פיתוח מערכת הטרולוגית לבחינת התפתחות ופעילות בלוטת העטין של בקר Heterologous system for analyzing bovine mammary development and actives דו"ח מסכם לתוכנית מחקר מספר 362-0339-15 מוגש למועצת החלב ע"י: איתמר ברש (חוקר ראשי) מכון לחקר בע"ח, מכון וולקני, מנהל המחקר החקלאי בית דגן מכון לחקר בע"ח, מכון וולקני, מנהל המחקר החקלאי בית דגן גת ראונר מכון לחקר בע"ח, מכון וולקני, מנהל המחקר החקלאי בית דגן משה רייכנשטיין תקציר מטרת תוכנית מחקר זו היא יצירת מודל להתפתחות בלוטת חלב של בקר ברקמת השומן של בלוטת החלב העכברית. מודל זה ישמש לחקר התפתחות הבלוטה מבקר ובחינת השפעות שונות על פעילותה. על מנת שניתן יהיה להתגבר על מכשולים בהתפתחות המבנים הפונקציונאליים מבקר בבלוטת החלב העכברית כפי שדווחו בעבר, הוגדרו בעבודה זו ארבע גישות: 1. שימוש בעכברים מדוכאים חיסונית ברמה גבוהה (NOD-.SCID) 2. הגברת הפיברוטיות של הרקמה 3. השראה הורמונאלית 4. יצירת כימרות ומבנים אפיתליאליים המכילים תאי עכבר ובקר. בעבודת המחקר הושתלו תאים אפיתליאליים מבקר לרקמת השומן של בלוטת החלב העכברית, ממנה הוסרו צינוריות החלב האנדוגניות. נמצא כי המעבר לעבודה על עכברים מדוכאים חיסונית ברמה גבוהה (NOD-SCID) איפשר התפתחות מבנים ספריים חלולים מבקר שהתקימו לפחות 8.5 שבועות לאחר ההשתלה ובכך נפרץ מחסום ההתפתחות שנקבע לפרוצדורה דומה ב"עכברים ערומים". אנליזה אימונוהיסטולוגית של חתכים ממבנים אלה הראתה זהות בין מאפייני המבנים מבקר ובלוטת החלב של עגלה. הגברת הפיברוטיות של רקמת השומן העכברית שיפרה את מספר המבנים המתפתחים, אך לא את החדירה שלהם לסטרומה השומנית. הגדלת הפיברוטיות של הרקמה שיפרה את קליטת תאי הבקר ברקמה העכברית ואת מספר המבנים המתפתחים. טיפול באסטרוגן ופרוגסטרון, הביא, במקרים מסוימים, ליצירת מבנים דמויי עטין בקר. עיכוב פארקריני על ידי לפטין של התפתחות מבנים אפיתליאליים מבקר נקבע בניסויים בתרבית. בחנו גם את האפשרות לשיפור התפתחות הבלוטה מבקר על ידי יצירת בלוטה כימרית המכילה תאים אפיתליאליים ממקור בקר ועכבר. הנסיונות הראו כי במרבית המקרים, שני סוגי התאים מתפתחים בנפרד וכי במרבית המקרים אין השפעה של תאי העכבר, המתפתחים לבלוטה מייצגת, על ההתפתחות המוגבלת (למקום) של תאי הבקר. 1
לסיכום: על ידי מניפולציות תאיות וסיסטמיות הצלחנו לשפר את קליטת התאים האפיתליאליים מבקר בבלוטה העכברית, ולשפר, אם כי לא באופן קונסיססטנטי, את התפתחות הבלוטה עד למצב של יצירת בלוטה מושלמת מבקר, הכוללת את המבנה האופיני של ducts).tdlu (Terminal lubuloalveolar Abstract Systemic growth and branching stimuli, and appropriate interactions with the host stroma are essential for the development of foreign epithelia in the mammary gland of immunodeficient mice. These factors were manipulated to promote and investigate the generation of representative bovine epithelial morphology in the transplanted mouse mammary stroma. The bovine mammary epithelium is unique in its commitment to rapid proliferation and high rate of differentiation. Its morphological organization within a fibrotic stroma resembles that of the human breast, and differs significantly from the rudimentary ductal network that penetrates a fatty stroma in mice. Transplantation of bovine mammary epithelial cells into the cleared mammary fat pad of NOD-SCID mice led to continuous growth of epithelial structures. Multilayered hollow spheres developed within fibrotic areas, but in contrast to mice, no epithelial organization was formed between adipocytes. The multilayered spheres shared characteristics with the heifer gland s epithelium, including lumen size, cell proliferation, cytokeratin orientation, estrogen/progesterone receptor expression and localization, and milk protein synthesis. However, they did not extend into the mouse fat pad via ductal morphology. Pre-transplantation of fibroblasts increased the number of spheres, but did not promote extension of bovine morphology. The bovine cells preserved their fate and rarely participated in chimeric mouse bovine outgrowths. Nevertheless, in some cases, terminal ductal lobuloalveolar unit (TDLU) development was recorded in mice treated with estrogen and progesterone, implying the feasibility of this representative bovine morphology s development. In vitro extension of these studies revealed paracrine inhibition of bovine epithelial mammosphere development by leptin secreted from the mouse adipocytes, which was also generalized to breast epithelial mammosphere formation. The rescue of mammosphere development by fibroblast growth factor administration evidences an active equilibrium between inhibitory and supportive effects exerted by the adipose and fibrotic regions of the stroma, respectively, which determines the development of foreign epithelium. In summary, by systemic and cellular manipulation of the mammary mouse fat pad, followed by transplantation of bovine mammary cells, we have succeeded to generate, a representative model of the bovine mammary gland development and function that may allow complexed bovine studies in the 2
rodent model. A better consistency in generating the complete bovine gland in the mouse stroma warrant further comparative studies of the bovine vs. the mouse gland. מבוא: למרות החשיבות הכלכלית והלאומית של מערך יצור החלב הן בישראל והן בעולם, המחקר בתחום הביולוגיה של בלוטת החלב והגורמים המשפיעים על ההתפתחות והפונקציונליות שלה מפגר מאד בהשוואה למחקר הבסיסי שמבוצע בחיות מעבדה והמחקר ההומני, המונע בעיקרו מהצורך למצוא פתרון לעליה הנמשכת בהתפתחות סרטן השד. הפיגור בחקר בלוטת העטין של חיות המשק נובע מגודל החיה, גודלה היחסי של בלוטת החלב, אורך הדור והזמן הרב יחסית הדרוש למעקב אחר השפעות שונות. גורמים אלו משפיעים כמובן גם על היתכנות ניסויים רבים ותורמים לעלותם הגבוהה. חיות מעבדה, בעיקר עכברים, משמשים כמודל מקובל לחקר בלוטת העטין והשד ההומני. בחיות אלה קימת אחידות יחסית בין הפרטים וניתן לבצע בהן מניפולציות גנטיות שונות. למרות תרומם הרבה של מודלים אלה לחקר ביטוי גנים ופעילות חלבונים בבלוטת העטין, כמו גם לחקר אספקטים התפתחותיים שונים, קימת שונות בין מבנה בלוטת העטין של עכבר ובקר. לדוגמא, היחידה הפונקצינלית של בלוטת העטין של בקר (וגם בשד ההומני) היא ה- Termeinal Ductal Lobuloar Unit (TDLU) ואילו בעכבר היא ה-.(LA) Lobular Unit יחידות אלה הינן בעלות שונות מורפולוגית. בנוסף, קיים גם הבדל בין במבנה הסטרומה אשר הינה שומנית במכרסמים ופיברוטית בעטין בקר ובשד ההומני. הבדלים נוספים במיקום ופעילות חלבונים פונקצינליים ורגולטורים דוגמת ציטוקרטין 6 וחלבוני מסלול ה NOTCH אחת הדרכים היעילות לעקוב אחר תהליכים ביולוגיים והתפתחותיים נמצאו על ידנו לאחרונה. in vivo ברקמות הומאניות הינה פיתוח הרקמה בחית מעבדה מאמצת, אם על ידי השתלה במקומה הטבעי או במקום אחר בעל אספקת דם טובה, לדוגמא מתחת לקפסולה של הכליה. לכיוון מחקרי זה יתרונות שכן העכבר הינו חיה בעלת מחזור רביה קצר יחסית והתנהגות סיסטמית המאפיינת את מרבית היונקים. קושי רב קיים בגידולם של תאים לא סרטניים ממקור הומני או ממקור בקר בבלוטת החלב של עכברים מדוכאים חיסונית. אחת הסיבות העקריות לכך היא כנראה השונות במבנה עטין הבקר אשר הינו בעל מאפינים פיברוטיים בהשוואה לעכבר בהעדר הגורמים סביבתיים מתאימים או קיומם של גורמים מעכבים. מטרות המחקר: מטרת המחקר הינה השראת התפתחות עטין בקר ברקמת השומן של עטין עכבר לבחינת התפתחות ופעילות עטין הבקר בתנאים שונים. באופן ספציפי הוגדרו בתוכנית ארבע גישות: 1. שימוש בעכברים מדוכאים חיסונית ברמה גבוהה.(NOD-SCID) 4. יצירת כימרות ומבנים אפיתליאליים המכילים תאי עכבר ובקר. 2. הגברת הפיברוטיות של הרקמה 3. השראה הורמונאלית תוצאות ומסקנות: השתלת תאי בקר לרקמת השומן של בלוטת עטין עכבר מבנים אפיתליאליים מבקר NOD-SCID אפשרה התפתחות נמשכת של 3
תאים אפיתליאליים מבלוטת החלב של עגלות (7-10 חודשים) הושתלו לבלוטת החלב של עכבר מדוכא חיסונית,NOD-SCID ממנה הוסרה קודם לכן מערכת הצינוריות האנדוגנית (תמונה 1) בגיל 3 שבועות. שבועיים לאחר מכן הושתלו תאי הבקר. מבנים אפיתליאליים ממקור בקר אופיינו החל משלשה שבועות לאחר ההשתלה. אלה המשיכו להתפתח עד תום המעקב 8.5 שבועות לאחר ההשתלה. בכך נפרץ המחסום של התפתחות בת ששה שבועות שנקבעה בעכברים ערומים mice).(nude המבנים ממקור בקר הכילו חלל הדומה לזה הקיים באלואלי מעטין עגלה, אך התפתחות של צינורות לא אופיינה. התפתחות המבנים הרב שכבתיים מוקמה באזורים פיברוטיים (תמונה 1H). מבנים חד שכבתיים עגולים אופיינו בגבול שבין האזורים פיברוטיים ורקמת השומן של העכבר. בין תאי השומן של בלוטת החלב של העכבר מוקמו תאים אפיתליאליים בודדים מבקר ללא כל ארגון או מורפולוגיה. הסטרומה העכברית הוצאה, נצבעה בקרמין אלום (אדום ורוד) ותחת הבינוקולר הוצאו המבנים הרב שכבתיים ממקור בקר וקובעו בבלוק פארפין. תמונה 1. יצירת מבנים אפיתליאליים ממקור בקר בבלוטת עטין של עכבר. A. פרוצדורת הניסוי. B-D התפתחות המבנים מבקר לאורך זמן. E. צביעת קרמין של Wholemount מבלוטת חלב של עגלה. F - חתך היסטולוגי של מבנה אפיתליאלים מבקר שהתפתח בבלוטת חלב של עגלה. G. חתך היסטולוגי מבלוטת חלב של עגלה. H. התפתחות המבנים הרב שכבתיים מוגבלת לאזורים פיברוטיים. בינם לבין רקמת השומן העכברית מתפתחים מבנים חד שכבתיים, ובין תאי השומן של הסטרומה העכברית קימים תאי בקר פזורים ללא התארגנות. למבנים מבקר שהתפתחו ברקמה העכברית מאפיינים דומים לאלו של עטין העגלה 4
אנליזה אימונוהיסטוכימית של חתכים היסטולוגיים (תמונה 2) הראתה דמיון בין מאפייני המבנים מבקר שהתפתחו בסטרומה העכברית לבין חתכים מרקמת עטין עגלה: ביטוי PCNA העיד על קצב חלוקת תאים דומה. ביטוי חלבוני החלב ביתא לקטוגלובולין וקזאין על ידי תאים לומינליים העיד על פעילות דומה, ביטוי ER אלפא ו PR (רצפטורים לאסטרוגן ופרוגסטרון, בהתאמה) על ידי תאים מרוחקים מהלומן העיד על התמינות ומורפולוגיה דומה, וביטוי ציטוקרטין 14 בתאים החיצוניים של המבנים העיד דמיון מורפולוגי ומיקומם המתאים של התאים המיואפיתליאליים במבנים ממקור בקר שהתפתחו בעכבר. תמונה 2. איפיון אימונוהיסטולוגי של המבנים אשר התפתחו לאחר השתלת תאי בקר לבלוטת החלב העכברית בהשוואה למבנים האפיתליאליים בעטין עגלה. 5
השפעת הגברת הפיברוטיות של הסטרומה השומנית של עכבר על קליטה והתפתחות מבנים אפיתליאליים מבקר לאחר שהראינו את התפתחותם של המבנים האפיתליאליים מבקר באזורים פיברוטיים בבלוטה, נבחנה האפשרות להפוך את הסטרומה השומנית מבקר לפיברוטית יותר (ובכך דומה לסטרומה של עטין הבקר) על ידי השתלת פיברובלסטים לפני ותוך כדי השתלת התאים האפיתליאליים ממקור בקר. הפרוצדורה מתוארת בתמונה 3. אכן, השתלת פיברובלסטים לפני השתלת תאי הבקר העלתה באופן משמעותי את מידת הפיברוטיות של הרקמה. זאת על פי צביעת Sirius Red (תמונv.(3B-D השתלת פיברובלסטים לפני השתלת התאים האפיתליאליים העלתה באופן מובהק את מספר הבלוטות בהן נקלטו תאי הבקר ופיתחו את המבנים הספריים עד ל- 84% מכלל הבלוטות שהושתלו. עם זאת, לא נמצא שינוי במורפולוגיה שהתפתחה שהיתה מוגבלת למבנים ספריים בלבד ללא צינורות וללא חדירה לסטרומה של הבלוטה העכברית. תמונה 3. השפעת הגברת הפיברוטיות של רקמת השומן על ידי השתלת פיברובלסטים על התפתחות מבנים אפיתליאליים מבקר. A. פרוצדורת הניסוי. B-D השפעת השתלת פיברובלסטים על מדד הפיברוטיות של הרקמה. B- צביעה לקולגן לאחר השתלת פיברובלסטים. C. ביקורת. D- כימות ההשפעה. E- השתלה מוקדמת של פיברובלסטים מגדילה את מספר הבלוטות בהם מתפתחים מבנים אפיתליאליים מבקר 6
השפעת חשיפה לרמות גבוהות יותר של אסטרוגן ופרוגסטרון על התפתחות המבנים האפיתליאליים מבקר אסטרוגן ופרוגסטרון מבקרים את התארכות והסתעפות צינוריות החלב בבלוטת החלב המתפתחת, בהתאמה. במטרה לעודד צמיחת צינוריות חלב ממקור בקר בעכבר, נחשפו עכברים לרמות סופר-פיזיולוגיות של הורמונים אלה על ידי השתלה מוקדמת של pellet המשחרר כמויות קבועות של ההורמונים אלה. הפרוצדורה מתוארת בתמונה 4. נמצא כי אכן בלוטת חלב אנדוגניות של עכברה בתולה אשר נחשפה לרמות סופר-פיזיולוגיות של אסטרוגן ופרוגסטרון למשך שלשה שבועות היו מפותחות יותר מבחינת מספר הצינוריות ורמת המסועפות שלהן (תמונה.(4B-C רמות ההורמונים הגבוהות לא השפיעו על מספר המבנים המתפתחים, אולם במקרה אחד התפתחה מורפולוגיה דומה מאד לזו של עטין הבקר. תמונות 4F-I מציגות מורפולוגיה אופיינית של Terminal Ductal Units ממקור בקר אשר התפתח בסטרומה העכברית. עם זאת חדירה משמעותית לתוך הסטרומה העכברית לא הוצגה. תמונה 4. השפעת טיפול באסטרוגן ופרוגסטרון על התפתחות בלוטת החלב של בקר בעכבר. A. הפרוצדורה. B,C בלוטות אנדוגניות ללא ולאחר טיפול בסטרואידים. D,E מבנים ספריים התפתחו במרבית הבלוטות..F-J התפתחות TDLU דמוי בקר בבלוטת העטין העכברית. 7
נסיונות ליצירת בלוטה כימרית המורכבת מתאי עכבר ובקר ככלי לשיפור התפתחות בלוטת החלב מבקר בסטרומה השומנית העכברית. מטרת ניסויים אלה היתה לנסות ולהשתמש בפוטנציאל ההתפתחות המלא של תאי העכבר על מנת לגרום להתפתחות מלאה של בלוטת חלב שעיקרה תאי בלוטת חלב מבקר. תמונה 5. השתלת תערובת של תאי בת חלב ממקור עכברי וממקור בקר כמעט ולא יוצרת בלוטה כימרית. A. יחסים בין מספר התאים המושתלים והתפתחות מבנים בסטרומה העכברית. C,B הגדלות שונות של מבנים מעורבים (דמויי בלוטה עכברית וכאלה המתפתחים לאחר השתלת תאי בקר). D. רק באחד מתוך 14 קבענו ביטוי של חלבון החלב הספציפי לבקר במבנים "מסועפים" לאחר השתלה. מרבית המבנים דמויי האלויאלי (כדוריים) הכילו את ה DNA ממקור בקר. אזור בו מתפתחים מבנים ספריים מוקף בקו מקוקו. חץ מציין התפתחות מבנה מסועף. 8
בניסוי הושתלו תאי בלוטת חלב מבקר ) 5 4X10) עם מספר זהה או נמוך יותר ) 4 8X10) 4, 4X10 של תאי עכבר (תמונה 5). התפתחות מבנים בסטרומה השומנית נבחנה לאחר 6 שבועות. השתלת תאי בקר הביאה להתפתחות מבנים ספריים ב 75% מהבלוטות המושתלות. ככל שהוספו תאי עכבר עלה המספר היחסי של הבלוטות בהן התפתחות מבנים. עם זאת, נראה כי השתלה מעורבת של תאי עכבר ובקר הביאה להתפתחות שתי סטרוקטורות נפרדות. מבנים ספריים שהתפתחותם מוגבלת למקום ההשתלה, ובנפרד רשת צינוריות דמוית בלוטה עכברית. אכן, ללא נוכחות תאי עכבר לא נוצרו מבנים מסועפים (דמויי מורפולוגית עטין עכבר) ומספרם של אלה שהתפתחו, תאם את מספר תאי העכבר בתערובת התאים. בחנו באופן גנטי את תרומת התאים ממקור בקר להתפתחות הסטרוקטורות על ידי קביעת הגן ל - -β lactoglobulin אשר ספציפי לבקר ואינו קיים בעכבר. אכן קיומו של גן זה תאם את מספר תאי הבקר שהושתלו. ורק במקרה אחד נמצאה מורפולוגיה מסועפת אשר הכילה תאים אשר נשאו את הגן מבקר. לכן, אנו מסיקים כי השתלת תערובת של תאי עכבר ובקר לסטרומה השומנית מביאה לרוב להתפתחות נפרדת של מבנים דמויי מורפולוגיה של בלוטת חלב מעכבר ומבנים ספריים דמויי אלויאולי של בקר. יצירת מבנים כימריים, אם קיימת, הינה נדירה יחסית ונמצאה בעבודה זו באחד מ 14 מקרים. יצוין עוד, כי מאמץ רב ואמצעים כספיים הושקעו ביצירת נוגדנים ספציפיים אשר יזהו חלבונים מבקר ולא מעכבר וישמשו לזיהוי דיפרנציאלי של תאים ממקור ספציפי במבנים הכימריים. לשם כך יצרנו, תוך שיתוף פעולה עם חברה מסחרית, נוגדנים לפפטיד בן 10 חומצות אמינו מהחלבון נוקלאולין ממקור בקר אשר מטרתו היתה להכיר באופן ספציפי את החלבון ממקור בקר ובעזרתו להבדיל בין תאי בקר ועכבר. לצערנו הנוגדן הכיר אמנם את החלבון ממקור בקר, אך לא היה ספציפי במידה מספקת לתאי בקר בלבד. בהמשך ניסינו להבין את מקור ההתפתחות המוגבלת של המבנים האפיתליאליים ממקור בקר למקום ההשתלה. מהו מקור העיכוב של התפתחות תאי בקר בסטרומה השומנית העכברית? על מנת לברר את הגורמ(ים) המעכבים את התפתחות המבנים מבקר בסטרומה השומנית של העכבר, נערכו מספר ניסויים בתרבית (תמונה מס 5). הפרשה של גורם מעכב על ידי רקמת השומן נבחנה על ידי יצירת condition medium של רקמת השומן על ידי הדגרתו עם אקספלנטים מרקמת השומן העכברית משך 6 ימים. למדיום זה נחשפו ממוספרות אפיתליאליות המשמשות כמודל להווצרות מבנים אפיתליאליים בתוך מטריגל, בתרבית. כביקורת שימשו מדיום שהודגר עם תאים אפיתליים מבקר, או מדיום טרי. רמות אמוניה שמשו כמדד לטריות המדיום. נמצא כי הדגרת תאים אפיתליאליים עם condition medium מרקמת השומן העכברית גרמה לדיכוי יצירת ממוספרות, או לקיומן לאחר שכבר נוצרו. 9
תמונה 5. השפעת Condition medium מרקמת שומן עכברית על התפתחות ממוספרות בתוך מטריגל בתרבית..A,B Condition medium מרקמת השומן מדכא יצירת ממוספרות. condition medium גם לאחר שנוצרו הממוספרות, הוספת C. מרקמת השומן מדכאת את קיומן. ממצא זה המעיד כי קיים גורם מעכב המופרש מהרקמה השומנית המעכב התפתחות או קיום ממוספרות בתרבית ויתכן כי פועל גם בחיה עצמה לדיכוי התפתחות מבנים אפיתליאליים מבקר. בניסיון לברר את מהותו של חלבון זה נערכו ניסויים רבים בהקשר לשני חלבונים קנדידטים המופרשים מרקמת השומן העכברית לפטין ו.IL6 בתמונה הבאה מובא סיכום ניסוי מיצג להשפעת לפטין ממקור עכבר על התפתחות ממוספרות מבקר. 10
70 60 50 * 40 30 *** *** *** 3 days 6 days 20 *** 10 0 Fresh Conditioned 2 ng/ml 0.4 ng/ml 0.1 ng/ml 0.01 ng/ml לפטין ממקור עכבר תמונה 6. קוטר ממוספרות (µm) מבלוטת חלב של בקר בתרבית כתלות בריכוז הלפטין שהוסף. נמצא כי לפטין ממקור עכבר שהוסף למשך שלשה ימים לתרבית תאי בקר גרם לירידה בגדילת הממוספרות, שהינן מודל להתפתחות בלוטת החלב. זאת בריכוזים שבין 0.1 ל 2 ננוגרם/מ"ל (סימון כחול). ריכוזים אלה הינם בטווח הרמות הפיזיולוגיות. בבדיקה שנערכה 3 ימים לאחר שלפטין הוסר מהמדיום (סימון אדום), לא נמצא שינוי בגודל הממוספרות. איננו יודעים עדיין מהו המנגנון שהביא לגדילת/ חלוקת הפיצוי הזו. נמצא כי גם תוספת של לפטין ממקור בקר גרמה לירידה בגדילת הממוספרות בריכוזים דומים אם כי בעוצמה פחותה (תמונה 7). 11
ריכוזי לפטין תמונה 7. השפעת לפטין ממקור בקר על קוטר ממוספרות מבקר. מנסיונות אלה עולה כי לפטין מבקר את גדילת בלוטת החלב וכי בריכוזים מסוימים הוא גורם לעיכוב משמעותי בגדילה. מאחר והשתלת תאי עכבר לבלוטה העכברית אינה נתקלת בבעיה התפתחותית בחנו האם לפטין ממקור עכבר מדכא גם את גדילת ממוספרות עכבריות. בחנו את השפעתו של לפטין ממקור עכבר על גדילת ממוספרות מעכבר ובניסוי אחד שבוצע לא נמצא שינוי בקוטרן (תמונה 8). לפני שניתן יהיה להסיק את המסקנה כי הלפטין העכברי המופרש מרקמת השומן פועל ספציפית כנגד התפתחות ממוספרות אפיתליאליות מבקר, ולחקור פעילות זו, עלינו לאשש את הניסויים בממוספרות עכבריות. מסיבה לא ברורה, תרבית ממוספרות עכבריות אלה "מזדהמת" בפיברובלסטים עובדה אשר מקשה על עריכת הניסויים וכתוצאה, עלינו לעבוד בתרבית תאים שנוקתה ב.FACS 12
18 16 14 a a a a a a 12 µm 10 8 *** b 6 4 2 0 Fresh Conditioned 50 ng/ml Leptin 2 ng/ml Leptin 0.4 ng/ml Leptin 0.1 ng/ml Leptin 0.01 ng/ml Leptin [Leptin] תמונה 8. ניסוי יחיד בו הוספת לפטין ממקור עכבר אינו משפיע על גדילת ממוספרות מעכבר. בסידרת ניסויים נוספת נמצא כי IL-6 המופרש גם הוא מרקמת השומן אינו משפיע על גדילת הממוספרות (לא מודגם). סיכום בעבודה זו נבחנו 4 סיבות אפשריות להתפתחות החלקית של בלוטת חלב מעכבר בסטרומה של הבלוטה העכברית. את כל אחד מהמקרים חקרנו מתוך כוונה להבין את מקור הבעיה ולהביא לשיפור התפתחות בלוטת החלב בסביבה העכברית. נבחנו: 1. תגובה אימונית שולית של העכבר כנגד השתל מבקר. ע"מ להתגבר על בעיה זו עברנו לשימוש בעכברים מדוכאים חיסונית NOD-SCID בהם מדוכאים הן תאי T והן תאי B ובכך התאפשרה התפתחות מבנים ספריים חלולים מבקר שהתקימו לפחות 8.5 שבועות לאחר ההשתלה ונפרץ מחסום ההתפתחות שנקבע לפרוצדורה דומה ב"עכברים ערומים". 2. סטימולציה הורמונלית שאינה מספקת. ע"מ להתגבר על בעיה אפשרית זו החדרנו באינפוזיה מתמשכת אסטרוגן ופרוגסטרון למערכת הסיסטמית למשך כל תקופת ההתפתחות של התאים מבקר בבלוטה העכברית. 3. הרכב שונה של הסטרומה העכברית בהשוואה לבקר. ע"מ לדמות את הסטרומה השומנית מעכבר לסטרומה הפיברוטית מבקר השתלנו פיברובלסטים לסטרומה העכברית ויצרנו סטורמה דומה לבקר. 13
יצירת בלוטה כימרית המכילה תאי עכבר אשר ישמשו זרזים להתפתחות תאי בקר. נוכחנו לדעת כי כל סוג תא התפתח בנפרד ולא היתה השפעה לתאי העכבר על תאי הבקר..4 על ידי מניפולציות אלה הצלחנו לשפר את קליטת התאים האפיתליאליים מבקר בבלוטה העכברית, ולשפר, אם כי לא באופן קונסיססטנטי, את התפתחות הבלוטה עד למצב של יצירת בלוטה מושלמת מבקר, הכוללת את המבנה האופיני של ducts).tdlu (Terminal lubuloalveolar חקרנו גם את הסיבה למגבלת ההתפתחות של הבלוטה המבקר בעכבר והראינו כי ההורמון לפטין המופרש מתאי השומן העכברים מעכב את התפתחות הבלוטה מבקר ומשמש כנראה כ"קו הגנה מקומי" למניעת התפתחות של גורמים זרים ברקמה. אנו ממשיכים לחקור תופעה זו ולגבש שיטה להתגבר על פעילות נוגדת התפתחות זו של הלפטין. המערכת המשופרת של בלוטת החלב מבקר בעכבר מאפשרת כבר עתה מחקר מקיף של התפתחות ופעילות עטין הבקר, תוך שימוש במודל העכברי. פרסומים מדעיים Rauner and Barash (2012). Cell Hierarchy and Lineage Commitment in the Bovine Mammary Gland. PLoS ONE 7: e30113. Barash I. and Rauner G. (2012). Principle cell populations in the bovine mammary gland: delineation of cell hierarchy and lineage commitment. 10th International Conference of the Association for Stem Cell Research (ISCCR). Yokohama.Japan. Rauner G. and Barash I. (2012). Cell hierarchy, Stem Cells, progenitors and differentiation in the mammary Gland. The 24th Annual meeting of the Israeli Society of Ruminant Sciences. Jerusalem. Rauner G. and Barash I. (2012). Delineation of cell hierarchy and lineage commitment in the bovine mammary gland. EMBO conference. Stem Cells in Cancer and Regenerative Medicine. Heidelberg, Germany. Rauner, G., Leviav, A., Mavor, E. and Barash, I. (2013). Development of foreign mammary epithelial morphology in the stroma of immunodeficient mice. PLoS ONE 8: e68637 Rauner G. and Barash, I. (2013). Impaired development of bovine mammary epithelial morphology following transplantation of dispersed cells into the mouse fad pad: new insights into epitheliastroma interactions. Gordon Research Conference on Mammary Gland Biology. Stowe, Vt. USA Rauner G. and Barash, I. (2013). Transplantation of bovine mammary epithelial cells in the immunocompromized mouse stroma. The 25th Annual Meeting of the Israeli Society of Ruminant Sciences. Jerusalem. Rauner, G. and Barash, I. (2014). Xanthosine administration does not affect the proportion of epithelial stem cells in bovine mammary tissue, but has a latent negative effect on cell proliferation. Exp. Cell Res. 328:186-196. Rauner, G. and Barash, I (2014) Isolation of a stem cell-enriched epithelial population in the bovine mammary gland. The meeting of the Israeli biological societies (ILANIT). Eilat. Rauner and Barash. Cell hierarchy and lineage commitment of bovine mammary epithelial cell populations and the unique recovery pattern of bovine morphology in the mouse stroma. 12 th Conference of the International Society for Stem cells Research (ISSCR). Vancouver. Canada. 14
Barash, I. Rauner, G. (2014). Stem cells and downstream hierarchy in the bovine mammary gland. The 27 th Annual Meeting for Ruminant Sciences. Ashkelon. Barash, I, Rauner, G. (2014). Stem Cells and Cell Hierarchy in the Bovine Mammary Gland. BIT's 7 th annual congress of regenerative medicine and stem cells. Haiku. China. Barash, I. (2015). Delineating Stem Cells and Cell Hierarchy in the Bovine Mammary Gland. 5 th world congress on cells and cell and stem cell research. Chicago. US. 15