سال دهم شماره 2 صفحات 103 تا 110 تابستان 1391 مقاله تحقيقاتي نام نويسند گان بررسي اثرات ضد توموري تركيبات ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس بر مهار توليد ا نزيمهاي متالوپروتي ينازها در رده سلولي فيبروساركوماي انساني * شهلا رودبار محمدي 1 مريم رودباري 2 محمود وحيدي 3 زهير محمد حسن 4 ناهيد دارابي 5 تاريخ اعلام وصول: 1390/9/6 تاريخ اعلام قبولى مقاله: 1391/1/23 چكيده سابقه و هدف: ا نزيمهاي متالوپروتي يناز نقش مهمي در فرايندهاي فيزيولوژيك و پاتولوژيك ايفا ميكنند. شواهد زيادي مبني بر نقش ا نزيمهاي متالوپروتي ينازها در تهاجم تومورها و بيماريهاي التهابي وجود دارد. در اين مطالعه اثر تركيبات ديواره سلولي كانديدا بر روي توليد ا نزيمهاي متالوپروتي ينازها با استفاده از سنجش سايتوتوكسيسيتي و همچنين زايموگرافي ژلاتين انجام شد. مواد و روشها: اين مطالعه توصيفي بهمدت يكسال در دانشكده پزشكي تربيت مدرس انجام شد. تركيبات ديواره سلولي كانديدا با بافر ليز كننده جدا سازي شد و غلظتهاي (μg/ml) 0 10 50 100 ا ن به سلولهاي فيبروساركوماي انساني موجود در چاهك ميكرو پليت 96 خانهاي اضافه شد و اثرات مهاري ا ن روي سلولهاي توموري با تست سايتوتوكسيسيتي 5-dimethylthiazol-2yl) MTT -3),4) bromide) -2,5- diphenyltetrazolium و همچنين تست زايموگرافي بررسي شد. يافتهها: نتايج حاصل از اين مطالعه نشان داد كه تركيبات ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس داراي اثرات مهاري بر روي سلولهاي توموري بوده است زيرا ميزان حيات و زنده بودن سلولهاي توموري را در تست MTT در مقايسه با گروه كنترل كه هيچ تيماري نداشتند كاهش داده است و همچنين توليد ا نزيمهاي متالو پروتي ينازها در حضور اين فراكشن كاهش معنا داري داشته است. بحث و نتيجهگيري: از ا نجايي كه مهار فعاليت ا نزيم ميتواند در درمان بيماريهايي از قبيل سرطان مفيد باشد و با توجه به نتايج حاصل از اين مطالعه ميتوان تركيبات ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس را به عنوان يك خط درمان جهت مهار فعاليت ا نزيمهاي متالوپروتي يناز به كار برد. كلمات كليدي: تركيبات ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس ا نزيمهاي متالوپروتي يناز MTT زايموگرافي مقدمه با توجه به افزايش بيماريهاي مرتبط با نقص ايمني و سرطان در سالهاي اخير تلاشهاي زيادي در جهت استفاده از عوامل ايمونومدولاتوري با منشا طبيعي بهعنوان تركيبات دارويي شكل گرفته است (1 2). متاستاز خصوصيتي است كه تومور بدخيم را از ني وپلازي خوشخيم مجزا ميكند (3) لذا جلوگيري از متاستاز يكي از اصليترين مراحل در درمان سرطان است (3) ماتريكس متالوپروتي ينازها (MMPs) Matrix Metalloproteinases يك خانواده ا نزيمي همولوگوس بوده كه از تركيبات ماتريكس خارج سلولي (ECM) Extra cellular Matrix بهعنوان سوبسترا جهت فعاليت 1 استاديار ايران تهران دانشگاه تربيت مدرس دانشكده پزشكي گروه قارچ شناسي پزشكي (*نويسنده مسي ول) تلفن: - 82883572 021 ا درس الكترونيك: Sh.mohammadi@modares.ac.ir 2 پژوهشگر ايران تهران دانشگاه تربيت مدرس دانشكده علوم پزشكي گروه قارچ شناسي پزشكي 3 مربي ايران تهران دانشگاه علوم پزشكي ا جا دانشكده پيراپزشكي گروه علوم ا زمايشگاهي 4 استاد ايران تهران دانشگاه تربيت مدرس دانشكده علوم پزشكي گروه ايمني شناسي پزشكي 5 پژوهشگر ايران تهران دانشگاه تربيت مدرس دانشكده علوم پزشكي گروه قارچ شناسي پزشكي
سال دهم شماره 2 تابستان 1391 شماره مسلسل 38 104 پروتي ولتيك خود استفاده ميكنند( 4 ). تخريب ماتريكس خارج سلولي منجر به تهاجم و متاستاز سلولهاي توموري ميشود. براساس سوبستراهاي اختصاصي و ساختار دومن متالوپروتي ينازها ا نها را به 4 گروه تقسيم ميكنند كه يكي از اين زير گروهها از ژلاتين و كلاژن به عنوان سوبسترا استفاده مينمايند اين زير گروه MMP ژلاتيناز شامل دو عنصر MMP-2 (ژلاتيناز A) و MMP-9 (ژلاتيناز B) ميباشد كه در ابتداي رشد و متاستاز سلولهاي توموري دخيل هستند 4).(5 بنابراين هر عاملي كه نقش ممانعت كنندگي در فعاليت و بيان متالوپروتي ينازها داشته باشد توانايي مهار رشد سرطان را خواهد داشت (4) و ميتواند بهعنوان يك خط درماني جهت بيمارهاي التهابي و بدخيميها باشد. در سالهاي اخير توجه ويژهاي بر روي ممانعت كنندههاي اثر MMPs بهعنوان يك كلاس جديد داروهاي ضد سرطان معطوف شده است( 5 ) اين نوع تركيبات در قارچها در بخشهاي حاوي گلوكان و پليساكاريدهاي ا ن وجود دارد (1) كه از ا نها بهعنوان ايمنومدولاتور با خاصيت ضد توموري ياد شده است از جمله lentinan β (1-3) D-glucan از قارچ Lentinus edoder و Schizaphyllan از قارچ شيزوفيليوم كاميونه از تركيبات اصلي ديواره سلولي اين قارچ هابوده كه خاصيت ضد توموري و ايمنواستيمولاتوري دارند (6 7). بتاگلوكان مشتق شده از قارچ گانودرما توانايي مهار رشد سلولهاي توموري را در Carcinoma و سلولهاي ملانوماي B16 داشته (7) و اين خاصيت ايمنوفارماكولوژيك β-glucan به اثرات ضدتوموري و مهار كارسينوژنز ا ن برميگردد. - β گلوكانها و مانان از اصليترين اجزا ديواره سلولي قارچها از جمله كانديدا ا لبيكنس ميباشند (8). در تحقيق حاضر اثر فراكشنهاي ديواره سلولي كانديدا بر روي فعاليت ا نزيمهاي متالوپروتي ينازها مورد بررسي قرار گرفته است. مواد و روشها اين مطالعه در سال 89 در دانشكده پزشكي دانشگاه تربيت مدرس انجام شد.در اين تحقيق ازتركيباتهاي ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنساستفادهشد.سويهاستانداردقارچكانديداا لبيكنسATCC ) (10321 از انستيتو پاستور ايران تهيه و بر روي محيط كشت سابورو دكستروز ا گار حاوي ا نتي بيوتيك كلرامفنيكل كشت و به مدت 24 ساعت در انكوباتور 37 C قرار گرفت. تهيه تركيبات ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس به منظور توليد كشت انبوه از محيط GYEP شامل گلوكز %2 پپتون 1/0% و عصاره مخمر %0/3 استفاده شده و ا نتي بيوتيكهاي كلرامفنيكل mg/ml) 50) و استرپتومايسين μg/ml) 100) به محيط اضافه گرديد. سوسپانسيوني از كانديدا ا لبيكنس به ميزان 10 6 سلول در هر ميلي ليتر تهيه و به ارلنها اضافه گرديد. سپس ارلنها به انكوباتور شيكردار با دور 100 دور در دقيقه منتقل و در درجه حرارت 28-30 C به مدت 48 ساعت نگهداري شدند بعد از 48 ساعت ارلنها در شرايط استريل به زير هود منتقل شده و پس از مخلوط نمودن محتويات ارلن محيط حاوي مخمر را درون فالكونهاي 50 ml ريخته و با بافر فسفات 10 ميلي مولار و با استفاده از سانتريفيوژ يخچال دار (4 C و دور 800) g به مدت 10 دقيقه شستشو و جمعا وري شدند. بعد از سانتريفيوژ مايع روي ي را خالي كرده و با استفاده از يك سمپلر مخمرهاي رسوب شده ته فالكون را جمعا وري نموده و همه نمونهها به درون يك فالكون منتقل شده و سپس 3 مرتبه با بافر فسفات استريل شستشو داده شد و در دور 800 g به مدت 10 دقيقه سانتريفيوژ شدند رسوب باقيمانده جمعا وري شد. به منظور تهيه عصاره ديواره سلولي از روش Casanova همراه با برخي تغييرات استفاده شد (20). شكستن ديواره سلولي مخمر زير هود و تحت شرايط استريل سلولهاي مخمري شسته شده كانديدا ا لبيكنس درون لوله درپيچ دار استريل با حجم مشخصي از بافر مخلوط و به ميزان نصف حجم بافر پرل شيشهاي استريل به ا ن افزوده گرديد. سپس ا نتي پروتي از (0/001 PMSF مولار) كه درون اپندورف 0/5 ml با الكل 70 در صد حل شده است به منظور جلوگيري از تخريب پروتي ينهاي ا زاد شده ضمن شكسته شدن ديوارهسلوليبهمخلوطحاصل اضافهگرديد.سپسمحتوياتلوله ورتكس شده عمل ورتكس تا ا نجايي ادامه مييابد كه حدود %90 سولهاي مخمري شكسته شوند.شكسته شدن سلولهاي مخمري با مشاهده زير ميكروسكوپ نوري تاييد گرديد. پس از هر 2 دقيقه
بررسي اثرات ضد توموري تركيبات ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس بر مهار توليد ا نزيم هاي... شهلا رودبار محمدي و همكاران 105 ورتكس حدود 30 ثانيه لوله محتوي مخمر درون بشر حاوي يخ قرارميگرفت.پسازشكستهشدنديوارهسلولي سلولهابهمدت 30 دقيقه در 37 C انكوبه شدند. بعد از اين مرحله و جداسازي پرل شيشهاي عصاره مخمري به مدت 5 دقيقه در حمام ا ب جوش (96 C) قرار گرفته و سپس در يك ظرف حاوي يخ قرار داده شد. لولههاي حاوي سوسپانسيون سلولي دوباره به مدت 5 دقيقه به كمك ورتكس مخلوط شده و سپس سوسپانسيون به مدت 10 دقيقه با دور 14000 g در دماي 4 C سانتريفيوژ شد. در انتها مايع روي ي را به كمك سمپلر برداشت نموده و وارد اپندورف استريل نمودهبهمنظورجداسازينمكومواداضافيازپروتي ينها نمونهها مورد دياليز قرار گرفتند. تعيين غلظت پروتي ين به روش برادفورد بهمنظورسنجشغلظتپروتي ينهايتخليصشدهازرنگكوماسي برليانتبلواستفادهشدهاست.الگويالكتروفورزيعصارهمخمري ديوارهسلوليكانديداا لبيكنسبااستفادهازروشالكتروفورز SDS- PAGE مورد مطالعه قرار گرفت. در اين روش از ژل %10 براي تهيه ژل جدا كننده و متراكم استفاده شده است ژل پلي اكريل ا ميد با كوماس بلو 250-R رنگ ا ميزي شدند. انجام اولترا فيلتراسيون اولترا فيلتر به صورت ا ماده از شركت Millipore خريداري گرديد. عصاره پروتي يني ديواره سلولي در لولههاي فالكول 15 ميلي ليتري كه محتوي فيلتر خاص با 50 KD Cutoff بوده است قرار گرفت پس از ريختن عصاره پروتي يني توسط سمپلر درون فيلتر لوله مربوطه در دماي 4 C و دور RPM3000 به مدت 10 دقيقه سانتريفوژ گرديد. پس از سانتريفوژ در حد فاصل فيلتر دو فاز تشكيل گرديد. فاز بالايي محتوي پروتي ينهايي با وزن مولكولي بيش از 50 KD بوده است كه مد نظر ما بوده است و فاز پاييني محتوي پروتي ينهايي با وزن مولكولي كمتر از 50 KD بوده است كه دور ريخته شد.سپس دوباره عصاره پروتيي ني الكتروفورز شدند. ا زمونL.A.L (Limulus Amebocyte Lysate) به منظور اثبات عدم وجود ليپو پلي ساكاريد LPS موجود در عصاره پروتي ينيتخليصشدهازديوارهسلوليكانديداا لبيكنستستL.A.L انجام شده است. اين تست در موسسه رازي كرج در بخش مركزي تحقيقات ميكروب شناسي انجام شد. اساس تست بر مبناي انعقاد ژل ميباشد. بدين صورت كه در صورت وجود گلوكان در عصاره پروتي يني مورد نظر ژل منعقد شده و رنگ ا بي ايجاد ميشود و در صورت عدم وجود گلوكان ژل منعقد نشده و تغيير رنگي مشاهده نميشود 0. قبل از انجام اين تست عصاره پروتي يني مورد نظر زير هود در شرايط استريل از فيلتر μ0/22 عبور داده شد. كشت رده سلولي مناسب در اين تحقيق از سلول فيبروساركوماي انساني (1080 (HT استفاده شد. ابتدا اين سلولها در فلاسك كشت سلولي حاوي RPMI همراه با %5 Serum) FBS (Fetal Bovine پنيسيلين 100 Iu/ml و استرپتومايسين 100/ml كشت داده شدند.پس از تريپسينه كردن سلولها و جداسازي ا نها از كف پليت شمارش ا نها با لام ني وبار انجام شد و مقدار 10 3 2 سلول به ميزان lμ100 در هر چاهك پليت 96 خانهاي به مدت 24 ساعت در انكوباتور CO 2 دار در دماي 37 C انكوبه شدند و پس از 24 ساعت مايع رويي چاهكها خالي شده وتعويض محيط انجام شد و دوباره به ميزان 24 ساعت انكوبه شدند.سپس مقادير مختلف از فراكشنهاي ديواره سلولي μg/ml) 0) 10 50 100 به هر چاهك اضافه شد. دوباره پليت به مدت 24 ساعت در انكوباتور 37 C با %5 2 CO انكوبه شد (براي هر غلظت بهصورت تريپليكيت ا زمون انجام شد). يك سري از چاهكها به عنوان كنترل منفي در نظر گرفته شد كه فقط حاوي سلولهاي فيبروساركوما بدون تركيبات ديواره سلولي بوده است. پس از ا ن مايع رويي هر چاهك بهطور مجزا با سر سمپلر جمعا وري شده و از ا ن براي انجام تست زايموگرافي استفاده گرديد. ا زمون زايموگرافي به منظور بررسي ميزان ممانعت كنندگي فعاليت ا نزيم MMP2,9 (متالوپروتي ينازهاي) توليد شده از رده سلولي فيبروساركوماي انساني تركيباتهاي ديواره سلولي به عنوان يك تركيب موثر بهكار گرفته شد. ميزان 20 ميكروليتر از مايع رويي چاهكهاي سلولي حاوي فراكشنهاي ديواره سلولي در غلظتهاي مختلف
سال دهم شماره 2 تابستان 1391 شماره مسلسل 38 106 جهت بارگذاري نمونهها بر روي ژل %0/1 ژلاتين استفاده شد. الكتروفورز روي ژل پلي اكريل ا ميد محتوي ژلاتين در حضور سديم دو دسيل سولفات (SDS) انجام شد. كه مقاير اضافي ا ن با ششتشوهاي مكرر با محلول تريتون 100-X حذف گرديد و سپس ژل به مدت يك شبانه روز در بافر فعال كننده ژلاتيناز قرار گرفته و سپس با كوماسي بلو رنگ ا ميزي شد. پس از رنگ زدايي مناطق پروتي وليز شده به عنوان باندهاي روشن در زمينه ا بي قابل رويت بوده است و سپس ارزيابي كمي باندهاي ليز شده در مقايسه با چاهكهاي سلولهاي كه كنترل منفي بودند (سلولهايي كه با فراكشن تيمار نشدند) توسط سيستم ژل داكيومنتيشن صورت گرفت و ا ناليزهاي مربوطه انجام شد. ا زمون سايتوتوكسيسيتي MTT پس از 24 ساعت انكوباسيون با مقادير مشخصي از تركيبات ديواره سلولي كه در روش كار ذكر شد مايع رويي هر چاهك بهطور مجزا با سر سمپلر جمعا وري شده و از ا ن براي انجام تست MTT استفاده شد. بدين ترتيب كه مايع رويي هر چاهك با سر سمپلر جداگانه جمعا وري شده و دور ريخته ميشود سپس 10 ميكروليتر از نمك تترازوليوم (MTT) به هر چاهك اضافه گرديد دوباره پليت به مدت 4 ساعت انكوباسيون شد. پس از اين مدت زمان حدود 200 ميكروليتر محلول DMSO (دي متيل سولفوكسايد) به ا ن اضافه گرديد و جذب نوري (OD) چاهكها در طول موج 580 نانومتر توسط دستگاه الايزا ريدر قراي ت شد. اين تست جهت بررسي ميزان زنده بودن سلولهايي كه با يك ماده تا ثيرگذار تيمار شدهاند به كار گرفته ميشود در اين تست از ماده احيا كننده تترازوليم بلو استفاده ميشود به عنوان مثال هر چه ميزان زنده بودن سلولها پس از تيمار بيشتر باشد ميزان جذب نوري كه با دستگاه قراي ت ميشود بيشتر ميباشد زيرا ميزان رنگ ايجاد شده توسط سلولهاي زنده بيشتر خواهد بود. ا ناليز ا ماري: تمامي دادهها بر اساس mean±sd محاسبه شده است. وبرايتاييداختلافبينگروههايكنترلوگروهتست (سلولهاي تيمار شده با تركيبات ديواره سلولي) از تست one-way analysis of (ANOVA) variance استفاده شده است ود ر تمامي تستهاي انجام شده فقط 0/05>P معنيدار در نظر گرفته شده است. يافته ها نتايج حاصل از تهيه تركيبات پس از تخريب ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس پس از كشت سوش استاندارد كانديدا ا لبيكنس در محيط كشت GYEP وجمع ا وري كردن ا نها به منظور دستيابي به پروتي ين هاي ديواره سلولي عمل شكستن ديواره سلولي كانديدا در بافر ليز كننده انجامشد.نتايجشكستنديوارهسلولينشاندادكهحدود %90-95 مخمرهاي كانديدا ا لبيكنس دچار تخريب شدند. نتايج حاصل از الكتروفورز SDS-PAGE نتايج حاصل از شكستن ديواره سولي و الگوي پروتي يني بهدست ا مده از ا ن با روش SDS-PAGE در شكل 1-3 نشان داده شده است. در اين مطالعه از ماركرهاي پروتي يني الكتروفورز با وزن مولكولي wide استفاده شده است تا تمامي وزن هاي مولكولي ممكن را داشته باشد وزن هاي مولكولي ماركر از 14/4 كيلو دالتون تا 116 كيلو دالتون بوده است كه در رنگ ا ميزي به روش كوماسي برلينت بلو شكل 1- الكتروفورز حاصل از عصاره پروتي يني ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس M: ماركر پروتي يني با وزن مولكولي استاندارد :CPF تركيبات جدا شده از ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس كه داراي وزن هاي مولكولي مختلفي ميباشد و در كنار ماركر اوزان باند ها قابل تشخيص ميباشد زيرا ماركر داراي وزن مولكولي مشخص است كه پس از الكتروفورز باندهاي ا ن از هم جدا شده و شاخصي جهت تعيين وزن مولكولي تركيبي است كه اوزان ا ن برايمان مجهول مبياشد.
بررسي اثرات ضد توموري تركيبات ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس بر مهار توليد ا نزيم هاي... شهلا رودبار محمدي و همكاران 107 G250 باندهاي پروتي يني به ترتيب وزن مولكولي ظهور مييابند. الگوي الكتروفورزي حاصل از عصاره پروتي يني استخراج شده از ديواره سلولي در شكل 1 طيف وسيعي از باندهاي پروتي يني با وزن مولكولي متفاوت را نشان ميدهد. نتايج حاصل از تعيين غلظت پروتي يني به روش برادفورد در اين مطالعه از روش براد فورد براي سنجش ميزان پروتي ينهاي نمونه استفاده شده است. منحني استاندارد برادفورد در شكل 2 نشان داده شده است. پس از قراي ت دانسيتههاي مربوطه با دستگاه الايزا ريدر با طول موج 590 nm غلظت پروتي ين با استفاده از منحني استاندارد محاسبه گرديد. غلظت پروتي ين نمونه با اين روش 2 mg/ml بوده است. شكل 2 - منحني استاندارد BSA به روش برا دفورد BSA يك ا لبومين سرم گاوي ميباشد و به عنوان يك پروتي ين استاندارد جهت سنجش غلظت تركيبي كه حاوي پروتي ين ميباشد بكار گرفته ميشود همانطور كه در شكل مشخص ميباشد از غظتهاي مختلف اين پروتي ين استاندارد استفاده شده و هر يك از اين غلظتها داراي جذب نوري خاصي ميباشند و بدين ترتيب منحني استاندارد ترسيم ميشود و جذب نوري تركيب مجهول قراي ت شده ودر منحني استاندارد قرار ميگيرد و بدين ترتيب غلظت مجهول تعيين ميشود. بر روي نمونه انجام شد. در اين مطالعه با توجه به نتايج SDS-PAGE از 50Cut off KD استفاده نموديم. پروتي ين هايي با وزن مولكولي بيشتر از 50 KD در فاز بالايي لوله اولترافيلتر قرار گرفته و فاز پاييني كه محتوي پروتي ينهايي با وزن مولكولي كمتر از 50 KD بودند دور ريخته شدند. نتايج حاصل از الكتروفورز مجدد پس از انجام اولترافيلتراسيون به منظور تاييد حذف باندهاي اضافي و خالص سازي بيشتر نمونه پروتي يني دوباره الكتروفورز SDS-PAGE با همان شرايط قبل بر روي ژل %10 ا گاروز انجام گرفت. نتايج الكتروفورز نمونه بعد از اوالترافيلتر در شكل 3 نشان داده شده است. الگوي پروتي يني نمونه بعد از اولترافيلتراسيون نشان مي دهد كه تعدادي از باندهاي اضافي حذف شدند و ميزان خلوص نمونه افزايش پيدا كرده است. در اينجا بيشتر باندها داراي وزن مولكولي حدود 40-55 كيلودالتون ميباشند. شكل 3- الكتروفورز حاصل از عصاره پروتي يني ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس پس اولترافيلتراسيون نمونه سمت راست: ماركر پروتي يني با وزن مولكولي استاندارد ميباشد. نمونه سمت چب: تركيب پروتي يني ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس كه پس از اولترا فيلتر و حذف باند هاي اضافي ميزان خلوص افزابش يافته و داراي وزني در حدود 45 كيلو دالتون است نتايج حاصل از اولترافيلتراسيون تركيب حاوي پروتي ين ديواره سلولي پس از مشاهده الگوي پروتي يني با وزنهاي مولكولي مختلف در SDS-PAGE به منظور حذف باندهاي غيرضروري اولترافيلتراسيون نتايج حاصل از ا زمون L.A.L پسازانجامتستL.A.L درلولههايتستمحتويتركيبپروتي يني استخراج شده از ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس هيچ گونه انعقاد ژل و تغيير رنگي كه نشان دهنده وجود ليپو پلي ساكاريد باشد
سال دهم شماره 2 تابستان 1391 شماره مسلسل 38 108 ديده نشد. اين نتايج نشان مي دهد كه عصاره پروتي يني تخليص شده فاقد ليپو پلي ساكاريدبوده است. انجام اين تست سريع بوده و حساسيت ا ن نيز مطلوب است. نتايج ا زمون زايموگرافي زايموگرافي جهت تا ييد اثر مهاري تركيبات ديواره سلولي روي فعاليت ا نزيمهاي MMP2 و MMP9 در رده سلولي HT108 انجام شد. در نمودار 1 نشان داده شده كه فعاليت MMP2 به طور قابل ملاحظه اي در حضور سلول هاي تيمار شده با تركيبات ديواره سلولي و به مدت 24 ساعت كاهش يافته و با افزايش غلظت فراكشن هاي ديواره سلولي ميزان ا نزيم هاي متالو پروتي يناز كاهش يافته است كه اين امر كاملا وابسته به دوز بوده است. بيشترين كاهش ميزان ا نزيم مربوط به غلظت 100 ميكروگرم بوده است. نمودار 1 - اثر فراكشن هاي ديواره سلولي كانديدا بر مهار توليد ا نزيم هاي متالوپروتي يناز در زايموگرافي. با افزايش غلظت فراكشن ها ميزان توليد متالوپروتي ينازها كاهش يافته است. نتايج حاصل از ا زمون سايتوتوكسيسيتي MTT نتايج حاصل از اين تست در نمودار 2 براي هر كدام از غلظت هاي فراكشن هاي ديواره سلولي نشان داده شده است.با افزايش غلظت ها ميزان جذبنوري چاهك ها كاهش يافتهاست كهنشان دهنده كاهش فعاليت ا نزيم MMP مي باشد. نتايج حاصل از ا ناليز ا ماري نشان داد كه (0/05>P) بوده است و كاهش توليد ا نزيم هاي متالوپروتي يناز توسط سلولهاي فيبروساركوما معنيدار بوده است در غلظت 100μg/ml از تركيبات ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس 0/003= P بوده است. نمودار 2- اثر فراكشن هاي ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس در غلظت هاي) 0 μg/ml و 10 و 50 و 100 ) نشان داده شده است.با افزايش غلظت فراكشن ها ميزان زنده بودن سلولهاي توموري كاهش يافته است كه نشان دهنده كاهش ميزان ا نزيم متالوپروتي يناز بوده است. بحث دليل اصلي مرگ و مير مربوط به سرطان ها متاستاز ا نها مي باشد كه متاستاز در ارگان هاي مختلف يا در مناطق مختلف از همان ارگان رخ مي دهد. سلول هاي متاستاز دهنده از نظر بيولوژيكي هتروژن مي باشند و شامل: جمعيت هاي سلولي مختلف با عملكردهاي متنوع سرعت رشد متفاوت گيرنده هاي سطحي مختلف خواص ا نتيژنتيكيوايمونوژنيسيتيوپروفايلا نزيميمتفاوتازيكديگر ميباشند 9).(10 متالوپروتي ينازهاي ماتريكس (زمينه اي) جزء گروه اصلي ا نزيم ها مي باشند كه تركيبات ماتريكس سلولي را با استفاده از روي (به عنوان كوا نزيم) جهت فعاليت هايپروتي وليتكي تجزيه مي كنند.اين ا نزيم ها براي فرا يندهاي بيولوژيكي مختلف طبيعي از قبيل توسعه جنيني شكلزايي (مورفوژنز) و توليد بافتهاي جديد ضروري ميباشند. متالوپروتي ينازها نقش مهمي در فرا يندهاي پاتولوژيكي شامل: التهاب ا رتريت بيماري هاي قلبي عروقي بيماري هاي ريوي و سرطان ايفا مي كنند. بسته اختصاصيت سوبسترا و ساختار دوميني ا نها متالوپروتي ينازها به 4 زيرگروه عمده تقسيم بندي مي شوند. يكي از زيرگروهها شامل ژلاتيناز نوع IV و كلاژناژمي باشد كه سبب تخريب ژلاتين ميگردند. اين زيرگروهها MMP (متالوپروتي ينازها) شامل اعضاي مجزا بهعنوان ژلاتينازA (MMP2) و ژلاتينازB (MMP9) مي باشد. MMP2 و MMP9 در تومورزايي و متاستاز تومور نقش اصلي دارند. (در سال هاي اخير توجه ويژه اي در شناسايي مهاركننده هاي MMP صورت گرفتهاست. در تحقيقات مختلفي ذكر شده كه تعدادي از MMP داراي فعاليت هاي ضدني وپلازي مي باشند (11). تركيبات
بررسي اثرات ضد توموري تركيبات ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس بر مهار توليد ا نزيم هاي... شهلا رودبار محمدي و همكاران 109 ضدسرطاني موجود در كانديدا ا لبيكنس مربوط به بخش حاوي پلي ساكاريدها از جمله گلوكان ميباشد.از ا نجايي كه تركيبات ديواره سلولي كانديدا در اين مطالعه حاوي گلوكان بوده است ميتوان خاصيت ضد توموري ا ن را به گلوكان موجود در ديواره نسبت داد. بتا گلوكانها تركيبات پلي ساكاريدي طبيعي ميباشند. اين پليمرهاي گلوكزي در ديواره سلولي قارچها وجود دارد (از جمله در كانديدا ا لبيكنس ا سپرژيلوس فوميگاتوس و هم چنين ساكارومايسس سرويسيه). تركيبات اصلي ديواره سلولي قارچها پلي ساكاريدها و گليكوپروتي ينها ميباشد كه 70 در صد وزن خشك ا نها را شامل ميشود. براي مثال در كانديدا ا لبيكنس ديواره سلولي شامل سه تا هشت لايه است (لايه داخلي حاوي بتاگلوكان نامحلول 30 تا %35 لايه مياني حاوي بتاگلوكان محلول 20 تا %22 و لايه خارجي حاوي گليكوپروتي يني حدود %30 را شامل ميشود 12).(13 بتاگلوكانها داراي خواص تعديل كننده سيستم ايمني ميباشند. بيماراني كه مبتلا به عفونتهاي قارچي از قبيل كانديديازيس ا سپرژيلوزيس و غيره ميباشند در سرم خود داراي مقادير بالايي از بتاگلوكان ميباشند. به همين دليل فعالسازي ماكروفاژها و عمل فاگوسيتوزيس پاتوژنها و ميزان سايتوكاينهاي پيش التهابي در اين دسته از بيماران بالاتر ميباشد. بتاگلوكانها نقش اصلي خود را از طريق فعالسازي ماكروفاژها ايفا ميكنند. ماكروفاژ در دفاع سيستم ايمني اختصاصي و ذاتي نقش مهمي را ايفا ميكند. ماكروفاژ قادر به توليد و ترشح سايتوكاين التهابي از قبيل,IL-1 IL-2,IL-8,IL-6 و NO و همچنين عوامل ضد ميكروبي ا زقبيل نيتريك اكسايد INF-α پراكسيدهيدروژن ) 2 (H 2 O ميباشند.بنابراينفعالسازيماكروفاژها توسطبتاگلوكانسببافزايشعملكردسيستمايمنيميزبانميگردد (14 15). مطالعات متعددي (در حال حاضر بيش از 6000 مقاله) نشان دادند كه بتا 1 و 3 گلوكان هم فرم محلول و هم فرم ذرهاي (نامحلول) ا ن داراي خصوصيت تعديل كننده سيستم ايمني شامل خواص ضد باكتريال ضد توموري ميباشد (16). بتاگلوكانها همچنين داراي خواص ضد كارسينوژنيك ميباشد. سلولهاي كشنده طبيعي در دفاع عليه تومورها نقش مهمي را ايفا ميكنند. از ا نجاييكهبتاگلوكانهاميتوانندسببفعالسازيسلولهايكشنده طبيعي شوند قادر به مهار رشد تومور در مراحل مختلف ميباشند. بتاگلوكان را ميتوان به عنوان ادجوانت در راديوتراپي بيماراني كه تحت شيمي درماني بيماريهاي خوني و ساير بدخيميها هستند بكار برد. در سرطانها گلوگان بهعنوان مكمل به منظور كاهش اثرات جانبي در طول شيمي درماني يا راديوتراپي جهت به حداقل رسانيدن متاستازو جلوگيري از عود بيماري ميتواند كاربرد داشته باشد.گلوكان با مهار سنتز DNA در سلولهاي سرطاني تخريب ا نزيمهاي مو ثر در فعاليت سلولهاي توموري افزايش عملكرد ماكروفاژهاوتنظيمفعاليتلنفوسيتB وT قادراستسرعتانتشار و متاستاز سلولهاي سرطاني را كاهش دهد (18 17). همچنين گلوكان قادر به فعال سازي سلولهاي NK (كشنده طبيعي) در موشهاي مبتلا به سرطان نيز ميباشد (19). امروزه بر پايه اثرات ايمونومديلاتورها اين تركيبات بهعنوان چهارمين روش در درمان سرطان مطرح هستند. در اين تحقيق نتايج تاثير تركيبات ديواره سلولي با غلظتهايμg/ml (100 0) 1 10 50 بر روي سلولهاي فيبرو ساركوما نشان داد كه اين فراكشن در تمامي غلظتهاي گلوكان قادر به مهار رشد سلولهاي سرطاني فيبروساركوما بوده است كه در غلظت 100μg/ml در تست MTT بيشترين مهار رشد سلولهاي سرطاني را موجب شد, (0/05>P) از ا نجاييكه ميزان (0/05>P) بوده است بنا بر اين مها رشد سلولها كه با روش تعيين ميزان سايتوتوكسيسيته سلولها سنجيده شد معنا دار بوده است و با نتايج زايموگرافي همخواني داشته است. كاهش در ا نزيمهاي مو ثر در فعاليت سلولهاي توموري نويد كاهش سرعت در انتشار و گسترش متاستاز سلولهاي سرطاني و كاهش و يا متوقف ساختن رشد ا نها ميباشد. باتوجهبهيافتههاياينتحقيقكهمشخصگرديداينتركيباتجدا شده از ديواره سلولي كانديدا ا لبيكنس قادر به مهار رشد سلولهاي فيبرو ساركوما و همچنين مهار توليد ا نزيمهاي متالوپروتي يناز ميباشند و همچنين ساير مطالعات انجام شده در رابطه با خواص ايمنوايستمولاتوري اين تركيبات پليساكاريدي ميتوان اين پليساكاريد را بهعنوان يك مكمل غذايي و يا دارو جهت درمان و يا كنترل كننده سلولهاي سرطان معرفي نمود.
سال دهم شماره 2 تابستان 1391 شماره مسلسل 38 References 110 1- Moradali MF, Mostafavi H, Ghods S, Hedjaroude GA. Immunomodulating and anticancer agents in the realm of macromycetes fungi (macrofungi). Int Immunopharmacol 2007; 7(6): 701-24. 2- Sarangi I, Ghosh D, Bhutia SK, Mallick SK, Maiti TK. Antitumor and immunomodulating effects of Pleurotus ostreatus mycelia-derived proteoglycans. Int Immunopharmacol 2006; 6(8): 1287-97. 3- Yoon TJ, Kim TJ, Lee H, Shin KS, Yun YP, Moon WK, et al. Anti-tumor metastatic activity of [beta]-glucan purified from mutated Saccharomyces cerevisiae. Int Immunopharmacol 2008; 8(1): 36-42. 4- Shahverdi AR, Saadat F, Khorramizadeh MR, Iranshahi M, Khoshayand MR. Two matrix metalloproteinases inhibitors from Ferula persica var. persica. Phytomedicine 2006; 13(9-10): 712-7. 5- Van Doren SR, Kurochkin AV, Hu W, Ye QZ, Johnson LL, Hupe DJ, et al. Solution structure of the catalytic domain of human stromelysin complexed with a hydrophobic inhibitor. Protein Sci 1995; 4(12): 2487-98. eng 6- Chen J, Seviour R. Medicinal importance of fungal [beta]- (1--> 3),(1--> 6)-glucans. Mycol Res 2007; 111(6): 635-52. 7- Mantovani MS, Bellini MF, Angeli JP, Oliveira RJ, Silva AF, Ribeiro LR. beta-glucans in promoting health: prevention against mutation and cancer. Mutat Res 2008; 658(3): 154-61. 8- Slamenova D, Labaj J, Krizkova L, Kogan G, Sandula J, Bresgen N, et al. Protective effects of fungal (1-->3)-beta- D-glucan derivatives against oxidative DNA lesions in V79 hamster lung cells. Cancer lett 2003; 198(2): 153-60. 9- Wang T, Zhang Y, Wang Y, Pei YH. Anti-tumor effects of Rubratoxin B on cell toxicity, inhibition of cell proliferation, cytotoxic activity and matrix metalloproteinase-2,9. Toxicol In Vitro 2007; 21(4): 646-50. eng 10- Fidler IJ, Kim SJ, Langley RR. The role of the organ microenvironment in the biology and therapy of cancer metastasis. J Cell Biochem 2007; 101(4): 927-36. eng 11- Mannello F, Gazzanelli G. Tissue inhibitors of metalloproteinases and programmed cell death: conundrums, controversies and potential implications. Apoptosis : an international journal on programmed cell death 2001; 6(6): 479-82. 12- Tokunaka K, Ohno N, Adachi Y, Miura NN, Yadomae T. Application of Candida solubilized cell wall beta-glucan in antitumor immunotherapy against P815 mastocytoma in mice. Int Immunopharmacol 2002; 2(1): 59-67. 13- Tokunaka K, Ohno N, Adachi Y, Tanaka S, Tamura H, Yadomae T. Immunopharmacological and immunotoxicological activities of a water-soluble (1-->3)-beta-Dglucan, CSBG from Candida spp. International journal of immunopharmacology 2000; 22(5): 383-94. 14- Lavigne LM, Albina JE, Reichner JS. Beta-glucan is a fungal determinant for adhesion-dependent human neutrophil functions. J Immunol 2006; 177(12): 8667-75. 15- Kim GY, Choi GS, Lee SH, Park YM. Acidic polysaccharide isolated from Phellinus linteus enhances through the upregulation of nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha from peritoneal macrophages. J Ethnopharmacol 2004; 95(1): 69-76. 16- Novak M, Vetvicka V. Beta-glucans, history, and the present: immunomodulatory aspects and mechanisms of action. J Immunotoxicol 2008; 5(1): 47-57. 17- Berdal M, Appelbom HI, Eikrem JH, Lund A, Zykova S, Busund LT, et al. Aminated beta-1,3-d-glucan improves wound healing in diabetic db/db mice. Wound Repair Regen 2007; 15(6): 825-32. 18- Smith JE, Rowan N, Sullivan R. Medicinal mushrooms: their therapeutic properties and current medical usage with special emphasis on cancer treatmentstrans]. Cancer Research UK; 2002. 19- Sliva D, Labarrere C, Slivova V, Sedlak M, Lloyd FP, Ho NWY. Ganoderma lucidum suppresses motility of highly invasive breast and prostate cancer cells. Biochem Biophys Res Commun 2002; 298(4): 603-12. 20- Casanova M, Chaffin WLJ. Cell wall glycoproteins of Candida albicans as released by different methods. J Gen Microbiol 1991; 137(5): 1045.
15 J Army Univ Med Sci. 2012 June; 10 (2) : 103-110 Evaluation of Anti tumor activity of Candida albicans Cell wall fraction on human Fibrosarcoma cell in vitro Abstract *Roudbar Mohammadi Sh 1 ; PhD, Roudbari M 2 ; PhD, Vahidi M 3 ; MSc Mohammad Hassan Z 4 ; PhD, Darabi N 5 ; PhD Received: 27 Nov 2011 Accepted: 11 Apr 2012 Background: Matrix metalloproteinases (MMPs) plays a role in the several physiologic and pathologic events. There is some evidence indicating the involvement of MMPs in tumor invasion and inflammatory diseases. In this study we evaluated the effect of cell wall candida albicans fraction on MMP production by the fibrosarcoma cell line using an in vitro cytotoxicity assay, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide, and gelatin zymography. Material and Methods: It was an experimental study. Fraction of cell wall candida albicans was extracted by lysis buffer and) 0, 10, 50, 100 (μg/ml from fraction was added to human fibrosarcoma cell line in 96 well microplate and inhibitory effect on tumor cell invasion was investigated by MTT and zymography test. Result: Our results showed that fraction of cell wall candida albicans was found to exhibit a inhibitory effect on tumor cell line in MTT test because the viability of tumor cells was decreased versus the control groups. Also the production of metalloproteinases enzyme in presence of fraction was diminished significantly) P<0.05). Conclusions: Since inhibition of MMP activity has been employed in modality therapy in diseases such as cancer, this fraction could be promised in the preparation of anti-mmp therapeutic derivatives. Keywords: Cell wall fraction, Metalloproteinase Enzyme, MTT, Zymography test, Candida albicans. 1- (*Corresponding Author) Associated Professor, Mycology Department, Faculty of Medicine, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran. Tel: +9821 82883572 E-Mail: Sh.mohammadi@modares.ac.ir 2- PhD Student, Mycology Department, Faculty of Medicine, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran. 3- Instructor, Faculty of Paramedicines, AjA University of Medical Sciences, Tehran, Iran. 4- Professor, Immunology Department, Faculty of Medicines, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran. 5- PhD Student, Mycology Department, Faculty of Medicines, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran.