Κεφάλαιο 6 Εισαγωγή στη Μοριακή Προσοµοίωση 6.1. Μοριακή Μηχανική 6.1.1. Εισαγωγή στη µεθοδολογία του «απ αρχής» διπλώµατος της πρωτείνης. Η ενέργεια κάθε µορίου µπορεί θεωρητικά να υπολογιστεί µε την χρήση κβαντικής µηχανικής. Στην πραγµατικότητα το κόστος και ο χρόνος του υπολογισµού δεν επιτρέπει την χρήση κβαντικής µηχανικής παρά για τα απλούστερα των µακροµορίων. Αντίθετα προσεγγίσεις των δυναµικών ενεργειακών συναρτήσεων χρησιµοποιούνται για τους υπολογισµούς της ενέργειας της στερεοδιάταξης της πρωτείνης. Ο προσδιορισµός του ελάχιστου της ενεργειακής συνάρτησης είναι επίσης δύσκολος. Ο µεγάλος αριθµός των βαθµών ελευθερίας του πρωτείνικού συστήµατος εµποδίζει τον υπολογισµό της ενέργειας για όλες τις δυνατές στερεοδιατάξεις. Για παράδειγµα χρειάζονται 110 ώρες σε υπερυπολογιστή για το δίπλωµα µιας µικρής πρωτείνης από την εκτεταµένη στερεοδιάταξη (Karplus and Petsko, 1990). Σε µια προσπάθεια να χωριστεί ο υπολογισµός σε µικρότερα µέρη οι ερευνητές µελετούν µερικές δοµές και απλοποιηµένα πρότυπα των πλήρων στερεοδοµών. Ιδιαίτερη έµφαση έχει δοθεί στον προσδιορισµό βέλτιστων ενεργειακών συναρτήσεων, µεθόδων εντοπισµού ελάχιστης ενέργειας και απλοποιηµένων λειτουργικών προτύπων του πρωτεϊνικού µορίου. Σε αυτό το κεφάλαιο θα εισαχθούν οι βασικοί ορισµοί και η µεθοδολογία που χρησιµοποιείται για την µελέτη της τριτοταγούς δοµής της πρωτείνης µε υπολογιστικές µεθόδους. 6.1.2. Μοριακή Μηχανική - Ορισµός Μοριακή µηχανική είναι η υπολογιστική µέθοδος που δίνει ακριβείς δοµές και ενέργειες µορίων. Χειρίζεται τα µόρια ως σύνολα µαζών που αλληλεπιδρούν µεταξύ τους µε αρµονικές (ή περισσότερο πολύπλοκες) δυνάµεις µεταξύ δέσµιων ατόµων και µε van der Waals και ηλεκτροστατικές δυνάµεις µεταξύ µη δέσµιων ατόµων. Μαθηµατικές συναρτήσεις των ατοµικών συντεταγµένων ή άλλων δοµικών παραµέτρων, οι ενεργειακές συναρτήσεις, χρησιµοποιούνται για την αναλυτική περιγραφή αυτών των αλληλεπιδράσεων. Η παραµετροποίηση των συναρτήσεων γίνεται µε βάσει πειραµατικές παρατηρήσεις σε πραγµατικά µόρια για την δηµιουργία του δυναµικού πεδίου.
6-2 6.1.3. Η Εµπειρική συνάρτηση υναµικής Ενέργειας Παρακάτω αναπτύσσονται οι αλληλεπιδράσεις που συνήθως συµπεριλαµβάνονται στην συνάρτηση δυναµικής ενέργειας : Η ολική δυναµική ενέργεια του συστήµατος δίνεται σαν το άθροισµα των επί µέρους αλληλεπιδράσεων. 6.1.3.1. Αλληλεπιδράσεις µεταξύ δέσµιων ατόµων ή τάσεις παραµόρφωσης Ενεργειακή συµµετοχή προσφέρουν και οι παραµορφώσεις από την θέση ισορροπίας των διαφόρων γεωµετρικών στοιχείων ενός µορίου όπως ανοιγµα/κλείσιµο γωνιών, τέντωµα/συµπίεση δεσµών, αποµάκρυνση ατόµων από επίπεδο και περιστροφές γύρω από δίεδρες γωνίες. Οι όροι αυτοί αναπαρίστανται συνήθως από αρµονικούς ταλαντωτές γύρω από µια θέση ισορροπίας. Α. Απλές αρµονικές συναρτήσεις περιγράφουν τις τάσεις των δεσµών και των επίπεδων γωνιών. Β. Η απόκλιση ατόµων από το επίπεδο ορισµένων οµάδων (όπως ο πεπτιδικός δεσµός) µπορεί επίσης να αναπαρασταθεί µε αρµονικά δυναµικά που εφαρµόζονται σε δίεδρες γωνίες. Γ. Περιστροφές γύρω από απλούς δεσµούς περιγράφονται από ηµιτονοειδείς συναρτήσεις. 6.1.3.2. Οι Ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις Η ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση µεταξύ δύο φορτίων περιγράφεται από τον νόµο Coulomb: όπου και είναι τα ατοµικά µερικά φορτία, είναι η απόσταση των ατοµικών κέντρων, και είναι η διαπερατότητα για το κενό και είναι η σχετική διηλεκτρική σταθερά για το µέσο µεταξύ των φορτίων ( ). Μία διηλεκτρική παράµετρος που εξαρτάται από την απόσταση (RDIE: ) χρησιµοποιείται για να προσεγγίσει την ύπαρξη διαλύτη χωρίς να συµπεριληφθούν αναλυτικά µόρια νερού. Για την µοριακή δυναµική η µοναδιαία διηλεκτρική σταθερά (CDIE) δίνει µια ικανοποιητική προσέγγιση. 6.1.3.3. Οι δυνάµεις Van der Waals Ένα σηµαντικό ηλεκτροδυναµικό φαινόµενο απεικονίζεται επίσης στην ενεργειακή συνάρτηση: οι αλληλεπιδράσεις van der Waals. Το ηλεκτρονικό νέφος ενός ουδέτερου ατόµου µεταβάλλεται γύρω από τον θετικά φορτισµένο πυρήνα. Οι µεταβολές αυτές µεταξύ γειτονικών µη οµοιoπολικά δέσµιων ατόµων συσχετίζονται επάγοντας αλληλεπιδράσεις διπόλων. Η απόσταση ισορροπίας προσδιορίζεται από την εξισορρόπηση των ελκτικών δυνάµεων των ηλεκτρονικών νεφών µε γειτονικούς
6-3 πυρήνες και των απωστικών µεταξύ των πυρήνων. Το δυναµικό Lennard-Jones προσοµοιάζει τις ελκτικές αλληλεπιδράσεις ως και τις απωστικές ως : όπου είναι η απόσταση ισορροπίας (όπου η δύναµη ) και είναι το βάθος του δυναµικού πεδίου δηλ.,. Γιατί `6-12' µορφή για την αλληλεπίδραση van der Waals; Η εφαρµογή της θεωρίας των κβαντικών διαταραχών σε δύο διακεκριµένα άτοµα υδρογόνου στην βασική τους κατάσταση οδηγεί σε ενέργεια αλληλεπίδρασης που φθίνει ανάλογα µε, και που µπορεί να υπολογιστεί εύκολα από. Οι δυνάµεις Lennard-Jones συνήθως υπολογίζονται µε αθροιστική προσέγγιση µεταξύ ζευγών ατόµων. ηλαδή η δυναµική ενέργεια µεταξύ τριών ατόµων Α,Β,C µη οµοιoπολικά συνδεδεµένων είναι το άθροισµα των τριών ενεργειών για κάθε ζεύγος ατόµων: 6.1.3.4. Οι υδρογονικοί δεσµοί. Οι υδρογονικοί δεσµοί είναι κυρίως ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις. Οι παρατηρούµενες θέσεις προτίµησης ή ελάχιστης ενέργειας τίθενται από τις κοντινές επαφές που παρατηρούνται έκτος των ορίων των αποστάσεων (εικ.6.1) και γωνιών (εικ.6.2.) που δίνονται στα παρακάτω σχήµατα. Η αλληλεπίδραση αυτή συµβάλει ανά υδρογονικό δεσµό ενεργειακά από 1-5 Kcal/mole και επηρεάζεται δραστικά από την τοπολογία των ατόµων που συµµετέχουν. Εικόνα 6.1. Η σχέση ενέργειας υδρογονικού δεσµού και απόστασης των τριών εµπλεκοµένων ατόµων.
6-4 Η ενεργειακή συµµετοχή των υδρογονικών δεσµών είναι υψηλή γιατί παρ ότι τα συµµετέχοντα µερικά ηλεκτροστατικά φορτία είναι µικρά, τα αλληλεπιδρώντα άτοµα είναι κοντά γιατί τα άτοµα υδρογόνου είναι µερικά απογυµνωµένα από το ηλεκτρονικό τους φορτίο. Εικόνα 6.2. Η σχέση ενέργειας απόστασης και γωνίας µεταξύ των τριών εµπλεκοµένων ατόµων στον υδρογονικό δεσµό.
6-5 Εικόνα 6.4. Οι αλληλεπιδράσεις που περιέχονται σε µία αντιπροσωπευτική συνάρτηση δυναµικής ενέργειας. Έτσι η συνολική αναπαράσταση της συνάρτησης δυναµικής ενέργειας δίνεται από Ε ολική = Ε van der Waals + E δίεδρες + Ε δεσµών + Ε ηλεκτροστατικές + Ε υδρογ.δεσµοί ή αναλυτικά
6-6 µε Για το δυναµικό των δέσµιων ατόµων ο πρώτος όρος είναι άθροισµα για όλα τα οµοιοπολικά συνδεδεµένα ατοµικά ζεύγη. Ο δεύτερος για όλες τις γωνιές δεσµών που ορίζονται από τρία άτοµα ενώ ο τρίτος και τέταρτος αθροίσµατα για τετραπλέτες ατόµων. Για τις µη οµοιοπολικές αλληλεπιδράσεις (van der Waals και ηλεκτροστατικές), το άθροισµα είναι για τα άτοµα i και j, όπου i < j' εξασφαλίζει ότι κάθε αλληλεπίδραση υπολογίζεται µόνο µία φορά. Συνήθως άτοµα που απέχουν ένα ή δυο δεσµούς µεταξύ τους εξαιρούνται από την αλληλεπίδραση ενώ άτοµα που απέχουν τρεις (οι 1-4 αλληλεπιδράσεις) έχουν ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις µειωµένες κατά ένα κλασµατικό παράγοντα. 6.1.4. Ελαχιστοποίηση της δυναµικής ενέργειας. Μετά την επιλογή της δυναµικής συνάρτησης ένας βασικός παράγοντας της µοριακής µηχανικής είναι ο προσδιορισµός της στερεοδιάταξης ελάχιστης ενέργειας. Η δυναµική επιφάνεια ως συνάρτηση των καρτεσιανών συντεταγµένων των ατόµων έχει πολλές κορυφές (ενεργειακά τοπικά µέγιστα) και κοιλάδες (ενεργειακά τοπικά ελάχιστα). Κάθε κοιλάδα αντιπροσωπεύει µία σταθερή ή τοπικά σταθερή κατάσταση του συστήµατος. Για την πρωτεΐνη η στερεοδοµή που σχετίζεται µε µία σταθερή κατάσταση λέγεται στερεοδιάταξη. Έτσι οι στερεοδιατάξεις µπορούν να προσδιοριστούν µε τον εντοπισµό των ενεργειακών ελαχίστων της επιφάνειας δυναµικής ενέργειας. Η τεχνική του υπολογισµού της ελαχίστης δυναµικής ενέργειας του µορίου ή του συστήµατος µορίων σαν συνάρτηση των µεταβλητών του συστήµατος (π.χ. δίεδρες γωνίες, αποστάσεις κλπ.)που υπολογίζει τα ενεργειακά ελάχιστα καλείται ελαχιστοποίηση της ενέργειας. Πολλές µέθοδοι ελαχιστοποίησης της ενέργειας είναι διαθέσιµοι. Οι µέθοδοι που χρησιµοποιούν µόνο πρώτες παραγώγους της συνάρτησης δυναµικής ενέργειας απαιτούν λιγότερους υπολογισµούς ενώ µεγαλύτερη ακρίβεια επιτυγχάνεται µε µεθόδους που χρησιµοποιούν και δεύτερες παραγώγους της συνάρτησης. Όπως αναφέρθηκε και προηγουµένως η βασική ιδέα της πρόβλεψης της δοµής µιας πρωτείνης µε µοριακή προσοµοίωση βασίζεται στην υπόθεση ότι η στερεοδιάταξη µε την χαµηλότερη δυναµική ενέργεια είναι η φυσική στερεοδιάταξη της πρωτείνης. Έτσι ο προσδιορισµός της φυσικής στερεοδιάταξης ανάγεται στην αναζήτηση του χαµηλότερου ενεργειακά ελάχιστου. Οι περισσότερες µέθοδοι ελαχιστοποίησης όµως δεν µπορούν να υπερβούν ενεργειακά φράγµατα που σχηµατίζονται γύρω από ενεργειακά ελάχιστα.
6-7 6.1.5.Οι επιφάνειες δυναµικής ενέργειας Όταν οι δυναµική ενέργεια του µορίου χαρτογραφηθεί για µία ή περισσότερες από τις παραµέτρους πού αλλάζουν (π.χ. δίεδρες γωνίες) κατασκευάζεται µία δυναµική ενεργειακή επιφάνεια. Εικόνα 6.5. Η επιφάνεια δυναµικής ενέργειας για τον αναστολέα της διυδροφολικής αφυδρογονάσης (DHFR) τριµεθοπρίµης µε παραµέτρους τις δίεδρες γωνίες Θ 1 και Θ 2. Οι γραµµοσκιασµένες περιοχές είναι οι περιοχές υψηλής ενέργειας και µη επιτρεπτής στερεοδιάταξης. Οι αριθµοί υποδεικνύουν παρατηρούµενες στερεοδιατάξεις σε περιοχές χαµηλής δυναµικής ενέργειας. Εικόνα 6.6. Η επιφάνεια δυναµικής ενέργειας για το διπεπτίδιο µε παραµέτρους τις δίεδρες γωνίες φ και ψ. Με (. ) και (+) σηµειόνονται οι παρατηρούµενες στερεοδιατάξεις (α-έλικα (στο µέσον), β- πτυχωτή επιφάνεια (επάνω)).
6-8 6.1.6. Ενθαλπία και Εντροπία. Η ελεύθερη ενέργεια του µορίου ή συστήµατος µορίων δινεται θερµοδυναµικά από Ε = G - T S οπου G είναι η ενθαλπία και S η εντροπία. Η διαφορά της εντροπίας εκφράζεται στα µοριακά συστήµατα από την κάλυψη των υδρόφοβων επιφανειών και την διάταξη των πολικών διαλυτών (νερού κλπ.).
6-9 6. 2. Μοριακή υναµική 6.2.1. Μοριακή υναµική - Ορισµός Η µοριακή δυναµική είναι η υπολογιστική µέθοδος για την προσοµοίωση της κίνησης ενός συστήµατος πολλών σωµατιδίων. Απαιτεί γνώση του δυναµικού αλληλεπίδρασης που δηµιουργείται από τις δυνάµεις που ασκούνται στα σωµατίδια και τις εξισώσεις κίνησης που ρυθµίζουν την δυναµική των σωµατιδίων. Τα δυναµικά πεδία της µοριακής µηχανικής συχνά χρησιµοποιούνται στις προσοµοιώσεις µοριακής δυναµικής. Η δύναµη που ασκείται σε κάθε άτοµο I υπολογίζεται από τις παραγώγους της συνάρτησης δυναµικής ενέργειας (de/dxi, de/dy i, de/dz i ) ως προς το άτοµο j. Η εξίσωση κίνησης του Νεύτωνα, f i = m i a i, χρησιµοποιείται για τον εντοπισµό των επιταχύνσεων κάθε ατόµου σε κάθε βήµα της προσοµοιώσης. G 1 D 1 + R D 1 R G 3 G 4 D 2 + R D 2 R G 2 G 1 + G 4 = G 3 + G 2 και συνεπώς η σχετική ενέργεια σύνδεσης είναι G 2 - G 1 = G 4 - G 3 Εικόνα 6.7. Μοριακή δυναµική και σύνδεση ενζύµου (R) - υποστρώµατος (D1,D2) Η τεχνική της προσοµοίωσης της εξάχνωσης (Simulated annealing) τοποθετεί το προσµοιαζόµενο πρωτεϊνικό σύστηµα σε υψηλή θερµοκρασία και µετά το αφήνει να κρυώσει» σταδιακά. Θερµαίνοντας την πρωτείνη σε υψηλή θερµοκρασία η προσοµοίωση την υποβοηθά να ξεπεράσει υψηλά ενεργειακά φράγµατα και έτσι να δοκιµάσει υπολογισµούς σε περισσότερες στερεοδιατάξεις. Όπως το σύστηµα κρυώσει προς τους 0 o K, η πρωτείνη εγκλωβίζεται στο συνολικό ενεργειακό ελάχιστο. Εάν το δυναµικό πεδίο έχει αρκετή ακρίβεια τότε τη στερεοδιάταξη του γενικού ενεργειακού ελάχιστου θα πρέπει να είναι η φυσική στερεοδοµή της πρωτεΐνης.
6-10 6. 3. Άλλες Μοριακές Προσοµοιώσεις 6.3.1. Προσοµοιώσεις Monte Carlo Η ανάγκη εντοπισµού του γενικού ενεργειακού ελάχιστου οδήγησε στην ανάπτυξη µιας µεθόδου Monte Carlo για την τυχαία διερεύνηση του στερεοδιατακτικού χώρου που προσοµοιάζει το µοριακό σύστηµα τροποποιώντας τυχαία την στερεοδιάταξη του. Η ενέργεια κάθε τυχαίας στερεοδιάταξης συγκρίνεται µε την προηγούµενη. Εάν είναι χαµηλότερη τότε αυτή είναι η νέα στερεοδιάταξη. Εάν είναι υψηλότερη τότε τυχαία επιλέγεται µία άλλη. Το πλεονέκτηµα της µεθόδου είναι ότι το τυχαίο που εισάγει µπορεί να υπερβεί πολλά ενεργειακά φράγµατα. Οι µέθοδοι Monte Carlo συνήθως συγκλίνουν αργότερα από τις µεθόδους µοριακής δυναµικής. Εικόνα 6.8. Η µέθοδος Monte Carlo συγκρίνει ενέργεια συστήµατος. Ο λόγος των πιθανοτήτων δύο ενεργειακών καταστάσεων Ε,Ε είναι συσχετισµένες µε την ενεργειακή διαφορά των στερεοδιατάξεων. Εικόνα 6.9. Ο αλγόριθµος Monte Carlo. V( R ) είναι η δυναµική ενέργεια του συστήµατος στην στερεοδιάταξη R.
6-11 6.3.2. Προσοµοιώσεις τρισδιάστατου πλέγµατος Ένας άλλος τρόπος προσέγγισης του προβλήµατος εντοπισµού της φυσικής στερεοδοµής είναι η απλοποίηση του προτύπου της πρωτεϊνικής δοµής. Ο περισσότερο προσφιλής τρόπος είναι η αναπαράσταση σφαιρικών πρωτεϊνών µέσα σε ένα κυβικό πλέγµα. Ο αριθµός των βαθµών ελευθερίας µειώνεται µε την αναπαράσταση των α-ανθράκων µόνον στους κόµβους ενός τρισδιάστατου πλέγµατος και την αντικατάσταση των πλευρικών αλυσίδων µε οµάδες µε πολύ λιγότερους βαθµούς ελευθερίας. Περαιτέρω απλοποίηση επέρχεται µε την απλοποίηση του πεδίου µε την χρήση µέσων τιµών δυναµικών µεταξύ τµηµάτων της πρωτείνης και του διαλύτη. Οι προσοµοιώσεις πλέγµατος βασίζονται σε πειραµατικές στατιστικές παρατηρήσεις της τοπικής δοµής της κύριας αλυσίδας της πρωτείνης. 1. Η απόσταση µεταξύ δύο διαδοχικών α-ανθράκων κατανέµεται γύρω από την θέση 3.8 Å µε µικρή διασπορά. 2. Η γωνία µεταξύ τριών διαδοχικών α-ανθράκων κατανέµεται γύρω από τις 90 o µε µικρή διασπορά. Όµως η δίεδρη γωνία µεταξύ τεσσάρων α-ανθράκων κατανέµεται γύρω από τις - 130 o Και 20-50 o, αλλά όχι τις 90 o που υπάρχουν στο κυβικό πλέγµα. Έτσι µη κυβικά πλέγµατα µε µικρότερη πλευρά από 3.8 Å, χρειάζονται για να προσεγγίσουν αυτή την παρατήρηση. Εικόνα 6.10. Σχηµατική αναπαράσταση κυβικού πλέγµατος µε ένα τµήµα της πολυπεπτιδικής αλυσίδας µε α-άνθρακες. Πολλά πιθανά προβλήµατα παρουσιάζονται στα πρότυπα πλέγµατος. Κατ αρχή η ακρίβεια των προβλέψεων δευτεροταγούς δοµής εξαρτάται από τον προσανατολισµό του βασικού άξονα του πλέγµατος. Πολλές µικρές ανακρίβειες στο πρότυπο µπορούν να συναθροιστούν γρήγορα και να είναι δύσκολο να απαλειφθούν εξ αιτίας της στατικότητας του πλέγµατος. Τµήµατα της δοµής χωρίς κανονικότητα όπως οι στροφές αναπαρίστανται χωρίς επιτυχία. Τα προβλήµατα αυτά ελαχιστοποιούνται όταν το πλέγµα που χρησιµοποιείται είναι ικανής διακριτικότητας. ( Godzik et al., 1993). Με την χρήση ενός προτύπου αναπαράστασης των α-ανθράκων σε τρισδιάστατο πλέγµα αναπτύχθηκε µια ιεραρχική µέθοδος πρόβλεψης τρισδιάστατης δοµής
6-12 (Kolinski and Skolnick, 1994a). Αρχίζοντας από την αµινοξική ακολουθία δηµιουργείται ένα πρότυπο δοµής σε ένα απλοϊκό πλέγµα για να αναδιπλωθεί η πρωτείνη σε µερικές οικογένειες δοµών ανάλογα µε την τοπολογία της και τις προβλέψεις δευτεροταγούς δοµής (εικ.6.11). Κατόπιν τα µέλη της κάθε οικογένειας µε την χαµηλότερη ενέργεια υποβάλλονται σε αναδιάταξη σε ένα ακριβέστερο πρότυπο πλέγµατος. Ακολουθεί η εφαρµογή της µοριακής δυναµικής µε αναλυτικό πεδίο δυνάµεων και η οικογένεια µε την χαµηλότερη ενέργεια και µικρότερη µέση απόκλιση µεταξύ µελών προσδιορίζεται ως η πιθανή φυσική στερεοδοµή. Εικόνα 6.11. Τα στάδια της αναδίπλωσης µε την µέθοδο του τρισδιάστατου πλέγµατος