MONITORIZAREA INCIDENŢEI INFECŢIEI GONOCOCICE ŞI CUNOAŞTEREA PROFILULUI REZISTENŢEI LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR DE NEISSERIA GONORRHOEAE CIRCULANTE PE TERITORIUL JUDEŢULUI SUCEAVA Doctorand: dr. Silvia Filipiuc Îndrumător: Prof. Univ. Dr. Luminiţa Smaranda Iancu
Justificarea alegerii temei Neisseria gonorrhoeae a doua cauză de infecţie cu transmitere sexuală după C. trachomatis, conform CDC Atalanta. În prezent, în România, nu se cunosc morbiditatea, incidenţa, prevalenţa, spectrul de rezistenţă la antibiotice şi circulaţia tulpinilor rezistente, în principal datorită dificultăților de izolare. Incidenţa gonoreei - subraportată atât la nivel naţional cât şi în zona în care ne-am propus să efectuăm studiul. Urmărirea circulaţiei tulpinilor rezistente este crucială, în vederea stabilirii celor mai adecvate strategii de control al utilizării antibioticelor.
Justificarea alegerii temei Extinderea studiilor microbiologice, inclusiv prin utilizarea markerilor de epidemiologie moleculară, pentru stabilirea mecanismelor de rezistenţă şi a modului de transmitere a acestor tulpini. Evoluţia sensibilităţii la cefalosporine - singura clasă de antibiotice disponibilă în momentul de faţă pentru terapia sindromică în uretrita gonococică - pentru surprinderea apariţiei tulpinilor rezistente.
Obiective: cunoaşterea incidenţei reale a infecţiei gonococice, în jud.suceava; cunoaşterea pattern-ului de sensibilitate la antibiotice pentru tulpinile de N. Gonorrhoeae izolate, inclusiv prin metode cantitative; furnizarea de argumente ştiinţifice privind oportunitatea schemelor de tratament sindromic şi orientarea tratamentului infecției gonococice, după criteriul sensibilității la antibiotice; diagnosticul infecțiilor gonococice asimptomatice, prin studii de biologie moleculară, în vederea terapiei adecvate, la paciente cu sindrom inflamator pelvin.
Constituirea lotului de studiu Tulpini studiate În perioada 2004-2008: am studiat sensibilitatea la antibiotice prin metoda Kirby-Bauer pentru 60 tulpini de N. gonorrhoeae izolate de la 12 femei şi 48 bărbaţi. În perioada 2009-2010: am determinat CMI, la antibiotice, prin metoda E-test pentru 32 de tulpini de N. gonorrhoeae, izolate de la 26 bărbaţi şi 6 femei. În perioada februarie - martie 2011 am efectuat un screning de detecţie a N. gonorrhoeae prin RT- PCR la 100 de paciente cu sindrom inflamator pelvin.
Caracteristici de timp, loc şi persoană ale cazurilor confirmate nr. cazuri-suspecte intrate în studiu 318 nr. cazuri confirmate 106 (33.7%): 92 izolări în cultură şi 14 frotiuri pozitive anul depistarii 2004-13 tulpini; 2005-32 tulpini; 2006-7 tulpini; 2008-8 tulpini; 2009-12-tulpini; 2010-20 tulpini mediu U/R 65 (71%) U sex 74 M (80.4%) grupa de vârstă starea civilă 81 necăsătorit (89%) ocupaţia secreţie uretrală tampon endocervical 2 (grupa de vârstă 15-19 ani); 37 (grupa de vârstă 20-24); 44 ( grupa de vârstă 25-34 ani); 7 (grupa de vârstă 35-44 ani); 2 (grupa de vârstă 45-54 ani). 59 fără; 3 agricultori; 6 muncitori;10 studenţi; 4 personal sanitar; 4 personal din învăţământ; 6, altele 78 (M) 14 (F) disurie 71 (78%) durere etaj abdominal inferior 17 (19%) probleme asemănătoare în antecedente 15 (17%) partener simptomatic 10 (11%) antibioterapie în ultimele 48 ore 7 (8%), durata tratamentului 24 h
Incidenţa gonoreei variază considerabil da la o ţară la alta în statele membre a Uniunii Europene: - 1-27 %000 de locuitori. - < 5 %000 cum ar fi cele din sud: Grecia, Spania şi Portugalia; centrul şi estul Europei: Bulgaria, Romania, Polonia şi Slovenia. - <15 %000: în Scandinavia (Danemarca, Norvegia şi Suedia), Irlanda, Estonia, Lituania, Malta. - > 15 %000: în Lituania şi Marea Britanie. Tendința de evoluție, din 2006-2010, a fost de descreştere mai mult de 9 procente în ţări ca: Republica Cehă, Estonia, Grecia, Irlanda, Lituania, Marea Britanie; peste 50%, în România şi Estonia (OMS).
incidenta la 100.000 locuitori 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Incidenta gonoreei in Romania si jud. Suceava in perioada 1984-2010 71,9 63,8 57,4 50,18 46,2 41,5 39,939,9 35,0 35,7 33,5 31,08 28,128,8 23,6 25,424,8 26,6 25,524,7 26,7 22,723,5 19,8 22,121,4 21,9 19 20,2 20,4 16,7 17,9 17,917,9 15,6 17,317,6 18,6 9,5 10,8 9,8 7,46,23,8 5,5 6,4 2,92,92,4 4,2 gonoree RO gonoree SV 1984 1987 1989 1991 1993 1995 1997 1999 ani 2001 2003 2005 2007 2009 Incidenţa gonoreei în România şi judeţul Suceava în perioada 1984-2010 (Sursa: MS-CCSSDM).
Incidenţa gonoreei în Statele membre UE în perioada 1990-2009 (Sursa: Surveillance Report - Sexually transmitted infections in Europe 1990-2009 ).
Incidenţa gonoreei în Statele membre UE în perioada 1990-2009 (Sursa: Surveillance Report - Sexually transmitted infections in Europe 1990-2009).
DETERMINAREA PROFILULUI DE REZISTENŢĂ LA ANTIBIOTICE PENTRU TULPINI DE NEISSERIA GONORRHOEAE PRIN ANTIBIOGRAMA DIFUZIMETRICĂ OBIECTIV: stabilirea tipului de rezistenţă a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae, prin metoda Kirby Bauer, la bolnavi cu gonoree, din judeţul Suceava, în perioada 2004-2008.
PACIENŢI SI METODE au fost testaţi 60 pacienţi (12 femei, 48 bărbaţi); perioada studiului: octombrie 2004- decembrie 2008; s-au recoltat probe de secreţie uretrală / endocervicală. frotiuri colorate Gram şi cu albastru de metilen, examinate la microscopul cu obiectivul cu imersie; izolarea, prin însămânţarea pe 2 plăci cu mediu selectiv şi neselectiv; identificare (microscopică, testul oxidazei, identificare biochimică, utilizând truse mini-api);
PACIENŢI SI METODE Secreţie uretrală examinată la microscopul cu imersie. Polimorfonucleare burate cu diplococi în boabe de cafea.
PACIENŢI SI METODE Cultură pură de Neisseria gonorrhoeae pe agar GC bază + 1% hemoglobină + 1% supliment nutitiv IsoVitalex, VITOX + supliment selectiv (VCN).
PACIENŢI SI METODE Teste biochimice: galerii API NH Biomerieux, tulpină β-lactamază pozitivă.
PACIENŢI SI METODE stabilirea profilului de sensibilitate la antibiotice pentru tulpinile izolate, la: P, Te, AMX, AMC, CH, CI, CRO, prin metoda Kirby-Bauer, conform tehnicii recomandate de O.M.S NCCLS 2004-2008; asigurarea calităţii s-a realizat prin utilizarea tulpinii de referinţă de N. gonorrhoeae ATCC 49226, pentru verificarea calităţii nutritive a mediilor de cultură şi a corectitudinii antibiogramei; prelucrarea datelor pentru cazurile de gonoree depistate şi confirmate (EpiData, EpiInfo).
Antibiograma difuzimetrică pe mediu GC agar bază completat cu 1% IsoVitaleX, fără hemoglobină; suspensia standardizată (0.5 McFarland 10 8 UFC/ml) pentru ceftriaxonă, augmentin, tetraciclină, penicilină.
REZULTATE TABEL I. Procentul şi numărul de tulpini Neisseria gonorrhoeae izolate în 2004-2008, rezistente la antibioticele testate Categorie sensibilitate % (nr.) Antibiotic Rezistent Intermediar Sensibil Ceftriaxona 30µg 1,6 (1/60) 3,3 (2/60) 95 (57/60) Penicilina 10ui 70 (42/60) 15 (9/60) 15 (9/60) Tetraciclina 30 µg 80 (48/60) 5 (3/60) 15 (9/60) Amoxicilina 10µg 60 (36/60) 16,6 (10/60) 23,3 (14/60) Augmentin 30µg 58,3 (35/60) 13,3 (8/60) 28,3 (17/60) Claritromicina 15µg 55 (33/60) 6,6 (4/60) 38,3 (23/60) Ciprofloxacina 5 µg 55 (33/60) 13,3 (8/60) 31,6 (19/60)
REZULTATE Tulpini de Neisseria gonorrhoeae izolate în perioada 2004-2008 rezistente la antibioticele testate 90,0% 80,0% 70,0% 60,0% 80,0% 70,0% 60,0% 58,3% 55,0% 55,0% Tetraciclina 30μg Penicilina 10μg Amoxicilina 10 μg 50,0% Augmentin 30μg 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% Rezistenta în valori procentuale 1,6% Claritromicina 15 μg Ciprofloxacina 5 μg Ceftriaxona 30μg Rezistenţele la antibiotice a tulpinilor de Neisseria gonorrheoae izolate în 2004-2008.
DISCUŢII Rezistenţa la penicilină pe diferite zone geografice 120,0% Africa (T. Berglund 2002) 100,0% 100,0% 100,0% 90,0% 82,0% Iaşi(A. Bădescu 2007) 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 77,0% 74,3% 70,0% America (T. Berglund 2002) Europa de Vest (T. Berglund 2002) Rusia (V. Vorobieva,all 20072008) Asia (T. Berglund 2002) 0,0% rezistenta în valori procentuale Spania (Beron S 2000) Rezistenţele la penicilină a tulpinilor de Neisseria gonorrheoae izolate în 2004-2008, comparativ cu datele din literatură.
DISCUŢII Tulpini de Neisseria gorrhoeae beta lactamază pozitive Iaşi(Aida Bădescu 2007) 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% 71,6% 51,0% 46,2% 33,3% 23,1% 21,2% 15,2%14,0% valori procentuale 0,50% Suceava Asia (Torsten Berglund 2002) Africa (Torsten Belgrund 2002) America (Torsten Berglund 2002) India (Tapsall J.W. 1948) Europa de Vest (Torsten Berglund 2002) Australia (Tapsall J.W.1948) Japonia (ITO M. 2006) Producerea de beta lactamază a tulpinilor de Neisseria gonorrheoae izolate în 2004-2008.
DISCUŢII Rezistenta la Tetraciclină pe diferite zone geografice 105,0% 100,0% 100,0% 98,4% America (Torsten Berglund 2002) Asia (Torsten Berglund 2002) 95,0% 92,6%92,0%91,7%91,3% Iaşi(Aida Bădescu 2007) 90,0% 85,0% 86,5% Rusia (A. Kubanova 2008) Africa (Torsten Belgrund 2002) 80,0% 75,0% rezistenta în valori procentuale Europa de Vest (Torsten Berglund 2002) Spania (Benon S 2000) Rezistenţele la tetraciclină a tulpinilor de Neisseria gonorrheoae izolate în 2004-2008, comparativ cu datele din literatură.
DISCUŢII Rezistenta la Ciprofloxacin pe diferite zone geografice China (Torsten Berglund 2002) 100,0% 90,0% 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% 94,3% 86,6% 81,6% 63,0% 59,2%55,0% 50,0%50,0% 7,7% 4,3% 0,0% rezistenta în valori procentuale India (Manju Bala) Japonia (ITO M. 2006) Asia (Torsten Berglund 2002) Iaşi (Aida Bădescu 2007) Suceava Rusia (Veronoca Vorobieva,all 20072008) Australia (Tapsall J. W. 1948) America (Torsten Berglund 2002) Europa de Vest (Torsten Berglund 2) Africa (Torsten Berglund 2002) Rezistenţele la ciprofloxacin a tulpinilor de Neisseria gonorrheoae izolate în 2004-2008.
DISCUŢII Rezistenţa la ceftriaxonă pe diferite zone geografice 35,0% 30,0% 25,0% 20,0% 15,0% 10,0% 5,0% 0,0% 30,3% 13,0% 5,5% 4,8% 3,0% 1,6% 1,0% 0,0% rezistenta în valori procentuale Japonia (ITO M. 2006) Africa (Torsten Berglund 2002) India (Marju Bala) Italia(Torsten Berglund 2002) Rusia (A. Kubanova 2008) Suceava Suedia (Martin IMC 2006) Iaşi(Aida Bădescu 2007) Rezistenţele la ceftriaxonă a tulpinilor de N. gonorrhoeae izolate în 2004-2008, comparativ cu datele din literatură.
DISCUŢII Acest studiu este primul de acest fel pentru arealul geografic analizat (judeţul Suceava). Optimizarea diagnosticului microbiologic al gonoreei cu implementarea controlului de calitate al testarii sensibilităţii la antibiotice, ca parte integrantă a programului naţional de supraveghere coordonat de OMS; scăderea sensibilităţii la antibiotice a tulpinilor izolate de Neisseria gonorrhoeae, în special la P şi T (85%) comparabil cu descreşterea sensibităţii tulpinilor raportată în Asia, Europa de Vest, America, Africa, Rusia, Spania şi Iaşi; am depistat 31 de tulpini Neisseria gonorrhoeae producătoare de ß-lactamază (51%); producerea de ß-lactamază nu a fost corelată cu reducerea sensibilităţii la alte antibiotice, exceptând tetraciclina.
CONCLUZII În zona noastră P, TE, CIP, CH, AMX, AMC nu pot fi folosite în tratamentul gonoreei, decât după rezultatul testării la antibiotice a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae. Continuarea, la nivel regional şi naţional, a supravegherii sensibilităţii la antibiotice este crucială în detectatea emergenţei noilor rezistenţe. Evoluţia sensibilităţii la cefalosporine a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae trebuie monitorizată obligatoriu, pentru surprinderea apariţiei tulpinilor rezistente şi ajustarea schemelor terapeutice. Sunt necesare studii microbiologice, inclusiv prin utilizarea markerilor de epidemiologie moleculară, pentru stabilirea mecanismelor de rezistenţă şi a modului lor de transmitere a tulpinilor rezistente de N. gonorrhoeae.
DETERMINAREA CONCENTRAŢIILOR MINIME INHIBITORII PENTRU TULPINI DE NEISSERIA GONORRHOEAE PRIN E-TEST OBIECTIV: stabilirea CMI a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae, utilizând benzi E-test, la bolnavi cu gonoree din judeţul Suceava, în perioada august 2009 - octombrie 2010.
PACIENŢI SI METODE au fost testaţi 32 pacienţi (6 femei, 26 bărbaţi); perioada studiului: octombrie 2009- august 2010; s-au recoltat probe de secreţie uretrală / endocervicală. frotiuri colorate Gram şi cu albastru de metilen, examinate la microscopul cu obiectivul cu imersie; izolarea, prin însămânţarea pe 2 plăci cu mediu selectiv şi neselectiv; identificare (microscopică, testul oxidazei, identificare biochimică, utilizând truse mini-api);
PACIENŢI SI METODE am determinat CMI pentru tulpinile izolate, la: P, Te, AMX, AMC, CIP, CH, CRO, SC, utilizând benzi E test, conform tehnicii recomandate de O.M.S, cu respectarea criteriilor de interpretare şi control ale CLSI, din 2008; asigurarea calităţii s-a realizat prin utilizarea tulpinii de referinţă de N. gonorrhoeae ATCC 49226; prelucrarea datelor pentru cazurile de gonoree depistate şi confirmate (EpiData, EpiInfo).
E-test CMI CMI este indicată de intersecţia dintre zona eliptică de inhibiţie a culturii şi scala de gradient a langhetei
Avantajele E-test Testul permite: - determinarea concomitentă, pe aceeaşi placă, a CMI pentru mai multe antibiotice, atât pentru bacterii aerobe cât şi anaerobe; - supravegherea pacienţilor pe parcursul terapiei antimicrobiene, pentru a surprinde selectarea de clone rezistente.
Avantajele E-test Poate determina CMI pentru bacterii fastidioase. Detectează/confirmă fenotipuri de rezistenţă deosebite (ex. ESBL). Detectează rezistenţe de nivel scăzut. Util în testarea antibioticelor noi sau care nu sunt testate de rutină. Clarifică rezultatele echivoce obţinute prin antibiograma difuzimetrică.
Criteriile de interpretare conform CLSI 2008 Antibiotic Tulpină sensibilă CMI (µg/ml) Tulpină intermediar sensibilă CMI (µg/ml) Tulpină rezistentă CMI (µg/ml) Penicilină 0.06 0.12-1 >2 Ceftriaxonă 0.25 Nu există limite CLSI Nu există limite CLSI Ciprofloxacin 0.06 0.12-05 >1 Spectinomicină 32 64 128 Tetraciclina 0.25 0.5-1 2-32
Criteriile de interpretare conform CLSI 2008 Multirezistenţa a fost definită pentru: QRNG şi PPNG, QRNG şi TRNG, QRNG, PPNG şi TRNG; sistemul de gene care codifică primul sistem eflux descris la Neisseria gonorrhoeae a fost MtrC-MtrD-MtrE, care explică rezistenţa la penicilină, tetraciclină, macrolide şi fluoroquinolone (Hagman, 1995).
Rezultate E-test pe mediu GC agar bază completat cu 1% IsoVitaleX, fară hemoglobină; suspensia standardizată (0.5 McFarland 10 8 UFC/ml) de Neisseria gonorrhoeae (pentru penicilină si tetraciclină).
Rezultate E-test pe mediu GC agar bază, completat cu 1% IsoVitaleX, fară hemoglobină; suspensia standardizată (0.5 McFarland 10 8 UFC/ml) (pentru augmentin şi ciprofloxacin.).
Rezultate E-test pe mediu GC agar bază completat cu 1% IsoVitaleX, fară hemoglobină; suspensia standardizată (0.5 McFarland 108 UFC/ml) de Neisseria gonorrhoeae (pentru amoxicilină şi ceftriaxonă ).
TABEL I: Rezultatele testării prin E-test pentru tulpini de Neisseria gonorrhoeae izolate în perioada 2009-2010 Antibiotic Rezistent % (pozitiv/total) Intermediar rezistente % (pozitiv/total) Sensibil % (pozitiv/total) Ceftriaxona 0 (0/32) 3,1 (1/32) 96.9 (31/32) (CMI =0,25μg/ml) Penicilina 53,1 (17/32) (CMI >2 μg/ml) Tetraciclina 59,4 (19/32) (CMI >2 μg/ml) Rezultate 15,6 (5/32) (CMI =0,12-1μg/ml) 9,4 (3/32) (CMI =0,5-1μg/ml) 31,2 (10/32) (CMI =0,06μg/ml) 31,2 (10/32) (CMI =0,25μg/ml) Amoxicilina 43.7 (14/32) 21,9 (7/32) 34,4 (11/32) Augmentin 40,6 (13/32) 18,8 (6/32) 40,6 (13/32) Claritromicina 34,4 (11/32) 40,6 (13/32) 25 (8/32) Ciprofloxacina 34,4 (11/32) (CMI >1 μg/ml) Spectinomicină 0 (0/32) (CMI =128 μg/ml) 28,1 (9/32) (CMI =0,12-0.5μg/ml) 3,1 (1/32) (CMI =64μg/ml) 37,5 (12/32) (CMI =0,06μg/ml) 96,7 (31/32) (CMI =32μg/ml)
Rezultate Pentru penicilină: 7 tulpini (21,8%) (PPNG), iar 8 tulpini (25%) (CMRNG), au avut rezistenţă mediată cromosomal ( CMI >2 µg/ml). Pentru tetraciclină, 19 tulpini au fost rezistente: - 11 tulpini (37.5%) au avut rezistenţă mediată cromosomal tetr (CMI: 2-8 µg/ml); - 4 tulpini (12.5%) au fost TRNG (CMI>16 µg/ml), având rezistenţă înaltă, mediată plasmidic; - 4 tulpini au avut CMI cuprins între 8-16 µg/ml, care nu pot fi încadrate, conform criteriilor CLSI 2008 (ar fi util de urmărit, în viitor, profilul lor genetic, prin studii de biologie moleculară).
Rezultate Pentru ciprofloxacină: 11 tulpini (34.4%) au avut rezistenţă înaltă, fiind QRNG (CMI>1 µg/ml), 9 tulpini (28,1%) au prezentat o reducere a sensibilităţii. Pentru ceftriaxonă: 1 tulpină (3,1%) a prezentat o reducere a sensibilităţii. - Concentraţia care defineşte reducerea sensibilităţii (CMI >0.25 µg/ml); - Nicio tulpină nu a fost rezistentă la ceftriaxonă.
Rezultate Pentru spectinomicină: o tulpină (3,1%) a prezentat o reducere a sensibilităţii. - Concentraţia care defineşte reducerea sensibilităţii (CMI>128 µg/ml). - Nicio tulpină nu a fost rezistentă la spectinomicină.
Tabel III: Rata de rezistenţă la antibiotice şi gradele de comparaţie cu alte state din Europa, Japonia şi Australia pentru tulpini de Neisseria gonorrhoeae testate prin metoda E-testª ( Martin IMC, 2006) Ţara CRO% QRNG % CMRNG % PPNG % TRNG % TetR % Austria 0 53.1 3.1 15.5 1 46.9 Belgia 0 46.9 10.9 4.7 12.5 35.9 Danemarca 0 46 11.2 1 5.1 43.9 Anglia 0 12 8 1 6 20 Franţa 0 32.7 10.9 15 6.7 57.4 Grecia 0 7.6 3.8 8.9 6.3 40.5 Italia 4.8 33.3 9.5 9.5 0 42.9 Olanda 0 16 0 8.6 8.6 33.3 Portugalia 0 17.6 0 11.8 35.3 35.3 Scoţia 0 30.3 17.2 7.1 1 25.3 Spania 0 15.2 2.2 6.5 6.5 43.5 Suedia 1 48 7.3 9.6 8.3 40.6 Japonia 30,3 78.3 59.3 1 2.2 68.8 Australia 38 34 12 Ro/Suceava 0 34.42 25 21.8 12.5 37.5
Discuţii Date privind rezistenţa la ciprofloxacină Asia (Martin IMC,2006) Date din literatura privind rezistenta de nivel inalt 63 53,1 46,9 48 50 50 86,6 81,6 Austria (Martin IMC,2006) Belgia (Martin IMC,2006) Suedia (Martin IMC,2006) Rusia (Kubanova A,2006) 0 20 40 60 80 100 % India (Manju B,2007) Australia (Tapsall JW,1998)
Discuţii Date privind rezistenţa la ceftriaxonă 4,8 Italia (Kubanova A,2006) America (sporadic) Date din literatură privind rezistanţa de nivel scăzut 1 3 5,5 4,8 13 30,3 Africa (Kubanova,2006) Rusia (Kubanova A,2006) India (Manju B,2007) Japonia (Ito M,2005) Italia (Martin IMC,2006) Suedia (Martin IMC,2006) 0 10 20 30 40 %
Discuţii rezistenţă crescută la P, Te şi Q în diferite ţări (India, China şi Japonia), pune probleme în tratarea acestei infecţii (Manju B, 2008); nu am izolat nicio tulpină rezistenă la SC. Testarea sensibilităţii la SC trebuie continuată şi în zona noastră, deoarece au fost raportate tulpini rezistente în ţările Pacificului de Vest (Martin IMC, 2006).
Concluzii In zona noastră, testarea sensibiltăţii la antibiotice, în vederea utilizării lor, în tratarea infecţiilor determinate de N. gonorrhoeae, este obligatorie pentru: P, Te, CIP, CH. Pe plan naţional nu există rapoarte referitoare la testarea CMI prin E-test a N. gonorrhoeae. In România se impune optimizarea, standardizarea şi introducerea în toate laboratoarele a controlului de calitate pentru testarea sensibilităţii la antibiotice pentru tulpinile de N. gonorrhoeae izolate, inclusiv prin metode cantitative. Continuarea la nivel regional şi naţional a supravegherii sensibilităţii la antibiotice este crucială în detectatea emergenţei noilor rezistenţe. Monitorizarea variaţiei profilurilor de sensibilitate va face posibilă adaptarea schemelor terapeutice.
Screening-ul pentru detecţia Neisseria gonorrhoeae prin Real Time PCR, la paciente cu sindrom inflamator pelvin Lotul de studiu În perioada februarie martie 2011 au fost testate 100 de paciente cu sindrom inflamator pelvin. Repartiția pacientelor pe grupe de vârstă: Grupa de vârstă Număr paciente 20 30 37 30 40 29 40 50 19 > 50 15
Cuantificarea absolută utilizând tehnica Real Time PCR Diluții seriate din controlul pozitiv Cuantificarea absolută realizată pe baza curbei standard
Principiul cuantificării în RT PCR Termocyclerul Stratagene Mx3005p Principiul TaqMan
Etapele detecției N. gonorrhoeae prin Real Time PCR recoltarea şi transportul probelor; purificarea ADN / N. gonorrhoeae; cuantificarea absolută utilizând tehnica Real Time PCR.
Recoltarea și transportul probelor Probele au fost recoltate de la nivelul endocolului cu ajutorul tampoanelor E - Swab / Copan Innovation; Cele 100 de probe au fost testate în 5 sesiuni diferite de lucru: I. probele 1 10; II. probele 11 40; III. probele 41 50; IV. probele 51 70; V. probele 71 100.
Purificarea ADN / N. gonorrhoeae Kitul PrimerDesign PrecisionTM Gram Negative Bacterial DNA extraction
Cuantificarea absolută utilizând tehnica Real Time PCR ETAPE: Setarea plăcuțelor; Setarea profilului termic; Pipetarea mixurilor de reacție RT PCR; Run ; Validarea experimentelor; Analiza rezultatelor obținute.
Setarea plăcuțelor RT PCR Sesiunea I Sesiunea II Sesiunea III Sesiunea IV Sesiunea V
Setarea profilului termic Profilul termic prezintă 1 segment cu 1 ciclu de amplificare și un al doilea segment cu 50 de cicluri.
Curbele de amplificare obținute în cele 5 sesiuni de lucru Sesiunea I Sesiunea II Sesiunea III Sesiunea IV Sesiunea V
Validarea experimentelor: verificarea parametrilor curbelor standard Sesiunea I Sesiunea I Sesiunea II Sesiunea III Sesiunea IV Sesiunea V
Analiza rezultatelor obținute: numărul de cópii ADN / gonococ detectate Sesiunea I Sesiunea II Sesiunea III Sesiunea IV Sesiunea V
Numărul probelor pozitive pentru N. gonorrhoeae: Sesiune de lucru Număr probe cu Ct 40 I 0 II 9 III 0 IV 0 V 2 TOTAL 11/ 100 probe pozitive
Discuții Nr. crt Prevalenta gonococ An publicare Tara Autor Sistemul RT PCR utilizat 1 0,006 2011 Elvetia Sakem B Abbott Diagnostics 2 0,2 2011 Spania Corbeto EL in house 3 16,7 2010 USA Gaydos CA Abbott RealTime CT/NG 4 1.7 2010 Anglia Hopkins MJ Roche COBAS Taqman CT 5 17 2008 Norvegia Hjelmevoll SO in house 6 0,84 2008 Austria Schabereiter- Gurtner C COBAS AMPLICOR 7 38 2007 USA Mangold KA COBAS Amplicor 8 16 2007 Rusia Shipitsyna E Real-time nucleic + (NASBA) 9 30 2005 Olanda Geraats-Peters CW COBAS AMPLICOR 10 3 2004 Australia Whiley DM TaqMan-ABI7500 11 19 2004 Australia Whiley DM in house
Concluzii: studiul nostru utilizează pentru prima dată în ţară o metodă RT-PCR pentru detectarea infecţiilor asimptomatice de N. gonorhoeae; studiul prezentat în acest capitol reprezintă o premieră, deoarece în baza de date PubMed nu am întâlnit nicio referinţă bibliografică referitoare la testarea prevalenţei infecţiei gonococice la asimptomatici, utilizând trusele de la PrimerDesing. Singurele referinţe, din 2003 şi 2005 se referă la testarea infecţiei meningococice;
Concluzii: prevalenţa de 11% se încadrează în datele din literatură, care semnlează valori cuprinse între 0.006% şi 19 %; detectarea infecţiilor asimptomatice prin tehnici de biologie moleculară, deşi mai scumpă, comparativ cu metodele clasice de izolare şi identificare, are o eficienţă superioară, ceea ce justifică utilizarea ei pentru femeile cu infecţie pelvină cronică, în vederea instituirii unei terapii specifice, cunoscând profilul de rezistenţă la antibiotice în zona studiată, determinată prin metode fenotipice sau/şi genotipice.
Vă mulțumesc!