مجله علمي پژوهشي د انشگاه علوم پزشكي ارتش جمهوري اسلامي ايران سال هشتم شماره 3 صفحات 159 تا 165 پاييز 1389 مقاله تحقيقاتي نام نويسند گان طراحي واكنش زنجيره اي پلي مراز براي تشخيص مولكولي سالمونلا تيفي نرگس اميني 1 دكتر محمد سليماني 2 دكتر ا رش قليان چي لنگرودي 3 * دكتر كيوان مجيدزاده 4 تاريخ اعلام وصول: 89/3/12 تاريخ اعلام قبولى مقاله: 89/6/15 چكيده سابقه و هدف: سالمونلا انتريكا سروتايپ تيفي باكتري مولد بيماري تب تيفوي يد ميباشد كه سالانه بيش از 16 ميليون نفر در جهان به ا ن مبتلا ميشوند و حدود 600 هزار نفر نيز در اثر ا ن ميميرند. روشهاي كلاسيك تشخيص اين بيماري اغلب وقتگير ميباشند و از حساسيت كافي برخوردار نيستند. هدف اين مطالعه اراي هي نوعي روش مولكولي واكنش زنجيرهاي پليمراز Reaction) (PCR: Polymerase Chain براي تشخيص سريع و انجام اقدامهاي درماني- بهداشتي مناسب و بهموقع است. مواد و روشها: در اين مقاله تحقيقاتي ژن اختصاصي viab مربوط به باكتري سالمونلا تيفي هدفگذاري و از نرمافزار Generunner براي طراحي پرايمرهاي اختصاصي استفاده شد. واكنش PCR ژن فوق با استفاده از ژنوم باكتري استاندارد (1609 (PTCC انجام و ويژگي روش نيز با استفاده از ژنوم انواعي از نمونههاي كنترل منفي تعيين گرديد. به منظور ساخت كنترل مثبت تعيين حساسيت و حد تشخيص كلونينگ محصولات PCR در وكتور پلاسميدي ptz57r/t انجام گرفت. يافتهها:الكتروفورزمحصولاتPCR بانديبهطول 441 جفتبازرابرايژنviaB نشانداد.نمونههايكنترلمنفيمورداستفادههيچ باندي ايجاد نكردند. كلونينگ محصولات PCR در وكتور ptz57r/t با استفاده از PCR هضم ا نزيمي و تعيين ترادف تا ييد گرديد. بحث و نتيجهگيري: پرايمرهاي طراحي شده براي ژن viab در اين روش ميتواند با حساسيتي حدود 19 كپي از ژنوم براي شناسايي اين ارگانيسم بهكار رود و با رديابي سريع و دقيق باكتري از ايجاد عوارض پايدار و ناخواسته جلوگيري نمايد. كلمات كليدي: تب تيفوي يد سالمونلا تيفي واكنش زنجيرهاي پليمراز ژن viab مقدمه تبتيفوي يد (بيماريحصبه)يكيازمهمترينمشكلاتبهداشتيدر كشورهاي در حال توسعه ميباشد. سالانه بالغ بر 16 ميليون نفر به اين بيماري مبتلا ميشوند و بيش از 600 هزار نفر در اثر اين بيماري ميميرند (1). عامل ايجادكننده بيماري سالمونلا انتريكا سروتايپ تيفي يك باكتري گرممنفي بيهوازي اختياري و تاژكدار است كه در جنس سالمونلا و در خانواده انتروباكترياسه قرار دارد. بر اساس جديدترينسيستمطبقهبندياينجنسبه 2 گونهسالمونلاانتريكاو سالمونلابونگوريتقسيمميشود.سالمونلاانتريكابهششزيرگونه (V I) II IIIa IIIb IV تقسيم ميشود. از بين اين شش زيرگونه تنها زير گونهي I مسوول تقريبا همه عفونتهاي سالمونلا در حيوانات خونگرم ميباشد. در اين گونه بالغ بر 2300 سرووار شناخته شده است كه در ميزان شيوع و بيماريهايي كه در ميزبانهاي مختلف ايجاد ميكنند متفاوت هستند (2). زيرگونهي I مسوول بيشترين بيماريهاي انساني ميباشد و شامل سالمونلا تيفي نيز ميباشد كه تنها سبب بيماريزايي در انسان و نخستيهاي عالي ميشود (3). سايرزيرگونهها شاملسالمونلاا ريزونا (زيرگونهيIIIa )وسالمونلا بونگوري مسوول بيماريزايي در حيوانات خونسرد ميباشند و به 1 پژوهشگر ايران قم دانشگاه ا زاد اسلامي 2 استاديار ايران تهران دانشگاه علوم پزشكي ا جا مركز تحقيقات زيست فن ا وري تسنيم 3 پژوهشگر ايران تهران مركز تحقيقات زيست فن ا وري تسنيم 4 استاديار ايران تهران دانشگاه علوم پزشكي ا جا مركز تحقيقات زيست فن ا وري تسنيم (*نويسنده مسوول) تلفن: 021-85955240 ا درس الكترونيك: k-majidzadeh@armyums.ac.ir
مجله علمي پژوهشي د انشگاه علوم پزشكي ارتش جمهوري اسلامي ايران سال هشتم شماره 3 پاييز 1389 شماره مسلسل 31 160 ندرت در انسان ايجاد بيماري ميكنند. اكثر سالمونلاها به غير از سالمونلا تيفي كه تب رودهاي ايجاد ميكند يكي از سه عارضهي تب پاراتيفوي يد سپتيسمي و مسموميت غذايي را ايجاد مينمايند (4). تب تيفوي يد در صورت عدم درمان و يا درمان ديرهنگام باعث ايجاد عوارض ناگواري ميگردد كه مهمترين ا نها خونريزي روده و پارگي روده ميباشد (5). سالمونلا انتريكا سرووار تيفي داراي دو سويهي مهم Ty2 و CT18 ميباشد. ژنوم كامل باكتري سالمونلا تيفي سروتايپ CT18 در سال 2001 بهطور كامل تعيين رديف گرديد. اين باكتري داراي يك ژنوم حلقوي به اندازه 4809037 جفتباز است. همچنين پلاسميدهاي مهم ا ن شامل پلاسميد مقاومت دارويي چندگانه (phcm1: Multiple plasmid) drug-resistance inch1 با اندازهي 218150 جفتباز و پلاسميد (phcm2) با اندازهي 10516 جفتباز (كه شباهت زيادي به پلاسميد بيماريزايي باكتري عامل طاعون دارد) نيز بهطور كامل تعيين رديف شدهاند. اين پلاسميدها تعداد 204 ژن را در خود جاي دادهاند (6). ژنوم سروتايپ Ty2 نيز در سال 2003 بهطور كامل تعيين رديف گرديد و مشخص شد كه اندازه ا ن 4791961 جفتبازميباشد.بامقايسهيژنومكاملدوسويهمختلفسالمونلا تيفي Ty2 و CT18 مشخص شد كه اندازهي ژنوم ا نها تفاوت بسيار اندكي دارد. اين بررسي همچنين نشان داد كه فقط 29 ژن بهطور اختصاصي متعلق به سويهي Ty2 است درحاليكه 84 ژن بهطور اختصاصي متعلق به سويهي CT18 است و در عين حال نكته جالب اين است كه سويهي TY2 فاقد دو پلاسميد مقاومت دارويي شناخته شده در CT18 است (7 8). اينباكتريبهدليلسهولتتهيهوتوليدوهمچنينا سانيبهكارگيري جهتا لودهنمودنافراد سابقهاستفادهبسياريدرعملياتبيولوژيك وبيوترويستي دارد (1). بررسي كارا يي عواملمختلفبيولوژيك از نظرا لودهكردنافرادنشاندادهاستكه 1 گرمكشتباكتريسالمونلا تيفي معادل 100 گرم عامل شيميايي اعصاب "V" و معادل 0/02 گرم سم سيانيدپتاسيم اثر دارد (1). در بررسي ديگري ذكر شده است كه مصرف 100 ميليليتر ا ب (نصف ليوان) از يك منبع 5 ميليون ليتري كه با 1200 گرم باكتري سالمونلا تيفي و يا 5 كيلوگرم سم بوتولينوم و يا 7 كيلوگرم سم استافيلوكوك ا لوده شده باشد سبب بيماري شديد ميشود. درحاليكه براي مسموم نمودن اين حجم از منبع ا ب با سموم شيمايي به 1 تن سيانيدپتاسيم نياز است (4). با توجه به اينكه تشخيص سريع و درمان بهموقع مانع از گسترش بيماريوايجادعوارضداي ميويامرگبيمارانميشودوروشهاي كلاسيك اغلب وقتگير بوده و حساسيت بالايي ندارند توجه به روشهاي مولكولي جهت شناسايي عوامل بيماريزاي ميكروبي گسترش يافته است. تشخيص سريع براي شناسايي سالمونلا تيفي علاوهبر جلوگيري از مرگومير به سبب قرار گرفتن اين باكتري در فهرست عوامل بيولوژيك گروه 2 نيز مورد توجه است (9). مواد و روشها اين مقاله از نوع تحقيقاتي است. كشت و استخراج ژنوم باكتريها: از ا نجايي كه باكتريهاي كنترل منفي و مثبت همگي به شكل ليوفيليزه تهيه شدند تمامي ا نها ابتدا در محيط كشت( Merk ) Brain Heart Infusion broth و سپس در محيط كشت (Merk) Brain Heart Infusion agar كشت داده شدند و پس از 24 ساعت گرمخانهگذاري در دماي 37 درجهي سانتيگراد ژنوم ا نها با استفاده از كيت استخراج DNA شركت سيناژن DNP Tm kit) Kit (DNA Purification استخراج گرديد. ليست باكتريهاي كنترل منفي مورد استفاده در جدول شمارهي 1 ا مده است. طراحي پرايمرها: پس از اخذ ترادف ژن هدفگذاري شده در اين مطالعه (viab) طراحي پرايمرها به كمك نرمافزار Generunner (ويرايش 2) انجام و ساخت ا نها توسط شركت سيناژن صورت گرفت (جدول 2). همچنين به منظور بررسي نهايي پرايمرهاي طراحيشده و اطمينان از اختصاصي بودن ا نها از سرويس BLAST سايت مركز ملي اطلاعات بيوتكنولوژي (NCBI: National Center Information) for Biotechnology استفاده شد. انجام واكنش زنجيرهاي پليمراز: واكنش PCR جهت ارزيابي ژن هدف viab با شرايط برقراري واكنش در حجم استاندارد 25 ميكروليتر انجام شد. در اين حجم 2 ميليمول يون منيزيم 0/2 ميليمول dntps 100 نانوگرم ژنوم باكتري 0/5 ميكرومول از پرايمرهاي عقبي و جلويي و 1 واحد ا نزيم Taq DNA Polymerase مورد استفاده قرار گرفت. تكثير با استفاده از برنامهي مشخص براي 35 سيكل در دماي دناتوراسيون اوليه 94 C به مدت 3 دقيقه سپس 94 C به مدت 1 دقيقه و دماي اتصال 52/5 C به مدت 45
واكنش زنجيرهاي پلي مراز و سالمونلا تيفي نرگس اميني و همكاران 161 جدول 1- ليست باكتري هاي كنترل منفي جهت بررسي تشخيص مولكولي سالمونلا انتريكا سروتايپ تيفي محل تهيه انستيتو پاستور ايران سازمان پژوهشهاي علمي و صنعتي شمارهي سويه نام ميكروارگانيس Staphylococcus aureus Bacillus subtilis Shigella sonnei Escherichia coli Enterococcus faecalis Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Yersinia enterocolitica Yersinia intermedia Yersinia pseudotuberculosis Proteus vulgaris Citrobacter freundii Serratia marcesens ATCC 25923 ATCC 6051 ATCC 9290 ATCC 25922 ATCC 29212 ATCC 27853 ATCC 7881 PTCC 1480 PTCC 1482 PTCC 1244 PTCC 1079 PTCC 1600 PTCC 1111 ثانيه و دماي تكثير 72 C به مدت 45 ثانيه انجام شد. بعد از اين 35 چرخه تكثير نهايي در دماي 72 C به مدت 15 دقيقه انجام يافت. همچنين يك واكنش 25 ميكروليتري با شرايط مشابه و با استفاده از ا ب ديونيزه به جاي ژنوم باكتري به عنوان كنترل منفي انجام شد. سپس مقدار 5 ميكروليتر محصول PCR با 1 ميكروليتر از بافر نمونهگذاري( Fermentase ) 6X) Loading dye Buffer) مخلوط و در ژل ا گارز %1 حاوي اتيديوم برومايد در ولتاژ 100 ولت به مدت 45 دقيقه الكتروفورز گرديد. همچنين يك ميكروليتر از ژنوم استخراجي از سوشهاي كلينيكال سالمونلا تيفي در شرايط و برنامهي مشابه PCR گرديد. تعيين ويژگي: بهمنظور بررسي ويژگي پرايمرها و تعيين ويژگي ا ناليتيكروش واكنشPCR باشرايطفوقبررويژنومباكتريهاي كنترل منفي انجام شد (جدول 1 ). همچنين به منظور اطمينان از قابليت DNA استخراجشده جهت بهكارگيري در واكنش PCR و عدم وجود مهاركننده در ا ن واكنش PCR بر روي ژن يونيورسال و كروموزومي 16S rrna انجام شد. كلونينگ محصول PCR و تهيهي كنترل مثبت: وجود كنترل مثبت براي استفاده در يك كيت تشخيصي به عنوان يك روش مولكولي دقيق و سريع بسيار حاي ز اهميت ميباشد. براي انجام اين كار پس از خالصسازي محصول PCR با استفاده از كيت ACCU Prep (PCR Purification kit) BIONEER در پلاسميد ptz57r/t و مطابق دستورالعمل كيت (Fermentase) InsTAclone TM PCR Cloning Kit كلونينگ صورت گرفت. كلونهاي دريافتكنندهي محصول تكثير ژنviaB بااستفادهازغربالگريسفيدوا بيانتخابشدند.استخراج پلاسميد در مورد كلنيهاي سفيد با استفاده از كيت ACCU Prep (Plasmid Mini extraction kit) BIONEER انجام گرفت. براي تا ييد كلونها از واكنش PCR و واكنش هضم ا نزيمي با استفاده از ا نزيم (Fermentase) XbaI استفادهشد.پيشبينيماايجاديكقطعهيخطي جدول 2- سكانس پرايمرهاي viab مورد استفاده در مطالعه ول محصول نقطهي و توالي پرايمر نام پرايمر viaf viar 5 -CATAAGGAGACTTCATGAGG-3 5 -CTATCCTGAAGCTCTTCC-3 59/7 62/2 400 bp
مجله علمي پژوهشي د انشگاه علوم پزشكي ارتش جمهوري اسلامي ايران سال هشتم شماره 3 پاييز 1389 شماره مسلسل 31 162 با طول حدود 3000 جفتباز در روي ژل ا گارز بود. تا ييد نهايي كلونها با استفاده از تعيين توالي به روش ترادف چرخشيCycle ) ptz57r/t-viab انجام گرفت و پلاسميد تا ييد شده sequencing) نامگذاري شد. تعيينحساسيتوحدتشخيص( LOD ):پسازكلونينگقطعهviaB ابتدا غلظت پلاسميد ptz57r/t-viab با قراي ت جذب نوري OD در طولموجهاي 260 و 280 نانومترمشخصشدوسپسجهتتعيين حساسيت ا ناليتيك روش حداقل تعداد كپي از قطعهي مورد نظر كه بتواند در واكنش PCR باند واضحي ايجاد كند محاسبه گرديد. بدين منظور رقتهاي متوالي دهبرابر ) 1-10 الي 10-10) از پلاسميد ptz57r/t-viab با غلظت مشخص تهيه شد. پس از انجام واكنش واكنش PCR بر روي كلونهاي دريافتكنندهي اين ژن (كنترل مثبت) كه ptz57r/t-viab نامگذاري شد. مطابق انتظار باندي به اندازه 441bp در ژل ا گاروز ايجاد شد. تعيين ويژگي: واكنش PCR مربوط به ژن viab در تمام باكتريهاي كنترل منفي باندي را ايجاد نكرد كه نشاندهندهي ويژگي بالاي واكنش PCR در اين مطالعه ميباشد (شكل 2). همچنين مثبت شدن واكنش PCR مربوط به ژن يونيورسال 16S rrna با طول 475bp حضور ژنوم استخراج شده قابل PCR در نمونههاي كنترل منفي را تا ييد نمود (شكل 3). تعيين حد نهايي تشخيص: ا خرين رقت از پلاسميد ptz57r/t- viab با غلظت اوليه 700ng/μl كه باند قابل مشخصي را در روي PCR روي رقتهاي متوالي پلاسميد كمترين رقتي از ا ن كه باند مشخص و واضحي را نشان داد تعيين و پس از انجام محاسبات مربوطه مطابق روش Chiang به عنوان حد نهايي تشخيص تعيين شد (10). يافته ها :PCR واكنش PCR مربوط به ژن viab تنظيم و قطعه اي به طول 441bp براي اين ژن در روي ژل مشخص گرديد (شكل 1). همچنين شكل 2- باكتري هاي كنترل منفي به ترتيب از چپ به راست Staphylococcus Escherichia coli Shigella sonnei Bacillus subtilis aureus Klebsiella Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Yersinia Yersinia intermedia Yersinia enterocolitica pneumoniae Citrobacter freundii Proteus vulgaris pseudotuberculosis و.Serratia marcesens شكل 1- محصول PCR ژن viab جهت تشخيص مولكولي سالمونلا انتريكا سروتايپ تيفي شكل 3- باند 475bp مربوط به ژن يونيورسال 16S rrna در باكتري هاي كنترل منفي به ترتيب از چپ به راست Bacillus Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Escherichia coli Shigella sonnei subtilis Yersinia Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Yersinia pseudotuberculosis Yersinia intermedia enterocolitica.serratia وmarcesens Citrobacter freundii Proteus vulgaris
واكنش زنجيرهاي پلي مراز و سالمونلا تيفي نرگس اميني و همكاران 163 شكل 4- نتايج حد تشخيص جهت تشخيص مولكولي سالمونلا انتريكا سروتايپ تيفي ژل ايجاد نمود 7-10 و كمترين تعداد كپي قابل تشخيص ژن viab در يك واكنش 25 ميكروليتري PCR برابر 19 كپي محاسبه گرديد (شكل 4). بحث و نتيجه گيري علي رغم كاهش شيوعبيماري تب تيفوي يد در كشورهاي توسعه يافته هنوز اين بيماري يكي از معضلات اساسي بهداشتي در كشورهاي در حال توسعه و از جمله كشور ما مي باشد. همچنين با توجه به هم جواري با كشورهايي كه از لحاظ بهداشتي در وضعيت مطلوبي نيستند مانند افغانستان و عراق توجه به تشخيص سريع و درمان بهموقع اين بيماري به خصوص در استانهاي مرزي بسيار حاي ز اهميت ميباشد. جهت تشخيص ا زمايشگاهي باكتري عامل حصبه در نمونه هاي كلينيكي از كشت خون و مغز استخوان كشت مدفوع سواپ ركتال كشتادرار و همچنين ا زمايش هاي ديگري چون تست ويدال الايزا و ايمونوفلورسنت استفاده مي شود كه تمام اين روش ها وقت گير و غيرقابل استفاده جهت تشخيص سريع و دقيق عامل بيماري است (11 12). از جمله معايب اين روش ها مي توان به اين موارد اشاره كرد: جداسازي باكتري حداقل به 2 تا 5 روز زمان نياز دارد ضمن اين كه كشت خون در 30-65 درصد از موارد تب تيفوي يد منفي است و در صورت استفاده ي قبلي از ا نتي بيوتيك رشد باكتري در محيط كشت مهار مي شود. تفسير تست ويدال در مناطق اندميك غيراختصاصي و دشوار است و براي استفاده ي مو ثر از تست ويدال در هر منطقه بايد تيتر مناسب ا ن منطقه تعيين شود لازمه ي اين كار تعيينتيترپايهدرگروهسالمميباشد.ازطرفيبرخيازبيماريهاي ديگر بهويژه عفونت ناشي از ساير ميكروارگانيسمهاي گرم منفي بهخاطر دارابودن ا نتيژنهاي متقاطع باعث افزايش غيراختصاصي درعيارا نتيباديهايموجوددرفردميشوند ا نتيباديبهوسيلهي ا نتيژنهايناشيازارگانيسمهايهمراهنيزافزايشمييابد ومثلا در اثر تزريق واكسن نيز ا نتيباديهاي ضدسالمونلايي توليد ميشوند. ازاينگذشتها نتيباديهايموردبحثبرايمدتبسيارطولانيدر سرم باقي ميمانند و لذا واكنش ا گلوتيناسيون مثبت صرفا به مفهوم تماسباميكروارگانيسمدرروزهاياخيرياگذشتهايدورميباشد. اين موارد بهطور كلي تفسير نتايج را پيچيده مينمايد (15-13). كشت ادرار نيز روش مناسبي براي تشخيص نيست زيرا سالمونلا بهطور مداوم و مرتب از ادرار دفع نميشود. در مورد كشت مدفوع نيز بايد ذكر شود كه در مناطق اندميك يافتن ارگانيسمها در مدفوع بيماران تشخيص بيماري را تا ييد نميكند. در ضمن كشت مدفوع و ادرار اغلب بعد از هفتهي اول بيماري مثبت ميشوند (16 17). با توجه به دلايل ذكرشده در مورد ناكارايي روشهاي تشخيص معمول روشهاي نوين مولكولي بهخصوص تكنيك PCR مناسبترين سريعترين و دقيقترين روش ميباشد كه معايب بيان شده در سطور پيشين در مورد ساير روشها را ندارد و از اختصاصيت و حساسيت بسيار بالايي نيز برخوردار است ضمن اينكه زمان لازم براي انجام ا ن يك ساعت تا يك روز ميباشد (18). درتحقيقحاضرژناختصاصيviaB باكتريسالمونلاتيفيانتخاب گرديد.اينژنبررويپلاسميدقرارداردوكدكنندهيا نتيژنvi كه يك پليساكاريد كپسولي است ميباشد و اولين بار توسط Felix و Pitt كشف گرديد. اين پليساكاريد كه يك هموپليمر خطي مركب ازacid α1,4 2-deoxy-2-n-acetylgalactosamine uronic ميباشد در فعاليت باكتريسيدال سرم و فاگوسيتوز مداخله مينمايد و لذا در ويرولانس ميكروب نقش دارد. ا نتيژن vi در باكتريهاي سالمونلا پاراتيفي A سالمونلا دوبلين و سيتروباكتر فروندي نيز وجود دارد ولي در تحقيق حاضر طراحي پرايمرها بهگونهاي بود كه بهطور اختصاصي فقط ژن مورد نظر در باكتري سالمونلا تيفي را تكثير مينمايد و قادر به شناسايي و تكثير اين ژن در باكتريهاي نامبرده نميباشد. براي اطمينان از اين امر از سرويس BLAST سايت مركز ملي اطلاعات بيوتكنولوژي (NCBI) استفاده شد.
مجله علمي پژوهشي د انشگاه علوم پزشكي ارتش جمهوري اسلامي ايران سال هشتم شماره 3 پاييز 1389 شماره مسلسل 31 164 حد تشخيص پرايمرهاي طراحيشده در اين تحقيق 19 كپي در يك واكنش 25 ميكروليتري PCR ميباشد. تعيين حد تشخيص يكي از مهمترين شاخصهاي اعتباربخشي كيتهاي تشخيص مولكولي ميباشد و محققين از روشهاي مختلف براي محاسبهي ا ن استفاده نمودهاند. يكي از اين روشها تهيهي رقتهاي سريال از باكتري زنده و سپس شمارش ا نها و تعيين CFU ميباشد (19). در اين روش استخراج ژنوم از رقتهاي مختلف باكتري انجام ميشود و با انجام PCR حد تشخيص محاسبه ميگردد. عليرغم اينكه اين روش دقت بالايي دارد اما مهمترين نقطهي ضعف ا ن نياز به باكتري زنده است. بهدليل خطرناك بودن كار با باكتري در اين تحقيق از باكتريها استفاده نشد. روش ديگر تعيين LOD اندازهگيري غلظت ژنوم تهيه رقتهاي سريال از ا ن تخمين تعداد كپي ژنوم در هر رقت انجام PCR در مورد هر رقت و درنهايت تخمين حد تشخيص ميباشد. دقت پايين تخمين ميزان غلظت قطعات بزرگ DNA (ژنوم باكتري) مهمترين نقطهي ضعف اين روش ميباشد. براساس مطالعات محققين مختلف كلونينگ ژن هدف در پلاسميد و سپس تهيهي رقتهاي سريال از ا ن و انجام PCR يكي از بهترين روشهاي تعيين LOD ميباشد بنابراين در مطالعهي حاضر نيز از اين روش استفاده گرديد. درسال 1994 Song وهمكارانبهشناساييسالمونلاتيفيبااستفاده از روش Nested PCR مبتني بر ژن Flagellin پرداختند (8). همچنين در سال 1995 شارما به شناسايي سالمونلا تيفي بهوسيله روش Nested PCR مبتني بر توالي ژن viab پرداخت و اعلام كرد كه با استفاده از اين روش اين امكان وجود دارد كه سالمونلا تيفي در حد يك سلول شناسايي شود (20). ياشيموتو و همكارانش در سال 1995 با استفاده از روش PCR و استفاده از ترادف ژن viab نسبت به شناسايي باكتري سالمونلا تيفي اقدام نمودند. در سال 1997 چاودري و همكاران تحقيقي تحت عنوان استانداردسازي PCR براي شناسايي سالمونلا تيفي در تب تيفوي يد با استفاده از ژن Flagellin انجام دادند (12). در سال 2001 هيروس و همكاران ا زمايشي تحت عنوان تكثير انتخابي ژنهاي viab prt tyv و flic توسط Multiplex PCR براي شناسايي سالمونلا انتريكا سرووار تيفي انجام دادند. در اين تحقيق براي هر يك از ژنها پرايمري طراحي و PCR انجام شد. در نهايت نتايج نشان داد كه همهي نمونههاي استخراجي ا زمايششدهي سالمونلا انتريكا سرووار تيفي بهدقت توسط اين ا زمايش شناسايي ميشوند (21). درسال 2004 سلطاني و همكاران به شناسايي سريع سالمونلا تيفي با استفاده از روش Multiplex PCR در ژنهاي prt tyv و inva پرداختند. در نهايت مشخص شد كه حساسيت اين روش حدود 10 2 CFU/ml 2/5 ميباشد كه ميتواند به عنوان روش مناسب براي شناسايي سريع سالمونلا تيفي مورد استفاده قرار گيرد (22). در سال 2005 كرمي و همكاران به بررسي و تشخيص سريع باكتري عامل حصبه به روش Multiplex PCR بر اساس ژنهاي prt tyv و inva و تعيين رديف و مقايسه سكانس سويهي جدا شده از ايران با بانك ژن پرداختند.پاركاش و همكاران در سال 2005 طي تحقيقي به ارزيابيPCR Nested در تشخيص تب تيفوي يد پرداختند. در اين تحقيق Nested PCR با استفاده از پرايمرهاي h1-d كه مخصوص سالمونلا انتريكا سرووار تيفي است با كشت خون و تست ويدال مقايسه شد. نتايج نشان داد كه Nested PCR ميتواند به عنوان يك روش استاندارد سريع در شناسايي تب تيفوي يد مورد استفاده قرار گيرد (23). اسميت و همكاران در سال 2007 به شناسايي سالمونلا تيفي بهوسيلهي Nested PCR در نمونههاي خون ادرار و مدفوع پرداختند. در اين بررسي 131 بيمار كه داراي علاي م كلينيكي تب تيفوي يد بودند مورد بررسي قرار گرفتند. نتايج نشان داد كه PCR روي خون روش حساسي براي تشخيص تب تيفوي يد است و PCR روي ادرار و مدفوع ميتواند تست مكمل مفيدي باشد (24). با توجه به اهميت و ضرورت تشخيص بهموقع سالمونلا تيفي در كاهش مرگ و مير ناشي از بيماري و بهخصوص اهميت اين امر در بحرانها و جنگهاي بيوتروريستي و ناكارا مد بودن روشهاي معمول شناسايي ا ن روش تشخيص مولكولي ميتواند عامل بيماريزا را در حداقل زمان و با دقت و حساسيت بالا تشخيص دهد و امكان مقابله با عمليات بيوتروريستي را در زمان مناسب فراهم ا ورد. همچنين در صورت شيوع بيماري با تشخيص سريع ميتوان از بروز عوارض پايدار و مرگا ور جلوگيري كرد. پيشنهاد ميشوددركيتهايتشخيصبيماريبهمنظورجلوگيريازا لودگي نمونههاي بيمار كنترل مثبت مورد استفاده به گونهاي طراحي و كلون گردد كه طول باند ايجاد شده در نتيجهي انجام PCR و سپس الكتروفورز متفاوتازطولباندبيماريباشدتاعلاوهبرجلوگيري
165 واكنش زنجيرهاي پلي مراز و سالمونلا تيفي از ا لودگي امكان انجام PCR در يك تيوب فراهم شود. براي اين منظور بايد بدون تغيير محل اتصال پرايمرهاي جلويي و عقبي طول باند افزايش و يا كاهش يابد كه اين تحقيق توسط نويسندگان مقاله در حال انجام است. نرگس اميني و همكاران تشكر و قدرداني بدينوسيلهنويسندگانمقالهبرخودلازمميدانندتاازهمكاريهاي بيدريغ مسوولين دانشگاه فرماندههان مربوطه و پرسنل مركز تحقيقات زيست فنا وري دانشگاه علوم پزشكي ا جا در اجراي اين طرح پژوهشي قدرداني و سپاسگزاري نمايند. References 1- Crump JA, Luby SP, Mintz ED. The global burden of typhoid fever. Bull Word Health org. 2004;82 (5): 346-53. 2- Porwollik S, Boyd EF, Choy C, Cheng P, Florea L, Proctor E, et al. Characterization of Salmonella enterica subspecies I genovars by use of microarrays. J Bacteriol. 2004;186 (17): 5883-98. 3- Crum NF. Current trends in typhoid Fever. Current Gastroenterol Rep. 2003;5 (4): 279-86. 4- Purver R. Chemical and biological terrorism. The threat according to the open literature 1995; available at: www. csis-scrs.gc.ca/eng/miscdics/purv-e.html. 5- Connor BA, Schwartz E. Typhoid and paratyphoid fever in travellers. Lancet Infect Dis. 2005;5 (10): 623-8. 6- Parkhill J, Dougan G, James KD, Thomson NR, Pickard D, Wain J, et al. Complete genome sequence of a multiple drug resistant Salmonella enterica serovar Typhi CT18. Nature. 2001;413 (6858): 848-52. 7- Deng W, Liou SR, Plunkett G 3rd, Mayhew GF, Rose DJ, Burland V, et al. Comparative genomics of Salmonella entericaserovartyphi strains Ty2 and CT18. J Bacteriol. 2003;185 (7): 2330-7. 8- Chan K, Baker S, Kim CC, Detwiler C S, Dougan G, Falkow S. Genomic Comparison of salmonella enteric Serovars and salmonella bongori by use of an S. enteric serovar typhi murium DNA microarray. J Bacteriol. 2003;185: 553-3. 9- Bhutta, ZA. Current concepts in the diagnosis and treatment of typhoid fever. BMJ. 2006; 333 (7558): 78-82. 10- Chiang YCH, Yang CH, Ho YCH, Lin CHK, Tsen HY. Identification of Bacillus spp., Escherichia coli, Salmonella spp. Staphylococcus spp. and Vibrio spp. with16s ribosomal DNA-based oligonucleotide array hybridization. Int J Food Microbiol. 2006;107 (2): 131-7. 11- Mochammad H, Smits H L. Detection Of Salmonella Typhi By Nested Polymerase Chain Reaction In Blood, Urine, And Stool Samples. Am J Trop Med Hyg. 2007;76 (1): 139 3. 12- Chaudhry R, Laxmi BV, Nisar N, Ray K, Kumar D. Standardisation ofpolymerase chain reaction for the detection of Salmonella typhi in typhoid fever. J Clin Pathol.. 1997;50 (5): 437-9. 13- Frankel G.Detection of Salmonella typhi by PCR..J Clin Microbiol. 1994;32 (5): 1415. 14- Ismail TF. Rapid diagnosis of typhoid fever. Indian J Med Res. 2006;123 (4): 489-92. 15- Olopoenia L, King A. Widal agglutination test - 100 years later: still plagued by controversy. Postgrad Med J. 2000;76 (892): 80-4. 16- Bhutta ZA. Current concepts in the diagnosis and treatment of typhoid fever.bmj. 2006; 333 (7558): 78-82. 17- Cunha BA., Typhoid fever: the temporal relations of key clinical diagnostic points. Lancet Infect Dis. 2006;6 (6): 318-20. 18- Nizami SQ, Bhutta ZA, Siddiqui AA, Lubbad L. Enhanced detection rate of typhoid fever in children in a periurban slum in Karachi, Pakistan using polymerase chain reaction technology. Scand J Clin Lab Invest. 2006;66 (5): 429-36. 19- Walia M, Gaind R, Mehta R, Paul P, Aggarwal P, Kalaivani M. Current perspectives of enteric fever: a hospital-based study from India. Ann Trop Paediatr. 2005;25 (3): 161-74. 20- Sharma KB. Detection of Salmonella typhiby Nested PCR Based on the ViaB Sequence. J Clin Microbiol.1995;33 (12): 3361. 21- Hirose K, Itoh K, Nakajima K, Kurazono T, Yamaguchi M, Moriya M, et al. Selective Amplification of tyv (rfbe), prt (rfbs), viab, and flic Genes by Multiplex PCR for Identification of Salmonella enterica Serovars Typhi and Paratyphi A. J Clin Microbiol. 2002;40 (2) 633 6. 22- Banavandi MJ, Shahhossein Y, Shahbazzadeh D, KarimI V, MirzahoseinI H, MahboudI F, Abachi M, Javadi G. Selective Amplification of prt, tyv and inva Genes by Multiplex PCR for Rapid Detection of Salmonella typhi. Iran Biomed J. 2005;9 (3): 135-8. 23- Prakash P, Mishra OP, Singh AK, Gulati AK, Nath G. Evaluation of nested PCR in diagnosis of typhoid fever. J Clin Microbiol. 2005;43 (1): 431 2. 24- Smits H, Hatta M,. Detection Of Salmonella Typhi By Nested Polymeras Chain Reaction In Blood, Urine, And Stool Sampls. Am J Trop Med Hyg. 2007;76 (1), 139-43.
JAUMS Volume 8 Number 3 Autumn 2010 25 A Polymerase Chain Reaction Method for Rapid Detection of Salmonella typhi Amini. N 1, Soleimani. MS; PhD 2, Ghalyanchi Langeroudi. A; DVM, PhD 3, *Majidzadeh. K; MD, MPH, PhD 4 Received: 2 Jun 2010 Accepted: 6 Sep 2010 Abstract Background: Salmonella enterica serotype Typhi is the causative pathogen of typhoid fever. Morbidity and mortality rates of the disease are 16 106 and 6 105 cases per year, respectively. Proper diagnosis of the disease and its suitable treatment have critical roles in morbidity and mortality reduction, especially in the developing countries. The traditional methods for detection of the organism are time consuming with low sensitivity. The aim of the present study is to design a new polymerase chain reaction (PCR) method for rapid detection of the organism. Materials and methods: Target specific viab genes were used for primer designing using Generunner software. PCR tests were sat up using the standard Salmonella typhi genome. Besides, specificity of the method was determined using negative control bacterial genomes. For construction of positive control, determination of sensitivity of the method and limit of the detection, PCR products were cloned in a ptz57rt plasmid vector. Results: The agarose gel electrophoresis of PCR products showed 441 bands for the viab genes. PCR tests for control negative genomes did not create any band on the agarose gel. Results of PCR, enzymatic digestion and sequencing confirmed the cloning process and the positive control construct. Conclusion: Considering the disadvantages of the classic methods for detection of the organism and the advantages of the molecular methods, the diagnostic kit proposes a suitable tool for rapid detection of the Salmonella typhi. Keywords: Salmonella Typhi,Typhoid fever, Polymerase chain reaction, viab gene 1- Researcher, Islamic Azad University, Ghom, Iran. 2- Assistant Professor, Aja University of Medical Sciences, Dept. of Tasnim Biotechnology Center, Tehran, Iran. 3- Researcher, Aja University of Medical Sciences, Tasnim Center, Tehran, Iran. 4- (*Corresponding Author) Assistant Professor, Aja University of Medical Sciences, Medical Faculty, Tehran, Iran Tel: 021-85955240 E-mail: k-majidzadeh@armyums.ac.ir