ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Σηματοδοτικοί μηχανισμοί κατά την απόπτωση και την κυτταροφαγία στα αιμοκύτταρα της μύγας της Μεσογείου ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Ειρήνη Mάμαλη ΠΑΤΡΑ, ΙΟΥΝΙΟΣ 2008

2 Τριμελής συμβουλευτική επιτροπή Μαρμάρας Βασίλης, Καθηγητής Λαμπροπούλου Μαρία, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Κατσώρης Παναγιώτης, Αναπληρωτής Καθηγητής Επταμελής εξεταστική επιτροπή Μαρμάρας Βασίλης Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Λαμπροπούλου Μαρία Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Κατσώρης Παναγιώτης Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Δημόπουλος Νικόλαος Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Λάζου Αντιγόνη Καθηγήτρια Τμήμα Βιολογίας Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης Ισίδωρος Μπέης Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών Μαρίνα Καρακάντζα Επίκουρος Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Η έγκριση διδακτορικής διατριβής από τη Σχολή Θετικών Επιστημών του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1932 άρθρο 202

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γενικά περί εντόμων H Ceratitis capitata Άμυνα και ανοσοποιητικό σύστημα Εγγενές (μη ειδικό) και επίκτητο (ειδικό) ανοσοποιητικό σύστημα Το αμυντικό σύστημα των εντόμων Η ορολογική απόκριση των εντόμων Η κυτταρική απόκριση των εντόμων o Προαιμοκύτταρα o Κοκκιοκύτταρα o Πλασματοκύτταρα o Οινοκυτοειδή o Σφαιροκύτταρα Η διαδικασία της αιματοποίησης στη Drosophila melanogaster Ρόλος-Δράση των αιμοκυττάρων o Συσσωμάτωση των αιμοκυττάρων o Κυτταροφαγία o Κυτταρική εγκύστωση και σχηματισμός οζιδίων o Επούλωση πληγών Αναγνώριση εισβολέων Ορολογικοί υποδοχείς αναγνώρισης προτύπου (ορολογικοί PRRs) Κυτταρικοί υποδοχείς αναγνώρισης προτύπου (κυτταρικοί PRRs) o Το μονοπάτι Toll o Το μονοπάτι Imd o Oι ιντεγκρίνες Αναγνώριση άλλων στόχων Μεταγωγή σήματος Γενικά o Τα μηνυματοφόρα μόρια και οι τύποι κυτταρικής επικοινωνίας o Οι υποδοχείς της κυτταροπλασματικής μεμβράνης Μόρια που συμμετέχουν στην ενδοκυτταρική μεταβίβαση μηνυμάτων o Δεύτερα μηνύματα o Ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες Ενδοκυτταρικοί οδοί μεταβίβασης μηνυμάτων o Η οδός του camp o Η οδός του cgmp o Η οδός των IP3 και Ca 2+ o Οδός των PI3-K/Akt o Οι οδοί των ΜΑΡΚ o H οδός JAK-STAT o Οδοί απόπτωσης και επιβίωσης Κινάσες ενεργοποιούμενες από μιτογόνα: Σύστημα MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinases) κινασών Γενικά Ενεργοποίηση των ΜΑΡΚs Η αλληλουχία γεγονότων σε μια τυπική MAPK οδό-οργάνωση και εξειδίκευση MAPK οδοί θηλαστικών

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ o Οδός των κινασών που ρυθμίζονται από εξωκυτταρικά σήματα (Extracellular signal Regulated Kinase, ERK1/2) o Η p38 οδός o JNK/SAPK (c-jun N - terminal protein kinases) οδός (JNK1, JNK2 και JNK3) ERK3, ERK5 και ERK7 o ERK3 o ERK5 o ERK7 MAPK Οδοί: Η μεταγωγή σημάτων στα έντομα Ιντεγκρίνες Γενικά Ιντεγκρίνες στα έντομα Μεταγωγή σήματος από τις ιντεγκρίνες Κινάσες τυροσίνης πρωτεϊνών Γενικά Η κινάση των εστιών προσκόλλησης (FAK) o Γενικά o o o o o o o Δομή Μόρια που αλληλεπιδρούν με την FAK και την ενεργοποιούν Αμινοτελική περιοχή της FAK Τυροσίνη 397: θέση αυτοφωσφορυλίωσης και πρόσδεσης SH2 περιοχών Μέλη της οικογένειας Src PI3K κινάση Κεντρική (καταλυτική) περιοχή της FAK Καρβοξυτελική περιοχή της FAK και FAT περιοχή Grb2 p130 cas Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις της FAK Pyk2: ένα άλλο μέλος της οικογένειας FAK Συντήρηση δομής και λειτουργίας του μορίου της FAK κατά την εξέλιξη Ρύθμιση της FAK Ενεργοποίηση της FAK από ιντεγκρίνες Μεταβίβαση ιντεγκρινικών σημάτων μέσω της FAK Λειτουργικός ρόλος της FAK Κυτταρική προσκόλληση και επέκταση Κυτταρικός πολλαπλασιασμός FAK και απόπτωση Μετανάστευση κυττάρων o Ενεργοποίηση της FAK από μη ιντεγκρινικά σήματα o Συμβολή της FAK στην κυτταροφαγία της E.coli από τα αιμοκύτταρα του εντόμου C.capitata Απόπτωση Απόπτωση-Νέκρωση Οδοί απόπτωσης και επιβίωσης o Η εξωγενής οδός απόπτωσης o Η ενδογενής οδός απόπτωσης Απόπτωση και κυτταροφαγία των αποπτωτικών σωμάτων Απόπτωση στα ασπόνδυλα: Μια συντηρημένη διαδικασία

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Καλλιέργεια του εντόμου Ceratitis capitata o Eνήλικα άτομα o Προνυμφικά στάδια Απομόνωση και καλλιέργεια αιμοκυττάρων o Απομόνωση αιμοκυττάρων o Λύση κυττάρων o Μονόστοιβα αιμοκυττάρων Καλλιέργεια ΗΚ-2 κυττάρων o Ανακαλλιέργεια κυττάρων o Συλλογή πρωτεϊνικού εκχυλίσματος από κυτταροκαλλιέργεια ΗΚ-2 κυττάρων Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών Ηλεκτροφόρηση o Ηλεκτροφόρηση πολυακρυλαμιδίου (PAGE) SDS-PAGE (SDS PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) Ανοσοαποτύπωμα Απομάκρυνση αντισωμάτων (stripping) Ανοσοϊστοχημεία Καλλιέργεια βακτηρίων E. coli o Σήμανση των βακτηρίων Escherichia coli με FITC Ανοσοκατακρήμνιση (Immunoprecipitation) Ανοσοεντοπισμός πρωτεϊνών με μικροσκοπία φθορισμού o Άµεσος ανοσοφθορισµός o Έµµεσος ανοσοφθορισµός Σήμανση αννεξίνης V και ιωδιούχου προπιδίου (PI) Κυτταρομετρία ροής (Flow Cytometry) Μέτρηση κυτταροφαγίας της E.coli Η τεχνική αποσιώπησης του RNA Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμερισμού αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμερισμού (Polymerase Chain Reaction, PCR) Ηλεκτροφόρηση πηκτώματος αγαρόζης Παραγωγή FAK dsrna Οσμωτική ένθεση αντισωμάτων στα αιμοκύτταρα της C. capitata Απομόνωση πυρήνων ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Μέθοδος TUNEL (TdT-mediated dutp biotin nick end-labelling) Κλωνοποίηση DNA σε πλασμιδιακό φορέα Απομόνωση πλασμιδιακού DNA ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ενότητα Α: Απόπτωση Απόπτωση στα αιμοκύτταρα κατά την ανάπτυξη της μύγας της Mεσογείου Απόπτωση των αιμοκυττάρων από εξωγενή χημικά ή φυσικά ερεθίσματα o Αναστολείς της πρωτεϊνοσύνθεσης (κυκλοεξαμίδιο, ανισομυκίνη) επάγουν την απόπτωση o Επίδραση του λιποπολυσακχαρίτη (LPS) και της σταυροσπορίνης στην απόπτωση

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ o Θερμοκρασιακό σοκ και απόπτωση Σηματοδοτικά μονοπάτια και απόπτωση κατά την ανάπτυξη o Έκφραση και φωσφορυλίωση των σηματοδοτικών μορίων FAK, ERK, Src, PI-3K p85a, και Akt κατά την ανάπτυξη o Συμμετοχή των σηματοδοτικών μορίων FAK, Src, ERK, PI-3K, και Akt στην απόπτωση Αποσιώπηση της FAK στα αιμοκύτταρα της Drosophila melanogaster και της Ceratitis capitata Αποσιώπηση της FAK στα αιμοκύτταρα της Ceratitis capitata κατά την αναπτυξιακά ρυθμιζόμενη απόπτωση Συμμετοχή των σηματοδοτικών μορίων Src, ERK, PI-3K, και Akt, στην διαδικασία της αναπτυξιακά ρυθμιζόμενης απόπτωσης o Έκφραση και φωσφορυλίωση των σηματοδοτικών μορίων ERK, PI-3K, Akt, Src και FAK κατά την απόπτωση Ενότητα Β: Κυτταροφαγία Σηματοδοτικά μονοπάτια και κυτταροφαγία o Ενεργοποίηση των MAP κινασών και της Src μέσω της FAK κατά την κυτταροφαγία στα αιμοκύτταρα o Ιντεγκρίνες και κυτταροφαγία Πιστοποίηση της έκφρασης ομολόγων των β υπομονάδων των ιντεγκρινών των θηλαστικών καθώς και της βps της Drosophila melanogaster στα αιμοκύτταρα της C.capitata Αποσιώπηση της έκφρασης ομολόγων των β υπομονάδων των ιντεγκρινών των θηλαστικών και της βps της Drosophila melanogaster και κυτταροφαγία βακτηρίων E. coli από τα αιμοκύτταρα της Ceratitis capitata Μεταγωγή σήματος από τις ιντεγκρίνες o Συμμετοχή του μεταγραφικού παράγοντα Elk-1 στην κυτταροφαγία Έκφραση του Elk-1 στα αιμοκύτταρα της C. capitata Ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα Elk-1 κατά την κυτταροφαγία στα αιμοκύτταρα Ρύθμιση της κυτταροφαγίας από το μεταγραφικό παράγοντα Elk-1 Ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα Elk-1 μέσω των FAK/Src και MAP κινασών κατά την κυτταροφαγία στα αιμοκύτταρα Κατανομή και αλληλεπίδραση των σηματοδοτικών μορίων FAK και Elk-1 o Αιμοκύτταρα της Ceratitis capitata Αλληλεπίδραση των σηματοδοτικών μορίων FAK και Elk-1 στα αιμοκύτταρα της Ceratitis capitata o Επιθηλιακά κύτταρα του εγγύς εσπειραμένου σωληναρίου του ανθρώπινου νεφρώνα (ΗΚ-2 κύτταρα) Κατανομή FAK, Elk-1 και των φωσφορυλιωμένων μορφών τους στα ΗΚ-2 κύτταρα Η γλυκόζη επάγει τη φωσφορυλίωση των ΜΑΡ κινασών, FAK και Elk-1 στα HK-2 κύτταρα Αλληλεπίδραση των σηματοδοτικών μορίων FAK και Elk-1 στα HK-2 κύτταρα Ο μεταγραφικός παράγοντας Elk-1 ρυθμίζει την έκφραση των FAK και MAPKs στα ΗΚ-2 κύτταρα o Ο μεταγραφικός παράγοντας Elk-1 ρυθμίζει την απόπτωση στα HK-2 κύτταρα ΣΥΖΗΤΗΣΗ

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γενικά περί εντόμων Τα έντομα αποτελούν την πολυπληθέστερη ομάδα οργανισμών πάνω στη γη με πάνω από είδη. Η εξάπλωσή τους είναι ευρεία, καταλαμβάνοντας σχεδόν κάθε οικολογικό θώκο του πλανήτη. Παρουσιάζουν διακριτά στάδια ανάπτυξης και σχετικά μικρό κύκλο ζωής, γεγονός που τα καθιστά ως ιδανικά πειραματικά συστήματα για τους ερευνητές προκειμένου να προσδιοριστούν οι μηχανισμοί που αφορούν τη μορφογένεση, τη διαφοροποίηση και τη λειτουργία βασικών βιολογικών συστημάτων, όπως για παράδειγμα του ανοσοποιητικού. Η μελέτη του ανοσοποιητικού συστήματος των εντόμων αποσκοπεί στη διαλεύκανση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην κυτταρική και ορολογική ανοσία, καθώς επίσης και στον προσδιορισμό των μορίων που είναι υπεύθυνα γι αυτές. Μια τέτοια ερευνητική προσπάθεια μπορεί να συμβάλει καταλυτικά στη μελέτη της εξέλιξης του ανωτέρω συστήματος σε διάφορες κατηγορίες οργανισμών όπως επίσης και στα θηλαστικά, με τα οποία τα έντομα παρουσιάζουν σημαντικές ομοιότητες τόσο στη βιοχημεία όσο και στη φυσιολογία τους. Πέραν όμως της σημαντικής συμβολής των εντόμων στην πρόοδο της βασικής έρευνας, η εκτενής μελέτη τους κρίνεται απαραίτητη καθότι η πολυπληθής αυτή ομάδα οργανισμών αποτελεί έναν απ τους κυριότερους «εχθρούς» των γεωργικών καλλιεργειών, επιφέροντας τεράστιες καταστροφές με ανάλογες οικονομικές επιπτώσεις, ενώ ακόμα πολλοί εκπρόσωποί της μπορούν να απειλήσουν άμεσα τη δημόσια υγεία, δρώντας ως φορείς διαφόρων επικίνδυνων ασθενειών. Για την εκπόνηση των παραπάνω ερευνητικών μελετών χρησιμοποιούνται ολομετάβολα έντομα, τα οποία χαρακτηρίζονται από περιορισμένου χρόνου κύκλο ζωής με διακριτά μορφολογικά στάδια ανάπτυξης. H Ceratitis capitata Στο εργαστήριο της Βιολογίας Κυττάρου έχει επιλεγεί σαν πειραματόζωο μελέτης το ολομετάβολο έντομο Ceratitis capitata (εικόνα 1), γνωστό ως μύγα της μεσογείου ή μύγα των φρούτων. Ανήκει στην τάξη Δίπτερα και στην οικογένεια των Τεφριτίδων (Πίνακας 1) (Grzimek, 1975). Αποτελεί ένα από τα πιο καταστροφικά παράσιτα φρούτων σε ολόκληρο τον κόσμο. Λόγω της ευρείας εξάπλωσής της, της ικανότητας επιβίωσης σε ψυχρότερα κλίματα από ότι άλλα είδη μυγών φρούτων, και του μεγάλου εύρους ξενιστών, η Ceratitis capitata κατατάσσεται πρώτη ανάμεσα στα οικονομικά σημαντικά είδη μυγών φρούτων. Παρασιτεί Εικόνα 1: Ceratitis capitata σε περισσότερα από 260 διαφορετικά είδη φρούτων, λουλουδιών, λαχανικών και καρπών, με μεγαλύτερη προτίμηση στα λεπτόσαρκα, ώριμα και σαρκώδη φρούτα. Οι εκάστοτε ξενιστές ποικίλουν ανάλογα με τις αντίστοιχες γεωγραφικές περιοχές. Οι κυριότερες περιοχές εξάπλωσης του εντόμου είναι οι χώρες της ευρύτερης περιοχής της Μεσογείου, η Λατινική και η Βόρειος Αμερική καθώς και η Αυστραλία και το νησιωτικό σύμπλεγμα της Χαβάη (Vargas, 1983). 2

10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 1 Συνομοταξία Ομοταξία Διαίρεση.. Υποδιαίρεση.. Υπέρταξη... Τάξη... Υπόταξη Υπεροικογένεια Οικογένεια Γένος. Είδος. Αρθρόποδα Έντομα Πτερυγωτά Ενδοπτερυγωτά Μεκοπτεροειδή Δίπτερα Βραχύκερα(μύγες) Σχιζόφορα Τεφριτίδες Ceratitis Ceratitis capitata, Ceratitis rosa... Άμυνα και ανοσοποιητικό σύστημα Το ανοσοποιητικό σύστημα είναι ένα από τα σημαντικότερα συστήματα για κάθε οργανισμό. Συνιστά την πρώτη γραμμή άμυνας του οργανισμού ενάντια σε εισβολείς, όπως είναι οι ιοί, τα βακτήρια και οι μύκητες. Είναι υπεύθυνο για την αναγνώριση και εξουδετέρωση των μικροοργανισμών που απειλούν τον οργανισμό καθημερινά, για την καταστολή των μολύνσεων καθώς και για την εξάλειψη καρκινικών κυττάρων που εμφανίζονται συχνά σε ιστούς και όργανα του σώματος. Οι διαταραχές και οι ανεπάρκειες που δυνατόν να παρουσιάσει το ανοσοποιητικό σύστημα εμπλέκονται στη γένεση πολλών ασθενειών συμπεριλαμβανομένου και του καρκίνου. Προκειμένου να αντεπεξέλθουν οι οργανισμοί στις αυξημένες αμυντικές τους ανάγκες, έχουν αναπτύξει μια πλειάδα μηχανισμών για την αναγνώριση και εξουδετέρωση των παθογόνων. Ακόμα και οι πιο απλοί μονοκύτταροι οργανισμοί, όπως τα βακτήρια, διαθέτουν ενζυμικά συστήματα για την προστασία τους από ιικές μολύνσεις. Άλλοι βασικοί ανοσοποιητικοί μηχανισμοί αναπτύχθηκαν για πρώτη φορά σε πρωτόγονους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και παραμένουν ακόμα στους σύγχρονους απογόνους τους, όπως στα φυτά, στα ψάρια, στα ερπετά και στα έντομα. Στους μηχανισμούς αυτούς περιλαμβάνονται τα αντιμικροβιακά πεπτίδια που ονομάζονται ντιφενσίνες, η κυτταροφαγία και το σύστημα του συμπληρώματος. Πιο εξελιγμένοι όμως μηχανισμοί αναπτύχθηκαν σχετικά πρόσφατα με την εξέλιξη των σπονδυλωτών. Το ανοσοποιητικό σύστημα των σπονδυλωτών καθώς και του ανθρώπου αποτελείται από πολλά είδη πρωτεϊνών, κυττάρων, ιστών και οργάνων, που αλληλεπιδρούν μεταξύ τους στα πλαίσια μιας ιδιαίτερα πολύπλοκης και δυναμικής ανοσοαπόκρισης. Το ανοσοποιητικό σύστημα των σπονδυλωτών, ως πιο εξελιγμένο, έχει την ικανότητα να προσαρμόζεται και να αναγνωρίζει συγκεκριμένα παθογόνα πιο αποτελεσματικά. Η διαδικασία της προσαρμογής δημιουργεί ανοσολογική μνήμη, επιτρέποντας την πιο αποτελεσματική προστασία του οργανισμού απέναντι στο ίδιο παθογόνο στο μέλλον. Το ανοσοποιητικό σύστημα των σπονδυλωτών, λοιπόν, στα πλαίσια μιας ανοσοαπόκρισης διαθέτει την ικανότητα να αναγνωρίζει και να αντιδρά στην παρουσία εισβολέων ως εξής: 1) η αντίδραση του οργανισμού είναι πάντα προσαρμοσμένη, 2) υπάρχει υψηλή εξειδίκευση, 3) έχει μεγάλης διάρκειας μνήμη, και 4) παρουσιάζει επιλεκτικότητα, διακρίνοντας τα βιομόρια του ίδιου του οργανισμού από τους ξένους παράγοντες. Εγγενές (μη ειδικό) και επίκτητο (ειδικό) ανοσοποιητικό σύστημα Το ανοσοποιητικό σύστημα διακρίνεται στο εγγενές (μη ειδικό) και στο επίκτητο (ειδικό) ανοσοποιητικό σύστημα. Το εγγενές ανοσοποιητικό σύστημα συνίσταται από διάφορους κυτταρικούς τύπους και μηχανισμούς (μηχανικούς, χημικούς και βιολογικούς φραγμούς) που προστατεύουν τον οργανισμό από τη μόλυνση του από παθογόνους παράγοντες με μη-ειδικό τρόπο. Δηλαδή, τα κύτταρα του εγγενούς ανοσοποιητικού συστήματος αναγνωρίζουν και αποκρίνονται στα παθογόνα με μη εξειδικευμένο («γενικό») τρόπο και σε αντίθεση με το 3

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ επίκτητο ανοσοποιητικό σύστημα, δεν παρέχεται ανοσία στον ξενιστή. Παρέχει άμεσα προστασία ενάντια των παθογόνων και συναντάται σε όλες τις τάξεις του φυτικού και ζωικού βασιλείου. Πιο αναλυτικά, το εγγενές ανοσοποιητικό σύστημα περιλαμβάνει: 1) φυσικούς και ορολογικούς φραγμούς, όπως τα επιθήλια και η βλέννα που τα καλύπτει, η οποία περιέχει και αντιβακτηριακές ουσίες (ντιφενσίνες), 2) τα φαγοκύτταρα (ουδετερόφιλα, μονοκύτταρα και μακροφάγα) και τα κύτταρα-φυσικοί «δολοφόνοι» (natural killer cells, NK), 3) πρωτεΐνες του αίματος, στις οποίες περιλαμβάνονται οι πρωτεΐνες του συμπληρώματος και μόρια που μεσολαβούν στις αντιδράσεις (Nappi et al., 2004) και 4) διάφορες κυτταροκίνες που συντονίζουν πολλές από τις δραστηριότητες των κυττάρων που συμμετέχουν στην εγγενή ανοσία (Bodian et al., 2004; Ottaviani et al., 2004). Κύριες λειτουργίες του εγγενούς ανοσοποιητικού συστήματος των σπονδυλωτών είναι: α) η παραγωγή χημικών παραγόντων (κυτταροκίνες) που «επιστρατεύονται» (ή προσελκύονται) στα σημεία της μόλυνσης ή της φλεγμονής από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, β) η ενεργοποίηση του συστήματος του συμπληρώματος προκειμένου να αναγνωριστούν τα βακτήρια-εισβολείς και να επιστρατευτούν τα ειδικά κύτταρα ώστε να απομακρύνουν τα νεκρά κύτταρα ή τα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος, γ) η αναγνώριση και απομάκρυνση ξένων συστατικών που βρίσκονται στα όργανα, στους ιστούς, στο αίμα και στη λέμφο με τη βοήθεια των λευκών αιμοσφαιρίων και δ) η ενεργοποίηση του επίκτητου ανοσοποιητικού συστήματος. Σε αντίθεση με το εγγενές ανοσοποιητικό σύστημα, το επίκτητο, οι αποκρίσεις του οποίου πυροδοτούνται με έκθεση σε μολυσματικούς παράγοντες, χαρακτηρίζεται από εξαιρετική ικανότητα διάκρισης ανάμεσα σε διαφορετικά, ακόμα και πολύ παρόμοια μικρόβια ή μόρια. Επίσης, χαρακτηρίζεται από μνήμη («θυμάται» κάθε παθογόνο με τη βοήθεια κάποιου χαρακτηριστικού του αντιγόνου) και αυξανόμενη ένταση και αποτελεσματικότητα σε επαναλαμβανόμενες εκθέσεις στον ίδιο μικροοργανισμό. Τα συστατικά του επίκτητου ανοσοποιητικού συστήματος είναι τα T και B λεμφοκύτταρα που είναι υπεύθυνα για την κυτταρική ανοσία και την παραγωγή αντισωμάτων, αντίστοιχα. Οι ξένες ουσίες που επάγουν τις ειδικές ανοσολογικές αποκρίσεις ή είναι οι στόχοι τέτοιων αποκρίσεων καλούνται αντιγόνα (Delves and Roitt, 2000; Janeway and Medzhitov, 2002). Το επίκτητο ανοσοποιητικό σύστημα συναντάται μόνο στα σπονδυλωτά. Το αμυντικό σύστημα των εντόμων Τα έντομα είναι διαρκώς εκτεθειμένα σε παθογόνους μικροοργανισμούς (προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς) και παράσιτα. Προκειμένου, λοιπόν, να αντεπεξέλθουν σ' αυτή τη μεγάλη απειλή του εκάστοτε περιβάλλοντός τους έχουν αναπτύξει ένα περίπλοκο σύστημα άμυνας, το οποίο περιλαμβάνει μηχανισμούς που μόλις τα τελευταία χρόνια έχουν αρχίσει να μελετώνται διεξοδικά. Το αμυντικό σύστημα των εντόμων είναι σαφώς πιο πρωτόγονο σε σύγκριση με το ανοσοποιητικό σύστημα των σπονδυλωτών, αφού δε χαρακτηρίζεται ούτε από μνήμη ούτε από εξειδίκευση, αλλά παρόλα αυτά είναι ικανό τόσο να αναγνωρίσει όσο και να αμυνθεί έναντι ξένων παραγόντων. Την πρώτη γραμμή άμυνας για τα έντομα αποτελεί το περίβλημα του επιδερμιδίου, το οποίο λόγω της ακαμψίας και της σκληρότητάς του λειτουργεί ως φυσικός φραγμός για τους εισβολείς. Το επιδερμίδιο είναι επίσης η θέση όπου, όπως θα αναλυθεί στη συνέχεια, συμβαίνουν οι πρώτες ανοσοαποκρίσεις. Η περίπτωση μόλυνσης αντιμετωπίζεται από τους εσωτερικούς ιστούς με δύο μηχανισμούς : 1) με ορολογική απόκριση (humoral defence), που απαιτεί τη συμμετοχή εξειδικευμένων πρωτεϊνών και 2) με κυτταρική απόκριση (cellural defence), που πραγματοποιείται με τη βοήθεια κυττάρων. 1) Κατά την ορολογική απόκριση εκκρίνονται διάφορες αντιβακτηριακές πρωτεΐνες, πεπτίδια και ένζυμα (Hoffmann, 2003; Janeway and Medzhitov, 2002; Lowenberger, 2001), που όμως διαφέρουν τελείως από τις ανοσοσφαιρίνες, που εκκρίνονται από τα σπονδυλωτά, τόσο στη δομή όσο και στη λειτουργία, ενεργά παράγωγα οξυγόνου και 4

12 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αζώτου (Bogdan et al., 2000; Nappi and Ottaviani, 2000) και ένζυμα που ρυθμίζουν την πήξη της αιμολέμφου και τη μελανογένεση (Gillespie et al., 1997). Τα κυριότερα ένζυμα που συμμετέχουν στην ορολογική απόκριση των εντόμων είναι η λυσοζύμη και η φαινολοξειδάση. Η φαινολοξειδάση είναι επιπλέον το ένζυμο που ευθύνεται για τη μελανογένεση και τη σκλήρυνση του περιβλήματος. Ενώ στις κυριότερες αντιβακτηριακές πρωτεΐνες συγκαταλέγονται οι λεκτίνες, οι αττακίνες, οι διπτερσίνες, οι ντιφενσίνες και οι κεκροπίνες. 2) Η κυτταρική απόκριση των εντόμων παρουσιάζει σημαντικές ομοιότητες με την κυτταρική ανοσία των σπονδυλωτών. Στη διαδικασία αυτή συμμετέχουν τα αιμοκύτταρα μέσω της συσσωμάτωσης, της κυτταροφαγίας, της εγκύστωσης και του σχηματισμού οζιδίων (Nappi et al., 2004; Schmidt et al., 2001). Η διάκριση σε ορολογικές και κυτταρικές αποκρίσεις είναι ως ένα σημείο αυθαίρετη, καθώς πολλοί ορολογικοί παράγοντες επηρεάζουν τη λειτουργία των αιμοκυττάρων και τα αιμοκύτταρα αποτελούν σημαντική πηγή αρκετών ορολογικών παραγόντων. Επιπλέον, παρατηρείται εκτεταμένη αλληλοεπικάλυψη σε διαδικασίες όπως η αναγνώριση των εισβολέων. Τα αιμοκύτταρα αναγνωρίζουν ένα ξένο οργανισμό ή μεγαλομόριο είτε άμεσα, μέσω των υποδοχέων της επιφάνειας τους που αλληλεπιδρούν με μόρια του ξένου οργανισμού, είτε έμμεσα, αναγνωρίζοντας ορολογικούς υποδοχείς που έχουν προσδεθεί και οψωνινοποιήσει την επιφάνεια του εισβολέα (Lavine and Strand, 2002). Η ορολογική απόκριση των εντόμων Ο μηχανισμός αυτός ενεργοποιείται σε περίπτωση που πραγματοποιηθεί κάποια μόλυνση, με αποτέλεσμα να παράγονται και να εκκρίνονται στην αιμολέμφο διάφορες αντιβακτηριακές πρωτεΐνες, πεπτίδια και ένζυμα, τα οποία όμως διαφέρουν τελείως από τις ανοσοσφαιρίνες των σπονδυλωτών τόσο στη δομή, όσο και στη λειτουργία. Το λιπαρό σώμα αποτελεί τον ιστό που είναι κυρίως υπεύθυνος για τη σύνθεση των πρωτεϊνών αυτών. Σε μικρότερο ποσοστό συνεισφέρουν τα αιμοκύτταρα και άλλοι ιστοί όπως τα περικαρδιακά κύτταρα, τα μαλπιγγιανά σωληνάρια και το μεσέντερο (Hoffmann, 1995). Η ταξινόμηση των εκκρινόμενων μορίων σε επιμέρους οικογένειες γονιδίων έχει γίνει βάσει των ομοιοτήτων που παρουσιάζονται στις αλληλουχίες τους. Η ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός νέων αντιβακτηριακών πεπτιδίων και πρωτεϊνών αποτελεί σήμερα ένα ερευνητικό πεδίο με έντονη δραστηριότητα, λόγω της πιθανής χρησιμότητας των μορίων αυτών και ως αντιβιοτικών. Τα κυριότερα ένζυμα που συμμετέχουν στην ορολογική απόκριση των εντόμων είναι : Η λυσοζύμη, ένα βασικό θερμοανθεκτικό ένζυμο μοριακού βάρους 14-16,5 kda. Πρόκειται για μια γλυκοσιδάση, η οποία προκαλεί λύση των βακτηρίων υδρολύοντας το γλυκοζιτικό δεσμό β(1 4) με τον οποίο συνδέονται τα αμινοσάκχαρα Ν-ακετυλομουραμικό οξύ και Ν- ακετυλογλυκοζαμίνη στο κυτταρικό τοίχωμα των βακτηρίων. Η φαινολοξειδάση, είναι ένα ένζυμο που παίρνει μέρος στην άμυνα των εντόμων, και στη μελανογένεση και σκλήρυνση του επιδερμιδίου και συμμετέχει στο σύστημα προφαινολοξειδάσης (ppo)-φαινολοξειδάσης (PO). Οι φαινολοξειδάσες είναι από τα πλέον σημαντικά ένζυμα της ορολογικής απόκρισης. Περιέχουν χαλκό και καταλύουν την οξείδωση μονοφαινολών και διφαινολών, όπως επίσης και τη μετατροπή των κατεχολαμινών σε κινόνες. Κάποιες κινόνες σχηματίζουν μελανίνη, ενώ άλλες διασυνδέουν τις πρωτεΐνες. Οι φαινολοξειδάσες κατατάσσονται σε δύο κατηγορίες : Στις τυροσινάσες, οι οποίες εντοπίζονται στα αιμοκύτταρα, στο πλάσμα της αιμολέμφου, στο λιπαρό σώμα και στο επιδερμίδιο, και Στις λακάσες, που εντοπίζονται μόνο στο επιδερμίδιο. Όλες οι φαινολοξειδάσες βρίσκονται με τη μορφή ανενεργών προενζύμων που ονομάζονται προφαινολοξειδάσες και οι οποίες ενεργοποιούνται σε απόκριση προς κάποια μόλυνση. Έχουν βρεθεί προφαινολοξειδάσες σε όλα τα αρθρόποδα που έχουν εξεταστεί, με εξαίρεση 5

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ τα χηλικεραιωτά (Krishnan and Ravindranath, 1972; Ratcliffe, 1985; Soderhall and Smith, 1983). Οι φαινολοξειδάσες που εντοπίζονται στην αιμολέμφο και στο περίβλημα του επιδερμιδίου διαφέρουν μεταξύ τους (Barrett, 1983; Thangaraj et al., 1982). Η ενεργοποίηση της προφαινολοξειδάσης της αιμολέμφου πραγματοποιείται από τη δράση/παρουσία μικροβίων ή συστατικών τους. Επίσης πιστεύεται ότι οι φαινολοξειδάσες της αιμολέμφου εμπλέκονται στην επούλωση τραυμάτων (Taylor, 1969) και στην άμυνα έναντι μικροβίων και παρασίτων (Pye, 1974; Soderhall, 1982; Taylor, 1969). Η ενεργοποιημένη φαινολοξειδάση έχει συγκολλητικές ιδιότητες (sticky protein) και εξαιτίας αυτής της ιδιότητας (opsonic) πιστεύεται ότι εμπλέκεται στην αναγνώριση των ξένων μικροοργανισμών/κυττάρων, στην ακινητοποίησή τους και στη ρύθμιση της κυτταροφαγίας (Leonard et al., 1985b; Leonard et al., 1985a; Ratcliffe et al., 1984). Τελικό προϊόν της ενεργοποίησής της προφαινολοξειδάσης στις αμυντικές αποκρίσεις των αρθροπόδων είναι μια μαύρη χρωστική, η μελανίνη. Η μελανίνη παράγεται κατά τη διαδικασία της σκλήρυνσης του περιβλήματος. Όμως η παραγωγή της μελανίνης (μελανογένεση) και η σκλήρυνση είναι δυο ανεξάρτητες διαδικασίες (Karlson and Scholossberger-Raeche, 1962). Η φαινολοξειδάση συμμετέχει όπως ήδη αναφέρθηκε στο σύστημα της προφαινολοξειδάσης (ppo)-φαινολοξειδάσης (PO). Με τον όρο σύστημα προφαινολοξειδάσης-φαινολοξειδάσης αναφερόμαστε σε ένα σύμπλεγμα ενζύμων και συνεργατικών παραγόντων που βρίσκονται στην αιμολέμφο. Η ενεργοποίηση του συμπλέγματος αυτού μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε από μικρόβια ή από συστατικά τους (όπως για παράδειγμα οι πεπτιδογλυκάνες και οι β-1,3- γλυκάνες) (Ashida et al., 1983). Αποτέλεσμα της ενεργοποίησης του συστήματος είναι η παραγωγή πεπτιδίων και συγκολλητικών πρωτεϊνών, οι οποίες ρυθμίζουν πολλές από τις αμυντικές δράσεις του ξενιστή. Συνοπτικά, λοιπόν, ως προς το ρόλο του συστήματος της ppo- PO στην άμυνα των εντόμων μπορούμε να αναφέρουμε ότι αυτό σχετίζεται άμεσα με : α) το μηχανισμό εγκύστωσης, β) την κυτταροφαγία, μέσω των επαγόμενων κολλωδών πεπτιδίων και πρωτεϊνών που συνθέτονται, και τα οποία δρουν ως οψωνίνες διευκολύνοντας την κυτταροφαγία βακτηρίων ή και άλλων ξένων σωμάτων, γ) τη θανάτωση και ακινητοποίηση (μέσω συσσωμάτωσης) των εισβολέων. Η θανάτωση πραγματοποιείται λόγω του σχηματισμού τοξικών κινονών ως απόρροια της ενεργοποίησης της προφαινολοξειδάσης. Το σύστημα της προφαινολοξειδάσης (ppo)-φαινολοξειδάσης (PO) έχει χαρακτηριστεί ως ένα πρωτόγονο σύστημα ανάλογο αυτού του συμπληρώματος των θηλαστικών, και η ρύθμισή του επιτυγχάνεται με τη βοήθεια ενός μεγάλου αριθμού αναστολέων και πρωτεασών. Στις κυριότερες αντιβακτηριακές πρωτεΐνες περιλαμβάνονται : Οι κεκροπίνες, οι οποίες είναι ουσιαστικά επαγόμενα αντιβακτηριακά πεπτίδια που εντοπίζονται στην αιμολέμφο, αρχικά απομονώθηκαν από την Hyalophora cecropia (Hultmark et al., 1980) και γι αυτό χαρακτηρίστηκαν στη συνέχεια ως κεκροπίνες (Steiner et al., 1981). Τα πεπτίδια αυτά έχουν λυτική δράση έναντι των Gram-αρνητικών και Gramθετικών βακτηρίων, δημιουργώντας κανάλια στην κυτταρική μεμβράνη των βακτηρίων. Οι αττακίνες είναι ένας τύπος αντιβακτηριακών πρωτεϊνών (Hultmark et al., 1983), με Μ.Β kDa και με φαινομενικά περιορισμένη αντιμικροβιακή δράση. Δρουν αυξάνοντας τη διαπερατότητα της εξωτερικής μεμβράνης των Gram-αρνητικών οργανισμών, καθιστώντας τους έτσι πιο ευάλωτους στη λυσοζύμη (Engstrom et al., 1984). Οι λεκτίνες είναι γλυκοπρωτεΐνες που διαθέτουν μια ή περισσότερες γλυκοζυλιωμένες θέσεις δέσμευσης για υδατάνθρακες (Boyd and Shapleigh, 1954) και κατανέμονται σε διάφορους ιστούς και σε συγκεκριμένα αναπτυξιακά στάδια. Είναι υπεύθυνες για την αναγνώριση και αλληλεπίδραση ξένων μορίων, κυττάρων και εξωκυτταρικού υλικού με τον ίδιο τον οργανισμό. Οι διπτερισίνες, οι οποίες δρουν μόνο σε βακτήρια που διαιρούνται. Έχει βρεθεί επίσης ότι οι πρωτεΐνες αυτές έχουν αντιβακτηριακή ενεργότητα μόνο έναντι της E. coli. Οι ντιφενσίνες. Πρόκειται για μια οικογένεια πρωτεϊνών που παράγονται από τα μακροφάγα των θηλαστικών. Παρόμοιες με αυτές στα έντομα είναι οι πρωτεΐνες σαπεκίνη (S. Peregrina) 6

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ και φορμικίνη (P. Terranovae), οι οποίες δρουν επιλεκτικά μόνο έναντι των Gram θετικών βακτηρίων. Η κυτταρική απόκριση των εντόμων Στην κυτταρική απόκριση συμμετέχουν τα αιμοκύτταρα με τους μηχανισμούς της κυτταροφαγίας, της εγκύστωσης και του σχηματισμού οζιδίων. Οι μηχανισμοί αυτοί θα αναλυθούν στη συνέχεια. Τα αιμοκύτταρα των εντόμων περιέγραψε για πρώτη φορά ο Schwammmerdam το Έχουν μεσοδερμική προέλευση, είναι εμπύρηνα και διαθέτουν πολυμορφικό σχήμα. Κυκλοφορούν στην αιμολέμφο, το μοναδικό εξωκυτταρικό υγρό των εντόμων και αποτελούν τα μόνα έμμορφα στοιχεία αυτής. Τα αιμοκύτταρα διακρίνονται σε διάφορους τύπους. Η απομόνωση καθαρών πληθυσμών όμως παρουσιάζει πολλά προβλήματα που οφείλονται κυρίως στην περιορισμένη ποσότητα αιμολέμφου αλλά και στην ασταθή φύση των αιμοκυττάρων των εντόμων. Το γεγονός αυτό κατ επέκταση δημιουργεί προβλήματα στην ταξινόμηση των αιμοκυττάρων η οποία μέχρι πρόσφατα γινόταν με βάση μορφολογικά κριτήρια τα οποία όμως είναι επισφαλή και είχαν οδηγήσει σε σύγχυση. Τα τελευταία χρόνια, ως δείκτες για τον προσδιορισμό του κυτταρικού τύπου, χρησιμοποιούνται μόρια της κυτταρικής επιφάνειας των αιμοκυττάρων. Η χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων για το διαχωρισμό των πληθυσμών των λευκοκυττάρων αποτέλεσε το έναυσμα για την εφαρμογή τους και στα αιμοκύτταρα των εντόμων (Chain et al., 1992; Mullet et al., 1993; Strand and Johnson, 1996; Willott et al., 1994). Σήμερα χρησιμοποιείται η ταξινόμηση της Lackie, η οποία βασίζεται σε μελέτες σε λεπιδόπτερα, υμενόπτερα, κολεόπτερα και δίπτερα (Lackie, 1988). Οι κύριες κατηγορίες των αιμοκυττάρων των εντόμων που αναφέρονται στη βιβλιογραφία είναι τα προαιμοκύτταρα, τα κοκκιοκύτταρα, τα πλασματοκύτταρα, τα σφαιροκύτταρα και τα οινοκυτοειδή (εικόνα 2). Αυτοί οι τύποι έχουν βρεθεί σε είδη διαφορετικών τάξεων όπως σε Λεπιδόπτερα, Δίπτερα, Ορθόπτερα, Κολεόπτερα, Υμενόπτερα και άλλα (Lavine and Strand, 2002). Προαιμοκύτταρα (prohemocytes). Αποτελούν πρόδρομες μορφές αιμοκυττάρων από τις οποίες δημιουργούνται όλες οι υπόλοιπες κατηγορίες αιμοκυττάρων. Είναι μικρότερα από τα ώριμα αιμοκύτταρα και έχουν σφαιρικό σχήμα. Απαντώνται κυρίως στα προνυμφικά στάδια. Κοκκιοκύτταρα (granulocytes). Φέρουν μεγάλο αριθμό εκκριτικών κοκκίων που τους προσδίδουν χαρακτηριστική μορφολογία και κατά το προνυμφικό στάδιο των Λεπιδοπτέρων έχουν την ικανότητα προσκόλλησης σε ξένες επιφάνειες. Πλασματοκύτταρα (plasmatocytes). Είναι η πολυπληθέστερη κατηγορία αιμοκυττάρων. Έχουν σχήμα κυκλικό ή ατρακτοειδές. Η λειτουργία τους συνίσταται στον εγκλωβισμό παθογόνων μικροοργανισμών και παρασίτων, την κυτταροφαγία, το σχηματισμό θρόμβων και την επούλωση πληγών. Όπως και τα κοκκιοκύτταρα, κατά το προνυμφικό στάδιο των Λεπιδοπτέρων έχουν την ικανότητα προσκόλλησης σε ξένες επιφάνειες. Αποτελούν πάνω από το 50% των κυκλοφορούντων αιμοκυττάρων (Lackie, 1988; Strand and Pech, 1995). Οινοκυτοειδή (oenocytoids). Μεγάλα κύτταρα με σχήμα σφαιρικό ή ωοειδές και μικρό, περιφερειακά τοποθετημένο, πυρήνα. Περιέχουν πρόδρομα κυτταροπλασματικά μόρια φαινολοξειδάσης που παίζουν ρόλο στην παραγωγή μελανίνης στην αιμολέμφο (Ashida and Dohke, 1980; Iwama and Ashida, 1986; Jiang et al., 1997). Σφαιροκύτταρα (spherule cells). Μεταφέρουν συστατικά του επιδερμιδίου (Sass et al., 1994) 7

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 2: Οι πέντε τύποι αιμοκυττάρων που απαντώνται στα Λεπιδόπτερα. (Α) Προαιμοκύτταρο, (Β) Σφαιροκύτταρο, (Γ) Οινοκυτοειδές, (Δ) Κοκκιοκύτταρα και (Ε) Πλασματοκύτταρα (Lavine and Strand, 2002) Στη Drosophila, τα αιμοκύτταρα έχουν διαφορετική ονομασία από αυτά των υπολοίπων εντόμων (Lanot et al., 2001). Έχουν προσδιοριστεί τρεις τύποι αιμοκυττάρων: τα πλασματοκύτταρα, τα κρυσταλλοκύτταρα και τα ελασματοκύτταρα (εικόνα 3) (Evans et al., 2003; Rizki and Rizki, 1959). Αυτά τα τρία είδη αιμοκοκυττάρων παρουσιάζουν μεταξύ τους πολλές ομοιότητες. Μορφολογικά και λειτουργικά τα ελασματοκύτταρα της Drosophila είναι αντίστοιχα των πλασματοκυττάρων των Λεπιδοπτέρων. Τα ελασματοκύτταρα είναι παρόντα μονάχα όταν το έντομο έχει υποστεί κάποια μόλυνση, σε αντίθεση με τα πλασματοκύτταρα των Λεπιδοπτέρων που κυκλοφορούν φυσιολογικά και στα υγιή έντομα. Είναι εξειδικευμένα μεγάλα, επίπεδα, προσκολλημένα κύτταρα που διαφοροποιούνται στους λεμφικούς αδένες ύστερα από παρασιτισμό των προνυμφών και η βασική τους λειτουργία είναι η εγκύστωση και εξουδετέρωση σωματιδίων πολύ μεγάλων για να φαγοκυτταρωθούν από τα πλασματοκύτταρα (Rizki and Rizki, 1980a; Rizki and Rizki, 1984; Rizki and Rizki, 1992). Κατά την εγκύστωση σχηματίζεται ένα κυστίδιο γύρω από τον εισβολέα, ακολουθεί η μελανογένεση οπότε και σταδιακά εξουδετερώνεται το παράσιτο εσωτερικά του κυστιδίου (Lavine and Strand, 2002). Τα πλασματοκύτταρα της Drosophila δεν έχουν κάποια προφανή αντιστοιχία με κάποιο τύπο αιμοκυττάρων των Λεπιδοπτέρων και παρουσιάζουν περισσότερες ομοιότητες με τα κοκκιοκύτταρα παρά με τα πλασματοκύτταρα των Λεπιδοπτέρων. Και οι δύο αυτοί τύποι κυττάρων (τα πλασματοκύτταρα της Drosophila και τα κοκκιοκύτταρα των Λεπιδοπτέρων) δρουν ως φαγοκύτταρα. Τα πλασματοκύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορες ανοσολογικές διεργασίες (Hoffmann and Reichhart, 2002; Lavine and Strand, 2002) καθώς έχουν την ικανότητα να φαγοκυτταρώνουν ξένη ύλη, να συνθέτουν και να εκκρίνουν αντιμικροβιακά πεπτίδια και τέλος να σηματοδοτούν στο λιπαρό σώμα ύστερα από κάποια μόλυνση (Agaisse et al., 2003). Τα πλασματοκύτταρα συνιστούν το 95% του συνόλου των αιμοκυττάρων του εντόμου, έχουν μεγάλη διάρκεια ζωής φτάνοντας μέχρι και το στάδιο της 8

16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ μεταμόρφωσης, ενώ σε μικρούς αριθμούς συναντώνται ακόμα και στα ενήλικα άτομα (Rizki and Rizki, 1980a). Ο τρίτος τύπος αιμοκυττάρων της Drosophila, τα κρυσταλλοκύτταρα, παρουσιάζουν μεγάλη ομοιότητα με τα οινοκυτοειδή των Λεπιδοπτέρων και συνιστούν το 5% του συνόλου των αιμοκυττάρων. Είναι και τα δύο μεγάλα κύτταρα, έχουν όμοιο σχήμα και περιέχουν φαινολοξειδάσες που είναι απαραίτητες για τη σύνθεση της μελανίνης, απαραίτητο συστατικό, όπως αναφέρθηκε νωρίτερα, της μελανογένεσης (Rizki and Rizki, 1959; Rizki and Rizki, 1980a; Shrestha and Gateff, 1982). Η σύνθεση της μελανίνης συνεπάγεται την παραγωγή, ως παραπροϊόντων, κυτταροτοξικών ελευθέρων ριζών οι οποίες πιστεύεται ότι συμμετέχουν στην εξουδετέρωση των παθογόνων (Rizki and Rizki, 1980a; Shrestha and Gateff, 1982). Εικόνα 3: Τρεις τύποι αιμοκυττάρων που απαντώνται στη Drosophila. (Α) Πλασματοκύτταρα, (Β) Κρυσταλλοκύτταρο, (C) Ελασματοκύτταρο (TΕΜ, 2μm) (Meister and Lagueux, 2003) Η διαδικασία της αιματοποίησης στη Drosophila melanogaster Στο έντομο αυτό, η αιμοποίηση πραγματοποιείται σε δύο φάσεις κατά την ανάπτυξη, από τις οποίες προκύπτουν τρεις τύποι αιμοκυττάρων στους οποίους αναφερθήκαμε νωρίτερα. Η πρώτη φάση λαμβάνει χώρα κατά την εμβρυογένεση, όταν δημιουργείται ένας πληθυσμός αιμοκυττάρων στο προκεφαλικό μεσόδερμα. Τα κύτταρα αυτά, σε αντίθεση με τα υπόλοιπα κύτταρα μεσοδερμικής προέλευσης, έχουν καθοριστεί ως αιμοκύτταρα ήδη από το στάδιο του βλαστοδέρματος (Holz et al., 2003). Κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, τα κύτταρα αυτά μεταναστεύουν από το σημείο γένεσής τους και διασκορπίζονται σε όλο το έμβρυο (Tepass et al., 1994). Αυτά τα κυκλοφορούντα κύτταρα είναι τα πλασματοκύτταρα. Ένας δεύτερος πληθυσμός αιμοκυττάρων, τα κρυσταλλοκύτταρα, διαφοροποιείται ταυτόχρονα με τα πλασματοκύτταρα κοντά στην πρόσθια περιοχή του εντέρου όπου και παραμένει (Bataille et al., 2005; Lebestky et al., 2000). Αυτά τα κύτταρα σε αντίθεση με τα πλασματοκύτταρα, δε μεταναστεύουν αλλά παραμένουν στον πρόλοβο. Η δεύτερη φάση λαμβάνει χώρα αργότερα κατά την εμβρυογένεση όταν σχηματίζονται οι πρόδρομες μορφές των λεμφικών αδένων στο ραχιαίο θωρακικό μεσόδερμα και συγχωνεύονται ώστε να σχηματιστεί το πρώτο ζεύγος λοβών του οργάνου. Στη συνέχεια το όργανο αναπτύσσεται με κυτταρικό πολλαπλασιασμό κατά το πρώτο και δεύτερο προνυμφικό στάδιο και λειτουργεί ως την κύρια περιοχή παραγωγής αιμοκυττάρων στα έντομα. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, τα αιμοκύτταρα του λεμφικού αδένα δεν εισέρχονται στην κυκλοφορία μέχρι το στάδιο της μεταμόρφωσης, αλλά παραμένουν στον αδένα καθόλη τη διάρκεια των προνυμφικών σταδίων (Holz et al., 2003). Συνεπώς, τα πλασματοκύτταρα που βρίσκονται στο αιμόκοιλο της προνύμφης αντιπροσωπεύουν εμβρυϊκά κύτταρα που προέρχονται από το προκεφαλικό μεσόδερμα. Σε περίπτωση όμως παρασιτισμού, ο λεμφικός αδένας απελευθερώνει μεγάλο αριθμό αιμοκυττάρων στην κυκλοφορία. Στη συνέχεια, κατά το στάδιο της μεταμόρφωσης, ο λεμφικός αδένας απελευθερώνει μεγάλο αριθμό ενεργών αιμοκυττάρων που παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναδιάρθρωση των ιστών, καθώς 9

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ φαγοκυτταρώνουν τα κύτταρα των κατεστραμμένων προνυμφικών δομών. Όλες οι τροποποιήσεις των ιστών που σχετίζονται με τη μεταμόρφωση βρίσκονται κάτω από τον έλεγχο της στεροειδούς ορμόνης εκδυσόνης (Lanot et al., 2001; Sorrentino et al., 2002). Αυτά τα ενεργά αιμοκύτταρα φαγοκυτταρώνουν επίσης και τα υπολείμματα των λεμφικών αδένων, γι αυτό το λόγο σε μετέπειτα αναπτυξιακά στάδια δεν υπάρχουν καθόλου αιμοποιητικά όργανα. Στο λεμφικό αδένα διακρίνονται τρεις διαφορετικές δομικές περιοχές: η εξωτερική φλοιώδης ζώνη, η εσωτερική μυελώδης ζώνη και το οπίσθιο σηματοδοτικό κέντρο (Jung et al., 2005). Η εσωτερική μυελώδης ζώνη περιλαμβάνει τα μη διαφοροποιημένα πρόδρομα κύτταρα, τα προαιμοκύτταρα, τα οποία καθώς διαφοροποιούνται σταδιακά μετακινούνται προς τη φλοιώδη ζώνη όπου και αρχίζουν να διαιρούνται (Jung et al., 2005). Τα αιμοκύτταρα, λοιπόν, είναι απαραίτητα για την ανάπτυξη και επιβίωση του εντόμου και γι αυτό το λόγο είναι χαρακτηριστικό ότι τα άτομα της Drosophila που στερούνται των αιμοκυττάρων τους είναι αρκετά ευαίσθητα στις μολύνσεις. Αυτό διαπιστώθηκε σε προνύμφες που φέρουν τη μετάλλαξη domino, η οποία οδηγεί σε μειωμένο αριθμό αιμοκυττάρων. Όταν αυτή η μετάλλαξη συνδυαστεί με μεταλλάξεις που αφορούν την ορολογική ανοσία, όπως για παράδειγμα η imd, ή τη μελανογένεση, η ανθεκτικότητα των διπλά μεταλλαγμένων προνυμφών μειώνεται κατά πολύ σε σχέση με τις προνύμφες με μια μετάλλαξη (Braun et al., 1998). Παρόμοια, η καταστροφή των αιμοκυττάρων ενηλίκων ατόμων, μετά από μαζική μόλυνση με σφαιρίδια πολυστυρενίου, μειώνει την ικανότητα των imd μυγών να καταπολεμήσουν τη βακτηριακή μόλυνση (Elrod-Erickson et al., 2000; Meister and Lagueux, 2003). Ρόλος-Δράση των αιμοκυττάρων Οι κύριες λειτουργίες των αιμοκυττάρων είναι η συμμετοχή τους στην ανοσολογική του οργανισμού έναντι προσβολών του αιμόκοιλου από παθογόνους παράγοντες (όπως συμβαίνει αντίστοιχα και με τα μακροφάγα κύτταρα των θηλαστικών) και στη διαδικασία επούλωσης των πληγών με το σχηματισμό πήγματος στην αιμολέμφο. Οι διαδικασίες αυτές αναφέρονται συνολικά ως κυτταρική ανοσία (Hoffmann, 1995). Στην εικόνα που ακολουθεί παρουσιάζεται ένα μοντέλο που εκφράζει την τρέχουσα αντίληψη για τα στάδια ενεργοποίησης των αιμοκυττάρων και τη συμμετοχή τους στην άμυνα του οργανισμού, το οποίο προτάθηκε από τους Gillespie et al. (Gillespie et al., 1997). Εικόνα 4: Υποθετικό μοντέλο της αλληλουχίας των γεγονότων κατά την ενεργοποίηση των αιμοκυττάρων και τις ανοσολογικές αντιδράσεις. Τα κυκλοφορούντα αιμοκύτταρα (1) έρχονται σε επαφή με ενδογενείς ή ξένες επιφάνειες απεικονιζόμενες σε πλευρική άποψη (2). Όταν λαμβάνουν ένα σήμα από ενδογενείς ή εξωγενείς παράγοντες (παράγοντες τραυματισμού ή αιματοκίνες) ή αναγνωρίζουν την ξένη επιφάνεια, προσκολλώνται μέσω παραγόντων προσκόλλησης ή/και υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας (3). Η αναγνώριση του εισβολέα οδηγεί στην έκταση νηματοποδίων από τα 10

18 ΕΙΣΑΓΩΓΗ κοκκιοκύτταρα και ψευδοποδίων/ελασματοποδίων από τα πλασματοκύτταρα (4). Τελικά τα αιμοκύτταρα μπορεί να επεκταθούν και να σχηματίσουν δίκτυα (5), να συσσωματωθούν (6), και να φαγοκυτταρώσουν μικρούς παθογόνους οργανισμούς (7) ή να εγκλωβίσουν μεγαλύτερα παράσιτα (8) (Gillespie et al., 1997). Ανεξάρτητα από την τελική κατάληξη των αιμοκυττάρων μετά την ενεργοποίησή τους, δηλαδή τη δημιουργία δικτύων, τη συσσωμάτωση, τη φαγοκυττάρωση μικρών παθογόνων, ή τον εγκλωβισμό μεγαλύτερων, σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις η επέκταση (spreading) των αιμοκυττάρων αποτελεί το κεντρικό γεγονός της κάθε διαδικασίας. Στη συνέχεια τα αιμοκύτταρα καταλήγουν σε μια από τις ακόλουθες αποκρίσεις : Συσσωμάτωση των αιμοκυττάρων (hemocyte aggregation): Η διαδικασία αυτή υποβοηθείται από την ενεργό φαινολοξειδάση που παράγεται, η οποία σε συνδυασμό με πρωτεΐνες της αιμολέμφου οδηγεί τελικά στο σχηματισμό συσσωματωμάτων που περικλείουν τους εισβολείς (εικόνα 5). Εικόνα 5: Συσσωμάτωση και μελανογένεση στα αιμοκύτταρα της C. capitata ύστερα από επίδραση E. coli (Mavrouli et al., 2005). Κυτταροφαγία (phagocytosis): Ως κυτταροφαγία αναφέρεται η διαδικασία αναγνώρισης και εγκόλπωσης μικροοργανισμών ή καταλοίπων ιστών που συσσωρεύονται κατά τη μόλυνση, τη φλεγμονή ή την επούλωση πληγών (Brown, 1994). Πρόκειται για μια φυλογενετικά συντηρημένη κυτταρική διαδικασία που εκτελούν τόσο μονοκύτταροι όσο και ορισμένες κατηγορίες κυττάρων πολυκύτταρων οργανισμών με διαφορετικό όμως στόχο. Για τους κατώτερους οργανισμούς (π.χ. πρωτόζωα), η κυτταροφαγία αποτελεί το συνηθέστερο, ή και αποκλειστικό για ορισμένους, τρόπο πρόσληψης της τροφής. Έτσι, λοιπόν, στα πρωτόζωα η κυτταροφαγία συνδέεται άμεσα με την αμοιβαδοειδή κίνηση, αφού αυτά προκειμένου να εγκολπώσουν την τροφή τους εκτείνουν ψευδοπόδια (κυτταροπλασματικές προεκβολές) τα οποία στη συνέχεια μεταπίπτουν σε κυστίδια και μέσα σ αυτά γίνεται η πέψη της τροφής με τη βοήθεια πρωτεολυτικών ενζύμων. Στους ανώτερους οργανισμούς η κυτταροφαγία αποτελεί βασικό στοιχείο του αμυντικού συστήματος. Είναι απαραίτητη τόσο για την ειδική όσο και για τη μη ειδική άμυνα, για την καταστροφή των παθογόνων εισβολέων και για την αποκατάσταση της ομοιόστασης στα σημεία προσβολής και φλεγμονής (επούλωση πληγών) καθώς επίσης και για την πέψη αποπτωτικών και νεκρωτικών σωματίων. Η κυτταροφαγία είναι επίσης σημαντική στην επαγωγή εξειδικευμένης ανοσοαπόκρισης σε παθογόνα, διότι είναι βασική στην παρουσίαση του αντιγόνου κατά την επαγωγή και ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων. Και στις δύο κατηγορίες κυτταροφαγίας, δηλαδή αυτή που επιτελείται από τους κατώτερους οργανισμούς και αυτή από τους ανώτερους, η διαδικασία αυτή εξαρτάται από ειδικές αλληλεπιδράσεις στην κυτταρική επιφάνεια. Τα κύτταρα τα οποία πραγματοποιούν φαγοκυττάρωση ονομάζονται φαγοκύτταρα. Στα ανώτερα ευκαρυωτικά, όπως και στον άνθρωπο, η κυτταροφαγία επιτελείται από τα μακροφάγα, τα μονοκύτταρα και τα πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα (ουδετερόφιλα) (Aderem and 11

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Underhill, 1999) (εικόνα 6). Τα κύτταρα αυτά προσπαθούν να απαλλάξουν το αίμα από τους υπάρχοντες ξένους μικροοργανισμούς, οι οποίοι μπορεί να είναι μολυσματικοί για τον οργανισμό. Τα μακροφάγα απαντώνται σε κάθε ιστό. Πιστεύεται ότι παίζουν ρόλο στην άμυνα έναντι των μολύνσεων, στην επούλωση πληγών και την αναδιάρθρωση ιστών. Τα μονοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα βρίσκονται στην κυκλοφορία και απαντώνται σε όλο το σώμα. Εικόνα 6: Κυτταροφαγία από μακροφάγο. Φωτογραφία από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μακροφάγου να φαγοκυτταρώνει βακτήρια E. coli. (Dennis Kunkel Microscopy Inc. 2001). Στα έντομα, οι κυρίαρχες τάξεις φαγοκυττάρων είναι τα πλασματοκύτταρα και τα κοκκιοκύτταρα (Gupta, 1991) (εικόνα 7). Τα έντομα δε διαθέτουν ανοσοσφαιρίνες όμως έχουν γίνει πολλές αναφορές για την παρουσία ορολογικών λεκτινών οι οποίες λειτουργούν ως οψωνίνες (Pendland and Boucias, 1996). Οι οψωνίνες εντοπίζονται στο πλάσμα (διαλυτές) και στην επιφάνεια των αιμοκυττάρων. Επιπλέον, το σύστημα της προφαινολοξειδάσης που υπάρχει στα αρθρόποδα, συμπεριλαμβανομένων και των εντόμων, επάγει το σχηματισμό κολλωδών συστατικών τα οποία δρουν ως οψωνίνες και λειτουργικά μοιάζουν με παράγοντες του συμπληρώματος των σπονδυλωτών. Η κυτταροφαγία και οι μηχανισμοί της στα έντομα δεν έχουν ακόμα πλήρως διευκρινιστεί. Η πλειονότητα των μελετών έχει πραγματοποιηθεί στη μεσογειακή μύγα και έχει οδηγήσει στο συμπέρασμα ότι οι μηχανισμοί μεταγωγής μηνυμάτων κατά την κυτταροφαγία είναι ως ένα βαθμό συντηρημένοι μεταξύ εντόμων και θηλαστικών (Foukas et al., 1998; Metheniti et al., 2001). Εικόνα 7: Κυτταροφαγία από αιμοκύτταρο της C. capitata. Φωτογραφία από συνεστιακό μικροσκόπιο αιμοκυττάρου να φαγοκυτταρώνει βακτήρια E. coli. (Lamprou et al., 2007). Συνοπτικά τα στάδια της κυτταροφαγίας είναι (εικόνα 8): Α) αναγνώριση του ξένου σώματος από τα κύτταρα, χημειοτακτική κίνηση των φαγοκυττάρων προς το ξένο σώμα, αναγνώριση και εγκλωβισμός του ξένου σώματος στην επιφάνεια των φαγοκυττάρων και ακολουθεί η εσωτερίκευση του ξένου σώματος προς το κυτταρόπλασμα του φαγοκυττάρου, όπου και εισέρχεται κλεισμένο μέσα σε φαγόσωμα, Β) σύντηξη του φαγοσώματος με λυσοσώματα, οπότε προκύπτει το φαγολυσόσωμα, όπου πραγματοποιείται η θανάτωση του εισβολέα μέσω της διαδικασίας της πέψης με ειδικά πρωτεολυτικά ένζυμα ή με ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που παράγονται από τα φαγοσώματα, και Γ) απομάκρυνση των άχρηστων υλικών από το φαγοκύτταρο με εξωκυττάρωση. 12

20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 8: Τα στάδια της κυτταροφαγίας ενός παθογόνου από ένα φαγοκύτταρο. Α) Εγκόλπωση του παθογόνου και σχηματισμός του φαγοσώματος, Β) Σύντηξη του φαγοσώματος με λυσοσώματα και σχηματισμός του φαγολυσοσώματος. Το παθογόνο καταστρέφεται με την παραγωγή πρωτεολυτικών ενζύμων ή ελευθέρων ριζών οξυγόνου. Γ) Απομάκρυνση των άχρηστων υλικών από το φαγοκύτταρο με εξωκυττάρωση. Κυτταρική εγκύστωση και σχηματισμός οζιδίων (encapsulation and nodule formation): Όταν ο εισβολέας είναι πολύ μεγάλος σε μέγεθος, τα αιμοκύτταρα περικυκλώνουν τον παθογόνο ή μη παράγοντα και στη συνέχεια προσκολλώνται στην επιφάνειά του (εικόνα 9). Η εγκύστωση πραγματοποιείται σε δύο φάσεις. Αρχικά τα αιμοκύτταρα συσσωματώνονται γύρω από τον εισβολέα και σε δεύτερη φάση λύονται και απελευθερώνουν στον ορό ουσίες που προσελκύουν άλλα αιμοκύτταρα και συμπληρώνουν το σχηματισμό της κύστης. Ενώ οζίδια σχηματίζονται όταν ο αριθμός των μικροοργανισμών που εισβάλουν στο αιμόκοιλο είναι πολύ μεγάλος ώστε να απομακρυνθούν με τη διαδικασία της κυτταροφαγίας. Πολλές φορές η διάκριση ανάμεσα στα οζίδια και τις κύστες είναι δύσκολη, ενώ είναι δυνατό οι δύο διαδικασίες να πραγματοποιούνται ταυτόχρονα. Για το σχηματισμό των οζιδίων έχει προταθεί ότι τα αιμοκύτταρα αποκοκκιώνονται και απελευθερώνουν παράγοντες που προκαλούν τη συσσωμάτωση των βακτηρίων. Εικόνα 9: Σχηματισμός οζιδίων από πλασματοκύτταρα της Manduca sexta (Willott et al., 2002). Με το βέλος υποδεικνύονται τα οζίδια. Επούλωση πληγών: Τα αιμοκύτταρα εκτός από την ανοσολογική-αμυντική απόκρισή τους σε εισβολείς ρυθμίζουν και τη διαδικασία της επούλωσης πληγών. Τα κύρια στάδια της διαδικασίας αυτής είναι τα ακόλουθα: 1) Γρήγορη πήξη για την αποφυγή της απώλειας αιμολέμφου, 2) Ενίσχυση του πήγματος με την προσθήκη κυττάρων, 3) Επιδιόρθωση της υποκείμενης στιβάδας, και 4) Επιδιόρθωση της εσωτερικής μεμβράνης. 13

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αναγνώριση εισβολέων Το εγγενές ανοσοποιητικό σύστημα των εντόμων, εξαιτίας της απουσίας επίκτητου ανοσοποιητικού συστήματος και κατ επέκταση εξειδικευμένων ανοσοαποκρίσεων, έχει να αντιμετωπίσει μια μεγάλη πρόκληση: τη διάκριση των ξένων προς τον οργανισμό τους παθογόνων και άλλων παραγόντων. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα των σπονδυλωτών, κατά την εξέλιξη, ανέπτυξαν τους υποδοχείς αναγνώρισης (pattern-recognition receptors, PRRs), οι οποίοι δεσμεύουν συντηρημένες μοριακές δομές που παράγονται από παθογόνους μικροοργανισμούς (pathogen-associated molecular pattern, PAMP), όπως τα βακτηρία και τους μύκητες (εικόνα 10) (Fearon, 1997). Οι πιο γνωστές PAMPs είναι συστατικά του κυτταρικού τοιχώματος όπως ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS), η πεπτιδογλυκάνη και οι β-1,3- γλυκάνες, τα οποία αναγνωρίζονται είτε από ορολογικούς (διαλυτούς) είτε από κυτταρικούς PRRs. Οι διαλυτοί PRRs, όπως η πρωτεΐνη δέσμευσης της μαννόζης, προσδένονται στα PAMPs με συνέπεια την οψωνινοποίηση του μολυσματικού οργανισμού. Το σύμπλοκο αυτό στη συνέχεια αναγνωρίζεται από πρωτεΐνες-υποδοχείς της επιφάνειας των αιμοκυττάρων. Αντίθετα, οι κυτταρικοί PRRs εκφράζονται στην επιφάνεια ανοσοκυττάρων και δεσμεύουν τα ΡΑΜΡs άμεσα (Aderem and Underhill, 1999). Εικόνα 10: Η αντιμικροβιακή άμυνα στη Drosophila. Αυτός ο μηχανισμός άμυνας πρέπει να ισχύει για όλα τα ολομετάβολα έντομα. Ορολογικοί υποδοχείς αναγνώρισης προτύπου (ορολογικοί PRRs) Στα έντομα έχουν ταυτοποιηθεί ως πιθανοί PRRs αρκετοί διαλυτοί παράγοντες όπως λεκτίνες, η αιμολίνη, η πρωτεΐνη δέσμευσης του LPS (LPS-binding protein, LBP), η πρωτεΐνη αναγνώρισης αρνητικών κατά Gram βακτηρίων (Gram-negative bacteria recognition protein, GNBP), η πρωτεΐνη αναγνώρισης πεπτιδογλυκάνης (peptidoglycan binding protein) (Bulet et al., 1999; Schmidt et al., 2001). Ενώ οι υποδοχείς αναγνώρισης των διαλυτών PRRs τόσο στα αιμοκύτταρα όσο και στους άλλους ιστούς παραμένουν άγνωστοι, είναι γνωστό από μελέτες ότι ορισμένοι από αυτούς τους παράγοντες, αφού προσδεθούν σε παθογόνα, επάγουν ή ενισχύουν την κυτταρική απόκριση των αιμοκυττάρων με την κυτταροφαγία ή το σχηματισμό οζιδίων. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα είναι η πρωτεΐνη δέσμευσης του LPS στο Bombyx mori (BmLBP). Η BmLBP προσδένεται σε άγρια στελέχη E. coli προκαλώντας σχηματισμό οζιδίων πολύ πιο γρήγορα από ότι στα στελέχη E. coli που δεν αναγνωρίζονται από την BmLBP (Koizumi et al., 1999). 14

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι περισσότεροι ορολογικοί PRRs που έχουν ταυτοποιηθεί στα έντομα σχετίζονται με την αναγνώριση και δέσμευση του LPS. Έχουν βρεθεί σε πολλά έντομα, όμως φαίνεται ότι το μόνο κοινό τους χαρακτηριστικό είναι η ικανότητά τους να δεσμεύουν LPS καθώς εμφανίζουν σημαντικές δομικές και λειτουργικές διαφορές μεταξύ τους. Στα αιμοκύτταρα της μεσογειακής μύγας έχει ταυτοποιηθεί η πρωτεΐνη p47, η οποία συμμετέχει στη δέσμευση του LPS στα αιμοκύτταρα και την ενδοκυττάρωση του δεσμευμένου LPS (Charalambidis et al., 1996). Η δέσμευση της p47 με τον LPS είναι ομοιοπολική και γίνεται με τη μεσολάβηση παραγώγων τυροσίνης τα οποία προκύπτουν από τη δράση της φαινολοξειδάσης. Κυτταρικοί υποδοχείς αναγνώρισης προτύπου (κυτταρικοί PRRs) Για τους κυτταρικούς PRRs πολύ λίγα είναι γνωστά. Στα θηλαστικά, ως υποδοχείς PRRs θεωρούνται οι Toll-like υποδοχείς καθώς αναγνωρίζουν άμεσα τον LPS και άλλα μικροβιακά προϊόντα. Οι υποδοχείς αυτοί, στη συνέχεια, ενεργοποιούν οδούς μεταγωγής μηνυμάτων μέσω του NF-κΒ με αποτέλεσμα την παραγωγή κυτταροκινών (Akira, 2001). Το γονιδίωμα της Drosophila περιλαμβάνει τον Toll, επτά ακόμα σχετιζόμενα με τον Toll γονίδια (Toll-3-8 και 18-wheeler) και το γονίδιο Imd (immune deficiency) (Imler and Hoffmann, 2000). Τα Toll-like γονίδια έχουν ταυτοποιηθεί και σε άλλα έντομα, όπως στα κουνούπια και στη μύγα Τσετσέ, Glossina papalis papalis (Luo and Zheng, 2000). Το μονοπάτι Toll Στη Drosophila ο Toll υποδοχέας αναγνωρίζει τα παθογόνα και ενεργοποιεί την εγγενή ανοσία μέσω των Rel μεταγραφικών παραγόντων, όπως o Dorsal, o Dif και ο Relish, που είναι ανάλογοι των μεταγραφικών παραγόντων NF-kB των θηλαστικών. Ο υποδοχέας Toll της Drosophila ανακαλύφθηκε στις αρχές του 80 είναι διαμεμβρανικός, αποτελείται από μια ενδοκυτταρική περιοχή που παρουσιάζει σημαντική ομοιότητα με το αντίστοιχο τμήμα του υποδοχέα της ιντερλευκίνης-1 (IL-1R) και ονομάζεται TIR (Toll/IL-1R υποδοχέας). Η εξωκυτταρική περιοχή του Toll είναι πλούσια σε λευκίνες και χαρακτηρίζεται ως LRR (leucine-rich repeats), ενώ πλευρικά μπορεί να υπάρχουν και χαρακτηριστικές επαναλήψεις κυστεΐνης (C-flank) (Imler and Hoffmann, 2002) (Εικόνα 11). Εικόνα 11: Υποδοχείς με TIR περιοχές στη Drosophila και στα θηλαστικά. Το εξωκυτταρικό τμήμα των Tolls και TLRs είναι πλούσιο σε LRRs, πλευρικά των οποίων βρίσκονται μοτίβα πλούσια σε κυστεΐνη (C- ή N-flanks). Τα μοτίβα N-flank βρίσκονται στους υποδοχείς της Drosophila Toll-1 μέχρι και Toll-8, αλλά όχι στον Toll-9 ή στους TLRs των θηλαστικών. Το εξωκυτταρικό τμήμα του IL-1R αποτελείται από τρεις ανοσοσφαιρίν ες (Ig περιοχές). 15