Qom Univ Med Sci J 2018 May

Transcript

1 Qom Univ Med Sci J 208 May Original Article Investigation of Chemical Composition of Helichrysum artemisioides Essential Oil, and its Antibacterial and Cytotoxic Effects on Colon Cancer Cell Line and Analysis of Apoptotic Gene Expression Using PCR Method Sepideh Piroozmand, Zahra Mousavi, Amir Mirzaie 2, Abdolhossein Rustaiyan 3 Department of Pharmacology & Toxicology, Faculty of Pharmacy, Pharmaceutical Sciences Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran. 2 Department of Biology, Roudehen Branch, Islamic Azad University, Roudehen, Iran. 3 Department of Chemistry, Science & Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran. Corresponding Author: Abdolhossein Rustaiyan, Department of Chemistry, Science & Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran. a.rustaiyan@srbiau.ac.ir Received: 3 Dec, 206 Abstract Background and Objectives: Helichrysum artemisioides is one of the endemic medicinal plants in Iran. The aim of this research was to identify the chemical composition of H. artemisioides essential oil and its antibacterial and cytotoxic effects on colon cancer cell line (). Methods: In this study, the essential oil of H. artemisioides was collected by hydrodistillation method using Clevenger apparatus. Chemical composition of essential oil was identified using a GC-MS device. Subsequently, antibacterial effect of the essential oil on pathogenic bacteria and its cytotoxic activity on colon cancer cell line (), were determined using MIC and MTT methods, respectively. The expression of Bax and Bcl2 apoptotic genes in cell line, was assessed using real time PCR method. Results: GC-MS analysis of essential oil of the plant showed 55 compounds, most of which belonged to Carvacrol (2.5%) and R-α- Pinene (2.5%). Furthermore, the essential oil of this plant had the highest effect on Gram-positive bacteria and the least effect on gramnegative bacteria. Moreover, the essential oil of this plant had IC50=3.54mg/ml on cell line. Results of real time PCR showed increase in expression level of Bax gene and decrease in expression level of Bcl2, respectively, 2.9 ± 0.2 (p<0.05) and 0.2±0.7 (p<0.05). Conclusion: Considering antibacterial and anticancer effects of H. artemisioides essential oil, it appears that this plant has the potential to be used in pharmaceutical industries. Keywords: Helichrysum artemisioides; Colon cancer; Antibacterial agents; Apoptosis; Real-time polymerase chain reaction. Accepted: 8 Feb, Qom Univ Med Sci J 208;2(3):9-8

2 مقاله پژهشي (Original Article) مجله دانشگاه علم پزشکی قم دره دازدهم شماره سم خرداد 97 صفحه 9 الی 8 سپیده بررسی ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه هلیکریزم آرتمیزییئیدس اثرات ضدمیکربی سم یت سللی آن بر ری رده سللی سرطان کلن آنالیز بیان ژنهای آپپتزی با رش PCR 3 2 پیرزمند زهرا مسی امیر میرزایی عبدالحسین رستاییان گره دارسازی سمشناسی دانشکده دارسازی احد علم داریی دانشگاه آزاد اسالمی تهران ایران. 2 گره زیستشناسی احد ردهن دانشگاه آزاد اسالمی ردهن ایران. 3 گره شیمی احد علم تحقیقات دانشگاه آزاد اسالمی تهران ایران. نیسنده مسئل مکاتبات: عبدالحسین رستاییان گره شیمی احد علم تحقیقات دانشگاه آزاد اسالمی تهران ایران آدرس پست الکترنیکی: a.rustaiyan@srbiau.ac.ir تاریخ دریافت: 95/9/2 تاریخ پذیرش: 95//9 چکیده زمینه هدف: گیاه Helichrysum artemisioides یکی از اناع گیاهان بمی داریی ایران است که از نظر طب سنتی حایز اهمیت میباشد. هدف از این پژهش بررسی ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه.H artemisioides اثرات ضدباکتریایی سم یت سللی آپپتزی آن بر ری رده سللی سرطانی کلن )( بد. رش بررسی: در این مطالعه تجربی ابتدا اسانس گیاه.H artemisioides به رش تقطیر با آب بهسیله دستگاه کلنجر استخراج شد سپس ترکیبات شیمیایی تشکیلدهنده اسانس این گیاه بهکمک دستگاه GC-MS شناسایی شدند. در پی آن اثرات ضدباکتریایی اسانس گیاه بر ری باکتریهای پاتژن اثرات سم یت سللی آن در رده سللی تعیین گردید. بیان ژنهای آپپتزی با رشه یا MTT MIC Bax Bcl2 در رده سللی Real Time PCR ارزیابی شد. یافتهها: آنالیز GC-MS )%2/5( Carvacrol با استفاده از رش اسانس گیاه تعداد 55 ترکیب را نشان داد که بیشترین آن مربط به )%2/5( بد. همچنین اسانس این گیاه بیشترین تأثیر را R-α-Pinene ری باکتریهای گرم مثبت کمترین اثر را ری باکتریهای گرم منفی داشت. عاله بر این اسانس این گیاه دارای سم یت سللی IC50=3/5mg/ml ری رده سللی Real Time PCR افزایش بیان ژن Bax کاهش بیان Bcl2 )p 0/05( 0/2±0/7 )p 0/05( نشان داد. نتیجهگیری: با تجه به اثرات ضدباکتریایی ضدسرطانی اسانس گیاه بهنظر میرسد این گیاه پتانسیل استفاده در صنایع داریی را داشته باشد. کلید اژهها: هلیکریزم آرتمیزییئیدس آپپتزیس اکنش زنجیره پلیمراز در زمان اقعی. بد. نتایج را به ترتیب به میزان 2/9±0/2 H. artemisioides سرطانهای کلن عامل ضدباکتریایی لطفا به این مقاله بهصرت زیر استناد نمایید: Piroozmand S, Mousavi Z, Mirzaie Z, Rustaiyan AH. Investigation of chemical composition of Helichrysum artemisioides essential oil, and its antibacterial and cytotoxic effects on colon cancer cell line and analysis of apoptotic gene expression using PCR method. Qom Univ Med Sci J 208;2(3):9-8. [Full Text in Persian] مجله دانشگاه علم پزشکی قم/ دره دازدهم شماره سم خرداد 397 0

3 ... بررسی ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه هلیکریزم آرتمیزییئیدس اثرات ضدمیکربی... مقدمه نسرین جاید تبریزی همکاران گیاهان داریی جزء منابع بالقهای هستند که از نظر طب سنتی حایز اهمیت بده از دیرباز خاص درمانی داریی آنها مردتجه محققین بده است )(. در اقع گیاهان داریی مخازن غنی از متابلیتهای ثانیه داریی هستند که مؤثره کمتر از % زن خشک گیاه را تشکیل میدهند. یکی از این ترکیبات دارای خاص داریی اسانسهای گیاهی میباشد )3 2(. اسانس گیاهان داریی ترکیبات فر ار معطری هستند که در اندامهای مختلف گیاه جد دارند یکی از نقشهای آن محافظت از گیاه در برابر عفنتهای میکربی است )5 4(. دلیل اصلی تشکیل اسانسها بهخبی مشخص نیست لی این ترکیبات بهطرکلی بازماندههای ناشی از فرآیندهای اصلی متابلیسم گیاهان بده که تحت تأثیر تنشها قرار دارند از نظر شیمیایی همگن نبده بهاشکال مختلف اغلب با منشأ ترپنی مشاهده میشند )7 6(. سالیان درازی است که خاص ضدمیکربی ضدسرطانی اسانسها در حال بررسی است همچنین تمایل محققان طی این سالها جهت شناسایی ترکیبات سازنده اسانسهای گیاهی اثرات بیلژیکی آنها مانند اثرات ضدسرطانی بیشتر شده است )9 8(. مطالعات نشان میدهند سرطان عامل اصلی مرگمیر در کشرهای پیشرفته بده تا چندسال آینده نیز تخمین زده میشد میزان شیع آن به چند برابر برسد )0(. سرطان کلن به رشد بیش از حد سللهای رده بزرگ گفته میشد که ممکن است به بافتهای دیگر هم متاستاز دهد. مطالعات اپیدمیلژیک نشان داده است سرطان کلن ساالنه باعث مرگ بسیاری از افراد در کل جهان میشد این نع سرطان در مردان پس از سرطان ریه بهعنان شایعترین نع سرطان شناخته شده است )2 (. درمان سرطان از برای مانند جراحی پرتدرمانی شیمیدرمانی استفاده رشهایی میشد درحالیکه این نع سرطان به اکثر دارها مقام بده درمان آن با مفقیت چندانی همراه نبده است )3(. یکی از رشهایی که اخیرا مطالعات زیادی بر ری آن انجام شده استفاده از گیاهان اسانسه یا آنها برای درمان سرطان است محققان نیز در حال یافتن ترکیبات داریی با منشأ گیاهی بدن اثرات جانبی هستند )4(. همچنین از نقطهنظر بالینی استفاده بیریه از آنتیبیتیکها سپیده پیرزمند همکاران جهت درمان بیماریهای باکتریایی منجر به پیدایش ایزلههای مقام به آنتیبیتیک میشد )5(. پیدایش یافتن برای به عامل که شده سیههای هر ضدمیکربی رز بر مقام به جدید افزده آنها تعداد آنتیبیتیک تالش ضرری را میکند. بهمنظر دستیابی به ترکیبات ضدمیکربی جدید از ترکیبات طبیعی مانند اسانس گیاهان داریی استفاده میشد. هزینه پایین تلید عدم برز مشکالت زیستمحیطی ازجمله مزایایی است که گیاهان داریی را بهعنان یکی از کاندیداهای مناسب برای مهار بیمرگ سیههای باکتریایی معرفی کرده است )6(. گیاه گل )Helichrysum artemisiodes( از گیاهان بمی کشر در استان مرکزی بده از خاناده آستراسه است. این گیاه علفی چندساله با ارتفاع 5-40 سانتیمتر در ماههای خرداد تا مرداد به گلدهی میرسد. این گیاه منبع با ارزشی از ترکیبات ثانیه بده که از آن میتان جهت درمان سنگ کلیه اختالالت ادراری دل درد یرقان اسهال تنگینفس استفاده کرد )8 7(. تاکنن مطالعهای در زمینه بررسی ترکیبات شیمیایی بیلژیک اسانس گیاه H. artemisiodes انجام نشده اثرات است. بنابراین این مطالعه با هدف بررسی ترکیبات شیمیایی تشکیلدهنده اسانس گیاه اثرات ضدباکتریایی سم یت سللی آپپتز بر ری رده سلل سرطانی رده بزرگ )( همچنین آنالیز بیان Bax Bcl2 در سلله یا رش بررسی در این مطالعه تجربی ابتدا گیاه انجام شد. H. artemisiodes ژنهای آپپتزی از مرکز ذخایر زیستی ایران تهیه گردید سپس ماد گیاهی جمعآریشده پس از تمیز شدن در سایه خشک بهسیله آسیاب پدر شده در شرایط بهینه مناسب نگهداری شدند. جهت استخراج اسانس گیاه از رش تقطیر با آب دستگاه اسانسگیری کلنجر استفاده شد بدین ترتیب که ابتدا 00 گرم از برگ خشک گیاه خرد به بالن 2 لیتری کلنجر منتقل گردید مقدار لیتر آب مقطر به آن اضافه شد. عملیات اسانسگیری بهمدت 4 ساعت ادامه یافت. در خالل عملیات اسانس گیاه بهعلت فر ار بدن بخار همراه جمعآری شد. آب تقطیر لله در جمعآریکننده مجله دانشگاه علم پزشکی قم/ دره دازدهم شماره سم خرداد 397 کلنجر

4 ... بررسی ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه هلیکریزم آرتمیزییئیدس اثرات ضدمیکربی... نسرین جاید تبریزی همکاران باتجه به اینکه چگالی اسانس از چگالی آب کمتر است بنابراین اسانس استخراجشده ری فاز آبی قرار گرفت بهراحتی بهسیله شیر تخلیه جداسازی شد. عمل آبگیری از اسانس بهدستآمده با سلفات سدیم بدن آب ( 4 )Na 2 SO انجام گرفت. از آنجاییکه اسانسها نسبت به نر اکسیژن دما حساسند در چنین شرایطی ترکیبات آنها دچار تغییر تحل میشد لذا بالفاصله اسانس استخراجشده به یک شیشه تیره دربسته منتقل تا مراحل بعدی یخچال در کار نگهداری ترکیبات فیتشیمیایی عصاره گیاه شد. بهمنظر جداسازی شناسایی کرماتگرافی گازی متصلشده به طیفسنج جرمی )مدل از دستگاه GC/MS Agilent 6890 ساخت کشر آمریکا( استفاده گردید. طل ستن 30 متر قطر داخلی 0/25 میلیمتر بد برای ردیابی از سامانه پنیزاسین الکترنی با انرژی 70eV استفاده شد. برنامه حرارتی دستگاه به این صرت بد که دما از 50 درجه سانتیگراد شرع تا 250 درجه سانتیگراد ادامه پیدا میکرد. از حامل هلیم %99/99 مقدار تزریق میکرلیتر سرعت جریان گاز 5 میلیلیتر در دقیقه تنظیم شده بد. حجم میکرلیتر از اسانس گیاه به دستگاه GC/MS تزریق شد سپس نتایج بهدستآمده از دستگاه براساس اندیس کاتس مراجعه به فرهنگ طبیعی ترکیبات طبیعی شناسایی گردید. برای شناسایی تعیین مقدار ترکیبات فیتشیمیایی عصاره گیاه زیرپیک GC/MS از سطح اطالعات مجد در بانک اطالعاتی (National Institute Standard and Technology) NIST استفاده شد. در این مرحله خاصیت ضدمیکربی اسانس با رش حداقل غلظت مهاری )MIC( بررسی گردید. MIC به کمترین غلظت از ترکیبات رشد که میکرارگانیسم میگردد. در این مطالعه از باکتریهای مهار را Listeria monocytogenes ATCC 3552 میکند اطالق Staphylococcus Salmonella typhimurium ATCC aureus ATCC آن Pseudomonas aeruginosa ATCC استفاده شد. بدین منظر ابتدا باکتریهای مدنظر در محیط کشت مایع )بهمدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد( انکبه در پی با استفاده از لله 5/ کم 0 فارلند رقیق شدند. رقته یا سپس محدده غلظت متالی از اسانس گیاه از سپیده پیرزمند همکاران H. artemisiodes 3/9-500 )3/9 در 7/8 ) /5 3/25 5/62 تهیه گردید. در ادامه پلیتهای ملرهینتن خانهای 96 براث کمک به 95 تزیع 5 میکرلیتر از اسانس با تلقیح از میکرلیتر از میکرلیتر میکربی محیط 00 غلظتهای مختلف مرد استفاده قرار گرفت. چاهک آخر شامل 95 میکرلیتر محیط ملر هینتن براث با 5 میکرلیتر از باکتریهای منتخب در هر ردیف بهمنزله نمنه شاهد در نظر گرفته شد. محتیات هر چاهک ری شیکر )بهمدت 60 ثانیه با در )00rpm مخلط شده سپس در دمای 37 درجه بهمدت 24 ساعت انکبه شدند. بعد از این مدت میزان رشد میکربی با میزان جذب در طلمج 620 نانمتر خانده شد MIC میزان تعیین گردید. سللهای رده سللی سرطان کلن نرمال L929 ) cell line( انستیتپاستر ایران RPMI 640 بهصرت USA( )Biosera, با بهذکر است محیط کشت از بخش کشت سللی فالسک تهیه در محیط کشت ph=7/3 کشت داده شد. الزم با نسبت RPMI میکرگرم برمیلیلیتر پنیسیلین G استرپتمایسین %0 سرم جنین گای )Fetal Bovine Serum: FBS( تست سم یت سللی اسانس گیاه رش غنی شده بد. بهمنظر انجام 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-( MTT Bromide )yl)-2,5-diphenyltetrazolium به کار برده شد. بهطر خالصه تعداد 5 هزار سلل در هر چاهک 96 تایی پلیت سللی اضافه شد غلظته یا 2 6/25 3/25 /56 0/ از اسانس در زمانه یا ساعت بر ری رده سللی سرطانی کلن )( نرمال L929 افزده شد. بعد از گذشت مدت زمان مرد نظر محلل ریی محیط کشت در ریخته شد سللها با رنگ برمیلیلیتر در MTT )PBS بهمدت 4 )محلل 0/5 میلیگرم ساعت تحت شرایط دیاکسیدکربن %5 دمای 37 درجه سانتیگراد انکبه شدند. پس از محللسازی فرمازان با 00 میکرلیتر دی متیل سلفکساید جذب نری در طلمج 570 نانمتر بهسیله دستگاه قرائتخان االیزا Teknika( ELISA reader, Oraganon ساخت هلند( 2 مجله دانشگاه علم پزشکی قم/ دره دازدهم شماره سم خرداد 397 خانده شد.

5 ... بررسی ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه هلیکریزم آرتمیزییئیدس اثرات ضدمیکربی... نسرین جاید تبریزی همکاران سپس رنگ MTT جداسازی کریستالهای فرمازان تلیدشده با سللهای زنده در ایزپرپانل حل شدند. در نهایت میزان کشندگی سلل بهکمک فرمل زیر محاسبه گردید. = میزان بقای سللی 00 )جذب نری سللهای کنترل/جذب نری سللهای تیمار شده( همچنین میزان دز %50 کشندگی concentration, )Half maximal inhibitory نیز محاسبه IC 50 ( شد. بهمنظر بررسی میزان بیان سطح mrna از رش ژنهای آپپتزی Bax Bcl2 Real Time PCR در استفاده گردید بدینترتیب که ابتدا کل RNA سللهای تحت تیمار غیرتیمار با عصاره با کیت استخراج RNA )کیاژن امریکا طبق دسترالعمل آن( استخراج شدند سپس غلظت آن بهسیله دستگاه ناندراپ GmbH( IMPLEN ساخت آلمان( تعیین گردید. در پی آن برای سنتز cdna از ملکله یا RNA استخراجشده از کیت Revert AidTM First strand cdna Synthesis Kit Fermentas( لیتانی( بهصرت: 5 میکرلیتر بافر 5x یک میکرگرم RNA 0/5 میکرلیتر پرایمرهای Random hexamer 0/5 میکرلیتر از پرایمر 2 Oligo dt dntps میکرلیتر RNase inhibitor 20( Reverse Transcriptase میکرلیتر میکرلیتر احد برمیکرلیتر( آب مقطر 2 بار تقطیر )تا حجم نهایی 20 میکرلیتر( استفاده گردید. در سنتز cdna از برنامه دمایی 5 دقیقه در دمای 25 درجه سانتیگراد 60 دقیقه در دمای 42 درجه سانتیگراد 5 دقیقه در دمای 70 درجه سانتیگراد دقیقه در دمای 5 4 پرایمرهای مرد استفاده برای ژنهای هدف درجه سانتیگراد استفاده شد. Bcl2 Bax GAPDH بد ژن بهعنان کنترل داخلی مرد استفاده قرار گرفت. تالی آغازگرهای رفتبرگشتی ژن هدف بهصرت Bax 5'- TTGCTTCAGGGTTTCATCCAG -3' -3' AGCTTCTTGGTGGACGCATC 5'- بدند. سپیده پیرزمند همکاران همچنین تالی آغازگرهای رفتبرگشت ژن هدف Bcl2 بهصرت -3' TGTGGATGACTGAGTACCTGAACC 5'- 5'- CAGCCAGGAGAAATCAAACAGAG -3' برای ژن مرجع GAPDH بهصرت 5'-CGTCTGCCCTATCAACTTTCG-3' 5'-CGTTTCTCAGGCTCCCTCT-3' رفت برگشتی بد. در نهایت برای بررسی بیان ژنها رش Bioneer( Real Time PCR کره( به کار برده شد )26(. نتایج حاصل در این مطالعه با استفاده از نرمافزار SPSS نسخه 20 آنالیز اریانس )با اندازهگیریهای مکرر( تحلیل شدند. سطح معنیداری p 0/05 در نظر گرفته شد. تمامی تستها بهصرت 3 بار تکرار انجام گرفت. یافتهها آنالیز کرماتگرام پیک را نشان داد که مجد در گیاه بد. GC-MS نشاندهنده در اسانس گیاه مقایسه NIST جد ترکیبات فیتشیمیایی طیفها با اطالعات کتابخانه ترکیب شیمیایی شناسایی گردید. از میان ترکیبات شناساییشده (2/585%) Carvacrol R-α-Pinene (2/5%) تشکیلدهنده بدند. دارای بیشترین درصد ماد نتایج حاصل از بررسی میزان اثرات ضدباکتریایی اسانس علیه باکتریهای S. typhimurium S. aureus L. monocytogenes P. aeroginosa باکتریهای گرم مثبت aureus(.s نشان داد این اسانس بیشترین تأثیر را ری ) L. monocytogenes کمترین را بر ری د باکتری دیگر که گرم منفی بدهاند داشته است )جدل شماره (. 3 مجله دانشگاه علم پزشکی قم/ دره دازدهم شماره سم خرداد 397

6 بررسی ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه هلیکریزم آرتمیزییئیدس اثرات ضدمیکربی... سپیده پیرزمند همکاران... نسرین جاید تبریزی همکاران جدل شماره. نتایج MIC اسانس گیاه.H artemisiodes در سیههای باکتریایی منتخب نام باکتری سالمنال تیفی مریم سدمناس آئرژینزا استافیلککس ارئس لیستریا منسیتژنز (میلیگرمبرمیلیلیتر ( MIC 62/5 5/62 7/8 7/8 بررسی میزان سم یت سللی اسانس با استفاده از رش غلظته یا MTT /25 3/25 /56 0/78 بر ری رده سللی دادهها با استفاده از نرمافزار در 00 نسخه SPSS انجام گرفت 6 آزمن آنالیز اریانس با اندازهگیریهای مکرر آنالیز شدند. نتایج حاصل از مقایسه تست سم یت سللی بین غلظته یا زمانه یا ساعت در رده سللی مختلف اسانس در نشان داد اسانس در مدت زمان 72 ساعت غلظت 00 میلیگرم بیشترین تأثیر سم یت سللی را داشته )p 0/000( در مقابل در مدت زمان 24 ساعت غلظت 0/78 میلیگرم کمترین تأثیر را بر ری سللها داشته است که از لحاظ آماری در مقایسه با گره کنترل نبد معنیدار.)p>0/05( همچنین میزان IC50 این اسانس در مدت زمان ساعت به ترتیب برابر با 6/08 3/5 2/9 بد. با مقایسه این یافتهها میتان نتیجه گرفت بیشترین میزان سم یت سللی اسانس مربط به غلظت 00 میلیگرم در زمان 72 ساعت بده کمترین تأثیر بر ری سلل را این اسانس در زمان 24 ساعت داشته است )جدل شماره 2( زمان ساعت 0/78 /56 جدل شماره 2. اثر غلظتهای مختلف اسانس گیاه.H artemisiodes بر ری رده سللی 3/25 6/ میلیگرم برمیلیلیتر 32/75±0/4 6/75±0/2 /7±0/ 40/5±0/5 20/7±0/3 0/8±0/2 53/7±0/2 3±0/3 23±0/4 60/5±0/3 39/5±0/3 29/5±0/5 68/5±0/4 50/5±0/5 4/5±0/3 80±0/7 66/5±0/5 5/2±0/3 89±0/5 72/5±0/4 59/5±0/2 94/5±0/2 85/3±0/6 73/2±0/ نتایج بهصرت درصد بقا در مقایسه با نمنهه یا کنترل به صرت میانگین ± انحراف معیار گزارش شد..)p 0/00 :0/0>p) ):0/05>p معنیدار در نظر گرفته شد. 0/05<p تیمار سللهای نرمال با غلظته یا L929 مختلف اسانس 0/ /25 3/25 /56 00 با استفاده از تست MTT طی مدت زمان ساعت انجام شد. همچنین اسانس در غلظت 00 بیشترین مهار تکثیر سللی را داشت اختالف فاحشی با گره کنترل نشان داد که از لحاظ آماری معنیدار بد.)p 0/00( درحالیکه در غلظتهای کمتر از 2/5 نسبت به گره کنترل اختالف معنیداری را نشان نداد از نظر آماری معنیدار نبد )0/05<p( )جدل شماره 3(. الزم به ذکر است میزان IC50 این اسانس در رده سللی L929 در مدت زمانه یا ساعت به ترتیب برابر با بد زمان ساعت 0/78 /56 جدل شماره 3: اثر غلظتهای مختلف اسانس گیاه.H artemisiodes بر ری رده سللی L929. 3/25 6/ /7±0/6 59±0/7 54±0/6 74±0/5 70/5±0/6 65±0/5 8/7±0/7 78/7±0/8 74/2±0/7 88±/3 87±0/9 8±0/5 9/7 ±0/4 90±0/9 84/5±0/8 92/2±0/3 9/2±0/6 86/2±0/7 94±0/2 93/2±/ 88/7±0/9 97/2±0/2 98/3±0/ 8 95±0/ نتایج به صرت درصد بقا در مقایسه با نمنهه یا کنترل به صرت میانگین ± انحراف معیار گزارش شد.)p 0/00 (p>0/0: p 0/05:( معنیدار در نظر گرفته شد. p>0/05. مجله دانشگاه علم پزشکی قم/ دره دازدهم شماره سم خرداد 397 4

7 ... بررسی ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه هلیکریزم آرتمیزییئیدس اثرات ضدمیکربی... بررسی میزان القای بیان ژنهای آپپتزی سللهای سرطانی کلن )( تیمارشده با غلظت اسانس با استفاده از رش ارزیابی شد. نسرین جاید تبریزی همکاران Bcl2 Bax در IC50 Real Time PCR بعد از 24 ساعت نتایج Real Time PCR نشان داد ژنه یا سپیده پیرزمند همکاران Bax Bcl2 نسبت به ژن مرجع در رده سللی سرطانی کلن تیمارشده طی 24 ساعت به میزان 2/9±0/2 کاهش داشتهاند )نمدار(. )p 0/05( افزایش )p 0/05( 0/2±0/7 بحث نسبت بیان ژنه یا نمدار: میزان بیان ژنه یا.)GAPDH( نسبت به ژن کنترل Bcl2 Bax Bax Bcl2 به ژن کنترل در رده سللی سرطانی کلن تیمارشده طی 24 ساعت به میزان 2/9±0/2 )p 0/05( افزایش از نقطهنظر طب سنتی استفاده از عصاره اسانسهای گیاهی جهت درمان عفنتهای باکتریایی سرطانی همچنین شناسایی ترکیبات تشکیلدهنده آنها از دیرباز حایز اهمیت بده انجام مطالعات اخیر در جهت جایگزینکردن ترکیبات طبیعی به جای دارهای شیمیایی جهت درمان بیماریها میباشد )9(. در این مطالعه یکی از گیاهان بمی کشر بهنام )p 0/05( 0/2 ±0/7 کاهش یافته است. H. artemisiodes جهت 55 بررسی ترکیبات شیمیایی تشکیلدهنده آن مرد بررسی قرار گرفت. نتایج آنالیز شیمیایی اسانس این گیاه بهسیله رش GC-MS شناساییشده د ترکیب ترکیب را نشان داد که از میان ترکیبات Carvacrol (2/585%) R-α-Pinene (2/5%) اسانس بدند. Carvacrol 50/27 دارای بیشترین درصد ماد تشکیلدهنده یک ترکیب شیمیایی با جرم ملی گرم برمل از خاناده ترکیبات فنلی منترپنی میباشد. این ترکیب بهعنان جزء مهم ترکیب مجد در اسانسهای برخی از گیاهان خاناده آستراسه دارای خاصیت ضدباکتریایی است )20(. R-α-Pinene مهم اسانسهای گیاهی به فرمل C 0 H 6 میباشد. نیز از ترکیبات شیمیایی مطالعات نشان میدهد این ترکیب دارای طیف میکربکشی سیعی است )2(. مطالعات مختلفی در زمینه بررسی ترکیبات شیمیایی جنس Helichrysum انجام شده است. Javidnia همکاران ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه Helichrysum leucocephalum Boiss. را با رش GC-MS شناسایی کردند. نتایج این مطالعه نشان داد (22/3%( Rosifoliol β-caryophyllene (0/%) ترکیبات α-humulene )9%) تشکیلدهنده اسانس بدهاند )22(. Mastelić بیشتر همکاران ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه.H italicum را با رش GC-MS شناسایی کردند. نتایج این مطالعه نشان داد alpha-pinen (2/8%) pentanoate بیشترین ترکیبات 2-methyl-cyclohexyl (/% ) مجد در اسانس این گیاه بدهاند )23(. با تجه به نتایج این پژهش سایر مطالعات بهنظر میرسد یکی از دالیل تفات ترکیبات شیمیایی اسانسهای گیاه یک جنس میتاند بهعلت نع منطقه جغرافیایی محل رشد این گیاه باشد. یکی دیگر از اهداف این مطالعه بررسی خاص ضدباکتریایی اسانس گیاه باکتریهای پاتژن بد. H. artemisiodes بر ری برخی از 5 مجله دانشگاه علم پزشکی قم/ دره دازدهم شماره سم خرداد 397

8 ... بررسی ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه هلیکریزم آرتمیزییئیدس اثرات ضدمیکربی... در مطالعه حاضر اسانس گیاه مدنظر بیشترین تأثیر را بر ری باکتریهای گرم مثبت داشت. با تجه به تعداد ترکیبات شیمیایی شناساییشده در این گیاه نمیتان مکانیسم احدی برای اثرات ضدباکتریایی آن در نظر گرفت بلکه آنها اهداف متعددی را در سلل باکتری خاهند داشت. یکی از یژگیهای نسرین جاید تبریزی همکاران Afoulous اسانسها اجزای تشکیلدهنده آنها خاصیت آبگریزی است که مجب نفذ این ماد به لیپیدهای غشای سلل باکتری شده سبب اختالل در ساختمان سللی ایجاد نفذپذیری بیشتر میگردد. این مسئله مجب خرج نشت ینها دیگر محتیات سللی میشد )24(. بهطرکلی هرچه ماد فنلیک دارای ساختارهای حلقهای عاملدار بیشتر باشد خاص ضدباکتریایی آنها نیز بیشتر است )25(. از میان 55 ترکیب شناساییشده از اسانس گیاه بهنظر میرسد ترکیباتی مانند R-α-Pinene Cyclohexene, - Benzene, -methyl-3-(-methylethyl) 4-Terpineol (2-nitro-2-propenyl) ضدباکتریایی هستند. Carvacrol دارای اثرات بهمنظر بررسی اثرات سیتتکسیک اسانس گیاه از رش MTT استفاده شد که نتایج نشان داد میزان اثرات سم یت سللی اسانس ابسته به دز زمان است بهطریکه در غلظتهای باالتر در مدت زمان بیشتر میزان سم یت سللی بیشتر میشد. همچنین اسانس این گیاه دارای اثرات سم یت سللی کمتری در سلل نرمال سرطانی L929 نسبت به سلل بد که بهنظر میرسد اسانس این گیاه بهعلت جد ترکیبان فنلی بهخصص فالنئیدها اثر مهاری دارد. در اقع اسانس این گیاه دارای ماهیت چربیدست بده با عبر از عرض غشای سللی ارد سلل میشد. مطالعات نشان میدهند اسانسها کانالهای ینی باعث تداخل بار غشای میتکندری غشای سللی میشند پتانسیل غشایی را برهم زده در نهایت باعث مهار پمپ پرتنی تلید برخی مطالعات نشان دادهاند ATP میشند.)26( اسانسهای گیاهی با تخریب پمپهای ینی غشایی منجر به نشت ینها )کلسیم( پرتئینهای سللی شده آپپتز را القا میکنند )27(. مطالعات مختلفی اثرات سم یت سللی اسانس گیاهان جنس Helichrysum را نشان دادهاند. سپیده پیرزمند همکاران همکاران اثرات سم یت سللی اسانس گیاه Helichrysum gymnocephalum را ری رده سللی سرطان سینه مرد بررسی قرار دادند. نتایج این مطالعه نشان داد اسانس این گیاه دارای اثرات چشمگیر ضدسرطانی علیه این سلل است Bigović.)28( گیاه Helicrysum plicatum همکاران با بررسی اثرات ضدسرطانی اسانس بر ری سه رده سلل سرطانی رحم پرستات کبد نشان دادند بین اسانس این گیاه با خاصیت سم یت سللی ارتباط معنیداری جد دارد )29(. در اقع نتایج مطالعه حاضر در زمینه اثرات سم یت سللی اسانس گیاه H. artemisiodes با سایر مقاالت منتشره همخانی داشت. یکی دیگر از اثرات بیلژیک اسانسهای گیاهی القای آپپتز در مرگ سللی است. بهطرکلی القای مرگ برنامهریزیشده سللی یکی از ریکردهای جذاب در درمان سرطان به شمار میرد. مسیر مرگ سللی میتاند شامل فعالسازی ریدادهای پرآپپتتیک در سلل باشد که با نفذپذیری غشای اندامک میتکندری بهسیله آزادسازی سیتکرم سپس کاسپاز- c 3 پرتئینهای Bax Bak شرع شده مجب از آن در نهایت فعالشدن کاسپاز 9 میشد. عاله بر این پرتئینهای Bcl2 Bclxl با قرار گرفتن در سطح شبکه اندپالسمی میتکندری هسته از کنار هم قرارگرفتن پرتئینهای Bax Bak جلگیری کرده فعالیت آ پ پتزی نشان میدهند. در این مطالعه د ژن مهم درگیر با فرآیند آپپتز ( Bax ) در سللهای تیمارشده Bcl2 با اسانس بررسی شدند )30(. در مطالعه حاضر سم یت سللی سللهای سرطانی کلن )( مرتبط با فرآیند آپپتز بد که نتیجه امیدارکنندگی داشت. همچنین در این مطالعه اثرات اسانس گیاه در افزایش بیان ژن در Bcl2 ژن پرآپپتتیک Bax کاهش بیان سللهای سرطانی کلن القای مرگ برنامهریزیشده سللی نشان داده شد بنابراین بررسیهای بیشتری الزم است تا بتان اثبات کرد "آیا پرفایل بیانی mrna 6 این ژنها میتاند مدرکی برای نقش آن در پیشگیی اختصاصی دقیقتر پاسخ سرطان به درمان باشد " باید تجه داشت بیشتر مطالعات سالهای اخیر در جهت یافتن دارهای ضدسرطانی است تا بتان با استفاده از این دارها آپپتز را در سللهای سرطانی القا بدن ایجاد التهاب آنها را فاگسیته کرده در نهایت از بین برد. مجله دانشگاه علم پزشکی قم/ دره دازدهم شماره سم خرداد 397

9 بررسی ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه هلیکریزم آرتمیزییئیدس اثرات ضدمیکربی... نسرین جاید تبریزی همکاران سپیده پیرزمند همکاران... نتیجهگیری بهطرکلی نتایج این مطالعه نشان داد اسانس گیاه.H artemisiodes دارای اثرات بیلژیک چشمگیر ضدباکتریایی ضدسرطانی است. بنابراین پیشنهاد میشد مطالعات بیشتری در مرد خاص زیستی ترکیبات شناساییشده انجام گیرد تا اهمیت پزشکی این گیاه بیشتر مشخص گردد بهعنان یک ترکیب ضدسرطانی ضدباکتریایی امیدبخش به مراکز داریی پیشنهاد شد. تشکر قدردانی این مطالعه حاصل بخشی از پایاننامه دانشجیی سپیده پیرزمند احد علم داریی دانشگاه آزاد اسالمی است که از اردیبهشت تا مهرماه سال 395 انجام گرفت. بدینسیله از تالش همکاران بهخصص جناب آقای حسن نربازرگان تمام کسانیکه در انجام این پرژه همکاری نمدهاند تشکر قدردانی مینماییم. References:. Petrovska BB. Historical review of medicinal plants' usage. Pharmacogn Rev 202;6(): Kong JM, Goh NK, Chia LS, Chia TF. Recent advances in traditional plant drugs and orchids. Acta Pharmacol Sin 2003;24(): Hossain MM. Therapeutic orchids: traditional uses and recent advances--an overview. Fitoterapia 20;82(2): Hansen SC, Stolter C, Imholt C, Jacob J. Plant secondary metabolites as rodent repellents: A systematic review. J Chem Ecol 206;42(9): Perricone M, Arace E, Corbo MR, Sinigaglia M, Bevilacqua A. Bioactivity of essential oils: A review on their interaction with food components. Front Microbiol 205;6: Solórzano-Santos F, Miranda-Novales MG. Essential oils from aromatic herbs as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol 202;23(2): Bassolé IH, Juliani HR. Essential oils in combination and their antimicrobial properties. Molecules 202;7(4): Radulović NS, Blagojević PD, Stojanović-Radić ZZ, Stojanović NM. Antimicrobial plant metabolites: structural diversity and mechanism of action. Curr Med Chem 203;20(7): Tariq A, Mussarat S, Adnan M. Review on ethnomedicinal, phytochemical and pharmacological evidence of Himalayan anticancer plants. J Ethnopharmacol. 205;22;64: Migliore L, Migheli F, Spisni R, Coppedè F. Genetics, cytogenetics, and epigenetics of colorectal cancer. J Biomed Biotechnol 20;20: Tariq K, Ghias K. Colorectal cancer carcinogenesis: a review of mechanisms. Cancer Biol Med 206;3(): Al-Sohaily S, Biankin A, Leong R, Kohonen-Corish M, Warusavitarne J. Molecular pathways in colorectal cancer. J Gastroenterol Hepatol 202;27(9): Sudhakar A. History of cancer, ancient and modern treatment methods. J Cancer Sci Ther 2009;(2): Greenwell M, Rahman PK. Medicinal plants: Their use in anticancer treatment. Int J Pharm Sci Res 205;6(0): Gillings MR, Paulsen IT, Tetu SG. Genomics and the evolution of antibiotic resistance. Ann N Y Acad Sci 207;388(): مجله دانشگاه علم پزشکی قم/ دره دازدهم شماره سم خرداد 397

10 بررسی ترکیبات شیمیایی اسانس گیاه هلیکریزم آرتمیزییئیدس اثرات ضدمیکربی... سپیده پیرزمند همکاران نسرین جاید تبریزی همکاران Arif T, Bhosale JD, Kumar N, Mandal TK, Bendre RS, Lavekar GS, et al. Natural products--antifungal agents derived from plants. J Asian Nat Prod Res 2009;(7): Leonardi M, Ambryszewska KE, Melai B, Flamini G, Cioni PL, Parri F, et al. Essential-oil composition of Helichrysum italicum (ROTH) G.DON ssp. italicum from Elba Island (Tuscany, Italy). Chem Biodivers 203;0(3): Antunes Viegas D, Palmeira-de-Oliveira A2, Salgueiro L3, Martinez-de-Oliveira J4, Palmeira-de-Oliveira R. Helichrysum italicum: from traditional use to scientific data. J Ethnopharmacol 204;5(): Bhalla Y, Gupta VK, Jaitak V. Anticancer activity of essential oils: A review. J Sci Food Agric 203;93(5): Du E, Gan L, Li Z, Wang W, Liu D, Guo Y. In vitro antibacterial activity of thymol and carvacrol and their effects on broiler chickens challenged with Clostridium perfringens. J Anim Sci Biotechnol 205;6: Rivas da Silva AC, Lopes PM, Barros de Azevedo MM, Costa DC, Alviano CS, Alviano DS. Biological activities of α-pinene and β-pinene enantiomers. Molecules 202;7(6): Javidnia K, Miri R, Soltani M, Khosravi AR. Essential oil composition of two Iranian Endemic Helichrysum Miller. Species (H. leucocephalum Boiss. and H. artemisioides Boiss. et Hausskn.). J Essent Oil Res 2009;2(): Mastelić J, Politeo O, Jerković I. Contribution to the analysis of the essential oil of Helichrysum italicum (Roth) G. Don. Determination of ester bonded acids and phenols. Molecules 2008;3(4): Freires IA, Denny C, Benso B, de Alencar SM, Rosalen PL. Antibacterial activity of essential oils and their isolated constituents against cariogenic bacteria: A systematic review. Molecules 205;20(4): Burt S. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods--a review. Int J Food Microbiol 2004;94(3): Lesgards JF, Baldovini N, Vidal N, Pietri S. Anticancer activities of essential oils constituents and synergy with conventional therapies: A review. Phytother Res 204;28(0): Bakkali F, Averbeck S, Averbeck D, Idaomar M. Biological effects of essential oils--a review. Food Chem Toxicol 2008;46(2): Afoulous S, Ferhout H, Raoelison EG, Valentin A, Moukarzel B, Couderc F, et al. Helichrysum gymnocephalum essential oil: chemical composition and cytotoxic, antimalarial and antioxidant activities, attribution of the activity origin by correlations. Molecules 20;6(0): Bigović D, Savikin K, Janković T, Menković N, Zdunić G, Stanojković T, et al. antiradical and cytotoxic activity of different helichrysum plicatum flower extracts. Nat Prod Commun 20;6(6): Bilia AR, Guccione C, Isacchi B, Righeschi C, Firenzuoli F, Bergonzi MC. Essential oils loaded in nanosystems: A developing strategy for a successful therapeutic approach. Evid Based Complement Alternat Med 204;204: مجله دانشگاه علم پزشکی قم/ دره دازدهم شماره سم خرداد 397 8