ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 8 (ΦΡΟΝΤΙΣΤΗΡΙΟ) ΦΑΣΜΑΤΟΦΩΤΟΜΕΤΡΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Με τον όρο αυτό ονοµάζουµε την τεχνική ποιοτικής και ποσοτικής ανάλυσης ουσιών µε βάση το µήκος κύµατος και το ποσοστό απορρόφησης της ακτινοβολίας αντίστοιχα όταν αυτό διέρχεται από κάποιο διάλυµά τους. Τα πλεονεκτήµατα των φασµατοφωτοµετρικών µεθόδων είναι: -χρησιµοποιείται µικρή ποσότητα δείγµατος, -δεν καταστρέφεται το δείγµα στο τέλος της ανάλυσης, -µεγάλη ακρίβεια και ευαισθησία, -µικρός χρόνος µέτρησης. Η ύλη αλληλεπιδρά µε την ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας. Η ηλεκτροµαγνητική ακτινοβολία απορροφάται από τα άτοµα, ή τα µόρια της ύλης και προκαλεί ηλεκτρονικές διεγέρσεις, διεγέρσεις πυρήνων, αλλαγές στην περιστροφή και τη δόνηση των µορίων. Στη συνέχεια τα άτοµα και τα µόρια επιστρέφουν συνήθως στην αρχική τους κατάσταση, αφού αποβάλλουν το ποσό της ενέργειας που απορρόφησαν. Η καταγραφή της έντασης της απορρόφησης σε συνάρτηση µε το µήκος κύµατος, ή τη συχνότητα της ακτινοβολίας αποτελεί το φάσµα απορρόφησης. Το φάσµα απορρόφησης, το οποίο µπορεί να είναι γραµµικό στα άτοµα αλλά πιο ευρύ στα χηµικά µόρια είναι χαρακτηριστικό για τα άτοµα, τις ουσίες ή τις χηµικές οµάδες που περιέχονται στα χηµικά µόρια. Εστί λοιπών το φάσµα απορρόφησης µπορεί να χρησιµοποιηθεί για ταυτοποίηση χηµικών ουσίων. Όµως σηµαντική είναι και η δυνατότητα ποσοτικό προσδιορισµού των ουσιών που περιέχονται σε κάποιο διάλυµα. Η ένταση της ακτινοβολίας που αλληλεπιδρά µε την ουσία είναι ανάλογη µε την συγκέντρωση της ουσίας στο διάλυµα Πιο συγκεκριµένα: Όταν ορισµένου µήκους κύµατος ακτινοβολία διέρχεται από κάποιο διάλυµα, ένα µέρος απορροφάται. Το ποσοστό που δεν θα απορροφηθεί φθάνει στον ανιχνευτή και καταγράφεται. Η ένταση της ακτινοβολίας που τελικά απορροφάται ακολουθεί τον νόµο των Beer-Lambert όπου: Α = a b c A- η ακτινοβολία που απορροφάται a- σταθερά χαρακτηριστική για κάθε ουσία
b- µήκος διαδροµής φωτός εντός του διαλύµατος (πάχος της κυψελίδας) c- συγκέντρωση της ουσίας Ο νόµος αυτός ισχύει για µονοχρωµατική ακτινοβολία (δηλαδή συγκεκριµένο µήκος κύµατος), µε την προϋπόθεση ότι η απορρόφηση φωτός από το δείγµα είναι ανεξάρτητη της συγκέντρωσης, η ουσία δεν αντιδρά χηµικά µε τον διαλύτη του διαλύµατος, δεν διίστανται στο διάλυµα ή κατά την αραίωση του διαλύµατος και τέλος ο διαλύτης δεν απορροφά την προσπίπτουσα ακτινοβολία Ανάλογα µε το µήκος κύµατος της χρησιµοποιούµενης ακτινοβολίας η φασµατοφωτοµετρία διακρίνεται σε φασµατοφωτοµετρία ορατού και φασµατοφωτοµετρία υπεριώδους. Τα όργανα ονοµάζονται φασµατοφωτόµετρα τα οποία αποτελούνται από: - πηγή ακτινοβολίας - σύστηµα επιλογής επιθυµητού µήκους κύµατος (µονοχρωµάτορας) - κυψελίδα για το δείγµα - ανιχνευτή - καταγραφικό πηγή ακτινοβολίας ανιχνευτής καταγραφικό πηγή ακτινοβολίας δείγµα ενισχυτής µονοχρωµάτορας κυψελίδα Ποσοτικός προσδιορισµός Ο ποσοτικός προσδιορισµός πραγµατοποιείται µε τα εξής στάδια: 1. Η ουσία που θέλουµε να προσδιορίσουµε θα πρέπει να ληφθεί σε διάλυµα. Αυτό απαιτεί προετοιµασία του δείγµατος (π.χ. σάρκα ψαριού) όπως οµογενοποίηση, εκχύλιση, φιλτράρισµα κτλ., ενώ είναι πιθανό εάν η ουσία µας δεν απορροφά ορατή ή υπεριώδη ακτινοβολία να χρειαστεί να την µετατρέψουµε σε παράγωγό της η οποία απορροφά.
2. Παρασκευάζεται σειρά διαλυµάτων γνωστών συγκεντρώσεων της ουσίας ή του παράγωγού της που θέλουµε να προσδιορίσουµε (πρότυπα διαλύµατα), καθώς και το τυφλό διάλυµα (περιέχει µόνο τον διαλύτη). 3. Επιλέγουµε στο φασµατοφωτόµετρο το µήκος κύµατος που είναι κατάλληλο για την µέτρηση της συγκεκριµένης ουσίας. 4. Τοποθετούµε κυψελίδα µε το τυφλό διάλυµα και µηδενίζουµε. 5. Κατόπιν µετρούµε την απορρόφηση των προτύπων διαλυµάτων ξεκινώντας από το αραιότερο. 6. Μετρούµε την απορρόφηση των άγνωστων δειγµάτων 7. Από τις απορροφήσεις των προτύπων διαλυµάτων κατασκευάζεται η καµπύλη αναφοράς. 8. Από την καµπύλη αναφορά προσδιορίζουµε τις συγκεντρώσεις των αγνώστων δειγµάτων. ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ Εισαγωγή Η χρωµατογραφία είναι η σπουδαιότερη τεχνική διαχωρισµού αλλά και ποιοτικού και ποσοτικού προσδιορισµού ουσίων. Για πρώτη φορά λεπτοµερής περιγραφή πραγµατοποιήθηκε από τον Ρώσο Βοτανολόγο Michael Tswett το 1906. Χρησιµοποίησε µια γυάλινη στήλη όπου την πλήρωσε µε σκόνη ανθρακικού ασβεστίου. Κατόπιν, πρόσθεσε στην κορυφή εκχύλισµα από πράσινους φυτικούς ιστούς και ξεκίνησε να προσθέτει πετρελαϊκό αιθέρα. Μετά από την πάροδο ορισµένου χρόνου, όπου κατά την διάρκεια του συνέχιζε να προσθέτει πετρελαϊκό αιθέρα, τα συστατικά του εκχυλίσµατος προχώρησαν εντός της στήλης, αλλά πλέων σχηµάτιζαν δύο έγχρωµους πράσινους δακτυλίους. Ο διαχωρισµός της α και β χλωροφύλλης είχε επιτευχθεί. Ο Tswett εξήγησε ότι οι χρωστικές που προσροφούνται ισχυρά στο υλικό πλήρωσης της στήλης εκτοπίζουν αυτές που προσροφούνται χαλαρά, οι οποίες παρασύρονται παρακάτω εντός της στήλης από τον διαλύτη. Στην εµφάνιση αυτών των έγχρωµων ζωνών οφείλεται και ο όρος χρωµατογραφία. Γενικά η χρωµατογραφία σήµερα εκφράζει µια ποικιλία διεργασιών όπου όλες αφορούν την διαφορετική κατανοµή των συστατικών ενός µίγµατος που θέλουµε να διαχωρίσουµε µεταξύ δύο φάσεων, της ακίνητης ή στατικής (stationary phase) και της κινητής (mobile phase). Η κινητή φάση διέρχεται επάνω από την επιφάνεια της στατικής προκαλώντας µετατόπιση των συστατικών του µίγµατος σε διαφορετικές θέσεις.
Είδη χρωµατογραφίας Τα είδη χρωµατογραφίας κατατάσσονται είτε µε το είδος των φάσεων κινητής και στατικής φάσης δηλαδή χρωµατογραφία υγρού-υγρού, αερίου-υγρού, υγρού-στερεού και αερίουστερεού αντίστοιχα, ή µε το είδος του µηχανισµού διαχωρισµού όπως χρωµατογραφία προσρόφησης, χρωµατογραφία κατανοµής, χρωµατογραφία ιονανταλλαγής, χρωµατογραφία gel κτλ. Χρωµατογραφία προσρόφησης είναι ο µηχανισµός χρωµατογραφίας του Tswett. Ο διαχωρισµός πραγµατοποιείται λόγω της διαφορετικής ικανότητας προσρόφησης των συστατικών του µίγµατος στην στατική φάση. Η στατική φάση σε αυτές τις περιπτώσεις είναι υλικά µε µεγάλο λόγο εµβαδού προς όγκο και µε χηµικές ενεργές (προσροφητικές) επιφάνειες. Η χρωµατογραφία του Tswett από πλευράς φάσεων ήταν χρωµατογραφία υγρούστερεού (ή αλλιώς υγρή χρωµατογραφία προσρόφησης). Χρωµατογραφία κατανοµής είναι ο συνηθέστερος µηχανισµός χρωµατογραφίας που χρησιµοποιούµε σήµερα. Η στατική φάση είναι ένα λεπτό στρώµα υγρού πάνω στην επιφάνεια ενός αδρανούς πορώδους υλικού. Ο διαχωρισµός πραγµατοποιείται λόγω της διαφορετικής κατανοµής ή αλλιώς διαλυτότητας των συστατικών του µίγµατος µεταξύ της υγρής στατικής φάσης και της κινητή φάσης, η οποία κινητή φάση µπορεί να είναι υγρό ή και αέριο. Στην περίπτωση της υγρής κινητής φάσης µιλάµε για την υγρή χρωµατογραφία κατανοµής (χρωµατογραφία υγρού-υγρού). Η γνωστή και πολυχρησιµοποιούµενη σήµερα υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ανήκει σε αυτό το είδος χρωµατογραφίας. Στην περίπτωση της αέριας κινητής φάσης µιλάµε για την αέριο χρωµατογραφία κατανοµής (χρωµατογραφία αερίου-υγρού). Με την αέριο χρωµατογραφία µπορούµε να διαχωρίσουµε πολύ µικρές συγκεντρώσεις ουσιών αλλά αυτές για να διαχωριστούν θα πρέπει να έχουν κάποια τάση ατµών (να είναι πτητικές) στην θερµοκρασία της στήλης (η οποία µπορεί να είναι από θερµοκρασία δωµατίου µέχρι 250 ο C ή και παραπάνω). Χρωµατογραφία ιονανταλλαγής είναι χρωµατογραφία υγρού-στερεού αλλά ο µηχανισµός διαχωρισµού αφορά ιονισµένα σωµατίδια. Χρωµατογραφία πηκτής (gel) είναι η χρωµατογραφική τεχνική όπου ο διαχωρισµός των συστατικών του µίγµατος οφείλετε στο διαφορετικός τους µέγεθος, δηλαδή οι ουσίες διαχωρίζονται ανάλογα µε το µοριακό τους βάρος. Θεωρία Χρωµατογραφικού διαχωρισµού Οι χρωµατογραφικοί διαχωρισµοί µιγµάτων διαφόρων ουσιών βασίζονται στην κατανοµή των ουσιών µεταξύ µιας στατικής και µιας κινητής φάσης, που βρίσκονται σε µια χρωµατογραφική
στήλη. Η κινητή φάση κινείται κατά µήκος της στήλης, παρασύροντας κάθε ένωση µε διαφορετική ταχύτητα. Οι διαφοροποιήσεις αυτές µπορεί να βασίζονται σε ιδιότητες των ουσιών όπως το σηµείο βρασµού (αέριος χρωµατογραφία), η πολικότητα (υγρή χρωµατογραφία), το ηλεκτρικό φορτίο (χρωµατογραφία ιονανταλλαγής), το µέγεθος του µορίου (χρωµατογραφία gel) κ.λ.π. Εάν στην έξοδο της χρωµατογραφικής στήλης υπάρχει ένα σύστηµα για την ανίχνευση και µέτρηση της ποσότητας κάθε εκλουόµενου συστατικού, τότε είναι δυνατός ο ποσοτικός προσδιορισµός κάθε διαχωριζόµενου συστατικού. Θεωρητικές πλάκες Η κίνηση µιας ουσίας Α κατά µήκος της χρωµατογραφικής στήλης µπορεί να θεωρηθεί ως κίνηση µέσο διαδοχικών θαλάµων εξισορρόπησης, που ονοµάζονται θεωρητικές πλάκες (theoretical plates). Μία θεωρητική πλάκα είναι ο όγκος της στήλης ο οποίος απαιτείται για να επιτευχθεί µια πλήρης εξισορρόπηση µεταξύ της στατικής (S) και της κινητής (M) φάσης που περιγράφεται από τον ακόλουθο λόγο κατανοµής (distribution ratio) ή συντελεστή κατανοµής (distribution coefficient). Όπου: (C A ) S συγκέντρωση ουσίας Α στην στατική φάση (C A ) M - συγκέντρωση ουσίας Α στην κινητή φάση κινητή φάση Α Μ στατική φάση Α S Σχήµα 3.1. Σχηµατική παράσταση τµήµατος χρωµατογραφικής στήλης όπου πραγµατοποιείται κατανοµή της ουσίας A µεταξύ της στατικής (Α S) και κινητής φάσης (Α Μ). Για µια δεδοµένη χρωµατογραφική στήλη µε ορισµένο µήκος, διάµετρο και τύπο στατικής φάσης, ο αριθµός των θεωρητικών πλακών δεν είναι ένας σταθερός αριθµός, αλλά εξαρτάται από πολλούς παράγοντες οι πιο σηµαντικοί από τους οποίους είναι: η φύση και η ταχύτητα της κινητής φάσης (διαλύτη), κινητικοί παράγοντες που εµπλέκονται στην ισορροπία
κατανοµής, ως και κάθε παράγοντας που µπορεί να την επηρεάσει (π.χ. η θερµοκρασία, ο τρόπος πλήρωσης της στήλης-γνωστότερος ως "πακετάρισµα"- και βέβαια η ίδια η φύση της ουσίας Α). Υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης -HPLC Η υψηλή απόδοση είναι αποτέλεσµα της στήλης η οποία είναι πακεταρισµένη µε σωµατίδια πορώδους υλικού πολύ µικρής διαµέτρου, µε αποτέλεσµα η επιφάνεια στην οποία πραγµατοποιείται η κατανοµή να είναι πολύ µεγάλη. Για την επίτευξη ικανοποιητικής ροής διαλύτη διαµέσου της στήλης χρειάζεται σε αυτή την περίπτωση χρήση αντλίας η οποία αναπτύσσει πίεση πολλών psi (1500-3000 psi είναι σύνηθες). Η αντλία, ανάλογα τον τύπο της, µπορεί να έχει την ικανότητα να αλλάζει την ροή της κινητής φάσης µε το χρόνο, ενώ ταυτόχρονα έχει την δυνατότητα να αναµιγνύει διαφορετικούς διαλύτες µε την συγκέντρωσή τους στο µίγµα της κινητής φάσης να είναι και αυτή µεταβαλλόµενη (αντλία gradient). Αυτά τα χαρακτηριστικά είναι σηµαντικά για να µπορούµε να πετυχαίνουµε καλύτερους διαχωρισµούς.