LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS TVIRTINU: Prorektorė mokslui Prof. Vaiva Lesauskaitė 2015 m. lapkričio mėn. 6 d. ŽEMĖS ŪKIO, MAISTO ŪKIO IR ŽUVININKYSTĖS 2015 2020 metų MOKSLINIŲ TYRIMŲ IR TAIKOMOSIOS VEIKLOS PROGRAMA BULIŲ IR KUILIŲ SPERMOS KOKYBĖS VERTINIMAS 2015 M. GALUTINĖ ATASKAITA Tyrimo vadovas Prof. Henrikas Žilinskas Kaunas 2015
ĮVADAS Gyvulių reprodukcijoje iki šiol labai svarbią vietą užima veislinės medžiagos kokybė. Tik iš sveikų bulių ir kuilių reproduktorių gaunama daug, kokybiškos ir didelės apvaisinimo galios spermos. Šiuo metu Lietuvoje karvėms ir telyčioms sėklinti naudojama šiaudeliuose įšaldyta, t.y. kriokonservuota, veislinių bulių sperma. Kiaulės sėklinamos skiesta šviežia arba atvėsinta kuilių sperma. Pateles sėklinant su patikrintos kokybės sperma galima pasiekti gerų apsivaisinimo rezultatų. Sėklinimui naudojama sperma turi būti ne tik aukštos genetinės vertės, bet ir ypatingai geros kokybės, apvaisinimo galios ir nebūti užkrėsta patogeniniais mikroorganizmais. Spermos kokybė nėra nekintanti, labai daug žinomų ir nežinomų veiksnių, veikiančių nuolat ar ne, turi įtakos gyvulių reproduktorių sveikatai, spermatogenezei, o tuo pačiu ir spermos kokybiniams ir kiekybiniams rodikliams. Ilgėjantis šviesusis paros laikas pavasarį, genetiniai veiksniai, intensyvus reproduktoriaus naudojimas skatina spermatogenezę, tuo tarpu aukšta aplinkos temperatūra, senyvas gyvulio amžius, šėrimas nekokybiškais ir nepilnaverčiais pašarais ir kt. turi neigiamos įtakos spermos kokybei, tuo pačiu ir apsivaisinimo rezultatams. Lietuvoje kuilių ir bulių sperma turi būti imama ir ruošiama pagal technologinius reikalavimus. Kiaulių ir karvių bei telyčių sėklinimui naudojamos spermos kokybė privalo atitikti šalyje šiuo metu vienintelius galiojančius šviežios ir kriokonservuotos spermos kokybės reikalavimus: Bulių sperma. Bendrieji reikalavimai. LST 1467:2006 ir Kuilių sperma. Bendrieji reikalavimai. LST 1574:2003. MTTV projekto tikslas buvo: Įvertinti Lietuvoje sėklinimui naudojamos įvairių veislių bulių kriokonservuotos ir kuilių skiestos spermos kokybę ir standartų reikalavimų atitikimą. nustatant: Darbo uždaviniai: Ištirti 100 kriokonservuotos bulių bei 100 skiestos kuilių spermos dozių, 1. Spermos spalvą, išvaizdą. 2. Spermos tūrį, cm 3. 3. Spermos judrumą, balais ar proc. 4. Spermatozoidų tankį mlrd/cm 3. 5. H jonų koncentraciją (ph). 6. Tiesiai judančių spermatozoidų skaičių dozėje, mln. 7. Absoliutų spermatozoidų gyvybingumą, h. 8. Spermatozoidų gyvybingumą 38 o C temperatūroje, h. 9. Bendrą patologinių spermatozoidų kiekį, proc. -Iš jų su patologinėmis galvutėmis, proc. -Su kitomis patologinėmis formomis, proc. 2
TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI Po 100 kriokonservuotos bulių ir šviežios atskiestos kuilių spermos dozių buvo pristatyti į LSMU Veterinarijos akademijos Neužkrečiamųjų ligų katedros Gyvulių reprodukcijos laboratoriją tyrimams. Kriokonservuotos 20 bulių (po 5 dozes kiekvieno) iš keturių (A, B, C ir D) Lietuvos spermos gamybos ir platinimo įmonių spermos dozės buvo pristatytos Diuaro induose, skystame azote -196 o C temperatūroje. Skiesta kuilių sperma pristatyta termodėžėse, išfasuota flakonuose dozėmis, paruoštomis kiaulių sėklinimui. Tyrimo metu gauta ir ištirta dvidešimt keturių kuilių sperma vieną kartą, keturiasdešimties kuilių - du kartus ir dvylikos kuilių sperma buvo tirta tris kartus. Pakartotini to paties kuilio spermos tyrimai atlikti su 6 8 savaičių pertrauka. Kriokonservuotos bulių spermos mėginio paruošimas tyrimams, t.y. šiaudelio atšildymas. Ištraukus šiaudelį su sperma iš Diuaro indo, nuo jo paviršiaus ir galų nupurtomi skysto azoto lašai. Šiaudelis panardinamas į šilto (37±0,5 o C) vandens vonelę ir joje laikomas ne daugiau kaip 10 sekundžių. Kriokonservuotos bulių spermos tyrimui atlikti reikalinga atšildyti 5 vnt. vieno buliaus, vienos partijos šiaudelius. Trys šiaudeliai ištraukiami iš vandens vonelės po 10 sekundžių ir naudojami tyrimams. Likę du inkubuojami vandens vonelėje 5 val. (žr.: Spermatozoidų gyvybingumo 38 o C temperatūroje nustatymas). Purtant kaip medicininį termometrą, šiaudelyje esantis oro tarpelis nustumiamas iš šiaudelio su sperma vidurio į jo galą. Hermetizuotas šiaudelio galas su oro tarpeliu nukerpamas 5 mm statmenai išilginei jo ašiai. Šiaudeliai nukirptais galais žemyn įdedami į pašildytą Eppendorf mėgintuvėlį esantį termomikseryje (Termomixer Compact), kuriame palaikoma pastovi 37±0,5 o C temperatūra, tik tada nukerpamas kitas šiaudelių galas ir šiaudelių turinys išbėga į mėgintuvėlį. Mėgintuvėlio turinys naudojamas tolimesniems tyrimams. Spermos spalva, išvaizda. Kriokonservuotos bulių spermos spalva ir išvaizda įvertinama vizualiai, išleidus šiaudelių turinį į Eppendorf mėgintuvėlį. Atskiestos kuilių spermos spalva ir išvaizda įvertinama vizualiai. Spermos tūris (g, cm 3 ). Kriokonservuota bulių sperma užšaldoma standartinio tūrio šiaudeliuose: 0,25ml (prancūziška šaldymo technologija) arba 0,5 ml (amerikietiška šaldymo technologija). Kuilių atskiestos spermos dozės tūris nustatomas pasvėrus kiekvieną spermos dozę elektroninėmis svarstyklėmis (KERN ALS 220-4, Vokietija) ir iš gauto dozės svorio atėmus tuščios taros svorį. Informaciją apie paimtos neskiestos spermos svorį (g) pateikia gamintojas. 3
Spermatozoidų judrumo nustatymas Spermatozoidų judrumas nustatomas 37-38 o C temperatūroje, kai spermatozoidai yra maksimaliai aktyvūs. Spermatozoidų judrumas vertinamas fazių kontrastiniu mikroskopu (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija), naudojant 10 kartų didinančius objektyvą ir okuliarą, padidina 100 kartų. Mikroskope integruotas šildomasis stalelis, palaikantis nekintančią 37 о C temperatūrą. Spermatozoidų judrumo tyrimui naudojami pašildyti dengiamieji ir objektiniai stikleliai, pipečių antgaliai. Ant šilto 37 o C temperatūros objektinio stiklelio užlašinamas šiltos spermos lašas ir uždengiamas šiltu dengiamuoju stikleliu. Spermatozoidų judrumas vertinamas subjektyviai, nustatant tiesiai judančių (bulių) ar judančių ratais (kuilių maniežinis judėjimas) spermatozoidų kiekį (procentais ir balais, (žr.: Absoliutaus spermatozoidų gyvybingumo nustatymas)) penkiuose mikroskopo matymo laukuose, o rezultatui gauti apskaičiuojamas 5 matavimų aritmetinis vidurkis. Jei spermatozoidų judrumas vertinamas 10 balų sistema, 3 5 mikroskopo matymo laukuose nustatomas tiesiai judančių spermatozoidų procentas. Jeigu tiesiuoju judėjimu juda 95 proc. spermatozoidų vertinama 10 balų, jeigu 90 proc. 9 balais, jeigu 80 proc. 8 balais ir t.t. Spermatozoidų tankis (mln/cm 3 ). Spermatozoidų tankis nustatomas fazių kontrastiniu mikroskopu (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija), naudojant 20 kartų padidinantį objektyvą ir Goriajevo kamerą. Sperma praskiedžiama destiliuotu vandeniu santykiu 1:20 ir kruopščiai išmaišoma. Užpildoma Goriajevo kamera. Spermatozoidai skaičiuojami 5 dideliuose kvadratuose (80 mažų kvadratėlių) arba 0,2 mm 2 plote. Spermatozoidai skaičiuojami tris kartus skirtinguose kvadratuose ir suskaičiuojamas trijų skaičiavimų vidurkis. Spermatozoidų koncentracija nustatoma pagal formulę: K = S P 5 1 0 1000 kur, K spermatozoidų skaičius spermos 1 ml (mln/cm 3 ), S spermatozoidų skaičius 80-tyje mažų kvadratų, P praskiedimo laipsnis, 5 koeficientas, nes spermatozoidai buvo skaičiuoti 0,2 mm 2 kameros plote, 10 daugiklis, nes kameros gylis yra 0,1 mm., 1000 daugiklis, spermatozoidus perskaičiuojant į 1 ml. H jonų koncentracijos nustatymas (ph). H jonų koncentracija nustatoma skiestoje kuilių spermos dozėje. H jonų koncentracija nustatoma elektroniniu ph-matuokliu (WTW 526) su skaitmenine prietaiso indikacija, naudojant standartinį H jonų elektrodą. Į stiklinį mėgintuvėlį 4
įpilama 10 ml skiestos kuilių spermos, o į ją įmerkiamas elektrodas. Fiksuojama ekrane nurodoma ph reikšmė. Tyrimo dieną ph-metras kalibruojamas pagal eksploatavimo instrukciją. Tiesiai judančių spermatozoidų skaičiaus dozėje nustatymas. Bulių teisiai judančių spermatozoidų skaičius dozėje apskaičiuojamas pagal formulę: Sd = ((K/4) J) /100 arba Sd = ((K/2) J) /100 kur: Sd tiesiai judančių spermatozoidų skaičius dozėje, mln. J spermatozoidų judrumas, proc. (žr. Spermatozoidų judrumo nustatymas.) K spermatozoidų koncentracija, mln/ml. (žr. Spermatozoidų koncentracijos nustatymas). 100 daugiklis, naudojamas perskaičiuojant spermatozoidus milijonais. 4 daugiklis naudojamas perskaičiuojant spermatozoidų koncentraciją dozėje, kai šiaudelio tūris 0,25 ml (prancūziškos šaldymo technologijos šiaudeliams). 2 daugiklis naudojamas perskaičiuojant spermatozoidų koncentraciją dozėje, kai šiaudelio tūris 0,5 ml. (amerikietiškos šaldymo technologijos šiaudeliams) Kuilių judriųjų spermatozoidų skaičius dozėje (mlrd.) apskaičiuojamas pagal formulę: S = (K J) /100 kur: S judančių spermatozoidų skaičius dozėje, mlrd. J spermatozoidų judrumas, proc. (žr. Spermatozoidų judrumo nustatymas.) K spermatozoidų koncentracija, mlrd./dozėje. (žr. Spermatozoidų koncentracijos nustatymas) 100 daugiklis, naudojamas perskaičiuojant spermatozoidus milijardais. Absoliutaus spermatozoidų gyvybingumo nustatymas. Absoliutaus spermatozoidų gyvybingumo nustatymas atliekamas atšildytoje kriokonservuotos bulių spermos dozėje. Nustatomas spermatozoidų judrumas J0 (balais) atšildytoje spermos dozėje (žr. Spermatozoidų judrumo nustatymas). Mėgintuvėlis su atšildytos spermos mėginiu užkemšamas kamšteliu ir paliekamos 37±0,5 C vandens vonioje. Kas valandą nustatomas spermatozoidų judrumas J1, J2.., Jn (balais), kiekvieną kartą paimant pavyzdį iš to paties flakono. Nustačius, kad spermatozoidų judrumas Jn+1= 0 (balais), absoliutus spermatozoidų gyvybingumas skaičiuojamas pagal formulę: S = J0 0,5 + J1 1,5 + J2 1,5 + J0 0,5; kur S absoliutus spermatozoidų gyvybingumas; J0 pradinis spermatozoidų judrumas; 5
gyvybingumą. J1, J2,, Jn, spermatozoidų judrumas po 1, 2, ir n valandų. 0,5 ir 1,5 daugikliai naudojami apskaičiuoti absoliutų spermatozoidų Spermatozoidų gyvybingumo 38 C temperatūroje nustatymas. Spermatozoidų gyvybingumo 38 C temperatūroje nustatymo tyrimas atliekamas kriokonservuotoje bulių spermos dozėje. Atšildoma ne mažiau kaip dvi tos pačios partijos spermos dozės ir nenukirpus šiaudelių galų, paliekamos 38±0,5 C vandens vonioje. Praėjus 5 val. abu šiaudeliai ištraukiami iš vandens vonios, nušluostomi servetėle, nukrečiami ir nukirpus abu šiaudelio galus turinys suleidžiamas į mėgintuvėlį, įstatytą į šildomąjį Termomixer Compact stovelį (Eppendorf) (žr.: Kriokonservuotos bulių spermos mėginio paruošimas tyrimams, t.y. šiaudelio atšildymas). Sperma mėgintuvėlyje gerai išmaišoma šilta mikropipete. Atliekamas spermatozoidų judrumo nustatymo tyrimas (žr. Spermatozoidų judrumo nustatymas). Nustatomas tiesiai judančių spermatozoidų kiekis procentais penkiuose vertinimo laukuose. Spermatozoidų gyvybingumo 16 C temperatūroje nustatymas (val.). Spermatozoidų gyvybingumo 16 o C temperatūroje nustatymo tyrimas atliekamas skiestos kuilių spermos dozėje. Atliekamas spermatozoidų judrumo tyrimas po 72 val., laikant skiestą spermą termostate 16 o C temperatūroje. Nustatomas spermatozoidų judrumas procentais (žr. Spermatozoidų judrumo nustatymas). Patologinių spermatozoidų kiekio nustatymas morfologiniai tyrimai. Spermatozoidų galvučių patologijos ir spermatozoidų su patologinėmis uodegėlėmis kiekis vertinamas atskirai. Norint įvertinti spermatozoidų galvučių patologijas spermatozoidai buvo dažomi metileno mėlynaisiais dažais pagal gamintojo instrukcijas (Sperm Blue, MICROPTIC S.L., Ispanija) Spermatozoidų dažymas Sperm Blue dažais : 1. Ant objektinio stiklelio padaromas tepinėlis ir išdžiovinamas ore. 2. Stiklelis merkiamas į fiksavimo tirpalą 10 min. 3. Stiklelis merkiamas į dažus 20-30 min. 4. Nudažytas stiklelis trims sekundėms įmerkiamas į destiliuotą vandenį ir išdžiovinamas ore. Mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu (Nicon ECLIPSE 50i, Japonija), naudojant 1000 kartų padidinimą su imersija. Spermatozoidų morfologinių pažeidimų nustatymui vertinama 500 spermatozoidų iš įvairių tepinėlio vietų. Registruojamos tokios 6
spermatozoidų galvučių patologijos: kriaušės formos, siauru pagrindu, nenormaliais kontūrais, neišsivysčiusios, nenormalios galvutės be uodegėlių, siauros, didelės, mažos normalios, trumpos plačios galvutės ir spermatozoidai su paracentriniu viduriniosios dalies prisitvirtinimu. Įvertinus 500 spermatozoidų būklę apskaičiuojama procentinė kiekvienos patologijos dalis mėginyje ir bendras galvučių patologijų procentas. Spermatozoidų uodegėlių įvertinimui buvo naudojamas Hancock o (šlapio preparato) metodas. Sperma skiedžiama buferinio formalino tirpalu santykiu 1 : 10. Lašas atskiestos spermos (5 10 μl) dedamas ant objektinio stiklelio, uždengiamas dengiamuoju stikleliu. Iš viršaus lengvai nusausinamas filtriniu popieriumi. Keletą minučių leidžiama nusėsti spermatozoidams ant stiklelio dugno, tada mikroskopuojama fazių kontrastiniu mikroskopu (Olympus BH2, Olympus Optical Co., Ltd., Japonija), naudojant 400 kartų padidinimą. Įvertiname 200 spermatozoidų. Registruojami tokie spermatozoidų uodegėlių pažeidimai: vidurinės dalies pakitimai, paprastai ir po galva susisukusios bei dvigubai sulinkusios uodegėlės, bei kitos patologijos: proksimaliniai ir distaliniai lašeliai, spermatozoidų galvutės be uodegėlių, akrosomų defektai ir pakitimai, vakuolės. Apskaičiuojama procentinė kiekvienos patologijos dalis mėginyje ir bendras uodegėlių patologijų procentas. Statistinė duomenų analizė. Gauti duomenys buvo apdoroti Microsoft Excel (Microsoft Office Excell, 2003) programa. Statistinė duomenų analizė buvo atlikta SPSS statistinio paketo Nr. 13 versija (SPSS for Windows 13.0, SPSS Inc., Chicago, IL, JAV, 1989 1999). Analizuojant duomenis buvo atliekamas jų aprašymas naudojantis aprašomąja statistika (aritmetinis vidurkis, standartinis nuokrypis, minimalios ir maksimalios reikšmės). REZULTATAI Kriokonservuotos bulių spermos kokybės tyrimo rezultatai Projekto metu buvo nupirkta 100 kriokonservuotos/užšaldytos bulių spermos dozių iš keturių (A, B, C ir D) Lietuvos spermos gamybos ir platinimo įmonių, po 25 dozes iš kiekvienos. Sperma gamybos įmonėse atskiedžiama, fasuojama, vėsinama ir užšaldoma pagal bulių spermos kriokonservavimo technologinius reikalavimus. Spermos dozės į Gyvulių reprodukcijos laboratoriją buvo pristatomos skystame azote, -196 o C Diuaro induose. Tyrimui buvo tinkamos ir panaudotos visos 100 kriokonservuotos spermos dozės/mėginiai. Spermos dozių su mechaniškai pažeistais šiaudeliais nebuvo. Oro tarpelis šiaudelyje nei vienoje dozėje nebuvo didesnis nei 12 mm. Spermos spalva ir išvaizda buvo nustatoma vizualiai apžiūrint iš šiaudelio išleistą turinį į 7
mėgintuvėlį, nes tik dalies šiaudelių spalva buvo skaidri, permatoma, o dauguma šiaudelių buvo iš nepermatomo spalvoto plastiko. Atšildytos spermos dozės buvo vienalytė, skysta masė, kurios spalva svyravo nuo balkšvos iki geltonos (priklausomai nuo skiediklio, kurio sudėtis nebuvo žinoma). Iš visų 100 tirtų kriokonservuotų bulių spermos mėginių tik 15 proc. sudarė 0,5 ml tūrio šiaudeliai (amerikietiška šaldymo technologija). Likę 75 proc. šiaudelių/dozių buvo užšaldyti 0,25 ml tūrio šiaudeliuose (prancūziška šaldymo technologija). 20 proc. spermos dozių/šiaudelių buvo pagaminta Lietuvoje. Likę 80 proc. importuoti iš užsienio šalių. Tyrimo metu nustatyta, kad vidutinis užšaldytų/atšildytų bulių spermatozoidų judrumas buvo 67 ± 7,85 proc. (nuo 50 proc. iki 80 proc.). Vidutinis spermatozoidų gyvybingumas 38 o C temperatūroje po 5 val. buvo 30,75 ± 11,73 proc. (nuo 15 proc. iki 50 proc.). Absoliutus apskaičiuotas spermatozoidų gyvybingumas 29,9 ± 40 (nuo 20,25 iki 40). Spermatozoidų koncentracijos skaičiavimai parodė, kad vidutinis spermatozoidų tankis spermos dozės mililitre (cm 3 ) yra 99,35 ± 55,07 mln. (nuo 40 mln. iki 248 mln.). Vidutinis spermatozoidų tankis (koncentracija) dozėje buvo 24,84 ± 13,8 mln. Bene svarbiausias spermos kokybės rodiklis - vidutinis tiesiai judančių spermatozoidų kiekis dozėje, kuris buvo 17,51 ±7,63 mln. (nuo 8,1 mln. iki 37,2 mln.). Kiekvieno buliaus pagrindiniai spermos kokybės rodikliai pateikiami 1 lentelėje. 8
1 lentelė. Bulių spermos kokybės tyrimo rezultatai (pagal atskirą bulių). Įmonė A B C D Bulius Judrumas, Judrumas po 5 val., Koncentracija mln/ml Koncentracija judrių mln/dozėje Galvučių patologijų Uodegėlių patologijų, Kitų patologijų, Iš viso patologinių, 11 80 30 60 12,00 6 6,5 3 15,5 12 70 50 76 13,30 3 11,5 8,5 23 13 75 30 71 13,31 4 6 1,5 11,5 14 70 20 103 18,03 3 7 1 11 15 70 50 48 8,40 2 6,5 1 9,5 1 75 45 81 15,19 4 9 5 18 2 70 40 136 23,80 2 3 3,5 8,5 3 70 45 80 14,00 2 4 1,5 7,5 4 70 35 108 18,90 6 6 4 16 5 50 30 44 11,00 1 3 1,5 5,5 6 60 20 248 37,20 2 4 0,5 6,5 7 60 15 54 8,10 2 3,5 2,5 8 8 60 20 105 15,75 1 5 0,5 6,5 9 60 15 54 16,20 2 2,5 0,5 5 10 65 15 40 13,00 2 3,5 0 5,5 16 75 45 88 16,50 1 2 2,5 5,5 17 60 25 209 31,35 1 5 1 7 18 70 30 169 29,58 2 10 2 14 19 75 30 108 20,25 2 6,5 1,5 10 20 55 25 105 14,44 4 2,5 0 6,5 9
Atlikus morfologinius spermatozoidų tyrimus buvo nustatyta, kad vidutinis bendras patologinių spermatozoidų kiekis vienoje spermos dozėje buvo 10,03 ± 4,94 proc. (nuo 5 proc. iki 23 proc.). Vidutinis bendras spermatozoidų su patologinėmis galvutėmis kiekis siekė 2,60 ± 1,50 proc. (nuo 1 proc. iki 6 proc.). Iš jų daugiausiai buvo nustatyta patologinių galvučių be uodegėlių (1,33 ± 1,78 proc.) ir spermatozoidų su nenormalaus kontūro galvute (1,20 ± 1,02 proc.). Vidutinis bendras spermatozoidų su patologinėmis uodegėlėmis kiekis nustatytas 5,35 ± 2,61 proc. (nuo 2 proc. iki 11,5 proc.). Dažniausia spermatozoidų su patologinėmis uodegėlėmis patologija buvo spermatozoidai su paprastai susisukusiomis uodegėlėmis (3,08 ± 1,82 proc.). Vidutinis bendras spermatozoidų kiekis su kitomis patologijomis buvo 2,08 ± 2,02 proc. (iki 8,5 proc.). Iš jų spermatozoidų su distaliniais lašeliais buvo 0,48 ± 0,70 proc., o su proksimaliniais lašeliais 0,25 ± 0,44 proc. Statistiškai reikšmingų spermos kiekybinių ir kokybinių skirtumų tarp keturių tyrime dalyvavusių spermos gamybos ir platinimo įmonių pagamintų dozių nenustatėme (1 pav.; p 0,05). 1 pav. Bendras patologinių spermatozoidų kiekis (proc.), kiekvieno buliaus atskirai, kriokonservuotoje/atšildytoje spermos dozėje (n=20). Kriokonservuotos ir atšildytos bulių spermos tyrimai parodė, kad tiek Lietuvoje pagaminta, tiek importuota bulių sperma dozėse, paruoštose karvių ir telyčių sėklinimui yra kokybiška, atitinkanti šiuo metu Lietuvoje galiojantį bulių spermos kokybės standartą. Nustatyti spermos kiekybiniai ir kokybiniai rodikliai buvo geresni už standarte nurodomus minimalius kokybės reikalavimus. Vidutinis nustatytas bulių spermatozoidų judrumas buvo 23 proc. didesnis nei 10
minimalus. Tiesiai judančių spermatozoidų skaičius dozėje buvo 2,51 mln. didesnis. Spermos gyvybingumo tyrimai parodė, kad dar po 5 val. spermatozoidų judrumas buvo vidutiniškai 30,75 proc., kai spermos kokybės standartuose nurodoma, kad spermatozoidai turėtų išlikti judrūs šiaudelyje, 38 o C temperatūroje, mažiausiai 5 val. Morfologiniai spermatozoidų tyrimai taip pat parodė, kad šaldoma tik labai geros kokybės bulių sperma. Nustatytas vidutinis bendras patologinių spermatozoidų kiekis buvo tik 10,03 proc., kai mažiausias leidžiamas bendras patologinių spermatozoidų kiekis nurodomas kokybės standarte 25 proc. Skiestos kuilių spermos kokybės tyrimo rezultatai Kuilių sperma numatytiems tyrimams buvo pirkta iš trijų, Lietuvoje kuilių spermą gaminančių ir platinančių, įmonių. Kuilių sperma įmonėse vidutiniškai imama 3 kartus per dvi savaites. Įmonėse sperma paimama iš kuilių, sveriama, vertinama, atskiedžiama skiedikliu iki reikiamo spermatozoidų kiekio ir išfasuojama į sėklinimo dozes, t.y. paruošiama pagal technologinius reikalavimus. Taip paruošta spermos dozė buvo pristatoma į Gyvulių reprodukcijos laboratoriją tyrimams, nurodant gauto ejakuliato svorį (g). Tyrimo laikotarpiu dvidešimt keturių kuilių sperma ištirta po vieną kartą. Keturiasdešimties kuilių sperma buvo tiriama du kartus: pirminis tyrimas ir pakartotinis tyrimas po 6 8 savaičių pertraukos. Dvylikos kuilių sperma tirta tris kartus. Tyrimo metu ištirta iš viso 100 skiestos kuilių spermos dozių. Apskaičiuota, kad vidutinis kuilio ejakuliato tūris buvo 267,73 ± 71,01 ml. Mėginio spalva ir išvaizda buvo nustatoma vizualiai apžiūrint spermos dozę. Visų tirtų spermos dozių spalva buvo balkšva. Spalvos intensyvumas koreliavo su spermatozoidų koncentracija: kuo didesnė spermatozoidų koncentracija, tuo spalvos balkšvumas buvo intensyvesnis. Pati sperma dozėse buvo skysta, vienalytė masė, be vizualiai matomų mechaninių priemaišų. Vidutinis dozės svoris buvo 87,75 ± 4,02 g (nuo 71,4 g iki 95,5 g). Kuilių, kurių sperma buvo imta ir tirta tris kartus, pagrindiniai kokybės parametrai ir jų kitimas tyrimo metu nurodyti 2 lentelėje. Visų kuilių pagrindiniai spermos kokybės rodikliai pateikiami 1 priedų lentelėje. 11
2 lentelė. Kuilių, kurių sperma buvo imta ir tirta tris kartus, spermos kokybės rezultatai (vidurkis ± standartinis nuokrypis) (n = 12). Rodikliai Tyrimo kartas Pirmas Antras Trečias Ejakuliato tūris, ml 260,50 ± 52,57 240,75 ± 88,04 280,50 ± 54,51 Dozės svoris, g 90,23 ± 2,40 87,98 ± 3,62 88,87 ± 2,31 ph 7,41 ± 0,24 7,30 ± 0,08 7,36 ± 0,20 Judrumas, 62,92 ± 6,20 66,67 ± 5,77 61,25 ± 6,44 Judrumas, po 72 val. 38,33 ± 10,52 30,00 ± 7,69 25,00 ± 9,29 Koncentracija mln/ml 59,58 ± 18,66 57,83 ± 44,98 42,83 ± 7,96 Koncentracija mlrd/dozėje 5,96 ± 1,87 5,78 ± 4,50 4,28 ± 0,80 Koncentracija judrių, mlrd/dozėje 3,71 ± 1,07 3,88 ± 3,19 2,65 ± 0,75 Galvučių patologijų 2,42 ± 2,02 3,17 ± 1,03 3,33 ± 1,44 Uodegėlių patologijų,. 10,58 ± 9,89 11,13 ± 8,22 7,00 ± 6,68 Kitų patologijų, 16,00 ± 7,35 8,79 ± 4,47 9,75 ± 4,66 Iš viso patologinių, 29,00 ± 15,56 23,08 ± 10,22 20,08 ± 8,24 1,5 ml gerai išmaišytos spermos dozės buvo įpilama į mėgintuvėlį tyrimams ir į Petri lėkštelę ph nustatymui. Likusi sperma dozėje buvo paliekama termostate 16 o C temperatūroje ir inkubuojama 72 val. spermatozoidų gyvybingumui nustatyti. H jonų koncentracija buvo nustatinėjama elektroniniu ph-matuokliu. Nustatyta, kad vidutinis spermos dozės ph buvo 7,31 ± 0,24 (nuo 6,7 iki 7,9). Ištyrus visus mėginius nustatyta, kad vidutinis spermatozoidų judrumas buvo 61,90 ± 9,01 proc. (nuo 35 proc. iki 75 proc.). Atlikus statistinius paskaičiavimus buvo nustatyta, kad spermatozoidų judrumas pirminio tyrimo metu buvo 6,95 ± 3,10 proc. ir 1,79 ± 3,41 proc. mažesnis nei atitinkamai antrinio ir tretinio tyrimo metu (2 pav.). 2 pav. Kuilių spermatozoidų judrumas (proc.) pirminio ir pakartotinų tyrimų metu. 12
Vidutinis spermatozoidų gyvybingumas 16 o C temperatūroje po 72 val. buvo 30,34 ± 11,36 proc. (nuo 5 proc. iki 55 proc.). Spermatozoidų koncentracijos skaičiavimai parodė, kad vidutinis spermatozoidų tankis mililitre (cm 3 ) spermos buvo 51,46 ± 32,29 mln. (nuo 11 mln. iki 199 mln.), o dozėje 5,15 ± 3,23 mlrd. (nuo 1,1 mlrd. iki 19,9 mlrd.). Apskaičiuotas vidutinis judančių spermatozoidų kiekis dozėje buvo 3,18 ± 2,09 mlrd. (nuo 0,7 mlrd. iki 13,8 mlrd.). Spermatozoidų gyvybingumo, koncentracijos ir ph parametrų skirtumų tarp tyrimų pakartojimų nebuvo (p 0,05). Atlikus morfologinius spermatozoidų tyrimus buvo nustatyta, kad vidutinis bendras patologinių spermatozoidų kiekis vienoje spermos dozėje buvo 27,64 ± 14,58 proc. (nuo 5 proc. iki 70 proc.). Vidutinis bendras spermatozoidų su patologinėmis galvutėmis kiekis buvo 3,27 ± 2,13 proc. (nuo 1 proc. iki 13 proc.). Iš jų daugiausia buvo nustatyta spermatozoidų su nenormalaus kontūro (1,26 ± 0,82 proc.) ir kriaušės formos (0,86 ± 1,48 proc.) galvute. Vidutinis bendras spermatozoidų su patologinėmis uodegėlėmis kiekis buvo 10,60 ± 9,19 proc. (nuo 1 proc. iki 61,5 proc.). Iš spermatozoidų uodegėlių patologijų didžiausią dalį sudarė spermatozoidai su paprastai susisukusiomis uodegėlėmis (8,88 ± 8,41 proc.). Vidutinis bendras spermatozoidų kiekis su kitomis patologijomis buvo 13,77 ± 10,19 proc. (nuo 1 proc. iki 48 proc.). Iš jų didžiausią dalį (63,18 proc.) sudarė spermatozoidai su distaliniais lašeliais ir su proksimaliniais lašeliais 36,82 proc. Morfologiniams spermatozoidų pakitimams, taip pat kaip spermatozoidų judrumui, reikšmingos statistinės įtakos turėjo pakartotinis kuilio spermos tyrimas. Bendrai apskaičiavus spermatozoidų su patologinėmis galvučių formomis pirminio tyrimo metu rasta 0,13 ± 1,12 proc. daugiau nei tretinio tyrimo metu. Spermatozoidų su patologinėmis uodegėlėmis pakartotino trečiojo tyrimo metu nustatyta 5,43 ± 3,47 proc. mažiau nei pirminio tyrimo metu. Bendras kitų patologinių spermatozoidų formų, tokių kaip spermatozoidų su proksimaliniais ar distaliniais lašeliais, kiekis pakartotinio tyrimo metu buvo net 7,52 ± 7,09 proc. mažiau, nei pirminio tyrimo metu (p 0,05). Bendras patologinių spermatozoidų kiekis kuilių spermos dozėje pirminio tyrimo metu buvo 12,81 ± 7,24 proc. didesnis nei tretinio ir 11,62 ± 4,74 proc. didesnis nei antrinio tyrimo metu (p 0,05). Atlikus atskirus statistinius paskaičiavimus (tik tarp tris kartus tirtų kuilių spermos dozių) nustatytas ryškus spermos kokybės pagerėjimas praėjus 5 8 sav. po pirmo tyrimo karto. Bendras patologinių spermatozoidų kiekis kuilių spermos dozėje tretinio tyrimo metu buvo 8,92 ± 7,32 proc. mažesnis nei nustatytas pradinio tyrimo metu (3 pav.). 13
3 pav. Patologinių spermatozoidų kiekio (proc.) pokyčiai spermoje pirminio ir pakartotinų tyrimų metu. Šviežios skiestos kuilių spermos kokybės tyrimai taip pat parodė, kad šalyje gaminama ir platinama Lietuvoje galiojančius kokybės standartus atitinkanti kuilių sperma. Judrių spermatozoidų dozėje, pagal standartus turėtų būti ne mažiau kaip 2 mlrd. Tuo tarpu nustatytas vidutinis judrių spermatozoidų kiekis dozėje buvo 3,18 ± 2,09 mlrd. Vidutinis nustatytas spermatozoidų judrumas buvo 61,90 ± 9,01 proc., kai leistina riba yra ne mažiau kaip 60 proc. Spermatozoidų gyvybingumo tyrimai parodė, kad spermos dozę laikant 16 o C temperatūroje mažiausiai 72 val. spermatozoidai išlieka judrūs, o jų judrumas buvo 30,34 proc. Bendras patologinių spermatozoidų kiekis dozėje viršijo normos ribas 2,64 proc. Atskirais atvejais kuilio spermos dozėje nustačius daugiau patologinių spermatozoidų nei leistina spermos kokybės standarte, t. y. 25 proc., buvo rekomenduojama tokios spermos kiaulių sėklinimui nenaudoti, o gyvulio spermos tyrimą pakartoti po 2 3 mėn., išlaikant įprastą spermos ėmimo intensyvumą. Kuilių spermatozoidai dėl sėklidžių anatominės sandaros yra labai jautrūs aplinkos temperatūros svyravimams. Aukšta aplinkos temperatūra mažina kuilio reproduktoriaus lytinį aktyvumą, pradeda lėtėti spermatogenezės hormoninė stimuliacija, kas sumažina spermatozoidų koncentraciją. Temperatūros pokyčiai neigiamai paveikia spermatogeninį epitelį, ko pasekoje pablogėja išskiriamų spermatozoidų morfologinė kokybė ir gyvybingumas, o visa tai sumažina kuilio vaisingumą. Numatydami aukštos aplinkos temperatūros neigiamą poveikį spermos kokybei, atlikome pakartotinus kuilių spermos kokybės tyrimus po 6 8 sav., t.y. laiko tarpo, spermatogenezės, per kurį susiformuoja subrendęs spermatozoidas. Tyrimo rezultatai parodė, kad žymiai daugiau patologinių spermatozoidų nustatyta pirminio, nei pakartotinų tyrimų metu. Tai paaiškintume tuo, kad pirminio tyrimo metu tirti spermatozoidai formavosi karštais liepos 14
rugpjūčio mėnesiais. O pakartotinų tyrimo metu tirti spermatozoidai susiformavę jau atvėsus orams, t.y. nepatyrę neigiamo karščio streso. Taip pat pastebėjome, kad spermos dozėje, esant didesniam patologinių spermatozoidų kiekiui ir tuo pačiu mažesniam spermatozoidų judrumui, spermatozoidų koncentracija buvo santykinai aukštesnė (4 pav.). 4 pav. Patologinių ir judrių spermatozoidų kiekio dozėje ryšys. IŠVADOS IR REKOMENDACIJOS Pagal Žemės ūkio ministerijos vykdomą MTTV projektą Bulių ir kuilių spermos kokybės vertinimas 2015 metais, kaip ir numatyta sutartyje, atlikti tyrimai apima palyginti nedidelį reproduktorių skaičių. Vadovaujantis gautais rezultatais galima teigti: 1. Kad ir Lietuvoje pagaminta, ir importuota bulių sperma dozėse, paruoštose karvių ir telyčių sėklinimui yra kokybiška, atitinkanti šiuo metu šalyje galiojantį bulių spermos kokybės standartą. 2. Tyrimo metu nustatyta, kad vidutinis užšaldytų/atšildytų bulių spermatozoidų judrumas buvo 67 ± 7,85 proc. O spermatozoidų gyvybingumas 38 o C temperatūroje po 5 val. buvo 30,75 ± 11,73 proc. 3. Vidutinis spermatozoidų tankis/koncentracija spermos dozės mililitre (cm 3 ) buvo 99,35 ± 55,07 mln. Vidutinis spermatozoidų tankis dozėje 24,84 ± 13,8 mln. O tiesiai judančių spermatozoidų kiekis kriokonservuotoje bulių spermos dozėje buvo 17,51 ±7,63 mln. 15
4. Morfologiniai spermatozoidų tyrimai taip pat parodė, kad šaldoma tik labai geros kokybės bulių sperma. Nustatytas vidutinis bendras patologinių spermatozoidų kiekis tirtoje bulių kriokonservuotoje spermoje buvo 10,03 proc. 5. Šviežios skiestos kuilių spermos kiekybės tyrimai taip pat parodė, kad vidutinis kuilio ejakuliato tūris buvo 267,73 ± 71,01 ml. Vidutinis kuilių spermatozoidų tankis spermos dozės mililitre (cm 3 ) buvo 51,46 ± 32,29 mln., o dozėje 5,15 ± 3,23 mlrd. 6. Vidutinis spermatozoidų judrumas buvo 61,90 ± 9,01 proc., o vidutinis judrių spermatozoidų kiekis dozėje buvo 3,18 ± 2,09 mlrd. 7. Šviežios skiestos kuilių spermos dozės ph vidutiniškai buvo 7,31 ± 0,24. 8. Morfologiniai kuilių spermatozoidų tyrimai parodė, kad bendras patologinių spermatozoidų kiekis vienoje spermos dozėje svyravo gan plačiose ribose nuo 5 proc. iki 70 proc. Mūsų tyrimas parodė, kad yra tam tikras spermos kokybinių rodiklių svyravimas. Neįvertintas tirtos spermos panaudojimo efektyvumas, apvaisinimas. Reikėtų ištirti žymiai daugiau iš įvairių šalių, įvairių gamintojų į Lietuvą įvežamos kriokonservuotos bulių spermos dozių. Vertinant šviežiai skiestą kuilių spermą, dėl trumpo tyrimo/projekto laikotarpio, nepavyko apžvelgti sezono, t. y. aplinkos temperatūros įtakos jos kokybei, kas būtų itin svarbu vartotojams. Taip pat reikėtų didesnio tyrimo pakartojimų skaičiaus tiems patiems kuiliams. Planuojant sekančių metų tyrimų finansavimą, Žemės ūkio ministerijai siūlome atsižvelgti į mūsų siūlymą ir planuoti 2 3 metų nuoseklius tyrimus, siekiant ištirti ženkliai didesnį reproduktorių kiekį, vertinant ne tik spermos kokybę, bet ir apvaisinimo rezultatus, sėklinimo efektyvumą. SUDERINTA: Gyvulininkystės, pašarų ir veterinarijos tyrimų priežiūros komisijos pirmininkas Vaidotas Prusevičius 2015 m. gruodžio 1 d. 16
PRIEDAI 17
Gyv. Nr. 1 lentelė. Kuilių spermos kokybės tyrimo rezultatai. Tyrimo kartas Dozės svoris, g. ph Judrumas, Judrumas po 72 val., Koncentracija mln/ml Koncentracija mlrd/ dozėje Koncentracija mlrd/dozėje judrių Galvučių patologijų Uodegėlių patologijų, Kitų patologijų, Iš viso patologinių, 1 1 88,37 7,51 60 25 11 1,10 0,66 3,0 5 10,0 18,0 2 1 88,01 7,18 75 50 22 2,20 1,65 7,0 2 9,0 18,0 3 1 88,45 7,19 65 45 30 3,00 1,95 2,0 9 26,0 37,0 5 1 89,79 7,34 55 35 58 5,80 3,19 2,0 12 22,0 36,0 6 1 91,52 6,98 40 20 59 5,90 2,36 2,0 8 48,0 58,0 11 1 88,31 7,27 45 10 49 4,90 2,21 2,0 25 20,0 47,0 12 1 91,32 7,07 50 25 48 4,80 2,40 2,0 3 17,0 22,0 14 1 92,12 7,04 45 25 55 5,50 2,48 2,0 9 36,0 47,0 15 1 88,99 7,70 40 5 35 3,50 1,40 3,0 61,5 5,5 70,0 16 1 87,81 7,27 65 15 39 3,90 2,54 3,0 2 9,5 14,5 22 1 78,62 6,91 65 40 185 18,50 12,03 2,0 23 7,0 32,0 23 1 79,52 6,74 55 25 199 19,90 10,95 6,0 13 11,0 30,0 24 1 79,62 6,69 40 15 44 4,40 1,76 3,0 26 39,0 68,0 25 1 71,42 6,88 60 15 43 4,30 2,58 13,0 12 8,0 33,0 27 1 76,62 6,80 55 17 56 5,60 3,08 2,0 18 5,0 25,0 32 1 89,65 7,64 55 25 75 7,50 4,13 8,0 10,5 3,5 22,0 33 1 89,07 7,15 60 40 51 5,10 3,06 2,0 11 7,0 20,0 34 1 89,01 7,26 60 30 70 7,00 4,20 4,0 12,5 12,5 29,0 36 1 87,57 7,69 60 20 43 4,30 2,58 4,0 22 5,0 31,0 37 1 89,52 7,59 35 40 40 4,00 1,40 3,0 14 45,0 62,0 39 1 89,09 7,13 60 40 65 6,50 3,90 2,0 14 4,0 20,0 41 1 81,12 6,65 55 17 42 4,20 2,31 4,0 19 9,0 32,0 43 1 91,55 7,04 60 45 26 2,60 1,56 3,0 8 7,5 18,5 50 1 74,12 6,81 70 50 127 12,70 8,89 2,0 13 13,0 28,0 4 1 89,28 7,45 75 40 27 2,70 2,03 3,0 0,5 9,5 13,0 2 88,84 7,30 60 25 21 2,10 1,26 3,0 0 5,0 8,0 18
7 1 87,39 7,48 70 50 67 6,70 4,69 1,0 7 27,0 35,0 2 90,05 7,07 75 40 55 5,50 4,13 2,0 3,5 3,0 8,5 8 1 87,53 7,56 60 25 88 8,80 5,28 1,0 10 32,0 43,0 2 88,79 7,39 60 25 41 4,10 2,46 3,0 23,5 12,5 39,0 9 1 88,32 7,24 40 20 58 5,80 2,32 1,0 22 32,0 55,0 2 87,21 7,28 60 15 31 3,10 1,86 1,0 11,5 11,0 23,5 10 1 86,22 7,46 45 25 37 3,70 1,67 6,0 17 28,0 51,0 2 92,74 7,41 60 25 31 3,10 1,86 4,0 22 18,5 44,5 18 1 87,92 7,03 60 25 110 11,00 6,60 1,0 23 18,0 42,0 2 87,65 7,94 70 25 53 5,30 3,71 3,0 16,5 7,5 27,0 19 1 84,87 7,44 70 20 17 1,70 1,19 9,0 6 15,0 30,0 2 81,15 7,28 75 25 21 2,10 1,58 3,0 0,5 2,0 5,5 20 1 85,38 7,29 70 35 28 2,80 1,96 11,0 4 9,0 24,0 2 85,49 7,15 65 20 24 2,40 1,56 6,0 0,5 3,5 10,0 21 1 83,94 7,27 65 30 23 2,30 1,50 3,0 3 25,0 31,0 2 80,13 7,41 75 25 23 2,30 1,73 3,0 2 0,0 5,0 26 1 86,59 7,50 70 30 14 1,40 0,98 5,0 5 7,0 17,0 2 85,13 7,27 70 25 28 2,80 1,96 4,0 2,5 3,0 9,5 28 1 92,82 7,54 75 50 48 4,80 3,60 2,0 9 3,0 14,0 2 84,90 7,58 65 40 48 4,80 3,12 3,0 6,5 11,0 20,5 38 1 90,35 7,67 60 35 47 4,70 2,82 1,0 15 33,0 49,0 2 88,44 7,46 70 45 46 4,60 3,22 6,0 6 21,0 33,0 40 1 90,63 7,36 65 50 65 6,50 4,23 5,0 4 16,0 25,0 2 90,50 7,36 70 45 93 9,30 6,51 6,0 6 9,5 21,5 42 1 89,60 7,08 60 15 37 3,70 2,22 4,0 24 10,0 38,0 2 83,71 7,19 55 10 21 2,10 1,16 3,0 2 10,0 15,0 44 1 89,22 7,01 50 25 32 3,20 1,60 3,0 10 47,0 60,0 2 87,93 7,37 65 30 29 2,90 1,89 4,0 4 18,0 26,0 46 1 91,22 7,06 55 20 52 5,20 2,86 1,0 17 15,0 33,0 2 86,52 7,27 75 50 37 3,70 2,78 3,0 8,5 7,5 19,0 47 1 88,32 7,42 75 50 34 3,40 2,55 2,0 9 9,0 20,0 19
2 88,01 7,67 60 35 45 4,50 2,70 7,0 14,5 9,0 30,5 48 1 88,62 7,24 55 25 81 8,10 4,46 2,0 18 35,0 55,0 2 83,49 7,36 65 30 96 9,60 6,24 1,0 5 11,0 17,0 52 1 93,02 7,66 65 45 38 3,80 2,47 1,0 1 17,0 19,0 2 87,74 7,27 75 30 37 3,70 2,78 3,0 5,5 17,5 26,0 53 1 88,92 7,36 60 40 41 4,10 2,46 2,0 12 8,0 22,0 2 89,63 7,16 55 20 27 2,70 1,49 2,0 6 6,5 14,5 13 1 92,42 7,43 65 40 41 4,10 2,67 1,0 5 2,0 8,0 2 88,10 7,39 55 20 53 5,30 2,92 3,0 22 8,0 33,0 3 83,46 7,42 55 15 35 3,50 1,93 3,0 3,5 8,5 15,0 17 1 90,52 7,16 75 50 37 3,70 2,78 3,0 1 5,0 9,0 2 93,37 7,18 70 30 63 6,30 4,41 4,0 0,5 3,5 8,0 3 90,14 7,12 65 20 39 3,90 2,54 3,0 0,5 3,5 7,0 29 1 89,02 7,34 60 25 30 3,00 1,80 3,0 8 15,0 26,0 2 83,48 7,33 75 45 32 3,20 2,40 4,0 5 7,5 16,5 3 90,38 7,22 60 15 45 4,50 2,70 2,0 2 17,0 21,0 30 1 89,38 7,68 65 40 61 6,10 3,97 1,0 18 21,0 40,0 2 87,45 7,29 65 30 43 4,30 2,80 5,0 18 8,5 31,5 3 90,20 7,28 55 15 40 4,00 2,20 3,0 7 17,0 27,0 31 1 95,52 7,69 70 55 74 7,40 5,18 2,0 1 15,0 18,0 2 89,67 7,32 70 35 40 4,00 2,80 1,0 3 9,0 13,0 3 87,57 7,75 65 25 37 3,70 2,41 4,0 1,5 14,0 19,5 35 1 90,72 7,02 60 45 92 9,20 5,52 1,0 12 13,0 26,0 2 87,52 7,43 65 30 54 5,40 3,51 2,0 4 18,0 24,0 3 88,57 7,36 75 30 61 6,10 4,58 3,0 6,5 5,0 14,5 45 1 89,22 7,60 60 40 71 7,10 4,26 2,0 15 24,0 41,0 2 92,45 7,17 65 20 56 5,60 3,64 3,0 6 5,5 14,5 3 89,91 7,68 60 25 52 5,20 3,12 2,0 9,5 13,0 24,5 49 1 87,92 7,07 55 25 83 8,30 4,57 1,0 36 28,0 65,0 2 86,57 7,31 65 20 43 4,30 2,80 3,0 20,5 5,0 28,5 3 90,77 7,44 60 40 35 3,50 2,10 6,0 17,5 8,0 31,5 20
51 1 88,07 7,38 70 50 52 5,20 3,64 1,0 5 16,0 22,0 2 92,94 7,17 70 30 197 19,70 13,79 3,0 2,5 4,0 9,5 3 92,04 7,48 65 30 44 4,40 2,86 6,0 2 6,0 14,0 54 1 91,52 7,32 55 25 66 6,60 3,63 2,0 16 18,0 36,0 2 87,38 7,32 60 30 43 4,30 2,58 3,0 17,5 16,0 36,5 3 88,79 7,30 50 15 38 3,80 1,90 2,0 21,5 11,0 34,5 55 1 86,62 7,68 60 35 54 5,40 3,24 4,0 7 21,0 32,0 2 82,35 7,34 75 40 43 4,30 3,23 4,0 19 10,5 33,5 3 86,23 7,24 60 30 38 3,80 2,28 2,0 10 9,0 21,0 56 1 91,82 7,53 60 30 54 5,40 3,24 8,0 3 14,0 25,0 2 84,44 7,31 65 30 27 2,70 1,76 3,0 15,5 10,0 28,5 3 88,33 7,08 65 40 50 5,00 3,25 4,0 2,5 5,0 11,5 21