Πανεπιστήµιο Αιγαίου Τµήµα Επιστηµών της Θάλασσας Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας & Γενετικής Κρήτης (Ι.ΘΑ.ΒΙ.Γ) ΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΧΑΡΤΟΓΡΑΦΗΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ (Sparus aurata) ΚΑΙ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΑΥΤΟΥ ΜΕ ΤΟ ΓΟΝΙ ΙΩΜΑ ΤΟΥ MEDAKA (Oryzias latipes)» ΝΟΥΣ ΙΛΗ ΗΜΗΤΡΑ Υπεύθυνος καθηγητής : Επίκ. Καθηγητής ρόσος Κουτσούµπας Υπεύθυνη Ερευνήτρια: ρ. Έλενα Σαρροπούλου ΜΥΤΙΛΗΝΗ 2007 1
ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Αρχικά, θερµές ευχαριστίες θα ήθελα να δώσω στον ρ. Κουτσούµπα ρόσο, επίκουρο καθηγητή του Τµήµατος Επιστηµών της Θάλασσας, σχολή Περιβάλλοντος, του Πανεπιστηµίου Αιγαίου (Μυτιλήνη) και υπεύθυνο καθηγητή µου, για την συµβολή του στην επίτευξη της συνεργασίας µου µε το εργαστήριο Γενετικής του Ινστιτούτου Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών (ΕΛΚΕΘΕ), παράρτηµα Κρήτης, καθώς και για την αδιάκοπη βοήθεια και συµπαράστασή του και τις συµβουλές του έως και σήµερα. Θερµές ευχαριστίες επίσης θα ήθελα να δώσω τον ρ. Μαγουλά Αντώνιο διευθυντή του Ινστιτούτου Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών (ΕΛΚΕΘΕ), παράρτηµα Κρήτης, για την επίτευξη της διεξαγωγής της πτυχιακής µου εργασίας στο ανωτέρω ινστιτούτο.. Ευχαριστώ ιδιαίτερα επίσης τον ρ. Κωτούλα Γεώργιο διευθυντή του εργαστηρίου Γενετικής του Ινστιτούτου Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών (ΕΛΚΕΘΕ), παράρτηµα Κρήτης, για την συµβολή του στην επίτευξη της συνεργασίας µου µε το ανωτέρω εργαστήριο, καθώς και για τον σχεδιασµό ορισµένων από των εκκινητών που χρησιµοποίησα και για την παροχή πληροφοριών απαραίτητων για την διεξαγωγή των πειραµάτων µου. Ευχαριστώ ιδιαίτερα επίσης στην ρ. Σαρροπούλου Έλενα, υπεύθυνη επίβλεψης της παρούσας εργασίας,ερευνήτρια του Ινστιτούτου Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών (ΕΛΚΕΘΕ), παράρτηµα Κρήτης, για την αµέριστη βοήθειά της, 2
την αφοσίωση, ατέλειωτη υποµονή, συµπαράστασή της καθώς και την προσφορά γνώσης προς το πρόσωπό µου. Ευχαριστώ τους ρ.τσιγγενόπουλο Κων/νο, ερευνητή του Ινστιτούτου Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής και τον κ. Lagnel Jacque τεχνικό του οµώνυµου Ινστιτούτου, για τον σχεδιασµό ορισµένων από των εκκινητών που χρησιµοποίησα. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον ρ. Benny Ron ερευνητή του Ινστιτούτου Ωκεανογραφίας και Λιµνολογίας του Ισραήλ, για την αµέριστη βοήθεια, συµπαράσταση, την προσφορά γνώσης καθώς και τις πολύτιµες συµβουλές του. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τους τεχνικούς του εργαστηρίου Γενετικής του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών (ΕΛΚΕΘΕ), παράρτηµα Κρήτης και τους µεταπτυχιακούς και διδακτορικούς φοιτητές που απασχολούνται σε αυτό για την προσφορά γνώσης, την άψογη συνεργασία και την αδιάκοπη βοήθειά τους. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον Παπαδόπουλο Σπυρίδων φοιτητή του τµήµατος Γεωπονίας, Ιχθυολογίας και Υδάτινου Περιβάλλοντος του πανεπιστηµίου Βόλου για την βοήθειά του στην υβριδική χαρτογράφηση. Ευχαριστώ ιδιαίτερα και τους φίλους µου για την αµέριστη συµπαράστασή τους. Τέλος, ένα µεγάλο ευχαριστώ αξίζει στους γονείς µου Ηλία και Μαρία και τα αδέρφια µου Μαρία και Χριστόδουλο που βρίσκονται συνεχώς δίπλα µου και µου συµπαραστέκονται σε οτιδήποτε κάνω. 3
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ...4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...5 ABSTRACT...7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ...9 1. Γενικές πληροφορίες για τεχνικές, µεθόδους και προβληµατισµούς της µοριακής βιολογίας και βιοτεχνολογίας των θαλάσσιων οργανισµών...9 2.Χαρτογράφηση γονιδίων των οργανισµών...13 2.1. Γενετικός χάρτης...13 2.2.Υβριδικός χάρτης...14 2.3.Φυσικός χάρτης...15 2.4.Γονιδιακοί χάρτες...15 3.Υδατοκαλλιέργειες και βιοτεχνολογία...16 3.1. Γενικές πληροφορίες για τις υδατοκαλλιέργειες...16 3.2 Βιοτεχνολογία στις Υδατοκαλλιέργειες...18 4.Στόχοι της πτυχιακής εργασίας...20 ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ..21 1.1. Περιγραφή µεθόδου...21 1.1.1. PCR...21 1.1.2. Υβριδικό πάνελ...24 1.1.3. Πήκτωµα αγαρόζης...25 1.1.4. Ηλεκτροφόρηση...26 2. Βιοπληροφορική...28 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ...30 ΣΥΖΗΤΗΣΗ...45 1. Συζήτηση...45 2. Συµπεράσµατα...52 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...53 1.ΕΛΛΗΝΙΚΉ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...53 2.ΞΕΝΟΓΛΩΣΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...53 3. ΙΑ ΥΚΤΙΑΚΕΣ ΠΗΓΕΣ...60 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ...61 4
ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η τσιπούρα Sparus aurata (Linnaeus 1758) ανήκει στα Περκόµορφα (Οικογένεια Sparidae), την πολυπληθέστερη τάξη ανάµεσα στους τελεόστεους, οι οποίοι συµπεριλαµβάνουν σχεδόν τα µισά από όλα τα υπάρχοντα σπονδυλωτά. Είναι ένα σηµαντικό θαλάσσιο ψάρι για τις υδατοκαλλιέργειες της Μεσογείου γενικότερα και της Ελλάδας ειδικότερα. Ο πρόσφατος χαρακτηρισµός ως ανερχόµενο είδοςστόχος συνέβαλε ώστε να αποτελέσει έναν από τους βασικούς στόχους του Ευρωπαϊκού προγράµµατος BRIDGEMAP που αφορούσε στη χαρτογράφηση του γονιδιώµατός της. Συνεπώς, παρόλο που δεν θεωρείται είδος µοντέλο, η τσιπούρα πληρεί σήµερα τις κατάλληλες προϋποθέσεις για να αποτελέσει πειραµατικό µοντέλο για γενωµικές µελέτες. Είναι πρότυπο για γονιδιακές πληροφορίες άλλων καλλιεργούµενων ειδών, όπως είναι τα άλλα εµπορικά είδη της τσιπούρας και τα είδη του λαυρακιού. Η συνδυασµένη γνώση για την τσιπούρα έχει σηµαντικές οικολογικές και εξελικτικές εφαρµογές. Το ενδιαφέρον στην σύγκριση της εξέλιξης των γονιδιωµάτων των σπονδυλωτών στην παρούσα µελέτη, οδήγησε στη χρήση ενός υβριδικού χάρτη υψηλής ανάλυσης και στον οποίο η τσιπούρα κατατάσσεται ανάµεσα στα ψάρια- µοντέλα όπως π.χ. το zebrafish, το medaka και το tetraodon. Η ένταξη της τσιπούρας στον χάρτη αυτό παρέχει επίσης σηµαντικές πληροφορίες στους θαλάσσιους βιολόγους και τους εκτροφείς. Τα αποτελέσµατα φυλογενετικών µελετών που είχαν γίνει µέχρι τώρα έδειξαν ότι η τσιπούρα (Sparus aurata) βρίσκεται στο φυλογενετικό δένδρο πιο κοντά στο medaka (Oryzias latipes) σε σχέση µε το tetraodon (Tetraodon nigroviridis) και το µακρινότερο zebrafish (Danio rerio). Λόγω της µεγαλύτερης φυλογενετικής συγγένειας µεταξύ της τσιπούρας και του medaka ήταν προφανής η επιλογή της σύγκρισης γονιδιωµάτων µεταξύ των 2 αυτών συγκεκριµένων ειδών στα πλαίσια της παρούσας εργασίας καθώς ήταν ευκολότερο να βρεθούν εκκινητές (primers) για συγκριτικές µελέτες µεταξύ αυτών των δύο ειδών. Στα 2 αυτά είδη εφαρµόστηκε η τεχνική γενετικής ανάλυσης (BLAST) (αναζήτηση υβριδικών οµάδων χρωµοσωµάτων της τσιπούρας µε τα χρωµοσώµατα του medaka) από την οποία έγινε δυνατή η κατασκευή ενός νέου γενετικού πίνακα ( Oxford grid ) ο οποίος και επιβεβαίωσε τη στενή γονιδιακή σχέση µεταξύ των δύο αυτών ψαριών. Στα πλαίσια 5
της εργασίας αυτής έγινε επιπρόσθετα, η σύγκριση µεταξύ των υβριδικών οµάδων χρωµοσωµάτων της τσιπούρας και του tetraodon. Πιο συγκεκριµένα η εφαρµογή της τεχνικής γενετικής ανάλυσης (BLAST) σε ήδη αναπτυγµένους εκκινητές από προηγούµενες επιστηµονικές µελέτες (34 EST δείκτες του tetraodon στο 20 ο χρωµόσωµά του) έδωσε την δυνατότητα ώθησης στη χαρτογράφηση ορισµένων από αυτούς (27 από τους 34) µε αποτέλεσµα να καταστεί δυνατή η συγκριτική γονιδιακή µελέτη µεταξύ των συγκεκριµένων ειδών. Συµπερασµατικά, η συγκριτική χαρτογράφηση που έγινε στα πλαίσια αυτής της εργασίας µεταξύ της τσιπούρας και άλλων ειδών ψαριών εκτιµάται ότι συµβάλλει στην περαιτέρω κατανόηση της χρωµοσωµικής εξέλιξης της τσιπούρας και στη βελτίωση των γνώσεων µας για τον γενετικό της χάρτη. Ο γενετικός χάρτης της τσιπούρας αποτελεί ένα ζωτικής σηµασίας εργαλείο για ανάλυση γονιδιακών περιοχών µε διακριτά χαρακτηριστικά (Quantitative Trait Loci QTL) καθώς αποτελεί ένα αξιόπιστο εργαλείο για τον καθορισµό εκείνων των γονιδιακών περιοχών που παρουσιάζουν εµπορικό ενδιαφέρον. Η χαρτογράφηση γονιδίωνστόχων (genes candidates) για ανίχνευση QTL που εφαρµόστηκε στην παρούσα µελέτη, πιστεύεται ότι θα επεκτείνει την γενωµική συλλογή που είναι διαθέσιµη για µελέτες που αφορούν την βελτιωµένη ανάπτυξη, την αντίσταση στις ασθένειες και τον φυλοκαθορισµό όχι µόνον της τσιπούρας αλλά και άλλων ειδών ψαριών και γενικά θαλάσσιων οργανισµών. 6
ABSTRACT The gilthead sea bream, Sparus aurata (Sparidae, Linnaeus, 1758) belongs to Perciformes, the most species rich order within the teleosts fish, while the latter comprise almost half of all the existing vertebrate species. The sea bream is an important seawater finfish in the Mediterranean Basin aquaculture in general and in particularly in Greece. In recent years, the sea bream has been implementing as potential target species and thus it was the heart of one of the goals of the European project BRIDGEMAP that dealt with the mapping of its genome. Therefore, although sea bream is a non-model fish, it has the appropriate associated data to become a forthcoming experimental model for genome studies since it has already paved the way for the genome information of other important aquaculture species such as other commercial sea bream species and the related sea bass species. Taken together, the knowledge accumulated on sea bream has also significant ecological and evolutionary implications. The interest in comparing vertebrate genomes evolution in this study, led to the use of a whole-genome radiation hybrid panel (RH) of sea bream. The quality of this RH panel was ascertained by the construction of a 2-Mb-resolution RH map. This RH map will put forward the sea bream as a model status together with zebrafish, medaka, and tetraodon while providing state-of-the-art information to the fish biologists and aquaculturists. Phylogeny studies showed that the sea bream (Sparus aurata) is closer to medaka (Oryzias latipes) than to tetraodon (Tetraodon nigroviridis) or the more distant zebrafish (Danio rerio). Due to this fact it is easier to find primers for comparative studies between these two species. Our BLAST results of the seabream RH groups against medaka chromosomes, and the construction of a new Oxford grid confirmed the close relationship between these two species. In addition, our comparison between sea bream RH groups and tetraodon chromosomes gave rise to the mapping of 27 of 34 EST markers of tetraodon that were found to be located on chromosome 20. In conclusion, comparative mapping will facilitate the chromosome evolution of sea bream and will improve the genetic linkage map. Sea bream linkage map 7
provides a vital comparative tool for QTL analysis and is valuable for the determination of commercially interested loci, as well. Mapping candidate genes for QTL scanning based on this study will broaden our genomic arsenal for the studies on enhanced growth, disease resistance and sex determination. 8
ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Γενικές πληροφορίες για τεχνικές, µεθόδους και προβληµατισµούς της µοριακής βιολογίας και βιοτεχνολογίας Η ανακάλυψη της διπλής έλικας του DNA από τους James Watson και Francis Crick το 1953 αποτέλεσε σταθµό στην αλµατώδη ανάπτυξη της µοριακής βιολογίας καθώς και της γενετικής. Οι µοριακές µελέτες κατατάσσονται σε τέσσερις βασικές κατηγορίες: Η Γενετική ασχολείται µε τη µεταβίβαση των βιολογικών πληροφοριών από γενιά σε γενιά, µε την αποσαφήνιση της φύσης του γενετικού υλικού, µε τη δηµιουργία των παραλλαγών του γενετικού υλικού, µε τους τρόπους που δρα και εκφράζεται το γενετικό υλικό για να καθορίσει τα χαρακτηριστικά ενός οργανισµού, καθώς επίσης µε τον τρόπο δηµιουργίας και εξέλιξης της βιοποικιλότητας (Τριανταφυλλίδης, 2001). Η Γενωµική έχει ως στόχο να προβάλλει την κατανόηση της κατασκευής, λειτουργίας και εξέλιξης των γενωµάτων σε όλα τα βασίλεια της ζωής, καθώς και της εφαρµογής γενωµικών επιστηµών και τεχνολογιών µε σκοπό την επίλυση προβληµάτων της βιολογίας και της ιατρικής (Quackenbush, 2007). Η Γενετική των Πληθυσµών είναι η επιστήµη η οποία χρησιµοποιεί µαθηµατική θεωρία και εµπειρικές µελέτες για να κατανοήσει την γενετική ποικιλότητα, τους ρυθµούς και την δυναµική των γενετικών αλλαγών ανάµεσα στους πληθυσµούς, συµπεριλαµβανοµένων εκείνων που οδηγούν σε προσαρµογή και κατανοµή (Τριανταφυλλίδης, 2001). Εστιάζει στην κατανοµή συχνότητας διαφόρων γονιδίων σε διαφορετικούς πληθυσµούς, χρησιµοποιεί δηλαδή τεχνικές που προέρχονται από τον κλάδο της στατιστικής. Με αυτό τον τρόπο επιδιώκει να δώσει απαντήσεις σε ερωτήµατα που σχετίζονται µε 9
τις µετακινήσεις πληθυσµών κατά το παρελθόν, τις φυλογενετικές τους σχέσεις, το βαθµό ανάπτυξης διαφόρων φυλετικών τύπων και τον τρόπο προσαρµογής τους στο περιβάλλον. Αυτός ο τοµέας συµπεριλαµβάνει τις επιδράσεις των µεταλλάξεων, τις τυχαίες αλλαγές, την φυσική επιλογή και την αποµόνωση (Futuyma, 1998). Η Λειτουργική Γενετική έγκειται στην έκφραση, τη δοµή και τη λειτουργία του γονιδίου. Χρησιµοποιεί την καινοτόµα γενετική τεχνολογία µε σκοπό την επίλυση πολύπλοκων βιολογικών προβληµάτων (Futuyma, 1998). Οι δύο βασικές τεχνικές προσέγγισης που χρησιµοποιούνται στις µοριακές µελέτες είναι: α) ο γενετικός ανασυνδυασµός. Ο όρος γενετικός ανασυνδυασµός περιλαµβάνει όλους τους βιολογικούς µηχανισµούς, οι οποίοι επιτρέπουν τη φυσική ανταλλαγή γενετικού υλικού ανάµεσα σε άτοµα του ίδιου είδους, διαφορετικών ειδών ή και ανάµεσα σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές, µε αποτέλεσµα να προκύπτουν αλλαγές στη σύνδεση των γονιδίων ή µερών των γονιδίων. Ο γενετικός ανασυνδυασµός αποτελεί ένα συχνό φαινόµενο καθώς πρόκειται για βασική κυτταρική λειτουργία, τόσο στους προκαρύωτες, όσο και στους ευκαρύωτες οργανισµούς και µπορεί να έχει σηµαντικές επιπτώσεις στην επιβίωση ή µη, µικροβίων και ιών. Ο γενετικός ανασυνδυασµός και η µετάλλαξη είναι οι βασικοί µηχανισµοί ανακατανοµής του γενετικού υλικού και της δηµιουργίας άπειρων νέων γονιδιακών συνδυασµών των χρωµοσωµάτων. Μαζί αποτελούν τις µοναδικές πηγές γενετικών αλλαγών και δηµιουργίας τεράστιας ποικιλίας νέων συνδυασµών γενωµάτων πάνω στους οποίους θα δράσει η φυσική επιλογή, προκειµένου να προσαρµοστεί ο οργανισµός στο περιβάλλον του. Η διαφορά τους είναι ότι ενώ µε τη µετάλλαξη δηµιουργείται νέα αλληλουχία στο γονιδίωµα, ο ανασυνδυασµός αναδιατάσσει προϋπάρχουσες διατάξεις (Τριανταφυλλίδης, 2001). β) Περιοριστικές ενδονουκλεάσες. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι ένζυµα που καταλύουν τη διάσπαση του DNA σε καθορισµένες αλληλουχίες. Μέχρι σήµερα έχουν αποµονωθεί περισσότερα από 1.000 ένζυµα περιορισµού από εκατοντάδες προκαρυωτικούς µικροοργανισµούς. Καθένα από αυτά αναγνωρίζει διαφορετική νουκλεοτιδική αλληλουχία- στόχο και 10
δηµιουργεί δύο ρήγµατα, ένα σε κάθε κλώνο DNA, οπότε δηµιουργούνται ελεύθερα 3 -ΟΗ και 5 -Ρ άκρα. Οι αλληλουχίες- στόχοι που αναγνωρίζονται από τα ένζυµα περιορισµού µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως δείκτες για να γίνει χαρτογράφηση του DNA. Πάνω στον γενετικό χάρτη δηλαδή, υπάρχουν οι θέσεις δράσης διαφόρων ενδονουκλεασών περιορισµού καθώς επίσης και οι σχετικές αποστάσεις τους. Η Βιοτεχνολογία είναι η τεχνολογία χρησιµοποίησης των βιολογικών διεργασιών για την παραγωγή προϊόντων και υπηρεσιών προς όφελος του ανθρώπου. Συνδυάζει πεδία όπως η γενετική, η µοριακή βιολογία, η βιοχηµεία, η εµβρυολογία και η κυτταρική βιολογία, τα οποία είναι συνδεδεµένα µε πρακτικά πεδία όπως η χηµική µηχανική, η πληροφοριακή τεχνολογία και η ροµποτική. Έχει πλήθος εφαρµογών στις επιστήµες υγείας, το περιβάλλον, τη γεωργία, την κτηνοτροφία και τη βιοµηχανία. Αξιοποιεί τα σύγχρονα επιτεύγµατα της Μοριακής Βιολογίας και χρησιµοποιεί ένα πλήθος τεχνικών, στις οποίες συµπεριλαµβάνονται η τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA, τεχνικές αποµόνωσης DNA, ακριβής κοπή του DNA µε χρήση περιοριστικών ενδονουκλεασών, µεταφορά του µε πλασµίδια και ιούς σε βακτήρια που κλωνοποιούνται, τεχνικές ιστοκαλλιεργειών και καλλιεργειών κυττάρων σε µεγάλη κλίµακα, αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR), τεχνητή βιβλιοθήκη βακτηριακών χρωµοσωµάτων (BAC libraries), αλληλούχιση (sequencing), συµπληρωµατικές DNA (complementary DNA-cDNA) και άλλα. Οι βασικές τεχνικές που χρησιµοποιούνται στην επιστηµονική κοινότητα και έχουν εφαρµοσθεί και στα πλαίσια της εργασίας αυτής είναι: Αλληλούχιση (sequencing): Είναι η διαδικασία προσδιορισµού της νουκλεοτιδικής σειράς ενός συγκεκριµένου τµήµατος DNA. Η πιο δηµοφιλής µέθοδος που χρησιµοποιείται είναι αυτή του Frederick Sanger η οποία χρησιµοποιεί συγκεκριµένη αλληλουχία τερµατισµού της διαδικασίας σύνθεσης του DNA τοποθετώντας τροποποιηµένα νουκλεοτιδικά υποστρώµατα. 11
Εικόνα 1. Απεικόνιση αποτελεσµάτων αλληλούχισης (sequencing) όπως λήφθηκαν από τον ηλεκτρονικό υπολογιστή µετά το τέλος της διαδικασίας (http://en.wikipedia.org/ wiki/sequencing). Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης PCR πολυµεράσης που έχει ως αποτέλεσµα τη σύνθεση εκατοµµυρίων αντιγράφων ενός εκκινητή DNA. Εκκινητής (primer) είναι ένα µόριο, συνήθως ένα ολιγονουκλεοτίδιο στο οποίο η DNA πολυµεράση µπορεί να προσθέσει το πρώτο δεοξυριβονουκλεοτίδιο κατά την αντιγραφή του DNA. Συµπληρωµατικές DNA βιβλιοθήκες (complementary DNA libraries-cdna) Πρόκειται για συλλογή από µόρια DNA που είναι συµπληρωµατικά µορίων mrna που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Τα συµπληρωµατικά µόρια DNA ενός ευκαρυωτικού οργανισµού µπορούν να κλωνοποιηθούν σε έναν προκαρυωτικό οργανισµό (Escherichia coli) και να εκφραστούν σε αυτό. Ένα πλεονέκτηµα είναι ότι περιέχουν µόνο την περιοχή του γονιδιώµατος που κωδικοποιείται. Η ολοκλήρωση των cdna βιβλιοθηκών αποκαλύπτει το συνολικό αριθµό των πρωτεϊνών που είναι πιθανό να εκφραστούν σε κάθε οργανισµό. Αποτελούν µέσο για κλωνοποίηση ολόκληρων (full-length) γονιδίων όπως απαιτείται για γενωµικές/ πρωτεοµικές έρευνες και στην ανακάλυψη φαρµακευτικών παρασκευασµάτων. Είναι επίσης σηµαντικές για ανάλυση µέσω της βιοπληροφορικής. Οι διαθέσιµες βιβλιοθήκες που υπάρχουν αναφέρονται στον άνθρωπο, στο ποντίκι και στον αρουραίο, στη µαϊµού, σε φυτά και σε µικρόβια. Πηγή : (www.genemedsyn.com) 12
DNA µικροδιατάξεις (microarray) Είναι µια συλλογή από µικροσκοπικά DNA κοµµάτια, που συνήθως αντιπροσωπεύουν µεµονωµένα γονίδια, τοποθετηµένα πάνω σε µια στερεή επιφάνεια (γυαλί, πλαστικό, τσιπ σιλικόνης ) εφοδιασµένη µε κατάλληλα χηµικά υλικά. Επιτρέπουν τον καθορισµό του συγκεκριµένου κυτταρικού τύπου στο οποίο εκφράζονται τα γονίδια που έχουν αναγνωριστεί. Επί παραδείγµατι, τα ηπατικά κύτταρα εκφράζουν γονίδια για ένζυµα που καταπολεµούν δηλητήρια, ενώ τα παγκρεατικά κύτταρα εκφράζουν γονίδια για την παραγωγή ινσουλίνης. Για να κατανοηθεί ο τρόπος αυτής της εξειδίκευσης, πρέπει να αναγνωριστούν τα είδη των γονιδίων που εκφράζουν τα κάθε κύτταρα. Τέλος, οι µικροδιατάξεις µπορούν να βοηθήσουν στην καλύτερη κατανόηση της φυσιολογίας των ψαριών και στην βελτίωση των πρακτικών µεθόδων υδατοκαλλιεργειών. Εικόνα 2. Απεικόνιση της διαδικασίας κατασκευής των DNA µικροδιατάξεων (microarray) (http://www.accessexcellence.org). 2. Χαρτογράφηση γονιδίων των οργανισµών Υπάρχουν τρία είδη χαρτών που αναφέρονται στους οργανισµούς : 2.1. Γενετικός χάρτης- χάρτης σύνδεσης Ο γενετικός χάρτης δείχνει την σχετική απόσταση δύο πολυµορφικών θέσεων πάνω στο γονιδίωµα (γενετική απόσταση). Βασίζεται στις συχνότητες του ανασυνδυασµού ανάµεσα σε γενετικούς δείκτες, κατά τη διάρκεια διασταυρώσεων οµόλογων χρωµοσωµάτων µέσω της µειωτικής διαίρεσης. Όσο µεγαλύτερη είναι η συχνότητα του ανασυνδυασµού µεταξύ δύο γενετικών 13
δεικτών, τόσο πιο µακριά θεωρείται ότι βρίσκονται. Μονάδα µέτρησης είναι το cm (centimorgan)-µονάδα γενετικής σύνδεσης η οποία αντιστοιχεί σε τέτοια απόσταση στο χρωµόσωµα που να επιτρέπει έναν ανασυνδυασµό στη περιοχή αυτή κατά τη διάρκεια της µείωσης. 1 cm=1% πιθανότητα ανασυνδυασµού. Ένα χρωµόσωµα έχει µήκος περίπου 100-300 cm (1-3 ανασυνδυασµοί ανά χρωµόσωµα). Οι γενετικοί χάρτες βοηθούν στην αποµόνωση και στην εξακρίβωση των γονιδίων που ευθύνονται για κληρονοµικές ασθένειες. Επίσης, προβάλλουν στοιχεία για το χρωµόσωµα που τα περιέχει καθώς και για την θέση που κατέχουν σε αυτό. Χαρτογραφούνται γονίδια που χαρακτηρίζονται από το φαινότυπό τους. Επιτρέπει επίσης τη χαρτογράφηση ενός γονιδίου χωρίς να είναι γνωστή η λειτουργία ή η αλληλουχία των βάσεών του (Τριανταφυλλίδης, 2001). Ένας γενετικός χάρτης µπορεί να κατασκευαστεί µε πολυµορφικούς µοριακούς δείκτες, όπως τα ένζυµα περιορισµού και τα µικροδορυφορικά. Ένας τρόπος να χαρτογραφηθούν και γονίδια πάνω στον γενετικό χάρτη µας δίνουν τα γονίδια τα οποία περιέχουν και µικροδορυφορικά όπως τα ESTs-SSR (Delgado et al, 1998). Expressed sequence tag-est: µικρού µήκους µοναδιαίες αλληλουχίες από τυχαία επιλεγµένους cdna κλώνους, από εκφρασµένες περιοχές του γονιδίου. ESTs-SSR : µικροδορυφορικοί τόποι συνδεδεµένοι µε γονίδια. 2.2. Υβριδικός χάρτης Ο υβριδικός χάρτης (RH map) δείχνει πραγµατικές αποστάσεις ανάµεσα σε θέσεις αναφοράς. Θεωρείται σαν µια δυναµική προσέγγιση στις υδατοκαλλιέργειες και προβάλλει εκτεταµένες δυνατότητες για την σύγκριση της γονιδιωµατικής εξέλιξης των σπονδυλωτών. Επιπλέον είναι αξιόπιστο εγχειρίδιο για την κατασκευή αξιόπιστων γονιδιακών χαρτών και παρέχει χρήσιµες πληροφορίες για την ανάλυση συντενιών. Είναι επίσης, χρήσιµο εργαλείο για σηµαντικoύς εµπορικά σκοπούς όπως είναι οι ασθένειες, η αντίσταση στο στρες και είναι πιθανόν να προβάλλει την σχέση µεταξύ των ειδών-µοντέλων. Σε αντίθεση µε τον γενετικό χάρτη, επιτρέπει την χαρτογράφηση µη πολυµορφικών µοριακών δεικτών, επειδή υπάρχουν κοµµάτια DNA. Μονάδα µέτρησης είναι τα centirays (cr) (Senger et al, 2006). 14
2.3. Απόλυτος Φυσικός χάρτης Ο φυσικός χάρτης προκύπτει µε την ανάγνωση της αλληλουχίας του DNA. είχνει την ακριβή θέση ενός γονιδίου πάνω σε ένα χρωµόσωµα. ηλώνει δηλαδή, τις φυσικές αποστάσεις πάνω στο γενετικό υλικό. Τοποθετεί τα γονίδια σε συγκεκριµένη θέση κατά µήκος των χρωµοσωµάτων. Μονάδα µέτρησης είναι τα ζεύγος βάσης (base pair-bp). (Τριανταφυλλίδης, 2001). 2.4. Γονιδιακοί χάρτες Ο γενετικός και ο φυσικός χάρτης είναι τα δύο κύρια είδη των γονιδιακών χαρτών. Ο απώτερος σκοπός τους είναι να προσδιορισθούν γονίδια, ειδικότερα αυτά που είναι συνδεδεµένα µε ασθένειες. Όταν προσδιορισθεί ένα γονίδιο, είναι εύκολο να ανιχνευθεί η αλληλουχία DNA του και να µελετηθεί το πρωτεϊνικό προϊόν. Με την ταυτοποίηση γενετικών επισηµαντών-δεικτών, καθίσταται δυνατή η γνώση της τοποθεσίας στο γονιδίωµα, κατά προσέγγιση, του γονιδίου που σχετίζεται µε την ασθένεια. Με αυτόν τον τρόπο, η αναζήτηση από τα περίπου τρία δισεκατοµµύρια ζεύγη βάσεων ολόκληρου του γονιδιώµατος, περιορίζεται σε µια περιοχή που εκτείνεται µεταξύ λίγων εκατοµµυρίων ζευγών βάσεων. Στη συνέχεια αναζητώνται γονίδια σε αυτήν την περιοχή του γονιδιώµατος και µελετώνται ένα προς ένα προκειµένου να προσδιορισθεί το γονίδιο που ευθύνεται για την συγκεκριµένη ασθένεια, κάθε φορά. Μελλοντικά, οι λεπτοµερέστεροι γονιδιακοί χάρτες πρόκειται να βοηθήσουν στην εύρεση των επιθυµητών γονιδίων γρηγορότερα (Τριανταφυλλίδης, 2001). Επίσης, ενδέχεται να βοηθήσουν στη µελέτη πολύπλοκων ανθρώπινων ασθενειών και χαρακτηριστικών που συνδέονται µε πολλά γονίδια. Επιπροσθέτως, οι γονιδιακοί χάρτες είναι χρήσιµοι στις καθηµερινές εργαστηριακές δραστηριότητες της µοριακής βιολογίας. Στο εργαστήριο, το ανθρώπινο γονιδίωµα ζει µε τη µορφή των «κλώνων»- κοµµατιών DNA τα οποία έχουν κατακερµατιστεί και ενσωµατωθεί µέσα στο DNA βακτηρίων ή άλλων κυττάρων. Αυτή η µέθοδος διατηρεί κάθε κοµµάτι του γονιδιώµατος ξεχωριστά από τα υπόλοιπα αλλά το καθιστά και διαθέσιµο σε πολλά αντίγραφα για την διευκόλυνση των πειραµάτων και της µελέτης. Ακόµη, συµβάλλουν στην ανακάλυψη και µελέτη πολλών σηµαντικών τµηµάτων του γονιδιώµατος, όπως 15
είναι κάποια που περιέχουν ασυνήθιστα υψηλή συγκέντρωση γονιδίων (Hartl D & Jones E., 2005). Τέλος, οι γονιδιακοί χάρτες διευκολύνουν τη σύγκριση των γονιδιωµάτων διαφορετικών ειδών βάσει της διαδικασίας της εξέλιξης. Όσον αφορά σε είδη µε πολύ µεγάλα γονιδιώµατα (άνθρωπος), η δηµιουργία ενός περιεκτικού γονιδιακού χάρτη είναι γρηγορότερη και ευκολότερη από την αλληλούχιση (sequencing) ολόκληρου του γονιδιώµατος. Για τη χαρτογράφηση απαιτείται µικρότερη συλλογή και οργάνωση από ότι στην αλληλούχιση και µικρότερο κόστος. Τα γονιδιώµατα των οργανισµών που έχουν χαρτογραφηθεί και έχουν δηµοσιευθεί αναφέρονται σε 21 θηλαστικά, 9 χορδωτά είδη και σε 4 ευκαρυωτικά είδη. Αναφορικά στους τελεόστεους, έχουν χαρτογραφηθεί µέχρι σήµερα τα γονιδιώµατα των εξής 5 ειδών : Danio rerio (zebrafish, Cypriniformes), Oryzias latipes (medaka, Beloniformes), Tetraodon nigroviridis (Tetraodon,Tetraodontiformes), Takifugu rubripes (Fugu,Tetraodontiformes), Gasterosteus aculeatus (Stickleback, Gasterosteiformes) Πηγή : (http://www.ensembl.org/index.html). 3. Υδατοκαλλιέργειες και βιοτεχνολογία 3.1 Γενικές πληροφορίες για τις υδατοκαλλιέργειες Τα ψάρια κυρίως και γενικότερα οι υδρόβιοι οργανισµοί, αποτελούν ένα σηµαντικό τµήµα της διατροφής των ανθρώπων. Έχουν υψηλή διατροφική αξία καθώς περιέχουν διάφορες βιταµίνες απαραίτητες για τον οργανισµό και Ω-3 λιπαρά οξέα που έχουν συνδεθεί µε την µείωση της εµφάνισης καρδιαγγειακών παθήσεων στους ανθρώπους. Συνεπώς, η κατανάλωση ψαριών αυξάνεται και γεννιέται η ανάγκη παραγωγής ικανού αριθµού ψαριών κατά τη διάρκεια του έτους, µε καλά ποιοτικά χαρακτηριστικά. Η υδατοκαλλιέργεια παρουσιάζει µεγάλη ποικιλοµορφία και αφορά ένα ευρύ φάσµα ειδών, συστηµάτων και πρακτικών. Η συµµετοχή της υδατοκαλλιέργειας στο εµπόριο, τόσο στο τοπικό όσο και στο διεθνές, παρουσιάζει επίσης αύξηση. Καλύπτει το 50% της παγκόσµιας παραγωγής ψαριών. Η Ελλάδα κατατάσσεται πρώτη στη Μεσόγειο από άποψη θαλάσσιων ιχθυοκαλλιεργειών. Ειδικότερα, παρουσιάζει µέση ετήσια παραγωγή 100.000 τόνων : ένα στα δύο ψάρια που 16
παράγονται σε µεσογειακές καλλιέργειες είναι ελληνικό και το 80% της εγχώριας παραγωγής εξάγεται, µε κυριότερα την τσιπούρα και το λαβράκι (FAO, 2006). Η τσιπούρα (Sparus aurata) είναι ένας θαλάσσιος τελεόστεος που ανήκει στην οικογένεια των Sparidae. Πηγή : (www.fishbase.org) Αυτή η οικογένεια περιέχει >100 είδη, που χωρίζονται σε δύο µεγάλους κλάδους (οµάδα Α και Β) σύµφωνα µε πρόσφατα µοριακά δεδοµένα (ORRELL and CARPENTER, 2004). Το κυρίαρχο χαρακτηριστικό της οικογένειας των Sparidae είναι η ποικιλία των µηχανισµών φυλοκαθορισµού. Υπάρχουν γονοχωριστικά είδη αλλά και ερµαφρόδιτα. Τα ερµαφρόδιτα είδη είναι είτε πρωτανδρικά (αρχικά είναι αρσενικά και µετά γίνονται θηλυκά), είτε πρωτογύναια (αρχικά είναι θηλυκά και µετά γίνονται αρσενικά). Η αναστροφή του φύλου καθίσταται δυνατή από την παρουσία µιας διφυλετικής γονάδας. Κάποια άλλα σπαροειδή έχουν διφυλετική γονάδα αλλά ποτέ δεν συµβαίνει αναστροφή του φύλου (ατελώς ερµαφρόδιτα). Ποικιλία στον καθορισµό του φύλου συµβαίνει και µέσα στα άτοµα του ίδιου είδους. Στην τσιπούρα, στα δύο χρόνια τα περισσότερα άτοµα γίνονται θηλυκά. Φαινόµενο που µπορεί πολλές φορές να µη συµβεί σε όλα τα αρσενικά, γιατί κάποια ζώα είτε καθυστερούν ή ποτέ δεν αλλάζουν φύλο, πιθανότατα λόγω κοινωνικών, περιβαλλοντικών και γενετικών παραγόντων (ZOHAR, 1978). Η τσιπούρα είναι ευρύαλο ψάρι και δεν µπορεί να ανεχτεί µεγάλος εύρος θερµοκρασιών. Συναντάται σε παράκτιες θαλάσσιες περιοχές, µε αµµώδεις βυθούς και µαύρες φυκιάδες (Posidonia oceanica) σε βάθη από 5-30 µέτρα και σε τροπικά νερά, µε την µέγιστη ποικιλότητα στον Βορειοανατολικό Ατλαντικό και στην περιοχή της Μεσογείου (Bauchot and Hureau, 1986). Προτιµά τα υφάλµυρα νερά,όπου και αναπτύσσεται πιο γρήγορα και το κρέας της παίρνει µια χαρακτηριστική γεύση. Είναι ερµαφρόδιτο ψάρι και αποτελεί είδος µε µεγάλο ενδιαφέρον για την αλιεία και τις υδατοκαλλιέργειες. Το κρέας του είναι άσπρο, τρυφερό, εξαιρετικής ποιότητας. 17
Έχει υψηλή εµπορική αξία µε µέσο όρο παραγωγής από καλλιέργεια της τάξης των 100 εκατοµµυρίων µετρικών τόνων/ έτος. Η ολική καλλιεργούµενη παραγωγή ανέρχεται στους 76000 τόνους (FAO 2005). Εξάγεται κυρίως στη Γαλλία, Ιταλία και Ισπανία. Το λαβράκι (Dicentrarchus labrax ) ανήκει στην οικογένεια των Moronidae. Απαντάται σε λιµνοθάλασσες, εκβολές, παράκτιες περιοχές και ποτάµια. Πηγή : (www.fishbase.org) Έχει ένα εύρος βάθους της τάξης των 10-100 µέτρων αλλά συνήθως απαντάται σε ρηχά νερά. Εξαπλώνεται στα νερά µέσα και γύρω από την Ευρώπη, συµπεριλαµβανοµένου και τον ανατολικό Ατλαντικό Ωκεανό ( από την Νορβηγία έως τη Σενεγάλη), τη Μεσόγειο και τη Μαύρη Θάλασσα. Είναι ευρύθερµο και ευρύαλο ψάρι µε µεγάλο εµπορικό ενδιαφέρον, καθώς είναι από τα κυρίαρχα ψάρια των υδατοκαλλιεργειών στην Ελλάδα και στην Ευρώπη. Η Ελλάδα αποτελεί τον σηµαντικότερο προµηθευτή φρέσκου λαυρακιού στην Ευρώπη ( 9.909 τόνοι το 2004, FAO). 3.2.Βιοτεχνολογία στις υδατοκαλλιέργειες Πηγή : (http://www.agwest.sk.ca/publications/infosource) Η βιοτεχνολογία χρησιµοποιείται µε πολλούς διάφορους τρόπους στις υδατοκαλλιέργειες. Οι ερευνητές χρησιµοποιούν την τεχνική µεταφοράς γονιδίων από το ένα είδος στο άλλο (transgenics) για να εισάγουν επιθυµητά 18
χαρακτηριστικά στους οργανισµούς ώστε να δηµιουργήσουν πιο ανθεκτικά είδη (Hew and Fletcher, 2001, Melamed et al, 2002). Οι έρευνες αφορούν στην παραγωγή τροποποιηµένων (transgenic) ψαριών µεταφέροντας γονίδια που κωδικοποιούν αντιµικροβιακά πεπτίδια όπως είναι η λυσοζύµη και γίνεται µια προσπάθεια καθορισµού της ανθεκτικότητας στις ασθένειες (Melamed et al, 2002). Οι µελέτες κατευθύνονται προς την παραγωγή ψαριών µε µεγαλύτερο µήκος, ταχύτερη ανάπτυξη, µεγαλύτερη ικανότητα αφοµοίωσης της τροφής στο µυικό σύστηµα, ανεπτυγµένο ανοσοποιητικό σύστηµα, ανθεκτικότητα σε συνθήκες χαµηλών συγκεντρώσεων οξυγόνου και χαµηλών θερµοκρασιών. Η ανάπτυξη ψαριών µε µεγαλύτερο µήκος και βάρος είναι ο στόχος των ερευνητών που ασχολούνται µε την εφαρµογή διαφόρων τύπων αυξητικών ορµονών στα ψάρια (Hulata, 2001).Τα ψάρια είναι πολύ αποτελεσµατικά στην ανάπτυξή τους, απαιτούν λιγότερη ενέργεια από τα υπόλοιπα ζώα. Γενικότερα, η γενετική βελτίωση των καλλιεργούµενων ειδών περιέχει την επιλογή, την εκτροφή µε διασταύρωση εντός και εκτός πληθυσµού και την υβριδοποίηση. Η ανίχνευση των QTL είναι ακόµη µια σηµαντική εφαρµογή της βιοτεχνολογίας στις υδατοκαλλιέργειες καθώς βοηθούν στον σχεδιασµό κατάλληλων γενετικών επισηµαντών-δεικτών (markers) µε στόχο να αναπτύξουν αποτελεσµατικότερα προγράµµατα υδατοκαλλιεργειών (Agresti et al., 2000). Η περιοχή ποσοτικού χαρακτηριστικού (Quantitative trait loci- QTL) ή γονιδιακή περιοχή µε διακριτά χαρακτηριστικά, είναι κοµµάτια DNA στο γονιδίωµα, στενά συνδεδεµένα µε τα επιθυµητά κάθε φορά γονίδια και σχετίζονται µε µια παραγωγική ιδιότητα ή κάποιο διακριτό (φαινοτυπικό) χαρακτηριστικό. Η γονιδιακή περιοχή µε διακριτά χαρακτηριστικά, δίνει τη δυνατότητα της µοριακής αναγνώρισης (π.χ. µε την µέθοδο της PCR) και της συµβολής στη χαρτογράφηση γονιδιακών περιοχών που περιέχουν γονίδια τα οποία καθορίζουν κάποιο ποσοτικό χαρακτηριστικό. Ακόµη, είναι δυνατόν να αποτελέσει ένα πρώιµο στάδιο στην ταυτοποίηση και αλληλούχιση των γονιδίων που καθορίζουν κάποιο ποσοτικό χαρακτηριστικό αλλά και στην εξαγωγή του συµπεράσµατος για τον αριθµό των γονιδίων τα οποία έχουν την ικανότητα να ελέγχουν µια ιδιότητα ή ένα συγκεκριµένο χαρακτηριστικό. Επίσης, όταν είναι γνωστός ο φαινότυπος µιας περιοχής DNA, µπορεί να γίνει αλληλούχιση. Συνεπώς, η αλληλουχία DNA οποιουδήποτε γονιδίου µπορεί να συγκριθεί µε την 19
βάση δεδοµένων του DNA για γονίδια των οποίων η λειτουργία είναι γνωστή. Οι αναλύσεις των QTL µπορούν να συνδυαστούν ακόµη µε µικροδιατάξεις DNA µε σκοπό την ανίχνευση γονιδίων που σχετίζονται µε ασθένειες (Zeng et al, 1994). Η κληρονοµησιµότητα των χαρακτηριστικών, ο µέσος όρος επίδρασης της υποκατάστασης αλληλοµόρφων γονιδίων από αλληλόµορφα γονίδια που είναι κληρονοµήσιµα, η απόσταση στον ανασυνδυασµό ανάµεσα σε γονιδιακές περιοχές µε διακριτά χαρακτηριστικά (QTL) και σχετιζόµενους γενετικούς δείκτες καθώς και το µέγεθος του δείγµατος των απογόνων, αποτελούν κοµβικά σηµεία στην ανίχνευση των γονιδιακών περιοχών µε τα διακριτά χαρακτηριστικά (QTL) (Wang et al, 2006). 4. Στόχοι της πτυχιακής εργασίας Η παρούσα εργασία έχει ως στόχο την χαρτογράφηση γονιδίων της τσιπούρας (Sparus aurata) ώστε να καταστούν δυνατά τα εξής : η σύγκριση µε το γονιδίωµα του medaka (Oryzias latipes) η χαρτογράφηση διαφορετικώς εκφρασµένων γονιδίων-στόχων (genes candidates) για ανίχνευση γονιδιακών περιοχών που περιέχουν διακριτά χαρακτηριστικά (QTL) η βελτίωση γενετικού χάρτη Η έρευνα, εκπονήθηκε στα εργαστήρια Γενετικής, στο Ινστιτούτο Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής του Ελληνικού Κέντρου Θαλασσίων Ερευνών, παράρτηµα Κρήτης, στα πλαίσια του προγράµµατος BRIDGEMAP. 20
ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟ ΟΙ 1.1. ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΜΕΘΟ ΟΥ 1.1.1. PCR Η βασική µέθοδος που εφαρµόστηκε στα πλαίσια της παρούσας εργασίας είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR). Είναι µια σχετικά νέα µέθοδος που επιτρέπει τον ενζυµικό πολλαπλασιασµό in vitro επιλεγµένων αλληλουχιών του DNA από ελάχιστες αρχικές ποσότητες υλικού. Μέσω της PCR καθίσταται δυνατή η παραγωγή τεράστιου αριθµού πιστών αντιγράφων µιας συγκεκριµένης αλληλουχίας DNA µε απλό σχετικά τρόπο. Χάρη στην εξαιρετική ταχύτητα, ευαισθησία και εντυπωσιακή της απλότητα, η αντίδραση της PCR αποτελεί σήµερα το πλέον βασικό και ουσιαστικό εργαλείο στη διερεύνηση της γενετικής ποικιλότητας των διαφόρων πληθυσµών, αλλά και στις µελέτες της µοριακής γενετικής, γενικότερα (Τριανταφυλλίδης, 2001). Η αρχή λειτουργίας της µεθόδου βασίζεται στη χρήση µιας ειδικής DNA (της θερµοσταθερής Taq DNA πολυµεράσης που έχει αποµονωθεί από το θερµόφιλο βακτήριο Thermus aquaticus και αντέχει σε θερµοκρασίες έως 95 ο C), ενός ζεύγους συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων (συνήθως 20-30 βάσεων) που ονοµάζονται εκκινητές ( primers), ενός διαλύµατος ελεύθερων 5 τριφωσφορικών δεοξυριβοζονουκλεοσιδίων (dntp s), ενός διαλύµατος MgCl 2, ενός ειδικού διαλύµατος για την Τaq DNA πολυµεράση και στην παρουσία µιας ποσότητας DNA που παίζει το ρόλο του µορίου-µήτρας. Για την επιλογή των δύο κατάλληλων αλληλουχιών-αφετηριών πρέπει να είναι γνωστή η αλληλουχία των βάσεων των δύο άκρων του τµήµατος του DNA, το οποίο µελετάται. Η αλληλουχία του κάθε εκκινητή είναι συµπληρωµατική µε την αλληλουχία ενός κλώνου της δίκλωνης έλικας του DNA στα δύο αντίθετα άκρα της επιλεγµένης περιοχής. εν είναι απαραίτητο να έχει αποµονωθεί µόνο η αλληλουχία DNA που πρόκειται να ενισχυθεί διότι αυτή µπορεί να καθοριστεί από τους εκκινητές που χρησιµοποιούνται στην αντίδραση (Τριανταφυλλίδης, 2001). Ένα τυπικό πρωτόκολλο της PCR διακρίνεται σε τρεις φάσεις: την αποδιάταξη της διπλής έλικας (denaturation), την πρόσδεση (annealing) των 21
ειδικών εκκινητών µε τις απλές έλικες και την επέκταση (extension) των εκκινητών. Στην πρώτη φάση της αντίδρασης σε υψηλή θερµοκρασία, 92 ο C, η διπλή έλικα του DNA διασπάται σε δύο µονές έλικες. Αµέσως µετά (β φάση) σε θερµοκρασία χαµηλότερη µε διαφορά της τάξης των 35 ο C - 40 ο C (η θερµοκρασία αυτού του σταδίου εξαρτάται από την αλληλουχία των εκκινητών) οι εκκινητές (primers) προσδένονται πάνω στο µόριο RNA µε τα αντίστοιχα συµπληρωµατικά προς αυτά άκρα των δύο αλυσίδων. Στην τρίτη φάση η θερµοκρασία ανεβαίνει στους 72 ο C, οπότε η πολυµεράση καταλύει την επέκταση του κάθε ολιγονουκλεοτιδίου σύµφωνα µε την αλληλουχία που χρησιµοποιείται σαν εκµαγείο. Η επέκταση γίνεται πάντοτε προς την πλευρά της 3 θέσης. Η διαδικασία επαναλαµβάνεται αρκετές φορές. Έτσι, από τη µία διπλή έλικα δηµιουργούνται δύο διπλές έλικες, στον αµέσως επόµενο κύκλο οι έλικες έχουν γίνει 4 και ο πολλαπλασιασµός συνεχίζεται εκθετικά για 50 κύκλους. Το αποτέλεσµα είναι ο πολλαπλασιασµός του τµήµατος στόχου µέχρι µερικά εκατοµµύρια φορές σε λίγες ώρες (Τριανταφυλλίδης, 2001). Εικόνα 1. Απεικόνιση της διαδικασίας της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης ( PCR). Παρουσιάζονται και τα 3 στάδια που περιέχει για παραπάνω από ένα κύκλους (http://en.wikipedia.org/wiki/pcr). 22
Για την PCR χρησιµοποιήθηκαν πλάκες τύπου Thermowell 96 Well plate Model (M) Polycarbonate 1/Pack, 25/case, µη αποστειρωµένες της Corning Incorporated costar 6511. Πρόκειται για πλάκες που διαθέτουν 96 θέσεις που κατατάσσονται σε 8σειρές. Ακόµη έγινε χρήση αντιστοίχων πλακών τύπου Biorad. Χρησιµοποιήθηκαν δύο διαφορετικά ένζυµα Taq πολυµεράσης: της εταιρίας GENAXXON bioscience µε χαρακτηριστικά 250Units U/µl και της εταιρίας FINNZYMES F501LDyNAzyme µε χαρακτηριστικά 112U/µl 500µl. Σε κάθε ένζυµο αντιστοιχεί ένα ρυθµιστικό διάλυµα 10x. Στις αντιδράσεις όπου χρησιµοποιήθηκε το πρώτο ένζυµο, αναλώθηκε ρυθµιστικό διάλυµα 10Χ PCR Buffer S 15Mm MgCl 2 : 1,0 µl και µε το δεύτερο ένζυµο έγινε χρήση του διαλύµατος Buffer F-511 10X. Το διάλυµα των dntp s περιείχε 40 µmoles από την κάθε βάση : datp, dctp, dgtp και dttp. Ο επισηµαντής-δείκτης (Marker) που χρησιµοποιήθηκε είναι ο GeneRuler 50bp DNA Ladder 0.1 µg/µl, 50 µg, Load 4µl της FERMENTAS. Όλα τα παραπάνω µαζί µε τους αντίστοιχους εκκινητές κάθε φορά, µεταφέρονταν µε τις αντίστοιχες πιπέτες σε πλαστικά φιαλίδια (eppendorf) των 1.5 ml,µε αποτέλεσµα την δηµιουργία ενός µείγµατος (Mastermix) στο οποίο περιέχονταν οι ακόλουθες ποσότητες : Taq: 11 µl Buffer: 110 µl ιάλυµα dntp s: 22 µl 20 µμ Primer (Forward+Reverse): 44 µl H 2 O (MERCK): 693 µl Είναι ιδιαίτερα σηµαντική η διατήρηση της πολυµεράσης, λόγω του µεγάλου κόστους της και της εξαιρετικής ευαισθησίας της. Έτσι, καθ όλην την διάρκεια της διαδικασίας πρέπει να παραµένει σε χαµηλές θερµοκρασίες (-20 ο C) και να είναι πάντα το τελευταίο συστατικό που προστίθεται στο µείγµα. Τα υπόλοιπα υλικά παραµένουν σε πάγο κατά την παρασκευή του µείγµατος προκειµένου να εξασφαλιστεί η διατήρηση τους. Στην συνέχεια το µείγµα αναδεύεται µε την βοήθεια της πιπέτας, ώστε να αναµειχθούν τα συστατικά και να διαλυθεί η γλυκερόλη που περιέχεται στο διάλυµα της πολυµεράσης. Μόλις ολοκληρωθεί η µεταφορά όλων αυτών πιπετάρεται πολύ καλά το µείγµα λόγω της γλυκερόλης που περιέχεται στην Taq, που είναι παχύρρευστη. 23
Από αυτό το µείγµα µεταφέρονται 8 µl σε κάθε µία από τις 96 θέσεις των πλακών της PCR. Σε αυτά ήδη έχουν µεταφερθεί 2 µl DNA τσιπούρας (Senger et al., 2005, Sarropoulou et al., 2007). Μόλις ολοκληρωθεί η διαδικασία αυτή, οι πλάκες καλύπτονται µε ειδικά αυτοκόλλητα και µεταφέρονται στην συσκευή φυγοκέντρισης για φυγοκέντριση ενός λεπτού. Ο τελικός όγκος µέσα σε κάθε κελί της πλάκας είναι 10 µl. Οι πλάκες τοποθετούνται σε PCR µηχανές (MJ Research, USA) όπου εκτελείται η µέθοδος των τριών φάσεων που περιγράφηκε παραπάνω, διάρκειας µίας ώρας και πενήντα λεπτών. Μετά το τέλος αυτής της χρονικής διάρκειας, οι πλάκες PCR φυλάσσονται στο ψυγείο ή σε πάγο µέχρις ότου παρασκευασθεί το πήκτωµα αγαρόζης. Όλα τα παραπάνω προϊόντα φυλάσσονται στους -20 ο C. 1.1.2. ΥΒΡΙ ΙΚΟ ΠΑΝΕΛ Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκε ένα υβριδικό πάνελ (RH panel) που περιέχει 93 υβρίδια-κλώνους από κοµµάτια DNA τσιπούρας και Hamster και τρία σηµεία ελέγχου (control points), νερό, DNA από hamster και DNA από τσιπούρα. Μέσω των control points διαπιστώνεται αν ο επισηµαντής- δείκτης (marker) που χρησιµοποιείται είναι ικανός να πολλαπλασιάσει και DNA από ή όχι. Αν στο δείγµα του hamster υπάρχει προϊόν PCR στο ίδιο µέγεθος µε της τσιπούρας τότε αυτός ο εκκινητής (primer) δεν είναι κατάλληλος για χρήση. Πηγή : (www.biochem4.okstate.edu) Το DNA του hamster χρησιµοποιείται µόνο ως εργαλείο. Η ποιότητα του πάνελ εξακριβώθηκε µε την κατασκευή ενός υβριδικού (radiation hybrid-rh) χάρτη υψηλής ανάλυσης (2 Mb). Ο χάρτης αυτός περιελάµβανε 440 δείκτες 24
(markers:288 µικροδορυφορικά, 82 gene-based δείκτες και 70 STS), κατάλληλα για ανάλυση γονιδίων που προκαλούν γενετικές ασθένειες και για συγκριτικές µελέτες µεταξύ γενετικών χαρτών (Senger et al, 2006). 1.1.3. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΠΗΚΤΩΜΑΤΟΣ ΑΓΑΡΟΖΗΣ Η αγαρόζη είναι ένας ευθύγραµµος πολυσακχαρίτης ο οποίος εκχυλίζεται σε µεγάλες ποσότητες από αρκετά είδη ερυθροφύκων και ιδιαίτερα από τα είδη Gelidium, Gelidiella και Pterocladia. Σε µια κωνική φιάλη των 200ml µεταφέρονται 4gr αγαρόζης και 100ml 1Χ ΤΑΕ (2% ΤΑΕ-GEL). Έπειτα η φιάλη τοποθετείται σε φούρνο µικροκυµάτων για 8 λεπτά. Μετά το τέλος των 8 λεπτών τοποθετείται η φιάλη κάτω από την βρύση για να κρυώσει λίγο. Κατόπιν µεταφέρεται στον απαγωγό και προστίθενται 10µl βρωµιούχο αιθίδιο (EtBr), ενώ αναδεύεται ελάχιστα. Το διάλυµα χύνεται οµοιογενώς στην ειδική πλάκα ηλεκτροφόρησης στην οποία τοποθετούνται 16 «χτενάκια», ξεκινώντας από την µέση της πλάκας αυτής. Το κάθε «χτενάκι» αποτελείται από έναν οριζόντιο άξονα κατά µήκος του οποίου ξεκινούν 24 κάθετοι άξονες (θέσεις) και χρησιµοποιείται για την δηµιουργία οπών-θέσεων µέσα στο πήκτωµα αγαρόζης. Η πλάκα ηλεκτροφόρησης που περιέχει το πήκτωµα αγαρόζης αφήνεται για λίγα λεπτά µέσα στον απαγωγό ώστε να στερεοποιηθεί (πολυµερισµός). Στις πλάκες της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR) που περιείχαν το υλικό του µείγµατος που παρασκευάστηκε για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) µεταφέρονται 4 µl πορτοκαλί χρωστικής σε κάθε θέση και τοποθετούνται στη φυγόκεντρο για ένα λεπτό. Σε αυτό το στάδιο το υλικό από τις πλάκες PCR είναι έτοιµο να µεταφερθεί στο πήκτωµα αγαρόζης σε συσκευή ηλεκτροφόρησης τύπου CONSORT E865 (600V- 500 ma ) στα 200V για 20 λεπτά. Το βρωµιούχο αιθίδιο είναι καρκινογόνο και χρήζει υψηλής προσοχής κατά την χρήση του. Ωστόσο, είναι πολύ χρήσιµο για το πείραµα. Έχει την ιδιότητα να εισχωρεί στις έλικες του DNA και να το κάνει να φωσφορίζει όταν το τελευταίο εκτεθεί σε υπέρυθρη ακτινοβολία µε αποτέλεσµα να καθίσταται δυνατή η ανίχνευση του DNA και η εξέταση των αποτελεσµάτων της PCR. 25
1.1.4. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Πρόκειται για µια τεχνική διαχωρισµού φορτισµένων µορίων (του DNA στο πείραµα αυτό). Το DNA είναι ένα αρνητικά φορτισµένο µόριο το οποίο κινείται µε το ηλεκτρικό ρεύµα διαµέσου του πήγµατος της αγαρόζης από τον αρνητικό πόλο προς τον θετικό της συσκευής ηλεκτροφόρησης. Η συσκευή ηλεκτροφόρησης περιέχει ΤΑΕ Βuffer 1Χ και 27µl βρωµιούχο αιθίδιο (EtBr).Ο θετικός πόλος βρίσκεται στο πάνω άκρο και ο αρνητικός στο κάτω. Η πλάκα που περιέχεται το πήκτωµα της αγαρόζης τοποθετείται στην συσκευή ηλεκτροφόρησης. Μεταφέρονται 4 µl δείκτη DNA των 50 bp στο πήκτωµα. Στη συνέχεια µεταφέρονται 14µl από το προϊόν της PCR και στο πήκτωµα παρέχεται ηλεκτρικό ρεύµα τάσης 200V για 20 λεπτά. Μετά από τα 20 λεπτά το πήκτωµα τεµαχίζεται µε λεπίδα σε τέσσερα τµήµατα και τοποθετείται σε λάµπα µε υπεριώδη ακτινοβολία (UV) εξοπλισµένη µε φωτογραφική µηχανή CCD (UVP VILBER LOURMAT) που συνδέεται µε επιτραπέζιο ηλεκτρονικό υπολογιστή. Οι φωτογραφίες µεταφέρονται απευθείας στον υπολογιστή και γίνεται επεξεργασία τους µε το πρόγραµµα GRAB-IT 2.0. Όλες οι παραπάνω διαδικασίες πραγµατοποιούνται µε την χρήση αποστειρωµένων γαντιών. Ιδιαίτερα κατά την επαφή µε το EtBr και της διαδικασία της ηλεκτροφόρησης χρησιµοποιούνται ειδικά γάντια,περισσότερο ανθεκτικά, σε συνδυασµό µε τα άλλα κοινά γάντια λόγω του EtBr που είναι καρκινογόνο-µεταλλαξιογόνο και της υπεριώδους ακτινοβολίας (UV). Τα tips που χρησιµοποιούνται για τις πιπέτες αποστειρώνονται σε κλίβανο ξηράς αποστείρωσης και χρησιµοποιούνται µόνο µία φορά. Στα πλαίσια της παρούσας µελέτης η πρώτη διαδικασία που πραγµατοποιήθηκε ήταν η δοκιµή των 96 συνεχών (contig) εκκινητών της τσιπούρας µε γενωµικό DNA και όχι DNA από το υβριδικό (RH) πάνελ, για να διαπιστωθεί αν δίνουν προϊόν PCR ή όχι οι εκκινητές και ανάλογα να ακολουθήσει η διαδικασία γονοτύπησης των εκκινητών αυτών χρησιµοποιώντας DNA από το υβριδικό πάνελ. Το γενωµικό DNA της τσιπούρας είναι από δείγµατα ψαριών από µονάδες υδατοκαλλιεργειών της Ιθάκης και έχει κωδικό F3A. Έγινε αραίωση 1:50 µε αποτέλεσµα να προκύψουν 300µl DNA. Για την δοκιµή των εκκινητών παρασκευάστηκε ένα µείγµα (mastermix) για 110 αντιδράσεις και όχι 96 26
αντιδράσεις όσες και οι θέσεις της πλάκας PCR (για ασφάλεια) µε τις ακόλουθες ποσότητες : DNA: 220 µl Buffer: 110 µl ιάλυµα dntp s: 22 µl 20 µμ Primer (Forward+Reverse): 44 µl Taq: 11 µl H 2 O (MERCK) : 693 µl Το παραπάνω δείγµα µεταφέρθηκε σε µια πλάκα PCR και τοποθετήθηκε σε ειδικό εξοπλισµό PCR στις συνθήκες που περιγράφηκαν στην παράγραφο 1.1.1. Πριν αρχίσει η γονοτύπηση των εκκινητών της παρούσας εργασίας, έγινε δοκιµή της αντίδρασης αλυσιδωτής πολυµεράσης (PCR) µε τον εκκινητή Ad46 του οποίου τα αποτελέσµατα είναι γνωστά από προηγούµενες επανειληµµένες δοκιµές PCR, χρησιµοποιώντας DNA από το υβριδικό (RH) πάνελ ώστε να γίνει έλεγχος επιµόλυνσης. εν διαπιστώθηκε επιµόλυνση οπότε ακολούθησε η διαδικασία γονοτύπησης. Οι εκκινητές contig είναι αλληλουχία DNA που συναρµολογείται από επικαλυπτόµενες βραχύτερες αλληλουχίες ώστε να σχηµατισθεί µια µεγάλη συνεχής αλληλουχία (Staden R.,1980). Οι συνεχείς εκκινητές (contig) της τσιπούρας που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία σχεδιάστηκαν χρησιµοποιώντας το λογισµικό Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgibin/primer3/primer3_www.cgi) (Senger et al, 2006) και βασίστηκαν στα αποτελέσµατα της τεχνικής των µικροδιατάξεων (microarray) που εφαρµόστηκε σε γονίδια υπεύθυνα για στρες και γονίδια που εκφράζονται σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια των οργανισµών (Senger et al, 2006). Η δοκιµή µε το γενωµικό DNA εφαρµόστηκε και στους 27 εκκινητές Sparus aurata-tetraodon nigroviridis. Ο σχεδιασµός πραγµατοποιήθηκε από το ένα και µοναδικό γονίδιο της τσιπούρας που βρέθηκε να αντιστοιχεί στο 20 ο χρωµόσωµα του Tetraodon nigroviridis ( Sarropoulou et al., 2007). Οι εκκινητές που σχεδιάστηκαν πάνω στο γονιδίωµα του medaka έχουν σαν στόχο την εύρεση οµόλογων γονιδίων στην τσιπούρα ώστε να γίνει η σύγκριση των δύο ψαριών (Naruse et al., 2006). 27
Οι 10 νέοι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν σχεδιάστηκαν επειδή οι 27 εκκινητές Sparus aurata-tetraodon nigroviridis δεν έδωσαν ικανοποιητικά αποτελέσµατα (Sarropoulou et al., 2007). Το µείγµα (mastermix) που παρασκευάστηκε στην προκειµένη περίπτωση για 30 αντιδράσεις, ήταν το εξής : DNA: 60 µl (γενωµικό DNA αραίωσης 1:50) Buffer: 30 µl ιάλυµα dntp s: 6 µl 20 µμ Primer (F+R): 0,4 µl από κάθε εκκινητή (F+R) συγκέντρωσης 20µΜ σε κάθε θέση Taq: 3 µl H 2 O: 200, 6 µl Οι αντιδράσεις τοποθετήθηκαν σε σειρές πλαστικών φιαλιδίων (strips). Στους 96 εκκινητές του medaka δεν έγινε δοκιµή µε το γενωµικό DNA επειδή είχε γίνει παλαιότερα και είχε δώσει πολύ ικανοποιητικά αποτελέσµατα. Μόνο 10 από τους 96 δεν εµφάνισαν προϊόν PCR. Στην παρούσα εργασία έγινε αρχικά γονοτύπηση 12 από αυτούς τους εκκινητές και αφού διαπιστώθηκε ότι εµφάνισαν προϊόν PCR συνεχίστηκε και η γονοτύπηση των υπολοίπων. 2. ΒΙΟΠΛΗΡΟΦΟΡΙΚΗ Η επεξεργασία των αποτελεσµάτων των PCR, αναλύθηκαν µε τη βοήθεια βάσεων δεδοµένων: www.ncbi.nlm.nih.gov και www.pubmed.gov. Στις βάσεις παρέχονται δεδοµένα από δηµοσιεύσεις, που µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την διεξαγωγή συµπερασµάτων. Χρησιµοποιήθηκε επίσης το τοπικό δίκτυο του Ινστιτούτου Θαλάσσιας Βιολογίας και Γενετικής, ΕΛΚΕΘΕ Κρήτης, για την αποθήκευση πληροφοριών. Η περαιτέρω επεξεργασία των δεδοµένων των εκκινητών που γονοτυπήθηκαν έγινε µε τα εργαλεία που παρατίθενται παρακάτω. BLAT Είναι ένα χρήσιµο εργαλείο που χρησιµοποιείται για την στοίχιση και αναζήτηση της τοποθεσίας µιας αλληλουχίας στο γονιδίωµα ή στον καθορισµό της δοµής των εξωνίων ενός mrna (messenger-αγγελιαφόρο RNA) (http://genome.ucsc.edu/faq/faqblat) 28
Η εφαρµογή της τεχνικής γενετικής ανάλυσης BLAT στο DNA οργανισµών λειτουργεί κρατώντας στη µνήµη του ολόκληρο το γονιδίωµα του οργανισµού. Είναι σχεδιασµένο ώστε να βρίσκει µε µεγάλη ταχύτητα αλληλουχίες µε οµοιότητα από 95% και πάνω και µήκος 40 ή περισσότερων βάσεων. Στην παρούσα εργασία εφαρµόστηκε η τεχνική γενετικής ανάλυσης BLAT για να διαπιστωθεί η αντιστοιχία ανάµεσα στις αλληλουχίες των εκκινητών της τσιπούρας µε τα χρωµοσώµατα του medaka και του tetraodon και στην κατασκευή ενός νέου γενετικού πίνακα ( Oxford grid ), του οποίου η πρώτη στήλη αντιπροσωπεύει τις 25 οµάδες του υβριδικού χάρτη (RH groups) της τσιπούρας (Sparus aurata), ενώ η πρώτη γραµµή τα χρωµοσώµατα του medaka (Oryzias latipes) (Sarropoulou et al., 2007). Ο γενετικός αυτός πίνακας παρουσιάζει τον αριθµό των οµόλογων γονιδίων που διατηρήθηκαν µετά την διαδικασία διπλασιασµού του γονιδιώµατος όλων των σπονδυλωτών. Τα αποτελέσµατα που έγιναν αποδεκτά είναι αυτά που εµφάνισαν σκορ και ποσοστό (identity) µεγαλύτερα από 80. BLAST Είναι ένα χρήσιµο εργαλείο αναζήτησης, στοίχισης αλληλουχιών, όπως το BLAT. Παρέχει µια µέθοδο για γρήγορη αναζήτηση νουκλεοτιδικών και πρωτεϊνικών βάσεων δεδοµένων (www.ncbi.nlm.nih.gov/education/blast). Καθορίζει επίσης, περιοχές µε οµοιότητες στις πρωτεΐνες οι οποίες είναι πιθανό να προβάλλουν σηµαντικές ενδείξεις για την λειτουργία αχαρακτήριστων πρωτεϊνών. Η εφαρµογή της τεχνικής γενετικής ανάλυσης BLAST για νουκλεοτίδια (nucleotide blast-blastn), αναζητά µια βάση δεδοµένων για νουκλεοτίδια χρησιµοποιώντας µια νουκλεοτιδική διάταξη. Η εφαρµογή της τεχνικής γενετικής ανάλυσης BLAST για πρωτεΐνες ( protein blast-blastx), αναζητά µια βάση δεδοµένων για πρωτεΐνες χρησιµοποιώντας µια µεταφρασµένη νουκλεοτιδική διάταξη. Με την εφαρµογή της τεχνικής γενετικής ανάλυσης BLAST N επιτεύχθηκε η εύρεση των διατάξεων των εκκινητών, οι οποίοι χρησιµοποιήθηκαν σε νουκλεοτιδικές αλληλουχίες που ανακτήθηκαν από τις βάσεις δεδοµένων. Ακόµη µια χρήσιµη πληροφορία που παρέχει είναι ο έλεγχος της ιδιαιτερότητας των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν κατά την PCR. 29
Η εφαρµογή της τεχνικής γενετικής ανάλυσης BLAST X χρησιµοποιήθηκε µε σκοπό την εύρεση παρόµοιων πρωτεϊνών µε αυτές που κωδικοποιούνται από την νουκλεοτιδική σειρά των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν. Στην παρούσα εργασία τα αποτελέσµατα που έγιναν αποδεκτά είναι αυτά που εµφάνισαν σκορ και ποσοστό (identity) µεγαλύτερα από 80 (http://genome.ucsc.edu/goldenpath/help/blatspec.html). Το πλεονέκτηµα του BLAT έναντι του BLAST είναι η ταχύτητα και η ικανότητα εισαγωγής µεγάλης λίστας αλληλουχιών σε µορφή fasta. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η γονοτύπηση των 236 εκκινητών που έγιναν στην παρούσα εργασία αφορούν στα ψάρια τσιπούρα (Sparus aurata), medaka (Oryzias latipes), tetraodon (Tetraodon nigroviridis) και λαβράκι (Dicentrarchus labrax). Παρουσιάζεται ο αριθµός των εκκινητών που γονοτυπήθηκαν καθώς και ο αριθµός των επαναλήψεων που πραγµατοποιήθηκαν στους εκκινητές αυτών των ψαριών. Πίνακας1. Γονοτύπηση εκκινητών των ψαριών S.aurata, O.latipes, T. nigroviridis, D. labrax. ΤΥΠΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΗ ΑΡΙΘΜΟΣ ΕΠΑΝΑΛΗΨΕΙΣ ΣΥΝΟΛΟ Contig Sparus aurata 96 11 107 Oryzias latipes 96 38 134 Sparus aurata- Tetraodon nigroviridis 27 2 29 Dicentrarchus labrax 7 0 7 Sparus aurata-tetraodon nigroviridis νέα 10 0 10 ΣΥΝΟΛΟ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ 236 30
Η δοκιµή των 96 συνεχών (contig) εκκινητών της τσιπούρας (S.aurata) που έγινε µε το γενωµικό DNA της τσιπούρας (F3A, Ιθάκη) παρουσίασε πολύ ικανοποιητικά αποτελέσµατα. ιαπιστώθηκε ότι µόνο 9 από τους 96 συνεχείς εκκινητές (contig) της τσιπούρας δεν εµφάνισαν (θέσεις χωρίς φωτεινά σηµεία) προϊόν PCR. Η δοκιµή των 96 εκκινητών του medaka είχε γίνει παλαιότερα και έδωσε πολύ ικανοποιητικά αποτελέσµατα. Μόνο 10 από τους 96 δεν εµφάνισαν προϊόν PCR. Επίσης, από τη δοκιµή των 27 εκκινητών Sparus aurata- Tetraodon nigroviridis διαπιστώθηκε ότι µόνο 4 από τους 27 δεν έδωσαν προϊόν PCR. Το αποτέλεσµα της δοκιµής των 96 συνεχών (contig) εκκινητών της τσιπούρας (S.aurata) που έγινε µε το γενωµικό DNA παρουσιάζεται στην παρακάτω εικόνα. Είναι η φωτογραφία του πηκτώµατος αγαρόζης µετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR) στην οποία το προϊόν PCR εµφανίζεται µε την µορφή ζωνών (µπάντες) που αντιπροσωπεύουν το µέγεθος του προϊόντος PCR. Το εκάστοτε µέγεθος διαπιστώνεται από τον επισηµαντή-δείκτη 50 bp (marker) που εισάγεται στην 1 η θέση της κάθε σειράς του πηκτώµατος αγαρόζης. Όταν δεν υπάρχει προϊόν PCR δεν εµφανίζεται καµία ζώνη προϊόντος. Εικόνα 1. Απεικόνιση του αποτελέσµατος της δοκιµής των 96 contig εκκινητών της τσιπούρας (S.aurata) που έγινε µε το γενωµικό DNA. Είναι η φωτογραφία του πηκτώµατος αγαρόζης µετά την ηλεκτροφόρηση για 20 λεπτά στα 200V που δείχνει τις διαφορετικές ζώνες στις οποίες εµφανίζεται το προϊόν PCR των 87 εκκινητών µέσα στις θέσεις του πηκτώµατος της αγαρόζης. Οι 9 εκκινητές που δεν εµφάνισαν προϊόν PCR δεν εµφανίζουν ζώνες (µπάντες). 31
Η γονοτύπηση των 236 εκκινητών µε το υβριδικό (RH) DNA που έγινε στην παρούσα εργασία έδωσε διαφορετικά αποτελέσµατα από αυτά µε το γενωµικό DNA που παρατηρήθηκαν στις δοκιµές των εκκινητών που πραγµατοποιήθηκαν. Η διαφορά που παρατηρείται ανάµεσα στο υβριδικό και το γενωµικό DNA οφείλεται στο γεγονός ότι το υβριδικό DNA είναι πιο ευαίσθητο. Τα αποτελέσµατα από την γονοτύπηση µε το υβριδικό DNA παρουσιάζονται αναλυτικά στους πίνακες 2 και 3. Κατηγοριοποιούνται µε βάσει την ύπαρξη ή όχι προϊόντος PCR και στην εµφάνιση προϊόντος PCR µόνο στη θέση της τσιπούρας (S.aurata) στο πήκτωµα της αγαρόζης µετά την ηλεκτροφόρησή τους. Πίνακας 2. Απεικόνιση των αποτελεσµάτων της γονοτύπησης των 236 εκκινητών µε το υβριδικό DNA. Παρουσιάζεται ο αριθµός των εκκινητών σε 3 κατηγορίες.σε αυτούς που εµφάνισαν προϊόν PCR, σε αυτούς που δεν εµφάνισαν και σε αυτούς που εµφάνισαν προϊόν PCR µόνο στη θέση της τσιπούρας στο πήκτωµα της αγαρόζης. ΤΥΠΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΗ ΠΟΥ ΓΟΝΟΤΥΠΗΘΗΚΕ ΑΡΙΘΜΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ ΠΟΥ ΕΜΦΑΝΙΣΑΝ ΠΡΟΪΟΝ PCR ΣΤΟ RH ΠΑΝΕΛ ΑΡΙΘΜΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ ΠΟΥ ΕΝ ΕΜΦΑΝΙΣΑΝ ΠΡΟΪΟΝ PCR ΣΤΟ RH ΠΑΝΕΛ Contig Sparus aurata 54 30 12 Oryzias latipes 43 53 3 ΑΡΙΘΜΟΣ ΕΚΚΙΝΗΤΩΝ ΠΟΥ ΕΜΦΑΝΙΣΑΝ ΠΡΟΪΟΝ PCR ΜΟΝΟ ΣΤΗ ΘΕΣΗ ΤΗΣ ΤΣΙΠΟΥΡΑΣ (S.aurata) (5 η θέση) Sparus aurata- Tetraodon nigroviridis (συνολικά) 15 24 0 Dicentrarchus labrax 2 5 0 Από το σύνολο των 236 εκκινητών που γονοτυπήθηκαν, οι εκκινητές που εµφάνισαν προϊόν PCR σε σχέση µε αυτούς που δεν εµφάνισαν προϊόν PCR ήταν περίπου ίδιος αριθµός.το 48% (114) των εκκινητών εµφάνισαν προϊόν PCR και το 46% (112) δεν εµφάνισαν προϊόν PCR, ενώ µόλις το 6% εµφάνισε προϊόν µόνο στη θέση της τσιπούρας (5 η ), το οποίο συνήθως κατατάσσεται στην κατηγορία που δεν έδωσαν προϊόν PCR επειδή δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί στην ένταξή του στον γενετικό χάρτη. εν αποτελεί αξιόπιστη πληροφορία. 32
Πίνακας 3. Σχηµατική απεικόνιση των αποτελεσµάτων της γονοτύπησης του συνολικού αριθµού των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν. Παρουσιάζεται το ίδιο σχεδόν ποσοστό στους εκκινητές που εµφάνισαν προϊόν PCR και σε αυτούς που δεν εµφάνισαν. 6% 48% ΠΡΟΪΟΝ ΧΩΡΙΣ ΠΡΟΪΟΝ 46% ΠΡΟΪΟΝ ΜΟΝΟ ΣΤΗΝ ΤΣΙΠΟΥΡΑ Μετά το τέλος της εφαρµογής της µεθόδου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (PCR) και της ηλεκτροφόρησης που εφαρµόστηκε στους εκκινητές των ψαριών της παρούσας εργασίας, τα αποτελέσµατα που έδειξαν αν οι εκκινητές δούλεψαν, εµφάνισαν δηλαδή προϊόν PCR ή όχι ή αν εµφάνισαν προϊόν PCR µόνο στη θέση της τσιπούρας, αποτυπώθηκαν στις φωτογραφίες των πηκτωµάτων αγαρόζης των εκάστοτε εκκινητών. Παρακάτω παρατίθενται ενδεικτικά κάποιες αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες των εκκινητών και από τις 3 κατηγορίες αποτελεσµάτων µαζί µε τις αλληλουχίες βάσεων DNA των γονιδίων τους πάνω στις οποίες επισηµαίνονται οι αλληλουχίες DNA του εκάστοτε εκκινητή. Με το γαλάζιο χρώµα αναδεικνύονται οι αλληλουχίες βάσεων DNA της αλυσίδας µε κατεύθυνση 5 3 (forward) και της 3 5 (reverse) των εκάστοτε εκκινητών. Ο επισηµαντής-δείκτης ( 50 bp marker) που χρησιµοποιήθηκε αναδεικνύει το µέγεθος του προϊόντος PCR µε τη µορφή ζωνών (µπάντες) οι οποίες διαχωρίζονται κατά την ηλεκτροφόρηση και έχουν ως µέγιστο τα 300 bp. Στην 1 η θέση στο πήκτωµα της αγαρόζης µετά την θέση του δείκτη µεταφέρεται το νερό που αποτελεί σηµείο ελέγχου για, στην 3 η θέση το hamster DNA που είναι και αυτό σηµείο ελέγχου και τέλος στην 5 η θέση µεταφέρεται το DNA της τσιπούρας ως σηµείο ελέγχου. Τα σηµεία ελέγχου χρησιµοποιούνται για να διαπιστωθεί αν υπάρχει ή όχι επιµόλυνση συνήθως. 33
Προϊόν PCR µόνο στη θέση της τσιπούρας (5 η ) στο πήκτωµα αγαρόζης. Πίνακας 4. Απεικόνιση της αλληλουχίας DNA του γονιδίου του συνεχούς (contig) εκκινητή 296 µε γαλάζια επισήµανση της αλληλουχίας DNA αυτού του εκκινητή. Contig_296 CTCATAATGACATCCAGCTTAATCCTGGTCTTCTTCCTGCTCTCGTACCCTGTCTTAACAACACTCCATCCAAACCCAC GAGAAGAAGGCTGAGCACTTCTCAAAGTCAAAACAGCAGTAAAACTAGCTTTCTTTGTTAGCCTACTCCCCCTATTTCT CCTTTTTAATGAAGGAGCCGAAGTTATCGTCACCAACTGAAACTGAACTAACACCTTAATTTTCGATATTAACATCAGC TTTAAATTTGACCACTACTCAACCATTTTTACCCCTATTGCCCTCTACGTAACATGGTCCATCCTAGAATTTGCCTCCT GGTATATACACGCTGATCCTTACATGAACCGATTCTTCAAGTATCTCCTCATCTTCCTTATCGCCATAATCGTCCTGGT TACCGCAAACAATATGTTTCAGCTTTTTATTGGTTGAGAAGGAGTCGGCATTATATCCTTTCTTCTCATTGGCTGATGA TACGGTCGAGCAGATGCAAATACCGCCGCACTCCAAGCTGTTCTCTACAACCGAGTCGGAGACATTGGCCTCATCTTTG CCATAGCATGAATAGCAACAAACCTCAACTCATGAGAAATGCAACAAATATTTGTATCTGCAAAGGGTCTTGATTTAAC TTTCCCTCTTATTGGACTAATCGTTGCTGCCACCGGTAAATCTGCCCAATTTGGCCTTCACCCCTGACTCCCCT Εικόνα 2. Απεικόνιση του αποτελέσµατος µετά την ηλεκτροφόρηση του συγκεκριµένου εκκινητή (contig_296). Παρουσιάστηκε προϊόν PCR µόνο στη θέση της τσιπούρας (5 η ) και σε καµία άλλη από τις 95 θέσεις. Ο δείκτης δείχνει το µέγεθος του προϊόντος PCR και εισάγεται πριν από την θέση του 1 ου σηµείου ελέγχου (νερό). δείκτης θέση της τσιπούρας 34
Χωρίς προϊόν PCR στο πήκτωµα αγαρόζης Πίνακας 5. Απεικόνιση της αλληλουχίας DNA του γονιδίου του συνεχούς (contig) εκκινητή 102 της τσιπούρας µε γαλάζια επισήµανση της αλληλουχίας DNA αυτού του εκκινητή. Contig_102 TGGCTCTCCTGTGTTATGAGGCTCAGGAACAACATGACCCTGAGAACACTGACAAAATATTTGAGGTCCTAAAAAGTTT GCAGCAGCAGCTGAACATAAGAGATGGGGACCTAGTTTGTGTGCGGGAGCTGGTTGGAAAATGCCTGGCTGAATATGCC ACCACCAGGTGCTCCAGGCCTAACAGCCAGAGGCTTCGCTGGTGTATTTCGGGAAGAACTGCACGTCAGCTGAAGCACA GCTACTACAAGATCACTCATCTTCCCACCATACCTGAGTCAGCTTATTAAACCTGGGGGTACAAATAGGTGACCTTGCA CGCAGAGAAAAGTAAACAACGGTCCCCACATAACTTTTGGGTGACTTTCTTGCAGTGTGGTCGCCTGGTACAGCCCAGT TATTTTCCTTACAGATATTCATCGTAGATGATGGATGTCTTTAAGGAAAAGTTTAGAATGTAACGGTTTTCCTCAAGTT TGTTCGTTGTCATACATTGATCATGCACACTGCATTTAATCAGCCTCAATGATGAGGAGTATCACTTATCTACAACCAT CCTGCTAAGTTTTACTTTCCTGGTTGAGTTGCTTGCACAAGTGTACAGTATGTTCTTGTTTAAATCCGTACCAAGGTGT TTGGTATTTCCTTGAACGGGTTGCTGGTTTTAAGCTCATAAGTATAGAACCACCTAGGTCCTCAGTCCACCT Εικόνα 3. Απεικόνιση του αποτελέσµατος µετά την ηλεκτροφόρηση του εκκινητή contig_102. εν εµφανίστηκε προϊόν PCR. 35
Με προϊόν PCR στο πήκτωµα αγαρόζης Πίνακας 6. Απεικόνιση της αλληλουχίας DNA του γονιδίου του συνεχούς (contig) εκκινητή 283 της τσιπούρας µε γαλάζια επισήµανση της αλληλουχίας DNA αυτού του εκκινητή. Contig_283 CTCAGTCGGACAGTAACCATTCCCAACAAATGTGGTGACCAAATGTGATGCACCCTGAATTTAGCAGAGATGATTCATT GTTTTGCTTTTTCTTCGCTAATTTAATATATTAGAGCTGGAAATAAAATACTAGCATGTCAAAACGTCGTTAACCTTTA CCGGATTCTCCTTGATGTCATTCCGATCCTCTTTCATCATTTCGATCTCAAAGCTTTTGGAGAGGAGGACCAAGCTCGT TTGTTTCGTGTGTTTTTTAAATAAGGCGGGAGTTCAGCTTAAGCAGTGAAGCAGAGAGAGTTGATGGTTTAAGTTCTCA TGGAGGTACATTTTGGCAGTGGCTCCTCTCGTTTTTCCAGTCCCAGTGAAATTCTGTGTGACCACTTGATCTCTTAAAA GTTTTTATTGTTTTGAATAGAGATGCCTGTAGAGAACTGCTGCACCTTTAAGGTGTATATGTAGCATTTCCATCCTTAA TGTCACTGTGTTTACCTGAATGCTATGACTCAGGATGCCACTCTGATTCATGAGGCACTTTACTGACTCACCTGCTGCG TAGAAACATACATGCTGCATACTAATCCATGTTCTGAGAGTAGAAACGGAGATGTTTTCACATGTTTAGAATAATGTTA GTGGTTCAAATTTATTCAAATGTTTTGTGACTGTTTTTCAGTCCAATGATGAGTTTCN Εικόνα 3. Απεικόνιση του αποτελέσµατος µετά την ηλεκτροφόρηση του εκκινητή contig_283. Εµφανίστηκε προϊόν PCR σε αρκετές θέσεις του πηκτώµατος αγαρόζης, δηλαδή πέτυχε η µέθοδος PCR στον συγκεκριµένο εκκινητή. 36