκιμασίας, εξετάστηκαν ένα αρνητικό και πέντε θετικά δείγματα 32 φορές σε μία σειρά εξετάσεων. Υπολογίστηκε η τιτλοποίηση σε AU/ml για κάθε δείγμα. Ο μέσος όρος των τιτλοποιήσεων, η τυπική απόκλιση (SD) και ο συντελεστής διακύμανσης (CV%) για κάθε δείγμα δίνονται στον ακόλουθο πίνακα: Ακρίβεια εντός μίας δοκιμασίας (επαναληψιμότητα) N=332 Αρνητικό δείγμα Ασθενές θετικό δείγμα Αρ. 1 Ασθενές θετικό δείγμα Αρ. 2 Ασθενές θετικό δείγμα Αρ. 3 Μέτριο θετικό δείγμα Μέσος όρος 2,44 9,31 10,31 13,64 31,69 43,10 SD 0,067 0,320 0,218 0,387 0,939 1,546 CV % 2,7% 3,4% 2,1% 2,8% 3,0% 3,6% Ισχυρό θετικό δείγμα Ακρίβεια σε πολλές δοκιμασίες (αναπαραγωγιμότητα): Για την αξιολόγηση της αναπαραγωγιμότητας σε πολλές δοκιμασίες, κάθε ένα από έξι δείγματα (ένα αρνητικό και πέντε θετικά) εξετάστηκε δύο φορές, σε δύο σειρές εξετάσεων καθημερινά για μια περίοδο 20 ημερών. Υπολογίστηκε η τιτλοποίηση σε AU/ml για κάθε θετικό δείγμα. Το αρνητικό δείγμα εκφράζεται υπό τη μορφή λόγου. Ο μέσος όρος των συγκεντρώσεων ή λόγων, η τυπική απόκλιση (SD) και ο συντελεστής διακύμανσης (CV%) για κάθε δείγμα δίνονται στον ακόλουθο πίνακα: Ακρίβεια σε πολλές δοκιμασίες (αναπαραγωγιμότητα) N=80 Αρνητικό δείγμα Ασθενές θετικό δείγμα Αρ. 1 Ασθενές θετικό δείγμα Αρ. 2 Ασθενές θετικό δείγμα Αρ. 3 Μέτριο θετικό δείγμα Μέσος όρος 1,88 3,60 6,99 12,34 32,49 51,65 SD 0,26 0,46 0,92 1,49 5,25 7,65 CV % 13,8% 12,8% 13,1% 12,1% 16,2% 14,8% Β. Αλληλεπιδράσεις Ισχυρό θετικό δείγμα Παθολογία Αριθμός δειγμάτων που εξετάστηκαν Αριθμός δειγμάτων Αντισώματα έναντι Candida 54 2* Αντισώματα έναντι ds-dna 10 0 Θετικά αντιπυρηνικά 10 0 αντισώματα (ANA) Μυέλωμα IgG 10 0 Τοξόπλασμα OgG 10 0 Ανθρώπινα αντισώματα έναντι 12 0 ποντικών HIV 10 0 Ρευματοειδής παράγοντας 10 0 θετικών * Οι δύο οροί που βρέθηκαν θετικοί επιβεβαιώθηκαν με ένα κιτ του εμπορίου για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι του Ασπέργιλλου. Γ. Γραμμικότητα Το γραμμικό δυναμικό εύρος της δόσης του Platelia Aspergillus IgG έχει καθοριστεί μεταξύ 2 και 80 UA/ml με τη χρήση μελετών αραίωσης που πραγματοποιήθηκαν σε 5 θετικά δείγματα. Δ. Κλινικές μελέτες Τα χαρακτηριστικά επιδόσεων του κιτ Platelia Aspergillus IgG αξιολογήθηκαν σε 2 τοποθεσίες με συνολικό αριθμό δειγμάτων 499 από 329. 7

ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ Η ευαισθησία καθορίστηκε με τη χρήση ενός πλαισίου από 277 δείγματα σε 2 τοποθεσίες που βρίσκονται στη Γαλλία και διαχωρίζονται ως εξής: Στην τοποθεσία 1 εξετάστηκαν 129 οροί από 64 που πάσχουν από κυστική ίνωση και παρουσιάζουν υψηλό κίνδυνο αλλεργικής βρογχοπνευμονικής ασπεργίλλωσης (ABPA). Στην τοποθεσία 2 εξετάστηκαν 148 οροί από 43 με χρόνια ασπεργίλλωση βαριάς μορφής. Αποτελέσματα από την τοποθεσία 1 Ο παρακάτω πίνακας περιέχει τα αποτελέσματα που προέκυψαν στην τοποθεσία 1 για που πάσχουν από κυστική ίνωση και για τους οποίους η διάγνωση της ABPA πραγματοποιήθηκε βάσει των κλινικών δεδομένων, με αποτελέσματα για το συνολικό IgE, ηλεκτροσυναίρεση Ασπέργιλλου, ανίχνευση αντιγόνων Ασπέργιλλου και ανίχνευση αντισωμάτων IgG έναντι του Ασπέργιλλου με ένα τεστ EIA του εμπορίου διαφορετικό από το Platelia Aspergillus IgG. Οι χωρίστηκαν σε 4 κατηγορίες: απουσία ABPA, με εκδήλωση ABPA στο παρελθόν, με υποψία για ABPA και με επιβεβαιωμένη ABPA 9, 11. Η απουσία ABPA δεν αποκλείει άλλη παθολογία Ασπέργιλλου 12. Η κατάσταση του ασθενή με ηλεκτροσυναίρεση Ασπέργιλλου ή Platelia Aspergillus IgG θεωρήθηκε θετική αν τουλάχιστον ένα από τα δείγματα του ασθενή βγήκε θετικό με την αντίστοιχη μέθοδο. Στην αντίθετη περίπτωση, η κατάσταση θεωρήθηκε ενδιάμεση αν τουλάχιστον ένα από τα δείγματα του ασθενή βγήκε ενδιάμεσο, και αρνητική αν όλα τα δείγματα του ασθενή βγήκαν αρνητικά. Κατηγορίες ασθενών 49 χωρίς ABPA 5 με εκδήλωση ABPA στο παρελθόν 4 με υποψία ABPA 6 με επιβεβαιωμένη ABPA Αποτελέσματα Αποτελέσματα PlateliaTM Aspergillus IgG ηλεκτροσυναίρεσης Κατάσταση Αριθμός Κατάσταση ασθενούς Θετικό (%) ασθενών (ενδιάμεσοι Θετική Ενδιάμεση Αρνητική αρνητικοί) Αρνητικό 40 7 (1) 4 (2) 29 7/40 (17,5%) 95% CI [7,3-32,8%] Θετικό 9 8 1 0 8/9 (88,9%)* Αρνητικό 5 5 (3) 0 0 5/5 Θετικό 0 - - - - - Αρνητικό 2 2 (4) 0 0 2/2 Θετικό 2 2 0 0 2/2 (100,0%) Αρνητικό 3 2 (5) 0 1 2/3 (66,7%)* Θετικό 3 3 0 0 3/3 Θετικό (%) (ενδιάμεσοι θετικοί) 11/40 (27,5%) 95% CI [14,6-43,9%] 9/9 5/5 2/2 2/2 (100,0%) 2/3 (66,7%)* 3/3 1): Το 57% (4/7) των θετικών αποτελεσμάτων με το Platelia Aspergillus IgG βγήκαν θετικά με άλλο κιτ EIA που ανιχνεύει IgG έναντι του Ασπέργιλλου. (2): Το 100% (4/4) των ενδιάμεσων αποτελεσμάτων με το Platelia Aspergillus IgG βγήκαν αρνητικά με άλλο κιτ EIA που ανιχνεύει IgG έναντι του Ασπέργιλλου. (3): Το 100% (5/5) των θετικών αποτελεσμάτων με το Platelia Aspergillus IgG βγήκαν θετικά με άλλο κιτ EIA που ανιχνεύει IgG έναντι του Ασπέργιλλου. (4): Το 100% (2/2) των θετικών αποτελεσμάτων με το Platelia Aspergillus IgG βγήκαν θετικά με άλλο κιτ EIA που ανιχνεύει IgG έναντι του Ασπέργιλλου. (5): Το 100% (2/2) των θετικών αποτελεσμάτων με το Platelia Aspergillus IgG βγήκαν θετικά με άλλο κιτ EIA που ανιχνεύει IgG έναντι του Ασπέργιλλου. * : Δεν ήταν δυνατός ο υπολογισμός του διαστήματος αξιοπιστίας κατά 95%, λόγω ανεπαρκούς μεγέθους δείγματος. Αποτελέσματα από την τοποθεσία 2 Ο παρακάτω πίνακας περιέχει τα αποτελέσματα που προέκυψαν από ένα δείγμα πληθυσμού ασθενών που πάσχουν από χρόνια ασπεργίλλωση βαριάς μορφής και επιλέχτηκαν βάσει συμβατών απεικονίσεων πνευμόνων, καλλιεργειών πτυέλου θετικών για Ασπέργιλλο και ορολογικών εξετάσεων θετικών για Ασπέργιλλο με τη χρήση ανοσοηλεκτροφόρησης (IEP). 8

Αποτελέσματα ανά δείγμα Κατηγορίες ασθενών Χρόνια ασπεργίλλωση βαριάς μορφής Αποτελέσματα IEP Αποτελέσματα PlateliaTM Aspergillus IgG Κατάσταση Αριθμός Κατάσταση ασθενούς Θετικό (%) ασθενών (ενδιάμεσοι Θετική Ενδιάμεση Αρνητική αρνητικοί) Θετικό 109 105 3 1 96,3% 95% CI [90,8-99,0] Ενδιάμεσο 22 15 4 3 68,2% 95% CI [45,1-86,1] Αρνητικό 17 6 5 6 35,3% 95% CI [14,2-61,7] Θετικό (%) (ενδιάμεσοι θετικοί) 99,1% 95% CI [95,0-100] 86,4% 95% CI [65,1-97,1] 64,7% 95% CI [38,5-85,8] Αποτελέσματα ανά ασθενή Η κατάσταση του ασθενή με ανοσοηλεκτροφόρησηασπέργιλλου ή Platelia Aspergillus IgG θεωρήθηκε θετική αν τουλάχιστον ένα από τα δείγματα του ασθενή βγήκε θετικό με την αντίστοιχη μέθοδο. Στην αντίθετη περίπτωση, η κατάσταση θεωρήθηκε ενδιάμεση αν τουλάχιστον ένα από τα δείγματα του ασθενή βγήκε ενδιάμεσο, και αρνητική αν όλα τα δείγματα του ασθενή βγήκαν αρνητικά. Κατηγορίες ασθενών Χρόνια ασπεργίλλωση βαριάς μορφής Αποτελέσματα IEP Αποτελέσματα PlateliaTM Aspergillus IgG Κατάσταση Αριθμός Κατάσταση ασθενούς Θετικό (%) ασθενών (ενδιάμεσοι Θετική Ενδιάμεση Αρνητική αρνητικοί) Θετικό 40 38 1 1 95,0% 95% CI [83,1-99,4] Αρνητικό 3 1 1 1 33,3%* 66,7%* * : Δεν ήταν δυνατός ο υπολογισμός του διαστήματος αξιοπιστίας κατά 95%, λόγω ανεπαρκούς μεγέθους δείγματος. Θετικό (%) (ενδιάμεσοι θετικοί) 97,5% 95% CI [86,8-99,00] ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ Η ειδικότητα καθορίστηκε με τη χρήση ενός πλαισίου 222 δειγμάτων από 222 που νοσηλεύτηκαν στην τοποθεσία 1 (200 δείγματα) και στην τοποθεσία 2 (22 δείγματα), οι οποίοι δεν είχαν συμπτώματα μόλυνσης από Ασπέργιλλο. Πληθυσμός Αριθμός Αρνητικό Ενδιάμεσο Θετικό ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ που δειγμάτων (οι ενδιάμεσοι εξετάστηκε / τοποθεσία αρνητικοί) Τοποθεσία 1 200 199 1 0 99,5% 95% CI [97,2-100,0%] Τοποθεσία 2 22 22 0 0 100% 95% CI [84,6-100,0%] Σύνολο 222 221 1 0 99,6% 95% [97,5-100,0%] ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ (οι ενδιάμεσοι θετικοί) 100% 95% CI [98,2-100,0%] 100% 95% CI [84,6%- 100,0%] 100% 95% CI [98,3-100,0%] 16. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΥ ΚΑΤΑΣΚΕΥΑΣΤΗ Όλα τα αντιδραστήρια που κατασκευάζονται, ετοιμάζονται σύμφωνα με το Σύστημά μας για τη διασφάλιση ποιότητας, από τη λήψη των πρώτων υλών μέχρι την εμπορευματοποίηση του τελικού προϊόντος. Κάθε παρτίδα υπόκειται σε αξιολόγηση ελέγχου ποιότητας και κυκλοφορεί στην αγορά μόνο αν πληροί τα προκαθορισμένα κριτήρια. Τα στοιχεία σχετικά με την παραγωγή και τον έλεγχο κάθε ξεχωριστής παρτίδας φυλάσσονται από την Bio-Rad. 9

17. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Agarwal, R. 2009. Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Chest 135 (3): p805-826. 2. Agarwal, R., Nath, A., Aggarwal, A. N., Gupta, D., Chakrabarti, A. 2009. Aspergillus hypersensitivity and allergic bronchopulmonary aspergillosis in patients with acute severe asthma in a respiratory intensive care unit in North India. Mycoses 24. 3. Centeno-Lima, S., de Lacerda, J. M., do Carmo, J. A., Abecasis, M., Casimiro, C., Exposto, F. 2002. Follow-up of anti- Aspergillus IgG and IgA antibodies in bone marrow transplated patients with invasive aspergillosis. Journal of clinical laboratory analysis 16: p156-162. 4. Denning, D. W. 2001. Chronic forms of pulmonary aspergillosis. Clinical microbiology and infection 7 (Suppl 2): p25-31. 5. Latzin, P., Hartl, D., Regamey, N., frey, U., Schoeni, M. H., Casaulta, C. 2008. Comparison of serum markers for allergic bronchopulmonary aspergillosis in cystic fibrosis. Eur. Respiratory Journal 31: p36-42. 6. Pagella, F., Matti, E., De Bernardi, F., Semino, L., Cavanna, C., Marone, P., Farina, C., Castelnuovo, P. 2007. Paranasal sinus fungus ball: diagnosis and management. Mycoses 50: p451-456. 7. Sarfati, J., Monod, M., Recco, P., Sulahian, A., Pinel, C., Candolfi, E., Fontaine, T., Debeaupuis, J.P., Tabouret, M., Latgé, J.P. 2006. Recombinant antigens as diagnostic markers for aspergillosis. Diagnostic microbiology and infectious disease 55: p. 279-291. 8. Schubert, M. S. 2009. Allergic fungal sinusitis: pathophysiology, diagnosis and management. Medical Mycology p1-7. 9. Shah, A. 2008. Aspergillus-associated hypersensitivity respiratory disorders. Indian journal of Chest disease and allied sciences 50: p117-128 10. Shah, R., Vaidesswar, P., Pandit, S. P. 2008. Pathlogy of pulmonary aspergillomas. Indian journal of pathology and microbiology 51 (3): p342-345. 11. Thia, L. P., Balfour Lynn, I. M. 2009. Diagnosing allergic bronchopulmonary aspergillosis in children with cystic fibrosis, Paediatric Respiratory Reviews 10: p37 42 12. Tillie-Leblond, I., Tonnel, A. B. 2005. Allergic bronchopulmonary aspergillosis. Allergy 60: p1004-1013. 13. Virnig, C., Bush, R. K. 2007. Allergic bronchopulmonary aspergillosis: a US perspective. Current opinion in Pulmonary Medicine 13: p67-71. 10

11

Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincare 92430 Marnes-la-Coquette - France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 2013/11 Fax : +33 (0) 1 47 41 91 33 881123 www.bio-rad.com 12