بررسی تأثیر تشدید بیان ژن توکوفرول سیکالز در تحمل به تنش خشکی در توتون چکیده

علم گیاهان زراعی ایران درة 6 شمارة 3 پاییز 336 )ص 63-6( بررسی تأثیر تشدید بیان ژن تکفرل سیکالز در تحمل به تنش خشکی در تتن (Nicotiana tabacum) 3 *2 1 ناهید رعنائیان علیرضا عباسی حسن زینالی خانقاه 2 1 3. دانشجی کارشناسی ارشد استادیار دانشیار پردیس کشارزی منابع طبیعی دانشگاه تهران کرج )تاریخ دریافت: - 1333//1 تاریخ تصیب: 133/3/22( چکیده تنشهای محیطی دامنة گستردهای از پاسخهای گیاهی مانند تغییر در بیان ژن تا تغییرپذیریها در سختساز )متابلیسم( درنیاختهای رشد را راهاندازی میکنند. اکنشهای گیاهی مختلفی برای ریاریی با اثرگذاریهای زیانبار بالقة ایجادشده تسط نر خشکی شری عفنت ناشی 1 از بیمارگر تنشهای دیگر جد دارد. آلفا تکفرل ترکیب عمدة است که در E یتامین کلرپالست برگ یافت میشد. این ضداکسنده )آنتیاکسیدان( گنههای فعال اکسیژن مشتقشده از نرساخت )فتسنتز( را غیرفعال کرده از انتشار پراکسیداسین چربی )لیپید( تسط پاکسازی رادیکالهای پرکسیل در چربی غشاهای تیالکئید جلگیری میکند. در این تحقیق گیاهان تتن دارای سازة ژنی pbin: At.TC که در آنها ژن تکفرل سیکالز )یکی از ژنهای کلیدی مسیر ساخت یتامین 2 که تبدیل E 2 تکفرل کاتالیز میکند( تشدید بیان یافته بد 3 -دی متیل- 5 -فیتیل- 1 استفاده -بنزکئینن را به گاما- شدند. به منظر بررسی اثر ژن منتقلشدة گیاهان تراریخت )تراژن( حاصل تحت تنش خشکی قرار گرفتند یژگیهای فیزیلژیک محتای مانند سبزینه )کلرفیل(ها کارتنئید محتای آمیناسید پرلین میزان نفذپذیری نسبی غشا محتای آب نسبی گیاه در گیاهان تراریخت شاهد بررسی تجزیه تحلیل شد. نتایج نشان داد که گیاهان تراریخت محتای سبزینه پرلین آب نسبی باالتر 62 همچنین میزان نشت ینی کمتری در سطح تنشی 2 درصد در مقایسه با گیاهان شاهد داشتند. بهطرکلی تشدید بیان ژن تکفرل سیکالز در گیاه تتن بهاحتمال مجب افزایش مقامت آن در شرایط تنش خشکی میشد. اژههای کلیدی: پراکسیداسین چربی تکفرل سیکالز تنش خشکی ضداکسنده گنههای فعال اکسیژن. E-mail: rezabbasi@ut.ac.ir 1. α-tocopherol 2. 2,3-dimethyl-5-phytyl-1,-benzoquinone (DMPBQ) * تلفن: 1362113 مقدمه تکفرلها تنها در غشاهای تیالکئیدها یا پالستیدها مکانیابی میشند زیستساخت )بیسنتز(شان تنها در گیاهان جلبکها بعضی از سیانباکتریها مشاهده شده است 2005).(Munne-bosch, این تزیع نشان میدهد که این مسیر در سیانباکتریها برای حفاظت این مجد )ارگانیسم(ها از گنههای فعال اکسیژن مشتقشده از طریق نرساخت )فتسنتز(

علم گیاهان زراعی ایران درة 6 شمارة 3 پاییز 336 66 هب) تکامل یافته است.)Munne-bosch, 2005 همچنین ( درمرد فرایندهای زیستشناختی نری )فتبیلژیکی( به عنان مثال نرساخت باید گفت که انجام این فرایندها در اقع بدن سرپش اطمینانی که بتاند انرژی برانگیختة اضافی را در یک راه بیزیان پراکنده کند امکانپذیر نخاهد بد. بنابراین در طبیعت نرساخت بهطر پیسته در یک انتقال متازن بین به دام انداختن کارآمد انرژی خرشیدی پراکندگی سریع آن زمانی که بیش از نیاز گیاه باشد عمل میکند )مکانیسم(های )2005.)Munne-bosch, گیاهان سازکار تکاملیافتة پرشماری را برای پراکندگی انرژی اضافی در کلرپالستها دارند که شامل غیرفعالسازی گرمایی القاشده تسط اسیدی شدن لمن در غشاهای تیالکئید چرخة زانتفیل چرخة انتقال الکترن تلید پاکسازی بعدی گنههای فعال اکسیژن )ROS( تنفس نری تغییرپذیریهای )متابلیکی( است دیگر در ( فعالیت سختسازی Demmig-Adams & Adams,.)1996; Osmond et al., 1997; Asada, 1999 تکفرل در تعامل با دیگر )آنتیاکسیدان(ها نقشی را در کاهش سطح طر عمده آلفا ضداکسنده ROSها O 2 )OH در غشاهای نرساخت عمل میکند میزان پراکسیداسین چربی )لیپید(ها را با کاهش رادیکالهای پرکسیل هیدرپراکسیدهای متناظر محدد میکند ( به چربی Havaux.et al., 2005; Maeda et al., 2005; Trebst et al., 2002(. آلفا تکفرل میتاند دفع فیزیکی بنابراین غیرفعالسازی O 2 در کلرپالستها را انجام دهد. برآرد شده است که یک ملکل آلفا تکفرل پیش از تخریب میتاند بیش از ملکل 1 را با O 2 انتقال انرژی تشدیدیافته )رزنانس( غیرفعال کند.)Fahrenholzt et al., 197( تکفرل به میتاند رادیکالهای پرکسیل پاکسازی شیمیایی افزن بر این صرت شیمیایی چربی O 2 O 2 آلفا را پاکسازی کند. با آلفاتکفرل بهطر 3 تغییرناپذیری به تشکیل اپکسیدها 6 کئینن ها ی آنها منجر میشد درحالیکه پاکسازی رادیکالهای 5 پرکسیل چربی به تشکیل رادیکالهای تکفرکسیل منجر میشد که میتاند دباره با آلفاتکفرل تبدیل شد ( آسکربات به Munne -Bosch &.)Alegre, 2002a بنابراین آلفاتکفرل در نگهداری یک حالت اکسایش-احیای )Redox( مناسب در کلرپالستها شرکت کرده همینطر در نگهداری ساختار عملکرد تسعة میکند گیاه در غشای تیالکئید در طل رشد پاسخهای گیاه به تنشها شرکت Munne -Bosch & Alegre, 2002a; Sattler (.)et al., 200 تکفرل سیکالز جهشیافته در ذرت به تجمع کربهیدرات آنتسیانین پینه )کالس( همچنین به تغییرپذیریهای پالسمدسماتا بین bundle sheath فراساختمانی یاختههای پارانشیم آندی در شرایط رشد بدن تنش منجر شد 1996( al.,.)russin et خامشی تکفرل سیکالز در گیاهان سیبزمینی همچنین منجر به تجمع تغییرپذیریهای bundle sheath.)hofius et al., 200( vte1 پینه فراساختمانی پالسمدسماتا بین یاختههای پارانشیم آندی شد در سال 11 گزارش شد که جهش )متانت(های علف تال )آرابیدپسیس( کربهیدرات را در شرایط دمای پایین تجمع میدهند.)Maeda et al., 2006( در سال 1 ژن osvte1 که یک راستنسخة )ارتلگ( تکفرل سیکالز در برنج را کد میکند جداسازی تعیین یژگی شد osvte1.)ouyang et al., 2010( بهطر قابل تجهی با تنشهای غیرزیستی مانند نمک باال H 2 O 2 خشکی سرما هرمنهای آبسیزیک اسید سالیسیلیک اسید گیاهی القا میشد Ouyang et al., (.)2010 تراژن در مقایسه با گیاهان شاهد گیاهان تراریخت یا )RNAiosVTE1) که در آنها ژن یادشده خامش شده بد بیشتر به تنش شری حساس بدند درحالیکه تشدید بیان osvte1 بیشتری را به تنش شری ایجاد کرد در گیاهان تراریخت تحمل Ouyang et al., ( 3. Epoxides. Quinones 5. Tocopheroxyl 6. Plasmodesmata 1. Lumen 2. Reactive oxygen species

65 رعنائیان همکاران: بررسی تأثیر تشدید بیان ژن تکفرل سیکالز در تحمل به....)2010 در سال 11 یک بررسی ری تأثیر α -تکفرل بر پیامرسانی درنیاختهای با تغییر سطح اسید جاسمنیک 2006(. در این بررسی انجام شد Munne-Bosch et al., ( جهشیافتههای با نقص vte1 تلید تکفرل سطح تکفرل پایینتر کاهش رشد افزایش تجمع آنتسیانین را در مقایسه با گنة حشی نشان دادند اسید سطح.)Munne-Bosch et al., 2006( همچنین جاسمنیک در گیاه تغییر کرده بد. نتیجه به تأثیرگذاریهای بالقة در تکفرلها ری پیامرسانی درنیاختهای تأثیر احتمالی بر رشد گیاه تجمع آنتسیانین پی برده شد Munne-Bosch et al., (.)2006 ماد رشها در این تحقیق از گیاهان تراریخت تتن Nicotiana ( )tabacum دارای ناحیة کدکنندة ژن تکفرلسیکالز آرابیدپسیس NM11930) (accession no. که تحت کنترل عممی راهانداز CaMV-35S خاتمهدهندة OCS در ناقل بد گیاه از آگرباکتریم )سیة پس از تأیید تراریختی استفاده شد. برای انتقال ژن به )LBA0 به کمک آزمنهای استفاده شد. PCR RT-PCR همچنین کشت بذرهای نسل ال ( 1 T( ری محیط دارای کانامایسین مشاهدة مقامت نمنههای تراریخت سبز ماندن آنها ری این محیط )رعنائیان )33 بذرهای این گیاهان مادری تراریخت به نسل بعد ( 2 T( در بستر نگهدارندة خاک برده شد تا بررسیهای فیزیلژیکی در شرایط تنش خشکی ری آنها انجام گیرد. این بررسیها برای د رگة )الین( تراریخت شاهد از هر کدام سه تکرار )سه گیاه در سه گلدان جداگانه( در چهار سطح 1 3 21 1 61 درصد ظرفیت زراعی مزرعه )FC( در مجمع 6 نمنه انجام شد. تنش خشکی در مرحلة هشتبرگی گیاهان بر آنها اعمال شد مدت اعمال تنش هم ده رز بد. ارزیابی ری یژگیهای فیزیلژیکی شامل محتای سبزینه )کلرفیل(ها کارتنئید محتای آمیناسید پرلین میزان نفذپذیری نسبی غشا محتای آب نسبی گیاه با استفاده از رابطههای زیر انجام گرفت. همچنین برای اندازهگیری این یژگیها از بافت برگ استفاده شد. رش اندازهگیری محتای نسبی آب برگ 6 )RWC( به (1990) Ritchie et al. رابطة زیر محاسبه شد: انجام گرفت سپس از RWC = [FW- DW / SW DW] 100 5 : زن تر FW : DW زن خشک : 1 SW زن اشباع همچنین محتای پرلین با استفاده از رش Bates (1973) et al. با کمی تغییر )استفاده از سانتریفیژ به جای استفاده از قیف شیشهای کاغذ صافی به منظر صاف کردن نمنهها( اندازهگیری شد با استفاده از رابطة زیر محتای اقعی آن محاسبه شد: (g) = زن تر / (μm) (ml)( / 5/5 (μg/μm)[ اندازهگیری کارتنئیدها به رش تلئن (ml/μg) / 5 )g( نمنه میزان سبزینة سبزینة a پرلین پرلین([ b (1967) Arnon سپس با استفاده از رابطة زیر محاسبه شد: رت گرفت = سبزینة A )3/3 A3 1/2 A65( = سبزینة B )3/3 A65 3/ A3( V / V / 11 11 = کارتنئیدها 11 )A611( -3/1 (mg chl. a)-16 (mg chl. b)/1 W W =V حجم محلل صافشده سانتریفیژ( )محلل A= جذب نر در طلمجهای 65 3 =W زن تر نمنه بر حسب گرم از ناشی باالیی 611 نانمتر. Relative water content 5. Fresh weight 6. Dry weight 7. Saturation weight 1. Promoter 2.Terminator 3. Field capacity

علم گیاهان زراعی ایران درة 6 شمارة 3 پاییز 336 6 اندازهگیری نفذپذیری نسبی غشا )EL( به رش (1992) Zhao et al. انجام شد سپس از رابطة زیر به منظر محاسبة آن استفاده شد: قابلیت هدایت الکتریکی پس از جذب آب 11 تسط نمنه EL: (EC1) قابلیت هدایت الکتریکی پس از گرما دیدن نمنه الف( (EC2) B رش سنجش آماری دادهها به منظر تجزیه تحلیل دادهها رسم نمدارها در این تحقیق از نرمافزارهای Excel SAS 9.2 استفاده شد. همچنین به منظر مقایسة میانگینها از آزمن LSD در سطح 5 درصد استفاده کردیم. نتایج بحث سنجش سبزینه کارتنئیدها در گیاهان تراریخت شاهد در شرایط تنش خشکی در فرایند نرساخت ملکلهای زیانبار بالقة چندی تلید میشند که گنههای فعال اکسیژن نامیده میشند. برای حفاظت دستگاه نرساختی در برابر آسیب اکسایشی نری )فتاکسیداتی( یتامین )بهیژه E آلفاتکفرل( میتاند خامشی فیزیکی یا پاکسازی شیمیایی اکسیژن ملکلی منفرد که در فرایند نرساخت تلید میشد را انجام دهد Foote et al., (.)197 به منظر بررسی تأثیر تشدید بیان ژن در TC گیاهان تراریخت بر حفاظت دستگاه نرساختی محتای سبزینهها کارتنئید در شرایط متفات تنش غیرتنش در گیاهان تراریخت شاهد اندازهگیری شد که نتایج آن در شکل نشان داده شده است. اختالف همانطر که محتای - در شکل معنیداری بین رگة تراریخت در A سبزینة الف مشخص است ظرفیت زراعی مزرعه شاهد در 11( درصد( نیست. در سطح 21 درصد اختالف بین رگة تراریخت شاهد مشاهده میشد لی معنیدار نیست. تنها در سطح تنش 1 درصد شده است. در این سطح اختالف این د معنیدار تنش محتای سبزینة رگة تراریخت بیشتر از شاهد است که ممکن است به دلیل افزایش میزان تکفرل در گیاهان تراریخت باشد. ب( ج( د( شکل. الف( نمدار میزان سبزینة A در گیاهان تراریخت شاهد در سه سطح تنش )21 1 61 درصد( یک سطح بدن تنش )11 درصد(. ب( نمدار میزان سبزینة در گیاهان تراریخت شاهد در سه سطح تنش )21 1 61 درصد( یک سطح بدن تنش )11 درصد(. ج( مجمع سبزینههای A+B در گیاهان تراریخت شاهد در سه سطح تنش )21 1 61 درصد( یک سطح بدن تنش )11 درصد(. د( میزان کارتنئید در گیاهان تراریخت شاهد در سه سطح تنش )21 1 61 درصد( یک سطح بدن تنش )11(. )wild type( شاهد :w )Transgenic( تراریخت :T

61 رعنائیان همکاران: بررسی تأثیر تشدید بیان ژن تکفرل سیکالز در تحمل به... این مضع بهاحتمال به دلیل نقش ضداکسندگی آن دفع گنههای فعال اکسیژن جلگیری از آسیب به دستگاه نرساختی باعث ایجاد آسیب کمتر در رگة تراریخت نسبت به شاهد باشد Havaux et al., 2005; ( al., 2002.)Maeda et al., 2005; Trebst et در مرد شکل - ب اختالفی بین رگة تراریخت شاهد در محتای سبزینة B در ظرفیت زراعی مزرعه )11 درصد( نیست اما در سطح 21 1 درصد اختالف معنیداری جد دارد همانطر که مشخص شده با افزایش فشار تنش میزان سبزینة B در هر د رگة شاهد تراریخت کاهش یافته است. این کاهش در رگة تراریخت کمتر است بدین معنی که آسیب اردشده به سبزینة B در آنها کمتر است که ممکن است به دلیل گفتهشده برای سبزینة A باشد. مجمع B A سبزینة نیز در ظرفیت زراعی مزرعه )11 درصد( تفاتی بین رگة شاهد تراریخت نشان نمیدهد. در سطح 21 درصد گرچه بین شاهد تراریخت تفات جد دارد لی معنیدار نیست. در سطح 1 درصد اختالف معنیداری بین این د مشاهده میشد که افزایش میزان آن در رگة تراریخت نسبت به شاهد مشهد است. در تحقیق انجامگرفته در سال 111 همچنین مشخص شد که در شرایط تنش خشکی در گیاهان علف تالی که HPT در آنها خامش شده بد HPT( یکی دیگر از آنزیمهای کلیدی در مسیر ساخت یتامین E است( سطح سبزینهها در گیاهان تراریخت نسبت به شاهد کمتر است. در اقع مشاهده شد که در نبد یتامین بهعنان E ضداکسنده در شرایط تنش تخریب سبزینهها بیشتر صرت خاهد گرفت که با نتایج بهدستآمده در این تحقیق همخانی دارد )2007 al.,.)abbasi et در شکل - ج میزان کارتنئید بین رگة شاهد تراریخت در سطح بدن تنش اختالف اندکی را نشان میدهد که معنیدار نیست اما در دیگر سطح اختالف معنیدار است در رگة شاهد بیشتر از تراریخت است که بهاحتمال به دلیل همبستگی منفی بین ضداکسندههاست که با افزایش یکی دیگری کاهش مییابد در رگة تراریخت مرد نظر به دلیل افزایش در تکفرلها میزان کارتنئیدها کاهش یافته است.)Munne-bosch, 2005( در رگة شاهد در آغاز یک افزایش جد داشته )تا سطح تنش 1 درصد( که ممکن است به دلیل نقش ضداکسندگی کارتنئید )Trebst et al., 2002; Trebst, 2003( باشد. گیاهان شاهد میزان آن را تا سطح تنش 1 درصد باال بردهاند اما در سطح تنش 61 درصد به دلیل سنگین بدن تنش ممکن است به کارتنئیدها هم آسیب ارد شده باشد که میزان آن کاهش یافته است. در گیاهان تراریخت میزان کارتنئید یک رند کاهشی را نشان داد که ممکن است به دلیل افزایش میزان ضداکسندة تکفرل در گیاهان تراریخت بده باعث کاهش ساخت ضداکسندههای دیگر مانند کارتنئیدها شد.)Munne-bosch, 2005( در بعضی بررسیها مانند پژهش درحالیکه Abbasi et al. (2007) خامشی ژن دیده شد که میزان کارتنئیدها در حالتهای HPT در شرایط تنش خشکی هم رند کاهشی را نشان داد. مقایسة RWC در گیاهان تراریخت نسبت به شاهد در شرایط تنش برای اندازهگیری میزان آب گیاه میتان از پتانسیل آب گیاه ( w Ψ( محتای آب نسبی )RWC( استفاده کرد. میزان سرعت کاهش محتای آب نسبی در شرایط تنش در ارقام مختلف متفات است. در بسیاری از آزمایشها در شرایط تنش خشکی ارقام مقام نسبت به تنش خشکی دارای محتای آب نسبی باالتری بدند.)Chandrasekar et al., 2000( همانطرکه در شکل 3- ج نشان داده شده است محتای آب نسبی در شرایط بدن تنش )11 درصد( در هر د گیاه تراریخت شاهد یکسان بده اختالفی ندارند. در سطح تنش 21 درصد اختالف مشاهده میشد لی معنیدار نیست. لی در سطح تنش 1 61 درصد اختالف معنیداری بین شاهد تراریخت مشاهده میشد. در هر د سطح تنش 1 61 درصد کاهش محتای آب نسبی گیاه در رگة تراریخت کمتر است. به عبارتی محتای آب نسبی در شرایط تنش در گیاه تراریخت بیشتر از شاهد است. این احتمال جد دارد که به دلیل

علم گیاهان زراعی ایران درة 6 شمارة 3 پاییز 336 62 همبستگی مثبت تکفرلها با هرمنهای تنش مانند اسید آبسیزیک اسید سالیسیلیک اسید جاسمنیک با افزایش میزان تکفرلها اثرگذاری آن ری میزان اسید آبسیزیک مجب بسته شدن بیشتر رزنهها در گیاهان تراریخت میشد Munne-(.)bosch, 2005 سنجش پرلین در گیاهان تراریخت در شرایط تنش خشکی پرلین بهعنان یکی از مهمترین اسملیتها پتانسیل اسمزی مطلبی را بین یاخته محیط اطراف آن حفظ میکند.)Pollard & Wn Jones, 1979( افزن بر تنظیم اسمزی گیاهان در شرایط تنش نقشهای پیشنهادی دیگری برای پرلین از جمله حذف رادیکالهای هیدرکسیل پایداری غشا ساختار پرتئینها به عنان منبعی برای کربن نیترژن برای ترمیم تنش تعدیل پتانسیل اکسایش احیای یاخته در شرایط تنش گزارش شده است ( Smirnoff &.)Cumbes, 1989; Ashraf & Foolad, 2007 همانطرکه در شکل 3- الف نشان داده شده است بین رگة شاهد تراریخت در شرایط بدن تنش ) 11 درصد( اختالفی جد ندارد. در سطح 21 درصد بهرغم اختالف بین این د این اختالف معنیدار نیست. اختالف بین رگة شاهد تراریخت از نظر محتای پرلین در سطح 1 61 درصد معنیدار است با افزایش فشار تنش میزان آن در هر د رگه افزایش مییابد )61 درصد بیشتر از 1 درصد( که این افزایش در رگة تراریخت بیشتر است. این افزایش بیشتر رگة تراریخت نسبت به شاهد ممکن است به دلیل تأثیر احتمالی تکفرل بر اسید آبسیزیک بسته شدن رزنهها باشد )2005.)Munne-Bosch, همچنانکه در بررسی نتایج شاخص شد میزان RWC CO 2 مشخص ردی به گیاه در شرایط تنش با بسته شدن رزنهها کاهش یافته در نتیجه میزان ATP NADPH تلیدی چرخة انتقال الکترن برای اینکه در مسیر تلید رادیکال دادن الکترن به اکسیژن ملکلی قرار نگیرند ارد مسیر تلید پرلین میشد ( kishor Delauney & Verma, 1993; Kavi al., 2005.)et به همین دلیل محتای پرلین رگة تراریخت بیش از شاهد است. همچنین گزارش شده است که اسملیتهای آلی مانند پرلین گالیسین بتائین 3-6 درصد در ایجاد پتانسیل اسمزی نقش دارند درحالیکه نقش ینهای غیرآلی 5-31 درصد بد پرلین به عنان یکی از مهمترین اسملیتهای الیه در تلید پتانسیل اسمزی به تنهایی 61-1 درصد پتانسیل اسمزی را نسبت به دیگر ترکیبات آلی تأمین میکند.)Lee et al., 2007, 2008( گنههای فعال اکسیژن که مجب از دست رفتن ساختار غشا مرگ یاختهای میشند تسط اسملیتهای آلی )اسمپرتکتانت( از بین میرند ( Bohnert &.)Jensen, 1996 افزایش تحمل به تنش خشکی در گیاهان تراریخت با تجمع باالی مانیتل ( Shen et al., 2003 )al., 1997; Abebe et گلیسین بتائین Zhu et al., Kereps & 2000) al., (Holmstrom et پرلین ( )1998 )Galiba, 2002 کربهیدراتهای محلل ( گزارش شده است. بررسیهای ژنتیکی نشان میدهد که ژنهای درگیر در زیستساخت حفاظتکنندههای اسمزی در شرایط تنشهای خشکی شری بهطر افزایشی تنظیم شده ( Xiong al., 2001 )et مجب افزایش تحمل به تنش در گیاهان نیز میشند ( Bohnert et al., 1995; Zhu,.)2001 با کنترل محتای هیدرپراکسی در کلرپالستها تکفرلها ممکن است بهطر مستقیم سطح هرمن گیاهی درنی مانند اسید جاسمنیک در برگها را تنظیم کنند بهاحتمال تأثیرش بر اسید جاسمنیک از طریق بیان ژن مربط به آن است )2005.)Munne-Bosch, بنابراین به یقیق پیامرسانی یاختهای در گیاهان را تحت تأثیر قرار میدهد. از آنجاییکه تکفرلها در انتقال پیام در شرایط تنش با تنظیم هرمنهای تنش مانند اسید جاسمنیک نقش دارند در نتیجه انتقال ژن TC در نتیجه افزایش ضداکسنده در پی آن افزایش اسید جاسمنیک ممکن است در زمینة پیامرسانی برای افزایش تجمع اسملیتهای آلی مانند پرلین مؤثر باشد مجب افزایش تجمع پرلین شد Munne-(.)Bosch et al., 2007

63 رعنائیان همکاران: بررسی تأثیر تشدید بیان ژن تکفرل سیکالز در تحمل به... پرلین الف( ب( ج( د( شکل 3. الف( آزمن PCR به منظر تأیید تراریختی گیاهان با استفاده از DNA ژنگانی )ژنمی( چاهک. محصل PCR گیاه تراریخت. چاهک. محصل PCR کلنی آگرباکتریم نترکیب. چاهک 3. محصل PCR پالسمید نترکیب )کنترل مثبت(. چاهک 6. نشانگر زن ملکلی DNA( فاژ الندا(. چاهک 5. محصل PCR گیاه غیرتراریخت ( کنترل منفی(. ب( نمدار محتای پرلین درگیاهان تراریخت شاهد در سه سطح تنش )61 1 21 درصد( یک سطح بدن تنش )11 درصد( ج( میزان نفذپذیری نسبی غشا درگیاهان تراریخت شاهد در سه سطح تنش )61 1 21 درصد( یک سطح بدن تنش )11 درصد( د( محتای آب نسبی گیاه درگیاهان تراریخت شاهد در سه سطح تنش )61 1 21 درصد( یک سطح بدن تنش )11 درصد(. )wild type( شاهد :w )Transgenic( تراریخت :T

علم گیاهان زراعی ایران درة 6 شمارة 3 پاییز 336 61 مقایسة میزان نشت ینی در گیاهان تراریخت نسبت به گیاهان شاهد تحت تنش خشکی به منظر بررسی تأثیر افزایش محتای تکفرل بر آسیب غشا نشت ینی از گیاهان تراریخت شاهد آزمایش شد. نشت ینی با قابلیت رسانایی الکتریکی محلل اندازهگیری شد. همانطر که در شکل 3- ب مشخص شده است در سطح بدن تنش )11 درصد( رگة شاهد تراریخت اختالفی از نظر محتای پرلین با یکدیگر ندارند. در سطح تنش 21 درصد اختالف مشاهده میشد لی معنیدار نیست. در سطح تنش 1 61 درصد اختالف معنیداری بین شاهد تراریخت مشاهده شد که نشان میدهد میزان نشت ینی در رگة شاهد بیشتر از تراریخت است. این نتایج نشان میدهد که افزایش تکفرلها به اسطة انتقال ژن بهاحتمال TC منجر به کاهش آسیب غشا از طریق جلگیری از پراکسیداسین چربی گیاهان تراریخت میشد ( Havaux.et al., 2005; Maeda et al., 2005; Trebst et al., 2002(. از آنجا که یکی از نقشهای اصلی تکفرلها به عنان یک ضداکسنده در غشاهای زیستی از بین بردن گنههای رادیکالی اسید چرب غیراشباع تلیدی در فرایند پراکسیداسین چربی است ( Foyer, 1992; )Munne-Bosch, 2002 در نتیجه ممکن است میزان نشت ینی در گیاهان تراریخت که محتای تکفرل بیشتری دارند در شرایط تنش نسبت به گیاه شاهد کمتر باشد همچنان که در نمدار مشاهده میشد )شکل 3 - ب(. نتیجهگیری در تحقیق انجام گرفته از گیاهان تراریخت تتن که ژن تکفرل سیکالز )TC( یکی از آنزیمهای کلیدی در مسیر زیستساخت یتامین E یکی از ضداکسندههای مؤثر در گیاهان برای ریاریی با تنش اکسایشی است در آنها تشدید بیان یافته بد استفاده شد. همچنین تراریختی گیاهان یادشده با تجزیة همچنین PCR کشت رشد بذرهای تراریخت این گیاهان ری محیط دارای کانامایسین تأیید شده بد ( Raanaian et al., 2013(. سپس بذرهای نسل ال کشت گیاهان به نسل بعد منتقل شدند تا یژگیهای فیزیلژیکی ری این گیاهان در شرایط تنش خشکی انجام گیرد. این بررسیها به نقش تکفرلها در حفاظت چربیهای غشا از گنههای فعال اکسیژن همچنین نقش احتمالی انتقال پیام تکفرلها تنظیم هرمنهای تنشی مانند اسید جاسمنیک همینطر حفاظت دستگاه نرساختی سبزینهها از آسیب اکسایشی گنههای فعال اکسیژن تلیدشده در نتیجه بدن کاهش ظرفیت نرساختی اشاره کرد. در نتیجه بهطرکلی انتقال این ژن به گیاه بهاحتمال مجب افزایش مقامت گیاه در شرایط تنش میشد. REFERENCES 1. Rahnama, A., Munns, A., Poustini, K. & Watt, M. (2011). A screening method to identify genetic variation in root growth response to a salinity gradient. Journal of Experimental Botany, 62(1) 69-77. 2. Raanaian, N., Abbasi, A.R. & Zeinali, H. (2013). Overexpression tochopherol cyclase (At.TC) in tabacco (Nicotiana tabacum) plants. Crop Biotechnology,, 19-156 3. Abebe, T., Guenzi, A. C., Martin, B. & Cushman, J. C. (2003). Tolerance of Mannitol Accumulating Transgenic Wheat to Water Stress and Slinity. Plant Phsiol, 131, 178-1755.. Arnon, A. N. (1967). Method of extraction of chlorophyll in the plants. Agronomy Journal, 23, 112-121. 5. Asada, K. (1999). The water-water cycle in chloroplasts: scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 50, 601-39. 6. Ashraf, M. & Foolad, M. R. (2007). Roles of glycin betaine and proline in improving plant abiotic stress resistance. Environ. Exp. Bot, 59, 207-216. 7. Bates, L. S., Waldern, R. P. & Tear, I. D. (1973). Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant soil, 39, 205-207. 8. Bohnert, H. J., Nelson, D. E. & Jensen, R. G. (1995). Adaptations to environmental stresses. Plant Cell, 7, 1099-1111. 9. Bohnert, H. J. & Jensen, R.G. (1996). Strategies for engineering water stress tolerance in plants. Trends in Biotechnology, 1, 89-97. 10. Burton, G. W., Cheng, S. C., Webb, A. & Ingold, K. U. (1986). Vitamin E in young and old human red nlood cells. Biochim Biophys Acta, 860, 8-90.

6 رعنائیان همکاران: بررسی تأثیر تشدید بیان ژن تکفرل سیکالز در تحمل به... 11. Chandrasekar, V., Sairam, R. K. & Srivastava, G. C. (2000). Physiological and Biochemical Responses of Hexaploid and Tetraploid Wheat to Drought Stress. J Agron Crop Sci, 185, 219-222. 12. Delauney, A. J. & Verma, D. P. S. (1993). Prolin biosynthesis and osmoregulation in plants. Plant J.,, 215-223. 13. Demmig-Adams, B. & Adams, III. WW. (1996). The role of xanthophyll cycle carotenoids in the protection of photosynthesis. Trends Plant Sci, 1, 21-6. 1. Fahrenholzt, S. R., Doleiden, F. H., Tozzolo, A. M. & Lamola, A. A. (197). On the quenching of singlet oxygen by a-tocopherol. Photochem Photobiol, 20, 505-9. 15. Foote, C. S., Ching, T. Y. & Geller, G. G. (197). Chemistry of singlet oxygen. XVlll. Rates of reaction and quenching of alpha-tocopherol and singlet oxygen. Photochem Photobiol, 20, 511-513. 16. Foyer, M. V. (1992). The antioxidant effects of thylakoid vitamin E. Plant cell inviron, 15, 381-392. 17. Hofius, D., Hajirezaeim, M., Geiger, M., Tschierschh, H., Melzer, M. & Sonnewald, U. (200). RNAi-mediated tocopherol deficiency impairs photoassimilate export in transgenic potato plants. Plant Physiol, 135, 1256-68. 18. Holmstrom, K. O., Somersalo, S., Mandal, A., Palva, E. T. & Welin, B. (2000). Improved tolerance to salinity and low temoerature in transgenic tobacco producing glycin betaine. J. Exp. Bot, 51, 177-185. 19. Kavi Kishor, P. B., Sangam, S., Amrurha, R. N., Sri Laxmi, P., Naidu, K. R., Rao, K. R. S. S., Sreenath Rao, Reddy, K. J., Theriappan, P. & Sreenivasulu, N. (2005) Regulation of prolin biosynthesis, degradation, uptake and transport in higher plants: its implications in plant growth and abiotic stress tolerance. Current Science, 88, 3-10 20. Kerepsi, I. & Galiba, G. (2000). Osmotic and salt stress-induced alteration in soluble carbohydrate content in wheat seedlings. Crop Sci, 0, 82-87. 21. Lee, G., Carrow, R. N., Duncan, R. R., Eiteman, M. A. & Rieger, M. W. (2008). Synthesis of organic osmolytes and salt tolerance mechanisms in Paspalum vaginatum. Environ Exp Bot, 63, 19-27. 22. Lee, G. J., Duncan, R. R. & Carrow, R. N. (2007). Nutrient uptake responses and inorganic ion contribution to solute potential under salinity stress in halophytic seashore paspalums. Crop Sci, 7, 210-219. 23. Maeda, H., Song, W., Sage, T. L. & DellaPenna, D. (2006). Arabidopsis vitamin E deficient mutants exhibit a cold sensitive phenotype independent of photooxidative damage and suppressed by alterations in membrane polyunsaturated fatty acids. Plant Cell, 18, 2710-2732. 2. Munne-Bosch, S. (2002). The function of tocopherol and tocotrienol in plants. Crit. Rev. Plant Sci, 21, 31-57. 25. Munne- Bosch, S. (2005). The role of a-tocopherol in plant stress tolerance. Plant Physiol, 162, 73-78. 26. Munne -Bosch, S. & Alegre, L. (2002 a). The function of tocopherols and tocotrienols in plants. Crit Rev Plant Sci, 21, 31-57. 27. Munne-Bosch, S., Weiler, E., Alegre, L., Muller, M., Duchting, P. & Falk, J. (2007). A-Tocopherol may influence cellular signaling by modulating jasmonic acid levels in plants. Planta, 225, 681-691. 28. Ohta, S., Mita, S., Hattori, T. & Nakamura, K. (1990). Construction and expression in tabacco of a b- glucuronidase (GUS) reporter gene containing an intron within the coding sequence. Plant Cell Physiol, 31, 805-813. 29. Osmond, B., Badger, M., Maxwell, K., Bjorkman, O. & Leegod, R. (1997). Too many photons: photorespiration, photoinhibition and photooxidation. Trends Plant Sci, 2, 119-20. 30. Ouyang, S., He, S., Liu, P., Zhang, W., Zhang, J. & Chen, S. (2010). The role of tocopherol cyclase in salt stress tolerance of rich (Oryza sativa). China Life Sci, 5, 181-188. 31. Pollard, A. & Wn Jones, R. G. (1979). Enzyme activities in concentrated solutions of glycinebetaine and other solutes. Planta, 1, 291-298. 32. Ritchie, S. W., Nguyen, H. T. & Holaday, A. S. (1990). Leaf water content and gas exchanges parameters of two wheat genotypes differing in drought resistance. Crop Sci, 30, 105-111. 33. Russin, W. A., Evert, R. E., Vanderveer, P. J., Sharkey, T. D. & Briggs, S. P. (1996). Modification of a specific class of plasmodesmata and loss of sucrose export ability in a sucrose export defective1 maize mutant. Plant Cell, 8,65-58. 3. Sattler, S. E., Gilliland, L. U., Magallanes-Lundback, M., Pollard, M. & DellaPenna, D. (200). Vitamin E i s essential for seed longevity and for preventing lipid peroxidation during germination. Plant Cell, 16, 119-32. 35. Shen, B., Jensen R. G. & Bohnert, H. J. (1997). Mannitol protects against oxidation by hydroxyl radicals. Plant Physiol, 115, 527-532. 36. Smirnoff, N. & Cumbes, Q. J. (1989). Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes. Phytochemistry, 28, 1057-1060. 37. Trebst, A. (2003). Function of b-carotene and tocopherol in photosystem II. Z Naturforsch, 58c, 609-20.

علم گیاهان زراعی ایران درة 6 شمارة 3 پاییز 336 6 38. Trebst, A., Depka, B. & Hollander-Czytko, H. (2002). A specific role for tocopherol and of chemical singlet oxygen quenchers in the maintenance of photosystem II structure and function in Chlamydomonas reinhardtii. FEBS Lett, 3, 2157-62. 39. Wagner, P. & Heinecke, J. W. (1997). Copper ions promote peroxidation of low density lipoprotein lipid by binding to histidin residues of apolipoprotein B100, but they are reduced at other sites on LDL. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 17, 3338-336. 0. Xiong, L., Ishitani, M., Lee, H. & Zhu, J. K. (2001). The Arabidopsis LOS5/ABA3 locus encodes a molybdenum cofactor sulfurase and modulates cold stressand osmotic stress-responsive gene expression. Plant Cell, 13, 2063-2083. 1. Zhao, Y., Aspinall, D. & Paleg, L. G. (1992). Protection of membrane integrity in Medicago sativa L. by glycinebetaine against the effects of freezing. Journal of Plant Physiology, 10, 51-53. 2. Zhu, J. K. (2001). Plant salt tolerance. Trends in Plant Sci, 6, 66-71. 3. Zhu, B., Su, J., Chang, M., Verma, D. P. S., Fan, Y. L. & Wu, R. (1998). Overexpression of Δ1- pyrroline-5-carboxylate synthetase gene and analysis of tolerance to water- and salt-stress in transgenic rice. Plant Sci, 139, 1-8.

7 Iranian Journal of Filed Crop Science, Vol. 6, No. 3, Autumn 2015 Investigation of Tocopherol cyclase gene overexpression effects on the drought stress tolerance by using of tabacco (Nicotiana tabacum) transgenic plants Nahid Ranaeian 1, Alireza Abbasi 2* and Hassan Zeinali Khanghah 3 1, 2, 3. M. Sc. Student, Assistant Professor and Associate Professor, University College of Agriculture & Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran (Received: Jun. 22, 201 - Accepted: Jun. 10, 2015) ABSTRACT Environmental stresses trigger a wide variety of plant responses, such as altered gene expression to changes in cellular metabolism and growth. The several plant reactions exist to circumvent the potentially harmful effects caused by light, drought, salinity, pathogen infections and other stresses. a-tocopherol is the major vitamin E compound found in leaf chloroplasts. This antioxidant deactivates photosynthesisderived reactive oxygen species and prevents the propagation of lipid peroxidation by scavenging lipid peroxyl radicals in thylakoid membranes. In this study, we used the tabacco plants containing of pbin: At.TC construct that overexpressed the tocopherol cyclase gene. For analysis effect of overexpressed this gene, the transgenic plants were subjected to drought stress and were studied number of physiologic parameters such as, chlorophyls and carotenoid, proline amino acid content, relative water content, membrane permeability, in transgenic and wild type plants in normal and drought stress condition. The results indicated that transgenic plants have increased chlorophyl, proline and relative water content and decreased membrane Permeability in 0 and 60 stress levels, in comparison to wild type plants. Therefore the overexpression of tocopherol cyclase gene in tabacco plants maybe cause increased plant tolerance under drought stress conditions. Keywords: antioxidant, droght stress, Lipid peroxidation, reactive oxygen species, tocopherol cyclase. * Corresponding author E-mail: rezabbasi@ut.ac.ir Tel: +98 912 128709