Δρ. ΔΗΜΗΤΡΗΣ ΣΟΦΙΑΝΟΣ. Η παρασκευή του εμβολίου της νέας γρίπης. Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ

Transcript

1 Δρ. ΔΗΜΗΤΡΗΣ ΣΟΦΙΑΝΟΣ Η παρασκευή του εμβολίου της νέας γρίπης Τμήμα Ποιοτικού Ελέγχου Εμβολίων Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ

2 ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΕΣ ΜΙΚΡΟΦΩΤΟΓΡΑΦΙΕΣ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΝΕΑΣ ΓΡΙΠΗΣ (ΓΡΙΠΗ ΤΩΝ ΧΟΙΡΩΝ)

3 ΙΟΣ ΤΗΣ ΝΕΑΣ ΓΡΙΠΗΣ (ΙΟΣ ΤΗΣ ΓΡΙΠΗΣ ΤΩΝ ΧΟΙΡΩΝ ΙΟΣ ΤΗΣ ΠΑΝΔΗΜΙΑΣ ΤΗΣ ΓΡΙΠΗΣ Α Η1Ν1) Το γονιδίωμα του ιού της νέας γρίπης συνίσταται από 8 νουκλεοκαψιδίκα τμήματα με αρνητικής πολικότητας RNA (negative sense RNA nucleocapsid segments). 3D Αναπαράσταση

4

5 ΠΡΟΕΛΕΥΣΗ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΝΕΑΣ ΓΡΙΠΗΣ Πρόκειται για ανακατανομή (reassortment) του γενετικού υλικού της ιού της γρίπης Α με γενετικό υλικό από τέσσερις προϋπάρχουσες μορφές του ιού: Γενετικό υλικό από γρίπη των χοίρων από Βόρεια Αμερική. Γενετικό υλικό από γρίπη των χοίρων από Ευρασία. Γενετικό υλικό από γρίπη των πτηνών. Γενετικό υλικό από την κοινή ανθρώπινη γρίπη.

6 Ανακατανομή (reassortment) Διαφορετικά στελέχη ιών προσβάλλουν τα ίδια κύτταρα και προκαλούν ανακατανομή (reassortment) των νουκλεοκαψιδικών τμημάτων

7 Γιατί χρειαζόμαστε νέα εμβόλια γρίπης Ο ιός ξεφεύγει από την ανοσολογική άμυνα χάρις στην αντιγονική ποικιλομορφία (antigenic variation) η οποία συνίσταται: Αντιγονική εκτροπή (antigenic shift) Αντιγονική απόκλιση (antigenic drift) λόγω συσώρευσης σημειακών μεταλλάξεων

8 ΠΟΥ ΣΤΟΧΕΥΕΙ ΤΟ ΕΜΒΟΛΙΟ ΓΙΑ ΤΗΝ ΝΕΑ ΓΡΙΠΗ ΣΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΠΡΟΣΤΑΤΕΥΤΙΚΗΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΚΥΡΙΩΣ ΕΝΑΝΤΙ ΤΗΣ ΑΙΜΟΣΥΓΚΟΛΗΤΙΝΗΣ (ΗΑ) ΚΥΡΙΩΣ ΜΕ ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΠΡΟΣΤAT ATΕΥΤΙΚΩΝ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ

9 ΣΗΜΕΙΑ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΣΤΗΝ ΗΑ Ο ιός εξουδετερώνεται κυρίως από αντισώματα που προσδένονται στην ΗΑ

10 ΕΙΔΗ ΕΜΒΟΛΙΩΝ ΕΝΑΝΤΙ ΤΗΣ ΝΕΑΣ ΓΡΙΠΗΣ ΕΜΒΟΛΙΑ ΜΕ ΑΔΡΑΝΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥΣ ΙΟΥΣ Ανάλογα με το μέρος του ιού που περιέχουν. Ανάλογα με τον τρόπο παρασκευής του εμβολιαστικού ιού. Ανάλογα με το εάν περιέχουν ή όχι ανοσοενισχυτικά. Ανάλογα με το εάν καλλιεργούνται σε εμβρυοφόρα αυγά ή κυτταροκαλλιέγειες.

11 ΑΝΑΛΟΓΑ ΜΕ ΤΟ ΜΕΡΟΣ ΤΟΥ ΙΟΥ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΑΙ Ολόκληρος ιός Τμήματα ιού Υπομονάδες του ιού

12 ΑΝΑΛΟΓΑ ΜΕ ΤΟΝ ΤΡΟΠΟ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗΣ ΤΟΥ ΕΜΒΟΛΙΑΣΤΙΚΟΥ ΙΟΥ Παρασκευή του εμβολιαστικού ιού με αναδιάταξη του γενετικού υλικού (reassortant). Παρασκευή του εμβολιαστικού ιού με αναστροφη γενετική (reverse genetics)

13 ΠΑΡΟΥΣΙΑ Η ΑΠΟΥΣΙΑ ΑΝΟΣΟΕΝΙΣΧΥΤΙΚΟΥ Απουσία ανοσοενισχυτικών Παρουσία ενός ή συνδιασμού περισσότερων ανοσοενισχυτικών

14 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΟΥ ΕΜΒΟΛΙΑΣΤΙΚΟΥ ΙΟΥ ΜΕ ΚΛΑΣΣΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟ Ο ιός παρέχεται από τον WHO Ο εμβολιαστικός ιός (seed virus) είναι ιός που έχει προέλθει απο ανακατανομή (reasortment) του γενετικού υλικού ιού της επιδημίας και του εργαστηριακού στέλεχος A/PR/8/34. Ειδικότερα από τον ιό της επιδημίας (wild type) λαμβάνονται τα ΗΑ και ΝΑ ενώ τα υπόλοιπα 6 από τον A/PR/8/34.

15 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΟΥ ΕΜΒΟΛΙΑΣΤΙΚΟΥ ΙΟΥ ΜΕ ΑΝΑΔΙΑΤΑΞΗ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ (REASSORTANT)

16 ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΟΥ ΕΜΒΟΛΙΑΣΤΙΚΟΥ ΙΟΥ ΜΕ ΑΝΑΣΤΡΟΦΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ (REVERSE GENETICS) Mε χρησιμοποίηση 8 πλασμιδίων που μεταφέρουν τους υποκινητές και τα γονίδια του ιού σε κύτταρα. Τα 2 πλασμίδια περιέχουν τα γονίδια για τα ΗΑ και ΝΑ από ιό της επιδημίας και τα υπόλοιπα 6 από αβλαβή εργαστηριακό ιό

17 Δημιουργία ιού με ανάστροφη γενετική Reverse genetics Aνακατανομή γενετικου υλικού με την βοήθεια πλασμιδίων Τα 2 πλασμίδια περιέχουν τα ΗΑ και ΝΑ από ιό της επιδημίας και Τα 6 υπόλοιπα από αβλαβή εργαστηριακό ιό

18 ΑΠΟΥΣΙΑ ΑΝΟΣΟΕΝΙΣΧΥΤΙΚΩΝ Έχουν μικρότερες παρενέργειες. Χρειάζεται μεγαλύτερη ποσότητα αντιγόνου πχ 15 μg αντί 7,5 μg. Χρειάζονται περισσότερες δόσεις.

19 ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΑΝΟΣΟΕΝΙΣΧΥΤΙΚΟΥ Έχουν περισσότερες παρενέργειες. Χρειάζεται μικρότερη ποσότητα αντιγόνου πχ 7,5 μg αντί 15 μg. Χρειάζονται λιγότερες δόσεις.

20 Διάφορα ανοσοενισχυτικά εμβολίων (vaccine adjuvants) Mineral salts, e.g., aluminium hydroxide and aluminium or calcium phosphate gels. Oil emulsions and surfactant based formulations, e.g., MF59 (microfluidised detergent stabilised oil-in-water emulsion), QS21 (purified saponin), AS02 [SBAS2] (oil-in-water emulsion + MPL + QS-21), Montanide ISA-51 and ISA-720 (stabilised water-in-oil emulsion). Particulate adjuvants, e.g., virosomes (unilamellar liposomal vehicles incorporating influenza haemagglutinin), AS04 ([SBAS4] Al salt with MPL), ISCOMS (structured complex of saponins and lipids), polylactide co-glycolide (PLG). Microbial derivatives (natural and synthetic), e.g., monophosphoryl lipid A (MPL), Detox (MPL + M. Phlei cell wallskeleton), AGP [RC-529] (synthetic acylated monosaccharide), DC_Chol (lipoidal immunostimulators able to self organise into liposomes), OM-174 (lipid A derivative), CpG motifs (synthetic oligonucleotides containing immunostimulatory Cp Gmotifs), modified LT and CT (genetically modified bacterial toxins to provide non-toxic adjuvant effects). Endogenous human immunomodulators, e.g., hgm-csf or hil-12 (cytokines that can be administered either as protein or plasmid encoded), Immudaptin (C3d tandem array) Inert vehicles, such as gold particles Other novel types of adjuvants not listed above may be under development and this guideline applies to these also.

21 ΣΕ ΕΜΒΡΥΟΦΟΡΑ ΑΥΓΑ Η κλασσική μέθοδος παραγωγής. Πολλές φορές χαμηλή παραγωγικότητα.

22 ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ Σε κυτταροκαλλιέργειες με: MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) Vero (African green monkey kidney) Πλεονεκτούν στο ότι υπάρχει μεγάλη αύξηση παραγωγής

23 Πως παρασκευάζονται τα αδρανοποιημένα εμβόλια Αναπτύσσονται σε εμβρυοφόρα αυγά κότας ή κυτταροκαλλιέργειες. Καθαρίζονται και συμπυκνώνονται Αδρανοποιούνται. Τα εμβόλια με τμήματα υφίστανται περαιτέρω επεξεργασία με απορρυπαντικά. Στους ιούς με υπομονάδες υπάρχουν μόνο ΗΑ και ΝΑ Προστίθεται ή όχι ανοσοενισχυτικό

24 ΕΜΒΟΛΙΑ ΜΕ ΖΩΝΤΑΝΟΥΣ ΙΟΥΣ Με ζωντανούς εξασθενημένους ιούς Cold- adapted live attenuated influenza virus (CAIV). Χρησιμοποιούνται: A/Ann Arbor/6/60 για την γρίπη Α (και το Β/Ann Arbor/1/6 /66 για την γρίπη Β). Αναπτύσσονται στους 25 ο C. Από την μύτη.

25 Ανάπτυξη ζωντανού εξασθενημένου ιού με γενετική αναδιάταξη

26 Διαδικασία εισόδου και πολλαπλασιασμού του ζωντανού εξασθενημένου ιού της γρίπης σε ένα κύτταρο

27 ΠΡΟΥΠΟΘΕΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΔΙΑΘΕΣΗ ΤΟΥ ΕΜΒΟΛΙΟΥ ΤΗΣ ΝΕΑΣ ΓΡΙΠΗΣ Στην Ευρώπη ο ΕΜΕΑ Θα επιτρέψει την διάθεση εκείνων των εμβολίων της νέας γρίπης που θα έχουν παραχθεί με τον ίδιο τρόπο που παράγονται τα εποχιακά θεωρώντας ότι είναι strain change 3D Αναπαράσταση του ιού της εποχιακής γρίπης

28 ΠΡΟΥΠΟΘΕΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΔΙΑΘΕΣΗ ΤΟΥ ΕΜΒΟΛΙΟΥ ΤΗΣ ΝΕΑΣ ΓΡΙΠΗΣ Παρόμοια με το εποχιακό Στην Ευρώπη ο ΕΜΕΑ Θα επιτρέψει την διάθεση εκείνων των εμβολίων της Νέας Γρίπης που θα έχουν παραχθεί με τον ίδιο τρόπο που παράγονται τα εποχιακά θεωρώντας ότι είναι strain change Στις ΗΠΑ το FDA δεν απαιτεί για την διάθεσή αυτών των εμβολίων κλινικές μελέτες 3D Αναπαράσταση του ιού της εποχιακής γρίπης

29 ΕΜΒΟΛΙΑΣΜΟΣ ΜΕ ΤΟ ΕΠΟΧΙΑΚΟ ΕΜΒΟΛΙΟ ΕΙΝΑΙ ΧΡΗΣΙΜΟΣ Το εποχιακό εμβόλιο δεν προστατεύει έναντι της νέας γρίπης όμως προστατεύει από τους ιούς της εποχιακής γρίπης. Υπάρχει κίνδυνος γίνει μετάλλαξη ή ανακατανομή στον ιό της νέας γρίπης αν κάποιο άτομο νοσήσει ταυτόχρονα με την εποχιακή γρίπη και την νέα γρίπη

30 ΠΡΟΥΠΟΘΕΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΔΙΑΘΕΣΗ ΤΟΥ ΕΜΒΟΛΙΟΥ ΤΗΣ ΝΕΑΣ ΓΡΙΠΗΣ Παρόμοια με του Η5Ν1 Στην Ευρώπη ο ΕΜΕΑ Θα επιτρέψεί σε όσους ανέπτυξαν εμβόλιο για τον Η5Ν1 και πήραν mock up registration να διαθέσουν τα εμβόλια τους. Στις ΗΠΑ το FDA δεν απαιτεί για την διάθεσή αυτών των εμβολίων κλινικές μελέτες 3D Αναπαράσταση του ιού της γρίπης Η5Ν1

31 ΕΤΑΙΡΕΙΕΣ ΠΟΥ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΖΟΥΝ ΤΟ ΝΕΟ ΕΜΒΟΛΙΟ ΤΗΣ ΝΕΑΣ ΓΡΙΠΗΣ O Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας επέτρεψε τον Ιούλιο του 2009, σε οκτώ φαρμακευτικές εταιρείες να παρασκευάσουν το νέο εμβόλιο. Αυτές ήταν οι: Sanofi-Pasteur Pasteur,, Baxter, Novartis, Nobilon, GlaxoSmithKline, Solvay, CSL και AstraZeneca. Δεν είναι όμως οι μόνες υπάρχουν τουλάχιστον 20 εταιρείες που πιστεύουν έχουν την δυνατότητα να παρασκευάσουν το νέο εμβόλιο.

32 ΕΙΔΗ ΕΜΒΟΛΙΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΝΕΑ ΓΡΙΠΗ ΠΟΥ ΕΧΟΥΝ ΠΡΟΤΑΘΕΙ ΑΠΟ ΤΟΥΣ ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΤΕΣ Συνολικός αριθμός εμβολίων Εμβόλια με ολόκληρο ιό (Whole) Εμβόλια με ιό σε κομμάτια (Split) Εμβόλια με υπομονάδες (subunit) Εμβόλια ζωντανά εξασθενημένα (LAIV) Εμβόλια με ανασυνδιασμένη πρωτεϊνη Είδη εμβολίων Εξ αυτών με ανοσο- ενισχυτικό

33 ΧΡΟΝΟΔΙΑΓΡΑΜΜΑ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΤΟΥ ΕΜΒΟΛΙΟΥ ΤΗΣ ΝΕΑΣ ΓΡΙΠΗΣ Bulk, FFP, QC, Batch release w1 w2 w3 w4 w5 w6 w7 w8 w9 w10 w11 w12 w13 w14 w15 w16 Egg inoculation Bulk manufacturing QC Reagents provided by WHO reference Formulation based on SRID testing using calibrated reagents Formulation Target defined from clinical results Formulation, Filling, Packaging QC Product available Internal released Product available If exernal release needed Reagents provided by WHO reference centers

34 ΔΟΣΟΛΟΓΙΑ Σύμφωνα με το CDC, θα απαιτηθούν δύο ενέσεις σε απόσταση τουλάχιστον 3 εβδομάδων και μία τρίτη ένεση για την εποχιακή γρίπη, για τη μέγιστη ανοσία. Τα παιδιά κάτω από 9 χρονών θα χρειαστούν τέσσερις ενέσεις. Μία ένεση δίνει λίγη προστασία γύρω στο 10%-20% το πολύ. Για το παρασκευασθέν με τις τεχνικές της εποχιακής γρίπης εμβόλιο η δόση θα περιέχει μg ΗΑ αν περιέχει ανοσοενισχυτικό και 15 μg ΗΑ χωρίς ανοσοενισχυτικό

35 ΕΜΒΟΛΙΑ ΜΕ ΝΕΕΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ Πιθανά να αντικαταστήσουν τα εποχιακά και τα επιμέρους εμβόλια έναντι της γρίπης

36 Εμβόλια με DNA Eδώ το γενετικό υλικό του ιού χρησιμοποιείται από κύτταρα που θα παράγουν τις ιικές πρωτεΐνες Αυτές ενεργοποιούν το ανοσολογικό σύστημα

37 Εμβόλια με αδρανοποίηση με αφαίρεση του γονιδίου ΝS1 To γονίδιο NS1 παράγει μια πρωτεΐνη που αναστέλλει την ιντερφερόνη ΙFNα. Η απουσία της επιτρέπει στο ανοσολογικό σύστημα την εξουδετέρωση του ιού.

38 Εμβόλια με ιούς με αδυναμία στον πολλαπλασιασμό Με αφαίρεση των γονιδίων Μ2 ή ΝS2 Μόνο ένας κύκλος αναπαραγωγής του ιού μπορεί να επιτευχθεί. Η αναπαραγωγή σταματά πριν τον σχηματισμό των μολυσματικών ιικών σωματιδίων

39

40 Εμβόλια με σταθερές πρωτεΐνες Μπορούν να χρησιμοποιηθούν πρωτεϊνες του ιού όπως η M2 και η ΝΡ που δεν αλλάζουν από χρόνο σε χρόνο. Σε εργαστηριακό επίπεδο έχει καλά αποτελέσματα.

41

42

43

44 ΕΜΒΟΛΙΑ ΜΕ ΖΩΝΤΑΝΟΥΣ ΙΟΥΣ

45 ΕΜΒΟΛΙΑ ΜΕ ΝΕΕΣ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΕΣ Σε κυτταροκαλλιέργειες με: MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) Vero (African green monkey kidney) Αύξηση παραγωγής

46 Με αντίστροφη γενετική (Reverse genetics) Mε χρησιμοποίηση πλασμιδίων που μεταφέρουν υποκινητές και γονίδια του ιού σε κύτταρα

47

48

49

50

51 Εμβόλια με ανοσοενισχυτικά έκδοχα Αlum το χρησιμοποιούμενο στα παραδοσιακά εμβόλια ΜF59 ένα εναιώρημα με λάδι-νερό Νeisseria meningitidis, πρωτεΐνες της εξωτερικής μεμβράνης

52

53 Πως παρασκευάζονται τα αδρανοποιημένα εμβόλια Αναπτύσσονται σε εμβρυοφόρα αυγά κότας. Καθαρίζονται και συμπυκνώνονται Αδρανοποιούνται. Τα εμβόλια με τμήματα υφίστανται περαιτέρω επεξεργασία με απορρυπαντικά. Στους ιούς με υπομονάδες υπάρχουν μόνο ΗΑ και ΝΑ

54 ΕΜΒΟΛΙΟ ΝΕΑΣ ΓΡΙΠΗΣ ΣΤΗΝ ΕΛΛΑΔΑ Για να χρησιμοποιηθεί κάποιο από τα εμβόλια της Νέας Γρίπης στην Ελλάδα πρέπει να έχει πάρει την έγκριση του ΕΜΕΑ (Εuropean Medicines evaluation Agency) Για τις ΗΠΑ αντίστοιχος φορές είναι το FDA (Food and Drug Administration) Για την Αυστραλία αντίστοιχος φορέας είναι το ΧΧΧ(TGA)

55 Ιός της γρίπης Α Yπάρχουν 16 ΗΑ υπότυποι Υπάρχουν 9 ΝΑ υπότυποι Οι υπότυποι Η1Ν1, 1, Η1Ν2 και Η3Ν2 είναι οι τύποι της γρίπης Α που κυκλοφορούν σήμερα στους ανθρώπινους πληθυσμούς

56 ΠΡΟΥΠΟΘΕΣΕΙΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΔΙΑΘΕΣΗ ΤΟΥ ΕΜΒΟΛΙΟΥ ΤΗΣ ΝΕΑΣ ΓΡΙΠΗΣ Στην Ευρώπη ο ΕΜΕΑ Θα επιτρέψει την διάθεση εκείνων των εμβολίων της Νέας Γρίπης που θα έχουν παραχθεί με τον ίδιο τρόπο που παράγονται τα εποχιακά θεωρώντας ότι είναι strain change Επίσης θα επιτρέψεί σε όσους ανέπτυξαν εμβόλιο για τον Η5Ν1 και πήραν mock up registration να διαθέσουν τα εμβόλια τους χωρίς κλινικές μελέτες Στις ΗΠΑ FDA δεν απαιτεί για την διάθεσή αυτών των εμβολίων κλινικές μελέτες

57 ΔΟΜΗ ΤΟΥ ΙΟΥ ΤΗΣ ΓΡΙΠΗΣ Το γονιδίωμα του ιού της γρίπης συνίσταται από 8 νουκλεοκαψιδίκα τμήματα με αρνητικής πολικότητας RNA (negative sense RNA nucleocapsid segments). Ο ιός ξεφεύγει από την ανοσολογική άμυνα χάρις στην αντιγονική ποικιλομορφία (antigenic variation) η οποία συνίσταται στη αντιγονική εκτροπή Αντιγονική απόκλιση Ευνοείται η γενετική ποικιλομορφία (genetic diversity) μέσω της μετάλλαξης (mutation) και της ανακατανομής (reassortment) των νουκλεοκαψιδικών τμημάτων όταν διαφορετικά στελέχη ιών προσβάλουν το ίδιο κύτταρο.

58

59 ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟYΜΕΝΑ ΜΕΝΑ ΣΤΕΛΕΧΗ ΓΡΙΠΗΣ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΕΜΒΟΛΙΟΥ Για την παρασκευή των εμβολίων γρίπης χρησιμοποιούνται ιοί οι οποίοι έχουν τεχνητά παρασκευαστεί από συνδιασμό εργαστηριακών στελεχών (laboratory adapted) με τα στελέχη της επιδημίας που προτείνει ο WHO Συνήθως χρησιμοποιείται το εργαστηριακό στέλεχος A/PR/8/34 που δίνει υψηλά επίπεδα ανάπτυξης σε αυγά. Ο τεχνητός ιός έχει 2 νουκλεοκαψιδικά τμήματα από τον ιό της επιδημίας αυτά που είναι για την ΗΑ και την ΝΑ και τα 6 υπόλοιπα από εργαστηριακό ιό.

60

61

62

63 EΜΒΟΛΙΟ ΕΠΟΧΙΑΚΗΣ ΓΡΙΠΗΣ Α Brisbane/59/2007(H1N1) like strain (A/Brisbane/59/2007(IVR-148)) 15μg g HA Α Brisbane/10/2007(H3N2) like strain (A/Uruguay/716/2007(NYMC X-175C)) X 15μg g HA B/Florida/4/2006 like strain(b/florida/2006) 15μg g HA

64

65

66