Επίδραση της DHEA (δεϋδροεπιανδροστερόνη) στην ωοθηκική απάντηση μετά από διέγερση με γοναδοτροπίνες σε γυναίκες με ελαττωμένη ωοθηκική λειτουργία

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ & ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟ ΕΚΠΑΙΔΕΥΤΙΚΟ ΙΔΡΥΜΑ ΑΘΗΝΑΣ ΤΜΗΜΑ ΜΑΙΕΥΤΙΚΗΣ Π Ρ Ο Γ Ρ Α Μ Μ Α Μ Ε Τ Α Π Τ Υ Χ Ι Α Κ Ω Ν Σ Π Ο Υ Δ Ω Ν «Ε Ρ Ε Υ Ν Α Σ Τ Η Γ Υ Ν Α Ι Κ Ε Ι Α Α Ν Α Π Α Ρ Α Γ Ω Γ Η» ΤΙΤΛΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Επίδραση της DHEA (δεϋδροεπιανδροστερόνη) στην ωοθηκική απάντηση μετά από διέγερση με γοναδοτροπίνες σε γυναίκες με ελαττωμένη ωοθηκική λειτουργία Όνομα μεταπτυχιακής φοιτήτριας : Μαρία Παπαλουκά Ιδιότητα : Βιολόγος Α.Μ. : Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή: 1. Βλάχος Νικόλαος, Αναπλ. Καθηγ., Β Μαιευτική-Γυναικολογική Κλινική : Επιβλέπων 2. Βιτωράτος Νικόλαος, Καθηγ., Β Μαιευτική-Γυναικολογική Κλινική 3. Λαμπρινουδάκη Ειρήνη, Αναπλ. Καθηγ. Γυναικ. Ενδοκρινολογίας Αθήνα, 2014

2 Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική εργασία πραγματοποιήθηκε υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Νικόλαου Βλάχου. Θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου προς όλους όσοι μου συμπαραστάθηκαν κατά την περίοδο από την έναρξη ως την αποπεράτωση της εργασίας αυτής: τα μέλη της συμβουλευτικής επιτροπής, τον Καθηγητή κ. Νικόλαο Βιτωράτο και την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Ειρήνη Λαμπρινουδάκη και, ιδιαίτερα, τον Επιβλέποντα Καθηγητή μου κ. Νικόλαο Βλάχο, καταρχάς για την ευκαιρία που μου έδωσε να εκπονήσω αυτή τη διπλωματική εργασία και στην πορεία για το ότι στάθηκε πολύτιμος καθοδηγητής, συνοδοιπόρος, συμπαραστάτης σε αυτή μου την προσπάθεια. Τον ευχαριστώ από καρδιάς για την εμπιστοσύνη και την πολύτιμη βοήθεια που μου προσέφερε. Ευχαριστίες οφείλω, επίσης, στους συνεργάτες και συναδέλφους για τη συμπαράσταση και κατανόηση καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων και της συγγραφής του κειμένου. Τέλος, θα ήθελα να αφιερώσω αυτή την εργασία στους γονείς μου και την αδερφή μου που με εμψυχώνουν και μου συμπαραστέκονται όλα αυτά τα χρόνια. 2

3 Περιεχόμενα Περίληψη 5 Abstract 6 Κατάλογος συντομογραφιών 7 1. Εισαγωγή Υποβοηθούμενη Αναπαραγωγή Φυσιολογικός Ωοθηκικός Κύκλος 10 Α. Ωοθυλακική Φάση 12 Β. Ωορρηκτική Φάση 14 Γ. Ωχρινική Φάση Υπογονιμότητα Τεχνικές Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής Τεχνητή Σπερματέγχυση Εξωσωματική Γονιμοποίηση (In Vitro Fertilization-IVF) 18 Στάδια Εξωσωματικής Γονιμοποίησης 19 Α. Ωοθηκική Διέγερση 19 Πρωτόκολλα Αγωνιστών GnRH 21 Πρωτόκολλα Ανταγωνιστών GnRH 24 Παρακολούθηση της διέγερσης των ωοθηκών 25 Β. Ανάκτηση Ωαρίων 26 Γ. Διαδικασία In Vitro Γονιμοποίησης 27 Ποιότητα Συνθηκών Καλλιέργειας 28 Γονιμοποίηση Γαμετών 29 Αξιολόγηση της ποιότητας των ωαρίων 31 Έλεγχος των ζυγωτών/εμβρύων 33 Δ. Μεταφορά εμβρύων 34 Ε. Κατάψυξη Αποτυχία της Αγωγής Πτωχή Ωοθηκική Απάντηση 38 3

4 Αιτιολογία 40 Πρόβλεψη 42 Στρατηγικές αντιμετώπισης πτωχής ωοθηκικής 46 απάντησης 1.6 O ρόλος των ανδρογόνων και των τροποποιητών 52 των ανδρογόνων στην ωοθυλακική ανάπτυξη Φυσιολογία των Ανδρογόνων 52 Μηχανισμός Δράσης-Βιοσυνθετικός Κύκλος της 55 DHEA Θεραπεία ορμονικής αναπλήρωσης με DHEA Συσχέτιση DHEA και Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής 60 Διαδερμική χορήγηση τεστοστερόνης ή 61 προσθήκη DHEA πριν την ωοθηκική διέγερση με γοναδοτροπίνες Προσθήκη αναστολέων αρωματάσης 61 Προσθήκη rlh κατά την ωοθηκική διέγερση με 62 γοναδοτροπίνες Προσθήκη hcg κατά την ωοθηκική διέγερση με 62 γοναδοτροπίνες 2 Σκοπός 64 3 Υλικό και μέθοδοι Σχεδιασμός Μελέτης-Πρωτόκολλο Εφαρμογής Μέτρηση Ενδοκρινολογικών Μεταβολιτών Στατιστική Ανάλυση 67 4 Αποτελέσματα 68 5 Συζήτηση 70 6 Βιβλιογραφικές αναφορές 78 4

5 Περίληψη Η δεϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA) είναι ένα ενδογενές στεροϊδές που παράγεται από το φλοιό των επινεφριδίων και τα κύτταρα της θήκης των ωοθηκών. Προέρχεται από τη μετατροπή της χοληστερόλης και είναι πολύ σημαντική πρωταρχικά για το σχηματισμό της τεστοστερόνης και δευτερευόντως της οιστραδιόλης στους περιφερικούς ιστούς. Δηλαδή, η DHEA είναι μία προ-ορμόνη στη διαδικασία στεροϊδογένεσης των ωοθυλακίων. Η συγκέντρωση της DHEA παραμένει υψηλή κατά τη διάρκεια της αναπαραγωγικής ηλικίας και ελαττώνεται σταδιακά με την πάροδο των ετών. Καθώς κι η ωοθηκική λειτουργία μειώνεται με τη πάροδο της ηλικίας υπάρχει η άποψη ότι η αποκατάσταση των επιπέδων της συγκεκριμένης ορμόνης μπορεί να συμβάλει στην αύξηση της ωοθηκικής λειτουργίας. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η χορήγηση συμπληρωμάτων DHEA δύναται να βελτιώσει τον αριθμό και την ποιότητα των ωαρίων μετά από διέγερση με γοναδοτροπίνες. Σκοπός αυτής της προοπτικής τυχαιοποιημένης μελέτης (prospective randomized trial) είναι να δείξουμε αν και κατά πόσο η χορήγηση DHEA βοηθάει τις γυναίκες με ελαττωμένη ωοθηκική λειτουργία στην παραγωγή ωαρίων μετά από διέγερση με γοναδοτροπίνες. Μελετήθηκε μία ομάδα γυναικών με ιστορικό προηγούμενων αποτυχημένων προσπαθειών εξωσωματικής και έχουν αποδεδειγμένα ελαττωμένη ωοθηκική απόκριση όπως προσδιορίζεται από τα επίπεδα της FSH>10mIU/ml ή της οιστραδιόλης E2>75pg/ml κατά τη 3η μέρα του κύκλου. Στις γυναίκες αυτές χορηγήθηκε από το στόμα σκεύασμα DHEA των 25mg 3 φορές την ημέρα για περίπου 16 εβδομάδες. Κατόπιν και μόνο εάν η FSH< 10mIU/ml προχωρήσαμε σε διέγερση με γοναδοτροπίνες και νέο κύκλο εξωσωματικής. Μετρήθηκαν ο αριθμός 1) των ωαρίων, 2) των ώριμων (Μ2) ωαρίων, 3) των γονιμοποιημένων ωαρίων, 4) των εμβρύων τη 3η μέρα, 5) των βλαστομεριδίων των εμβρύων τη 3η μέρα και τη ποιότητά τους, 6) των εμβρύων που μεταφέραμε, 7) των εγκυμοσυνών, καθώς και τα επίπεδα των ορμονών DHEA-S (θειική δεϋδροεπιανδροστερόνη) στον ορό του αίματος. Ως ομάδα ελέγχου (control) χρησιμοποιήθηκε μια ομάδα γυναικών που έχουν κάνει προηγούμενες αποτυχημένες προσπάθειες εξωσωματικής και έχουν αποδεδειγμένα ελαττωμένη ωοθηκική απόκριση όπως προσδιορίζεται από τα επίπεδα της FSH> 10mIU/ml ή της οιστραδιόλης E2>75pg/ml κατά τη 3η μέρα του κύκλου, στις οποίες δεν χορηγήθηκε συμπλήρωμα DHEA. Στα πλαίσια αυτής της μελέτης εξετάσθηκαν οι αλλαγές στο ορμονικό προφίλ (FSH, E2 and AMH) πριν και μετά τη θεραπεία, τα χαρακτηριστικά της διέγερσης, το αποτέλεσμα της διέγερσης καθώς και η κλινική έκβαση (κλινική εγκυμοσύνη και γεννήσεις παιδιών από εξωσωματική εγκυμοσύνη). Συμπερασματικά, η χορήγηση συμπληρωμάτων DHEA δεν είχε κάποια σημαντική επίδραση σε κανέναν από τους υποβοηθητικούς δείκτες ωοθηκικής επάρκειας, αλλά ούτε και σε κανένα από τα χαρακτηριστικά διέγερσης. Καμία διαφορά δεν παρατηρήθηκε στην κλινική εγκυμοσύνη αλλά και στις γεννήσεις παιδιών από εξωσωματική εγκυμοσύνη μεταξύ των δύο ομάδων. Η χορήγηση συμπληρωμάτων DHEA δεν έχει καμία σημαντική επίδραση σε γυναίκες με πτωχή πρόγνωση που υποβάλλονται σε Ελεγχόμενη Ωοθηκική Διέγερση για Εξωσωματική Γονιμοποίηση. 5

6 Abstract Dehydroepiandrosterone (DHEA) is an endogenous steroid produced by the adrenal cortex and theca cells of the ovary. It comes from the conversion of cholesterol and is very important primarily for the formation of testosterone and secondary of estradiol at the peripheral tissues. That is, DHEA is a pro-hormone in the process of steroidogenesis follicles. The concentration of DHEA remains high during the reproductive age and gradually decreases over the years. As though the ovarian function declines with age there is a view that the restoration of the levels of this hormone can help increase-improve ovarian function. Previous studies have shown that DHEA supplementation can improve the number and quality of oocytes following stimulation with gonadotropins. The purpose of this prospective randomized study is to show whether and how the DHEA administration helps oocyte production in women with reduced ovarian function after stimulation with gonadotropins. Α group of women with a history of previous unsuccessful attempts of in vitro fertilization and reduced ovarian response as determined by the levels of FSH> 10mIU / ml or estradiol E2> 75pg / ml during the third day of the cycle was studied. An oral formulation of DHEA 25mg 3 times daily for about 16 weeks was administered to these women. Then and only if FSH <10 miu/ml we proceeded to gonadotropin stimulation and new IVF cycle. The following parameters were measured, the number of 1) oocytes, 2) mature (M2 ) oocytes, 3) fertilized oocytes, 4) embryos on the 3rd day, 5) blastomere embryos on the 3rd day as well as 6) quality of embryos transferred, 7) pregnancies, and the levels of serum hormone DHEA-S (dehydroepiandrosterone sulfate). Women who have made previous failed IVF attempts and have demonstrated reduced ovarian response as determined by the levels of FSH> 10mIU/ml estradiol or E2> 75pg/ml during the 3rd third day of the cycle were used as a control group (control) and not granted supplement DHEA. As part of this study we examined the changes in hormonal profile (FSH, E2 and AMH) before and after treatment, characteristics of ovarian stimulation, the effect of the stimulation and the clinical outcome (clinical pregnancy and IVF pregnancy births). In conclusion, DHEA supplementation had no significant effect on any of the supplementary markers of ovarian response, nor in any of the characteristics of stimulation. No difference was observed in clinical pregnancy and births in IVF pregnancy between the two groups. DHEA supplementation has no significant effect in women with poor prognosis undergoing Controlled Ovarian Stimulation for IVF. 6

7 Κατάλογος συντομογραφιών AFC Antral Follicle Count Αριθμός ωοθυλακίων με άντρο ΑΜΗ Antimullerian Hormone Αντιμυλλέριος ορμόνη COC Cumulus Oocyte Complex Σύμπλεγμα ωοκυττάρου ωοφόρου DHEA Dehydroepiandrosterone Δεϋδροεπιανδροστερόνη DHEAS Dehydroepiandrosterone Sulfate Θειική Δεϋδροεπιανδροστερόνη FSH Follicle Stimulating Hormone Ωοθυλακιοτρόπος ορμόνη GnRH Gonadotropin Releasing Hormone Εκλυτική ορμόνη των γοναδοτροπινών GH Growth Hormone Αυξητική ορμόνη GHRF Growth Hormone Releasing Factor Εκλυτικός παράγοντας της αυξητικής ορμόνης GnSAF Gonadotropin surgeattenuating factor Παράγοντας άμβλυνσης του κύματος των γοναδοτροπινών hcg Ηuman Chorionic Gonadotropin Ανθρώπινη χοριακή γοναδοτροπίνη hmg Human Menopausal Gonadotropin Ανθρώπινη εμμηνοπαυσιακή γοναδοτροπίνη IVF Ιn Vitro Fertilization Εξωσωματική γονιμοποίηση ICSI Intra-cytoplasmic Sperm Injection Ενδοκυτταρική έγχυση σπερματοζωαρίου IUI Intrauterine insemination Ενδομητρική σπερματέγχυση LH Luteinizing Hormone Ωχρινοποιητική ορμόνη PCOS Polycystic Ovarian Syndrome Σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών RCT Randomized Controlled Trial Τυχαιοποιημένη κλινική μελέτη με ομάδα ελέγχου s-vegfr-1 Soluble Vascular Endothelial Growth Factor Διαλυτός αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας-1 7

8 Εισαγωγή 1.1 Υποβοηθούμενη Αναπαραγωγή Η εποχή της ανθρώπινης υποβοηθούμενης αναπαραγωγής εγκαινιάστηκε με τη γέννηση της Louise Brown, του πρώτου παιδιού που γεννήθηκε με τη μέθοδο της εξωσωματικής γονιμοποίησης το 1978 στο Bourn Hall της Αγγλίας (Εικόνα 1). Στη σημερινή εποχή, ακόμα και σε γόνιμα ζευγάρια το προσδόκιμο επίτευξης εγκυμοσύνης κυμαίνεται από 25 έως 36% και επομένως η πρόκληση να γίνει η θεραπεία της υπογονιμότητας πιο αποτελεσματική και προσιτή για τα περισσότερα ζευγάρια είναι υπαρκτή και μεγάλη. Η ανάπτυξη ενός σημαντικότατου ρεπερτορίου τεχνικών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής αντιπροσωπεύουν σήμερα ένα απαραίτητο εργαλείο στη διαχείριση των υπογόνιμων ζευγαριών και αποτελούν την προσπάθεια και ανταπόκριση της ιατρικής κοινότητας σε αυτή της πρόκληση (Kamel 2013; Wang and Sauer 2006). Εικόνα 1. Χρονολόγιο των κυριότερων οροσήμων στην τεχνολογία εξωσωματικής γονιμοποίησης. Η τεχνητή πρόκληση πολλαπλής ωοθυλακιορρηξίας με τη χορήγηση γοναδοτροπινών έγινε τη δεκαετία του 50 σε ποντίκια καθώς και τα πρώτα πειράματα που καταδείκνυαν το ρόλο της υπόφυσης και του υποθαλάμου στη ρύθμιση της λειτουργίας της ωοθήκης καθώς και στοιχειοθέτούσαν τη σχέση αρνητικής ανατροφοδότησης μεταξύ των ορμονών της ωοθήκης και της υπόφυσης (Everett and Sawyer 1950). Τα πειράματα αυτά επεκτάθηκαν σε ανθρώπους με τη χορήγηση ανθρώπινης εμμηνοπαυσιακής γοναδοτροπίνης σε αμηνορροϊκές γυναίκες και την επίτευξη πολύδυμων κυήσεων (Gemzell 1965). Θα πρέπει να τονιστεί ότι η ωρίμανση και ανάπτυξη ανθρώπινων ωαρίων in vitro είχε αρχίσει τουλάχιστον μία δεκαετία πριν μεταφέροντας τις υπάρχουσες γνώσεις από την ανάπτυξη ωαρίων ποντικιών ή 8

9 κουνελιών στην καλλιέργεια ανθρώπινων ωαρίων (Pincus 1939; Pincus and Shapiro 1940). Σημαντική πρόοδος σημειώθηκε τις επόμενες δεκαετίας στο πρόβλημα της ενεργοποίησης των σπερματοζωαρίων in vitro, στον προσδιορισμό του χρόνου ωρίμασης των ωαρίων και στην επιτυχή ανάπτυξη των πρώτων ανθρωπίνων εμβρύων σε εργαστήριο από ωάρια που είχαν αναπτυχθεί in vivo και είχαν συλλεχθεί από γυναίκες στο προωρρηκτικό στάδιο (Edwards 1965a; Edwards 1965b; Edwards et al. 1969). Το πρόβλημα της υπολειπόμενης ωχρινικής λειτουργίας ξεπεράστηκε το 1976, όταν η ομάδα των Edwards και Steptoe πέτυχαν την πρώτη εξωμήτριο κλινική εγκυμοσύνη σε άνθρωπο (Edwards and Steptoe 1983) και το 1978 γεννήθηκε το πρώτο παιδί από εξωσωματική γονιμοποίηση, στα πλαίσια όμως φυσιολογικού κύκλου και όχι με τεχνητή πρόκληση ωοθυλακιορρηξίας. Τα πρώτα παιδια κατόπιν εξωσωματικής γονιμοποίησης και τεχνητής πρόκλησης ωοθυλακιορρηξίας γεννήθηκαν τη δεκαετία του 80 (Edwards 1981; Edwards and Steptoe 1983). Μια πληθώρα τεχνικών/μεθόδων υποβοηθούμενης αναπαραγωγής χρησιμοποιούνται από τους την ιατρική κοινότητα παγκοσμίως. Αυτές είναι οι παρακάτω: -Ενδομήτρια σπερματέγχυση (IUI) -Εξωσωματική γονιμοποίηση (IVF) -Ενδοσαλπιγγική τοποθέτηση γαμετών (GIFT-ZIFT) -Μικρογονιμοποίηση/Ενδοκυτταρική έγχυση σπερματοζωαρίου (ICSI) -Δωρεά ωαρίων -Κατάψυξη εμβρύων/ωαρίων -Παρένθετη μητέρα Βασική επιδίωξη των μεθόδων της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής αποτελεί η αύξηση του ποσοστού επίτευξης κλινικής εγκυμοσύνης. Η αυξημένη αποτελεσματικότητα στα ποσοστά επιτυχίας επίτευξης κύησης της εξωσωματικής γονιμοποίησης είναι το αποτέλεσμα της διαδικασίας ωοθηκικής διέγερσης που παρέχει τη δυνατότητα ανάκτησης πολλαπλών ωαρίων σε συνδυασμό με τη μεταφορά στη μήτρα περισσοτέρων από ένα εμβρύων (Bouckaert et al. 1994). Συγκεκριμένα, έρευνες έδειξαν ότι η μεταφορά ενός εμβρύου σημείωνε επιτυχία επίτευξης κύησης 9,5%, ενώ η μεταφορά δύο, τριών ή τεσσάρων εμβρύων αύξανε αυτό το ποσοστό σε 14,6%, 19,3% και 24,1%, αντίστοιχα (Seppala 1985). Σύμφωνα με τα στοιχεία της Ευρωπαϊκής Εταιρείας Ανθρώπινης Αναπαραγωγής και Εμβρυολογίας (ESHRE), τo μέσο ποσοστό επιτυχίας κλινικών κυήσεων το 2006 σε ευρωπαϊκές χώρες ανέρχεται στο 32,4% ανά εμβρυομεταφορά μετά από IVF και σε 33,0% μετά από ICSI (de Greef et al. 2010), 9

10 ποσοστά που ανοίγουν το δρόμο για περαιτέρω έρευνα και εξέλιξη στον τομέα της ανθρώπινης αναπαραγωγής για την επίτευξη υψηλότερων ποσοστών κύησης. 1.2 Φυσιολογικός ωοθηκικός κύκλος Ο έμμηνος κύκλος διαρκεί περίπου 28 ημέρες και χωρίζεται σε τρεις φάσεις: την Ωοθυλακική φάση, την Ωορρηκτική φάση και την Ωχρινική φάση (Εικόνα 2). Ο ωοθηκικός κύκλος αντικατοπτρίζει τα στάδια ωρίμανσης και λειτουργίας του ωοθυλακίου, και ελέγχεται από τη θετική και αρνητική αλληλεπίδραση των ωοθηκικών ορμονών με την υπόφυση και τον υποθάλαμο. Οι κυριότερες ορμόνες ρύθμισής του είναι η θυλακιοτρόπος ορμόνη (FSH), η ωχρινοτρόπος ορμόνη (LH), τα οιστρογόνα (όπως η οιστραδιόλη) και η προγεστερόνη. Το γυναικείο αναπαραγωγικό σύστημα βρίσκεται υπό τον έλεγχο του υποθαλάμου και της υπόφυσης. Η εκλυτική ορμόνη των γοναδοτροπινών (Gonadotropin releasing hormone, GnRH) εκκρίνεται από τον τοξοειδή πυρήνα του υποθαλάμου και διοχετεύεται στην υπόφυση υπό μορφή ώσεων, οι οποίες αυξάνονται σε συχνότητα και ένταση, καθώς πλησιάζει η εφηβεία και θέτουν έτσι σε λειτουργία τον αναπαραγωγικό κύκλο. Τα γοναδοτρόπα κύτταρα της υπόφυσης έχουν περίπου 10,000 υποδοχείς GnRH, η έκφραση των οποίων βρίσκεται υπό τον έλεγχο της GnRH μέσω ενός κύκλου αρνητικής ανάδρασης (downregulation). Κατά τη διάρκεια της εμβρυικής ζωής, από ένα σύνολο 2 περίπου εκατομμυρίων ωογονιών, δημιουργούνται, κατά την εικοστή εβδομάδα ενδομήτριας ζωής, 7 εκατομμύρια αρχέγονα ωοθυλάκια. Από αυτά, κατά τη γέννηση, παραμένουν μόλις ένα με δυο εκατομμύρια, καθώς τα υπόλοιπα υφίστανται ατρησία. Με την πάροδο του χρόνου, τα ωοθυλάκια σταδιακά ελαττώνονται με αποτέλεσμα η γυναίκα να ξεκινάει την αναπαραγωγική της ζωή, με το 25% των ωαρίων από αυτά που γεννήθηκε, δηλαδή περίπου με 300,000. Από αυτά, περίπου 500 θα οδηγηθούν σε ωοθυλακιορρηξία, ενώ τα υπόλοιπα θα υποστούν ατρησία. Ο ρυθμός που τα ωάρια υφίστανται ατρησία είναι σταθερός μέχρι την ηλικία των 37, οπότε ο αριθμός τους έχει περιοριστεί σε περίπου 25,000. Από το σημείο αυτό, ο ρυθμός απώλειας είναι ταχύτερος, ώστε να οδηγηθεί η γυναίκα σε εμμηνόπαυση, στην ηλικία των 51 κατά μέσο όρο. Αξίζει να αναφερθεί εδώ, ότι κατά την είσοδο στην εμμηνόπαυση θα έχουν απομείνει στις ωοθήκες της περίπου 1000 ωάρια. 10

11 Εικόνα 2. Ωοθηκικός κύκλος. 11

12 Το ωοθυλακιορρηκτικό ωοθυλάκιο δημιουργείται από μία σειρά πρωτογενών ωοθυλακίων των οποίων η ανάπτυξη ξεκίνησε περίπου 85 μέρες πριν από την ωοθυλακιορρηξία (Εικόνα 3). Σε κάθε ωοθήκη αναπτύσσονται περαιτέρω από αυτά έως και 11 ωοθυλάκια και αρχίζουν να ξεπερνούν τα 2mm σε μέγεθος. Η ανάπτυξη αυτή μέχρι αυτό το σημείο είναι ανεξάρτητη της FSH και συμβαίνει περίπου 15 με 20 μέρες προ της ωοθυλακιορρηξίας. Όμως, για την εξέλιξη και ωρίμανση του δευτερογενούς ωοθυλακίου είναι απαραίτητη η δράση της FSH στα κοκκώδη κύτταρα. Οπότε είναι σημαντικό να κατανοήσουμε ότι το σημαντικότερο γεγονός που συμβαίνει λίγο πριν το τέλος του προηγούμενου καταμήνιου κύκλου είναι η αύξηση των επιπέδων της FSH (Gougeon 1996). Α. Ωοθυλακική Φάση Στην αρχική ωοθυλακική φάση (ημέρα 1) τα επίπεδα των ορμονών FSH και LH αυξάνονται λόγω αυξημένης έκκρισης από την υπόφυση του εγκεφάλου. Μέσω του αίματος φτάνουν στις ωοθήκες όπου διεγείρουν την ανάπτυξη 15 με 20 ωαρίων (το καθένα προστατευμένο στο δικό του ωοθυλάκιο) στο στάδιο του πρώιμου άντρου από τις ωοθήκες το καθένα από τα οποία δυνητικά μπορεί να φτάσει σε ωοθυλακιορρηξία. Συγκεκριμένα, καθώς το ωχρό σωμάτιο του προηγούμενου κύκλου εκφυλίζεται, ελαττώνεται η παραγωγή των στεροειδών της ωοθήκης, με αποτέλεσμα την άρση της κατασταλτικής δράσης των οιστρογόνων και της προγεστερόνης στον υποθάλαμο και την υπόφυση, και την ακόλουθη αύξηση της FSH. Συγκεκριμένα, στην όψιμη ωχρινική φάση η συχνότητα έκκρισης της GnRH ευνοεί την έκκριση της FSH. Η αύξηση της FSH αποτελεί το κατώφλι για το πέρασμα μιας ομάδας ωοθυλακίων σε πιο προχωρημένο στάδιο ανάπτυξης. Διαρκεί όμως μικρό χρονικό διάστημα και επιτρέπει το πέρασμα μικρού αριθμού ωοθυλακίων σε περαιτέρω ανάπτυξη. Όπως αναφέρθηκε, η παύση της ανασταλτικής δράσης των οιστρογόνων συνδυάζεται με την αύξηση της συχνότητας ώσεων της GnRH που διεγείρει την έκκριση FSH (Groome et al. 1996). Οι ίδιες ορμόνες επίσης, FSH/LH, πυροδοτούν μία αύξηση της παραγωγής των οιστρογόνων τα οποία, όσο αυξάνονται τα επίπεδά τους, μέσω ενός συστήματος βιοανάδρασης ελαττώνουν την παραγωγή της FSH. Αυτός ο κύκλος βιοανάδρασης περιορίζει τον αριθμό των αναπτυσσόμενων ωοθυλακίων και είναι σημαντικός διότι προσδίδει ισορροπία στον φυσιολογικό έμμηνο κύκλο. Από όλα τα αναπτυσσόμενα ωοθυλάκια ένα κυριαρχεί, ωριμάζει και καταστέλλει τα υπόλοιπα ωοθυλάκια της ομάδας τα οποία σταματούν να αναπτύσσονται και πεθαίνουν, ενώ το επικρατές ωοθυλάκιο συνεχίζει να παράγει οιστρογόνα. 12

13 Η παραγωγή της αρωματάσης και της α υπομονάδας της ινχιμπίνης προκαλείται εξαιτίας της αύξησης της FSH σε αυτή τη φάση που με τη σειρά της οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης γονιδίων των κοκκωδών κυττάρων. Με την έναρξη της αύξησης της FSH έχουμε παραγωγή και των δύο β υπομονάδων που η ένωσή τους οδηγεί στην παραγωγή της ακτιβίνης. Η FSH, εκτός από την εκκριτική αιχμή στο μέσο του κύκλου, παρουσιάζει και μια δεύτερη μικρότερη αιχμή στο τέλος της ωχρινικής φάσης 2-3 ημέρες πριν την έμμηνο ρύση, η οποία συμπίπτει με τη μείωση των ωοθηκικών ορμονών, και έχει ως ρόλο την ωρίμανση των ωοθυλακίων, από τα οποία θα επιλεγεί το κυρίαρχο ωοθυλάκιο. Σύμφωνα με τη θεωρία των δύο κυττάρων δύο γοναδοτροπινών η παραγωγή του ενζύμου αρωματάση διεγείρεται από την FSH που συνδέεται με υποδοχείς στα κοκκώδη κύτταρα. Το ένζυμο αυτό αρωματοποιεί σε οιστρογόνα τα ανδρογόνα που παράγονται στα κύτταρα της έσω θήκης, κάτω από τη διέγερση της LH υποδοχείς της οποίας υπάρχουν μόνο στα κύτταρα της έσω θήκης (Fowler et al. 1978; Hillier et al. 1994). Χωρίς την παρουσία της LH η ωοθηκική στεροειδογένεση θα ήταν αδύνατη, καθώς αυτή είναι που διεγείρει την παραγωγή ανδρογόνων από τα κύτταρα της έσω θήκης. Δηλαδή, σύμφωνα με τη θεωρία «δύο κύτταραδύο γοναδοτροπίνες» τα κύτταρα θήκης διεγείρονται από την LH προς παραγωγή ανδρογόνων, κυρίως ανδροστενδιόνης και λιγότερο τεστοστερόνης. Αυτά τα ανδρογόνα στη συνέχεια μεταφέρονται στα κοκκώδη κύτταρα, όπου εκεί μετατρέπονται σε οιστρογόνα, μέσω της δράσης της αρωματάσης. Η αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο τύπων κυττάρων (κοκκώδη και θήκης) είναι απαραίτητη, αφού τα κύτταρα θήκης δεν διαθέτουν αρωματάση για την τροποποίηση των ανδρογόνων σε οιστρογόνα, και τα κοκκώδη δεν διαθέτουν το ένζυμο P450c17 για την παραγωγή ανδρογόνων. Τα οιστρογόνα που παράγονται δρουν στα κοκκώδη κύτταρα και οδηγούν στον πολλαπλασιασμό τους, καθώς και στην αύξηση των υποδοχέων της FSH σε αυτά. Παράλληλα, και η FSH επάγει την έκφραση των υποδοχέων της. Η FSH και τα οιστρογόνα προκαλούν αύξηση του ωοθυλακικού υγρού από το οποίο τρέφεται το ωάριο. Η FSH ανιχνεύεται στο ωοθυλακικό υγρό όταν τα οιστρογόνα υπερτερούν των ανδρογόνων. Η μετατροπή του ανδρογονικού μικροπεριβάλλοντος του ωαρίου σε οιστρογονικό χαρακτηρίζει το ωάριο που θα φτάσει σε ωοθυλακιορρηξία. Όπως αναφέρθηκε, η αύξηση της FSH διαρκεί βραχύ χρονικό διάστημα και στη συνέχεια ελαττώνεται. Αυτό συμβαίνει γιατί τα αυξανόμενα επίπεδα της οιστραδιόλης μέσω αρνητικής ανάδρασης οδηγούν προοδευτικά σε μείωση των επιπέδων της FSH. Έτσι παύει η παραγωγή οιστρογόνων και ο πολλαπλασιασμός των κοκκωδών κυττάρων. Τα λιγότερο αναπτυγμένα ωάρια υποστρέφουν και εκφυλίζονται, ενώ το κυρίαρχο ωοθυλάκιο, παρά τη μείωση της FSH, συνεχίζει να αναπτύσσεται λόγω του μεγαλύτερου αριθμού κοκκωδών κυττάρων και 13

14 υποδοχέων FSH που διαθέτει, καθώς και της πλουσιότερης αγγείωσης των κυττάρων της θήκης που επιτρέπουν την επιλεκτική άφιξη της FSH στο κυρίαρχο ωοθυλάκιο. Τα αυξημένα επίπεδα οιστρογόνων στο κυρίαρχο ωοθυλάκιο και η FSH υποβοηθούν τη δημιουργία υποδοχέων LH στα κοκκώδη κύτταρα, επιτρέποντας στο κυρίαρχο ωοθυλάκιο να απαντήσει στη μεσοκυκλική αιχμή της LH που θα ακολουθήσει. Χωρίς οιστρογόνα δεν αναπτύσσονται υποδοχείς LH στα κοκκώδη κύτταρα. Η επιλογή του κυρίαρχου ωοθυλακίου γίνεται την 5η- 7η ημέρα του καταμήνιου κύκλου (Erickson and Shimasaki 2001). Β. Ωορρηκτική Φάση Με τη συνεχιζόμενη αύξηση των οιστρογόνων η FSH φτάνει στη χαμηλότερη τιμή της, ενώ η LH αρχικά αυξάνει με βραδύ και στη συνέχεια με ταχύτερο ρυθμό (Jabbour et al. 2006). Tα επίπεδα της LH αυξάνουν συνεχώς και επάγουν την παραγωγή ανδρογόνων από τα κύτταρα της θήκης, κι έτσι επιτυγχάνεται μεγαλύτερη παραγωγή οιστρογόνων. Η LH φτάνει στη μέγιστη τιμή της (αιχμή) στο μέσο του κύκλου (ημέρα 14), και συνοδεύεται από μικρότερη αιχμή της FSH. Η θετική παλίνδρομη ρύθμιση που ασκούν τα οιστρογόνα στην υπόφυση οδηγεί στη μεσοκυκλική αιχμή της LH. Το κύμα αυτό διαρκεί ώρες, και 36 περίπου ώρες μετά την έναρξη του κύματος πραγματοποιείται η ωοθυλακιορρηξία. Κατά την απελευθέρωση του ωαρίου από την ωοθήκη (ωορρηξία) αυτό παγιδεύεται από εγκολπώσεις στην άκρη της σάλπιγγας και μεταφέρεται μέσα στη σάλπιγγα. Συγχρόνως, η ποσότητα και η πυκνότητα της βλέννας που παράγεται στον τράχηλο εξυπηρετεί τη παγίδευση του σπέρματος σε περίπτωση σεξουαλικής επαφής αυξάνοντας με αυτόν τον τρόπο τις πιθανότητες γονιμοποίησης (θρέφοντάς το και βοηθώντας στη μετακίνηση του προς το ωάριο). Παράλληλα, 48 ώρες πριν την έναρξη του κύματος της LH, η LH δρώντας μέσω των υποδοχέων της στα κοκκώδη κύτταρα προκαλεί παραγωγή προγεστερόνης, η οποία αυξάνει σημαντικά ώρες πριν την ωοθυλακιορρηξία. Γ. Ωχρινική Φάση Στην ωχρινική φάση (ημέρα 15-16) έπειτα από την απελευθέρωση του ωαρίου και τη μετακίνησή του στον τράχηλο το άδειο ωοθυλάκιο αναπτύσσεται σε μία νέα δομή που ονομάζεται ωχρό σωμάτιο το οποίο αρχίζει να εκκρίνει μία ορμόνη που ονομάζεται προγεστερόνη η οποία είναι υπεύθυνη για την προετοιμασία της μήτρα για την εμφύτευση του γονιμοποιημένου ωαρίου. Επιπροσθέτως, αμέσως πριν την ωοθυλακιορρηξία η LH υπορυθμίζει τους δικούς της υποδοχείς, γεγονός που οδηγεί σε μειωμένη δραστηριότητα της ορμονικής μονάδας των δύο κυττάρων και επομένως σε μείωση της παραγωγής οιστραδιόλης 14

15 (Chabbert-Buffet and Bouchard 2002). Συνολικά, το κύμα της LH διεγείρει την ολοκλήρωση της μειωτικής διαίρεσης στο ωάριο, την ωχρινοποίηση των κοκκωδών κυττάρων και τη σύνθεση της προγεστερόνης. Εκτός από την εκκριτική αιχμή της, η LH βρίσκεται σε χαμηλά επίπεδα καθ όλη τη διάρκεια του κύκλου. Αυτό οφείλεται στην αρνητική ανάδραση (negative feedback) της έκκρισης γοναδοτροπινών που προκαλείται από τις ωοθηκικές ορμόνες. Η προγεστερόνη με τη σειρά της δρα αυτοκρινικά προκαλώντας την παραγωγή πλασμινογόνου, προσταγλανδινών και μεταλλοπρωτεασών που διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη ρήξη του ωοθυλακίου. Τα ωοθυλάκια που έγιναν άτρητα πριν μετατραπούν σε στρωματικό ιστό κάτω από τη δράση της αυξανόμενης LH παράγουν ανδρογόνα από τη θήκη τους, τα οποία παρουσιάζουν μια αιχμή στο μέσο του κύκλου, οδηγώντας στην ατρησία τα λιγότερα προικισμένα ωοθυλάκια, αλλά και σε αύξηση της libido (Adams et al. 1978). Μετά την ωοθυλακιορρηξία και σε απάντηση στην LH, τα μεμβρανικά κοκκώδη κύτταρα και τα κύτταρα της θήκης διαφοροποιούνται σε ωχρινοποιημένα κύτταρα και σχηματίζουν το ωχρό σωμάτιο. Η επαρκής ωχρινοποίηση είναι απαραίτητη για την προετοιμασία του ενδομήτριου και την εμφύτευση του εμβρύου. Υπό τη δράση της LH τα κοκκώδη κύτταρα παράγουν τον αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα (vascular endothelial growth factor VEGF) ο οποίος παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της αγγείωσης του ωχρού σωματίου. Τα νεόπλαστα αγγεία διαπερνούν τη βασική μεμβράνη και προμηθεύουν τα κοκκώδη κύτταρα με χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) για τη σύνθεση προγεστερόνης. Μετά την ωοθυλακιορρηξία τα ωχρινικά κύτταρα ρυθμίζουν προς τα πάνω τους υποδοχείς LH με άγνωστο μηχανισμό. Αυτό επιτρέπει στα βασικά επίπεδα LH να διατηρούν το ωχρό σωμάτιο. Αντίστοιχη δράση έχει και η hcg του εμβρύου. Εξαιτίας της LH ή της hcg τα ωχρινικά κύτταρα αυξάνουν την έκφραση των ενζύμων P450scc και 3β-υδροξυστεροειδική αφυδρογονάση (3β-HSD), με αποτέλεσμα την παραγωγή προγεστερόνης, ανδροστενδιόνης, οιστραδιόλης και ινχιμπίνης Α. Η μέγιστη τιμή προγεστερόνης καταγράφεται την 8η ημέρα της ωχρινικής φάσης. Το ωχρό σωμάτιο αρχίζει την ωχρινόλυση περίπου την 9η ημέρα μετά την ωοθυλακιορρηξία. Το ωχρό σωμάτιο διατηρείται για 14 ημέρες, εκτός και εάν επέλθει εγκυμοσύνη, οπότε συντηρείται περαιτέρω από την χοριακή γοναδοτροπίνη. Σε περίπτωση εγκυμοσύνης η hcg αίρει τον εκφυλισμό του ωχρού σωματίου και το γονιμοποιημένο ωάριο ταξιδεύει μέσω της σάλπιγγας και εμφυτεύεται στην μήτρα. Συνήθως, ελλείψει γονιμοποίησης, το ωάριο περνά διαμέσου της μήτρας, το τοίχωμα της μήτρας διασπάται και ένας νέος έμμηνος κύκλος ξεκινά. 15

16 Σε περίπτωση μη επιτυχούς εγκυμοσύνης αρχίζει η ωχρινόλυση οπότε έχουμε απότομη μείωση της προγεστερόνης. Στην ωχρινόλυση θεωρείται ότι παίζουν ρόλο τα οιστρογόνα (παρατηρείται αυξημένη δραστηριότητα αρωματάσης στο ωχρό σωμάτιο), η ωκυτοκίνη (εκκρίνεται από τα ωχρινικά κύτταρα) και οι προσταγλανδίνες (παράγονται από την ωοθήκη και τη μήτρα και διεγείρουν τη σύνθεση κυτταροκινών που προκαλούν απόπτωση). Το γεγονός αυτό οδηγεί σε μείωση της οιστραδιόλης, προγεστερόνης και ινχιμπίνης Α, με αποτέλεσμα διέγερση του υποθάλαμο-υποφυσιακού άξονα και έκκριση FSH η οποία θα σώσει άλλη μια ομάδα ανώριμων ωοθυλακίων από την ατρησία, ένα από τα οποία θα φτάσει μέχρι την ωοθυλακιορρηξία. Αντίθετα προς τα οιστρογόνα, η προγεστερόνη μόνη της δεν ασκεί ανασταλτική δράση στην έκκριση των γοναδοτροπινών. Η ταυτόχρονη δράση οιστρογόνων και προγεστερόνης προκαλεί αρνητική ανάδραση στην έκκριση της FSH και της LH. Επίσης, αν και η πρωταρχική δράση των οιστρογόνων ασκείται κυρίως στο επίπεδο της υπόφυσης, έχει παρατηρηθεί ότι τα οιστρογόνα δρουν και στον υποθάλαμο μειώνοντας το ύψος και αυξάνοντας τη συχνότητα των ώσεων της GnRH. Έτσι τα χαμηλά επίπεδα οιστρογόνων (και ινχιμπίνης Α) στο στάδιο μετάβασης από την ωχρινική στην παραγωγική φάση σχετίζονται με επεισόδια έκκρισης GnRH (κάθε λεπτά), τα οποία ευνοούν την αύξηση της FSH (Chabbert-Buffet and Bouchard 2002). Αντίθετα προς τα οιστρογόνα, η δράση της προγεστερόνης ασκείται κυρίως στον υποθάλαμο, όπου προκαλεί μείωση της συχνότητας των ώσεων μέσω διέγερσης της παραγωγής ενδογενών οπιοειδών, ή με άμεση δράση στον τοξοειδή πυρήνα. Εικόνα 2. Ωογένεση. 16

17 1.3 Υπογονιμότητα Η υπογονιμότητα έχει αναγνωρισθεί από την Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας (WHO) ως ένα παγκόσμιο πρόβλημα δημόσιας υγείας με σημαντικές δημογραφικές και κοινωνικές επιπτώσεις (Vayena et al. 2002). Συγκεκριμένα στοιχεία δείχνουν ότι αφορά το 15% περίπου των ζευγαριών αναπαραγωγικής ηλικίας (Boivin et al. 2007; Schmidt and Munster 1995). Ως υπογονιμότητα ορίζεται η αποτυχία επίτευξης εγκυμοσύνης μετά από σεξουαλικές επαφές άνευ προφυλάξεων για χρονικό διάστημα τουλάχιστον 12 μηνών (Gnoth et al. 2005; Zegers- Hochschild et al. 2009). Διακρίνεται σε πρωτοπαθή όταν δεν έχει επιτευχθεί ποτέ κύηση όσον αφορά το συγκεκριμένο ζευγάρι και σε δευτεροπαθή όταν έχει προηγηθεί κύηση του ζευγαριού, ανεξάρτητα με το αποτέλεσμά της. Η υπογονιμότητα αφορά και τους δύο συντρόφους, αφού οι αιτίες της μπορεί να προέρχονται τόσο από τη γυναίκα όσο και από τον άνδρα. Τις κυριότερες αιτίες γυναικείας υπογονιμότητας συνιστούν συνήθως η προχωρημένη ηλικία της γυναίκας, η έλλειψη διαβατότητας των σαλπίγγων, οι διαταραχές της ανωοθυλακιορρηξίας, οι φλεγμονές του γεννητικού συστήματος, οι ορμονικές διαταραχές, η ενδομητρίωση, κτλ. Η ανδρική υπογονιμότητα οφείλεται κυρίως σε διαταραχές του σπέρματος με σημαντικότερες την ολιγοσπερμία, τη χαμηλή κινητικότητα των σπερματοζωαρίων ή την κακής ποιότητας μορφολογία τους (Gurunath et al. 2011). Επίσης δύναται ένα ζευγάρι να πάσχει από ανεξήγητη στειρότητα, όταν υπάρχει αδυναμία σύλληψης μετά από ένα χρόνο προσπάθειας και όταν οι συνήθεις εξετάσεις διερεύνησης δεν αναδεικνύουν κάποια ανωμαλία. Στην κατηγορία αυτή υπολογίζεται ότι ανήκει το 10-25% των ζευγαριών (Hull et al. 1985). Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος, τα υπογόνιμα ζευγάρια υποβάλλονται σε τεχνικές της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής, ενός τομέα της ιατρικής επιστήμης που ασχολείται με τη διάγνωση και θεραπευτική αντιμετώπιση της ανθρώπινης υπογονιμότητας. Η γέννηση της Louise Brown το 1978 μετά από εξωσωματική γονιμοποίηση (IVF) (Steptoe and Edwards 1978), υπήρξε η απαρχή μιας όλο και περισσότερο εξελισσόμενης πορείας προόδου στον τομέα αυτό, ανοίγοντας νέους ορίζοντες στην έρευνα της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Έκτοτε, η συμβολή της εξωσωματικής γονιμοποίησης στη θεραπεία της ανθρώπινης υπογονιμότητας υπήρξε καθοριστική. 17

18 1.4 Τεχνικές Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής Τεχνητή Σπερματέγχυση Η τεχνητή σπερματέγχυση, μέσω ποικιλίας τεχνικών, συνίσταται στην τοποθέτηση του σπέρματος αυτούσιου ή μετά από επεξεργασία στο γυναικείο αναπαραγωγικό σύστημα. Σε αυτή την περίπτωση είναι εφικτή η συνεύρεση σπερματοζωαρίου-ωαρίου απουσία σεξουαλικής επαφής. Οι πλείστες υποθέσεις σπερματέγχυσης σήμερα αφορούν τη χρήση ομόλογου ή ετερόλογου σπέρματος ως θεραπεία ανδρικής υπογονιμότητας. Ετερόλογο σπέρμα δύναται να χρησιμοποιηθεί σε περιπτώσεις αζωοσπερμίας, ανδρικής υπογονιμότητας σε συνδυασμό με κληρονομική νόσο ή σε περιπτώσεις γυναικών χωρίς σύντροφο που επιθυμούν εγκυμοσύνη. Η ανδρική υπογονιμότητα ανευρίσκεται ως μεμονωμένο αίτιο υπογονιμότητας στο 20% των υπογόνιμων ζευγαριών και σαν επιπρόσθετο αίτιο έως και στο 40% αυτών και η πιο συνηθισμένη μέθοδος σπερματέγχυσης είναι η ενδομητρική σπερματέγχυση (Intrauterine insemination-iui). Η μέθοδος αυτή αυξάνει τις πιθανότητες γονιμοποίησης τοποθετώντας μέσω ειδικού καθετήρα, διαμέσου του τραχήλου επεξεργασμένου in vitro σπέρματος στην ενδομητρική κοιλότητα παρακάμπτωντας τον φραγμό της τραχηλικής βλέννας και συνήθως συνδυάζεται καλύτερα με πρωτόκολλα διέγερσης των ωοθηκών Εξωσωματική Γονιμοποίηση (In Vitro Fertilization-IVF) Η εξωσωματική ή in vitro γονιμοποίηση αφορά την πραγματοποίηση εξωσωματικής γονιμοποίησης (γονιμοποίηση στο εργαστήριο) και πραγματοποιείται αρχικά με τη συλλογή των γαμετών του ζεύγους και την τελική μεταφορά του εμβρύου στη μήτρα ύστερα από ένα αρχικό στάδιο ανάπτυξης στο εργαστήριο. Οι πιο συνήθεις λόγοι για τους οποίους ένα ζεύγος θα επιλέξει εξωσωματική γονιμοποίηση είναι η ανεξήγητη στειρότητα, κληρονομούμενη γενετική νόσος, απουσία μήτρας (παρένθετη μητέρα), αποτυχία άλλων μεθόδων (πχ. σπερματέγχυση), ενδομητρίωση, περιπλοκές που αφορούν ανδρική υπογονιμότητα, παράγοντες που αφορούν γυναικολογική φυσιολογία (πχ. σάλπιγγες, ωοθήκες). Στην επίτευξη κύησης στην IVF συμβάλλουν πολλοί καθοριστικοί παράγοντες, όπως το αίτιο της υπογονιμότητας, η ηλικία της γυναίκας, η πολλαπλή διέγερση των ωοθηκών καθώς και η απάντηση των ωοθηκών σε αυτήν (καλή ή πτωχή απάντηση). Η ποιότητα της εργαστηριακής υποστήριξης επίσης φαίνεται ότι παίζει σημαντικότατο ρόλο (είδος καλλιεργητικού υλικού, συνθήκες κλπ.). 18

19 Στάδια Εξωσωματικής Γονιμοποίησης Σημαντικότατα στοιχεία της επιτυχίας των προσπαθειών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής αποτελούν η ποιότητα των εξετάσεων που θα λάβουν χώρα προ της θεραπείας καθώς και τα προτεινόμενα θεραπευτικά πρωτόκολλα. Τα κύρια στάδια της εξωσωματικής γονιμοποίησης είναι η Ωοθηκική Διέγερση, η Ανάκτηση των Ωαρίων και τελικά η Μεταφορά των Εμβρύων. Α. Ωοθηκική Διέγερση Κατά την πρώτη φάση του κύκλου IVF χορηγείται στον ασθενή η κατάλληλη δόση συγκεκριμένων ορμονών προκειμένου να διεγερθεί η παραγωγή και ωρίμανση των ωαρίων και να κατασταλεί η έκκριση της ωχρινοποιητικής ορμόνης (LH) μέσω της απευαισθητοποίησης της υπόφυσης. Απουσία αυτής της ορμονικής αγωγής οι ωοθήκες παράγουν συνήθως 1 ώριμο ωάριο ανά μήνα. Ο σκοπός, λοιπόν, της ωοθηκικής διέγερσης είναι η αύξηση των πιθανοτήτων απόκτησης εμβρύων μέσω της απόκτησης ικανοποιητικού αριθμού ώριμων ωαρίων. Αυτό επιτυγχάνεται με την ταυτόχρονη ωρίμανση πολλών ωοθυλακίων μέσω της διέγερσης που ουσιαστικά αποτρέπει την ατρησία των ωοθυλάκιων της εκάστοτε ωοθυλακικής σειράς. Συνήθως, τα πρωτόκολλα διέγερσης IVF συνδυάζουν τη χορήγηση γοναδοτροπινών με αγωνιστές/ανταγωνιστές GnRH προς αποφυγή της πρώιμης ωοθυλακιορρηξίας (πιθανότητα 20-30%) (Olivennes et al. 2006). Παρόλο που στόχος της διέγερσης είναι η συλλογή ικανοποιητικού αριθμού ωαρίων, ιδανικά 8-15, η διέγερση θα πρέπει να επιτελείται με μεγάλη προσοχή διότι μπορεί να προκαλέσει σημαντικές αντιδράσεις. Η αύξηση του μεγέθους των ωοθηκών λόγω της ορμονικής διέγερσης δύναται να προκαλέσει σε κάποιες περιπτώσεις βάρος στο υπογάστριο, κεφαλαλγίες, βάρος στα κάτω άκρα, καθώς και αύξηση του σωματικού βάρους. Τη μεγαλύτερη αντένδειξη της διαδικασίας ωοθηκικής διέγερσης αποτελεί το σύνδρομο υπερδιέγερσης των ωοθηκών (The Rotterdam ESHRE/ASRM sponsored PCOS consensus workshop group, 2004). Γενικά, 3 τύποι ορμονικής αγωγής χορηγούνται κατά τη διαδικασία IVF: 1. Χορήγηση GnRH αγωνιστών [Arvekap (triptorelin) και Daronda (leuprorelin)]/ανταγωνιστών [Cetrotide (cetrorelix) και Orgalutran (genirelix)] προκειμένου να καταστείλουν τη δράση της ορμόνης LH που είναι υπεύθυνη για την ωοθυλακορηξία όταν τα ωάρια είναι ώριμα και επομένως να αποφευχθεί η πρώιμη ωοθυλακορηξία. Tα GnRH ανάλογα διακρίνονται σε αγωνιστές και ανταγωνιστές. Οι GnRH αγωνιστές είναι συνθετικά 19

20 δεκαπεπτίδια που διεγείρουν τους υποδοχείς στα γοναδοτρόπα κύτταρα προκαλώντας αρχικά έντονη και παρατεταμένη έκλυση γοναδοτροπινών από την υπόφυση (flare up response). Λόγω, όμως, της παρατεταμένης δράσης τους, επέρχεται απευαισθητοποίηση των υποδοχέων της GnRH με αποτέλεσμα την κατασταλτική επίδραση στην έκκριση των γοναδοτροπινών. Σε αντίθεση με τους GnRH αγωνιστές, οι ανταγωνιστές GnRH, επίσης συνθετικά δεκαπεπτίδια, παρουσιάζουν αμιγή ανταγωνιστική ενέργεια, αναστέλλοντας την υποφυσιακή έκκριση των ενδογενών γοναδοτροπινών από την αρχή της χορήγησής τους χωρίς όμως να προηγηθεί το αρχικό flare up. Τα δύο βασικά πρωτόκολλα ωοθηκικής διέγερσης όπου χορηγούνται οι GnRH ανταγωνιστές είναι i) το πρωτόκολλο της μοναδικής δόσης (μια δόση την 8η -9η ημέρα του κύκλου) και ii) το πρωτόκολλο πολλαπλών δόσεων (μικρές δόσεις καθημερινά από την 5η ή 6η ημέρα έως την ημέρα χορήγησης της hcg). Παρόλ αυτά θα πρέπει να τονιστεί ότι δεν υπάρχει στη βιβλιογραφία ξεκάθαρη υπεροχή κάποιας από τις δύο κατηγορίες ενώσεων (Check et al. 2013) αν και γενικότερα οι ανταγωνιστές παρουσιάζουν πιο σύντομο διάστημα διέγερσης, μικρότερη κατανάλωση σε γοναδοτροπίνες και μειωμένη συχνότητα εμφάνισης του συνδρόμου υπερδιέγερσης ωοθηκών. 2. Χορήγηση FSH ή FSH/LH [Altermon, Gonal-F, Menopur, Merional, Puregon] για τη διέγερση ωρίμανσης πολλαπλών ωαρίων. Η επιδιωκόμενη πολλαπλή ωοθυλακική ανάπτυξη επιτυγχάνεται με τη χρήση εξωγενώς χορηγούμενων γοναδοτροπινών, όπως rfsh (ανασυνδυασμένη ωοθυλακιοτρόπος ορμόνη) ή hmg (ανθρώπινη εμμηνοπαυσιακή γοναδοτροπίνη). Η χορήγησή τους αρχίζει τη 2η ή 3η ημέρα της εμμηνορρυσίας και η δοσολογία των γοναδοτροπινών ρυθμίζεται ανάλογα με την ανταπόκριση των ωοθηκών της κάθε γυναίκας. Η ανάπτυξη των ωοθυλακίων ελέγχεται υπερηχογραφικά και με προσδιορισμό της συγκέντρωσης της οιστραδιόλης στον ορό. Η χορήγηση γοναδοτροπινών σε συνδυασμό με GnRH ανάλογα αυξάνει την πιθανότητα επιτυχούς έκβασης ενός κύκλου IVF μέσω της πρόληψης των πρόωρων αιχμών της LH. 3. Χορήγηση HCG [HCG Pregnyl ή r-hcg Ovitrelle] που ενεργοποιεί την τελική ωρίμανση των ωαρίων. Στις πλείστες περιπτώσεις η διέγερση μέσω FSH διαρκεί 8-14 ημέρες, ανάλογα με το πρωτόκολλο, εως την πλήρη ωρίμαση των ωοκυττάρων. Επομένως, η δοσολογία των παραπάνω ορμονών θα πρέπει να είναι η βέλτιστη προκειμένου να προκαλέσει την παραγωγή ικανοποιητικού αριθμού ωαρίων. Θα πρέπει να τονιστεί ότι η δοσολογία αυτή δεν θα πρέπει να είναι υπερβολική ώστε να οδηγήσει σε συμπτώματα υπερδιέγερσης αλλά ούτε και πολύ χαμηλή ώστε ο αριθμός των παραγόμενων ώριμων ωοκυττάρων να είναι μικρός. Η διέγερση 20

21 των ωοθηκών ολοκληρώνεται συνήθως με τη διαπίστωση τριών τουλάχιστον ωοθυλακίων μέσης διαμέτρου 17 mm και τη χορήγηση hcg για την πρόκληση τελικής ωοκυτταρικής ωρίμανσης (Kolibianakis et al. 2005). Σε αυτή τη φάση της διαδικασίας IVF ο ρόλος του γυναικολόγου είναι να επιλέξει το σωστό πρωτόκολλο διέγερσης και την κατάλληλη δοσολογία, να παρακολουθεί την πορεία του ασθενούς και να κάνει τις απαραίτητες διορθώσεις στη δοσολογία, καθώς και να ενεργοποιήσει την τελική ωρίμανση των ωαρίων την κατάλληλη στιγμή με τη χορήγηση HGC. Η πρώιμη ωοθυλακιορρηξία λόγω πολυ-ωοθυλακικής ανάπτυξης υπήρξε στο παρελθόν ένα σύνηθες πρόβλημα που αφορούσε τη χρήση ανθρώπινης εμμηνοπαυσιακής γοναδοτροπίνης (hmg) για διέγερση ωοθυλακικής ωρίμασης. Περίπου το 20% των κύκλων IVF ακυρωνόταν λόγω πρόωρης έξαρσης της ωχρινοποιητική ορμόνης (Elter and Nelson 2001). Η υποφυσιακή απευαισθητοποίηση μέσω της χορήγησης αγωνιστών γοναδοτροπίνης προτού την ωοθηκική διέγερση με χορήγηση hmg πρωτοαναφέρθηκε στο 1984 (Porter et al. 1984) μειώνοντας τα ποσοστά πρώιμης ωοθυλακιορρηξίας στο 2% και αυξάνοντας τα ποσοστά εγκυμοσύνης με εξωσωματικής γονιμοποίηση (Elter and Nelson 2001). Πρωτόκολλα Αγωνιστών GnRH Οι αγωνιστές GnRH είναι συνθετικά παράγωγα της GnRH. Παρουσιάζουν δομικές διαφοροποιήσεις διαφορές που αυξάνουν το χρόνο ημιζωής τους και παρουσιάζουν φορές μεγαλύτερη συγγένεια με τον υποδοχέα GnRH συγκριτικά με το φυσικό μόριο GnRH (Kiesel and Runnebaum 1992). Η υπερδοσολογία τους και συνεχή χρήση προκαλεί απευαισθητοποίηση της υπόφυσης (down regulation), ελάττωση της έκκρισης των γοναδοτροπινών και καταστολή των ωοθηκών με παρεμπόδιση της ωοθυλακιορρηξίας. Μετά από μελέτες φάνηκε ότι η χρήση των αγωνιστών GnRH σε συγκεκριμένες δοσολογίες (αυξημένη δοσολογία προκαλεί ελάττωση της έκκρισης των γοναδοτροπινών και καταστολή των ωοθηκών με παρεμπόδιση της ωοθυλακιορρηξίας) εμποδίζει την πρώιμη αιχμή της LH, ελαττώνοντας το ποσοστό ακυρούμενων κύκλων, αλλά και βελτιώνοντας την ωοθηκική ανταπόκριση, κυρίως σε ασθενείς με πτωχά αποτελέσματα σε προηγούμενα πρωτόκολλα (Depalo et al. 2012; Fatemi et al. 2012; Humaidan et al. 2012; Kol and Humaidan 2013). Επιπλέον, φαίνεται να βελτιώνουν το ποσοστό γονιμοποίησης και εμφύτευσης, οδηγώντας σε μια καθαρή αύξηση του ποσοστού κυήσεων ανά κύκλο. Μετά τη χορήγηση ενός αγωνιστή GnRH, λαμβάνει χώρα το πρώτο στάδιο της απελευθέρωσης LH και FSH («flare-up»), και 21

22 στη συνέχεια ακολουθεί η απευαισθητοποίηση που αντιστοιχεί στην κατακρήμνιση της LH και της FSH, οδηγώντας σε πτώση της οιστραδιόλης και της προγεστερόνης. Τα θεραπευτικά σχήματα ή πρωτόκολλα διέγερσης ωοθηκών στα οποία χρησιμοποιούνται οι GnRH αγωνιστές είναι : α) επίμηκυσμένο (χορήγηση από το μέσο της εκκριτικής φάσης του προηγούμενου κύκλου), β) το βραχύ (χορήγηση την πρώτη ή δεύτερη ημέρα του κύκλου) και γ) το υπερβραχύ πρωτόκολλο (χορήγηση την πρώτη ή δεύτερη ημέρα του κύκλου και διακοπή μετά την πάροδο της αγωνιστικής δράσης). Εικόνα 4. Θεραπευτικά πρωτόκολλα Σχηματική αναπαράσταση των θεραπευτικών επεμβάσεων κατά την ωοθηκική διέγερση. α) Επιμηκυσμένο πρωτόκολλο με χρήση αγωνιστή GnRH, β) Βραχύ πρωτόκολλο με χρήση ανταγωνιστή GnRH. Στο (α) η υπόφυση μειορρυθμίζεται και απευαισθητοποιείται με χορήγηση αγωνιστή GnRH και ακολουθεί καθημερινή ωοθηκική διέγερση με FSH. Στο (β) το πρωτόκολλο ξεκινά με ωοθηκική διέγερση στην πρώιμη ωοθυλακική φάση και περιλαμβάνει χορήγηση του ανταγωνιστή GnRH σε περίπτωση πρόωρης έξαρσης LH. Και στα δύο πρωτόκολλα, η ανθρώπινη χοριακή γοναδοτροπίνη (hcg) χορηγείται προκειμένου να επάγει την τελική ωρίμανση των ωοκυττάρων (de Greef et al. 2010). Στο επιμηκυσμένο πρωτόκολλο (Long Protocol) η διέγερση με γοναδοτροπίνες πραγματοποιείται ύστερα από την απευαισθητοποίηση η οποία επιτυγχάνεται με τη χορήγηση αγωνιστή GnRH βραδείας/ταχείας (ανάλογα με την επιθυμούμενη περίοδο χορήγησης του σκευάσματος). Η έναρξη της αγωγής με τον αγωνιστή GnRH πραγματοποιείται τις 4 πρώτες ημέρες του κύκλου για τα βραδείας αποδέσμευσης σκευάσματα ή στην ωχρινική φάση (20η ημέρα του κύκλου) για τα ταχείας δράσης σκευάσματα. Είναι βασικο προτού την έναρξη της 22

23 θεραπείας ο πλήρης αποκλεισμός του ορμονικού άξονα. Κατά το επιμηκυσμένο πρωτόκολλο, το οποίο φαίνεται ότι αποδίδει τα καλύτερα αποτελέσματα συγκριτικά με τα βραχέα/υπερβραχέα πρωτόκολλα, επιβεβαιώνεται η απευαισθητοποίηση (18 με 30 ημέρες από τη χορήγηση ενός σκευάσματος GnRH βραδείας αποδέσμευσης ή 10 με 15 ημέρες μετά από την καθημερινή χορήγηση) με υπερηχογραφικό έλεγχο και με μέτρηση της οιστραδιόλης. Ύστερα από την επιβεβαίωση είναι δυνατή η έναρξη της διέγερσης εφόσον δεν υπάρχει εκκριτική κύστη και τα επίπεδα οιστραδιόλης βρίσκονται κάτω από 50 pg/ml. Περαιτέρω έλεγχοι πραγματοποιούνται την 6η, 8η και 10η ημέρα της θεραπείας. Η χορήγηση του αγωνιστή GnRH γίνεται προς το τέλος της ωχρινικής φάσης του προηγούμενου κύκλου. Αυτό αυξάνει τις πιθανότητες υψηλών ποσοστών επιτυχίας της εξωσωματικής γονιμοποίησης, διότι υψηλά επίπεδα LH τις μέρες πριν τη χορήγηση του αναλόγου θα οδηγήσουν σε χαμηλά ποσοστά επιτυχίας. Στο βραχύ/υπερβραχύ πρωτόκολλο (Short/Ultra-short Protocol) πραγματοποιείται έναρξη χορήγησης του αγωνιστή στην αρχή του κύκλου, ενώ το flare-up φαινόμενο χρησιμοποιείται για την έναρξη της διέγερσης των ωοθηκών. Στη συνέχεια η διέγερση επιτυγχάνεται με τις εξωγενώς χορηγούμενες γοναδοτροπίνες, είτε ανασυνδυασμένες είτε βιολογικές. Κατά το βραχύ πρωτόκολλο, ο αγωνιστής GnRH χορηγείται περίπου 12 ημέρες σε συνδυασμό με τις γοναδοτροπίνες, ενώ στο υπερβραχύ πρωτόκολλο ο αγωνιστής GnRH χορηγείται αρχικά για 3 ημέρες (ωοθηκική διέγερση) και μετά συνεχίζεται μεμονωμένα η εξωγενής χορήγηση γοναδοτροπινών. Παρενέργειες της χορήγησης του αγωνιστή είναι μία επακόλουθη ορμονική στέρηση, που το φυσιολογικό της αντίστοιχο αποτελεί η εμμηνόπαυση, και επομένως συνοδεύεται από εξάψεις, κεφαλαλγίες, ευερεθιστότητα, ξηρότητα του κόλπου καθώς και αιμορραγία κατά το τέλος του flare-up φαινομένου, λόγω της πτώσης των ορμονικών επιπέδων. Τα χαρακτηριστικά της ασθενούς καθορίζουν και τον αριθμό των χορηγούμενων μονάδων γοναδοτροπινών όπως εκτιμάται έπειτα από εκτίμηση με πρώιμο υπερηχογραφικό έλεγχο (μέτρηση ωοθυλακίων με άντρο) και με ορμονολογικές μετρήσεις κατά την έναρξη ενός φυσιολογικού κύκλου. Σε γενικές γραμμές, απαιτούνται IU/ημέρα κατά το επιμηκυσμένο πρωτόκολλο, με εξαίρεση τις ασθενείς με παράγοντες κινδύνου για υπερδιέγερση ωοθηκών (γυναίκες νεαρής ηλικίας, σύνδρομο πολυκυστικών ωοθηκών). Η παρακολούθηση της διέγερσης συνίσταται στην παρακολούθηση της ωοθυλακικής ανάπτυξης και της ανάπτυξης του ενδομήτριου με επαναλαμβανόμενους υπερηχογραφικούς ελέγχους, 23

24 καθώς και με μετρήσεις των επιπέδων 17β-οιστραδιόλης (Ε2), προγεστερόνης και LH. Η συχνότητα της παρακολούθησης εξαρτάται από το πρωτόκολλο, το ορμονικό προφίλ και το ατομικό αναμνηστικό της ασθενούς. Πρωτόκολλα Ανταγωνιστών GnRH Τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούν τους ανταγωνιστές GnRH είναι πιο πρόσφατα (Depalo et al. 2012; Fatemi et al. 2012; Marci et al. 2013). Επιτρέπουν την πρόληψη ή τη διακοπή της έξαψης των επιπέδων της LH. Σε αντίθεση με τους αγωνιστές, οι ανταγωνιστές, δεν παρουσιάζεται το flare-up φαινόμενο και επομένως δεν είναι απαραίτητη η απευαισθητοποίηση. Οι ανταγωνιστές GnRH χρησιμοποιούνται κατά το μέσο ή το τέλος της ωοθυλακικής φάσης. Δύο πρωτόκολλα είναι διαθέσιμα : α) Το πρωτόκολλο πολλαπλών δόσεων, που αφορά τη χορήγηση μικρών δόσεων ανταγωνιστή (0.25mg), μετά την 6η ημέρα της διέγερσης (8η ημέρα του κύκλου) έως και τη μέρα της πρόκλησης ωοθυλακιορρηξίας (απλό και διευκολύνει τη θεραπεία), β) Το πρωτόκολλο μιας δόσης, που αφορά τη χορήγηση μεγαλύτερη δόσης ανταγωνιστή (3mg) κατά το τέλος της ωοθυλακικής φάσης (διευκολύνει την παρακολούθηση του κύκλου, αλλά απατεί συνέπεια στη χορήγηση των δόσεων). Ο έλεγχος προ της έναρξης της in vitro γονιμοποίησης για τη γυναίκα περιλαμβάνει μετρήσεις ορμονών (LH, FSH, E2, PRL) τη 2η με 4η ημέρα του κύκλου και εάν διατίθενται ινχιμπίνη Β και ΑΜΗ. Αυτές οι μετρήσεις επιτρέπουν την εκτίμηση της ωοθηκικής λειτουργίας, ενώ ο έλεγχος μπορεί να συμπληρωθεί και με μία δοκιμασία ωοθηκικής εφεδρείας. Η πραγματοποίηση υστεροσκόπησης αποσκοπεί στο να επιβεβαιωθεί η απουσία βλάβης εντός της μήτρας, που θα μπορούσε να επηρεάσει την εμφύτευση. Ο έλεγχος συμπληρώνεται με πλήρη ανοσολογικό έλεγχο (HIV, HBV, HCV, αντισώματα για την ερυθρά και το τοξόπλασμα), καθώς και καρυότυπο, τραχηλικό επίχρισμα και έλεγχο των μαστών. 24

25 Παρακολούθηση της διέγερσης των ωοθηκών Ένας από τους πιο καθοριστικούς παράγοντες της επιτυχούς έκβασης της IVF είναι η ωοθηκική απάντηση στην πρόκληση της ωοθυλακιορρηξίας. Αυτό συμβαίνει επειδή σχετίζεται άμεσα με την ποιότητα των ωαρίων, την υποδεκτικότητα του ενδομήτριου και τη λειτουργία του ωχρού σωματίου. Ο λόγος για τον οποίο η παρακολούθηση της ωοθηκικής διέγερσης είναι τόσο κρίσιμη από πρακτικής άποψης είναι για τον καθορισμό της ανταπόκρισης των ωοθηκών ώστε να προσδιοριστεί η καταλληλότερη στιγμή για την πρόκληση της ωοθυλακιορρηξίας και για την πρόληψη της υπερδιέγερσης των ωοθηκών. Οι βασικοί τρόποι παρακολούθησης της ανάπτυξης των ωοθυλακίων είναι η μέτρηση της 17β-οιστραδιόλης και η υπερηχογραφία. Στο φυσιολογικό κύκλο, τα επίπεδα της οιστραδιόλης σχετίζονται με το μέγεθος των ωοθυλακίων, όπως μετράται με τους υπερήχους και οι δύο αυτές παράμετροι είναι εξίσου αποτελεσματικοί δείκτες για την ωοθυλακική ανάπτυξη. Το μεγαλύτερο ποσό της κυκλοφορούσης Ε2 προέρχεται από το επικρατούν ωοθυλάκιο και η ωοθυλακιορρηξία συμβαίνει όταν το ωοθυλάκιο κυμαίνεται υπερηχογραφικά μεταξύ 22 και 27mm. Στους προκλητούς κύκλους όμως οι παραπάνω συσχετίσεις διαταράσσονται, γιατί υπάρχει ταυτόχρονη ανάπτυξη πολλών ωοθυλακίων. Η καθημερινή αύξηση στην τιμή της οιστραδιόλης (25-30%) και τα επίπεδά της τη μέρα πρόκλησης της ωοθυλακιορρηξίας διαδραματίζουν σπουδαίο ρόλο. Επιπλέον, με τον υπερηχογραφικό έλεγχο αξιολογείται η ανάπτυξη των ωοθυλακίων, τα οποία πρέπει να μεγαλώνουν κατά 2 mm ημερησίως. Με κριτήρια τη μέτρηση της οιστραδιόλης και την υπερηχογραφία γίνεται ορθή εκτίμηση του χρόνου πρόκλησης της ωοθυλακιορρηξίας. Σχηματικά, η πρόκληση της ωοθυλακιορρηξίας προτείνεται όταν υπάρχουν τουλάχιστον 2 με 3 ωοθυλάκια διαμέτρου 16-18mm και τα επίπεδα της οιστραδιόλης κυμαίνονται pg/ml ανά ωοθυλάκιο άνω των 14mm, δηλαδή τα επιθυμητά επίπεδα οιστραδιόλης είναι περίπου pg/ml. Η πρόκληση της ωοθυλακιορρηξίας πραγματοποιείται με ένεση κεκαθαρμένης από ούρα χοριακής γοναδοτροπίνης (hcg) ή UI, ή ανασυνδυασμένης hcg. Η επιπλέον χρήση της LH πραγματοποιείται σε ειδικές περιπτώσεις. Η ωοληψία πραγματοποιείται περίπου 34 με 36 ώρες μετά την πρόκληση της ωοθυλακιορρηξίας. Τα προϊόντα που κυκλοφορούν στην αγορά τα τελευταία χρόνια και αφορούν στην διέγερση των ωοθηκών είναι πολλαπλά. Πρόκειται για τις ανασυνδυασμένες γοναδοτροπίνες FSH (Gonal F, Puregon) και LH (Luveris), που είναι προϊόντα γενετικής και είναι απολύτως καθαρές. Τα παλαιότερα σκευάσματα (hmg) περιείχαν είτε ένα μείγμα ανθρώπινων εμμηνοπαυσιακών γοναδοτροπινών LH και FSH είτε μία κεκαθαρμένη από ούρα 25

26 FSH. Σήμερα κυκλοφορεί σκεύασμα που περιέχει γοναδοτροπίνη προϊόν ούρων με FSH και LH σε αναλογία 1:1 (Menopur) καθώς και σκεύασμα που περιέχει ως γοναδοτροπίνη προϊόν ούρων με υψηλώς κεκαθαρμένη FSH (Fostimon). Οι διάφορες έρευνες που έχουν δημοσιευτεί και συγκρίνουν τα προϊόντα ούρων με τα ανασυνδυασμένα προϊόντα φαίνεται να καταδεικνύουν μία πιο ισχυρή βιολογική δράση των ανασυνδυασμένων προϊόντων, αλλά τα ποσοστά των κυήσεων παραμένουν παρόμοια. Η δυνατότητα υποδορίων ενέσεων με πένα (όπως η χορήγηση ινσουλίνης) είναι το μεγάλο πλεονέκτημα που προσφέρουν τα ανασυνδυασμένα προϊόντα, επιτρέποντας την αυτοδιαχείριση της θεραπείας. Ο τρόπος παραγωγής τους επίσης είναι προκαθορισμένος, και η τιμή τους πολύ πιο υψηλή. Β. Ανάκτηση Ωαρίων Η ωοληψία πραγματοποιείται περίπου 34 με 36 ώρες μετά τη χορήγηση της hcg. Τη μέρα της ωοληψίας πραγματοποιείται και η συλλογή σπέρματος (με αυνανισμό) καθώς και η προετοιμασία αυτού, ώστε να πραγματοποιηθεί η επαφή των γαμετών (Sakkas 2013). Η ωοληψία πραγματοποιείται υπό διακολπικό υπερηχογραφικό έλεγχο (Εικόνα 5). Με τη βοήθεια οδηγού, ο ενδοτραχηλικός σωλήνας φέρεται στην κατάλληλη θέση ώστε να συλλέξει, μέσω βελόνας, τα ωοθυλάκια με διάμετρο 14mm. Το συλλεχθέν ωοθυλακικό υγρό μεταφέρεται στο εργαστήριο για την αναζήτηση των ωαρίων. Η ωοληψία πραγματοποιείται υπό πλήρη ή τοπική αναισθησία. Οι πιθανές επιπλοκές είναι ο τραυματισμός αγγείων ή τμήματος εντέρου, που μπορούν να αποφευχθούν με τη χρήση ποιοτικού υπερηχογραφικού ελέγχου και με κατάλληλη κλινική εμπειρία. Η πραγματοποίηση της διαδικασίας σε πλήρως αποστειρωμένο χειρουργικό περιβάλλον και ο επιμελής καθαρισμός του τραχήλου μειώνουν στο ελάχιστο τον κίνδυνο περιτοναϊκής μόλυνσης που μπορεί να οδηγήσει σε περιτονίτιδα. Η αιμορραγία στο σημείο του τραχήλου όπου πραγματοποιείται η λήψη των ωαρίων σπανίως χρειάζεται συρραφή. 26

27 Εικόνα 5. Διαδικασία ανάκτησης ωαρίων από την ωοθήκη ( Γ. Διαδικασία In Vitro Γονιμοποίησης Ο στόχος ανάπτυξης διαφόρων τεχνικών εξωσωματικής γονιμοποίησης ήταν αρχικά η παράκαμψη προβλημάτων υπογονιμότητας σαλπιγγικής αιτιολογίας (πχ. απόφραξη) και στη συνέχεια προστέθηκαν επιπλέον ενδείξεις όπως οι αλλοιώσεις του σπέρματος. Η διαδικασία της εξωσωματικής γονιμοποίησης απαιτεί υψηλή ποιότητα χειρισμών σε κάθε στάδιο προκειμένου να επιτευχθεί το προσδόκιμο, δηλαδή η κύηση ζώντος νεογνού. Επομένως, η εμπειρία σε κάθε στάδιο του χειρισμού των γαμετών είναι εξαιρετικά σημαντικός και καθοριστικός παράγοντας για τη διατήρηση υψηλού ποσοστού κυήσεων. Ο χρόνος in vitro γονιμοποίησης των ωαρίων ποικίλει ανάμεσα σε 2-3 ημέρες, στις συνήθεις περιπτώσεις, εως και 6 ημέρες, σε περιπτώσεις παρατεταμένων καλλιεργειών και η in vitro εξέλιξη του γονιμοποιημένου ωαρίου φτάνει μέχρι το στάδιο της βλαστοκύστης. Η διαδικασία περιλαμβάνει τη λήψη ωαρίων ύστερα από παρακέντηση των ωοθηκών (ημέρα 0) και τοποθέτησή τους μαζί με τα επιλεγμένα σπερματοζωάρια του συντρόφου (Εικόνα 7). Ύστερα από μία διαδικασία επώασης που διαρκεί 18 ώρες γίνεται έλεγχος του αριθμού και της ποιότητας των γονιμοποιημένων ωαρίων αφού απομακρύνουμε τα κύτταρα της κοκκώδους στιβάδας (decoronization). Εν τέλει, τα γονιμοποιημένα ωάρια αυτού του σταδίου επωάζονται για ώρες επιπλέον πριν επανατοποθετηθούν στη μήτρα ή καταψυχθούν για μία μελλοντική εμβρυομεταφορά (Olivennes et al. 2006). 27

28 Εικόνα 6. Σύμπλεγμα ανθρώπινου ωαρίου και κοκκώδους στιβάδας. Η γονιμοποίηση των ωαρίων γίνεται είτε με τη μέθοδο της κλασσικής IVF, όπου τα ωάρια και τα σπερματοζωάρια τοποθετούνται μαζί σε καλλιεργητικό υλικό για να πραγματοποιηθεί η γονιμοποίηση, είτε με τη μέθοδο της ICSI, όπου γίνεται κατευθείαν εισαγωγή ενός και μόνο σπερματοζωαρίου μέσα στο ωάριο με τη χρήση ειδικής βελόνας. Ποιότητα Συνθηκών Καλλιέργειας Όπως αναφέραμε παραπάνω η εμπειρία χειρισμού της διαδικασίας είναι εξαιρετικά σημαντικός παράγοντας για την επιτυχία της και εξίσου καθοριστικός παράγοντας είναι και η ποιότητα των υλικών που χρησιμοποιούνται σε αυτή, όπως καλλιεργητικά μέσα καθώς επίσης και ο αυστηρός έλεγχος των συνθηκών της διαδικασίας. Είναι λογικό ότι η διατήρηση σταθερών και ελεγχόμενων συνθηκών επώασης των γαμετών είναι εξαιρετικά σημαντική και αυτό το τεχνητό μικροπεριβάλλον θα πρέπει να προσομοιάζει όσο το δυνατόν τις φυσικές, in vivo, συνθήκες. Συγκεκριμένα, παράγοντες όπως η θερμοκρασία (37 ºC), ph ( ), ωσμωτική πίεση ( mmol/kg), έκθεση στο φως (ελάχιστη), αέρια επώασης (5% CO2) και καλλιεργητικά υγρά θα πρέπει να είναι υπό διαρκή έλεγχο και να υπάρχει πλήρης εργαστηριακή καταγραφή όλων των ενεργειών που λαμβάνουν χώρα. 28

29 Τα πιο συνηθισμένα καλλιεργητικά μέσα είναι το Β2, προϊόν με σύσταση βόειου σαλπιγγικού υγρού, σε συσκευασία αμπουλών έτοιμων για χρήση και τα μέσα HTF (Human Tubal Fluid), IVF (Medicult), BM1 και Ham s F10, ορισμένα από τα οποία απαιτούν κάποια προ-εργασία. Για τις παρατεταμένες καλλιέργειες εμβρύων χρησιμοποιούνται άλλου τύπου καλλιεργητικά μέσα (sequential), που λαμβάνουν υπόψη τις διακυμάνσεις του μεταβολισμού του εμβρύου (G1/G2-Gardner, ISM1/ISM2-Medicult), αλλά και πιο προηγμένα υλικά που επιτρέπουν στις παρατεταμένες καλλιέργειες τη διατήρηση του ίδιου υγρού για 5 ημέρες (global). Σε όλα τα καλλιεργητικά μέσα προστίθεται πενικιλίνη και στρεπτομυκίνη, καθώς και κάποια πηγή αζώτου, όπως ορός. Γονιμοποίηση Γαμετών Η επιλογή της τεχνικής βάσει της οποίας θα επιτευχθεί η γονιμοποίηση των γαμετών εξαρτάται από το αίτιο της υπογονιμότητας του ζεύγους και τις παραμέτρους του σπέρματος κατά το σπερμοδιάγραμμα. 1. Καλλιέργεια σε δισκία Η γονιμοποίηση λαμβάνει χώρα σε τρυβλία που περιέχουν 4 δισκία το καθένα, χωρητικότητας 1ml καλλιεργητικού υλικού το καθένα, όπου και μπορούν να τοποθετηθούν έως και 4 ωάρια. Η διαδικασία περιλαμβάνει την υποδοχή του πρώτου ωαρίου (σύμπλεγμα κοκκωδών κυττάρων-ωαρίου) ατο πρώτο δισκίο και χρησιμοποιείται για τον αρχικό καθαρισμό από ίχνη αίματος ύστερα από τον οποίο το σύμπλεγμα τοποθετείται στο δεύτερο δισκίο μαζί με περίπου σπερματοζωάρια καλής κινητικότητας όπου και επωάζονται για 18 ώρες. Επακολούθως αφαίρείται η ζώνη των κοκκωδών κυττάρων και οι ζυγώτες τοποθετούνται στα εναπομείναντα δισκία όπου και επωάζονται για περαιτέρω 24 ώρες πριν τη μεταφορά ή κατάψυξή τους. 2. Καλλιέργεια σε μικρο-σταγόνες Η γονιμοποίηση λαμβάνει χώρα σε μικρή ποσότητα καλλιεργητικού μέσου (50 μl), υπό ελαίου και αποτελεί την πιο χρησιμοποιούμενη τεχνική. Με αυτή την τεχνική επιτυγχάνεται η ανεξάρτητη ανάπτυξη κάθε ωαρίου και συγχρόνως ελαχιστοποιείται ο απαιτούμενος αριθμός (3000 σπερματοζωάρια καλής κινητικότητας ανά μικρο-σταγόνα). Η τεχνική αυτή απαιτεί εξαιρετική προσοχή στις μεταβολές της ποσότητας του καλλιεργητικού υλικού, της θερμοκρασίας και του ph, καθώς και είναι σημαντικός ο έλεγχος τοξικότητας του χρησιμοποιούμενου ελαίου. Σε περιπτώσεις σοβαρού βαθμού ολιγοασθενοσπερμίας, η διείσδυση του σπερματοζωαρίου στο κυτταρόπλασμα δύναται να επιτευχθεί με τεχνητό τρόπο. Η κατεξοχήν 29

30 χρησιμοποιούμενη μέθοδος σήμερα είναι εκείνη της ενδοκυτταρικής έγχυσης ενός σπερματοζωαρίου εντός του κυτταροπλάσματος (ICSI) (Εικόνα 7). Το σπερματοζωάριο λαμβάνεται είτε μετά από εκσπερμάτωση είτε χειρουργικά από την επιδιδυμίδα/όρχεις σε ένα προγενέστερο στάδιο ανάπτυξής του. H τεχνική της ενδοκυτταρικής έγχυσης του σπερματοζωαρίου (ICSI-Intra Cytoplasmic Sperm Injection) συνίσταται στην εισαγωγή ενός και μόνο σπερματοζωαρίου μέσα στο κυτταρόπλασμα του ωοκυττάρου παρακάμπτοντας το φυσικό φραγμό της διαφανούς ζώνης και της κυτταρικής μεμβράνης του ωαρίου (Palermo et al. 1992). Πράγματι, χάρη στην πρόοδο της εμβρυολογίας και της μικροεπεμβατικής ανδρολογίας, είναι δυνατή η λήψη σπερματίδων από την επιδιδυμίδα (Percutaneous epididymal sperm aspiration- PESA, Microepididymal sperm aspiration- MESA) ή από το ορχικό επιθήλιο (Testicular sperm aspiration- TESA, Testicular sperm extraction- TESE), επιτρέποντας έτσι την τεκνοποίηση σε περιπτώσεις αζωοσπερμίας αποφρακτικού τύπου. Εικόνα 7. Διαδικασία ενδοκυτταρικής έγχυσης σπερματοζωαρίων και IVF ( Το πλεονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι εμφανές σε πολλές περιπτώσεις ζευγαριών με ανδρικής αιτιολογίας υπογονιμότητα: σοβαρού βαθμού ολιγο-ασθενο-τερατοσπερμία, σύνδρομα σπερματικών ανωμαλιών, αυτοάνοσα νοσήματα με παρουσία υψηλού ποσοστού αντισωμάτων κατά των σπερματοζωαρίων, καθώς και σε περιπτώσεις κατάψυξης σπέρματος λόγω ασθένειας και σε περίπτωση αζωοσπερμίας, οπότε και λαμβάνονται σπερματοζωάρια από την επιδιδυμίδα ή τους όρχεις. Η τεχνική αυτή έδωσε τη δυνατότητα επίτευξης κύησης με λήψη σπερματοζωαρίων από το ορχικό επιθήλιο ή την επιδιδυμίδα, σε αζωοσπερμικούς 30

31 ασθενείς, με αζωοσπερμία αποφρακτικού τύπου ή με βιολογική ανωριμότητα. Το ποσοστό γονιμοποίησης των ωαρίων με την τεχνική αυτή έφτασε στο 60-70%, δηλαδή όσο και σε ασθενείς με φυσιολογικό σπέρμα που εντάσσονται σε πρόγραμμα κλασσικής εξωσωματικής γονιμοποίησης, λόγω σαλπιγγικού παράγοντα (Van Steirteghem et al. 1993b; Van Steirteghem et al. 1993c). Αφού γίνει η κατάλληλη προεργασία των ωαρίων και των σπερματοζωαρίων, πραγματοποιείται η επιλογή αυτών που πρόκειται να γονιμοποιηθούν. Μόνο τα ώριμα ωάρια που έχουν εξωθήσει το πρώτο πολικό σωμάτιο (μετάφαση ΙΙ) μεταφέρονται στον επωαστή (συνθήκες 37ºC και 5-6%CO2) για 2-3 ώρες, πριν έρθουν σε επαφή με τον άλλο γαμέτη. Η διαδικασία ICSI πραγματοποιείται σε τράπεζα εργασίας ανάστροφου μικροσκοπίου σε μεγέθυνση x400. Κατά την έγχυση, το ωάριο κρατείται στη θέση του με αναρρόφηση με τη βοήθεια της μικρο-πιπέττας ακινητοποίησης, με τέτοιο τρόπο ώστε το πολικό σωμάτιο να βρίσκεται στην 6η ή στη 12η ώρα, ώστε να αποφευχθεί η είσοδος της μικρο-πιπέττας με το σπερματοζωάριο στην κυτταροπλασματική περιοχή που περιλαμβάνει τα χρωμοσώματα του ωαρίου και την μειωτική άτρακτο. Ένα μορφολογικά φυσιολογικό σπερματοζωάριο με αργή κίνηση επιλέγεται και με τη βοήθεια της μικρο-πιπέττας εγχύσεως τοποθετείται στο κυτταρόπλασμα του ωαρίου. Λαμβάνεται ιδιαίτερη προσοχή προκειμένου να διαρραγεί η κυτταροπλασματική μεμβράνη κατά την έγχυση και να ενεργοποιηθεί το ωάριο (Εικόνα 12). Μετά την έγχυση, τα ωάρια μεταφέρονται σε νέο καλλιεργητικό μέσο και επωάζονται σε συνθήκες 37ºC και 5-6%CO2, μέχρι να εκτιμηθούν ως προς την παρουσία προπυρήνων, 16 με 18 ώρες μετά. Η μεταφορά των εμβρύων λαμβάνει χώρα μετά από 48 ώρες, όπως πραγματοποιείται και στην IVF. Αξιολόγηση της ποιότητας των ωαρίων Ένας από τους πιο καθοριστικούς παράγοντες τις επιτυχίας της εξωσωματικής γονιμοποίησης είναι η αξιολόγηση της ωρίμανσης των ωαρίων που αναπτύσσονται in vitro και παρόλο που δεν υπάρχουν τυποποιημένα κριτήρια βαθμολόγησης των ωαρίων η εξάπλωση των κοκκωδών κυττάρων καθώς και η ακτίνα του ακτινωτού στεφάνου σε σχέση με τη διάμετρο του ωαρίου αποτελούν τα πιο συνήθη κριτήρια βαθμολόγησης της ποιότητας των εμβρύων. Η αποβολή του πολικού σωματίου αποτελεί έναν έμμεσο τρόπο εκτίμησης της ωρίμανσης του ωαρίου και είναι σημαντικό η γονιμοποίηση των ωαρίων να πραγματοποιηθεί μέσα στις ώρες που ακολουθούν από το πέρας της ωρίμανσης του πυρήνα και της αποβολής του πολικού σωματίου. Αυτό πρακτικά σημαίνει ότι τα ώριμα ωάρια στο στάδιο της μετάφασης ΙΙ, πρέπει να γονιμοποιηθούν εντός 6-8 ωρών. 31

32 Μέσα στο κυτταρόπλασμα, 5-22 ώρες ύστερα από τη γονιμοποίηση είναι εμφανείς οι δύο προπυρήνες οι οποίοι στη συνέχεια συγχωνεύονται και ανταλλάσσουν χρωμοσωμικό υλικό παράγοντας ένα πλήρες συμπλήρωμα χρωμοσωματιδιακού υλικού που θα αποτελέσει το εμβρυικό γονιδίωμα (Εικόνα 8). Εικόνα 8. Ωρίμανση του ωαρίου. A. Το ωάριο στην αρχή της διαδικασίας. B. Έπειτα από τη δημιουργία της ατράκτου. Τα χρωμοσώματα τοποθετούνται στην ισημερινή ζώνη της ατράκτου σε τετράδες κάθε μία από τις οποίες αποτελείται από 2 δυάδες. C. Μία κορυφή της ατράκτου προβάλλεται σε μία προεξοχή της επιφάνειας και οι δυάδες μετακινήθηκαν προς τους πόλους D. Ο διαχωρισμός του πρώτου πολικού σωματίου E. Η απαρχή του δεύτερου πολικού σωματίου F. Η ολοκλήρωση του δεύτερου πολικού σωματίου. ( Τα επόμενα στάδια είναι κρίσιμα για την περαιτέρω ανάπτυξη του γονιμοποιημένου ωαρίου. Η διατήρηση ελεγχόμενων και σταθερών συνθηκών θερμοκρασίας είναι απαραίτητες για την αποφυγή θερμικού σοκ το οποίο θα μπορεί να αποβεί μοιραίο για την τύχη του εμβρύου. Για αυτό το λόγο ο έλεγχος του ζυγώτη λαμβάνει χώρα σε προκαθορισμένες χρονικές στιγμές, μεταξύ της 15ης με 20ης ώρας από την τοποθέτηση του σπέρματος. Η παρουσία δύο προπυρήνων και δύο πολικών σωματίων είναι ένδειξη φυσιολογική γονιμοποίησης. Σε περιπτώσεις όπου μόνο ένας μονο προπυρήνας είναι ορατός το ωάριο επανεξετάζεται μετά από 2 ώρες. Στις περιπτώσεις φυσιολογικής γονιμοποίησης ακολουθεί κυτταρική διαίρεση (ο φυσιολογικός ρυθμός διαίρεσης των ανθρώπινων εμβρύων είναι 4 κύτταρα σε 48 ώρες) και η πρόοδος του γονιμοποιημένου πια ωαρίου εξετάζεται και την δεύτερη ημέρα μετά την επιτυχημένη γονιμοποίηση. Ο μειωμένος ρυθμός διαίρεσης του ζυγώτου δύναται να έχει αρνητική επίπτωση στα ποσοστά εμφύτευσης, ενώ η επίπτωση αυξημένου ρυθμού διαίρεσης είναι ασαφής. 32

33 Εικόνα 9. Γονιμοποίηση του ωαρίου. Έλεγχος των ζυγωτών/εμβρύων Η εμφύτευση των εμβρύων γίνεται συνήθως τη δεύτερη/τρίτη μέρα μετά τη λήψη των ωαρίων και κατά την οποία τα έβρυα δύναται να βρίσκονται σε οποιοδήποτε στάδιο μεταξύ των 2 και 6 κυττάρων. Είναι προφανές ότι μόνο τα βέλτιστης ποιότητας έμβρυα είναι σκόπιμο να μεταφερθούν προκειμένου να αυξηθούν οι πιθανότητες εμφύτευσής τους. Αυτή η αξιολόγηση της ποιότητά τους γίνεται 24 ώρες μετά τη γονιμοποίηση και λίγο πριν την εμβρυομεταφορά. Στο αρχικό στάδιο του ζυγώτη η αξιολόγησή του περιλαμβάνει το μέγεθος των προπυρήνων, το σχήμα των προπυρήνων, τη ευθυγράμμιση των προπυρήνων καθώς και των νουκλεολίων που περιλαμβάνουν (αριθμός, μέγεθος, ευθυγράμμιση). Στο επόμενο στάδιο όπου ο ζυγώτης αρχίζει να διαιρείται εκτιμούνται παράγοντες όπως η ταχύτητα των κυτταρικών διαιρέσεων, το μέγεθος και το σχήμα των βλαστομεριδίων καθώς και η παρουσία εξωκυτταρικών «σπασιμάτων» (fragmentation) (Εικόνα 10). Τα έμβρυα καλής πρόγνωσης (τύπος Α) έχουν ισομερή βλαστομερίδια και δεν περιέχουν εξωκυτταρικά «σπασίματα», ή έχουν ισομερή βλαστομερίδια και περιέχουν εξωκυτταρικά «σπασίματα» τα οποία δεν ξεπερνούν το 20% του συνολικού εμβρυικού όγκου (τύπος Β). Τα έμβρυα τύπου C έχουν ανισομερή βλαστομερίδια και τα «σπασίματα» καταλαμβάνουν το 20%-50% του συνολικού εμβρυικού όγκου, ενώ τα έμβρυα τύπου D έχουν ανισομερή βλαστομερίδια και τα «σπασίματα» καταλαμβάνουν πάνω από 50% του συνολικού εμβρυικού όγκου. 33

34 Εικόνα 10. Σχεδιασμός συστήματος βαθμολόγησης ποιότητας του ζυγωτού και του εμβρύου A. Βαθμολόγηση ζυγωτού. Εξαρτάται από τρεις κύριους παράγοντες: (i) θέση των προπυρήνων, (ii) θέση και τύπων των πυρηνίσκων, (iii) κυτταροπλασματική μορφολογία. B. Μορφολογία εμβρύων. Η βαθμολογία εξαρτάται από τρεις κύριους παράγοντες: (iv) όγκος βλαστομεριδίου και συγχρονισμός διαίρεσης, (v) επίπεδο πολυνουκλεοποίησης, (vi) επίπεδο κατάτμησης (De et al. 2002). Δ. Μεταφορά εμβρύων Ο αριθμός των μεταφερόμενων εμβρύων αντιστοιχεί σε έναν αριθμό που επιτρέπει ένα επιθυμητό ποσοστό εγκυμοσύνης, με τη μικρότερη δυνατή πιθανότητα πολλαπλής κύησης. Οι κύριοι παράγοντες που φαίνεται να επηρεάζουν το ποσοστό των πολλαπλών κυήσεων είναι η ηλικία της ασθενούς, το ποσοστό γονιμοποίησης και η ποιότητα των εμβρύων. Σε κάθε μεταφορά πρέπει να λαμβάνονται αυτοί οι παράγοντες υπόψη. Πρακτικά, συνήθως μεταφέρονται 3 έμβρυα, εκτός εάν η γυναίκα είναι άνω των 40 ετών, οπότε επιτρέπεται η μεταφορά έως και 4 εμβρύων, λαμβάνοντας υπόψη τη μικρή πιθανότητα για πολλαπλή κύηση. Η εμβρυομεταφορά λαμβάνει χώρα τη 2η ή την 3η μέρα μετά την ωοληψία χωρίς να έχει παρατηρηθεί διαφορά στα ποσοστά εμφύτευσης (Εικόνα 11). Σε συγκεκριμένες μόνο 34

35 περιπτώσεις, η καλλιέργεια των εμβρύων μπορεί να παραταθεί έως και την 5η ή 6η ημέρα, με σκοπό να φτάσουν τα έμβρυα στο στάδιο της βλαστοκύστης. Σε αυτό το στάδιο, οι πιθανότητες εμφύτευσης είναι περισσότερες και με αυτόν τον τρόπο μπορεί να περιοριστεί ο αριθμός των μεταφερόμενων εμβρύων. Ωστόσο, με τα καλλιεργητικά υγρά που έχουμε ως τώρα στη διάθεσή μας λαμβάνουμε μόνο 40-50% των εμβρύων σε βλαστοκύστεις. Τα έμβρυα τοποθετούνται σε ένα καθετήρα και μεταφέρονται στη μήτρα. Ο καθετήρας που χρησιμοποιείται συχνότερα είναι ο καθετήρας FrydmanWallace (CCD). Οι παρυφές του τραχήλου καθαρίζονται με καλλιεργητικό υγρό ή φυσιολογικό ορό και μερικές φορές προ της εισαγωγής του καθετήρα εισάγεται ένας δοκιμαστικός καθετήρας που εξασφαλίζει ότι το πέρασμα θα πραγματοποιηθεί χωρίς δυσκολία. Ο καθετήρας περνά με προσοχή στην κοιλότητα της μήτρας, αποφεύγοντας επίσης την κορυφή της μήτρας. Ο καθετήρας συνδέεται με μία σύριγγα του 1ml που περιέχει καλλιεργητικό μέσο. Το ή τα έμβρυα τοποθετούνται στο άκρο του καθετήρα σε μία σταγόνα 300 μ L. Η τοποθέτηση των εμβρύων μπορεί να γίνει, τόσο στην ανώτερη όσο και στην κατώτερη μοίρα της μήτρας, με μία απλή πίεση του εμβόλου της σύριγγας, η οποία απελευθερώνει τα έμβρυα στην κοιλότητα της μήτρας. Στη συνέχεια πραγματοποιείται έλεγχος του καθετήρα από τον βιολόγο, για να επιβεβαιωθεί ότι τα έμβρυα δεν έχουν παραμείνει στα τοιχώματα του καθετήρα. Οι περισσότερες ομάδες προτείνουν την πραγματοποίηση της εμβρυομεταφοράς υπό υπερηχογραφικό έλεγχο, ενώ στη συνέχεια η ασθενής πρέπει να παραμείνει σε ύπτια θέση για τουλάχιστον 10 λεπτά. Την ημέρα της εμβρυομεταφοράς πραγματοποιείται έναρξη της συμπληρωματικής αγωγής με προγεστερόνη διακολπικά, προς υποστήριξη της ωχρινικής φάσης. Η υποστήριξη της ωχρινικής φάσης είναι πρωταρχικής σημασίας, γιατί τα υψηλά επίπεδα Ε2 μετά από την πρόκληση ωοθυλακιορρηξίας με γοναδοτροπίνες μπορεί να έχουν αρνητική επίδραση στο ωχρό σωμάτιο. Μελέτες έχουν δείξει ότι ένα έμβρυο που βρίσκεται σε πιο πρώιμο στάδιο ανάπτυξης από ότι θα αντιστοιχούσε in vivo έχει μεγαλύτερες πιθανότητες να εμφυτευθεί σε ένα ενδομήτριο περισσότερο ανεπτυγμένο κατά λίγες ημέρες, αλλά ο βαθμός ασυγχρονισμού δεν πρέπει να ξεπερνάει τις 1-2 ημέρες (παράθυρο εμφύτευσης). Η εμφύτευση του εμβρύου παραμένει το δυσκολότερο στάδιο της εξωσωματικής γονιμοποίησης. Από τα μεταφερόμενα έμβρυα, μόνο το 10-20% καταλήγουν σε επιτυχή εμφύτευση. Το τεστ εγκυμοσύνης (έλεγχος β- hcg) πραγματοποιείται τη 10η με 12η ημέρα μετά τη μεταφορά. 35

36 Εικόνα 11. Διαδικασία μεταφοράς εμβρύου ( Ε. Κατάψυξη Η δυνατότητα κατάψυξης των εμβρύων προτάθηκε πρώτη φορά το 1983, διότι αποδείχθηκε ότι τα έμβρυα που είχαν διατηρηθεί σε περιβάλλον υγρού αζώτου (-196ºC) διατηρούσαν τη δυνατότητα περαιτέρω εξέλιξης. Η διαδικασία της κατάψυξης ως μέθοδος συντήρησης εμβρύων/ωαρίων χρησιμοποιείται όλο και πιο συχνά (Andersen et al. 2012; Wallace 2011). Ωστόσο, πρέπει να επισημανθεί ότι δεν μπορούν να ανταπεξέλθουν όλα τα έμβρυα στις συνθήκες κατάψυξης/απόψυξης. Καταψύχοντας τα καλής ποιότητας έμβρυα, περίπου το 80% επιβιώνουν της διαδικασίας κατάψυξης/απόψυξης. Επιπλέον, τα ποσοστά κύησης των αποψυγμένων εμβρύων είναι χαμηλότερα. Ωστόσο η κατάψυξη των εμβρύων αποτελεί την καλύτερη εναλλακτική λύση έναντι της καταστροφής των υπεράριθμων εμβρύων που προκύπτουν από τη διέγερση και επιτρέπει να γεννηθούν στο μέλλον υγιή παιδιά. Τέλος, κατά τη μεταφορά των κατεψυγμένων εμβρύων χρησιμοποιούνται πιο απλά πρωτόκολλα από αυτά της κλασικής IVF, όπως φυσικός κύκλος, ήπια διέγερση των ωοθηκών ή ένας κύκλος υποκατάστασης κατά τον οποίο γίνεται συνεχής χορήγηση οιστρογόνου μαζί με προσθήκη προγεστερόνης κατά το δεύτερο μέρος του κύκλου (μίμηση του φυσιολογικού κύκλου). 36

37 1.4.3 Αποτυχία της Αγωγής Το θεραπευτικό πρωτόκολλο της IVF μπορεί να αποτύχει σε διάφορα στάδια. Η αγωγή μπορεί να διακοπεί κατά τη φάση της διέγερσης, λόγω εκσεσημασμένης απάντησης. Η διέγερση μπορεί επίσης να ακυρωθεί λόγω ασθενούς απάντησης. Έχει πολλαπλώς αποδειχθεί ότι τα ποσοστά εγκυμοσύνης συνδέονται άμεσα με την ποιότητα της ωοθηκικής απάντησης στη διέγερση. Σε περίπτωση ακατάλληλης ανταπόκρισης στην αγωγή, είναι προτιμότερο να ματαιωθεί ο κύκλος και να γίνει επανέλεγχος του ορμονικού προφίλ και τροποποίηση της αγωγής. Οι αποτυχημένες ωοληψίες είναι σπάνιες, αλλά μπορούν να λάβουν χώρα, ενώ μπορεί να προκύψει πρόβλημα στην πρόκληση της ωοθυλακιορρηξίας (πρόβλημα στη χορήγηση ή στην ποιότητα του χρησιμοποιούμενου σκευάσματος). Αποτυχία μπορεί να προκύψει κατά το στάδιο της γονιμοποίησης, και να είναι σπερματικής αιτιολογίας, ωαριακής αιτιολογίας, ή μεικτής αιτιολογίας. Η μικρο-έγχυση των σπερματοζωαρίων (ICSI) όπως στις περιπτώσεις σοβαρής παθολογίας του σπέρματος έχουν μειώσει σημαντικά την αποτυχία στο στάδιο της γονιμοποίησης. Η μη ανάπτυξη των εμβρύων μπορεί να λάβει χώρα, αλλά είναι σπάνια. Τέλος, το πιο συχνό φαινόμενο είναι η απουσία εμφύτευσης των εμβρύων. Αυτή μπορεί να οφείλεται σε αποβολή του εμβρύου αμέσως μετά τη μεταφορά, σε αίτια που έχουν σχέση με το έμβρυο ή με το ενδομήτριο, ή σε μία αποτυχία σε επίπεδο των πολύπλοκων μηχανισμών που λαμβάνουν χώρα κατά την εμφύτευση. 37

38 1.5 Πτωχή Ωοθηκική Απάντηση Στόχος της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής είναι η απόκτηση βιώσιμων εμβρύων σε περιπτώσεις υπογόνιμων ζευγαριών ή αδυναμίας φυσιολογικής σύλληψης. Ωστόσο, δυστυχώς υπάρχουν περιπτώσεις γυναικών που αντιδρούν πτωχά στο αρχικό στάδιο της ωοθηκικής ορμονικής διέγερσης με σημαντικά μειωμένο αριθμό αναπτυσσόμενων ωοθυλακίων κάτι που αποτελεί αρνητικό προγνωστικό παράγοντα εξαρχής της διαδικασίας της εξωσωματικής υποβοηθούμενης αναπαραγωγής. Μολονότι αυτές οι γυναίκες έχουν χαμηλότερα ποσοστά εγκυμοσύνης από τις «φυσιολογικές» απαντήτριες δεν υπάρχει επίσημος ορισμός για την «πτωχή» ή «μη» ή «χαμηλή» απαντήτρια και μέχρι σήμερα δεν υπάρχει ομοφωνία όσον αφορά στον ορισμό της πτωχής απαντήτριας (Surrey and Schoolcraft 2000), ούτε και στις μεθόδους που χρησιμοποιούνται για την πρόβλεψη της πτωχής απάντησης ή στην στρατηγική για την θεραπεία που θα ακολουθηθεί. Κατά γενική ομολογία η προχωρημένη ηλικία, η πρότερη πτωχή απάντηση σε διέγερση με γοναδοτροπίνες, η ανάκτηση λιγότερων των 3 ωοκυττάρων σε πρότερο κύκλο διέγερσης και τιμή οιστραδιόλης Ε2 <300 pg/ml την 5η ημέρα της διέγερσης θεωρούνται ως σοβαρές ενδείξεις πτωχής απάντησης. Παρόλ αυτά, σε πρόσφατα ανασκόπηση 47 κλινικών μελετών εδόθησαν 41 διαφορετικοί ορισμοί (Polyzos and Devroey 2011). Η πρώτη περιγραφείσα περίπτωση πτωχής απαντήτριας ανέφερε μέγιστη τιμή οιστραδιόλης Ε2 <300 pg/ml, πτωχή απάντηση ωοθηκών, λήψη μικρού αριθμού ωαρίων μετά από διέγερση και μικρό αριθμό μεταφερόμενων εμβρύων (Garcia et al. 1983). Ο χαμηλός αριθμός ώριμων ωαρίων δεν αποτελεί μόνο σημαντική αντένδειξη επιτυχημένης εγκυμοσύνης αλλά και ισχυρή αρνητική πρόγνωση για τους επόμενους κύκλους που θα ακολουθήσουν (Ferraretti et al, 2000). Γενικά, η επίπτωση της χαμηλής ωοθηκικής απάντησης υπολογίζεται μεταξύ 9 και 24% αντιπροσωπεύοντας ένα σημαντικό ποσοστό ασθενών που χρειάζονται ιδιαίτερη θεραπευτική προσέγγιση και αντιμετώπιση (Jenkins et al. 1991; Keay et al. 1997; Surrey and Schoolcraft 2000) και νέα στοιχεία δείχνουν ότι αυτό το ποσοστό αυξάνεται λόγω της ολοένα και αυξανόμενης ηλικίας σύλληψης των γυναικών (Leong and Patrizio 2010). Τα κριτήρια που χρησιμοποιούνται για το χαρακτηρισμό μιας γυναίκας ως πτωχής απαντήτριας είναι πλείστα (Surrey and Schoolcraft 2000; Tarlatzis et al. 2003), όπως: 38

39 1. Το μείζον κριτήριο είναι ο αριθμός των ώριμων ωοθυλακίων μετά από διέγερση και ο αριθμός των ληφθέντων ωαρίων (Busacca et al. 1996; Feldberg et al. 1994; Fridstrom et al. 1997; Land et al. 1996; Lindheim et al. 1996; Raga et al. 1999). Ο προτεινόμενος μέγιστος αριθμός ποικίλλει μεταξύ <3-5 ώριμα ωοθυλάκια την ημέρα της χορήγησης της hmg, αλλά η πλειοψηφία των συγγραφέων υποστηρίζουν <3 ώριμα ωοθυλάκια. Ορισμένοι λαμβάνουν υπόψη τον αριθμό των λαμβανομένων ώριμων ωαρίων (Chong et al. 1986; Rombauts et al. 1998; Surrey et al. 1998), 2. Σημαντικό κριτήριο επίσης αποτελεί η τιμή της FSH την 3η ημέρα όταν μετράται >7UI/ml ή, πιο συχνά, >15 UI/ml (Brzyski et al. 1988; Feldberg et al. 1994; Karande et al. 1990; Toth et al. 1996), 3. Εξίσου χρησιμοποιημένο κριτήριο αποτελεί η μέγιστη τιμή της αρχικής οιστραδιόλης Ε2, λόγω της πρόωρης αύξησης της FSH κατά την ωχρινική φάση (Kligman and Rosenwaks 2001) με όριο που κυμαίνεται μεταξύ <300 και <500pg/ml, ανάλογα με τον συγγραφέα (Ibrahim et al. 1991). Xαμηλότερες τιμές οιστραδιόλης, Ε2<100 pg/ml την 5η ημέρα της διέγερσης έχουν επίσης προταθεί (Schoolcraft et al. 1997), 4. Η προχωρημένη ηλικία της γυναίκας, > 40 ετών (Karande et al. 1990; Muasher 1993), 5. Η μέση χορηγούμενη ημερήσια δόση γοναδοτροπίνης >300IU/ημέρα (Busacca et al. 1996; Faber et al. 1998; Hofmann et al. 1989; Hughes et al. 1994), 6. Η ολική δόση γοναδοτροπινών ή συνολικός αριθμός χρησιμοποιούμενων αμπουλών >25 ή >44 αμπούλες (Shaker et al. 1992), 7. Η διάρκεια θεραπείας με γοναδοτροπίνες (Toth et al. 1996), 8. Η παρουσία ενός μοναδικού κυρίαρχου ωοθυλακίου μετά την ωοθηκική διέγερση (Surrey et al. 1998), 9. Η παρουσία πρόωρης έκλυσης LH (Benadiva et al. 1988; Lindheim et al. 1996), 10. Η ύπαρξη αρνητικού Clomid test (Navot et al. 1987) ή στο Lupron test (Katayama et al. 1988; Padilla et al. 1991). Ένας καθολικά αποδεκτός ορισμός για την πτωχή ωοθηκική απάντηση προτάθηκε από διάφορους ερευνητές (συναντίληψη-consensus) (Ferraretti et al. 2011) εφόσον τουλάχιστον δύο από τα τρία κριτήρια είναι παρόντα: α) προχωρημένη ηλικία της γυναίκας ( 40 ετών) ή ύπαρξη άλλου παράγοντα κινδύνου για πτωχή ωοθηκική απάντηση, 39

40 β) προηγούμενη πτωχή ωοθηκική απάντηση ( 3 ωοκύτταρα μετά από διέγερση των ωοθηκών), γ) μη φυσιολογική ωοθηκική εφεδρεία [αριθμός ωοθυλακίων με άντρο (AFC) <5-7 ή αντιμυλλέριος ορμόνη (ΑΜΗ) < ng/ml] (Ferraretti et al. 2011). Επίσης, ελλείψει της προχωρημένης ηλικίας της ή της μη φυσιολογικής ωοθηκικής εφεδρείας, επαρκούν δύο επεισόδια πτωχής ωοθηκικής απάντησης μετά από μέγιστη ωοθηκική διέγερση για να χαρακτηριστεί μια ασθενής ως πτωχή απαντήτρια. Αιτιολογία Στα αίτια της πτωχής ωοθηκικής απάντησης συμπεριλαμβάνονται η προχωρημένη ηλικία της γυναίκας (Akande et al. 2002), προηγηθείσα χειρουργική επέμβαση στις ωοθήκες (Nargund and Bromhan 1995), συμφύσεις στην περιοχή της πυέλου (Keay et al. 1998) και ο αυξημένος δείκτης μάζας σώματος (Loh et al. 2002) καθώς όμως και πιο απροσδόκητοι λόγοι (Keay et al. 1997), που δύναται να καταδεικνύουν πρόωρη ωοθηκική γήρανση (Nikolaou and Templeton 2003). Πολλαπλές είναι οι αιτίες που έχουν ενοχοποιηθεί για την κακή ωοθηκική απάντηση, αλλά ο πιο σημαντικός παράγοντας για αυτό το φαινόμενο είναι η μείωση της ωοθηκικής εφεδρείας/επάρκειας (Pellicer et al. 1998). Παρόλο που αυτοί οι ασθενείς αποτελούν ένα ετερογενές σύνολο, η πλειονότητα είναι γυναίκες άνω των 38 ετών με φυσιολογική μείωση του αποθέματος ωοθυλακίων και κατά συνέπεια μείωση των διαθέσιμων προς ωρίμανση ωοθυλακίων ύστερα από ωοθηκική διέγερση (Ferraretti et al. 2000) (Πίνακας 1). Μία σειρά ερευνών έχουν παρουσιάσει δεδομένα που καταδεικνύουν την επιτάχυνση της ωοθυλακικής ατρησίας λαμβάνει χώρα μεταξύ 36 και 38 χρονών και σχετίζεται με μείωση της γονιμότητας και αύξηση των πυρηνικών ανωμαλιών του ωαρίου (Hofmann et al. 1998) και γενικά μία ηλικιακά εξαρτώμενη επιτάχυνση της ωχρινοποίησης των ωοθυλακίων, που δικαιολογεί τις χαμηλές σε Ε2 μετά την διέγερση με FSH (Luborsky et al. 2002), αυξημένο ποσοστό κατακερματισμού σε ώριμα ποντίκια σε σύγκριση με τα πιο νεαρά (Fujino et al. 1996), ηλικιακά σχετιζόμενη αύξηση της εκφύλισης του χρωμοσωμιακού και μιτοχονδριακού DNA του ωοκυττάρου (Keefe et al. 1995). Παρόλ αυτά, πέρα από την ηλικιακά σχετιζόμενη αύξηση των ποσοστών πτωχής απάντησης είναι εξίσου αληθές ότι υπάρχουν περιπτώσεις νεαρών γυναικών με πρόωρη μείωση ωοθηκικής επάρκειας που σχετίζεται κυρίως με γενετικούς παράγοντες. Παρόλ αυτά, οι 40

41 νεαρές πτωχές απαντήτριες παρουσιάζουν καλύτερα ποσοστά εξελισσόμενης εγκυμοσύνης, γεγονός που πρέπει να λαμβάνεται υπόψη για την στρατηγική της θεραπείας (Check et al. 1998). 29χρ χρ χρ χρ. 44χρ. Αριθμός κύκλων Αριθμός ακυρωμένων κύκλων (%) 60(12%) 187(17%) 162(21%) 253(30%) 27(53%) Αριθμός ωαρίων/κύκλο 14.5±6 11.3±5 9.9± ±4.5 9±2 Πίνακας 1. Επίπτωση ακυρωμένων κύκλων σε σχέση με την ηλικία της γυναίκας σε ένα πρωτόκολλο απευαισθητοποίησης με αgnrh (στοιχεία S.I.S.M.E.R.), σύμφωνα με τον Ferraretti et al. (2000) (Ferraretti et al. 2000). Επιπρόσθετες πιθανές αιτίες ωοθηκικής ανεπάρκειας έχουν προταθεί οι οποίες δύναται να παίζουν κάποιο ρόλο, είτε ανεξάρτητα, είτε σε συνδυασμό στον τελικό φαινότυπο πτωχής απάντησης: 1. Υπάρχει κάποια υποψία ότι η μείωση του αριθμού των υποδοχέων της FSH στα κύτταρα της κοκκιώδους στοιβάδας παίζει κάποιο ρόλο σε αυτό το φαινόμενο (Zeleznik et al. 1981) παρόλο που άλλες μελέτες δείχνουν ότι η έκφραση των υποδοχέων των FSH και LH και η σύνδεση των ορμονών δεν παίζουν σπουδαίο ρόλο στην απάντηση μετά από διέγερση (Thiruppathi et al. 2001). 2. Ελλειμματική μετάδοση σήματος (signal transduction) μετά την σύνδεση της FSH με τον υποδοχέα, λόγω της μειωμένης ικανότητας πολλαπλασιασμό του σήματος από την έκκριση του IGF-1, εκ των κυττάρων της θήκης (Hernandez et al. 1992; Hugues and Cedrin Durnerin 1998). 3. Ύπαρξη αναστολέα του υποδοχέα της FSH στο ωοθυλακικό υγρό (Lee et al. 1993). 4. Επίδραση των πολυμορφισμών του υποδοχέα της FSH (FSHR SNP s) στην ωοθηκική ανταπόκριση μετά από διέγερση με FSH παρόλο που κάποιοι μελετητές υποστηρίζουν ότι αυτή η επίδραση μόνο συνδυαστικά με άλλους παράγοντες δύναται να παίζει κάποιον ρόλο (de et al. 2003), Συγκεκριμένα, ο πολυμορφισμός Ser680Asn εντοπίζεται πιο συχνά στις 41

42 καλές απαντήτριες (Loutradis et al. 2006) και μελέτες έχουν δείξει επίσης ότι ο πολυμορφισμός Ser/Ser σχετίζεται με πιο υψηλά αρχικά επίπεδα FSH και με ανάγκη χορήγησης μεγαλύτερων δόσεων γοναδοτροπινών (αμπούλες FSH) για την ωοθηκική διέγερση (Perez et al. 2000). 5. Αλλοιώσεις του τοπικού αγγειακού δικτύου για την διάχυση των ορμονών (Pellicer et al. 1994; Zeleznik et al. 1981). 6. Μείωση της βιολογικής δράσης του παράγοντα άμβλυνσης του κύματος των γοναδοτροπινών GnSAF (Martinez et al. 2002). 7. Ύπαρξη αντισωμάτων έναντι των κυττάρων της κοκκώδους στιβάδας, των ωοθηκών, των γοναδοτροπινών και της διάφανης ζώνης (zona pellucida) (Hovav et al. 1994; Luborsky et al. 2002; Meyer et al. 1990; Pellicer et al. 1998). 8. Αλλοίωση του σωματοτρόπου άξονα και ρόλος της αυξητικής ορμόνης (GH) στην ωοθηκική διέγερση (Pellicer et al. 1994; Salobir et al. 1996). 9. Επίδραση λοιμώξεων (πχ.πυελικές λοιμώξεις, ενδομητριώσεις) (Keay et al. 1998). Πρόβλεψη Η πρόβλεψη της ωοθηκικής απάντησης ενός κύκλου IVF θα ήταν ένα εργαλείο ανυπολόγιστης αξίας διότι βάσει αυτού θα μπορούσε να υπάρξει τροποποίηση των πρωτοκόλλων διέγερσης. Παρόλ αυτά, δεν υπάρχει κάποια 100% αξιόπιστη εξειδικευμένη εξέταση για την εκτίμηση της ωοθηκικής απάντησης (Broekmans et al. 2006), παρά μόνο καθίσταται δυνατό να εκτιμηθεί η ωοθηκική εφεδρεία. Πρακτικά, το ιδανικό τεστ παραμένει η ωοθηκική απάντηση στην διέγερση. Διάφοροι προγνωστικοί παράγοντες/δείκτες έχουν προταθεί, όπως η FSH, η οιστραδιόλη, η ινχιμπίνη Β και η αντιμυλλέριος ορμόνη (ΑΜΗ). Για παράδειγμα συγκεντρώσεις της FSH (6.5 < FSH < 15 ΙU/L) στον ορό την 3η ημέρα του εμμηνορρυσιακού κύκλου, και/ή επίπεδα οιστραδιόλης < 80 pg / ml σχετίζονται με μειωμένα ποσοστά εγκυμοσύνης (Muasher et al. 1988), ενώ επίπεδα FSH > 20 IU/L σε δύο τουλάχιστον κύκλους σχετίζονται με εξαιρετικά μικρή πιθανότητα επίτευξης εγκυμοσύνης (Martin et al. 1996). Η ινχιμπίνη Β επίσης, σε χαμηλά επίπεδα (< 45 pg/ml) την 3η ημέρα του εμμηνορρυσιακού κύκλου έχει συσχετιστεί με πτωχά αποτελέσματα ωοθηκικής διέγερσης (Seifer et al. 1997) καθώς,και της ΑΜΗ (de et al. 2002). Οι δοκιμασίες που χρησιμοποιούνται προκειμένου να αξιολογηθεί η πιθανότητα πτωχής απάντησης είναι : 42

43 1. Κλινική αξιολόγηση Πρόωρη έκκριση της FSH κατά την ωχρινική φάση (5-6 ημέρες πριν την έμμηνο ρύση αντί για το φυσιολογικό των 2-3 ημερών) οδηγεί σε βράχυνση των καταμήνιων κύκλων και είναι μία σημαντική ένδειξη μειωμένης ωοθηκικής επάρκειας. 2. Βιολογική αξιολόγηση FSH: Δείκτης άσχημης πρόγνωσης είναι η αυξημένη συγκέντρωση της FSH του ορού (>12 ή >15mUI/ml) την 2η ή 3η ημέρα του κύκλου (Cameron et al. 1988; Scott et al. 1989; Toner et al. 1991) ιδιαίτερα σε γυναίκες άνω των 38 ετών, απ ότι τις πιο νεαρές γυναίκες (Olivennes et al. 2006). Kλάσμα FSH/LH: Αποτελεί έγκυρο πρακτικό δείκτη του προβλεπόμενου όγκου των παραγόμενων ώριμων ωοθυλακίων (Ho et al. 2005; Mukherjee et al. 1996) και είναι αντιστρόφως ανάλογο με τον αριθμό των ώριμων ωοθυλακίων (FSH/LH 3). Οιστραδιόλη Ε2: Η αυξημένη συγκέντρωση της E2 του ορού (>30 ή >75pg/ml) την 2η ή 3η ημέρα του κύκλου σχετίζεται με την ποιότητα της ωοθηκικής έκκρισης (Licciardi et al. 1995). Επειδή όμως αυξημένες τιμές της E2 μειώνουν τεχνητά την FSH η μέτρηση της E2 πρέπει να πραγματοποιείται με ταυτόχρονη μέτρηση της FSH (Olivennes et al. 2006). Inhibin B: Τα επίπεδα της ινχιμπίνης Β είναι ανάλογα με τον αριθμό του συνόλου των ωοθυλακίων και των κυρίως των δευτερογενών ωοθυλακίων (παρουσία άντρου) και σχετίζονται με την επιλογή του κυρίαρχου ωοθυλακίου (Olivennes et al. 2006). Οι χαμηλές τιμές της (<45ng/ml) την 2η ή 3η ημέρα (Hall et al. 1999; Seifer et al. 1997), θεωρείται εξαιρετικά άσχημος προγνωστικούς παράγοντες. AMH: Εκκρίνεται από τα πρωτογενή ωοθυλάκια και ο προσδιορισμός της μπορεί να πραγματοποιηθεί σε οποιαδήποτε ημέρα του κύκλου, και έχει την καλύτερη συσχέτιση με την ποιότητα και ωρίμανση των ωοκυττάρων. (Fernandez, 2006). Χαμηλές τιμές της ΑΜΗ συχνά απαντώνται σε πτωχές απαντήτριες (van Rooij et al. 2003). GnSAF: Απαντάται σε χαμηλά επίπεδα σε γυναίκες με πτωχή ωοθηκική απάντηση (Martinez et al. 2002). Παράγοντας IGF-1: Ευρίσκεται σε χαμηλά επίπεδα στο ωοθυλακικό υγρό σε γυναίκες με πτωχή ωοθηκική απάντηση και έχει ρυθμιστική δράση στην στεροειδογένεση (Bahceci et al. 2007; Oosterhuis et al. 1998). Παράγοντας s-vegfr-1: Απαντάται σε υψηλά επίπεδα σε γυναίκες με πτωχή ωοθηκική απάντηση (Neulen et al. 2001). 43

44 3. Υπερηχογραφική αξιολόγηση Το υπερηχογράφημα αποτελεί ένα εξαιρετικό εργαλείο εκτίμησης της εφεδρείας των ωοθηκών, και, εμμέσως, της απάντησης στην ωοθηκική διέγερση, κυρίως λόγω της μη επεμβατικής του φύσης. Έχει χρησιμοποιηθεί στη διερεύνηση της σημασίας και συσχέτισης του ωοθηκικού όγκου και του αριθμού των δευτερογενών ωοθυλακίων με τα ποσοστά εγκυμοσύνης (Πίνακας 2). Να σημειωθεί ότι παρόλο που η εκτίμηση της ωοθηκικής επάρκειας μέσω της ωοθηκικής πυκνότητας είναι εφικτή μέσω λαπαροσκοπίας αυτή αντενδείκνυται αν δεν αποτελεί ένδειξη για την διερεύνηση της υπογονιμότητας (Lass et al. 1997). Παρόλη την ύπαρξη κάποιων μελετών που δείχνουν ξεκάθαρο συσχετισμό του ωοθυλακικού όγκου με τα ποσοστά εγκυμοσύνης (Lass et al. 1997; Syrop et al. 1995) είναι ακόμα ασαφές αν όντως και σε ποιές περιπτώσεις δύναται να συμβαίνει αυτό (Pellicer et al. 1998). Παρόλ αυτά, ο αριθμός των δευτερογενών ωοθυλακίων (διαμέτρου 2-5mm) φαίνεται ότι συσχετίζεται τα ποσοστά επιτυχίας της IVF (Bancsi et al. 2002; Chang et al. 1998) και έχει καλύτερη προγνωστική αξία σε ότι αφορά την πτωχή ωοθηκική απάντηση από ότι η ηλικία και οι ενδοκρινολογικοί δείκτες. 44

45 Συνολικός αριθμός Ωοθυλακίων με άντρο Αναμενόμενη απάντηση στην διέγερση με FSH <3 Πολύ χαμηλός αριθμός, πτωχή απάντηση στη διέγερση και πολύ πιθανή ακύρωση κύκλου. Μικρά ποσοστά επιτυχίας IVF Χαμηλά ποσοστά εγκυμοσύνης στους ολοκληρωμένους κύκλους. 3-5 Χαμηλός αριθμός, πιθανή πτωχή απάντηση στην διέγερση. Πολύ πιθανή χρήση υψηλών δόσεων FSH για την ωοθηκική διέγερση. Ποσοστό ακύρωσης κύκλου μεγαλύτερο του μέσου όρου. Ποσοστά εγκυμοσύνης σε ολοκληρωμένους κύκλους μικρότερο του μέσου όρου. 6-7 Μέτριος αριθμός. Ικανοποιητικά ποσοστά εγκυμοσύνης Μέσος αριθμός ωοθυλακίων με άντρο, πιθανή πολυ καλή απάντηση σε διέγερση. Πιθανή καλή απάντηση με σχετικά χαμηλές δόσεις FSH για την ωοθηκική διέγερση. Χαμηλό ποσοστό ακύρωσης κύκλου. Μικρός κίνδυνος για υπερδιέγερσης. Καλά ποσοστά εγκυμοσύνης. >15 Υψηλός αριθμός, προσοχή για ωοθήκες πολυκυστικού τύπου. Πιθανή καλή απάντηση με χαμηλές δόσεις FSH για την ωοθηκική διέγερση. Μεγαλύτερος κίνδυνος υπερδιέγερσης. Καλά ποσοστά εγκυμοσύνης. Πίνακας 2. Συσχέτιση μεταξύ του αριθμού των δευτερογενών ωοθυλακίων και του ποσοστού επιτυχίας της IVF. 45

46 Στρατηγικές αντιμετώπισης πτωχής ωοθηκικής απάντησης Η αντιμετώπιση των περιπτώσεων πτωχών απαντητριών βασίζεται στην εφαρμογή πρωτοκόλλων βασιζόμενα σε διαφορετικά είδη ή διαφορετική δοσολογία γοναδοτροπινών, GnRH αγωνιστών/ανταγωνιστών, διαφορετικών μεθόδων γονιμοποίησης και μεταφοράς εμβρύων (Madani et al. 2012; Vollenhoven et al. 2008). Συγκεκριμένα, έχουν προταθεί διάφορα πρωτόκολλα ωοθηκικής διέγερσης (Kyrou et al. 2009; Tarlatzis et al. 2003; Ubaldi et al. 2005) και έχει συνεκτιμηθεί η προσθήκη διαφόρων ουσιών, όπως αυξητικής ορμόνης (GH), της εκλυτικής ορμόνης της GH (GHRF), της πυριδοστιγμίνης και της L-αργινίνης προκειμένου να αυξηθούν τα ποσοστά επιτυχημένης κύησης. Η ανάγκη για εξατομίκευση των πρωτόκολλων διέγερσης έχει οδηγήσει σε ποικίλες θεραπευτικές προσεγγίσεις : 1. Υψηλή δόση γοναδοτροπινών Προοπτικές τυχαιοποιημένες μελέτες αυτών των πολυχρησιμοποιημένων πρωτοκόλλων (κυρίως στα flare-up πρωτόκολλα με GnRH αγωνιστές) που απαιτούν αρχικές δόσεις συνήθως UI/ημέρα δεν έδειξαν κάποιο πλεονέκτημα (van Hooff et al. 1993) ενώ υπάρχουν μεμονωμένες περιπτώσεις βελτίωσης των ποσοστών εγκυμοσύνης χρησιμοποιώντας υψηλές δόσεις (Hofmann et al. 1989). 2. Χρήση ανασυνδυασμένης FSH Η χρήση της ανασυνδυασμένης έναντι της κεκαθαρμένης FSH είναι πολύ αμφιλεγόμενη. Δυστυχώς, λόγω του μικρού μεγέθους των ερευνών δε δυνάμεθα να καταλήξουμε σε κάποιο αξιόπιστο συμπέρασμα όσον αφορά την αύξηση του αριθμού των λαμβανομένων ωαρίων και των ποσοστών εγκυμοσύνης. Δύο προοπτικές μελέτες (De et al. 2000; Raga et al. 1999) έδειξαν συσχέτιση της χρήσης ανασυνδυασμένης FSH με επιτυχημένη έκβαση της IVF αλλά γενικά δεν έχει αποδειχθεί ξεκάθαρα διαφορά ανάμεσα στη χρήση των δύο. 3. Έναρξη της FSH κατά την ωχρινική φάση Δυστυχώς η χρήση αυτού του πρωτοκόλλου που προέβλεπε έναρξη της FSH την 25η ημέρα του προηγούμενου κύκλου, ούτως ώστε να αυξηθεί ο αριθμός των ωοθυλακίων προς επιστράτευση (Rombauts et al. 1998) κατέληξε σε περισσότερους ακυρωμένους κύκλους, λιγότερα ωοκύτταρα, αυξημένο κόστος και πρόωρη ωοθυλακική ωρίμανση. 46

47 4. Αγωνιστές GnRH Επιμηκυσμένο πρωτόκολλο και διέγερση με γοναδοτροπίνες (standard πρωτόκολλο) Η καταστολή της ενδογενούς LH λόγω της χρήσης των αγωνιστών GnRH και κατά συνέπεια η αναστολή της πρόωρης ωχρινοποίησης των ωοκυττάρων οδηγεί στη μείωση των ακυρωμένων κύκλων και σε αύξηση των κλινικών εγκυμοσυνών. Δυστυχώς, στις περιπτώσεις πτωχών απαντητριών η προκληθείσα καταστολή είναι πάρα πολύ μεγάλη και συνεπώς δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί αυτό το ιδιαίτερα επιτυχημένο πρωτόκολλο (Horvath et al. 1988; Surrey and Schoolcraft 2000). 5. Αγωνιστές GnRH σε χαμηλή δόση Επιμηκυσμένο πρωτόκολλο και διέγερση με γοναδοτροπίνες, και 6. Αγωνιστές GnRH σε χαμηλή δόση Πρωτόκολλο έναρξης στην ωχρινική φάση (long) Επιμηκυσμένο διακεκομμένο και διέγερση με γοναδοτροπίνες Την αποτυχία του παραπάνω standard πρωτοκόλλου λόγω της ύπαρξης πλήρους καταστολής της ωοθηκικής απάντησης στην επακόλουθη διέγερση με εξωγενείς γοναδοτροπίνες προσπάθησαν να διορθώσουν αυτά τα δύο πρωτόκολλα. Η σύγκριση χρήσης διαφορετικών τύπων αγωνιστών GnRH δεν κατέδειξε κάποιο σημαντικό πλεονέκτημα κάποιου αγωνιστή (Schachter et al. 2001). Συγκεκριμένες μελέτες έδειξαν βελτίωση της ωοθηκικής απάντησης με χαμηλή δόση leuprolide acetate και διακοπή κατά τη διάρκεια της διέγερσης με γοναδοτροπίνες παρόλο που τα ποσοστά εμφύτευσης παρέμειναν χαμηλά (Faber et al. 1998; Pinkas et al. 2000) σε αντίθεση με τις τυχαιοποιημένες προοπτικές μελέτες των Dirnfeld et al (Dirnfeld et al. 1999) και Garcia-Velasco et al (Garcia- Velasco et al. 2000) που δεν επιβεβαίωσαν αυτά τα αποτελέσματα. Εφαρμογή αυτού του πρωτοκόλλου με τριπτορελίνη (triptoreline) σε προοδευτικώς μειωμένη (step down)δόση από την ωχρινική φάση μέχρι τη διέγερση είχε ως αποτέλεσμα λιγότερους ακυρωμένους κύκλους, υψηλότερα επίπεδα E2, περισσότερα λαμβανόμενα ωάρια και εμβρυομεταφορές καθώς και βελτιωμένα αλλά όχι στατιστικώς σημαντικά ποσοστά εγκυμοσύνης και εμφύτευσης (Feldberg et al. 1994). 7. Αγωνιστές GnRH : πρωτόκολλα flare-up (δόση standard) και micro-flare-up Σε αυτά τα πρωτόκολλα, ο αγωνιστής GnRH χορηγείται κατά την έναρξη της ωοθυλακικής φάσης (αντί για την ωχρινική φάση), αμέσως πριν την έναρξη της διέγερσης των ωοθηκών αποφεύγοντας την υπερβολική καταστολή των ωοθηκών. Ενθαρρυντικά ήταν τα αποτελέσματα των πρώτων μελετών με την standard δόση σε αγωνιστή GnRH όπου φάνηκε 47

48 μία ελάττωση των ακυρωμένων κύκλων και μία αύξηση των ποσοστών εγκυμοσύνης (Garcia et al. 1990; Howles et al. 1987; Katayama et al. 1988). Επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων ήρθε αργότερα (Toth et al. 1996) με μία συγκριτική μελέτη σύγκριση μεταξύ αυτού του πρωτοκόλλου και της έναρξης του αγωνιστή κατά την ωχρινική φάση, σε ασθενείς με FSH 15 UI/ml ενώ πολλοί μελετητές δεν μπόρεσαν να καταδείξουν την ύπαρξη πλεονεκτήματος αυτών των πρωτοκόλλων (Kondaveeti-Gordon et al. 1996; Loumaye et al. 1989; Padilla et al. 1996). Σύμφωνα με υποθέσεις ερευνητών τα πτωχά αποτελέσματα μπορούν να εξηγηθούν από το άμεσο αντίκτυπο που έχει ο αγωνιστής GnRH πάνω στην έκκριση της LH ][(διατήρηση των ωχρών σωματίων των προηγούμενων κύκλων (Surrey and Schoolcraft 2000). Βάσει αυτής της υπόθεσης πρωτόκολλα με μειωμένη δόση του αγωνιστή GnRH μειώθηκε που στην πλειοψηφία τους πραγματοποιήθηκαν σε σύγκριση με ένα μακρύ πρωτόκολλο με έναρξη στην ωχρινική φάση δεν παρουσίασαν ξεκάθαρα αποτελέσματα (Leondires et al. 1999; Schoolcraft et al. 1997; Scott and Navot 1994; Surrey et al. 1998). Υπάρχει μάλλον ανάγκη για πιο ευρείες, τυχαιοποιημένες προοπτικές μελέτες, ώστε να καταλήξουμε σε πιο απτά αποτελέσματα. 8. Πρωτόκολλα ανταγωνιστών GnRH Η αποτροπή πρόωρης αιχμής είναι η λογική πίσω από τη χρήση πρωτοκόλλων ανταγωνιστών GnRH στην υποβοηθούμενη αναπαραγωγή, σε συνδυασμό με τις γοναδοτροπίνες και γενικότερα δίνουν τη δυνατότητα για χρησιμοποίηση του μέγιστου αριθμού λαμβανομένων ωαρίων, χωρίς καταστολή από ανάλογα GnRH στους αντίστοιχους ωοθηκικούς υποδοχείς, κάτι που οδηγούσε σε καταστολή των ωοθηκών στο κρίσιμο στάδιο της επιστράτευσης των ωοθυλακίων. Δύο τύποι πρωτοκόλλων χρησιμοποιούνται σήμερα : α) πολλαπλών δόσεων, με τη χορήγηση μικρών δόσεων [250μg/ημέρα από την 6η ημέρα της διέγερσης (8η ημέρα του κύκλου) μέχρι την ημέρα της έκλυσης της ωοθυλακιορρηξίας] και β) μίας δόσης, όπου χορηγείται μία μοναδική δόση των 3mg στο τέλος της ωοθυλακικής φάσης (Olivennes et al. 2006). Παρόλο που τα αποτελέσματα όσο αφορά τα τελικά ποσοστά εγκυμοσύνης ήταν συγκρίσιμα με τα συνήθη πρωτόκολλα (flare-up ή ακόμα και χωρίς χρήση αγωνιστή) (Akman et al. 2001) αρχικά τα αποτελέσματα έδειχναν μειωμένο αριθμό λαμβανομένων ωαρίων ανά κύκλο. Γενικότερα η χρήση ανταγωνιστών GnRH είναι ενθαρρυντική (Copperman 2003), και έχει αυξηθεί τα τελευταία χρόνια ακόμα και σε φυσιολογικές απαντήτριες ενώ φαίνεται να υπάρχει μία ισοδυναμία αποτελεσματικότητας όσον αφορά τη χρήση αγωνιστών και 48

49 ανταγωνιστών (Craft et al. 1999). Πιο πρόσφατα, έχουν παρατηρηθεί διαφορές με τη χρήση ανταγωνιστών σε πτωχές απαντήτριες (περισσότερες εμβρυομεταφορές, μεγαλύτερος αριθμός λαμβανομένων ωαρίων) αλλά χωρίς κάποια αύξηση εγκυμοσυνών (Cheung et al. 2005; Malmusi et al. 2005; Marci et al. 2005). 9. Συνδυασμός των πρωτοκόλλων με GH ή GH-releasing factor (GHRF) ή πυριδοστιγμίνη Η υπόθεση είναι ότι η αυξητική ορμόνη GH διεγείρει την στεροειδογένεση στις ωοθήκες και την ανάπτυξη την ωοθυλακίων, μέσω του παράγοντα IGF-1, σε συνέργεια με την FSH. Συνήθως χορηγούνται 4-12 UI GH υποδορίως, κατά τη διέγερση. Η προσθήκη της αυξητικής ορμόνης έχει καταδειχθεί ότι επιδρά ευεργετικά στην επίτευξη εγκυμοσύνης (Kolibianakis et al. 2009; Kyrou et al. 2009; Venetis et al. 2010). Επίσης έχει παρατηρηθεί η ευεργετική δράση της προσθήκης πυριδοστιγμίνης (Kim et al. 1999). 10. Αγωγή πριν το πρωτόκολλο με οιστρογόνα/προγεσταγόνα (OP) Στόχος της χορήγησης OP (κυρίως μέσω χορήγησης αντισυλληπτικών) είναι η καταστολή ενδογενών γοναδοτροπινών και η αύξηση του αριθμού και της ευαισθησίας των υποδοχέων της FSH στα ωοθυλάκια μέσω των οιστρογόνων, από τη μείωση των επιπέδων της ενδογενούς FSH. Η χορήγηση οιστρογόνων και προγεσταγόνων εμποδίζει την παραγωγή της GnRH και, επομένως, των ορμονών που είναι υπεύθυνες για την ωοθυλακιορρηξία (FSH και LH). Επομένως δεν παρατηρείται ωοθυλακιορρηξία. Οταν η γυναίκα σταματήσει να παίρνει το χάπι ακολουθεί η εμμηνορρυσία. Το πρωτόκολλο απαιτεί τη χορήγηση από την 18η έως την 24η ημέρα OP με επακόλουθη διέγερση με FSH ή HMG, και αργότερα ανταγωνιστή GnRH στο τέλος της διέγερσης, όταν λαμβάνεται ένα ωοθυλάκιο >13 ή 14 mm (short microdosed). Τα αποτελέσματα ήταν ενθαρρυντικά (αύξηση των εγκυμοσυνών και μείωση των ακυρωμένων κύκλων) σε φυσιολογικές απαντήτριες (Biljan et al. 1998; Gonen et al. 1990) καθώς και σε πτωχές απαντήτριες (Lindheim et al. 1996) αλλά υπάρχουν και περιπτώσεις μη επιβεβαίωσης των παραπάνω πορισμάτων για τη χρησιμότητα αυτών των πρωτοκόλλων (Meldrum et al. 2009). 11. Πρωτόκολλο short microdosed με ανταγωνιστή GnRH, σε συνδυασμό με προκαταρτική αγωγή με προγεσταγόνα και Letrozole Πρόκειται για ένα ολοένα και πιο χρησιμοποιούμενο χαμηλής δόσης πρωτόκολλο που συνδυάζει έναν αναστολέα της αρωματάσης, όπως το Letrozole, με υψηλές δόσεις 49

50 γοναδοτροπινών και ανταγωνιστή GnRH οδηγώντας σε υψηλότερα επίπεδα τεστοστερόνης και ανδροστενδιόνης στο ωοθυλακικό υγρό, περισσότερα ωάρια, και καλύτερα ποσοστά εμφύτευσης (Garcia-Velasco et al. 2005). 12. Συνδυασμός με Κλομιφαίνη (Clomifene) ή Ταμοξιφένη (Tamoxifen) Η κιτρική κλομιφαίνη είναι συνθετικό, μη στεροειδές παράγωγο, με αντιοιστρογονικές ιδιότητες. Η κιτρική κλομιφαίνη, καταλαμβάνοντας τους υποδοχείς οιστρογόνων στην υπόφυση, προκαλεί την απελευθέρωση γοναδοτροπινών και, επομένως, διέγερση της ωοθήκης. Χορηγείται κατά τη ωοθυλακική φάση του κύκλου για πέντε μέρες, ξεκινώντας από τη δεύτερη μέρα του κύκλου (Kousta et al. 1997). Πληθώρα συγγραφέων δοκίμασαν να βελτιώσουν τα θεραπευτικά τους πρωτόκολλα προσθέτοντας κιτρική κλομιφαίνη (clomifene citrate), η οποία έχει την ίδια δράση με τους αναστολείς της αρωματάσης, δηλαδή αντιοιστρογονικές ιδιότητες που ασκούνται στο επίπεδο του υποθαλάμου (οιστρογονικοί υποδοχείς). Η Κλομιφένη έχει συνδυαστεί με ποικίλα πρωτόκολλα: γοναδοτροπίνες (Saadat et al. 2003) ή ανταγωνιστές GnRH (Craft et al. 1999). Τα αποτελέσματα δείχνουν μία βελτίωση, καθώς η κλομιφαίνη αποτελεί ένα πολύ ισχυρό ερέθισμα για την FSH, αλλά ο αριθμός των ωαρίων παραμένει αμετάβλητος, σε σύγκριση με ένα flare up πρωτόκολλο (Saadat et al. 2003). Πρέπει κανείς να αναφερθεί στις παρενέργειες της κλομιφαίνης στην τραχηλική βλέννη και στο ενδομήτριο, που μπορούν να την καταστήσουν λιγότερο αποτελεσματική από το letrozole, που δεν παρουσιάζει αυτές τις δράσεις. H Ταμοξιφένη είναι ουσία συγγενής της κιτρικής κλομιφαίνης με μερική αντιοιστρογονική δράση. Ανήκει στην κατηγορία των SERMS (Selective Estrogen Receptor Modulator) και διεγείρει την ωοθυλακιορρηξία με αντίστοιχο τρόπο, όπως και η κιτρική κλομιφαίνη. Χορηγείται, επίσης, για πέντε μέρες, ξεκινώντας από την 2η ή 3η μέρα του κύκλου και μπορεί να χρησιμοποιηθεί αντί της κλομιφαίνης και προτιμάται σε περίπτωση που η γυναίκα παρουσιάσει παρενέργειες από τη χρήση της τελευταίας. 13. Συνδυασμός με Κορτικοειδή Υπάρχουν ενδείξεις ότι η προσθήκη δεξαμεθαζόνης μπορεί να έχει άμεση επίδραση στην ωοθυλακική ανάπτυξη και την ωρίμανση του ωαρίου (μέσω της ισομορφής 11-β HSD) διά των κυττάρων της κοκκώδους στιβάδας και έμμεση επίδραση αυξάνοντας την GH του πλάσματος και την IGF-1 ενδο-ωοθυλακικά αυξάνοντας τα ποσοστά εγκυμοσύνης και μείωση των ακυρωμένων κύκλων (Keay et al. 2001). 50

51 14. Συνδυασμός με L-αργινίνη Υπάρχουν ενδείξεις ότι δύναται να αυξήσει των αριθμό των λαμβανομένων ωαρίων, να βελτιώσει τα ποσοστά εγκυμοσύνης και να μειώσει τα ποσοστά ακυρωμένων κύκλων μέσω πιθανών αγγειοδιασταλτικών ιδιοτήτων της με συνέπεια την αύξηση της κυκλοφορίας στο επίπεδο του ωοθυλακικού μικρο-περιβάλλοντος επηρεάζοντας την ωρίμανση του ωοθυλακίου (Battaglia et al. 1999). 15. Φυσικός κύκλος (αυθόρμητος) στην IVF Αυτή η μέθοδος είχε αρκετά επιτυχή αποτελέσματα (Bassil et al. 1999; Feldman et al. 2001) (Bassil et al. 1999) παρόλο που υπάρχουν μελέτες που δεν φαίνεται να συνηγορούν ως προς κάποια από τα συμπεράσματα (Bar-Hava et al. 2000). Είναι μία στρατηγική αντιμετώπισης με λιγοστές μελέτες στις πτωχές απαντήτριες αλλά έχει σημαντικά πλεονεκτήματα διότι είναι λιγότερο επεμβατική και αρκετά οικονομική. Υπήρξαν επίσης μελέτες που κατέληξαν σε συγκρίσιμα αποτελέσματα με τους κύκλους υπό διέγερση (Feldman et al. 2001). 16. Προετοιμασία αγωγής με διαδερμική τεστοστερόνη Τα ανδρογόνα πρωτοχορηγήθηκαν ως αγωγή για τις ωοθήκες το 2005 (Garcia-Velasco et al. 2005) βάσει παλαιών μελετών του Hillier et al (Hillier et al. 1994) και του Weil et al (Weil et al. 1998) οι οποίοι κατέδειξαν το ρόλο των ανδρογόνων στην ανάπτυξη των πρωτογενών και δευτερογενών ωοθυλακίων (antral και preantral). Αυτό επιβεβαιώθηκε και πειραματικά αργότερα όπου η χρήση τους φάνηκε να είναι ευνοϊκή στην αύξηση των αριθμών των ωαρίων και εμβρυομεταφορών κατά την θεραπεία με τεστοστερόνη για 15 ημέρες πριν την διέγερση με FSH (Massin et al. 2006) καθώς και σε πρωτόκολλα χορήγησης 5 μόνο ημερών (Balasch et al. 2006). 51

52 1.6 O ρόλος των ανδρογόνων και των τροποποιητών των ανδρογόνων στην ωοθυλακική ανάπτυξη Η χορήγηση ανδρογόνων ή τροποποιητών των ανδρογόνων πριν ή κατά τη διάρκεια διέγερσης των ωοθηκών προκειμένου να μεγιστοποιήσουμε τα αποτελέσματα της εξωσωματικής γονιμοποίησης στις πτωχές απαντήτριες είναι μία πρόσφατη κατεύθυνση διερεύνησης η οποία όμως χρήζει περαιτέρω διερεύνησης. Η συγκέντρωση των ανδρογόνων στο μικρο-περιβάλλον της ωοθήκης έχει αναφερθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην πρώιμη ωοθυλακική ανάπτυξη, στη διαφοροποίηση και τον έντονο πολλαπλασιασμό των κοκκωδών κυττάρων και γενικότερα στη φυσιολογία των ωοθηκών (Vendola et al. 1998; Weil et al. 1999; Weil et al. 1998). Πειραματικές μελέτες κατέδειξαν ότι τα ανδρογόνα έχουν θετική επίδραση στην ωοθυλακική ανάπτυξη, αυξάνοντας την ευαισθησία των ωοθηκών στη δράση της FSH (Weil et al. 1999; Weil et al. 1998) επάγοντας την αύξηση του αριθμού των υποδοχέων FSH στα κοκκιώδη κύτταρα οδηγώντας έτσι σε αύξηση της ευαισθησίας των κυττάρων στην FSH και διεγείροντας τα μικρά ωοθυλάκια επάγοντας μια σημαντική αύξηση του αριθμού των αρχέγονων και πρωτογενών ωοθυλακίων (Vendola et al. 1999; Vendola et al. 1998), ενώ δρουν αρνητικά στα προωορρηκτικά ωοθυλάκια (Harlow et al. 1988) Φυσιολογία των Ανδρογόνων Η προέλευση των κυκλοφορούντων ανδρογόνων στη γυναίκα είναι η ωοθήκη, τα επινεφρίδια και κάποιοι περιφερικοί ιστοί (Εικόνα 12). Η συνολική παραγωγή ανδρογόνων στις γυναίκες είναι 71% της ποσότητας που παρατηρείται στους άνδρες (Labrie et al ;Labrie et al ). Η βιοσυνθετική οδός των ανδρογόνων είναι ίδια στις ωοθήκες και στα επινεφρίδια. Όμως, ενώ το καθοριστικό για την στεροειδογένεση ένζυμο διασπάσεως της πλευρικής αλυσίδας της χοληστερίνης, το κυτόχρωμα Ρ-450 (P-450scc), στα κύτταρα της ωοθήκης ελέγχεται από την LH, στα επινεφριδικά κύτταρα της δικτυωτής ζώνης ελέγχεται από την φλοιοτρόπο ορμόνη (ACTH), χωρίς να αποτελεί και τον μόνο ρυθμιστικό παράγοντα για την επινεφριδική παραγωγή ανδρογόνων. Η ωοθήκη παράγει ένα αρκετά μεγάλο ποσοστό των κυκλοφορούντων στο γυναικείο σώμα ανδρογόνων. Οι στεροειδείς ορμόνες της ωοθήκης ονομάζονται γεννητικές ορμόνες (sex hormones) και εξυπηρετούν κυρίως τη λειτουργία της αναπαραγωγής, αλλά ασκούν και 52

53 σημαντική βιολογική επίδραση στα λοιπά συστήματα του οργανισμού. Παράγει το 50% της κυκλοφορούσας Δ4-ανδροστενδιόνη (Abraham 1974), το 25% της τεστοστερόνης και ἐνα 10-20% της δεϋδροεπιανδροστερόνης (DHEA). Τα στεροειδή αυτά παράγοντα από τα κύτταρα της έσω θήκης και από τα διάμεσα (interstitial) κύτταρα του στρώματος του ωοθυλακίου. Οι συγκεντρώσεις αυτών των μεταβολιτών μεταβάλλονται κατά διάρκεια του κύκλου (Judd and Yen 1973), ανάλογα με την στεροειδογενετική τους δραστηριότητα. Εικόνα 12. Κατανομή των ανδρογόνων, τεστοστερόνη (ΤESTO), διϋδροτεστοστερόνη (DHT), δεϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA), και διάφορων άλλων μεταβολιτών στο αίμα και στους περιφερικούς ιστούς στη γυναίκα (Labrie et al. 1993). 53

54 Η δικτυωτή ζώνη του φλοιού των επινεφριδίων είναι κυρίως υπεύθυνη για την παραγωγή του 90% της κυκλοφορούσας ποσότητας της δεϋδροεπιανδροστερόνης (DHEA) (Abraham 1974) καθώς και του θειικού της παραγώγου, DHEA-S, το οποίο το παράγει σχεδόν εξ ολοκλήρου λόγω της μοναδικής παρουσίας σε αυτά τα κύτταρα του ενζύμου στεροειδική σουλφοτρανσφεράση το οποίο μετατρέπει την δεϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA) στο θειικό παράγωγο αυτής, θειική δεϋδροεπιαδροστερόνη (DHEA-S). Παράγει επίσης σημαντικότατες ποσότητες Δ4-ανδροστενδιόνη (50% της κυκλοφορούσας) και τεστοστερόνης (25% της κυκλοφορούσας). Σε αντίθεση με τον ωοθηκικό κύκλο, η επινεφριδική παραγωγή ανδρογόνων εμφανίζει ημερήσια διακύμανση (μέγιστες τιμές τις πρωινές ώρες και ελάχιστες τιμές την νύχτα), εξαιτίας της ρύθμισης της παραγωγής αυτής από την ACTH. Η επινεφριδιακή έκκριση της DHEA και DHEA-S παρουσιάζει μέγιστο στην ηλικία των χρόνων, ενώ στη συνέχεια οι τιμές αρχίζουν να μειώνονται σημαντικά (Belanger et al. 1994; MIGEON et al. 1957; Orentreich et al. 1984; Vermeulen et al. 1982) και σε ηλικίες άνω των 60 τα επίπεδα της DHEA-S στον ορό μειώνονται περίπου στο 20% της υψηλότερης τιμής τους, και τελικά φτάνουν στο 5% στις ηλικίες μεταξύ χρόνων (MIGEON et al. 1957). Η μείωση της τάξης του 70-95% στο σχηματισμό της DHEA και DHEA-S από τα επινεφρίδια κατά τη διάρκεια της γήρανσης, έχει ως αποτέλεσμα τη δραματική μείωση στο σχηματισμό οιστρογόνων και ανδρογόνων στους περιφερικούς ιστούς-στόχους, που θα μπορούσε να ευθύνεται για την παθογένεια ασθενειών που σχετίζονται με τη γήρανση. Η σταθερή πτώση στην εκκριτική δραστηριότητα μετά την ηλικία των ετών πιθανότατα λόγω τροποποιήσεως της δραστηριότητας 17,20-λυάσης του P-450cl7 (Liu et al. 1990; Schiebinger et al. 1981) ή λόγω μειωμένης μάζας της δικτυωτής ζώνης με την πάροδο της ηλικίας (Parker, Jr. et al. 1997). Πέρα από την ωοθήκη και τα επινεφρίδια, αρκετοί περιφερικοί ιστοί όπως ο λιπώδης ιστός, ο μυϊκός ιστός, το ήπαρ, το δέρμα και εξαρτήματα αυτού (τριχοθυλάκια, σμηγματογόνοι αδένες), τα έξω γεννητικά όργανα, διαθέτουν ενζυμικούς μηχανισμούς (3ß-HSD, 17ß-HSD, P-450cl7 και 5α-αναγωγάση) για την μετατροπή των ασθενέστερων ανδρογόνων DHEA, DHEA-S και Δ4-ανδροστενδιόνη (Horton 1992; Labrie 1991), σε δραστικά ανδρογόνα τεστοστερόνη και διϋδροτεστοστερόνη (DHT) καθώς και ικανότητα αρωματοποίηση των ανδρογόνων σε οιστρογόνα (κυρίως της Δ4-ανδροστενδιόνης σε οιστρόνη και λιγότερο της τεστοστερόνης σε οιστραδιόλη). Παρόμοια δραστικότητα αρωματάσης υπάρχει και στα κύτταρα της ωοθήκης. Η παραγωγή γεννητικών στεροειδών ορμονών στους περιφερικούς 54

55 ιστούς είναι εξαιρετικής σημασίας (Labrie 1991; Labrie et al. 1985). Ο μετασχηματισμός της DHEA και DHEA-S σε ανδρογόνα και οιστρογόνα στους ιστούς-στόχους εξαρτάται από το επίπεδο έκφρασης των διαφόρων στεροειδογόνων και μεταβολικών ενζύμων σε κάθε έναν από αυτούς τους ιστούς. Η σύνθεση ενεργών στεροειδών από την DHEA στους περιφερικούς ιστούς στόχους έχει το πλεονέκτημα ότι η ορμονική δράση εξασκείται στα ίδια κύτταρα όπου λαμβάνει χώρα και η σύνθεσή τους, χωρίς διάχυση των ενεργών στεροειδών στον εξωκυττάριο χώρο και στη γενικότερη κυκλοφορία (Labrie, 1991). Μηχανισμός Δράσης-Βιοσυνθετικός Κύκλος της DHEA Ο μηχανισμός δράσης της DHEA (Εικόνα 13) παραμένει γενικά άγνωστος. Πρόσφατα διαπιστώθηκε ότι η DHEA μπορεί να εξασκεί πολλές από τις δράσεις της με άμεση πρόσδεσή της στον υποδοχέα ανδρογόνων (AR) και ER (Martin et al. 2004; Tan et al. 1997). Έχει αναφερθεί ότι κάτω από συνθήκες που αποκλείουν τη μετατροπή της DHEA σε κάποιο μεταβολίτη της αυτή έχει μεγαλύτερη ικανότητα πρόσδεσης στον ERβ απ ότι στον ERα και τον AR (Chen et al. 2005). Επίσης διαπιστώθηκε ότι εξασκεί κυρίως ανταγωνιστικές δράσεις στον AR (Chen et al. 2005), αγωνιστικές δράσεις στον ERβ και μια μέτρια αγωνιστική δράση στον ERα εκτός πάντα της δυνατότητάς της να δράσει μέσω της μετατροπής της σε ισχυρά ανδρογόνα και οιστρογόνα. Εικόνα 13. Χημική δομή της DHEA 55

56 Έχει υπολογιστεί ότι περίπου το 50% των συνολικών ανδρογόνων στον προστάτη των ενήλικων ανδρών προέρχεται από την DHEA και την DHEA-S (Belanger et al. 1994; Labrie et al. 1993; Labrie et al. 1985). Στις γυναίκες, τα οιστρογόνα που συντίθενται από την DHEA/S στους ειδικούς ιστούς-στόχους είναι της τάξης του 75% του συνόλου των οιστρογόνων πριν την εμμηνόπαυση και περίπου 100% μετά την εμμηνόπαυση (Labrie 1991). Η σύνθεση των ανδρογόνων και οιστρογόνων από την DHEA εμπλέκει διάφορα ένζυμα όπως η 3β-υδροξυστεροειδική δεϋδρογενάση (3β-HSD), η 17β-υδροξυστεροειδική δεϋδρογενάση (17β-HSD), η 5α-αναγωγάση και η αρωματάση. Η 3β-HSD-1 εκφράζεται στους κλασικούς στεροειδoγόνους ιστούς (πλακούντας, φλοιός των επινεφριδίων, ωοθήκες, όρχεις) καθώς και σε άλλους περιφερικούς ιστούς όπως το δέρμα, ο λιπώδης ιστός, ο μαστός, ο προστάτης, ο εγκέφαλος (Labrie et al. 1992; Martel et al. 1994; Milewich et al. 1993; Pelletier et al. 1992) και καταλύει τον μετασχηματισμό της DHEA σε 4-dione (Εικόνα 14). Η 3β HSD-1 εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη και καταλύει επίσης την οξείδωση των 3β υδρόξυ- σε 3-κετο-5α-ανδροστανο στεροειδή (Huang and Luu-The 2001). Η αντίστροφη αναγωγική αντίδραση καταλύεται από ένα άλλο ένζυμο, την 3(α β) υδροξυστεροειδική επιμεράση [3(α β)-hsε] (Huang and Luu-The 2000; Huang and Luu-The 2001) και από τη 17β-HSD τύπου 7. Έχει επίσης βρεθεί και ένας δεύτερος τύπος του ενζύμου (3β-HSD 2) που εκφράζεται στα επινεφρίδια και στους γεννητικούς αδένες του ανθρώπου (Rheaume et al. 1991). Τα ένζυμα τύπου 17β-HSD είναι υπεύθυνα για το σχηματισμό και την απενεργοποίηση όλων των ενεργών ανδρογόνων και οιστρογόνων. Οι τύποι 1, 3, 5, 7, 12 και 13 καταλύουν τις αναγωγικές αντιδράσεις ενώ οι τύποι 2, 4, 6, 8 τις οξειδωτικές. Συγκεκριμένα, ο τύπος 1 είναι κυτταροπλασματική πρωτεΐνη που συναντάται σε ομοδιμερή μορφή και καταλύει κυρίως τη μετατροπή της Ε1 σε Ε2 (Dumont et al. 1992) και της DHEA σε 5-diol. Ο τύπος 5, συνθέτει τεστοστερόνη από την 4-dione όπως και ο τύπος 3 αλλά στους περιφερικούς ιστούς-στόχους στους άντρες και στις γυναίκες (π.χ στο μαζικό αδένα) όπως επίσης και στις ωοθήκες. Ο τύπος 3 της 17β-HSD εκφράζεται κυρίως στους όρχεις όπου καταλύει τη σύνθεση της τεστοστερόνης από την 4-dione. Ο τύπος 6 καταλύει την οξείδωση της 3α-diol σε ανδροστερόνη (ADT). Η μετατροπή και άλλων C19 στεροειδών όπως της DHT σε Α-dione και της τεστοστερόνης σε 4-dione καταλύεται επίσης από αυτό το ένζυμο αλλά με περίπου φορές χαμηλότερο ρυθμό. Ο τύπος 4 μετατρέπει επίσης την Ε2 σε Ε1 και την 5-diol σε DHEA (Adamski et al. 1995; Leenders et al. 1994). 56

57 Έχει υπολογιστεί ότι περίπου το 50% των συνολικών ανδρογόνων στον προστάτη των ενήλικων ανδρών προέρχεται από την DHEA και την DHEA-S (Labrie et al., Bélanger et al., 1986 Labrie et al., 1993). Στις γυναίκες, τα οιστρογόνα που συντίθενται από την DHEA/S στους ειδικούς ιστούς-στόχους είναι της τάξης του 75% του συνόλου των οιστρογόνων πριν την εμμηνόπαυση και περίπου 100% μετά την εμμηνόπαυση (Labrie, 1991) (Σχ.1). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, η σύνθεση των ανδρογόνων και οιστρογόνων από την DHEA εμπλέκει διάφορα ένζυμα όπως η 3β-υδροξυστεροειδική δεϋδρογενάση (3β-HSD), η 17β-υδροξυστεροειδική δεϋδρογενάση (17β-HSD), η 5α-αναγωγάση και η αρωματάση. Εικόνα 14. Βιοσύνθεση ανδρογόνων και οιστρογόνων από την Δεϋδροεπιανδροστερόνη. DHEA, δεϋδροεπιανδροστερόνη, 5-diol, 5 ανδροστενο-3β-17β-διόλη, 4-dione, 4- ανδροστενο-3,17-διόνη, Τ, τεστοστερόνη, DHT, διϋδροτεστοστερόνη, Ε1, οιστρόνη, Ε2, 17β-οιστραδιόλη, A-dione, 5α-ανδροστανο-3,17-διόνη, 3α-diol, 5α-ανδροστανο-3α,17βδιόλη, 3β-diol, 5α-ανδροστανο-3β,17β-διόλη, ADT, ανδροστερόνη ή 5α-ανδροστανο-3α-όλη- 17-όνη, epi-adt, επιανδροστερόνη ή 5α-ανδροστανο-3β-όλη-17-όνη, Ε1-S, θειική οιστρόνη, HSD, υδροξυστεροειδική δεϋδρογενάση, 3(α β)-hse, 3(α β) υδροξυστεροειδική επιμεράση, RoDH-1, Ro δεϋδρογενάση 1, ER, υποδοχέας οιστρογόνων, AR, υποδοχέας ανδρογόνων, UGT2B28, τρανσφεράση της γλουκουρονικής ουριδίνης 2B28, Sult2B1, σουλφοτρανσφεράση 2Β1, 3α-diol-G, γλουκουρονική 3α-diol, κλπ. (Labrie et al. 2005) Ο τύπος 4 εκφράζεται ουσιαστικά σε όλους τους ιστούς του ανθρώπου όπως ήπαρ, καρδιά, προστάτης, όρχεις, ωοθήκες, πλακούντας και σε ορισμένες μόνο καρκινικές σειρές μαστού. Αντίθετα, ο τύπος 7 καταλύει επιλεκτικά τη μετατροπή της Ε1 σε Ε2 (Nokelainen et al., 1998). Έχει ανιχνευθεί στις ωοθήκες, μαστό, πλακούντα, όρχεις, προστάτη και ήπαρ. Ο τύπος 2 της 17β-HSD εντοπίζεται στις μεμβράνες του ενδοπλασματικού δικτύου και καταλύει τη μετατροπή της Ε2 σε Ε1, της τεστοστερόνης σε 4-dione και της 5-diol σε DHEA. O τύπος 8 μετατρέπει επιλεκτικά την Ε2 σε Ε1. Ο τύπος 12 καταλύει επίσης τη μετατροπή της Ε1 σε Ε2 ενώ ο τύπος 13 καταλύει τη μετατροπή της 4-dione σε Τ, της A-dione σε DHT, της ADT σε 3α-diol και της epi-adt σε 3β-diol (Liu et al. 2005). 57