ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΛΙΝΙΚΕΣ- ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΛΙΝΙΚΕΣ- ΚΛΙΝΙΚΟΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΕΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΠΟΣΤΟΛΟΣ Γ. ΒΑΓΕΝΑΚΗΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «ΑΠΟΠΤΩΣΗ ΤΟΥ ΠΕΠΤΙΚΟΥ ΕΠΙΘΗΛΙΟΥ: Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΣΤΗΝ ΚΑΡΚΙΝΟΓΕΝΕΣΗ» ΗΛΙΑΣ ΣΚΟΤΙΝΙΩΤΗΣ ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2004

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Απόστολος Γ. Βαγενάκης, Καθηγητής Παθολογίας, Δ/ντής Παθολογικής Κλινικής Επιβλέπων Καθηγητής Ιωάννης Βαράκης, Καθηγητής Ανατομίας, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Βασιλική Νικολοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παθολογίας-Γαστρεντερολογίας Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Απόστολος Γ. Βαγενάκης, Καθηγητής Παθολογίας, Δ/ντής Παθολογικής Κλινικής Επιβλέπων Καθηγητής Ιωάννης Βαράκης, Καθηγητής Ανατομίας, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Βασιλική Νικολοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παθολογίας-Γαστρεντερολογίας Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Χρυσούλα Λαμπροπούλου-Καρατζά, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Παθολογίας Μέλος Επταμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Γεωργία Σωτηροπούλου-Μπονίκου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ανατομίας Μέλος Επταμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Γεώργιος Δημητρακόπουλος, Καθηγητής Μικροβιολογίας Μέλος Επταμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Μαρία Μελαχροινού, Επίκουρη Καθηγήτρια Παθολογικής Ανατομίας Μέλος Επταμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής 1

Στη μνήμη της Ιωάννας και στους γονείς μου, Αντώνη και Τζένη Σκοτινιώτη. 2

ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Σύντομο Βιογραφικό Σημείωμα 5 Πρόλογος 9 Σελίδα Κεφάλαιο Α. Εισαγωγή Α.1 Εισαγωγή & Ιστορική Αναδρομή 10 Α.2 Επιδημιολογία & Μετάδοση του ΕΠ 11 Α.3 Μέθοδοι Ανίχνευσης του ΕΠ 12 Α.4 Κλινικές Εκδηλώσεις του ΕΠ 16 Α.5 Προκαρκινικά Στάδια Γαστρικού Αδενοκαρκινώματος 19 Α.6 ΕΠ και το Γαστρικό Επιθήλιο 21 Α.7 Απόπτωση 22 Κεφάλαιο Β. Στόχος 27 Κεφάλαιο Γ. Υλικά & Πειραματικές Μέθοδοι Γ.1 Ασθενείς 28 Γ.2 Εκτίμηση Γαστρίτιδας 29 Γ.3 Εκτίμηση Απόπτωσης και Πολλαπλασιασμού 30 Γ.4 Μετρήσεις Απόπτωσης και Πολλαπλασιασμού 34 Γ.5 Στατιστική Ανάλυση 35 Κεφάλαιο Δ. Αποτελέσματα Δ.1 Λοίμωξη με ΕΠ 36 Δ.2 Απόπτωση 39 3

Δ.3 Πολλαπλασιασμός 44 Δ.4 Σχέση Απόπτωσης και Πολλαπλασιασμού 49 Κεφάλαιο Ε. Συμπεράσματα & Συζήτηση 54 Περίληψη 64 Summary in English 66 Βιβλιογραφία 67 Δημοσιεύσεις 76 4

ΣΥΝΤΟΜΟ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ ΗΛΙΑΣ-ΑΛΕΞΗΣ ΣΚΟΤΙΝΙΩΤΗΣ Ημερομηνία Γέννησης: 19 Αυγούστου 1966 Τόπος Γέννησης: Αθήνα Διεύθυνση Οικίας: Ηρώς Κωνσταντοπούλου 144 163 41 Ηλιούπολη Τηλ. 210 9919 596 Κιν. 6947 701702 Email: iascotiniotis@bics. bwh. harvard. edu Ακαδημαϊκές Θέσεις: 2000-2003 Λέκτορας Ιατρικής Σχολής Harvard University, Βοστώνη, Η.Π.Α. Μεταπτυχιακές Σπουδές: 1991.1994 Ειδικότητα Παθολογίας, Univ. of Pennsylvania, Φιλαδέλφεια, Η.Π.Α. 1996.1999 Ειδικότητα Γαστρεντερολογίας, University of Pennsylvania, Φιλαδέλφεια, Η.Π.Α. 1999.2000 Fellow Επεμβατικής Ενδοσκόπησης, University of Pennsylvania, Φιλαδέλφεια, Η.Π.Α. Προπτυχιακές Σπουδές: 1984-1987 Πτυχίο Bachelor Βιολογίας University of Pennsylvania, Φιλαδέλφεια, ΗΠΑ 1987-1991 Πτυχίο Ιατρικής Cornell University, Νέα Υόρκη, Η.Π.Α. Ιατρικές Ειδικότητες Πιστοποιημένες από το American Board of Internal Medicine: 1994 Παθολογία 1999 Γαστρεντερολογία Στρατιωτική Θητεία: 1994-1996 11 ο Σύνταγμα Πεζικού Βραβεία και Τιμητικές Διακρίσεις: 5

1999 2 ο Βραβείο, Διαγωνισμός Έρευνας Komarov, Philadelphia GI Training Group 1999 Ερευνητικό Βραβείο του Delaware Valley Society for Gastrointestinal Endoscopy 1998 Διάκριση από το American College of Gastroenterology για την καλύτερη εργασία από ειδικευόμενο γαστρεντερολόγο 1998 1 ο Βραβείο, Διαγωνισμός Έρευνας Komarov, Philadelphia GI Training Group 1998 Βραβείο Διδασκαλίας Edward Raffensberger του University of Pennsylvania 1998 Βραβείο Κλινικής Έρευνας του American College of Gastroenterology 1989 Βραβείο Καλύτερης Εργασίας του Ελληνικού Ιατρικού Συλλόγου της Νέας Υόρκης 1987 Εκλογή στην τιμητική εταιρία ΦΒΚ Honors Society του University of Pennsylvania 1987 Διάκριση σαν Scholar του University of Pennsylvania Συμμετοχή σε Επιστημονικές Εταιρίες: 1996 έως τώρα American Gastroenterological Association 1998 έως τώρα American College of Gastroenterology 1999 έως τώρα American Society for Gastrointestinal Endoscopy 1994-2000 American College of Physicians 1996-2000 American Association for the Study of Liver Diseases Ιστορικό Εργασίας σε Κλινικά και Εκπαιδευτικά Τμήματα: 2000-2003: Τμήμα Γαστρεντερολογίας, Νοσοκομείο Brigham & Women's Hospital της Ιατρικής Σχολής του Harvard University, Βοστώνη 1999-2000: Τμήμα Γαστρεντερολογίας, Νοσοκομείο Hospital of University of Pennsylvania, Φιλαδέλφεια 1999-2000: Διδάσκων στον Τομέα Παθολογίας, Νοσοκομείο Hospital of University of Pennsylvania, Φιλαδέλφεια 1999-2000: Υπεύθυνος Εξωτερικών Ιατρείων Γαστρεντερολογίας, Presbyterian Medical Center, Φιλαδέλφεια 1997-2000: Εκπαιδευτικός Βοηθός, Μάθημα Παθοφυσιολογίας, Ιατρική Σχολή του University of Pennsylvania, Φιλαδέλφεια Εκπαιδευτικές Παρουσιάσεις: Συμπόσιο «Καρκίνος του Στομάχου: Βήματα Μπροστά», Διαγνωστικό & Θεραπευτικό Κέντρο Αθηνών «Υγεία». Ομιλία: Η Ενδοσκοπική Βλεννογονεκτομή στον Πρώιμο Καρκίνο του Στομάχου, Αθήνα, Ιανουάριος 2004. Συμπόσιο Ιατρικής Εταιρίας Κύπρου «Παθήσεις του Οισοφάγου». Ομιλία: Η Ενδοσκοπική Υπερηχογραφία στη Σταδιοποίηση του Καρκίνου του Οισοφάγου, Λευκωσία, Φεβρουάριος 2003. 25th Annual Intensive Review of Internal Medicine, Harvard Medical School, Βοστώνη, 4-11 Αυγούστου 2002. Εκπαιδευτική Ημερίδα Νοσοκομείου Boston Veterans Affairs Medical Center: "Approach to Acute Diarrhea", Βοστώνη, Ιούλιος 2002. 6

Τμήμα Θωρακοχειρουργικής, Brigham & Women's Hospital: "Where are we with Barrett's Esophagus?", Βοστώνη, Ιούνιος 2002. Morbidity & Mortality Conference Τομέα Χειρουργικής, Brigham & Women's Hospital: "Biliary Ductal Injuries", Βοστώνη, Μάιος 2002. Combined Clinical Symposium του Συνεδρίου Γαστρεντερολογίας Digestive Disease Week: Approach to Early Esophagogastric Cancer, Σαν Φρανσίσκο, 21 Μαϊου 2002. Live Endoscopy Course, American Society of Gastrointestinal Endoscopy: Βοστώνη, 22-23 Μαϊου 2002. Εκπαιδευτική Ημερίδα Νοσοκομείου Brigham & Women's Hospital: Approach to Choledocholithiasis In the Post-Cholecystectomy Patient, Βοστώνη, Φεβρουάριος 2002. Εκπαιδευτική Ημερίδα Νοσοκομείου Boston Veterans Affairs Medical Center: "Screening for Colorectal Cancer", Βοστώνη, Σεπτέμβριος 2001. Δημοσιεύσεις: Αρθρα: Blam ME, Kobrin S, Siegelman ES, Scotiniotis I. "Downhill" esophageal varices as an iatrogenic complication of upper extremity hemodialysis access. Am J Gastroenterol 2002; 97:216-7. Scotiniotis I, Lucey MR, Metz DC. Helicobacter pylori Infection Is not associated with subclinical hepatic encephalopathy In stable cirrhotic patients. Dig Dis Sci 2001; 46:2744-51. Scotiniotis I, Kochman ML, Lewis JD, Furth EE, Rosato EF, Ginsberg GG. Accuracy of EUS In the evaluation of Barrett's esophagus and high-grade dysplasia or Intramucosal carcinoma. Gastrointest Endoscopy, 2001; 54:689-96. Scotiniotis I, Kochman ML. Intramural cyst of the bile duct demonstrated by cholangioscopy and Intraductal ultrasonography. Gastrointest Endoscopy, 2001; 54:260-2. Rubesin SE, Scotiniotis I, Birnbaum BA, Ginsberg GG. Radiologic and endoscopic diagnosis of Crohn s disease. Surg Clin N Am, 2001; 81:39-70. Scotiniotis I, Long WB. Endoscopic management of common bile duct stones. Curr Treat Option Gastro, 2000; 3:133-140. Scotiniotis I, Rokkas T, Furth EE, Rigas B, Shiff S. Altered gastric epithelial cell kinetics in Helicobacter pylori-associated intestinal metaplasia: Implications for gastric carcinogenesis. Int J Cancer, 2000; 85:192-200. Scotiniotis I, Stecker M, Deren JJ. Recurrent nausea as a manifestation of a seizure disorder: Part of the spectrum of abdominal epilepsy. Dig Dis Sci, 2000; 45:1238-40. 7

Scotiniotis I, Metz DC. Approaching dyspepsia in the primary care setting. J Clin Outcomes Management, 1999; 6:53-63. Scotiniotis I, Ginsberg GG. Endoscopic clip-assisted biliary cannulation: Externalization and fixation of the papilla of Vater from within a duodenal diverticulum using the endoscopic clipfixing device. Gastrointest Endoscopy, 1999; 50:431-3. Scotiniotis I, Metz DC. Diverticulitis in the young (commentary). Resident Staff Phys, 1999; 45:47-51. Scotiniotis I, Rubesin S, Ginsberg GG. Imaging modalities in inflammatory bowel disease. Gastroenterol Clin N Am, 1999; 28:391-422. Scotiniotis I, Lewis JD, Strom BL. Screening for colorectal cancer and other GI cancers. Curr Opin Oncol, 1999; 11:305-11. Scotiniotis I, Kochman ML. Endoscopic management of biliary tract disease. Curr Opin Gastroenterol, 1998; 14:417-421. Scotiniotis I, Brass C, Malet PF. Hepatitis C: Diagnosis & treatment. J Gen Intern Med, 1995; 10:273-82. Κεφάλαια Βιβλίων: Scotiniotis I, Kochman ML. Evaluation of the patient with abdominal or rectal mass. In Humes HD (ed): Kelley s Textbook of Internal Medicine, 4th edition. Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, 2000; 763-770. Scotiniotis I, Carr-Locke DL, Farrell J. Interventional imaging of the liver and biliary system: Endoscopic retrograde cholangiopancreatography with emphasis on liver disease patients. In Schiff ER, Maddrey W, Sorrell M (eds): Schiff's Diseases of the Liver, 9th edition. Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, 2003; 344-368. Stockwell D, Scotiniotis I. Upper Endoscopy. In Rustgi AK (ed): Requisites for Gastroenterology: Endoscopy and Imaging. Harcourt Health Sciences, Philadelphia (In press). Scotiniotis I, Ginsberg GG. Diagnostic and Therapeutic ERCP. In Rustgi AK (ed): Requisites for Gastroenterology: Endoscopy and Imaging. Harcourt Health Sciences, Philadelphia (In press). 8

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η ολοκλήρωση της εργασίας αυτής ήταν για μένα ένας σημαντικός στόχος. Όχι μόνο γιατί ήταν αποτέλεσμα αρκετής δουλειάς, αλλά και γιατί στη σύλληψη και διεκπεραίωσή της με βοήθησαν επιστήμονες που πίστεψαν στις δυνάμεις μου. Ο «κεντρικός ήρωας» είναι ο καθηγητής μου στην Ιατρική Σχολή του Cornell Βασίλης Ρήγας, ο οποίος με έχει συμβουλεύσει σοφά σε πολλές φάσεις της σταδιοδρομίας μου. Ζητώ τη γνώμη του σε όλα τα δύσκολα θέματα και εύχομαι να συνεχίσει να μου την προσφέρει πάντα τόσο απλόχερα. Το οξύ του πνεύμα ήταν το θεμέλιο πάνω στο οποίο βασίστηκε μία ακόμη επιστημονική μελέτη. Πολλά οφείλω επίσης στον καθηγητή κο Απόστολο Βαγενάκη, που έσκυψε με πολλή υπομονή πάνω στην εργασία αυτή, ακόμη και όταν η ολοκλήρωσή της φαινόταν αμφίβολη. Τον ευχαριστώ για αυτό. Τέλος, ευχαριστώ θερμά τον κο Θόδωρο Ροκκά που μου παρείχε τη δυνατότητα επιστημονικής συνεργασίας κατά τη διάρκεια της στρατιωτικής μου θητείας. Αποτελεί για μένα λαμπρό παράδειγμα θέλησης, εργατικότητας και αισιοδοξίας. Εύχομαι στο υπόλοιπο της σταδιοδρομίας μου να μπορέσω να έχω κοντά μου ανθρώπους σαν αυτούς. 9

ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1 Εισαγωγή και Ιστορική Αναδρομή Η παρουσία σπειροειδών μικροβίων στο γαστρικό βλεννογόνο περιγράφηκε για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία κατά τη δεκαετία του 1930 (1,2). Πέρασε όμως μισός αιώνας πριν αναγνωριστεί η παθογόνος ιδιότητα αυτών των μικροβίων. Μόλις το 1983, οι Marshall και Warren στο Περθ της Αυστραλίας κατάφεραν να καλλιεργήσουν μικροοργανισμούς από βιοψίες ασθενών με έλκος στομάχου (3). Τον επόμενο χρόνο, ο Marshall κατάφερε να αποδείξει με πρωτότυπο τρόπο το ρόλο αυτών των μικροβίων στην παθογένεση της χρόνιας γαστρίτιδας. Υποβλήθηκε ο ίδιος σε γαστροσκόπηση, κατά την οποία πάρθηκαν βιοψίες άντρου, οι οποίες ήταν φυσιολογικές. Στη συνέχεια κατάπιε αποικία 10 9 μικροβίων που είχε απομονώσει ο ίδιος από ασθενή με γαστρίτιδα. Μέσα σε δέκα ημέρες, παρουσίασε επιγαστρικό πόνο. Επανάληψη της γαστροσκόπησης έδειξε ενεργό γαστρίτιδα, και ο οργανισμός καλλιεργήθηκε από τις βιοψίες. Έτσι, ο Marshall απέδειξε ότι ο οργανισμός αυτός πληροί τα κριτήρια του Koch για παθογόνους μικροοργανισμούς, αλλάζοντας ανεπίστρεπτα τις αντιλήψεις μας για τη χρόνια γαστρίτιδα (4). Ο μικροοργανισμός αυτός έφερε μορφολογικές ομοιότητες με τα βακτήρια του γένους Campylobacter και αρχικά ονομάστηκε Campylobacter pyloridis. Η μετέπειτα ανάλυση της σύστασης του βακτηριακού τοιχώματος και της περιεκτικότητας σε νουκλεϊνικά οξέα ανέδειξε διαφορές με τα υπόλοιπα καμπυλοβακτήρια, και ο οργανισμός μετονομάσθηκε σε Helicobacter pylori (Ελικοβακτήριο του πυλωρού ή ΕΠ). 10

Το βακτήριο Helicobacter pylori είναι μικροαεροφιλής, Gram-αρνητικός οργανισμός που κατοικεί στο παχύρευστο στρώμα βλέννης που καλύπτει το γαστρικό επιθήλιο. Έχει σχήμα ελικοειδές ή καμπυλοειδές με μήκος 2,5-5 μm και πλάτος 0,75-1 μm. Από το ένα άκρο του ξεκινούν 4-6 ελυτροφόρες βλεφαρίδες που επιτρέπουν στον μικροοργανισμό να κινείται ταχέως μέσα στο στρώμα βλέννης. Το βακτήριο αυτό χαρακτηρίζεται από την ικανότητα παραγωγής του ενζύμου ουρεάση σε μεγάλες ποσότητες, γεγονός στο οποίο βασίζονται πολλές από τις δοκιμασίες ανίχνευσής του. Α.2 Επιδημιολογία και Μετάδοση του ΕΠ Το ΕΠ προσβάλλει άτομα σε όλες τις περιοχές της υφηλίου, αλλά η συχνότητα της λοίμωξης διαφέρει από χώρα σε χώρα και ακόμη και από πληθυσμό σε πληθυσμό μέσα στην ίδια χώρα. Η συχνότητα της λοίμωξης καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από τις κοινωνικοοικονομικές συνθήκες του πληθυσμού (5). Σε αναπτυσσόμενες χώρες, η λοίμωξη προσβάλλει το 80% των ενηλίκων, ενώ σε ανεπτυγμένες χώρες το ποσοστό αυτό είναι 20 έως 50%. Ο οργανισμός μεταδίδεται με πρόσληψη από το στόμα, συνήθως από μέλη της ίδιας οικογένειας κατά τη διάρκεια των πρώτων παιδικών χρόνων (6). Σε ανεπτυγμένες χώρες, η μετάδοση γίνεται από άτομο σε άτομο μέσω επαφής με σάλιο, εμετό ή κόπρανα. Σε αναπτυσσόμενες χώρες, είναι επίσης πιθανή η μετάδοση από πόσιμο νερό. Δεν υπάρχουν ενδείξεις ότι ο οργανισμός μπορεί να μεταδοθεί στον άνθρωπο από ζώο, αν και το ΕΠ έχει βρεθεί και σε άλλα θηλαστικά εκτός του ανθρώπου, πρωτεύοντα και μη, (7,8). Στις βιομηχανοποιημένες κοινωνίες, οι ρυθμοί πρόσληψης του ΕΠ έχουν μειωθεί σημαντικά μέσα στις τελευταίες δεκαετίες. Μαθηματικά μοντέλα στις Ηνωμένες Πολιτείες έχουν αναδείξει ότι η μείωση της μετάδοσης του μικροβίου ήταν ταυτόχρονη 11

με τη βελτίωση στις συνθήκες υγιεινής που ξεκίνησαν στην χώρα αυτή στα τέλη του 19 ου αιώνα. Τα μοντέλα αυτά οδηγούν στην πρόβλεψη ότι το ΕΠ κάποια στιγμή θα εξαφανιστεί από τις Ηνωμένες Πολιτείες, αλλά όχι μέσα στον αιώνα που διανύουμε (9). Κάτι τέτοιο δεν ισχύει βέβαια για τον αναπτυσσόμενο κόσμο, όπου οι ρυθμοί μετάδοσης του ΕΠ παραμένουν πάντα υψηλοί. Α.3 Μέθοδοι Ανίχνευσης του ΕΠ Οι αρχικές μέθοδοι ανίχνευσης του ΕΠ βασίζονταν αποκλειστικά στην καλλιέργεια γαστρικού ιστού. Σήμερα έχουν αναπτυχθεί πολλές μέθοδοι ανίχνευσης της λοίμωξης με ΕΠ. Τα στοιχεία τους συνοψίζονται στον Πίνακα Α. Καλλιέργεια ιστού: Το ΕΠ είναι μικρόβιο που απαιτεί ειδικά υλικά και συνθήκες για την καλλιέργειά του. Έτσι, η μέθοδος αυτή είναι χρονοβόρα και δαπανηρή και δεν είναι ο πλέον πρακτικός τρόπος ανίχνευσης της λοίμωξης. Παρόλα αυτά, παραμένει ο μοναδικός τρόπος προσδιορισμού της ευαισθησίας των στελεχών σε αντιβιοτικά και μελέτης άλλων ειδικών χαρακτηριστικών του μικροβίου. Η καλλιέργεια του μικροβίου περιορίζεται σήμερα σε ερευνητικά ή άλλα κέντρα με ειδικό ενδιαφέρον στο ΕΠ και δεν έχει ρόλο στην καθημερινή διάγνωση της λοίμωξης. Πίνακας Α. Σύγκριση των διαφόρων δοκιμασιών για τη διάγνωση της λοίμωξης από ΕΠ. Δοκιμασία Ευαισθησία (%) Ειδικότητα (%) Ανάγκη Ενδοσκόπησης Σχετικό Κόστος* Καλλιέργεια 77-92 100 Ναι + + + ιστού Ιστολογική 93-99 95-99 Ναι + + + εξέταση Ορολογική 88-99 86-95 Όχι + εξέταση CLO-test 89-98 93-98 Ναι + 12

Δοκιμασία αναπνοής με 13 C Δοκιμασία αναπνοής με 14 C Αντιγόνο κοπράνων 90-100 98-100 Όχι + + + 90-97 89-100 Όχι + + 90-92 88-93 Όχι + + * Δεν συνυπολογίζεται το κόστος της ενδοσκόπησης Ιστολογική διάγνωση: Στις αρχικές ιστολογικές μελέτες χρησιμοποιήθηκε η τεχνική λευκοχρυσού με χρώση Warthin-Starry, η οποία θεωρήθηκε πιο ειδική για την ανίχνευση του ΕΠ. Ακολούθησε η χρήση διαφόρων άλλων χρώσεων, όπως η Giemsa και η θειαζίνη, η οποίες είναι ταχείες και χαμηλού κόστους, με παρόμοια ποσοστά ανίχνευσης με την Warthin-Starry (10). Το μειονέκτημα των μεθόδων αυτών είναι η ελλιπής χρώση του περιβάλλοντος ιστού που δυσκολεύει την γενικότερη εξέταση του γαστρικού βλεννογόνου. Αυτό το πρόβλημα αντιμετωπίστηκε με την τροποποιημένη χρώση Wright- Giemsa, που χρησιμοποιείται ευρέως (11). Ορολογική διάγνωση: Η φλεγμονή του γαστρικού βλεννογόνου στη λοίμωξη με ΕΠ έχει σαν αποτέλεσμα την ανάπτυξη συστηματικής αντίδρασης στο αίμα, με την εμφάνιση αντισωμάτων εναντίον του ΕΠ. Αρχικά εμφανίζονται τα ειδικά IgM και IgA αντισώματα, τα οποία στη συνέχεια δίνουν τη θέση τους στα ειδικά IgG αντισώματα. Τα αντισώματα αυτά προσδιορίζονται με την ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA (12). Οι ορολογικές εξετάσεις είναι μη επεμβατικές, γρήγορες και απλές. Έχουν το σημαντικό πλεονέκτημα ότι δεν απαιτούν τη λήψη βιοψιών. Επίσης, δεν επηρεάζονται από τη μείωση στον αριθμό των μικροοργανισμών που μπορεί να προκληθεί από φάρμακα, όπως τα αντιβιοτικά ή οι αναστολείς αντλίας πρωτονίων, ή από τη γαστρική ατροφία. Παρομοιώς, δεν υπόκεινται σε δειγματοληπτικό λάθος, αφού αντανακλούν την παρουσία του βακτηρίου οπουδήποτε 13

στο στομάχι. Το σημαντικότερο μειονέκτημα των ορολογικών μεθόδων είναι η παραμονή ανιχνεύσιμων επιπέδων αντισωμάτων 6 μήνες ή παραπάνω μετά από πετυχημένη θεραπεία εκρίζωσης. Έτσι, η ορολογική εξέταση δεν θεωρείται πάντα αξιόπιστη μετά τη χορήγηση τέτοιας θεραπείας (13). Λόγω της ευκολίας χρήσης της, η ορολογική διάγνωση έχει φανεί ιδιαίτερα πολύτιμη σε ευρείες επιδημιολογικές μελέτες. Ιδιαίτερη ερευνητική σημασία έχει αποκτήσει η μέθοδος της ανοσοαποτυπώσεως (immune typing), στην οποία μελετάται η παρουσία αντισωμάτων έναντι συγκεκριμένων προτεϊνών του βακτηρίου με πιθανή παθογόνο δράση, όπως η caga και η vaca (14). Η ανάλυση αυτή έχει βοηθήσει στον χαρακτηρισμό των στελεχών του βακτηρίου που συνδέονται στενότερα με επιπλοκές όπως το πεπτικό έλκος και ο γαστρικός καρκίνος. Δοκιμασίες ουρεάσης: Όπως προαναφέρθηκε, ένα από τα χαρακτηριστικά του ΕΠ είναι η παραγωγή του ενζύμου ουρεάση σε μεγάλες ποσότητες. Στην παραγωγή αυτού του ενζύμου βασίζονται οι δοκιμασίες ουρεάσης για την ανίχνευση του μικροβίου. Αυτές διακρίνονται σε ταχείες μεθόδους και σε μεθόδους μετρήσεως ραδιενεργού CO 2 στον εκπνεόμενο αέρα (breath tests). 1. Ταχεία μέθοδος ουρεάσης: Η γνωστότερη δοκιμασία σε αυτήν την κατηγορία είναι το οικείο CLO-test (Delta West Ltd., Canning Vale, Western Australia). Η δοκιμασία αυτή βασίζεται στη τοποθέτηση ιστοτεμαχίου του άντρου του στομάχου, που λαμβάνεται κατά τη διάρκεια της ενδοσκόπησης, σε ειδικό βοθρίο το οποίο περιλαμβάνει ουρία σαν υπόστρωμα και ερυθρό της φαινόλης σαν δείκτη αλλάγής του ph. Αν στο ιστοτεμάχιο υπάρχουν μικροοργανισμοί του ΕΠ, η ουρεάση που παράγουν διασπά την ουρία, απελευθερώνοντας αμμωνία. Η επακόλουθη αλλαγή στο ph ανιχνεύεται ως αλλαγή του χρώματος του βοθρίου 14

από κίτρινο σε κόκκινο. Η ανάγνωση του αποτελέσματος γίνεται συνήθως σε 24 ώρες, αν και η μεταλλαγή μπορεί να είναι εμφανής και εντός 5 λεπτών αν το βακτήριο υπάρχει σε υψηλή ποσότητα. Λόγω της ευκολίας χρήσεως, της ταχύτητας και της ακρίβειάς της, η δοκιμασία CLO-test είναι ευρύτατα διαδεδομένη (15). 2. Μέθοδοι εκπνεόμενου CO 2 (breath tests): Οι μέθοδοι αυτές βασίζονται στη χορήγηση συγκεκριμένης ποσότητας ουρίας υπό τη μορφή κάψουλας στον ασθενή. Στην περίπτωση λοίμωξης με ΕΠ, η βακτηριακή ουρεάση στο στομάχι διασπά την ουρία και απελευθερώνει αμμωνία και CO 2. Το παραγόμενο CO 2 απορροφάται από το βλεννογόνο του στομάχου και αποβάλλεται κύρια από τους πνεύμονες (16). Το αποβαλλόμενο CO 2 μπορεί να μετρηθεί με χρωματογραφία μάζας εφόσον η ουρία είχε σημανθεί με 13 C ή με beta-counter εφόσον η σήμανση είχε γίνει με 14 C (16-18). Οι μέθοδοι εκπνεόμενου CO 2 έχουν το πλεονέκτημα της αναίμακτης διαδικασίας, χωρίς τη λήψη βιοψίας. Θετικοποιούνται εντός 20λέπτου και έχουν υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα. Σχετικό μειονέκτημα είναι η ανάγκη ακριβού εξοπλισμού (χρωματογράφος μάζας) στην περίπτωση του 13 C και η έκθεση σε μικρή δόση ραδιενέργειας (2-5 μci) στην περίπτωση του 14 C. Αντιγόνο κοπράνων: Η ανίχνευση αντιγόνων του ΕΠ στα κόπρανα έγινε πρόσφατα δυνατή με δοκιμασία που βασίζεται σε πολυκλωνικά αντισώματα (HpSA, Meridian Diagnostics, Cincinnati, ΗΠΑ) (19). Η νέα αυτή δοκιμασία έχει απόδοση ανάλογη με αυτή των μεθόδων εκπνεόμενου CO 2 (breath tests) και αποτελεί εναλλακτική λύση στη μη-επεμβατική διάγνωση της λοίμωξης (20,21). Λόγω της ευκολίας της, θεωρείται ο πλέον ενδεδειγμένος τρόπος διάγνωσης της λοίμωξης στον παιδικό πληθυσμό (22). Μετά από χορήγηση αντιβακτηριακής αγωγής, όμως, το επίπεδο των αντιγόνων μειώνεται 15

ακόμη και σε ασθενείς στους οποίους δεν επιτεύχθηκε εκρίζωση, με αποτέλεσμα την πιθανή μείωση στην ευαισθησία αυτής της δοκιμασίας (23,24). Έτσι, η δοκιμασία αντιγόνου κοπράνων δεν έχει αντικαταστήσει το breath test στην εξακρίβωση της επιτυχίας της θεραπείας εκρίζωσης. Α.4 Κλινικές Εκδηλώσεις του ΕΠ Γαστρίτιδα και Πεπτικό Έλκος Η λοίμωξη με ΕΠ αναπόφευκτα οδηγεί σε χρόνια γαστρίτιδα με φλεγμονή του επιθηλίου και του υποκείμενου χόριου. Όμως, η πλειοψηφία των ξενιστών με χρόνια γαστρίτιδα δεν αναφέρει συμπτωματολογία και δεν αναπτύσσει ποτέ κάποια επιπλοκή από την ύπαρξη του βακτηρίου. Αυτός είναι ο λόγος που η ύπαρξη ΕΠ στο στομάχι ασυμπτωματικών ατόμων έχει θεωρηθεί από μερικούς ερευνητές ως αποίκηση και όχι λοίμωξη (25). Όμως, ένα ποσοστό ξενιστών αναπτύσσει πεπτικό έλκος στο στομάχι ή το δωδεκαδάκτυλο. Η πλειοψηφία των περιπτώσεων πεπτικού έλκους παγκοσμίως οφείλονται στο ΕΠ (26). Η πιθανότητα κλινικής εκδήλωσης πεπτικού έλκους σε άτομο που έχει προσβληθεί από ΕΠ σε νεαρή ηλικία ποικίλει σε διαφορετικές περιοχές του κόσμου. Στις Ηνωμένες Πολιτείες, ο κίνδυνος εμφάνισης έλκους είναι περίπου 3 τοις εκατό, ενώ στην Ιαπωνία φτάνει το 25 τοις εκατό (27). Σε άτομα με ιστορικό ελκοπάθειας, η εκρίζωση του ΕΠ μειώνει δραματικά την πιθανότητα υποτροπής (28). Λέμφωμα Η ανάπτυξη γαστρικών λεμφωμάτων χαμηλού βαθμού είναι σπανιότερη επιπλοκή της λοίμωξης με ΕΠ. Οι όγκοι αυτοί προέρχονται από τον λεμφικό ιστό του γαστρικού βλεννογόνου (Mucosa-Associated Lymphoid Tissue, MALT) και έτσι είναι γνωστοί ως 16

ΜΑLΤώματα. Τα λεμφώματα αυτά σχετίζονται με λοίμωξη με ΕΠ σε ποσοστό 75 με 95 τοις εκατό (29,30). Πιστεύεται ότι ο χρόνιος αντιγονικός ερεθισμός που προκαλεί το ΕΠ οδηγεί σε μονοκλωνική ανάπτυξη λεμφικών κυττάρων (31). Τα MALTώματα είναι τόσο στενά συνδεδεμένα με το ελικοβακτήριο ώστε η εκρίζωση του μικροοργανισμού οδηγεί σε υποστροφή του λεμφώματος στο 70 με 80 τοις εκατό των περιπτώσεων (32). Η ύφεση αυτών των λεμφωμάτων μετά από θεραπεία εκρίζωσης είναι παρατεταμένη (33). Καρκίνος του Στομάχου Η πιο σημαντική επίπτωση του ΕΠ παγκοσμίως είναι η σχέση του με τον καρκίνο του στομάχου. Το γαστρικό αδενοκαρκίνωμα παραμένει σήμερα το δεύτερο σε συχνότητα αίτιο θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως μετά από αυτόν του πνεύμονα. Από το 1981, πριν δηλαδή την ανακάλυψη του ΕΠ, γνωρίζαμε ότι η παρατεταμένη χρόνια γαστρίτιδα σε μερίδα ασθενών εξελίσσεται σε αδενοκαρκίνωμα (34). Η διαπίστωση το 1985 ότι το ΕΠ είναι η πιο συνηθισμένη αιτία χρόνιας γαστρίτιδας οδήγησε σε αρκετές επιδημιολογικές μελέτες της σχέσης ΕΠ και αδενοκαρκινώματος του στομάχου (35-38). Οι μελέτες αυτές έγιναν σε πολλές διαφορετικές χώρες και όλες ανέδειξαν την ύπαρξη στενής αναλογίας ανάμεσα στην οροθετικότητα στο ΕΠ και το ποσοστό εμφάνισης καρκίνου. Η πειστικότερη απόδειξη ήλθε τελικά από μία προοπτική μελέτη στην Ιαπωνία κατά τη δεκαετία του 1990 (39). Σε σύνολο 1526 ασθενών που παρακολουθήθηκαν κατά μέσον όρο για 7,8 έτη, οι ΕΠ-θετικοί ασθενείς ανέπτυξαν γαστρικό καρκίνο σε ποσοστό 3 τοις εκατό, ενώ η νόσος δεν εμφανίστηκε σε κανέναν από τους ΕΠ-αρνητικούς ασθενείς. O κίνδυνος ήταν παρόμοια αυξημένος και για τις δύο ιστολογικές μορφές γαστρικού καρκίνου, δηλαδή το διάχυτο και τον εντερικό τύπο. 17

Συνολικά, ο κίνδυνος ανάπτυξης καρκίνου σε άτομα με λοίμωξη με ΕΠ είναι περίπου διπλάσιος σε σύγκριση με ΕΠ-αρνητικά άτομα (40-42). Ορισμένοι ερευνητές θεωρούν ότι το ΕΠ συνδέεται με τον καρκίνο του στομάχου στον ίδιο βαθμό όσο το κάπνισμα με τον καρκίνο του πνεύμονα (43). Έτσι, από το 1994, ο Διεθνής Οργανισμός Υγείας έχει χαρακτηρίσει το ΕΠ ως καρκινογόνο 1 ου βαθμού, καθιστώντας το το μοναδικό βακτήριο σε αυτή την κατηγορία (44). Η καρκινογόνος επίδραση του ΕΠ στο γαστρικό επιθήλιο έχει επιβεβαιωθεί και σε μελέτες πάνω σε ζώα, αφού η πρόκληση λοίμωξης σε γερβίλους της Μογκολίας έχει σαν αποτέλεσμα την ανάπτυξη αδενοκαρκινώματος στο ένα τρίτο των ζώων (45-47). Οι επιδημιολογικές μελέτες έχουν δείξει ότι οι ασθενείς με ΕΠ που πάσχουν από δωδεκαδακτυλικό έλκος διαφέρουν από αυτούς με ΕΠ και καρκίνο του στομάχου. Μάλιστα η ανάπτυξη έλκους φαίνεται να προστατεύει τον ξενιστή από την ανάπτυξη καρκίνου (48). Αυτό δεν οφείλεται σε διαφορές ανάμεσα σε ελκογόνα ή καρκινογόνα στελέχη του βακτηρίου αφού τα ίδια στελέχη αυξάνουν τον κίνδυνο και για τις δύο παθήσεις. Φαίνεται λοιπόν ότι οι επιπτώσεις της λοίμωξης διαφέρουν από ξενιστή σε ξενιστή και δεν καθορίζονται μόνο από βακτηριακούς παράγοντες. Παράγοντες που έχουν να κάνουν με τον ίδιο τον ξενιστή παίζουν ρόλο στην τελική έκβαση της λοίμωξης, όπως η διατροφή, η γενετική σύνθεση αλλά και η ανοσολογική κατάσταση του ξενιστή. Υπάρχουν ενδείξεις ότι ρόλο παίζει επίσης η ηλικία προσβολής από τη λοίμωξη. Προσβολή από το ΕΠ σε νηπιακή ή παιδική ηλικία συνδέεται περισσότερο με τον καρκίνο ενώ προσβολή σε μεγαλύτερη ηλικία συνδέεται περισσότερο με το πεπτικό έλκος (49). Το φαινόμενο αυτό μπορεί να εξηγήσει και την αυξημένη τάση προς γαστρικό καρκίνο στις αναπτυσσόμενες χώρες, όπου η έκθεση στο βακτήριο ξεκινά από 18

βρεφική ηλικία, σε αντίθεση με την τάση προς ελκοπάθεια στον ανεπτυγμένο κόσμο (50). Α.5 Προκαρκινικά Στάδια Γαστρικού Αδενοκαρκινώματος Χάρη στις πολύχρονες μελέτες του Correa, γνωρίζουμε ότι η εξέλιξη της χρόνιας γαστρίτιδας σε αδενοκαρκίνωμα περνά από ενδιάμεσα στάδια. Το πρώτο εξελικτικό στάδιο είναι αυτό της γαστρικής ατροφίας (51). Η γαστρική ατροφία χαρακτηρίζεται από την μείωση του συνολικού αριθμού των αδένων στο βλεννογόνο, συνδέεται άρα με την ανάπτυξη υποχλωρυδρίας. Όμως, μόνο ένα ποσοστό των ασθενών με χρόνια γαστρίτιδα φτάνουν στην γαστρική ατροφία. Από αυτούς, ακόμη λιγότεροι προχωρούν στα επόμενα προκαρκινικά στάδια, αυτά της εντερικής μεταπλασίας και της δυσπλασίας, τα οποία μπορεί να καταλήξουν τελικά σε αδενοκαρκίνωμα (Εικόνα 1). 19

Φυσιολογικό γαστρικό επιθήλιο Helicobacter pylori Χρόνια γαστρίτιδα Γαστρική ατροφία Εντερική μεταπλασία Δυσπλασία Αδενοκαρκίνωμα του στομάχου Εικόνα 1. Οι ιστολογικές αλλοιώσεις στη λοίμωξη με ΕΠ που οδηγούν στην ανάπτυξη αδενοκαρκινώματος του στομάχου. Η ύπαρξη εντερικής μεταπλασίας (ΕΜ) είναι προάγγελος της δυσπλασίας και του αδενοκαρκινώματος και θεωρείται απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξή τους. Η εντερική μεταπλασία χαρακτηρίζεται ιστολογικά από την παρουσία επιθηλίου εντερικού τύπου με καλυκοειδή κύτταρα που αντικαθιστούν εν μέρει το φυσιολογικό γαστρικό αδενικό επιθήλιο. Η χρόνια γαστρίτιδα, η γαστρική ατροφία, αλλά και η εντερική μεταπλασία και η δυσπλασία είναι καθαρά ιστολογικές βλάβες που δεν εμφανίζουν συγκεκριμένα ενδοσκοπικά ευρήματα. Η διάγνωσή τους απαιτεί, δηλαδή, την παθολογοανατομική εξέταση βιοψιών του βλεννογόνου. 20

Α.6 ΕΠ και το Γαστρικό Επιθήλιο Η λοίμωξη με ΕΠ προκαλεί διήθηση του γαστρικού βλεννογόνου με πολυμορφοπύρηνα κύτταρα, μακροφάγα, αλλά και Τ- και Β-λεμφοκύτταρα. Παραδόξως, αυτή η ισχυρή ανοσολογική απάντηση δεν είναι ικανή να εξουδετερώσει τον μικροοργανισμό. Αντιθέτως, αφήνει τον ξενιστή εκτεθειμένο στις επιπτώσεις της χρόνιας φλεγμονής. Η αδυναμία εξόντωσης του μικροοργανισμού οφείλεται εν μέρει στην παραμονή του μικροβίου στο στρώμα βλέννης σε προστατευτική απόσταση από το επιθήλιο. Παρόλη όμως την απόσταση αυτή, ο μικροοργανισμός προκαλεί έντονη ανοσοαπάντηση στο βλεννογόνο. Αυτή η ανοσοαπάντηση φαίνεται να ξεκινά από την επαγωγή στα επιθηλιακά κύτταρα παραγωγής φλεγμονωδών ουσιών όπως η ιντερλευκίνη-8 (ΙL-8), η οποία ακολούθως στρατολογεί και ενεργοποιεί πολυμορφοπύρηνα (52,53). Παράλληλα ενεργοποιούνται CD4+ Τ-λεμφοκύτταρα (helper T-lymphocytes) που βρίσκονται στον βλεννογόνο. Προσεκτικός χαρακτηρισμός αυτών των κυττάρων έχει αποδείξει ότι έχουν τον φαινότυπο T h -1 λεμφοκυττάρων, παράγουν δηλαδή ιντερφερόνη-γ (IFN-γ) και tumor necrosis factor-α (54-56). Η IFN-γ είναι ουσία με ισχυρή φλεγμονώδη δράση. Επάγει την περαιτέρω έκκριση IL-8 από το γαστρικό επιθήλιο και αυξάνει την έκφραση ουσιών του MHC. Τα μόρια τάξης II του MHC που παράγονται φαίνονται να λειτουργούν ως υποδοχείς για το βακτήριο και ρυθμίζουν τη μεταβίβαση σημάτων από το βακτήριο στο βλεννογόνο του ξενιστή (57). Ταυτόχρονα, τα T h -1 λεμφοκύτταρα που ενεργοποιούνται είναι ικανά να προκαλέσουν απευθείας βλάβη στο επιθήλιο (58). 21

Τα ενεργοποιημένα πολυμορφοπύρηνα από την πλευρά τους παράγουν μεγάλο αριθμό οξειδωτικών ουσιών και αντιδραστικών ουσιών αζώτου (reactive nitrogen intermediates) (59). Μακροπρόθεσμα, η χρόνια φλεγμονή έχει σαν αποτέλεσμα την καταστολή έκκρισης οξέος στο στομάχι, ακόμη και πριν την εμφάνιση γαστρικής ατροφίας. Αυτή η σχετική υποχλωρυδρία επιτρέπει την ανάπτυξη άλλων μικροοργανισμών, ικανών να παράγουν νιτρώδη και να καταλύουν Ν-νιτροζο-ενώσεις, μερικές από τις οποίες είναι ισχυρά καρκινογόνες (60). Σε φυσιολογικό βλεννογόνο, η δράση των νιτρωδών περιορίζεται από ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C) που παράγει ο βλεννογόνος. Στην λοίμωξη με ΕΠ, τα επίπεδα ασκορβικού οξέος στο γαστρικό χυμό είναι σημαντικά μειωμένα (61,62). Επομένως, παρατηρείται αύξηση των βλαβερών αντιδραστικών ουσιών αζώτου και ελάττωση της εξουδετερωτικής ικανότητας του γαστρικού χυμού, συμβάλλοντας στη δημιουργία επιβλαβούς περιβάλλοντος. Α.7 Απόπτωση Οι μηχανισμοί που αναφέρθηκαν δεν είναι οι μόνοι που συμβάλλουν στη δημιουργία της βλεννογονικής βλάβης από το ΕΠ. Μία άλλη σημαντική επίδραση της λοίμωξης αφορά την απόπτωση ή προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο των επιθηλιακών κυττάρων. Η απόπτωση αποτελεί μαζί με τη νέκρωση τους δύο βασικούς μηχανισμούς κυτταρικού θανάτου. Οι δύο αυτοί μηχανισμοί έχουν διαφορετικά ιστολογικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά. Στη νέκρωση, το ερέθισμα, π.χ. η ισχαιμία ή η παρουσία τοξίνων, συχνά αποτελεί το ίδιο το αίτιο θανάτου του κυττάρου. Το αίτιο της νέκρωσης συνήθως επιδρά σε μεγάλους αριθμούς ομόρων κυττάρων. Αντιθέτως, η απόπτωση αφορά ένα συγκεκριμένο κύτταρο ανεξάρτητα από τους γείτονές του. Στην 22

απόπτωση, το αρχικό ερέθισμα δεν είναι το ίδιο θανατηφόρο, αλλά θέτει σε κίνηση μία αλληλουχία κυτταρικών γεγονότων που καταλήγουν στον κυτταρικό θάνατο. Η απόπτωση περιγράφηκε αρχικά το 1971 από τον John Kerr, ο οποίος, μετά την απολίνωση πυλαίων αγγείων σε αρουραίους, παρατήρησε ένα είδος κυτταρικού θανάτου στο ήπαρ όμοιο με αυτό που είχε παρατηρηθεί στη φυσιολογική ανάπτυξη του εμβρύου στα θηλαστικά (63). Αρχικά ονόμασε το φαινόμενο αυτό συρρικνωτικό θάνατο και τον επόμενο χρόνο το μετονόμασε σε απόπτωση για να μεταδόσει την ομοιότητα των κυττάρων αυτών με φύλλα που πέφτουν από τα δέντρα το φθινόπωρο (64). Αν παρατηρήσει κανείς ένα κύτταρο που υπόκειται απόπτωση, βλέπει αρχικά την συμπύκνωση του κυτταροπλάσματος και ακολούθως τη συνάθροιση των μιτοχονδρίων και των ριβοσωμάτων. Στην επόμενη φάση, συμπυκνώνεται ο πυρήνας και τελικά συρρικνώνεται η χρωματίνη. Το DNA τεμαχίζεται από ενδονουκλεάσες, αρχικά σε μεγάλα θραύσματα των 50-200 κιλοβάσεων και ακολούθως σε μικρότερα τεμάχια των 180 βάσεων. Κατά τη διαδικασία αυτή, το κύτταρο αποσπάται από τα γειτονικά κύτταρα και διασπάται σε αποπτωτικά σωματίδια που υποβάλλονται σε φαγοκυττάρωση από μακροφάγα. Έτσι, σε αντίθεση με τη νέκρωση, το κύτταρο κατά το θάνατό του συρρικνώνεται αντί να διογκώνεται. Άλλα βιοχημικά χαρακτηριστικά της απόπτωσης είναι η μείωση του ηλεκτρικού δυναμικού του τοιχώματος των μιτοχονδρίων και η παραγωγή ελευθέρων ριζών. Η αλληλουχία των κυτταρικών γεγονότων της απόπτωσης διαρκεί συνολικά μόνο 1-2 ώρες, και γι αυτό είναι εύκολο να υποτιμηθεί η συχνότητά της ιστολογικά. Σε αντίθεση με τη νέκρωση, η οποία θεωρείται πάντα παθολογική διαδικασία, η απόπτωση αποτελεί τμήμα πολλών βασικών λειτουργιών του ανθρώπινου οργανισμού, όπως είναι η ανάπλαση των ιστών κατά την ανάπτυξη και μετά από τραυματική βλάβη 23

(φυσιολογική απόπτωση). Σε αυτή τη διαδικασία παίζει σημαντικό ρόλο η ισορροπία ανάμεσα στην απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό. Όταν ο ρυθμός απόπτωσης στους ιστούς υπερτερεί σε σχέση με τον πολλαπλασιασμό, το αποτέλεσμα είναι συνολική απώλεια κυττάρων, όπως παρατηρείται στην αρνητική επιλογή Τ-λεμφοκυττάρων στον θύμο αδένα των βρεφών. Αντιθέτως, αν ο πολλαπλασιασμός υπερτερεί της απόπτωσης υπάρχει συνολική αύξηση στον αριθμό των κυττάρων, όπως παρατηρείται στην αποκατάσταση των ιστών μετά από τραύμα αλλά και στις νεοπλασματικές νόσους (65). Οι μηχανισμοί που ελέγχουν αυτή την ισορροπία είναι πολύπλοκοι και δεν ήταν κατανοητοί μέχρι τα τελευταία δέκα χρόνια. Σύντομα μετά την ανακάλυψη της απόπτωσης περιγράφηκε η επαγωγή της σε περιπτώσεις βακτηριακών και ιογενών λοιμώξων, αλλά και σε βλάβες από τοξίνες όπως η αλκοόλη, η ιονίζουσα ακτινοβολία και οι χημειοθεραπευτικές ουσίες (66). Όλοι αυτοί οι βλαβεροί παράγοντες δρούν μέσω της καταστολής ή της επαγωγής συγκεκριμένων γονιδίων που ρυθμίζουν την απόπτωση. Το 1993 δημοσιεύτηκε η πρώτη ταυτοποίηση τέτοιων γονιδίων στο νηματώδη σκώληκα Caenorhabditis elegans (67). Στον σκώληκα αυτόν βρέθηκαν τέσσερα γονίδια που ρυθμίζουν την ομαλή εκτέλεση του αποπτωτικού προγράμματος. Τα γονίδια ced-3, ced-4 και egl-1 επάγουν την απόπτωση. Σκώληκες στους οποίους λείπει η λειτουργία αυτών των γονιδίων αποκτούν υπερβολικό αριθμό κυττάρων. Αντιθέτως, το γονίδιο ced- 9 έχει ανασταλτική επίδραση στην απόπτωση και σκώληκες που δεν εκφράζουν το γονίδιο αυτό παρουσιάζουν διάχυτη απόπτωση. Τα τελευταία χρόνια έχουν περιγραφεί ομόλογα γονίδια και σε πιο εξελιγμάνους οργανισμούς. Τα γονίδια αυτά παράγουν πρωτεϊνες όπως οι κασπάσες (ομόλογες της ced-3), η Apaf-1 (ομόλογη της ced-4) και η Bcl-2 (ομόλογη της ced-9). (68-70). 24

Ένας καθοριστικός παράγοντας στην επιλογή ενός κυττάρου για απόπτωση είναι η κατάσταση στην οποία βρίσκεται το DNA του. Έτσι, ένα κύτταρο που έχει υποστεί σημαντικές βλάβες στο γονιδίωμα έχει μεγάλες πιθανότητες να υποστεί απόπτωση. Κατά αυτή την έννοια, η απόπτωση παίζει σημαντικό ρόλο στην επιλεγμένη καταστροφή κυττάρων με γονιδιακές βλάβες. Επακόλουθο είναι ότι μείωση της απόπτωσης ευνοεί την επιβίωση μεταλλαγμένων κυττάρων. Τα τελευταία χρόνια έχει αναγνωρισθεί ότι διαταραχές στην απόπτωση μπορεί να παίξουν παθογόνο ρόλο σε διάφορες ασθένειες. Για παράδειγμα, ορισμένοι τύποι καρκίνου παρουσιάζουν ελαττωμένους βαθμούς απόπτωσης σε συνδυασμό με αυξημένους ρυθμούς πολλαπλασιασμού (71,72). Πιθανολογείται λοιπόν ότι μείωση της απόπτωσης μπορεί να είναι ένας από τους μηχανισμούς της καρκινογένεσης. Στο φυσιολογικό γαστρικό επιθήλιο διατηρείται μία προσεκτική ισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και απόπτωσης. Η λοίμωξη με ΕΠ σχετίζεται με αύξηση του πολλαπλασιασμού, αλλά και με επέκταση της ζώνης πολλαπλασιασμού από το μεσαίο τμήμα του γαστρικού βοθρίου προς την επιφάνεια και τους βαθύτερους αδένες, περιοχές όπου συνήθως δεν υπάρχουν διαιρούμενα κύτταρα. (73). Ως προς την απόπτωση, ο Moss πρώτος περιέγραψε αύξηση των αποπτωτικών σωματιδίων σε ασθενείς με ΕΠ και παρατήρησε μείωση μετά από την εκρίζωση του βακτηρίου (74). H αύξηση της απόπτωσης έχει θεωρηθεί από μερικούς ερευνητές πιθανή εξήγηση για τη μείωση των κυττάρων που παρατηρείται στη γαστρική ατροφία (75). Δεν είναι γνωστό, όμως, αν οι επιδράσεις αυτές του ΕΠ στον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των γαστρικών κυττάρων συνεισφέρουν στην καρκινογόνο δράση του μικροβίου (76). 25

ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β ΣΤΟΧΟΣ Η εργασία έχει σαν στόχο την ανάλυση της επίδρασης λοίμωξης με ΕΠ στούς ρυθμούς απόπτωσης και πολλαπλασιασμού του γαστρικού επιθηλίου. Ιδιαίτερη έμφαση δίνεται στην μελέτη του προκαρκινικού σταδίου της εντερικής μεταπλασίας. Η ανάλυση αυτή προσπαθεί να αναδείξει αν η καρκινογόνος επίδραση της λοίμωξης σχετίζεται με διαταραχές στη φυσιολογική ισορροπία ανάμεσα σε απόπτωση και πολλαπλασιασμό στο γαστρικό επιθήλιο. 26

ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Γ.1 Ασθενείς Μελετήσαμε την απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό σε βιοψίες του γαστρικού άντρου που πάρθηκαν ενδοσκοπικά σε 42 ασθενείς. Οι 30 ήταν άνδρες ηλικίας από 18 έως 78 ετών (μέσος όρος ηλικίας 45.4 έτη) και οι 12 ήταν γυναίκες ηλικίας από 28 έως 59 ετών (μέσος όρος ηλικίας 43.9 έτη). Οι ασθενείς είχαν υποβληθεί σε γαστροσκόπηση από τον ίδιο ενδοσκόπο (Θ.Ρ.) στο 401 Γενικό Στρατιωτικό Νοσοκομείο Αθηνών λόγω δυσπεπτικών ενοχλημάτων. Βιοψίες του γαστρικού άντρου είχαν ληφθεί για τη ανίχνευση του ΕΠ ανεξαρτήτως των άλλων ευρημάτων της ενδοσκόπησης. Το βιοψικό υλικό είχε μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη και διατηρηθεί σε μπλοκ παραφίνης. Ουδείς από τους ασθενείς είχε λάβει θεραπεία με μη-στεροειδή αντιφλεγμονώδη φάρμακα για τουλάχιστον μία εβδομάδα πριν την ενδοσκόπηση. Η ανίχνευση του ΕΠ έγινε με συνδυασμό CLO test (Tri-Med Specialties, Charlottesville, Η.Π.Α.) και χρώση θειαζίνης σε ιστολογικές τομές, όπως περιγράφεται παρακάτω. Το CLO test πραγματοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της ενδοσκόπησης και ερμηνεύθηκε από τον ενδοσκόπο (Θ.Ρ.). Η χρώση θειαζίνης, που είναι τροποποιημένη χρώση τύπου Diff- Quick, αξιολογήθηκε από παθολογοανατόμο που δεν γνώριζε τα αποτελέσματα του CLO test. Ο κάθε ασθενής θεωρήθηκε προσβλημένος με ΕΠ (ΕΠ-θετικός) μόνο αν και οι δύο μέθοδοι ανίχνευσης του ΕΠ έδωσαν θετικά αποτελέσματα. Αν και οι δύο μέθοδοι έδωσαν αρνητικά αποτελέσματα, ο ασθενής θεωρήθηκε μη προσβλημένος με ΕΠ (ΕΠ- 27

αρνητικός). Σε περίπτωση θετικού αποτελέσματος με μόνο μία από τις δύο μεθόδους, η ύπαρξη του ΕΠ θεωρήθηκε αμφίβολη και ο ασθενής δεν συμπεριλήφθηκε στη μελέτη. Γ.2 Εκτίμηση Γαστρίτιδας Πλακίδια με τομές των 5μm χρωσμένες με Αιματοξυλίνη/Ηωσίνη εξετάστηκαν από τον ίδιο παθολογοανατόμο (E.E.F.) που αξιολόγησε τη χρώση θειαζίνης. Για να αποφευχθεί μεροληψία, ένα σημαντικό χρονικό διάστημα μεσολάβησε ανάμεσα στην εξέταση των δύο χρώσεων και τα πλακίδια εξετάστηκαν με τυχαία σειρά. Στα δείγματα εκτιμήθηκαν τα ακόλουθα ευρήματα: 1. Όξεία Γαστρίτιδα: Διήθηση του επιθηλίου και του βλεννογόνου με πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα. 2. Χρόνια Γαστρίτιδα: Διήθηση του επιθηλίου και του βλεννογόνου με μονοπύρηνα λευκοκύτταρα. Οι δύο τύποι γαστρίτιδας βαθμολογήθηκαν ο καθένας από το 0 ως το 3, σύμφωνα με την καθιερωμένη κλίμακα κατά Sydney: 0 βαθμοί = απούσα 1 βαθμός = ήπια 2 βαθμοί = μέτρια 3 βαθμοί = έντονη Το άθροισμα των βαθμών για την οξεία και τη χρόνια γαστρίτιδα αποτέλεσε τον συνολικό δείκτη γαστρίτιδας (cumulative gastritis score ή CGS) με τον οποίον εκτιμήθηκε η συνολική ένταση της γαστρίτιδας. Η φλεγμονή εκτιμήθηκε ως ήπια αν ο συνολικός δείκτης γαστρίτιδας ήταν 1 ή 2, μέτρια αν ο δείκτης ήταν 3 ή 4 και έντονη αν ο δείκτης ήταν 5 ή 6. 28

Συνολικός Δείκτης Γαστρίτιδας (CGS, cumulative gastritis score) = Βαθμός οξείας γαστρίτιδας + Βαθμός χρόνιας γαστρίτιδας Ένταση γαστρίτιδας 1-2 Ήπια 3-4 Μέτρια 5-6 Έντονη 3. Εντερική Μεταπλασία (ΕΜ): Αυτή ορίστηκε ως το εύρημα 3 ή περισσοτέρων παρακείμενων γαστρικών βοθρίων που περιείχαν τουλάχιστον 2 λαγηνοειδή κύτταρα το καθένα. Η ΕΜ αξιολογήθηκε απλώς ως παρούσα ή απούσα σε κάθε ασθενή. Γ.3 Εκτίμηση Απόπτωσης και Πολλαπλασιασμού Ο ιστός είχε μονιμοποιηθεί σε υγρό που περιείχε 10% ουδέτερα ρυθμιζόμενη φορμαλίνη και διατηρηθεί σε μπλοκ παραφίνης. Από τα μπλοκ αυτά παρασκευάστηκαν τομές πάχους 5 μικρομέτρων (μm) σε φορτισμένα πλακάκια μικροσκόπησης (Fisher, Springfield, NJ, Η.Π.Α.). Έτσι ώστε τα πλακάκια της απόπτωσης να μην διαφέρουν σημαντικά από αυτά του πολλαπλασιασμού, εκτιμήθηκαν συνεχόμενες τομές. Πάχος 50μm μεσολαβούσε ανάμεσα στα διαφορετικά επίπεδα τομών, έτσι ώστε να εκτιμηθούν τα γαστρικά βοθρία σε διαφορετικά επίπεδα του ιστού. Οι επωάσεις που περιγράφονται ακολούθως έγιναν όλες σε θερμοκρασία δωματίου εκτός αν αναφέρεται κάτι άλλο. Απόπτωση 29

Η απόπτωση στα γαστρικά επιθηλιακά κύτταρα αξιολογήθηκε με την ιστοχημική μέθοδο TUNEL (terminal deoxynucleotidyltransferase [TdT]-mediated dutp-biotin nick-end labeling). Η μέθοδος TUNEL βασίζεται στο γεγονός ότι ένα από τα στάδια της απόπτωσης είναι η τεμάχιση των τελικών αλληλουχιών του κυτταρικού DNA από ενδονουκλεάσες. Αυτό έχει σαν συνέπεια τη δημιουργία φθαρμένων άκρων (nick ends), οι οποίες ανιχνεύονται με τη μέθοδο του TUNEL. Η παραφίνη αφαιρέθηκε από τις τομές με ξυλόλη. Η δράση ενδογενούς υπεροξειδάσης εξουδετερώθηκε με διάλυμα 2% υπεροξειδίου του υδρογόνου (H 2 O 2 ) για 15 λεπτά. Οι τομές ενυδατώθηκαν σταδιακά σε διαλύματα αλκοόλης. Ακολούθως αφαιρέθηκαν οι πυρηνικές πρωτεϊνες με χρήση πρωτεινάσης Κ σε διάλυμα 20μg/mL για 15 λεπτά. Η επιμήκυνση του 3'-άκρου των θραυσμάτων DNA επιτεύχθηκε ως εξής: Μετά από προεπώαση για 5 λεπτά με ρυθμιστικό διάλυμα για TdT (30mM Tris-HCl base, ph=7.2/ 140mM sodium cacodylate/ 1mM cobalt chloride), οι τομές επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 C με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα που επιπλέον περιείχε 0,3 U/μL TdT (Pharmacia, Piscataway, NJ, Η.Π.Α.) και 40 μμ biotin-16-dudp (Boeringer Mannheim, Γερμανία). Η αντίδραση τερματίστηκε με πλύση για 15 λεπτά σε διάλυμα 300mM χλωριούχου νατρίου/ 30mM κιτρικού νατρίου σε ph 7. Τα πλακάκια κατόπιν ξεπλύθηκαν με νερό και PBS. Η χρώση των τομών έγινε με επώαση για 30 λεπτά στους 37 C με περίσσεια avidin peroxidase (EAP) (Sigma, St. Louis, Η.Π.Α.) διαλυμένη 1:200. Η τελική συγκέντρωση του ΕΑΡ ήταν 0,011 mg/ml (1,32 purpurogallanin units/ml) σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 1% BSA/ 0,5M NaCl/ 1x PBS. Τα πλακάκια ακολούθως επωάστηκαν για 2 λεπτά σε διάλυμα 0,4 mg/ml diaminobenzidine (DAB, Sigma, St. Louis, Η.Π.Α.). 30

Η αντίχρωση (counterstaining) των πλακακιών έγινε με φιλτραρισμένη αιματοξυλίνη του Harris (Shandon, Pittsburgh, H.Π.Α.) και διάλυμα 2% NH 4 OH. Τα πλακάκια ακολούθως ξεπλύθηκαν, αφυδατώθηκαν και καλύφθηκαν με καλυπτρίδες για εξέταση με το μικροσκόπιο. Σε κάθε χρώση συμπεριλήφθησαν θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες. Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν τομές επεξεργασμένες με DNAse I (Sigma, St, Louis) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου πριν εφαρμοστεί η τεχνική TUNEL. Αυτό είχε σαν αποτέλεσμα θετική χρώση όλων των πυρήνων (καφέ χρώμα, βλέπε Εικόνα 3). Ως αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν τομές στις οποίες παραλείφθηκε η χρήση TdT και biotin-16-dudp, έχοντας σαν αποτέλεσμα την ομοιόμορφα αρνητική χρώση όλων των πυρήνων (μπλέ χρώμα). Πολλαπλασιασμός Η εκτίμηση του πολλαπλασιασμού στις τομές έγινε με χρώση ανοσοπεροξειδάσης για το αντιγόνο Ki-67, το οποίο εκφράζεται σε κύτταρα κατά τη διάρκεια του πολλαπλασιασμού. Η έκφραση αυτού του αντιγόνου εκτιμήθηκε με το ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα ΜΙΒ-1. Τομές ιστού πάχους 5 μικρομέτρων τοποθετήθηκαν σε φορτισμένα πλακίδια μικροσκόπησης. Η παραφίνη αφαιρέθηκε και οι τομές ενυδατώθηκαν όπως περιγράφηκε νωρίτερα. Οι τομές ακολούθως χρώσθηκαν με έμμεση μέθοδο ανοσοϋπεροξειδάσης. Η ενδογενής υπεροξειδάση εξουδετερώθηκε με διάλυμα 1% υπεροξιδίου του υδρογόνου (H 2 O 2 ) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές κατόπιν ξεπλύθηκαν δις με διπλά απεσταγμένο νερό και επωάσθηκαν δις σε φούρνο μικροκυμάτων με διάλυμα ανάκτησης αντιγώνων Citra (BioGenex, San Ramon, California, Η.Π.Α.). Η κάθε επώαση διήρκεσε 5 λεπτά. Η μη ειδική δέσμευση του αντισώματος αποφεύχθηκε με διάλυμα 10% φυσιολογικού ορού κατσίκας (normal goat 31

serum, NGS, Pocono Rabbit Farm and Laboratory, Canadensis, Pennsylvania, Η.Π.Α.). Για την ανίχνευση του αντιγόνου Ki-67, τα πλακάκια επωάστηκαν μέχρι το επόμενο πρωί στους 4 C με μονοκλωνικό αντισωμα ΜΙΒ-1 (Immunotech, Westbrook, Maine, Η.Π.Α.), διαλυμένο 1:50 (0,34 μg/ml) σε 1% NGS. Μετά την επαναφορά σε θερμοκρασία δωματίου, οι τομές επωάσθηκαν για 30 λεπτά με αντισώματα αλόγων κατά ποντικιών (horse anti-mouse secondary antibodies, Vector, Burlingame, California, Η.Π.Α.) σε διάλυμα 1:200. Ακολούθως έγινε η χρώση με την πρόσθεση συμπλέγματος avidin-biotinperoxidase (ABC reagent, Vector) διαλυμένου 1:100 σε 1% NGS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η χρώση ολοκληρώθηκε με 0,4 mg/ml diaminobenzidine (DAB, Sigma). Η αντίχρωση έγινε με φιλτραρισμένη αιματοξυλίνη του Harris (Shandon). Τα πλακάκια αφυδατώθηκαν σταδιακά με διαλύματα αλκοόλης και καλύφθηκαν με καλυπτρίδες για εξέταση με το μικροσκόπιο. Ως θετικοί μάρτυρες χρώστηκαν παράλληλα τομές από φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου, στις οποίες παρατηρείται θετική χρώση με ΜΙΒ-1 στις βάσεις των αδένων. Ως αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν τομές από γαστρικό άντρο στις οποίες το αντίσωμα ΜΙΒ-1 αντικαταστάθηκε από αντίσωμα IgG 1 διαλυμένο 1:200 σε 1% NGS, με αποτέλεσμα την ομοιόμορφα αρνητική χρώση (με μπλε χρώμα) των πυρήνων. Γ.4 Μετρήσεις Απόπτωσης και Πολλαπλασιασμού Οι μετρήσεις απόπτωσης και πολλαπλασιασμού έγιναν σε σύνολο 1000 επιθηλιακών κυττάρων των γαστρικών βοθρίων σε κάθε ασθενή. Ο Δείκτης Απόπτωσης (Apoptotic Index, AI) ορίστηκε ως το ποσοστό των πυρήνων που είχαν θετική χρώση με 32

την τεχνική TUNEL σε σύνολο 1000 κυττάρων που μετρήθηκαν. Παρομοίως, ο Δείκτης Πολλαπλασιασμού (Proliferative Index, PI) ορίστηκε ως το ποσοστό των πυρήνων που είχαν θετική χρώση για το αντιγόνο Ki-67 σε σύνολο 1000 κυττάρων. Σε πλακάκια με εστίες εντερικής μεταπλασίας, έγιναν χωριστές μετρήσεις σε βοθρία με μεταπλασία και χωρίς μεταπλασία. Όλες οι μετρήσεις έγιναν από τον ίδιο ερευνητή (ΗΣ), ο οποίος δεν γνώριζε την ύπαρξη ή μη λοίμωξης με ΕΠ στον κάθε ασθενή. Ο Λόγος Απόπτωσης- Πολλαπλασιασμού (Apoptosis/Proliferation ratio, AI/PI) μετρήθηκε διαιρώντας τον Δείκτη Απόπτωσης (AI) δια του Δείκτη Πολλαπλασιασμού (PI). Εφόσον η φύση διατηρεί μια ισορροπία ανάμεσα σε απόπτωση και πολλαπλασιασμό, ο λόγος ΑΙ/ΡΙ αναμένεται να είναι σταθερός σε φυσιολογικούς ιστούς, αν και αυτός δεν αναμένεται να ισούται με 1 λόγω των διαφορετικών μεθόδων που χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση του ΑΙ και του ΡΙ. Παρόλα ταύτα, η σύγκριση του λόγου ΑΙ/ΡΙ μεταξύ ομάδων ατόμων με διαφορετικές παθήσεις είναι δυνατόν να διαφωτίσει το ρόλο που παίζει η αναλογία απόπτωσηςπολλαπλασιασμού σε αυτές τις παθήσεις. Η ακρίβεια των μετρήσεων που έγιναν επαληθεύτηκε με την ανεξάρτητη επανάληψη των μετρήσεων ΑΙ και ΡΙ στούς πρώτους δέκα ασθενείς μετά το πέρας όλων των μετρήσεων. Πράγματι, σε όλες τις περιπτώσεις οι επαναληπτικές μετρήσεις δεν απέκλειναν από τις αρχικές κατά περισσότερο από 0,2%. Γ.5 Στατιστική Ανάλυση Τα δεδομένα στις ομάδες ασθενών συγκρίθηκαν με την τεχνική ANOVA (analysis of variance). Η σύγκριση ανάμεσα σε στα βοθρία με μεταπλασία και αυτά χωρίς μεταπλασία στον ίδιο ασθενή έγινε με τη χρήση linear regression analysis. Για τη 33

στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα JMP Software (SAS Institute, Cary, North Carolina, Η.Π.Α.). Η αξία στατιστικής σημασίας ορίστηκε στο p<0,05. 34

ΚΕΦΑΛΑΙΟ Δ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Δ.1 Λοίμωξη με ΕΠ Ο Πίνακας Β παρουσιάζει τα κλινικά στοιχεία των ασθενών της μελέτης. Από τους 42 ασθενείς που εξετάσθηκαν, 31 βρέθηκαν να είναι ΕΠ-θετικοί και 11 βρέθηκαν να είναι ΕΠ-αρνητικοί. Υπήρξε 100% συμφωνία μεταξύ των αποτελεσμάτων του CLO test και της χρώσης θειαζίνης για την ανίχνευση του ΕΠ. Οι βιοψίες των 11 ασθενών που ήταν ΕΠ-αρνητικοί ήταν φυσιολογικές, χωρίς ευρήματα γαστρίτιδας ή εντερικής μεταπλασίας στη χρώση Αιματοξυλίνης/Ηωσίνης (φυσιολογικοί μάρτυρες). Οι 31 ασθενείς που ήταν ΕΠ-θετικοί επέδειξαν όλοι ιστολογικά ευρήματα γαστρίτιδας. Η γαστρίτιδα ήταν ήπια σε 10 ασθενείς, μέτρια σε 16 και έντονη σε 5. Εστίες εντερικής μεταπλασίας παρατηρήθηκαν σε 9 από τους 31 ΕΠθετικούς ασθενείς (4 με ήπια, 4 με μέτρια και 1 με έντονη γαστρίτιδα). 35

Πίνακας Β. Κλινικά Χαρακτηριστικά και Δείκτες Απόπτωσης και Πολλαπλασιασμού των Ασθενών Ηλικία Γένο ς Τεστ ΕΠ Ιστολογικά Ευρήματα Ένταση Γαστρίτιδας ΑΙ (%) ΡΙ (%) ΑΙ/ΡΙ 1 36 Θ - Φυσιολογικά - 0,08 6,9 0,011 2 20 Α - Φυσιολογικά - 0,23 14,1 0,016 3 28 Θ - Φυσιολογικά - 0,28 8,1 0,034 4 46 Θ - Φυσιολογικά - 0 11,7 0 5 56 Θ - Φυσιολογικά - 0,21 17,9 0,011 6 52 Α - Φυσιολογικά - 0,33 5,7 0,057 7 29 Θ - Φυσιολογικά - 0,10 9,2 0,011 8 48 Α - Φυσιολογικά - 0,10 19,0 0,005 9 20 Α - Φυσιολογικά - 0,19 8,7 0,022 1 0 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 0 2 1 2 2 2 3 2 4 36 Α - Φυσιολογικά - 0,10 13,0 0,008 37 Α - Φυσιολογικά - 0,08 28,2 0,003 50 Α + Γαστρίτιδα Ήπια 1,25 20,7 0,060 20 Α + Γαστρίτιδα Ήπια 0,87 14,2 0,061 45 Α + Γαστρίτιδα Ήπια 0 26,0 0 32 Α + Γαστρίτιδα Ήπια 1,31 19,7 0,066 37 Θ + Γαστρίτιδα Ήπια 0 20,7 0 35 Α + Γαστρίτιδα Ήπια 0,12 16,9 0,007 20 Α + Γαστρίτιδα Μέτρια 2,19 26,0 0,084 37 Θ + Γαστρίτιδα Μέτρια 1,95 19,7 0,099 18 Α + Γαστρίτιδα Μέτρια 2,35 25,5 0,092 46 Α + Γαστρίτιδα Μέτρια 0,93 27,4 0,034 38 Α + Γαστρίτιδα Μέτρια 1,57 22,3 0,070 59 Α + Γαστρίτιδα Μέτρια 1,17 37,2 0,032 78 Α + Γαστρίτιδα Μέτρια 0,44 30,3 0,015 36

2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 3 1 3 2 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 3 8 3 9 4 0 4 1 4 2 53 Θ + Γαστρίτιδα Μέτρια 0,59 19,1 0,031 58 Α + Γαστρίτιδα Μέτρια 2,27 23,0 0,099 41 Α + Γαστρίτιδα Μέτρια 1,63 22,5 0,073 58 Θ + Γαστρίτιδα Μέτρια 0,33 29,0 0,011 40 Θ + Γαστρίτιδα Μέτρια 0,64 29,9 0,021 50 Α + Γαστρίτιδα Έντονη 1,62 35,9 0,045 48 Θ + Γαστρίτιδα Έντονη 1,18 19,1 0,062 76 Α + Γαστρίτιδα Έντονη 1,54 24,3 0,063 65 Α + Γαστρίτιδα Έντονη 1,81 23,6 0,077 40 Α + Γαστρίτιδα.και Εντ. Μεταπλασία 72 Α + Γαστρίτιδα.και Εντ. Μεταπλασία 56 Α + Γαστρίτιδα.και Εντ. Μεταπλασία 59 Θ + Γαστρίτιδα.και Εντ. Μεταπλασία 31 Α + Γαστρίτιδα.και Εντ. Μεταπλασία 56 Α + Γαστρίτιδα.και Εντ. Μεταπλασία 65 Α + Γαστρίτιδα.και Εντ. Μεταπλασία 62 Α + Γαστρίτιδα.και Εντ. Μεταπλασία 36 Α + Γαστρίτιδα.και Εντ. Μεταπλασία Ήπια 1,18 (0,20) Ήπια 1,19 (0,12) Ήπια 0,56 (0,20) Ήπια 0,10 (0,27) Μέτρια 1,86 (0,30) Μέτρια 1,27 (0,10) Μέτρια 1,71 (0,46) Μέτρια 2,05 (0,10) Έντονη 2,13 (0) 19,5 (14,7) 21,8 (25,1) 21,0 (14,4) 24,8 (46,1) 25,1 (14,3) 19,3 (28,5) 26,3 (22,7) 28,4 (39,8) 33,2 (22,6) 0,060 (0,013) 0,055 (0,005) 0,027 (0,014) 0,004 (0,006) 0,074 (0,02) 0,066 (0,004) 0,065 (0,020) 0,072 (0,003) 0,064 (0) Βάσει του Συνολικού Δείκτη Γαστρίτιδας (Cumulative Gastritis Score ή CGS). Οι τιμές εντός παρενθέσεως αντιπροσωπεύουν μετρήσεις σε βοθρία με εντερική μεταπλασία. 37

Δ.2 Απόπτωση Ο Πίνακας Γ και η Εικόνες 2 α και 2β συνοψίζουν την ανάλυση της απόπτωσης. Οι τιμές των Δεικτών Απόπτωσης (Apoptotic Index, AI) και Πολλαπλασιασμού (Proliferative Index, PI), όπως και του Λόγου Απόπτωσης-Πολλαπλασιασμού (Apoptosis/Proliferation ratio, AI/PI), αναφέρονται παντού ως μέσος όρος ± standard error of the mean (SEM). Πίνακας Γ. Η Απόπτωση στον Βλεννογόνο του Γαστρικού Άντρου Ιστολογικό Εύρημα Αριθμός Ασθενών Δείκτης Απόπτωσης, ΑΙ (% ± SEM) Σύγκριση με Φυσιολογικό Βλεννογόνο (p value) Φυσιολογικός βλεννογόνος (ΕΠ-αρνητικός) 11 0,15 ± 0,03 - Γαστρίτιδα (ΕΠ-θετική) 31 1,22 ± 0,13 <0,0001 Ήπια 10 0,66 ± 0,18 <0,01 Μέτρια 16 1,43 ± 0,17 <0,0001 Έντονη 5 1,66 ± 0,16 <0,0001 Γαστρίτιδα χωρίς περιβάλλουσα Εντερική Μεταπλασία 22 1,17 ± 0,16 <0,0001 Γαστρίτιδα που περιβάλλει Εντερική Μεταπλασία 9 1,34 ± 0,23 <0,0001 Εντερική Μεταπλασία 9 0,20 ± 0,06 0,18 Στατιστικά σημαντική διαφορά (p<0,05) Υπήρχε σημαντική διαφορά (p=0,0014) σε σύγκριση με την περιβάλλουσα γαστρίτιδα 38