«Μελέτη πρωτεόµατος του zebrafish (Danio rerio) και φυλοειδικές διαφορές στο πρωτεοµικό προφίλ»

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΜΣ : «Βιολογική Τεχνολογία» «Μελέτη πρωτεόµατος του zebrafish (Danio rerio) και φυλοειδικές διαφορές στο πρωτεοµικό προφίλ» Θωµάς Καρίνος Βιολόγος Επιβλέπων: Αναπληρωτής Καθηγητής Κωνσταντίνος Φλυτζάνης ΠΑΤΡΑ 2006

2 Στην οικογένειά µου και σε όσους πίστεψαν στις δυνάµεις µου Η αληθινή Ευτυχία εµπεριέχει την χρήση όλων των δυνάµεων και ταλέντων µας. Gardner 2

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωµατική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Βιοτεχνολογίας, στο Κέντρο Βασικής Έρευνας του Ινστιτούτου ΙατροΒιολογικών Ερευνών της Ακαδηµίας Αθηνών (ΙΙΒΕΑΑ) στα πλαίσια του µεταπτυχιακού προγράµµατος : «Βιολογική Τεχνολογία» του Τµήµατος Βιολογίας του Πανεπιστηµίου Πατρών, για την απόκτηση Μεταπτυχιακού ιπλώµατος Ειδίκευσης. Χρηµατοδοτήθηκε από το 2 ο Επιχειρησιακό Πρόγραµµα Εκπαίδευσης και Αρχικής Επαγγελµατικής Αποκατάστασης (ΕΠΕΑΕΚ) : ΠΥΘΑΓΟΡΑΣ I. Για την ολοκλήρωσή της είχα τη χαρά να συνεργαστώ µε ικανότατα άτοµα προερχόµενα τόσο από το Τµήµα Βιολογίας στην Πάτρα, όσο και από το ΙΙΒΕΑΑ στην Αθήνα. Η συµβολή αυτών των ατόµων ήταν πολύτιµη στον σχεδιασµό των πειραµάτων αλλά και στην επεξεργασία των αποτελεσµάτων. Καταρχήν θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα της εργασίας, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τµήµατος Βιολογίας Κύριο Φλυτζάνη Κωνσταντίνο για την τιµή που µου έκανε αναθέτοντας µου το συγκεκριµένο θέµα, για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε εντάσσοντάς µε στο συγκεκριµένο ερευνητικό πρόγραµµα, για τις πολύτιµες πάντα συµβουλές και υποδείξεις (επιστηµονικές και µη) κατά τη διάρκεια του πειραµατικού µέρους, αλλά και της συγγραφής της συγκεκριµένης εργασίας, όπως επίσης και για την υποµονή µε την οποία δεχόταν τις επίµονες απορίες µου. Τον ευχαριστώ επίσης για την ευκαιρία που µου έδωσε στέλνοντάς µε να εργαστώ σε ένα άρτια οργανωµένο και εξοπλισµένο εργαστήριο στο ΙΙΒΕΑΑ, για το πειραµατικό µέρος αυτής της εργασίας. Ευχαριστώ επίσης τον Λέκτορα Κύριο Κουµουνδούρο Γεώργιο για την άψογη συνεργασία που είχαµε όταν προέκυπταν απορίες επί των πειραµατοζώων (στο πειραµατικό µέρος και στη συγγραφή), καθώς ήταν και η πρώτη φορά που ασχολιόµουν πειραµατικά µε το zebrafish. Οι γνώσεις του πάνω στο αντικείµενο και οι υποδείξεις του για το σχεδιασµό πειραµατικών στόχων αποδείχτηκαν πολύτιµες σε κάθε περίπτωση. Η ιδιαίτερα φιλική διάθεση που έδειξε από τη πρώτη στιγµή απέναντί µου ήταν ένας ακόµη καθοριστικός παράγοντας για την άψογη συνεργασία µας. Ιδιαίτερο ευχαριστώ και στον Αναπληρωτή Καθηγητή Κύριο Μίντζα Αναστάσιο για την προθυµία µε την οποία δέχτηκε να συµµετάσχει στην τριµελή εξεταστική επιτροπή µε τους ανωτέρω καθηγητές. Αποτέλεσε µέλος αντίστοιχης επιτροπής και για τη διπλωµατική µου εργασία σε προπτυχιακό επίπεδο και από τότε έχει δείξει εµπιστοσύνη στις δυνατότητές µου. Πολλά ευχαριστώ στη µεταπτυχιακή φοιτήτρια Γεώργα Γιάννα,, το µέλος του τεχνικού προσωπικού Γεωργακοπούλου Έφη, τον προπτυχιακό φοιτητή Μιχαήλ Χαρίλαο και την εκπαιδευόµενη σπουδάστρια Κουντούρα Μαρία από το εργαστήριο του Κυρίου Κουµουνδούρου, που είχαν τη γενική εποπτεία για την αναπαραγωγή και την εκτροφή των πειραµατόζωων στα ενυδρεία, για τη φιλική διάθεση που έδειξαν απέναντί µου, για τις εξηγήσεις και πληροφορίες όσον αφορά τον τρόπο µε τον οποίο εκτρέφονται τα zebrafish σε εργαστηριακές συνθήκες και για την βοήθεια που µου προσέφεραν λαµβάνοντας φωτογραφίες από τα διάφορα αναπτυξιακά στάδια που µελετούσα. εν θα πρέπει να παραλείψω και την προπτυχιακή φοιτήτρια Έλενα Μήτση, η οποία παράλληλα και µε τη βοήθειά µου εκπόνησε το ίδιο χρονικό διάστηµα τη διπλωµατική της εργασία στο εργαστήριο του Κυρίου Φλυτζάνη. Η αφοσίωσή της στο αντικείµενο βοήθησε και τους δυο µας να αποκοµίσουµε γνώσεις µέσω της συνεργασίας µας. Από το εργαστήριο Βιοτεχνολογίας στο ΙΙΒΕΑΑ θα ήθελα να ευχαριστήσω : Τον ρα. Φουντουλάκη Μιχάλη, πρώην διευθυντή του εργαστηρίου, για τις υποδείξεις του επί των τεχνικών που χρησιµοποίησα. Η πολυετής του εµπειρία αποδείχτηκε χρήσιµη σε πολλές περιπτώσεις. Τον ευχαριστώ επίσης για την ευκαιρία που µου έδωσε να συµµετάσχω ενεργά στο 1 ο ιεθνές Συνέδριο της Ελληνικής Εταιρίας Πρωτεοµικής. 1

4 Την ρα. Βλάχου Αντωνία, η οποία είχε και τη γενική επίβλεψη των πειραµάτων µου στο ΙΙΒΕΑΑ. Την ευχαριστώ για το χρόνο που αρχικά διέθεσε να µε διδάξει τις τεχνικές που χρησιµοποίησα, να λύσει τις όποιες απορίες µου, να προτείνει εναλλακτικές λύσεις όταν έφτανα σε αδιέξοδο, να ελέγχει τις δικές µου παρατηρήσεις επί των αποτελεσµάτων. Ήταν πάντα διαθέσιµη να λύσει απορίες µου και να µε στηρίξει ακόµη και σε στιγµές που ήταν απασχοληµένη µε άλλη εργασία. Την ρα. Κοσσίδα Σοφία, η οποία µε µύησε στα άγνωστα για εµένα µέχρι πρότινος µονοπάτια της Βιοπληροφορικής, µε βοήθησε να αξιοποιήσω στο έπακρο τα δεδοµένα µου από τα πειράµατα Πρωτεοµικής Ανάλυσης και φυσικά ήταν πρόθυµη κάθε στιγµή να λύσει οποιαδήποτε απορία µου, όσο απλή κι αν ήταν η απάντηση. Τον Κύριο Βουγά, Κώστα που «έτρεχε» τα δείγµατά µου στον φασµατογράφο µάζας και από τον οποίο λάµβανα τα τελικά αποτελέσµατα των πειραµάτων. Με βοήθησε ιδιαίτερα να κατανοήσω αρκετά καλά τη λειτουργία αυτού του τόσο πολύτιµου οργάνου. Τον µεταπτυχιακό φοιτητή Μακρυδάκη Μανούσο, τον προπτυχιακό φοιτητή Πρόκο Βαγγέλη, τους υποψήφιους διδάκτορες Αναγνωστόπουλο Θανάση και Ζερεφό Παναγιώτη, τους µεταδιδακτορικούς ερευνητές Καραµεσίνη Παναγιώτη, Ξηξή Έλενα και Mañadas Bruno, τα µέλη του τεχνικού προσωπικού ηµητράκη Πλουµιστή και Παπαδοπούλου Αγγελική, καθώς και τον ειδικό επιστήµονα Γαρµπή Σπύρο στο εργαστήριο στο ΙΙΒΕΑΑ που από την πρώτη στιγµή που βρέθηκα εκεί µε υποδέχτηκαν µε φιλική διάθεση, γεγονός που µε έκανε να περνώ πιο ευχάριστα τις ώρες µου κατά τη διάρκεια των πειραµάτων. Τους ευχαριστώ επίσης για τις πρακτικές συµβουλές που µου έδωσαν κατά τα διάρκεια των πειραµάτων και τις χρήσιµες υποδείξεις στο χειρισµό των µηχανηµάτων και των υπολογιστικών εφαρµογών που ήταν απαραίτητα για τη συλλογή και επεξεργασία των δεδοµένων. Ευχαριστώ επίσης το Ίδρυµα Κρατικών Υποτροφιών για τα µηνιαία τροφεία που µε στήριξαν οικονοµικώς κατά το δεύτερο χρόνο του Μεταπτυχιακού Προγράµµατος. Τέλος θέλω να ευχαριστήσω την οικογένειά µου, η οποία µου συµπαραστάθηκε οικονοµικά και ηθικά καθ όλη τη διάρκεια των σπουδών µου (προπτυχιακών και µεταπτυχιακών). H βοήθειά τους µου έδινε δύναµη να συνεχίσω σε δύσκολες και ευχάριστες στιγµές. Πάτρα,

5 Περιεχόµενα ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος 1 Περιεχόµενα 3 Εισαγωγή 5 1. Ταξινοµικά και µορφολογικά χαρακτηριστικά 5 του zebrafish (Danio rerio, Hamilton 1822) 2. Το zebrafish ως πειραµατόζωο 8 3. Φυλετικός καθορισµός και φυλετική διαφοροποίηση 14 στα ψάρια 3.1 Περίληψη οντογένεσης και καταβολές των αρσενικών και θηλυκών γενετικών κυττάρων Περίληψη οντογένεσης Οι καταβολές των αρσενικών και θηλυκών γενετικών κυττάρων Η ανάπτυξη και διαφοροποίηση των γονάδων Συστήµατα καθορισµού του φύλου Γενετικός φυλοκαθορισµός Η επίδραση εξωγενών στεροειδών στο φύλο Η επίδραση περιβαλλοντικών και άλλων παραγόντων (θερµοκρασία, περιβαλλοντικοί ρυπαντές, πληθυσµιακή πυκνότητα) Σκοπός εργασίας 43 Υλικά και µέθοδοι Εκτροφή ενήλικων και νυµφών zebrafish Νερό και ενυδρεία Τροφή και συνθήκες αναπαραγωγής Ζωοτοµή, συλλογή και αποθήκευση ιστών Ζωοτοµή Συλλογή εµβρύων Πρωτεοµική ανάλυση Εισαγωγή ιαχωρισµός πρωτεϊνικού µίγµατος µε Ηλεκτροφόρηση 2 3

6 Περιεχόµενα διαστάσεων (2D Gel Electrophoresis) Γενικά περί ηλεκτροφόρησης 2 διαστάσεων (Η2 ) Οµογενοποίηση ιστών, αποµόνωση ολικών πρωτεϊνών και ποσοτικός προσδιορισµός τους ιαχωρισµός πρωτεϊνών µε ισοηλεκτρική εστίαση (1 η διάσταση) Εξισορρόπηση των ΤΑΚ Η δεύτερη διάσταση (SDS - PAGE) Ανάλυση εικόνας 2 πηκτωµάτων Εξαγωγή πρωτεϊνικών κηλίδων από τα πηκτώµατα και ταυτοποίηση των διαχωρισµένων πρωτεϊνών µε Φασµοµετρία Μάζας Εξαγωγή των πρωτεϊνικών κηλίδων από τα 2 πηκτώµατα Ταυτοποίηση των πρωτεϊνικών κηλίδων µέσω πεπτιδικών χαρτών (peptide maps) και φασµοµετρία µάζας (ΦΜ) (Mass spectrometry) Βιοπληροφορική ανάλυση µέσω έρευνας στις on line βάσεις δεδοµένων 82 Πειραµατικό µέρος Κατασκευή πρωτεοµικών χαρτών για µυ και εγκέφαλο Κατηγοριοποίηση των δεδοµένων από τους πρωτεοµικούς χάρτες Βιοπληροφορική ανάλυση υποθετικών πρωτεϊνών ιαφορές στην έκφραση πρωτεϊνών ανάλογα µε το φύλο σε µυ και εγκέφαλο ιαφορές στην έκφραση πρωτεϊνών σε νύµφες µε διαφορετική θερµοκρασία ανάπτυξης 122 Συζήτηση Συµπεράσµατα 134 Βιβλιογραφία 142 4

7 Εισαγωγή ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. Ταξινοµικά και µορφολογικά χαρακτηριστικά του zebrafish (Danio rerio, Hamilton 1822) Το zebrafish (Danio rerio ή και Brachydanio rerio, Hamilton 1822) είναι ένα µικρό τροπικό ψάρι του γλυκού νερού ενδηµικό σε ποταµούς, χείµαρρους, κανάλια, τάφρους και λίµνες της Βόρειας Ινδίας, του Βορείου Πακιστάν, του Νεπάλ, του Μυανµάρ και του Μπουτάν (Γεωγραφικά µήκη 33 Ν - 8 Ν και πλάτη 66 Ε - 98 Ε). Σε αυτές τις περιοχές µπορεί εκάστοτε να βρεθεί και σε στάσιµα νερά, ιδίως σε ορυζώνες. Το µικρό του µέγεθος δεν το καθιστά ιδιαίτερης οικονοµικής σηµασίας για βρώση, όµως το βρίσκουµε και σε πολλές περιοχές του κόσµου ως αλλόχθονο είδος, καθώς διαβεί σε ένα µεγάλο εύρος περιβαλλοντικών συνθηκών (εύρος ph: 6,5-8, σκληρότητας περιβάλλοντος νερού: 5-19 dgh και θερµοκρασίας: C). Πρόσφατα βρέθηκε και σε ποτάµια της Κολοµβίας, καθώς δραπέτευσε ένας µεγάλος αριθµός ατόµων από εγκαταστάσεις εκτροφής τους (Πίνακας 1) Χώρα Τοπ. Ονοµασία Κατάσταση Bangladesh Anju Ενδηµικό Bhutan Colombia India Japan Anju, Lauputi, Patte-meenu, Pidtuli Ενδηµικό Αλλόχθονo Ενδηµικό Αλλόχθονο Martinique Poisson zèbre Αλλόχθονο Myanmar Ενδηµικό Nepal Zebra macha Ενδηµικό Pakistan Sri Lanka USA Zebrafish, Zebra Danio Αµφισβητήσιµο Αλλόχθονο Αλλόχθονο Πίνακας 1. Η γεωγραφική εξάπλωση του είδους. Ενδεικτικά αναφέρονται οι χώρες µε τους µεγαλύτερους πληθυσµούς. 5

8 Εισαγωγή Εικόνα 1. Το zebrafish είναι ενδηµικό της Ινδικής Χερσονήσου και απαντάται σε χείµαρρους του Νεπάλ, αλλά και σε µεγαλύτερους ποταµούς όπως ο Γάγγης και ο Βραχµαπούτρας. εν είναι τόσο απαιτητικό στην εκτροφή, ενώ µπορεί να ζήσει άνετα σε ενυδρεία που περιέχουν και άλλα είδη ψαριών. Το zebrafish ανήκει στην οικογένεια των κυπρινοειδών, την µεγαλύτερη οικογένεια των ψαριών, που αριθµεί περίπου 2000 είδη και στο είδος Danio, που αριθµεί 50 είδη. Ο τόπος που ενδηµεί (Νότια-Νοτιοανατολική Ασία και Ινδική χερσόνησος) (Εικ. 1) θεωρείται γενικά το κέντρο της εξέλιξης των κυπρινοειδών, λόγω του µεγάλου αριθµού ειδών και της ποικιλίας που εµφανίζουν. Τα περισσότερα κυπρινοειδή της Αφρικής ανήκουν σε γένη που συναντώνται και στην Ασία, από τα οποία µάλλον προήλθαν [36]. Η συστηµατική του κατάταξη είναι η παρακάτω: ΒΑΣΙΛΕΙΟ Ζώα ΦΥΛΟ Χορδωτά ΥΠΟΦΥΛΟ Σπονδυλωτά ΥΠΕΡΟΜΟΤΑΞΙΑ Γναθοστόµατα ΟΜΟΤΑΞΙΑ Ακτινοπτερύγιοι ΥΦΟΜΟΤΑΞΙΑ Τελεόστεοι ΤΑΞΗ Κυπρινόµορφοι ΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ Κυπρινοειδή ΓΕΝΟΣ Danio ΕΙ ΟΣ rerio Πίνακας 2. H συστηµατική κατάταξη του zebrafish (Danio rerio) Συνήθως, στο φυσικό τους περιβάλλον αρέσκονται να κολυµπούν κοντά στην επιφάνεια, αλλά και στο βένθος και τρέφονται µε µικρούς σκώληκες, καρκινοειδή, 6

9 Εισαγωγή Εικόνα 2. Χαρακτηριστικό αρσενικό άτοµο εκπρόσωπος του είδους Danio rerio. καθώς και µε νύµφες η αυγά εντόµων. Η τελευταία αυτή ιδιότητά τους τα έχει καταστήσει χρήσιµα είδη στην καταπολέµηση των κουνουπιών και κατ επέκταση της ελονοσίας, η οποία αποτελεί µόνιµο πρόβληµα στις χώρες όπου ενδηµεί. Αν και όχι τόσο εντυπωσιακό στην όψη, εντούτοις είναι όµορφο µε τον δικό του τρόπο, καθώς διαθέτει ένα τυπικό σώµα ψαριού µε χαρακτηριστικές παράλληλες προς τον διαµήκη άξονα σκούρες µπλε ζωνώσεις, οι οποίες διατρέχουν ολόκληρο το σώµα του, ακόµη και το εδρικό και το ουραίο πτερύγιο. Ανάµεσα από τις ζωνώσεις διακρίνουµε χρυσαφί ( ) ή ασηµένια ( ) απόχρωση, η οποία είναι πιο σκούρα στο ραχιαίο τµήµα και πιο ανοιχτή στο κοιλιακό και στα βράγχια (Εικ. 2). Χαρακτηριστική είναι και η απουσία πλευρικής γραµµής. Το στόµα του είναι στην τελική θέση της κεφαλής. Το όνοµα zebrafish προέρχεται από την εντύπωση που δίνει η αντίθεση των παράλληλων ζωνώσεων µε την χρυσαφί ή ασηµένια απόχρωση (µοιάζει µε τις µαύρες ρίγες στο λευκό τρίχωµα της ζέβρας). Στις ΗΠΑ το συναντάµε και µε τις κοινές ονοµασίες Leopard Danio και Zebra Danio. Τα ενήλικα µπορούν να φτάσουν έως τα 5 εκατοστά σε µήκος και 5 γραµµάρια βάρος, ενώ είναι αρκετά δραστήρια, καθώς ακόµη και σε ενυδρεία διακρίνονται για την συνεχή κινητικότητά τους. Τα αρσενικά είναι πιο λεπτά µε τορπιλοειδές σώµα, ενώ τα θηλυκά είναι πιο ογκώδη µε πιο στρογγυλό σώµα, ιδίως όταν φέρουν αυγά στο εσωτερικό της κοιλιάς τους (Εικ. 3). Εικόνα 3. Το ώριµο θηλυκό zebrafish είναι κατά κανόνα πιο ογκώδες λόγω της µεταφοράς αυγών στο εσωτερικό της κοιλιάς του. Η γονιµοποίηση είναι εξωτερική και λαµβάνει χώρα στο υδάτινο περιβάλλον. Τα zebrafish είναι ωοτόκα και τα θηλυκά µπορούν να γεννούν καθόλη τη διάρκεια του χρόνου έως και 400 αυγά κάθε φορά. Η ανάπτυξη του εµβρύου είναι ραγδαία και η εκκόλαψη µπορεί να συµβεί την 2 η ή 3 η ηµέρα µετά τη γονιµοποίηση. Στους 3 µε 4 µήνες (χρόνος γενιάς) τα 7

10 Εισαγωγή νεαρά ιχθύδια φτάνουν στην αναπαραγωγική τους ωριµότητα και τα ενήλικα έχουν όριο ζωής τα 5 µε 7 χρόνια. Σε άριστες περιβαλλοντικές συνθήκες µπορούν να διπλασιάσουν τον πληθυσµό τους µέσα σε 15 µήνες. 2. To zebrafish ως πειραµατόζωο Αρκετοί λόγοι συνηγορούν στην καταλληλότητα του zebrafish ως πειραµατόζωο, καθώς συγκεντρώνει αρκετά πλεονεκτήµατα σε σχέση µε άλλους οργανισµούς µοντέλα, που ανήκουν στα σπονδυλωτά. Το zebrafish και το αµφίβιο Xenopus αποτελούν τα απλούστερα σπονδυλωτά πειραµατόζωα αυτή τη στιγµή. Αποτελεί δηµοφιλές πειραµατόζωο για τους γενετιστές και τους αναπτυξιακούς βιολόγους. Ο µικρή διάρκεια γενιάς και η ικανότητα να δίνει σε τακτά χρονικά διαστήµατα πολλούς απογόνους δίνει το πλεονέκτηµα στους ερευνητές να έχουν ένα µεγάλο αριθµό δειγµάτων σε µικρό χρονικό διάστηµα [20]. O παρακάτω πίνακας συνοψίζει κάποια από τα χαρακτηριστικά του είδους: Βιολογικά χαρακτηριστικά Danio rerio Οικογένεια Κυπρινοειδή Χρόνος γενιάς (αυγό έως αναπαραγωγική 4 µήνες ωρίµανση) Αναπαραγωγικός κύκλος Συνεχής ιάρκεια αναπαραγωγικού κύκλου 2 5 µέρες Μήκος (Ηλικία) στην πρώτη γονιµότητα : 24.9mm, : 23,1mm (74-75 ηµέρες) Αριθµός αυγών ανά θηλυκό ανά φορά γέννησης Ποσοστό γονιµοποίησης 70-80% Ποσοστό εκκόλαψης 80-90% ιάρκεια εµβρυϊκού σταδίου 3-5 µέρες ιάρκεια sac-fry σταδίου 8-10 µέρες Χαρακτηρισµένη εµβρυϊκή ανάπτυξη Ναι Χαρακτηριστικά αυγών ιαφανή Αναλογία φύλου : 40:60, 50:50 Φυλετική διαφοροποίηση Οι νύµφες περνούν από το στάδιο του νεανικού ερµαφροδιτισµού Συµπεριφορά αναπαραγωγής Συγκεκριµένη συµπεριφορά αρσενικών και θηλυκών επάγει την απελευθέρωση σπέρµατος και αυγών µετά την πρώτη ώρα της ηµέρας της φωτοπεριόδου. Μπορεί να επηρεαστεί από φεροµόνες ευτερεύοντα φυλετικά χαρακτηριστικά εν διακρίνονται εύκολα στα νεαρά ψάρια. Τα αρσενικά ενήλικα είναι λεπτά κι έχουν µεγαλύτερα εδρικά πτερύγια, ενώ τα θηλυκά διακριτά γεννητικά pappila Εξωγενής χορήγηση τροφής Από την 3 η ηµέρα µετά τη γονιµοποίηση Απαιτήσεις χώρου Χαµηλές Συνιστώµενο διαιτολόγιο Εµπορικά διαθέσιµες νιφάδες για διακοσµητικά ψάρια, Artemia, νύµφες κόκκινου κουνουπιού Πίνακας 3. Γενικά χαρακτηριστικά του zebrafish. Ιδιότητες όπως ο µικρός χρόνος γενιάς, τα διάφανα αυγά, οι µικρές απαιτήσεις σε χώρο και ο συνεχής αναπαραγωγικός κύκλος είναι µερικές από αυτές που το καθιστούν άριστο πειραµατόζωο [34]. Ίσως το µεγαλύτερο πλεονέκτηµά του είναι η διαφάνεια των αυγών και των 8

11 Εισαγωγή εµβρύων (Εικ. 4). Τα zebrafish είναι εντελώς διάφανα µέχρι περίπου την 5 η ηµέρα µετά τη γονιµοποίηση, οπότε και αρχίσουν να εµφανίζονται τα πρώτα χρωµοφόρα κύτταρα, που αργότερα θα δώσουν τις µαύρες παράλληλες ζωνώσεις. Μπορούµε να παρατηρήσουµε ζωντανά κύτταρα, ακόµη και κυτταρικά οργανίδια χωρίς τη χρήση ειδικής βαφής και χωρίς µεγάλη προετοιµασία του πειραµατόζωου. Το γεγονός αυτό συνδυαζόµενο µε την ex utero ανάπτυξη επιτρέπει την επί τόπου παρακολούθηση της αναπτυξιακής τύχης µεµονωµένων ή οµάδων κυττάρων. Μέχρι τις 3 ηµέρες µετά τη γονιµοποίηση µπορούµε να εφαρµόσουµε whole mount in situ υβριδοποίηση, ενώ και σε µεταγενέστερα στάδια η γονιδιακή έκφραση φαίνεται σε πιο επιφανειακές δοµές, οι οποίες παραµένουν διαφανείς. Η κατανόηση της δυναµικής των κυττάρων σε αναπτυσσόµενα έµβρυα είναι σηµαντική για όλες τις αναπτυξιακές διαδικασίες κι ως εκ τούτου η παραπάνω προσέγγιση µας παρέχει σηµαντικά δεδοµένα, που δεν θα µπορούσαµε να έχουµε πρωτύτερα [21]. Το zebrafish ως αναπτυσσόµενο έµβρυο εµφανίζει πολλές οµοιότητες µε τα θηλαστικά, οπότε µπορούµε να µελετήσουµε κατά κάποιο τρόπο αντίστοιχα αναπτυξιακά φαινόµενα µε αυτά των ανώτερων θηλαστικών και κατ επέκταση του ανθρώπου (Εικ. 5). A. B. Β. Εικόνα 4. A) Γονιµοποιηµένο αυγό zebrafish λίγο µετά την έναρξη της πρώτης αυλάκωσης. Β) Αναπτυσσόµενα έµβρυα πριν το στάδιο της εκκόλαψης. Τα µεγάλα και διάφανα αυγά διευκολύνουν και τις µικροενέσεις για παραγωγή διαγονιδιακών ζώων. Η επισκόπηση µοτίβων έκφρασης της φθορίζουσας χρωστικής GFP, υπό τον έλεγχο ιστοειδικών, ακόµη και κυτταροειδικών υποκινητών, µας 9

12 Εισαγωγή επιτρέπει να παρακολουθούµε το γονιδιακό προϊόν και να ταυτοποιούµε ή να αποµονώνουµε συγκεκριµένους κυτταρικούς πληθυσµούς [27]. Εικόνα 5. Φυλογένεση σπονδυλωτών, στην οποία παρατηρούµε και τις θέσεις κάποιων πειραµατόζωων. Η εξελικτική γραµµή των τελεόστεων, στη οποία ανήκει και το zebrafish απέκλίνε από αυτή των υπόλοιπων ακτινοπτερύγιων πριν 200 εκ. χρόνια περίπου. Ο κοινός πρόγονος των τελεόστεων και των θηλαστικών έζησε πριν περίπου 470 εκατοµµύρια χρόνια, ενώ είχε ήδη γίνει ο διαχωρισµός χονδριχθύων οστεϊχθύων [35]. Υπάρχουν αρκετές µελέτες στις οποίες εξετάστηκε η χωροχρονική έκφραση γονίδιων αναφοράς (reporter genes), τα οποία τοποθετήθηκαν καθοδικά των ρυθµιστικών περιοχών µιας ευρεία ποικιλίας διαφορετικών γονιδίων του zebrafish. Η Πίνακας 4. Χαρακτηριστικά παραδείγµατα συνδυασµών υποκινητών/γονιδίων αναφοράς που έχουν χρησιµοποιηθεί επιτυχώς στο zebrafish. πλειονότητα αυτών των µελετών στόχευε στην εξέταση υποκινητών, που ήταν υπεύθυνοι για τη ρύθµιση της έκφρασης γονιδίων σηµαντικών για την εµβρυϊκή ανάπτυξη (Πίνακας 4). Συνήθως µελετούνται δοκιµές παροδικής έκφρασης (transient expression assays), όπου γίνεται ένεση στα έµβρυα λίγο µετά τη γονιµοποίηση και κατόπιν παρατηρούνται όταν 10

13 Εισαγωγή φτάσουν στο επιθυµητό αναπτυξιακό στάδιο. Τα πειράµατα αυτά µπορούν ολοκληρωθούν και µέσα σε µια µέρα, λόγω της ταχύτατης εµβρυϊκής ανάπτυξης του zebrafish. Εντούτοις έχουν δηµιουργηθεί και σταθερές σειρές διαγονιδιακών zebrafish (stable transgenic lines) στις οποίες εξωγενές DNA µεταφέρεται σε άτοµα και µε διασταύρωση αυτών στις επόµενες γενιές [31]. Ο πρωταρχικός σκοπός της δηµιουργίας διαγονιδιακών ζώων στον τοµέα της ιχθυολογίας ήταν η προσθήκη επιθυµητών φαινοτυπικών χαρακτηριστικών σε εµπορικώς σηµαντικά ψάρια. Σήµερα υπάρχουν εµπορικά διαθέσιµα διάφορα zebrafish, στα οποία έχουν εισαχθεί γονίδια που κωδικοποιούν φθορίζουσες πρωτεΐνες, έτσι ώστε να φθορίζουν υπό την επίδραση φωτός συγκεκριµένου µήκους κύµατος (Εικ. 6) Εικόνα 6. Φθορίζοντα zebrafish προοριζόµενα για εµπορικούς σκοπούς. πρώιµο έµβρυο [31]. να Το zebrafish χρησιµοποιείται πλέον εντατικά σε µελέτες που εξετάζουν ένα ευρύ πεδίο της εµβρυϊκής ανάπτυξης, περιλαµβάνοντας τον προσδιορισµό του εµβρυϊκού άξονα, την ανάλυση κυτταρικών σειρών, το σχηµατισµό του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήµατος, της ανάπτυξης του µυϊκού συστήµατος, καθώς και της διαφορικής γονιδιακής έκφρασης στο Μεγάλη απήχηση έχει και ως µοντέλο οργανισµός στη µελέτη επιπτώσεων τερατογόνων παραγόντων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης [33]. Έχουν ήδη χαρακτηριστεί µορφολογικές αλλαγές στα αναπτυσσόµενα έµβρυα zebrafish µετά από έκθεση σε γνωστά τερατογόνα όπως η υπερθερµία, η αιθανόλη και το ρετινοϊκό οξύ [31]. Πλέον, οι ερευνητές εστιάζουν στην επίδραση αυτών των παραγόντων στο επίπεδο της γονιδιακής έκφρασης. Ακόµη, δίνει τη δυνατότητα να εκπονηθούν πειράµατα µεταλλαξιγένεσης σε µεγάλη κλίµακα, ώστε να αποµονωθούν µεταλλαγές σε γονίδια που ελέγχουν συγκεκριµένες αναπτυξιακές διαδικασίες και να ελεγχθούν οι απόγονοι για διαφορετικούς τύπους µεταλλαγµάτων. Πολύ γνωστές σειρές µεταλλαγµάτων χρησιµοποιούνται για τη µελέτη ανάπτυξης και δυσλειτουργιών του οπτικού νεύρου [29], της αγγειογένεσης [28], της ανάπτυξης του µυοκαρδίου [30], κ.ά [21]. 11

14 Εισαγωγή O George Streisinger και οι συνεργάτες του αποτέλεσαν την πρώτη ερευνητική οµάδα που ανακάλυψε τις αρετές αυτού του µικρού ψαριού. Μάλιστα, ανέπτυξαν µεθόδους για παραγωγή οµόζυγων ατόµων χρησιµοποιώντας γενετικά απενεργοποιηµένο σπέρµα [23]. Πρωτοπόρησαν στις µελέτες µεταλλαξιγένεσης και απόδειξαν ότι συµπληρωµατικές µέθοδοι, στις οποίες ζευγαρώνουν ετερόζυγα µεταλλαγµένα ψάρια, µπορούν να χρησιµοποιηθούν για να συσχετίζουν µεταλλαγές µε συµπληρωµατικές γενετικές οµάδες. Η οµάδα του Streisinger αποτέλεσε τον πυρήνα της πρώτης ερευνητικής οµάδας για zebrafish στο πανεπιστήµιο του Oregon, το οποίο διαθέτει και δικτυακό τόπο αποκλειστικά για άντληση πληροφοριών, που αφορούν το εν λόγω ψάρι ( Μεγάλης κλίµακας γενετικά screens πρωτοεπιχειρήθηκαν από δυο οµάδες, µια στο Tuebingen, υπό την καθοδήγηση της Christiane Nusslein-Volhard [24] και µια δεύτερη στο Massachusetts General Hospital υπό την καθοδήγηση των Wolfgang Driever και Mark Fishman [25]. Οι παραπάνω µελέτες εστίασαν σε αναπτυξιακά γεγονότα του πρώιµου εµβρύου και οδήγησαν στην ταυτοποίηση περίπου 1800 µεταλλαγµάτων. Παρόµοιες µελέτες έχουν γίνει και σε µύες. Τα γενετικά screens µεταλλαξιγένεσης απαιτούν µεγάλους αριθµούς ζώων και ικανότατο προσωπικό στο να κρατά ακριβές αρχείο και να είναι υπεύθυνο για τα ζώα. Παρόµοιες απαιτήσεις για το zebrafish είναι σηµαντικά λιγότερες µε τις αντίστοιχες απαιτήσεις και το κόστος για µελέτες σε µύες [26]. Συγκεκριµένα το κόστος διατήρησης των ψαριών αυτών µπορεί να είναι έως και στο 1% του αντίστοιχου κόστους για µύες [38] Πρόσφατα, ως συµπλήρωµα στα πειράµατα κλασσικής γενετικής, εκπονήθηκαν πειράµατα αντίστροφης γενετικής (reverse genetics) µε στοχευόµενη καταστολή γονιδίων που εκφράζονται µόνο στα πρώιµα γεννητικά κύτταρα (primordial germ cells) για τη µελέτη της ανάπτυξης των συγκεκριµένων κυττάρων [22]. To zebrafish καθίσταται εύκολο στους πειραµατικούς χειρισµούς. Σήµερα είναι διαθέσιµα πειραµατικά πρωτόκολλα για τη δηµιουργία απλοειδών και οµόζυγων ψαριών, τεχνικές για πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες και για δηµιουργία διαγονιδιακών ζώων [16]. Ακόµα υπάρχουν µέθοδοι για έλεγχο χηµικών ουσιών (chemical screening) οι οποίες στοχεύουν µόρια από όλες τις κατηγορίες των βιοµορίων. Σήµερα, σε δυο µεγάλες µελέτες για τον έλεγχο χηµικών ουσιών (chemical screens) χρησιµοποιείται η ethyl nitrosourea (ENU) µε αποτέλεσµα να παραχθούν αρκετές χιλιάδες φαινοτυπικών µεταλλαγµάτων. Για τα µεταλλάγµατα από ENU, ο εντοπισµός των γενετικών σηµείων µεταλλαγής έχει επιτευχθεί µε την 12

15 Εισαγωγή εξέταση µεγάλων αριθµών απογόνων (κι εποµένως µειοτικών γεγονότων) προερχόµενων από ετερόζυγους για τη µεταλλαγή γονείς [37]. Μέχρι σήµερα δεν έχει επιτευχθεί η δηµιουργία στοχευόµενων knockout zebrafish. H εκτροφή zebrafish, όπως αναφέρθηκε και παραπάνω δεν απαιτεί µεγάλο προϋπολογισµό αν αφαιρέσει κανείς το αρχικό κόστος δηµιουργίας εγκατάστασης µε ενυδρεία. Κατά τα άλλα είναι ανθεκτικό σε ακραίες συνθήκες θερµοκρασίας και σκληρότητας νερού και το βασικότερο είναι αναπαραγωγικά έτοιµο όταν εφαρµόζουµε κατάλληλη φωτοπερίοδο. Το µικρό του µέγεθος είναι ένα άλλο πλεονέκτηµα, καθώς δεν απαιτείται µεγάλος χώρος για να στήσει κανείς έστω κι ένα µικρό ενυδρείο 10 λίτρων, το οποίο µπορεί να φιλοξενήσει έως και 30 ψάρια. Η ικανότητα αυτή, που δίνεται να διατηρείται µεγάλος αριθµός ζώων σε σχετικά µικρό χώρο, επιτρέπει να χρησιµοποιούνται πολυάριθµα δείγµατα για τοξικολογικές µελέτες και µάλιστα αυτός είναι ακόµη ένας τοµέας στον οποίο έχουν κατά κόρον χρησιµοποιηθεί τα zebrafish, από τα τέλη της δεκαετίας του 70 µέχρι και σήµερα. Ανάµεσα στα στοιχεία που έχουν µελετηθεί είναι ο ψευδάργυρος, το κάδµιο, το σελήνιο, ο χαλκός, το νικέλιο, ο σίδηρος, το κοβάλτιο, ο µόλυβδος, το χρώµιο και το αλουµίνιο. Όλα αυτά είναι βαρέα µέταλλα, τα οποία ως παραπροϊόντα βιοµηχανικής επεξεργασίας αποβάλλονται σε υδάτινα περιβάλλοντα και συσσωρεύονται σε ιστούς ιχθύων. Ακόµη έχει µελετηθεί και η επίδραση οργανικών ουσιών όπως η φαινόλη, η ανιλίνη, το κυκλοεξάνιο και τα παράγωγά τους [32]. Υπάρχουν αρκετές αναφορές στις οποίες παρατηρούµε την ευρεία χρήση του zebrafish ως πειραµατικού µοντέλου για τη µελέτη ποικίλλων δυσλειτουργιών του ανθρώπινου οργανισµού. Εκτός από αυτές που αναφέρθηκαν πιο πάνω (σελ.7) για τις οποίες υπάρχουν και τα αντίστοιχα µεταλλάγµατα, το µικρό αυτό τροπικό ψάρι χρησιµοποιείται για τη µελέτη διαταραχών αιµοποιητικού συστήµατος, νεφρικής ανεπάρκειας, σκελετικών διαταραχών, διαταραχών ακοής, κάποιων µορφών καρκίνου, νευροµυϊκών και νευροεκφυλιστικών ασθενειών [38]. Η χρήση του σε υψηλής ρυθµοαπόδοσης µελέτες για τις επιπτώσεις µικρών µορίων επιτρέπει την έρευνα της διαφορικής γονιδιακής έκφρασης στο πρώιµο έµβρυο και σε τοξικολογικές µελέτες. Σε µια από αυτές, έµβρυα που αναπτύσσονταν σε πηγαδάκια από 96 well plates εκτέθηκαν σε 1100 συνθετικά µόρια που µπορεί να επηρέαζαν την εµβρυϊκή ανάπτυξη [39]. Με αυτό τον τρόπο, γίνεται πλέον 13

16 Εισαγωγή αντιληπτό ότι το µικρό µέγεθός του αποτελεί ένα σηµαντικό πλεονέκτηµα όταν θα θελήσουµε να ελέγχουµε την επίδραση διαφόρων φαρµάκων στον οργανισµό. Ο πακτωλός της πληροφορίας από το πρόγραµµα αποκρυπτογράφησης του γονιδιώµατος ( του zebrafish µαζί µε µια εκτενή βάση δεδοµένων ESTs ( έχει οδηγήσει στην κατασκευή πολλών εµπορικά διαθέσιµων µικροσυστοιχιών για το γνωστό µέχρι σήµερα γονιδίωµα ή για τα µετάγραφα των γονιδίων που εµπλέκονται σε συγκεκριµένες µεταβολικές οδούς., όπως επίσης, καθώς και η βελτιστοποίηση των τεχνικών εκτροφής και χρησιµοποίησής του ως πειραµατόζωο, το έχουν καταστήσει ως έναν από τους πιο υποσχόµενους οργανισµούς - µοντέλα για διάφορες µελέτες (Εικ. 7), όπως έχει αναφερθεί και παραπάνω. Λαµβάνοντας υπόψη ότι πολλές βασικές βιολογικές διεργασίες παραµένουν αρκετά συντηρηµένες, η συλλογή δεδοµένων από πειράµατα υψηλής ρυθµοαπόδοσης αλλά και κλασσικής γενετικής και µοριακής βιολογίας θα επιτρέψει τη σύγκρισή τους µε αντίστοιχα αποτελέσµατα πειραµάτων που έχουν γίνει σε ανθρώπινα κύτταρα ή µύες, καθιστώντας δυνατή µια καλύτερη εκτίµηση για την σπουδαιότητα αυτού του σπονδυλωτού ως µοντέλο οργανισµός στη µελέτη ανθρώπινων βιολογικών διεργασιών [38]. Εικόνα 7. Μερικές από τις εφαρµογές του zebrafish ως πειραµατόζωου και οι τεχνικές που χρησιµοποιούνται [38]. 3. Φυλετικός καθορισµός και φυλετική διαφοροποίηση στα ψάρια Έχουν περάσει περίπου 35 χρόνια από την πρώτη ανασκόπηση για την φυλετική διαφοροποίηση στα ψάρια [40], στην οποία συνοψίζονταν πληροφορίες για τύπους 14

17 Εισαγωγή γονάδων, τον ερµαφροδιτισµό, καθώς και για τη γενετική επίδραση και την επίδραση των στεροειδών σε αυτή. Όλη αυτή η πληροφορία έθεσε ένα σηµαντικό υπόβαθρο, πάνω στο οποίο στηρίχθηκε όλα αυτά τα χρόνια µια σηµαντική έρευνα πάνω στον θέµα της φυλετικής διαφοροποίησης στα ψάρια. Σήµερα η έρευνα επικεντρώνεται πιο πολύ στον πρωτογενή καθορισµό του φύλου. Στο σηµείο αυτό ίσως θα έπρεπε να αποσαφηνίσουµε τους όρους φυλετικό καθορισµό και διαφοροποίηση. Ο πρώτος όρος (sex determination) χρησιµοποιείται για να περιγράψει τις γενετικές και περιβαλλοντικές επιρροές και τις µεταβλητές που επηρεάζουν τη φυλετική διαφοροποίηση. Ο δεύτερος όρος (sex differentiation) χρησιµοποιείται για την περιγραφή της διαδικασίας κατά την οποία οι παραπάνω επιρροές διαµορφώνουν τις ήδη αναπτυσσόµενες γονάδες [41]. Εξ ορισµού ο φυλοκαθορισµός υπόκειται περισσότερο στην επίδραση του γονιδιώµατος και προηγείται της φυλετικής διαφοροποίησης, η οποία υπόκειται στην επίδραση των γοναδικών ορµονών. Σήµερα είναι αρκετά πράγµατα γνωστά όσον αφορά τη διαδικασία της φυλετικής διαφοροποίησης στα ψάρια, όµως οι µηχανισµοί που εµπλέκονται στο φυλοκαθορισµό µόλις ξεκινούν να αποσαφηνίζονται. Στους ιχθυοπληθυσµούς συναντούµε µια ποικίλα γοναδικής διαφοροποίησης, που περιλαµβάνει από γονοχωριστικά είδη µε ιστό ωοθηκών ή όρχεων µέχρι ερµαφρόδιτα είδη, που δύνανται να ωριµάσουν αρχικά ως αρσενικά (πρώτανδρα) ή ως θηλυκά (πρωτόγυνα). Ο καθορισµός του φύλου στα ψάρια είναι µια διαδικασία που επηρεάζεται από εξωτερικούς παράγοντες (περιβαλλοντικοί, συµπεριφοράς, φυσιολογικοί) οι οποίοι µπορούν να καθορίσουν την τύχη σωµατικών και γοναδικών κυττάρων στην αρχέγονη γονάδα. Η µελέτη του φυλοκαθορισµού στα ψάρια είναι σηµαντική για διάφορους λόγους. Σήµερα είναι γνωστά πάνω από είδη, που ζουν σε ένα ευρύ φάσµα υδατικών περιβαλλόντων παγκοσµίως, προσφέροντας ένα πλούσιο υλικό για βασικές και εφαρµοσµένες µελέτες στον φυλοκαθορισµό των σπονδυλωτών. Οι µελέτες αυτές έχουν αποσαφηνίσει µερικώς την πλαστικότητα της διαδικασίας καθορισµού του φύλου, κάτι που εµείς οι άνθρωποι δεν µπορούµε να συνειδητοποιήσουµε εύκολα, λόγω της σταθερότητάς του στο είδος µας. Επιπλέον, τα ψάρια είναι υποκείµενα σε τεχνητές καλλιέργειες, προσφέροντας έτσι σηµαντικές ευκαιρίες για τη µελέτη θεωρητικών γνώσεων (εξελικτικών µηχανισµών και βιοχηµικών διαδικασιών) φυλοκαθορισµού. Εξάλλου, στις υδατοκαλλιέργειες η κατανόηση και ο έλεγχος της 15

18 Εισαγωγή αναπαραγωγής είναι βασικά για την αποτελεσµατική εκτροφή οργανισµών, λόγω του διαφορετικού ρυθµού ανάπτυξης µεταξύ των φύλων σε κάποια είδη και της ανάγκης για ταυτόχρονη και αξιόπιστη ωρίµανση του ιχθυοπληθυσµού. 3.1 Περίληψη οντογένεσης και καταβολές των αρσενικών και θηλυκών γεννητικών κυττάρων Περίληψη οντογένεσης Το ωάριο του zebrafish, όπως και όλων των τελεόστεων είναι τελολεκιθικό (Εικ. 4Α). Ο εµβρυϊκός άξονας προέρχεται από τον βλαστόδισκο και το υπόλοιπο τµήµα του ζυγωτού δίνει τον λεκιθικό σάκο, ο οποίος σε µεταγενέστερα αναπτυξιακά στάδια πέπτεται από το ίδιο το έµβρυο. Μετά τις πρώτες αυλακώσεις (Εικ. 8) (περίπου στα 64 κύτταρα και µετά 2 1/2 ώρες περίπου από τη γονιµοποίηση) το έµβρυο εισέρχεται στο στάδιο του βλαστιδίου, καθώς ο βλαστόδισκος σχηµατίζει µια σφαιρική δοµή, που επικάθεται στη λέκιθο. εν υπάρχει καθορισµένο βλαστόκοιλο, αλλά µικρά, ακανόνιστα εξωκυττάρια διαστήµατα ανάµεσα στα ενδότερα κύτταρα της παραπάνω δοµής. Τα βλαστοµερίδια που εφάπτονται στη λέκιθο απελευθερώνουν τους πυρήνες και το κυτταρόπλασµα τους σε αυτή, σχηµατίζοντας το λεκιθικό συγκυτιακό στρώµα (ΥSL). Στο ξεκίνηµα του σταδίου του ώριµου βλαστιδίου, τα κύτταρα του ζωικού πόλου (YSL και βλαστόδισκος) κινούνται και εξαπλώνονται πάνω από τον φυτικό πόλο, καλύπτοντας τη λέκιθο, διαδικασία που είναι γνωστή ως επιβολή. Εικόνα 8. Έµβρυα κατά τη διάρκεια της περιόδου των αυλακώσεων. Α) Στάδιο 2 κυττάρων (0,75h), Β) Στάδιο 4 κυττάρων (1h), C) Στάδιο 8 κυττάρων (1,25h), D) Στάδιο 16 κυττάρων (1,5h), E) Στάδιο 32 κυττάρων (1,75h), F) Στάδιο 64 κυττάρων (2h). 16

19 Εισαγωγή Η αρχή της γαστριδίωσης ξεκινά στο 50% της επιβολής (χρονικά περίπου 5 ώρες µετά τη γονιµοποίηση) (Εικ. 9). Τη στιγµή αυτή, αρχίζει ο σχηµατισµός επιβλάστης και υποβλάστης, ως αποτέλεσµα των πρώτων µορφογενετικών κινήσεων. Στο χρονικό διάστηµα ανάµεσα στις 5 1/2 και 6 ώρες σχηµατίζονται ο εµβρυικός δίσκος και η εµβρυονική ασπίδα, ενώ στις 9 ώρες και στο 90% περίπου της επιβολής αρχίζει να σχηµατίζεται ο εγκέφαλος. Η διαδικασία ολοκληρώνεται µε το εκβλάστηµα της ουράς στις 10 ώρες περίπου. 50% επιβολή (5.3 h) Εµβρυϊκός δίσκος (5.7 h) Εµβρυονική ασπίδα (6 h) 75% επιβολή (8 h) 90% επιβολή (9 h) 100% επιβολή (10 h) Εικόνα 9. Μορφογενετικές κινήσεις πολυδιείσδυσης και συγκλίνουσας επέκτασης σχηµατίζουν την υποβλάστη, την επιβλάστη και το νευρικό άξονα κατά τη διάρκεια της επιβολής. Μετά την επιβολή ακολουθεί ο σχηµατισµός των σωµιτών (στις 10 1/3 ώρες µετά τη γονιµοποίηση), του νευρικού σωλήνα και των καταβολών των οργάνων (Εικ. 10). Το έµβρυο επιµηκύνεται. Οι σωµίτες σχηµατίζονται στο µέσο του σώµατος και επεκτείνονται κατά τον προσθοπίσθιο άξονα. Σύντοµα, τα πρώτα κύτταρα διαφοροποιούνται µορφολογικά και το έµβρυο ξεκινά τις πρώτες σπασµωδικές κινήσεις (19 ώρες µετά τη γονιµοποίηση). Στις 22 ώρες µετά τη γονιµοποίηση η γαστριδίωση έχει ολοκληρωθεί µε µια πλευρική κάµψη του εµβρύου. Στο φυλοτυπικό στάδιο (Εικ. 11) που ακολουθεί έχουµε σχηµατισµό δέρµατος αµφιβληστροειδούς χιτώνα, ενώ η καρδιά αρχίζει να χτυπά. Στις 36 ώρες µετά τη γονιµοποίηση είναι πλήρως σχηµατισµένο το πρώτο αορτικό τόξο, ενώ το ουραίο προσαγωγό αγγείο είναι ορατό και εκτείνεται ως τα ¾ της ουράς. Εµφανής προς στο τέλος του σταδίου (42 ώρες µετά τη γονιµοποίηση) είναι και η πρωτογενής περιφερική πτερυγιοπτυχή, η οποία θα δώσει το ραχιαίο, το ουραίο και το εδρικό πτερύγιο. 17

20 Εισαγωγή 3-σωµίτες (11 h) 6-σωµίτες (12 h) 10-σωµίτες (14 h) 14-σωµίτες (16 h) 18-σωµίτες (18 h) 21-σωµίτες (19.5 h) 26-σωµίτες (22 h) Εικόνα 10. Σχηµατισµός σωµιτών, νευρικών τόξων και νευροµεριδίων. Πρωτογενής οργανογένεση, πρώτες κινήσεις και εµφάνιση ουράς. Prim-6 (25 h) Prim-16 (31 h) Prim-22 (35 h) High-pec (42 h) Εικόνα 11. Φυλοτυπικό στάδιο. Ο άξονας του σώµατος ισιώνει από την αρχική του καµπυλότητα γύρω από το λεκιθικό σάκο. Η κυκλοφορία, ο χρωµατισµός και τα πτερύγια αρχίζουν να αναπτύσσονται. Η περίοδος εκκόλαψης (Εικ. 12) καταλαµβάνει το διάστηµα από τις 48 έως τις 72 ώρες µετά τη γονιµοποίηση και χαρακτηρίζεται από έντονες κινήσεις του εµβρύου και την εµφάνιση χρωµοφόρων κυττάρων στο δέρµα. Ακόµη, σχηµατίζεται ο χόνδρος 18

21 Εισαγωγή του Meckel ( 60 ώρες ), οι βραγχιακές σχισµές και τα βραγχιακά τόξα. Εικόνα 12. Κατά τη διάρκεια της περιόδου της εκκόλαψης, η µορφογένεση των περισσοτέρων οργάνων είναι ολοκληρωµένη κι επιβραδύνεται σηµαντικά, µε µερικές εξαιρέσεις που περιλαµβάνουν το αρχέντερο και τα συσχετιζόµενα µε αυτό όργανα. Α-Β) Στάδιο Log-pec (48h), C-D) Στάδιο pec-fin (60h), E-F) Στάδιο 19 protruding mouth (72h) Στο λεκιθοφόρο νυµφικό στάδιο που ακολουθεί (Εικ. 13), οι πρώιµες νύµφες έχουν ήδη εκκολαφθεί από το αυγό και φτάνουν σε µήκος τα 3,5mm. Φέρουν ένα λεκιθικό σάκο µε αποθέµατα, τα οποία καταναλώνονται εωσότου τα άτοµα να είναι έτοιµα να περάσουν στην εξωγενή διατροφή περί το τέλος αυτού του σταδίου. Πλήρως σχηµατισµένος είναι πλέον και ο πεπτικός σωλήνας, ενώ η πρώιµη νύµφη αρχίζει πλέον να κολυµπά ενεργητικά. Εικόνα 13. Λεκιθοφόρος νύµφη 3 ηµερών Το επόµενο στάδιο είναι το νυµφικό, που χαρακτηρίζεται από εξωγενή θρέψη, αύξηση και ανάπτυξη. Περιλαµβάνει τη διαφοροποίηση του σχήµατος του σώµατος µέσω της αλλοµετρικής 19

22 Εισαγωγή αύξησης, την ηθολογική διαφοροποίηση, την εξέλιξη του χρωµατισµού, αλλά και την ανάπτυξη της νηκτικής κύστης, των βραγχίων, των πτερυγίων και των λεπιών. Εικόνα 14. Νύµφη 8 ηµερών Η ετερότροφη φάση χωρίζεται σε τρία διακριτά αναπτυξιακά στάδια: 1) Το νυµφικό από την έναρξη της διατροφής µέχρι την έναρξη της µεταµόρφωσης 2) Το στάδιο της µεταµόρφωσης 3) Το στάδιο των ιχθυδίων Οι καταβολές των αρσενικών και θηλυκών γεννητικών κυττάρων Η δοµή των γονάδων των ψαριών οµοιάζει σε αυτή των άλλων σπονδυλωτών µε δύο πληθυσµούς κυττάρων: σωµατικά κύτταρα που στηρίζουν και βοηθούν τη διαφοροποίηση των γεννητικών κυττάρων. Οι αναπτυξιακές καταβολές των δυο αυτών κυτταρικών πληθυσµών είναι διαφορετικές. Όπως σε πολλούς άλλους οργανισµούς, έτσι και στα ψάρια, έχει παρατηρηθεί µια ειδική κοκκώδης περιοχή στο φυτικό πόλο του ωαρίου. Τα κύτταρα που αναπτύσσονται γύρω από αυτή την περιοχή παραµένουν αδιαφοροποίητα και δεν ακολουθούν τη γενική αναπτυξιακή πορεία. Αργότερα διαφοροποιούνται σε αρχέγονα γεννητικά κύτταρα (Primordial Germ Cells ή PGCs), τα οποία θα δώσουν τους γαµέτες µέσα στην αναπτυσσόµενη γονάδα. mrnas µεταγραφόµενα από γονίδια του ωαρίου φαίνεται να αποτίθενται στην περιοχή του φυτικού πόλου όπου µελλοντικά θα σχηµατιστούν τα αρχέγονα γεννητικά κύτταρα. Εικόνα 15. Το mrna του vasa γονιδίου ως µοριακός δείκτης των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων. Στο στάδιο των 4 κυττάρων το γεννητικό πλάσµα (και το mrna vasa) εντοπίζεται ακριβώς στα όρια των επιπέδων αυλάκωσης (µπλε ζώνες). Επίσης ανιχνεύεται και αλλού (µπλε κουκίδες), αλλά προοδευτικά αποικοδοµείται. Τα κύτταρα που περιέχουν το γεννητικό πλάσµα διαιρούνται ασύµµετρα σε σχέση µε όλα τα υπόλοιπα, έτσι ώστε ο αριθµός τους να παραµένει σχετικά σταθερός. Οι θέσεις των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων παραµένουν σταθερές καθώς αυτά συγκεντρώνονται σε 4 συσσωµατώµατα εµφανή από το στάδιο των 1000 κυττάρων ή και της σφαίρας [42]. 20

23 Εισαγωγή Στους τελεόστεους τα PGCs γίνονται ορατά περί το τέλος της σωµιτογένεσης και αναγνωρίζονται από το µεγάλο µέγεθός τους και τις τυπικές ηλεκτρονιακά πυκνές υποκυτταρικές δοµές (nuages). Αυτά τα κυτταροπλασµατικά οργανίδια συγκροτούν το γεννητικό πλάσµα (germ plasm). Περιέχουν συγκεκριµένα RNAs και πρωτεΐνες και παίζουν σηµαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση της γεννητικής σειράς. Στο zebrafish ένα από αυτά τα RNAs, αυτό του γονιδίου vas (κωδικοποιεί µια DNA-ελικάση και παρέχεται από το ωάριο) συγκεντρώνεται στα ακραία σηµεία του επιπέδου της πρώτης αυλάκωσης. Παρόµοια συγκέντρωση παρατηρείται και στο δεύτερο επίπεδο αυλάκωσης, έτσι ώστε να σχηµατίζονται 4 διακριτές ζώνες (µετά από whole mount in situ υβριδοποίηση). Η παρουσία του mrna του vasa σηµατοδοτεί τη δηµιουργία γεννητικού πλάσµατος και κατ επέκταση αρχέγονων γεννητικών κυττάρων (Εικ. 15, 16) A. B. Εικόνα 16. A) Μακροσκοπική εικόνα στην οποία µπορούµε να δούµε την ακριβή θέση των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων στο νυµφικό στάδιο του zebrafish (4 ηµέρες µετά τη γονιµοποίηση) έµπροσθεν της νηκτικής κύστης (SB). B. Τρία αρχέγονα γεννητικά κύτταρα στο ύψος του όγδοου σωµίτη κοιλιακά του προνεφρικού αγωγού σε έµβρυο 2 ηµερών [68]. O συνολικός αριθµός των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων στο τέλος της πρώτης ηµέρας της αυλάκωσης φτάνει τα 25 µε 30. Όπως παρατηρούµε και στην εικόνα τα κύτταρα αυτά ξεκινούν να µεταναστεύουν από τέσσερις διαφορετικές κατευθύνσεις σε αντίθεση µε τη Drosophila, το Xenopus και τον µυ από όπου ξεκινούν από ένα καθορισµένο σηµείο. Αφού σχηµατιστούν, παραµένουν σε στενή σύνδεση µε ενδοδερµικούς ιστούς και µεταναστεύουν µέσω του ραχιαίου εντέρου στην περιοχή όπου θα σχηµατιστούν οι γονάδες. Όταν φτάσουν στην περιοχή όπου θα σχηµατιστούν οι αδιαφοροποίητες γονάδες (genital ridge), εγκαθίστανται και παραµένουν αδιαφοροποίητα µέχρι τη στιγµή που θα ωριµάσουν οι γονάδες και µε τη επίδραση κυρίως ορµονικών ερεθισµάτων µετατραπούν σε ωογόνια ή σπερµατογόνια. H αποσιώπηση µε αντινοηµατικά morpholinos του γονιδίου dnd, το προϊόν του οποίου είναι απαραίτητο για τη µετανάστευση των PGCs, έδειξε ότι τα 21

24 Εισαγωγή αναπτυσσόµενα έµβρυα zebrafish είχαν όλα αρσενικό φαινότυπο. Τα άτοµα αυτά επέδειξαν φυσιολογική συµπεριφορά ζευγαρώµατος, καθώς έγινα δεκτά από αγρίου τύπου θηλυκά, όµως ήταν στείρα, καθώς απουσίαζαν γοναδικές δοµές. Τα PGCs λοιπόν, δεν ήταν απαραίτητα για το σχηµατισµό της γονάδας, αλλά περισσότερο για τη διαφοροποίηση και την επιβίωση αυτού του οργάνου [93]. 3.2 Η ανάπτυξη και διαφοροποίηση των γονάδων Γενικά, η διαφοροποίηση των γονάδων µπορεί να λάβει διάφορες µορφές στους τελεόστεους από τις περιπτώσεις όπου τα άτοµα αναπτύσσονται απευθείας σε αρσενικά ή θηλυκά, διαθέτοντας στη φυλετική ωρίµανση µόνο όρχεις ή ωοθήκες αντίστοιχα, µέχρι εκείνες τις περιπτώσεις όπου ερµαφρόδιτα είδη διαθέτουν λειτουργικές αρσενικές και θηλυκές γονάδες ταυτόχρονα. Φυσικά, ανάµεσα σε αυτές τις ακραίες περιπτώσεις, στους ιχθυοπληθυσµούς υπάρχουν πολλές στρατηγικές που περιλαµβάνουν αναστροφή φύλου ή εύνοια ενός από τα δυο φύλα, αφού σε πολλά είδη οι όρχεις και οι ωοθήκες ξεκινούν να διαφοροποιούνται από ερµαφρόδιτες γονάδες. Οι γονάδες έχουν µεσοδερµική προέλευση κι αναπτύσσονται σε συνάφεια µε το απεκκριτικό σύστηµα. Όπως και στα ανώτερα σπονδυλωτά, έτσι και στα ψάρια το ουροποιητικό και το γεννητικό σύστηµα έχουν κοινή εµβρυϊκή προέλευση. Τα κύτταρα που θα δώσουν τις γονάδες προέρχονται από τη σωµατική σειρά και έχουν διαφορετικές καταβολές από τα PGCs. To εξωτερικό τµήµα των αναπτυσσόµενων γονάδων προέρχεται από το επιθήλιο της γεννητικής γραµµής (genital ridge), όµως κάποια σωµατικά κύτταρα πιθανότατα να προέρχονται και από την εισβολή µεσεγχυµατικού ιστού (όπως και µε το σχηµατισµό των φυλετικών χορδών στα θηλαστικά). Μετά την µετανάστευση των PGCs στη γεννητική γραµµή, ξεκινούν, όπως προαναφέρθηκε, οι κυτταρικές διαιρέσεις για το σχηµατισµό ωογονίων και σπερµατογονίων, ενώ παράλληλα ξεκινά η διαφοροποίηση και η µετανάστευση και των σωµατικών κυττάρων. Σε πολλά είδη ψαριών, παρατηρείται πρώτα η ανάπτυξη ωοθηκών στα θηλυκά µε τον πολλαπλασιασµό σωµατικών κυττάρων και πρώιµη ανάπτυξη ωογονίων και συνεπακόλουθα ωοκυττάρων. Όλοι αυτοί οι κυτταρικοί πληθυσµοί περικλείονται από ένα σχηµατισµό που ονοµάζεται κοιλότητα ωοθήκης (ovarian cavity). H ανάπτυξη των όρχεων συµβαίνει συνήθως αργότερα. Στα σαλµονοειδή η πρώτη ένδειξη ότι η 22

25 Εισαγωγή αδιαφοροποίητη γονάδα ξεκινά να διαφοροποιείται παρατηρείται στα θηλυκά 3 εβδοµάδες µετά την εκκόλαψη, µε τα ωοκύτταρα να έχουν ξεκινήσει τη µείωση και να φτάνουν στην πρόφαση Ι [41]. Στους γονοχωριστικούς τελεόστεους τα άτοµα αναπτύσσονται µόνο ως αρσενικά ή θηλυκά και διατηρούν το φύλο τους καθ όλη τη διάρκεια της ζωής τους. Πρέπει όµως να τονιστεί ότι η τελική φυλετική κατάσταση στην ωριµότητα µπορεί να διαφέρει από την αρχική οδό διαφοροποίησης των γονάδων. Για παράδειγµα, τα γονοχωριστικά είδη δύνανται να αναπτυχθούν απευθείας σε αρσενικά ή θηλυκά ή να αναπτύξουν ερµαφρόδιτες γονάδες που τελικά διαφοροποιούνται σε όρχεις ή ωοθήκες ή ακόµη να έχουν στα πρώτα νυµφικά στάδια αδιαφοροποίητες θηλυκές γονάδες, οι οποίες στη συνέχεια να δίνουν ώριµες ωοθήκες ή να αποπίπτουν και να δίνουν ώριµους όρχεις (όπως για παράδειγµα στο zebrafish). Μπορούµε να διακρίνουµε δύο περιπτώσεις όσον αφορά τον φυλοκαθορισµό των γονοχωριστικών ψαριών. Στα διαφοροποιηµένα ή πρωτογενή γονοχωριστικά η πρώιµη ανάπτυξη της γονάδας εξελίσσεται από την αδιαφοροποίητη κατάσταση απευθείας σε ωοθήκες ή όρχεις (π. χ. C. carpio, Dicentrarchus labrax, κ. ά). Εναλλακτικά µπορούµε να συναντήσουµε είδη όπου όλα τα άτοµα αναπτύσσουν αρχικά ωοθήκες, αλλά σε µεταγενέστερα στάδια ανάπτυξης οι θηλυκές γονάδες εκφυλίζονται και στον ιστό εισβάλλουν επιπλέον σωµατικά κύτταρα. Η αρρενοποίηση προχωρά έτσι ώστε µετά την αρχικά διαφυλετική γονάδα (intersexual gonad), αυτή να διαφοροποιείται τελικά σε φυσιολογικό όρχι [43]. Στα θηλαστικά είναι γνωστό ότι το φύλο ενός ατόµου καθορίζεται από το είδος των φυλετικών χρωµοσωµάτων του (ΧΧ, ΧΥ ). Τα αρσενικά γονίδια που καθορίζουν την ανάπτυξη του όρχεως στο Υ χρωµόσωµα οδηγούν στην παραγωγή χυµικών παραγόντων που επάγουν τη διαφοροποίηση των αρσενικών γονάδων. Απουσία αυτών των παραγόντων οδηγεί σε ανάπτυξη ωοθηκών. Τα θηλυκά έµβρυα αναπτύσσουν θηλυκούς ουρογεννητικού αγωγούς, οπότε το άτοµο αναπτύσσεται ως θηλυκό εκτός κι αν οι όρχεις παρέµβουν αλλάζοντας την κατεύθυνση του φυλοκαθορισµού προς δηµιουργία αρσενικού ατόµου. Η υπόφυση στα θηλαστικά αναπτύσσει το θηλυκό πρότυπο έκκρισης γοναδοτροπινών, εκτός κι αν είναι παρόντα τα ανδρογόνα, οπότε ακολουθείται το αρσενικό πρότυπο ανάπτυξης των γονάδων. Συνεπώς στα θηλαστικά η γοναδική ανάπτυξη φαίνεται να είναι προκαθορισµένη προς την κατεύθυνση των θηλυκών και τα ανδρογόνα είναι αυτά που επάγουν τη διαφοροποίηση προς αρσενικά. Υπάρχουν αποδείξεις ότι κάτι παρόµοιο ισχύει και 23

26 Εισαγωγή στα ψάρια, παρά το γεγονός ότι η γοναδική ανάπτυξη επηρεάζεται κι από εξωγενείς παράγοντες. Η περίοδος κατά την οποία τα αδιαφοροποίητα γονοχωριστικά είδη των τελεόστεων ιχθύων περνούν ένα στάδιο ερµαφροδιτισµού, ασχέτως από το φύλο που ορίζει ο γονότυπός τους, πριν την τελική διαφοροποίηση ονοµάζεται ερµαφροδιτισµός ιχθυδίου (juvenile hermaphroditism)[43] (Εικ. 17) και συναντάται στο zebrafish. Τελευταία αποδείχτηκε ότι στο zebrafish η περίοδος αυτή διαρκεί περίπου 12 ηµέρες (22 η -34 η ηµέρα µετά τη γονιµοποίηση σε θερµοκρασία ανάπτυξης 28,5ºC) (Εικ.18) και ότι η µετάπτωση από ιστούς που οµοιάζουν ωοθηκικοί σε όρχεις επιτελείται µέσω απόπτωσης (Εικ. 19) [44]. Εικόνα 17. Ιχθίδιο zebrafish λίγο πριν εισέλθει στην περίοδο του νεανικού ερµαφροδιτισµού Εικόνα 18. Η γοναδική ανάπτυξη στο zebrafish. Από τις 9 έως τις 30 µέρες µετά τη γονιµοποίηση έχουµε τον πολλαπλασιασµό των αρχέγονων γεννητικών κυττάρων. Από τις 14 έως τις 60 τη φυλετική διαφοροποίηση θηλυκών ατόµων και από τις 30 έως τις 60 αντίστοιχα των αρσενικών. Στην εικόνα φαίνεται και η περίοδος του ερµαφροδιτισµού ιχθιδίου (22 η έως 34 η ηµέρα µετά τη γονιµοποίηση) [44]. Υπάρχουν όµως και περιπτώσεις ψαριών που εµφανίζουν ερµαφροδιτισµό, δηλαδή ωριµάζουν ως αρσενικά και θηλυκά ταυτόχρονα ή σε διαφορετικές περιόδους της ζωής τους. Έτσι συναντάµε σύγχρονα ερµαφρόδιτα, που παράγουν αρσενικού και θηλυκούς γαµέτες ταυτοχρόνως. Κάποια από αυτά τα είδη δύνανται να εναλλάσσουν την απόθεση σπέρµατος µε ωάρια και το αντίστροφο (π.χ. Serranus sp.) ενώ άλλα είναι ικανά ακόµα και για αυτογονιµοποίηση (π.χ. Rivulus mamroratus). Στα διαδοχικά ερµαφρόδιτα τα άτοµα ενός είδους παράγουν πρώτα γαµέτες ενός τύπου 24

27 Εισαγωγή και κατόπιν του άλλου κατά τη διάρκεια ενός κύκλου αναπαραγωγής. Έτσι έχουµε πρώτανδρα είδη (π.χ. Sparus aurata) τα οποία ωριµάζουν πρώτα ως αρσενικά ή πρωτόγυνα όταν ωριµάζουν πρώτα ως θηλυκά. (π.χ. Thalassoma dupperrey). Τέλος υπάρχουν και οι περιπτώσεις ανώµαλων ερµαφρόδιτων στα οποία ιστολογικά παρατηρούνται γονάδες µε εµφανή σπερµατογόνια, αλλά και ωογόνια (Micropogonias furneri). H στρατηγική του ερµαφροδιτισµού ακολουθείται πιθανώς για να παρέχει σε άτοµα ενός Εικόνα 19. Μοντέλο για την απόπτωση των γοναδικών κυττάρων στο zebrafish. Σηµειώνονται τυπικοί κυτταρικοί πληθυσµοί που αποπίπτουν κατά τη διάρκεια της φυλετικής διαφοροποίησης. Το εύρος κάθε διαµαντιού υποδεικνύει τον αριθµό των αποπίπτοντων κυττάρων [44]. ιχθυοπληθυσµού το µέγιστο αναπαραγωγικό δυναµικό [41]. 3.3 Συστήµατα καθορισµού του φύλου Γενικά, οι γονάδες των ψαριών είναι ασταθείς όσον αφορά στον φυλετικό καθορισµό, από τη στιγµή όµως που θα επιλεχθεί ένα συγκεκριµένο αναπτυξιακό προφίλ, σε συνδυασµό µε ενδογενείς γενετικούς και εξωγενείς περιβαλλοντικούς παράγοντες, η κατάσταση της γοναδικής διαφοροποίησης µπορεί να ακολουθήσει συγκεκριµένο πρότυπο στην επακόλουθη ανάπτυξη. Εξαιρέσεις αποτελούν βέβαια οι περιπτώσεις όπου ερµαφρόδιτα είδη αλλάζουν την πορεία της φυλετικής διαφοροποίησης έτσι ώστε να έχουν ευέλικτη παραγωγή διαφορετικών τύπων γαµετών. Στα γονοχωριστικά είδη τα γεγονότα φυλοκαθορισµού συµβαίνουν στα αρχικά αναπτυξιακά στάδια και η επακόλουθη διατήρηση µιας διαφοροποιηµένης κατάστασης επιτυγχάνεται µε τη σταθερότητα έκφρασης γενετικών προφίλ και µηχανισµών ανάδρασης, έτσι ώστε να εξασφαλιστεί ένα συνεπές πρότυπο που συνδυάζει κυτταρικά και ορµονικά σήµατα. 25

28 Εισαγωγή Στα θηλαστικά, όταν καθοριστεί το φύλο, η γοναδική διαφοροποίηση εξελίσσεται πάνω σε ένα συγκεκριµένο αναπτυξιακό µονοπάτι, έτσι ώστε το τέλος να έχουµε πλήρως διαφοροποιηµένους όρχεις ή ωοθήκες ανάλογα µε αυτό που επιτάσσουν τα φυλετικά χρωµοσώµατα. Στα ψάρια φυσικά υπάρχουν πολλές εξαιρέσεις. Η ανάπτυξη της γονάδας µπορεί να επηρεαστεί από διακυµάνσεις ενδογενών παραγόντων όπως είδαµε και παραπάνω, όπως και εξωτερικών (Θερµοκρασία, ορµονική επαγωγή, µόλυνση). Οι εξωτερικοί παράγοντες επιδρούν άµεσα στην ανάπτυξη του εµβρύου, της νύµφης και του νεαρού ιχθυδίου καθώς δεν πρέπει να ξεχνάµε ότι αυτή η ανάπτυξη επιτελείται έξω από το σώµα της µητέρας για τα περισσότερα ψάρια. Στα γονοχωριστικά είδη πολλές επιρροές περιβάλλοντος έχουν άµεση επίδραση στο φύλο. Για παράδειγµα, στην ιριδίζουσα πέστροφα, η χρήση τεστοστερόνης ή οιστρογόνων, µετά την έναρξη του φυλοκαθορισµού, µπορεί να σταµατήσει τη γαµετογένεση, σταµατώντας αντίστοιχα την ωογένεση στα θηλυκά και τον σχηµατισµό όρχεων στα αρσενικά [45]. Στο ίδιο είδος διαιτητική χορήγηση 17α-µεθυλτεστοστερόνης σε θηλυκά άτοµα µετά το πέρας του χρόνου φυλοκαθορισµού, µπορεί να επάγει την ανάπτυξη όρχεων. Το φαινόµενο της αρρενοποίησης σε αυτή την περίπτωση ήταν παροδικό [46]. Παρόµοιες παρατηρήσεις έχουν γίνει και στον κυπρίνο (Cyprinus carpiο), στο πρωτόγυνο Epinephelus suillus και το πρώτανδρο Acanthopagrus schlegeli. H αναστροφή φύλου (Εικ. 20) σε αυτές και άλλες περιπτώσεις δεν έχει ξεκάθαρη αιτιολογία. εν είναι ξεκάθαρο αν τα τελικά διαφοροποιηµένα ωογόνια ή Εικόνα 20. Φωτογραφίες από γονάδες κατά τη διάρκεια της αναστροφής φύλου στο πρωτόγυνο ερµαφρόδιτο Thalassoma dupperrey. A) Ωοθήκη πριν την αναστροφή µε εµφανή ωοθυλάκια, Β) Γονάδα κατά τη διάρκεια της αναστροφής µε ατρητικά ωοθηλάκια(f), δυνητικά σπερµατογόνια(g), και κύτταρα που παράγουν στεροειδή(s), C) Όρχις µετά την αναστροφή φύλου µε γεννητικά κύτταρα σε διάφορα στάδια σπερµατογένεσης και κύτταρα Leydig [48]. 26

29 Εισαγωγή σπερµατογονία δύνανται να αλλάξουν τις αναπτυξιακές τους µοίρες ή αδιαφοροποίητα κύτταρα µέσα στη γονάδα στρατολογούνται για µια νέα πορεία διαφοροποίησης. Πάντως έχουν παρατηρηθεί αρχέγονα γεννητικά κύτταρα σε διαφοροποιηµένες γονάδες στα είδη Xiphophorus sp., Liza aurata, Serranus hepatus και Coris julis [47]. H παρουσία αυτών των κυττάρων σε διάφορα στάδια της γοναδογένεσης σηµαίνει ότι κατά τη διάρκεια της ωρίµανσης πολλών ψαριών διατηρείται η δυνατότητα της αναστροφής φύλου και επαναδιαφοροποίησης του αναπαραγωγικού συστήµατος. Γενικά, λοιπόν, τα ψάρια χρησιµοποιούν µια ποικιλία (Πίνακας 5) µηχανισµών για να ελέγχουν τη φυλετική διαφοροποίηση. Κάποια είδη χρησιµοποιούν γενετικά συστήµατα, ώστε το φύλο να καθοριστεί τη στιγµή της γονιµοποίησης (όπως και στα θηλαστικά), σε κάποια άλλα σηµαντικό ρόλο παίζει η ηθολογική συµπεριφορά µε τα άλλα άτοµα του ιχθυοπληθυσµού, ενώ συναντάµε και περιπτώσεις όπου χρησιµοποιούνται αλλαγές σε περιβαλλοντικούς παράγοντες (π. χ θερµοκρασία) για να διαµορφώσουν την αναλογία φύλου. Η τελευταία περίπτωση συναντάται σε αρκετά είδη όπως αναφερθούµε παρακάτω στην επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων στη φυλετική διαφοροποίηση Γενετικός φυλοκαθορισµός H πορεία ανάπτυξης προς το ένα ή το άλλο φύλλο καθορίζεται από τον σχετικό αριθµό και την ισχύ των φυλοκαθοριστικών παραγόντων, που εδράζουν τόσο στα φυλετικά, όσο και στα αυτοσωµικά χρωµοσώµατα. Σε πολλά είδη ψαριών οι διασταυρώσεις δεν παράγουν τη φυσιολογική αναλογία 1:1 για τα δυο φύλα των απογόνων, γεγονός που αποδεικνύει ότι ο διαχωρισµός των φυλετικών χρωµοσωµάτων δεν είναι υπεύθυνος για τον φυλοκαθορισµό. Σε αυτές τις περιπτώσεις συµβαίνει κάποια γονίδια να καθορίζουν την αναπτυξιακή πορεία ωοθηκών και κάποια άλλα των όρχεων (αυτοσωµικός φυλοκαθορισµός), συνεπώς το φύλο ενός συγκεκριµένου ατόµου καθορίζεται από την ισχύ των γενετικών παραγόντων που κληρονοµεί από τους γονείς του. Τον κανόνα αυτό φαίνεται να ακολουθεί και το zebrafish το οποίο διαθέτει 50 (2N) χρωµοσώµατα, κανένα από τα οποία δεν είναι φυλετικό (Εικ. 21). Τα αποτελέσµατα πειραµάτων για επαγωγή ανδρογένεσης (androgenesis) ή γυνογένεσης (gynogenesis) στο zebrafish [51] έδειξαν ότι διαφορετικά στελέχη αυτού του είδους µπορεί να έχουν διακριτές ισορροπίες ανάµεσα σε φυλοκαθοριστικούς παράγοντες, οι 27