Σχεδιασμός νέων πολυκετιδικών φαρμάκων. Αλέξανδρος Σίσκος

Συνδυαστική Βιοσύνθεση: Σχεδιασμός νέων πολυκετιδικών φαρμάκων Αλέξανδρος Σίσκος Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών, Ακαδημία Αθηνών asiskos@bioacademy.gr Μεταπτυχιακό δίπλωμα ειδίκευσης: Μικροβιακή Βιοτεχνολογία Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ 20 εκεμβρίου 2010

υο διαλέξεις Συνδυαστική Βιοσύνθεση: Σχεδιασμός νέων πολυκετιδικών φαρμάκων Polyketide drug design with combinatorial biosynthesis/ bioengineering Σχεδιασμός νέων φαρμάκων και βιοενεργών ουσιών με τη βοήθεια γονιδιακών αλλαγών ιερεύνηση προφίλ μικροβιακών μεταβολιτών με φασματομετρία μάζας Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 2

Πολυκετίδια : ορισμός, παραδείγματα Βιοσύνθεση λιπαρών οξέων Βιοσύνθεση πολυκετιδίων (πολυκετιδικές συνθάσες) : δύο (ακραίες) περιπτώσεις ενζυμικής οργάνωσης : α) επαναληπτική (iterative)- αρωματική και β) πολύπλοκη ενζυμική οργάνωση σε ομάδες δραστικοτήτων (modular) Βιοσύνθεση της ερυθρομυκίνης Α : πρότυπο παράδειγμα Άλλες ενζυμικές δομές, πχ. Μη ριβοσωμικές πεπτιδικές συνθάσες (NRP : non ribosomal peptide synthases), chalcone synthase Γενετική μηχανική πολυκετιδικών συνθασών : ιαγραφή/ανασυνδυασμός/πρόσθεση/ανάμιξη γονιδίων πολυκετιδικών συνθασών και συναφών γονιδίων. Παραδείγματα. Χρήση συνδυαστικών μεθόδων για την δημιουργία νέων ενώσεων Σχεδιασμός επιθημητών αλλαγών : στερεοχημεία, αναγωγικές αντιδράσεις, πλευρικές ομάδες. Εξ ολοκληρου σχεδιασμός δομικών μοναδών (rational design of building blocks). Υβρικά φυσικά προϊόντα ή μη φυσικά φυσικά προϊόντα Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 3

ΠΟΛΥΚΕΤΙ ΙΑ Μεγάλη ομάδα δευτερογενών μεταβολιτών με εξαιρετικά μεγάλη ποικιλία στις δομές. Παράγονται από μύκητες, βακτήρια, φυτά, θαλάσσιους οργανισμούς. Ο Ο παραδοσιακός ορισμός τους θεωρεί ότι παράγονται από τη συμπύκνωση (πολυμερισμό, συνένωση) μονάδων οξικού κατά τρόπο κεφαλή-ουρά. (Λιπαρά οξέα, τερπένια) Ενώσεις εξαιρετικά μεγάλης βιολογικής σημασίας και χρήσεων (αντιβιοτικά, αντικαρκινικά) Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 4

ΜΑΚΡΟΛΙ ΙΑ (macrolides) H Tartolon B Na B CH 3 H Me H Me Me H Me Me Me Me H H Me Me Me erythromycin A αντιβιοτικό Me H NMe 2 CH 3 H CH3 soraphen A αντιμυκητιακό H Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 5

ΠΟΛΥΕΘΕΡΕΣ ΚΑΙ ΠΟΛΥΕΝΙΑ Me H H Me H H H H Me H H 2 C Monensin A αντιβιοτικό H N Me H H rapamycin ανοσοκαταστολέας Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 6

ΑΡΩΜΑΤΙΚΑ ΠΟΛΥΚΕΤΙ ΙΑ Me H H H rubrofusarin Me H H Me Me Aflatoxin B1 καρκινογόνος μυκητοξίνη NH 2 H daunomycin αντικαρκινικό C 2 H H 6-methylsalicylic acid αρωματικό αντιβιοτικό Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 7

ΠΟΛΥΚΕΤΙΔΙΑ Κοινό χαρακτηριστικό όλων των πολυκετιδίων είναι ο τρόπος με τον οποίο κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσής τους σχηματίζονται νέοι δεσμοί C-C: C αποκαρβοξυλιοτική συνένωση μαλονικού και ενός άκυλο θειοεστέρα με αποτέλεσμα την παραγωγή ενός β-κετο-θειοεστέρα. Ο βιοσυνθετικός μηχανισμός προσομοιάζει εξαιρετικά με τη βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων και μάλιστα η βιοσύνθεση των λιπαρών οξέων μπορεί να θεωρηθεί απλά σαν μια ειδική περίπτωση βιοσύνθεσης πολυκετιδίων. Πως τόσο διαφορετικά δομικές ενώσεις προέρχονται από την ίδια βιοσυνθετική οδό (pathway)????? Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 8

H 3 C (5) CoA ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΛΙΠΑΡΩΝ ΟΞΕΩΝ acetyl-coa carboxylase C 2 H ACP ACP CoA H malonyl-coa ACP CoAH ACP H malonyl-acp ACP fatty acid malonyl-coa ACP ACP C 2 HCoA H ACP ACP ACP Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 9

ΠΡΟΤΕΙΝΗ ΦΟΡΕΑΣ ΑΚΥΛΙΟΥ (acyl carrier protein ACP) H N H N H - P NH 4'-phosphopantetheine moiety peptide chain Ο βραχίονας φωσφοπαντοθενικού της ACP (θειοεστέρας) έ πηγαινοφέρνει τα υποστρώματα μεταξύ των ενζυμικών ενεργοτήτων

R AT K ACP KR DH ER R ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΠΟΛΥΚΕΤΙ ΙΩΝ CoA C 2 CoA AT acyl transferase keto synthase acyl carrier protein keto reductase dehydratase enoyl reductase Ομάδα εκκίνησης (starter unit) R K R * ACP Ομάδα επέκτασης (extender unit) C 2 H K R R * ACP R R R R * * R R * ACP ER ACP DH ACP Σχηματισμός δεσμού C-C στη βιοσύνθεση πολυκετιδίων προς παραγωγή δι-, τρι-, πολυκετιδίων KR H

ΟΜΙΚΗ ΠΟΙΚΙΛΙΑ ΠΟΛΥΚEΤΙ ΙΩΝ (σύγκριση με FA) Οφείλεται στην επιλογή της ομάδας εκκίνησης (οξικό, προπιονικό, βουτυρικό, φαινολικό) Στην ικανότητα ενσωμάτωσης όχι μόνο ομάδων οξικού, αλλά και ομάδων προπιονικού (C 3 ) και βουτιρικού (C 4 ) και στον αριθμό αυτών των ομάδων Στο διαφορετικό βαθμό αναγωγής γής της κέτο ομάδας του β-κετο- θειοέστερα Συνεπώς προκύπτουν μχρ μέχρι και δυο οπτικώς ενεργά κέντρα για κάθε βιοσυνθετικό κύκλο ιαφορετικές αντιδράσεις κυκλοποίησης ης Μέτα πολυκετιδικές τροποποίησεις όπως οξειδώσεις, αναγωγές, γ μεθυλιώσεις, ακυλιώσεις, γλυκοσυλιώσεις Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 12

ΠΟΙΚΙΛΙΑ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗΣ ΠΟΛΥΚΕΤΙ ΙΩΝ Πλήρης αναγωγή Enz fatty acids pathway A R Enz + n R C 2 H Enz pathway B H H Enz pathway C complex polyketides type I Καμία αναγωγή Enz aromatic polyketides type II Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 13

ΠΟΛΥΚΕΤΙ ΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ (Polyketide synthases PK) Οι διαφορές στις δομές των πολυκετιδίων προκύπτουν από διαφορές στην ενζυμική αρχιτεκτονική, οργάνωση και λειτουργία. Υπάρχουν δυο ακραίες μορφές ενζυμικής οργάνωσης (όπως και στα FA). PK τύπος I PK τύπος II Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 14

ΠΟΛΥΚΕΤΙ ΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ (Polyketide synthases PK) TYPE I (modular) PK: πολύπλοκα ενζυμικά συστήματα. Κάθε αντίδραση της βιοσύνθεσης πραγματοποιείται από μια ξεχωριστή ενζυμική δραστικότητα (περιοχή-domain) και η οποία χρησιμοποιείται κατά κανόνα μια και μόνο φορά. Οι περιοχές (domain) υπεύθυνες για μια δομική μονάδα ακυλίου είναι οργανωμένες σε στοιχεία δραστικοτήτων (module) και τα οποία είναι οργανωμένα σε μια η περισσότερες πολυδραστικές πρωτεΐνες (πολύ μεγάλου μεγέθους). Παράγουν πολύπλοκα μη-αρωματικά πολυκετίδια όπως τα μακρολίδια, οι πολυεθέρες, τα πολυένια. Απαντώνται συνήθως σε βακτήρια και θαλάσσιους οργανισμούς. ιαφορετικός βαθμός αναγωγής σε κάθε βιοσυνθετικό κύκλο. Χρήση προπιονικού, βουτυρικού. Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 15

ΟΡΓΑΝΩΣΗ ΕΝΖΥΜΙΚΩΝ ΠΕΡΙΟΧΩΝ ΤΗΣ ΣΥΝΘΑΣΗΣ ΤΗΣ ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ TYPE I (modular) PK eryai eryaii eryaiii gene level 3 πλαίσια αναγνωσης load DEB 1 DEB 2 DEB 3 protein level module 2 module 4 module 6 module 1 module 3 module 5 end ER DH KR KR KR KR KR AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP TE H H H H H H H H H H H H H H H H H 6-Deoxyerythronolide B Γονιδιακό συγκρότημα ερυθρομυκίνης Α στο accharopolyspora erythraea. Η θειοεστεράση (thiosterare TE) κυκλοποίει (λακτόνη) και απελευθερώνει το πολυκετίδιο από το ένζυμο.

ΠΟΛΥΚΕΤΙ ΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ (Polyketide synthases PK) TYPE II (aromatic) PK: πιο πρωτόγονη συλλογή ξεχωριστών ενζύμων. Κάθε ενζυμική δραστικότητα αποτελεί και μια ξεχωριστή πρωτεΐνη. Κάθε μια από τις ενζυμικές αυτές δραστικότητες μπορεί να χρησιμοποιείται επαναληπτικά σε κάθε βιοσυνθετικό κύκλο (όπως και οι βακτηριακές FA). Απουσία αναγωγικών δραστικοτήτων (ΣΕ ΠΛΗΡΗ ΑΝΤΙΘΕΣΗ ΜΕ ΤΙΣ FA) και συνεπώς τρεις και μόνο ενζυμικές δραστικότητες-πρωτείνες μπορούν να αποτελούν την ελάχιστη PK. Απαντώνται σε μύκητες και φυτά. Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 17

TYPE II (aromatic) PK: AR Βιοσύνθεση της Doxorubicin i από βακτηριακή τύπου ΙΙ PK Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 18

ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΠΟΛΥΚΕΤΙ ΙΩΝ R CoA C 2 AT CoA R AT acyl transferase K keto synthase ACP acyl carrier protein KR keto reductase DH dehydratase ER enoyl reductase R R R * R * C 2 H K ACP K ACP type II PK FA type I KR R R R R * * H R R * ACP ER ACP DH ACP Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 19

Η εμφάνιση PK τύπου Ι ή ΙΙ έχει σχέση με τη δομή του πολυκετιδίου και όχι τον οργανισμό προέλευσης (σε αντίθεση με τα FA). Η δομική οργάνωση των FA εξαρτάται από τον οργανισμό που απαντώνται FA I: Θηλαστικών. Όλες οι ενζυμικές δραστικότητες είναι συνδεδεμένες (ομοιοπολικά) μ μεταξύ για να σχηματίσουν μια μεγάλη μγ πολυδραστική πρωτείνη (συνήθως επτά ενζυμικές δραστικότητες). FAII: Βακτηριακή. Αποτελείται από σετ διακριτών πρωτεϊνών οι οποίες μπορούν να απομονωθούν η κάθε μια ξεχωριστά. Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 20

ΣΥΣΤΗΜΑΤΑ ΙΑΦΟΡΕΤΙΚΗΣ ΕΝΖΥΜΙΚΗΣ ΑΡΧΙΤΕΚΤΟΝΙΚΗΣ Τα μοντέλα των PK τύπου Ι και ΙΙ δεν είναι οι μοναδικές περιπτώσεις που απαντώνται στη φύση. Ποικιλία παραδειγμάτων όπου η ενζυμική οργάνωση είναι ενδιάμεση των ακραίων δομών τύπου I και II. Επαναληπτικά PK Ι (iteratively) Συνθάσες της χαλκόνης (chalcone synthases CH). PK τύπος ΙΙΙ (φυτά) Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 21

Επαναληπτικά (iterative) PK Ι Επαναληπτικά PK Ι: Ενζυμική αρχιτεκτονική τύπου Ι, αλλά μερικές ενζυμικές δραστικότητες χρησιμοποιούνται επαναληπτικά (iteratively). ηλαδή οι ενζυμικές δραστικότητες είναι οργανωμένες σε μεγάλες πολυδραστικές πρωτείνες, αλλά σε αντίθεση με τις κλασικού τύπου Ι, μερικές από τις δραστικότητες χρησιμοποιούνται επαναληπτικά. Παραδείγματα η βιοσύνθεση από μύκητες των 6- MA και lovastatin. Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 22

Βιοσύνθεση Lovastatin από επαναληπτική μυκητιακή PK τύπου Ι Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 23

Συνθάσες της χαλκόνης (chalcone synthases CH) Συνθάσες της χαλκόνης (chalcone synthases CH): Ενζυμική αρχιτεκτονική τύπου ΙΙ (ξεχωριστά ένζυμα). Όμως τα ένζυμα αυτά μπορούν να χρησιμοποιήσουν τις ομάδες ακυλίου με τη μορφή του συνενζύμου Α (CoA), χωρίς να μεταφερθούν στην ACP. Επίσης πολλές ενζυμικές αντιδράσεις (αποκαρβοξυλίωση, κυκλοποίηση, δημιουργία δεσμού C-C, C αρωματοποίηση) Πολυκετίδια φυτών, φαινυλοπροπανοείδη (χρωστικές, αντι-uv, χημειοπροστατευτικές κλπ.). ) Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 24

Naringenin (ναρινγκίνη). Συνθάση της χαλκόνη (chalcone synthase). Φυτά τυπος ΙΙΙ PK Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 25

ΜΗ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΕΣ ΠΕΠΤΙ ΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ (non ribosomal peptide p synthases NRP) Τα μη ριβοσωμικά πεπτίδια είναι γραμμικά, κυκλικά ή διακλαδιζώμενα πεπτίδια με συνήθως λιγότερο από 20 μονάδες Πολλά μη ριβοσωμικά πεπτίδια είναι πολύ σημαντικά φάρμακα όπως η κυκλοσπορίνη Α,, πενικιλίνη, βανκομυσίνη Παράγονται από τις μη ριβοσωμικές πεπτιδικές συνθάσες οι οποίες εκτός από τα πρωτεϊνογενή αμινοξέα (20) μπορούν και χρησιμοποίουν γύρω στα 300!!!! άλλα αμινοξέα Οι NRP έχουν δομή και ενζυμική αρχιτεκτονική παρόμοια με τον τυπο Ι PK (modular) Για κάθε δομική μονάδα-αμινοξύ, υπάρχει ένα διαφορετικό στοιχείο ενζυμικών δραστικοτήτων (module) και όλες μαζί είναι οργανωμένες σε μια η περισσότερες πολυδραστικές πρωτεΐνες Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 26

ΜΗ ΡΙΒΟΣΩΜΙΚΕΣ ΠΕΠΤΙ ΙΚΕΣ ΣΥΝΘΑΣΕΣ (non ribosomal peptide synthases NRP) module' module'' module' module'' C A PCP C A PCP C A PCP C A PCP H R ' πεπτιδικός R'' R'' δεσμός NHR NH 2 NH A: adenylation PCP: peptyl p carrier protein γνωστό και ως T: thiolation C: condenastion E: epimerasation MT: methylation Cy: cyclisation R: reduction x: oxidation RHN R ' Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 27

Πολλά παραδείγματα συστημάτων που είναι μίγματα δυο από των παραπάνω για παράδειγμα εναλλαγή PK τύπου Ι και ΙΙ, μεικτά PK/NRP (epothiolone, myxothiazol, rapamycin) Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 28

MEIKTA PK/NRP (ή μήπως φυσική βιοσυνθετική μηχανική) N H H H 2 N H PK/NRP systems H Epothilone cysteine N N Me Me CNH 2 Myxothiazol Χρησιμοποίηση αμινοξέων σαν δομικές μονάδες σε φυσικά συστήματα PK/NRP. Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 29

Βιοσύνθεση ραπαμυκίνης Me H Me H N Me H H rapamycin ανοσοκαταστολέας Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 30

Ταξινόμηση διαφόρων PK σε σχέση με τους οργανισμούς Τύπος PK Οργανισμοί Modular PK τύπος Ι Βακτήρια (πρώτιστα) Επαναληπτική PK τύπος Ι Μύκητες (μερικά βακτήρια) Επαναληπτική PK τύπος ΙΙ Μύκητες, φυτά, βακτήρια Επαναληπτική PK τύπος ΙΙΙ PK/NRP υβριδικά Κυρίως φυτά, (μερικά βακτήρια και μύκητες) Βακτήρια - μύκητες Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 31

ΣΥΝ ΙΑΣΤΙΚΗ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ (combinatorial biosynthesis) Το μοντέλο ενζυμικής αρχιτεκτονικής PK τύπου Ι προβλέπει ότι κάθε ενζυμική περιοχή (domain) είναι υπεύθυνη για μια και μόνο αντίδραση της βιοσύνθεσης και κάθε στοιχείο δραστικοτήτων για κάθε δομική μονάδα. Υπόθεση: Πιθανές αλλαγές στο γονίδιο θα πρέπει να προκαλέσουν τις αντίστοιχες αλλαγές στη δομή του μορίου. Αξιοποίηση της τεράστιας βιοσυνθετικής ποικιλίας (δομικές μονάδες, στερεοχημεία, οξειδωτική κατάσταση) των πολυκετιδίων για την επίτευξη των τεραστίου εύρους δομικών αλλαγών. Παραγωγή υβριδικών αντιβιοτικών ή μη-φυσικών φυσικών προϊόντων με τη χρήση της λεγόμενης βιοσυνθετικής μηχανικής. Mutasynthesis: Η παραγωγή αναλόγων φαρμακευτικών προϊόντων,, όχι με χημική σύνθεση, αλλά με τη χρήση της μοριακής βιολογίας (σχεδιασμένες αλλαγές στο επίπεδο των γονιδίων)

Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 33

ΣΥΝ ΙΑΣΤΙΚΗ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ (combinatorial biosynthesis) Η συνδυαστική βιοσύνθεση κατέστη δυνατή με τη κατανόηση της βιοσύνθεσης των πολυκετιδίων και ανάπτυξη της γενετικής, κλωνοποίησης, μικροβιολογίας, ετερόλογης έκφρασης πρωτεϊνών. Επίσης η αλληλουχία πολλών βιοσυνθετικών γονιδιωμάτων έχει αποσαφηνισθεί, προσφέροντας τη δυνατότητα αναγνώρισης των αλληλουχίας λ υπεύθυνων για συγκεκριμένες αντιδράσεις. Εφαρμογή σε Βακτήρια. Actinomycetes (βακτήρια εδάφους) και ειδικά στα treptomyces. Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 34

ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ eryai eryaii eryaiii load DEB 1 DEB 2 DEB 3 module 2 module 4 module 6 module 1 module 3 module 5 end ER DH KR KR KR KR KR AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP TE H H H H H H H H H H H H H H H H H 6-Deoxyerythronolide B

ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ H H H H H H H hydroxylase glycosyltransferase H H 6-Deoxyerythronolide H Me H H H H e H glycosyltransferase H NMe 2 H H ()-methyltransferase Me H Me erythromycin A H H NMe 2 H H hydroxylase Me H H H H H NMe 2 Me H H

ΔΙΑΓΡΑΦΗ ΤΗΣ KR ΣΤΟ ΣΤΟΙΧΕΙΟ 5 ΤΗΣ ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ K DEB 3 module 6 module 5 end KR KR AT ACP K AT ACP TE 5 H κυκλοποίηση H 5 H μετα PK γλυκοσυλίωση H 5 H H H 5 H H H H NMe 2 H H H Me Me H erythromycin A Donadio et al 1991: Το πρωτοποριακό πείραμα που αποκάλυψε την ενζυμική Donadio et al. 1991: Το πρωτοποριακό πείραμα που αποκάλυψε την ενζυμική αρχιτεκτονική των PK τύπου Ι και άνοιξε το δρόμο της συνδυαστικής βιοσύνθεσης. Η διαγραφή της KR προκαλεί την ακριβώς προβλεπόμενη δομική αλλαγή.

ΔΙΑΓΡΑΦΗ ΤΗΣ ER ΣΤΟ ΣΤΟΙΧΕΙΟ 4 ΤΗΣ ΕΡΥΘΡΟΜΥΚΙΝΗΣ DEB 2 DEB 3 module 4 module 6 module 3 module 5 end DH ER KR KR KR H K AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP TE H H H H H H H H H H H H H H NMe 2 H H Donadio et al. 1993 Me H H Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 38

ΒΙΟΣΥΝΘΕΤΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ Biosynthetic engineering Τα παραπάνω πειράματα διαγραφής μίας ενζυμικής περιοχής σκοπό είχαν την μελέτη των ενζύμων PK τύπου Ι, αλλά αποκάλυψαν τις τεράστιες δυνατότητες τις οποίες έχει οι γενετική μηχανική τέτοιων συστημάτων. Από τότε η έρευνα της γενετικής τροποποίησης των PK έχει προσελκύσει τεράστιο ερευνητικό ενδιαφέρον. Μεθοδολογίες που έχουν χρησιμοποιηθεί η περιλαμβάνουν τη διαγραφή περιοχών, μεταφορά περιοχών ή στοιχείων, ανάμειξη περιοχών ή στοιχείων δυο διαφορετικών PK γονιδιακών συστημάτων, εμφύτευση νέων στοιχείων δραστικοτήτων, αλλαγή ενζυμικής εκλεκτικότητας ή ειδικότητας. Παράγωγή πληθώρα αναλόγων πολυκετιδίων. Απομώνωση των αντιστοίχων πρωτείνων DEB1, 2 και 3 και in vitro μελέτη. Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 39

ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΘΕΙΟΕΣΤΕΡΑΣΗΣ DEB-1-TE AT ACP K AT KR ACP K AT KR ACP TE H H H H cyclise triketide lactone Cortes et al., 1995: Μεταφορά της θειοεστεράσης στο τέλος της DEB1 και παραγωγή γή του τρικετιδίου αντί του επτακετιδίου. Εξαιρετικό μοντέλο μελέτης των PK (δουλεύει και in vitro), παραγωγή αναλόγων στατίτης κτλ. Από τότε η ΤΕ έχουν επιτυχώς τοποθετηθεί στο τέλος του στοιχείου 3 και 5 δινοντας τα αντίστοιχα τετρα-, εξα-κετίδια Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 40

ΥΒΡΙΔΙΚΗ PK-ΑΛΛΑΓΗ ΔΟΜΙΚΗΣ ΜΟΝΑΔΑΣ Hybrid PK απουσία μεθυλίου KR KR AT ACP K AT r ACP K AT ACP TE H cyclise H H AT r from RAP 1 H hybrid product liynyk et al., 1996: Αλλαγή δομικής μονάδας στη παραγωγή τρικετίδιου. Πληθώρα παραδειγμάτων αξιοποίησης διαφορετικών εκλεκτικοτήτων των ΑΤ. Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 41

AΝΤΙΚΑΤΑΣΤΑΣΗ ΣΤΟΙΧΕΙΟΥ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΩΝ ΣΤΗ DEB1-TE avermectin loading module Hybrid PK ery extension modules end KR KR AT ACP K AT ACP K AT ACP TE R cyclise R H R: Me, Et, i-pr, sec-bu H R H R: Ph R H Jacobsen et al., 1997: Εμφύτευση του στοιχείου φόρτωσης δομικής μονάδας από το γονίδιο της avermectin. Παραγωγή αναλόγων του τρικετίδιου. Wilkinson et al., 2001: Εμφύτευση του στοιχείου φόρτωσης δομικής μονάδας (Ph) από το γονίδιο του soraphen A Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 42

ΕΜΦΥΤΕΥΣΗ ΟΛΟΚΛΗΡΟΥ ΣΤΟΙΧΕΙΟΥ rap module 2 load module 1 module 2 module 3 module 4 module 5 module 6 end ER DH KR KR KR KR KR KR AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP K AT ACP TE H H Et H H Et novel octaketides H H H H Rowe et al. 2001: Εμφύτευση ολοκλήρου στοιχέιου απο το γονίδιο της ραπαμυκίνης και παραγωγή νέων οκτακετιδίων μακρολιδίων από καλιεργειες accharopolyspora erythraea. Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 43

ΥΒΡΙ ΙΚΕΣ PK Avermectin-erythromycin erythromycin υβριδικά αντιβιοτικά H Ανάλογα της ερυθρομυκίνης Α, Β, D, με τουλάχιστον την H NMe R 2 2 μ χ η H ίδια δραστικότητα R 1 H R 1 = H or CH 3, R 2 = H or H Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 44

ΣΥΝΔΙΑΣΤΙΚΗ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ - ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ H Me Me H Rapamycin Me H Me N Me H H H H H H NMe H 2 H + H Me H Erythromycin A H Me H H H Erymectamycin Avermectin B1b H H Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 45

ιερεύνηση προφίλ μικροβιακών μεταβολιτών με φασματομετρία μάζας Αλέξανδρος Σίσκος Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών, Ακαδημία Αθηνών asiskos@bioacademy.gr Μεταπτυχιακό δίπλωμα ειδίκευσης: Μικροβιακή Βιοτεχνολογία Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ 20 Ιανουαρίου 2010

ιερεύνηση προφίλ μικροβιακών μεταβολιτών με φασματομετρία μάζας Mutasynthesis Μικροοργανισμοί ως εργοστάσια παραγωγής βιοενεργών ουσιών Φασματομετρίας μάζας ιερεύνηση προφίλ μεταβολιτών Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 47

Mutasynthesis (a) Wild type (b) Μεταλλαγμα στο οποίο η βιοσύνθεση έχει ανασταλεί σε κάποιο κρίσιμο στάδιο (c) Precursor-directed biosynthesis: στη καλλιέργεια προσθέτουμε ανάλογα (mutasynthon) των πρόδρομων ενώσεων ανταγωνισμός με τις φυσικές πρόδρομες ενώσεις (d) Mutasynthesis: Μόνο τα ανάλογα παράγονται

Rapamycin Rapalogues Mutasynthesis of rapamycin: a) ομή ραπαμυκίνης, ηομάδα εκκίνησης φαίνεται με το κόκκινο b) ομές της φυσικής ομάδας εκκίνησης, και των ομάδων που ενσωματώθηκαν με mutasynthesis. Έξι νέα ανάλογα της ραπαμυκίνης παρήχθησαν, και βρίσκονται στη διαδικασία της αναπτυξης τους ως νέα φάρμακα Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 49

Βελτιώνοντας το Borrelidin ομή του Borrelidin και αναλόγων με αλλαγή ομάδας εκκίνησης με mutasynthesis Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 50

ΣΥΝΔΙΑΣΤΙΚΗ ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ (ετερόλογηέκφραση) Συστήματα ετερόλογης έκφρασης treptomyces coelicolor CH999 (actinorodin defecient, τύπος ΙΙ), treptomyces lividans K4-114 (actinorodin defecient, τύπος ΙΙ), accharopolyspora erythraea JC2 (ερυθρομυκίνη deficient, τυπος Ι) E.coli με συν-έκφραση Ppant ενζύμων Myxococcus xanthus Pseudomonas putida Στα συστήματα ετερόλογης έκφρασης θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη εάν υπάρχουν? Post-PK PK ενζυμα Φωσφωπαντοθεϊνικός βραχίονας Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 51

Παράδειγμα μεθοδολογίας ετερόλογης έκφρασης σε Pseudomonas putida Μεθοδολογία ετερόλογης έκφρασης βιοσυνθετικών γονιδίων από μη διαθέσιμες πήγες ή δύσκολες πηγές. ημιουργία βιβλιοθηκών βιοσυνθετικών γονιδιωμάτων Αναγνώριση και ανάλυση του γονιδιακού συγκροτήματος Κλωνοποίηση σε κατάλληλη κατασκευή με υποκινητή κλπ Μετασχηματισμός σε pseudomonad Παραγωγή της ουσίας στον ετερόλογο ξενιστή Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 52

Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 53

Φασματομετρία μάζας Αναλυτική μεθοδολογία, η οποία προσδιορίζει το λόγο m/z ιόντων στην αέρια φάση. Όλοι τα φασματόμετρα μάζας αποτελούνται από τρία τμήματα Πηγή ιόντων ιαχωριστής μαζών Ανιχνευτής Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 54

ιαφορετική αρχιτεκτονική στο σχεδιασμό του M, εξυπηρετεί διαφορετικές ανάγκες Aebersold & Mann, Nature, 2003

Χαρακτηριστικά μεθοδολογιών φασματομετρίας μάζας Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 56

Η υγρή χρωματογραφίας - φασματομετρία μάζας (LC-M) χρησιμοποιείται σε μεγάλο βαθμό στην έρευνα βιοσύνθεσης φυσικών προϊόντων. Ανίχνευση/ποσοτικοποίηση γνωστών μεταβολικών προϊόντων, ενδιάμεσων κλπ Ανακάλυψη «ορφανών» προϊόντων (νέων προϊόντων) από βακτήρια, μύκητες, κλπ Τέλος, μελέτη των βιοσυνθετικών ενζύμων (διαφορές ετερόλογης έκφρασης, μεταμεταφραστικές τροποποίησης, κλπ) Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 57

ιερεύνηση προφίλ μεταβολιτών (mining metabolite profile) Η ανάλυση των αλληλουχιών των μικροβιακών γονιδιωμάτων έχει αποκαλύψει την ύπαρξη πολυάριθμών «κρυφών» ρ φ ή «ορφανών βιοσυνθετικών συστάδων γονιδίων (gene clusters). «Ορφανές» συστάδες γονιδίων βιοσύνθεσης φυσικών προϊόντων είναι αυτές οι οποίες εκφράζουν βιοσυνθετικές πρωτεΐνες για φυσικά προϊόντα, αλλά ακόμη δεν έχουν βρεθεί οι αντίστοιχοι μεταβολίτες, πχ treptomyces coelicolor A3(2). Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 58

Μεθοδολογίες αναγνώρισης μεταβολικών προϊόντων από «κρυφά» ά gene clusters Genomisotopic (in vivo) Ανίχνευση με NMR Κλασματοποίηση, εκχύλιση Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 59

In vitro Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 60

Knockout «ορφανού» gene cluster Συγκριτικό μεταβολικό προφίλ (LC-M) εκχυλίσματος Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 61

Ετερόλογη έκφραση Συγκριτικό μεταβολικό προφίλ (LC-M) εκχυλίσματος Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 62

ιέγερση μεταγραφής Συγκριτικό μεταβολικό προφίλ (LC-M) εκχυλίσματος Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 63

Ανίχνευση phenalamid A από νέο στέλεχος Myxococcus με μεθοδολογία LC-M EI - TF Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 64

ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Η συνδυαστική βιοσύνθεση δίνει τη δυνατότητα παραγωγής βιβλιοθήκης αναλόγων φυσικών προϊόντων με σχεδιασμένες αλλαγές στο επίπεδο των γονιδίων. Τεραστία δυναμική στην ανακάλυψη νέων φαρμάκων Παντρεύει τη μοριακή βιολογία με τη συνθετική χημεία Επιθυμητή η δημιουργία βιοσυνθετικών βιβλιοθηκών δομικών μονάδων Σχεδιασμός φαρμάκων: Στο μέλλον o σχεδιασμός φαρμάκων θα γίνεται με το ανακάτεμα και ταίριασμα γονιδίων κατά παραγγελία για τη δημιουργία νέων επιθυμητών ενώσεων. Αξιοποίηση του ενζυμικού συστήματος σαν μια μοριακή γραμμή παραγωγής Η μεθοδολογίες μεταβολομικής και φασματομετρίας μάζας αποκτούν αυξανόμενο ενδιαφέρον στην έρευνα μικροβιακών δευτερογενών μεταβολιτών Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 65

ΒΙΟΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Ανασκόπησης (Για τις εξετάσεις να διαβάσετε τα τρία πρώτα) 1. Amoutzias GD, Van de Peer Y, Mossialos D. Evolution and taxonomic distribution of nonribosomal peptide and polyketide synthases. Future Microbiol. 2008;3:361-70. 2. Weissman KJ. Mutasynthesis - uniting chemistry and genetics for drug discovery. Trends Biotechnol. 2007; 25(4):139-42. 3. Challis GL. Mining microbial genomes for new natural products and biosynthetic pathways. Microbiology. 2008 Jun;154(Pt 6):1555-69. PubMed PMID: 18524911. 4. Bode HB, Müller R. Analysis of myxobacterial secondary metabolism goes molecular. J Ind Microbiol Biotechnol. 2006;33(7):577-88. 5. Weissman KJ, Müller R. A brief tour of myxobacterial secondary metabolism. Bioorg Med Chem. 2009 ;17(6):2121-36. 6. Hertweck C. The biosynthetic logic of polyketide diversity. Angew Chem Int Ed Engl. 2009;48(26):4688-716. 7. taunton, J. and Weissman, K.J., 2001. Natural Products Reports, 18, 380-416. Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 66

ΒΙΟΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Ερευνητικά άρθρα 1. Donadio,.;taver,M.J.;McAlpine,J.B.;wanson,.J.;Katz,L.cience 1991, 252, 675-679. 679 2. Donadio,.; McAlpine, J. B.; heldon, P. L.; Jackson, M.; Katz, L. Proc. Natl. Acad. ci. U..A. 1993, 90, 7119. 3. Cortes, J.; Wiesmann, K. E. H.; Roberts, G. A.; Brown, M. J. B.; taunton, J.; Leadlay, P. F. cience 1995, 268. 4. liynyk,m.;brown,m.j.b.;cortes,j.;taunton,j.;leadlay,p.f.chem. Biol. 1996, 3, 833-839. 5. Jacobsen, J. R.; Hutcinson, C. R.; Cane, D. E.; Khosla, C. cience 1997, 277, 367-369. 6. Wilkinson, C. J.; Frost, E. J.; taunton, J.; Leadlay, P. F. Chem. Biol. 2001, 151, 1-12. 7. Hill, A., M., Harris, J. P., iskos, A., P., 1998. Chem. Commun., 2361-2362. 8. Rowe,C.J.,Bohm,I.U.,Thomas,I.P.,Wilkinson,B.,Rudd,B.A.M.,Foster,G., Blackaby, A. P.,idebottom, P. J., Roddis, Y., Buss, A. D., taunton, J., Leadlay, P. F., Chemistry and Biology 2001, 8, 475-485. Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 67

ΒΙΟΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Ερευνητικά άρθρα 9. iskos AP, Baerga-rtiz A, Bali, tein V, Mamdani H, piteller D, Popovic B, pencer JB, taunton J, Weissman K, Leadlay PF (2005) Molecular Basis of Celmer s Rules: tereochemistry of Catalysis by Isolated Ketoreductase Domains from Modular Polyketide ynthases. Chem Biol, 12(10): 1145-1153. 10. Hong H, Appleyard AN, iskos AP, Garcia-Bernardo J, taunton J, Leadlay PF. Chain initiation on type I modular polyketide synthases revealed by limited proteolysis and iontrap mass spectrometry. FEB J. 2005; 272(10):2373-87. 11. Weissman KJ, Hong H, liynyk M, iskos AP, Leadlay PF. Identification of a phosphopantetheinyl transferase for erythromycin biosynthesis in accharopolyspora erythraea. Chembiochem. 2004; 5(1):116-25. Α. Σίσκος. Συνδυαστική Βιοσύνθεση 68