ΑΣΚΗΣΗ: ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ

ΑΣΚΗΣΗ: ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ

ΑΣΚΗΣΗ: ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ Σκοπός της άσκησης Η εκμάθηση του συστήματος χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας (CAM assay). Η αξιολόγηση της επίδρασης ουσιών στην αγγειογενετική διαδικασία με το σύστημα της CAM. 1. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ Τα κύτταρα των θηλαστικών απαιτούν συνεχή παροχή οξυγόνου και θρεπτικών στοιχείων για την επιβίωσή τους. Βασικό δίκτυο για την μεταφορά των παραπάνω συστατικών αποτελούν τα αιμοφόρα αγγεία, τα οποία διεισδύουν σε όλους τους ιστούς του οργανισμού. Η ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος περιλαμβάνει τις διαδικασίες της νεοαγγειογένεσης και της αγγειογένεσης και απαιτεί τον ακριβή συντονισμό πολλαπλών κυτταρικών διαδικασιών συμπεριλαμβανομένων των κυτταρικού πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης, μετανάστευσης κ.ά. Η δημιουργία του αγγειακού συστήματος ξεκινάει τις πρώτες εβδομάδες της ενδομήτριας ζωής με τη διαδικασία της νεοαγγειογένεσης, κατά την οποία σχηματίζονται νέα αγγεία από πρόδρομα ενδοθηλιακά κύτταρα. Το πρωταρχικό αυτό αγγειακό πλέγμα στη συνέχεια επεκτείνεται με τη δημιουργία νέων αγγείων από άλλα προϋπάρχοντα με την διεργασία της αγγειογένεσης. Αγγειογένεση επομένως είναι η βιολογική διαδικασία σχηματισμού νέων αγγείων από άλλα, προϋπάρχοντα αγγεία, ενώ η νεοαγγειογένεση αναφέρεται στον de novo σχηματισμό νέων αγγείων από πρόδρομα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η αγγειογένεση συνεισφέρει τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις. Συμμετέχει για παράδειγμα στην ανάπτυξη νέων οργάνων, στην αναπαραγωγική διαδικασία και στην επούλωση τραυμάτων, ενώ καταστάσεις αυξημένης αγγειογένεσης εντοπίζονται σε πολλές παθολογίες όπως καρκίνος, φλεγμονή, ρευματοειδής αρθρίτιδα κ.ά.

Το αγγειακό σύστημα περιλαμβάνει τις φλέβες, τις αρτηρίες και τα τριχοειδή αιμοφόρα αγγεία. Το τοίχωμα των αγγείων αποτελείται κυρίως από ενδοθηλιακά και λεία μυϊκά κύτταρα και περιβάλλεται από δίκτυο εξωκυττάριας ύλης που αποτελείται από ελαστίνη, κολλαγόνο, λαμινίνη, πρωτεογλυκάνες κ.ά., το οποίο στηρίζει και διατηρεί την ελαστικότητα των αγγείων. 1.1. Η αγγειογενετική διαδικασία Η διαδικασία της αγγειογένεσης αρχίζει με τη δράση αγγειογενετικών παραγόντων που δρουν ως ερέθισμα για την ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων και την έναρξη μιας σειράς γεγονότων που στοιχειοθετούν το σχηματισμό νέων αγγείων. Τα γεγονότα αυτά περιλαμβάνουν περιληπτικά τα εξής βήματα: Ενεργοποίηση ενδοθηλιακών κυττάρων: Οι αγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες επιδρούν σε υποδοχείς των ενδοθηλιακών κυττάρων υπαρχόντων αγγείων. Αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης: Τα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα εκκρίνουν πρωτεολυτικά ένζυμα που αποικοδομούν την εξωκυττάρια ύλη ώστε να μπορέσουν να διαφύγουν από τον αυλό του αγγείου. Πολλαπλασιασμός και μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και εκβλάστηση νέων αγγείων: Τα ενδοθηλιακά κύτταρα μεταναστεύουν και πολλαπλασιάζονται σχηματίζοντας σταθερές εκβλαστήσεις οι οποίες θα συνδεθούν με γειτονικές εκβλαστήσεις. Μετατροπή των εκβλαστήσεων σε αγγεία και δημιουργία ώριμου αυλού: Οι εκβλαστήσεις προσανατολίζονται προς το σημείο δράσης του αγγειογενετικού παράγοντα, όπου συνδέονται με γειτονικές νέες εκβλαστήσεις προς τον τελικό σχηματισμό ενός εκτεταμένου αγγειακού δικτύου (Εικόνα 1).

Εικόνα 1. Τα βήματα της αγγειογένεσης. 1.2. Μόρια που συμμετέχουν στην αγγειογενετική διαδικασία. Η ρύθμιση της αγγειογένεσης διαμεσολαβείται από τη δράση διαφόρων βιολογικών παραγόντων που μπορούν είτε να επάγουν είτε να αναστέλλουν την διαδικασία, δρώντας συνήθως ταυτόχρονα και στοχεύοντας σε ένα ή περισσότερα βήματα της αγγειογένεσης. Είναι προφανές ότι οι παράγοντες αυτοί πρέπει να δρουν πάντα σε ισορροπία προκειμένου το αγγειακό σύστημα να εκτελεί τη φυσιολογική του λειτουργία. Ο πιο γνωστός παράγοντας που επάγει την αγγειογενετική διαδικασία είναι ο αυξητικός παράγοντας του αγγειακού ενδοθηλίου (vascular endothelial growth factor, VEGF), ενώ άλλα μόρια με παρόμοια δράση είναι ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών (fibroblast growth factor, FGF), ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (platelet-derived growth factor, PDGF), διάφοροι άλλοι αυξητικοί παράγοντες, ένζυμα, ορμόνες κ.ά. Τα μόρια αυτά εμφανίζουν διαφορετικούς τρόπους δράσης, συμμετέχοντας για παράδειγμα στην αύξηση της αγγειακής διαπερατότητας, στη σταθεροποίηση των νέων αγγείων, στην προσέλκυση λείων μυϊκών κυττάρων, στη σύνδεση των ενδοθηλιακών κυττάρων κ.ά. Παραδείγματα μορίων που εμφανίζουν ανασταλτική δράση για την πορεία της αγγειογένεσης περιλαμβάνουν την αγγειοστατίνη, την ενδοστατίνη και πολλούς άλλους παράγοντες οι οποίοι μπορεί να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και την μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, να ανταγωνίζονται τη δράση του VEGF, να επάγουν την απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων κ.ά.

1.3. Το σύστημα της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας (CAM assay) Η χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας (Chorioallantoic Membrane, CAM) είναι μια εξωεμβρυϊκή μεμβράνη που χαρακτηρίζεται από μεγάλη αγγειοβρίθεια, γι αυτό και το σύστημα της CAM αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα συστήματα μελέτης της αγγειογένεσης αλλά και πολλών άλλων βιολογικών διαδικασιών. Το αυγό της όρνιθας αποτελείται από το κέλυφος, τη στιβάδα της αλβουμίνης (δηλαδή το ασπράδι) και τη λέκιθο (δηλαδή τον κρόκο). Η λέκιθος αντιπροσωπεύει το ώριμο ωοκύτταρο. Όταν το αυγό γονιμοποιηθεί, το σχηματιζόμενο έμβρυο προστατεύεται από μια σειρά εξωεμβρυϊκών μεμβρανικών δομών (Εικόνα 2). Η εσωτερική εξωεμβρυϊκή στιβάδα ονομάζεται λεκιθικός σάκος, περιβάλλει τη λέκιθο και μεταφέρει θρεπτικά συστατικά από τη λέκιθο στο έμβρυο. Η εξωτερική εξωεμβρυϊκή μεμβράνη είναι το χόριο. Καθώς αναπτύσσεται το έμβρυο, σχηματίζονται σταδιακά δύο πλήρεις μεμβράνες που το περιβάλλουν πλήρως, μία εξωτερική μεμβράνη που είναι το χόριο και μία εσωτερική μεμβράνη που ονομάζεται άμνιο. Η αλλαντοΐδα, που αποτελεί το κύριο αναπνευστικό όργανο του εμβρύου, προβάλλει από το οπίσθιο έντερο του εμβρύου και εισέρχεται στο εξωεμβρυϊκό κοίλωμα προκειμένου να συντηχθεί με το χόριο. Η προκύπτουσα χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη περιβάλλει το έμβρυο, βρίσκεται ακριβώς κάτω από το κέλυφος και είναι πολύ πλούσια σε αιμοφόρα αγγεία ώστε να πραγματοποιείται αποτελεσματικά η ανταλλαγή των αερίων. Η ανάπτυξη των αγγείων της CAM ολοκληρώνεται μέχρι περίπου την δωδέκατη ημέρα ανάπτυξης του εμβρύου και σε μεγάλο βαθμό πραγματοποιείται με εκβλάστηση από προϋπάρχοντα αγγεία. Η εξωκυττάρια ύλη της CAM περιλαμβάνει φιμπρονεκτίνη, κολλαγόνο, λαμινίνη κ.ά. Η CAM εμβρύου όρνιθας αποτελεί ένα ευρέως αποδεκτό in vivo σύστημα για τη μελέτη της επίδρασης ουσιών (επαγωγέων ή αναστολέων) στη δημιουργία νέων αγγείων, αλλά χρησιμοποιείται και σε πολλές άλλες εφαρμογές όπως σε μελέτες συμπεριφοράς των καρκινικών κυττάρων, σε μελέτες μεταμόσχευσης ιστού, σε μελέτες δράσης φαρμάκων και τοξικών ουσιών κ.ά. Το σύστημα της CAM παρουσιάζει πολλά πλεονεκτήματα όπως το ότι είναι απλή, γρήγορη και οικονομική, παράγει αναπαραγώγιμα

αποτελέσματα, εμφανίζει έντονη αγγειοβρίθεια που ευνοεί τόσο τις μελέτες αγγειογένεσης όσο και εγκατάστασης καρκινικών κυττάρων, επιτρέπει την άμεση παρατήρηση των αποτελεσμάτων, απαιτεί μικρή ποσότητα των προς εξέταση ουσιών κ.ά. Χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη Εικόνα 2. Σχηματισμός των εξωεμβρυϊκών μεμβρανών στο έμβρυο της όρνιθας. Από Βασικές αρχές βιολογίας ανάπτυξης, Slack 3 η έκδοση. 2. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Στην άσκηση αυτή θα χρησιμοποιήσετε το σύστημα της CAM για να μελετήσετε την αγγειογενετική δράση διαφόρων ουσιών, αξιολογώντας παραμέτρους όπως το μήκος και το πάχος των αγγείων, τη δημιουργία νέων σημείων διακλάδωσης των αγγείων (εκβλαστήσεις) και τη συνολική επιφάνεια του αγγειακού δικτύου. 2.1. Υλικά και όργανα Γονιμοποιημένα αυγά όρνιθας Ουσίες επαγωγής ή αναστολής της αγγειογένεσης Διάλυμα φορμόλης 10% Αποστειρωμένοι ελαστικοί δακτύλιοι διαμέτρου 1 cm Αντικειμενοφόρες πλάκες Μικροσκόπιο / στερεοσκόπιο Σύριγγες των 10 ml

Βελόνες ανατομίας Ψαλίδι ανατομίας Κολλητική ταινία Μαρκαδόρος μόνιμης γραφής Γάντια 2.2. Πειραματική πορεία 1. Τα γονιμοποιημένα αυγά όρνιθας προετοιμάζονται ως εξής: Καθαρίζονται με νερό και τοποθετούνται σε οριζόντια θέση σε επωαστικό θάλαμο θερμοκρασίας 37 C και υγρασίας περίπου 50% (Εικόνα 3). Η χρονική αυτή στιγμή θεωρείται ως ημέρα 0 της ανάπτυξης του εμβρύου. Εικόνα 3. 2. Την 3 η ημέρα ανάπτυξης αφαιρείται αλβουμίνη από το εσωτερικό του αυγού ώστε να αποκολληθεί η CAM από το κέλυφος και να αποκαλυφθούν τα αγγεία της. Με τη βοήθεια ανατομικής βελόνας ανοίγονται δύο οπές στο κέλυφος του αυγού, μία στο οξύ και μία στο αμβλύ άκρο. Ο χειρισμός αυτός απαιτεί προσοχή ώστε να μη σπάσει το αυγό και να μην προχωρήσει σε βάθος η βελόνα με κίνδυνο να τραυματιστεί το έμβρυο. Με τη χρήση σύριγγας αναρροφώνται περίπου 5 ml αλβουμίνης (Εικόνα 4). Τέλος, η οπή κλείνεται με κολλητική ταινία και τα αυγά επανατοποθετούνται στον επωαστικό θάλαμο.

Εικόνα 4. 3. Την 4 η ημέρα ανάπτυξης ανοίγονται μεγαλύτερα «παράθυρα» στο κέλυφος ξεκινώντας από το οξύ άκρο του αυγού (περίπου 1 x 1 cm). Τα παράθυρα αυτά στη συνέχεια κλείνονται με κολλητική ταινία και τα αυγά επανατοποθετούνται στον επωαστικό θάλαμο (Εικόνα 5). Εικόνα 5. 4. Την 9 η ημέρα ανάπτυξης τοποθετούνται πάνω στην CAM οι υπό εξέταση ουσίες (σε διάφορες συγκεντρώσεις ώστε να βρεθεί η συγκέντρωση βέλτιστης δραστικότητας) περικλειόμενες από αποστειρωμένους ελαστικούς δακτυλίους και σε τελικό όγκο που δεν ξεπερνά τα 20 μl (Εικόνα 6). Φροντίζουμε μία ομάδα αυγών να μην επωαστεί με κάποια ουσία ώστε να αποτελέσει την ομάδα αναφοράς του πειράματος. Προσέχουμε ώστε ο δακτύλιος να τοποθετηθεί σε περιοχή της CAM που εμφανίζει ικανοποιητική αγγείωση. Τα αυγά επανατοποθετούνται στον επωαστικό θάλαμο.

Εικόνα 6. 5. Την 11 η ημέρα ανάπτυξης πραγματοποιείται μονιμοποίηση του εμβρύου με έγχυση 3-4 ml μονιμοποιητικού διαλύματος φορμόλης 10% τόσο πάνω στην επιφάνεια της CAM που περικλείεται από τον δακτύλιο όσο και μέσα σε κάθε αυγό. Η έγχυση γίνεται με αργό ρυθμό με σύριγγα η οποία εισχωρεί κάτω από την χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη (Εικόνα 7). Στη συνέχεια τα αυγά αφήνονται εκτός επωαστικού θαλάμου σε σκιερό μέρος για μία ημέρα. Εικόνα 7. 6. Την 12 η ημέρα πραγματοποιείται εκτομή της CAM περιμετρικά και εξωτερικά του δακτυλίου. Το παρασκεύασμα τοποθετείται στη συνέχεια σε αντικειμενοφόρο πλάκα, αφού προηγουμένως έχει ξεπλυθεί προσεκτικά με νερό, και παρατηρείται στο μικροσκόπιο / στερεοσκόπιο. Παρατηρείστε τον αριθμό, το μέγεθος και την συνολική επιφάνεια των αγγείων της CAM καθώς και τη δημιουργία νέων εκβλαστήσεων μετά από την επίδραση των διαφόρων ουσιών σε σχέση με τις αντίστοιχες παραμέτρους της ομάδας αναφοράς (Εικόνες 8 και 9).

Εικόνα 8. Εικόνα 9. Αντιπροσωπευτικές εικόνες μετά από παρατήρηση στο στερεοσκόπιο δείγματος CAM που δεν επωάστηκε με κάποια ουσία (αρνητικός μάρτυρας, εικόνα στα αριστερά) και δείγματος CAM που επωάστηκε με ουσία η οποία επάγει την αγγειογένεση (εικόνα στα δεξιά). Παρατηρείστε τον μεγαλύτερο αριθμό, μέγεθος και αριθμό σημείων διακλάδωσης των αγγείων καθώς και τη μεγαλύτερη συνολική επιφάνεια του αγγειακού δικτύου στη δεύτερη περίπτωση.

3. Βιβλιογραφία 1. J. M. W. Slack. Βασικές Αρχές Βιολογίας Ανάπτυξης, Τρίτη έκδοση, Ακαδημαϊκές εκδόσεις Ι. Μπάσδρα και ΣΙΑ, 2014. 2. N. A. Lokman, A. S. F. Elder, C. Ricciardelli and M.K. Oehler. Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Study the Effect of Newly Identified Molecules on Ovarian Cancer Invasion and Metastasis. Int. J. Mol. Sci. 2012, 13, 9959-9970. 3. D. Ribatti. The chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) assay. Reprod Toxicol. 2017 Jun;70: 97-101. 4. Κουκαλιώτης Γ. Αναστάσιος. Το κολπικό νατριουρητικό πεπτίδιο ως αγγειογενετικός παράγοντας. Διδακτορική Διατριβή, Πανεπιστήμιο Πατρών 2008.