ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ. Σωτήρης Τσάκας

ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Σωτήρης Τσάκας ΠΑΤΡΑ 2018

2

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Γενική αίματος Επίχρισμα αίματος Χρώση και παρατήρηση κυτταρικών τύπων Ομάδα αίματος Διερεύνηση φλεμονής C αντιδρώσα πρωτεΐνη Ταχύτητα καθίζησης ερυθρών Έλεγχος νεφρικών λειτουργιών Γενική ούρων stick ούρων Γενική ούρων μικροσκοπική παρατήρηση Χημική ανάλυση ουρόλιθου Διερεύνηση αναιμίας Ηλεκτροφορητική ανάλυση αιμοσφαιρινών Έλεγχος παραγωγής αντισωμάτων έναντι παράγοντα Rhesus Έμμεση Coombs 3

4

ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι αναλύσεις οι οποίες επιλέχθηκαν για το πρακτικό μέρος του μαθήματος «Κλινικό Εργαστήριο» είναι μερικές από αυτές που εφαρμόζονται σήμερα σε ένα τέτοιο χώρο. Στο φυλλάδιο εργαστηριακών ασκήσεων αναφέρεται επιγραμματικά η θεωρία κάθε άσκησης, αφού ο φοιτητής μπορεί να ανατρέξει για περισσότερες λεπτομέρειες στις σημειώσεις του μαθήματος. Στόχος τόσο του μαθήματος όσο και του Εργαστηρίου κυρίως, είναι να έχει τη αίσθηση ο φοιτητής, έστω και για λίγο ότι βρίσκεται πράγματι, σε ένα Κλινικό Εργαστήριο και είναι υπεύθυνος για το αποτέλεσμα που θα δώσει. Κάτι που μπορεί να συμβεί και στην πραγματικότητα μετά από δύο χρόνια. Το φυλλάδιο περιλαμβάνει 3 ασκήσεις. Όμως προηγείται μια άσκηση επίδειξης βασισμένη στα κεφάλαια 1-4 των σημειώσεων του μαθήματος. Όλες οι ασκήσεις είναι υποχρεωτικές και απουσία σε μια από αυτές αφαιρεί το δικαίωμα συμμετοχής στις τελικές εξετάσεις. Στις 3 εργαστηριακές ασκήσεις είναι υποχρεωτική η εργαστηριακή ρόμπα. Πριν την έναρξη των ασκήσεων θα έχει προηγηθεί σεμινάριο για το χειρισμό των δειγμάτων και των κανόνων ασφαλείας. Η βαθμολογία των Εργαστηρίων θα είναι το αποτέλεσμα της συνεχούς προφορικής εξέτασης κατά τη διάρκεια μιας άσκησης, καθώς και μιας σύντομης γραπτής δοκιμασίας. Μη προβιβάσιμη βαθμολογία σε 2 από τα 4 εργαστήρια αφαιρεί το δικαίωμα συμμετοχής στις τελικές εξετάσεις, αφού η επιτυχής παρουσία στα εργαστήρια είναι προαπαιτούμενο. Η ύλη των εργαστηριακών ασκήσεων συμπεριλαμβάνεται στην εξεταστέα ύλη του μαθήματος. 5

6

ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΣΚΗΣΗ 1 Γενική αίματος Επίχρισμα αίματος Χρώση και παρατήρηση κυτταρικών τύπων Διερεύνηση φλεγμονής C αντιδρώσα πρωτεΐνη (CRP) Ταχύτητα καθίζησης ερυθρών Ομάδα αίματος 7

8

Γενική αίματος Με τον όρο γενική αίματος εννοούμε την εξέταση δείγματος από περιφερικό αίμα που δίνει πληροφορίες τόσο για τον αριθμό των κυτταρικών τύπων όσο και για το μέγεθος και το σχήμα τους. Το αίμα, μέσω των έμμορφων συστατικών του, επιτελεί τρεις πολύ σημαντικές λειτουργίες: α) μεταφορά οξυγόνου στους ιστούς με τα ερυθρά αιμοσφαίρια, β) φαγοκυττάρωση και παραγωγή αντισωμάτων από τα λευκά αιμοσφαίρια και γ) συμμετοχή στην πήξη του αίματος με τα αιμοπετάλια. Σήμερα, η γενική αίματος γίνεται αρχικά σε αυτόματο αιματολογικό αναλυτή και δίνει πληροφορίες για αριθμό ερυθρών, λευκών και αιμοπεταλίων, αιματοκτρίτη, συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης καθώς και διάφορα υπολογιστικά μεγέθη, που αφορούν τον όγκο των ερυθρών και την περιεχόμενη αιμοσφαιρίνη σε αυτά (εικόνα 1). Εικόνα 1. Έκθεση αποτελεσμάτων γενικής αίματος από αιματολογικό αναλυτή Όταν όμως παρουσιαστούν στη έκθεση των αποτελεσμάτων του αιματολογικού αναλυτή σημαντικές ανωμαλίες, σε έναν ή περισσότερους κυτταρικούς πληθυσμούς, ακολουθεί οπτική επιβεβαίωση, που γίνεται με μικροσκοπική παρατήρηση επιχρίσματος περιφερικού αίματος σε αντικειμενοφόρο πλάκα ή κοινώς πλακάκι. Στην εξέταση αυτή επίχρισμα αίματος απλώνεται σε λεπτή στιβάδα σε αντικειμενοφόρο πλάκα (εικόνα 2) και αφού στεγνώσει, βάφεται με ειδικές χρωστικές. Ο κλινικός ιατρός, Βιοπαθολόγος ή Αιματολόγος, που φέρει και την ευθύνη των αποτελεσμάτων, εκτιμά στη συνέχεια τα φυσικά χαρακτηριστικά των ερυθρών και των λευκών αιμοσφαιρίων στο μικροσκόπιο. 9

Ερυθρά αιμοσφαίρια (RBC) Τα ερυθρά αιμοσφαίρια είναι κύτταρα με σχήμα αμφίκοιλου φακού και στο μικροσκόπιο εμφανίζονται με ελαφρά κόκκινο χρώμα. Η γενική αίματος μας δίνει πληροφορίες για τη συγκέντρωση των ερυθρών αιμοσφαιρίων και εάν ο πληθυσμός των ερυθρών αιμοσφαιρίων είναι ο φυσιολογικός, τόσο μορφολογικά όσο και στην περιεκτικότητα του σε αιμοσφαιρίνη. Σε φυσιολογικές καταστάσεις τα ερυθρά αιμοσφαίρια έχουν όλα το ίδιο μέγεθος και σχήμα. Αλλαγές παρατηρούνται σε έλλειψη βιταμίνης Β12 και φυλικού οξέως, σε έλλειψη σιδήρου και σε παρουσία μη φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης. Ένα άτομο μπορεί να έχει ερυθρά αιμοσφαίρια με φυσιολογικό μέγεθος και σχήμα αλλά είναι λιγότερα στον αριθμό, είτε λόγω αναιμίας είτε λόγω απώλειας αίματος. Σε αντίθετη περίπτωση, μπορεί στο αίμα να κυκλοφορούν πολύ περισσότερα ερυθρά αιμοσφαίρια (ερυθραιμία ή ερυθροκυττάρωση), γεγονός που μπορεί νε οδηγήσει σε παρεμπόδιση της φυσιολογικής ροής του αίματος. σταγόνα αίματος Εικόνα 2. Στάδια παρασκευής επιχρίσματος αίματος Λευκά αιμοσφαίρια (WBC) Τα λευκά αιμοσφαίρια είναι υπεύθυνα για την προστασία του οργανισμού από την εισβολή μικροοργανισμών και επιβλαβών ουσιών. Διακρίνονται σε πέντε κατηγορίες: ουδετερόφιλα, λεμφοκύτταρα, βασεόφιλα, ηωσινόφιλα και μονοπύρηνα. Η αναλογία των πέντε τύπων των λευκών αιμοσφαιρίων είναι σταθερή και μεταβάλλεται ανάλογα σε κάθε νοσογόνο κατάσταση. Έτσι μια λοίμωξη μπορεί να επάγει την παραγωγή ουδετερόφιλων σε μεγάλη συγκέντρωση για να καταπολεμηθεί το βακτήριο-εισβολέας. Στις αλλεργίες αυξάνεται ο αριθμός των ηωσινόφιλων που απελευθερώνουν αντιισταμινικές ουσίες για να ελαχιστοποιήσουν την αλλεργική αντίδραση. Τα λεμφοκύτταρα επάγονται για να παράγουν αντισώματα. Σε παθολογικές 10

καταστάσεις, όπως η λευχαιμία, (βλαστοκύτταρα) ενώ αυξάνεται και ο αριθμός. εμφανίζονται πρόδρομες μορφές λευκών αιμοσφαιρίων Αιμοπετάλια Τα αιμοπετάλια είναι ειδικά κυτταρικά θραύσματα που συμμετέχουν στην πήξη του αίματος. Ασθενής που δεν έχει αρκετά αιμοπετάλια, έχει αυξημένο κίνδυνο για σοβαρή αιμορραγία. Στη γενική αίματος μετράμε τον αριθμό και το μέγεθος των αιμοπεταλίων. Σε κάποιες περιπτώσεις, στη γενική αίματος καταγράφεται αυξημένο μέγεθος αιμοπεταλίων που μπορεί να οφείλεται σε συσσώρευση τους, με αποτέλεσμα να μην είναι αξιόπιστη καταμέτρησή τους από τον αναλυτή. Στην περίπτωση αυτή επιβάλλεται η εξέταση επιχρίσματος περιφερικού αίματος. Διερεύνηση φλεγμονής Η φλεγμονή (inflammation) είναι ένα σύνολο διεργασιών, σε ένα ιστό, ως αντίδραση σε κάποια βλάβη. Τα συμπτώματά της φλεγμονής είναι οίδημα, ερυθρότητα, πόνος και πολλές φορές πυρετός. Η οξεία φλεγμονή (acute inflammation), όπως μια παιδική ασθένεια ή σκωλικοειδίτιδα, συνήθως συνοδεύεται από αύξηση των πολυμορφοπύρηνων κυττάρων στο αίμα, αύξηση της C- αντιδρώσας πρωτεΐνης (CRP) στον ορό και αύξηση της ταχύτητας καθίζησης των ερυθρών αιμοσφαιρίων (ΤΚΕ). Παράλληλα, τόσο στη χρόνια όσο και στην οξεία φλεγμονή, ως απόκριση του οργανισμού, παρουσιάζεται αλλοίωση του ηλεκτροφορητικού προτύπου των πρωτεϊνών του ορού (εικόνα 3). A B Εικόνα 3. A. Φυσιολογικό πρότυπο ηλεκτροφορητικής ανάλυσης πρωτεϊνών ορού Β. Αυξημένο κλκάσμα α2 σε περίπτωση φλεγμονής Ταχύτητα καθίζησης ερυθρών Σε ένα δείγμα αίματος, σε ηρεμία, τα ερυθρά καθιζάνουν λόγω βάρους με την πάροδο του χρόνου. Το ύψος της στήλης του πλάσματος σε mm μετά από 1 h ονομάζεται ταχύτητα καθίζησης ερυθρών. Η ταχύτητα καθίζησης ερυθρών είναι μια εύκολη, απλή και οικονομική εξέταση που συνήθως συνοδεύει ένα παραπεμπτικό γενικής αίματος. Μια αυξημένη τιμή σε αυτή 11

την εξέταση δημιουργεί υποψίες για την ύπαρξη κάποιας φλεγμονής, λοίμωξης ή γενικά μιας διαταραχής στην ισορροπία του οργανισμού. CRP (C-αντιδρώσα πρωτεΐνη) Ο πιο γρήγορος τρόπος για την ταυτοποίηση και την παρακολούθηση της πορείας μιας φλεγμονής είναι ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της στον ορό. Μέχρι πρότινος αυτό γινόταν αποκλειστικά με ανοσοσυγκόλληση, όμως τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιούνται μέθοδοι που βασίζονται στη νεφελομετρία και γίνονται σε βιοχημικό αναλυτή. Αρχή της ανοσοσυγκόλλησης Η ανοσοσυγκόλληση χρησιμοποιεί πολυμερή σφαιρίδια που φέρουν στην επιφάνεια τους αντισώματα έναντι της CRP. Η ανάμιξη αντιδραστηρίου σφαιριδίων με ίση ποσότητα ορού δίνει αναοσοσυγκόλληση, σε συγκεντρώσεις CRP πάνω από το φυσιολογικό όριο των 0,6 μg/ml. Για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό της συγκέντρωσης της, χρησιμοποιούμε υποδιπλασιαζόμενες αραιώσεις ορού μέχρι να προσδιοριστεί η μέγιστη αραίωση που δίνει ανοσοσυγκόλληση. Στην περίπτωση αυτή η συγκέντρωση της CRP ισούται με τι γινόμενο 0,6 μg/ml επί το συντελεστή αραίωσης. Ομάδα αίματος Στην επιφάνεια των ερυθρών αιμοσφαιρίων μπορεί να υπάρχουν τρία αντιγόνα, τα Α, Β, Ο των οποίων τα γονίδια είναι αλληλόμορφα και βρίσκονται στον ίδιο γενετικό τόπο σε κάθε ένα από δύο ομόλογα χρωμοσώματα. Έτσι κάθε ζεύγος χρωμοσωμάτων φέρει οποιαδήποτε δύο από τα τρία γονίδια. Τα Α και Β έχουν ισχυρά αντιγονικό χαρακτήρα και τα γονίδια τους χαρακτηρίζονται ως υπερέχοντα, ενώ το Ο συμπεριφέρεται ως υποτελές. Αποτέλεσμα είναι η ύπαρξη 4 φαινοτύπων (6 γονοτύπων), Α (ΑΟ ή ΑΑ), Β (ΒΟ ή ΒΒ), ΑΒ (ΑΒ), Ο (ΟΟ). Όταν τα ερυθρά αιμοσφαίρια φέρουν τα αντιγόνα είτε Α είτε Β, τα αντίστοιχα αντισώματα απουσιάζουν από τον ορό. Αντίθετα η απουσία αντιγόνων έχει ως αποτέλεσμα την παρουσία αντισωμάτων γι αυτά. Το σύστημα Rhesous (Rh) είναι το άλλο κύριο σύστημα ομάδας αίματος. Και εδώ υπάρχουν διάφορα αλληλόμορφα γονίδια, αλλά μόνο ένα αντιγόνο, το Rh o, είναι αυτό που έχει κατά πολύ τη μεγαλύτερη αντιγονικότητα και καθορίζει ένα άτομο ως Rh(+). Το γονίδιο αυτό έχει υπερέχοντα χαρακτήρα και είτε σε ομοζυγωτία είτε σε ετεροζυγωτία έχει φαινότυπο (+). Ο έλεγχος της ομάδας αίματος (εικόνα 4) γίνεται σε ολικό αίμα με τη χρήση αντιορών, που περιέχουν αντι-α, για την ταυτοποίηση ομάδας Α, αντι-β για την ταυτοποίηση ομάδας Β και αντι-d για τον παράγοντα Rhesus. Η πρόκληση συγκόλλησης ερυθρών είναι δείκτης της ύπαρξης Α ή και Β ή και Rh, ενώ η απουσία συγκόλλησης είναι ένδειξη απουσίας αντιγόνων Α, Β ή Rh. 12

Εικόνα 4: Η παρουσία αιμοσυγκόλλησης μόνο στη θέση 3 είναι ένδειξη ομάδας αίματος Ο(+). 13

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Φλεβικό αίμα σε σωληνάκι με αντιπηκτικό K 2 EDTA Φλεβικό αίμα σε σωληνάκι με αντιπηκτικό οξαλικά ιόντα Ορός Αντικειμενοφόρες πλάκες και καλυπτρίδες Γάντια Δοχεία χρώσης Μεθανόλη Χρωστική May-Grünwall Χρωστική Giesma Μικροσκόπιο Σωλήνες καθίζησης Αντιδραστήριο CRP Αντιοροί αντι-α, αντι-β, αντι-d ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΕΠΙΧΡΙΣΜΑΤΟΣ Τοποθετείστε μια μικρή ποσότητα αίματος (10 μl) στην άκρη μιας αντικειμενοφόρου πλάκας. Φέρτε σε επαφή με το αίμα την μικρή πλευρά μιας άλλης αντικειμενοφόρου, την οποία στην συνέχεια σύρετε υπό γωνία 30 ο -40 ο προς την άλλη άκρη ώστε να απλώσετε τη σταγόνα αίματος όπως φαίνεται στο σχήμα. Αφήστε το παρασκεύασμα να στεγνώσει για 15-20 min. ΧΡΩΣΗ Τοποθέτηση δειγμάτων σε δοχείο με μεθανόλη για 5 min. Μεταφορά δειγμάτων σε δοχείο με χρωστική May- Grünwall Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης Μεταφορά δειγμάτων σε δοχείο με χρωστική Giemsa Ξέπλυμα με άφθονο νερό βρύσης Στέγνωμα και επικάλυψη με μια σταγόνα γλυκερόλης Τοποθέτηση καλυπτρίδας ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ Παρατηρείστε τα παρασκευάσματα στο μικροσκόπιο με αντικειμενικό φακό 40x. Προσπαθήστε να αναγνωρίσετε τους διάφορους τύπους των λευκών αιμοσφαιρίων. Παρατηρήστε τα ερυθρά αιμοσφαίρια και τα αιμοπετάλια 14

ΤΑΧΥΤΗΤΑ ΚΑΘΙΖΗΣΗΣ ΕΡΥΘΡΩΝ Σε σωληνάκι με αίμα τοποθετήστε κατάλληλα το σωληνάκι καθίζησης. Παρατηρήστε πως γεμίζει με αίμα και αφήστε σε ηρεμία για 1 h σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, καταγράψτε το ύψος του πλάσματος στην κορυφή της στήλης. ΗΜIΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ CRP Σε κατάλληλο λευκό πλακίδιο τοποθετούμε 30 μl ορό και 30 μl αντιδραστήριο Αναμιγνύουμε με τη βοήθεια ενός κίτρινου ρύγχους από πιπέτα Τοποθετούμε το πλακίδιο σε αναδευτήρα Ελέγχουμε το δείγμα μας για κροκίδωση μετά 3-4 min Σε περίπτωση κροκίδωσης επαναλαμβάνω με υποδιπλασιαζόμενες ποσότητες ορού Με βάση το συντελεστή αραίωσης του τελευταίου δείγματος που κροκιδώθηκε υπολογίστε τη συγκέντρωση της CRP ΟΜΑΔΑ ΑΙΜΑΤΟΣ Σε λευκή αντικειμενοφόρο πλάκα τοποθετείστε τρεις σταγόνες αίμα των 20 μl Σε κάθε μια από αυτές προσθέστε 20 μl από κάθε αντιορό, αντίστοιχα Αναμείξτε και παρατηρείστε αν δημιουργηθεί αιμοσυγκόλληση από την αντίδραση Ag-Ab 15

ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΣΚΗΣΗ 2 Έλεγχος νεφρικών λειτουργιών Γενική ούρων stick ούρων Γενική ούρων μικροσκοπική παρατήρηση Χημική ανάλυση ουρόλιθου 16

17

Έλεγχος νεφρικών λειτουργιών Οι νεφροί παίζουν σημαντικό ρόλο στην ομοιόσταση του οργανισμού, αφού ρυθμίζουν το ισοζύγιο ύδατος, τη συγκέντρωση βασικών ηλεκτρολυτών και την απομάκρυνση τοξικών ουσιών. Επίσης συμμετέχουν στη ρύθμιση της αιμοποίησης με την παραγωγή ερυθροποιητίνης, στη ρύθμιση της πίεσης του αίματος με την παραγωγή ρενίνης και στο μεταβολισμό ασβεστίου με την τελική υδροξυλίωση και ενεργοποίηση της Βιταμίνης D. Με βάση αυτά τα δεδομένα, εξωκρινική ή ενδοκρινική δυσλειτουργία των νεφρών σημαίνει αυτόματα εμφάνιση αναιμίας, υπέρτασης και τοξικότητας, όχι απαραίτητα με αυτή τη σειρά, με ό,τι επιπλοκές μπορεί να εμφανιστούν σε άλλα όργανα. Ο αρχικός έλεγχος των νεφρικών λειτουργιών περιλαμβάνει τη γενική εξέταση ούρων και την ικανότητα απέκκρισης τοξικών ουσιών. Εικόνα 5. Γενική ούρων με stick Γενική ούρων Η γενική ούρων ξεκινάει με τη μακροσκοπική εικόνα ενός δείγματος πρωινών ούρων και αφορά το χρώμα (κιτρινωπό, κοκκινωπό, κίτρινο ιριδίζον) και τη διαύγεια ή τη θολερότητα του. Στη συνέχεια ακολουθεί προσδιορισμός διαφόρων παραμέτρων με τα λεγόμενα stick ούρων (εικόνα 5). Αυτά είναι πλαστικές ταινίες που φέρουν στην επιφάνεια τους αντιδραστήρια ξηράς χημείας για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό ασκορβικού οξέος, γλυκόζης, χολερυθρίνης, κετονοσωμάτων, ειδικού βάρους, αιμοσφαιρίνης, ph, πρωτεϊνών, ουροχολινογόνου, νιτρωδών αλάτων και παρουσίας λευκών αιμοσφαιρίων. Πιο αναλυτικά: ασκορβικό οξύ γλυκόζη διαβήτης Χολερυθρίνη χολική απόφραξη κετονοσώματα κακός μεταβολισμός υδατανθράκων - νηστεία ειδικό βάρος ένδειξη συμπυκνωτικής ικανότητας νεφρών αίμα-αιμοσφαιρίνη απώλεια αίματος ή αιμόλυση 18

ph φυσιολογικό ph ούρων είναι όξινο 5,0-6,0 πρωτεΐνες ένδειξη σπειραματικής ή σωληναριακής βλάβης ουροχολινογόνο βακτήρια στο έντερο νιτρώδη άλατα ουρολοίμωξη λευκά αιμοσφαίρια πύον, λοίμωξη, φλεγμονή Σε περίπτωση που ένας από τους παραπάνω δείκτες είτε μακροσκοπικά είτε στο stick, φανεί μη φυσιολογικός, ακολουθεί μικροσκοπική παρατήρηση του ιζήματος των ούρων μετά από φυγοκέντρηση. Η μικροσκοπική παρατήρηση αφορά παρουσία ερυθρών και λευκών αιμοσφαιρίων, κρυσταλλικών σχηματισμών από άλατα, κυλίνδρων, επιθηλιακών κυττάρων και μικροοργανισμών (εικόνα 6). Η παρατήρηση πρέπει να εστιάζεται περιμετρικά του παρασκευάσματος, όπου λόγω βάρους παρασύρονται οι παραπάνω παράγοντες. Η γενική ούρων χαρακτηρίζεται από τους νεφρολόγους ως η βιοψία του φτωχού γιατί ουσιαστικά με χαμηλό κόστος, απλά και εύκολα μπορεί να δώσει πληροφορίες, οι οποίες με την κατάλληλη ερμηνεία μπορούν να οδηγήσουν στη διάγνωση για την παθολογική κατάσταση των νεφρών. Πιο αναλυτικά: ερυθρά αιμοσφαίρια απώλεια αίματος λευκά αιμοσφαίρια φλεγμονή σπειραματονεφρίτιδα κρύσταλλοι αλάτων κίνδυνος δημιουργίας ουρόλιθοων κύλινδροι σωληναριακή βλάβη επιθηλιακά κύτταρα μικροοργανισμοί ουρολοίμωξη Α Β Εικόνα 6. Κύλινδρος ερυθρών αιμοσφαιρίων (Α) και κρύσταλλοι οξαλικού οξέος (Β) 19

Χημική ανάλυση ουρόλιθου Οι ουρόλιθοι (urinary calculi) ή νεφρικοί λίθοι, είναι συμπαγείς μάζες κρυσταλλικών αλάτων που δημιουργούνται και αναπτύσσονται μέσα στο νεφρό. Το πρώτο βήμα για το σχηματισμό τους είναι η δημιουργία ενός πυρήνα (core). Ιόντα που διηθούνται στα ούρα από τους νεφρούς, όπως το ασβέστιο και τα οξαλικά, ενώνονται και σχηματίζουν κρυσταλλικούς σχηματισμούς από στερεά αδιάλυτα άλατα. Οι σχηματισμοί ταξιδεύουν μέσω του νεφρώνα και εναποθέτονται συνήθως στους νεφρικούς θύλακες. Οι κρύσταλλοι κολλούν μεταξύ τους, σχηματίζοντας μεγάλα συσσωματώματα και μάλιστα πολύ γρήγορα. Οι ουρόλιθοι συνεχίζουν να αναπτύσσονται στο νεφρό και να διογκώνονται αυξάνοντας το μέγεθος τους μέχρι και 4-6 mm. Συνήθως αποκολλώνται και μετακινούνται προς στον ουρητήρα. Εκεί μπορεί να ακινητοποιηθούν προκαλώντας απόφραξη των σωληναρίων και πόνο (κολικός του νεφρού). Στη συνέχεια περνούν στην ουροδόχο κύστη και απεκκρίνονται από τον οργανισμό με την ούρηση. Οι συνηθέστεροι ουρόλιθοι αποτελούνται από οξαλικό ασβέστιο, εναμμώνιο φωσφορικό μαγνήσιο, ουρικό οξύ, φωσφορικό ασβέστιο, φωσφορικό μαγνήσιο και ανθρακικό ασβέστιο. Ο πιο συνηθισμένος είναι εκείνος του οξαλικού ασβεστίου. Στις περιπτώσεις που το μέγεθος των ουρολίθων ξεπεράσει κάποιο όριο, σφηνώνουν και δεν μπορούν να μετακινηθούν, συνεχίζουν να διογκώνονται και απαιτείται λιθοτριψία ή και χειρουργείο για την αφαίρεση τους. Η ανάλυση ενός ουρόλιθου γίνεται σε τρία στάδια: στην κονιορτοποίηση του σε ιγδίο από αχάτη μέχρι να γίνει πάρα πολύ λεπτή σκόνη στη διαλυτοποίησης μέρους της σκόνης σε 1,6 Ν HCl και χημική ανάλυση με εξειδικευμένες αντιδράσεις για συγκεκριμένα ιόντα (πίνακας 1) Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά ανιόντα και κατιόντα Ανιόντα Κατιόντα Οξαλικά [(COO) 2 2- ] Ασβέστιο (Ca 2+ ) Ανθρακικά (CO 3 2- ) Μαγνήσιο (Mg 2+ ) Ουρικό (C 5 H 3 N 4 O 3 - ) Αμμώνιο (NH 4 + ) Φωσφορικά (PO 4 3- ) Το αποτέλεσμα της ανάλυσης του ουρόλιθου προκύπτει από το συνδυασμό ανιόντων και κατιόντων τα οποία δίνουν θετική μια χαρακτηριστική αντίδραση. 20

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ Δείγματα ούρων (πρωινή συλλογή) Stick ούρων Κλινική φυγόκεντρος Σωληνάκια φυγοκέντρου Ρυθμιζόμενες πιπέτες 10-100 μl, 100-1000 μl Σωληνάρια Falcon Σωληνάρια RIA Αντικειμενοφόρες πλάκες Καλυπτρίδες Δείγματα ουρολίθων Αντιδραστήρια για ανίχνευση συγκεκριμένων ιόντων STICK ΟΥΡΩΝ Βυθίστε από μια ταινία (stick) ούρων σε κάθε δείγμα ούρων και αφού αφήσετε να απομακρυνθεί η περίσσεια υγρού ακουμπήστε την στο στόμιο του δοχείου. Μετά από 3-5 λεπτά καταγράψτε την αλλαγή του χρώματος και κάντε την αντιστοίχιση για τον ημιποσοτικό προσδιορισμό. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΚΗ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΗ ΙΖΗΜΑΤΟΣ ΟΥΡΩΝ Μεταφέρετε σε πλαστικό σωληνάκι Falcon 10 ml ούρων. Φυγοκεντρήστε για 5 λεπτά σε 2.500 στροφές. Αδειάστε το υπερκείμενο χωρίς να στραγγίσετε. Επαναιωρείστε το ίζημα στη μικρή ποσότητα υγρού που έχει μείνει στο σωληνάκι. Μεταφέρετε 50 μl σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα και Παρατηρείστε στο μικροσκόπιο με φακό 40Χ. ΧΗΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΟΥΡΟΛΙΘΟΥ Κονιορτοποίηση του ουρόλιθου σε πάρα πολύ λεπτή σκόνη Μεταφορά 25 mg σκόνης σε σωληνάριο RIA Διαλυτοποίηση σε 150 μl αντιδραστηρίου R1 (1,6 N HCl): Διάλυμα Μ1 Μεταφορά ποσότητας 10 μl από το διάλυμα Μ1 σε αντικειμενοφόρο πλάκα Προσθήκη αντιδραστηρίων σύμφωνα με τον πίνακα 1 Παρατήρηση και καταγραφή των θετικών αποτελεσμάτων 21

Πίνακας 2. Βήματα χημικής ανάλυσης ουρόλιθου Βήμα 1 Βήμα 2 Βήμα 3 Βήμα 4 Βήμα 5 Βήμα 6 Βήμα 7 Βήμα 8 HCO3 - ΚΥΣΤΙΝΗ P Mg Ca NH4 + ΟΥΡΙΚΟ ΟΞΑΛΙΚΑ Σκόνη λίθου 25 mg Μ1 10 μl Μ1 10 μl Μ1 10 μl Μ2 10 μl Μ1 10 μl Μ1 10 μl Μ1 υπόλοιπο R1 250 μl R3 10 μl R5 20 μl R6 10 μl R2 10 μl R2 10 μl R2 10 μl R10 60 mg = M1 5 min ανάμιξη R2 50 μl R7 20 μl R8 10 μl R9 10 μl R4 10 μl 5 min ανάμιξη ανάμιξη ανάμιξη ανάμιξη Θετικό αποτέλεσμα Αφρισμός Κόκκινο χρώμα Μπλε χρώμα Μπλε ίζημα Κίτρινο χρώμα Καφέ ίζημα Πορτοκαλί χρώμα Αφρισμός Αρνητικό αποτέλεσμα Απουσία αφρισμού Κίτρινο χρώμα Καμία αλλαγή Μωβ χρώμα Πορτοκαλί χρώμα Κίτρινο χρώμα Καμία αλλαγή Απουσία αφρισμού 22

ΚΛΙΝΙΚΟ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΣΚΗΣΗ 3 Διερεύνηση αναιμίας Ηλεκτροφορητική ανάλυση αιμοσφαιρινών Έλεγχος παραγωγής αντισωμάτων για τον παράγοντα Rhesus Έμμεση Coombs 23

24

ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ Η αιμοσφαιρίνη (hemoglobin, Hb) είναι η κύρια πρωτεΐνη των ερυθρών αιμοσφαιρίων, η οποία δεσμεύει οξυγόνο από τους πνεύμονες και το μεταφέρει στους ιστούς. Η σύνθεση της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης Hb A, στα ενήλικα άτομα, είναι του τύπου α 2 β 2. Εκτός από τις αμινοξικές αντικαταστάσεις σε αλυσίδες της φυσιολογικής αιμοσφαιρίνης, μη φυσιολογικά μόρια δημιουργούνται και από τη αντικατάσταση και των δύο β αλυσίδων από άλλες, με εντελώς διαφορετική αμινοξική αλληλουχία και ηλεκτροφορητική κινητικότητα (Πίνακας 1). Τέτοιες αιμοσφαιρίνες είναι η Hb A 2 (α 2 δ 2 ) και η Hb F (α 2 γ 2 ), που έχουν μικρότερη ικανότητα πρόσληψης του οξυγόνου σε σχέση με την Hb A. ΑΝΑΙΜΙΑ ΚΑΙ ΔΟΜΙΚΕΣ ΑΝΩΜΑΛΙΕΣ ΤΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ Η αιμοσφαιρίνη αποτελείται από δύο ζεύγη πολυπεπτιδικών αλυσίδων που η κάθε μία περιέχει ένα μόριο αίμης που έχει ένα δισθενές άτομο σιδήρου στο κέντρο. Στα ενήλικα άτομα η φυσιολογική αιμοσφαιρίνη (Hb A) αποτελείται από ένα ζεύγος αλυσίδων α και ένα ζεύγος β (α 2 β 2 ). Μη φυσιολογικά μόρια αιμοσφαιρίνης προκαλούν αναιμία και αυτά μπορεί να δημιουργηθούν είτε από αλλαγή της αμινοξικής αλληλουχία των α και β αλυσίδων, είτε από αντικατάσταση των β αλυσίδων από άλλες, με διαφορετική αμινοξική αλληλουχία και διαφορετικές ιδιότητες ως προς την πρόσληψη του οξυγόνου. Η πιστοποίηση της ύπαρξης μη φυσιολογικών αιμοσφαιρινών γίνεται με ηλεκτροφορητική ανάλυση, όπου οι διάφοροι τύποι κινούνται, κάτω από την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου, σε διαφορετικές αλλά συγκεκριμένες θέσεις, λόγω διαφορετικού φορτίου (εικόνα 7). Δρεπανοκυτταρική αναιμία Η αντικατάσταση του πολικού γλουταμινικού οξέος στη θέση 5 των β αλυσίδων της αιμοσφαιρίνης, από το μη πολικό βαλίνη, λόγω σημειακής μεταλλαγής του γονιδίου, έχει ως αποτέλεσμα το μεταλλαγμένο μόριο να χάσει αρνητικό φορτίο και να υστερεί σε ηλεκτροφορητική κινητικότητα. Σε μια ηλεκτροφόρηση, η αιμοσφαιρίνη S δίνει μια ζώνη στη μέση περίπου του ηλεκτροφορήματος. Όμως, η εμφάνιση μιας τέτοιας ζώνης, δεν σημαίνει και απαραίτητα ύπαρξη δρεπανοκυτταρικής αιμοσφαιρίνης, αφού την ίδια περίπου κινητικότητα έχει και μια άλλη αιμοσφαιρίνη, που ονομάζεται αιμοσφαιρίνη C (Hb C) και προέρχεται επίσης από σημειακή μεταλλαγή. β-θαλασσαιμία Σε κάθε άνθρωπο κάθε μια από τις α-αλυσίδα και β-αλυσίδες κληρονομείται από τον ένα γονέα. Σε ετεροζυγωτία, με μη λειτουργικές β-αλυσίδες, αυξάνεται η σύνθεση της λειτουργικής Hb A, συμπληρώνεται από αύξηση της σύνθεσης Hb A 2 που εμφανίζεται με αύξηση του ποσοστού της 3,5%-6,5% (στίγμα). Σε περίπτωση ομοζυγωτίας στην προηγούμενη περίπτωση, η Hb A εξαφανίζεται εντελώς και στη θέση της αρχίζει να συνθέτονται γ-αλυσίδες, με αποτέλεσμα την εμφάνιση Hb F αιμοσφαιρίνης, ενώ αυξάνεται και η σύνθεση της Hb A 2. 25

Πίνακας 1. Ηλεκτροφορητική ανάλυση αιμοσφαιρινών Ηλεκτροφορητική ζώνη Είδος αιμοσφαιρίνης Λειτουργία (+) Hb A (97-98 %) Αιμοσφαιρίνη Α Η φυσιολογική αιμοσφαιρίνη των ενηλίκων Hb F (0-2 %) Εμβρυική αιμοσφαιρίνη Αιμοσφαιρίνη που εμφανίζεται στο εμβρυικό στάδιο Hb C/S (0 %) Αιμοσφαιρίνη C ή S Αιμοσφαιρίνης C ή S από σημειακή μεταλλαγή Hb A2 (1,8-3,3 %) Αιμοσφαιρίνη A2 Αιμοσφαιρίνη που υπάρχει στους ενήλικες σε μικρό ποσοστό Καρβονική ανυδράση (-) Βοηθάει τη δέσμευση Ο 2 και CO 2 στα ερυθρά αιμοσφαίρια Hb A Hb F Hb C/S Hb A 2 Εικόνα 7. Ηλεκτροφορητική ανάλυση αιμοσφαιρινών 26

ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ RHESUS Στην επιφάνεια κάθε ερυθρού αιμοσφαιρίου υπάρχουν κατά μέσο όρο 40 μόρια IgG ανοσοσφαιρινών που είναι είτε προσδεμένες σε κάποιο αντιγόνο είτε προσροφημένες μη ειδικά. Το φαινόμενο αυτό δεν είναι απαραίτητα παθολογικό, αν όμως ο αριθμός των αντισωμάτων αυξηθεί υπερβολικά, όπως σε περίπτωση αυτοανοσίας (αυτοάνοσο αιμολυτικό σύνδρομο), τότε προκαλείται αιμόλυση και αναιμία. Η διερεύνηση ύπαρξης αντισωμάτων έναντι αντιγόνων επιφανείας των ερυθροκυττάρων γίνεται με: Άμεση Coombs, DAT (direct agglutination test): έλεγχος για ύπαρξη αντισωμάτων στην επιφάνεια των ερυθρών αιμοισφαιρίων Έμμεση Coombs, IAT (indirect agglutination test): έλεγχος ύπαρξης αντισωμάτων για αντιγόνα επιφανείας ερυθροκυττάρων στο ορό Για τους παραπάνω ελέγχους χρησιμοποιείται το αντιδραστήριο Coombs το οποίο περιέχει αντισώματα που έχουν αναπτυχθεί σε κουνέλι και αναγνωρίζουν την Fc περιοχή των ανθρώπινων IgG ανοσοσφαιρινών. Στην άμεση Coombs, εναιώρημα ερυθρών σε φυσιολογικό ορό, από δείγμα ολικού αίματος, αναμειγνύεται με αντιορό κουνελιού έναντι ανθρώπινων αντισωμάτων. Όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των αντισωμάτων στην επιφάνεια των ερυθρών αιμοσφαιρίων τόσο πιο έντονη θα είναι και η συγκόλληση που θα παρατηρηθεί. Με την έμμεση Coombs ανιχνεύεται η παρουσία αντισωμάτων έναντι του παράγοντα Rh στο ορό μητέρας με ομάδα αίματος Rh(-). Δείγμα ορού αναμειγνύεται με εναιώρημα ερυθρών αιμοσφαιρίων από δείγμα αίματος Ο Rh(+). Αν στον ορό υπάρχουν αντισώματα για τα επιφανειακά αντιγόνα Rh, τότε θα προσκολληθούν πάνω τους. Στη συνέχεια, η εφαρμογή της άμεσης Coombs θα δείξει αν υπάρξει αιμοσυγκόλληση που θα υποδηλώνει παρουσία αντισωμάτων στο ορό που εξετάζεται. Το θετικό δείγμα ελέγχου (control) περιλαμβάνει επώαση με αντιορό έναντι του παράγοντα Rhesus Η έμμεση Coombs χρησιμοποιείται για να ελεγχθεί κάποια ανεπιθύμητη αντίδραση σε αίμα που θα χρησιμοποιηθεί για μετάγγιση. Στην περίπτωση αυτή αναμειγνύεται ορός του δέκτη με εναιώρημα ερυθρών αιμοσφαιρίων του δότη και στη συνέχεια εφαρμόζεται άμεση Coombs. 27

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΩΝ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Συσκευή ηλεκτροφόρησης - Τροφοδοτικό συνεχούς ρεύματος Συσκευή εναπόθεσης δειγμάτων (εικόνα 2) Θάλαμος θερμού αέρα Θήκη πηκτώματος για χρώση Δοχεία χρώσης Χρονόμετρο Αναδευτήρας Vortex Πιπέτα των 10 λ Πιπέτα των 100 1000 λ Φυσιολογικός ορός 0,9% NaCl Πήκτωμα Αγαρόζης 0,8% Ρυθμιστικό διάλυμα: 0,1 Μ tris-barbital ph 9,2 Δείγματα ολικού αίματος Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (stock διάλυμα 75 ml και απιονισμένο νερό μέχρι 1 l): 0,1Μ tris-barbital ph 9,2 Διάλυμα μονιμοποίησης: 60% αιθανόλη, 10% οξεικό, 30% απιονισμένο νερό Χρωστική (stock διάλυμα 75 ml και απιονισμένο νερό μέχρι όγκο 300 ml): 0,4% amidoblack, 6,7% αιθυλενογλυκόλη Αποχρωστικό (stock διάλυμα 1 ml σε 1 l απιονισμένο νερό): 0,05% κιτρικό οξύ Απιονισμένο νερό ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Σε σωληνάκια Eppendorff προσθέτουμε 200 μl ολικό αίμα από κάθε δείγμα Προσθέτουμε 1 ml φυσιολογικό ορό και αναδεύουμε απαλά Φυγοκεντρούμε τα δείγματα στις 3.000 στροφές για 1 min Αφαιρούμε το υπερκείμενο και προσθέτουμε 1 ml φυσιολογικό ορό Αναδεύουμε και φυγοκεντρούμε τα δείγματα στις 3.000 στροφές για 1 min Αφαιρούμε το υπερκείμενο και προσθέτουμε 1 ml φυσιολογικό ορό Αναδεύουμε και φυγοκεντρούμε τα δείγματα στις 3.000 στροφές για 1 min Αφαιρούμε το υπερκείμενο Σε αντίστοιχα σωληνάκια Eppendorff προσθέτουμε 130 μl διαλύματος λύσης Σε κάθε σωληνάκι προσθέτουμε 10 μl από το αντίστοιχα ίζημα ερυθρών Λύουμε τα ερυθρά με Vortex για 5-6 sec 28

ΕΝΑΠΟΘΕΣΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Προετοιμάζουμε τη συσκευή εναπόθεσης δειγμάτων (εικόνα 8) Στην επιφάνεια τοποθέτησης του πηκτώματος ρίχνουμε 100 λ Η 2 Ο Βγάζουμε το πήκτωμα από το φάκελο του και το τοποθετούμε στη συσκευή (εικόνα 9) Στεγνώνουμε το πήκτωμα με διηθητικό χαρτί Προσθέτουμε 10 λ αιμολύματος από κάθε δείγμα στις αριθμημένες θέσεις της συσκευής (εικόνα 10) Ακουμπάμε το βραχίονα εναπόθεσης πάνω στο πήκτωμα για 1 min (εικόνα 11) Απομακρύνουμε το βραχίονα Μεταφέρουμε το πήκτωμα στη συσκευή ηλεκτροφόρησης ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Προσθέτουμε 300 ml ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων στη συσκευή ηλεκτροφόρησης Κλείνουμε το καπάκι της συσκευής και συνδέουμε τα ηλεκτρόδια Ανοίγουμε το τροφοδοτικό Ρυθμίζουμε την τάση του ρεύματος στα 150 V Αφήνουμε να αναπτυχθεί η ηλεκτροφόρηση για 11 min Κλείνουμε το τροφοδοτικό Βγάζουμε το πήκτωμα από τη συσκευή και το τοποθετούμε στο πλαίσιο χρώσης ΕΜΦΑΝΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΖΩΝΩΝ Τοποθετούμε το πήκτωμα στο μονιμοποιητικό για 4 min Ξηραίνουμε το πήκτωμα στη συσκευή ζεστού αέρα για 15min Τοποθετούμε το πήκτωμα στο πλαίσιο χρώσης Τοποθετούμε το πλαίσιο στη χρωστική για 4 min Ξεπλένουμε καλά με νερό βρύσης Τοποθετούμε το πλαίσιο διαδοχικά τρεις φορές σε αποχρωστικό από 2 min Ξηραίνουμε το πήκτωμα στη συσκευή ζεστού αέρα για 3 min Σαρώνουμε το ηλεκτροφόρημα 29

ΣΧΗΜΑΤΙΚΗ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΕΝΑΠΟΘΕΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΟΖΗΣ Εικόνα 8: συσκευή εναπόθεσης δειγμάτων Εικόνα 9: τοποθέτηση πηκτώματος Εικόνα 10: εναπόθεση δειγμάτων Εικόνα 11: εναπόθεση δειγμάτων στο πήκτωμα 30

ΕΜΜΕΣΗ COOMBS ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ Ολικό αίμα ομάδας ΟRh(+) Δείγματα ορών Φυσιολογικός ορός Σωληνάρια eppendorf Αντι-D Αντιδραστήριο Coombs ΠΟΡΕΙΑ Σε ένα σωληνάριο Eppendorf μεταφέρουμε 50 μl αίμα ομάδας ΟRh(+) Προσθέτουμε 1 ml φυσιολογικό ορό και αναμιγνύουμε Φυγοκεντρούμε 1 min σε 4.000 rpm Αφαιρούμε το υπερκείμενο Προσθέτουμε 1 ml φυσιολογικό ορό και αναμιγνύουμε Φυγοκεντρούμε 1 min σε 4.000 rpm Αφαιρούμε το υπερκείμενο Επαναιωρούμε τα ερυθροκύτταρα σε 1 ml φυσιολογικό ορό Σε σωληνάριο eppendorf μεταφέρουμε 50 μl εναιώρημα Προσθέτουμε 100 μl από τον ορό που ελέγχουμε Επωάζουμε 30 min σε 37 o C Φυγοκεντρούμε και ξεπλένουμε 2 φορές με 1 ml φυσιολογικό ορό Προσθέτουμε στο ίζημα των ενεργοποιημένων ερυθρών 100 μl αντιδραστήριο Coombs και αναμιγνύουμε Μετά από 10 min παρατηρούμε και ελέγχουμε για αιμοσυγκόλληση (θετική αντίδραση 31