Σηµατοδοτικά πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα ρυθµίζουν την µεταγωγή µηνυµάτων κατά την κυτταροφαγία των

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Σηµατοδοτικά πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα ρυθµίζουν την µεταγωγή µηνυµάτων κατά την κυτταροφαγία των αιµοκυττάρων της µύγας της Μεσογείου. Ο ρυθµιστικός ρόλος της FAK και η συµµετοχή των ιντεγκρινών, των MAPKs και άλλων σηµατοδοτικών µορίων. ΙΑΤΡΙΒΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟΥ ΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙ ΙΚΕΥΣΗΣ ΦΕΡΤΑΚΗΣ Ε. ΒΑΣΙΛΕΙΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2006

2 Ευχαριστίες Ευχαριστίες Πάτρα, Ιανουάριος 2006, Η παρούσα διπλωµατική εργασία µε τίτλο: «Σηµατοδοτικά πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα ρυθµίζουν την µεταγωγή µηνυµάτων κατά την κυτταροφαγία των αιµοκυττάρων της µύγας της Μεσογείου. Ο ρυθµιστικός ρόλος της FAK και η συµµετοχή των ιντεγκρινών, των MAPKs και άλλων σηµατοδοτικών µορίων», διεξήχθη στο εργαστήριο της Βιολογίας Κυττάρου του τµήµατος Βιολογίας του Πανεπιστήµιου Πατρών, υπό την επίβλεψη και πνευµατική καθοδήγηση του καθηγητή κ. Μαρµάρα Β. και της αναπληρώτριας καθηγήτριας κα Λαµπροπούλου- Μαρµάρα Μ. Ήταν τιµή για µένα να εργαστώ στο συγκεκριµένο εργαστήριο, διότι µου δόθηκε η ευκαιρία να γνωρίσω από κοντά τον τρόπο µε τον οποίο διεξάγεται µια επιστηµονική µελέτη και να έρθω σε άµεση επαφή µε όλους τους ερευνητές που εργάζονταν στο χώρο αυτό. Στο εργαστήριο αυτό, δεν έµαθα µόνο να χειρίζοµαι µε ευχέρεια τα διάφορα όργανα, αλλά έµαθα να σκέφτοµαι απλά, να ιεραρχώ τις εργασίες µου και να χρησιµοποιώ αποδοτικά το χρόνο µου. Επίσης, µου δόθηκε η ευκαιρία να συνειδητοποιήσω τη σηµασία της λεπτοµέρειας, και της οργάνωσης, δύο εννοιών οι οποίες είναι στενά συνυφασµένες µε την επιτυχία των πειραµάτων και όχι µόνο. Θα ήθελα πριν από όλους να ευχαριστήσω τους καθηγητές µου κκ Β. Μαρµάρα, Μ. Λαµπροπούλου-Μαρµάρα, Π. Κατσώρη, Ν. ηµόπουλο οι οποίοι όχι µόνο µου παρείχαν τις γνώσεις τους δίνοντας τροφή για τη σκέψη µου αλλά και µε συµβούλευσαν στην λήψη καθοριστικών αποφάσεων για την µετέπειτα ζωή µου. Σε όλη τη διάρκεια της εκπαίδευσής µου, στο πλευρό µου βρισκόταν ο φίλος, συνεργάτης, συνοδοιπόρος και σύντοµα «σειρά» (στην φανταρική διάλεκτο) Κωνσταντίνος Ντάλλας. Η βοήθεια του είναι ανεκτίµητη και η συνεργασία του άψογη. Μαζί καταφέραµε να ολοκληρώσουµε ευχάριστα και δηµιουργικά τις µεταπτυχιακές σπουδές µας και για το λόγο αυτό δεν µπορώ παρά να του είµαι ευγνώµων. Ιδιαίτερη µνεία χρειάζεται στον Τσάκα Σωτήρη, ο οποίος προσέφερε απλόχερα τις γνώσεις και την πολύτιµη εµπειρία του οιαδήποτε στιγµή και αν τον χρειάστηκα.

3 Ευχαριστίες Η πρόσφορα του (πνευµατική και υλική) σε αυτή την διατριβή είναι πραγµατικά τεράστια µε συµβολή τόσο στην οργάνωση όσο και την εκτέλεση των πειραµάτων. Για το λόγο αυτό αισθάνοµαι την ανάγκη να του εκφράσω µια ακόµη φορά την εκτίµηση µου. Επίσης, πρέπει να τονίσω πως και τα υπόλοιπα µέλη του εργαστηρίου που πραγµατοποιούν τις µεταπτυχιακές τους σπουδές, µου παρείχαν την αµέριστη βοήθειά τους και τις γνώσεις τους, καθ όλη τη διάρκεια των πειραµάτων, γι αυτό ευχαριστώ εκ βαθέων (µε σειρά παλαιότητας) τους Σολδάτο Αναστάσιο, Λάµπρου Ειρήνη, Μάµαλη Ειρήνη, Μαυρούλη Μαρία και Σίδερη Μαρία. Βεβαίως, δεν ξεχνώ και τους µικρότερους (διπλωµατικούς) φίλους µου Νάνσυ, Σπύρο, Φώτη, Γίαννη, Κατερίνα και Τίνα, ένα µεγάλο ευχαριστώ για τις ωραίες στιγµές που περάσαµε µαζί στο εργαστήριο. Τέλος, το θερµότερο ευχαριστώ στους γονείς µου, στον αδελφό µου και στους φίλους µου Έλσα, Θύµιο, Γιώτα, ηµήτρη, Ελένη, για την ηθική και ψυχική στήριξη που µου παρείχαν. Ιδιαίτερα, το Ελσάκι µου αποτέλεσε (και αποτελεί) την έµπνευση µου και για αυτό της αφιερώνω αυτή την εργασία Βασίλης Φερτάκης

4 Περιεχόµενα ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Εισαγωγή 1 Έντοµα, Αιµοκύτταρα Και Ανοσολογικές Αποκρίσεις 2 Γενικά Για Τα Έντοµα ως πειραµατικό υλικό 2 Το δίπτερο Ceratitis capitata 3 Το Ανοσοποιητικό Σύστηµα Των Εντόµων 6 Τύποι Αιµοκυττάρων 7 Κυτταρικές Ανοσολογικές Αποκρίσεις Εντόµων 10 Αναγνώριση Εισβολέων 10 Ορολογικοί Υποδοχείς Αναγνώρισης Προτύπου 10 Κυτταρικοί Υποδοχείς Αναγνώρισης Προτύπου 11 Αναγνώριση Άλλων Στόχων 12 Αποκρίσεις Αιµοκυττάρων 13 Κυτταροφαγία 13 Κυτταρική Εγκύστωση Και Σχηµατισµός Οζιδίων 15 Κυτταρική Επικοινωνία 16 Εισαγωγή 16 Βασικές Αρχές Της Κυτταρικής Επικοινωνίας 17 Γενικά 17 Μηχανισµοί Κυτταρικής Επικοινωνίας 19 Μηνυµατοφόρα Μόρια 20 Κάθε Κύτταρο Είναι Προγραµµατισµένο Να Ανταποκρίνεται Σε Συγκεκριµένους Συνδυασµούς Εξωκυτταρικών Μηνυµατοφόρων Μορίων. 21 Υποδοχείς Κυτταρικής Επιφάνειας 22 Μόρια Που Συµµετέχουν Στην Ενδοκυτταρική Μεταβίβαση Μηνυµάτων 26 Πρωτεΐνες Μικροτσίπ. Πως Μια Πρωτεΐνη Μπορεί Να Λειτουργεί Ως «Λογική Πύλη»; Το Παράδειγµα Της Πρωτεϊνικής Κινάσης Src. 39 Ενδοκυτταρικοί Οδοί Μεταβίβασης Μηνυµάτων 41 Συµπεράσµατα 45 Μεταβίβαση Μηνυµάτων Από Σηµεία Επαφής Κυττάρου-Κυττάρου Και Κυττάρου- 47 Εξωκυτταρικής Ύλης Ιντεγκρίνες 47 Πρωτεΐνες Που Συνδέουν Τις Ιντεγκρίνες Με Τον Κυτταροσκελετό. 50 Οδοί ιαµέσου Ιντεγκρινών 53 Rho Πρωτεΐνες Και Κυτταροσκελετός 54 Παξιλίνη, Μια Πρωτεΐνη Συνδετήρας Των Εστιών Προσκόλλησης 55 Η οµή Της Παξιλίνης Είναι Υπεύθυνη Για Τις Αλληλεπιδράσεις Με Άλλες 56 Πρωτεΐνες. Η Παξιλίνη Φωσφορυλιώνεται Σε Αµινοξέα Τυροσίνης, Σερίνης Και Θρεονίνης. 57 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (Focal Adhesion Kinase) 59 Γενικά 59 Ο Βιολογικός Ρόλος Της FAK 59 οµικά Χαρακτηριστικά Της Πρωτεΐνης FAK 61 Η Κεντρική Περιοχή Είναι Το Καταλυτικό Κέντρο Του Ενζύµου(Κινάση). 63 Η Αµινοτελική Περιοχή Της FAK Χαρακτηρίζεται Από Μια FERM Περιοχή. 65 Η Καρβόξυ-Τελική Περιοχή Της FAK Είναι Υπεύθυνη Για Τις Περισσότερες Από Τις Αλληλεπιδράσεις Του Μορίου Με Άλλες Πρωτεΐνες. 67 FAK: Ένα Εξελικτικά Συντηρηµένο Μόριο. Η Σύγκριση Με Την Dfak Η Τυροσίνη 397 Αποτελεί Θέση Αυτοφωσφορυλίωσης Και Θέση Πρόσδεσης Για Πρωτεΐνες Που Φέρουν SH2 Περιοχές 70

5 Περιεχόµενα Η Καρβοξυτελική Περιοχή Της FAK Είναι Υπεύθυνη Για Την Στόχευση Της Πρωτεΐνης Στις Εστίες Προσκόλλησης Μέσω Της FAT Υποπεριοχής 71 Μηχανισµοί Ενεργοποίησης Της Κινάσης Εστιακής Προσκόλλησης 74 ιαµοριακή ενεργοποιηση της FAK 74 Ενδοµοριακή ενεργοποίηση της FAK 76 Η Λειτουργία Της FAK Ρυθµίζεται Από Φωσφορυλιώσεις Σε Αµινοξέα Τυροσίνης 79 Και Σερίνης Η Ενεργοποίηση Της FAK Και Η Src 81 Η Ενεργοποίηση Της Src: Φωσφορυλιώσεις-Αποφωσφορυλιώσεις Και Λοιπές 83 Αλληλεπιδράσεις Μετά Από ιέγερση Των Ιντεγκρινών Μοντέλα Ενεργοποίησης Της FAK Και Της Src. Σχηµατισµός Σηµατοδοτικού 85 Συµπλόκου Αναστέλλοντας Την FAK 86 FIP 200: Αρνητικός Ρυθµιστής Της FAK 86 Πρωτεϊνικές Φωσφατάσες Τυροσίνης. 86 Πρωτεολυτικό Σπάσιµο Της FAK 88 Μεταγωγή Σηµάτων Μέσω Της FAK (FAK Signaling) 90 FAK Και MAP Κινάσες 90 Συνεισφορά Της FAK Σε Σηµαντικές Βιολογικές Αποκρίσεις Του Κυττάρου. 92 FAK: Ένας ιακόπτης Που Ρυθµίζει Πολλαπλά Σηµατοδοτικά Μονοπάτια 92 FAK, Rho Και Η Ρύθµιση Της υναµικής Των Εστιών Προσκόλλησης. 93 FAK Και Κυτταρική Κινητικότητα 95 FAK Και Κυτταρικός Κύκλος 95 FAK Και Απόπτωση 96 Ο Ρόλος Της Κινάσης Εστιακών Προσκολλήσεων (FAK) Στον Καρκίνο 98 Ρύθµιση Της ράσης Της FAK Στα Καρκινικά Κύτταρα 98 Κινάσες ενεργοποιούµενες από µιτογόνα: Σύστηµα MAPKs Κινασών 104 Γενικά 104 Οργάνωση και εξειδίκευση των ΜΑΡΚ οδών 107 MAPK οδοί θηλαστικών 109 ERK1/2 οδός 109 p38 οδός 112 JNK / SAPK οδός 114 Άλλες ΜΑΡ κινάσες 116 Απενεργοποίηση των ΜΑΡΚ 117 Υποστρώµατα των ΜΑΡΚ 117 MAPK Οδοί: Η Μεταγωγή Σηµάτων Στα Έντοµα 119 Σκοπός Της ιατριβής 120 Υλικά Και Μέθοδοι 122 Συνοπτικός Πίνακας Με Αναφορά Στα Υλικά Που Χρησιµοποιήθηκαν Για Την 122 Εκπόνηση Της Μεταπτυχιακής Εργασίας. Καλλιέργεια Του Εντόµου Ceratitis capitata 126 Ενήλικα Άτοµα 127 Προνυµφικά Στάδια 128 Αποµόνωση Αιµοκυττάρων 130 Καλλιέργεια Αιµοκυττάρων 132 Καλλιέργεια Βακτηρίου Ε. coli 132 Ποσοτικός Προσδιορισµός Πρωτεϊνών 133 Ηλεκτροφόρηση Πολυακρυλαµιδίου 135 SDS -PAGE 137

6 Περιεχόµενα Ανοσοαποτύπωση 143 Αποµάκρυνση Αντισωµάτων 149 Ανοσοκατακρήµνιση 150 Ανοσοεντοπισµός Πρωτεϊνών Με Μικροσκοπία Φωτονική Και Φθορισµού 153 Κυτταροµετρια Ροής (Flow Cytometry) 158 Elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 163 Αποτελέσµατα 167 Γενικές Παρατηρήσεις-Αποτελέσµατα Μέχρι Σήµερα 168 Πειράµατα Πιστοποίηση της έκφρασης της Fak στα αιµοκύτταρα της C.capitata Εντοπισµός της Fak µε ανοσοφθορισµό στα αιµοκύτταρα της C.capitata Έλεγχος της κατανοµής της Fak σε αιµοκύτταρα αναπτυξιακών σταδίων του εντόµου C.capitata Αλληλεπίδραση της FAK µε τις ιντεγκρινικές υποµονάδες β1 και β3 στα αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata Πιστοποίηση της παξιλίνης µε ανοσοκατακρήµνιση και εντοπισµός της µε ανοσοφθορισµό στα αιµοκύτταρα της C.capitata Η παξιλίνη αλληλεπιδρά µε την Fak σε κύτταρα που βρίσκονται σε εναιώρηµα δίχως εξωκυτταρική ενεργοποίηση των κυττάρων. 7. Βακτήριο επαγόµενη ενεργοποίηση της FAK σε αιµ οκύτταρα της Ceratitis capitata Η έκκριση των φαγοκυττάρων επηρεάζει την κυτταροφαγία των βακτηρίων E.coli Κινητική της κυτταροφαγίας των βακτηρίων E.coli από τα αιµοκύτταρα Η διαµόρφωση της FAK αλλάζει κατά την βακτήριο-επαγόµενη ενεργοποίηση της Η FAK συµµετέχει στο σχηµατισµό µεγάλων πολύπρωτεϊνικών συµπλόκων των οποίω ν η σύσταση αλλάζει κατά την διάρκεια της κυτταροφαγίας βακτηρίων. Συµµετοχή του κυτταροσκελετού της ακτίνης και των µικροσωληνίσκων στα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα της FAK Συνεντοπισµός της phospho-fak Y397 και του κυτταροσκελετού τουµπουλίνης στα αιµοκύτταρα της C.capitata. 204 Συµµετοχή της ERK MAPK στα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα που σχηµατίζει η FAK σε φυσιολογικές συνθήκες και κατά την κυτταροφαγία βακτηρίων. Συµµετοχή του µεταγραφικού παράγοντα Elk-1 στα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα που σχηµατίζει η FAK σε φυσιολογικές συνθήκες και κατά την κυτταροφαγία βακτηρίων Συµµετοχή της παξιλίνης, µιας πρωτεΐνης-συνδετήρα, στα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα που σχηµατίζει η FAK κατά την κυτταροφαγία της E.coli. 216 Συµµετοχή της P13K και της Akt στα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα που σχηµατίζει η FAK κατά την κυτταροφαγία της E.coli. 218 Συµµετοχή της Src στα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα που σχηµατίζει η FAK κατά την κυτταροφαγία της E.coli Μεταγωγή σηµάτων κατά την κυτταροφαγία της E.coli από τα αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata διαµέσου της FAK. 224 Αναστολείς του κυτταροσκελετού ακτίνης και των µ ικροσωληνίσκων (κυτταροσκελετός τουµπουλίνης). Συµβολή των Rho, Ras, c-raf 1, MEK 1/2 πρωτεϊνών στην ενεργοποίηση της FAK µετά από επώαση µε βακτήρια E.coli. Η συµβολή της P13k και της Akt στην ενεργοποίηση της FAK κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων της E.coli. Η συµβολή της Src και άλλων κινασών τυροσίνης, αλλά και πρωτεϊνασών όπως την καλπαΐνη στην ενεργοποίηση της FAK κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων της E.coli. Συζήτηση-Συµπεράσµατα 236 Βιβλιογραφία

7 Εισαγωγή Εισαγωγή 1

8 Έντοµα - Ceratitis capitata Έντοµα, Αιµοκύτταρα και Ανοσολογικές αποκρίσεις Γενικά για τα έντοµα ως πειραµατικό υλικό Τα έντοµα συγκροτούν την πολυπληθέστερη οµοταξία οργανισµών στο ζωικό βασίλειο που περιλαµβάνει τουλάχιστο γνωστά είδη, τα οποία καταλαµβάνουν όλους τους οικολογικούς θώκους του πλανήτη. Τα έντοµα παρουσιάζουν διακριτά αναπτυξιακά στάδια και σχετικά µικρό βιολογικό κύκλο ζωής. Τα χαρακτηριστικά αυτά, τα καθιστούν ελκυστικά πειραµατικά συστήµατα για την µελέτη των µηχανισµών διαφοροποίησης, της ανάπτυξης των κυττάρων και άλλων βασικών τοµέων της βιολογίας, όπως είναι η µελέτη του ανοσοποιητικού συστήµατος. Η µελέτη του ανοσοποιητικού συστήµατος των εντόµων, µε την χρήση βιοχηµικών, ανοσολογικών και µοριακών τεχνικών, αποσκοπεί στη διαλεύκανση των µηχανισµών που εµπλέκονται στην άµυνα των οργανισµών αυτών και την εύρεση των µορίων που συµµετέχουν στην κυτταρική και ορολογική ανοσία. Τα αποτελέσµατα τέτοιων µελετών είναι πολύ χρήσιµα για την βασική έρευνα, γιατί µας δίνουν πληροφορίες για την εξέλιξη του συστήµατος άµυνας στις διάφορες κατηγορίες οργανισµών, καθώς και για τις αλληλεπιδράσεις των διάφορων µορίων που εµπλέκονται στις ανασοαποκρίσεις. Εικόνα 1. Η µύγα της Μεσογείου, Ceratitis capitata. Εκτός, όµως, από την συµβολή τους στην βασική έρευνα, η µελέτη του ανοσοποιητικού συστήµατος των εντόµων έχει και πρακτικές εφαρµογές. Πολλά είδη εντόµων προκαλούν σοβαρά προβλήµατα στον άνθρωπο, είτε αυτά αφορούν στην 2

9 Έντοµα - Ceratitis capitata υγεία του, όπως στην περίπτωση της ελονοσίας που προκαλεί το κουνούπι, είτε στην οικονοµία και στην ευηµερία της κοινωνίας λόγω των καταστροφών που προκαλούν, σε είδη µεγάλης οικονοµικής αξίας στα οποία παρασιτούν και τα οποία εκµεταλλεύεται ο άνθρωπος. Τέτοια παραδείγµατα παρασίτων αποτελούν ο δάκος (Dacus oleae) ως παράσιτο της ελιάς και η µεσογειακή µύγα (Ceratitis capitata) ως παράσιτο σε περισσότερα από 250 είδη φρούτων και λαχανικών στις περιοχές της Μεσογείου, Μέσης Ανατολής, Λατινικής και Βορείου Αµερικής, Αυστραλίας και Αφρικής (Εικόνα 2). Γίνεται, λοιπόν, εύκολα αντιληπτό το πόσο απαραίτητη είναι η µελέτη της και η κατανόηση της φυσιολογίας και της βιοχηµείας τέτοιων οργανισµών, ώστε να γίνει εφικτός ο σχεδιασµός βιολογικών λύσεων για τον έλεγχο του πληθυσµού, χωρίς την επιβάρυνση του περιβάλλοντος µε χηµικά µέσα. Εικόνα 2. Η παγκόσµια κατανοµή του εντόµου Ceratitis capitata. Το δίπτερο Ceratitis capitata Στο εργαστήριο της Βιολογίας Κυττάρου χρησιµοποιείται ως πειραµατόζωο µελέτης του ανοσοποιητικού συστήµατος το ολοµετάβολο έντοµο Ceratitis capitata (Εικόνα 1). Το έντοµο αυτό είναι γνωστό και ως µύγα της Μεσογείου ή φρουτόµυγα. Ο κύκλος της ζωής των ολοµετάβολων εντόµων, όπως είναι το δίπτερο Ceratitis 3

10 Έντοµα - Ceratitis capitata capitata, περιλαµβάνει τα στάδια του αυγού, της προνύµφης (larva), της νύµφης (pupa) και του ενήλικου ατόµου (adult) (Εικόνα 3). Το στάδιο της προνύµφης του εντόµου είναι ειδικά εξειδικευµένο για την πρόσληψη της τροφής του. Κατά το στάδιο αυτό αποθηκεύονται τα θρεπτικά συστατικά που θα χρησιµοποιηθούν κατά την µεταµόρφωση της προνύµφης σε νύµφη, καθώς και για το νυµφικό στάδιο ανάπτυξης. Η µεταµόρφωση της προνύµφης σε νύµφη ονοµάζεται νυµφοποίηση (pupariation). Κατά το στάδιο αυτό, η προνύµφη του εντόµου της Ceratitis capitata συσπάται έντονα µε αποτέλεσµα να αποµακρύνεται από το θρεπτικό υλικό, σε αυτό το στάδιο γίνεται η συλλογή των ατόµων τα οποία χρησιµοποιούµε για τα πειράµατα του εργαστηρίου. Στη συνέχεια, η προνύµφη ακινητοποιείται στο έδαφος όπου αρχίζει να επιτελείται η σκλήρυνση του περιβλήµατος (στάδιο λευκής νύµφης), µετά ακολουθεί η διαδικασία χρωµατισµού του περιβλήµατος. Το νυµφικό στάδιο παρουσιάζεται επιφανειακά αδρανές, όµως στο εσωτερικό του ατόµου λαµβάνει χώρα η δηµιουργία των δοµών που θα αποτελέσουν τους ιστούς του ώριµου ενήλικου άτοµου (Μπουρνάζος Σταύρος 1996, Ζέρβας Χρήστος 1998). Εικόνα 3. Τα στάδια του κύκλου ζωής της Ceratitis capitata 4

11 Έντοµα - Ceratitis capitata Η συστηµατική κατάταξη του εντόµου είναι η ακόλουθη: Συνοµοταξία Υποσυνοµοταξία Οµοταξία Υφοµοταξία Υπέρταξη Τάξη Υπόταξη Ανθυπόταξη Οικογένεια Γένος Είδος Αρθρόποδα Ευτραχειωτά Έντοµα Πτερυγωτά Ολοµετάβολα ίπτερα Βραχύκερα Κυκλόρραφα Tephritidae Ceratitis capitata Εικόνα 4. Φυτικά είδη στα οποία παρασιτεί η µύγα της Μεσογείου. 5

12 Ανοσοποιητικό Σύστηµα Εντόµων Το ανοσοποιητικό σύστηµα των εντόµων Τα έντοµα δεν διαθέτουν επίκτητο σύστηµα ανοσίας (όπως οι ανώτεροι οργανισµοί) αλλά έχουν αποκτήσει εξελικτικά αποτελεσµατικούς µηχανισµούς για την αντιµετώπιση προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών µικροοργανισµών, το σύστηµα της εγγενούς ανοσίας (innate response). Η άµυνα πρώτης γραµµής περιλαµβάνει κύτταρα ή κυτταρικά προϊόντα που σχετίζονται µε το περίβληµα, το έντερο και την τραχεία. Όταν οι µικροοργανισµοί διαπεράσουν τους παραπάνω φραγµούς και εισβάλλουν στο αιµόκοιλο του ξενιστή, αντιµετωπίζουν τους αµυντικούς µηχανισµούς που αντιστοιχούν στις ορολογικές και κυτταρικές αποκρίσεις του ανοσοποιητικού συστήµατος των εντόµων. Η ορολογική απόκριση (humoral) συνίσταται στην παραγωγή αντιµικροβιακών πεπτιδίων από το λιπαρό σώµα (Hoffmann 2003, Janeway and Medzhitov 2002, Lowenberger 2001, Meister et al. 2000), ενεργών παραγώγων οξυγόνου και αζώτου (Bogdan et al. 2000, Nappi and Ottavianni 2000, Vass and Nappi 2001) και ενζύµων που ρυθµίζουν την πήξη της αιµολέµφου και τη µελανογένεση (Gillespie et al. 1997, Mavrouli et al. 2005). Αντίθετα, η κυτταρική άµυνα συνίσταται σε αποκρίσεις των αιµοκυττάρων όπως την κυτταροφαγία, τον σχηµατισµό οζιδίων και την εγκύστωση (Schmidt et al. 2001; Nappi et al. 2004, Metheniti et al. 2001, Lamprou et al. 2005). Ωστόσο, η διάκριση σε ορολογικές και κυτταρικές αποκρίσεις είναι ως ένα σηµείο αυθαίρετη καθώς πολλοί ορολογικοί παράγοντες επηρεάζουν τη λειτουργία των αιµοκυττάρων και αντίστροφα τα αιµοκύτταρα αποτελούν σηµαντική πηγή αρκετών ορολογικών παραγόντων. Επιπλέον, παρατηρείται εκτεταµένη αλληλοεπικάλυψη σε διαδικασίες όπως η αναγνώριση των εισβολέων. Τα αιµοκύτταρα αναγνωρίζουν ένα ξένο σώµα είτε άµεσα, µέσω των υποδοχέων της επιφάνειας τους που αλληλεπιδρούν µε µόρια του ξένου οργανισµού, είτε έµµεσα, αναγνωρίζοντας ορολογικούς υποδοχείς που έχουν προσδεθεί και οψωνινοποιήσει την επιφάνεια του εισβολέα (Lavine and Strand 2002). Τα τελευταία χρόνια έχουν γίνει µεγάλα βήµατα στην ταυτοποίηση των αντιµικροβιακών πεπτιδίων και των οδών που ρυθµίζουν τη σύνθεσή τους. Όµως οι δυσκολίες που εµφανίζονται σε τέτοιες µελέτες είναι πολλές. Για παράδειγµα το µικρό µέγεθος πολλών εντόµων δυσκολεύει πολύ τη συλλογή αιµοκυττάρων και κατ επέκταση την ταυτοποίηση µορίων που παράγονται από αυτά. Επίσης, είναι δύσκολη 6

13 Ανοσοποιητικό Σύστηµα Εντόµων η διεξαγωγή περίπλοκων in vivo πειραµάτων για τη µελέτη των κυτταρικών ανοσοαποκρίσεων αλλά και η αποµόνωση συγκεκριµένων κυτταρικών πληθυσµών προκειµένου να χρησιµοποιηθούν σε in vitro πειράµατα. Τύποι αιµοκυττάρων Τα έντοµα παράγουν διάφορους τύπους αιµοκυττάρων οι οποίοι παραδοσιακά ταυτοποιούνται µε βάση µορφολογικά, ιστοχηµικά και λειτουργικά κριτήρια. Τα τελευταία χρόνια όµως, η χρήση αντισωµάτων και γενετικών µαρτύρων έδωσε ένα νέο, πιο αξιόπιστο τρόπο διαχωρισµού των διαφόρων κυτταρικών τύπων (Lebestky et al. 2000, Willott et al. 1994). Οι πιο κοινοί τύποι αιµοκυττάρων που αναφέρονται στη βιβλιογραφία είναι τα προαιµοκύτταρα (prohemocytes), τα κοκκιοκύτταρα (granulocytes), τα πλασµατοκύτταρα (plasmatocytes), τα σφαιροκύτταρα (spherule cells) και τα οινοκυτοειδή (oenocytoids) (Εικόνα 5). Αυτοί οι τύποι αιµοκυττάρων έχουν βρεθεί σε είδη διαφορετικών τάξεων των εντόµων όπως σε Λεπιδόπτερα, ίπτερα, Ορθόπτερα, Κολεόπτερα, Υµενόπτερα και άλλα (Lavine and Strand 2002). Εικόνα 5. Πέντε τύποι αιµοκυττάρων που απαντώνται στα Λεπιδόπτερα. (Α) Προαιµοκύτταρο, (Β) Σφαιροκύτταρο, (C) Οινοκυτοειδές, (D) Κοκκιοκύτταρα και (Ε) Πλασµατοκύτταρα (Lavine and Strand 2000). 7

14 Τύποι Αιµοκυττάρων Στο προνυµφικό στάδιο των Λεπιδόπτερων, οι µόνοι τύποι αιµοκυττάρων που έχουν την ικανότητα προσκόλλησης σε ξένες επιφάνειες είναι τα κοκκιοκύτταρα και τα πλασµατοκύτταρα. Τα τελευταία αποτελούν πάνω από το 50% των κυκλοφορούντων αιµοκυττάρων (Strand and Pech 1995, Lackie 1988). Οι άλλοι τύποι αιµοκυττάρων που αναφέρονται στα Λεπιδόπτερα είναι τα σφαιροκύτταρα, τα οινοκυτοειδή και τα προαιµοκύτταρα. Τα σφαιροκύτταρα µεταφέρουν συστατικά του επιδερµιδίου ενώ τα οινοκυτοειδή περιέχουν πρόδροµα κυτταροπλασµατικά µόρια φαινολοξειδάσης που παίζουν ρόλο στην παραγωγή µελανίνης και στη µελανοτική εγκύστωση. Τα προαιµοκύτταρα χαρακτηρίζονται ως αρχέγονα κύτταρα, τα οποία διαφοροποιούνται σε ένα ή περισσότερους από τους προαναφερόµενους κυτταρικούς τύπους. Στη Drosophila, τα αιµοκύτταρα έχουν διαφορετική ονοµασία από αυτά των υπολοίπων εντόµων (Lanot et al. 2001). Στο έντοµο αυτό, η αιµοποίηση πραγµατοποιείται σε δύο φάσεις κατά την ανάπτυξη, και προκύπτουν τρεις σειρές αιµοκυττάρων που παρουσιάζουν κοινά χαρακτηριστικά µε τις µυελοειδείς σειρές των θηλαστικών. Η πρώτη φάση λαµβάνει χώρα στο δεύτερο µισό της εµβρυογένεσης όταν ένας πληθυσµός αιµοκυττάρων ξεκινά από το προκεφαλικό µεσόδερµα και µεταναστεύει για να αποικίσει όλο το έµβρυο (Tepass et al. 1994). Αυτά τα κύτταρα καλούνται πλασµατοκύτταρα και δρουν ως µακροφάγα καθώς εξαλείφουν τα αποπτωτικά κύτταρα. Ένας δεύτερος πληθυσµός διαφοροποιείται ταυτόχρονα κοντά στην πρόσθια περιοχή του εντέρου όπου και παραµένει (Lebestky et al. 2000). Ονοµάζονται κρυσταλλοκύτταρα και ο ρόλος τους στο έµβρυο είναι άγνωστος. Περιέχουν πρόδροµα µόρια φαινολοξειδάσης και µορφολογικά µοιάζουν µε τα οινοκυτοειδή των άλλων εντόµων. Οι λεµφικοί αδένες είναι οι κύριες περιοχές αιµοποίησης κατά τα προνυµφικά στάδια (Lanot et al. 2001). Αποτελούνται από ποικίλο αριθµό ζευγαριών λοβών που είναι τοποθετηµένα κατά µήκος του ραχιαίου αγγείου. Στους οπίσθιους λοβούς υπάρχουν κυρίως µη διαφοροποιηµένα πρόδροµα κύτταρα, τα προαιµοκύτταρα. Πιο µπροστά παρατηρούνται διαφοροποιηµένα κύτταρα, που απελευθερώνονται στην κυκλοφορία (Evans and Banerjee 2003). Τα κυκλοφορούντα αιµοκύτταρα είναι στην πλειοψηφία τους, πλασµατοκύτταρα ή φαγοκύτταρα και ένα µικρό ποσοστό, περίπου 5% αντιστοιχεί σε κρυσταλλοκύτταρα (crystal cells). Στους πρόσθιους λοβούς των λεµφαδένων υπάρχει ένας επιπλέον τύπος κυττάρων που παρουσιάζει χαρακτηριστικά 8

15 Τύποι Αιµοκυττάρων έντονης πρωτεϊνοσύνθεσης. Αυτά τα εκκριτικά κύτταρα δεν απαντώνται στη κυκλοφορία. Τέλος, στις προνύµφες υπάρχει µια τρίτη ανεξάρτητη σειρά αιµοκυττάρων, γνωστά ως ελασµατοκύτταρα (lamelocytes), που διαφοροποιούνται µαζικά στους λεµφαδένες µετά από περιπτώσεις παρασιτισµού. Πρόκειται για µεγάλα επίπεδα κύτταρα που συµµετέχουν στην εγκύστωση εισβολέων που είναι αρκετά µεγάλοι για να υποστούν κυτταροφαγία (Meister and Lagueux 2003). Τα έντοµα συνεχίζουν την παραγωγή αιµοκυττάρων κατά την διάρκεια των σταδίων της προνύµφης και νύµφης είτε µε την διαίρεση των αρχέγονων κυττάρων που εντοπίζονται στα µεσοδερµικής προέλευσης αιµοποιητικά όργανα είτε µε την διαίρεση των αιµοκυττάρων που βρίσκονται ήδη στην κυκλοφορία (Lavine et al. 2002). Κατά την έναρξη της µεταµόρφωσης, οι λεµφαδένες απελευθερώνουν µεγάλους αριθµούς ενεργών φαγοκυττάρων που παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ανακατασκευή των ιστών καθώς πραγµατοποιούν κυτταροφαγία κυττάρων των κατεστραµµένων προνυµφικών δοµών. Κατά τη διαδικασία αυτή, αποµακρύνουν τα υπολείµµατα των λεµφαδένων, µε αποτέλεσµα στα τελευταία στάδια να µην υπάρχει κανένα αιµοποιητικό όργανο (Lanot et al. 2001). Όλες οι τροποποιήσεις των ιστών που σχετίζονται µε τη µεταµόρφωση βρίσκονται κάτω από τον έλεγχο της στεροειδούς ορµόνης εκδυσόνης (Sorrentino et al. 2002, Lanot et al. 2001). Στα ενήλικα άτοµα της Drosophila, ο κυρίαρχος τύπος αιµοκυττάρων που υπάρχει στην κυκλοφορία είναι τα πλασµατοκύττταρα (Meister and Richards 1996) (Εικόνα 6). Εικόνα 6. Οι τρεις τύποι αιµοκυττάρων που απαντώνται στη Drosophila. (Α) Πλασµατοκύτταρα, (Β) Κρυσταλλοκύτταρο, (Γ) Ελασµατικύτταρο (φωτογραφία από ηλεκτρονικό µικροσκόπιο διέλευσης,bars: 2µm) (Meister and Lagueux 2003). 9

16 Ανοσολογικές Αποκρίσεις Εντόµων Κυτταρικές ανοσολογικές αποκρίσεις εντόµων Αναγνώριση εισβολέων Τα έντοµα δεν έχουν την ικανότητα εξειδικευµένων ανοσοαποκρίσεων και γι αυτό ένα θεµελιώδες ερώτηµα για το ανοσοποιητικό τους σύστηµα είναι το πώς καταφέρνουν να διακρίνουν ξένους προς τον οργανισµό τους παράγοντες. Τα κύτταρα των σπονδυλωτών, κατά την εξέλιξη, ανέπτυξαν υποδοχείς αναγνώρισης (pattern-recognition receptors, PRRs), οι οποίοι δεσµεύουν συντηρηµένες µοριακές δοµές παθογόνων µικροοργανισµών (pathogen-associated molecular pattern, PAMP), όπως δοµές βακτηρίων ή µυκήτων (Fearon 1997). Οι πιο γνωστές PAMPs είναι συστατικά του κυτταρικού τοιχώµατός τους όπως ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS), η πεπτιδογλυκάνη και οι β-1,3-γλυκάνες, τα οποία αναγνωρίζονται είτε από ορολογικούς (διαλυτούς) είτε από κυτταρικούς υποδοχείς PRRs. Οι διαλυτοί PRRs, όπως η πρωτεΐνη δέσµευσης της µαννόζης, προσδένονται στα PAMPs µε συνέπεια τον οψωνισµό του εισβολέα. Το σύµπλοκο αυτό στη συνέχεια αναγνωρίζεται από πρωτεΐνες-υποδοχείς της επιφάνειας των αιµοκυττάρων. Αντίθετα, οι κυτταρικοί PRRs εκφράζονται στην επιφάνεια ανοσοκυττάρων και δεσµεύουν τα ΡΑΜΡs άµεσα (Aderem and Underhill 1999). Ορολογικοί υποδοχείς αναγνώρισης προτύπου (PRRs) Στα έντοµα (αλλά και στα θηλαστικά) έχουν ταυτοποιηθεί ως πιθανοί PRRs αρκετοί διαλυτοί παράγοντες όπως λεκτίνες, η αιµολίνη, η πρωτεΐνη δέσµευσης του LPS (LPS-binding protein, LBP), η πρωτεΐνη δέσµευσης αρνητικών κατά Gram βακτηρίων (Gram-negative bacteria recognition protein, GNBP), η πρωτεΐνη δέσµευσης πεπτιδογλυκάνης (peptidoglycan binding protein) (Lavine et al. 2002, Schmidt et al. 2001). Οι υποδοχείς αναγνώρισης των διαλυτών PRRs τόσο στα αιµοκύτταρα όσο και στους άλλους ιστούς παραµένουν άγνωστοι. Αυτό που είναι γνωστό από µελέτες είναι ότι ορισµένοι από αυτούς τους παράγοντες, αφού προσδεθούν σε παθογόνα, επάγουν ή ενισχύουν τις ανοσοαποκρίσεις στα αιµοκύτταρα, όπως την κυτταροφαγία ή τον σχηµατισµό οζιδίων. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγµα είναι η πρωτεΐνη δέσµευσης του LPS από το Bombyx 10

17 Ανοσολογικές Αποκρίσεις Εντόµων mori (BmLBP). Η BmLBP προσδένεται σε άγρια στελέχη Escherichia coli προκαλώντας σχηµατισµό οζιδίων πολύ πιο γρήγορα από ότι στα στελέχη E. coli που δεν αναγνωρίζονται από την BmLBP (Koizumi et al. 1999). Οι περισσότεροι ορολογικοί PRRs που έχουν ταυτοποιηθεί στα έντοµα σχετίζονται µε την αναγνώριση και δέσµευση του LPS. Έχουν βρεθεί σε πολλά έντοµα, όµως φαίνεται ότι το µόνο κοινό τους χαρακτηριστικό είναι η ικανότητά τους να δεσµεύουν LPS καθώς εµφανίζουν σηµαντικές δοµικές και λειτουργικές διαφορές µεταξύ τους. Τέλος, στα αιµοκύτταρα της µεσογειακής µύγας έχει ταυτοποιηθεί µια πρωτεΐνη, η p47, η οποία συµµετέχει στη δέσµευση του LPS στα αιµοκύτταρα και την εσωτερίκευση του δεσµευµένου LPS (Charalambidis et al. 1996). Η δέσµευση της p47 µε τον LPS είναι οµοιοπολική και γίνεται µε τη µεσολάβηση παραγώγων τυροσίνης τα οποία προκύπτουν από τη δράση της φαινολοξειδάσης. Κυτταρικοί υποδοχείς αναγνώρισης προτύπου (PRRs) Για τους κυτταρικούς PRRs πολύ λίγα είναι γνωστά. Στα θηλαστικά, ως υποδοχείς PRRs θεωρούνται οι Toll-like υποδοχείς καθώς αναγνωρίζουν απευθείας τον LPS και άλλα µικροβιακά προϊόντα. Οι υποδοχείς αυτοί, στη συνέχεια, ενεργοποιούν οδούς µεταγωγής µηνυµάτων µε αποτέλεσµα την παραγωγή κυτταροκινών (Akira 2001). Μια άλλη κατηγορία πιθανών κυτταρικών PRRs είναι και οι ιντεγκρίνες. Πρόκειται για µια µεγάλη οικογένεια (α,β)-ετεροδιµερών διαµεµβρανικών πρωτεϊνών που παράγονται από τα µετάζωα σε διάφορους ιστούς και κύτταρα. Ο συνδυασµός συγκεκριµένης α και β υποµονάδας καθορίζει την ειδικότητα προς τα προσδέσµατα (ligand) η οποία ποικίλει έντονα µεταξύ των µελών της οικογένειας των ιντεγκρινών και φυσικά, εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου. Στα θηλαστικά, οι ιντεγκρίνες προσδένονται σε πρωτεΐνες της εξωκυτταρικής ύλης (extracellular matrix, ECM), όπως η λαµινίνη, το κολλαγόνο IV και η φιµπρονεκτίνη, οι οποίες περιέχουν την αλληλουχία αναγνώρισης Arg-Gly-Asp (RGD) (Gonzalez-Amaro et al. 1999) (Εικόνα 7). Επίσης, έχει βρεθεί ότι ορισµένες ιντεγκρίνες, και συγκεκριµένα η β2 ή CD11/CD18, µπορούν να δεσµεύσουν LPS (Lavine et al. 2002). Στη Drosophila έχουν ταυτοποιηθεί γενετικά πέντε α και δύο β υποµονάδες ενώ λειτουργικά έχουν χαρακτηριστεί τρία πλήρη µόρια ιντεγκρινών (Hynes and Zhao 2000). Όλες αυτές οι ιντεγκρίνες είναι απαραίτητες στις αναπτυξιακές διαδικασίες όµως καµία δεν έχει 11

18 Ανοσολογικές Αποκρίσεις Εντόµων εµπλακεί στις διαδικασίες αναγνώρισης µικροοργανισµών. Ωστόσο, µελέτες στη µεσογειακή µύγα, Ceratitis capitata, έδειξαν ότι η κυτταροφαγία της E. coli γίνεται µέσω ενός µηχανισµού που εξαρτάται από τις ιντεγκρίνες και ειδικά τη β3 υποµονάδα (Foukas et al. 1998, Metheniti et al. 2001). Εικόνα 7. Απεικόνιση της δοµής και της τοπογραφίας ενός µορίου ιντεγκρίνης στην κυτταροπλασµατική µεµβράνη. ιακρίνουµε τις διάφορες συνδέσεις του µε κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες, π.χ. την ακτίνη και πρωτεΐνες της ECM όπως την φιµπρονεκτίνη. Αναγνώριση άλλων στόχων Ίσως τελικά δεν είναι τόσο παράξενο το γεγονός ότι τα έντοµα µπορούν µέσω των PRRs να αναγνωρίζουν βακτήρια και µύκητες καθώς οι µικροοργανισµοί αυτοί φέρουν στην επιφάνειά τους πρωτεΐνες που είναι πολύ διαφορετικές βιοχηµικά από αυτές του ξενιστή που προσβάλλουν. Όµως τα αιµοκύτταρα των εντόµων αναγνωρίζουν πολλούς άλλους στόχους, όχι και τόσο διαφορετικούς από αυτά σε µοριακό επίπεδο. Η ποικιλία των στόχων αυτών είναι πολύ µεγάλη και περιλαµβάνει οργανισµούς, όπως πρωτόζωα και νηµατώδεις, µέχρι και αβιοτικούς στόχους, όπως νάιλον, λάτεξ και σφαιρίδια χρωµατογραφίας, δηλαδή, υλικά που τα έντοµα είναι απίθανο να έχουν αντιµετωπίσει στην εξελικτική τους πορεία. Αυτό φυσικά υποδηλώνει ότι το ανοσοποιητικό σύστηµα των εντόµων, παρά την έλλειψη εξειδικευµένων αποκρίσεων, αναγνωρίζει µια ευρύτερη κλίµακα µορίων από τα ΡΑΜΡs των µικροοργανισµών. Εντούτοις ο τρόπος επίτευξης αυτής της αναγνώρισης παραµένει ανεξιχνίαστος. 12

19 Αποκρίσεις Αιµοκυττάρων Αποκρίσεις αιµοκυττάρων Κυτταροφαγία Η κυτταροφαγία είναι µια διαδικασία που απαντάται τόσο σε µονοκύτταρους οργανισµούς (αµοιβάδες, βλεφαριδοφόρα πρωτόζωα) όσο και σε πολυκύτταρους (φαγοκύτταρα). Για τους κατώτερους οργανισµούς (π.χ. πρωτόζωα), η κυτταροφαγία αποτελεί το συνήθη, ή και αποκλειστικό για ορισµένους, τρόπο πρόσληψης της τροφής. Στους ανώτερους οργανισµούς η κυτταροφαγία αποτελεί βασικό στοιχείο του αµυντικού συστήµατος και έχει εκτεταµένα µελετηθεί σε λευκοκύτταρα θηλαστικών όπως τα µακροφάγα (Aderem and Underhill 1999) (Εικόνα 8). Εικόνα 8. Κυτταροφαγία από ουδετερόφιλο. Φωτογραφία από ηλεκτρονικό µικροσκόπιο που απεικονίζει ένα ουδετερόφιλο να φαγοκυτταρώνει ένα βακτήριο. Το βακτήριο βρίσκεται σε φάση διαίρεσης (Η φωτογραφία είναι από τον Dorothy F. Bainton, Phagocytic Mechanisms in Health and Disease. New York: Intercontinental Book Corporation, 1971). Πρόκειται για µια διαδικασία αναγνώρισης και εγκόλπωσης µικροοργανισµών ή καταλοίπων ιστών που συσσωρεύονται κατά τη µόλυνση, τη φλεγµονή ή την επούλωση πληγών (Brown 1994). Είναι απαραίτητη τόσο για την ειδική όσο και για τη µη ειδική άµυνα, για την καταστροφή των παθογόνων εισβολέων και για την αποκατάσταση της οµοιόστασης στα σηµεία προσβολής και φλεγµονής (επούλωση πληγών). Η κυτταροφαγία είναι, επίσης, σηµαντική στην επαγωγή εξειδικευµένης ανοσοαπόκρισης σε παθογόνα, διότι είναι βασική στην παρουσίαση του αντιγόνου κατά την επαγωγή και ενεργοποίηση των λεµφοκυττάρων. Η κυτταροφαγία ξεκινά µε την πρόσδεση του στόχου στον υποδοχέα του. Η πρόσδεση αυτή οδηγεί στην ενεργοποίηση οδών µεταγωγής µηνυµάτων στο κύτταρο µε τελικό αποτέλεσµα την εσωτερίκευση του στόχου µε τη µεσολάβηση του κυτταροσκελετού της ακτίνης και το σχηµατισµό φαγοσώµατος. Ο στόχος θανατώνεται ή διασπάται µε τις ελεύθερες ρίζες οξυγόνου που παράγονται στα φαγοσώµατα ή µε τη βοήθεια λυοσωµατικών ενζύµων (Marmaras & Lambropoulou, 13

20 Αποκρίσεις Αιµοκυττάρων 2000) (Εικόνα 9). Τα αιµοκύτταρα φαγοκυτταρώνουν βιοτικούς παράγοντες όπως βακτήρια, ζυµοµύκητες και αποπτωτικά σωµάτια καθώς και µικρούς αβιοτικούς παράγοντες όπως τα συνθετικά σφαιρίδια (Lavine and Strand 2002, Hernandez et al. 1999) (Εικόνα 10). Στα Λεπιδόπτερα, τα κοκκιοκύτταρα και τα πλασµατοκύτταρα και στα δίπτερα τα πλασµατοκύτταρα είναι οι κύριες κατηγορίες κυττάρων που Εικόνα 9. Κυτταροφαγία. Η πρόσδεση ενός πραγµατοποιούν κυτταροφαγία βακτηρίου στην κυτταρική επιφάνεια επάγει την δηµιουργία ψευδοποδίων τα οποία τελικά περικυκλώνουν το βακτήριο. Η σύντηξη των (Elrod-Erickson et al. 2000, µεµβρανών των ψευδοποδίων συνεπάγεται τον Lamprou et al. 2005). Η σχηµατισµό ενός µεγάλου ενδοκυτταρικού κυστιδίου (φαγόσωµα). Το φαγόσωµα συντίκειται κυτταροφαγία και οι µηχανισµοί της στα έντοµα δεν έχουν ακόµα πλήρως στην συνέχεια µε λυσοσώµατα σχηµατίζοντας τα φαγολυσοσώµα, µέσα στο οποίο πραγµατοποιείται η πέψη του βακτηρίου. διευκρινιστεί. Η πλειονότητα των µελετών έχει πραγµατοποιηθεί στη µεσογειακή µύγα και έχει οδηγήσει στο συµπέρασµα ότι οι µηχανισµοί µεταγωγής µηνυµάτων κατά την κυτταροφαγία είναι ως ένα βαθµό συντηρηµένοι µεταξύ εντόµων και θηλαστικών (Foukas et al., 1998, Metheniti et al., 2001). Η διαπίστωση αυτή δίνει µεγάλη βαρύτητα στη µελέτη των µηχανισµών αυτών. Εικόνα 10. Κυτταροφαγία από µακροφάγο. Μακροφάγου ποντικού φαγοκυτταρώνει δυο χηµικά τροποποιηµένα ερυθροκύτταρα. Τα κόκκινα βέλη δείχνουν τις άκρες των ψευδοποδίων του µακροφάγου που εκτείνονται για να φαγοκυτταρώσουν τα δυο κύτταρα. (φωτογραφία από τον Jean Paul Revel). 14

21 Αποκρίσεις Αιµοκυττάρων Κυτταρική εγκύστωση και σχηµατισµός οζιδίων Η εγκύστωση είναι µια διαδικασία που γίνεται όταν ο εισβολέας είναι πολύ µεγάλος σε µέγεθος οπότε τα αιµοκύτταρα περικυκλώνουν το στόχο και στη συνέχεια προσκολλώνται στην επιφάνειά του. Πραγµατοποιείται σε δύο φάσεις. Αρχικά τα αιµοκύτταρα συσσωµατώνονται γύρω από τον εισβολέα και σε δεύτερη φάση λύονται και απελευθερώνουν στον ορό ουσίες που προσελκύουν άλλα αιµοκύτταρα και συµπληρώνουν το σχηµατισµό της κύστης (Εικόνα 11). Εικόνα 11. Εγκύστωση αυγών/ προνυµφών σφήκας στη Drosophila melanogaster. Α-Γ. Μια προνύµφη σφήκας περιβάλλεται από ελασµατοκύτταρα (µπλε χρώση στην εικόνα Α). Το στρώµα των κυττάρων γίνεται λεπτότερο καθώς αρχίζει η µελανογένεση του παρασίτου. Τελικά το αυγό /προνύµφη της σφήκας αποκτά έντονο µελανό χρώµα µέσα στην κάψουλα που αποτελείται από ελασµατοκύτταρα. Οζίδια σχηµατίζονται όταν ο αριθµός των µικροοργανισµών που εισβάλουν στο αιµόκοιλο είναι πολύ µεγάλος ώστε να αποµακρυνθούν µε τη διαδικασία της κυτταροφαγίας. Πολλές φορές η διάκριση ανάµεσα στα οζίδια και τις κύστεις είναι δύσκολη, ενώ είναι δυνατό οι δύο διαδικασίες να πραγµατοποιούνται ταυτόχρονα. Για το σχηµατισµό των οζιδίων έχει προταθεί ότι τα αιµοκύτταρα αποκοκκιώνονται και απελευθερώνουν παράγοντες που προκαλούν τη συσσωµάτωση των βακτηρίων. Ο σχηµατισµός οζιδίου ή κύστης απαιτεί τα κυκλοφορούντα αιµοκύτταρα να αλλάξουν συµπεριφορά και να αποκτήσουν την ικανότητα της προσκόλλησης τόσο µε τον στόχο τους όσο και µεταξύ τους. Στα ανοσοκύτταρα των θηλαστικών αυτό ρυθµίζεται από µηνυµατοφόρα µόρια (κυτταροκίνες), µόρια κυτταρικής προσκόλλησης και τους αντίστοιχους υποδοχείς τους. Στα έντοµα ο µηχανισµός αυτός είναι άγνωστος. Μέχρι στιγµής έχει ταυτοποιηθεί ένας δραστικός ενεργοποιητής των πλασµατοκυττάρων στο λεπιδόπτερο P. includens. Πρόκειται για µια κυτταροκίνη 23 αµινοξέων που ονοµάζεται πεπτίδιο επέκτασης πλασµατοκυττάρων (plasmatocyte spreading peptide, PSP) (Clark et al. 1997). Οµόλογα PSP πεπτίδια έχουν βρεθεί και σε άλλα λεπιδόπτερα και µάλιστα ορισµένα από αυτά δρουν ως ενεργοποιητές πλασµατοκυττάρων (Wang et al. 1999). 15

22 Κυτταρική Επικοινωνία ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΑ Εισαγωγή Σύµφωνα µε δεδοµένα από µελέτες απολιθωµάτων, µονοκύτταροι οργανισµοί που µοιάζουν µε τα σηµερινά βακτήρια διαπιστώθηκε ότι ζούσαν στον πλανήτη µας για περίπου 2,5 δισεκατοµµύρια χρόνια πριν την εµφάνιση του πρώτου πολυκύτταρου οργανισµού. Μια αιτία που µπορεί να ερµηνεύσει την καθυστέρηση που παρουσιάζεται στην εξέλιξη των πολυκύτταρων οργανισµών, από τη δηµιουργία τους µέχρι και σήµερα, ίσως να σχετίζεται µε την δυσκολία ανάπτυξης των κατάλληλων εξειδικευµένων µηχανισµών κυτταρικής επικοινωνίας που χρειάζονται οι εξελικτικά ανώτεροι οργανισµοί. ιότι το κάθε κύτταρο σε έναν πολυκύτταρο οργανισµό, θα πρέπει να είναι ικανό να επικοινωνεί µε το περιβάλλον του µε πολυσύνθετους τρόπους προκείµενου να δύναται να καθορίζει την ατοµική του συµπεριφορά προς όφελος ολόκληρου του οργανισµού. Οι µηχανισµοί επικοινωνίας βασίζονται κατά κύριο λόγο στα εξωκυτταρικά σηµατοδοτικά µόρια τα οποία παράγουν τα κύτταρα ώστε να επικοινωνήσουν µε γειτονικά προς αυτά κύτταρα ή άλλα τα οποία βρίσκονται σε µεγαλύτερη απόσταση. Επίσης, στηρίζονται σε εξειδικευµένα συστήµατα πρωτεϊνών τα οποία διαθέτει κάθε κύτταρο, ώστε να είναι σε θέση να ανταποκρίνονται στα διάφορα υποσύνολα µηνυµάτων µε, ενδεχοµένως, ειδικό για κάθε κυτταρικό τύπο τρόπο. Στις πρωτεΐνες αυτές περιλαµβάνονται πρωτεΐνες-υποδοχείς της κυτταρικής επιφανείας, στις οποίες προσδένεται το µηνυµατοφόρο µόριο, και ενδοκυτταρικές σηµατοδοτικές πρωτεΐνες οι οποίες Εικόνα 12. Ένα τυπικό µονοπάτι µεταγωγής σηµάτων από το εξωκυτταρικό περιβάλλον προς το εσωτερικό του κυττάρου. Στο σχήµα παρουσιάζονται τα βασικότερα στοιχεία ενός τέτοιου µονοπατιού. διανέµουν το µήνυµα στα κατάλληλα διαµερίσµατα του κυττάρου. Ανάµεσα στις σηµατοδοτικές πρωτεΐνες βρίσκονται κινάσες, φωσφατάσες, G-πρωτεΐνες αλλά και 16

23 Κυτταρική Επικοινωνία πολλές άλλες µε τις οποίες αλληλεπιδρούν. Κάθε σηµατοδοτικό µονοπάτι καταλήγει στις πρωτεΐνες στόχους, η αλλαγή των οποίων καθορίζει και την συµπεριφορά του κυττάρου. Ανάλογα µε το είδος του µηνυµατοφόρου µορίου, οι πρωτεΐνες στόχοι µπορεί να είναι µεταγραφικοί παράγοντες που ρυθµίζουν την έκφραση των γονιδίων, ιοντικά κανάλια, στοιχεία ενός µεταβολικού µονοπατιού, µέρη του κυτταροσκελετού και πολλά άλλα (Εικόνα 12). ΒΑΣΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΑΣ Γενικά Κανένας οργανισµός δεν µπορεί να επιβιώσει αποµονωµένος από το περιβάλλον του. Ακόµα και οι µονοκύτταροι οργανισµοί δέχονται συνεχώς ερεθίσµατα από το περιβάλλον, οργανικό ή µη και αποκρίνονται σε αυτά. Η κυτταρική επικοινωνία επιτυγχάνεται είτε µε την άµεση επαφή ενός κυττάρου µε τα γειτονικά του είτε έµµεσα µέσω διαφόρων εκκρινόµενων µηνυµατοφόρων µορίων, από κύτταρα που βρίσκονται µακριά ή κοντά στο κύτταρο-στόχο. Έτσι για παράδειγµα, οι ζύµες επικοινωνούν µεταξύ τους προκειµένου να ζευγαρώσουν εκκρίνοντας µικρά πεπτίδια. Αντίθετα, τα κύτταρα των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισµών χρησιµοποιούν για την επίτευξη της επικοινωνίας τους πλήθος εκατοντάδες - σηµατοδοτικών µορίων. Ως προς τα µηνυµατοφόρα µόρια υπάρχει µια πολύ µεγάλη ποικιλία, από απλά αέρια έως πρωτεΐνες. Έτσι, ένα τέτοιο µόριο µπορεί να είναι για παράδειγµα ένα αέριο όπως NO ή CO, ένα µικρό λιπόφιλο µόριο όπως µια στεροειδής ορµόνη, ένα µικρό υδρόφιλο µόριο προερχόµενο από αµινοξέα όπως µια κατεχολαµίνη ή ένα πεπτίδιο ή πρωτεΐνη όπως ένας αυξητικός παράγοντας. Τα περισσότερα από αυτά τα µόρια εκκρίνονται από το σηµατοδοτικό κύτταρο (signaling cell) στον εξωκυτταρικ χώρο µε την διαδικασία της εξωκυττάρωσης, ενώ άλλα µόρια διαχέονται µέσω της πλασµατικής µεµβράνης. Τέλος, µερικά εκτίθενται στον εξωκυτταρικό χώρο ενώ ταυτόχρονα παραµένουν ισχυρά προσδεµένα στην κυτταρική επιφάνεια. Άσχετα από την φύση του σήµατος, το κύτταρο στόχος (target cell) αναγνωρίζει το µήνυµα µε ειδικές πρωτεΐνες που αποκαλούνται υποδοχείς. Στους υποδοχείς προσδένεται το σηµατοδοτικό µόριο και αµέσως ξεκινάει µια αντίδραση στο εσωτερικό του κυττάρου στόχου. Συνήθως, οι υποδοχείς είναι διαµεµβρανικές 17

24 Κυτταρική Επικοινωνία Εικόνα 13. Η πρόσδεση των εξωκυτταρικών σηµατοδοτικών µορίων γίνεται µε υποδοχείς που βρίσκονται στην κυτταρική επιφάνεια ή µε ενδοκυτταρικούς υποδοχείς. πρωτεΐνες που αναγνωρίζουν ειδικά σηµατοδοτικά µόρια τα οποία προσδένουν ισχυρά. Η πρόσδεση έχει ως αποτέλεσµα την ενεργοποίηση των υποδοχέων και κατ επέκταση την γένεση µιας ακολουθίας ενδοκυτταρικών µηνυµάτων τα οποία διαφοροποιούν την συµπεριφορά του κυττάρου στόχου. Σε άλλες περιπτώσεις, οι υποδοχείς βρίσκονται στο εσωτερικό των κυττάρων, µε συνέπεια να απαιτείται για την ενεργοποίηση των υποδοχέων το σηµατοδοτικό µόριο να είναι αρκετά µικρό και υδρόφοβο, προκειµένου να διαχυθεί διαµέσου της πλασµατικής µεµβράνης (Εικόνα 13). Γενικώς, η επικοινωνία µέσω εξωκυτταρικά εκκρινόµενων µορίων περιλαµβάνει συνήθως τα παρακάτω βήµατα: 1. Σύνθεση του µηνυµατοφόρου µορίου. 2. Απελευθέρωση του µηνυµατοφόρου µορίου. 3. Μεταφορά του µηνυµατοφόρου µορίου από το κύτταρο που το παράγει στο κύτταρο-στόχο. 4. Αναγνώριση του µηνυµατοφόρου µορίου από ένα υποδοχέα του κυττάρουστόχου. 5. Αλλαγή στον κυτταρικό µεταβολισµό, λειτουργία ή ανάπτυξη που επάγεται από το σύµπλοκο υποδοχέας-µηνυµατοφόρο µόριο. 6. Τερµατισµός της κυτταρικής απόκρισης, για παράδειγµα µε αποµάκρυνση του µηνυµατοφόρου µορίου. 18

25 Κυτταρική Επικοινωνία Μηχανισµοί κυτταρικής επικοινωνίας ιακρίνουµε 3 τρόπους µε τους οποίους επιτυγχάνεται η κυτταρική επικοινωνία αναλόγως µε τις αποστάσεις που διατρέχουν τα µηνυµατοφόρα µόρια για να συνδεθούν µε τον υποδοχέα τους στα κύτταρα-στόχους. Τον ενδοκρινή, τον παρακρινή και τον αυτοκρινή (Εικόνα 14). Στον ενδοκρινή τρόπο µεταβίβασης, τα µόρια (ορµόνες) εκκρίνονται από εξειδικευµένα ενδοκρινή κύτταρα και διατρέχουν δια της κυκλοφορίας του αίµατος µεγάλες αποστάσεις µέχρι και µέτρα, όπως π.χ. τα οιστρογόνα που εκκρίνονται από την ωοθήκη και επάγουν την ανάπτυξη και διατήρηση του αναπαραγωγικού συστήµατος και των φυλετικών χαρακτηριστικών. Στον παρακρινή τρόπο µεταβίβασης, το µηνυµατοφόρο µόριο που εκκρίνεται από ένα κύτταρο δρα σε µικρή απόσταση, (µέχρι µm), στα γειτονικά κύτταρα. Παράδειγµα, οι διάφορες λεµφοκίνες καθώς και οι νευροδιαβιβαστές όπως η ακετυλοχολίνη που δρα στην περιοχή της σύναψης µεταξύ νευρικών Εικόνα 14. Μηχανισµοί κυτταρικής επικοινωνίας. (α) Ενδοκρινής, (β) παρακρινής και (γ) αυτοκρινής τρόπος µεταβίβασης «µηνυµάτων» µεταξύ των κυττάρων ενός πολυκύτταρου οργανισµού. κυττάρων. Τέλος στον αυτοκρινή τρόπο µεταβίβασης, το µηνυµατοφόρο µόριο δρα στο ίδιο κύτταρο από το οποίο έχει εκκριθεί. Για παράδειγµα µερικά Τ λεµφοκύτταρα εκκρίνουν αυξητικούς παράγοντες που επάγουν τον πολλαπλασιασµό τους ώστε να ισχυροποιηθεί η ανοσοαπόκριση. Να σηµειωθεί ότι πολλά µηνυµατοφόρα µόρια µπορούν να δρουν τόσο τοπικά όσο και σε αποστάσεις, όπως οι εγκεφαλίνες και ενδορφίνες που λειτουργούν ως νευροδιαβιβαστές και ως ορµόνες. Ο τρόπος δράσης επίσης των µηνυµατοφόρων µορίων ποικίλει. Μερικά, όπως οι στεροειδείς ορµόνες, διαπερνούν την πλασµατική µεµβράνη και ενώνονται µε κυτταροπλασµατικούς ή πυρηνικούς υποδοχείς (που είναι και παράγοντες 19

26 Κυτταρική Επικοινωνία µεταγραφής). Τα περισσότερα όµως µηνυµατοφόρα µόρια δεν την διαπερνούν αλλά ενώνονται µε τους υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας των κυττάρων-στόχων και µέσω αυτών µεταβιβάζουν την πληροφορία. Όσον αφορά την ταχύτητα αντίδρασης σε ένα εξωκυτταρικό σήµα, εξαρτάται όχι µόνο από τον µηχανισµό µετάδοσης του µηνύµατος, αλλά και από την φύση της αντίδρασης στο κύτταρο στόχο. Εκεί που η αντίδραση απαιτεί µόνο αλλαγές σε προϋπάρχουσες πρωτεΐνες, µπορεί να πραγµατοποιηθεί σε δευτερόλεπτα ή και χιλιοστά δευτερολέπτου. Όταν όµως η αντίδραση περιλαµβάνει αλλαγές στην γονιδιακή έκφραση και την σύνθεση νέων πρωτεϊνών, τότε απαιτείται µεγάλος χρόνος, ακόµα και ώρες, άσχετα από το µηχανισµό µετάδοσης του σήµατος. Μηνυµατοφόρα µόρια Τα µηνυµατοφόρα εµπίπτουν σε µία από τις 3 παρακάτω µεγάλες κατηγορίες: Λιπόφιλα µόρια που συνδέονται µε ενδοκυτταρικούς υποδοχείς. Τα µόρια αυτά διαχέονται διαµέσου της πλασµατικής µεµβράνης. Το σύµπλοκο µηνυµατοφόρο µόριο-υποδοχέας συνδέεται στο DNA σε περιοχές µεταγραφής επηρεάζοντας (αυξάνοντας ή µειώνοντας) µε αυτόν τον τρόπο την έκφραση ειδικών γονιδίων. Τέτοιου τύπου µόρια είναι οι στεροειδείς ορµόνες (π.χ. κορτιζόλη, οιστροδιόλη, εκδυσόνη, τεστοστερόνη, προγεστερόνη), η θυροξίνη και το ρετινοϊκό οξύ. Υδατοδιαλυτές ορµόνες που συνδέονται µε υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας. Η µεγάλη αυτή οµάδα υποδιαιρείται σε 2 µικρότερες: α) τις πεπτιδορµόνες µε µέλη µικρά πεπτίδια έως πρωτεΐνες όπως ινσουλίνη, αυξητικοί παράγοντες και γλυκαγόνο και β) µικρά φορτισµένα µόρια που προέρχονται από αµινοξέα και λειτουργούν ως ορµόνες και νευροδιαβιβαστές όπως επινεφρίνη (αδρεναλίνη), ισταµίνη, ακετυλοχολίνη, ντοπαµίνη κ.ά. Λιπόφιλα µηνυµατοφόρα µόρια που συνδέονται µε υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας. Τέτοια µόρια είναι οι προσταγλανδίνες κυρίως, οι θροµβοξάνες, τα λευκοτριένια και η προστακυκλίνη. Οι προσταγλανδίνες είναι µέλη µιας µεγαλύτερης οικογένειας ορµονών µε 20 άτοµα C που ονοµάζονται εικοσανοειδή και έχουν κοινό πρόδροµο µόριο το αραχιδονικό οξύ, το οποίο µε τη σειρά του προέρχεται από φωσφολιπίδια. Πολλές προσταγλανδίνες δρουν ως τοπικοί µεσολαβητές κατά τον παρακρινή ή αυτοκρινή τρόπο µεταβίβασης µηνυµάτων και συµµετέχουν σε αντιδράσεις φλεγµονής επηρεάζοντας την εξελικτική πορεία διαφόρων αγγειακών νοσηµάτων και την επούλωση πληγών, επάγοντας την 20

27 Κυτταρική Επικοινωνία συνάθροιση και προσκόλληση στα τοιχώµατα των αιµοφόρων αγγείων των αιµοπεταλίων. Κάθε κύτταρο είναι προγραµµατισµένο να ανταποκρίνεται σε συγκεκριµένους συνδυασµούς εξωκυτταρικών µηνυµατοφόρων µορίων. Ένα κύτταρο σε έναν πολυκύτταρο οργανισµό είναι εκτεθειµένο σε εκατοντάδες διαφορετικά µηνύµατα στο περιβάλλον του. Αυτά τα µηνύµατα µπορεί να είναι διαλυτά, προσδεµένα στην εξωκυτταρική ύλη, ή ακόµα δεσµευµένα στην επιφάνεια γειτονικών κυττάρων. Όπως είναι ευνόητο αυτά τα µηνύµατα µπορούν να συνδυαστούν µε πάρα πολλούς τρόπους. Το κύτταρο, όµως, θα ανταποκριθεί στην πληθώρα των µηνυµάτων επιλεκτικά, σύµφωνα µε τον ειδικό χαρακτήρα που έχει αποκτήσει µε προοδευτική κυτταρική εξειδίκευση κατά την ανάπτυξη. Έτσι, ένα κύτταρο µπορεί να είναι προγραµµατισµένο να αντιδρά σε ένα συνδυασµό µηνυµάτων µε διαφοροποίηση ενώ σε άλλο συνδυασµό µε πολλαπλασιασµό, ή ακόµα εκτελώντας ειδικές λειτουργίες όπως είναι η σύσπαση και η έκκριση (Εικόνα 15). Η χρήση αυτών των πολυάριθµων συνδυασµών µηνυµάτων για τον έλεγχο της κυτταρικής συµπεριφοράς επιτρέπει στους οργανισµούς να ελέγχουν τα κύτταρα τους µε πολύ ειδικό τρόπο χρησιµοποιώντας µια περιορισµένη ποικιλία µηνυµατοφόρων µορίων. Εικόνα 15. Κάθε κυτταρικός τύπος εµφανίζει διαφορετικούς συνδυασµούς υποδοχέων που του επιτρέπουν να ανταποκρίνεται σε διαφορετικά ερεθίσµατα ή στα ίδια ερεθίσµατα µε ενδεχοµένως διαφορετικό τρόπο. Τα σηµατοδοτικά µόρια (δηλ. τα ερεθίσµατα) δρουν σε συνδυασµούς οι οποίοι ρυθµίζουν την συµπεριφορά των κυττάρων. Όπως φαίνεται στην εικόνα, το κύτταρο απαιτεί πολλαπλά σήµατα για να επιβιώνει (µπλε βέλη), πρόσθετα µηνύµατα µπορεί να οδηγήσουν το κύτταρο σε διαίρεση (κόκκινα βέλη) ή διαφοροποίηση (πράσινα βέλη). Όταν όµως το κύτταρο στερηθεί τα µηνύµατα επιβίωσης τότε εκτελεί ένα τύπο κυτταρικής αυτοκτονίας, τον προγραµµατισµένο κυτταρικό θάνατο ή απόπτωση. 21

28 Κυτταρική Επικοινωνία Υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας Τα περισσότερα εκκρινόµενα, διαλυτά στο νερό, µηνυµατοφόρα µόρια (πεπτιδορµόνες, αυξητικοί παράγοντες, νευροδιαβιβαστές) δεσµεύονται σε ειδικούς υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας. Αυτές οι πρωτεΐνες-υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας λειτουργούν ως µεταγωγείς µηνυµάτων (signal transducers). Μετατρέπουν το γεγονός της πρόσδεσης ενός εξωκυτταρικού µορίου σε ενδοκυτταρικό µήνυµα το οποίο αλλάζει την συµπεριφορά του κυττάρου στόχου. Οι περισσότεροι από τους υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας ανήκουν σε µια από τρεις τάξεις (υποδοχείς ιοντικοί δίαυλοι, υποδοχείς συνδεδεµένοι µε G- πρωτεΐνες και υποδοχείς-ένζυµα ή συνδεδεµένοι µε ένζυµα) η οποία καθορίζεται από το µηχανισµό που χρησιµοποιείται για την µετατροπή (Εικόνα 16). Για παράδειγµα οι υποδοχείς των νευροδιαβιβαστών (υποδοχείς ιοντικοί δίαυλοι) ελέγχουν τη ροή των ιόντων δια της πλασµατικής µεµβράνης, ενώ οι υποδοχείς των πεπτιδορµονών και των παραγόντων αύξησης δρουν ρυθµίζοντας την ενεργότητα ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών. Εικόνα 16. Οι τρεις µεγαλύτερες τάξεις των υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας. (Α) Υποδοχείς ιοντικά κανάλια, (Β) Υποδοχείς που συνδέονται µε G-πρωτεΐνες και (Γ) Υποδοχείς µε ενζυµική ενεργότητα ή συνδεόµενοι µε ένζυµα. 22

29 Κυτταρική Επικοινωνία Στην κατηγορία των υποδοχέωνιοντικών διαύλων (Εικόνα 17), το µηνυµατοφόρο µόριο όταν δεσµευτεί στον υποδοχέα, αλλάζει τη στερεοδιάταξή του ώστε να περάσουν µέσα από το δίαυλο ειδικά ιόντα. Η κίνηση των ιόντων αλλάζει το ηλεκτρικό δυναµικό της πλασµατικής µεµβράνης. Ένα παράδειγµα τέτοιου υποδοχέα είναι ο υποδοχέας της ακετυλοχολίνης στις νευροµυϊκές συνάψεις. Η µεγαλύτερη οικογένεια υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας που µεταβιβάζουν µηνύµατα σε ενδοκυτταρικούς στόχους είναι οι υποδοχείς που συνδέονται µε G πρωτεΐνες (Εικόνα 18). Τέτοιοι είναι οι υποδοχείς πολλών Εικόνα 18. Ένας υποδοχέας συνεζευγµένος µε µια πρωτεΐνη G περιλαµβάνει επτά διαµεµβρανικές περιοχές. Εδώ απεικονίζεται η δοµή ενός αδρενεργικού υποδοχέα β 2.. Το τµήµα του υποδοχέα που σηµειώνεται µε καφέ σκούρο χρώµα είναι η θέση πρόσδεσης της G πρωτεΐνης. Τα δύο κατάλοιπα σερίνης που σηµειώνονται µε µαύρο χρώµα είναι σηµεία φωσφορυλίωσης. Εικόνα 17. Ένας δίαυλος-υποδοχέας αποτελείται συνήθως από πέντε υποµονάδες, καθεµία από τις οποίες θεωρείται ότι περιλαµβάνει τέσσερις διαµεµβρανικές ελικοειδείς περιοχές. νευροδιαβιβαστών, νευροπεπτιδίων και πεπτιδορµονών, όπως της επινεφρίνης, του γλυκαγόνου, της σεροτονίνης κ.ά., αλλά και οι υποδοχείς για τη γεύση, την όραση και την όσφρηση. οµικά οι υποδοχείς αυτοί είναι διαµεµβρανικές πρωτεΐνες που διαπερνούν τη µεµβράνη 7 φορές. Με τη δέσµευση του µηνυµατοφόρου µορίου αλλάζει η στερεοδιάταξη του υποδοχέα µε αποτέλεσµα να µπορεί η κυτταροπλασµατική του περιοχή να συνδεθεί µε τη G πρωτεΐνη και να την ενεργοποιήσει, οπότε αποσυνδέεται από τον υποδοχέα και µεταφέρει το µήνυµα σε ένα ενδοκυτταρικό στόχο που είναι είτε µεµβρανικό ένζυµο είτε ιοντικός δίαυλος. Το ένζυµο που ενεργοποιείται (ή αναστέλλεται) είναι ένα ένζυµο-τελεστής (αδενυλική κυκλάση, φωσφολιπάση C) που 23

30 Κυτταρική Επικοινωνία δηµιουργεί ένα ειδικό δεύτερο µήνυµα. Ο ιοντικός δίαυλος τροποποιείται (ανοίγει και κλείνει) επιφέροντας έτσι αλλαγή στη διαπερατότητα και εποµένως και στο δυναµικό της µεµβράνης. Η τρίτη κατηγορία υποδοχέων είναι οι υποδοχείς που συνδέονται µε κινάσες (Εικόνα 19). Οι υποδοχείς αυτοί δεν έχουν ενδογενή ενεργότητα κινάσης, αλλά µε τη δέσµευση του µηνυµατοφόρου µορίου δι-µερίζονται, συνδέονται άµεσα και ενεργοποιούν µια ή περισσότερες κυτταροπλασµατικές κινάσες τυροσίνης. Τέτοιου είδους υποδοχείς είναι οι υποδοχείς πολλών κυτταροκινών και ιντερφερονών. Η ιδία κατηγορία υποδοχέων περιλαµβάνει και υποδοχείς µε ενδογενή ενζυµική ενεργότητα στο κυτταρο-πλασµατικό τους τµήµα. Οι υποδοχείς αυτοί ενεργοποιούνται ως ένζυµα µε τη δέσµευση του µηνυµατοφόρου µορίου. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι υποδοχείς µε ενεργότητα γουανυλικής κυκλάσης που καταλύουν τη µετατροπή του GTP σε cgmp, οι υποδοχείς µε ενεργότητα φωσφατάσης που Εικόνα 19. Υποδοχείς που συνδέονται µε ένζυµα (π.χ. πρωτεϊνικές κινάσες τυροσίνης). Στην ίδια κατηγορία ανήκουν και οι υποδοχείς µε ενδογενή ενζυµική ενεργότητα(π.χ. ενεργότητα γουανυλικής κυκλάσης, φωσφατάσης ή ενεργότητα κινάσης). αποµακρύνουν το Ρ από τις φωσφοτυροσίνες των πρωτεϊνών-υποστρωµάτων τροποποιώντας έτσι την ενεργότητά τους και οι υποδοχείς µε ενεργότητα κινάσης είτε σερίνης/θρεονίνης είτε τυροσίνης. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων το µηνυµατοφόρο µόριο όταν δεσµεύεται σε υποδοχέα µε ενεργότητα κινάσης οδηγεί στο διµερισµό (έτερο- ή οµοδιµερισµό) του υποδοχέα, στην ενεργοποίησή του ως κινάση και στην αυτοφωσφορυλίωσή του στο κυτταροπλασµατικό τµήµα του. Η 24

31 Κυτταρική Επικοινωνία αυτοφωσφορυλίωση των υποδοχέων µε ενεργότητα κινάσης τυροσίνης (RTKs) που είναι οι πιο µελετηµένοι υποδοχείς της κατηγορίας αυτής, τους καθιστά ικανούς να φωσφορυλιώνουν διάφορες πρωτεΐνες-υποστρώµατα. Επιπλέον, η αυτόφωσφορυλίωση των RTKs δηµιουργεί θέσεις δέσµευσης για διάφορα κυτταροπλασµατικά ένζυµα φέρνοντάς τα έτσι κοντά στα υποστρώµατά τους στην πλασµατική µεµβράνη. Σε µερικές περιπτώσεις τα ένζυµα αυτά δηµιουργούν δεύτερα µηνύµατα. Εικόνα 20. Ο Υποδοχέας Fas. Η πρόσδεση του προσδέµατος στον υποδοχέα επάγει την απόπτωση µε άµεση ενεργοποίηση της κασπάσης-8. Τέλος, σε µια άλλη οµάδα, η οποία δεν εµπίπτει στην ανωτέρω κατηγοριοποίηση, ανήκουν οι υποδοχείς που συνδέονται µε πεπτίδια, µέλη της οικογένειας TNF (TNF=παράγοντας νέκρωσης όγκων), που επάγουν την απόπτωση (Εικόνα 20). Οι υποδοχείς αυτοί, που είναι επίσης µέλη της οικογένειας TNF, τριµερίζονται συνδεόµενοι µε τα µηνυµατοφόρα µόρια θανάτου και συνδέονται στο κυτταροπλασµατικό τµήµα τους µε πρωτεάσες, τις κασπάσες, που οδηγούν στον κυτταρικό θάνατο. Παράδειγµα ο υποδοχέας Fas, που εκφράζεται κυρίως σε κύτταρα του λεµφικού συστήµατος, παίζει σηµαντικό ρόλο στον έλεγχο της απόπτωσης στο ανοσοποιητικό σύστηµα των θηλαστικών, αφενός γιατί εξαλείφει τα καρκινικά και τα µολυσµένα µε ιούς κύτταρα και αφετέρου γιατί εξουδετερώνει τα λεµφοκύτταρα στο τέλος της ανοσοαπόκρισης. Εκτός, όµως, από τους υποδοχείς των εκκρινόµενων µορίων που προαναφέρθηκαν, υπάρχουν και οι υποδοχείς που είναι µόρια αναγνώρισης και σύνδεσης κυττάρου µε κύτταρο και µε την εξωκυτταρική ύλη όπως οι καντερίνες και οι ιντεγκρίνες αντίστοιχα, ο ρόλος των οποίων στη µεταβίβαση µηνυµάτων θα αναπτυχθεί αργότερα. 25

32 Κυτταρική Επικοινωνία Μόρια που συµµετέχουν στην ενδοκυτταρική µεταβίβαση µηνυµάτων Οι υποδοχείς της πλασµατικής µεµβράνης όταν ενεργοποιηθούν µεταφέρουν µηνύµατα προς το εσωτερικό του κυττάρου µέσω µικρών µορίων και δικτύων ενδοκυτταρικών σηµατοδοτικών πρωτεϊνών. εύτερα µηνύµατα Η δέσµευση των µηνυµατοφόρων µορίων στους υποδοχείς τους οδηγούν σε βραχύχρονη αλλαγή (αύξηση ή µείωση) της συγκέντρωσης ενδοκυτταρικών µηνυµατοφόρων µορίων τα οποία ονοµάζονται small intracellular mediators, ή δεύτερα µηνύµατα (second messengers) (πρώτο µήνυµα είναι το εξωκυτταρικό σήµα). Τέτοια µικρού µοριακού βάρους µόρια είναι τα: camp, cgmp, Ca 2+, DAG, IP 3, PIP 3 και άλλα φωσφολιπίδια. Παράγονται σε µεγάλες ποσότητες ως απόκριση σε ενεργοποίηση των υποδοχέων και διαχέονται ταχύτατα µακριά από την πηγή παραγωγής τους, µεταδίδοντας έτσι το σήµα σε άλλα µέρη του κυττάρου. Μερικά, όπως το κυκλικό AMP και τα Ca +2 είναι υδατοδιαλυτά και διαχέονται στο κυτταρόπλασµα σε αντίθεση µε άλλα, όπως την διακυλογλυκερόλη, που είναι λιποδιαλυτά και κατά συνέπεια διαχέονται στην πλασµατική µεµβράνη. Σε κάθε περίπτωση, τα µόρια αυτά µεταβιβάζουν την πληροφορία µε πρόσδεση σε επιλεγµένες σηµατοδοτικές πρωτεΐνες ή πρωτεΐνες στόχους αλλάζοντας την συµπεριφορά τους. Η αύξηση ή η µείωση της συγκέντρωσης ενός ή περισσοτέρων δεύτερων µηνυµάτων µετά τη δέσµευση του µηνυµατοφόρου µορίου στον υποδοχέα του, αλλάζει γρήγορα την ενεργότητα ενός ή περισσοτέρων ενζυµικών ή µη πρωτεϊνών, µε τελικό αποτέλεσµα αλλαγές στο µεταβολισµό (πρόσληψη και χρησιµοποίηση της γλυκόζης, αποθήκευση και διακίνηση των λιπών, έκκριση κυτταρικών προϊόντων), πολλαπλασιασµό, διαφοροποίηση, επιβίωση. Όλα αυτά γίνονται εν µέρει µε ρύθµιση της µεταγραφής ειδικών γονιδίων. Η αποµάκρυνση (ή αποικοδόµηση) του µηνυµατοφόρου µορίου (πρώτο ή δεύτερο µήνυµα) ή η απενεργοποίηση του υποδοχέα µπορεί να τερµατίσει την κυτταρική απόκριση στο συγκεκριµένο εξωκυτταρικό σήµα. 26

33 Κυτταρική Επικοινωνία Ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες Εκτός από τους υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας και τα δεύτερα µηνύµατα, στις οδούς µεταβίβασης των διαφόρων εξωκυτταρικών µηνυµάτων συµµετέχουν και µερικοί άλλοι τύποι πρωτεϊνών, οι οποίοι έχουν διατηρηθεί κατά την εξέλιξη, όπως G πρωτεΐνες, κινάσες πρωτεϊνών, πρωτεΐνες συνδετήρες και πρωτεΐνες-ικριώµατα. Οι ενδοκυτταρικές σηµατοδοτικές πρωτεΐνες µεταβιβάζουν το σήµα στο κύτταρο είτε ενεργοποιώντας την επόµενη πρωτεΐνη στο µονοπάτι είτε παράγοντας δευτερογενή µηνύµατα. Αυτές οι πρωτεΐνες µπορούν να ταξινοµηθούν συµφώνα µε την ιδιαίτερη λειτουργία που επιτελούν αν και πολλές από αυτές συγκαταλέγονται σε περισσότερες από µια κατηγορίες (Εικόνα 21). Πρωτεΐνες διαβιβαστές (Relay proteins): απλά περνούν το µήνυµα στο επόµενο σηµατοδοτικό-µόριο στόχο στην αλυσίδα. Μήνυµατοφόρες πρωτεΐνες (Messenger proteins): µεταφέρουν το µήνυµα από το ένα µέρος του κυττάρου σε άλλο, από το κυτταρόπλασµα, για παράδειγµα, στον πυρήνα. Πρωτεΐνες συνδετήρες (Adaptor proteins): συνδέουν σηµατοδοτικές πρωτεΐνες µεταξύ τους, δίχως να µεταβιβάζουν το σήµα. Πολλοί οδοί µεταβίβασης σηµάτων περιλαµβάνουν µεγάλα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα που συχνά συγκρατούνται µεταξύ τους µε πρωτεΐνεςσυνδετήρες που δεν έχουν καµία καταλυτική δράση αλλά περιέχουν περιοχές που λειτουργούν ως θέσεις σύνδεσης άλλων πρωτεϊνών αλλά και φωσφολιπιδίων. Πρωτεΐνες ενισχυτές (Amplifier proteins): είναι συνήθως είτε ένζυµα είτε ιοντικοί δίαυλοι που αυξάνουν ισχυρά το σήµα που λαµβάνουν. Η ενίσχυση της πληροφορίας γίνεται µε παραγωγή µεγάλου αριθµού δευτερογενών µηνυµάτων ή µε την ενεργοποίηση µεγάλου αριθµού ενδοκυτταρικών σηµατοδοτικών πρωτεϊνών που βρίσκονται πιο κάτω στο µεταγωγικό µονοπάτι (signaling cascade). Πρωτεΐνες µεταγωγείς (Transducer proteins): µετατρέπουν το µήνυµα σε διαφορετική µορφή, π.χ. το ένζυµο που παράγει κυκλικό AMP µετατρέπει το µήνυµα και ταυτόχρονα το ενισχύει, άρα ανήκει και στις δυο παραπάνω κατηγορίες. 27

34 Κυτταρική Επικοινωνία Πρωτεΐνες διακλάδωσης (Bifurcation proteins): διανέµουν το µήνυµα από ένα µεταγωγικό µονοπάτι σε άλλο. Πρωτεΐνες ενοποίησης (Integrator proteins): συγκεντρώνουν µηνύµατα από δυο ή περισσότερα µεταγωγικά µονοπάτια και τα συνενώνουν πριν προωθήσουν την πληροφορία προς την εποµένη πρωτεΐνη. Latent gene regulatory proteins: ενεργοποιούνται κοντά στην κυτταρική επιφάνεια, από ενεργοποιηµένους κυτταρικούς υποδοχείς, και µεταναστεύουν προς τον πυρήνα για να τροποποιήσουν την γονιδιακή έκφραση. Εικόνα 21. ιαφορετικά είδη ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών που συµµετέχουν στην µεταγωγή σηµάτων κατά µήκος ενός σηµατοδοτικού µονοπατιού, από την κυτταρική επιφάνεια έως τον πυρήνα, όπου τροποποιείται η έκφραση ενός γονιδίου. Όπως φαίνεται και στο παραπάνω σχήµα και άλλοι τύποι ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών κατέχουν σηµαντικούς ρόλους στην ενδοκυτταρική µεταγωγή σηµάτων. Οι πρωτεΐνες τροποποιητές (modulator) τροποποιούν την ενεργότητα των σηµατοδοτικών πρωτεϊνών και κατ επέκταση ρυθµίζουν την ένταση του σήµατος 28

35 Κυτταρική Επικοινωνία Εικόνα 22. Η πρωτεΐνη των κυττάρων των µατιών της δροσόφιλας η Ina D έχει πέντε PDZ περιοχές δέσµευσης. Τρεις από αυτές συνδέονται µε ένα ιοντικό δίαυλο, µε ένα ένζυµο που ανοίγει το δίαυλο όταν πέφτει το φως σε ένα υποδοχέα, τη ροδοψίνη, και µε ένα ένζυµο που κλείνει το δίαυλο. Οι άλλες δύο βοηθούν να περάσει η πληροφορία συνδεόµενες µε άλλες πρωτεΐνες µεταβίβασης του σήµατος φως. κατά µήκος του µεταγωγικού µονοπατιού. Από την άλλη, οι πρωτεΐνες (anchoring) αγκυροβόλησης διατηρούν συγκεκριµένες πρωτεΐνες σε ακριβείς τοποθεσίες στο κύτταρο συνδέοντας τις πρωτεΐνες σε µεµβράνες ή στον κυτταροσκελετό. Τέλος, οι πρωτεΐνες ικριώµατα (Scaffold proteins) είναι πρωτεΐνες συνδετήρες ή / και αγκυροβόλησης που συγκρατούν κοντά διάφορες πρωτεΐνες και εξασφαλίζουν ότι πολλά µόρια µεταβίβασης µηνυµάτων θα δράσουν σχεδόν συγχρόνως ως ένα λειτουργικό σύµπλοκο, ενώ συχνά, τις διατηρούν σε συγκεκριµένη τοποθεσία. Επιταχύνουν δηλαδή οι πρωτεΐνες-ικριώµατα τη µεταγωγή των µηνυµάτων, αλλά και περιορίζουν τα λάθη (Εικόνα 22). Οι πρωτεΐνες-ικριώµατα φαίνεται να αποτελούν κοινή στρατηγική που χρησιµοποιούν τα κύτταρα για να εµποδίσουν να δράσουν σε ένα συγκεκριµένο στόχο λάθος κινάσες και φωσφατάσες. Επιτυγχάνουν την µεταγωγή σηµάτων συγκρατώντας τις κατάλληλες κινάσες και φωσφατάσες κοντά στις πρωτεΐνες που ρυθµίζουν. Φαίνεται, επίσης, από την µελέτη των µοριακών µηχανισµών που χρησιµοποιούν τα κύτταρα για να επικοινωνούν µεταξύ τους και µε το περιβάλλον, ότι συχνά οι πρωτεΐνες που συµµετέχουν στις οδούς µεταβίβασης µηνυµάτων είναι αρθρωτές (modular proteins). Αποτελούνται δηλ. από επιµέρους στοιχεία (modules) που επιτελούν διαφορετικές λειτουργίες. Τα στοιχεία αυτά δεν ανήκουν µόνιµα σε συγκεκριµένη πρωτεΐνη αλλά σε διαφορετικές χρονικές στιγµές µπορεί να ανήκουν σε διαφορετικές πρωτεΐνες ώστε να διευκολύνουν µε τη λειτουργία τους τη µεταβίβαση του µηνύµατος. Αναµειγνύοντας δηλαδή το κύτταρο διάφορα πρωτεϊνικά 29

36 Κυτταρική Επικοινωνία κοµµάτια, µπορεί να δηµιουργεί συνδυασµούς µορίων και να κατασκευάζει συστοιχίες από αλληλοσυνδεόµενες οδούς. Ο σχηµατισµός ενδοκυτταρικών σηµατοδοτικών συµπλόκων ενισχύει την ταχύτητα, την αποδοτικότητα και την ειδικότητα της αντίδρασης. Τα εξωκυτταρικά µηνύµατα που φθάνουν στα κύτταρα, ακόµα και όταν προσδεθούν σε ένα µόνο τύπο υποδοχέα, συνήθως ενεργοποιούν πολλαπλά παράλληλα σηµατοδοτικά µονοπάτια. Με αυτό τον τρόπο µπορούν να ρυθµιστούν ταυτόχρονα οι περισσότερες κυτταρικές λειτουργίες, όπως αλλαγή σχήµατος, κίνηση, µεταβολισµός, γονιδιακή έκφραση, που στο σύνολο τους συγκροτούν την κυτταρική συµπεριφορά. Είναι ακόµα γνωστό, ότι διαφορετικοί υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας, όταν διεγερθούν, συχνά ενεργοποιούν τα ίδια µεταγωγικά µονοπάτια. Η πολυπλοκότητα των συστηµάτων µεταγωγής σηµάτων µε τις πολλαπλές αλληλοεπηρεαζόµενες αλυσίδες σηµατοδοτικών πρωτεϊνών είναι πραγµατικά αποθαρρυντική. Σίγουρα, µέχρι σήµερα δεν είναι ξεκάθαρο πώς ένα κύτταρο καταφέρνει να αντιδρά ειδικά στα τόσα διαφορετικά εξωκυτταρικά µηνύµατα που το κατακλύζουν, εκ των οποίων πολλά προσδένονται στην ίδια κλάση υποδοχέων και ενεργοποιούν τα ίδια κυτταρικά µονοπάτια. Μια στρατηγική που χρησιµοποιείται από τα κύτταρα ώστε να επιτευχθεί ειδικότητα περιλαµβάνει τις πρωτεΐνες ικριώµατα, ο ρόλος των οποίων είναι να οργανώνουν οµάδες πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν σε σηµατοδοτικά σύµπλοκα (signaling complexes) (Εικόνα 23Α). Επειδή, λοιπόν, η πρωτεΐνη ικρίωµα «κατευθύνει» την αλληλεπίδραση ανάµεσα στις διαδοχικές πρωτεΐνες ενός συµπλόκου, το σήµα µπορεί να µεταβιβαστεί µε ακρίβεια, ταχύτητα και αποτελεσµατικότητα. Επιπλέον είναι δυνατό να περιοριστούν ή να αποφευχθούν οι ανεπιθύµητες συνοµιλίες (cross talk) µε άλλα µεταγωγικά µονοπάτια. Προκείµενου, όµως, να ενισχυθεί ένα σήµα και να µεταφερθεί σε διαφορετικά διαµερίσµατα του κυττάρου, είναι αναγκαίο ορισµένα από τα στοιχεία ενός σηµατοδοτικού µονοπατιού να έχουν δυνατότητα ελεύθερης διάχυσης. Σε άλλες περιπτώσεις, τα σηµατοδοτικά σύµπλοκα σχηµατίζονται µόνο παροδικά, όταν οι σηµατοδοτικές πρωτεΐνες συγκεντρώνονται γύρω από ένα υποδοχέα που έχει διεγερθεί από κάποιο εξωκυττάριο µήνυµα (Εικόνα 23Β). Έτσι όταν το κυτταροπλασµατικό τµήµα υποδοχέων φωσφορυλιώνεται κατά την 30

37 Κυτταρική Επικοινωνία Εικόνα 23. ύο τύποι ενδοκυτταρικών σηµατοδοτικών συµπλόκων. (Α) Προσχηµατισµένα σύµπλοκα σε µεγάλες πρωτεΐνες ικριώµατα. (Β) Σχηµατισµός παροδικών συµπλόκων µετά από ενεργοποίηση υποδοχέα. διαδικασία ενεργοποίησης, τα φωσφορυλιωµένα αµινοξέα αποτελούν θέσεις πρόσδεσης για την σηµατοδοτικών συγκέντρωση πρωτεϊνών. Επιπρόσθετα, η ενεργοποίηση υποδοχέων µπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή τροποποιηµένων φωσφολιπιδίων στην γειτονική περιοχή της πλασµατικής µεµβράνης. Τα λιπίδια στρατολογούν συγκεκριµένες σηµατοδοτικές πρωτεΐνες στην περιοχή της µεµβράνης, συνεπώς αυξάνεται η πιθανότητα να αλληλεπιδράσουν οι κατάλληλες για την επιθυµητή απόκριση πρωτεΐνες. Όλα αυτά τα σύµπλοκα σχηµατίζονται µόνο προσωρινά και ταχύτατα από-συναρµολογούνται µετά την αποµάκρυνση του προσδέτη από τον υποδοχέα. Οι αλληλεπιδράσεις µεταξύ των σηµατοδοτικών πρωτεϊνών πραγµατοποιούνται διαµέσου αρθρωτών περιοχών πρόσδεσης (Modular Binding Domains). Η συναρµολόγηση τόσο των σταθερών όσο και των προσωρινών σηµατοδοτικών συµπλόκων βασίζεται σε µια ποικιλία, πολύ συντηρηµένων, µικρών περιοχών πρόσδεσης που βρίσκονται στις περισσότερες ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες που συµµετέχουν στην µεταγωγή σηµάτων. Κάθε µια από αυτές τις συµπαγείς πρωτεϊνικές υποµονάδες προσδένει σε ένα συγκεκριµένο δοµικό µοτίβο στην πρωτεΐνη (ή στο λιπίδιο) µε την οποία η σηµατοδοτική πρωτεΐνη αλληλεπιδρά. Λόγω αυτών των αρθρωτών περιοχών, οι σηµατοδοτικές πρωτεΐνες µπορούν να προσδένουν η µια στην άλλη σε πολλούς συνδυασµούς. Έτσι, οι πρωτεΐνες σχηµατίζουν τρισδιάστατα δίκτυα αλληλεπιδράσεων που καθορίζουν την διαδροµή που ακολουθεί 31

38 Κυτταρική Επικοινωνία το µεταγωγικό µονοπάτι. Πιθανότατα, η ένωση αυτών των αρθρωτών περιοχών σε νέους συνδυασµούς να διευκολύνει την εξέλιξη και δηµιουργία νέων σηµατοδοτικών µονοπατιών. Εικόνα 24. Ένα υποθετικό µοντέλο µεταγωγής σηµάτων στο οποίο συµµετέχουν πρωτεΐνες µε αρθρωτές περιοχές πρόσδεσης. Η σηµατοδοτική πρωτεΐνη 1 φέρει 3 περιοχές πρόσδεσης και µια καταλυτική περιοχή κινάσης. Όταν εξωκυτταρικό σήµα οδηγεί στην δηµιουργία θέσεων πρόσδεσης στην πλασµατική µεµβράνη και στον υποδοχέα (φωσφορυλιωµένα λιπίδια και αµινοξέα αντίστοιχα), η πρωτεΐνη 1 δεσµεύεται µε την SH2 περιοχή της στον υποδοχέα (στην φωσφορυλιωµένη τυροσίνη) και µε την PH περιοχή της, στην πλασµατική µεµβράνη στα φωσφορυλιωµένα λιπίδια ινοσιτόλης. Η ενζυµική περιοχή της πρωτεΐνης 1 φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη 2 σε αµινοξέα τυροσίνης (µεταφέροντας την πληροφορία), µε συνέπεια η πρωτεΐνη 2 να προσδένεται στην περιοχή PTB της πρωτεΐνης 1 και στην περιοχή SH2 της adaptor πρωτεΐνης. Η adaptor πρωτεΐνη φέρει δυο περιοχές πρόσδεσης: µια SH2 µε την οποία δένει την πρωτεΐνη 2 και µια SH3 µε την οποία προσδένεται σε µια πλούσια σε προλίνες περιοχή στην σηµατοδοτική πρωτεΐνη 3. Έτσι, οι πρωτεΐνες 2 και 3 έρχονται σε γειτνίαση µε αποτέλεσµα την φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης 3 από την 2. Οι περιοχές Src homology 2 (SH2) και phosphotyrosine-binding (PTB) προσδένονται σε φωσφορυλιωµένα αµινοξέα τυροσίνης (φωσφοτυροσίνες) σε ειδικές πεπτιδικές αλληλουχίες που βρίσκονται σε ενεργοποιηµένους υποδοχείς ή ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες. Οι Src homology 3 (SH3) περιοχές προσδένονται σε µικρές αλληλουχίες αµινοξέων που είναι πλούσιες σε προλίνη. Η εξειδίκευση της σύνδεσης εξασφαλίζεται όχι µόνο από την ύπαρξη φωσφοτυροσίνης ή προλίνης αλλά και από τα γειτονικά αµινοξέα. Οι Pleckstrin homology (PH) περιοχές (περιγράφτηκαν για πρώτη φόρα στην πρωτεΐνη Plecstrin των αιµοπεταλίων) προσδένονται σε φορτισµένες οµάδες ειδικών φωσφορυλιωµένων φωσφολιπιδίων ινοσιτόλης (φωσφοϊνοσιτίδια) τα οποία παράγονται στην πλασµατική µεµβράνη σε 32

39 Κυτταρική Επικοινωνία απόκριση προς ένα εξωκυτταρικό σήµα. Έτσι, οι πρωτεΐνες που φέρουν αυτές τις οµάδες µπορούν να προσδένονται στην µεµβράνη και να αλληλεπιδρούν µε άλλες στρατολογηµένες πρωτεΐνες σε αυτή την περιοχή. Από την άλλη, υπάρχουν και πρωτεΐνες που λειτουργούν αποκλειστικά ως συνδετήρες και συνδέουν δυο οι περισσότερες πρωτεΐνες σε ένα µεταγωγικό µονοπάτι, αυτές αποτελούνται από δυο ή περισσότερες περιοχές πρόσδεσης µόνο (Εικόνα 24). Σε µερικές περιπτώσεις οι πρωτεΐνες-συνδετήρες περιέχουν µια σειρά από περιοχές δέσµευσης ενός τύπου και σε άλλες περιέχουν συνδυασµούς πολλών τύπων, συγκεντρώνοντας έτσι περισσότερα στοιχεία του κυκλώµατος µεταβίβασης. Παράδειγµα η Grb2 που περιέχει SH2 περιοχές που ενώνονται µε ειδικές φωσφοτυροσίνες των ενεργοποιηµένων RTK υποδοχέων και SH3 περιοχές που ενώνονται µε την πρωτεΐνη Sos (µια GEF πρωτεΐνη) φέρνοντας έτσι την Sos κοντά στη δεσµευµένη στη µεµβράνη Ras-GDP και ενεργοποιώντας την. Επιπλέον, τέτοιες περιοχές µπορεί να βρεθούν µόνες ή σε συνδυασµούς, σε πρωτεΐνες µε καταλυτικές περιοχές. Γίνεται λοιπόν κατανοητό ότι δηµιουργούνται έτσι οι προϋποθέσεις για πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις µεταξύ των διαφόρων οδών µεταβίβασης των σηµάτων χωρίς µάλιστα το κύτταρο να χρειάζεται κατά την εξέλιξη να συνθέτει για τις ανάγκες του ένα τεράστιο αριθµό νέων πρωτεϊνών. Όσον αφορά τις πρωτεΐνες ικριώµατα, συχνά περιέχουν πολλαπλές PDZ περιοχές (αλληλουχίες που φέρουν υδρόφοβα αµινοξέα) κάθε µια από τις οποίες προσδένεται σε ειδικές αλληλουχίες πεπτιδίων, σε υποδοχείς ή σηµατοδοτικές πρωτεΐνες. Για παράδειγµα η πρωτεΐνη-ικρίωµα InaD, η οποία εντοπίζεται σε φωτουποδεκτικά κύτταρα στην Drosophila, φέρει πέντε PDZ περιοχές. Μια από αυτές συνδέεται µε ένα φωτο-ενεργοποιούµενο ιοντικό κανάλι, ενώ οι υπόλοιπες προσδένουν την πρωτεΐνη µε άλλες σηµατοδοτικές πρωτεΐνες που συµµετέχουν στην αντίδραση του κυττάρου στο φως. Αν κάποια από αυτές τις PDZ περιοχές είναι µη λειτουργική ή απουσιάζει τότε δεν πραγµατοποιείται η κατάλληλη συνάθροιση πρωτεϊνών προς σχηµατισµό ενεργού συµπλόκου και κατά συνέπεια η όραση της µύγας είναι ελαττωµατική (Εικόνα 22). G πρωτεΐνες Είναι µία µεγάλη κατηγορία πρωτεϊνών που ενώνονται µε το GTP και δρουν σαν µοριακοί διακόπτες στους δρόµους µεταβίβασης των σηµάτων. Οι πρωτεΐνες 33

40 Κυτταρική Επικοινωνία αυτές ανάβουν και σβήνουν όταν ενώνονται µε το GTP και GDP αντίστοιχα Όταν απουσιάζει το µηνυµατοφόρο µόριο είναι δεσµευµένες µε το GDP. Η παρουσία του µορίου ενεργοποιεί την απελευθέρωση του GDP και τη δέσµευση του GTP. Η ενδογενής ενεργότητα GTPασης των G πρωτεϊνών υδρολύει το GTP σε GDP και P µετατρέποντας την ενεργό µορφή σε ανενεργό. Η κινητική δε της υδρόλυσης ρυθµίζει το χρόνο που είναι αναµµένος ο διακόπτης. Υπάρχουν 2 κατηγορίες τέτοιων G πρωτεϊνών. Οι τριµερείς G πρωτεΐνες που συνδέονται άµεσα µε υποδοχείς και οι µονοµερείς Ras και τύπου Ras (Rho, Rab, Ran) που αλληλεπιδρούν µε τους υποδοχείς έµµεσα. Η ενεργοποίηση των δύο κατηγοριών G πρωτεϊνών ρυθµίζεται µε πολύ διαφορετικό τρόπο. Για τις τριµερείς G πρωτεΐνες η ενεργοποίηση γίνεται µε τη δέσµευση του µηνυµατοφόρου µορίου στον υποδοχέα η οποία οδηγεί σε αλλαγή της διαµόρφωσής του µε αποτέλεσµα το κυτταροπλασµατικό του τµήµα να αλληλεπιδράσει µε την α υποµονάδα της G πρωτεΐνης η οποία στην ανενεργό κατάσταση είχε δεσµευµένο το GDP και ήταν ενωµένη µε τις βγ υποµονάδες. Η αλλαγή όµως διαµόρφωσης του Εικόνα 25. Μεταγωγή σήµατος µε την µεσολάβηση των G-πρωτεϊνών. Η αλλαγή διαµόρφωσης του υποδοχέα επάγει την ανταλλαγή του GDP µε GTP και την ενεργοποίηση έτσι της α υποµονάδας που αποδεσµεύεται από τις βγ οι οποίες παραµένουν ενωµένες. Στη συνέχεια και οι α και οι βγ υποµονάδες αλληλεπιδρούν µε τις πρωτεΐνες στόχους. υποδοχέα επάγει την ανταλλαγή του GDP µε GTP και την ενεργοποίηση έτσι της α υποµονάδας που αποδεσµεύεται από τις βγ οι οποίες παραµένουν ενωµένες. Στη συνέχεια και οι α και οι βγ υποµονάδες αλληλεπιδρούν µε τις πρωτεΐνες στόχους. Η ενεργότητα της α υποµονάδας σταµατά µε την υδρόλυση του δεσµευµένου GTP οπότε η ανενεργή δεσµευµένη µε GDP τώρα υποµονάδα α ξαναενώνεται µε το σύµπλοκο βγ (Εικόνα 25). Για τις µονοµερείς G πρωτεΐνες η ενεργοποίηση και απενεργοποίηση γίνεται από διάφορες ρυθµιστικές πρωτεΐνες τις GEFs και GAPs. Οι πρώτες δρουν ως παράγοντες ανταλλαγής των νουκλεοτιδίων (GEFs) που επάγουν την απελευθέρωση 34

41 Κυτταρική Επικοινωνία του GDP και την ένωση µε GTP και οι δεύτερες επάγουν την ενδογενή δράση GTPασης που έχουν οι G πρωτεΐνες (Εικόνα 26). Εικόνα 26. Οι µικρές µονοµερής G πρωτεΐνες, όπως η Ras, ενεργοποιούνται µε την πρόσδεση του GTP στο µόριο τους. Αντίθετα, όταν φέρουν προσδεµένο GDP βρίσκονται σε ανενεργή κατάσταση. ιαθέτουν ενδογενή ενεργότητα GTPασης και υδρολύουν το GTP προς GDP µε αποτέλεσµα την απενεργοποίηση τους. Τότε οι παράγοντες guanine nucleotide exchange factors (GEFs) επάγουν την ανταλλαγή του GDP µε GTP ενεργοποιώντας τις µικρές G πρωτεΐνες. Ακριβώς την αντίθετη λειτουργία επιτελούν οι GAPs (GTPase activating proteins) που επάγουν την υδρόλυση του GTP και οι GDI (guanine nucleotide dissociation inhibitors) που εµποδίζουν την ανταλλαγή των νουκλεοτιδίων και κατά συνέπεια διατηρούν τις µικρές G πρωτεΐνες ανενεργές. Κινάσες πρωτεϊνών Η ενεργοποίηση των υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας οδηγεί σε αλλαγές στη φωσφορυλίωση διαφόρων κυτταροπλασµατικών πρωτεϊνών η οποία επιτυγχάνεται µε την ενεργοποίηση των κινασών. Σε µερικές περιπτώσεις οι κινάσες αποτελούν τµήµα του ίδιου του υποδοχέα και σε άλλες είναι κυτταροπλασµατικές κινάσες ή κινάσες που συνδέονται µε την κυτταροπλασµατική µεµβράνη. Τα ζωικά κύτταρα έχουν 2 τύπους κινασών, τις κινάσες τυροσίνης και τις κινάσες σερίνης ή θρεονίνης µε Εικόνα 27. Οι κινάσες πρωτεϊνών προσθέτουν φωσφορικές οµάδες σε αµινοξέα σερίνης / θρεονίνης πολύ παρόµοιες καταλυτικές ή σε αµινοξέα τυροσίνης, µεταφέροντας έτσι περιοχές. Η καταλυτική τους πληροφορία στα υποστρώµατα τους. Αντίθετα οι πρωτεϊνικές φωσφατάσες αποµακρύνουν τις δράση τροποποιείται µε φωσφορικές οµάδες από φωσφορυλιωµένα αµινοξέα επαναφέροντας τις πρωτεΐνες στην αρχική τους φωσφορυλίωση, µε κατευθείαν κατάσταση. 35

42 Κυτταρική Επικοινωνία δέσµευση σε άλλες πρωτεΐνες και µε αλλαγές στα επίπεδα των διαφόρων δεύτερων µηνυµάτων. Η ενεργότητά τους σταµατά µε τη δράση των φωσφατασών που αποµακρύνουν το P από ειδικές πρωτεΐνες (Εικόνα 27). Από την ανάλυση της αλληλουχίας του γονιδιώµατος του ανθρώπου έχει υπολογιστεί ότι το 2% των γονιδίων µας κωδικοποιούν κινάσες πρωτεϊνών και εκτιµάται ότι εκατοντάδες από διαφορετικές κινάσες πρωτεϊνών είναι παρούσες σε ένα τυπικό κύτταρο θηλαστικού. Μοριακοί διακόπτες. Πολλές ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες συµπεριφέρονται ως µοριακοί διακόπτες, δηλαδή, µόλις δεχτούν κάποιο σήµα αλλάζουν από την ανενεργή κατάσταση τους προς µια ενεργή από την οποία επανέρχονται στην αρχική, ώστε να είναι σε θέση και πάλι να διεγερθούν στην παρουσία σήµατος. Πρέπει να τονιστεί ότι το «σβήσιµο» είναι το ίδιο σηµαντικό όσο και το «άναµµα» για αυτές τις πρωτεΐνες. Ωστόσο, οι µοριακοί διακόπτες µπορούν να διακριθούν σε δυο κατηγορίες ανάλογα µε το µηχανισµό που χρησιµοποιείται για να περάσουν από την ανενεργή στην ενεργή κατάσταση. Στην ουσία, όµως, και στις δυο περιπτώσεις το κέρδος ή η απώλεια µιας φωσφορικής οµάδας είναι το κρίσιµο γεγονός που καθορίζει σε ποια κατάσταση θα περιέλθει η σηµατοδοτική πρωτεΐνη. Η µεγαλύτερη από τις δυο κατηγορίες είναι εκείνη στην οποία οι αλλαγές στην κατάσταση των πρωτεϊνών πραγµατοποιούνται µε φωσφορυλιώσεις αµινοξέων. Σε αυτές τις περιπτώσεις οι πρωτεϊνικές κινάσες προσθέτουν τις φωσφορικές οµάδες και ουσιαστικά ρυθµίζουν την ενεργότητα των σηµατοδοτικών πρωτεϊνών, ενώ οι πρωτεϊνικές φωσφατάσες αποµακρύνουν τις φωσφορικές οµάδες από τις πρωτεΐνες επαναφέροντας αυτές στην αρχική τους κατάσταση (Εικόνα 28Α). Η σπουδαιότητα της φωσφορυλίωσης για το κύτταρο αποδεικνύεται από υπολογισµούς που παρουσιάζουν το 1/3 των πρωτεϊνών ενός ευκαρυωτικού κυττάρου να είναι φωσφορυλιωµένες µια οποιαδήποτε χρονική στιγµή. Η άλλη µεγάλη κατηγορία των µοριακών διακοπτών σχετίζεται µε τις GTPbinding πρωτεΐνες. Όπως έχει αναφερθεί σε προηγούµενη ενότητα, αυτές οι πρωτεΐνες βρίσκονται στην ενεργή τους κατάσταση όταν έχουν προσδεµένο GTP και γίνονται ανενεργές µόλις προσδέσουν GDP. ιαθέτοντας ενδογενή ενεργότητα GTPασης, υδρολύουν το GTP σε GDP και αυτό-απενεργοποιούνται. Οι κατηγορίες των GTP-binding πρωτεϊνών είναι δυο: οι µεγάλες τριµερείς GTP-binding proteins 36

43 Κυτταρική Επικοινωνία (G-proteins) και οι µικρές µονοµερείς GTPases (monomeric GTP-binding proteins) (Εικόνα 28Β). Εικόνα 28. υο τύποι ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών που δρουν ως µοριακοί διακόπτες. Και στις δυο περιπτώσεις µια σηµατοδοτική πρωτεΐνη ενεργοποιείται µε την προσθήκη µιας φωσφορικής οµάδας και απενεργοποιείται µε την αποµάκρυνση της φωσφορικής οµάδας. (Α) Η φωσφορική οµάδα προστίθεται οµοιοπολικά από µια πρωτεϊνική κινάση. (Β) Μια σηµατοδοτική πρωτεΐνη επάγεται να ανταλλάξει το προσδεµένο της GDP µε GTP. Πολύπλοκες κυτταρικές συµπεριφορές όπως η κυτταρική επιβίωση και ο κυτταρικός πολλαπλασιασµός γενικά επάγονται από ειδικούς συνδυασµούς Εικόνα 29. Συνένωση σηµάτων (Signal integration). (A) Τα εξωκυτταρικά σήµατα Α και Β επάγουν την φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης Υ σε δυο διαφορετικά σηµεία. Η πρωτεΐνη Υ ενεργοποιείται µόνο όταν φωσφορυλιωθεί και στα δυο αυτά σηµεία, έτσι, γίνεται ενεργή µόνο όταν τα σήµατα Α, Β συνυπάρξουν (Coincidence Detectors). (Β) Σε αυτήν την περίπτωση τα εξωκυτταρικά σήµατα Α, Β οδηγούν στην φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών α, β αντίστοιχα. Όταν φωσφορυλιωθούν οι δυο πρωτεΐνες αλληλεπιδρώντας δηµιουργούν ένα ενεργό πρωτεϊνικό σύµπλοκο. Οι παραπάνω περιπτώσεις ευσταθούν και για πρωτεΐνες που δεν φωσφορυλιώνται αλλά ανταλλάζουν το GDP µε GTP. µικροεπεξεργαστή ενός υπολογιστή (Εικόνα 29). εξωκυτταρικών µηνυµάτων παρά από κάποιο αποµονωµένο σήµα. Το κύτταρο, λοιπόν, θα πρέπει να συγκεντρώσει τα µηνύµατα, να τα «επεξεργαστεί» ενοποιώντας τα και να προβεί στην κατάλληλη απόκριση: να ζήσει ή να πεθάνει, να διαιρεθεί ή όχι κτλ. Αυτού του είδους η επεξεργασία λαµβάνει χώρα στις πρωτεΐνες ενοποιητές (integrator proteins) που ισοδυναµούν µε τον 37

44 Κυτταρική Επικοινωνία Λιπίδια Εκτός από τις διάφορες κατηγορίες πρωτεϊνών (µηνυµατοφόρα µόρια, υποδοχείς, κινάσες, G πρωτεΐνες) που προαναφέραµε ότι παίζουν ρόλο µε τις αλληλεπιδράσεις τους στην έναρξη µεταβίβασης µηνυµάτων, τα τελευταία χρόνια άρχισε να διαφαίνεται και ο ρόλος των µεµβρανικών λιπιδίων. Μερικοί υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας, καθώς και ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες, θεωρείται ότι συναθροίζονται παροδικά σε ειδικές µικροπεριοχές της λιπιδικής διπλόστοιβάδας της πλασµατικής µεµβράνης οι οποίες είναι πλούσιες σε χοληστερόλη και γλυκολιπίδια. Ορισµένες πρωτεΐνες κατευθύνονται προς αυτές τις λιπιδικές νησίδες (lipid rafts) έχοντας οµοιοπολικά προσδεµένα λιπιδικά µόρια. Οι νησίδες αυτές µπορούν να αλλάξουν την έκτασή τους και τη σύστασή τους αποκρινόµενες σε εξωκυτταρικά και ενδοκυτταρικά σήµατα, γεγονός που ευνοεί την αλληλεπίδραση ειδικών πρωτεϊνών µεταβίβασης σηµάτων (Εικόνα 30). Έτσι, πρωτεΐνες-συνδετήρες, ικριώµατα και Εικόνα 30. Μηχανισµοί συνάθροισής των λιπιδικών νησίδων. (α) Οι νησίδες είναι µικρές περιοχές (πορτοκαλί χρώµα)στην πλασµατική µεµβράνη και περιέχουν µόνο λίγες πρωτεΐνες. (β) Το µέγεθος τους µπορεί να αυξηθεί µε συνάθροιση τους προκαλώντας µείξη των µορίων που βρίσκονται στην µεµβράνη. Η συνάθροιση µπορεί να προκληθεί από (1) εξωκυτταρικους προσδέτες, (2) ολιγοµερισµό στην µεµβράνη και (3) από κυτταροπλασµατικούς παράγοντες. πρωτεΐνες µε ενζυµική ενεργότητα συγκεντρώνονται στην κυτταρική επιφάνεια µετά την σύνδεση του µηνυµατοφόρου µορίου µε τον υποδοχέα του. Συµπερασµατικά, όπως οι πρωτεΐνες ικριώµατα, έτσι και αυτά τα λιπιδικά ικριώµατα συµβάλλουν στην µεταγωγή µηνυµάτων αυξάνοντας την ταχύτητα και την αποτελεσµατικότητα των διαδικασιών αφού εξυπηρετούν ως θέσεις όπου τα σηµατοδοτικά µόρια συναθροίζονται και αλληλεπιδρούν. 38

45 Κυτταρική Επικοινωνία Πρωτεΐνες µικροτσίπ. Πως µια πρωτεΐνη µπορεί να λειτουργεί ως «λογική πύλη»; Το παράδειγµα της πρωτεϊνικής κινάσης Src. Οι εκατοντάδες των διαφορετικών κινασών σε ένα ευκαρυωτικό κύτταρο είναι οργανωµένες σε πολύπλοκα δίκτυα σηµατοδοτικών µονοπατιών τα οποία βοηθούν στο συντονισµό των κυτταρικών λειτουργιών. Έτσι συµµετέχουν, για παράδειγµα, στον κυτταρικό κύκλο, αλλά και µεταφέρουν σήµατα στο κύτταρο από το εξωκυττάριο περιβάλλον. Πολλά από αυτά τα σήµατα θα πρέπει, όµως, να συνενωθούν και να ενισχυθούν (δηλαδή να επεξεργαστούν) από τον κυτταρικό µηχανισµό. Οι κινάσες (αλλά και άλλες σηµατοδοτικές πρωτεΐνες) λειτουργούν ως µονάδες Εικόνα 31. Η πρωτεΐνη Src αποτελείται από εισόδου εξόδου, δηλαδή ως τέσσερις διακριτές περιοχές (domains). υο από αυτές συνθέτουν την καταλυτική περιοχή του µικροεπεξεργαστές, όσον αφορά την διαδικασία συνένωσης των σηµάτων ενζύµου, ενώ µε τις άλλες δυο, SH2 και SH3, η Src µπορεί και αλληλεπιδρά µε άλλα µόρια. (integration process). Σηµαντικό µέρος της πληροφορίας που δέχονται αυτές οι πρωτεΐνες προέρχεται από τις φωσφορικές οµάδες που προστίθενται ή αποµακρύνονται από αυτές από πρωτεϊνικές κινάσες και πρωτεϊνικές φωσφάτασες αντίστοιχα. Εικόνα 32. Η δοµή των κινασών πρωτεϊνών της οικογένειας Src. Για µια πρωτεΐνη που µπορεί να φωσφορυλιωθεί σε πολλαπλά σηµεία, ισχύει ότι ορισµένες φωσφορυλιώσεις αµινοξέων ενεργοποιούν την πρωτεΐνη ενώ άλλες την απενεργοποιούν. Ένα καλό παράδειγµα αυτής της «υπολογιστικής» δράσης των πρωτεϊνών αποδίδεται από την Src οικογένεια των κινασών πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη Src είναι η πρώτη κινάση τυροσίνης που ανακαλύφθηκε, η οποία σήµερα είναι 39

46 Κυτταρική Επικοινωνία γνωστό ότι ανήκει σε µια υποοικογένεια εννέα πολύ όµοιων κινασών πρωτεϊνών που εντοπίζονται µόνο στους πολυκύτταρους οργανισµούς. Εικόνα 33. Η ενεργοποίηση των πρωτεϊνικών κινασών τύπου Src ολοκληρώνεται µε την διαδοχική πραγµατοποίηση δύο γεγονότων: µια αποφωσφορυλίωση και την ειδική πρόσδεση µιας πρωτεΐνης ενεργοποιησης. (Moareti I. et al., Nature 385, , 1997) Η Src και οι οµόλογες της πρωτεΐνες περιλαµβάνουν µια µικρή αµινοτελική περιοχή που συνδέεται οµοιοπολικά µε ένα ισχυρώς υδροφοβικό λιπαρό οξύ. Αυτή η σύνδεση συγκρατεί το µόριο στην κυτταροπλασµατική πλευρά της πλασµατικής µεµβράνης. Η δοµή της πρωτεΐνης ολοκληρώνεται µε δυο περιοχές που προσδένουν πεπτίδια, την Src homology 3 (SH3) domain, και την SH2 domain καθώς και την καταλυτική περιοχή της κινάσης (Εικόνες 31, 32). Αυτές οι κινάσες συνήθως βρίσκονται στην ανενεργό κατάσταση-διαµόρφωση, στην οποία µια φωσφορυλιωµένη τυροσίνη, κοντά στην καρβοξυτελική περιοχή, είναι δεσµευµένη στην SH2 περιοχή. Αυτό έχει ως συνέπεια η SH3 περιοχή να είναι δεσµευµένη µε ένα εσωτερικό πεπτίδιο κατά τέτοιο τρόπο που παρεµποδίζεται το ενεργό κέντρο του ένζυµου και συµβάλει στο να διατηρείται το µόριο απενεργοποιηµένο. Η ενεργοποίηση της κινάσης χρειάζεται τουλάχιστον δυο βήµατα (γεγονότα) για να πραγµατοποιηθεί. Έτσι απαιτείται η αποµάκρυνση της φωσφορικής οµάδας από το καρβοξυτελικό άκρο αλλά και η πρόσδεση της SH3 περιοχής σε µια συγκεκριµένη πρωτεΐνη ενεργοποίησης (Εικόνα 33). Συνεπώς η ενεργοποίηση της Src κινάσης δηλώνει ότι ένα συγκεκριµένο σύνολο διακριτών ερεθισµάτων έχει ολοκληρωθεί (Εικόνα 34). Άρα η κινάση Src (και κατ επέκταση τα µέλη της οικογένειας) λειτουργούν ως κυκλώµατα ολοκλήρωσης σηµάτων, βοηθώντας στη δηµιουργία πολύπλοκων δικτύων πληροφοριών (που έχουν υποστεί µια αρχική επεξεργασία) έτσι ώστε το κύτταρο τελικά να δύναται να υπολογίσει λογικές 40

47 Κυτταρική Επικοινωνία αντιδράσεις στο υπερβολικά πολύπλοκο (χαοτικό) σύνολο ερεθισµάτωνσυνθηκών που υπόκειται. Εικόνα 34. Οι κινάσες τύπου Src λειτουργούν ως «λογικές πύλες». Για να ενεργοποιηθούν θα πρέπει να πραγµατοποιηθούν συγκεκριµένα γεγονότα. Ενδοκυτταρικοί Οδοί Μεταβίβασης Μηνυµάτων ιάφοροι οδοί µεταβίβασης µηνυµάτων οδηγούν σε πλήθος κυτταρικών αποκρίσεων όπως αλλαγή µεταβολισµού, σχήµατος, κίνηση, διαφοροποίηση, πολλαπλασιασµό, έκκριση, επιβίωση ή θάνατο. Οι περισσότεροι υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας επάγουν ενδοκυτταρικά ένζυµα τα οποία συνδέονται µε αυτούς είτε άµεσα (FAK, JAK) είτε έµµεσα µέσω G πρωτεϊνών (αδενυλική κυκλάση, φωσφολιπάση C). Τα ενδοκυτταρικά αυτά ένζυµα δρουν ως στοιχεία, που προωθούν και ενισχύουν το σήµα το οποίο αρχίζει µε τη δέσµευση του µηνυµατοφόρου µορίου στον υποδοχέα. Η αλυσίδα των ενδοκυτταρικών αντιδράσεων που ξεκινά από την επιφάνεια του κυττάρου µπορεί να έχει ως τελικό στόχο κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες που έχουν σχέση µε το µεταβολισµό ή τον κυτταροσκελετό, ή µεταγραφικούς παράγοντες που ρυθµίζουν τη γονιδιακή έκφραση. Με αυτό τον τρόπο συνδέεται στη δεύτερη περίπτωση η κυτταρική επιφάνεια µε τον πυρήνα µε αποτέλεσµα αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση ως απόκριση στα διάφορα εξωκυτταρικά ερεθίσµατα. Οι πιο µελετηµένες οδοί µεταβίβασης σηµάτων από υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας είναι: α) Η οδός camp: Η δέσµευση διαφόρων ορµονών ενεργοποιεί τριµερείς G πρωτεΐνες που έχουν στόχο την ενεργοποίηση του ενζύµου που σχηµατίζει το camp, 41

48 Ενδοκυτταρικά Μονοπάτια την αδενυλική κυκλάση. Συνήθως, η δράση του camp επιτελείται µέσω της κινάσης Α (PKA), η οποία φωσφορυλιώνει διάφορα ένζυµα του µεταβολισµού στο κυτταρόπλασµα και διαχεόµενη στον πυρήνα φωσφορυλιώνει και τον παράγοντα µεταγραφής CREB. Ο τερµατισµός της απόκρισης επιτυγχάνεται µε τη δράση φωσφατασών. β) Οδοί cgmp: Το κυκλικό GMP σχηµατίζεται από την ενεργοποίηση της γουανυλικής κυκλάσης και αποικοδοµείται επίσης από µια φωσφοδιεστεράση. ιάφοροι τύποι γουανυλικής κυκλάσης ενεργοποιούνται και από µονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) και από διάφορα πεπτίδια. Η δράση του cgmp επιτυγχάνεται συχνά, όπως και του camp, διαµέσου µιας κινάσης ή µπορεί να δράσει κατευθείαν στη ρύθµιση ιοντικών διαύλων. γ) Οδοί φωσφολιπιδίων: Από τις πιο διαδεδοµένες και µελετηµένες οδούς µεταβίβασης σηµάτων είναι οι οδοί που βασίζονται σε δεύτερα µηνύµατα, που είναι παράγωγα των µεµβρανικών φωσφολιπιδίων, κυρίως της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης. Τα δεύτερα µηνύµατα προκύπτουν επίσης από ενεργοποίηση υποδοχέων που συνδέονται µε G πρωτεΐνες και υποδοχέων µε ενεργότητα κινάσης της τυροσίνης. Η ινοσιτόλη µπορεί να φωσφορυλιώνεται αντιστρεπτά σε διάφορες θέσεις µε τη συνδυασµένη δράση κινασών και φωσφατασών και να δώσει διάφορα φωσφοϊνοσιτίδια που συνδέονται µε τη µεµβράνη, όπως τα PIP2, PIP3 κλπ. Η οδός IP3 και Ca 2+ : Είναι από τις πιο καλά µελετηµένες. Οδηγεί σε δηµιουργία των δεύτερων µηνυµάτων IP3 και Ca +2 ως εξής: Με την υδρόλυση του µεµβρανικού φωσφολιπιδίου PIP2 από το µεµβρανικό ένζυµο φωσφολιπάση C, µετά από την ένωση µε τον υποδοχέα (τύπου RTK ή υποδοχέα σύνδεσης µε τριµερείς G πρωτεΐνες) µιας ποικιλίας ορµονών και αυξητικών παραγόντων, προκύπτουν δύο δεύτερα µηνύµατα. η διακυλογλυκερόλη (DAG), ένα λιπόφιλο µόριο που παραµένει συνδεδεµένο µε τη µεµβράνη και η τριφωσφορική ινοσιτόλη (IP3) που διαχέεται στο κυτταρόπλασµα. H DAG ενεργοποιεί την κινάση C η οποία παίζει ρόλο στην αύξηση και διαφοροποίηση γιατί ενεργοποιεί µεταξύ των άλλων πρωτεϊνών στόχων, τις πρωτεΐνες της οδού MAPK. Η IP3 κινητοποιεί την έξοδο του Ca 2+ από τις αποθήκες του ενδοπλασµατικού δικτύου δεσµευόµενη σε υποδοχείς του Ε.. που είναι δίαυλοι Ca 2+. Η αύξηση των επιπέδων Ca 2+ έχει ως αποτέλεσµα την ενεργοποίηση µιας ποικιλίας πρωτεϊνών στόχων στις οποίες δεσµεύεται το Ca 2+. Για παράδειγµα έχει διαπιστωθεί ότι ένα µόριο που είναι ευαίσθητο σε αλλαγές των επιπέδων του Ca 2+ είναι και η µονοµερής G πρωτεΐνη Ras, η ενεργοποίηση της οποίας οδηγεί στην οδό 42

49 Ενδοκυτταρικά Μονοπάτια των MAPΚ (βλ. παρακάτω) που ρυθµίζει τον πολλαπλασιασµό της και τη διαφοροποίηση. Οδός PI3-K/Akt: Το PIP2 εκτός από την υδρόλυσή του σε IP3 και διακυλογλυκερόλη, µπορεί να φωσφορυλιωθεί µε την PI3-κινάση (PI3-Κ) και να δώσει ένα άλλο δεύτερο µήνυµα το PIP3 που όπως και το PIP2 µπορεί να ενεργοποιηθεί και από G πρωτεΐνες και από υποδοχείς µε ενεργότητα κινάσης τυροσινών. Το PIP3 ενεργοποιεί την κινάση σερίνης / θρεονίνης Akt, σηµαντικό µόριο για τη µεταβίβαση σηµάτων επιβίωσης, ως εξής: ενώνεται µε την Akt διαµέσου της τύπου PH συνδετικής περιοχής καθώς και µε µια άλλη κινάση (PDK) η οποία φωσφορυλιώνει την Akt. Με τη φωσφορυλίωσή της η Akt ενεργοποιείται και φωσφορυλιώνει πλήθος πρωτεϊνών (µέλη της οικογένειας Bcl-2) που ρυθµίζουν τον κυτταρικό θάνατο ή την επιβίωση (Εικόνα 35). εύτερα µηνύµατα µπορούν να προέλθουν και από άλλα φωσφολιπίδια, όπως από τη φωσφατιδυλοχολίνη να παραχθεί διακυλογλυκερόλη, από τη σφιγγοµυελίνη κεραµίδιο κ.ά., τα οποία ενεργοποιώντας διάφορες κινάσες και φωσφατάσες επηρεάζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό και την επιβίωση. Εικόνα 35. Η όδος µεταγωγής κυτταρικών µηνυµάτων επιβίωσης PI3K AKT (PKB). δ) Οι οδοί ΜΑΡΚ: Οι οδοί ΜΑΡΚ περιλαµβάνουν την ενεργοποίηση µιας σειράς κινασών των πρωτεϊνών σε απόκριση σε µια ποικιλία εξωκυτταρικών σηµάτων π.χ κυτταροκινών, UV ακτινοβολίας, κυτταρικό στρες κ.α. Οι ευκαρυωτικοί οργανισµοί διαθέτουν πολλαπλές οδούς ενεργοποίησης ΜΑΡΚ (οδός ERK, JNK, P38) οι οποίες καταλήγουν σε ποικίλες αποκρίσεις από πολλαπλασιασµό, 43

50 Ενδοκυτταρικά Μονοπάτια διαφοροποίηση και επιβίωση, µέχρι φλεγµονές και κυτταρικό θάνατο. Περισσότερες λεπτοµέρειες για αυτές τις οδούς θα αναφερθούν παρακάτω. ε) H οδός JAK-STAT: Οι οδοί ΜΑΡΚ συνδέουν έµµεσα την κυτταρική επιφάνεια µε τον πυρήνα µέσω των κινασών σερίνης/θρεονίνης που φωσφορυλιώνουν µεταγραφικούς παράγοντες. Μία άλλη οδός πολύ περισσότερο άµεση είναι η οδός JAK/STAT. Στην οδό αυτή η φωσφορυλίωση των µεταγραφικών παραγόντων STAT, οι οποίοι περιέχουν περιοχές SH2 και βρίσκονται στο κυτταρόπλασµα, από την κινάση τυροσίνης JAK, που συνδέεται µε το κυτταροπλασµατικό τµήµα του υποδοχέα, προκαλεί το διµερισµό τους και τη µετανάστευσή τους στον πυρήνα όπου µεταγράφουν τα γονίδια-στόχους. Τα µηνυµατοφόρα µόρια σε αυτή την οδό είναι κυτταροκίνες αλλά και αυξητικοί παράγοντες. στ) Οδοί απόπτωσης και επιβίωσης: Η απόπτωση, δηλαδή o προγραµµατισµένος κυτταρικός θάνατος, επάγεται από διάφορα εξωγενή ερεθίσµατα όπως: από στεροειδείς ορµόνες, από καταστροφή του DNA λόγω ακτινοβολιών, από δέσµευση στους υποδοχείς θανάτου µελών της οικογένειας του TNF, από έλλειψη τροφικών παραγόντων. Οι οδοί που καταλήγουν σε απόπτωση περιλαµβάνουν 3 κατηγορίες µορίων που αποτελούν τον πυρήνα της κυτταρικής µηχανής θανάτου: α) τα ρυθµιστικά µόρια (πρωτεΐνες µέλη της οικογένειας Bcl-2 στα θηλαστικά), που είναι κλειδιά για τη ζωή ή το θάνατο των κυττάρων εφόσον επάγουν (προαποπτωτικές πρωτεΐνες) ή µπλοκάρουν (αντιαποπτωτικές πρωτεΐνες) τα µηνύµατα θανάτου, β) πρωτεΐνες τελεστές. Η κατηγορία αυτή περιλαµβάνει τις πρωτεάσες κυστεΐνης γνωστές ως κασπάσες, οι οποίες συνθέτονται ως ανενεργά πρόδροµα µόρια και γ) πρωτεΐνες συνδέτες των κασπασών (CED-4, dark, Apaf-1). Υπάρχουν δύο κύριες οδοί απόπτωσης (Εικόνα 36) α) η εξωγενής που επάγεται από τη δέσµευση υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας µε µόρια θανάτου π.χ. µέλη της οικογένειας του TNF και β) η ενδογενής που επάγεται από στρεσογόνα σήµατα όπως καταστροφή του DNA και έλλειψη τροφικών παραγόντων. Κάθε µια οδός ενεργοποιεί ειδικές εναρκτήριες κασπάσες, την κασπάση-8 και κασπάση-9 αντίστοιχα. Στην εξωγενή οδό η σύνδεση του υποδοχέα µε το µηνυµατοφόρο µόριο επάγει την ένωση µιας πρωτεΐνης-συνδέτη στο κυτταροπλασµατικό τµήµα του, διαµέσου περιοχών που φέρουν και ο υποδοχέας και η πρωτεΐνη γνωστές ως περιοχές θανάτου. Στο σύµπλοκο αυτό προσδένονται µόρια προκασπασών 8 µε αποτέλεσµα 44

51 Ενδοκυτταρικά Μονοπάτια την ενεργοποίηση της αυτοπρωτεόλυσής τους και την απελευθέρωση στο κυτταρόπλασµα των κασπασών 8. Στην ενδογενή οδό, το κυτταρόχρωµα C που απελευθερώνεται από τα µιτοχόνδρια συνδέεται µε τον παράγοντα Apaf-1 ο οποίος ενεργοποιεί την κασπάση 9. Και οι δύο οδοί συγκλίνουν στην ενεργοποίηση του τελεστή κασπάση-3 (ενεργοποιείται και από την κασπάση 8 και από την 9) η οποία µε τη σειρά της περνά το σήµα θανάτου σε άλλες κασπάσες. Έτσι ξεκινά µια αλυσίδα διαδοχικών πρωτεολύσεων µε τελικό αποτέλεσµα την πρωτεόλυση πρωτεϊνών-στόχων όπως FAK, λαµίνες, ένζυµα επιδιόρθωσης DNA κ.ά. και τελικά την απόπτωση. Είναι σηµαντικό να τονιστεί ότι πολλοί κυτταρικοί τύποι εξαρτούν την επιβίωσή τους όχι µόνο από εκκρινόµενους τροφικούς παράγοντες που καταστέλλουν την απόπτωση αλλά και από διακυτταρικές επαφές και επαφές µε την εξωκυτταρική ύλη. Εικόνα 36. Σηµατοδοτικά µονοπάτια που οδηγούν σε απόπτωση στα κύτταρα των θηλαστικών. Από αριστερά προς τα δεξιά περιγράφονται η εξωγενής οδός, η ενδογενής οδός, η εξαρτηµένη από την κασπάση 2 οδός και η επαγόµενη από το Granzyme A οδός. Από τις παραπάνω οι δυο πρώτες αποτελούν τις κύριες οδούς απόπτωσης. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα µόρια που συµµετέχουν στις διάφορες οδούς έχει διαπιστωθεί ότι ανήκουν σε ένα µικρό αριθµό διαφορετικών κατηγοριών (G πρωτεΐνες, κινάσες, υποδοχείς, δεύτερα µηνύµατα, πρωτεΐνες-συνδετήρες και ικριώµατα). Φαίνεται ότι κατά τη 45

52 Ενδοκυτταρικά Μονοπάτια διάρκεια της εξέλιξης οι πρωτεΐνες αυτές έχουν διατηρηθεί. Ενώ όµως στα ασπόνδυλα συχνά υπάρχουν ένα ή λίγα µόνο γονίδια που κωδικοποιούν τέτοιες πρωτεΐνες, στα σπονδυλωτά λόγω γονιδιακών διπλασιασµών και της µετέπειτα απόκλισης ο αριθµός των γονιδίων αυξάνει µε αποτέλεσµα να υπάρχουν πολλαπλές ισοµορφές των πρωτεϊνών. Οι ισοµορφές αυτές που εκφράζονται συχνά σε διαφορετικά στάδια ανάπτυξης ή σε διαφορετικούς ιστούς, εµφανίζουν διαφορετική δράση. Τέλος, από όσα προαναφέρθηκαν γίνεται αντιληπτό ότι αν και σήµερα έχουµε κατανοήσει, σε µερικές µάλιστα περιπτώσεις µε λεπτοµέρεια, τον τρόπο που ανιχνεύουν τα κύτταρα ένα ερέθισµα, οι µηχανισµοί τους οποίους χρησιµοποιούν για να ενσωµατώσουν και να επεξεργαστούν το πλήθος των µηνυµάτων που λαµβάνουν συγχρόνως, ώστε να αποκριθούν ανάλογα, παραµένουν άγνωστοι. Η αποκωδικοποίησή τους αποτελεί βασικό στόχο για την κατανόηση της κυτταρικής επικοινωνίας γιατί θα µας δώσει πολύ σηµαντικές πληροφορίες για τη ρύθµιση των φυσιολογικών και µη λειτουργιών. Η γνώση π.χ. της ρύθµισης της κυτταρικής διαίρεσης στα φυσιολογικά κύτταρα θα µας δώσει τη δυνατότητα καλύτερης κατανόησης των µηχανισµών µε τους οποίους τα κύτταρα χάνουν τον έλεγχο της διαίρεσής τους και οδηγούνται σε καρκινογένεση. Η γνώση δε του τρόπου της κυτταρικής επικοινωνίας σε παθολογικές καταστάσεις θα µας οδηγήσει στην εξεύρεση νέων στρατηγικών για την αντιµετώπιση ασθενειών όπως ο διαβήτης, ο καρκίνος, διάφορα καρδιοαγγειακά νοσήµατα και νοσήµατα του ανοσοποιητικού και του νευρικού συστήµατος. Εποµένως η γνώση του τρόπου επικοινωνίας των κυττάρων έχει τεράστιο ενδιαφέρον τόσο για τη βασική όσο και για την εφαρµοσµένη έρευνα. Μέσα σε αυτό το πλαίσιο και για την καλύτερη κατανόηση του θέµατος της παρούσας διατριβής θα ακολουθήσει ανάλυση των βασικότερων στοιχείων της οδού µεταγωγής σηµάτων που έχει ως κοµβικό µόριο την FAK. Τα εξωκυτταρικά σήµατα σε αυτήν την περίπτωση δεσµέυονται σε υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας (δηλ. στις ιντεγκρίνες) και γεννούν ενδοκυτταρικά µηνύµατα τα οποία φιλτράρονται από πρωτεΐνες όπως η FAK για να φτάσουν στον κυτταροσκελετο ή / και στον πυρήνα µε τελικό αποτέλεσµα την αλλαγή συµπεριφοράς του κυττάρου ή την επιτέλεση του βιολογικού του ρόλου. 46

53 Εστίες Προσκόλλησης- Ιντεγκρίνες Μεταβίβαση Μηνυµάτων Από Σηµεία Επαφής Κυττάρου-Κυττάρου Και Κυττάρου-Εξωκυτταρικής Ύλης Τα κύτταρα λαµβάνουν σήµατα διαµέσου διαφόρων εκκρινόµενων µηνυµατοφόρων µορίων αλλά και διαµέσου των επαφών τους µε τα γειτονικά κύτταρα και µε τα συστατικά της εξωκυτταρικής ύλης. Σήµερα γνωρίζουµε ότι τα σηµεία επαφής κυττάρου-κυττάρου (σύνδεσµοι πρόσδεσης, στενοσύνδεσµοι, δεσµοσώµατα) ή κυττάρου-εξωκυτταρικής ύλης (ηµιδεσµοσώµατα, εστίες προσκόλλησης) δεν είναι απλώς δοµικές συνδέσεις, αλλά και κέντρα µεταβίβασης µηνυµάτων από το εξωτερικό περιβάλλον. Πράγµατι, στα σηµεία αυτά έχουν διαπιστωθεί πλήθος κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών αλλά και πρωτεϊνών που είναι συστατικά µεταβίβασης µηνυµάτων όπως κινάσες, φωσφατάσες, πρωτεΐνες συνδετήρες (Εικόνα 37). Υποδοχείς τέτοιων σηµάτων είναι οι διαµεµβρανικές πρωτεΐνες, ιντεγκρίνες και καντερίνες. Οι ενδοκυτταρικοί οδοί που ξεκινούν από τους υποδοχείς αυτούς οδηγούν σε αλλαγές στην οργάνωση του κυτταροσκελετού και εποµένως σε αλλαγές του κυτταρικού σχήµατος, σε κίνηση, σε κυτταρική προσκόλληση, κυτταροφαγία κ.ά. αλλά και σε άλλες που προϋποθέτουν αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης όπως πολλαπλασιασµό, διαφοροποίηση, απόπτωση κλπ. Ιντεγκρίνες Οι πιο καλά µελετηµένοι υποδοχείς µηνυµάτων από σηµεία επαφής του κυττάρου είναι οι ιντεγκρίνες. Οι υποδοχείς αυτοί είναι ετεροδιµερείς, αποτελούνται από α και β πεπτιδικές αλυσίδες που συνδέονται µεταξύ τους µε ασθενείς δεσµούς, διαµεµβρανικές πρωτεΐνες. Αποτελούν τους κύριους υποδοχείς επαφής κυττάρουεξωκυτταρικής ύλης στους οποίους προσδένονται µόρια της εξωκυτταρικής ύλης (ECM) (Giancotti, 2003) αλλά και σε υποδοχείς της επιφάνειας άλλων κυττάρων συµβάλλοντας έτσι και στην επαφή κυττάρου µε κύτταρο. Τα σήµατα που περνούν µέσω ιντεγκρινών από τα σηµεία επαφής σχετίζονται µε την κυτταρική αύξηση, την κυτταρική κινητικότητα, την άµυνα και επιβίωση (Brakebusch et al., 2002). Συνεπώς, οι ιντεγκρίνες ρυθµίζουν πολυάριθµα κυτταρικά µονοπάτια µεταγωγής σηµάτων (Hynes, 2002). Ο βιολογικός ρόλος των ιντεγκρινών είναι απαραίτητος για τα κύτταρα, γεγονός που επιβεβαιώνει τόσο η εκτεταµένη έκφραση τους κατά την ανάπτυξη όσο και η σωρεία ασθενειών που σχετίζεται µε ανωµαλίες των ιντεγκρινών. 47

54 Εστίες Προσκόλλησης- Ιντεγκρίνες Οι ιντεγκρίνες συνιστούν τουλάχιστο τρεις κατηγορίες οικογενειών γονιδίων και απαντούν σε όλα σχεδόν τα κύτταρα. Είναι διαµεµβρανικές γλυκοπρωτεΐνες, το εξωκυτταρικό τµήµα των οποίων δεσµεύει διάφορες πρωτεΐνες προσκόλλησης και το κυτταροπλασµατικό τµήµα τους ενώνεται συνήθως διαµέσου διάφορων κυτταροπλασµατικών πρωτεϊνών µε το κυτταροσκελετό της ακτίνης του κυττάρου (Εικόνα 37). Εικόνα 37. Σχηµατική απεικόνιση της πολυπλοκότητας των κύριων µοριακών δοµών των προσκολλήσεων κυττάρου εξωκυτταρικής ύλης. Οι κύριοι υποδοχείς προσκόλλησης των κυττάρων είναι οι ετεροδιµερείς (α & β υποµονάδες) ιντεγκρίνες (πορτοκαλί κύλινδροι). Επιπρόσθετα, µόρια που σχετίζονται µε την µεµβράνη (και έχουν ενισχυµένη παρουσία στις εστίες προσκόλλησης) περιλαµβάνουν τα συνδεκάνη-4 (Syn4), την λαϊλίνη (Lay= layilin), τον υποδοχέα LAR (phosphatase leukocyte common antigen-related receptor), το SHP-2 substrate-1 (SHPS-1) και το upar (urokinase plasminogen activator receptor) (κόκκινα). Επίσης, πρωτείνες που αλληλεπιδρούν µε τις ιντεγκρίνες και τον κυτταροσκελετό της ακτίνης, και οι οποίες εξυπηρετούν ως δοµικά ικριώµατα των εστιών προσκόλλησης, περιλαµβάνουν την α-ακτινίνη (a-actinin, a-act), την ταλίνη (Tal), την τενσίνη (Ten) και την φιλαµίνη (Fil), που φαίνονται ως χρυσές ράβδοι. Ακόµα πρωτεινες που αλληλεπιδρούν µε τις ιντεγκρίνες (µπλε χρώµα) είναι οι εξης: η κινάση εστιακών προσκόλλήσεων (FAK), η παξιλίνη (Pax), ILK (integrin linked kinase), DRAL (downregulated in rhabdomyosarcoma LIM-protein), β και η καβεολίνη (Cav). Από την άλλη οι πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν µε την ακτίνη (φαίνονται µε πράσινο χρώµα στο σχήµα) περιλαµβάνουν τις: VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein), Fim (fimbrin), πρωτεΐνες ERM (ezrin radixin moesin), Abl κινάση, νεξιλίνη (nexillin), παρβίνη (parvin/actopaxin) και η βινκουλίνη (Vin). Άλλες πρωτεινες που λειτουργούν ως συνδετήρες είναι οι: ζυξίνη (Zyx), CRP (cysteine-rich protein), παλλαντίνη (Pall), PINCH, paxillin kinase linker (PKL), PIX (PAKinteracting exchange factor), Vnx (vinexin), Pon (ponsin), Grb-7, ASAP1, Synt (syntenin), και Synd (syndesmos) (οι παραπάνω πρωτεΐνες φέρουν ροζ χρώµα). Τέλος, υπάρχουν και αρκετά ένζυµα (κινάσες, φωσφατάσες και πρωτεολυτικά ένζυµα) όπως τα: SHP-2 (SH2-containing phosphatase-2), SHIP-2 (SH2-containing inositol 5-phosphotase-2), PAK (p21-activated kinase), PI3K (phosphatidyl inositol 3-kinase), Src FK (Src-family kinases), Csk (carboxy-terminal src kinase), η πρωτεΐνη καλπαΐνη 2 (Calp II) και η πρωτεϊνική κινάση C (PKC). Τα ένζυµα διακρίνονται από τις φωτεινότερες σκιές. 48

55 Εστίες Προσκόλλησης- Ιντεγκρίνες Εικόνα 38. Σχηµατική απεικόνιση των ιντεγκρινών. Το µεγαλύτερο µέρος από τις δυο υποµονάδες είναι εξωκυτταρικό ενώ τη θέση αναγνώρισης και αλληλεπίδρασης µε το µόριο-συνδέτη την συνιστούν τµήµατα και από τις δυο υποµονάδες. Για την ρύθµίση της κυτταρικής αύξησης και διαφοροποίησης, οι ιντεγκρίνες συνεργάζονται µε άλλους υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας, όπως για παράδειγµα τους υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων. εν επαρκεί όµως µόνον η συνεργασία µεταξύ των υποδοχέων. Οι ιντεγκρίνες θα πρέπει να ενεργοποιηθούν για να συνδεθούν µε την ECM. Φαίνεται ότι εξωκυτταρικά σήµατα ενεργοποιούν ενδοκυτταρικά σήµατα, που µε την σειρά τους αλλάζουν την ικανότητα προσκόλλησης των ιντεγκρινών. Η αλλαγή αυτή οφείλεται σε αλλαγή της διαµόρφωσης της ιντεγκρίνης (Εικόνα 39). Πολλές από τις εξωκυτταρικές πρωτεΐνες που δεσµεύονται σε ένα κύτταρο, αναγνωρίζονται από περισσότερες από µια ιντεγκρίνες (π.χ. η φιµπρονεκτίνη δεσµεύεται από 8 ιντεγκρίνες). Για να γίνει η δέσµευση απαιτούνται ιόντα Ca 2+ ή Mg 2+ (Εικόνα 38). Μετά την δέσµευση της ιντεγκρίνης µε την εξωκυτταρική πρωτεΐνη, ακολουθεί η δέσµευση του κυτταροπλασµατικού άκρου της β-αλυσίδας της, µε την ταλίνη και την α-ακτινίνη, δηλαδή επιτυγχάνεται σύνδεση µε τον κυτταροσκελετό της ακτίνης. Η σύνδεση αυτή επιτρέπει να επικοινωνούν διαµέσου της πλασµατικής µεµβράνης ο κυτταροσκελετός µε την ECM, µε άµεσες βιολογικές συνέπειες. Εικόνα 39. Όταν οι ιντεγκρίνες βρίσκονται σε ανενεργή κατάσταση τα ετεροδιµερή (α και β υποµονάδες) έχουν τέτοια διαµόρφωση ώστε να µην αλληλεπιδρούν µε εξωκυτταρικούς προσδέτες. Οι κυτταροπλασµατικές περιοχές των υποµονάδων ίσως να συγκρατούνται µαζί µε την παρεµβολή κάποιας πρωτεΐνης (ροζ πλαίσιο). Η ενεργοποίηση των ιντεγκρινών, η οποία σταθεροποιεί την διαµόρφωση ενεργοποίησης, µπορεί να γίνει είτε από εξωκυτταρικό προσδέτη είτε από κάποια ενδοκυτταρική πρωτεΐνη π.χ. την ταλίνη. Η συνάθροιση των ιντεγκρινών σταθεροποιείται από οµοολιγοµερή των διαµεµβρανικών τµηµάτων των α και β υποµονάδων. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις φέρουν σε γειτνίαση τις ιντεγκρίνες, τα προσδέµατα τους, κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες αλλά και σηµατοδοτικές πρωτεΐνες όπως για παράδειγµα την FAK (LI R. et al., Science 300, 795 (2003). 49

56 Εστίες Προσκόλλησης- Ιντεγκρίνες Οι ιντεγκρίνες αναγνωρίζουν και δεσµεύουν πρωτεΐνες που έχουν µια συγκεκριµένη αλληλουχία αµινοξέων. Μερικές µάλιστα, αναγνωρίζουν την ίδια ειδική αλληλουχία σε περισσότερες από µια διαφορετικές πρωτεΐνες. Η πιο διαδεδοµένη αλληλουχία είναι η RGD (αργινίνη γλυκίνη - ασπαραγίνη). Απαντά µεταξύ άλλων, στη βιτρονεκτίνη, φιµπρινογόνο, εντακτίνη, κολλαγόνο και φιµπρονεκτίνη. Εκτός των παραπάνω οι ιντεγκρίνες είναι γνωστό ότι συµµετέχουν στην προσκόλληση ενός κυττάρου µε ένα άλλο κύτταρο µε ετεροφιλική σύνδεση. Οι ιντεγκρίνες µεταβιβάζουν σήµατα και προς τις δυο κατευθύνσεις: η πρόσδεση στο υπόστρωµα επάγει την αλληλεπίδραση των ιντεγκρινών µε τον κυτταροσκελετο της ακτίνης και κατά συνέπεια ενεργοποιούνται βιοχηµικά µονοπάτια µέσα στο κύτταρο (outside-in) (Giancotti et Ruoslahti, 1999). Αντιστρόφως, ενδοκυτταρικά σήµατα µπορούν να διεγείρουν την πρόσδεση των ιντεγκρινών στο υπόστρωµα (inside out) (Liddington and Ginsberg, 2002). Πρωτεΐνες που συνδέουν τις ιντεγκρίνες µε τον κυτταροσκελετό. Πρόσφατα δεδοµένα αποδεικνύουν ότι οι συνδέσεις ανάµεσα στις ιντεγκρίνες και τον κυτταροσκελετό της ακτίνης χαρακτηρίζονται από έντονη δυναµικότητα διότι υπόκεινται σε πληθώρα ρυθµιστικών διαδικασιών (Brakebusch et al., 2003). Πολλές Εικόνα 40. Οι ιντεγκρίνες µπορούν να συνδεθούν µε κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες τον κυτταροσκελετο ακτίνης µε ποικίλους τρόπους οι οποίοι ρυθµίζονται από πληθώρα πρωτεϊνών. αλληλεπιδρούν τόσο µε τις ιντεγκρίνες όσο και µε κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες εξασφαλίζοντας µε αυτό τον τρόπο την µεταγωγή µηνυµάτων από τις ιντεγκρίνες (Εικόνα 40). Τέτοιες πρωτεΐνες είναι οι ακόλουθες: Ταλίνη. Αποτελεί µια µεγάλη πρωτεΐνη (>2500 αµινοξέα) που φέρει µια αµινοτελική κεφαλή 50 kda και µια µεγάλη ραβδόµορφη περιοχή 220 kda. Στην περιοχή της κεφαλής υπάρχει µια FERM περιοχή µε την οποία συνδέεται µε τις ιντεγκρίνες αλλά και τις υπόλοιπες πρωτεΐνες µε τις οποίες αλληλεπιδρά (Chen et al., 1995, Martel et al., 2001). Η καρβοξυτελική περιοχή του µορίου 50

57 Εστίες Προσκόλλησης- Ιντεγκρίνες φέρει θέση πρόσδεσης της ακτίνης ενώ στην ραβδόµορφη περιοχή της ταλίνης υπάρχουν και τρεις θέσεις δέσµευσης της βινκουλίνης (Hemmings et al., 1996). Ευρήµατα από µελέτες σε έντοµα υποδεικνύουν ότι η λειτουργία των ιντεγκρινών βασίζεται σε πολύ µεγάλο βαθµό στην ταλίνη (Schöck et al., 2003). Στα θηλαστικά υπάρχουν δυο αρκετά όµοιες ισοµορφές της ταλίνης (Monkley et al., 2000). α-ακτινίνη. Συνδέει τα ινίδια της ακτίνης µε τις κυτταροπλασµατικές ουρές διαµεµβρανικών υποδοχέων (π.χ. τις ιντεγκρίνες) ή διασυνδέει τα νηµάτια της ακτίνης σε µεγαλύτερα δίκτυα. Υπάρχουν 4 ισοµορφές στα θηλαστικά (Honda et al., 1998). Πολλές κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν µε την α- ακτινίνη, σε αυτές περιλαµβάνονται οι PI3K, Erk 1/2, η βινκουλίνη, η ζυξίνη, η FAK κ.α., συνεπώς η πρωτεΐνη αυτή εξυπηρετεί ως µια σηµαντική πρωτεΐνη ικρίωµα. Για αυτό, άλλωστε, οι α-actinin-null µεταλλαγές είναι θανατογόνες για τα έντοµα (Fyrberg et al., 1998). Φιλαµίνη. ιµερής πρωτεΐνη που φέρει µια περιοχή κεφαλής η οποία έχει την θέση δέσµευσης µε την ακτίνη. Στον άνθρωπο είναι τρία τα γονίδια των φιλαµινών, τα οποία µε εναλλακτικό µάτισµα εκφράζουν διάφορες ισοµορφές. Μπορεί να συνδεθεί µε τις ιντεγκρίνες, σηµατοδοτικά µόρια όπως τις Rho- GTPases, την MEKK, τις GEFs αλλά και άλλες πρωτεΐνες (Brakebusch et al., 2003). Η φιλαµίνη έχει βρεθεί ότι ρυθµίζει τα επίπεδα µεµβρανικών ιντεγκρινών και την λειτουργία τους (Calderwood et al., 2001). FAK. (θα εξετασθεί αναλυτικότατα παρακάτω) ICAP-1. εσµεύεται αποκλειστικά στην β1 ιντεγκρίνη. Θεωρείται πως η ICAP- 1 λειτουργεί ως αναστολέας των Rho-GTPases, όταν όµως δεσµευτεί στις ιντεγκρίνες τότε απελευθερώνεται η δράση των Cdc42 και Rac1 µε αποτέλεσµα την κυτταρική επέκταση και µετανάστευση (Degani et al., 2002). ILK-parvin-PINCH (σύµπλοκο). Η ILK (integrin linked kinase) περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1995 ως µια κινάση σερίνης/θρεονίνης, η οποία δεσµεύεται στην κυτταροπλασµατική ουρά των ιντεγκρινικών υποµονάδων β1, β2 και β3 (Hannigan et al., 1996). Υποστρώµατα της κινάσης ILK θεωρήθηκαν η Akt και η GSK-3β. Πρόσφατες, όµως, µελέτες απέδειξαν ότι η δράση της ILK ως κινάση δεν είναι απαραίτητη ούτε για την ανάπτυξη των ασπόνδυλων αλλά ούτε και απαιτείται για την µεταγωγή σηµάτων προς τις Akt και 51

58 Εστίες Προσκόλλησης- Ιντεγκρίνες GSK-3β σε πολλούς κυτταρικούς τύπους σπονδυλωτών (Zervas et al., 2001, Sakai et al., 2003). Αντίθετα, βρέθηκε από τους Zervas et al. ότι η σηµαντικότητα της ILK οφείλεται στην ικανότητα του µορίου να συνδέει την πλασµατική µεµβράνη µε τον κυτταροσκελετό της ακτίνης στις θέσεις των εστιών προσκόλλησης. Επίσης, φαίνεται πως η ILK είναι υπεύθυνη για την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού (Sakai et al., 2003). Η ILK αλληλεπιδρά µε την καρβοξυτελική της περιοχή (στην οποία εντοπίζεται η καταλυτική περιοχή του µορίου) την παξιλίνη (Nikolopoulos et al., 2001). Στο αµινοτελικο της άκρο, στο οποίο φέρει 4 ankyrin επαναλήψεις όπως επίσης και µια PH περιοχή, δεσµεύεται η Pinch (Zhang et al., 2002a, Braun et al., 2003). Η pinch αλληλεπιδρά µε την πρωτεΐνη συνδετήρα Nck2 η οποία φέρει SH2-SH3 περιοχές και θεωρείται πως συµµετέχει πιθανότατα στην «συνοµιλία» µεταξύ των ιντεγκρινών και των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων. Επιπλέον στην Nck2 δεσµεύονται πρωτεΐνες που σχετίζονται µε την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Ακόµα στην περιοχή της κινάσης της ILK δεσµεύεται η Parvin, η οποία µπορεί και αλληλεπιδρά µε την F- ακτίνη, άµεσα ή έµµεσα µέσω παξιλίνης και βινκουλίνης (Olski et al., 2001). Ο σχηµατισµός συµπλόκου ανάµεσα σε ILK- Pinch - Parvin και αλληλεπιδράσεις µε άλλες πρωτεΐνες επιτρέπουν την συµµετοχή του συµπλόκου στις εστίες προσκόλλησης, όπου ρυθµίζουν τον πολυµερισµό της ακτίνης σε πολλαπλά επίπεδα (Εικόνα 41). Περισσότερες από 20 πρωτεΐνες έχουν βρεθεί να δεσµεύονται άµεσα µε το κυτταροπλασµατικό µέρος των ιντεγκρινών. Πολύ περισσότερες είναι αυτές που αλληλεπιδρούν έµµεσα µε τις ιντεγκρίνες. Έτσι σχηµατίζονται πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα γύρω από τις ιντεγκρίνες συνδέοντας τις µε τον κυτταροσκελετο και επάγοντας τις κυτταροσκελετικές αναδιοργανώσεις που τροποποιούν την κυτταρική συµπεριφορά. Εικόνα 41. Η ILK στρατολογεί πολλές πρωτεΐνεςσυνδετήρες οι οποίες ρυθµίζουν την δυναµική της ακτίνης ή την σύνδεση της ακτίνης µε τις ιντεγκρίνες στις θέσεις προσκόλλησης, άµεσα ή έµµεσα. 52

59 Εστίες Προσκόλλησης- Ιντεγκρίνες Εξωκυτταρικά σήµατα διέρχονται από τις ιντεγκρίνες προς την FAK Η αλληλεπίδραση της εξωκυτταρικής περιοχής µιας ιντεγκρίνης µε µια πρωτεΐνη ή πρωτεογλυκάνη της εξωκυτταρικής ουσίας, π.χ. µε τη φιµπρονεκτίνη, προκαλεί την συνάθροιση των ιντεγκρινών και µπορεί να επάγει τη δηµιουργία δεύτερων µηνυµάτων καθώς και τη φωσφορυλίωση διάφορων κυτταρικών πρωτεϊνών διαµέσου της ενεργοποίησης κινασών (Hynes, 2002). Όλα αυτά προφανώς επηρεάζουν βασικές κυτταρικές λειτουργίες όπως πολλαπλασιασµό, κίνηση, διαφοροποίηση, επιβίωση (Brakebusch et al., 2002). Αυτός είναι και ο λόγος που τα φυσιολογικά κύτταρα δε µπορούν να πολλαπλασιαστούν και να επιβιώσουν σε κυτταροκαλλιέργειες αν δεν προσκολληθούν στο δοχείο καλλιέργειας. Στις εστίες προσκόλλησης που είναι τα πιο µελετηµένα σηµεία κυτταρικών επαφών, οι ιντεγκρίνες συνδέονται µε την κυτταροπλασµατική τους περιοχή µε διάφορες κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες (α-ακτινίνη, ταλίνη, φιλαµίνη κ.ά.) αλλά και µε πρωτεΐνες µεταβίβασης µηνυ- µάτων όπως την κινάση τυροσινών γνωστή ως κινάση εστιών προσκόλλησης (FAK). Οι φωσφοτυροσίνες που προκύπτουν αποτελούν θέσεις σύνδεσης του συµπλόκου Grb2-Sos που θα οδηγεί στην οδό Ras-MAPK, καθώς και της PI3K (διαµέσου της περιοχής SH2 που διαθέτει). Επίσης, οι ιντεγκρίνες µπορούν µέσω της FAK και των κινασών της οικογένειας Src να ενεργοποιήσουν τις Rho-GTPases, οι οποίες εκτός από την κυτταρική κίνηση και µετανάστευση σχετίζονται µε τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό, την κυτταρική επιβίωση ακόµα και µε την µεταφορά των κυστιδίων στο εσωτερικό του κυττάρου. Εποµένως, µε τη σύνδεση ιντεγκρίνης-εξωκυτταρικής ύλης περνούν διαµέσου της FAK µηνύµατα πολλαπλασιασµού, διαφοροποίησης, επιβίωσης (Εικόνα 42). Εικόνα 42. Μοντέλο µεταγωγής σηµάτων από τις ιντεγκρίνες και την κινάση εστιακής προσκόλλησης. Οι ιντεγκρίνες συνδέονται µε την FAK την οποία ενεργοποιούν και διαµέσου της οποίας στέλνουν σήµατα πολλαπλασιασµού, διαφοροποίησης, επιβίωσης προς ενδοκυτταρικούς τελεστές π.χ. τις MAPKs 53

60 Εστίες Προσκόλλησης- Ιντεγκρίνες Rho πρωτεΐνες και κυτταροσκελετός Το σχήµα και η κίνηση των κυττάρων οφείλεται ως γνωστό κατά κύριο λόγο στον κυτταροσκελετό της ακτίνης. Η κυτταρική προσκόλληση και διάφοροι αυξητικοί παράγοντες συχνά προκαλούν αλλαγές στο κυτταρικό σχήµα και κίνηση λόγω αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Κεντρικό ρόλο στη ρύθµιση της οργάνωσης του κυτταροσκελετού της ακτίνης έχουν οι πρωτεΐνες της οικογένειας Rho (Rho, Rac, Cdc42), δηλαδη οι Rho-GTPases. Τα µέλη της οικογένειας αυτής είναι µονοµερείς G πρωτεΐνες όπως η Ras. Η δράση των Rho, Rac, Cdc42 επιτελείται διαµέσου της ενεργοποίησης διαφόρων ειδικών κινασών σερίνης/θρεονίνης, των RhoK, LIMK, PAK κ.ά. Οι κινάσες αυτές µε την σειρά τους φωσφορυλιώνουν διάφορες πρωτεΐνες που συνδέονται µε τον κυτταροσκελετό. Π.χ. η RhoK που ενεργοποιείται από την Rho φωσφορυλιώνει την ελαφριά αλυσίδα της µυοσίνης ΙΙ µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση της µυοσίνης η οποία µπορεί να δηµιουργήσει ινίδια ακτινοµυοσίνης (ινίδια τάσης), και εστίες προσκόλλησης (Εικόνα 43), συνδέσµους πρόσδεσης, κυτταροκίνηση. Αντίθετα η PAK που ενεργοποιείται από τις Rac και Cdc42 όταν φωσφορυλιώσει την ελαφρά αλυσίδα της µυοσίνης την απενεργοποιεί. Έτσι η µυοσίνη δεν αλληλεπιδρά µε την ακτίνη για τη δηµιουργία εστιών προσκόλλησης και η ακτίνη είναι ελεύθερη να δηµιουργεί διάφορες κυτταρικές προεκβολές (ελασµατοπόδια, νηµατοπόδια) (Etienne-Manneville et al., 2002). Εικόνα 43. Η κατευθυνόµενη κυτταρική µετανάστευση εξαρτάται από τον δυναµική διαδοχική προσκόλληση του κυττάρου στο υπόστρωµα (µέσω των εστιών προσκόλλησης ή των εστιακών επαφών) στο άκρο οδηγό συντονισµένη µε την αποκόλληση του κυττάρου από το υπόστρωµα στο αντίθετο άκρο. Οι εστίες προσκόλλησης είναι πολυµερή πρωτεϊνικά σύµπλοκα τα οποία παρέχουν δοµική σύνδεση των επιφανειακών ιντεγκρινικών υποδοχέων του κυττάρου µε προσδέτες της εξωκυτταρικής ύλης αλλά και τον ενδοκυτταρικό κυτταροσκελετό της ακτίνης. Οι τροποποιήσεις στην κυτταρική µορφολογία ελέγχονται από την οικογένεια των µικρών GTPασών (Rac1, RhoA και Cdc42) αλλά και από πρωτεολυτικά ένζυµα όπως τις καλπαΐνες οι οποίες πρωτεολύουν πρωτεϊνικά συστατικά των εστιών προσκόλλησης προκαλώντας την αποκόλληση από το υπόστρωµα. 54

61 Paxillin Παξιλίνη, µια πρωτεΐνη συνδετήρας των εστιών προσκόλλησης. Οι πρωτεΐνες ικριώµατα και συνδετήρες διευκολύνουν την ακριβή χωροχρονική ρύθµιση και συνένωση των πολλαπλών σηµατοδοτικών οδών, για την σύνθεση της βέλτιστης κυτταρικής απόκρισης στις αλλαγές του άµεσου εξωκυτταρικού περιβάλλοντος. Η παξιλίνη είναι µια τέτοια πρωτεΐνη συνδετήρας που αποτελείται από πολλές περιοχές και η οποία στρατολογεί πολλές δοµικές και σηµατοδοτικές πρωτεΐνες στις εστίες προσκόλλησης όπου και εντοπίζεται υπό φυσιολογικές συνθήκες. Η παξιλίνη αρχικά χαρακτηρίστηκε ως µια πρωτεΐνη των εστιών προσκόλλησης µε µοριακό βάρος περίπου 68 kda, η οποία επιδεικνύει σηµαντική αύξηση στην φωσφορυλίωση των τυροσινών της µετά από έκφραση του v-src (Glenney et al., 1989). Το όνοµα της προέρχεται από το λατινικό paxillus που σηµαίνει καρφώνω, κρατώ σε προκαθορισµένο σηµείο. Η ονοµασία που της δόθηκε συµφωνεί µε την λειτουργία της, αφού η παξιλίνη είναι γνωστό ότι συνδέει τα ινίδια της ακτίνης στις ιντεγκρινικές εστίες προσκόλλησης συµβάλλοντας στην σταθεροποίηση των πολυπρωτεϊνικών συµπλόκων που τις σχηµατίζουν. Ο αριθµός των αµινοξέων που συνιστούν την παξιλίνη είναι 559, τα οποία οργανώνονται σε περιοχές πρόσδεσης πρωτεϊνών. Συγκεκριµένα, το αµινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης περιλαµβάνει πέντε LD και αρκετά SH2 µοτίβα, ενώ στο καρβοξυτελικό άκρο του µορίου εντοπίζονται 4 LIM περιοχές (Khurana et al., 2002, Tumbarello et al., 2002) (Εικόνα 44). Επίσης, πρέπει να σηµειωθεί ότι η παξιλίνη αποτελεί µια εξαιρετικά συντηρηµένη πρωτεΐνη στους οργανισµούς, γεγονός που επιβεβαιώνει τη σηµαντικότητα του µορίου. Εικόνα 44. Η υπεροικογένεια της παξιλίνης περιλαµβάνει τα µέλη: παξιλίνη, Hic-5a και Leupaxin. Στην εικόνα φαίνονται τα δοµικά χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών (LD µοτίβα και LIM περιοχές), ο αριθµός των αµινοξέων που τις συνθέτουν, τα εναλλακτικά σηµεία εκκίνησης της µετάφρασης και οι διαφορές µεταξύ των παρατηρούµενων ισοµορφών. 55

62 Paxillin Για την παξιλίνη έχουν διαπιστωθεί τρεις ισοµορφές που προέρχονται από εναλλακτικό µάτισµα (α, β, γ) από τις οποίες η α είναι η κύρια ισοµορφή µε ευρεία διάδοση (Mazaki et al., 1997). Επίσης, έχει βρεθεί και µια τέταρτη ισοµορφή η οποία προέρχεται από εναλλακτική έναρξη της µετάφρασης (αρχίζει από το αµινοξύ 132). Προϊόντα εναλλακτικού µατίσµατος έχουν βρεθεί και σε έντοµα (Drosophila) (Wheeler et al., 2001). Η παξιλίνη ανήκει στην υπεροικογένεια της παξιλίνης η οποία περιλαµβάνει και δυο ακόµα µέλη τις Hic-5a και Leupaxin (Εικόνα 44). Η δοµή της παξιλίνης είναι υπεύθυνη για τις αλληλεπιδράσεις µε άλλες πρωτεΐνες. Η δοµή της παξιλίνης µε τις πολλές περιοχές αλληλεπίδρασης µε άλλες πρωτεΐνες αλλά και η έλλειψη αναγνωρισµένου προτύπου ενζυµατικής περιοχής, αποτέλεσε την πρώτη ένδειξη ότι πρόκειται για µια πρωτεΐνη συνδετήρα (Turner et al., 1994). Μέσα στην αµινοτελική περιοχή της πρωτεΐνης υπάρχουν πέντε περιοχές πλούσιες σε λευκίνη, οι οποίες ονοµάζονται LD µοτίβα (Brown et al., 1998). Στην αντίθετη πλευρά του µορίου, δηλαδή την καρβοξυτελική, εντοπίζονται 4 LIM περιοχές (Lin-11, Isl-1, Mec-3). Οι LD και LIM περιοχές αποτελούν θέσεις µε τις οποίες αναγνωρίζονται άλλες πρωτεΐνες και δεσµεύονται από την παξιλίνη. Επίσης, διασκορπισµένες κατά µήκος του µορίου υπάρχουν θέσεις φωσφο- Εικόνα 45. Πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν µε την παξιλίνη. Στο σχήµα φαίνονται οι πρωτεΐνες που έχουν συσχετιστεί µε κάποιο από τα δοµικά χαρακτηριστικά της παξιλίνης ενώ στον πίνακα 1 καταγράφονται πρωτεΐνες µε τις οποίες αλληλεπιδρά η παξιλίνη αλλά δεν έχουν ολοκληρωθεί ακόµα όλα τα στοιχεία της µελέτης. Πίνακας 1. 56

63 Paxillin ρυλίωσης σε σερίνες, θρεονίνες και τυροσίνες. Οι LD περιοχές είναι οι περισσότερο µελετηµένες και χαρακτηρισµένες περιοχές της παξιλίνης. Είναι περιοχές πλούσιες σε λευκίνη και έχει βρεθεί ότι αποτελούν εξελικτικά συντηρηµένα πεπτίδια (LDXLLXXL) που χρησιµοποιούνται ως θέσεις δέσµευσης της FAK και της βινκουλίνης (Tumbarello et al., 2002). Εκτός από τις FAK και βινκουλίνη, µε τα LD αλληλεπιδρούν πρωτεΐνες όπως οι ακτοπαξίνη, ILK, PYK2, κλαθρίνη, ArfGAPs κ.α.. Επιπλέον έχει βρεθεί ότι γύρω από τα LD υπάρχουν τµήµατα πλούσια σε προλίνες και γλυκίνες που συνεισφέρουν στην τελική διαµόρφωση, παρουσίαση, ρύθµιση και λειτουργία κάθε µιας ξεχωριστά από τις περιοχές δέσµευσης της παξιλίνης. Οι LIM περιοχές είναι διπλοί δάκτυλοι ψευδαργύρου (zinc finger) που βρίσκονται διαδοχικά στο καρβοξυτελικό άκρο της παξιλίνης. Αποτελούν περιοχές πολύ συντηρηµένες εξελικτικά. Θεωρείται ότι συµµετέχουν στον εντοπισµό της παξιλίνης στις εστίες προσκόλλησης και στον κυτταροσκελετο της ακτίνης. Παρόµοιες περιοχές έχουν βρεθεί στην pinch και την ζυξίνη. Εκτός όµως από τον ρόλο τους στον υποκυτταρικό εντοπισµό της παξιλίνης, έχει υποστηριχτεί ότι αλληλεπιδρούν µε την τουµπουλίνη αλλά και µε φωσφατάσες όπως την PTP-PEST (Herreros et al., 2000, Cote et al., 1999). Επιπλέον, οι LIM εκτός από τις κυτταροπλασµατικές αλληλεπιδράσεις που πραγµατοποιούν, σχετίζονται και µε την δέσµευση του DNA και κατά συνέπεια µε την γονιδιακή έκφραση. Εκτός από τα παραπάνω για την παξιλίνη έχουν αναφερθεί αλληλεπιδράσεις µε τις ιντεγκρίνες (β1, α4, α9), την ταλίνη, την αντιαποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2, την ERK/MAPK και άλλες ακόµα που αναφέρονται στον πίνακα 1. Η παξιλίνη φωσφορυλιώνεται σε αµινοξέα τυροσίνης, σερίνης και θρεονίνης. Ο κλασικός τρόπος µε τον οποίο έχει συσχετιστεί η φωσφορυλίωση της παξιλίνης είναι η συνάθροιση των ιντεγκρινών κατά την κυτταρική προσκόλληση. Σε αυτή την περίπτωση επάγεται η φωσφορυλίωση της παξιλίνης (κυρίως στις τυροσίνες) από την ενεργοποίηση της FAK και της οικογένειας των Src κινασών (Bellis et al., 1995, Schaller et al., 1995). Είναι όµως ξεκάθαρο σήµερα, ότι πλήθος από άλλους παράγοντες που προκαλούν γένεση σηµάτων σε µια ποικιλία οικογενειών διαµεµβρανικών υποδοχέων, επάγουν την φωσφορυλίωση της παξιλίνης. Έτσι, µε τα σηµερινά δεδοµένα, η παξιλίνη θεωρείται ότι βρίσκεται στο σταυροδρόµι της 57

64 Paxillin µεταγωγής σηµάτων από την κυτταρική προσκόλληση και τους υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων (Rozengurt et al., 1995, Schaller 2001, Turner 2000) (Εικόνα 46). Η παξιλίνη, λοιπόν, έχει βρεθεί ότι φωσφορυλιώνεται σε πολλές τυροσίνες από τις οποίες οι κυριότερες θέσεις φωσφορυλίωσης είναι οι Y31 και Υ118 (Bellis et al., 1995, Schaller et al., 1995). Αποτέλεσµα της φωσφορυλίωσης των τυροσινών της παξιλίνης είναι η γένεση θέσεων πρόσδεσης πρωτεϊνών που διαθέτουν SH2 µοτίβα (π.χ. της Crk). Επίσης, η παξιλίνη φωσφορυλιώνεται σε αµινοξέα σερίνης-θρεονίνης. Σε αυτές τις φωσφορυλιώσεις εµπλέκονται κινάσες πρωτεϊνών όπως οι MAPK JNK (Huang et al., 2003), p38 (Huang et al., 2004), ERK1/2 (Ishibe et al., 2003) αλλά και η PKC. Τέλος, η παξιλίνη υπόκειται στην δράση πολλών φωσφατασών όπως οι: PTP- PEST, PP2A, PTP1D είτε ως άµεσο υπόστρωµα τους, είτε έµµεσα µέσω παθητικής µείωσης της φωσφορυλίωσης των αµινοξέων της (Cote et al., 1999). Εικόνα 46. Η φωσφορυλίωση της παξιλίνης σε τυροσίνες (PY), σερίνες (PS) και θρεονίνες (PT) και οι σχετιζόµενες µε αυτά λειτουργίες της πρωτεΐνης. Η παξιλίνη φωσφορυλιώνεται σε αυτά τα αµινοξέα σε απόκριση στην κυτταρική προσκόλληση και στην έκθεση σε πλήθος αυξητικών παραγόντων και κυτταροκινών. Η φωσφορυλίωση στις τυροσίνες δηµιουργεί θέσέις πρόσδεσης µε άλλες πρωτεΐνες (µέσω SH2 περιοχών) ενώ οι φωσφορυλιώσεις στις σερίνες και θρεονίνες συνεισφέρουν περισσότερο στην αλλαγή της διαµόρφωσης της παξιλίνης, επηρεάζοντας αλλοστερικά την ικανότητα του µορίου να αλληλεπιδρά µε συγκεκριµένες πρωτεΐνες. 58

65 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (Focal Adhesion Kinase) Γενικά Η Focal Adhesion Kinase ( ή FAK) ή κινάση της εστιακών προσκόλλησεων είναι µια πρωτεΐνη που διαδραµατίζει πρωταγωνιστικό ρόλο στη µεταγωγή µηνυµάτων µέσω της ενεργοποιησης των ιντεγκρινών (integrin signaling). Η FAK είναι µια κυτταροπλασµατική PTK (κινάση τυροσίνης) η οποία, όπως άλλωστε φανερώνει το όνοµα της, εντοπίζεται κατά κύριο λόγο στις εστίες προσκόλλησης των κυττάρων. Αποτελεί σηµαντικό στοιχείο των εξαρτώµενων από τις ιντεγκρίνες κυτταρικών µονοπατιών µεταγωγής σηµάτων µεταφέροντας µηνύµατα από την εξωκυτταρική ύλη στο κυτταρόπλασµα. Με δεδοµένο, λοιπόν, ότι µια σειρά σηµαντικών βιολογικών διαδικασιών, στις οποίες συµπεριλαµβάνονται η κυτταρική κινηση και επιβίωση, ελέγχονται από σήµατα που διέρχονται από τις ιντεγκρίνες, γίνεται εύκολα κατανοητός ο νευραλγικός ρόλος του µορίου της FAK ως ρυθµιστή αυτών των διαδικασιών. Επιπλέον, η παρουσία του πρωτεϊνικού προϊόντος του γονίδιου της FAK κρίνεται απαραίτητη, κυρίως στα πρώτα αναπτυξιακά στάδια των οργανισµών, αφού δεδοµένα από ποντίκια µε γονότυπο fak -/- εµφανίζουν εµβρυϊκή θνησιµότητα. Ο βιολογικός ρόλος της FAK Περισσότερα από δέκα χρόνια έχουν περάσει από την αρχική αναγνώριση του µορίου της FAK (Hanks et. al. 1992, Schaller et al. 1992) και την δηµοσίευση των πρώτων δεδοµένων που τη συσχετίζουν µε τη µεταγωγή σηµάτων µέσω των ιντεγκρινών (Guan et al. 1991, Kornberg et al. 1992). Από τότε µέχρι σήµερα έχει σηµειωθεί σηµαντική πρόοδος στο πεδίο της µεταγωγής µηνυµάτων διαµέσου των ιντεγκρινών και του ρόλου των κινασών τυροσίνης, και ιδιαιτέρως της FAK, σε αυτά τα µονοπάτια (Miranti and Brugge 2002, Schawartz and Ginsberg 2002). Παρόλα αυτά, ακόµα δεν έχει διευκρινιστεί πως τα σήµατα από τις ιντεγκρίνες συνεισφέρουν στη δυναµική ρύθµιση των κυτταρικών διεργασιών, και κατά συνέπεια ποιος ακριβώς είναι ο ρόλος της FAK σε αυτό το πλαίσιο. Η FAK αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά στα 1992 ως µια πρωτεΐνη ισχυρά φωσφορυλιωµένη σε αµινοξέα τυροσίνης, σχετιζόµενη µε το ογκογονίδιο v-src 59

66 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) (Schaller et al. 1992). Ανήκει στην οικογένεια των κινασών τυροσίνης που παρουσιάζουν κυτταροπλασµατική κατανοµή και είναι εντοπισµένη στις εστίες προσκόλλησης (focal contacts, focal adhesions), που είναι εµπλουτισµένες σε ιντεγκρινικούς υποδοχείς (Schlaepfer et al. 1999, Guan 1997, Schaller 1996, Parsons et al. 2000, Parsons 2003). Η ενεργότητα της FAK ρυθµίζεται από την διαµεσολαβούµενη από τις ιντεγκρίνες προσκόλληση αλλά και από υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων και υποδοχείς που συνδέονται µε τις G-πρωτεΐνες (Schlaepfer et al. 1999, Schaller et al. 2001). Η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης έχει ως άµεσο αποτέλεσµα την πρόσδεση της µε πρωτεΐνες της οικογένειας των Src PTKs (protein tyrosine kinases) που φέρουν SH2 περιοχές. Η αλληλεπίδραση της FAK µε αυτές τις πρωτεΐνες γίνεται κυρίως µε την περιοχή που περιβάλλει τη φωσφορυλιωµένη τυροσίνη στη θέση 397 του µορίου της. Η συγκρότηση του συµπλόκου FAK-Src επάγει την φωσφορυλίωση αµινοξέων τυροσίνης σε πολλαπλά υποστρώµατα όπως τις παξιλίνη, p130cas και άλλες πρωτεΐνες που µε την σειρά τους διεγείρουν την ενεργοποίηση πολλαπλών µονοπατιών µεταγωγής σηµάτων στα οποία πρωτεύοντα Εικόνα 47. Η κινάση των εστιακών προσκολλήσεων λειτουργεί ενοποιώντας µηνύµατα. Η FAK συγκεντρώνει σήµατα από εξωκυτταρικά στοιχεία όπως είναι οι υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων και οι ιντεγκρίνες αλλά και από πρωτεΐνες της οικογένειας των Src κινασών µε αποτέλεσµα τον αποτελεσµατικό έλεγχο και συντονισµό της δυναµικής της κυτταρικής προσκόλλησης και της µεταγωγής µηνυµάτων επιβίωσης. ρόλο κατέχουν κινάσες, φωσφατάσες και πρωτεάσες (Schlaepfer et al. 1999, Schaller 2001, Abbi et al. 2002). Η κινάση εστιακής προσκόλλησης συνεισφέρει στην ολοκλήρωση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, (λειτουργώντας ως πρωτεΐνη συνδέτης) στις θέσεις κυτταρικής προσκόλλησης στην εξωκυτταρική ύλη. Συνεπώς, εκπληρώνει την λειτουργία της ως πρωτεΐνη µε το να µετέχει στην «συµπλοκοποίηση» των πρωτεϊνών που εντοπίζονται στις εστίες προσκόλλησης. Ακόµα µεταδίδει µηνύµατα, προς το εσωτερικό του κυττάρου, εξαρτώµενα από την προσκόλληση και τους αυξητικούς παράγοντες (Εικόνα 47). Προκειµένου να ανιχνευθεί ο βιολογικός ρόλος της FAK διεξάγονται πειράµατα στα οποία διαταράσσεται η φυσιολογική µεταγωγή µηνυµάτων διαµέσου 60

67 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) της FAK και πειράµατα στα οποία επάγεται υπέρ-έκφραση της. Η αναστολή της µεταγωγής µηνυµάτων µέσω της FAK έχει ως αποτέλεσµα µειωµένη κινητικότητα και σε ορισµένες περιπτώσεις συνεπάγεται κυτταρικό θάνατο (Ilic et al. 1995, Hunderford et al. 1996). Ακόµα, knock out µελέτες έδειξαν ότι οι FAK-null ινοβλάστες παρουσιάζουν, απρόσµενα, αυξηµένο αριθµό εστιών προσκόλλησης και ελαττώµατα όσον αφορά την κινητικότητα τους (Hanks et al. 2003). Αντιθέτως, ενισχύοντας την δράση της FAK, δηλαδή υπέρ-εκφράζοντας µε εξωτερική παρέµβαση το µόριο, παρατηρείται αυξηµένη κυτταρική κινητικότητα και προάγεται η κυτταρική επιβίωση απουσία σηµάτων από την εξωκυτταρική ύλη, σε κατάσταση, δηλαδή, που οδηγεί σε απόπτωση υπό φυσιολογικές συνθήκες (Frisch et al. 1996, Cary et al. 1996). Συνοψίζοντας, λοιπόν, η FAK εµπλέκεται στον έλεγχο της κυτταρικής κίνησης και στη µεταγωγή µηνυµάτων επιβίωσης από το εξωκυτταρικό περιβάλλον. Επιπλέον, θα πρέπει να σηµειωθεί ότι σε µετασχηµατισµένα κύτταρα και κλινικές αναλύσεις όγκων από ανθρώπινους ιστούς, η αυξηµένη έκφραση της FAK σε συνδυασµό µε ενισχυµένη ενεργοποίηση του µορίου έχουν συσχετιστεί µε κακοήθεις και µεταστατικούς καρκινικούς φαινοτύπους (Gabarra-Niecko et al. 2003, Hecker et al. 2003, McLean et al. 2003). εδοµένου του σηµαντικού ρόλου του µορίου στον έλεγχο αυτών των βασικών βιολογικών ιδιοτήτων αιτιολογείται το αξιοσηµείωτο ενδιαφέρον των ερευνητών για την αποσαφήνιση των µηχανισµών ενεργοποιησης της FAK. οµικά χαρακτηριστικά της πρωτεΐνης FAK Η FAK αποτελεί µέλος µιας οικογένειας κινασών τυροσίνης, που δεν είναι υποδοχείς (NRTKs, Non Receptor Tyrosine Kinases). Στην ίδια οικογένεια ανήκει και η PYK2 (ή αλλιώς CAK-β: cell adhesion kinase β, RAFTK: related adhesion focal tyrosine kinase, CADTK: calcium-dependent protein tyrosine kinase). Η σηµαντικότητα του µορίου διαφαίνεται από το γεγονός ότι η FAK εκφράζεται στους περισσότερους ιστούς και κυτταρικούς τύπους, όπως επίσης από το γεγονός ότι είναι ένα εξελικτικά συντηρηµένο µόριο, τόσο στα διάφορα είδη των θηλαστικών όσο και στους κατώτερους ευκαρυωτικούς οργανισµούς στους οποίους συµπεριλαµβάνονται τα έντοµα (όπως π.χ. οι µύγες Drosophila και Ceratitis) και το ψάρι zebrafish (Fox et al. 1999, Hanks et al. 1992, Henry et al. 2001, Palmer et al. 1999, Schaller et al. 1992, Metheniti et al., 2001). Όσον αφορά την PYK2, η οποία παρότι παρουσιάζει 61

68 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) σηµαντική δοµική οµοιότητα µε την FAK η έκφραση της είναι περιορισµένη. Ειδικότερα, η έκφραση της PYK2 είναι υψηλή στον εγκέφαλο και σε µικρότερο βαθµό στα ήπαρ, νεφρά, σπλήνα, πνευµόνες και σε κύτταρα αιµοποιητικής προέλευσης (Avraham et al., 1995, Lev et al., 1995, Sasaki et al., 1995, Yu et al., 1996). Ωστόσο, αν και η κατανοµή της ποικίλλει, γενικά περιγράφεται ως διαχεόµενη κυτταροπλασµατική πρωτεΐνη. Επιπλέον θα πρέπει να σηµειωθεί ότι στα έντοµα δεν έχει ανιχνευθεί µέχρι σήµερα η PYK2 ως ξεχωριστό µόριο. Η PYK2 ή FAK2 αλληλεπιδρά µε αρκετές πρωτεΐνες για τις οποίες έχει ήδη αναφερθεί αλληλεπίδραση µε την FAK, σε αυτές περιλαµβάνονται οι κινάσες της οικογένειας Src καθώς και η παξιλίνη. Η CAKβ ρυθµίζεται από ερεθίσµατα τα οποία αυξάνουν το κυτταροπλασµατικό επίπεδο των Ca ++. Συνεπώς, οι FAK και PYK2 αντιδρούν σε διαφορετικά ερεθίσµατα, αλλά µπορεί να χρησιµοποιούν τα ίδια κυτταρικά στοιχεία για να µεταβιβάσουν τα µηνύµατα προς τις επόµενες πρωτεΐνες που συµµετέχουν στο εκάστοτε κυτταρικό µονοπάτι (Schlaepfer et al. 1999, Avraham et al. 2000). Η δοµή της FAK µπορεί να διακριθεί σε τρία τµήµατα: ένα κεντρικό τµήµα που περιλαµβάνει την καταλυτική περιοχή του µορίου και δυο µη καταλυτικές περιοχές, την άµινο(ν)-τελική και την κάρβοξυ(-cooh)-τελική περιοχή (Εικόνα 48). Εκτός από τις παραπάνω χαρακτηριστικές περιοχές, η πρωτεΐνη φέρει έξι, τουλάχιστον, Εικόνα 48. Οργάνωση των περιοχών της κινάσης των εστιακών προσκολλήσεων. Η άµινοτελική περιοχή εµφανίζει οµοιότητα µε την οικογένεια πρωτεϊνών που φέρουν οµολογία FERM περιοχής. Αυτή η περιοχή θεωρείται υπεύθυνη για άµεση αλληλεπίδραση µε τις ιντεγκρίνες και τους υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων. Η κεντρική περιοχή είναι η καταλυτική περιοχή της κινάσης. Τέλος, η καρβοξύ-τελική περιοχή περιέχει θέσεις για πολλαπλές αλληλεπιδράσεις µεταξύ πρωτεϊνών. Στο σχήµα εµφανίζονται πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν µε την FAK, καθώς και η FAT περιοχή που είναι υπεύθυνη για την µεταφορά του µορίου στις εστίες προσκόλλησης. Η πρωτεΐνη παξιλίνη αλληλεπιδρά µε την FAT περιοχή. 62

69 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) τυροσίνες που είναι θέσεις φωσφορυλίωσης από άλλες κινάσες αλλά και από αυτοφωσφορυλίωση του µορίου. Την κύρια θέση αυτοφωσφορυλίωσης της FAK αποτελεί η θέση τυροσίνη 397 (Y397), η οποία χαρτογραφείται αµέσως πριν από καταλυτική περιοχή του µορίου. Η θέση αυτή, όταν φωσφορυλιωθεί, αποτελεί στόχο πρόσδεσης για πρωτεΐνες που φέρουν SH2 περιοχές, στις οποίες περιλαµβάνονται και οι κινάσες τυροσίνης της οικογένείας Src (Schaller et al. 1994). Με τη δέσµευση της Src στην Y397 θέση γίνεται δυνατή η φωσφορυλίωση των υπόλοιπων θέσεων φωσφορυλίωσης (Calalb et al. 1995). υο από αυτές τις θέσεις φωσφορυλίωσης, Υ576 και Υ577, εντοπίζονται µέσα στο βρόγχο ενεργοποίησης (activation loop) της καταλυτικής περιοχής της FAK και αποτελούν ρυθµιστικές θέσεις φωσφορυλίωσης που ενισχύουν την καταλυτική ενεργότητα του µορίου. Η φωσφορυλίωση στην τυροσίνη Y925, η οποία βρίσκεται στην καρβόξυ-τελική περιοχή της FAK, συνεπάγεται την γένεση µιας θέσης πρόσδεσης για την SH2 περιοχή της πρωτεΐνης Grb2 και εικάζεται ότι µε αυτό τον τρόπο µπορεί να ενεργοποιείται το µονοπάτι Ras/MAPK από την FAK (Schlaepfer et al. 1994). Η κεντρική περιοχή είναι το καταλυτικό κέντρο του ενζύµου (κινάση). Η κεντρική περιοχή της FAK αποτελεί την καταλυτική περιοχή της κινάσης. Η περιοχή αυτή παρουσιάζει υψηλή συντηρητικότητα και φέρει µεγάλη οµολογία από τον άνθρωπο µέχρι την Drosophila και τον C. elegans (Schaller et al. 2001). Η αλληλουχία της καταλυτικής περιοχής της FAK εµφανίζει σηµαντική οµοιότητα µε τις οµόλογες περιοχές άλλων κινασών τυροσίνης είτε αυτές είναι υποδοχείς είτε κυτταροπλασµατικά µόρια. Όµως ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η κρυσταλλογραφία της περιοχής αποκάλυψε την παρουσία ενός δισουλφιδικού δεσµού στην αµινοτελική περιοχή της κινάσης. Ο δεσµός αυτός είναι ένα ασυνήθιστο χαρακτηριστικό για κινάσες και θα πρέπει να συµβάλλει στην λειτουργία της κινάσης (Nowakowski et al., 2002). Σε εγκεφαλικό ιστό και νευρικά κύτταρα έχουν διαπιστωθεί ισοµορφές του µορίου, από εναλλακτικό µάτισµα, µε ενθέσεις 6-28 αµινοξέων στην περιοχή γύρω από την τυροσίνη Υ397 (NCBI, Build 32). Οι ενθέσεις αυτές καλούνται FAK box 6, box 7 και box 28 και έχουν αναγνωρισθεί ως τα exons 15, 17 και 14 αντίστοιχα. Αυτό που πρέπει να σηµειωθεί είναι το ότι τα πρωτεϊνικά µόρια που προκύπτουν από το εναλλακτικό µάτισµα παρουσιάζουν υψηλότερα 63

70 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) επίπεδα φωσφορυλίωσης στις τυροσίνες στα κύτταρα, όπως και ότι η ενεργότητα της κινάσης είναι αυξηµένη in vitro, συγκρινόµενα µε την αγρίου τύπου (φυσιολογική) FAK (Messina et al. 2003) (Εικόνα 49). Η FAK αυτοφωσφορυλιώνεται στη θέση Υ397 από διάφορες αιτίες όπως όταν ενεργοποιηθεί η καταλυτική περιοχή της FAK ή µε την συνάθροιση των ιντεγκρινών που έχει ως αποτέλεσµα την ταχύτατη φωσφορυλίωση της FAK στη θέση Tyr397 (και σε άλλες θέσεις στην καταλυτική περιοχή και στην C-τελική περιοχή) (Calalb et Εικόνα 49. Τα δοµικά χαρακτηριστικά της FAK και οι ισοµορφές της λόγω εναλλακτικού µατίσµατος. Η FAK αποτελείται από µια αµινοτελική περιοχή µε οµολογία FERM, µια κεντρική περιοχή κινάσης και την FAT περιοχή, µε µέγεθος περίπου 150 αµινοξέων, που εντοπίζεται µέσα στην καρβόξυ-τελική περιοχή. Η FAK επίσης περιέχει τρεις πλούσιες σε προλίνες περιοχές που αποτελούν θέσεις δέσµευσης πρωτεϊνών που φέρουν SH3 περιοχές. Η κύρια θέση φωσφορυλιωσης του µορίου είναι η τυροσίνη 397. Οι ισοµορφές της FAK (Box 6,7,28) φέρουν ενθέσεις αµινοξέων στην περιοχή κοντά στην Υ397. Η C-τελική περιοχή που ονοµάζεται FRNK εκφράζεται επίσης ως ξεχωριστό mrna µετάγραφο, το ποιο είναι ταυτόσηµο µε τα αµινοξέα της FAK. Η FRNK λειτουργεί ως ανταγωνιστικός αναστολέας στην µεταγωγή µηνυµάτων µέσω της FAK. al. 1995). Επίσης, πρόσφατες µελέτες δείχνουν πως ο παροδικός διµερισµός µορίων της FAK οδηγεί σε ενδοµοριακή φωσφορυλίωση στην θέση Tyr397 (Toutant et al. 2002). Η φωσφορυλίωση σε αυτή τη θέση συνάδει µε αυξηµένη καταλυτική ενεργότητα της FAK (Calalb et al. 1995, Lipfert et al. 1992) και φαίνεται πως είναι σηµαντική για την φωσφορυλίωση άλλων πρωτεϊνών που σχετίζονται µε τις εστίες προσκόλλησης (Cobb et al. 1994, Schaller et al. 1999, Schaller et al. 1994). Ακόµα φωσφορυλίωση στην Tyr397 συνεπάγεται φωσφορυλιώσεις στις θέσεις Tyr576 και Tyr577, που αποτελούν δυο έντονα συντηρηµένες θέσεις που εντοπίζονται µέσα στην καταλυτική περιοχή της κινάσης (Owen et al. 1999). Οι φωσφορυλιώσεις αυτές είναι σηµαντικές για την µέγιστη, επαγόµενη από προσκόλληση, ενεργοποίηση της FAK 64

71 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) και κατ επέκταση την µεταγωγή των µηνυµάτων στους παρακάτω τελεστές (Calalb et al. 1995, Owen et al. 1999). Η FAK έχει βρεθεί πως συµµετέχει στην φωσφορυλίωση αµινοξέων τυροσίνης σε ποικίλα υποστρώµατα, συµπεριλαµβανοµένων των p130cas και παξιλίνης (Frisch et al. 1996, Vuori et al. 1996, Schaller et al. 1995). Τα υποστρώµατα αυτά µπορεί να φωσφορυλιώνονται απευθείας από την FAK ή έµµεσα από την Src, η οποία έχει στρατολογηθεί στο σύµπλοκο από την FAK. Τα φωσφορυλιωµένα πρωτεϊνικά µόρια, παξιλίνη και p130cas «προσελκύουν» στο σύµπλοκο πρωτεΐνες συνδετήρες (adaptors) όπως η Crk και Nck. Οι τελευταίες µε την σειρά τους δεσµεύουν και συγκρατούν στο σύµπλοκο τις εκάστοτε πρωτεΐνες στόχους τους (π.χ. C3G) µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία συµπλόκων µεταγωγής σηµάτων τα οποία διευκολύνουν, ενισχύουν και κατευθύνουν προς τα έσω µηνύµατα από το εξωκυτταρικό περιβάλλον. Εκτός όµως από τις φωσφορυλιώσεις τυροσίνης που επάγονται από την FAK σε διάφορα υποστρώµατα, η στρατολόγηση των πρωτεϊνών-συνδετήρων αλλά και άλλων σηµατοδοτικών µορίων (π.χ. Grb2 και PI3K) είναι ένας εξίσου σηµαντικός µηχανισµός για την επακόλουθη µεταγωγή σηµάτων (Schlaepfer et al. 1994, Chen et al. 1994). Η αµινοτελική περιοχή της FAK χαρακτηρίζεται από µια FERM περιοχή. Έχει βρεθεί ότι η αλληλουχία των αµινοξέων της άµινο(ν)-τελικής περιοχής παρουσιάζει οµολογία µε µια οικογένεια πρωτεϊνών που περιέχουν τις λεγόµενες FERM (erythrocyte band four.1 ezrin radixin moesin) περιοχές (Girault et al. 1999, Sun et al. 2002). Η οµολογία αυτή είναι πιθανό να είναι σηµαντική για την λειτουργία της πρωτεΐνης αφού είναι σε σηµαντικό βαθµό συντηρηµένη στους οργανισµούς. Στην Drosophila, η αµινοτελική περιοχή της DFak56 παρουσιάζει 32% οµοιότητα µε την FAK του ανθρώπου, όµως σε ότι αφορά τις FERM περιοχές η αναλογία φτάνει το 49% (Εικόνα 50). Σε γενικές γραµµές, τα µέλη αυτής της οικογένειας (FERΜ) και η ταλίνη συνδέουν διαµεµβρανικές γλυκόπρωτεΐνες µε τον κυτταροσκελετό της ακτίνης (Critchley et al. 2000, Tsukita et al. 1999, Mangeat et al. 1999, Bretscher et al. 1999). Βεβαίως, όσον αφορά την FERM περιοχή της FAK δεν έχει αποσαφηνιστεί, µέχρι σήµερα, ο ακριβής ρόλος της. Τα αρχικά πειραµατικά δεδοµένα, in vitro, υποδεικνύουν πως η άµινο(ν)-τελική περιοχή του µορίου προσδένεται σε αλληλουχίες της κυτταροπλασµατικής περιοχής των υποµονάδων των 65

72 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) β-ιντεγκρινών (Schaller et al. 1995). Σε αυτά τα πειράµατα η FAK, µέσω της FERM, µπορούσε να συγκροτεί σύµπλοκα µε πεπτίδια τα οποία µιµούνταν τις κυτταροπλασµατικές περιοχές των β υποµονάδων των ιντεγκρινών in vitro. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η FAK κατακρηµνίζεται µαζί µε την β1 υποµονάδα των ιντεγκρινών (Chen et al. 2000, Danker et al. 1998). Τα δεδοµένα αυτά, όµως, δεν έχουν επιβεβαιώσει άµεση αλληλεπίδραση ανάµεσα στην FERM και τις ιντεγκρίνες in vivo. Αντιθέτως, επικρατεί η άποψη ότι η FERM περιοχή µιας άλλης πρωτεΐνης του «συµπλόκου προσκόλλησης», δηλαδή της ταλίνης προσδένεται στην ουρά των β3 ιντεγκρινών και µε αυτό τον τρόπο ρυθµίζεται η ενεργοποίηση των ιντεγκρινών (Calderwood et al. 1999). Έτσι, σε αντίθεση µε µελέτες που υποστήριζαν την ιδέα της άµεσης σύνδεσης της FAK µε τις ιντεγκρίνες (Parsons 2003, Schaller 2001), φαίνεται πως ισχύει η έµµεση πρόσδεση της COOH-τελικής περιοχής της FAK (FAT) µε τις ιντεγκρίνες µέσω αλληλεπιδράσεων µε άλλες πρωτεΐνες. Μάλιστα δοµικές αναλύσεις και συγκρίσεις αλληλουχιών έχουν δείξει ότι η FERM περιοχή περιλαµβάνει τρεις προεξοχές που φέρουν πολλαπλά σηµεία για πρόσδεση άλλων πρωτεϊνών αλλά και λιπιδίων (Sun et al. 2002). Επιπλέον, νέες αποδείξεις στηρίζουν τον ρόλο της FERM περιοχής ως ρυθµιστή της καταλυτικής ενεργότητας αλλά και του υποκυτταρικού εντοπισµού του µορίου (Dunty and Schaller 2002, Stewart et al. 2002). Εννοείται, δηλαδή, ότι η άµινο(ν)-τελική FERM περιοχή µπορεί να κατευθύνει την FAK σε θέσεις όπου υπάρχει συνάθροιση (clustering) των ιντεγκρινών ή υποδοχέων αυξητικών παραγόντων. Επίσης, θεωρείται ότι µέσω της άµινο(ν)-τελικής περιοχής το µόριο µπορεί να αλληλεπιδρά µε άλλες πρωτεΐνες, πιθανά υποστρώµατα της FAK, µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση πρωτεϊνών στόχων. Για παράδειγµα η πρωτεΐνη ezrin προσδένεται στην FERM περιοχή της FAK µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση της FAK δίχως ερέθισµα µέσω των ιντεγκρινών (Poullet et al. 2001). Ακόµα, υπάρχουν αναφορές για την µεσολάβηση της FERM περιοχής στην σύνδεση του µορίου της FAK µε ενεργοποιηµένη µορφή υποδοχέα αυξητικών παραγόντων (EGFR ή PDGFR), αν και δεν έχει αποσαφηνιστεί αν οι αλληλεπιδράσεις είναι άµεσες (Sieg et al. 2000). Έτσι έχει προταθεί από πολλές µελέτες ότι η FAK λειτουργεί downstream των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων, αφού έχει βρεθεί πως η φωσφορυλίωση των αµινοξέων τυροσίνης της FAK επάγεται µετά από επώαση των κυττάρων µε αυξητικούς παράγοντες. Η αλληλεπίδραση της FAK µε τους υποδοχείς των αυξητικών παραγοντων και η φωσφορυλίωση του µορίου στην θέση Υ397 είναι 66

73 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) σηµαντικά γεγόνοτα για την επαγόµενη από τους αυξητικούς παράγοντες κυτταρική κινητικότητα (Sieg et al. 2000). Η ιδιότητα της FERM να συνδέεται µε άλλες πρωτεΐνες, ενδεχοµένως, οφείλεται σε µια πλούσια σε προλίνες περιοχή που έπεται της FERM και η οποία έχει αναγνωρισθεί ως θέση πρόσδεσης πρωτεϊνών µε SH3 περιοχές, ιδιαίτερα για µέλη της οικογένειας Src PTKs. Επίσης, η FAK εµπλέκεται στην ενεργοποίηση κινασών τυροσίνης από πρωτεΐνες της εξωκυτταρικής ύλης, για παράδειγµα η Etk της οικογένειας κινασών Btk αλληλεπιδρά, µε την PH περιοχή της µε την FERM της FAK µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση του µορίου (Chen et al. 1994, Chen et al. 2001). Tέλος, η FAK κατακρηµνίζεται µε πολλούς από τους υποδοχείς µε ενεργότητα κινάσης τυροσίνης στους οποίους συµπεριλαµβάνονται οι ErbB2, ErbB3, ο υποδοχέας του IGF1 και ο Eph2A (Vartanian et al. 2000, Ignatoski et al. 2000, Manes et al. 1999, Miao et al. 2000). Βεβαίως σε όλες τις παραπάνω περιπτώσεις θα πρέπει να διευκρινιστεί αν η αλληλεπίδραση είναι άµεση ή έµµεση και ποιός ακριβώς είναι ο ρόλος της FERM περιοχής σε όλες αυτές τις αλληλεπιδράσεις. Η καρβόξυ-τελική περιοχή της FAK είναι υπεύθυνη για τις περισσότερες από τις αλληλεπιδράσεις του µορίου µε άλλες πρωτεΐνες. Η καρβόξυ-τελική περιοχή της FAK αποτελεί το τµήµα της πρωτεΐνης που είναι υπεύθυνο για τις περισσότερες αλληλεπιδράσεις µε άλλες πρωτεΐνες διότι φέρει πολλαπλά σηµεία-θέσεις µε τα οποία µπορούν να προσδεθούν οι πρωτεΐνες υποστρώµατα στην FAK. Σε αυτήν την περιοχή εντοπίζονται αρκετές πλούσιες σε προλίνη αλληλουχίες οι οποίες εξυπηρετούν ως θέσεις πρόσδεσης πρωτεϊνών που φέρουν SH3 περιοχές και οι οποίες διαµεσολαβούν για την πρόσδεση πρωτεϊνών όπως η p130cas και η Graf (Hildebrand et al. 1996, Polte et al. 1995). Ένα κοµµάτι της COOH-τελικής περιοχής (περί τα 100 αµινοξέα) έχει χαρακτηριστεί ως FAT περιοχή (Focal Adhesion Targeting), η οποία όπως υποδηλώνει το όνοµα της είναι υπεύθυνη για την κατεύθυνση της FAK στις περιοχές όπου συγκροτούνται νέα ή βρίσκονται προϋπάρχων σύµπλοκα προσκόλλησης (adhesion complexes) (Martin et al. 2002). Όπως παρατήρησε ο Hildebrand, το 1993, οι αλληλουχίες που εντοπίζονται σε αυτήν την περιοχή είναι απαραίτητες αλλά και επαρκείς για την στόχευση της FAK στα σύµπλοκα προσκόλλησης. Η ακεραιότητα 67

74 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) αυτής της περιοχής είναι ουσιαστικής σηµασίας για την µεταγωγή µηνυµάτων διαµέσου της FAK (Sieg et al. 1999, Thomas et al. 1999). Μελέτες κρυσταλλογραφίας και NMR αναλύσεις έχουν αποκαλύψει ότι τα δοµικά χαρακτηριστικά της FAT οµοιάζουν µε δοµές που υπάρχουν και σε άλλες πρωτεΐνες προσκόλλησης όπως η βινκουλίνη, Cas, a-κατενίνη (Arold et al. 2002, Hayashi et al. 2002, Liu G. et al. 2002). Ακόµα είναι γνωστό ότι η FAT περιοχή αποτελεί την θέση πρόσδεσης της παξιλίνης και της ταλίνης που αποτελούν πρωτεΐνες των εστιακών προσκολλήσεων (Chen et al. 1995, Hildebrand et al. 1995). Η αλληλεπίδραση µε την παξιλίνη απαιτεί συγκεκριµένη δοµική ακεραιότητα (δεµάτιο που περιλαµβάνει 4 έλικες που έχει ανιχνευθεί κρυσταλλογραφικά στην FAT) έτσι ώστε να δηµιουργηθούν οι υδρόφοβοι δεσµοί που συγκρατούν τα αλληλεπιδρώντα µόρια. Οι δεσµοί αυτοί φέρεται να προσδένουν δυο LD µοτίβα της παξιλίνης µε την εξετάζουσα περιοχή της FAK (Arold et al. 2002, Hayashi et al. 2002, Liu et al. 2002). Επειδή η παξιλίνη προσδένει απευθείας σε κυτταροπλασµατικές περιοχές των ιντεγκρινικών υποδοχέων (Liu et al. 1999, Schaller et al. 1995) ενδεχοµένως να λειτουργεί ως βοηθός αγκυροβόλησης για την FAK στα σύµπλοκα προσκόλλησης. Όµως θα πρέπει να τονιστεί ότι ο µηχανισµός στρατολόγησης της FAK στις δοµές προσκόλλησης είναι περισσότερο πολύπλοκος από µια µόνο πρόσδεση µε την παξιλίνη. Οι καρβόξυ-τελικές, µη καταλυτικές περιοχές της FAK και της PYK2 οι οποίες ονοµάζεται FRNK (FAKrelated-non-kinase) και PRNK (PYK2 related non-kinase) αντίστοιχα, εκφράζονται ανεξάρτητα σε ορισµένα κύτταρα και µπορεί να λειτουργούν ως αρνητικοί ρυθµιστές της ενζυµικής ενεργότητας (κινάσης) του µορίου (Schaller et al. 1993, Taylor et al. 2001, Xiong and Parsons 1997). Η έκφραση του FRNK είναι αυξηµένη στα λεία µυϊκά κύτταρα των αγγείων, και φαίνεται να αυξάνεται ακόµα περισσότερο ως αντίδραση σε τραυµατισµό των αγγείων (Taylor et al. 2001). Στα περισσότερα κύτταρα, εξαναγκαστική υπερέκφραση της FRNK αναστέλλει την κυτταρική έκταση (cell spreading), την κυτταρική µετανάστευση αλλά και την επαγόµενη από αυξητικούς παράγοντες µεταγωγή µηνυµάτων µέσω των MAPK (Taylor et al. 2001, Hauck et al. 2001, Richardson et al. 1997). 68

75 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) FAK: ένα εξελικτικά συντηρηµένο µόριο. Η σύγκριση µε την DFak56. Έχει αποδειχτεί ότι τόσο η αλληλουχία της πρωτεΐνης FAK όσο και οι λειτουργίες της είναι συντηρηµένες εξελικτικά. Η οµόλογη πρωτεΐνη της FAK στο έντοµο Drosophila που ονοµάζεται DFak56, αποµονώθηκε πρόσφατα και επιδεικνύει περίπου 33% αµινοξική οµοιότητα µε την FAK που απαντάται στον άνθρωπο (Fox et al. 1999, Palmer et al. 1999, Fujimoto et al. 1999). Η DFak56 παρουσιάζει την ίδια δοµική οργάνωση µε την FAK, έχοντας µια κεντρική καταλυτική περιοχή που οριοθετείται από τις αµινοτελική και την καρβόξυτελική -µη καταλυτικές- περιοχές Εικόνα 50. Η αµινοξική οµολογία ανάµεσα στις αλληλουχίες της DFak56 µε την ανθρώπινη FAK. Οι (Εικόνα 50). Όµως, η DFak56 µαύρες µπάρες υποδηλώνουν την FERM περιοχή ενώ περιέχει µια µεγάλη στο σχήµα φαίνονται η περιοχή της κινάσης, οι κυρίες θέσεις φωσφορυλίωσης, η FAT αλληλουχία και οι καρβοξυτελική περιοχή πέρα από περιοχές που είναι πλούσιες σε προλίνες. Οι αριθµοί αντιπροσωπεύουν την εκατοστιαία (%) οµοιότητα των την καρβοξυτελική FAT διαφορετικών περιοχών της FAK και της DFak56. Το 49% αποτελεί το ποσοστό της οµοιότητας των αλληλουχία της FAK. Η DFak56 αµινοξέων µεταξύ των FERM περιοχών των δυο πρωτεϊνών. εµφανίζει και τις ίδιες βιολογικές ιδιότητες µε την ανθρώπινη FAK δηλαδή υποκυτταρικό εντοπισµό στις εστίες προσκόλλησης και εξαρτώµενη από την προσκόλληση ρύθµιση της φωσφορυλίωσης τυροσινών (Fox et al. 1999, Palmer et al. 1999, Fujimoto et al. 1999). Η µεγαλύτερη οµοιότητα ανάµεσα στις περιοχές της DFak56 και FAK εµφανίζεται στην περιοχή της κινάσης τυροσίνης, η οποία είναι κατά 63% συντηρηµένη στα δυο αυτά διαφορετικά είδη. Επίσης, η ακολουθία της FAT είναι εξίσου πολύ συντηρηµένη, σε ποσοστό 47%, ενώ η αµινοτελική περιοχή και η περιοχή που βρίσκεται µετά την κινάση και πριν την FAT εµφανίζουν ποσοστό οµοιότητας µόνο κατά 32% και 31% αντίστοιχα, ανάµεσα στην µύγα και στον άνθρωπο. Χωρίς να προκαλεί έκπληξη, η θέση της κύριας αυτοφωσφορυλίωσης είναι συντηρηµένη στην DFak56, όπως και οι άλλες δυο τυροσίνες στην καταλυτική περιοχή. Αντίθετα, αν και υπάρχει µια τυροσίνη στην DFak56 που αντιστοιχεί σε 69

76 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) αυτήν της θέσης 925 της FAK, φαίνεται ότι αυτό το αµινοξύ δεν εξυπηρετεί ως θέση πρόσδεσης για την πρωτεΐνη Grb2 επειδή υπάρχουν σηµαντικές διαφορές στα γειτονικά αµινοξέα. Οµοίως, η πρώτη Ρ περιοχή (Ρ: πλούσιες σε προλίνες περιοχές) στην καρβοξυτελική περιοχή της FAK, η οποία χρησιµεύει ως θέση πρόσδεσης για την p130cas, είναι συντηρηµένη στην DFak56, κάτι που δεν ισχύει για την δεύτερη Ρ αλληλουχία στην καρβοξυτελική περιοχή, η οποία δεσµεύει την GRAF στην FAK. Τελικά, όµως, οι οµοιότητες και όχι οι διαφορές, έχουν πείσει τους ερευνητές να χρησιµοποιούν την DFak56, και κατ επέκταση την µύγα, ως εργαλείο (model system) για την ανίχνευση νέων γονιδίων και πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν µε την FAK ή συµµετέχουν στη µεταγωγή των σηµάτων διαµέσου ιντεγκρινών, όπου η FAK κατέχει εξέχοντα ρόλο. Η τυροσίνη 397 αποτελεί θέση αυτοφωσφορυλίωσης και θέση πρόσδεσης για πρωτεΐνες που φέρουν SH2 περιοχές. Η κύρια θέση αυτοφωσφορυλίωσης της FAK είναι η τυροσίνη 397, ένα αµινοξύ που βρίσκεται προς το αµινοτελικό άκρο αµέσως µετά τη καταλυτική περιοχή του µορίου. Αυτό το αµινοξύ αποτελεί ένα βασικότατο στοιχείο για την βιοχηµική και βιολογική λειτουργία της FAK. Αν και η Src ήταν η πρώτη πρωτεΐνη µε SH2 περιοχές που βρέθηκε να προσδένεται στην θέση αυτοφωσφορυλίωσης της FAK, προσφάτως έχουν Εικόνα 51. Πολλές σηµατοδοτικές πρωτεΐνες αναφερθεί και άλλες πρωτεΐνες που συµπεριφέρονται αναλόγως. Στην οµάδα των SH2 πρωτεϊνών αλληλεπιδρούν µε την τυροσίνη 397 της FAK. Τουλάχιστον τέσσερις διαφορετικές πρωτεΐνες προσδένονται στην φωσφορυλιωµένη Υ397 της FAK:PI3K, PLCγ, Src και Grb7. Οι Src και PI3K λειτουργούν ως ρυθµιστές της κυτταρικής κινητικότητας, όπως µπορεί να συµµετέχει και η Grb7. Ορισµένες από αυτές επίσης συµµετέχουν στην που αλληλεπιδρούν µε την Υ397 της FAK συµπεριλαµβάνονται η PI3 κινάση, η PLCγ και η Grb7 (Zhang et al. 1999, Reiske et al. µεταγωγή µηνυµάτων επιβίωσης από το εξωκυτταρικό περιβάλλον. 70

77 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) 1999, Han et al. 1999). Ακόµα έχει βρεθεί ότι η τυροσίνη 397 απαιτείται για την δέσµευση της Shc από την FAK αλλά η ακριβής θέση πρόσδεσης της SH2 περιοχής της Shc δεν έχει αποκαλυφθεί µέχρι τώρα (Schlaepfer et al. 1997). Υπάρχουν, δηλαδή, τέσσερα τουλάχιστον διακριτά σηµατοδοτικά µόρια τα οποία στρατολογούνται σε σύµπλοκα στην ίδια θέση πρόσδεσης πάνω στην FAK (Εικόνα 51). Επειδή, όµως, δεν είναι δυνατό περισσότερες από µια πρωτεΐνες (που φέρουν SH2 περιοχές) να προσδένονται ταυτόχρονα στην ίδια φωσφορυλιωµένη τυροσίνη πάνω στην FAK, είναι πιθανό η αυτοφωσφορυλίωση του µορίου να προωθεί την συγκρότηση περισσότερων του ενός ξεχωριστών συµπλοκών, µε βασική πρωτεΐνη την FAK. Κάθε ένα από τα διακριτά αυτά σύµπλοκα µπορεί στην συνέχεια να αναβαθµιστεί µε την προσθήκη κι άλλων πρωτεϊνών (π.χ. στις εστίες προσκόλλησης) έτσι ώστε να διευκολυνθεί ο συν-εντοπισµός ενός αριθµού διακριτών σηµατοδοτικών µορίων σε ορισµένη περιοχή του κυττάρου. Πιθανώς έτσι µπορεί να προωθηθεί µια συγκεκριµένη βιολογική απόκριση µέσω του κατάλληλου κυτταρικού µονοπατιού µεταγωγής σηµάτων ή µπορεί να συντονιστούν καλύτερα περισσότερα µονοπάτια. Εναλλακτικά, ο συνεντοπισµός των πρωτεϊνών που συγκροτούν αυτά τα σύµπλοκα µπορεί να συνεισφέρει σε συνεργασία µεταξύ των πρωτεϊνών αυτών, οι οποίες δεν θα µπορούσαν να βρεθούν σε γειτνίαση αν πρώτα δεν αλληλεπιδρούσαν µε την FAK. Για παράδειγµα, η στρατολόγηση των PI3K και PLCγ σε σύµπλοκα µε την FAK µπορεί να διευκολύνει την παραγωγή της PI(3,4,5)P 3 από την PI3 κινάση, η οποία στην συνέχεια εξυπηρετεί ως θέση πρόσδεσης για την PH περιοχή της PLCγ. Η καρβοξυτελική περιοχή της FAK είναι υπεύθυνη για την στόχευση της πρωτεΐνης στις εστίες προσκόλλησης µέσω της FAT υποπεριοχής. Ο σωστός υποκυτταρικός εντοπισµός της FAK είναι απαραίτητος για την λειτουργία του µορίου. Μεταλλάγµατα της FAK τα οποία στερούνται της δυνατότητας να µεταφερθούν στις εστίες προσκόλλησης δεν συνεισφέρουν στην κυτταρική απόκριση κατά την προσκόλληση (Shen et al. 1999, Cooley et al. 2000). Επιπλέον, αποµάκρυνση της ενδογενούς FAK από τις εστίες προσκόλλησης ύστερα από έκφραση της καρβοξυτελικής µη καταλυτικής- περιοχής του µορίου προκαλεί αναστολή της φωσφορυλίωσης των αµινοξέων τυροσίνης της FAK και κατά συνέπεια δρα αρνητικά στις βιολογικές λειτουργίες της πρωτεΐνης (Gilmore et al. 1996, 71

78 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) Renshaw et al. 1999, Ilic et al. 1998, Almeida et al. 2000). Συνεπώς, η σηµασία της δεδοµένης περιοχής για τη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης είναι αναµφισβήτητη, για αυτό το λόγο υπάρχει ανάλογο ερευνητικό ενδιαφέρον για την αποκάλυψη των µηχανισµών που διέπουν την στόχευση των εστιών προσκόλλησης από την FAK. Μέχρι σήµερα, έχουν προταθεί δυο πρωτεΐνες, σχετιζόµενες µε τις εστίες προσκόλλησης, ως «σύντροφοι» και αρωγοί της FAK στην στόχευση των εστιών προσκόλλησης, η παξιλίνη και η ταλίνη. Αµφότερες θεωρείται ότι µεσολαβούν αλληλεπιδρώντας µε την FAT περιοχή της FAK για τον εντοπισµό της πρωτεΐνης στις υπό συζήτηση περιοχές. Η αµινοτελική περιοχή της παξιλίνης (της οποίας η δοµή θα αναλυθεί σε επόµενο κεφάλαιο) περιέχει πέντε επαναλήψεις ενός µοτίβου (LD motif), του οποίου η λειτουργία είναι η µεσολάβηση για την πραγµάτωση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων (Brown et al. 1998). υο από αυτές τις επαναλήψεις διαµεσολαβούν για την αλληλεπίδραση της παξιλίνης µε την FAK, ενώ έχουν συµµετέχουν και στην πρόσδεση µε τη βινκουλίνη (Brown et al. 1996, Thomas et al. 1999). Σύµφωνα µε τον Tachibana στην FAT περιοχή της FAK ανιχνεύονται δυο µικρές αλληλουχίες που έχουν αµινοξική αλληλουχία παρόµοια µε την περιοχή της βινκουλίνης που είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση µε την παξιλίνη. Μεταλλάξεις σε αυτές τις δυο περιοχές (PBS1, PBS2: Paxillin binding site) έχουν ως συνέπεια τον µη εντοπισµό της FAK στις εσίες προσκόλλησης (Tachibana et al. 1995). υστυχώς, όµως, άλλα αποτελέσµατα δεν υποστηρίζουν την αναγκαιότητα της πρόσδεσης της παξιλίνης για τον εντοπισµό της FAK στις εστίες προσκόλλησης. Συγκεκριµένα βρέθηκαν µεταλλάγµατα της FAK τα οποία ενώ στερούνται της ικανότητας να προσδέσουν την παξιλίνη µπορούν, παρόλα αυτά, να συµµετέχουν στην οργάνωση των εστιών προσκόλλησης (Cooley et al. 2000, Hildebrand et al. 1995). Έτσι, θα κατέληγε κανείς στο συµπέρασµα ότι η αλληλεπίδραση µε την παξιλίνη δεν είναι απαραίτητη για τον εντοπισµό της FAK στις εστίες προσκόλλησης. Όµως, το γεγονός ότι όλα τα µεταλλάγµατα της FAK που δεν επιτυγχάνουν σωστό εντοπισµό αδυνατούν να αλληλεπιδράσουν µε την παξιλίνη φανερώνει ότι η σχέση της FAK µε την παξιλίνη σε ότι αφορά την µεταφορά της FAK στις εστίες προσκόλλησης είναι ιδιαίτερα πολύπλοκη (Cooley et al. 2000, Tachibana et al. 1995). Η δεύτερη πρωτεΐνη για την οποία έχουν προκύψει αποτελέσµατα που την συνδέουν µε τον εντοπισµό της FAK στις εστίες προσκόλλησης είναι η ταλίνη. Από τη µια η συγκατακρήµνιση της ταλίνης µε την FAK (η οποία εντοπίζεται στις εστίες προσκόλλησης) και από την άλλη η αδυναµία συγκατακρήµνισης µε την PYK2 (η 72

79 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) οποία διαχέεται στο κυτταρόπλασµα) οδηγούν στο παραπάνω συµπέρασµα (Zheng et al. 1998). Όµως, λαµβάνοντας υπόψη όλα τα σχετικά αποτελέσµατα ακόµα και η αλληλεπίδραση µε την ταλίνη µόνο, αδυνατεί να δικαιολογήσει την ικανότητα της FAK να εντοπίζεται στις εστίες προσκόλλησης. Το πιθανότερο είναι να υφίστανται περισσότεροι του ενός διαθέσιµοι, ανεξάρτητοι, µηχανισµοί για την στόχευση της FAK στις εστίες προσκόλλησης (π.χ. δέσµευση µε ταλίνη και δέσµευση µε παξιλίνη). Μια τέτοια πιθανότητα, η οποία είναι υπό διερεύνηση, µπορεί προς το παρόν να δώσει λύση στην βιβλιογραφική ασυµφωνία στο ζήτηµα του εντοπισµού της FAK στις εστίες προσκόλλησης. Μια ακόµα ενδιαφέρουσα παρατήρηση αποτελεί το γεγονός ότι η καρβοξυτελική περιοχή της FAK µπορεί να εκφραστεί ως αυτόνοµη πρωτεΐνη, την FRNK. Η έκφραση της ενδογενούς FRNK πρωτοπαρατηρήθηκε στα CE κύτταρα. Σε αυτά τα κύτταρα ανιχνεύονται δυο κύρια µετάγραφα, ένα mrna µεγέθους 4,5 Kb το οποίο κωδικοποιεί την FAK και ένα mrna µεγέθους 2,5 kb που κωδικοποιεί την FRNK (Schaller et al. 1993). Το µικρότερο mrna µεταγράφεται από έναν εναλλακτικό υποκινητή που εντοπίζεται µέσα σε ιντρόνιο του γονιδίου της FAK (Nolan et al. 1999). Ενώ η FAK εκφράζεται ευρέως στα κύτταρα, η έκφραση της FRNK είναι αρκετά περιορισµένη, ενώ έχει παρατηρηθεί ότι αυξάνεται στα κύτταρα του αρτηριακού λείου µυ ύστερα από επεισόδιο αγγειακού τραυµατισµού (Taylor et al. 2001). Η FRNK έχει χρησιµοποιηθεί σε πολλές µελέτες ως επικρατούσα αρνητική µετάλλαξη για να αναστείλει την µεταγωγή σηµάτων διαµέσου της FAK (Cooley et al. 2000, Gilmore et al. 1996, Xu et al. 2000, Taylor et al. 2000). Η εξωγενής έκφραση της FRNK µπορεί πιθανότατα να αναστέλλει την λειτουργικότητα της ενδογενούς FAK εκτοπίζοντας την από τις εστίες προσκόλλησης και / ή αλληλεπιδρώντας µε άλλες πρωτεΐνες που φυσιολογικά συµµετέχουν σε µεταγωγικά σύµπλοκα µε την FAK. Ωστόσο η ακριβής λειτουργία της ενδογενούς FRNK δεν έχει αποκαλυφθεί ακόµα. Η FRNK µπορεί να δρα ως φυσιολογικός ανταγωνιστικός αναστολέας της FAK ή µπορεί να αυξάνει την µη καταλυτική δράση της FAK π.χ. προσφέροντας θέσεις πρόσδεσης για τις πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν µε την FAK / FRNK. 73

80 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) Μηχανισµοί ενεργοποίησης της Κινάσης Εστιακής Προσκόλλησης Σε πολλούς κυτταρικούς τύπους, η ενεργοποίηση της FAK οδηγεί στην πρόσδεση των PTKs της οικογένειας Src στην περιοχή που γειτνιάζει µε την φωσφορυλιωµένη τυροσίνη στη θέση 397. Η αλληλεπίδραση αυτή πραγµατοποιείται λόγω της SH2 περιοχής που φέρουν οι κινάσες της προαναφερθείσας οικογένειας. Ως επακόλουθο της πρόσδεσης της Src στην FAK επάγεται η καταλυτική ενεργότητα της πρώτης, η οποία µε την σειρά της φωσφορυλιώνει την FAK σε αµινοξέα τυροσίνης που εντοπίζονται µέσα καταλυτικό κέντρο της κινάσης. Τα αµινοξέα για τα οποία γίνεται λόγος είναι τα Tyr576 και Tyr577 τα οποία µόλις φωσφορυλιωθούν αυξάνουν την καταλυτική ενεργότητα της FAK (Ruest et al. 2000). Η ενεργότητα της Src στο σύµπλοκο που έχει σχηµατιστεί, µεταξύ Src-FAΚ, συνεπάγεται επίσης, την προσθήκη φωσφορικών οµάδων στις τυροσίνες Tyr861 και Tyr925 που βρίσκονται στο καρβοξυτελικό άκρο της FAK. Η φωσφορυλιωµένη τυροσίνη στην θέση 925 αποτελεί θέση πρόσδεσης για την SH2 περιοχή της πρωτεΐνης συνδετήρα Grb2 (Schlaepfer et al. 1999) (Εικόνα 52). Το σύµπλοκο των FAK-Src επάγει την φωσφορύλιωση τυροσινών πολλών πρωτεϊνικών συνδετήρων όπως η Shc, η παξιλίνη και η p130cas αλλά και άλλων κύτταροσκελετικών πρωτεϊνών όπως η α-ακτινίνη (Izaguirre et al. 2001). Πολλές από αυτές τις φωσφορυλιωσεις µπορούν να οδηγήσουν στην ενεργοποίηση πολλαπλών ενδοκυτταρικών σηµατοδοτικών µονοπατίων (Schaller 2001, Abbi et al. 2002, Schlaepfer et al. 1999). Όµως, πάρα τη γνώση που έχει αποκτηθεί όσον αφορά τις θέσεις στις οποίες η FAK φωσφορυλιώνεται, τους στόχους και τα σχετιζόµενα σηµατοδοτικά γεγονότα, ο ακριβής µηχανισµός ενεργοποίησης της FAK παραµένει ανεξακρίβωτος. Αυτό ίσως να οφείλεται στο γεγονός ότι η FAK δύναται να ενεργοποιηθεί από πολλαπλά ερεθίσµατα µε ενδεχοµένως διαφορετικό τρόπο. ιαµοριακή φωσφορυλίωση της FAK Είναι γενικά αποδεκτό ότι η συνάθροιση των ιντεγκρινών ή χιµαιρικών µορίων που περιέχουν τις κυτταροπλασµατικές περιοχές των ιντεγκρινών, µπορούν να επάγουν την ενεργοποίηση της FAK. Γι αυτή την περίπτωση έχει προταθεί ένα δια- µοριακό (intermolecular) µοντέλο ενεργοποίησης που περιλαµβάνει τον διµερισµό της FAK (Toutant et al. 2002, Katz et al. 2002). Επίσης, αναλύσεις µε µεταλλάγµατα 74

81 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) της FAK έχουν δείξει ότι η στόχευση της FAK στις εστίες προσκόλλησης είναι σηµαντική για τη ρύθµιση της λειτουργίας της (Shen et al. 1999). Εικόνα 52. Θέσεις πρόσδεσης για τις σχετιζόµενες µε την FAK πρωτεΐνες. Η αµινοτελική FERM περιοχή της FAK είναι σηµαντική για την συνάθροιση των µηνυµάτων που προέρχονται από τους υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων, όπως της οικογένειας Eph, τους υποδοχείς µε ενεργότητα κινάσης τυροσίνης (EGFR και PDGFR) όπως και από την κυτταροπλασµατική Etk PTK. Επίσης, η FERM αλληλεπιδρά µε την πρωτεΐνη ικρίωµα του σηµατοδοτικού µονοπατιού της JNK (JSAP1), όπως και µε την πρωτεΐνη Ezrin που σχετίζεται µε τον κυτταροσκελετό αλλά και τις SUMO πρωτεΐνες. H καρβοξυτελική περιοχή της πρωτεΐνης, FAT, αλληλεπιδρά µε τις κυτταροσκελετικές πρωτεινες παξιλίνη και ταλίνη και µεσολάβει για τον εντοπισµό της FAK στις εστίες προσκόλλησης οπού εντοπίζονται πολλοί ιντεγκρινικοί υποδοχείς. Ακόµα, η FAT αλληλεπιδρά άµεσα µε την p190rhogef µε αποτέλεσµα να ρυθµίζεται η ενεργοποίηση της Rho-GTPασης. Πρωτεΐνες που φέρουν SH3 περιοχές, όπως δηλαδή η Trio και η c-src, προσδένονται στην Pro-1 περιοχή της FAΚ, ενώ άλλες πρωτεΐνες µε SH3 αλληλουχίες όπως η p130cas, η Graf και η Asap-1 µπορούν να αλληλεπιδράσουν µε τις περιοχές Pro2 και Pro3 της FAK. Η φωσφορυλιωση στην τυροσίνη 397 της FAK, δηµιουργεί θέσείς υψηλής συγγένειας για πρωτεΐνες µε SH2 περιοχές όπως η οικογένεια κινασών Src και η πρωτεΐνη συνδετήρας Shc. Οµοίως, η p.y925 αποτελεί θέση πρόσδεσης για την πρωτεΐνη συνδετήρα Grb2. Αντίθετα, φωσφορυλίωση των τυροσινών Υ576 και Υ577 προκαλεί την µέγιστη καταλυτική ενεργοποίηση της κινάσης FAK. Η αναστολή της καταλυτικής ενεργότητας της FAK προκαλείται από την αλληλεπίδραση µε την πρωτεΐνη FIP200, στην καταλυτική περιοχή του µορίου, και µε τις SOCKs πρωτεΐνες των οποίων η πρόσδεση ρυθµίζεται από την φωσφορυλίωση της θέσης 397. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση της FAK στην τυροσίνη 861 µπορεί να τροποποιήσει την πρόσδεση των ιντεγκρινών, ενώ η φωσφορυλίωση της FAK στην θέση Ser910, είτε από την πρωτεινική κινάση C ή την ERK2, ίσως επηρεάζει αρνητικά την πρόσδεση της παξιλίνης στην περιοχή FAT της FAK. Επιεδή η FAK οδηγείται στις εστίες προσκόλλησης µέσω των αλληλεπιδράσεων της µε πρωτεΐνες που σχετίζονται µε ιντεγκρίνες, όπως η παξιλίνη και η ταλίνη, έχει αποδειχτεί, από µελέτες µε ινοβλάστες που δεν εξέφραζαν παξιλίνη (paxillin null), ότι η ενεργοποίηση της FAK, ύστερα από επαγωγή µε φιµπρονεκτίνη, είναι µειωµένη γιατί δεν είναι δυνατός ο εντοπισµός του µορίου κοντά στις ιντεγκρίνες (Hagel et al. 2002). Όµοια αποτελέσµατα προκύπτουν και από περιπτώσεις όπου µεταλλαγές στην FAT έχουν ως αποτέλεσµα την αδυναµία 75

82 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) σύνδεσης µε την παξιλίνη, µε συνέπεια και σε αυτά τα πειράµατα η επαγόµενη από τις ιντεγκρίνες φωσφορυλίωση της FAK να είναι µειωµένη (Zhao et al. 2001, 2003). Ωστόσο, υπάρχουν µελέτες που υποστηρίζουν ότι ο εντοπισµός της FAK στις εστίες προσκόλλησης είναι ξεχωριστό γεγονός από την ενεργοποίηση του µορίου µέσω των ιντεγκρινών (Wennerberg et al. 2000). Ίσως να υπάρχει, λοιπόν, µια ιεραρχία πρωτεϊνικών µορίων µε τα οποία αλληλεπιδρά η FAT περιοχή της FAK, απαραίτητη για τη διεγειρόµενη από τις ιντεγκρίνες ενεργοποίηση της πρωτεΐνης. Το τοπίο ενδέχεται να ξεκαθαρίσει χρησιµοποιώντας εξειδικευµένα αντισώµατα έναντι διαφορετικών επιτόπων και φωσφορυλιωµένων αµινοξέων για το µόριο της FAK, τα οποία µέσω των σύγχρονων τεχνικών θα αποκαλύψουν την φύση και τη σύσταση (χωροχρονικά) του συµπλόκου των πρωτεϊνών που επηρεάζουν, ρυθµίζουν και ενεργοποιούν την FAK. Περιπλέκοντας, όµως, την κατάσταση έχει υποστηριχθεί ότι η συνάθροιση των ιντεγκρινών (α5β1) σε κύτταρα εναιωρήµατος αποδίδει αυξηµένη φωσφορυλίωση στην τυροσίνη 861 της FAK σε αντίθεση µε τα προσκολληµένα, σε υπόστρωµα, κύτταρα τα οποία δείχνουν φωσφορυλίωση τόσο στην θέση 397 όσο και στην 861 (Shi et al. 2003). Είναι, όµως, γνωστό ότι η θέση Υ861 φωσφορυλιώνεται από κινάσες της Src οικογένειας (Hanks et al. 2003) όπως, επίσης, ότι αυτές οι κινάσες ενεργοποιούνται από την συνάθροιση των ιντεγκρινών (Giancotti et al. 1999) µε απευθείας αλληλεπίδραση µε τις ιντεγκρίνες, ιδιαιτέρως µε την κυτταροπλασµατική περιοχή της β υποµονάδας (Arias-Salgado et al. 2003). Συνεπώς, η διαδικασία ενεργοποίησης της FAK καθαρά περιλαµβάνει την φωσφορυλίωση του µορίου in trans από άλλες PTKs. Αυτό το µοντέλο συµφωνεί µε δεδοµένα που εµφανίζουν ότι η kinase-inactive FAK µπορεί να φωσφορυλιωθεί in trans όταν εκφράζεται σε FAKnull κύτταρα (Sieg et al. 2000). Ενδοµοριακή ενεργοποίηση της FAK Ενδοκυτταρικά εµπόδια επίσης παίζουν ρόλο στη ρύθµιση της ενεργότητας της FAK. Σε αυτό το πλαίσιο έχει παρατηρηθεί ότι η φωσφορυλίωση της FAK στην Υ861 συσχετίζεται µε ενισχυµένη cis- και trans- φωσφορυλίωση στην θέση Tyr 397 (Leu et al. 2002). Επίσης, έχει προταθεί πως η αµινοτελική περιοχή της FAK και συγκεκριµένα η FERM προσδένεται, in vitro, στην περιοχή κινάσης της FAK µε αποτέλεσµα να µειώνεται η ενεργότητα του µορίου αφού λειτουργεί ως ένας 76

83 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) Εικόνα 53. Μοντέλα ενεργοποίησης της FAK σε περιοχές όπου είναι συναθροισµένες οι ιντεγκρίνες. (Α) Σε κύτταρα του σταδίου ηρεµίας ή προσκολληµένα, η FAK εντοπίζεται σε περιοχές που είναι εµπλουτισµένες σε µόρια βινκουλίνης. Σε αυτές τις περιπτώσεις η FAK αλληλεπιδρά µε τις ιντεγκρίνες µέσω της παρεµβάσεως πρωτεϊνών όπως η παξιλίνη και η ταλίνη. Σε αυτήν την κατάσταση η FAK µπορεί να φωσφορυλιωθεί αλλά εµφανίζει µικρά επίπεδα ενζυµικής ενεργότητας λόγω περιορισµών της διαµόρφωσης του µορίου που εµποδίζουν την καταλυτική ενεργότητα και την πρόσδεση της SH2 περιοχής της c-src στην p.y397 της FAK. (B) Η επέκταση των κυττάρων σε πρωτεΐνες του στρώµατος προάγει την συνάθροιση των ιντεγκρινών και την ενεργοποίηση της FAK µέσω δια- µοριακής συνάθροισης αλλά και ενδο- µοριακής απελευθέρωσης της στερεοδοµικής παρεµπόδισης. Η µέγιστη αυτοφωσφορυλίωση στην FAK Y397 προωθεί την στρατολόγηση των Src πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης µέσω της Src. Στην συνέχεια ακολουθούν οι φωσφορυλιώσεις των αµινοξέων Tyr576/577 της FAK που εντοπίζονται µέσα βρόχο ενεργοποίησης της κινάσης και η συγκρότηση του σηµατοδοτικού συµπλόκου FAK-Src PTK. ενδοµοριακός αναστολέας της FAK (Cooper et al. 2003). Ακόµα, η ezrin, η οποία είναι µια πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά µε την FERM περιοχή της FAK, όταν υπερεκφράζεται µπορεί να επάγει την αυτοφωσφορυλίωση της FAK στην θέση Tyr 397 κατά τρόπο ανεξάρτητο από τις ιντεγκρίνες και τις κινάσες της οικογένειας Src (Poullet et al. 2001). Επιπλέον, έχει παρατηρηθεί ότι η πρόσδεση της Trio, που συντελείται µέσω της SH3 περιοχής που φέρει, στο proline-rich µοτίβο που ακολουθεί την FERM περιοχή προκαλεί αύξηση της ενεργότητας κινάσης της FAK (Medley et al. 2003). Τέλος, η ιδέα λειτουργίας της FERM περιοχής ως αρνητικού ρυθµιστή της ενζυµικής ενεργότητας της FAK, ενισχύεται από την αλληλεπίδραση της FERM µε τις πρωτεΐνες PIAS1 (πρωτεϊνικοί αναστολείς των ενεργοποιηµένων STAT1). Οι Pias1 προκαλούν SUMOylation της FAK (Kadare et al. 2003) στην Lys-152 δηλαδή µέσα στην FERM εµποδίζοντας την αλληλεπίδραση της FERM µε την περιοχή της κινάσης. Αυτό το γεγονός έχει συνδεθεί µε αυξηµένη φωσφορυλίωση στην Tyr397 κατά τρόπο ανεξάρτητο από τις ιντεγκρίνες. Οι ενδείξεις που έχουν συγκεντρωθεί µέχρι σήµερα υποδεικνύουν ότι είτε µετά- µεταφραστικές τροποποιήσεις είτε αλληλεπιδράσεις µε πρωτεΐνες στόχους 77

84 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) λειτουργούν έτσι ώστε η FERM περιοχή της FAK να απελευθερώνει κάποιο αλλοστερικό περιορισµό ή κάποιο εµπόδιο στην διαµόρφωση του µορίου που περιορίζει την ενζυµική δράση της FAK (Εικόνα 53). Είναι πιθανό, λοιπόν, για τη µέγιστη καταλυτική ενεργότητα της FAK να είναι απαραίτητες αλλαγές στην χωροδιάταξη της περιοχής της κινάσης. Οι αλλαγές αυτές που απαιτούνται για την ενεργοποίηση της FAK ίσως αποτελούν τον λόγο για τον οποίο είναι δύσκολη η επίτευξη µεταλλαξιγένεσης µέσα στην περιοχή της κινάσης ώστε να δηµιουργηθούν διαρκώς ενεργά µεταλλάγµατα. Ωστόσο, η Super FAK η οποία δηµιουργήθηκε από την αλλαγή του γλουταµινικού οξέος σε λυσίνη στις θέσεις 578 και 581, µέσα στον καταλυτικό βρόχο, οδήγησε σε αύξηση στην in vitro ενεργότητα της κινάσης και σε αυξηµένη φωσφορυλίωση της παξιλίνης (σε αµινοξέα τυροσίνης) in vivo (Gabarra- Niecko et al. 2002). Παρόλα αυτά, όµως, η υπέρ-έκφραση της δεν προκαλεί σηµαντικές αλλαγές στην συµπεριφορά των κυττάρων σε σχέση µε την αγρίου τύπου πρωτεΐνη. Τέλος, η ρύθµιση της ενεργότητας της FAK συντελείται, επίσης, από πρωτεΐνες όπως η FIP200, η οποία είναι µια ανασταλτική πρωτεΐνη της FAK 200 KDa που προσδένεται στην περιοχή της κινάσης της FAK (Abbi et al. 2002) αλλά και µε αλληλεπίδραση µε τις SOCKs πρωτεΐνες που µαρκάρουν την FAK για πολύουµπικιτινυλίωση και αποικοδόµηση (Liu et al. 2003). Επιπλέον, η ενεργότητα της FAK ρυθµίζεται αρνητικά από την δράση φωσφατασών τυροσίνης (PTPs) όπως η SHP2 (SH2 containing tyrosine phosphatase 2) (Yu et al. 1998, VonWichert et al., 2003) και οι φωσφατάσες τυροσίνης µικρού µοριακού βάρους (LMW-PTP) (Chiarugi et al. 2003). Αντίθετα, τα κύτταρα τα οποία δεν εκφράζουν την PTPα επιδεικνύουν µειωµένη φωσφορυλίωση στις τυροσίνες της FAK µετά από διέγερση των ιντεγκρινών, γεγονός που υποστηρίζει την δράση της PTPα ως θετικού ρυθµιστή της ενεργοποίησης της FAK (Zeng et al. 2003). Εντούτοις, επώαση των κυττάρων µε φαρµακολογικούς αναστολείς των Src κινασών (π.χ. PP2) δίνει φαινότυπο όµοιο µε αυτόν των PTPα-null κυττάρων, άρα η FAK πιθανότατα δεν αποτελεί υπόστρωµα για την PTPα. Αντίθετα υποστηρίζεται ότι η φωσφατάση αυτή λειτουργεί ως ενεργοποιητής της Src, ύστερα από διέγερση των ιντεγκρινών, αποφωσφορυλιώνοντας την ρυθµιστική καρβοξυτελική τυροσίνη της c-src (Zeng et al. 2003). Η παραπάνω παρατήρηση ενισχύει τη διαµοριακή ενεργοποίηση της FAK από την Src µέσω άµεσης φωσφορυλίωσης της θέσης Υ397. Επειδή, όµως, η Src µπορεί να ενεργοποιηθεί απευθείας από τις ιντεγκρίνες, κυρίως από την 78

85 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) κυτταροπλασµατική ουρά της υποµονάδας β3 των ιντεγκρινικών υποδοχέων, (Arias- Salgado et al. 2003) δεν πρέπει να ερµηνεύεται πάντοτε η φωσφορυλίωση της τυροσίνης 397 της FAK, η οποία οδηγεί στην ενζυµική ενεργοποίηση του µορίου, ως γεγονός αυτοφωσφορυλίωσης. Γι αυτό τον λόγο, άλλωστε, ο χαρακτηρισµός που περιγράφει καλύτερα την FAK (ή το µοντέλο λειτουργίας της) είναι ότι αποτελεί µια ενεργοποιήσιµη πρωτεΐνη ικρίωµα (activatable scaffolding protein) (Schwartz et al. 2001), στην οποία η συγκέντρωση σηµατοδοτικών µορίων που προσδένονται επάνω της µπορεί να εκκινήσει είτε από την αυτοφωσφορυλίωση του µορίου στην θέση Tyr397 είτε από trans φωσφορυλίωση από άλλη κινάση στην ίδια θέση. Η λειτουργία της FAK ρυθµίζεται από φωσφορυλιώσεις σε αµινοξέα τυροσίνης και σερίνης. H πρόσδεση της Src στην FAK, η οποία συντελείται µε την αλληλεπίδραση της SH2 περιοχή της Src µε την φωσφορυλιωµένη τυροσίνη στην θέση 397 της FAK, είναι η γενεσιουργός αιτία του ενεργοποιηµένου σηµατοδοτικού συµπλόκου FAK-Src (Schlaepfer et al. 1999). Η Src διευκολύνει την µέγιστη ενεργοποίηση της FAK φωσφορυλιώνοντας την στις θέσεις Tyr576/577 (µέσα στην περιοχή της κινάσης) ενώ επιπρόσθετα φωσφορυλιώνει και άλλες θέσεις στο καρβοξυτελικό άκρο του µορίου και συγκεκριµένα στις θέσεις Tyr861/925. Η τυροσίνη στην θέση 925 αποτελεί σηµείο πρόσδεσης για την Grb2 (Εικόνα 54). Έχει αποδειχτεί, όµως, σε ότι αφορά αυτήν την αλληλεπίδραση ότι είτε η φωσφορυλίωση στην θέση 925 είτε η πρόσδεση της Grb2 οδηγεί στην αποσύνδεση της FAK από τις εστίες προσκόλλησης (Katz et al. 2003). Επίσης, στόχευση της FAK στην πλασµατική µεµβράνη συνεπάγεται ενίσχυση της φωσφορυλίωσης στην θέση 925 που έχει ως συνέπεια τη µεταγωγή σηµάτων, µη εξαρτώµενη από προσκόλληση, σε στόχους όπως η ERK2 MAPK (Renshaw et al. 1999). Η θέση Tyr925 εντοπίζεται µέσα στην FAT περιοχή στο καρβοξυτελικό άκρο της FAK, µια δοµή που σχηµατίζεται από τέσσερις έλικες (Hayashi et al. 2002). Η τοποθέτηση στο χώρο της τυροσίνης στη θέση 925 επιτρέπει τη φωσφορυλίωση της πλευρικής της οµάδας. Η FAT, όπως έχει προαναφερθεί, προσφέρει θέσεις πρόσδεσης για τα πεπτιδικά µοτίβα LD2 και LD4 της παξιλίνης, µε τα οποία σχηµατίζονται δεσµοί ανάµεσα στις δυο πρωτεΐνες και εξασφαλίζεται έτσι (σε αρκετές αν όχι σε όλες τις περιπτώσεις) ο εντοπισµός της FAK κοντά στις 79

86 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) ιντεγκρίνες, στις εστίες προσκόλλησης (Turner et al. 2000). Όταν, όµως, προσδεθεί η παξιλίνη στην FAT η τυροσίνη 925 καλύπτεται εν µέρει µε αποτέλεσµα να θεωρείται ότι η πρόσδεση της παξιλίνης και η πρόσδεση της Grb2 είναι δυο καταστάσεις αποκλειόµενες αµοιβαία (Liu et al. 2002). Αυτά τα ευρήµατα ενισχύουν την υπόθεση κατά την οποία το ενεργοποιηµένο σύµπλοκο της FAK, ίσως, αποσυνδέεται από τις εστίες επαφής µε το υπόστρωµα. Εικόνα 54. Η FAK συνενώνει σήµατα από µια ποικιλία υποδοχέων της κυτταρικής επιφανείας. Οι ιντεγκρίνες, οι υποδοχείς οι συνδεόµενοι µε G πρωτεΐνες και οι υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων επάγουν την ενεργοποίηση της FAK (αύξηση στην φωσφορυλίωση των τυροσίνων 576, 577, 861, 925). Ερεθίσµατα που διεγείρουν την κινητικότητα επάγουν την ενεργοποίηση της FAK µέσω αυτοφωσφορυλίωσης του µορίου στην θέση 397 ή η FAK µπορεί να λειτουργήσει ως υπόστρωµα για άλλες PTKs µε αποτέλεσµα στην αύξηση της trans φωσφορυλίωσης της FAK. Αλλά καθώς η φωσφορυλίωση στην θέση Y397 δεν ταυτίζεται πάντοτε µε γεγονός αυτοφωσφορυλίωσης, η FAK µπορεί να θεωρηθεί ότι λειτουργεί ως µια ενεργοποιήσιµη πρωτεΐνη ικρίωµα. Άλλη µια θέση η οποία έχει συσχετιστεί µε µειωµένη πρόσδεση της παξιλίνης όταν βρίσκεται στην φωσφορυλιωµένη κατάσταση της είναι η Ser910. Η σερίνη στην θέση 910 βρίσκεται επίσης στην FAT περιοχή του µορίου και φωσφορυλιώνεται κατά την διάρκεια της µίτωσης (Ma et al. 2001) ή ύστερα από µιτογόνο διέγερση των κυττάρων (Hunger-Glaser et al. 2003). Πιθανότατα και σε αυτή την περίπτωση η φωσφορυλίωση της σερίνης προκαλεί σηµαντική αλλαγή της χωροδιάταξης της FAT περιοχής της FAK µε συνέπεια να µειώνεται η ισχύς της αλληλεπίδρασης µεταξύ της FAK και της παξιλίνης µε αποτέλεσµα την αποσύνδεση των δυο πρωτεϊνών. Οι υπόλοιπες θέσεις φωσφορυλίωσης της FAK συµµετέχουν ενεργά στον εντοπισµό του µορίου µέσα στο κύτταρο. Έτσι, η διαµεσολαβούµενη από την Src φωσφορυλίωση της Tyr861 συνεισφέρει σηµαντικά στην συσχέτιση της FAK µε το 80

87 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) σηµατοδοτικό σύµπλοκο των ανβ5 ιντεγκρινών ύστερα από επαγωγή των ενδοθηλιακών κυττάρων µε τον αυξητικό παράγοντα VEGF (Eliceiri et al. 2002). Επίσης, η ενεργότητα της FAK και η συσχέτιση της µε τις ιντεγκρίνες έχουν αναφερθεί από µελέτες ως απαραίτητος και καθοριστικός παράγοντας για φαινόµενα κυτταροφαγίας π.χ. κυτταροφαγία της E.coli (Alrutz et al. 1998, Reddy et al. 2000, Metheniti et al. 2001, Bruce-Staskal et al. 2002) και της Yersinia από κύτταρα των θηλαστικών. Τέλος, κατά την διάρκεια της ανάπτυξης του εγκεφάλου του ποντικού η Cdk5 (cycllin-dependent kinase 5) έχει βρεθεί ότι προάγει την φωσφορυλίωση της FAK στην θέση Ser 732 στα νευρικά κύτταρα (Rodriguez et al. 2003). Η ενεργοποίηση της FAK και η Src Όπως ηδη εχει σηµειωθεί ο συνεντοπισµός της FAK µε τις ιντεγκρίνες στις εστίες προσκόλλησης είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την ενεργοποίηση της FAK που προκαλείται από την προσκόλληση των κυττάρων. Έτσι µόρια της FAK τα οποία δεν µπορούν να µεταφερθούν στις εστίες προσκόλλησης, ίσως λόγω κάποιας µετάλλαξης, δεν φωσφορυλιώνονται σε τυροσίνες ύστερα από προσκόλληση των κυττάρων στην φιµπρονεκτίνη (Shen et al. 1999, Cooley et al. 2000). Επίσης, ο κυτταροσκελετός της ακτίνης συµβάλλει καθοριστικά στην φωσφορυλίωση των τυροσινών της FAK αφού επώαση των κυττάρων µε την κυτταροχαλασίνη D προκαλεί αναστολή της ενεργοποίησης της FAK σε πληθώρα διεγέρσεων που υπό φυσιολογικές συνθήκες επάγουν την φωσφορυλίωση της FAK. Η αναστολή παρατηρείται ακόµα και µετά από προσκόλληση των κυττάρων δηλαδή διέγερση των ιντεγκρινών (Lipfert et al. 1992, Schlaepfer et al. 1998). Κύριοι ρυθµιστές του κυτταροσκελετού είναι µέλη από την Rho οικογένεια των µονοµερών G πρωτεϊνών ενώ και η ίδια η Rho επάγει την κυτταρική σύσπαση και την σύσταση των ινιδίων τάσης και των εστιών προσκόλλησης (Schoenwaelder et al. 1999). Υπάρχουν αρκετά στοιχεία που υποστηρίζουν ότι η ενεργοποίηση των Rho επάγει την φωσφορυλίωση της FAK και επιπρόσθετα η αναστολή των Rho εµποδίζει την φωσφορυλίωση της FAK (Seckl et al. 1995, Wang et al. 1997). Ο εντοπισµός της Rho σε εστίες προσκόλλησης µπορεί να προκαλεί την σύσπαση του κυτταροσκελετού και να επάγει τη γειτνίαση κυτταροσκελετικών στοιχείων, συµπεριλαµβανοµένης και της FAK, µε συνέπεια την ενδεχόµενη αυτοφωσφορυλίωση της FAK και την ενεργοποίηση των σηµατοδοτικών µονοπατιών της FAK. Τέλος η Src εµπλέκεται στην φωσφορυλίωση 81

88 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) πολλών τυροσινών της FAK. Μάλιστα, η Src θεωρείται απαραίτητη για την µεγιστοποίηση της δραστης της FAK ως κινάσης τυροσίνης κατά την απόκριση στην κυτταρική προσκόλληση. Είναι γενικά παραδεκτό ότι η Src αλληλεπιδρά µε την FAK όταν η τελευταία είναι φωσφορυλιωµένη στην θέση Υ397 και κατόπιν η Src φωσφορυλιώνει τη FAK σε άλλες θέσεις τυροσίνης. Εντούτοις, έχουν βρεθεί στοιχεία από µετασχηµατισµένους για την Src ινοβλάστες που αποδεικνύουν ότι η ενεργοποιηµένη Src µπορεί να φωσφορυλιώσει µόρια FAK τα οποία έχουν µεταλλάξεις (397F) που δεν επιτρέπουν την αναµενόµενη αλληλεπίδραση FAK-Src στην θέση 397 (McLean et al. 2000, Ruest et al. 2000). Όντως η ύπαρξη µιας SH3 θέσης πρόσδεσης της Src στην FAK περιπλέκει την διαλεύκανση του φαινοµένου από την στιγµή που είναι δυνατή µια τέτοια αλληλεπίδραση, έστω και όχι ισχυρής (Thomas et al., 1998). Συνεπώς, σύµφωνα µε τις παραπάνω εργασίες, για να δράσει η Src δεν χρειάζεται ισχυρή πρόσδεση µε την FAK για να επάγει την δράση της ως κινάση. Ωστόσο, φαίνεται ότι µεταλάγµατα της FAK στη θέση αυτοφωσφορυλίωσης, Υ397, τα οποία αποτυγχάνουν να αλληλεπιδράσουν µε την Src παρουσιάζουν µια σηµαντική πτώση στη φωσφορυλίωση των αµινοξέων που βρίσκονται στο βρόχο ενεργοποίησης του ενζύµου (Ruest et al. 2000). Άρα η αλληλεπίδραση µε την Src κρίνεται απαραίτητη για την φωσφορυλίωση των αµινοξέων 576 και 577. Ακόµα έχει υποστηριχτεί ότι η φωσφορυλίωση της τυροσίνης στην θέση αυτοφωσφορυλίωσης γίνεται ανεξάρτητα από τις λοιπές φωσφορυλιώσεις τυροσινών στο µόριο της FAK. Συµπερασµατικά, λοιπόν, η ενεργοποίηση της FAK πρέπει να γίνεται σε δυο φάσεις, στην πρώτη φάση πραγµατοποιείται αυτοφωσφορυλίωση του µορίου απουσία της Src και ως αποτέλεσµα φωσφορυλιώνεται η τυροσίνη στην θέση 397. Η δεύτερη φάση ακολουθεί µε την στρατολόγηση της Src στο σύµπλοκο της FAK και συνεπάγεται την φωσφορυλίωση της FAK σε άλλες θέσεις τυροσίνης. Έτσι, ολοκληρώνεται η διαδικασία πλήρους ενεργοποιησης της FAK και εκκινεί η διαδικασία µετάδοσης µηνυµάτων προς τις επόµενες πρωτεΐνες που συµµετέχουν στα διάφορα µονοπάτια κυτταρικής επικοινωνίας που ρυθµίζει η FAK. 82

89 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) Η ενεργοποίηση της Src: φωσφορυλιώσεις-αποφωσφορυλιώσεις και λοιπές αλληλεπιδράσεις µετά από διέγερση των ιντεγκρινών Η Src και οι κινάσες που ανήκουν στην οικογένεια των Src κινασών τυροσίνης είναι ρυθµιστικές πρωτεΐνες µε σηµαντικότατο ρόλο στην κυτταρική διαφοροποίηση, την κίνηση, τον πολλαπλασιασµό και την επιβίωση. Οι θέσεις στις οποίες φωσφορυλιώνεται η Src περιλαµβάνουν µια θέση αυτοφωσφορυλίωσης, την Υ416, και την θέση Υ527 που βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης. Η Src ρυθµίζεται αρνητικά µε την φωσφορυλίωση του καρβοξυτελικού αµινοξέος από την κινάση τυροσινών Csk (C-terminal Src Kinase) (Thomas et al. 1997). Αυτή η τροποποίηση προκαλεί την ενδοµοριακή αλληλεπίδραση ανάµεσα στο φωσφορυλιωµένο αµινοξύ και την SH2 περιοχή της Src. Επιπλέον µια δεύτερη ενδοκυτταρική αλληλεπίδραση πραγµατοποιείται µε την µεσολάβηση της SH3 περιοχής του µορίου (Thomas et al. 1997). Αυτές οι δυο αλληλεπιδράσεις σταθεροποιούν την Src σε µια ανενεργή κατάσταση. Η Src µπορεί να ενεργοποιηθεί βασικά, µε δυο µηχανισµούς: είτε πρέπει να αποφωσφορυλιωθεί η τυροσίνη που προκαλεί την αρνητική ρύθµιση του µορίου είτε πρέπει να καταστραφούν οι, µικρής ισχύος, ενδοµοριακοί δεσµοί που σχηµατίζουν οι SH2 και SH3 περιοχές της Src. Κατά την ενεργοποίηση των ιντεγκρινών έχουν προταθεί και οι δυο µηχανισµοί για την ενεργοποίηση της Src. Συγκεκριµένα, στις εστίες προσκόλλησης εντοπίζονται αρκετά µόρια που φέρουν περιοχές οι οποίες µπορούν να αλληλεπιδράσουν µε τις εν λόγω περιοχές της Src και κατά συνέπεια να ενεργοποιήσουν το µόριο. Σε αυτές τις περιοχές περιλαµβάνονται τόσο η κύρια θέση αυτοφωσφορυλίωσης της FAK όσο και µια τυροσίνη (φωσφορυλιωµένη) στην p130cas. Σύµφωνα µε τα παραπάνω, αυτές οι θέσεις αλληλεπιδρούν µε SH2 περιοχές και εν προκειµένω µε την Src SH2 περιοχή (Nakamoto et al. 1996, Schaller et al. 1994). Επιπρόσθετα, έχει αποδειχτεί πως υπάρχουν θέσεις αλληλεπίδρασης µε την SH3 περιοχή της Src στις πρωτεΐνες παξιλίνη, p130cas και FAK (Thomas et al. 1998, Nakamoto et al. 1996, Weng et al. 1993). Μάλιστα για τις FAK και p130cas οι θέσεις αλληλεπίδρασης µε τις SH2, SH3 βρίσκονται η µια κοντά στην άλλη, γεγονός που µπορεί να µεταφραστεί στην ταυτόχρονη δέσµευση και των δυο περιοχών. Ωστόσο, ακόµα και στην περίπτωση της Src τα αποτελέσµατα δεν επαρκούν για την ολοκληρωµένη κατανόηση του 83

90 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) φαινοµένου αφού πολλές φορές είναι αντικρουόµενα. Έτσι, γενικά, θα µπορούσε να ισχυριστεί κάποιος ότι η Src µπορεί να ενεργοποιηθεί ανεξάρτητα από την FAK αλλά για τη µέγιστη διέγερση της ενεργότητας της Src απαιτείται η δράση της FAK η οποία ακολουθεί την κυτταρική προσκόλληση. Σηµαντικό, όµως, ρόλο στην ενεργοποίηση της Src, κατά την κυτταρική προσκόλληση, έχουν οι φωσφατάσες πρωτεϊνών. Μια από αυτές είναι η PTP1B η οποία έχει υποστηριχτεί ότι όταν χορηγηθεί στα κύτταρα ως µια καταλυτικά ανενεργή πρωτεΐνη, τότε µπλοκάρει την δράση της αγρίου τύπου φωσφατάσης, γεγονός που συνεπάγεται µειωµένη ενεργοποίηση της Src (Arregui et al. 1998). Άλλες φωσφατάσες στις οποίες αποδίδεται ρόλος ανάλογος µε την PTP1B είναι οι Shp1 και Shp2 καθώς επίσης και τα διαµεµβρανικά ένζυµα CD45, PTPα, PTPε και PTPλ (Levin et al. 2004). Για την PTPα υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις που υποστηρίζουν τη λειτουργία της φωσφατάσης ως θετικού ρυθµιστή της Src. Η υπέρέκφραση της αγρίου τύπου PTPα στα κύτταρα Α431 επάγει την αποφωσφορυλίωση της Src και συνεπώς την αύξηση της ενεργότητας της κινάσης (Harder et al. 1998). Ακόµα, δε, η έκφραση της φωσφατάσης προάγει την συγκρότηση του συµπλόκου ανάµεσα σε Src-FAK, το οποίο συνήθως σχηµατίζεται µετά από διέγερση των ιντεγκρινών. Επιπλέον, παρατηρείται φωσφορυλίωση σε τυροσίνες της παξιλίνης (Harder et al. 1998), συνεπώς η PTPα µπορεί να εντοπίζεται κοντά σε θέσεις πλούσιες σε ιντεγκρίνες (Lammers et al., 2000). Επίσης, κύτταρα που δεν εκφράζουν την φωσφατάση PTPα παρουσιάζουν εικόνα ίδια µε εκείνη των κυττάρων που είναι ελλατωµατικά στην έκφραση της Src (Su et al. 1999). Γενικά, ο µηχανισµός µε τον οποίο µπορεί να ρυθµίζεται η ενεργότητα της Src από την PTPα θεωρείται πως είναι ως εξής: µια καρβοξυτελική τυροσίνη στην PTPα αποτελεί θέση φωσφορυλίωσης και κατ επέκταση θέση πρόσδεσης της SH2 περιοχής της Src. Αυτή η αλληλεπίδραση, ίσως, διαταράσσει τις ενδοµοριακές ανασταλτικές αλληλεπιδράσεις του µορίου της Src µε συνέπεια να εµφανίζεται η καρβοξυτελική ρυθµιστική φωσφοτυροσίνη της Src, της οποίας η αποφωσφορυλίωση, από την φωσφατάση, θα οδηγήσει στην ενεργοποίηση της Src (Zheng et al., 2000). 84

91 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) Μοντέλα ενεργοποίησης της FAK και της Src. Σχηµατισµός σηµατοδοτικού συµπλόκου. Αν λάβουµε υπόψη µας όλα τα παραπάνω, θα κατέληγε κανείς στην εικόνα 55 που περιγράφει συνολικά την ενεργοποίηση της FAK. Η FAK, λοιπόν, µπορεί να αυτοφωσφορυλιωθεί αρχικά απουσία της Src (Εικόνα 55, Α και C). Αν και η Src Εικόνα 55. Μοντέλα ενεργοποίησης της Src και της FAK. Η Src είναι ανενεργή (1) και η FAK στην αποφωσφορυλιωµένη κατάσταση της(2). Προτείνονται τρία πιθανά µοντέλα για την ενεργοποίηση αυτών των κινασών και την συγκρότηση σηµατοδοτικού συµπλόκου µπορεί να προταθούν. (Α) Η συνάθροιση των FAK µπορεί να είναι επαρκής για να επάγει την trans φωσφορυλίωση στην θέση 397 (3). Τότε η ανενεργή Src στρατολογείται σε σύµπλοκο µε την FAK και οι -υψηλής συγγένειας για SH2 και SH3 περιοχές- θέσεις πρόσδεσης πάνω στην FAK εξουδετερώνουν τους ενδοµοριακούς δεσµούς της Src. Έτσι η Src ενεργοποιείται και ολοκληρώνεται η συγκρότηση του συµπλόκου Src/FAK (9). (B) Η Src αρχικά µπορεί να ενεργοποιείται από µια φωσφατάση (4). Η ενεργοποιηµένη Src πιθανότατα φωσφορυλιώνει την FAK στο βρόχο ενεργοποίησης της κινάσης (5) και ενεργοποιεί την FAK η οποία στην συνέχεια αυτοφωσφορυλιώνεται στην τυροσίνη 397 (6). Στην συνέχεια η Src και η ενεργοποιηµένη FAK συγκροτούν το σηµατοδοτικό σύµπλοκο (9). (C) Η Src και η FAK ενεργοποιούνται ανεξάρτητα η µια από την άλλη (7,8) και στην συνέχεια αλληλεπιδρούν σχηµατίζοντας το σηµατοδοτικό σύµπλοκο (9). µπορεί να ενεργοποιηθεί ύστερα από συµπλοκοποίηση της µε την FAK και καταστροφή των ανασταλτικών ενδοµοριακών δεσµών του µορίου, θεωρείται πως ο µηχανισµός αυτός µάλλον δεν αποτελεί τον κύριο τρόπο ενεργοποίησης της Src (Εικόνα 55). Αντιθέτως, η δράση φωσφατασών, κυρίως µε την PTPα, φαίνεται να ενεργοποιεί την Src σε απόκριση στην κυτταρική προσκόλληση (Εικόνα 55, Β και C). Όταν η FAK και η Src ενεργοποιηθούν ανεξάρτητα, πραγµατοποιείται η συγκρότηση του συµπλόκου. Αυτή η αλληλεπίδραση συνεισφέρει στη διατήρηση της ενεργοποιηµένης µορφής της Src. Στη συνέχεια η Src φωσφορυλιώνει τη FAK σε τυροσίνες, αυξάνοντας σηµαντικά την ενεργότητα της FAK ως κινάση, αλλά και 85

92 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) παράλληλα δηµιουργώντας θέσεις πρόσδεσης για άλλα σηµατοδοτικά µόρια, προωθώντας µε αυτόν τον τρόπο την διάδοση των µηνυµάτων προς το εσωτερικό του κυττάρου. Αναστέλλοντας την FAK FIP 200: αρνητικός ρυθµιστής της FAK; Πρόσφατα αποµονώθηκε µια πρωτεΐνη η οποία συµµετέχει στην αρνητική ρύθµιση της µεταγωγής σηµάτων µέσω FAK (Ueda et al. 2000). Η πρωτεΐνη αυτή, FIP 200, βρέθηκε µε την εφαρµογή της τεχνικής διυβριδικό σύστηµα ζύµης (yeast two hybrid system) στις οποίες χρησιµοποιήθηκε το αµινοτελικό άκρο και η καταλυτική περιοχή της PYK2 ως δόλωµα (bait). Η FIP 200 βρέθηκε ότι αλληλεπιδρά µε το καταλυτικό κέντρο της PYK2 αναστέλλοντας την καταλυτική ενεργότητα του µορίου in vitro και τη µεταγωγή σηµάτων διαµέσου του µορίου in vivo. Οµοίως βρέθηκε ότι αυτή η πρωτεΐνη µπορεί να αλληλεπιδράσει και µε την FAK ρυθµίζοντας αρνητικά την ενζυµική δράση του µορίου in vitro. Συνεπώς, η FIP 200 ενδεχοµένως ρυθµίζει και τις δύο πρωτεΐνες. Φωσφατάσες τυροσίνης. Από τη στιγµή που η φωσφορυλίωση τυροσίνων της FAK ρυθµίζει την καταλυτική ενεργότητα του µορίου αλλά και την αλληλεπίδραση του µε άλλες σηµατοδοτικές πρωτεΐνες, η αποφωσφορυλίωση αυτών των αµινοξέων θα είναι ένας πολύ σηµαντικός µηχανισµός ρύθµισης της µεταγωγής σηµάτων µέσω της FAK. Ως φωσφατάσες, λοιπόν, που ρυθµίζουν την FAK έχουν προταθεί αρκετά µόρια στα οποία περιλαµβάνονται οι PTP-PEST (Shen et al. 1998) και PTP1β (Liu et al. 1998), όπως επίσης µπορούν να προστεθούν και οι PTEN και η Shp-2. Για την Shp2 έχουν βρεθεί αρκετά στοιχεία τα οποία, δυστυχώς, είναι αντικρουόµενα για τους διάφορους κυτταρικούς τύπους που εξετάστηκαν και κατά συνέπεια δεν µπορεί να προκύψει κάποιο τελικό συµπέρασµα για την ακριβή λειτουργία του µορίου και τον τρόπο µε τον οποίο η Shp2 ρυθµίζει την FAK. Όσον αφορά την PTEN υπάρχουν σηµαντικά στοιχεία που υποστηρίζουν την δράση του µορίου ως φωσφατάση-ρυθµιστή της FAK. Μάλιστα, η PTEN αρχικά είχε αποµονωθεί ως ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο, γεγονός που ίσως έχει σχέση µε τη 86

93 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) συµµετοχή της FAK στην ανάπτυξη καρκίνου (Li et al. 1997, Steck et al. 1997). Η PTEN εκδηλώνει τρεις διαφορετικούς τύπους ενεργότητας φωσφατάσης. Αρχικά είχε θεωρηθεί ως φωσφατάση τυροσινών, αργότερα αποδείχτηκε ότι µπορεί να εκτελεί αποφωσφορυλιωσεις και σε αµινοξέα σερίνης-θρεονίνης in vitro αλλά και, πιο πρόσφατα, ότι µπορεί να λειτουργεί ως φωσφατάση λιπιδίων (Myers et al. 1997, 1998, Maehama et al. 1998). Όσον αφορά την τελευταία δράση της η PTEN µπορεί να αλληλεπιδράσει µε τα προϊόντα αντίδρασης της PI3 κινάσης για της οποίας την µεταγωγή σηµάτων αποτελεί έναν αρνητικό ρυθµιστή in vivo (Vazquez et al. 2000). Υπερέκφραση της PTEN στις κυτταρικές σειρές NIH 3T3 ή U87-MG, οι οποίες είναι ελαττωµατικές στην έκφραση της PTEN, προκαλεί µείωση στην φωσφορυλίωση τυροσινών της FAK (Tamura et al. 1998, 1999) ενώ ο φαινότυπος των κυττάρων οµοιάζει µε τις περιπτώσεις εκείνες που έχει ανασταλεί η µεταγωγή σηµάτων µέσω της FAK, δηλαδή παρατηρείται µειωµένη κινητικότητα κτλ. Σε αυτές τις περιπτώσεις υπερέκφραση της FAK επανέφερε τον άγριο φαινότυπο. Συνεπώς τα στοιχεία στηρίζουν την υπόθεση ότι η φωσφατάση αυτή επάγει αυτά τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά αποφωσφορυλιώνοντας την FAK και αναστέλλοντας την µεταγωγή σηµάτων µέσω αυτής. Επίσης, η έκφραση καταλυτικά ανενεργής PTEN επάγει αύξηση στην φωσφορυλίωση της FAK ενώ ταυτόχρονα έχει βρεθεί ότι η φωσφατάση αυτή συγκατακρηµνίζεται µε την FAK (Tamura et al. 1998, 1999). Ακόµα, έχει βρεθεί ότι η ανενεργή PTEN δεν αλληλεπιδρά µε την FAK στην οποία έχει αντικατασταθεί η τυροσίνη 397 µε φαινυλαλανίνη, γεγονός που σηµαίνει ότι η PTEN µπορεί να στοχεύει σε αυτή την σηµαντική ρυθµιστική θέση της FAK για αποφωσφορυλίωση (Tamura et al. 1999). Όµως, τα παραπάνω δεδοµένα δεν είναι γενικά αποδεκτά αφού άλλες µελέτες δεν τα επιβεβαιώνουν (Liliental et al. 2000, Sun et al. 1999), κατά συνέπεια η FAK δεν πρέπει να αποτελεί κύριο υπόστρωµα για την PTEN. Τέλος, είναι ενδιαφέρον να επισηµανθεί ότι η PTEN ρυθµίζει την µεταγωγή σηµάτων διαµέσου ενός από τους downstream τελεστές της FAK δηλαδή της PI3K. Συγκεκριµένα, η PTEN µπορεί µε την ενεργότητα της ως φωσφατάση πρωτεϊνών για να αποφωσφορυλιώνει την FAK, αναστέλλοντας µε αυτόν τον τρόπο την PI3k, ενώ µε την ενεργότητα της ως φωσφατάση λιπιδίων µπορεί να εξουδετερώνει τα προϊόντα της PI3k όταν παράγονται (Εικόνα 56). Με αυτόν τον τρόπο δηλαδή, η PTEN δρα ως ένας ισχυρός αναστολέας της µεταγωγής σηµάτων µέσω της PI3k κατά την εξαρτώµενη από τις ιντεγκρίνες κυτταρική προσκόλληση. Όσον αφορά την FAK το 87

94 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) γεγονός ότι φωσφορυλιώνεται σε πολλά αµινοξέα αυξάνει την πιθανότητα διαφορετικές φωσφάτασες τυροσίνης να είναι υπεύθυνες για την αποφωσφορυλίωση συγκεκριµένων θέσεων. Ο µηχανισµός αυτός της τόπο ειδικής αποφωσφορυλίωσης µπορεί να είναι ένας αποτελεσµατικός τρόπος για να ρυθµίζονται ορισµένες πλευρές της µεταγωγής σηµάτων µέσω FAK ανεξάρτητα από τις υπόλοιπες. Εικόνα 56. Επιδράσεις της φωσφατάσης PTEN στην ρύθµιση της κυτταρικής µετανάστευσης. Είναι γνωστά δυο κύρια µονοπάτια που ρυθµίζουν την κυτταρική µετανάστευση (τυχαία ή κατευθυνόµενη). Το πρώτο εµπλέκει την κινάση εστιακών προσκόλλησεων και το δεύτερο την ERΚ. Η Phospatase and tensin homologue (PTEN) είναι µια πρωτεΐνη µε πολλές πτυχές: (1) παρουσιάζει ενεργότητα φωσφατάσης τυροσίνης, η οποία αναστέλλει τις ενεργοποιήσεις των FAK και της Shc, (2) αναστέλει το µονοπάτι της PI3k αλληλεπιδρώντας µε τα PtdInsP 3, ρυθµίζοντας και στις δυο περιπτώσεις την κυτταρική µετανάστευση. Πρωτεολυτική Θραύση της FAK Εκτός των παραπάνω ένας εξίσου αποτελεσµατικός µηχανισµός λήξης της µεταγωγής σηµάτων µέσω της FAK είναι η πρωτεόλυση της FAK. Πρωτοπαρατηρήθηκε σε ινοβλάστες από έµβρυα κοτόπουλων οι οποίοι είχαν µετασχηµατιστεί από τα ογκογονίδια v-src ή myc (Fincham et al. 1995, Crouch et al. 1996). Στην συνέχεια η θραύση της FAK παρατηρήθηκε σε αρκετούς κυτταρικούς τύπους που είχαν εκτεθεί σε διαφορετικά ερεθίσµατα (Wen et al. 1997, Levkau et al. 1998, Cooray et al. 1996, Carragher et al. 1999, Van de Water et al. 1999, Chan et al. 1999). Στις παραπάνω περιπτώσεις η FAK πρωτεολύεται σε ένα µεγάλο αµινοτελικό θραύσµα kda, το οποίο στην συνέχεια κόβεται σε µικρότερα κοµµάτια, και σε ένα καρβοξυτελικό θραύσµα 35 kda. Χρησιµοποιώντας αναστολείς και in vitro cleavage assays, έχουν εµπλακεί αρκετές πρωτεάσες στην διάσπαση της FAK. Οι κασπάσες 3 και 7 έχουν αναγνωρισθεί ως κύρια ένζυµα που συµµετέχουν στη θραύση της FAK, ενώ η κασπάση 6 µπορεί να παίζει µικρότερο ρόλο (Gervais et al. 1998, Wen et al. 1997, Levkau et al. 1998). Σε άλλες περιπτώσεις εµπλέκεται η καλπαΐνη 88

95 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) ως η πρωτεάση που είναι υπεύθυνη για την θραύση της FAK (Carragher et al. 1999, Van de Water et al. 1999, Carragher et al. 2001) (Εικόνα 57). Εικόνα 57. Πρωτεόλυση της FAK από την καλπαΐνη. Η FAK µπορεί να διακριθεί σε τρεις περιοχές, µια αµινοτελική που προσδένεται στην κυτταροπλασµατική περιοχή της β υποµονάδας των ιντεγκρίνων και στην κυτταροπλασµατική περιοχή των υποδοχέων αυξητικών παραγόντων, µια κεντρική περιοχή µε ενεργότητα κινάσης τυροσίνης και µια καρβοξυτελική περιοχή η οποία περιέχει δυο πλούσιες σε προλίνη περιοχές και την FAT περιοχή η οποία αλληλεπιδρά µε τις πρωτεΐνες των εστιών προσκόλλησης, παξιλίνη και ταλίνη. A. Το ανέπαφο µόριο της FAK λειτουργεί ως συνδετήρας που διατηρεί την συνοχή των συµπλόκων προσκόλλησης και παράλληλα ενοποιεί µηνύµατα που προέρχονται από ιντεγκρίνες, αυξητικούς παράγοντες και την Src προς τους ενδότερους τελεστές του κυττάρου,όπως η PI3K και η ERK/MAPK. Β. Μελέτες έχουν δείξει ότι η καλπαΐνη πρωτεολύει την FAK σε ένα αµινοτελικό θραύσµα 95 kda περίπου και φυσικά το καρβοξυτελικό θραύσµα των 30 kda. Στην συνέχεια το µεγαλύτερο θραύσµα φαίνεται να µεταφέρεται κυτταροπλασµατικά από την περιφέρεια του κυττάρου µε συνέπεια να κόβεται σε µικρότερα τµήµατα µεγέθους 30 µε 40 kda. Έτσι, η πρωτεόλυση της καλπαΐνης προκαλεί την αποσύνδεση της FAT αλληλουχίας και της δεύτερης πλούσιας σε προλίνη περιοχής, από την αµινοτελική και την καταλυτική περιοχή της FAK. Συνεπώς, η καλπαΐνη καταστέλλει την ενεργότητα κινάσης της FAK στις εστίες προσκόλλησης και το µορίου δεν λειτουργεί ως πρωτεΐνη συνδετήρας. Τελικά, οι εστίες προσκόλλησης αποσυναρµολογούνται στα δοµικά στοιχεία τους και χάνεται η ικανότητα µεταγωγής σηµάτων από τις ιντεγκρίνες, τους αυξητικούς παράγοντες και την Src προς τους υποκείµενους τελεστές της κυτταρικής επικοινωνίας. Οι θέσεις που αναγνωρίζουν οι διάφορες πρωτεάσες πάνω στην FAK δεν είναι συντηρηµένες στους οργανισµούς. Επίσης, οι διαφορετικές πρωτεάσες επάγονται από διαφορετικά ερεθίσµατα για να πρωτεολύσουν την FAK. Παρόλα αυτά, όµως, το σπάσιµο του µορίου δίνει κοµµάτια παραπλήσιου µοριακού βάρους κάθε φορά. Ίσως, λοιπόν, η θέση στην οποία πραγµατοποιείται η διάσπαση του µορίου είναι περιοχή η οποία είναι εκτεθειµένη και ευαίσθητη στη πρωτεόλυση. Οι συνέπειες της θραύσης είναι να αποµακρυνθεί κατά κύριο λόγο η καταλυτική περιοχή της πρωτεΐνης από την FAT αλληλουχία µε αποτέλεσµα το ενζυµικό κοµµάτι της πρωτεΐνης να µην µπορεί να µεταφερθεί στα σηµεία όπου εντοπίζεται φυσιολογικά, και συνεπώς αναστέλλεται η µεταγωγή σηµάτων. Επίσης, έχει προταθεί ότι τα θραύσµατα της FAK µπορεί να 89

96 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) συµµετέχουν τυχαία σε µεταγωγή µηνυµάτων µε συνέπεια να επάγεται η στάση της προόδου του κυτταρικού κύκλου ή να επάγεται απόπτωση. Μεταγωγή σηµάτων µέσω της FAK (FAK Signaling) Όπως έχει ήδη αναφερθεί υπάρχουν αρκετά βιοχηµικά µονοπάτια που ενεργοποιούνται ή ρυθµίζονται από την FAK. Σε αυτά περιλαµβάνονται σηµατοδοτικά στοιχεία όπως η PI3K, η PLCγ και οι MAP κινάσες. Εκτός από αυτά, όµως, η FAK µεταφέρει µηνύµατα φωσφορυλιώνοντας (σε αµινοξέα τυροσίνης) πρωτεΐνες συνδετήρες σαν την παξιλίνη και την p130cas, οι οποίες στην συνέχεια στρατολογούν άλλα πρωτεϊνικά µόρια σε σύνθετα σύµπλοκα που οδηγούν στην ενεργοποίηση των κατάλληλων κυκλωµάτων λειτουργίας του κυττάρου. Από τα παραπάνω µονοπάτια ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η ενεργοποίηση των MAPK µέσω της FAK. FAK και MAP κινάσες Η FAK µπορεί να ενεργοποιήσει τα βιοχηµικά µονοπάτια των MAPK µε διάφορους µηχανισµούς. Ετσι όταν φωσφορυλιώνεται στην θέση Υ925 δηµιουργείται θέση πρόσδεσης για την πρωτεινη Grb2 η οποία σχηµατίζει σύµπλοκο µε την Sos (Grb2/Sos) για να ενεργοποιηθεί στην συνέχεια η Ras και το MAPK/ERK µονοπάτι (Schlaepfer et al. 1994). Επίσης η FAK φέρει θέση πρόσδεσης για την p130cas η οποία όταν φωσφορυλιωθεί επιφέρει την πρόσδεση των πρωτεϊνών συνδετήρων Crk και Nck. Οι τελευταίες µπορούν να αλληλεπιδράσουν µε την Sos για να ενεργοποιήσουν το µονοπάτι Ras/MAPK (δεύτερος µηχανισµός) (Schlaepfer et al. 1997). Τέλος, η FAK όταν ενεργοποιηθεί επάγει τη φωσφορυλίωση των τυροσινών της πρωτεΐνης Shc, η οποία µε τη σειρά της προσδένει την Grb2 και την Sos σε σύµπλοκο που αποτελεί ένα τρίτο µηχανισµό διέγερσης του µονοπατιού Ras/MAPK (Schlaepfer et al. 1997). Επιπρόσθετα, η προσκόλληση των κυττάρων µε τη χρησιµοποίηση των ιντεγκρινών επάγει την ενεργοποίηση του µονοπατιού της JNK MAPK. Η FAK, όπως είναι αναµενόµενο, κατέχει ένα σηµαντικό ρόλο και σε αυτό το µονοπάτι (Oktay et al. 1999, Igishi et al. 1999, Lebrun et al. 2000). Οµοίως και στην περίπτωση της JNK, η FAK µπορεί να χρησιµοποιηθεί ποικιλοτρόπως για την διέγερση του µονοπατιού. Έτσι, διακρίνει κανείς ενεργοποίηση δίχως τη συµµετοχή της καταλυτικής περιοχής 90

97 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) της FAK, ίσως σε αυτήν την περίπτωση να µεσολαβεί η παξιλίνη για την αλληλεπίδραση FAK-JNK. Άλλα υπάρχει και το ενδεχόµενο η FAK µέσω γεγονότων που σχετίζονται µε φωσφορυλιώσεις τυροσινών (π.χ. στρατολόγηση της p130cas) να προκαλεί την συγκρότηση συµπλόκων που ως τελικό αποτέλεσµα έχουν την ενεργοποίηση της JNK (p130cas/crk/dock180 Rac JNK) (Almeida et al. 2000) (Εικόνα 58). Εικόνα 58. Πολλαπλά σηµατοδοτικά µονοπάτια από την FAK συγκλίνουν στις MAP κινάσες (ERK και JNK). Πολλά µονοπάτια συνδέουν την FAK µε την ενεργοποίηση της ERK. (1) Η καρβοξυτελική περιοχή της FAK περιέχει µια θέση πρόσδεσης για το σύµπλοκο Grb2/Sos, (2) Φωσφορυλίωση τυροσίνης της Shc που επάγεται από την FAK προκαλεί την συγκρότηση του συµπλόκου Shc/Grb2/Sos, (3)η p130cas όταν φωσφορυλιωθεί δεσµεύει τις πρωτεΐνες συνδετήρες Crk και Nck. Έτσι δηµιουργούνται τα σύµπλοκα Nck/Sos και Crk/C3G. Οι πρωτεΐνες Sos και C3G ενεργοποιούν τις G πρωτεΐνες οι οποίες ενεργοποιούν µε την σειρά τους τις MAPKs. Επίσης, πολλά µονοπάτια οδηγούν µέσω της FAK στην ενεργοποίηση της JNK. Φωσφορυλίωση της p130cas οδηγεί στην συγκρότηση του Crk/Dock180 συµπλόκου το οποίο µέσω της Rac ενεργοποιεί την JNK. Τέλος, η JNK ενεργοποιείται από την αλληλεπίδραση µε το σύµπλοκο paxillin/pkl/pix. Τα δεδοµένα ωστόσο, που προκύπτουν από διάφορες εργασίες, όσον αφορά τον ρόλο της FAK στην ενεργοποίηση των MAPKs µετά από διέγερση των ιντεγκρινών, είναι πραγµατικά αντιφατικά. Υπό ορισµένες συνθήκες, η FAK αποτελεί κύριο ρυθµιστή της ενεργοποίησης των MAPKs κατά την διέγερση των ιντεγκρινών, ενώ σε άλλες περιπτώσεις επικρατούν αλλά σηµατοδοτικά µονοπάτια που διεγείρουν τις MAPK. Εξάλλου, είναι γνωστό ότι η ενεργοποίηση των MAPKs µπορεί να αποσυσχετιστεί από την φωσφορυλίωση (άρα και ενεργοποίηση) της FAK (Lin et al. 1997, Wary et al. 1996, Barberis et al. 2000). Ενώ, από την αντίθετη πλευρά, η έκφραση της FAK ενισχύει την ενεργοποίηση των MAPKs σε περιπτώσεις προσκόλλησης επιθηλιακών κυττάρων και η αναστολή της µεταγωγής σηµάτων της 91

98 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) FAK προκαλεί διακοπή στην ενεργοποίηση τους µετά από διέγερση των ιντεγκρινών στον ίδιο τύπο κυττάρων (Sanders et al. 2000). Γενικά, έχει προταθεί ότι η ανεξάρτητη από την FAK ενεργοποίηση των MAPKs είναι παροδική ενώ η περαιτέρω χρησιµοποίηση του εξαρτώµενου από την FAK µονοπατιού παράγει µια παρατεταµένη αντίδραση από τις MAP κινάσες. Τέλος, η FAK θεωρείται πως µετέχει ενεργά στην σύζευξη των µηνυµάτων που προέρχονται από τις ιντεγκρίνες µε αυτά που φθάνουν από τους διάφορους αυξητικούς παράγοντες ρυθµίζοντας έτσι την ενεργοποίηση των MAPKs. Συνεισφορά της FAK σε σηµαντικές βιολογικές αποκρίσεις του κυττάρου. FAK: ένας διακόπτης που ρυθµίζει πολλαπλά σηµατοδοτικά µονοπάτια Η φωσφορυλίωση της FAK που επάγεται από την ενεργοποίηση των ιντεγκρινών οδηγεί στο σχηµατισµό θέσεων φωσφοτυροσίνης όπου µπορούν να προσδεθούν πολλές κατηγορίες µορίων που συµµετέχουν σε διάφορα µονοπάτια µεταγωγής µηνυµάτων. Υπό αυτή την έννοια, η FAK µπορεί να παροµοιαστεί µε ένα διακόπτη από τον οποίο τροφοδοτούνται, δυνητικά, περισσότερα του ενός µονοπάτια µεταγωγής σηµάτων προς τον πυρήνα. Η ενεργοποίηση της FAK έχει ως άµεσο ή έµµεσο αποτέλεσµα την στρατολόγηση ενός πλήθους πρωτεϊνών που φέρουν χαρακτηριστικές SH2 και SH3 περιοχές. Όπως είναι γνωστό αυτές οι πρωτεΐνες αποτελούν µεσολαβητές για την µεταγωγή σηµάτων από την κυτταρική επιφάνεια προς τον πυρήνα και αντιστρόφως. Τα µονοπάτια που ξεκινούν ή χρησιµοποιούν την FAK ως απαραίτητο σκαλοπάτι σχετίζονται µε την κυτταρική κίνηση και µετανάστευση, την µεταγωγή σηµάτων µέσω των ιντεγκρινών και των αυξητικών παραγόντων, την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου αλλά και την κυτταρική επιβίωση. 92

99 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) FAK, Rho και η ρύθµιση της δυναµικής των εστιών προσκόλλησης. Οι υποθέσεις για το ρόλο της FAK στη συγκρότηση / αποσυγκρότηση των εστιών προσκόλλησης έχουν αλλάξει ολοκληρωτικά τα τελευταία χρόνια. Ενώ αρχικά θεωρούταν ότι η FAK συµµετέχει στην συγκρότηση των εστιών προσκόλλησης, τα πιο πρόσφατα αποτελέσµατα κλίνουν προς την άποψη πως η δράση της είναι µάλλον προς την αντίθετη κατεύθυνση δηλαδή της αποσυγκρότησης των εστιών προσκόλλησης (Fincham et al. 1995). Η θεωρία αυτή συµφωνεί εν µέρει µε αποτελέσµατα από fak-/- ινοβλάστες οι οποίοι παρουσίαζαν µεγαλύτερες εστίες προσκόλλησης σε σχέση µε εκείνες των φυσιολογικών (Ilic et al. 1995). Στις µέρες µας, η υπόθεση αυτή έχει επιβεβαιωθεί µε πειράµατα σύγχρονων τεχνικών στα οποία χρησιµοποιήθηκε η GFP-a-actinin προκειµένου να ανιχνευθεί η δυναµική των εστιών προσκόλλησης (Ren et al. 2000). Σε κύτταρα fak -/- αποδείχτηκε ότι οι εστίες προσκόλλησης παραµένουν ανέπαφες µε το πέρας του χρόνου, κατά συνέπεια από τα πειράµατα αυτά προκύπτει το συµπέρασµα ότι η FAK είναι ρυθµιστής της αποδιάταξης των εστιών προσκόλλησης. Μάλιστα, έχει προταθεί το µοντέλο στο οποίο η FAK ρυθµίζει (µειώνοντας) την ενεργότητα της Rho προκειµένου να ελεγχθεί η δυναµική των εστιών προσκόλλησης (Ren et al. 2000) (Εικόνα 59). Στην ίδια µελέτη Εικόνα 59. Η σχέση της FAK µε την Rho. Η Rho βρέθηκε ότι αναστολή της είναι ενεργή όταν φέρει προσδεµένο GTP και ανενεργή όταν βρίσκεται το GDP δεσµευµένο. ενεργότητας της Rho σε κύτταρα Παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίων προκαλούν την δέσµευση του GTP στην Rho, γεγονός που επάγει fak-/- δινεί φαινότυπο όµοιο µε τον την συσταλτικότητα του κυτταροσκελετού. Έτσι αγρίου τύπου κυττάρων. Αντίθετα, δηµιουργούνται ινίδια τάσης και εστίες προσκόλλησης ενώ προκαλείται και φωσφορυλίωση όταν η Rho παραµένει διαρκώς της FAK. Η FAK µε την σειρά της δεσµεύει µια GAP πρωτεΐνη, η οποία ονοµάζεται GRAF και η οποία ενεργοποιηµένη σε φυσιολογικούς προκαλεί υδρόλυση του GTP που είναι δεσµευµένο στην Rho. Τόσο η FAK όσο και η Src εµπλέκονται ινοβλάστες τότε φαινοτυπικά τα στην αναστολή της Rho κατά την κυτταρική προσκόλληση. Επίσης, υπάρχουν στοιχεία πως µια κύτταρα γίνονται fak-/-. Τα δεύτερη GAP, η RhoGAP αναστέλλει την Rho κατά δεδοµένα αυτά υποστηρίζουν ότι η την προσκόλληση. FAK ρυθµίζει την αναδιοργάνωση 93

100 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) των εστιών προσκόλλησης ελέγχοντας την ενεργότητα της Rho. Βεβαίως ο µηχανισµός µε τον οποίο η FAK αναστέλλει την Rho δεν είναι απόλυτα εξακριβωµένος, αλλά θα µπορούσε να περιλαµβάνει την πρωτεΐνη GRAF µε την οποία αλληλεπιδρά η FAK. Η GRAF είναι αναστολέας της Rho. Η Src εµπλέκεται επίσης στην αναστολή της ενεργότητας της Rho µετά την αλληλεπίδραση της µε τις ιντεγκρίνες (Arthur et al. 2000). Επιπλέον, η RhoGAP ενδέχεται να αναστέλλει την Rho κατά την προσκόλληση σε φιµπρονεκτίνη. Τέλος, άλλη µια GAP πρωτεΐνη που αλληλεπιδρά άµεσα µε το καρβοξυτελικό άκρο της FAK, µέσω περιοχών SH3, είναι η ASAP1. Η ενεργότητα της ASAP1 ρυθµίζει την δυναµική των εστιών προσκόλλησης (Randazzo et al. 2000, Liu et al. 2002). Εικόνα 60. Μοντέλο που περιγράφει το πολύ-πρωτεϊνικό σύµπλοκο µε βάση την FAK που οδηγεί στην δηµιουργία των εστιών προσκόλλησης. Η δηµιουργία των ινιδίων τάσης της ακτίνης και η συσταλτικότητα του κυττάρου σχετίζονται µε την δηµιουργία των εστιών επαφής και αυξηµένα επίπεδα των Rho-GTP. Οι Rho-GTPases έµµεσα ρυθµίζουν την φωσφορυλίωση της MLC (myosin light chain) ενεργοποιώντας την MLC κινάση και αναστέλλοντας τις MLC φωσφατάσες. Η επαγόµενη από την FAK αύξηση των επίπεδων των Rho µπορεί να πραγµατοποιηθεί µε πολλούς µηχανισµούς. Έτσι, µπορεί να υπάρξει η εξαρτώµενη από την ERK2 διαδικασία που ρυθµίζεται από το σύµπλοκο FAK-Src και η ανεξάρτητη από την ERK2 πορεία κατά την οποία η FAK αλληλεπιδρά µε την p190rhogef που επάγει την ενεργοποίηση της Rho ανταλλάσσοντας το δεσµευµένο GDP µε GTP. Τέλος, η φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της PIPKIγ συντελεί στην αλληλεπίδραση της ταλίνης µε τις ιντεγκρίνες µε αποτέλεσµα την συγκρότηση των εστιών προσκόλλησης. Ακόµα είναι γνωστό ότι η FAK δεν αλληλεπιδρά µονό µε GAPs αλλά και µε GEFs. Οι παράγοντες ανταλλαγής νουκλεοτιδίων διεγείρουν την ανταλλαγή του GDP µε GTP και διευκολύνουν έτσι την µετατροπή της Rho στην ενεργή της µορφή. H FAK έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά µε τις PDZ-RhoGEF και τις leukemia-associated RhoGEF αυξάνοντας την φωσφορυλίωση τους και ενεργοποιώντας έτσι έµµεσα την Rho (Chikumi et al. 2002). Επίσης, έχει αποδειχτεί µε ανοσοκατακρηµνίσεις και διυβριδικό σύστηµα ζύµης (two hybrid, coimmunoprecipitation) ότι η FAK συνδέεται 94

101 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) άµεσα µε την p190rhogef µε αλληλεπιδράσεις µέσω της FAT περιοχής της (Zhai et al. 2003). Αυτή η αλληλεπίδραση οδηγεί στην ενεργοποίηση της RhoA, στην δηµιουργία των ινιδίων τάσης και στην συγκρότηση εστιών προσκόλλησης (Van Horck et al. 2001). Άρα λοιπόν, η συσχέτιση και η φωσφορυλίωση των RhoGEFs από την FAK αποτελεί έναν άµεσο δρόµο για την ενεργοποίηση της RhoA (Εικόνα 60). FAK και κυτταρική κίνηση Είναι γνωστό από τα αρχικά πειράµατα που είχαν ως στόχο την FAK ότι η πρωτεΐνη αυτή ρυθµίζει την κινητικότητα των κυττάρων σε απόκριση προς τα εξωκυτταρικά σήµατα (haptotaxis). Η κύρια θέση αυτοφωσφορυλίωσης είναι απολύτως απαραίτητη για την ενίσχυση της κυτταρικής κίνησης (Owen et al. 1999, Sieg et al. 1999). Στη ρύθµιση της κίνησης σηµαντικό ρόλο παίζει και η Src διότι όπως έδειξε ο Sieg όταν σε ινοβλάστες fak-/- εκφραστεί εξωγενώς η FAK τότε ενισχύεται η κινητικότητα. Όµως αν συνεκφραστεί και ο αναστολέας της Src, δηλαδή η πρωτεϊνική κινάση Csk, µειώνεται η ικανότητα της FAK να προάγει την µετανάστευση των κυττάρων. Επιπλέον, η p130cas ως υπόστρωµα της FAK φαίνεται πως είναι απαραίτητο συστατικό του συµπλόκου που σχηµατίζεται από τις FAK-Src για την ρύθµιση της κυτταρικής µετανάστευσης (Klemke et al. 1998, Cary et al. 1998). Ακόµα, ως ρυθµιστές της κίνησης έχουν προταθεί και άλλες πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν µε την FAK και οι οποίες όταν αποκλείονται από το σύµπλοκο FAK- Src προκαλούν µείωση της κυτταρικής κινητικότητας. Σε αυτές τις πρωτεΐνες περιλαµβάνονται οι: PI3K (Reiske et al. 1999), Grb7 (Han et al. 2000). Επίσης, σε πολλά διαφορετικά συστήµατα χηµειόταξης έχει δειχτεί πως η FAK λειτουργεί ως ρυθµιστική πρωτεΐνη. FAK και κυτταρικός κύκλος Η FAK έχει υποστηριχτεί ότι λειτουργεί ως θετικός ρυθµιστής του κυτταρικού κύκλου. Υπέρέκφραση του µορίου µπορεί να αυξήσει την σύνθεση του DNA στους ινοβλάστες µετά από συνθήκες στέρησης θρεπτικών παραγόντων και διέγερση τους µε ορό (Zhao et al. 2000). Αντίθετα, µεταλλάγµατα της FAK στις ίδιες συνθήκες προκαλούν παύση της προόδου του κυτταρικού κύκλου (Zhao et al. 1997). Ο µηχανισµός, βεβαίως, µε τον οποίο επηρεάζει η FAK τον κυτταρικό κύκλο δεν είναι µέχρι σήµερα αποσαφηνισµένος αλλά θεωρείται ότι η FAK ελέγχει τα επίπεδα της 95

102 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) κυκλίνης D και του αναστολέα της κυκλινοεξαρτώµενης κινάσης, p21 (Zhao et al. 1997). FAK και απόπτωση Πολλά κύτταρα δέχονται από την εξωκυτταρική ύλη σήµατα κυτταρικής επιβίωσης. Αυτό σηµαίνει ότι όταν τα κύτταρα καλλιεργηθούν απουσία αυτών των σηµάτων τότε οδηγούνται στον προγραµµατισµένο κυτταρικό θάνατο ή διαφορετικά σε απόπτωση (ή anoikis) (Frisch et al. 1994). Έχει βρεθεί ότι η αναστολή της FAK µπορεί να επάγει την απόπτωση ενώ η υπέρέκφραση της FAK µπορεί να εµποδίσει την απόπτωση που επάγεται από διάφορους παράγοντες (Xu et al. 1998, Sonoda et al. 2000, Chan et al. 1999). Τα παραπάνω δεδοµένα υποστηρίζουν κάποιο ρόλο της FAK στη µεταγωγή σηµάτων επιβίωσης στα κύτταρα. Συγκεκριµένα, έχει υποστηριχτεί ότι τόσο η καταλυτική περιοχή της FAK όσο και η θέση της αυτοφωσφορυλίωσης, Υ397, αποτελούν απαραίτητα στοιχεία για τη διεκπεραίωση του αντίαποπτωτικού ρόλου της FAK (Frisch et al. 1996, Sonoda et al. 2000, Chan et al. 1999). Μάλιστα, στα MDCK κύτταρα η αλληλεπίδραση της FAK µε την PI3K αποδείχτηκε ότι αποτελεί προϋπόθεση για την αναστολή της απόπτωσης που επάγεται από την υπεριώδη ακτινοβολία (Chan et al. 1999). Σε άλλη κυτταρική σειρά έχει βρεθεί ότι η θέση Υ925, µέσω της οποίας αλληλεπιδρά η FAK µε την Grb2 και κατ επέκταση µε το µονοπάτι της Ras/ERK (MAPK), είναι σηµαντική στην αναστολή της απόπτωσης (Sonoda et al. 2000). Οι παραπάνω µελέτες στηρίζονται σε µεταλλάξεις της FAK. Επιπρόσθετα, ένας άλλος τρόπος προσέγγισης του φαινοµένου αποτελεί η χορήγηση ή έκφραση τµηµάτων της FAK τα οποία εµποδίζουν την άρτια µεταγωγή σηµάτων διαµέσου της FAK στα κύτταρα. Έτσι, υπερέκφραση υβριδικών πρωτεϊνών που φέρουν το καρβοξυτελικό τµήµα της FAK συνεπάγεται την επαγωγή απόπτωσης σε ινοβλάστες κουνελιού σε αντίθεση µε την περίπτωση που οι υβριδικές πρωτεΐνες φέρουν την αµινοτελική περιοχή (FRNK) της FAΚ (Ilic et al. 1998, Renshaw et al. 1999). Επίσης, στις ίδιες µελέτες υποστηρίζεται ότι και η αλληλεπίδραση της FAK µε την p130cas ενισχύει την αντιαποπτωτική δράση της FAK σε ινοβλάστες σε συνθήκες απουσίας ορού. Σε αυτήν την περίπτωση η στρατολόγηση και φωσφορυλίωση της p130cas οδηγεί στην ενεργοποίηση της JNK. Ακόµα φαίνεται ότι η µεταγωγή µηνυµάτων διαµέσου του µονοπατιού PI3K-Αkt αποκλειστικά δεν επαρκεί για την αναστολή της απόπτωσης (Ilic et al. 1998, Renshaw et al. 1999). Ένας εναλλακτικός µηχανισµός αναστολής της απόπτωσης από 96

103 Κινάση Εστιακής Προσκόλλησης (FAK) την FAK φαίνεται ότι σχετίζεται µε την ενίσχυση της ενεργότητας του NFκΒ που συνεπάγεται την έκφραση αναστολέων των κασπασών (ciap-1, ciap-2, X-IAP) άρα πιθανών αναστολέων της απόπτωσης (Sonoda et al. 2000, Deveraux et al. 1999). Συµπερασµατικά, λοιπόν, φαίνεται ότι η FAK συµµετέχει στην κυτταρική επιβίωση ως συνέπεια της κυτταρικής προσκόλλησης. Επιπλέον, θεωρείται σηµαντικό ότι η υπερέκφραση της FAK µπορεί να προστατεύσει τα κύτταρα από την απόπτωση που επάγεται από ποικίλα ερεθίσµατα. Βεβαίως, οι µηχανισµοί που χρησιµοποιούνται από την FAK για να υποστηριχτεί ο αντιαποπτωτικός της ρόλος δεν είναι ακόµα πλήρως αποσαφηνισµένοι, αλλά οι πληροφορίες µέχρι σήµερα είναι αρκετά σηµαντικές ώστε να θεωρείται η FAK ως στόχος για την δηµιουργία στρατηγικών αντιµετώπισης της επαγοµένης από την FAK κυτταρικής επιβίωσης σε πειραµατικά µοντέλα αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις όπως για παράδειγµα τον καρκίνο. 97

104 FAK και καρκίνος Ο ρόλος της κινάσης των εστιακών προσκολλήσεων (FAK) στον καρκίνο Όπως έχει ήδη τονιστεί, η FAK είναι ένας σηµαντικός διαµεσολαβητής της µεταγωγής σηµάτων από τους αυξητικούς παράγοντες και την εξωκυτταρική ύλη και κατά συνέπεια ρυθµιστής του κυτταρικού πολλαπλασιασµού, της κυτταρικής επιβίωσης και της µετανάστευσης. Με δεδοµένο ότι η ανάπτυξη των κακοηθειών συχνά περιλαµβάνει διαταραχές σε αυτές τις διαδικασίες είναι αναµενόµενο πως η ενεργότητα της FAK θα είναι τροποποιηµένη στα καρκινικά κύτταρα. Μελέτες αποδεικνύουν την συµµετοχή της FAK στο σχηµατισµό των όγκων και στη µετάσταση. Γενικεύοντας, φαίνεται πως η έκφραση της FAK είναι αυξηµένη σε πολλούς καρκινικούς τύπους, γεγονός που ερµηνεύεται σε µερικές περιπτώσεις µε την υπερέκφραση του γονιδίου της FAK, ενώ σε άλλες περιπτώσεις, ως αποτέλεσµα αύξησης του αριθµού των γονιδίων fak (Agochiya et al., 1999). Τα αποτελέσµατα προέρχονται κυρίως από ανοσοϊστοχηµικά πειράµατα και αναλύσεις ανοσοαποτυπωµάτων και έχουν δείξει αυξηµένα επίπεδα της έκφρασης της FAK σε καρκίνους του θυρεοειδούς αδένα, του προστάτη, του αυχένα, του εντέρου, του επιθηλίου της στοµατικής κοιλότητας και των ωοθηκών (McLean et al., 2005). Τα αυξηµένα επίπεδα της FAK σε πολλές περιπτώσεις συσχετίζονται µε µεταστάσεις και προχωρηµένα στάδια της ασθένειας, για αυτό τον λόγο και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (FAK) µπορούν να αποτελέσουν κατάλληλο δείκτη διάγνωσης (ή και πρόγνωσης) του καρκίνου. Βεβαίως, πρέπει να σηµειωθεί ότι έχουν παρατηρηθεί και καρκινικές καταστάσεις (π.χ. µεταστατικοί όγκοι ήπατος) που προτείνεται διαφορετικός ρόλος για την FAK (Ayaki et al., 2001). Συνεπώς, είναι πιθανό ο ρόλος της FAK να διαφέρει στους διαφορετικούς καρκινικούς τύπους ή στα διαφορετικά στάδια εξέλιξης της νόσου. Ρύθµιση της δράσης της FAK στα καρκινικά κύτταρα Αν και ο υποκινητής της FAK δεν έχει µελετηθεί εκτεταµένα, παρόλα αυτά, έχει βρεθεί ότι στον υποκινητή υπάρχουν διαθέσιµες θέσεις πρόσδεσης της όγκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53. Μάλιστα, στην ίδια έρευνα έγινε φανερό ότι η πρόσδεση της p53 στις θέσεις αυτές καταστέλλει την έκφραση της FAK (Golubovskaya et al., 2004). Έτσι, πιθανολογείται ότι η µεταγραφική αποσιώπηση 98

105 FAK και καρκίνος της FAK από την p53 µπορεί να ρυθµίζει την έκφραση της FAK σε φυσιολογικές καταστάσεις. Μένει όµως, να αποσαφηνιστεί κατά πόσο, µεταλλάξεις στο γονίδιο p53 συνεισφέρουν στην τροποποιηµένη έκφραση της FAK σε καρκινικούς φαινοτύπους. Εικόνα 61. Η κινάση των εστιακών προσκολλήσεων επηρεάζει την κυτταρική µετανάστευση µέσω µοριακών σηµατοδοτικών µονοπατιών. (a). Η επαγόµενη από τις ιντεγκρίνες φωσφορυλίωση της FAK προκαλεί την στρατολόγηση ενός αριθµού σηµατοδοτικών και δοµικών πρωτεϊνών, δηµιουργώντας το αρχικό σύµπλοκο των εστιών προσκόλλησης. Όταν φωσφορυλιωθεί από την Src η FAK θα λειτουργήσει ως πρωτεΐνη συνδετήρας στρατολογώντας τις ERK και καλπαΐνη στις εστίες προσκόλλησης. Έτσι, θα ενεργοποιηθεί η καλπαΐνη από την ERK µε συνέπεια την πρωτεόλυση συστατικών των εστιών προσκόλλησης όπως την ταλίνη ή ακόµα και την ίδια την FAK. Τελικά, οι εστίες προσκόλλησης θα αποδιοργανωθούν για να κινηθεί το κύτταρο (Franco et al., 2004, Carragher et al., 2003). Η FAK, επίσης, στρατολογεί την JNK στις εστίες προσκόλλησης η οποία θα φωσφορυλίωσει την παξιλίνη σε αµινοξέα σερίνης, γεγονός που προωθεί την αναδιοργάνωση των εστιών προσκόλλησης και την κυτταρική κίνηση συνολικά (Huang et al., 2003). (b). Η αναδιάταξη του κυτταροσκελετού της ακτίνης κατά την κυτταρική κίνηση σε δυσδιάστατα υποστρώµατα ελέγχεται από την οικογένεια των µικρών GTPασών, δηλαδή τις RHO, RAC, CDC42. Οι πρωτεΐνες αυτές ρυθµίζουν τον κύκλο πολυµερισµού/ αποπολυµερισµού της ακτίνης και την αποδιάταξη των ινιδίων τάσης της ακτίνης. Η FAK συµµετέχει σε αυτήν την συµπεριφορά ελέγχοντας είτε θετικά είτε αρνητικά τελεστές που δρουν πριν από τις GTPάσες. Φωσφοριλιώνοντας, λοιπόν, η FAK διάφορες GEFs των RHO επιτυγχάνεται αυξηµένη δράση της RHOA (Schlaepfer et al., 2004, Zhai et al., 2003, Chikumi et al., 2002). Αλλά, επίσης, η FAK αλληλεπιδρά και µε τις GAPs ελέγχοντας µε διαφορετικό τρόπο την ενεργότητα των πρωτεϊνών της RHO οικογένειας (Liu et al., 2002, Hildebrand et al., 1996). Επιπλέον, η FAK συνδέεται µε το πολυ-πρωτεϊνικό σύµπλοκο των CAS-CRK-DOCK180-ELMO που ενεργοποιεί την RAC1 (Brugnera et al., 2002). Τέλος, φωσφορυλίωση της N-WASP από την FAK τροποποιεί την υποκυτταρική της κατανοµή και την κυτταρική κινητικότητα, επηρεάζοντας ίσως την ικανότητα της N-WASP να επάγει πολυµερισµό της ακτίνης µέσω του συµπλόκου Arp2/3 (Wu et al., 2004). Όσον αφορά την φωσφορυλίωση των αµινοξέων της FAK έχει αναφερθεί ότι µπορεί να διαφέρει στους διάφορους καρκινικούς τύπους. Για παράδειγµα, σε ωοθηκικό ιστό η φωσφοτυροσίνη 397 της FAK εντοπίζεται στους διηθητικούς όγκους σε αντίθεση µε το φυσιολογικό επιθήλιο (Grisaru-Granovsky et al., 2004). Αύξηση στην φωσφορυλίωση της Y397 έχει επιβεβαιωθεί και από άλλες µελέτες σε διαφορετικούς καρκινικούς τύπους (McLean et al., 2005). Σύµφωνα µε την ανωτέρω λογική, η τροποποιηµένη φωσφορυλίωση των τυροσινών της FAK στους όγκους 99

106 FAK και καρκίνος µπορεί να συνεπάγεται διαφορετική υποκυτταρική κατανοµή, διαφορετική σηµατοδοτική λειτουργία του µορίου και συνολικά να δίνει γένεση στην καρκινική κυτταρική συµπεριφορά. εν υπάρχει αµφιβολία πως η FAK καταλαµβάνει µια σηµαντική θέση στο ρυθµιστικό σηµατοδοτικό δίκτυο της κυτταρικής µετανάστευσης και διήθησης. Η συνεισφορά της αφορά, κυρίως, τον δυναµικό έλεγχο της προσκόλλησης των κυττάρων, µέσω των ιντεγκρινών, στην εξωκυτταρική ύλη, τις συνδέσεις κύτταρων µε άλλα κύτταρα, συµπεριφορά εξαρτώµενη από τις καντερίνες και επίσης την οργάνωση των περιφερειακών δοµών ακτίνης (Schlaepfer et al., 2004, Parsons et al., 2000, Hsia et al., 2003). Η εικόνα 61α αναφέρει συνοπτικά τις αλληλεπιδράσεις της FAK µε άλλες πρωτεΐνες που έχουν ως αποτέλεσµα την συγκρότηση ή την αποδιοργάνωση των εστιών προσκόλλησης. Επιπρόσθετα, στην εικόνα 61β φαίνεται ότι η FAK συνεισφέρει στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, διαδικασία απαραίτητη για την φυσιολογική κυτταρική κινητικότητα. Όµως, επειδή έχει βρεθεί πως η FAK ρυθµίζει σηµαντικά την συµπεριφορά των επιθηλιακών κυττάρων σε ότι αφορά τις παραπάνω διαδικασίες (Ilic et al., 2004), µπορεί κανείς να υποθέσει ότι οποιαδήποτε σχετική ανωµαλία µπορεί να επηρεάσει προς την ανάπτυξη όγκων. Όσον αφορά την κυτταρική διήθηση (invasion), συµπεριφορά που έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον για την µελέτη του καρκίνου, θα πρέπει να αναφερθεί ότι τα κύτταρα συµπεριφέρνονται διαφορετικά όταν καλλιεργούνται σε τρισδιάστατο µέσο (3D matrix) ή σε υπόστρωµα 2 διαστάσεων. Αυτά τα ευρήµατα υποστηρίζουν ενδεχοµένως διαφορετικό ρόλο και για την FAK (Cukierman et al., 2001). Για να µεταναστεύσει ένα κύτταρο χρειάζεται την συντονισµένη δράση µέταλλοπρωτεϊνασών (MMPs) οι οποίες θα «καταστρέψουν» τα εµπόδια της εξωκυτταρικής ύλης (Εικόνα 62). Πρόσφατα, όµως, έχει αναφερθεί και µηχανισµός διήθησης κυττάρων δίχως την αναγκαιότητα της πρωτεόλυσης της ECM. Στους παραπάνω µηχανισµούς και ιδιαίτερα σε περιπτώσεις καρκινικών κυττάρων, ο ρόλος της FAK θεωρείται διαφορετικός σε κάθε µηχανισµό. Ειδικότερα, σε ότι αφορά την σχέση της FAK µε τις MMPs, έχει βρεθεί ότι µε αναστολή της FAK (είτε µε dominant negative µορφές της, είτε µε την χρήση αντινοηµατικού RNA) προκαλείται µείωση στην έκφραση των MMPs σε καρκινικά κύτταρα (Cukierman et al., 2001, Zhang et al., 2002, Shibata et al., 1998), γεγονός που συνδέει την FAK µε την καρκινόσχετιζόµενη αλλοίωση της εξωκυτταρικής ύλης από τις µεταλλοπρωτεϊνάσες (Εικόνα 100

107 FAK και καρκίνος Εικόνα 62. Μεταγωγή σηµάτων από την FAK επάγει την έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν τις µεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) (Hauck et al., 2002). Μόλις εκκριθούν οι MMPs πρωτεολύουν τα πρωτεϊνικά συστατικά της ECM και διευκολύνουν την κυτταρική διήθηση. Η διέγερση των γονιδίων των MMPs επάγεται από την JNK η οποία ενεργοποιείται από το σύµπλοκο FAK-CAS-CRK-DOCK180- ELMO-RAC. Η p130cas αλληλεπιδρά µε την φωσφοτυροσίνη Υ861 της FAK (Lim et al., 2004). 62) (διήθηση µεσεγχυµατικού τύπου, mesenchymal like invasion). Αντίθετα, φαίνεται ότι ο εναλλακτικός τρόπος διήθησης (αµοιβαδοειδούς τύπου διήθησ δεν εξαρτάται από ανάλογη συµπεριφορά της FAK. Αν όµως, οι διαφορετικοί καρκινικοί κυτταρικοί τύποι µπορούν να χρησιµοποιούν διαφορετικούς µηχανισµούς διήθησης, τότε ίσως µπορεί να επεξηγηθούν τα αντικρουόµενα αποτελέσµατα για την συµπεριφορά της FAK σε αυτές τις περιπτώσεις (Hsia et al., 2003, Lu et al., 2001). Από τη άλλη πλευρά, η συνοµιλία ανάµεσα στους διαφορετικούς τύπους προσκόλλησης, δηλαδή των ιντεγκρινικών εστιών προσκόλλησης και των συνδέσµων επαφής των κυττάρων που εξαρτώνται από τις καντερίνες, συµβάλλει καθοριστικά στην ισορροπία ανάµεσα στους δυο τύπους προσκόλλησης και θεωρείται ότι συνεισφέρει στην εξέλιξη του καρκίνου. Η FAK είναι γνωστό ότι αποτελεί διαµεσολαβητή αυτής της συνοµιλίας. Αναστέλλοντας την µεταγωγή σηµάτων διαµέσου της FAK ή ελλατώνοντας την έκφραση της µπορεί να προκληθεί είτε αύξηση των διακυτταρικών, µέσω των καντερινών, προσκολλήσεων ή ακριβώς το αντίθετο. Η υποκυτταρική σύσταση των πρωτεϊνών (χρονικά και τοπικά) και ο τύπος των καντερινών καθορίζει την τελική συµπεριφορά του κυττάρου (Yano et al., 2004). Ο Frisch και οι συνεργάτες του στα 1996, ήταν οι πρώτοι που συνέδεσαν την FAK µε την κυτταρική επιβίωση, αφού παρατήρησαν ότι η FAK µπορούσε να αποτρέψει τον κυτταρικό θάνατο των MDCK κυττάρων (από επιθήλιο νεφρού) που επαγόταν από την αποκόλληση από το υπόστρωµα (anoikis) (Frisch et al., 1996). Η αντιαποπτωτική συµπεριφορά της FAK σχετίζεται τόσο µε την φωσφορυλίωση στην θέση Y397 όσο και µε την δράση της FAK ως κινάσης. Επίσης, υπερέκφραση της FAK «σώζει» τα κύτταρα MDCK από κυτταρικό θάνατο που επάγεται από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία, µια ιδιότητα που αποδίδεται στην αλληλεπίδραση της FAK µε την p130cas (Chan et al., 1999). Επιπλέον, µελέτες στα HL60 κύτταρα έχουν 101

108 FAK και καρκίνος επιβεβαιώσει την σχέση της FAK µε την καταστολή της απόπτωσης (Sonoda et al., 2000). Ακόµα, πειράµατα µε στόχο την εξασθένιση της δράσης της FAK, είτε µε χρήση αντισωµάτων (Liu et al., 2002), είτε αντινοηµατικών ολιγονουκλεοτιδίων (Xu et al., 1996) ενισχύουν τις θεωρίες που υποστηρίζουν την αντιαποπτωτική δράση της FAK, αφού σε αυτές τις περιπτώσεις επάγεται απόπτωση. Η αναστολή, επίσης, της FAK φαίνεται να έχει συνεργατικά αποτελέσµατα µε την αναστολή της µεταγωγής σηµάτων από υποδοχείς αυξητικών παραγόντων (π.χ. EGF υποδοχέα) ή µε την ταυτόχρονη αναστολή της Src (Golubovskaya et al., 2002, 2003). Παρόλα αυτά, η ικανότητα της FAK να προστατεύει τα κύτταρα από απόπτωση διαφέρει στις διαφορετικές καρκινικές σειρές. Ωστόσο, εντυπωσιακό είναι το γεγονός ότι πιθανότατα η καταστολή της FAK εµποδίζει τις οδούς επιβίωσης µόνο σε κύτταρα κακοηθειών (McLean et al., 2005). Αντίστρωφα, η υπερέκφραση της FAK σε καρκινικά κύτταρα θεωρείται ότι συνεισφέρει στην επιβίωση των κυττάρων σε συνθήκες που φυσιολογικά θα οδηγούνταν σε αποπτωτικό θάνατο. Μάλιστα, προσφάτως, προτάθηκε από τους Kurenova et al. ότι η ικανότητα της FAK να καταστέλλει την απόπτωση προκύπτει από την πρόσδεση της πρωτεΐνης RIP (receptor-interacting protein) (Kurenova et al., 2004), που είναι ένα κύριο συστατικό του συµπλόκου των υποδοχέων θανάτου. Η FAK σύµφωνα µε τους συγγραφείς, θεωρείται ότι αποµακρύνει την πρωτεΐνη από το σύµπλοκο και κατά συνέπεια καταστέλλει την απόπτωση. Τέλος, έχει υποστηριχτεί ότι τα επίπεδα της FAK στα καρκινικά κύτταρα συµβάλλουν στην αντίδραση των κυττάρων στη χηµείοθεραπευτική αγωγή. (Recher et al., 2004). Σε ότι αφορά την αύξηση (growth) των κυττάρων έχει βρεθεί ότι η FAK µέσω της σηµατοδοτικής οδού ERK-MAPK συµβάλει σηµαντικά στην διατήρηση της αύξησης, τουλάχιστον ορισµένων καρκινικών κυττάρων (Aguirre et al., 2002). Τα παραπάνω επιβεβαιώνονται και από άλλες µελέτες που κάνουν αναφορά στην σχέση της FAK µε την Shc (Hecker et al., 2002) και την p120rasgap (Hecker et al., 2004). Μολονότι υπάρχουν αρκετά στοιχεία που εµπλέκουν την FAK µε τον καρκίνο, θα πρέπει, ωστόσο, να πραγµατοποιηθούν ακόµα περισσότερα πειράµατα για να καθοριστεί πλήρως ο ακριβής ρόλος της πρωτεΐνης στην καρκινογένεση και εξέλιξη της νόσου, µε δεδοµένο, ότι η συµπεριφορά του µορίου µπορεί να ποικίλει στους διαφορετικούς καρκινικούς τύπους. Στην εικόνα 63 συνοψίζεται η πιθανή συνεισφορά της FAK στην ανάπτυξη όγκων. Συνεκτιµώντας όλα τα παραπάνω 102

109 FAK και καρκίνος συµπεράσµατα, προκύπτει ότι πάνω στην FAK µπορεί να στηριχτεί µια αξιόλογη θεραπευτική αγωγή για την καταπολέµηση ή ακόµα και πρόληψη του καρκίνου (McLean et al., 2003). Προς αυτήν την κατεύθυνση κινούνται πολλές ερευνητικές οµάδες οι οποίες στοχεύουν σε πρώτη φάση, στην κατανόηση των µηχανισµών στους οποίους συµµετέχει η FAK σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Ενώ κατά δεύτερο λόγο επιχειρείται η αναστολή της δράσης της πρωτεΐνης είτε µε την χρήση φαρµακολογικών αναστολέων (αν και δεν έχουν γίνει «επίσηµα» γνωστές ουσίες που έχουν αυτή την ιδιότητα), είτε µε την χρήση αναστολέων που µπλοκάρουν τις SH2 και SH3 περιοχές του µορίου (δηλ. την λειτουργία του µορίου ως πρωτεΐνη συνδετήρας), ή τέλος µε την χρήση της τεχνολογίας RNAi (παρεµβολή RNA). Στόχος σε κάθε περίπτωση είναι να επιτευχθεί το θετικότερο αποτέλεσµα µε τη µικρότερη τοξικότητα για τα φυσιολογικά κύτταρα. Εικόνα 63. Μοντέλο της πιθανής συνεισφοράς της κινάσης των εστιακών προσκόλλήσεων στην ανάπτυξη του καρκίνου. Η φωσφορυλίωση της FAK από την Src όχι µόνο ρυθµίζει την ενεργότητα κινάσης του µορίου και την κατανοµή της αλλά επίσης και τον σχηµατισµό πολύπρωτεϊνικών συµπλόκων που εξαρτώνται από φωσφορυλιώσεις τυροσινών. Επίσης, ρυθµίζει τον σχηµατισµό εστιών προσκόλλησης που σχηµατίζονται από τις ιντεγκρίνες και τις καντερίνες αλλά και ελέγχει την κυτταρική κινητικότητα και διήθηση. Στο σχήµα απεικονίζεται η επαγωγή της διήθησης από την FAK, η οποία περιλαµβάνει την µεταγωγή σηµάτων πρώτα στην RAC1 και στην JNK, για να καταλήξει στις MMPs και στην πρωτεόλυση της ECM. Επιπλέον, η FAK φαίνεται να ρυθµίζει, εµποδίζοντας, την απόπτωση µετά από την µεταγωγή σηµάτων διαµέσου των ιντεγκρινών και των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων, αφού διατηρεί την κασπάση 3 ανενεργή. Αυτή η αντιαποπτωτική δράση της FAK επάγει τον σχηµατισµό και την εξέλιξη του όγκου σε πειραµατικό µοντέλο ποντικού (McLean et al., 2004). Τέλος φαίνεται και η συνεισφορά της FAK στην αύξηση των κυττάρων µέσω της RAS-MAPK οδού. 103

110 MAPKs Κινάσες ενεργοποιούµενες από µιτογόνα Σύστηµα MAPKs (Mitogen Activated Protein Kinases) κινασών Γενικά Η ενδοκυτταρική µεταβίβαση της πληροφορίας µετά τη δέσµευση των διαφόρων µηνυµατοφόρων µορίων στους υποδοχείς τους, γίνεται µέσω ενός δικτύου οδών µεταγωγής µηνυµάτων στο εσωτερικό του κυττάρου µε αποτέλεσµα την επαγωγή βιολογικής απόκρισης. Μάλιστα το δίκτυο αυτό είναι τόσο πολύπλοκο ώστε δίνει στο κύτταρο τη δυνατότητα να συνδυάζει πληροφορίες από διάφορες πηγές, να τις αξιολογεί και να ανταποκρίνεται κατάλληλα σε κάθε περίπτωση, µε σκοπό πάντα τον έλεγχο της συµπεριφοράς και την επιβίωσή του. Οι ΜΑΡ κινάσες ανακαλύφθηκαν στις αρχές της δεκαετίας του 1980 και από τότε διαδραµατίζουν σηµαντικό ρόλο στον τοµέα της µεταγωγής µηνυµάτων. Είναι ευρέως διαδεδοµένες στα ευκαρυωτικά κύτταρα και ρυθµίζουν θεµελιώδεις κυτταρικές διεργασίες όπως πολλαπλασιασµό, διαφοροποίηση, µετανάστευση, επιβίωση, κυτταροφαγία και απόπτωση. Οι ΜΑΡKs είναι κινάσες σερίνης-θρεονίνης που ενεργοποιούνται από ποικίλα ερεθίσµατα, όπως από: α) ορµόνες (ινσουλίνη) και αυξητικούς παράγοντες (επιδερµικός, ινοβλαστών και αιµοπεταλίων) µέσω υποδοχέων µε ενεργότητα κινάσης τυροσίνης, β) αυξητικές ορµόνες µέσω υποδοχέων κυτταροκινών, γ) πολυπεπτίδια (TGF-β-related) µέσω υποδοχέων µε ενεργότητα κινάσης σερίνης-θρεονίνης, δ) Κυτταροκίνες φλεγµονών της οικογένειας TNF και διάφορα περιβαλλοντικά στρες (οσµωτικό σοκ, ιονίζουσα ακτινοβολία, ισχαιµική βλάβη) µέσω υποδοχέων της οικογένειας των TNF υποδοχέων και ε) αγγειοδραστικά πεπτίδια (ενδοθηλίνη) µέσω διαµεµβρανικών υποδοχέων που συνδέονται µε G πρωτεΐνες στο κυτταροπλασµατικό τους τµήµα (Kyriakis et al. 1996, Herskowitz, 1995, Marshall 1995). Μια οδός µεταγωγής σήµατος µέσω ΜΑΡΚ αποτελείται από ένα πολύ συντηρηµένο σύστηµα τριών τύπων κινασών (MAPK module). Πρόκειται ουσιαστικά για µια αλληλουχία αντιδράσεων που οδηγούν στην ενεργοποίηση των ΜΑΡΚ. Ένα σύστηµα ΜΑΡΚ περιλαµβάνει µια κινάση της κινάσης της ΜΑΡΚ (ΜAPKKK), µια κινάση της ΜΑΡΚ (MAPKK) και µια ΜΑΡΚ (Cobb and Goldsmith 1995) (Εικόνα 64). 104

111 MAPKs Οι ΜΑΡΚ φωσφορυλιώνουν µόνο υποστρώµατα που περιέχουν προλίνη στη θέση Ρ +1. Για τις ERK1/2 (µέλη των ΜΑΡΚ) το γενικό µοτίβο είναι Pro-X-Ser/Thr- Pro (Alvarez et al. 1991). Η ενεργότητα των ΜΑΡΚ ρυθµίζεται µε διπλή φωσφορυλίωση µιας αµινοξικής αλληλουχίας γνωστής ως βρόγχος ενεργοποίησης (activation loop). H αλληλουχία Thr-X-Tyr στο βρόγχο ενεργοποίησης (όπου το Χ είναι αµινοξύ που εξαρτάται από τον τύπο της ΜΑΡΚ) είναι η θέση διπλής φωσφορυλίωσης που καταλύεται από την ειδική ΜΚΚ. Για τις ERK1/2 οι θέσεις φωσφορυλίωσης είναι οι Thr-183 και Tyr-185. Η διπλή φωσφορυλίωση των θέσεων αυτών οδηγεί σε τουλάχιστον 1000 φορές αύξηση της ειδικής ενεργότητας των ΜΑΡΚ (Widmann et al. 1999). Θα πρέπει να σηµειωθεί ότι οι ERK1/2 φωσφορυλιώνονται στην τυροσίνη πριν τη φωσφορυλίωση σε θρεονίνη. Οι φωσφορυλιωµένες όµως στην τυροσίνη πρωτεΐνες δεν είναι ενεργές και πρέπει να συσσωρευτούν προκειµένου να φθάσουν σε ένα επίπεδο συγκέντρωσης οπότε και µεταπίπτουν αµέσως στην ενεργή µορφή καθώς φωσφορυλιώνεται η θρεονίνη (Pearson et al 2001). Είναι αξιοσηµείωτο το ότι η αντικατάσταση της Thr-183 ή Tyr-185 από κάποιο όξινο αµινοξύ, όπως το γλουταµινικό οξύ, δεν οδηγεί σε ενεργοποίηση. Τα χαρακτηριστικά του βρόγχου ενεργοποίησης και η διπλή φωσφορυλίωση σε Thr και Tyr επάγουν αρκετές αλλαγές στη διαµόρφωση του πρωτεϊνικού µορίου οι οποίες δεν µπορούν να επαχθούν από το γλουταµινικό. Για το λόγο αυτό οι σηµειακές µεταλλάξεις στις ΜΑΡΚ δεν επάγουν την ενεργότητά τους. Φαίνεται λοιπόν ότι για τη ρύθµιση της ενεργότητας των ΜΑΡΚ απαιτείται το µοτίβο P-Thr-X-P-Tyr γεγονός που εξηγεί γιατί οι ΜΑΡΚ δεν έχουν ποτέ ταυτοποιηθεί ως ογκογονίδια όπως αναµένεται για πρωτεΐνες που ρυθµίζουν την κυτταρική αύξηση (Canagarajah et al. 1997). Τα βασικά στάδια µιας ΜΑΡΚ-οδού µεταγωγής σήµατος είναι: Ενεργοποίηση των ΜΚΚΚs: µε φωσφορυλίωση, αλληλεπιδρώντας µε µικρού µοριακού βάρους πρωτεΐνες που δεσµεύουν GTP (π.χ. οικογένεια των Ras ή Rho), µε αλλαγή της τοπογραφίας τους στο κύτταρο (π.χ. τοποθέτηση στη µεµβράνη), κ.ά. Ενεργοποίηση των ΜΚΚs: οι ΜKKΚs είναι κινάσες σερίνης-θρεονίνης οι οποίες όταν ενεργοποιηθούν, φωσφορυλιώνουν και ενεργοποιούν τις ΜKKs. Ενεργοποίηση των ΜΑΡΚs: οι ΜKΚs είναι κινάσες διπλής εξειδίκευσης καθώς αναγνωρίζουν και φωσφορυλιώνουν περιοχές Thr-X-Tyr στο µόριο 105

112 MAPKs των ΜΑΡΚ. Η διπλή αυτή φωσφορυλίωση στη θρεονίνη και τυροσίνη είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση των ΜΑΡΚ. Η ενεργοποίηση των ΜΑΡΚ απευθείας µε φωσφορυλίωση, απουσία ρυθµιστικής περιοχής, είναι ένα ιδιαίτερο χαρακτηριστικό των κινασών αυτών. Φωσφορυλίωση των υποστρωµάτων των ΜΑΡΚ: οι ΜΑΡΚ φωσφορυλιώνουν υποστρώµατα σε κατάλοιπα σερίνης και θρεονίνης. Η πλειοψηφία των υποστρωµάτων αυτών είναι µεταγραφικοί παράγοντες. Άλλα υποστρώµατα των ΜΑΡΚ είναι πρωτεϊνικές κινάσες, φωσφολιπάσες και πρωτεΐνες που σχετίζονται µε τον κυτταροσκελετό. Εικόνα 64. Στάδια ενεργοποίησης των MAPK. Οι ΜKΚΚ (ΜΑΡ kinase kinase kinase) ενεργοποιούνται: α) µε φωσφορυλίωση από κάποια κινάση, β) αλληλεπιδρώντας µε πρωτεΐνες που δεσµεύουν GTP ( π.χ. οικ. Ras, Rho) ή γ) µε αλλαγή της τοπογραφίας τους στο κύτταρο. Όταν ενεργοποιηθούν φωσφορυλιώνουν τις ΜKΚ και τις ενεργοποιούν. Οι ΜKΚ (ΜΑΡ kinase kinase) είναι κινάσες διπλής εξειδίκευσης καθώς φωσφορυλιώνουν σε κατάλοιπα θρεονίνης και τυροσίνης στο µόριο των ΜΑΡΚ. Η διπλή αυτή φωσφορυλίωση είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση των ΜΑΡΚ. Οι ΜΑΡΚ όταν ενεργοποιηθούν φωσφορυλιώνουν τα υποστρώµατά τους σε κατάλοιπα σερίνης/θρεονίνης. 106

113 MAPKs Οργάνωση και εξειδίκευση των ΜΑΡΚ οδών Ανάλυση του γονιδιώµατος στο Caenorhabditis elegans έχει αποκαλύψει µέχρι στιγµής 15 µέλη της οικογένειας των ΜΑΡ κινασών (Plowman et al. 1999). Στα θηλαστικά περίπου 20 ΜΑΡ κινάσες είναι γνωστές ενώ προβλέπεται ο αριθµός αυτός να αυξηθεί τα επόµενα χρόνια (Pearson et al 2001). Οι ΜKΚs αντιπροσωπεύονται µε τα λιγότερα µέλη στο σύστηµα των ΜΑΡΚ (έχουν βρεθεί 7 ΜΚΚs). Επιπλέον εµφανίζουν υψηλό βαθµό εξειδίκευσης για τα ΜΑΡΚ υποστρώµατά τους επιτρέποντας έτσι ελάχιστους συνδυασµούς του ΜKΚ-ΜΑΡΚ τµήµατος του ΜΑΡΚ συστήµατος. Αντίθετα οι 14 ταυτοποιηµένες ΜKΚΚs ποικίλλουν δοµικά. Έχουν διαφορετικές ρυθµιστικές περιοχές που δεν υπάρχουν στις MKKs ή τις MAPKs. Στις περιοχές αυτές ανήκουν αλληλουχίες πλούσιες σε προλίνη για δέσµευση SH3 περιοχών, θέσεις δέσµευσης για πρωτεΐνες που δεσµεύουν GTP, αλληλουχίες διµερισµού του τύπου φερµουάρ λευκίνης (leucine-zipper) και θέσεις φωσφορυλίωσης για κινάσες τυροσίνης ή σερίνης/θρεονίνης. Με τον τρόπο αυτό, οι ΜΚΚΚs ρυθµίζονται διαφορετικά από διάφορα σήµατα που προηγούνται και στη συνέχεια ρυθµίζουν εκλεκτικά τις MΚKs (Garrington and Johnson 1999). Οι περισσότερες, αν όχι όλες, οι ΜΚΚΚs δεν απαντούν σε περίσσεια, γεγονός που υποδηλώνει ότι το στάδιο ΜΚΚΚ-ΜΚΚ πολλαπλασιάζει το σήµα που λαµβάνεται από µια δεδοµένη ΜΚΚΚ (Pearson et al. 2001). Η ποικιλοµορφία των ρυθµιστικών περιοχών σε διαφορετικές ΜΚΚΚs προσδίδει στην οικογένεια των ΜΑΡΚ συστηµάτων την ευελιξία να αποκρίνονται σε µια ευρεία κλίµακα κυτταρικών ερεθισµάτων. Όµως αυτό που δίνει σε µια ΜΚΚΚ την ικανότητα να δρα εκλεκτικά σε µια ΜΑΡΚ οδό και ειδικότερα να φωσφορυλιώνει και να ενεργοποιεί διαφορετικές ΜΚΚs αποτελεί ένα εντελώς νέο και εξαιρετικά ενδιαφέρον πεδίο. Οι πρωτεΐνες επίσης φαίνεται ότι συµβάλλουν στην εξειδίκευση των ΜΑΡΚ οδών. Οι µικροί αυτοί παράγοντες δρουν ως µοριακοί συνοδοί (chaperones) επιτρέποντας τη δοµική σταθεροποίηση των κινασών, όπως έχει δειχθεί για τη Raf όπου η αλληλεπίδραση µε τις είναι απαραίτητη για τη σταθεροποίηση τόσο της ανενεργής κυτταροπλασµατικής µορφής όσο και της ενεργούς διαµόρφωσης (Hagemann & Rapp 1999). Οι πρωτεΐνες αυτές έχουν επιπλέον και ρυθµιστικές λειτουργίες καθώς δεσµεύονται σε πολλές πρωτεΐνες που είναι φωσφορυλιωµένες σε 107

114 MAPKs σερίνη αποτρέποντας έτσι την αποφωσφορυλίωσή τους από φωσφατάσες, την πρόσδεσή τους σε άλλους παράγοντες και την πιθανή τροποποίηση της ενεργότητάς τους. Μία άλλη λειτουργία των είναι η δράση τους ως πρωτεΐνες-σκαλωσιάς (scaffold). Μονοµερή µπορούν να αλληλεπιδρούν ως οµο- ή ετεροδιµερή µέσω της αµινοτελικής τους περιοχής δηµιουργώντας µια µορφή συνδετήρα ικανή να φέρει µαζί δύο παράγοντες σε ένα σύµπλεγµα (Hagemann & Rapp 1999). Συνοψίζοντας τα δεδοµένα για τις , είναι αναµφισβήτητο ότι οι πρωτεΐνες αυτές είναι σηµαντικές για τη λειτουργία των ΜΚΚΚ αφού µεσολαβούν για τις αλληλεπιδράσεις µε άλλες ρυθµιστικές πρωτεΐνες και ελέγχουν την ενδοκυτταρική τους τοποθέτηση. Οι πρωτεΐνες-σκαλωσιάς αυξάνουν το βαθµό εξειδίκευσης των οδών µεταγωγής µηνυµάτων και µπορούν να οδηγήσουν σε αποτελεσµατική ενεργοποίηση ορισµένων οδών ακόµα και σε µια περιορισµένη περιοχή του κυττάρου, δρουν όµως εις βάρος του πολλαπλασιασµού της έντασης του σήµατος. Αντιθέτως, αλληλεπιδράσεις κινασών που είναι σε αλληλουχία και δεν εµπεριέχουν πρωτεΐνες-σκαλωσιάς δίνουν Εικόνα 65. Το χαοτικό δίκτυο των ΜΚΚΚ, ΜΚΚ και ΜΑΡΚ που έχουν ταξινοµηθεί σε συγκεκριµένες ΜΑΡΚ οδούς. 108

115 MAPKs τη δυνατότητα πολλαπλασιασµού, θυσιάζοντας ίσως την εξειδίκευση. Και οι δύο αυτοί µηχανισµοί λειτουργούν παράλληλα, οδηγώντας σε διαφορετική ενεργοποίηση της ίδιας ΜΑΡΚ σε απόκριση διαφορετικών ερεθισµάτων (Hagemann & Blank 2001). Στο εικόνα 65 απεικονίζονται οι ΜΚΚΚ, ΜΚΚ και ΜΑΡΚ που έχουν ταξινοµηθεί σε συγκεκριµένες ΜΑΡΚ οδούς. Θα πρέπει όµως να σηµειωθεί ότι αλληλεπιδράσεις µεταξύ των οδών συµβαίνουν σε µεγάλο βαθµό, µε απώτερο σκοπό µια ολοκληρωµένη απόκριση. Σύµφωνα µε πάρα πολλές ενδείξεις, παρατηρείται αλληλοκάλυψη στην ειδικότητα των υποστρωµάτων µεταξύ των ΜΑΡΚ (Waskiewicz et al. 1997, Lewis et al. 1998). Ένα ακόµα χαρακτηριστικό των ΜΑΡΚ οδών είναι ότι σχηµατίζουν συµπλέγµατα τα οποία διευκολύνουν την ενεργοποίησή τους και επηρεάζουν την ενδοκυτταρική τους τοποθέτηση, την εξειδίκευση και τους στόχους τους. Αρκετά µέλη των ΜΚΚ περιέχουν θέσεις που φωσφορυλιώνονται από κινάσες άλλων οδών (Frost et al. 1997). Τέλος, ορισµένες ΜΚΚΚ ρυθµίζουν περισσότερες από µία ΜΑΡΚ οδούς ενώ ορισµένες οδοί ρυθµίζονται από αρκετές, διαφορετικές ΜΚΚKs. MAPK οδοί θηλαστικών Στα θηλαστικά έχουν ταυτοποιηθεί µέχρι σήµερα τέσσερα, τουλάχιστον, συστήµατα ΜΑΡΚs. Πρόκειται για το σύστηµα της ΜΑΡΚ ERK, το σύστηµα της ΜΑΡΚ JNK, το σύστηµα της ΜΑΡΚ P38 και το σύστηµα της ΜΑΡΚ ERK5. Τα συστήµατα των ΜΑΡΚs των θηλαστικών µετέχουν σε διάφορες αποκρίσεις των κυττάρων που αφορούν τον πολλαπλασιασµό και τη διαφοροποίηση, την προσαρµογή σε περιβαλλοντικά στρες, την απόπτωση, την κίνηση, την κυτταροφαγία, τον µεταβολισµό και την γονιδιακή έκφραση (Johnson et al. 2002). Οδός των κινασών που ρυθµίζονται από εξωκυτταρικά σήµατα (Extracellular signal Regulated Kinase, ERK1/2) Οι ERK 1 και 2 είναι πρωτεΐνες µοριακού βάρους 44kDa και 42kDa αντίστοιχα και εµφανίζουν οµολογία 85% στο σύνολο του µορίου, ποσοστό το οποίο αυξάνεται για τις περιοχές πρόσδεσης υποστρωµάτων (Boulton et al. 1991). Οι δύο θέσεις φωσφορυλίωσης, στην τυροσίνη και θρεονίνη, χωρίζονται από ένα αµινοξύ γλουταµινικού οξέος τόσο στην ERK1 όσο και στην ERK2 δηµιουργώντας το µοτίβο 109

116 MAPKs ΤΕΥ στο βρόγχο ενεργοποίησης. Αµφότερες εκφράζονται ευρέως µε το ποσοστό έκφρασης να ποικίλλει στους διαφορετικούς ιστούς. Οι ERK 1 και 2 ενεργοποιούνται από ένα ζεύγος ΜΕΚs (ΜΚΚ), τις ΜΕΚ 1 και 2. Και οι δύο αυτές ΜΕΚ µπορούν να ενεργοποιήσουν πλήρως τις ERK1/2 in vitro. Οι ΜΕΚ1/2 φωσφορυλιώνονται από µέλη των ΜΕΚΚs (ΜΚΚΚ) και συγκεκριµένα από ισοµορφές Raf και Mos. Μάλιστα, οι πρωτεΐνες αυτές φωσφορυλιώνουν αποκλειστικά τις ΜΕΚ1/2 γεγονός που τις εντάσσει στην ERK1/2 οδό (Kyriakis et al. 1992). Η οικογένεια των Raf κινασών αποτελείται από την Α-Raf, τη Β- Raf και τη Raf-1 ή c- Raf. Οι περισσότερες µελέτες έχουν εστιαστεί στη Raf-1. Η ρύθµιση της κινάσης αυτής είναι σύνθετη καθώς αφορά πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, φωσφορυλίωση σε τυροσίνη, σερίνη και θρεονίνη και κατάλληλη ενδοκυτταρική τοποθέτηση (Morrison & Cutler 1997). Αυτοί οι πολλαπλοί τρόποι ρύθµισης επιτρέπουν στη Raf-1 να κυµαίνεται µεταξύ διαφόρων επιπέδων ενεργοποίησης. Ίσως η καλύτερα χαρακτηρισµένη ERK1/2 οδός είναι αυτή που περνά µέσω υποδοχέων µε ενεργότητα κινάσης τυροσίνης. Η δέσµευση του κατάλληλου προσδέµατος στους υποδοχείς αυτούς έχει ως αποτέλεσµα αύξηση της καταλυτικής τους ενεργότητας και ακολούθως αυτοφωσφορυλίωση σε τυροσίνες. Η φωσφορυλίωση των υποδοχέων αυτών οδηγεί στο σχηµατισµό πολυπρωτεϊνικών συµπλεγµάτων, η οργάνωση των οποίων καθορίζει τα µετέπειτα σήµατα (Εικόνα 66). Εικόνα 66. Η ενεργοποίηση των ERK MAP κινασών. Η διέγερση των υποδοχέων των αυξητικών παραγόντων οδηγεί στην ενεργοποίηση των µικρών GTPασών Ras, οι οποίες αλληλεπιδρούν µε την πρωτεϊνική κινάση Raf. Η Raf φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την MEK η οποία ενεργοποιεί την ERK φωσφορυλιώνοντας την σε αµινοξέα θρεονίνης (Thr-183) και τυροσίνης (Tyr-185). Η ενεργοποιηµένη ERK θα φωσφορυλιώσει στην συνέχεια µια ποικιλία πυρηνικών και κυτταροπλασµατικών πρωτεϊνών στόχων. 110

117 MAPKs Πολύ συχνά το αποτέλεσµα είναι η ενεργοποίηση µιας µονοµερούς G πρωτεΐνης, της Ras. Αυτό επιτυγχάνεται µε συνάθροιση στον υποδοχέα διαφόρων πρωτεϊνών-συνδετήρων, όπως η Shc και η Grb2, λόγω των αλληλεπιδράσεων των SH2 περιοχών τους µε φωσφοτυροσίνες. Τότε ο παράγοντας ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης, Sos (Son of Sevenless), εισέρχεται στο σύµπλεγµα, καθώς βρίσκεται διαρκώς δεσµευµένος µε την SH3 περιοχή της Grb2, επάγοντας την ανταλλαγή του GDP της Ras µε GTP στην πλασµατική µεµβράνη. Η Ras δεσµευµένη πλέον µε GTP αλληλεπιδρά άµεσα µε διάφορους τελεστές όπως ισοµορφές της Raf µε καλύτερα χαρακτηρισµένη τη Raf-1. Η δέσµευση της Ras στη Raf οδηγεί είτε σε αλλαγές της στερεοδιαµόρφωσης της Raf οι οποίες αυξάνουν την ενεργότητά της ως κινάση, είτε απλά δηµιουργεί το κατάλληλο περιβάλλον για τη µεταγωγή µηνυµάτων από τη Raf-1 (Moodie et al. 1993, Jelinek et al. 1996). Η τοποθέτηση της Raf στην πλασµατική µεµβράνη επιτρέπει επίσης σε πρωτεϊνικές κινάσες, όπως η Src και η PKC, να τροποποιούν περαιτέρω τη Raf ώστε να αυξηθεί η ενεργότητά της (Dent et al. 1995, Diaz et al. 1997). H αύξηση αυτή µεταβιβάζεται στη συνέχεια µέσω των ΜΕΚ-ERK. Η µεταγωγή µηνυµάτων στις ERKs µέσω GPCRs (υποδοχείς συνδεδεµένοι µε G πρωτεΐνες) είναι επίσης άρρηκτα συνδεδεµένη µε τροποποίηση της ενεργότητας της Raf. Παρόλα αυτά οι µηχανισµοί που χρησιµοποιούνται από τους συγκεκριµένους υποδοχείς ποικίλλουν. Η πολυπλοκότητα των GPCRs, η διαφορετική αλληλεπίδρασή τους µε ετεροτριµερείς ισοµορφές G πρωτεϊνών, η ικανότητα ορισµένων υποδοχέων να ενεργοποιούν περισσότερες από µία τάξεις G πρωτεϊνών και οι κυτταρο-ειδικοί µηχανισµοί συµβάλλουν σε αυτή την εκπληκτική ποικιλότητα (Belcheva & Coscia 2002). Οι µεγάλου µοριακού βάρους G-πρωτεΐνες αποτελούνται από 3 υποµονάδες α, β και γ, οι οποίες είναι συνδεδεµένες µε την εσωτερική πλευρά της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης. Στην ανενεργή κατάσταση, η α υποµονάδα φέρει δεσµευµένο GDP και είναι χαλαρά συνδεδεµένη στο διµερές των β και γ υποµονάδων. Στις περισσότερες οδούς που έχουν µελετηθεί, οι β και γ υποµονάδες είναι αυτές που φαίνεται να εµπλέκονται στη µεταγωγή µηνυµάτων (Koch et al. 1994). Σύµφωνα µε ένα προτεινόµενο µοντέλο, οι β και γ ενεργοποιούν µέλη της οικογένειας Src µέσω της ΡΙ-3 κινάσης (Lopez-Ilasaca et al. 1997). Η Src µπορεί τότε να φωσφορυλιώσει την PyK2 ή τη FAK δηµιουργώντας SH2 θέσεις πρόσδεσης (Della rocca et al. 1999). Στη συνέχεια, ανάλογα µε το µηχανισµό που 111

118 MAPKs χρησιµοποιείται από τους υποδοχείς µε ενεργότητα κινάσης τυροσίνης, σχηµατίζεται στη µεµβράνη ένα σύµπλεγµα που περιλαµβάνει τις Shc, Grb2 και Sos, το οποίο ενεργοποιεί τη Ras και ακολούθως τη Raf-1. Σε κυτταρικούς τύπους που η έκφραση της ΡΙ-3 κινάσης είναι µικρή, η ενεργοποίηση της ERK εξαρτάται από εναλλακτικές οδούς ενεργοποίησης του συµπλέγµατος FAK/Src (Dikic et al. 1996) (Εικόνα 67). Εικόνα 67. Σχηµατική απεικόνιση της ERK1/2 MAPK οδού µεταγωγής σηµάτων µε συµβολή στην αύξηση και στην διαφοροποίηση των κυττάρων. p38 οδός Η p38 αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά το 1994 ως MAP κινάση-στόχος της ενδοτοξίνης και της υπερωσµωτικότητας στα κύτταρα των θηλαστικών (Han et al. 1994). Λίγο αργότερα, αναφέρθηκε ότι το αποτέλεσµα της κλωνοποίησης του στόχου ενός αντί-φλεγµονώδους φαρµάκου (SB203580), ήταν ταυτόσηµο µε την p38 και ονοµάστηκε CSBP (Lee et al. 1994). Η κινάση αυτή παρουσιάζει µεγάλη οµοιότητα αλληλουχίας µε την κινάση HOG1 του Saccharomyces cerevisiae που συµµετέχει στην προστασία του κυττάρου από το υπερωσµωτικό στρες (Brewster et al. 1993). Πολλαπλοί τύποι κυτταρικού στρες βρέθηκε να ενεργοποιούν τις p38 των 112

119 MAPKs θηλαστικών (υπεριώδης ακτινοβολία, οσµωτικό σοκ, θερµικό σοκ, λιποπολυσακχαρίτης, αναστολείς της σύνθεσης πρωτεϊνών). Επίσης, στην ενεργοποίηση των p38 MAP κινασών συµµετέχουν ορισµένες κυτταροκίνες (IL-1, TNF-α), ορµόνες και υποδοχείς συνδεόµενοι µε G πρωτεΐνες (Widmann et al. 1999). Ενώ άλλες µεταγενέστερες µελέτες πρότειναν την συµµετοχή των p38 όχι µόνο στις αντιδράσεις φλεγµονής αλλά επίσης στην επαγόµενη από στρες µεταγωγή µηνυµάτων, στον κυτταρικό πολλαπλασιασµό καθώς και στην απόπτωση (Johnson et al. 2002). Η οδός αυτή αποτελείται από τουλάχιστον 4 διαφορετικές οµόλογες πρωτεΐνες, την p38α, την p38β, την p38γ και την p38δ (Wang et al. 1999, Zerbos et al. 1995). Και οι 4 κινάσες περιέχουν το µοτίβο ΤGY (G = γλυκίνη) στο βρόγχο ενεργοποίησης. Οι p38 ΜΑΡ κινάσες ενεργοποιούνται από δύο ΜΕΚ, τη ΜΕΚ3 και ΜΕΚ6. Η ΜΕΚ3 φωσφορυλιώνει κατά προτίµηση τις ισοµορφές p38α και p38β ενώ η ΜΕΚ6 όλα τα µέλη της οικογένειας p38. Και οι δύο µπορούν να φωσφορυλιώσουν ισοµορφές JNK/SAPK (Enslen et al. 2000). Σε όλες σχεδόν τις περιπτώσεις οι διεγέρσεις που ενεργοποιούν τις JNK/SAPK, ασκούν την ίδια δράση και στις p38s (Johnson et al. 2002, Kyriakis et al. 1996). Εικόνα 68. ίκτυο των οδών ενεργοποίησης του συστήµατος p38 που οδηγούν σε παραγωγή κυτταροκινών και απόπτωση. 113

120 MAPKs JNK/SAPK (c-jun N - terminal protein kinases) οδός Η JNK/SAPK αποµονώθηκε αρχικά ως µια 54 kda MAPK. Στη συνέχεια ανακαλύφθηκαν άλλες δύο ισοµορφές 46 και 54 kda (Hibi et al. 1993). Αποµόνωση των cdnas των πρωτεϊνών αυτών και ανάλυση της έκφρασής τους αποκάλυψε τρία γονίδια από τα οποία µε εναλλακτικό µάτισµα προκύπτουν 10 τουλάχιστον ισοµορφές (Tibbles & Woodgett 1999) (Εικόνα 69). Εντός της καταλυτικής περιοχής η οµολογία των JNK1/SAPKγ, JNK2/SAPKα και JNK3/SAPKβ αγγίζει το 85%. Φωσφορυλιώνονται σε δύο θέσεις, µία σε τυροσίνη και µία σε θρεονίνη οι οποίες χωρίζονται από µια προλίνη, σχηµατίζοντας έτσι το µοτίβο ΤΡΥ στο βρόγχο ενεργοποίησης. Ενεργοποιούνται από κυτταροκίνες, προσδέµατα GPCRs, παράγοντες που εµπλέκονται στη σύνθεση DNA και πρωτεϊνών, παράγοντες στρες κ.ά. Εικόνα 69. Σχηµατική παράσταση των τριών γονιδίων που κωδικοποιούν τις JNK MAPK. Οι JNK/SAPK ενεργοποιούνται από τις ΜΕΚ4 και 7. Οι ΜΕΚ4/7 έχουν την ικανότητα να φωσφορυλιώνουν και µέλη της οικογένειας των p38 όµως οι JNK/SAPK φαίνεται να είναι τα επικρατέστερα υποστρώµατα (Pearson et al. 2001). Από in vitro µελέτες προκύπτει ότι η ΜΕΚ4 προτιµά τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης στο ΤΡΥ µοτίβο του βρόγχου ενεργοποίησης ενώ η ΜΕΚ7 της θρεονίνης. Με βάση αυτό το δεδοµένο, έχει προταθεί ότι οι κινάσες αυτές συνεργάζονται ώστε να ενεργοποιήσουν τις JNK/SAPK (Lawler et al. 1998, Lisnock et al. 2000). Μάλιστα για την JNK3, τα αποτελέσµατα δείχνουν ότι η φωσφορυλίωση στη θρεονίνη ίσως είναι η πιο σηµαντική για την ενεργότητά της (Lisnock et al. 2000). Αναλύσεις για την ενεργότητα της JNK στα θηλαστικά, απoκάλυψαν ότι, σε αντίθεση µε την ERK(1/2) MAPK, στα περισσότερα κύτταρα που εξετάσθηκαν, η JNK δεν 114

121 MAPKs ενεργοποιείται από µιτογόνους παράγοντες όπως EGF, PDGF και FGF. Αντίθετα, η JNK ενεργοποιείται ισχυρά από µια µεγάλη ποικιλία βλαπτικών για τα κύτταρα παραγόντων. Τέτοιοι παράγοντες ήταν κυτταροκίνες της οικογένειας TNF (Tumour Necrosis Factor) όπως ιντερλευκίνη1 (IL1), CD40-ligand, CD27-ligand, Fas ligand και άλλοι, το κυτταρικό στρες, όπως θερµοκρασιακό ή υπερωσµωτικό σοκ, η UV ακτινοβολία, το ισχαιµικό σοκ, τα αγγειοδραστικά πεπτίδια όπως η ενδοθηλίνη και αγγειοτενσίνη II (ANGII), το ριβοτοξικό στρες που προκαλείται από την ανισοµικίνη και τη παλιτοξίνη (Iordanov et al 1998, Kallunki et al. 1998, Matsuda et al. 1997, Silapiro et. al. 1996, Miden et al., 1994). Τέλος, η ενεργοποίηση της JNK έχει δειχθεί ότι σχετίζεται µε τον προγραµµατισµένο κυτταρικό θάνατο ή την απόπτωση (Johnson et al. 2002, Tournier et al. 2000) (Εικόνα 70). Εικόνα 70. ίκτυο οδών ενεργοποίησης του συστήµατος JNK που οδηγεί σε µεταγραφή παραγόντων αύξησης, διαφοροποίησης, επιβίωσης και απόπτωσης. 115

122 MAPKs Άλλες ΜΑΡ κινάσες ERK3 Πρόκειται για δύο ισοµορφές µοριακού βάρους 63 kda οι οποίες εµφανίζουν στην καταλυτική περιοχή οµολογία 50% µε τις ERK1/2. Παρά την οµοιότητα αυτή όµως οι ERK3 έχουν κάποια ιδιαίτερα χαρακτηριστικά. Για παράδειγµα διαθέτουν µία µόνο θέση φωσφορυλίωσης, τη σερίνη 189, στην αλληλουχία SEG όπου η γλυκίνη έχει αντικαταστήσει την τυροσίνη που συνήθως έχουν οι ΜΑΡ κινάσες. Μάλιστα για τη µία ισοµορφή έχει βρεθεί ότι µπορεί να αυτοφωσφορυλιωθεί και ότι η συγκέντρωσή της είναι αυξηµένη στον πυρήνα σε αντίθεση µε τις άλλες ΜΑΡΚ οι οποίες εντοπίζονται στο κυτταρόπλασµα και µετακινούνται στον πυρήνα µετά από ενεργοποίηση του κυττάρου (Cheng et al. 1996, Pearson et al. 2001). ERK5 Λόγω του µεγάλου µεγέθους της, η ERK5 ονοµάζεται και Big MAPK (BMK, µεγάλη ΜΑΡΚ). Η πρωτοταγής δοµή της καταλυτικής περιοχής της ERK5 εµφανίζει µεγαλύτερη οµοιότητα µε την αντίστοιχη της ERK2. Η έκφρασή της στα θηλαστικά είναι ευρύτατη και όπως οι άλλες ΜΑΡΚ, η ρύθµισή της υπόκειται σε µια ποικιλία παραγόντων πολλαπλασιασµού (αυξητικοί παράγοντες, φορβολικοί εστέρες) και κυτταρικού στρες (σορβιτόλη, Η 2 Ο 2, ακτινοβολία UV κ.α.). Η ERK5 ενεργοποιείται από τη ΜΕΚ5 και µάλιστα αποτελεί το µόνο γνωστό υπόστρωµά της. Βάση πρωτοταγούς δοµής, η ΜΕΚ5 σχετίζεται περισσότερο µε τις ΜΕΚ1 και 2. Ως συνέπεια αυτής της σύνδεσης, η ERK5 αναστέλλεται από τους PD98059 και U0126, δύο πολύ εξειδικευµένους αναστολείς των ΜΕΚ1/2 (Kamakura et al. 1999). Πάντως η ΜΕΚ5 δε φωσφορυλιώνεται και δεν ενεργοποιείται από τη Raf-1 όπως οι ΜΕΚ1/2. ERK7 Η ERK7 είναι µια ΜΑΡ κινάση 61 kda, µε µοτίβο ΤΕΥ στο βρόγχο ενεργοποίησης, ακριβώς όπως οι ERK1, ERK2 και ERK5. Εµφανίζει υψηλή βασική ενεργότητα και θεωρείται ότι µετέχει στην αναστολή της ανάπτυξης (Abe et al. 1999). 116

123 MAPKs Απενεργοποίηση των ΜΑΡΚ Η διάρκεια και ένταση της ενεργοποίησης των ΜΑΡΚ εξαρτάται από τους µηχανισµούς απενεργοποίησης. Όπως έχει ήδη επανειληµµένως αναφερθεί, η ενεργότητα των ΜΑΡΚ ρυθµίζεται µέσω της φωσφορυλίωσης αµινοξέων τυροσίνης και θρεονίνης στο βρόγχο ενεργοποίησης. Η αποµάκρυνση της φωσφορικής ρίζας από τη µία ή και τις δύο αυτές θέσεις από φωσφατάσες τυροσίνης, σερίνης/θρεονίνης ή διπλής εξειδίκευσης, µειώνει δραστικά την ενεργότητα των ΜΑΡΚ. Η εξειδίκευση των φωσφατασών αυτών καθορίζεται σε σηµαντικό βαθµό από την ενδοκυτταρική τους τοποθέτηση. Μέχρι στιγµής έχουν ταυτοποιηθεί αρκετές φωσφατάσες διπλής εξειδίκευσης γνωστές και ως φωσφατάσες των MAPK (MAP kinase phosphatases: ΜΚΡs) οι οποίες διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: α) αυτές που κωδικοποιούνται από γονίδια τα οποία επάγονται µε στρες ή αυξητικούς παράγοντες και εντοπίζονται κυρίως στον πυρήνα και β) αυτές που εντοπίζονται στο κυτταρόπλασµα και δεν υπόκεινται σε µεταγραφική ρύθµιση (Pearson et al. 2001). Υποστρώµατα των ΜΑΡΚ Οι ΜΑΡΚ φωσφορυλιώνουν υποστρώµατα σε σερίνες και θρεονίνες που ακολουθούνται από προλίνη. Η προλίνη στη θέση Ρ+1 είναι αναγκαία αλλά όχι µοναδική προϋπόθεση για την ταυτοποίηση ενός υποστρώµατος των ΜΑΡΚ. Φαίνεται ότι υπάρχουν εκτεταµένες περιοχές αλληλεπίδρασης οι οποίες προάγουν την αναγνώριση του υποστρώµατος. Ιδιαίτερα για τις ERK1/2, τα υποστρώµατά τους περιέχουν συχνά προλίνη και στη θέση Ρ-2, δηλαδή, µοτίβο ΡΧ(T/S)P. Οι γνώσεις µας για τις λειτουργίες των ΜΑΡΚ συνέχεια επεκτείνονται καθώς διαρκώς ανακαλύπτονται νέα κυτταρικά υποστρώµατα. Οι ΜΑΡΚ έχουν ως στόχους µεµβρανικές πρωτεΐνες όπως η φωσφολιπάση Α 2, κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες όπως πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού και πυρηνικές πρωτεΐνες όπως µεταγραφικούς παράγοντες. Πυρηνικά υποστρώµατα Οι ΜΑΡΚ επηρεάζουν τη γονιδιακή έκφραση φωσφορυλιώνοντας µεταγραφικούς παράγοντες είτε άµεσα είτε ενεργοποιώντας άλλες πρωτεϊνικές 117

124 MAPKs κινάσες (Rsk, Mnk) οι οποίες φωσφορυλιώνουν πρωτεΐνες που ρυθµίζουν τη γονιδιακή έκφραση. Επιπλέον οι ΜΑΡΚ έχουν την ιδιότητα να µετακινούνται από το κυτταρόπλασµα στον πυρήνα όπου µπορούν να φωσφορυλιώσουν µεταγραφικούς παράγοντες. Οι ERK1/2 φωσφορυλιώνουν αρκετές οικογένειες µεταγραφικών παραγόντων. Η οικογένεια AP-1 (activating protein-1) που φωσφορυλιώνεται από τις ERK1/2 συµπεριλαµβάνει τους παράγοντες c-jun, c-fos και ATF-2 (activating transcription factor). Oι πρωτεΐνες αυτές είναι του τύπου φερµουάρ λευκίνης οι οποίες σχηµατίζουν οµοδιµερή και ετεροδιµερή όταν ενεργοποιούνται για να δεσµευτούν στο DNA. Ο c-jun φωσφορυλιώνεται στη σερίνη 63 και 73 από τη JNK/SAPK και σε ανασταλτικές καρβοξυτελικές περιοχές από τις ERK1/2. Φωσφορυλίωση θέσεων της αµινοτελικής περιοχής οδηγεί σε αύξηση της σταθερότητας του c-jun και της συγγένειας µε το DNA. Αντίθετα, φωσφορυλίωση θέσεων της καρβοξυτελικής περιοχής αναστέλλει τη δέσµευση µε το DNA (Pearson et al. 2001). Μια άλλη κατηγορία µεταγραφικών παραγόντων που αποτελούν υποστρώµατα των ΜΑΡΚs είναι οι TCFs (ternary complex factors). Σε αυτούς ανήκει ο Elk-1 ο οποίος φωσφορυλιώνεται in vivo από ERK1/2, JNK/SAPK και p38, αν και τα αποτελέσµατα για την p38 είναι αντιφατικά (Gille et al. 1995). Ο Elk-1 φωσφορυλιώνεται σε αρκετά αµινοξέα της καρβοξυτελικής περιοχής και κυρίως στη σερίνη 389. ύο άλλα µέλη των TCF που ενεργοποιούνται από τις ΜΑΡΚ είναι οι SAP-1 και SAP-2. Οι SAP-1 και SAP-2 φωσφορυλιώνονται από τις ERK και τη p38 αλλά όχι από τη JNK (Price et al. 1995). 118

125 MAPKs MAPK Οδοί: Η Μεταγωγή Σηµάτων Στα Έντοµα Το προϊόν του γονιδίου rolled της Drosophila είναι οµόλογο των ERK των θηλαστικών. Η κινάση dmapk rolled απαιτείται κατά την ανάπτυξη του σύνθετου οφθαλµού από το σύστηµα sevenless το οποίο λειτουργεί για την τελική διαφοροποίηση των πρόδροµων κυττάρων των R7 φωτοϋποδοχέων (Biggs et al. 1994). Η οµόλογη της Raf1 στη Drosophila, dmkkk raf1,απαιτείται κατά την ανάπτυξη των πρώιµων προνυµφικών σταδίων. Γενικά φαίνεται ότι η οδός MAPK erk εµπλέκεται σε αρκετά αναπτυξιακά στάδια της µύγας. Οι πρωτεΐνες dμκκ hep (γονιδιακό προϊόν του hemipterus) και dmapk bsk (γονιδιακό προϊόν του basket) είναι οµόλογες των ΜΚΚ mkk7 και ΜΑΡΚ jnk1 αντίστοιχα και ρυθµίζουν µορφογενετικές κινήσεις κατά την εµβρυογένεση. Επιπλέον η dmapk bsk µετέχει στην ανοσοαπόκριση έναντι βακτηρίων στη Drosophila καθώς ενεργοποιείται από το λιποπολυσακχαρίτη (Sluss et al. 1996). Επίσης έχουν κλωνοποιηθεί στη Drosophila οµόλογα των ΜΑΡΚ p38, οι dmapk p38α και dmapk p38β (Han et al. 1998), που ενεργοποιούνται από στρες (οσµωτικό, θερµικό, οξειδωτικό) στα κύτταρα της Drosophila. Όµως αντίθετα µε τις οµόλογες πρωτεΐνες των θηλαστικών, οι dmapk p38 δε ρυθµίζουν θετικά σήµατα άµυνας. Φαίνεται µάλιστα ότι συµµετέχουν στην καταστολή της γονιδιακής έκφρασης κατά την ανοσοαπόκριση (π.χ. καταστολή της µεταγραφής των αντιµικροβιακών πεπτιδίων, αττακίνη και ακροπίνη) (Han et al. 1998). Η µείωση αυτή πάντως πραγµατοποιείται στα τελευταία στάδια της µόλυνσης και πιθανώς αντιπροσωπεύει ένα µηχανισµό ελέγχου που αποτρέπει την υπερδιέγερση του ανοσοποιητικού συστήµατος µε τις επακόλουθες βλαβερές συνέπειες. 119

126 Σκοπός Σκοπός της ιατριβής Οι ανοσολογικές αποκρίσεις των εντόµων σε βακτηριακές προσβολές έχουν αποτελέσει αντικείµενο έρευνας από την οποία έχουν προκύψει σηµαντικές πληροφορίες για τους µοριακούς µηχανισµούς της θεµελιώδους αυτής λειτουργίας. Οι πιο γνωστοί επαγωγείς της ανοσολογικής απόκρισης σε κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος τόσο των σπονδυλωτών όσο και των ασπόνδυλων, είναι δοµικά συστατικά της επιφάνειας των εισβολέων όπως ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS) και οι πεπτιδογλυκάνες του βακτηριακού τοιχώµατος. Τα τελευταία χρόνια έχουν παρατηρηθεί σηµαντικές οµοιότητες µεταξύ του ανοσοποιητικού συστήµατος των εντόµων και των θηλαστικών, ιδιαίτερα σε ότι αφορά τις ενδοκυτταρικές οδούς µεταγωγής µηνυµάτων. Οι παρατηρούµενες οµοιότητες ίσως να οφείλονται στην υψηλή εξελικτική συντηρητικότητα των κοµβικών µορίων που απαρτίζουν τις ενδοκυτταρικές οδούς µεταγωγής σηµάτων, από τα έντοµα µέχρι τον άνθρωπο. Αντικείµενο της παρούσας εργασίας είναι η µελέτη των µηχανισµών της κυτταροφαγίας παθογόνων από τα αιµοκύτταρα της µύγας της Μεσογείου. Γενικά, στόχος είναι η µελέτη των οδών µεταγωγής µηνυµάτων των αιµοκυττάρων σε απόκρισή τους στη δέσµευση βακτηρίων, µε τελικό σκοπό την κυτταροφαγία του βακτηρίου. Ειδικότερα, ωστόσο, µας ενδιαφέρει η εξακρίβωση του ρυθµιστικού ρόλου της κινάσης των εστιών προσκόλλησης FAK, στην κυτταροφαγία των βακτηρίων από τα αιµοκύτταρα αλλά και η συµµετοχή της σε πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα, που έχουν ως σκοπό την λήψη και µεταγωγή µηνυµάτων κατά την παρουσία ή απουσία των βακτηρίων. 120

127 Υλικά και Μέθοδοι Υλικά και Μέθοδοι 121

128 Υλικά και Μέθοδοι ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Συνοπτικός πίνακας µε αναφορά στα υλικά που χρησιµοποιήθηκαν για την εκπόνηση της µεταπτυχιακής εργασίας. Προϊόν Συνοπτικός Πίνακας Αντιδραστηρίων Αριθµός Λειτουργία Εταιρεία Παραγγελίας Αναστολείς Τελική Συγκέντωση Akt inhibitor Inhibits Akt Calbiochem 10 µμ Brefeldin A protein secretion B6542 Sigma 10 µμ Calpain Inhibitor 1 (ALLN) Cytochalasin B Cytochalasin D Demecolcine Genistein Calpain inhibitor A 6185 Sigma 10 µμ Blocking formation of contractile microfilaments Inhibitor of actin polymerization Inhibitor of tyrosine specific protein kinases C 6762 Sigma 10 µμ C8273 Sigma 10 µμ 0,01 µg/ml G 6649 Sigma 100 µμ GW 5074 c-raf 1inhibitor G 6416 Sigma 10 µμ Latrunculin A Disrupts microfilament mediated processes L5163 Sigma 60 nm LY PI3k inhibitor #9901 Cell Signaling 10 µμ Manumycin A Inhibitor of Ras M6418 Sigma 20 µμ Disrupts microtubules by Nocodazole binding to β tubulin M1404 Sigma 5 µμ PD Phosphatase inhibitor cocktail ½ PMSF MEK 1 inhibitor #9900 Cell Signaling 8 µμ Inhibits Tyrosine protein phosphatases Serine Protease inhibitor P5726 Sigma 1/100 P 7626 Sigma 100 µμ PP2 Src inhibitor Calbiochem 15 µμ Protease Inhibitors of inhibitor cocktail cellular proteases P 2714 Sigma SB P38 inhibitor S7067 Sigma 20 µμ SB P38 inhibitor S 8307 Sigma 0,4 µμ Protein secretion SITS inhibitor A0554 Sigma 100 µμ SP JNK inhibitor Calbiochem 15 µμ 122

129 Υλικά και Μέθοδοι Inactivates Rho Toxin A C3977 Family GTPases Sigma 0,3 µμ #9903 Cell Signaling U0126 MEK ½ inhibitor 8 µμ U-120 Sigma Wortmannin PI3k inhibitor W 1628 Sigma 100 nm Αντισώµατα Anti- Αντισώµατα Αριθµός Παραγγελίας Εταιρεία ABC staining system (Rabbit) (Horseradish peroxidase for biotinylated secondary antibody) sc-2018 Santa Cruz Actin A 2066 Sigma c-src Sc-19-G Santa Cruz ERK (p44/42) MAP kinase #9101 Cell Signaling FAK phospho Y397 Sc R Santa Cruz FAK phospho Y861 Sc Santa Cruz FAK c-903 Sc-932 Santa Cruz Goat Molecular anti-rabbit Probes (Labeled) Integrin β1 (N-terminal ) Integrin β3 (N-terminal ) Integrin β3 (COOH-terminal ) JNK 1 (C-17) Mouse (FITC conjugate) Mouse (peroxidase conjugate) Mouse (Tritc conjugate) I I Sc F 2012 A 2554 T 5393 BD Transduction Laboratories Transduction Laboratories Transduction Laboratories Santa Cruz Sigma Sigma Sigma 123

130 Υλικά και Μέθοδοι Paxillin PCNA P Phospho P38 MAP Kinase (Thr180-Tyr182) Phospho p44/42 Map kinase (Thr202-Tyr204) Phalloidin Fitc Phalloidin Tritc BD biosciences BD transduction Laboratories #9211 Cell Signaling #9101 Cell Signaling Santa Cruz Santa Cruz PI 3-Kinase Sc-423 Santa Cruz Pinch P63320 BD Transduction laboratories Prestained Protein Marker #7720 Cell Signaling PYK2 Sc 1514 Santa Cruz SAPK-JNK #9252 Cell Signaling Αντιδραστήρια-Λοιπά Υλικά Amerlex M second antibody reagent Cyanogen bromideactivatedsepharose 4B AP (Ammonium persulfate) Fibronectin DTT (DL- Dithiothreitol) ECL (Western blotting detection reagents and analysis system) Gel Mount (Aqueus mounting medium) Μαγνητικά σφαιρίδια συζευγµένα µε δεύτερο anti-rabbit αντίσωµα Σφαιρίδια για κατακρηµνίσεις Polymerization of acrylamide and bis acrylamide Reduces protein disulfide bonds Amersham Life Science (UK) Sigma Sigma Amersham Biosciences Sigma 124

131 Υλικά και Μέθοδοι Grace s insect medium Kodak Films Latex Beads PVDF membranes Cell culture medium Films for autoradiography Sigma Kodak Sigma Pierce RGD Arg-Gly-Asp A8052 Sigma RGE Super Block Blocking Buffer Pierce TEMED Vectashield (mounting medium) Electrophoresis reagent Sigma Vector Laboratories 125

132 Υλικά και Μέθοδοι Καλλιέργεια του εντόµου Ceratitis capitata Στα πειράµατα που διεξήχθησαν χρησιµοποιήθηκε εργαστηριακός πληθυσµός του εντόµου Ceratitis capitata, το οποίο ανήκει στην οικογένεια Tephritidae της τάξης Diptera ( ίπτερα). Ο πληθυσµός αυτός διατηρείται στο εργαστήριο Βιολογίας από το 1973 και προέρχεται από το Μπενάκειο Φυτοπαθολογικό Ινστιτούτο (Εικόνα 71). Εικόνα 71. Η µύγα της Μεσογείου, Ceratitis capitata Ο κύκλος ζωής του εντόµου εξαρτάται από τις συνθήκες θερµοκρασίας, υγρασίας και φωτοπεριοδισµού. Στο εργαστήριό µας διατηρείται σε θάλαµο σταθερής θερµοκρασίας 25 0 C, µε σχετική υγρασία 75% και µε αυτόµατο σύστηµα 12ωρου φωτοπεριοδισµού. Στις συνθήκες αυτές η εµβρυογένεση διαρκεί 52 ώρες, το προνυµφικό στάδιο περίπου 6 ηµέρες, το νυµφικό στάδιο 9 ηµέρες, ενώ το στάδιο του ενηλίκου διαρκεί περίπου 15 ηµέρες (Πίνακας 1). Πίνακας 1. ιάρκεια των σταδίων ανάπτυξης της µύγας της Μεσογείου Στάδια ανάπτυξης Φυσικός πληθυσµός Εργαστηριακός πληθυσµός Αυγά 2-20 ηµέρες 9-10 ηµέρες Προνύµφη (3 στάδια) ηµέρες 5-6 ηµέρες Νύµφη ηµέρες 9-10 ηµέρες 126

133 Υλικά και Μέθοδοι Ενήλικα άτοµα Τα ενήλικα άτοµα διατηρούνται σε πολυεστερικά κλουβιά διαστάσεων 42 x 24 x 30 cm (Εικόνα 72). Η οροφή του κλουβιού φέρει συρµάτινη σήτα όπου και τοποθετείται vettex εµποτισµένο µε νερό προσφέροντας έτσι την δυνατότητα στις µύγες να προσλαµβάνουν νερό. Η µια πλευρά του επίσης, αυτή που είναι στραµµένη προς το φως, φέρει λεπτό συνθετικό ύφασµα µε οπές µικρής διαµέτρου έτσι τα θηλυκά άτοµα µε τον ωοθέτη τους διαπερνούν το ύφασµα και αφήνουν τα αυγά τους έξω από το κλουβί. Τα ενήλικα άτοµα γίνονται σεξουαλικώς ενεργά την τρίτη µέρα της ενήλικης ζωής τους. Τα θηλυκά άτοµα διαπερνούν µε τον ωοθέτη τους το ύφασµα και εναποθέτουν στην εξωτερική επιφάνειά του τα αυγά τους. Τα αυγά που γεννιούνται σε διάστηµα λεπτών, συλλέγονται (0,04gr / διηθητικό χαρτί) και τοποθετούνται για µια ηµέρα σε τρυβλίο petri µε σχετικά µεγάλη υγρασία, ενώ την επόµενη ηµέρα µεταφέρονται σε ειδικά αεριζόµενα πλαστικά κουτιά µε τροφή για να εκκολαφθούν ύστερα από 6 ηµέρες περίπου. Εικόνα 72. Τα ενήλικα έντοµα διατηρούνται σε πολυεστερικά κλουβιά. 127

134 Υλικά και Μέθοδοι Προνυµφικά στάδια Η ανάπτυξη των προνυµφών γίνεται µέσα στα αεριζόµενα πλαστικά κουτιά τα οποία περιέχουν 100gr τροφής. Στην επιφάνεια αυτής τοποθετούνται 40 mg αυγά. Η σύσταση της τροφής δίνεται στον Πίνακα 2. Πίνακας 2. Η σύσταση της τροφής που δίδεται στις προνύµφες της µύγας της Μεσόγειου. Συστατικά Νερό δικτύου Ζάχαρη εµπορίου Μαγιά Χαρτί τύπου Softex ιάλυµα HCl 1.5 N Χοληστερίνη 5% σε υδατικό διάλυµα αιθανόλης 85% Βενζοϊκό νάτριο 10% σε υδατικό διάλυµα αιθανόλης 25% Ποσότητες 500ml 30gr 30gr 120gr 10ml 10ml 10ml Η ανάπτυξη των προνυµφών µέσα στο υλικό αυτό διαρκεί 6 ηµέρες περίπου. Στο τέλος του προνυµφικού σταδίου κατά την έκτη ηµέρα, οι προνύµφες εκτινάσσονται (βρίσκονται στο στάδιο περιπλάνησης- wandering stage) εγκαταλείποντας την τροφή και πέφτουν σε ένα κουτί µε άµµο όπου και βοµβυκιώνονται µετά από 7-8 ώρες. Αρχικά σχηµατίζεται η λευκή νύµφη (white pupae) της οποίας η επιδερµίδα σταδιακά σκουραίνει και σκληραίνει (Brown pupae) (Εικόνα 73). Το στάδιο της νύµφης διαρκεί 8-9 ηµέρες. Μια ηµέρα πριν εκκολαφθούν τα ενήλικα άτοµα τοποθετούνται σε κλουβιά ενήλικων ατόµων όπου γίνεται και η µεταµόρφωσή τους. Στην παρούσα µελέτη τα άτοµα που χρησιµοποιήθηκαν ήταν του σταδίου περιπλάνησης. 128

135 Υλικά και Μέθοδοι Ο κύκλος ζωής της µύγας της Μεσογείου. Εικόνα 73. Τα στάδια του κύκλου ζωής της Ceratitis capitata. Από τα δεξιά προς τα αριστερά παρατηρούµε τα αυγά του εντόµου, την προνύµφη, την νύµφη και το ενήλικο άτοµο. 129

136 Υλικά και Μέθοδοι Αποµόνωση αιµοκυττάρων Προνύµφες του σταδίου περιπλάνησης (wandering stage) αρχικά ξεπλένονται µε νερό, πρώτα µε νερό βρύσης και στη συνέχεια µε απιονισµένο νερό. Η αιµολέµφος συλλέγεται τρυπώντας το επιδερµίδιο της κάθε προνύµφης µε λεπτή βελόνα στο πίσω µέρος του σώµατος και τοποθετώντας τις προνύµφες σε ένα σωληνάκι Eppendorf, το οποίο φέρει οργαντίνα που παίζει το ρόλο φίλτρου. Το σωληνάκι περιέχει 500 µl αντιπηκτικού διαλύµατος και αφού τρυπήσουµε τον πυθµένα του, το τοποθετούµε σε ένα δεύτερο σωληνάκι Eppendorf. Στη συνέχεια ακολουθούν τρεις διαδοχικές φυγοκεντρήσεις σε κλινική φυγόκεντρο στους 4 C. Τα αιµοκύτταρα παραλαµβάνονται ως ίζηµα και ξεπλένονται 3 φορές µε διάλυµα Ringer. Μετά την ολοκλήρωση των εκπλύσεων τα αιµοκύτταρα είτε θα αναδιαλύθουν σε θρεπτικό µέσο ώστε να γίνει καλλιέργεια τους και επίδραση µε διάφορες ουσίες, είτε θα λυθούν µε διάλυµα λύσης (lysis buffer) και επίδραση µε υπερήχους (sonication) (Εικόνα 74). Εικόνα 74. Η συσκευή των υπερήχων (sonicator). Τα αιµοκύτταρα που συλλέγονται από τις προνύµφες θα αναδιαλυθούν σε lysis buffer και για να ολοκληρωθεί η λύση των κυττάρων αποτελεσµατικότερα θα υποστούν υπερήχους (3 επαναλήψεις των 10 sec). Οι υπέρηχοι προκαλούν την ταχύτατη κίνηση των φυσαλίδων αέρα που βρίσκονται στο διάλυµα µε αποτέλεσµα τα κύτταρα να δέχονται ένα καταιγιστικό βοµβαρδισµό µε τελική συνέπεια την λύση τους. 130

137 Υλικά και Μέθοδοι Πειραµατική πορεία 1. Συλλογή αιµολέµφου από άτοµα του σταδίου περιπλάνησης όπως περιγράφεται παραπάνω (100 άτοµα / δείγµα). 2. Φυγοκέντρηση στις 1000 στροφές (800g) για 10 min, 4 C. 3. Αποµάκρυνση του υπερκείµενου (ορός) και επαναιώρηση των αιµοκυττάρων (ίζηµα) σε 500 µl διαλύµατος Ringer. 4. Φυγοκέντρηση στις 1000 στροφές για 5 min, 4 C. 5. Ακολουθεί άλλη µια έκπλυση µε Ringer. 6. Στο τέλος τα αιµοκύτταρα που αποµονώνονται από τις προνύµφες επαναιωρούνται σε θρεπτικό µέσο Grace (Sigma,USA) (Grace, 1962), το οποίο περιέχει όλα τα απαραίτητα για την επιβίωση των κυττάρων θρεπτικά συστατικά. ιαλύµατα 62mM NaCl 100mM Glucose 10mM EDTA Αντιπηκτικό* 30mM tri-sodium citrate 26mM citric acid ph mm NaCl Ringer s insect medium* 18 mm CaCl mm KCl 2.3 mm NaHCO 3 ph 7 * Για την παρασκευή των διαλυµάτων που απαιτούνται για την αποµόνωση και καλλιέργεια κυττάρων χρησιµοποιούνται αντιδραστήρια και νερό που προορίζονται για κυτταροκαλλιέργεια και είναι απαλλαγµένα από ενδοτοξίνες (LPS). 131

138 Υλικά και Μέθοδοι Καλλιέργεια αιµοκυττάρων Τα αιµοκύτταρα µπορούν να καλλιεργηθούν είτε σε εναιώρηµα είτε σε µονόστοιβα, ανάλογα µε τους σκοπούς του πειράµατος. Για την καλλιέργεια των αιµοκυττάρων σε εναιώρηµα, τα αποµονωµένα αιµοκύτταρα αιωρούνται σε θρεπτικό µέσο Grace και επωάζονται για ορισµένο χρονικό διάστηµα (συνήθως για µία ώρα) πριν την εφαρµογή της πειραµατικής διαδικασίας, υπό συνεχή ανακίνηση σε rocker στους 25 ο C (στάδιο ηρεµίας) για να αποφευχθεί η προσκόλληση των κυττάρων. Για την καλλιέργεια των αιµοκυττάρων σε µονόστοιβα, αιµοκύτταρα που έχουν αποµονωθεί από προνύµφες του σταδίου περιπλάνησης, όπως περιγράφηκε παραπάνω, αιωρούνται σε θρεπτικό µέσο Grace (Sigma) σε αναλογία αιµοκύτταρα 30 ατόµων/ 100 µl Grace ( 10 5 κύτταρα/δείγµα). Το εναιώρηµα τοποθετείται σε αντικειµενοφόρους, στις οποίες στην µια πλευρά έχουµε σχηµατίσει δύο κύκλους µε υαλογράφο (50 µl εναιωρήµατος/ κύκλο) ή µικροφρεάτια κυτταροκαλλιέργειας (100µl αιωρήµατος/ µικροφρεατίδιο) και αφήνεται για 10 ή 20 λεπτά, αντίστοιχα, ώστε να προσκολληθούν τα κύτταρα. Ακολουθεί πλύση 3 φορές µε Ringer για να αποµακρυνθούν τα κύτταρα που δεν προσκολλήθηκαν και στη συνέχεια αφήνονται να ηρεµήσουν για 30 λεπτά. Το στάδιο της ηρεµίας είναι απαραίτητο καθώς η διαδικασία αποµόνωσης των αιµοκυττάρων ενεργοποιεί τα αιµοκύτταρα. Και στις δύο περιπτώσεις καλλιέργειας, µετά την περίοδο της ηρεµίας, ακολουθεί η επίδραση µε αναστολείς ή ενεργοποιητές των διαδικασιών που µελετούµε. Καλλιέργεια βακτηρίου Ε. coli Τα βακτήρια (Εικόνα 75) διατηρούνται σε στερεή καλλιέργεια (1,5 % άγαρ, 0,5% bactopeptone, 0,5% yeast extract) και γίνονται ανακαλλιέργειες ανά τακτά χρονικά διαστήµατα. Στα πειράµατα χρησιµοποιούνται βακτήρια απενεργοποιηµένα µε φορµαλδεΰδη (4%, 10 λεπτά). Για την εκτέλεση των πειραµάτων αναδιαλύονται σε Grace. Εικόνα 75. Το βακτήριο E. coli. 132

139 Υλικά και Μέθοδοι Ποσοτικός προσδιορισµός πρωτεϊνών Οι µέθοδοι Bradford και Lowry χρησιµοποιούνται πιο συχνά για τον υπολογισµό µικροµοριακών ποσοτήτων πρωτεϊνών. Τα τελευταία χρόνια χρησιµοποιείται η Bradford, λόγω της ευκολίας και της ταχύτητας µε την οποία µπορεί να πραγµατοποιηθεί. Η µέθοδος αυτή εξαρτάται από τη δέσµευση της χρωστικής Coomassie brilliant blue, κυρίως στα βασικά αµινοξέα των πρωτεϊνών, αλλάζοντας ταυτόχρονα το µήκος κύµατος της µέγιστης απορρόφησής τους. Η δέσµευση αυτή είναι ανάλογη του ποσού των πρωτεϊνών (Bradford, 1976). Με τη µέθοδο Bradford µπορούν να µετρηθούν από 1 ως 100 µg πρωτεΐνης. Για τον υπολογισµό της συγκέντρωσης αγνώστου δείγµατος χρησιµοποιείται πρότυπη καµπύλη, η οποία κατασκευάζεται µε τη βοήθεια γνωστών συγκεντρώσεων αλβουµίνης ορού βοός (BSA). Θα πρέπει να σηµειωθεί ότι η πρότυπη πρωτεΐνη διαλύεται σε ρυθµιστικό διάλυµα ίδιας σύστασης µε αυτή του άγνωστης συγκέντρωσης διαλύµατος. Πειραµατική πορεία Σε eppedorf προσθέτουµε µια ποσότητα αγνώστου δείγµατος (µέχρι όγκου 10 µl) ή το πρότυπο διάλυµα BSA. Στη συνέχεια προσθέτουµε 250µl αραιωµένου αντιδραστηρίου Bradford µε d-h 2 O σε αναλογία 1:4. Οι σωλήνες αναδεύονται σε Vortex και µετά από 2-5 λεπτά µετράµε την οπτική απορρόφηση των δειγµάτων σε πλαστικές ή γυάλινες κυψελίδες. Οι µετρήσεις γίνονται σε φασµατοφωτόµετρο τύπου PYE unicam PU 8610 UV/VIS kinetics spectrophotometer (Εικόνα 76), σε µήκος κύµατος 595 nm, µηδενίζοντας την οπτική απορρόφηση που έχει ο µάρτυρας. Ως µάρτυρας χρησιµοποιείται το αντιδραστήριο Bradford µε την προσθήκη ρυθµιστικού διαλύµατος (Εικόνα 77). 133

140 Υλικά και Μέθοδοι ιαλύµατα Αντιδραστήριο Bradford* 85% κ.ό d-h2o 10% κ.ό Φωσφορικό οξύ 5% κ.ό Αιθανόλη 95 ο 0,01% κ.β. Coomassie brilliant blue G- 250 (Merck, Germany) Πρότυπο διάλυµα BSA 10 mg/ml Παρατήρηση: * Το Αντιδραστήριο Bradford πριν χρησιµοποιηθεί φιλτράρεται για την αποµάκρυνση της χρωστικής που δεν έχει διαλυτοποιηθεί. Εικόνα 76. Το φωτόµετρο που χρησιµοποιήθηκε για την µέτρηση και ποσοτικοποίηση των πρωτεϊνικών εκχυλισµάτων µε την µέθοδο Bradford. Εικόνα 77. είγµατα από διαφορετικά πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα που πρόκειται να µετρηθούν µε την µέθοδο Bradford. Το πρώτο eppendorf αποτελεί το δείγµα-µάρτυρα, δηλ. το τυφλό, µε το οποίο θα συγκριθούν τα υπόλοιπα. Όσο αυξάνεται η ένταση του µπλε χρώµατος στο δείγµα τόσο περισσότερη πρωτεΐνη είναι η διαλυµένη σε αυτό. 134

141 Υλικά και Μέθοδοι Ηλεκτροφόρηση Πολυακρυλαµιδίου PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) Ηλεκτροφόρηση είναι το φαινόµενο µεταφοράς ηλεκτρικά φορτισµένων σωµατιδίων (ιόντων και άλλων) µέσα σε ηλεκτρικό πεδίο. Η ηλεκτροφόρηση είναι µια τεχνική διαχωρισµού, χαρακτηρισµού και ανάλυσης βιοµορίων και βασίζεται στο γεγονός ότι µακροµόρια όπως το DNA, το RNA και οι πρωτεΐνες φέρουν ηλεκτρικά φορτία, που τους προσδίδουν την ιδιότητα της κίνησης µέσα σε ηλεκτρικό πεδίο. Οι πρωτεΐνες οφείλουν το ηλεκτρικό τους φορτίο στα όξινα (π.χ. Glu, Asp) και στα βασικά αµινοξέα (π.χ. Lys, Arg). Όµως το φορτίο που αξιοποιεί η ηλεκτροφόρηση είναι το συνολικό καθαρό φορτίο των βιοµορίων. Για να υπάρξει µετακίνηση φορτισµένων µορίων θα πρέπει το ηλεκτρικό πεδίο να έχει σταθερή πολικότητα και για το λόγο αυτό χρησιµοποιείται µόνο το συνεχές ρεύµα. Το ακρυλαµίδιο δηµιουργεί τρισδιάστατα πολυµερή δίκτυα σε µια ευρεία κλίµακα συγκεντρώσεων από 3% µέχρι 30%. Τα πηκτώµατα ακρυλαµιδίου είναι ουδέτερα, υδρόφιλα και παρουσιάζουν τρισδιάστατες διατάξεις µακριών υδατανθράκων που συνδέονται µε µεθυλενοµάδες. Το πήκτωµα σχηµατίζεται µε βινυλ-πολυµερισµό των µονοµερών ακρυλαµιδίου, που οδηγεί στη δηµιουργία αλυσίδων πολυακρυλαµιδίου. Στις αλυσίδες αυτές ενσωµατώνονται κατά διαστήµατα µόρια ΝΝ-µεθυλεν-bis-ακρυλαµιδίου (bis), τα οποία λόγω της δοµής τους µπορούν να ενσωµατωθούν σε δύο διαφορετικές αλυσίδες και έτσι να δηµιουργηθεί πλέγµα. Ο πολυµερισµός του ακρυλαµιδίου γίνεται µε µία βάση, την ΝΝΝ Ν - τετραµεθυλαιθυλενοδιαµίνη (TEMED), αλλά µόνο µε την παρουσία ελευθέρων ριζών που µπορούν να δηµιουργηθούν χηµικά µε υπερθειϊκά ιόντα (S 2 O 2-8 ). Η συγκέντρωση του χρησιµοποιούµενου ακρυλαµιδίου καθορίζει το µέσο µήκος της αλυσίδας του πολυµερούς ενώ το ΝΝ-µεθυλεν-δις-ακρυλαµίδιο, καθορίζει την έκταση του σχηµατισµού γεφυρών (cross-links). Η µέση απόσταση µεταξύ των πολυµερών του πηκτώµατος είναι γνωστή ως µέγεθος πόρου του πηκτώµατος. Το µέγεθος που επιλέγεται εξαρτάται από το µέγεθος των πρωτεϊνικών µορίων που πρόκειται να διαχωριστούν και καθορίζεται µε αλλαγές στις συγκεντρώσεις ακρυλαµιδίου και δις-ακρυλαµιδίου. Γενικά, τα πηκτώµατα χαµηλής συγκέντρωσης ακρυλαµιδίου είναι µαλακά και επειδή έχουν µεγάλους πόρους χρησιµοποιούνται για το διαχωρισµό µακροµορίων µεγάλου µοριακού βάρους. Πηκτώµατα µε µεγάλες 135

142 Υλικά και Μέθοδοι συγκεντρώσεις είναι σκληρότερα, περισσότερο εύθραυστα, έχουν µικρότερους πόρους και χρησιµοποιούνται για το διαχωρισµό ουσιών µικρού σχετικά µοριακού βάρους. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται σε πηκτώµατα επιφανείας που πολυµερίζονται µεταξύ δυο γυάλινων πλακών και δυο πλαστικών πλευρικών ελασµάτων. Τα δείγµατα των πρωτεϊνών τοποθετούνται σε ειδικά φρεάτια υποδοχής που προκύπτουν µε ειδική πλαστική οδοντωτή µήτρα στο πήκτωµα πακεταρίσµατος κατά τη διάρκεια του πολυµερισµού του. Το πήκτωµα τοποθετείται στη συσκευή σε κάθετη θέση έτσι ώστε το άνω και το κάτω άκρο του να είναι εµβαπτισµένα σε ρυθµιστικά διαλύµατα των δοχείων της καθόδου και της ανόδου, αντίστοιχα (Εικόνες 78, 79). Εικόνα 78. Συσκευή ηλεκτροφόρησης. Εικόνα 79. Φορτώνοντας τα προς ανάλυση δείγµατα στην συσκευή ηλεκτροφόρησης (SDS PAGE). 136

143 Υλικά και Μέθοδοι SDS -PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) Η ανάλυση των πρωτεϊνών έγινε µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου, παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων (SDS, DTT). Το SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) είναι ένα αρνητικά φορτισµένο ιοντικό απορρυπαντικό το οποίο δεσµεύεται στις υδρόφοβες περιοχές των πρωτεϊνικών µορίων µε σταθερή αναλογία βάρους (1,4 g SDS ανά g πρωτεΐνης), ανεξάρτητα από την πρωτεϊνική αλληλουχία και τις αναγκάζει να ξεδιπλωθούν. Με αυτόν το τρόπο τα πρωτεϊνικά µόρια αποσυνδέονται από άλλες πρωτεΐνες ή λιπίδια και γίνονται υδατοδιαλυτά. Το σταθερό ποσοστό του SDS που δεσµεύεται στην πρωτεΐνη κάνει τις πεπτιδικές αλυσίδες να συµπεριφέρονται σαν να έχουν παρόµοιο σχήµα και ταυτόσηµη αναλογία φορτίου και µάζας. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα η κινητικότητα των µορίων να είναι ανάλογη µε το µοριακό τους βάρος. Εικόνα 80. Συντακτικός τύπος του µορίου του Η επιπλέον χρήση αναγωγικών SDS (sodium dodecyl sulfate). - Επίδραση SDS παραγόντων όπως είναι το DTT σε πρωτεϊνικά µόρια πριν την ηλεκτροφόρηση (Dithiothreitol) και η µερκαπταιθανόλη, τους σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου. έχει σαν αποτέλεσµα τη διάσπαση των δισουλφιδικών δεσµών των πρωτεϊνών µε καταστροφή της τεταρτοταγούς δοµής των και τον διαχωρισµό των ανεξάρτητων πολυπεπτιδικών υποµονάδων. Η αποδιάταξη των πρωτεϊνών επιτυγχάνεται πλήρως µε τη θέρµανση των πρωτεϊνικών δειγµάτων για 3 min στους 100 ο C, παρουσία όλων των παραπάνω αποδιατακτικών παραγόντων. Τελικά στην SDS PAGE αναλύονται 137

144 Υλικά και Μέθοδοι πολυπεπτίδια τα οποία έχουν αποκτήσει καθαρό αρνητικό φορτίο λόγω του SDS και εποµένως η ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα είναι συνάρτηση του µοριακού τους βάρους. Σε όλα τα πειράµατα που περιγράφονται χρησιµοποιήθηκε ασυνεχές σύστηµα ρυθµιστικών διαλυµάτων (discontinuous PAGE), σύµφωνα µε τη µέθοδο του Laemli (Laemli, 1970). Εικόνα 81. Η συσκευή ηλεκτροφόρησης που χρησιµοποιήθηκε για την διεξαγωγή των πειραµάτων µας. Εικόνα 82. Αφού φορτωθούν τα δείγµατα στην συσκευή τοποθετούµε τα ηλεκτρόδια στο τροφοδοτικό. Η ένταση του ρεύµατος ρυθµίζεται στα 40 ma και η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα 10% ολοκληρώνεται σε περίπου 1 ώρα και 30 λεπτά. 138

145 Υλικά και Μέθοδοι Πειραµατική πορεία Τα πρωτεϊνικά δείγµατα αναµιγνύονται µε το ρυθµιστικό διάλυµα δειγµάτων σε αναλογία 5:2. Αµέσως µετά ακολουθεί θέρµανση των δειγµάτων για 5 min σε υδατόλουτρο 100 ο C και φυγοκέντρηση για 10 min σε g. Το υπερκείµενο τοποθετείται σε ειδικά φρεάτια υποδοχής των δειγµάτων που έχουν σχηµατιστεί στο πήκτωµα πακεταρίσµατος από κατάλληλη πλαστική οδοντωτή µήτρα. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται σε θερµοκρασία δωµατίου µε την εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου σταθερής έντασης 40 ma, µέχρι η χρωστική της βρωµοφαινόλης να φθάσει 0,5 cm από το όριο του πηκτώµατος (Εικόνες 81, 82). Το πήκτωµα χρωµατίζεται σε διάλυµα χρώσης Coomassie brilliant blue για 1 ώρα και στη συνέχεια τοποθετείται σε διάλυµα αποχρωµατισµού. Με την χρωστική αυτή βάφονται όλες οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες που υπάρχουν στο πήκτωµα και στην µεµβράνη. Ο υπολογισµός των µοριακών βαρών των πολυπεπτιδίων γίνεται µε βάση πρότυπη καµπύλη η οποία κατασκευάζεται σε ηµιλογαριθµικά βαθµολογηµένο χαρτί µε τη βοήθεια των πρωτεϊνών-δεικτών µοριακού βάρους-markers (Sigma). Οι πρωτεΐνες-δείκτες που χρησιµοποιήθηκαν ήταν οι εξής: Οι Weber και Osborn (1969) έδειξαν ότι εάν σε µια στήλη πηκτώµατος ακρυλαµιδίου, παρουσία SDS, υποστεί ηλεκτροφόρηση µια σειρά από πρωτεΐνες διαφορετικών µοριακών βαρών, τότε οι πρωτεΐνες αυτές θα διαχωριστούν σε µια σειρά από ζώνες. Η γραφική παράσταση της απόστασης των ζωνών από το σηµείο έναρξης τους έναντι του logm (Μ= Μοριακό Βάρος) δίνει µια ευθεία γραµµή, που µπορεί να χρησιµοποιηθεί αργότερα για τον προσδιορισµό του µοριακού βάρους µιας 139

146 Υλικά και Μέθοδοι άγνωστης πρωτεΐνης (Εικόνες 83 & 84). Έτσι αν µια πρωτεΐνη, αγνώστου µοριακού βάρους, ηλεκτροφορηθεί µαζί µε δυο ή περισσότερες πρωτεΐνες γνωστών µοριακών βαρών, τότε µπορεί να υπολογιστεί το ΜΒ της από µια τέτοια γραφική παράσταση µε ακρίβεια 5-10 %. Εικόνα 83. Υπολογισµός του Rf των πρωτεϊνών σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου. Εικόνα 84. Σχέση του φυσικού λογαρίθµου του µοριακού βάρους και του Rf. Από την γραφική παράσταση των Rf πρωτεϊνών γνωστού µοριακού βάρους µπορούµε να υπολογίσουµε το µοριακό βάρος µιας άγνωστης πρωτεΐνης που έχει ηλεκτροφορηθεί µαζί τους βάσει του Rf της. 140

147 Υλικά και Μέθοδοι ιαλύµατα Ηλεκτροφόρησης Ρυθµιστικό διάλυµα πηκτώµατος διαχωρισµού 1.5 Μ Tris-HCl, ph 8.8 Ρυθµιστικό διάλυµα πηκτώµατος συµπύκνωσης 0.5 Μ Tris-HCl, ph 6.8 Ρυθµιστικό διάλυµα δειγµάτων (5Χ) (αραιό Sample Buffer) 0.25 Μ Tris-HCl, ph 6.8 4% κ.β. SDS 40% κ.β. γλυκερόλη 0.2 Μ DTT 0.05% κ.β. µπλε της βρωµοφαινόλης το DTT προστίθεται λίγο πριν τη χρήση του ρυθµιστικού διαλύµατος δειγµάτων, από πυκνό διάλυµα DTT 1Μ που διατηρείται στους 20 ο C. Ρυθµιστικό διάλυµα ηλεκτροδίων ιάλυµα ακρυλαµιδίου / bis 30% (100:1) ιάλυµα SDS 10% κ.β. ιάλυµα ΑP 20% κ.β. TEMED 100% κ.ό. ιάλυµα χρώσης 50 mm Tris-γλυκίνη 0.1% κ.β. SDS ph % κ.ό νερό 40% κ.ό µεθανόλη 7% κ.ό οξικό οξύ 0.3% κ.β. Coomassie brilliant blue R-250 ιάλυµα αποχρωµατισµού 53% κ.ό νερό 40% κ.ό µεθανόλη 7% κ.ό οξικό οξύ 141

148 Υλικά και Μέθοδοι Πήκτωµα διαχωρισµού 10% ή 12% ρυθµιστικό διάλυµα d-h 2 O διάλυµα ακρυλαµιδίου / bis SDS AP (υπερθειϊκό αµµώνιο) ΤΕΜΕD Μ 33.3% κ.ό 10% % ή 12% % 0.1% κ.β % κ.β. 0.1% κ.ό Πήκτωµα συµπύκνωσης ρυθµιστικό διάλυµα Μ d-h 2 O διάλυµα ακρυλαµιδίου / bis SDS AP (υπερθειϊκό αµµώνιο) ΤΕΜΕD 55% κ.ό 6 % % 0.1% κ.β. 0.16% κ.β. 0.1% κ.ό 142

149 Υλικά και Μέθοδοι Ανοσοαποτύπωση (Immunoblotting) Η µέθοδος αυτή αναφέρεται στο σχηµατισµό και την ανίχνευση ενός συµπλόκου αντιγόνου-αντισώµατος ανάµεσα σε ένα αντίσωµα και ένα πολυπεπτίδιο που έχει ακινητοποιηθεί σε µεµβράνη (Gershoni and Palade, 1983; Beisiegel 1986; Stott 1989). Εφαρµόζεται για την ανίχνευση και την ποσοτική µέτρηση αντιγόνων ενός µίγµατος πρωτεϊνών, για τη σύγκριση της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών και για τη µελέτη των τροποποιήσεων τους κατά τη διάρκεια της σύνθεσής τους. Περιλαµβάνει την ηλεκτροφορητική ανάλυση του αντιγονικού διαλύµατος µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου, τη µεταφορά των πρωτεϊνών σε µεµβράνες (PVDF) και τέλος τη δέσµευση των ειδικών αντισωµάτων στο αντιγόνο (Towbin et al, 1979). Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, το πήκτωµα τοποθετείται σε κατάλληλη συσκευή (Εικόνα 85) µε τέτοιο τρόπο ώστε οι αρνητικά φορτισµένες πρωτεΐνες του πηκτώµατος να µεταφερθούν, µε την εφαρµογή ηλεκτρικού ρεύµατος, στη µεµβράνη, η οποία είναι τοποθετηµένη µεταξύ του θετικού πόλου και του Εικόνα 85. Η συσκευή στην οποία πραγµατοποιείται η ηλεκτροµεταφορά (Western Blot). πηκτώµατος. Η µεµβράνη βρίσκεται σε επαφή µε το πήκτωµα µε αποτέλεσµα να δηµιουργείται σε αυτή ένα αποτύπωµα των πρωτεϊνών του πηκτώµατος. Οι πρωτεΐνες οι οποίες δεσµεύονται ισχυρά κυρίως µε υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, διατηρούν τις αντιγονικές τους ιδιότητες και έτσι διευκολύνεται η αναγνώρισή τους από τα αντισώµατα. Η εµφάνιση του συµπλόκου αντιγόνου-αντισώµατος γίνεται µε τη χρήση ενζυµικών ή ραδιενεργών ( 131 Ι) ιχνηθετών. Η ανοσοαποτύπωση ή αποτύπωση Western έχει πολλά πλεονεκτήµατα αφού µε τον ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό των πρωτεϊνών του εξεταζόµενου δείγµατος, ο 143

150 Υλικά και Μέθοδοι οποίος προηγείται, υπάρχει η δυνατότητα µελέτης του βαθµού συγγένειας των αντισωµάτων του αντί-ορού για συγκεκριµένες πρωτεΐνες ή για τις υποµονάδες τους. Παράλληλα µε τη χρήση κατάλληλων πρωτεϊνικών δεικτών υπάρχει η δυνατότητα προσδιορισµού των µοριακών βαρών πιθανών ισοµορφών των επί µέρους πρωτεϊνικών κινασών. Εποµένως, η τεχνική αυτή έχει µεγάλη διακριτική ικανότητα και ειδικότητα. Η τροποποιηµένη δε τεχνική εµφάνισης µε ενισχυµένη χηµειοφωταύγεια (E C L) που περιγράφεται παρακάτω προσδίδει ακόµα µεγαλύτερη ευαισθησία. Εικόνα 86. Συσκευή µεταφοράς πρωτεϊνών σε µεµβράνες. Από αριστερά προς τα δεξιά διακρίνουµε Wettex, χαρτί Wattman, πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου, µεµβράνη PVDF, χαρτί Wattman, Wettex. Εικόνα 87. Η ηλεκτροµεταφορά στην πράξη. 144

151 Υλικά και Μέθοδοι Πειραµατική Πορεία Μεταφορά των πρωτεϊνών Μετά την SDS-PAGE τα πολυπεπτίδια που έχουν αναλυθεί στο πήκτωµα διαχωρισµού µεταφέρονται σε µεµβράνη µεταφοράς (PVDF, Immobilon-P polyvinylidene fluoride membranes, Millipore Corp., Bedford, MA, USA), µε την εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου σταθερής έντασης 400mA για 120 min. Πριν την ηλεκτροµεταφορά, επειδή η µεµβράνη PVDF είναι υδρόφοβη, προετοιµάζεται κατάλληλα (1 min σε µεθανόλη) και στη συνέχεια εξισορροπείται σε διάλυµα µεταφοράς (συνήθως για 90 min). Κορεσµός των ελεύθερων θέσεων δέσµευσης της µεµβράνης Η µεµβράνη επωάζεται για όλη τη νύχτα σε θερµοκρασία 4 0 C, υπό συνεχή ανάδευση, σε 20 ml SuperBlock blocking buffer (Pierce Rockford, IL, USA) µε 10µl Tween-20 ή ρυθµιστικό διάλυµα TBS το οποίο περιέχει 5% κ. β. αποβουτυρωµένο γάλα (skim milk). Πρόσδεση του πρώτου αντισώµατος Η µεµβράνη επωάζεται µε το πρώτο αντίσωµα για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου, υπό συνεχή ανάδευση. To αντίσωµα είναι διαλυµένο στην κατάλληλη συγκέντρωση σε TBS-Tween. Το στάδιο αυτό είναι πολύ σηµαντικό καθώς περιλαµβάνει την αναγνώριση και δέσµευση των αντισωµάτων στο αντιγόνο, το οποίο µας ενδιαφέρει να εντοπίσουµε. Για το λόγο αυτό απαιτείται η σωστή τιτλοδότηση των αντισωµάτων ώστε να αποφευχθεί η δέσµευσή τους σε µη ειδικές θέσεις δέσµευσης. Ακολουθεί συγκεντρωτικός πίνακας µε τις αραιώσεις των αντισωµάτων που χρησιµοποιηθήκαν καθώς και τις ακριβείς συνθήκες επώασης για κάθε αντίσωµα. ιάλυµα 1ου αντισώµατος 15 ml TBS-Tween 150µl SuperBlock blocking buffer 150 µl thimerosal 15 µl αντισώµατος(1:1000) 145

152 Υλικά και Μέθοδοι Πλύσεις Ακολουθούν 3 διαδοχικές εκπλύσεις των 5 min µε TBS-Tween. Πρόσδεση του δεύτερου αντισώµατος Το δεύτερο αντίσωµα (anti-rabbit IgG) αναγνωρίζει και δεσµεύεται στην Fc περιοχή των IgGs και είναι συζευγµένο µε το ένζυµο υπεροξειδάση (Transduction Laboratories, USA). Η µεµβράνη επωάζεται για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου, σε ρυθµιστικό διάλυµα που φέρει το αντίσωµα σε αναλογία 1:3000, υπό συνεχή ανάδευση. ιάλυµα 2ου αντισώµατος 15 ml TBS-Tween 5 µl αντισώµατος (1:3000) 150 µl thimerosal Πλύσεις Ακολουθούν 3 διαδοχικές εκπλύσεις µε TBS-Tween των 5 min και 2 εκπλύσεις µε TBS (1x) των 5 min. ABC Staining System Όταν επωάζουµε µε δεύτερο αντίσωµα bio-rabbit (1:2000 σε TBS-Tween) τότε ακολουθεί ένα ακόµα βήµα ενίσχυσης του σήµατος (15µl αβιδίνης και 15µl βιοτίνης διαλύονται σε 15ml TBS-Tween και ακολουθεί επώαση της µεµβράνης για 30 min σε θερµοκρασία δωµατίου). Πλύσεις Ακολουθούν 3 διαδοχικές εκπλύσεις µε TBS-Tween των 5 min και 2 µε TBS (1x) των 5 min. 146

153 Υλικά και Μέθοδοι Εµφάνιση του συµπλόκου αντιγόνου-αντισώµατος µε την τεχνική της ενισχυµένης χηµειοφωταύγειας ( E C L ). Χρησιµοποιήθηκε η τεχνική ECL (Enchanced Chemilunescent substrate: ECL) (Amersham Pharmacia Biotech., UK) η οποία βασίζεται στην αρχή της χηµειοφωταύγειας και έχει µεγάλη ευαισθησία. Το δεύτερο αντίσωµα φέρει συνδεδεµένο οµοιοπολικά ένα ένζυµο την υπεροξειδάση η οποία καταλύει την οξείδωση της λουµινόλης. Κατά την αντίδραση αυτή παράγονται φωτόνια τα οποία φανερώνουν τη θέση του συµπλόκου αντιγόνου-αντισώµατος όταν η µεµβράνη εκτεθεί για σύντοµο χρονικό διάστηµα, ανάλογα µε την ένταση του σήµατος, σε X- ray film CP-BU (Agfa). Σηµαντικό πλεονέκτηµα της µεθόδου αυτής είναι ότι µπορούµε να αποµακρύνουµε τα αντισώµατα από τη µεµβράνη (stripping) και να την επωάσουµε µε άλλα. Η ενισχυµένη χηµειοφωταύγεια βασίζεται στην αντίδραση της λουµινόλης (3- amino-phthalhydrazide) µε έναν οξειδωτικό παράγοντα, όπως το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Αυτή η αντίδραση καταλύεται από µεταλλικά ιόντα σε υψηλό ph, οδηγώντας σε εκποµπή µπλε φωτός (µέγιστη εκποµπή περίπου 425nm). Σε χαµηλότερο ph, η αντίδραση καταλύεται από ένζυµα που περιέχουν συστατικά αιµοσφαιρίνης, όπως η υπεροξειδάση, η καταλάση, το κυτόχρωµα C και η αιµοσφαιρίνη. Παρόλα αυτά η εκποµπή του φωτός είναι ασθενής µε χρόνο ηµιζωής µερικών δευτερολέπτων. Η παρουσία µιας σειράς µορίων ενισχυτών αυξάνει την διάρκεια και ένταση της εκποµπής του φωτός από την υπεροξειδάση περίπου 100 φορές και αλλάζει την κινητική έτσι ώστε να παράγεται µια σταθερή λάµψη που διαρκεί αρκετές ώρες (Thorpe et al, 1986). Τα φωτόνια που παράγονται φανερώνουν τη θέση του συµπλόκου αντιγόνου αντισώµατος, όταν η µεµβράνη εκτεθεί για σύντοµο χρονικό διάστηµα σε X ray film CP BU (Agfa). Χρησιµοποιούνται 2 διαλύµατα, το Luminol / Enchancer και το διάλυµα υπεροξειδίου. Τα δύο διαλύµατα αναµιγνύονται σε αναλογία 1:1, σε ποσότητα 100 λ/cm 2 επιφάνειας µεµβράνης. 147

154 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 88. Απεικόνιση ηλεκροµεταφοράς (α) και ανίχνευσης αντισωµάτων (β). Εικόνα 89. Αφού το πρώτο αντίσωµα συνδεθεί στην πρωτεΐνη στόχο, σχηµατίζεται σύµπλοκο µε το δεύτερο αντίσωµα το οποίο είναι ενωµένο µε υπεροξειδάση (HRP). Ακολουθεί η προσθήκη του υποστρώµατος που είναι υπεύθυνο για την παραγωγή φωτονίων και εµφάνιση σε φιλµ. 148

155 Υλικά και Μέθοδοι Αποµάκρυνση Αντισωµάτων (Stripping) Όπως προαναφέρθηκε η χρήση της µεθόδου ECL έχει το βασικό πλεονέκτηµα ότι είναι δυνατή η αποµάκρυνση των αντισωµάτων που έχουν προσδεθεί αρχικά στη µεµβράνη (stripping) και η επώασή της µε διαφορετικό αντίσωµα. Συγκεκριµένα η µεµβράνη, µετά την εµφάνιση µε το σύστηµα ECL, επωάζεται σε διάλυµα αποµάκρυνσης αντισωµάτων για 30 min σε υδατόλουτρο 70 ο C υπό συνεχή ανακίνηση. Ακολουθούν πλύσεις µε TBS (1x) (2 x 5min). Στη συνέχεια µπορούµε να προσδέσουµε ένα διαφορετικό αντίσωµα βάσει της πειραµατικής πορείας που προαναφέρθηκε ξεκινώντας από το βήµα 2 (κορεσµός των µη ειδικών θέσεων δέσµευσης της µεµβράνης). ιάλυµα stripping 10ml 0.5 M Tris-Cl, ph 6.8 2ml 10% SDS µl β-µερκαπταιθανόλη Το διάλυµα stripping απαιτεί προεπώαση για 15 min στους 70 ο C. Ακολουθεί επώαση της µεµβράνης για 30 min στους 70 ο C. Η β-µερκαπτοαιθανόλη είναι άκρως τοξική και για αυτό απαιτείται η χρήση µέσων προφύλαξης (γάντια, µάσκα), ενώ η εργασία πραγµατοποιείται στον απαγωγό. 149

156 Υλικά και Μέθοδοι ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ (Immunoprecipitation) Πρόκειται για µια διαδικασία κατά την οποία ένα αντίσωµα ειδικό για ένα πρωτεϊνικό αντιγόνο που περιέχεται σε ένα µίγµα πρωτεϊνών, χρησιµοποιείται για την αποµόνωση και αποµάκρυνση του συγκεκριµένου αντιγόνου από το µίγµα, µε σκοπό την ποσοτική και ποιοτική µελέτη ορισµένων χαρακτηριστικών του όπως το µοριακό βάρος ή το ισοηλεκτρικό σηµείο. Το αντίσωµα έχει προσδεθεί σε σωµάτια στερεής φάσης (π.χ. σφαιρίδια αγαρόζης) είτε άµεσα µε χηµικό δεσµό είτε έµµεσα. Η άµεση πρόσδεση µπορεί να επιτευχθεί µε τη χρήση ενός αντι-αντισώµατος (δεύτερου αντισώµατος) όπως το rabbit antimouse Ig αντίσωµα είτε µε τη χρήση κάποιας άλλης πρωτεΐνης µε ειδική συγγένεια για το Fc τµήµα των Ig µορίων, όπως η πρωτεΐνη Α ή η πρωτεΐνη G από σταφυλόκοκκους. Η επιλογή της πρωτεΐνης εξαρτάται από το είδος του οργανισµού που έγινε η παραγωγή του αντισώµατος. Για παράδειγµα η πρωτεΐνη Α δεσµεύεται ισχυρά σε IgGs που προέρχονται από κουνέλι, γάτα, άνθρωπο ή χοιρίδια αλλά και IgG 2a και IgG 2b ποντικού. Η πρωτεΐνη G δεσµεύεται ισχυρά σε IgGs βοός, αλόγου, κουνελιού, χοιριδίου, αιγός αλλά και IgG 1 και IgG 2 ποντικού. Αφού τα επικαλυµµένα µε αντίσωµα σφαιρίδια επωαστούν µε το διάλυµα του αντιγόνου, τα µόρια που δεν έχουν προσδεθεί αποµακρύνονται µε ξεπλύµατα από το σύµπλοκο σφαιρίδιο-αντίσωµα-αντιγόνο. Το αντιγόνο που επιθυµούµε απελευθερώνεται από το αντίσωµα µε αλλαγή του ph ή µε άλλες συνθήκες που ελαττώνουν τη συγγένεια της πρόσδεσης αντισώµατος-αντιγόνου. Το καθαρισµένο αντιγόνο µπορεί να αναλυθεί µε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και άλλες συνηθισµένες βιοχηµικές τεχνικές. 150

157 Υλικά και Μέθοδοι Οι πίνακες που παρατίθενται παρακάτω περιλαµβάνουν τα υλικά που χρησιµοποιούµε για την παρασκευή του ρυθµιστικού διαλύµατος λύσης των κυττάρων, καθώς και µια αναλυτική αναφορά στους αναστολείς πρωτεασών που περιλαµβάνονται στο διάλυµα. Ρυθµιστικό διάλυµα λύσης 50 mm Tris-Cl ph mm NaCl 5 mm EDTA 1% Triton-X mm sodium vanadate 1mM PMSF Protease inhibitor cocktail* * Μείγµα αναστολέων πρωτεασών Αναστολέας πρωτεασών σερίνης AEBSF (τρυψίνη, χυµοτρυψίνη) Αναστολέας µεταλλοπρωτεασών EDTA (δέσµευση δισθενών κατιόντων) Αναστολέας αµινοπεπτιδασών Bestatin (αµινοπεπτιδάσες λευκίνης, αλανίνης) Αναστολέας πρωτεασών κυστεϊνης και θειόλης E-64 (καλπαΐνη, τρυψίνη, παπαΐνη, καθεψίνη B και καθεψίνη L) Αναστολέας πρωτεασών σερίνης και θειόλης Leupeptin (καλπαΐνη, τρυψίνη, παπαΐνη, και καθεψίνη B) Αναστολέας πρωτεασών σερίνης Aprotinin (τρυψίνη, χυµοτρυψίνη, πλασµίνη, τρυψινογόνο, ουροκινάση,καλλικρεΐνη) PMSF Αναστολέας πρωτεασών σερίνης (τρυψίνη) 151

158 Υλικά και Μέθοδοι Πειραµατική πορεία Ανοσοκατακρήµνισης Για κάθε δείγµα της ανοσοκατακρήµνισης συλλέγουµε αιµοκύτταρα από άτοµα του σταδίου περιπλάνησης (χρειάζεται για κάθε ανοσοκατακρήµνιση περίπου 300γ πρωτεΐνης). Τα αιµοκύτταρα που αποµονώνονται µπορούν να φυλαχτούν ως ίζηµα αρχικά σε υγρό άζωτο για min και στη συνέχεια µπορούν να αποθηκευτούν στους -80 ο C. Η λύση των αιµοκυττάρων γίνεται µε ρυθµιστικό διάλυµα λύσης (300 µl/δείγµα) για min σε πάγο. Ακολουθεί επεξεργασία µε υπερήχους (3x15sec στα 10 microns) και τοποθέτηση σε πάγο για 10min. Στη συνέχεια πραγµατοποιούµε φυγοκέντρηση στις rpm, για 15 min, στους 4 0 C προκειµένου να αποµακρυνθούν όλα τα άσπαστα κύτταρα. Συλλέγουµε το υπερκείµενο που αποτελεί το πρωτεϊνικό εκχύλισµα των αιµοκυττάρων και η συγκέντρωση του υπολογίζεται µε τη µέθοδο Bradford. Το εκχύλισµα επωάζεται µε 1-2 µg αντισώµατος για 2 ώρες στους 4 0 C υπό συνεχή ανάδευση. Το σύµπλοκο του αντιγόνου µε το αντίσωµα κατακρηµνίζεται µε τη βοήθεια σφαιριδίων (δεσµευµένα µε αγαρόζη ή µαγνητικά) τα οποία επωάζονται για 1 ώρα µε το πρωτεϊνικό εκχύλισµα στους 25 ο C. Η κατακρήµνιση του συµπλόκου σφαιρίδια-αντίσωµα-αντιγόνο γίνεται είτε µε φυγοκέντρηση στις 1000 rpm για 1 min (σφαιρίδια αγαρόζης) είτε µε µαγνήτη (µαγνητικά σφαιρίδια). Ακολουθούν 4-5 πλύσεις του συµπλόκου µε TBS. Τέλος προστίθεται ρυθµιστικό διάλυµα δειγµάτων για ηλεκτροφόρηση (50 µl/ δείγµα). Μίγµα του αντιγόνου που µας ενδιαφέρει Προσθήκη αντισώµατος έναντι του αντιγόνου που µας ενδιαφέρει Κατακρήµνιση του συµπλόκου αντιγόνουαντισώµατος µε τη βοήθεια σφαιριδίων δεσµευµένων µε µαγνητικά σφαιρίδια Αποµάκρυνση των αντιγόνων που δεν έχουν προσδεθεί στο αντίσωµα Απελευθέρωση του αντιγόνου από το αντίσωµα µε αλλαγή του ph ή µε άλλες συνθήκες που ελαττώνουν τη συγγένεια πρόσδεσης αντισώµατοςαντιγόνου. µε άλλα αντιγόνα Εικόνα 90. Τα βασικά στάδια µιας ανοσοκατακρήµνισης. 152

159 Υλικά και Μέθοδοι Ανοσοεντοπισµός πρωτεϊνών Με µικροσκοπία φωτονική και φθορισµού Για τον εντοπισµό ενός συγκεκριµένου αντιγόνου στην επιφάνεια ή στο εσωτερικό των κυττάρων χρησιµοποιούνται αντισώµατα συζευγµένα είτε µε κάποιο ένζυµο είτε µε κάποια φθορίζουσα ουσία. Στην πρώτη περίπτωση, το ένζυµο (π.χ. υπεροξειδάση, αλκαλική φωσφατάση) επωάζεται µε το κατάλληλο χρωµογόνουπόστρωµα και σχηµατίζεται ως προϊόν ενζυµικής αντίδρασης, ένα αδιάλυτο χρωµατιστό ίζηµα, που κατακρηµνίζεται στην περιοχή σχηµατισµού του συµπλόκου αντιγόνου-αντισώµατος. Με αυτό τον τρόπο, η περιοχή γίνεται ορατή µε ένα απλό φωτονικό µικροσκόπιο. Στην περίπτωση που το αντίσωµα είναι δεσµευµένο µε φθορίζουσα ουσία (π.χ. φλουοροσεΐνη (FITC), ροδαµίνη (TRITC)) το παρασκεύασµα παρατηρείται σε µικροσκόπιο φθορισµού. Μια βασική διαφορά των δύο µεθόδων είναι ότι η πρώτη µέθοδος επιτρέπει τη µελέτη λεπτοµερειών στη δοµή των κυττάρων αλλά και την αρχιτεκτονική των ιστών και δεν είναι ευαίσθητη στο φως. Αντίθετα, µε τη δεύτερη, είναι δυνατή η ποσοτικοποίηση των αποτελεσµάτων και η ανίχνευση περισσότερων διαφορετικών αντιγόνων λόγω της δυνατότητας χρήσης συγχρόνως πολλών διαφορετικών φθοριζουσών χρωστικών. Στις παραπάνω µεθόδους, το σήµα µπορεί να ενισχυθεί µε τη χρήση τεχνικών sandwich. Για παράδειγµα, αντί να προσδεθεί η υπεροξειδάση σε ένα αντίσωµα ποντικού (mouse antibody) έναντι του αντιγόνου που µας ενδιαφέρει, µπορεί να προσδεθεί σε ένα δεύτερο αντι-αντίσωµα (αντίσωµα κουνελιού έναντι στο αντίσωµα Ig ποντικού, rabbit antimouse Ig antibody) που χρησιµοποιείται για την πρόσδεση στο µη σηµασµένο πρώτο αντίσωµα. Όταν το σήµα προσδεθεί άµεσα στο πρώτο αντίσωµα η µέθοδος καλείται άµεση ενώ όταν προσδεθεί στο δεύτερο ή στο τρίτο αντίσωµα, έµµεση. Σε µερικές περιπτώσεις, µπορούν να χρησιµοποιηθούν σε έµµεσες µεθόδους άλλα µόρια εκτός των αντισωµάτων. Η πρωτεΐνη Α που προσδένεται σε IgG ή η αβιδίνη που προσδένεται στα πρώτα αντισώµατα που είναι σηµασµένα µε βιοτίνη, µπορούν να συζευχθούν µε φθορίζουσες χρωστικές ή ένζυµα. 153

160 Υλικά και Μέθοδοι Πειραµατική διαδικασία ανοσοεντοπισµού µε φωτονικό µικροσκόπιο Τα αιµοκύτταρα καλλιεργούνται σε µονόστοιβα και στη συνέχεια µονιµοποιούνται µε διάλυµα φορµαλδεΰδης 3.7% για 10min. Ακολουθεί κατεργασία µε Protein Blocking Agent για να µειωθεί το φαινόµενο µη ειδικής δέσµευσης των αντισωµάτων. Τα κύτταρα επωάζονται για µία ώρα σε 37 ο C µε αντίσωµα έναντι της προς ανίχνευση πρωτεΐνης (2-4 µg/ml). Στη συνέχεια ακολουθούν εκπλύσεις µε ΤBS και επωάζονται για 10min µε πολυδύναµο µείγµα βιοτινυλιοµένων αντι-igg αντισωµάτων. Ακολουθεί έκπλυση µε ΤBS και επώαση των µονόστοιβων µε διάλυµα αλκαλικής φωσφατάσης που είναι συνδεµένη µε στρεπταβιδίνη, για 10min. Μετά από µια ακόµα έκπλυση µε ΤBS, γίνεται επώαση για 5-10min µε διάλυµα του χρωµογόνου υποστρώµατος της αλκαλικής φωσφατάσης, Fast red, µέχρι την εµφάνιση κόκκινου χρώµατος όπου έχει δηµιουργηθεί σύµπλοκο αντιγόνου και αντισωµάτων. Η διαδικασία ολοκληρώνεται µε µια χρώση αντίθεσης (µπλε) µε αιµατοξυλίνη για 30sec και ξέπλυµα µε νερό. Τέλος στα παρασκευάσµατα προσθέτεται διάλυµα επικάλυψης και κλείνονται µε καλυπτρίδα. Όλη η διαδικασία µε εξαίρεση την επώαση µε το πρώτο αντίσωµα γίνεται σε θερµοκρασία δωµατίου. Τα παρασκευάσµατα παρατηρούνται σε φωτονικό µικροσκόπιο. 154

161 Υλικά και Μέθοδοι Πειραµατική πορεία ανοσοεντοπισµού µε µικροσκοπία φθορισµού Ανίχνευση αντιγόνου που εντοπίζεται στην εξωτερική επιφάνεια της πλασµατικής µεµβράνης Αποµόνωση εντόµων από το στάδιο Wandering Stage (WS). Αποµόνωση των αιµοκυττάρων και αναδιάλυσή τους σε Grace s insect medium. Επώαση των κυττάρων µε καταλλήλους επαγωγείς ή αναστολείς για τον απαιτούµενο για την ουσία χρόνο (συνήθως 30 min). Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε µονόστοιβα ώστε να προσκολληθούν, ο χρόνος προσκόλλησης ποικίλει από 10 µέχρι 90. Ακολουθεί έκπλυση µε TBS (1x) ώστε να αποµακρυνθεί το µη προσκολληµένο υλικό. Τα κύτταρα µονιµοποιούνται µε φορµαλδεΰδη (HCHO 4%) για 10. Αρκετές πλύσεις µε TBS (1x) ώστε να αποµακρυνθεί εντελώς η HCHO. Ακολουθεί κατεργασία µε 5% BSA (σε διάλυµα TBS) ή SuperBlock (PIERCE) για 10 προκειµένου να κορεστούν οι θέσεις µη ειδικής δέσµευσης των αντισωµάτων. Το πρώτο αντίσωµα επωάζεται για 1 ώρα σε συγκέντρωση 5-10 µg/ml (διαλυµένο σε TBS). Η επώαση γίνεται στους 37 ο C, σε επωαστικό κλίβανο. Μετά από τρεις πλύσεις µε TBS, τα κύτταρα επωάζονται για µία ώρα µε το δεύτερο αντίσωµα (αραίωση 1:50 ή 1:100) στο οποίο είναι δεσµευµένη φλουοροσεΐνη (FITC) ή άλλο φθορόχρωµα (π.χ. TRITC). Η επώαση γίνεται στους 37 ο C, σε επωαστικό κλίβανο. Από το βήµα αυτό και µετά, η διαδικασία λαµβάνει χώρα στο σκοτάδι λόγω της φωτοευαισθησίας της φλουοροσεΐνης. Ακολουθούν τρεις εκπλύσεις µε TBS, τοποθέτηση µίας σταγόνας µέσου επικάλυψης κατάλληλου για τη διατήρηση του φθορισµού (anti-fade) και κλείσιµο µε καλυπτρίδα. Τα παρασκευάσµατα παρατηρούνται σε µικροσκόπιο φθορισµού εντός λίγων ηµερών. 155

162 Υλικά και Μέθοδοι Ανίχνευση κυτταροπλασµατικού αντιγόνου, αποµάκρυνση της διαλυτής πρωτεΐνης. Αποµόνωση εντόµων από το στάδιο Wandering Stage (WS). Αποµόνωση των αιµοκυττάρων και αναδιάλυσή τους σε Grace s insect medium. Επώαση των κυττάρων µε καταλλήλους επαγωγείς ή αναστολείς για τον απαιτούµενο για την ουσία χρόνο (συνήθως 30 min). Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε µονόστοιβα ώστε να προσκολληθούν, ο χρόνος προσκόλλησης ποικίλει από 10 µέχρι 90. Ακολουθεί έκπλυση µε TBS (1x) ώστε να αποµακρυνθεί το µη προσκολληµένο υλικό. Έκπλυση µε απορρυπαντικό TRITON X-100 (0,01%). Επώαση σε µεθανόλη (100%) στους -20 ο C, για 30. Αρκετές πλύσεις µε TBS (1x). Ακολουθεί κατεργασία µε 5% BSA (σε διάλυµα TBS) ή SuperBlock (PIERCE) για 10 προκειµένου να κορεστούν οι θέσεις µη ειδικής δέσµευσης των αντισωµάτων. Το πρώτο αντίσωµα επωάζεται για 1 ώρα σε συγκέντρωση 5-10 µg/ml (διαλυµένο σε TBS). Η επώαση γίνεται στους 37 ο C, σε επωαστικό κλίβανο. Μετά από τρεις πλύσεις µε TBS, τα κύτταρα επωάζονται για µία ώρα µε το δεύτερο αντίσωµα (αραίωση 1:50 ή 1:100) στο οποίο είναι δεσµευµένη φλουοροσεΐνη (FITC) ή άλλο φθορόχρωµα (π.χ. TRITC). Η επώαση γίνεται στους 37 ο C, σε επωαστικό κλίβανο. Από το βήµα αυτό και µετά, η διαδικασία λαµβάνει χώρα στο σκοτάδι λόγω της φωτοευαισθησίας της φλουοροσεΐνης. Ακολουθούν τρεις εκπλύσεις µε TBS, τοποθέτηση µίας σταγόνας µέσου επικάλυψης κατάλληλου για τη διατήρηση του φθορισµού (anti-fade) και κλείσιµο µε καλυπτρίδα. Τα παρασκευάσµατα παρατηρούνται σε µικροσκόπιο φθορισµού εντός λίγων ηµερών. Tα παραπάνω πρωτοκόλλα µπορούν να τροποποιηθούν καταλλήλως για ταυτόχρονο ανοσοεντοπισµό δυο αντιγόνων. Για την εκτέλεση µιας τέτοιας εργασίας αρκεί τα αντισώµατα που χρησιµοποιούνται για την ανίχνευση να έχουν διαφορετική προέλευση (π.χ. anti-mouse & anti-rabbit) και φυσικά να είναι διαθέσιµα φθοροχρώµατα µε διαφορετικό φάσµα εκποµπής (π.χ. Fitc & Tritc). 156

163 Υλικά και Μέθοδοι Σήµανση Escherichia coli µε FITC Καλλιεργούµε τα βακτήρια σε 5-10ml θρεπτικού µέσου στους 37 0 C overnight. Αρχικά γίνεται φυγοκέντρηση 1ml καλλιέργειας Escherichia coli στις 5000 στροφές για 10min και το ίζηµα επαναιωρείται σε 1ml PBS. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 5000 στροφές για 10min, επαναιώρηση του ιζήµατος και επανάληψη τριών εκπλύσεων µε PBS και µιας µε d-h 2 O. Το ίζηµα που προκύπτει αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο (εναλλακτικά επαναιωρείται σε HCHO 3,7% όπου παραµένει για 10 λεπτά). Στη συνέχεια επαναλαµβάνεται φυγοκέντρηση στις 5000 στροφές για 10min και προσθήκη 500µl διαλύµατος FITC (2mg/ml σε 0,5M Na 2 CO 3 /0,5M NaHCO 3 ) στο ίζηµα των βακτηρίων. Τα κύτταρα επωάζονται στο σκοτάδι υπό συνεχή ανάδευση για 30min. Αφού ξεπλυθούν τέσσερις φορές (3x PBS και 1x dd-h 2 O) ακολουθεί spin (αποµάκρυνση συσσωµατωµάτων), γίνεται επαναιώρηση σε 500λ Grace και αποθήκευση στους -20 ο C. 157

164 Υλικά και Μέθοδοι ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ (Flow Cytometry) Η κυτταροµετρία ροής είναι µια τεχνική αυτοµατοποιηµένης κυτταρικής ανάλυσης που επιτρέπει τη µέτρηση µεµονωµένων σωµατιδίων (κυττάρων, πυρήνων, χρωµοσωµάτων κ.λ.π) καθώς διέρχονται σε νηµατική ροή από ένα σταθερό σηµείο όπου προσπίπτει µια ακτίνα laser. Το πεδίο εφαρµογών της κυτταροµετρίας ροής είναι τεράστιο και περιλαµβάνει διαφόρους κλάδους της επιστήµης, αλλά η πιο σηµαντική εφαρµογή της είναι ο κλάδος της κυτταρικής βιολογίας. Στην κυτταροµετρία ροής απαραίτητη προϋπόθεση είναι τα κύτταρα να βρίσκονται υπό µορφή εναιωρήµατος ώστε ένα-ένα να εστιάζονται στο σηµείο ανάλυσης, όπου γίνεται η µέτρηση των διαφόρων παραµέτρων τους. Στο σηµείο ανάλυσης περνούν µερικές χιλιάδες κύτταρα ανά δευτερόλεπτο. Ένας κυτταροµετρητής ροής αποτελείται από τρία συστήµατα: α) σύστηµα ροής, β) οπτικό σύστηµα και γ) ηλεκτρονικό σύστηµα. Το υπό εξέταση υλικό πρέπει να οδηγηθεί στο σηµείο της ανάλυσης. Αυτό πραγµατοποιείται µε την έγχυση του µέσα σε ένα άλλο αδρανές υγρό και στη συνέχεια µε ειδικές υδροδυναµικές ρυθµίσεις επιτυγχάνεται η κίνηση των κυττάρων του ενός πίσω από το άλλο στο κέντρο της ροής. Η διάµετρος του αυλού µειώνεται σταδιακά όσο πλησιάζει προς το σηµείο ανάλυσης. Εκεί ένα-ένα κύτταρο έρχεται σε επαφή µε µια ακτίνα που εκπέµπεται από µια πηγή ακτινοβολίας laser. Η ισχύς της πηγής κυµαίνεται από 0,5mW-5,0W, ενώ το µήκος κύµατος της εκπεµπόµενης ακτινοβολίας µεταξύ nm. Το µήκος κύµατος της δέσµης που εκπέµπουν αυτές οι πηγές παίζει πρωτεύοντα ρόλο και αυτό γιατί τα κύτταρα πριν εξεταστούν από τον κυτταροµετρητή ροής τα επεξεργαζόµαστε µε µονοκλωνικά αντισώµατα που έχουν την ιδιότητα αφενός να ενώνονται µε συγκεκριµένα χαρακτηριστικά αντιγόνα της επιφάνειας των κυττάρων και αφετέρου είναι συζευγµένα µε φθορίζουσες ενώσεις. Οι φθορίζουσες ενώσεις διεγείρονται σε ένα αυστηρά περιορισµένο φάσµα ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας. Άρα το µήκος κύµατος της πηγής laser καθορίζει ποιες ουσίες µπορεί να χρησιµοποιηθούν ως ανιχνευτές. Οι συνηθέστερα χρησιµοποιούµενες φθορίζουσες χρωστικές είναι α) ισοθειοκυανική φλουοροσεΐνη (FITC) µε πράσινο φθορισµό, β) η ισοθειοκυανική τετραµεθυλροδαµίνη (ΤRICH) µε κόκκινο φθορισµό και γ) οι 158

165 Υλικά και Μέθοδοι φυκοχολοπρωτεΐνες, όπως η φυκοερυθρίνη και η φυκοκυανίνη µε µεγάλη διασπορά τιµών στα φάσµατα διέγερσης και εκποµπής. Πίνακας 3. Κάθε φθορόχρωµα έχει το δικό του φάσµα διέγερσης (Εxcitation spectrum: η περιοχή των µηκών κύµατος φωτός που προκαλούν το φθορισµό του) και ένα φάσµα εκποµπής (Emission spectrum: η περιοχή του φθορισµού που εκπέµπεται). Κάθε φθορόχρωµα έχει το δικό του φάσµα διέγερσης (η περιοχή των µηκών κύµατος φωτός που προκαλούν το φθορισµό του) και ένα φάσµα εκποµπής (η περιοχή του φθορισµού που εκπέµπεται). Εφόσον οι κυτταροµετρητές ροής χρησιµοποιούν ακτινοβολία laser, το µήκος κύµατος του laser πρέπει να βρίσκεται µέσα στα όρια του φάσµατος διέγερσης. Όταν χρησιµοποιούνται δυο χρωστικές µαζί, τα φάσµατα διέγερσης πρέπει να επικαλύπτουν το µήκος κύµατος του laser, αλλά τα φάσµατα εκποµπής πρέπει να διαφέρουν. Όταν ένα συστατικό απορροφά φως, τα ηλεκτρόνια µεταφέρονται από µια κατάσταση ελάχιστης ενέργειας σε µια διεγερµένη κατάσταση. Τα ηλεκτρόνια επιστρέφουν στην κατάσταση ελάχιστης ενέργειας µέσω ποικίλων οδών. Κάποιες διαδικασίες όπως η απώλεια ενέργειας µε τη µορφή θερµότητας δεν οδηγούν σε φθορισµό, αλλά συγκεκριµένα µόρια χάνουν επίσης ενέργεια µέσω φθορισµού. Στο σηµείο υδροδυναµικής εστίασης η ακτίνα laser χτυπά µεµονωµένα κύτταρα µε αποτέλεσµα καταρχάς τη σκέδαση της ακτίνας. Ως σκέδαση εννοούµε τη διάχυση 159

166 Υλικά και Μέθοδοι της προσπίπτουσας, µετά τη σύγκρουσή της µε το κύτταρο, προς όλες τις κατευθύνσεις στο χώρο. Το σκεδασµένο φως ανιχνεύεται υπό διαφορετικές γωνίες ανάλογα µε τη διάταξη ειδικών ανιχνευτών (βολταϊκών φωτοδιόδων). Αν η φωτοδίοδος βρίσκεται µπροστά από το κύτταρο µετράται το οριζόντιο σκεδαζόµενο φως (FSC). Αν η φωτοδίοδος είναι κάθετη προς την προσπίπτουσα ακτινοβολία τότε ανιχνεύεται η κάθετη σκέδαση του φωτός (SSC). Το οριζόντια σκεδαζόµενο φως δίνει στοιχεία για τον όγκο (µέγεθος) του κυττάρου ενώ το υπό ορθή γωνία σκεδαζόµενο φως µας δίνει στοιχεία για την υφή του εσωτερικού του κυττάρου και ιδίως την κοκκίωσή του. Εκτός από τα δυο αυτά οπτικά σήµατα που προαναφέρθηκαν παράγεται και ένα τρίτο ο φθορισµός. Πρόκειται για µια ιδιότητα που έχουν ορισµένες ουσίες να εκπέµπουν δευτερεύουσα ακτινοβολία όταν διεγείρονται από µια άλλη πρωτογενή. Η διεγείρουσα και η εκπεµπόµενη ακτινοβολία είναι χαρακτηριστικές για τη φθορίζουσα ουσία. Τέλος παρατηρείται και η απορρόφηση του προσπίπτοντος φωτός. Τα φωτεινά αυτά σήµατα συλλέγονται από τις βολταϊκές φωτοδιόδους και το τελικό προϊόν αυτής της συλλογής είναι ένα ρεύµα παλµού. Το ύψος αυτού του ρεύµατος, η διάρκεια του, το σχήµα του µας δίνουν πληροφορίες για το κύτταρο. Τα σήµατα αυτά µετατρέπονται από αναλογικά σε ψηφιακά µε κατάλληλους µετατροπείς. Από την ταξινόµηση χιλιάδων σηµάτων σε µερικά δευτερόλεπτα θα δηµιουργηθούν και οι κατανοµές συχνότητας των παραµέτρων. Έτσι έχουµε κατανοµές συχνότητας µιας παραµέτρου όταν το αναλογικό σήµα που µετράται εκφράζει ένα µόνο χαρακτηριστικό του κυττάρου. Όταν εξετάζονται δυο χαρακτηριστικά έχουµε τις διπαραµετρικές κατανοµές ενώ όταν εξετάζονται περισσότερα χαρακτηριστικά έχουµε πολυπαραµετρικές κατανοµές. Όµως, εκτός από τη µελέτη διαφόρων κυτταρικών χαρακτηριστικών είναι δυνατό η τεχνική της κυτταροµετρίας να χρησιµοποιηθεί και για κυτταρική διαλογή. Αυτό επιτυγχάνεται και µε την εκµετάλλευση της υδροδυναµικής αστάθειας που µεταβάλλει το εναιώρηµα σε σταγονίδια. Φορτίζοντας κατόπιν µε ακτίνα laser τα κύτταρα µπορούµε ανάλογα του φορτίου τους να τα ξεχωρίσουµε και να συλλέξουµε καθαρούς πληθυσµούς κυττάρων. Η ανοσοφαινοτυπική ανάλυση κυτταρικών υποπληθυσµών δίνει σήµερα τη δυνατότητα ταυτόχρονης µέτρησης τεσσάρων δεικτών της επιφάνειας, του 160

167 Υλικά και Μέθοδοι κυτταροπλάσµατος ή του πυρήνα των κυττάρων καθώς και των λειτουργικών ιδιοτήτων µεµονωµένων κυττάρων. Η ανάλυση π.χ του κυτταρικού κύκλου και του DNA, η µέτρηση της απόπτωσης, της κινητικής των µεταβολών του ενδοκυττάρικου ασβεστίου, του δυναµικού της µεµβράνης και του ph, του RNA και πολλών κυτταρικών ενζύµων είναι πλέον καθηµερινές πρακτικές. Σήµερα είναι δυνατόν να µετρηθεί ποσοτικά ο αριθµός των µορίων αντισώµατος που συνδέονται µε κάθε κύτταρο και να υπολογίζεται έτσι από την ένταση φθορισµού ο βαθµός έκφρασης ενός κυτταρικού αντιγόνου. Εικόνα 91. Σχηµατική απεικόνιση κυτταροµετρητή ροής. Ένας κυτταροµετρητής ροής αποτελείται από τρία συστήµατα: α) σύστηµα ροής, β) οπτικό σύστηµα και γ) ηλεκτρονικό σύστηµα. Το υπό εξέταση υλικό πρέπει να οδηγηθεί στο σηµείο της ανάλυσης. Αυτό πραγµατοποιείται µε την έγχυση του µέσα σε ένα άλλο αδρανές υγρό και στη συνέχεια µε ειδικές υδροδυναµικές ρυθµίσεις επιτυγχάνεται η κίνηση των κυττάρων του ενός πίσω από το άλλο στο κέντρο της ροής (Α). ιακρίνεται η δέσµη laser, το σηµείο ανάλυσης (analysis point), ο φωτοπολλαπλασιαστικός σωλήνας (photomultiplier tube) και το σηµείο εξόδου (breakoff point) (Β). 161

168 Υλικά και Μέθοδοι Πειραµατική διαδικασία ετοιµασίας δειγµάτων για ανάλυση µε κυτταροµετρία ροής Αρχικά, αποµονώνονται αιµοκύτταρα (5x10 5 κύτταρα/δείγµα), που επωάζονται σε 100 µl θρεπτικό µέσο Grace s, παρουσία αντισώµατος έναντι της πρωτεΐνης που επιθυµούµε να µελετήσουµε (1:100) για 30 min σε θερµοκρασία δωµατίου.τα εναιωρήµατα των αιµοκυττάρων επωάζονται µε σηµασµένα µε FITC anti-rabbit IgG για 30 min στους 25 ο C. Ακολουθεί προσθήκη 400 µl διαλύµατος Ringer και άµεση κυτταροµετρική ανάλυση. Η παραπάνω διαδικασία χρησιµοποιείται για τον προσδιορισµό των επιφανειακών αντιγόνων. Για τη µελέτη της κυτταροφαγίας της E.coli, τα αιµοκύτταρα επωάζονται σε 100 µl θρεπτικό µέσο Grace s, παρουσία E.coli-FITC (10 βακτήρια ανά αιµοκύτταρο) για το χρονικό διάστηµα που µας ενδιαφέρει, στους 30 ο C, παρουσία ή απουσία αναστολέων (π.χ. της έκκρισης). Η ενδοκυττάρωση της E.coli-FITC προσδιορίζεται µετά από σβήσιµο του φθορισµού των προσκολληµένων E.coli-FITC µε διάλυµα trypan blue 4%. Περίπου κύτταρα από το κάθε δείγµα αναλύονται µε τη χρήση κυτταροµετρητή ροής (Coulter EPICS-XL-MCL cytometer) ενώ τα αποτελέσµατα επεξεργάζονται µε το πρόγραµµα XL-2. Εικόνα 92. Το αιµοκυτταρόµετρο είναι µια ειδική αντικειµενοφόρος µε µια κοιλότητα η οποία υποδιαιρείται σε ένα πλέγµα χαραγών που σχηµατίζουν τετράγωνα. Μπορούµε να µετρήσουµε τον αριθµό των κυττάρων που εµπεριέχει το αρχικό εναιώρηµα από το οποίο πήραµε το δείγµα µας. 162

169 Υλικά και Μέθοδοι ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Τα αντισώµατα µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως εξαιρετικά ειδικά αναλυτικά αντιδραστήρια που προσδιορίζουν την ποσότητα ή παρουσία µιας πρωτεΐνης ή άλλου αντιγόνου. Η µέθοδος αυτή είναι γνωστή ως ELISA. Ένα ένζυµο που αλληλεπιδρά µε ένα άχρωµο υπόστρωµα και παράγει ένα έγχρωµο προϊόν, είναι οµοιοπολικά συνδεδεµένο µε ένα εξειδικευµένο αντίσωµα που αναγνωρίζει ένα αντιγόνο στόχο. Εάν το αντιγόνο είναι παρόν, το σύµπλοκο αντισώµατος-ενζύµου θα προσδεθεί σε αυτό και το ενζυµικό συστατικό του συµπλόκου αντισώµατος-ενζύµου, θα καταλύσει την αντίδραση που παράγει το έγχρωµο προϊόν. Έτσι η παρουσία του έγχρωµου προϊόντος υποδηλώνει την παρουσία του αντιγόνου. Με τη µέθοδο αυτή, µπορεί να ανιχνευτεί λιγότερο από ένα νανογραµµάριο (10-9 g) πρωτεΐνης. Η ELISA πραγµατοποιείται είτε µε πολυκλωνικά είτε µε µονοκλωνικά αντισώµατα, µόνο που η χρήση µονοκλωνικών αντισωµάτων δίνει περισσότερο αξιόπιστα αποτελέσµατα. Τα καταλληλότερα ένζυµα είναι αυτά που µετατρέπουν ένα άχρωµο υπόστρωµα σε ένα έγχρωµο προϊόν, όπως η αλκαλική φωσφατάση που µετατρέπει το p- nitrophenylphosphate (pnpp) σε κίτρινη p-νιτροφαινόλη και η υπεροξειδάση που µετατρέπει τα υποστρώµατα o-phenylenediamine (OPD), 3,3 A5,5 Atetramethylbenzidine base (TMB), και 2,2 A-azo-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) σε προϊόντα µε πορτοκαλί, µπλε και πράσινο χρώµα, αντίστοιχα. Η έµµεση ELISA χρησιµοποιείται για την ανίχνευση της παρουσία του αντισώµατος και είναι η βάση του τεστ για τη µόλυνση µε HIV. Σε αυτό το test, πρωτεΐνες του ιού (αντιγόνο) προσροφώνται στη βάση του µικροφρεατίου. Στη συνέχεια, αντισώµατα του εξεταζόµενου προστίθενται στο καλυµµένο µικροφρεάτιο ώστε να επιτευχθεί η πρόσδεση µε το αντιγόνο. Ακολουθεί προσθήκη αντισωµάτων που φέρουν κάποιο ένζυµο και αναγνωρίζουν τα ανθρώπινα αντισώµατα. Αφού γίνει και η προσθήκη του υποστρώµατος, η πραγµατοποίηση της ενζυµικής αντίδρασης και η παραγωγή έγχρωµου προϊόντος υποδηλώνει ότι ο εξεταζόµενος νοσεί. Η «sandwich» ELISA επιτρέπει την ανίχνευση αλλά και την ποσοτικοποίηση του αντιγόνου. Αντίσωµα έναντι ενός συγκεκριµένου αντιγόνου προσροφάται στη βάση του µικροφρεατίου. Στη συνέχεια, προστίθεται το αντιγόνο (αίµα ή ούρα) που προσδένεται στο αντίσωµα, καθώς και ένα δεύτερο αντίσωµα έναντι του αντιγόνου. Το τελευταίο αντίσωµα είναι συνδεδεµένο µε ένζυµο και ακολουθεί η διαδικασία που 163

170 Υλικά και Μέθοδοι περιγράφηκε στην έµµεση ELISA. Σε αυτή την περίπτωση, η έκταση της αντίδρασης είναι άµεσα ανάλογη µε το ποσό του αντιγόνου που είναι παρόν. Συνεπώς επιτρέπει τη µέτρηση ακόµα και πολύ µικρών ποσοτήτων αντιγόνου. Έµµεση ELISA (ποσοτικός προσδιορισµός αντισωµάτων) Εικόνα 93. Στην έµµεση ELISA, η παραγωγή του χρώµατος προσδιορίζει το ποσό ενός αντισώµατος που προσδένεται σε ένα συγκεκριµένο αντιγόνο. Sandwich ELISA (ποσοτικός προσδιορισµός αντιγόνων) Εικόνα 94. Στην sandwich ELISA, η παραγωγή του χρώµατος προσδιορίζει την ποσότητα του αντιγόνου. Τα σηµασµένα αντισώµατα µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την ανίχνευση µη σηµασµένου αντισώµατος που έχει σχηµατίσει σύµπλοκο µε µη σηµασµένο αντιγόνο. Σε αυτή την περίπτωση, η χρήση του δεύτερου αντισώµατος ενισχύει το σήµα, καθώς δυο τουλάχιστον µόρια του είναι ικανά να προσδένονται σε µη σηµασµένο αντίσωµα. 164

171 Υλικά και Μέθοδοι Πειραµατική διαδικασία για την ELISA Αρχικά γίνεται αποµόνωση αιµοκυττάρων, όπως έχουµε ήδη περιγράψει και επαναιώρησή τους σε Grace. Τα εναιωρήµατα των κυττάρων αφήνονται να ηρεµήσουν για 30 λεπτά. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 1000 rpm για 5 λεπτά, στους 4 C και συλλογή του υπερκειµένου. Τα αιµοκύτταρα επαναιωρούνται σε θρεπτικό µέσο Grace s και επωάζονται παρουσία ή µη ατόµων E.coli για διάφορους χρόνους, ενώ πραγµατοποιείται και επώαση µε κατάλληλους αναστολείς για 15 min πριν την επίδραση της E.coli. Γίνεται νέα φυγοκέντρηση στις 1000 rpm για 5 λεπτά, στους 4 C και συλλογή του υπερκειµένου, το οποίο χρησιµοποιείται σε πειράµατα που έχουν σχέση µε την έκκριση των κυττάρων. Επίσης, συλλέγεται το ίζηµα που αποτελείται από τα κύτταρα. Τα κύτταρα λύονται σε lysis buffer και µε επίδραση υπερήχων (sonication). Η ολική πρωτεΐνη από τα κύτταρα υπολογίζεται µε εφαρµογή της µεθόδου Bradford. Για την εφαρµογή της τεχνικής ELISA χρειάζεται να αραιωθεί το πρωτεϊνικό εκχύλισµα σε συγκέντρωση 2-4 γ/ml. Η αραίωση γίνεται σε Na 2 CO 3 το οποίο πρέπει στο τελικό διάλυµα να έχει συγκέντρωση 50 mm και ph 9. Σε κάθε µικροκυψελίδα ενός µικροπλακιδίου ELISA προστίθεται ποσότητα 100λ από το πρωτεϊνικό εκχύλισµα, έτσι ώστε σε κάθε µικροκυψελίδα να αντιστοιχεί ολική πρωτεΐνη 0,2-0,4 γ. Ακολουθεί επώαση σε θερµοκρασία 4 ο C για όλη τη νύχτα. Μετά το ξέπλυµα των µικροκυψελίδων (4 φορές επί 5 λεπτά) µε TBS-Tween 0,05% (300µl/µικροκυψελίδα) προστίθεται BSA (250µl/µικροκυψελίδα) και γίνεται επώαση στους 4 ο C για όλη τη νύχτα. Αφού ξεπλυθούν οι µικροκυψελίδες (4 φορές επί 5 λεπτά) µε TBS-Tween 0,05% (300µl/µικροκυψελίδα), ακολουθεί επώαση µε το πρώτο αντίσωµα (100µl/µικροκυψελίδα) για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Το αντίσωµα αραιώνεται σε τελική συγκέντρωση 1/1000 σε TBS-Tween 0,05%. Μετά το ξέπλυµα των µικροκυψελίδων (4 φορές επί 5 λεπτά) µε TBS-Tween 0,05% (300µl/µικροκυψελίδα) γίνεται επώαση µε το δεύτερο αντίσωµα 165

172 Υλικά και Μέθοδοι (100µl/µικροκυψελίδα), το οποίο είναι συζευγµένο µε υπεροξειδάση για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Το αντίσωµα αραιώνεται 1/3000 σε TBS- Tween 0,05%. Ακολουθεί ξέπλυµα των µικροκυψελίδων (4 φορές επί 5 λεπτά) µε TBS- Tween 0,05% (300µl/µικροκυψελίδα), προσθήκη 100 µl υποστρώµατος της υπεροξειδάσης και επώαση για 45 λεπτά. Τέλος, διακόπτεται η ενζυµική αντίδραση µε προσθήκη διαλύµατος H 2 SO 4 1Ν και πραγµατοποιείται φωτοµέτρηση στα 490nm. Εικόνα 95. Τα πηγαδάκια που φορτώνονται τα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα για να πραγµατοποιηθεί η τεχνική ELISA. Το κίτρινο χρώµα υποδηλώνει την ένταση της αντίδρασης ενζύµου-υποστρώµατος άρα και την ποσότητα του αντιγόνου που µας ενδιαφέρει σε κάθε πηγαδάκι. 166

173 Αποτελέσµατα Αποτελέσµατα 167

174 Παλαιότερα αποτελέσµατα εργαστηρίου ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γενικές Παρατηρήσεις-Αποτελέσµατα µέχρι σήµερα Η φαγοκυττάρωση αποτελεί ένα κοµβικό γεγονός της ανοσοποιητικής αντίδρασης των οργανισµών σε καταστάσεις µόλυνσης µε παθογόνους µικροοργανισµούς, όπως τα βακτήρια. Παρόλα αυτά, µέχρι σήµερα δεν έχει αποδειχτεί η ακριβής σχέση της µε το πολύπλοκο δίκτυο της ενδοκυτταρικής µεταγωγής σηµάτων στα φαγοκύτταρα. Ωστόσο, στα έντοµα, και συγκεκριµένα στην Ceratitis capitata, έχει γίνει σηµαντική πρόοδος στην κατανόηση των µηχανισµών αναγνώρισης και εσωτερίκευσης της E.coli από τα αιµοκύτταρα, τα οποία ως γνωστόν είναι τα φαγοκύτταρα των εντόµων σε αντιστοιχία µε τα µακροφάγα των θηλαστικών. Στο εργαστήριο µας, λοιπόν, διαπιστώθηκε ότι ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS) επάγει την ενεργοποίηση της Ras / MAPK οδού µεταγωγής σηµάτων στα αιµοκύτταρα και επίσης ότι η κυτταροφαγία της E. coli από τα αιµοκύτταρα πραγµατοποιείται ως µια εξαρτώµενη από τις ιντεγκρίνες διαδικασία (Foukas et al., 1998). Συγκεκριµένα, για την εσωτερίκευση της E. coli απαιτείται η συµµετοχή της υποµονάδας β3 των ιντεγκρινικών υποδοχέων αλλά και αναδιατάξεις του κυτταροσκελετού (Foukas et al., 1998). Ταυτοποιήθηκε, επίσης, η ύπαρξη της Drk, ενός οµολόγου µορίου της Grb2 των θηλαστικών που είχε χαρακτηριστεί στη Drosophila (Olivier et al., 1993). Όπως προαναφέρθηκε η Grb2 τοποθετείται πριν από την Ras/MAPK οδό την οποία και ενεργοποιεί. Η οσµωτική εισαγωγή αντισωµάτων έναντι της Drk πρωτεΐνης στο κυτταρόπλασµα των αιµοκυττάρων της C. capitata αναστέλλει την επαγόµενη από τον LPS έκκριση της p47, µια πρωτεΐνη που δεσµεύει LPS. Αυτά τα αποτελέσµατα έδειξαν ότι η µεταβίβαση σήµατος από τον LPS για την έκκριση ανοσολογικών πρωτεϊνών, γίνεται µέσω του δρόµου των Ras/MAP κινασών, κάτι που για πρώτη φορά αναφέρθηκε όσον αφορά τα ασπόνδυλα, αλλά και τα µακροφάγα. Επιπλέον, πιστοποιήθηκε η παρουσία της FAK στα αιµοκύτταρα των εντόµων και δείχθηκε ότι η E.coli επάγει την ταχύτατη ενεργοποίηση της FAK, αυξάνοντας τα επίπεδα φωσφορυλίωσης της σε τυροσίνες (Metheniti et al. 2001). Συνεπώς, ετέθη ζήτηµα συµµετοχής της FAK στην µεταγωγή σηµάτων που απαιτείται για την αναγνώριση και φαγοκυττάρωση των βακτηρίων. H αναστολή της φωσφορυλίωσης 168

175 Παλαιότερα αποτελέσµατα εργαστηρίου της FAK, από χρήση αντισωµάτων έναντι της αυτής, αλλά και της κυτταροφαγίας των βακτηρίων, καταδεικνύει την φωσφορυλίωση της FAK ως ένα σηµαντικό γεγονός, απαραίτητο για την κυτταροφαγία της E.coli. Με άλλα λόγια η µεταγωγή σηµάτων διαµέσου της FAK επάγει την κυτταροφαγία. Επίσης, η εξέταση του ρόλου της κινάσης Src, εισάγοντας, οσµωτικά, στα κύτταρα αντισώµατα έναντι της Src, απέδειξε ότι η επαγόµενη από τα αντισώµατα αναστολή της λειτουργικότητας της Src είναι αρκετή και ικανή να αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της FAK και κατά συνέπεια την κυτταροφαγία. Εποµένως, η κυτταροφαγία της E.coli από τα αιµοκύτταρα της Μεσογειακής µύγας εξαρτάται από τις ιντεγκρίνες δια µέσου της ενεργοποίησης του συµπλόκου FAK-Src (Metheniti et al. 2001, Foukas et al. 1998). Πρόσφατα, αποδείχθηκε ακόµα, ότι τα αιµοκύτταρα αντιδρούν στην παρουσία των LPS/E. coli µε αλλαγή της µορφολογίας τους και επάγοντας την ενεργοποίηση σηµατοδοτικών µονοπατιών, όπως αυτό των MAP κινασών, της PI3 κινάσης και κυτταρικά µονοπάτια στα οποία συµµετέχουν οι Rho (Lamprou et al. 2005, Soldatos et al. 2003). Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι τα µονοπάτια των ERK και P38 συµµετέχουν στην επαγόµενη από τον LPS έκκριση των αιµοκυττάρων, ενώ όλες οι υποοικογένειες των MAP κινασών φαίνεται πως συµµετέχουν στην επαγόµενη από την E.coli έκκριση. ιαπιστώθηκε, επίσης ότι η επαγόµενη από LPS/E. coli έκκριση αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την εσωτερίκευση των LPS/E.coli (Lamprou et al. 2005). Τέλος, αναλύσεις µε κυτταροµετρία ροής σε αιµοκύτταρα, αποδεικνύουν την αναστολή της κυτταροφαγίας της E. coli από αντισώµατα έναντι των PAPs ή της propo αλλά και από διάφορους αναστολείς πρωτεασών σερίνης. Κατά συνέπεια, διαφαίνεται σαφώς η συµµετοχή του µονοπατιού της προφαινολοξειδάσης στην κυτταροφαγία της E.coli από τα αιµοκύτταρα της C. capitata (Mavrouli et al. 2005). Έτσι, τα µέχρι τώρα δεδοµένα του εργαστηρίου µας αποτέλεσαν το έναυσµα για µια πιο εµπεριστατωµένη µελέτη των οδών µεταγωγής µηνυµάτων που ενεργοποιούνται κατά τις ανοσολογικές αποκρίσεις των εντόµων και στα οποία η FAK παίζει πρωταγωνιστικό ρόλο. 169

176 Αποτελέσµατα ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ 1. Πιστοποίηση της έκφρασης της FAK στα αιµοκύτταρα της C.capitata. Έχει αποδειχτεί ότι τόσο η αλληλουχία της πρωτεΐνης FAK όσο και οι λειτουργίες της είναι συντηρηµένες εξελικτικά. Σχετικά πρόσφατα ταυτοποιήθηκε στη Drosophila µια πρωτεΐνη οµόλογη της FAK των θηλαστικών (DFak56, 140 kda) και διαπιστώθηκε ότι έχει υψηλό βαθµό οµολογίας σε περιοχές βασικές για τη λειτουργία του µορίου όπως η θέση αυτοφωσφορυλίωσης και θέσεις αλληλεπίδρασης µε άλλες κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες (Fox et al., 1999, Palmer et al., 1999, Fujimoto et al., 1999). Από πειράµατα που έγιναν µε in situ υβριδοποίηση και ανοσοϊστοχηµεία διαπιστώθηκε η έκφραση της DFak56 στο κεντρικό νευρικό σύστηµα, τον εβρυϊκό εγκέφαλο, την επιδερµίδα, την νευρική χορδή και στο σπλαγχνικό µεσόδερµα. Ο κύριος τρόπος ρύθµισης της κινάσης αυτής είναι διαµέσου των ιντεγκρινών καθώς η FAK αποτελεί αναπόσπαστο κοµµάτι της οδού µεταγωγής µηνυµάτων µέσω ιντεγκρινών (Zachary and Rozengurt, 1992). Γνωρίζοντας ότι οι ιντεγκρίνες µετέχουν στις ανοσολογικές αποκρίσεις των εντόµων, η πιθανή συµµετοχή της FAK στις διαδικασίες αυτές παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον. Η κινάση FAK έχει πιστοποιηθεί στο εργαστήριο µας στα αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata και µάλιστα έχει διαπιστωθεί ότι το σύµπλοκο FAK/Src συµµετέχει µαζί µε τις ιντεγκρίνες στην κυτταροφαγία των βακτηρίων (Metheniti et al., 2001). Στην παρούσα εργασία µελετήσαµε την έκφραση της FAK στα αιµοκύτταρα της φρουτόµυγας. Για το λόγο αυτό, αποµονώθηκε αιµολέµφος από άτοµα C. capitata του τρίτου προνυµφικού σταδίου και ακολούθησε φυγοκέντρηση προκειµένου να διαχωριστούν τα αιµοκύτταρα από την αιµολέµφο. Μετά τη λύση και την οµογενοποίηση των αιµοκυττάρων, το πρωτεϊνικό τους εκχύλισµα επωάστηκε µε αντίσωµα έναντι της FAK για 2 ώρες στους 4 o C, υπό συνεχή ανάδευση. Το σύµπλοκο του αντιγόνου µε το αντίσωµα κατακρηµνίστηκε µε τη βοήθεια µαγνητικών σφαιριδίων, τα οποία είχαν επωαστεί για µια ώρα µε το πρωτεϊνικό εκχύλισµα στους 25 o C. Το σύµπλοκο σφαιρίδια-αντίσωµα-αντιγόνο ξεπλύθηκε τρεις φορές µε TBS. Οι κατακρηµνισµένες πρωτεΐνες αποδεσµεύτηκαν από τα σφαιρίδια παρουσία διαλύµατος ηλεκτροφόρησης δειγµάτων. Τα δείγµατα (ανοσοΐζηµα, υπερκείµενο εκχύλισµα ανοσοκατακρήµνισης, αντίσωµα έναντι FAK, ολικά εκχυλίσµατα αιµοκυττάρων C.capitata και λευκών αιµοσφαιρίων ανθρώπου) 170

177 Αποτελέσµατα αναλύθηκαν µε SDS-PAGE (σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10%) και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα για την FAK (Εικόνα 96). Το αντίσωµα που χρησιµοποιήθηκε για την διαπίστωση της FAK ήταν έναντι της φωσφοτυροσίνης στην θέση Υ397 που αντιστοιχεί στην κύρια θέση αυτοφωσφορυλίωσης της κινάσης. Υπερκείµενο ανοσ. Ανοσοΐζηµα Αντίσωµα έναντι FAK Ολικό εκχ. αιµοκυτ. C. c Λευκά αιµοσφ. 120 kda 66 kda WB FAK p.y IP FAK Εικόνα 96. Πιστοποίηση της έκφρασης της οµόλογης FAK σε αιµοκύτταρα της C.capitata. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων από προνύµφες C.capitata αναλύθηκε σε πήκτωµα SDS- PAGE 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντισώµατα έναντι FAK θηλαστικών. ιαδροµή 1: Υπερκείµενο εκχύλισµα ανοσοκατακρήµνισης. ιαδροµή 2: Ανοσοΐζηµα. ιαδροµή 3: Αντίσωµα έναντι της FAK. ιαδροµή 4: ολικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων Ceratitis capitata. ιαδροµή 5: Ολικό εκχύλισµα λευκών αιµοσφαιρίων ανθρώπου. Πράγµατι διαπιστώθηκε ότι πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι FAK θηλαστικών αναγνωρίζει µια πεπτιδική αλυσίδα στα 120 kda στα αιµοκύτταρα των εντόµων και µια δεύτερη στα 66 kda, πιθανώς πρωτεολυτικό θραύσµα της FAK. Η πρώτη πεπτιδική αλυσίδα πρέπει να αντιστοιχεί στο άθικτο πρωτεϊνικό µόριο της FAK ενώ η δεύτερη ζώνη πρέπει να αντιστοιχεί σε τµήµα του µορίου, που εµφανώς περιλαµβάνει την φωσφορυλιωµένη τυροσίνη Υ397, αλλά έχει υποστεί θραύση, πιθανότατα από κάποιο πρωτεολυτικό ένζυµο. Επίσης φαίνεται ότι στα λευκά αιµοσφαίρια τα µόρια της FAK έχουν όλα πρωτεολυθεί και για αυτό υπάρχουν δυο µόνο ζώνες (θραύσµατα των άθικτων µορίων) κοντά στα 60 KDa. Εξάλλου, είναι βιβλιογραφικά γνωστό ότι η πρωτεόλυση είναι ένας δραστικός µηχανισµός τερµατισµού µεταγωγής µηνυµάτων από την FAK. Πρωτεόλυση της FAK έχει παρατηρηθεί σε πολλούς κυτταρικούς τύπους ύστερα από έκθεση σε διάφορα ερεθίσµατα (Carragher et al., 1999). Η FAK είναι υπόστρωµα περισσότερων του ενός πρωτεολυτικών ενζύµων τα οποία 171

178 Αποτελέσµατα επάγονται από διαφορετικά ερεθίσµατα για να πρωτεολύσουν την FAK τελικά σε παρόµοια θραύσµατα. Επίσης, ενώ πρωτεόλυση της FAK έχει παρατηρηθεί σε διαφορετικά είδη, η κύρια θέση πρωτεόλυσης που έχει χαρτογραφηθεί δεν είναι εξελικτικά συντηρηµένη (Hauck et al., 2002). 2. Εντοπισµός της FAK µε ανοσοφθορισµό στα αιµοκύτταρα της C.capitata Η ύπαρξη της FAK στα αιµοκύτταρα της C. capitata πιστοποιήθηκε και µε τη µέθοδο του ανοσοφθορισµού (Εικόνα 97). Η ανίχνευση έγινε σε αιµοκύτταρα του σταδίου περιπλάνησης αµέσως µετά την προσκόλλησή τους σε αντικειµενοφόρους για 90 λεπτά. Το συγκεκριµένο αντιγόνο, η FAK, εντοπίζεται στο εσωτερικό του κυττάρου. Για το λόγο αυτό, µετά την παρασκευή των µονόστοιβων και τη µονιµοποίησή τους, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά (επώαση µε 0,01% Triton-X- 100 σε TBS για µερικά δευτερόλεπτα). Η ανίχνευση έγινε µε αντισώµατα έναντι της FAK θηλαστικών (για την ολική FAK και για το φωσφορυλιωµένο κλάσµα της στην θέση Υ397). Το δεύτερο αντίσωµα ήταν συζευγµένο µε το φθορόχρωµα FITC το οποίο όταν διεγερθεί καθιστά τα κύτταρα στα οποία εκφράζεται η FAK, πράσινα λόγω του µήκους κύµατος που φθορίζει. Εικόνα 97. Κατανοµή της FAK και της φωσορυλιωµένης στην τυροσίνη 397 FAK µε ανοσοφθορισµό. (Α). Αιµοκύτταρα του σταδίου περιπλάνησης καλλιεργήθηκαν σε µονόστοιβα για 90 λεπτά και µετά από µονιµοποίηση (µεθανόλη για 30 λεπτά στους -20 ο C), έγιναν διαπερατά µε επώαση µε Triton-X-100. Για την ανίχνευση της ολικής FAK χρησιµοποιήθηκε αντιορός έναντι της FAK θηλαστικών (επώαση για 1 ώρα σε 37 ο C). Το δεύτερο αντίσωµα ήταν συζευγµένο µε FITC. (Β). Αιµοκύτταρα του σταδίου περιπλάνησης καλλιεργήθηκαν σε µονόστοιβα για 90 λεπτά και µετά από µονιµοποίηση (µεθανόλη για 30 λεπτά στους -20 ο C), έγιναν διαπερατά µε επώαση µε Triton-X-100. Για την ανίχνευση της pfak Y397 χρησιµοποιήθηκε αντιορός έναντι της pfak Y397 θηλαστικών (επώαση για 1 ώρα σε 37 ο C). Το δεύτερο αντίσωµα ήταν συζευγµένο µε FITC. Οι φωτογραφίες προέρχονται από συνεστιακό µικροσκόπιο σάρωσης (Confocal Scanning Microscopy, Leica TCS-SP Confocal Microscope, Argon Ion Laser- Helium-Neon Laser, nm). 172

179 Αποτελέσµατα Με τον ανοσοφθορισµό πιστοποιείται η FAK στα αιµοκύτταρα της Μεσογειακής µύγας αλλά και καταδεικνύεται ταυτόχρονα η κατανοµή τόσο της ολικής πρωτεΐνης (FAK c-903) όσο και η κατανοµή του φωσφορυλιωµένου, στην θέση Υ397, κλάσµατος της FAK. Από τις φωτογραφίες παρατηρούµε ότι η κατανοµή διαφέρει. Η ολική πρωτεΐνη δείχνει πως εντοπίζεται σε όλη την έκταση των κυττάρων. Συγκεντρώνεται όµως και σε ορισµένες εστίες, οι οποίες αν αναλογιστούµε το µεγάλο χρόνο προσκόλλησης (90 min) µπορεί να αντιστοιχούν στις εστίες προσκόλλησης και στην συνάθροιση πρωτεϊνών που συνεπάγεται η προσκόλληση των κυττάρων στο υπόστρωµα. Από την άλλη, η pfak Y397 παρουσιάζει ενιαία κατανοµή στα κύτταρα, µε τονισµένη περισσότερο την παρουσία της στην περιφέρεια των κυττάρων. Με προσεκτική παρατήρηση µπορεί κανείς να αντιληφθεί ότι στικτό µοτίβο που επικρατεί σε αυτήν την περίπτωση. 3. Έλεγχος της κατανοµής της FAK σε αιµοκύτταρα αναπτυξιακών σταδίων του εντόµου C.capitata. Είναι γνωστό, από µελέτες στο εργαστήριο µας, ότι τα αιµοκύτταρα όπως και άλλοι ιστοί του εντόµου υπόκεινται σε απόπτωση κατά την ανάπτυξη του εντόµου. Με δεδοµένη, λοιπόν, την πιθανότητα συµβολής της FAK σε µονοπάτια απόπτωσηςεπιβίωσης θα ήταν ενδιαφέρον να παρατηρήσουµε το πρότυπο της αναπτυξιακής κατανοµής της FAK στα αιµοκύτταρα. Τα στάδια που επιλέχτηκαν για να γίνει η ανάλυση είναι το στάδιο της προνύµφης, όπου τα άτοµα συλλέγουν τα θρεπτικά συστατικά που θα χρησιµοποιηθούν στην µετέπειτα πορεία προς την ενηλικίωση, το στάδιο της λευκής νύµφης και της καφέ νύµφης. Τα δυο τελευταία στάδια απέχουν χρονικά ελάχιστα (µόλις 2 ώρες). Κατά την νυµφική περίοδο τα άτοµα φαίνονται αδρανή. Τα φαινόµενα ωστόσο, πολλές φορές απατούν αφού και σε αυτή την περίπτωση στο εσωτερικό της κάθε νύµφης διενεργείται η καταστροφή των παλιών δοµών (µε απόπτωση) και η σύνθεση των νέων δοµών που θα αποτελέσουν τους ιστούς των ενήλικων ατόµων. Στα τρία αυτά στάδια, λοιπόν, µελετήθηκε το αναπτυξιακό πρότυπο της FAK στα αιµοκύτταρα της φρουτόµυγας µε ανοσοφθορισµό (Εικόνα 98) αλλά και µε ανάλυση κατά Western (Εικόνα 99). 173

180 Αποτελέσµατα Εικόνα 98. Το αναπτυξιακό πρότυπο της κατανοµής της FAK στα αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata. (A) Αιµοκύτταρα από το στάδιο περιπλάνησης (wαndering stage), (B) Αιµοκύτταρα από το στάδιο της λευκής νύµφης (white pupae), (C) Αιµοκύτταρα από το στάδιο της καφέ νύµφης (brown pupae). Οι φωτογραφίες προέρχονται από συνεστιακό µικροσκόπιο σάρωσης (Confocal Scanning Microscopy, Leica TCS-SP Confocal Microscope, Argon Ion Laser- Helium-Neon Laser, nm). Από την παραπάνω φωτογραφία φαίνεται ότι η έκφραση της FAK µεταβάλλεται στα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια. Συγκεκριµένα, φαίνεται ότι η µεγαλύτερη έκφραση της FAK απαντά στα αιµοκύτταρα του σταδίου της λευκής νύµφης. Αντίθετα, στο στάδιο της καφέ νύµφης η έκφραση της FAK έχει αισθητά µειωθεί. Η µείωση αυτή µπορεί να είναι αποτέλεσµα πρωτεολυτικής ρύθµισης της διότι τα αιµοκύτταρα σε αυτό το στάδιο είναι αποπτωτικά σε µεγάλο ποσοστό (αδηµοσίευτα αποτελέσµατα) και έντονη παρουσία της FAK δεν ευνοεί την απόπτωση, καθότι η FAK έχει αντιαποπτωτική δράση. Επικύρωση των αποτελεσµάτων µε ανοσοφθορισµό πήραµε µε ανάλυση κατά Western (Εικόνα 99). Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα των αιµοκυττάρων αναλύθηκαν σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE 10% και ανοσοαποτύπωµα έναντι της ολικής FAK. H παρουσία ισόποσων δειγµάτων επιβεβαιώθηκε επανεµφανίζοντας τη µεµβράνη για ακτίνη. Παρατηρούµε ότι τα αποτελέσµατα από την εικόνα 99 συµφωνούν µε τα αποτελέσµατα από τον ανοσοφθορισµό (Εικόνα 98). Η παρατηρούµενη αύξηση στα επίπεδα της FAK ίσως να σχετίζεται µε τον βιολογικό της ρόλο και την αντιαποπτωτική της δράση. Είναι εξάλλου γνωστό ότι στο στάδιο της λευκής νύµφης τα επίπεδα της απόπτωσης είναι αυξηµένα µέσα στο πλαίσιο της καταστροφής των παλαιών δοµών του εντόµου και της σύνθεσης των νέων που θα αποτελέσουν τους ιστούς του ενήλικου ατόµου. Σε αυτή την κατάσταση ίσως είναι απαραίτητα τα αυξηµένα επίπεδα της FAK ώστε να διατηρηθεί υπό έλεγχο 174

181 Αποτελέσµατα η προγραµµατισµένη αυτοκαταστροφή της νύµφης. Αν και από ότι φαίνεται η FAK εκφράζεται περισσότερο στο στάδιο της λευκής νύµφης, τα πειράµατα για την παρούσα εργασία συντελέστηκαν µε άτοµα του σταδίου περιπλάνησης. Η επιλογή αυτή καθορίζεται από τον σκοπό της εργασίας µας που είναι η µελέτη της κυτταροφαγίας στα αιµοκύτταρα. Αν χρησιµοποιούσαµε ως πειραµατικό υλικό πληθυσµό αιµοκυττάρων µε υψηλό δείκτη απόπτωσης τότε τα αποτελέσµατα µας, σε ότι αφορά την κυτταροφαγία, θα ερµηνεύονταν δυσκολότερα δεδοµένης µιας ακόµα µεταβλητής στο σύστηµα που εξετάζουµε. Στάδιο Περιπλάνησης (WS) Λευκή νύµφη (WP) Καφέ νύµφη (BP) WB FAK WB Actin Εικόνα 99. Αναπτυξιακό πρότυπο της FAK σε αιµοκύτταρα διαφόρων σταδίων του εντόµου C.ceratitis. ιαδροµή 1: ολικό εκχύλισµα από αιµοκύτταρα σταδίου περιπλάνησης, ιαδροµή 2: ολικό εκχύλισµα από αιµοκύτταρα του σταδίου της λευκής νύµφης, ιαδροµή 3: ολικό εκχύλισµα από αιµοκύτταρα της καφέ νύµφης. Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα των αιµοκυττάρων αναλύθηκαν σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE 10% και ανοσοαποτύπωµα έναντι ολικής FAK (anti-fak, c-903). H παρουσία ισόποσων δειγµάτων επιβεβαιώθηκε επανεµφανίζοντας τη µεµβράνη για ακτίνη. 175

182 Αποτελέσµατα 4. Αλληλεπίδραση της FAK µε τις ιντεγκρινικές υποµονάδες β1 και β3 στα αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata. Με δεδοµένη την ύπαρξη της FAK στα αιµοκύτταρα της C. capitata, ελέγχθηκε στην συνέχεια αν η πρωτεΐνη αυτή συµπεριφέρεται λειτουργικά όπως η DFak56 και η FAK των σπονδυλωτών. ηλαδή, αν σχηµατίζει λειτουργικό σύµπλοκο µε τις ιντεγκρίνες. Γι αυτό µελετήσαµε την ύπαρξη των ιντεγκρινικών υποδοχέων στα αιµοκύτταρα. Για την ανάλυση επιλέξαµε τις ιντεγκρινικές υποµονάδες β1 και β3 οι οποίες είναι αρκετά συντηρηµένες στους οργανισµούς, από τα έντοµα έως και τον άνθρωπο, και εµπλέκονται σε πληθώρα βιολογικών δράσεων σε πολλούς κυτταρικούς τύπους. Για το σκοπό αυτό αιµοκύτταρα του σταδίου περιπλάνησης καλλιεργήθηκαν ως εναιώρηµα σε θρεπτικό µέσο Grace, δηλαδή. Ακολούθησε λύση των κυττάρων, µε χρήση υπερήχων, µέτρηση της πρωτεΐνης των εκχυλισµάτων µε την µέθοδο Bradford (επιθυµητή συγκέντρωση πρωτεΐνης 500γ) και στην συνέχεια πραγµατοποιήθηκε ανοσοκατακρήµνιση µε αντισώµατα έναντι των β1 και β3 υποµονάδων των ιντεγκρινών υποδοχέων. Anti-β3 Υπερκ. IP IP µεµβρ. Ανοσοΐζηµα Λευκά αιµοσφ. WB Integrin β IP β3integrin Εικόνα 100. Πιστοποίηση της β3 ιντεγκρινικής υποµονάδας στα αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata. Έγινε ανοσοκατακρήµνιση της ιντεγκρινικής υποµονάδας β3 σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της ιντεγκρίνης β3 θηλαστικών. Στην διαδροµή 4 απεικονίζεται η παρουσία της β3 ιντεγκρίνης στα αιµοκύτταρα των εντόµων. ιαδροµή 1. Αντίσωµα έναντι της β3 ιντεγκρίνης, ιαδροµή 2. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της β3 ιντεγκρινικής υποµονάδας, ιαδροµή 3. Ανοσοΐζηµα από κατακρήµνιση β1 ιντεγκρίνης σε µεµβρανικό υπόλειµµα από την λύση των αιµοκυττάρων, ιαδροµή 4. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για την β3 ιντεγκρινη. ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από λευκά αιµοσφαίρια ανθρώπου. 176

183 Αποτελέσµατα Τα ανοσοϊζήµατα αναλύθηκαν σε SDS PAGE και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της β3 ιντεγκρινικής υποµονάδας (Εικόνα 100). Στην διαδροµή 4 της εικόνας 100 πιστοποιείται η παρουσία της β3 ιντεγκρίνης στα αιµοκύτταρα της Μεσογειακής µύγας. Εξάλλου έχει διαπιστωθεί µε κυτταροµετρία ροής (Lamprou et al. 2006, αδηµοσίευτα δεδοµένα), ότι και οι δυο ιντεγκρινικές υποµονάδες (β1 και β3) είναι παρούσες στην επιφάνεια των αιµοκυττάρων των εντόµων. Για να ελεγχθεί η αλληλεπίδραση µε την FAK, η µεµβράνη επωάστηκε µε αντισώµατα έναντι της FAK αφού πρώτα είχαν αποµακρυνθεί τα προηγούµενα αντισώµατα µε τη µέθοδο Striping (Εικόνα 101). Υπερκείµενο εκχύλισµα IP Anti-β1 IP µεµβρανών Ανοσοΐζηµα Υπερκείµενο εκχύλισµα IP Εκχύλισµα λευκών αιµοσφαιρίων Anti-β3 Υπερκείµενο εκχύλισµα IP IP µεµβρανών Ανοσοΐζηµα Εκχύλισµα λευκών αιµοσφαιρίων WB FAK WB FAK IP β1 integrin IP β3integrin Εικόνα 101. Πιστοποίηση της αλληλεπίδρασης των υποµονάδων β1 και β3 των ιντεγκρινών µε την FAK σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων, του 3 ου προνυµφικού σταδίου, της Ceratitis capitata. Έγινε ανοσοκατακρήµνιση των ιντεγκρινικών υποµονάδων β1 και β3 σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK θηλαστικών. Στην αριστερή στήλη απεικονίζεται η συγκατακρήµνιση της β1 ιντεγκρίνης µε την FAK και αντίστοιχα, στην δεξιά στήλη η συγκατακρήµνιση της β3 ιντεγκρίνης µε την FAK. Αριστερά: ιαδροµή 1. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της β1 ιντεγκρινικής υποµονάδας. ιαδροµή 2. Αντίσωµα έναντι της β1 ιντεγκρίνης. ιαδροµή 3. Ανοσοΐζηµα από κατακρήµνιση β1 ιντεγκρίνης σε µεµβρανικό υπόλειµµα από την λύση των αιµοκυττάρων. ιαδροµή 4. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για την β1 ιντεγκρινη. ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της β1 ιντεγκρινικής υποµονάδας. ιαδροµή 6. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από λευκά αιµοσφαίρια ανθρώπου. εξιά: ιαδροµή 1. Αντίσωµα έναντι της β3 ιντεγκρίνης, ιαδροµή 2. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της β3 ιντεγκρινικής υποµονάδας, ιαδροµή 3. Ανοσοΐζηµα από κατακρήµνιση β1 ιντεγκρίνης σε µεµβρανικό υπόλειµµα από την λύση των αιµοκυττάρων, ιαδροµή 4. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για την β3 ιντεγκρινη. ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από λευκά αιµοσφαίρια ανθρώπου. 177

184 Αποτελέσµατα Από την εικόνα 101 φαίνεται ότι και στις δυο περιπτώσεις η FAK συγκατακρήµνιζεται µε τις ιντεγκρινικές υποµονάδες. Αναµφίβολα, λοιπόν, η FAK των αιµοκυττάρων, αλληλεπιδρά µε τις κυτταροπλασµατικές περιοχές των ιντεγκρινών β1 και β3. Ωστόσο, µε τις ανοσοκατακρηµνίσεις και µόνο, δεν µπορεί να αποδειχτεί αν η αλληλεπίδραση είναι άµεση ή έµµεση µε την παρεµβολή, δηλαδή, κάποιας άλλης πρωτεΐνης. Το σηµαντικό, παρόλα αυτά, συµπέρασµα που προκύπτει από αυτά τα πειράµατα είναι το γεγονός ότι η FAK σχηµατίζει σύµπλοκο µε τις ιντεγκρίνες δίχως προηγούµενη διέγερση των ιντεγκρινών (όπως π.χ. επωάζοντας τα αιµοκύτταρα µε φιµπρονεκτίνη). Επίσης, πρέπει να τονιστεί ότι τα κύτταρα δεν ήταν προσκολληµένα σε υπόστρωµα αλλά καλλιεργήθηκαν σε εναιώρηµα. Με τα δεδοµένα αυτά µπορεί να διατυπώσει κανείς δυο υποθέσεις για την κατάσταση των ιντεγρκρινών κατά την αλληλεπίδραση τους µε την FAK. Έτσι, µπορούµε να υποθέσουµε ότι ακόµα και σε εναιώρηµα κυττάρων σε θρεπτικό υλικό, ορισµένα ιντεγκρινικά µόρια είναι ενεργοποιηµένα και κατά συνέπεια να αλληλεπιδρούν µε κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες, όπως τη FAK, προκείµενου να µεταβιβάσουν σήµατα. Ή αντιστρόφως, κυτταροπλασµατικές πρωτεΐνες (συµπεριλαµβανοµένης και της FAK) διεγείρουν τις ιντεγκρίνες από την στιγµή που αλληλεπιδρούν µαζί τους σε αιµοκύτταρα που βρίσκονται σε εναιώρηµα (inside out signaling). Ως δεύτερη υπόθεση µπορούµε να ισχυριστούµε ότι οι ιντεγκρίνες απουσία ερεθισµάτων, δηλαδή στην ανενεργή- «διπλωµένη» διαµόρφωση τους, αλληλεπιδρούν κυτταροπλασµατικά µε την FAK σχηµατίζοντας λειτουργικά σύµπλοκα. Όποια κι αν είναι η σωστή υπόθεση που ερµηνεύει τα παραπάνω δεδοµένα το γεγονός είναι ότι και οι δύο υποθέσεις υπαινίσσονται την προΰπαρξη συµπλόκου µεταβίβασης σηµάτων µεταξύ ιντεγκρινών και FAK σε αιµοκύτταρα που βρίσκονται σε εναιώρηµα. 5. Πιστοποίηση της παξιλίνης µε ανοσοκατακρήµνιση και εντοπισµός της µε ανοσοφθορισµό στα αιµοκύτταρα της C.capitata. Με την διαπίστωση του συµπλόκου ανάµεσα στις ιντεγκρίνες και στην FAK, το επόµενο ερώτηµα που θελήσαµε να απαντήσουµε ήταν αν η FAK αλληλεπιδρά µε κάποια πρωτεΐνη από τις φερόµενες ως άµεσα συνδεόµενες µε τις ιντεγκρίνες όπως είναι η ταλίνη και η παξιλίνη. Από αυτές τις δυο επιλέξαµε να µελετήσουµε την 178

185 Αποτελέσµατα παξιλίνη. Πριν όµως από τη µελέτη της παξιλίνης ως προς την αλληλεπίδραση της µε την FAK θα πρέπει να πιστοποιήσουµε κατά πρώτο λόγο την ύπαρξή της στα κύτταρα του εντόµου C.capitata και κατά δεύτερο λόγο την κατανοµή της στα αιµοκύτταρα της. Η πιστοποίηση της παξιλίνης έγινε µε ανοσοκατακρήµνιση και ανάλυση κατά Western (Εικόνα 102). Για την πραγµατοποίηση του πειράµατος αιµοκύτταρα από προνύµφες του σταδίου περιπλάνησης αποµονώθηκαν και επωάστηκαν για µικρό χρονικό διάστηµα σε θρεπτικό µέσο για ηρεµία. Ακολούθησε λύση των κυττάρων, µε χρήση υπερήχων, µέτρηση της πρωτεΐνης των εκχυλισµάτων µε την µέθοδο Bradford (επιθυµητή συγκέντρωση πρωτεΐνης 300γ) και στην συνέχεια πραγµατοποιήθηκε ανοσοκατακρήµνιση µε αντίσωµα έναντι της παξιλίνης θηλαστικών (Εικόνα 102). Anti-paxillin Υπερκ. IP Ανοσοΐζηµα Σφαιρίδια IP Υπερκ. Σφαιριδίων Ολικό εκχ. Αιµοκυτ. C.c. WB Paxillin IP paxillin Εικόνα 102. Πιστοποίηση της παξιλίνης σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων της Ceratitis capitata. Έγινε ανοσοκατακρήµνιση της παξιλίνης σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντισώµατα έναντι της παξιλίνης θηλαστικών. ιαδροµή 1. Αντίσωµα έναντι της παξιλίνης. ιαδροµή 2. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της παξιλίνης. ιαδροµή 3. Ανοσοΐζηµα από κατακρήµνιση παξιλίνης. ιαδροµή 4. Ανοσοΐζηµα ανοσοκατακρήµνισης για τα σφαιρίδια µε τα οποία έγινε η κατακρήµνιση της παξιλίνης. ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση σφαιριδίων. ιαδροµή 6. Ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισµα από αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata. Παρατηρώντας τα αποτελέσµατα της ανοσοκατακρήµνισης πιστοποιείται η ύπαρξη της παξιλίνης στα αιµοκύτταρα. Στο ανοσοΐζηµα διαπιστώνουµε 3 τουλάχιστον έντονες ζώνες, οι οποίες διακρίνονται και στο ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισµα των αιµοκυττάρων και στο υπερκείµενο πρωτεϊνικό εκχύλισµα της 179

186 Αποτελέσµατα ανοσοκατακρήµνισης. Τα µοριακά βάρη αυτών των ζωνών είναι 71 kda, 64 kda και 34 kda. Το µοριακό βάρος της παξιλίνης είναι kda περίπου. Κατά συνέπεια, λοιπόν, το αντίσωµα που χρησιµοποιήσαµε αναγνωρίζει περισσότερες από µια πολυπετιδικές ζώνες οι οποίες µπορεί είτε να είναι προϊόντα της ίδιας πρωτεΐνης µετά από πρωτεόλυση της είτε είναι διαφορετικές πρωτεΐνες οι οποίες όµως αναγνωρίζονται από το χρησιµοποιούµενο αντίσωµα. Όσον αφορά την πρωτεόλυση υπάρχουν βιβλιογραφικές αναφορές που υποστηρίζουν την θραύση της παξιλίνης από πρωτεολυτικά ένζυµα. Η κατανοµή της πρωτεΐνης στα αιµοκύτταρα µελετήθηκε µε ανοσοφθορισµό (για την ακρίβεια έγινε διπλός ανοσοφθορισµός για παξιλίνη και τουµπουλίνη) (Εικόνα 103). Εικόνα 103. ιαπίστωση της κατανοµής της παξιλίνης σε αιµοκύτταρα της C.capitata. Αιµοκύτταρα του σταδίου περιπλάνησης καλλιεργήθηκαν σε µονόστοιβα για 90 λεπτά και µετά από µονιµοποίηση (µεθανόλη για 30 λεπτά στους -20 ο C), έγιναν διαπερατά µε επώαση µε Triton-X-100. (Α). Για την ανίχνευση της παξιλίνης χρησιµοποιήθηκε αντίσωµα έναντι παξιλίνης εντόµων (επώαση για 1 ώρα σε 37 ο C). Το δεύτερο αντίσωµα ήταν συζευγµένο µε FITC. (Β). Για την ανίχνευση του κυτταροσκελετού της τουµπουλίνης χρησιµοποιήθηκε αντίσωµα έναντι τουµπουλίνης θηλαστικών (επώαση για 1 ώρα σε 37 ο C). Το δεύτερο αντίσωµα ήταν συζευγµένο µε Cy3. (C). Επικάλυψη των Α και Β. Στα σηµεία συνεντοπισµού των δυο αντιγόνων που µελετάµε, η σύµπτωση του πράσινου και του κόκκινου (δηλ. της παξιλίνης και της τουµπουλίνης αντίστοιχα) θα δώσει πορτοκαλί χρώµα. Οι φωτογραφίες προέρχονται από συνεστιακό µικροσκόπιο σάρωσης (Confocal Scanning Microscopy, Leica TCS-SP Confocal Microscope, Argon Ion Laser- Helium-Neon Laser, nm). Για το σκοπό αυτό αιµοκύτταρα προνυµφών του σταδίου περιπλάνησης προσκολλήθηκαν σε αντικειµενοφόρους πλάκες για 90 min. Χρησιµοποιώντας διάλυµα µη ιονικού απορρυπαντικού Triton-X 100, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά. Η µονιµοποίησή των κυττάρων πραγµατοποιήθηκε σε απόλυτη µεθανόλη για 30 min, στους -20 ο C, ενώ παράλληλα αποµακρύνθηκε η διαλυτή πρωτεΐνη από τα κύτταρα. Τα µονόστοιβα επωάστηκαν µε πρώτα αντισώµατα έναντι της παξιλίνης 180

187 Αποτελέσµατα και της τουµπουλίνης. Τα δεύτερα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν έναντι του αντισώµατος της παξιλίνης και της τουµπουλίνης ήταν συζευγµένα µε FITC και Cy3 αντίστοιχα. Έτσι, όπου έχει δηµιουργηθεί σύµπλοκο αντιγόνου-αντισώµατος θα εµφανίζεται πράσινο χρώµα (παξιλίνη) ή κόκκινο (τουµπουλίνη) ή πορτοκαλί στα σηµεία όπου συνεντοπίζονται σύµπλοκα και των δυο αντιγόνων. Ο ανοσοφθορισµός επιβεβαιώνει την παρουσία της παξιλίνης στα αιµοκύτταρα του εντόµου. Η πρωτεΐνη φαίνεται πως κατανέµεται περιφερειακά στα αιµοκύτταρα και πιθανότατα βρίσκεται πλησίον του κυτταροσκελετού της τουµπουλίνης. Άλλωστε είναι βιβλιογραφικά γνωστή η αλληλεπίδραση της παξιλίνης µε τον κυτταροσκελετό της τουµπουλίνης (Brown & Turner 2002). 6. Η παξιλίνη αλληλεπιδρά µε την FAK σε κύτταρα που βρίσκονται σε εναιώρηµα δίχως εξωκυτταρική ενεργοποίηση των κυττάρων. Το πρότυπο κατανοµής της παξιλίνης (Εικόνα 104 Α ) µοιάζει µε αυτό της κατανοµής της FAK. Αυτή η οµοιότητα µπορεί να ερµηνευτεί ως πιθανότητα συνεντοπισµού των δυο πρωτεϊνών. Το γεγονός αυτό σε συνδυασµό µε βιβλιογραφικά δεδοµένα που υποστηρίζουν την αλληλεπίδραση της παξιλίνης µε την FAK, σε διάφορους κυτταρικούς τύπους, µας παρακίνησε να µελετήσουµε την µεταξύ τους αλληλεπίδραση. Στο ερώτηµα αν η FAK των αιµοκυττάρων των εντόµων όντως αλληλεπιδρά µε την παξιλίνη µπορεί να απαντήσει πειραµατικά κανείς µε την τεχνική της ανοσοκατακρήµνισης. Για το σκοπό αυτό, πραγµατοποιήσαµε δυο διαφορετικές ανοσοκατακρηµνίσεις. Στην πρώτη κατακρηµνίσαµε την FAK µε αντίσωµα έναντι αυτής (Εικόνα 104Α) και στη δεύτερη περίπτωση η κατακρήµνιση έγινε µε αντίσωµα έναντι της παξιλίνης (Εικόνα 104Β). Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση των δειγµάτων σε SDS-PAGE 10% και ανασοαποτύπωµα µε αντισώµατα έναντι παξιλίνης για την πρώτη περίπτωση και έναντι της FAK για τη δεύτερη. Τα αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν έχουν παραχθεί για τα αντίστοιχα αντιγόνα θηλαστικών. 181

188 Αποτελέσµατα Αντί-FAK Ανοσοΐζηµα Υπερκ. IP Ανοσοΐζηµα Υπερκ. IP Σφαιρ. IP Ολικό εκχ. αιµοκ.ων C.c. FAK Παξιλίνη A IP FAK B IP Paxillin Εικόνα 104. Αλληλεπίδραση της παξιλίνης µε την κινάση εστιακών προσκολλήσεων (FAK). Έγινε ανοσοκατακρήµνιση των FAK (A) και παξιλίνη (Β) σε πρωτεινικά εκχυλίσµατα αιµοκυττάρων της C.capitata. Τα αιµοκύτταρα είχαν καλλιεργηθεί ως εναιώρηµα θρεπτικό µέσο Grace. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντισώµατα έναντι των παξιλίνη (Α) και FAK (B). Αµφότερα τα αντισώµατα έχουν παραχθεί σε θηλαστικά. Στην εικόνα (Α) φαίνεται η κατακρήµνιση της παξιλίνης από το αντίσωµα έναντι της FAK, ενώ στην εικόνα (B) µπορεί να διακρίνει κανείς την κατακρήµνιση της FAK από το αντίσωµα έναντι της παξιλίνης. Εικόνα Α: ιαδροµή 1. Αντίσωµα έναντι της FAK. ιαδροµή 2. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για την FAK. ιαδροµή 3. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της FAK. Εικόνα Β: ιαδροµή 1. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για την παξιλίνη. ιαδροµή 2. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της παξιλίνης. ιαδροµή 3. Κατακρήµνισµα των σφαιριδίων που χρησιµοποιήθηκαν για την ανοσοκατακρήµνιση της παξιλίνης. ιαδροµή 4. Ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισµα από αιµοκύτταρα του εντόµου Ceratitis capitata. Από τις διασταυρούµενες ανοσοκατακρηµνίσεις προκύπτει πως τα δυο αντιγόνα που µελετάµε συνκατακρηµνίζονται. Συγκεκριµένα, στην πρώτη περίπτωση φαίνεται πως το αντίσωµα έναντι της FAK κατακρηµνίζει εκτός από την FAK και την παξιλίνη (Εικόνα 104 Α ). Στο ανοσοαποτύµωµα παρατηρούµε µια ζώνη περίπου στα 62 kda η οποία αντιστοιχεί στην παξιλίνη. Οι υπόλοιπες ζώνες αντιστοιχούν στο αντίσωµα που χρησιµοποιήθηκε για την κατακρήµνιση (δηλαδή στο anti-fak) και στα σφαιρίδια µε τα οποία έγινε η αποµάκρυνση του συµπλόκου αντιγόνουαντισώµατος από το υπόλοιπο πρωτεϊνικό εκχύλισµα (µαγνητικά σφαιρίδια). Κατά αντιστοιχία στη δεύτερη ανοσοκατακρήµνιση το αντίσωµα µε το οποίο κατακρηµνίζεται η παξιλίνη, µπορεί και κατακρηµνίζει και την FAK. Τα 182

189 Αποτελέσµατα αποτελέσµατα εξηγούνται από το γεγονός ότι και στις δυο περιπτώσεις τα αντισώµατα που χρησιµοποιούνται στις ανοσοκατακρηµνίσεις δηµιουργούν σύµπλοκα µε τα αντιγόνα τους και ό,τι άλλο είναι δεσµευµένο στα αντιγόνα εκείνη την χρονική στιγµή. Με άλλα λόγια, υπό τις δεδοµένες συνθήκες οι πρωτεΐνες FAK και παξιλίνη αλληλεπιδρούν σχηµατίζοντας σύµπλοκο, δίχως προηγούµενη ενεργοποίηση των κυττάρων από εξωκυτταρικό ερέθισµα. Η διαπίστωση αυτού του συµπλόκου, ως ένδειξη, µας επιτρέπει να υποθέσουµε ότι η παξιλίνη πιθανότατα αποτελεί ένα διαµεσολαβητή της σύνδεσης µεταξύ της FAK και των ιντεγκρινών στα αιµοκύτταρα, αποτέλεσµα που είναι σε συµφωνία µε ανάλογα βιβλιογραφικά δεδοµένα ( Tachibana et al. 1995, Brown et al. 1996, Thomas et al. 1999, Cooley et al. 2000, Turner 2000, Turner & Brown 2004) 183

190 Αποτελέσµατα 7. Βακτήριο-επαγόµενη ενεργοποίηση της FAK σε αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata. Από δεδοµένα του εργαστηρίου µας, είναι γνωστό ότι οι ιντεγκρίνες µετέχουν στη διαδικασία της κυτταροφαγίας της E. coli (Foukas et al., 1998). Επίσης, έχει δειχθεί ότι η κινάση FAK φωσφορυλιώνεται παρουσία βακτηρίων (Metheniti et al., 2001).Στην παρούσα εργασία η µελέτη της FAK έγινε µε αντισώµατα κουνελιού τα οποία αναγνωρίζουν την FAK στα θηλαστικά και στα έντοµα όπως δείξαµε προηγουµένως. Επίσης, χρησιµοποιήθηκε αντίσωµα για την θέση Y397 της FAK, δηλαδή, αντίσωµα που αναγνωρίζει την φωσφορυλιωµένη τυροσίνη στην θέση 397 της FAK. Η φωσφορυλίωση στην θέση 397 θεωρείται πως είναι το κρίσιµο βήµα για την ενεργοποίηση του µορίου και κατά συνέπεια η χρήση του αντισώµατος αυτού έχει ως σκοπό την ανάδειξη του φωσφορυλιωµένου και άρα ενεργοποιηµένου κλάσµατος της FAK στις περιπτώσεις που θα µελετήσουµε. ιερευνώντας βαθύτερα τη συµµετοχή της FAK στην κυτταροφαγία των βακτηρίων, µελετήσαµε την κινητική φωσφορυλίωσης της FAK στη θέση της τυροσίνης Y397 στα αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata σε δυο διαφορετικές θερµοκρασίες στους 4 ο C (Εικόνα 105) και στους 25 ο C (Εικόνα 106). Έτσι, αιµοκύτταρα σε εναιώρηµα επωάστηκαν µε E. coli (αναλογία 10:1 µε τα αιµοκύτταρα) για διάφορους χρόνους (από 2 µέχρι 30 λεπτά) στις αναφερόµενες θερµοκρασίες και υπό συνεχή ανάδευση. Τα πρωτεϊνικά τους εκχυλίσµατα αναλύθηκαν σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα έναντι της φωσφορυλιωµένης στην τυροσίνη 397 FAK. Ως µάρτυρας χρησιµοποιήθηκε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων που δεν επωάστηκε µε βακτήρια. Για να διαπιστωθεί η παρουσία ισόποσων δειγµάτων η µεµβράνη επανεµφανίστηκε για ολική FAK (Εικόνες 105 &106). Ως γενικό συµπέρασµα µπορεί να υποστηρίξει κανείς ότι στις εικόνες 105 και 106 φαίνεται καθαρά πως η E. coli επάγει φωσφορυλίωση στην τυροσίνη 397 της κινάσης των εστιακών προσκολλήσεων και στις δυο θερµοκρασίες επώασης. Επίσης, συγκρίνοντας τις εικόνες 105 και 106 σχετικά µε τη FAK, διαπιστώνεται ότι η ποσότητα της πρωτεΐνης παραµένει σταθερή (Εικόνες 105Β, 106Β). Ακόµα, η φωσφορυλίωση της FAK είναι ταχύτατη. Παρατηρούµε ότι ήδη από τα 2 λεπτά επώασης η φωσφορυλίωση της FAK Y397 έχει φτάσει σε υψηλό επίπεδο για να σηµειωθεί το µέγιστο της φωσφορυλίωσης αυτής περίπου στα 5 λεπτά. 184

191 Αποτελέσµατα Επώαση µε E. coli στους 25 ο C Grace FAK Y397: WB G min FAK: WB Εικόνα 105. Επαγόµενη ενεργοποίηση της FAK από την E. coli στους 25 ο C. Αιµοκύτταρα από το στάδιο περιπλάνησης καλλιεργήθηκαν σε εναιώρηµα και διεγέρθηκαν µε βακτήρια E. coli για χρόνο από 2 µέχρι 30 λεπτά (διαδροµές 2-7) ή όχι (µάρτυρας, διαδροµή 1), στους 25 ο C. Ακολούθως τα αιµοκύτταρα ξεπλύθηκαν και έγινε η λύση των κυττάρων και ηλεκτροφορητική ανάλυση των πρωτεϊνικών εκχυλισµάτων σε SDS-PAGE 10%. Στην συνέχεια πραγµατοποιήθηκε ανοσοαποτύπωµα έναντι του φωσφορυλιωµένου κλάσµατος στην θέση της τυροσίνης 397 (pfak Y397). H παρουσία ισόποσων δειγµάτων επιβεβαιώθηκε επανεµφανίζοντας τη µεµβράνη για ολική FAK. Στην εικόνα 105 απεικονίζεται η κινητική της φωσφορυλίωσης της τυροσίνης 397 της FAK κατά την επώαση των αιµοκυττάρων µε βακτήρια E. coli σε θερµοκρασία δωµατίου. Από την φωτογραφία µπορεί να εξαχθεί το συµπέρασµα ότι τα βακτήρια προκαλούν την φωσφορυλίωση στη θέση Υ397και κατά συνέπεια την ενεργοποίηση της FAK των αιµοκυττάρων. Μάλιστα, το γεγονός της φωσφορυλίωσης πραγµατοποιείται αµέσως (ίσως σε χρόνο µικρότερο από τα 2 λεπτά). Τα δείγµατα είναι ισόποσα όπως φαίνεται από την εικόνα 105Β, στην οποία η µεµβράνη µετά από stripping έχει επανεµφανιστεί για ολική FAK. Το µέγιστο της φωσφορυλίωσης όπως εκτιµάται από την εικόνα 105 Α πραγµατοποιείται στο χρονικό διάστηµα ανάµεσα στα 5 µε 10 λεπτά. Στο χρονικό διάστηµα 15 λεπτών παρατηρείται µια πτώση της φωσφορυλίωσης για να αυξηθεί στα αµέσως επόµενα 5 λεπτά. Συνεπώς, µπορούµε να θεωρήσουµε ότι η κινητική φωσφορυλίωσης της FAK στην θέση Υ397 ακολουθεί πρότυπο µε δυο µέγιστα, το πρώτο σε χρόνο 5-10 λεπτών και το δεύτερο µετά τα 20 λεπτά. Αυτή η συµπεριφορά της FAK µπορεί να προέρχεται από διαφορετική ρύθµιση του µορίου κατά την διάρκεια της κυτταροφαγίας. 185

192 Αποτελέσµατα Grace Επώαση µε E. coli στους 4 ο C FAK Y397: WB G min FAK: WB Εικόνα 106. Επαγόµενη ενεργοποίηση της FAK από την E. coli στους 4 ο C. Αιµοκύτταρα από το στάδιο περιπλάνησης καλλιεργήθηκαν σε εναιώρηµα και διεγέρθηκαν µε βακτήρια E. coli για χρόνο από 2 µέχρι 30 λεπτά (διαδροµές 2-7) ή όχι (µάρτυρας διαδροµή 1), στους 4 ο C. Ακολούθως τα αιµοκύτταρα ξεπλύθηκαν, έγινε λύση των κυττάρων και ηλεκτροφορητική ανάλυση των πρωτεϊνικών εκχυλισµάτων σε SDS-PAGE 10%. Στην συνέχεια πραγµατοποιήθηκε ανοσοαποτύπωµα έναντι του φωσφορυλιωµένου κλάσµατος της FAK στην θέση της τυροσίνης 397 (pfak Y397). H παρουσία ισόποσων δειγµάτων επιβεβαιώθηκε επανεµφανίζοντας τη µεµβράνη για ολική FAK. Όσον αφορά την επαγόµενη από βακτήρια φωσφορυλίωση της FAK, κατά την επώαση στους 4 ο C, µπορεί να διαπιστώσει κανείς παρατηρώντας την εικόνα 106 την φωσφορυλίωση της FAK στην θέση Υ397, η οποία συντελείται και σε αυτές τις συνθήκες αµέσως. Συνεπώς, µπορούµε να υποθέσουµε ότι η πρόσδεση των βακτηρίων στους υποδοχείς της κυτταρικής µεµβράνης των αιµοκυττάρων (ιντεγκρίνες, ενδεχοµένως κι άλλοι) είναι ακαριαία. Η πρόσδεση συνεπάγεται σίγουρα µεταγωγή µηνυµάτων προς το εσωτερικό των κυττάρων και όπως διαπιστώνουµε, κάποιο σήµα διεγείρει και την FAK η οποία (αυτό)- φωσφορυλιώνεται στην θέση Y397. Όλα τα παραπάνω συντελούνται τόσο στη θερµοκρασία δωµατίου όσο και στη θερµοκρασία 4 ων ο C µέσα σε πολύ µικρό χρονικό διάστηµα. Συνεπώς, η µεταγωγή σηµάτων από το εξωκυτταρικό περιβάλλον προς την FAK συντελείται ταχύτατα, ακολουθώντας πιθανότατα την κινητική προσκόλλησης των βακτηρίων στους υποδοχείς της πλασµατικής µεµβράνης. Επιπλέον, στην εικόνα 106 φαίνεται πως γίνεται επαναφορά της FAK p.y397 από την ενεργοποιηµένη κατάσταση στην κατάσταση Grace (αρνητικός µάρτυρας ενεργοποίησης) στους χρόνους λεπτά. Μέσα σε αυτό το χρονικό διάστηµα παρατηρούµε ότι έχει αποσβεσθεί η επαγόµενη από την E.coli φωσφορυλίωση της 186

193 Αποτελέσµατα FAK Y397 σε θερµοκρασία 4 ο C. Με άλλα λόγια φαίνεται πως σε συνθήκες ψύξης χάνεται το δεύτερο µέγιστο της παρατηρούµενης φωσφορυλίωσης της FAK Y397. Αυτό µπορεί να σηµαίνει ότι αυτή η συµπεριφορά της FAK µπορεί να µην σχετίζεται µε την πρόσδεση των βακτηρίων στην µεµβράνη των αιµοκυττάρων και την κυτταροφαγία, αλλά ότι µπορεί να έχει σχέση µε την επεξεργασία του πρώτου µηνύµατος από το φαγοκύτταρο. Αποτελέσµατα του εργαστηρίου (Soldatos et al., αδηµοσίευτα) δείχνουν ότι η κυτταροφαγία των βακτηρίων περιορίζεται σε σηµαντικό βαθµό κατά την πραγµατοποίηση των πειραµάτων κυτταροφαγίας σε θερµοκρασία 4 ο C. Τα αποτελέσµατα αυτά έχουν προκύψει από πειράµατα που αναλύθηκαν µε κυτταροµετρία ροής. Το γεγονός της αναστολής της κυτταροφαγίας ίσως σχετίζεται µε την απώλεια της φωσφορυλίωσης στην FAK Y397 µετά τα 10 λεπτά επώασης µε τα βακτήρια. Με αυτά τα δεδοµένα έχει ενδιαφέρον να ερευνήσουµε γιατί αναστέλλεται η κυτταροφαγία σε συνθήκες ψύξης; Μια προφανής απάντηση είναι ότι η πτώση της θερµοκρασίας επηρεάζει αρνητικά την κινητικότητα, δραστικότητα, λειτουργικότητα των πρωτεϊνών (δηλ. των ενζύµων) και κατά συνέπεια όλες τις κυτταρικές συµπεριφορές. Επίσης, είναι γνωστό ότι σε θερµοκρασίες κοντά στο µηδέν εµποδίζεται ο πολυµερισµός του κυτταροσκελετού, γεγονός που πιθανότατα δρα ανασταλτικά στην αλλαγή της µορφολογίας των κυττάρων και κατά συνέπεια στην κυτταροφαγία αλλά και στην έκκριση των απαιτούµενων για την κυτταροφαγία βιοενεργών µορίων (π.χ. PAPs) (Mavrouli et al. 2005). Τελικά, πειραµατικά αυτό που διαπιστώνουµε ίσως να µην περιγράφεται ακριβώς όρο αναστολή της κυτταροφαγίας αλλά να αποδίδεται καλύτερα µε τον όρο µε τον επιβράδυνση της κυτταροφαγίας στους 4 o C. 8. Η έκκριση των φαγοκυττάρων, πιθανότατα, επηρεάζει και ρυθµίζει την κυτταροφαγία των βακτηρίων E.coli. εδοµένα του εργαστηρίου µας δείχνουν ότι η έκκριση των αιµοκυττάρων είναι ένα πολύ κρίσιµο βήµα για την κυτταροφαγία που επιτελείται από αυτά (Mavrouli et al., 2005). Με δεδοµένο ότι η κυτταροφαγία µειώνεται σε θερµοκρασία 4 o C (Soldatos et al., αδηµοσίευτα αποτελέσµατα), µελετήσαµε την έκκριση των 187

194 Αποτελέσµατα αιµοκυττάρων µε επίδραση βακτηρίων Ε.coli στα αιµοκύτταρα σε θερµοκρασίες 4 o C και 25 o C. Για το σκοπό αυτό αιµοκύτταρα του σταδίου περιπλάνησης επωάστηκαν για χρόνους 2-50 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου και σε συνθήκες ψύξης. Μετά το πέρας της επώασης των βακτηρίων ακολουθούσε φυγοκέντρηση και αποµάκρυνση των αιµοκυττάρων (ίζηµα). Το πρωτεϊνικό φορτίο του υπερκειµένου εκχυλίσµατος προσδιορίστηκε ποσοτικά µε την µέθοδο Bradford. Από τα αποτελέσµατα της φωτοµέτρησης (τα οποία δεν παρουσιάζονται εδώ) µπορούµε να συµπεράνουµε ότι τα επίπεδα της εκκρινόµενης πρωτεΐνης σε συνθήκες θερµοκρασίας 4 o C είναι κατά πολύ κατώτερα από τα αντίστοιχα στην θερµοκρασία δωµατίου. Κατά συνέπεια η µειωµένη έκκριση ίσως συµβάλλει σηµαντικά στην µειωµένη κυτταροφαγία που παρατηρείται σε αυτή την θερµοκρασία. Για την ενίσχυση της παραπάνω υπόθεσης πραγµατοποιήσαµε ELISA. Για την εφαρµογή της µεθόδου προσδιορισµού αντιγόνου ELISA χρησιµοποιήθηκαν πλαστικά µικροπλακίδια. Το πλαστικό είναι ειδικής σύνθεσης ή επεξεργασµένο ώστε να προσδένονται πάνω του πρωτεΐνες µε µη ειδικό τρόπο (υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις). Σε κάθε µικροκυψελίδα ενός µικροπλακιδίου ELISA προστέθηκε ποσότητα µέσου επώασης τέτοια που αντιστοιχεί σε ολική πρωτεΐνη 2-4 γ/ml και αφέθηκε σε θερµοκρασία 4 ο C για όλη τη νύχτα. Επειδή το αντιγόνο είναι σε περίσσεια, όλες οι διαθέσιµες θέσεις του πλαστικού καταλαµβάνονται από µόρια αντιγόνου. Λόγω των στερεοχηµικών παρεµποδίσεων, παραµένουν περιοχές του πλαστικού που είναι εκτεθειµένες. Την επόµενη µέρα προστέθηκε διάλυµα BSA 3% για την κάλυψη των µη ειδικών θέσεων στους 4 ο C για όλη τη νύχτα. Ακολούθησε επώαση µε το πρώτο αντίσωµα (έναντι όλων των PAPs: PAP1, PAP2, PAP3) για µια ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου και αργότερα µε το δεύτερο αντίσωµα, που είναι συζευγµένο µε υπεροξειδάση, για µια ώρα στους 25 ο C. Στη συνέχεια έγινε προσθήκη του υποστρώµατος της υπεροξειδάσης, τετραµεθυλβενζιδίνη (ΤΜΒ) και αφού ολοκληρώθηκε η επώαση, έγινε διακοπή της ενζυµικής αντίδρασης µε 50 µl διαλύµατος H 2 SO 4 1Ν και φωτοµέτρηση στα 490 nm. Τα αποτελέσµατα από την ELISA απεικονίζονται στην εικόνα 107 όπου φαίνεται ότι τα επίπεδα των εκκριθέντων PAPs σε θερµοκρασία 0 ο C είναι χαµηλότερα από τα αντίστοιχα στους 25 ο C. Μάλιστα η ανώτερη τιµή έκκρισης των PAPs στους 4 ο C είναι περίπου ίση µε τη χαµηλότερη των 25 ο C. Αυτό µπορεί να µεταφραστεί σε µειωµένη κυτταροφαγία όπως εξάλλου έχουµε παρατηρήσει. 188

195 Αποτελέσµατα Εικόνα 107. Η έκκριση των PAPs κατά την διάρκεια της επίδρασης µε βακτήρια E.coli σε διαφορετικές θερµοκρασίες. Αιµοκύτταρα από το στάδιο περιπλάνησης επωάστηκαν µε βακτήρια E.coli σε δυο θερµοκρασίες (25 o C, 4 o C) για διαφορετικούς χρόνους (2-50 min). Από τα εναιωρήµατα συλλέχτηκε το υπερκείµενο µετά από φυγοκέντρηση και προσδιορίστηκε ποσοτικά η πρωτεΐνη µε την µέθοδο Bradford. Η επαγόµενη έκκριση των PAPs στο πρωτεϊνικό εκχύλισµα των αιµοκυττάρων προσδιορίστηκε µε ELISA. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που επωάστηκαν σε θρεπτικό µέσο Grace. Για να επιβεβαιώσουµε τα παραπάνω αποτελέσµατα χρησιµοποιήσαµε τον αναστολέα έκκρισης SITS, ο οποίος δρα αναστέλλοντας τη διαπερατότητα των µεµβρανών ως προς τα ανιόντα. Για τον συγκεκριµένο αναστολέα της έκκρισης έχει βρεθεί ότι αναστέλλει την κυτταροφαγία της E.coli από τα αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata (Mavrouli et al., 2005). Έτσι χρησιµοποιώντας τον SITS θελήσαµε να µελετήσουµε την ενεργοποίηση της FAK σε µια πειραµατική κατάσταση κατά την οποία είναι δεδοµένη η αναστολή της κυτταροφαγίας σε αντιστοιχία µε την επώαση των κυττάρων στους 4 o C. Με την παραπάνω λογική, αιµοκύτταρα (WS) της C.capitata προεπωάστηκαν µε τον αναστολέα SITS για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Έπειτα στα εναιωρήµατα των αιµοκυττάρων προσθέσαµε βακτήρια E.coli και τα εναιωρήµατα επωάστηκαν υπό συνεχή ανάδευση για χρόνο από 5 µέχρι 30 λεπτά, σε θερµοκρασία δωµατίου. Στην συνέχεια έγινε φυγοκέντρηση και λύση των αιµοκυττάρων (ίζηµα) µε την συνδυασµένη χρήση του κατάλληλου διαλύµατος και υπερήχων. Το πρωτεϊνικό 189

196 Αποτελέσµατα φορτίο των διαλυµάτων προσδιορίστηκε µε Bradford και ακολούθησε ηλεκτροφορητική ανάλυση ισοπρωτεϊνικών δειγµάτων σε 10 % SDS PAGE και ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p.y397 (Εικόνα 108). H παρουσία ισόποσων δειγµάτων επιβεβαιώθηκε επανεµφανίζοντας τη µεµβράνη για ακτίνη. Grace + SITS Επώαση µε E. coli στους 25 ο C FAK Y397: WB Sits min Actin: WB Εικόνα 108. Ο αναστολέας έκκρισης SITS επηρεάζει την ενεργοποίηση της FAK που επάγεται από την παρουσία των βακτηρίων E.coli στο περιβάλλον των αιµοκυττάρων στους 25 o C. Αιµοκύτταρα από το στάδιο περιπλάνησης καλλιεργήθηκαν σε εναιώρηµα και προεπωάστηκαν για 30 λεπτά µε τον αναστολέα έκκρισης SITS. Στην συνέχεια διεγέρθηκαν µε βακτήρια E. coli για χρόνο από 5 µέχρι 30 λεπτά (διαδροµές 2-9) ή όχι (µάρτυρας διαδροµή 1), στους 25 ο C. Ακολούθως τα αιµοκύτταρα ξεπλύθηκαν, έγινε λύση των κυττάρων και ηλεκτροφορητική ανάλυση των πρωτεϊνικών εκχυλισµάτων σε SDS-PAGE 10%. Έπειτα, πραγµατοποιήθηκε ανοσοαποτύπωµα έναντι του φωσφορυλιωµένου κλάσµατος της FAK στην θέση της τυροσίνης 397 (p. FAK Y397). H παρουσία ισόποσων δειγµάτων επιβεβαιώθηκε επανεµφανίζοντας τη µεµβράνη για ακτίνη. ιαπιστώνεται από την εικόνα 108 ότι η αναστολή της έκκρισης που προκαλεί αναστολή και της κυτταροφαγίας στη δεδοµένη θερµοκρασία συνεπάγεται απώλεια της δεύτερης κορυφής (µετά τα 20 λεπτά) στην ενεργοποίηση της FAK. Τα αποτελέσµατα συµφωνούν µε την διαπίστωση της αναστολής της κυτταροφαγίας στους 4 o C (Soldatos et al., αδηµοσίευτα δεδοµένα), τη µειωµένη έκκριση στους 4 o C (Εικόνα 107) και την παρατηρούµενη ενεργοποίηση της FAK σε αυτή την θερµοκρασία, η οποία διαφέρει από την αντίστοιχη στους 25 o C στην εµφάνιση και δεύτερου κύµατος ενεργοποίησης µετά τα 20 λεπτά επώασης µε E.coli. 190

197 Αποτελέσµατα 9. Κινητική της κυτταροφαγίας των βακτηρίων E. coli από τα αιµοκύτταρα. Η κινητική της κυτταροφαγίας των βακτηρίων από τα αιµοκύτταρα µελετήθηκε µε κυτταροµετρία ροής. Με αυτή την τεχνική µπορούµε να µελετήσουµε την κυτταροφαγία των βακτηρίων σε συνάρτηση µε το χρόνο µετρώντας τον φθορισµό των κυττάρων που προέρχεται από σηµασµένα, µε FITC, βακτήρια E. coli τα οποία έχουν φαγωθεί από τα αιµοκύτταρα. Η συνηθισµένη µέθοδος που χρησιµοποιείται για την παρουσίαση των αριθµητικών δεδοµένων που προκύπτουν από την κυτταροµετρία ροής είναι οι κατανοµές συχνότητας ή ιστογράµµατα συχνοτήτων όπου η τετµηµένη συνιστώσα αναπαριστά την παράµετρο που µετράται (π.χ. FITC φθορισµός) και η τεταγµένη συνιστώσα παρουσιάζει των αριθµό των κυττάρων µε µια συγκεκριµένη τιµή για αυτή την παράµετρο. Η περιοχή που υπάρχει κάτω από την καµπύλη αναπαριστά το συνολικό αριθµό κυττάρων που αναλύθηκαν. Στην κυτταροµετρία ροής, απαραίτητη προϋπόθεση είναι τα κύτταρα να βρίσκονται υπό µορφή εναιωρήµατος ώστε ένα-ένα να εστιάζονται στο σηµείο ανάλυσης, όπου γίνεται η µέτρηση των διαφόρων παραµέτρων τους. Εναιωρήµατα αιµοκυττάρων (5x10 5 κύτταρα / δείγµα) ατόµων του σταδίου περιπλάνησης επωάστηκαν, υπό ανάδευση, σε 300 µl θρεπτικό µέσο Grace στο οποίο προσθέσαµε αναστολείς έκκρισης (Brefeldin & Sits) για 30 min, σε θερµοκρασία δωµατίου. Στην συνέχεια ακολούθησε φυγοκέντρηση για να αποµακρυνθεί το υπερκείµενο µε την περίσσεια των αναστολέων έκκρισης από τα κύτταρα. Tο ίζηµα των κυττάρων επαναιωρήθηκε σε θρεπτικό µέσο Grace (300 µl) στο οποίο προστέθηκε σηµασµένη µε ισοθειοκυανική φλουοροσεΐνη (FITC) E.coli. Αµέσως µετά την προσθήκη των βακτηρίων ξεκίνησαν οι µετρήσεις στον κυτταροµετρητή ροής, σε συγκεκριµένους χρόνους (Εικόνα 109, 110). Επειδή κάποιες κυτταρικές ουσίες, όταν διεγείρονται από φως συγκεκριµένου µήκους κύµατος, έχουν την ικανότητα παραγωγής φθορισµού (ενδογενής ή µη ειδικός φθορισµός) είναι απαραίτητο να παρασκευαστεί ένα δείγµα µάρτυρας, που αντιστοιχεί σε εναιώρηµα αιµοκυττάρων που έχουν επωαστεί σε θρεπτικό µέσο Grace s απουσία σηµασµένων βακτηρίων. Επίσης, επειδή τα βακτήρια E.coli FITC δεσµεύονται στην επιφάνεια των κυττάρων πριν περάσουν στο εσωτερικό τους, ένα 191

198 Αποτελέσµατα µέρος από το σήµα που λαµβάνουµε θα είναι «θόρυβος» της κυτταροφαγίας αφού θα προέρχεται από τα βακτήρια τα είναι προσκολληµένα στην επιφάνεια των κυττάρων. Για να υπολογίσουµε µόνο τον ενδογενή φθορισµό των κυττάρων χρησιµοποιούµε διάλυµα Trypan blue- TBS που σβήνει το φθορισµό (quenching). Έτσι, ο εξωτερικός φθορισµός-θόρυβος θα «σβηστεί» από την xχρωστική. Η χρωστική trypan blue έχει την ιδιότητα να απορροφάται από νεκρά κύτταρα, έτσι χρησιµεύει και για µέτρηση της βιωσιµότητας των κυττάρων. Κατά συνέπεια, πραγµατοποιώντας δυο µετρήσεις σε κάθε δείγµα, µια µε Trypan blue και µια δεύτερη χωρίς την χρωστική, µπορεί να απεικονιστεί η παρουσία των βακτηρίων τόσο στο εσωτερικό όσο και στο εξωτερικό των αιµοκυττάρων, δηλαδή η κυτταροφαγία και η προσκόλληση των βακτηρίων (αθροιστικά) στην πρώτη περίπτωση και η κυτταροφαγία στην δεύτερη (χρήση χρωστικής) (Εικόνες 109 & 110). Για το σωστό τρόπο περιγραφής της κατανοµής ενός συνόλου δεδοµένων ορίζουµε κάποια αριθµητικά µεγέθη, γνωστά ως µέτρα. Τα πιο συνηθισµένα µέτρα που χρησιµοποιούνται για την περιγραφή της θέσης ενός συνόλου δεδοµένων πάνω στον οριζόντιο άξονα 0x, εκφράζοντας την «κατά µέσο όρο» απόστασή τους από την αρχή των αξόνων είναι ο αριθµητικός µέσος ή µέση τιµή (arithmetic mean, Mn), η διάµεσος (median, Md) και η κορυφή ή επικρατούσα τιµή (mode). Η µέση τιµή ενός συνόλου παρατηρήσεων αποτελεί το σπουδαιότερο και χρησιµότερο µέτρο της Στατιστικής και ορίζεται ως το άθροισµα των παρατηρήσεων δια του πλήθους των παρατηρήσεων. Η διάµεσος είναι η τιµή που χωρίζει ένα σύνολο παρατηρήσεων σε δυο ίσα µέρη όταν οι παρατηρήσεις αυτές τοποθετηθούν µε σειρά τάξης µεγέθους. Τα σηµαντικότερα µέτρα που εκφράζουν τις αποκλίσεις των τιµών της µεταβλητής γύρω από τα µέτρα κεντρικής τάσης και καλούνται µέτρα διασποράς είναι το εύρος (range), η διακύµανση (variance) και η τυπική απόκλιση (standard deviation). Εκτός από τα µέτρα θέσης και διασποράς µιας κατανοµής πολλές φορές είναι απαραίτητος και ο προσδιορισµός κάποιων άλλων µέτρων, που καθορίζουν τη µορφή της κατανοµής. Κατά πόσο δηλαδή η αντίστοιχη καµπύλη συχνοτήτων είναι συµµετρική ή όχι προς την ευθεία x=x ο, για δεδοµένο σηµείο x 0 του άξονα 0x. Τα µέτρα αυτά, που συνήθως εκφράζονται σε συνάρτηση µε τα µέτρα θέσης και διασποράς καλούντα µέτρα ασυµµετρίας. Εικόνα 111. Οι καµπύλες συχνοτήτων Α και Β είναι συµµετρικές µε το ίδιο «κέντρο» χ 0, αλλά η Β έχει µεγαλύτερη µεταβλητότητα από την Α. Οι καµπύλες Γ και είναι ασύµµετρες, µε τη Γ να παρουσιάζει θετική ασυµµετρία και τη αρνητική ασυµµετρία και τη αρνητική ασυµµετρία. Το «κέντρο» της Γ είναι αριστερότερα του χ0, ενώ της είναι δεξιότερα του χ0. Η παρουσιάζει µεγαλύτερη µεταβλητότητα από τη Γ. 192

199 Αποτελέσµατα Εικόνα 109. Κινητική κυτταροφαγίας της E. coli από τα αιµοκύτταρα της C. capitata στους 25 ο C, µε κυτταροµετρία ροής. Εναιωρήµατα αιµοκυττάρων (5x10 5 κύτταρα / δείγµα) ατόµων του σταδίου περιπλάνησης επωάστηκαν µε αναστολείς έκκρισης (Bref. + Sits) για 30 min σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολούθησε επώαση µε βακτήρια σηµασµένα µε FITC για χρόνους 4, 7, 12, 17, 30 λεπτά, στους 25 o C. Ο ενδογενής φθορισµός (Grace) προκύπτει όταν εναιώρηµα αιµοκυττάρων που έχουν επωαστεί σε θρεπτικό µέσο Grace απουσία βακτηρίων περνά από τον κυτταροµετρητή ροής. Σε αυτή την περίπτωση δεν έχει προστεθεί trypan blue πριν την µέτρηση στον κυτταροµετρητή, άρα στις γραφικές παραστάσεις απεικονίζεται ο ολικός φθορισµός των κυττάρων που είναι το άθροισµα των βακτηρίων που είναι προσκολληµένα στην επιφάνεια των κυττάρων και αυτών που έχουν εισέλθει στο εσωτερικό των κυττάρων, δηλαδή αυτών που έχουν κυτταροφαγωθεί. 193

200 Αποτελέσµατα Εικόνα 110. Γραφική απεικόνιση του φθορισµού των αιµοκυττάρων µετά από επώαση µε βακτήρια E.coli-FITC και µέτρηση µε κυτταροµετρία ροής χρησιµοποιώντας την χρωστική Trypan blue. Εναιωρήµατα αιµοκυττάρων (5x10 5 κύτταρα/δείγµα) ατόµων του σταδίου περιπλάνησης επωάστηκαν µε αναστολείς έκκρισης (Bref. + Sits) για 30 min σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολούθησε επώαση µε βακτήρια σηµασµένα µε FITC για χρόνους 4, 7, 12, 17, 25, 30 λεπτά, στους 25 o C. Ο ενδογενής φθορισµός (Grace) προκύπτει όταν εναιώρηµα αιµοκυττάρων που έχουν επωαστεί σε θρεπτικό µέσο Grace απουσία βακτηρίων περνά από τον κυτταροµετρητή ροής. Σε αυτή την περίπτωση έχει προστεθεί trypan blue πριν την µέτρηση στον κυτταροµετρητή. Η χρωστική trypan blue έχει την ιδιότητα να απορροφάται από νεκρά κύτταρα και να σβήνει το φθορισµό (quenching). Συνεπώς, στις γραφικές παραστάσεις απεικονίζεται ο φθορισµός των ζωντανών κυττάρων, ο οποίος προέρχεται από βακτήρια που έχουν εισέλθει στο εσωτερικό των κυττάρων, δηλαδή αυτών που έχουν κυτταροφαγωθεί. 194

201 Αποτελέσµατα Από τις παραπάνω εικόνες πιστοποιείται κατά πρώτο λόγο η κυτταροφαγία των βακτηρίων από τα αιµοκύτταρα. Επίσης, παρατηρούµε ότι εκτός από τα βακτήρια που έχουν περάσει στο εσωτερικό των κυττάρων λόγω κυτταροφαγίας υπάρχουν και άλλα τα οποία είναι προσκολληµένα στην εξωτερική επιφάνεια των αιµοκυττάρων. Αυτό φαίνεται από την διαφορά στις γραφικές παραστάσεις χωρίς την χρωστική (συνολικός φθορισµός κυττάρων) και µε την trypan blue (εσωτερικός φθορισµός) (Εικόνα 110). Κινητική Κυτταροφαγίας βακτηρίων E.colil-FITC από αιµοκύτταρα της C.capitata σε θερµοκρασία 25 ο C Ποσοστό (%) φθορισµού Grace Επώαση µε E. coli-fitc (min) Εικόνα 112. Γραφική απεικόνιση της κινητικής της κυτταροφαγίας βακτηρίων E.coli από αιµοκύτταρα της C.capitata. Στον οριζόντιο άξονα υπάρχουν οι τιµές του χρόνου επώασης των κυττάρων µε την E.coli-Fitc ενώ στον κατακόρυφο βρίσκεται το ποσοστό % του φθορισµού που µετράται σε κάθε χρόνο. Ο ενδογενής φθορισµός προσδιορίζεται µετρώντας δείγµα στο οποίο δεν έγινε επώαση µε βακτήρια (Grace). Η παράµετρος που χρησιµοποιήθηκε για την σύνθεση της γραφικής παράστασης είναι η διάµεσος τιµή (Medium, MdX) Όσον αφορά την κινητική κυτταροφαγίας φαίνεται ότι αυξάνεται προοδευτικά µε την πάροδο του χρόνου (Εικόνα 112). Για την δηµιουργία του γραφήµατος της εικόνας 112 χρησιµοποιήθηκε η παράµετρος MdX (διάµεσος) των παρατηρήσεων που αποτυπώνονται γραφικά στην εικόνα 110. Η τιµή της διαµέσου σε κάθε περίπτωση µπορεί να θεωρηθεί ως αυθαίρετες µονάδες φθορισµού, κατά συνέπεια µπορούµε, κατά προσέγγιση, να εκτιµήσουµε το ποσοστό του φθορισµού των πληθυσµών των κυττάρων στα διαφορετικά χρονικά σηµεία της κινητικής. Έχοντας προεπωάσει τα εναιωρήµατα των αιµοκυττάρων µε τους αναστολείς έκκρισης (Bref. και Sits) προκαλούµε παρεµπόδιση της έκκρισης από τα αιµοκύτταρα 195

202 Αποτελέσµατα (Mavrouli et al., 2005). Έτσι, τα αιµοκύτταρα µε την αφαίρεση των αναστολέων και την προσθήκη των βακτήριων ξεκινούν από µηδενικό επίπεδο για να επιτύχουν την κυτταροφαγία των βακτηρίων. Ωστόσο, από τα αποτελέσµατα της κυτταροµετρίας φαίνεται ότι η κυτταροφαγία των βακτηρίων ξεκινάει σε πολύ µικρό χρόνο, σχεδόν αµέσως µε την παρουσία των βακτηρίων στο εξωκυτταρικό περιβάλλον (υπάρχουν αποτελέσµατα που αποδεικνύουν την κυτταροφαγία σε χρόνο µικρότερο των 2 λεπτών). Επίσης, παρατηρούµε πως ορισµένα από τα κύτταρα «τρώνε» περισσότερα του ενός βακτήρια, ενώ µε την πάροδο του χρόνου γίνεται περισσότερο διακριτή η ύπαρξη δυο πληθυσµών. εξιότερα εντοπίζεται ο πληθυσµός των αιµοκυττάρων που έχουν φαγοκυτταρώσει πολλά βακτήρια. Ακόµα πρέπει να σηµειωθεί ότι σε χρόνο µεγαλύτερο από 30 λεπτά φαίνεται ότι όλα τα αιµοκύτταρα πραγµατοποιούν κυτταροφαγία. Η µοναδική διαφορά ανάµεσα στα αιµοκύτταρα, σε αυτό το χρονικό διάστηµα, είναι ο αριθµός των βακτηρίων που έχουν εσωτερικεύσει. 196

203 Αποτελέσµατα 10. Η διαµόρφωση της FAK αλλάζει κατά την βακτήριο-επαγόµενη ενεργοποίηση της. Με δεδοµένο ότι η FAK ενεργοποιείται από την κυτταροφαγία βακτηρίων E.coli σύµφωνα µε την ανάλυση κατά Western θελήσαµε να επιβεβαιώσουµε τα αποτελέσµατα µας µε εφαρµογή της µεθόδου ELISA. Αρχικά έγινε αποµόνωση αιµοκυττάρων, όπως έχουµε ήδη περιγράψει και επαναιώρηση τους σε Grace. Τα εναιωρήµατα των κυττάρων αφέθηκαν να ηρεµήσουν για µικρό χρονικό διάστηµα. Ακολούθησε επώαση µε E. coli (10 βακτήρια ανά κύτταρο) για 30 min στους 25 ο C. Μετά την επώαση τα δείγµατα φυγοκεντρήθηκαν σε 1000 rpm για 10 λεπτά ώστε να αποµακρυνθούν στο υπερκείµενο βακτήρια τα οποία δεν είχαν προσβάλει τα αιµοκύτταρα (περίσσεια). Έπειτα τα αιµοκύτταρα (ίζηµα) αναδιαλύθηκαν σε διάλυµα λύσης και η λύση τους ολοκληρώθηκε µε την χρήση υπερήχων. Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα φυγοκεντρήθηκαν για να αποµακρυνθούν τα αδιάσπαστα κοµµάτια των κυττάρων και τα υπερκείµενα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα µετρήθηκαν µε την µέθοδο Bradford για να εκτιµηθεί η ποσότητα της πρωτεΐνης που περιείχαν. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που επωάστηκαν σε θρεπτικό µέσο Grace. Για την εφαρµογή της µεθόδου προσδιορισµού αντιγόνου ELISA χρησιµοποιήθηκαν πλαστικά µικροπλακίδια. Σε κάθε µικροκυψελίδα ενός µικροπλακιδίου ELISA προστέθηκε ποσότητα µέσου επώασης τέτοια που αντιστοιχεί σε ολική πρωτεΐνη 2-4 γ/ml. H επώαση µε το πρώτο αντίσωµα (FAK c-903, FAK Y397, FAK Y861) έγινε για µια ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Οµοίως, το δεύτερο αντίσωµα που είναι συζευγµένο µε υπεροξειδάση, χρησιµοποιήθηκε για µια ώρα στους 25 ο C. Στη συνέχεια έγινε προσθήκη του υποστρώµατος της υπεροξειδάσης, τετραµεθυλβενζιδίνη (ΤΜΒ) και αφού ολοκληρώθηκε η επώαση, έγινε διακοπή της ενζυµικής αντίδρασης µε 50 µl διαλύµατος H 2 SO 4 1Ν και φωτοµέτρηση στα 490 nm. Ένα µέρος του σήµατος οφείλεται σε µη ειδική πρόσδεση του 2 ου αντισώµατος, το σήµα αυτό αποτελεί πειραµατικό «θόρυβο». Ο θόρυβος µπορεί να προσδιοριστεί εάν σε κάποιες από τις µικροκυψελίδες παραλείψουµε το στάδιο της προσθήκης του 1 ου αντισώµατος. Όσο χρώµα αναπτυχθεί, οφείλεται σε µη ειδική πρόσδεση του 2 ου αντισώµατος, µια και δεν υφίσταται 1 ο αντίσωµα. Η µη ειδική πρόσδεση του 1 ου αντισώµατος προσδιορίζεται αν παραλείψουµε το αντιγόνο. Τα αποτελέσµατα από την ELISA απεικονίζονται στην εικόνα

204 Αποτελέσµατα Eνεργοποίηση της FAK από την E. coli Απορρόφηση στα 490 nm FAK FAK(+) pfak y397 pfak y397(+) pfak y861 pfak y861(+) Αντιγόνα Εικόνα 114. Ενεργοποίηση της FAK κατά την κυτταροφαγία της E. coli. Τα εναιωρήµατα των κυττάρων αφέθηκαν να ηρεµήσουν για µικρό χρονικό διάστηµα (επωάστηκαν σε θρεπτικό µέσο Grace). Ακολούθησε επίδραση µε E. coli για 30 min στους 25 ο C. Στην συνέχεια τα αιµοκύτταρα επαναιωρήθηκαν σε διάλυµα λύσης όπου ολοκληρώθηκε η λύση τους µε χρήση υπερήχων. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που επωάστηκαν σε θρεπτικό µέσο Grace για το ίδιο χρονικό διάστηµα. Η επαγόµενη ενεργοποίηση της FAK στο πρωτεϊνικό εκχύλισµα των αιµοκυττάρων προσδιορίστηκε µε ELISA. Από την παραπάνω γραφική παράσταση φαίνεται ότι η µεταβολή της ενεργοποίησης της FAK, δηλαδή η φωσφορυλίωση στην τυροσίνη 397 (p. FAK Y397) από την κατάσταση control (Grace) στην ενεργοποιηµένη από την E.coli κατάσταση είναι πολύ µικρή. Επίσης, ελέγξαµε την φωσφορυλίωση στην Y861, για την οποία, βιβλιογραφικά, υποστηρίζεται ότι φωσφορυλιώνεται από την Src, µετά από την φωσφορυλίωση της Y397 που έχει ως αποτέλεσµα την στρατολόγηση της Src από την FAK. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα η Υ861 φωσφορυλιώνεται ως απόκριση στην παρουσία E.coli, αλλά η µεταβολή από την κατάσταση ελέγχου είναι σχετικά µικρή. Τέλος, το αποτέλεσµα που προκαλεί µεγάλη εντύπωση είναι η αρκετά σηµαντική αύξηση της ποσότητας της FAK, ως απόκριση στην παρουσία βακτηρίων στο θρεπτικό µέσο. Φυσικά, µέσα σε χρονικό διάστηµα 30 λεπτών δεν µπορεί να συντέθηκε de novo τέτοια ποσότητα FAK. Η σύνθεση νέων πρωτεϊνών µέσω της µετάφρασης είναι µια διαδικασία που απαιτεί µεγαλύτερο χρονικό διάστηµα από 30 λεπτά για να ολοκληρωθεί. Συνεπώς, η ερµηνεία του αποτελέσµατος αυτού πρέπει να 198

205 Αποτελέσµατα βρίσκεται στην αλληλεπίδραση µεταξύ αντισώµατος και αντιγόνου στην εφαρµογή της µεθόδου ELISA. Η υπόθεση που κάναµε για να ερµηνεύσουµε τα αποτελέσµατα σε αυτή την περίπτωση είναι ότι τα αντισώµατα που χρησιµοποιήσαµε δεν µπορούν να αλληλεπιδράσουν «σωστά» µε τα αντιγόνα για τα οποία έχουν δηµιουργηθεί. Η υπόθεση αυτή ευσταθεί θεωρητικά µε δεδοµένο ότι στην ELISA τα αντιγόνα µε τα οποία πρόκειται να αλληλεπιδράσουν τα αντισώµατα, εν προκειµένω η FAK, βρίσκονται στην φυσιολογική τους κατάσταση, δηλαδή στην διαµόρφωση που διατηρούν in vivo. Αντίθετα, κατά τα ανοσοαποτυπώµατα οι πρωτεΐνες είναι αποδιαταγµένες αφού έχουν υποστεί επεξεργασία µε αποδιατακτικούς παράγοντες (SDS, DTT), βρασµό µε τελικό αποτέλεσµα την πλήρη αποδιάταξή τους. Συνεπώς, ένα αντίσωµα µπορεί να έχει παραχθεί για να αναγνωρίζει την «ξεδιπλωµένη» κατάσταση των πρωτεϊνών, µε συνέπεια να αλληλεπιδρά λιγότερο µε την φυσιολογική. Για να εξετάσουµε µια τέτοια υπόθεση χρησιµοποιήσαµε αποδιατακτικούς παράγοντες και στην ELISA. Έτσι αρχικά έγινε αποµόνωση αιµοκυττάρων, όπως έχουµε ήδη περιγράψει και επαναιώρηση τους σε Grace. Τα εναιωρήµατα των κυττάρων αφέθηκαν να ηρεµήσουν για µικρό χρονικό διάστηµα. Ακολούθησε επώαση µε E. coli (10 βακτήρια ανά κύτταρο) για 30 min στους 25 ο C. Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα που προέκυψαν από την λύση των αιµοκυττάρων µετρήθηκαν µε την µέθοδο Bradford για να εκτιµηθεί η ποσότητα της πρωτεΐνης που περιείχαν. Στην συνέχεια προσθέσαµε τις κατάλληλες ποσότητες από το πρωτεϊνικό εκχύλισµα στις µικροκυψελίδες της ELISA µε την διαφορά σε σχέση µε το προηγούµενο πείραµα ότι σε αυτήν την περίπτωση προσθέσαµε σε δείγµατα 0,1% SDS και 1% SDS. ηµιουργήσαµε δηλαδή, συνθήκες µερικής και ολικής αποδιάταξης για τα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα. Τα µικροπλακίδια παρέµειναν για 1 µέρα σε θερµοκρασία 4 ο C για να προσροφήθουν οι πρωτεΐνες στις πλαστικές µικροκυψελίδες. Ακολούθησε πολύ καλό ξέπλυµα µε TBS-tween των µικροκυψελίδων ώστε να αποµακρυνθεί εντελώς η ποσότητα του SDS και έπειτα συνεχίστηκε η πορεία σύµφωνα µε το πρωτόκολλο της µεθόδου. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που επωάστηκαν σε θρεπτικό µέσο Grace, µε και χωρίς τις αποδιατακτικές συνθήκες (Εικόνα 115). 199

206 Αποτελέσµατα Εικόνα 115. Ποσοτικός προσδιορισµός της FAK κατά την κυτταροφαγία της E. coli, µε ή χωρίς αποδιατακτικούς παράγοντες. Τα εναιωρήµατα των κυττάρων αφέθηκαν να ηρεµήσουν για µικρό χρονικό διάστηµα (επωάστηκαν σε θρεπτικό µέσο Grace). Ακολούθησε επίδραση µε E. coli για 30 min στους 25 ο C. Στην συνέχεια τα αιµοκύτταρα λύθηκαν µε δίαλυµα λύσης και µε χρήση υπερήχων. Μετρήθηκε η πρωτεΐνη µε Bradford και µοιράστηκαν 2-4 γ/ml σε κάθε µικροκυψελίδα. Για να δηµιουργήσουµε αποδιατακτικές συνθήκες προσθέσαµε 0,1 % SDS (µερική αποδιάταξη) και 1% SDS (ολική αποδιάταξη) Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που επωάστηκαν σε θρεπτικό µέσο Grace για το ίδιο χρονικό διάστηµα, µε ή χωρίς SDS. Η ποσότητα της FAK στο πρωτεϊνικό εκχύλισµα των αιµοκυττάρων προσδιορίστηκε µε ELISA. Η εικόνα 115 αποδεικνύει ότι η υπόθεση που διατυπώσαµε παραπάνω ευσταθεί και πειραµατικά. Όντως, το αντίσωµα έναντι της FAK (ολικής) για κάποιο λόγο αναγνωρίζει περισσότερο τα µόρια της FAK παρουσία E.coli και λιγότερο όταν βρίσκονται στο θρεπτικό υλικό (κατάσταση ελέγχου). Αντίθετα, όταν χρησιµοποιήθηκε 1% SDS, οι ποσότητες της FAK που αναγνωρίζονται από το αντίσωµα εξισώθηκαν. Αυτό σηµαίνει ότι µε την παρουσία, πρόσδεση και κυτταροφαγία του βακτηρίου από τα αιµοκύτταρα του εντόµου παράγεται κάποιο σήµα που φτάνει στην FAK την ενεργοποιεί και ταυτόχρονα επηρεάζει την διαµόρφωση της πρωτεΐνης στο χώρο (ή και αντίστροφα). Η αλλαγή διαµόρφωσης της FAK αυξάνει την ικανότητα του αντισώµατος έναντι της ολικής FAK (c-903) να αναγνωρίζει το αντιγονικό καθοριστή του. Σε συνθήκες µερικής αποδιάταξης τα αποτελέσµατα αντιστρέφονται σε σχέση µε την εικόνα της κατάστασης ελέγχου. Αυτό το αποτέλεσµα ενισχύει την άποψη περί αλλαγής της διαµόρφωσης της FAK. 200

207 Αποτελέσµατα Συνολικά από τα αποτελέσµατα της ELISA προκύπτει ότι για να εξαχθούν σωστά συµπεράσµατα από αυτή την µέθοδο θα πρέπει τα αντισώµατα που θα χρησιµοποιηθούν να είναι κατάλληλα για αναγνώριση αντιγόνων στην φυσική τους διαµόρφωση. Υπό αυτό το πρίσµα το αποτέλεσµα για την Υ397 της εικόνας 114 δεν πρέπει να απεικονίζει την πραγµατική εικόνα της κατάστασης της φωσφορυλίωσης που ισχύει την δεδοµένη στιγµή. 201

208 Αποτελέσµατα 11. Η FAK συµµετέχει στο σχηµατισµό µεγάλων πολύπρωτεϊνικών συµπλόκων των οποίων η σύσταση αλλάζει κατά την διάρκεια της κυτταροφαγίας βακτηρίων. Είδαµε µέχρι τώρα ότι η FAK ενεργοποιείται κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων της E.coli, γεγονός που σχετίζεται άµεσα µε αλλαγή της διαµόρφωσης του µορίου στο χώρο. Επίσης, από τα προηγούµενα αποτελέσµατα φαίνεται ότι η FAK σχηµατίζει πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα µε τη συµµετοχή των ιντεγκρινών (β1 και β3) αλλά και µε την παξιλίνη σε εναιωρήµατα αιµοκυττάρων δίχως την ύπαρξη εξωγενών ερεθισµάτων. Συνεπώς, ένα εύλογο ερώτηµα που προκύπτει είναι αν συµµετέχουν σε αυτά τα προσχηµατισµένα σύµπλοκα και άλλες πρωτεΐνες. Επίσης, ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η αλλαγή διαµόρφωσης της FAK σε σχέση µε τα σύµπλοκα, µε δεδοµένο ότι µια αλλαγή µπορεί να έχει τροποποιητικές συνέπειες για την σύσταση των συµπλόκων ή µπορεί να είναι απόρροια της τροποποίησης της σύστασης των πολύπρωτεϊνικων συµπλόκων σε απόκριση προς την κυτταροφαγία των βακτηρίων. Για να µελετήσουµε και να απαντήσουµε τα παραπάνω ζητήµατα χρησιµοποιήσαµε ως πειραµατική µεθοδολογία την ανοσοκατακρήµνιση. A1. Συµµετοχή του κυτταροσκελετού της ακτίνης και των µικροσωληνίσκων στα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα της FAK. Οι πρωτεΐνες που θελήσαµε σε πρώτη φάση να ελέγξουµε αν αλληλεπιδρούν (άµεσα ή έµµεσα) µε την FAK, σε εναιώρηµα κύτταρων, σχετίζονται µε τον κυτταροσκελετό. Συγκεκριµένα, πραγµατοποιήσαµε ανοσοκατακρηµνίσεις για να ανιχνεύσουµε την αλληλεπίδραση της FAK µε την ακτίνη και την τουµπουλίνη. Για τις πρωτεΐνες αυτές υπάρχουν βιβλιογραφικά δεδοµένα όπου διαπιστώνεται η αλληλεπίδραση τους µε την FAK στις εστίες προσκόλλησης (Lipfert et al. 1992, Schlaepfer et al. 1998, Brunton et al. 2004, Mitra et al. 2005). Για το σκοπό αυτό αιµοκύτταρα του σταδίου περιπλάνησης επωάστηκαν σε θρεπτικό µέσο Grace. Ακολούθησε λύση των κυττάρων, µε χρήση υπερήχων, µέτρηση της πρωτεΐνης των εκχυλισµάτων µε την µέθοδο Bradford (επιθυµητή συγκέντρωση πρωτεΐνης 300γ) και στην συνέχεια πραγµατοποιήθηκε ανοσοκατακρήµνιση µε αντίσωµα έναντι της ολικής FAK. Ακολούθησε ηλεκτροµεταφορά σε µεµβράνη PVDF και για να ελεγχθεί 202

209 Αποτελέσµατα η αλληλεπίδραση µε την FAK, οι µεµβράνες επωάστηκαν µε αντίσωµα έναντι της ακτίνης (Εικόνα 116Α) και έναντι της τουµπουλίνης (Εικόνα 116Β). Anti-FAK Ανοσοΐζηµα Υπερκείµενο IP Μαγν. Σφαιρ. Λευκά αιµοσφ. Anti-FAK Ανοσοΐζηµα Υπερκείµενο IP Μαγν. Σφαιρ. Λευκά αιµοσφ. WB Actin WB Tubulin A IP FAK B IP FAK Εικόνα 116. ιαπίστωση της αλληλεπίδρασης της FAK µε τον κυτταροσκελετό της ακτίνης και τους µικροσωληνίσκους σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων, του 3 ου προνυµφικού σταδίου, της Ceratitis capitata. Έγινε ανοσοκατακρήµνιση της ολικής FAK σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντισώµατα έναντι της ακτίνης (Α) και τουµπουλίνης (Β). Στην εικόνα Α απεικονίζεται η κατακρήµνιση της ακτίνης από τo αντίσωµα έναντι της FAK. Αντίστοιχα, στην εικόνα Β φαίνεται η κατακρήµνιση της τουµπουλίνης από το αντίσωµα έναντι της FAK. Αριστερά: ιαδροµή 1. Αντίσωµα έναντι της ολικής FAK. ιαδροµή 2. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για ολική FAK. ιαδροµή 3. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της ολικής FAK. ιαδροµή 4. Κατακρήµνιση µαγνητικών σφαιριδίων που χρησιµοποιήθηκαν για την ανοσοκατακρήµνιση της FAK (c-903). ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από λευκά αιµοσφαίρια ανθρώπου. Η PVDF µεµβράνη εµφανίστηκε µε αντίσωµα έναντι της ακτίνης. εξιά: ιαδροµή 1. Αντίσωµα έναντι της ολικής FAK. ιαδροµή 2. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για ολική FAK. ιαδροµή 3. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της ολικής FAK. ιαδροµή 4. Εκχύλισµα από κατακρήµνιση µαγνητικών σφαιριδίων που χρησιµοποιήθηκαν για την ανοσοκατακρήµνιση της FAK (c-903). ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από λευκά αιµοσφαίρια ανθρώπου. Η PVDF µεµβράνη εµφανίστηκε µε αντίσωµα έναντι της τουµπουλίνης. Από την παραπάνω εικόνα αποδεικνύεται ότι η ακτίνη είναι συνδεδεµένη µε την FAK σε συνθήκες εναιωρήµατος. Ανοσοκατακρήµνιζοντας την FAK παρατηρούµε ότι κατακρηµνίζεται και η ακτίνη (µοριακό βάρος 42 KDa), που σηµαίνει ότι στα αιµοκύτταρα της µύγας η FAK βρίσκεται υπό φυσιολογικές 203

210 Αποτελέσµατα συνθήκες σε σύµπλοκο µε την ακτίνη. Οµοίως, στην εικόνα 116Β φαίνεται ότι σε αντίστοιχη ανοσοκατακρήµνιση της FAK κατακρηµνίζεται µαζί της και η τουµπουλίνη. Άρα, σε συνθήκες ελέγχου, δηλαδή δίχως να επιδράσουµε µε κάποιο ερέθισµα στα κύτταρα, βρίσκουµε ότι η FAK σχηµατίζει σύµπλοκα µε τον κυτταροσκελετο της τουµπουλίνης. Συµπερασµατικά µπορούµε να εικάσουµε ότι η FAK συνδέεται άµεσα ή έµµεσα µε τον κυτταροσκελετού της ακτίνης και της τουµπουλίνης. Α2. Συνεντοπισµός της phospho-fak Y397 και του κυτταροσκελετού τουµπουλίνης στα αιµοκύτταρα της C.capitata Για να ενισχυθεί το αποτέλεσµα της συγκατακρήµνισης της τουµπουλίνης µε την FAK µελετήθηκε στην συνέχεια η κατανοµή της FAK p. Y397 σε σχέση µε τον κυτταροσκελετό της τουµπουλίνης. Για το σκοπό αυτό πραγµατοποιήθηκε διπλή χρώση των κυττάρων µε αντισώµατα έναντι της FAK p. Y397 και έναντί της τουµπουλίνης. Τα αντισώµατα που χρησιµοποιήσαµε ήταν συζευγµένα µε διαφορετικά φθοροχρώµατα. Συγκεκριµένα το αντίσωµα έναντι του FAK p.y397 αντισώµατος ήταν συζευγµένο µε FITC ενώ το αντίσωµα έναντι του αντισώµατος της τουµπουλίνης ήταν συζευγµένο µε Cy3 (κόκκινο φθορόχρωµα). Οι φωτογραφίες της εικόνας 117 προέρχονται από συνεστιακό µικροσκόπιο. Από την παρατήρηση των παρασκευασµάτων προκύπτει ότι η φωσφορυλιωµένη στην θέση Υ397 FAK συνεντοπίζεται µε τον κυτταροσκελετό τουµπουλίνης. Συνεπώς, εκτός από τον κυτταροσκελετό της ακτίνης που βρίσκεται αναµφισβήτητα σε αλληλεπίδραση µε την FAK και ο κυτταροσκελετός της τουµπουλίνης φαίνεται να αλληλεπιδρά (ή τουλάχιστον να εντοπίζεται στις ίδιες περιοχές του κυττάρου) µε την FAK. Βεβαίως, θα πρέπει να τονιστεί ο χρόνος προσκόλλησης των κυττάρων είναι αρκετά µεγάλος δεδοµένου του γεγονότος ότι τα αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata µπορούν να προσκολληθούν σε αντικειµενοφόρους µέσα σε λιγότερο από 10 λεπτά. Για αυτό τον λόγο εξετάστηκε η κατανοµή της FAK και η αλληλεπίδραση της µε τον κυτταροσκελετό της τουµπουλίνης µετά από χρόνο προσκόλλησης των κυττάρων στο υπόστρωµα, δέκα λεπτών (Εικόνα 118). 204

211 Αποτελέσµατα Εικόνα 117. Η κατανοµή της FAK p. Y397 σε σχέση µε τον κυτταροσκελετό της τουµπουλίνης (x63). (Α1-Α2): Η κατανοµή της FAK p.y397 µε δυο διαφορετικές απεικονίσεις, η Α1 παρουσιάζει το πραγµατικά ορατό µε γυµνό µάτι σήµα (τα κύτταρα είναι πράσινα λόγω του anti-rabbit-fitc) ενώ η Α2 παρουσιάζει το ψηφιακό σήµα που λαµβάνουµε µε την κάµερα του συνεστιακού µικροσκοπίου. (Β1-Β2): Η κατανοµή του κυτταροσκελετού της τουµπουλίνης. Στην Β1 ο κυτταροσκελετός φαίνεται κόκκινος λόγω του anti-mouse-cy3 ενώ στην Β2 φαίνεται το ψηφιακό σήµα που λαµβάνει η φωτογραφική κάµερα και το οποίο φυσικά αντιστοιχεί στα σηµεία φθορισµού του φθοροχρώµατος δηλαδή στην τουµπουλίνη των κυττάρων. (C1): Η συνένωση των δυο παραπάνω φωτογραφιών µας επιτρέπει να παρατηρήσουµε τον συνεντοπισµό των δυο αντιγόνων που βάψαµε της FAK py397 και του κυτταροσκελετού τουµπουλίνης. Οι φωτογραφίες προέρχονται από συνεστιακό µικροσκόπιο σάρωσης (Confocal Scanning Microscopy, Leica TCS-SP Confocal Microscope, Argon Ion Laser- Helium-Neon Laser, nm). 205

212 Αποτελέσµατα Συγκρίνοντας τις εικόνες 117 και 118 µπορεί κανείς να παρατηρήσει ότι το δίκτυο της τουµπουλίνης, δηλαδή ο κυτταροσκελετός, δεν είναι τόσο ανεπτυγµένος στην εικόνα 118 όπου η προσκόλληση των κυττάρων πραγµατοποιείται σε πολύ µικρό χρονικό διάστηµα (10 λεπτά) σε αντίθεση µε την εικόνα 117 στην οποία η προσκόλληση των κυττάρων διατηρείται για 90 λεπτά. Παράλληλα, όσον αφορά την FAK, το σήµα της εικόνας 118 είναι σαφώς ισχνότερο σε σχέση µε την ένταση του σήµατος που απεικονίζεται στην εικόνα 97. Η διαφορά αυτή µπορεί να οφείλεται επίσης στον χρόνο που τα κύτταρα παρέµειναν σε συνθήκες προσκόλλησης. Εικόνα 118. Συνεντοπισµός της FAK µε τον κυτταροσκελετό της τουµπουλίνης µετά από προσκόλληση στο υπόστρωµα για 10 λεπτά. (Α) Η κατανοµή της FAK (αντίσωµα έναντι της ολικής πρωτεΐνης), (Β) Ο κυτταροσκελετός της τουµπουλίνης και (C) η εικόνα που προκύπτει από τον συνδυασµό-επικάλυψη των Α,Β (merge). Οι φωτογραφίες προέρχονται από συνεστιακό µικροσκόπιο σάρωσης (Confocal Scanning Microscopy, Leica TCS-SP Confocal Microscope, Argon Ion Laser- Helium-Neon Laser, nm). Ερµηνεύοντας την διαφορά, στην περίπτωση της εκτεταµένης προσκόλλησης τα κύτταρα πιθανότατα να αναπτύσσουν περισσότερες συνδέσεις µε το υπόστρωµα (του τύπου των εστιών προσκόλλησης). Οι συνδέσεις αυτές είναι «ώριµες» µε την έννοια ότι έχουν συναθροιστεί µε την πάροδο του χρόνου όλα εκείνα τα στοιχεία που συµβάλλουν στην ενίσχυση και σταθεροποίηση τους και για αυτό ίσως παρατηρούµε έντονα σηµεία στην κατανοµή της FAK (Wozniak et al. 2004, Brakebusch et al. 2003). Αυτές οι εστίες σήµατος θα πρέπει να αντιστοιχούν σε συνάθροιση µορίων FAK σε «χρονικώς ώριµα» σηµεία επαφής ανάµεσα στα κύτταρα και την εξωκυτταρική ύλη. Αντίθετα, στην εικόνα 118 παρατηρούµε νεοσχηµατιζόµενες εστίες προσκόλλησης (focal complexes) ή σηµεία επαφής µε την εξωκυτταρική ύλη και για αυτό πιθανότατα το σήµα της FAK παρουσιάζει περισσότερο ενιαία κατανοµή. 206

213 Αποτελέσµατα B. Συµµετοχή της ERK MAPK στα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα που σχηµατίζει η FAK σε φυσιολογικές συνθήκες και κατά την κυτταροφαγία βακτηρίων. Πειραµατικά δεδοµένα υποστηρίζουν ότι οι κινάσες ERK και JNK αλληλεπιδρούν µε την FAK σε κύτταρα τα οποία δέχονται σήµατα από υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων ή από την εξωκυτταρική ύλη διαµέσου των ιντεγκρινών (Renshaw et al. 1999, Almeida et al. 2000, Barberis et al. 2000). Στηριζόµενοι σε τέτοια δεδοµένα µελετήσαµε την σχέση ERK-FAK σε αιµοκύτταρα τα οποία καλλιεργήθηκαν ως εναιώρηµα και επωάστηκαν µε βακτήρια E.coli για 15 λεπτά σε θερµοκρασία 4 o C. Με την χρήση υπερήχων λύσαµε τα αιµοκύτταρα και ακολούθησε η µέτρηση του πρωτεϊνικού εκχυλίσµατος µε την µέθοδο Bradford. Έπειτα, προετοιµάστηκαν δείγµατα µε ίση ποσότητα πρωτεΐνης (300 γ) και πραγµατοποιήθηκαν ανοσοκατακρηµνίσεις για την ERK και την p. ERK (ενεργοποιηµένη µορφή της ERK). Ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της p. FAK Y397 (Εικόνα 119). Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν δείγµατα αιµοκυττάρων τα οποία λύσαµε αµέσως µετά από µια ολιγόλεπτη επώαση σε θρεπτικό µέσο (Grace). Η επώαση των κυττάρων στο θρεπτικό µέσο είχε ως σκοπό την επάνοδο των κυττάρων στην φυσιολογική κατάσταση ύστερα από το στρες στο οποίο ενδεχοµένως υποβλήθηκαν κατά πορεία της αποµόνωσης τους. Επιλέξαµε να πραγµατοποιηθεί η επώαση των αιµοκυττάρων µε τα βακτήρια στους 4 o C γιατί σε αυτές τις συνθήκες η κυτταροφαγία επιβραδύνεται. Μάλιστα, στις συνθήκες ψύξης παρατηρήσαµε (όπως αναφέρθηκε προηγουµένως) ότι χάνεται η δεύτερη κορυφή στην ενεργοποίηση της FAK p. Y397 σε σύγκριση µε τους 25 o C. Αυτό σηµαίνει ότι επιβραδύνονται αναλόγως και οι αλλαγές που προκαλούνται από την κυτταροφαγία στην σύσταση των πολύπρωτεϊνικων συµπλόκων, την οποία θέλουµε να µελετήσουµε. Κατά συνέπεια, λοιπόν, µπορούµε να µελετήσουµε σε αυτές τις συνθήκες την σύσταση των συµπλόκων που σχηµατίζονται από την FAK µε την επίδραση του πρώτου κύµατος σηµάτων που προκαλούν την ενεργοποίηση της. Επιλέγουµε εποµένως, αυτό το µεταβατικό στάδιο για να εντοπίσουµε τυχόν διαφορές στην σύσταση των συµπλόκων. Με βάση τα όσα έχουµε παρατηρήσει µέχρι τώρα η ενεργοποίηση της FAK στα πρώτα λεπτά πρέπει να οφείλεται στην 207

214 Αποτελέσµατα πρόσδεση των βακτηρίων στους υποδοχείς της πλασµατικής µεµβράνης (που οδηγεί στην εσωτερίκευση των βακτηρίων) (outside in signal). Υπερ. Ανοσ. Υπ ερ. Ανοσ. Ανοσοΐζηµα Υπερ. Ανοσ. E.coli Υπερ. Ανοσ. Ανοσοΐζηµα Υπερ. Ανοσ. Υπερ. Ανοσ. Ανοσοΐζηµα Υπερ. Ανοσ. E.coli Υπερ. Ανοσ. Ανοσοΐζηµα Anti-ERK Anti-p. ERK Ολικό εκχ. αιµοκυττάρων C.c. WB p. FAK Y IP ERK IP p. ERK Εικόνα 119. ιαπίστωση της αλληλεπίδρασης της ERK µε την FAK σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων, του 3 ου προνυµφικού σταδίου, της Ceratitis capitata. Σε εναιωρήµατα αιµοκυττάρων έγινε επώαση µε βακτήρια E.coli για 15 λεπτά, στους 4 ο C. Ακολούθησε φυγοκέντρηση, αποµάκρυνση του υπερκειµένου και λύση των αιµοκυττάρων. Έπειτα έγινε ανοσοκατακρήµνιση της ERK και της p.erk στο πρωτεϊνικό εκχύλισµα των αιµοκυττάρων. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p.y397. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που είχαν καλλιεργηθεί σε θρεπτικό µέσο Grace απουσία των βακτηρίων. IP ERK: ιαδροµή 1. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της ERK απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 2. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της ERK απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 3. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για ERK απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 4. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της ERK µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της ERK µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 6. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για ERK µετά από επώαση µε E. coli. IP p. ERK: ιαδροµή 7. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.erk απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 8. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.erk απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 9. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για p.erk απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 10. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.erk µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 11. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.erk µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 12. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για p.erk µετά από επώαση µε E. coli. ιαδροµή 13. Αντίσωµα έναντι της ERK. ιαδροµή 14. Αντίσωµα έναντι της p.erk. ιαδροµή 15. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata. Πράγµατι από την εικόνα 119 διαπιστώνουµε ότι η ERK αλληλεπιδρά µε την FAK σε εναιώρηµα αιµοκυττάρων υπό συνθήκες ελέγχου αφού όπως προκύπτει από την διαδροµή 3 της εικόνας 119, συγκατακρηµνίζονται. Το ίδιο αποτέλεσµα 208

215 Αποτελέσµατα προκύπτει επίσης από πείραµα κατά το οποίο ακολουθήσαµε την αντίστροφη πορεία, δηλαδή σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων έγινε ανοσοκατακρήµνιση για την FAK και ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της ERK (Εικόνα 120). Υπερκ. IP Ανοσοΐζηµα Σφαιρίδια WB ERK IP FAK Εικόνα 120. ιαπίστωση της αλληλεπίδρασης της ERK µε την FAK σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων, του 3 ου προνυµφικού σταδίου, της Ceratitis capitata. Έγινε ανοσοκατακρήµνιση της FAK σε πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα αιµοκυττάρων. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της ERK. ιαδροµή 1. Υπερκείµενο εκχύλισµα ανοσοκατακρήµνισης της FAK. ιαδροµή 2. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης της FAK. ιαδροµή 3. Κατακρήµνιση µαγνητικών σφαιριδίων που χρησιµοποιούνται για την κατακρήµνιση της FAK. Η επίδραση µε τα βακτήρια στα αιµοκύτταρα φαίνεται ότι ενισχύει την αλληλεπίδραση των FAK-ERK αφού όπως φαίνεται από την διαδροµή 6 της εικόνας 119, η ποσότητα της p. FAK που κατακρηµνίζεται από το αντίσωµα έναντι της ERK, µε τις δεδοµένες συνθήκες, έχει αυξηθεί. Ειδικότερα, διαπιστώνουµε θραύσµατα της FAK κοντά στα 70 KDa που δεν παρατηρούνται στα δείγµατα ελέγχου. Επίσης, έχει ενισχυθεί µερικώς και η ζώνη στα 120 KDa. Η εµφάνιση των θραυσµάτων µπορεί να σχετίζεται µε την δράση πρωτεασών (όπως π.χ. την καλπαΐνη). Όσον αφορά την ενεργοποιηµένη µορφή της ERK οι αλλαγές ανάµεσα στην κατάσταση ελέγχου και µετά την επίδραση βακτηρίων είναι περισσότερο εντυπωσιακές. Από την εικόνα παρατηρούµε ότι η ενεργοποιηµένη ERK υπό συνθήκες ελέγχου βρίσκεται σε σύµπλοκο µε την p.fak Y397 (διαδροµή 9). Το αντίθετο συµβαίνει όµως µε την επίδραση των βακτηρίων στα αιµοκύτταρα, δηλαδή παρατηρούµε ότι η p. FAK Y397 κατακρηµνίζεται λιγότερο από το αντίσωµα έναντι 209

216 Αποτελέσµατα της p. ERK. Κατά συνέπεια, η p. ERK φαίνεται να αποδεσµεύεται από το σύµπλοκο της FAK µε την επίδραση της E.coli. Στην διαδροµή 12 της εικόνας 119 παρατηρούµε µια ζώνη που πιθανότατα αντιστοιχεί στο θραύσµα των 66 KDa της FAK. Επίσης, στην διαδροµή 6 της ίδιας εικόνας παρατηρούµε µια αντίστοιχη ζώνη. Αντίθετα στις διαδροµές 3 και 9 δεν φαίνεται να υπάρχει η συγκεκριµένη ζώνη αλλά µπορούµε να παρατηρήσουµε το θραύσµα των 66 kda. Η εµφάνιση αυτής της ζώνης είναι πιθανό να σχετίζεται µε την επίδραση των βακτηρίων. Άρα µπορεί να υποθέσει κανείς ότι µετά την επίδραση των βακτηρίων ανιχνεύονται σύµπλοκα της FAK p. Y397 µε την ERK για τα οποία θα πρέπει να τονιστεί ότι το τµήµα της FAK που αλληλεπιδρά µε την (ενεργοποιηµένη) ERK, σε αυτή την περίπτωση, δεν αντιστοιχεί στο πλήρες µόριο της FAK αλλά σε µικρότερο τµήµα του, ενδεχοµένως κάποιο θραύσµα του. Τέτοιου είδους θραύσµατα πιθανότατα αποτελούν το αποτέλεσµα πρωτεολυτικής δράσης ενζύµων όπως π.χ. η καλπαΐνη που είναι γνωστό ότι ενεργοποιείται (φωσφορυλιώνεται) από την p. ERK. Έχοντας ως δεδοµένο, λοιπόν, την αποδέσµευση της p. ERK από το λειτουργικό σύµπλοκο µε την FAK θελήσαµε να ερευνήσουµε τη συµπεριφορά της αλληλεπίδρασης p. ERK- FAK p.y397 όταν µετά από την επίδραση µε τα βακτήρια µεσολαβήσει κάποιο διάστηµα επώασης των κυττάρων δίχως το ερέθισµα από τα βακτήρια. Έτσι, αιµοκύτταρα από το τρίτο προνυµφικό στάδιο συλλέχθηκαν και καλλιεργήθηκαν ως εναιώρηµα µε επίδραση βακτηρίων για 15 λεπτά στους 4 ο C. Στην συνέχεια, τα βακτήρια αποµακρύνθηκαν µε φυγοκέντρηση και το ίζηµα των αιµοκυττάρων επαναιωρήθηκε σε νέο θρεπτικό µέσο Grace. Τα εναιωρήµατα των κυττάρων παρέµειναν για 30 λεπτά υπό ανάδευση στους 4 ο C. Ακολούθησε φυγοκέντρηση, λύση των κυττάρων µε υπερήχους, µέτρηση της πρωτεΐνης των εκχυλισµάτων µε Bradford. Σε δείγµατα των 300γ (ολικής πρωτεΐνης) έγινε ανοσοκατακρήµνιση για την p. ERK και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα έναντι της FAK p. Y397 (Εικόνα 121). 210

217 Αποτελέσµατα - E.coli E.coli Μαγν. Σφαιρίδ. Υπερκείµενο Σφαιριδίων Υπερκείµενο εκχύλισµα IP Ανοσοΐζηµα Υπερκείµενο εκχύλισµα IP Ανοσοΐζηµα Anti-p. ERK WB p.fak Y IP p. ERK Εικόνα 121. Η αλληλεπίδραση της ενεργοποιηµένης ERK µε την FAK p. Y397 τροποποιείται µε την επίδραση βακτηρίων στα αιµοκύτταρα. Σε εναιωρήµατα αιµοκυττάρων έγινε επώαση µε βακτήρια E.coli για 15 λεπτά, στους 4 ο C. Ακολούθησε φυγοκέντρηση, αποµάκρυνση του υπερκειµένου και αναδιάλυση του ιζήµατος των αιµοκυττάρων σε θρεπτικό µέσο Grace. Τα εναιωρήµατα των κυττάρων επωάστηκαν υπό ανάδευση για ακόµα 30 λεπτά στους 4 ο C. Στην συνέχεια πραγµατοποιήθηκε φυγοκέντρηση των δειγµάτων, λύση των αιµοκυττάρων και ποσοτικός προσδιορισµός της πρωτεΐνης των εκχυλισµάτων µε Bradford. Έπειτα σε πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα 300γ έγινε ανοσοκατακρήµνιση της p. ERK. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p. Y397. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που είχαν καλλιεργηθεί σε θρεπτικό µέσο Grace µε την επίδραση βακτηρίων και στα οποία έγινε ανοσοκατακρήµνιση για την p.erk αµέσως µετά από την επίδραση της E.coli. IP p. ERK: ιαδροµή 1. Κατακρήµνιση µαγνητικών σφαιριδίων που χρησιµοποιήθηκαν για τις ανοσοκατακρηµνίσεις. ιαδροµή 2. Υπερκείµενο εκχύλισµα από κατακρήµνιση σφαιριδίων. ιαδροµή 3. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p. ERK µετά από αποµάκρυνση της E.coli και ηρεµία για 30 λεπτά. ιαδροµή 4. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για p. ERK µετά από αποµάκρυνση της E.coli και ηρεµία για 30 λεπτά. ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p. ERK µετά από επώαση µε E.coli ιαδροµή 6. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για p. ERK µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 7. Αντίσωµα έναντι της p. ERK. Γνωρίζοντας ότι η p.erk αποδεσµεύεται από το σύµπλοκο της FAK µετά από επίδραση βακτηρίων (εικόνα 119) µπορούµε να υποστηρίξουµε για το αποτέλεσµα της εικόνας 121 ότι η p.erk δείχνει να «επιστρέφει» στο σύµπλοκο της FAK µετά την αποµάκρυνση των βακτηρίων. Το χρονικό διάστηµα των 30 λεπτών ηρεµίας που ακολούθησε την αποµάκρυνση των βακτηρίων είχε ως σκοπό την επαναφορά των κυττάρων στη φυσιολογική κατάσταση (ηρεµία) µετά από την διέγερση των 211

218 Αποτελέσµατα βακτηρίων. Βεβαίως στην εικόνα 121 παρατηρούµε κάποιο ίχνος ζώνης στα 120 kda που αντιστοιχεί στο πλήρες λειτουργικό- µόριο της FAK, αλλά θεωρούµε ότι αυτή η εµφάνιση δεν έρχεται σε αντίθεση µε την εικόνα 119 γιατί τα αποτελέσµατα των ανοσοκατακρηµνίσεων είναι περισσότερο ποιοτικά και όχι ποσοτικά. Στην προκειµένη περίπτωση ενδιαφέρει περισσότερο η σύγκριση των διαδροµών 4 και 6 από την οποία καταλήγουµε στο συµπέρασµα ότι το αντίσωµα έναντι της p.erk κατακρηµνίζει περισσότερη p. FAK Y397 όταν ακολουθεί την επίδραση των βακτηρίων µια περίοδος ηρεµίας για τα κύτταρα η οποία συνεπάγεται την επάνοδο των συµπλόκων στην φυσιολογική τους κατάσταση. Τέλος και στις δυο παραπάνω περιπτώσεις (διαδροµές 4, 6: εικόνα 121) φαίνεται πως η p.erk βρίσκεται σε σύµπλοκο µε θραύσµα της FAK ( 70 KDa), γεγονός που ενισχύει την συσχέτιση της συγκεκριµένης ζώνης µε την παρουσία της E.coli. Γ. Συµµετοχή του µεταγραφικού παράγοντα Elk-1 στα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα που σχηµατίζει η FAK σε φυσιολογικές συνθήκες και κατά την κυτταροφαγία βακτηρίων. Η αποδέσµευση της ενεργοποιηµένης ERK από το σύµπλοκο της FAK ίσως να σχετίζεται µε µεταφορά σήµατος προς µεταγραφικούς παράγοντες που αποτελούν τα υποστρώµατα των MAP κινασών. Γνωστός µεταγραφικός παράγοντας-υπόστρωµα της ERK είναι και ο Elk-1. Έτσι θελήσαµε να βρούµε εάν υπάρχει αλληλεπίδραση ανάµεσα στον µεταγραφικό παράγοντα Elk-1 και στην φυσιολογική κινάση που τον ενεργοποιεί ενώ παράλληλα µελετήσαµε ενδεχόµενη αλληλεπίδραση του Elk-1 µε την FAK. Για αυτό τον σκοπό αιµοκύτταρα από WS άτοµα της φρουτόµυγας αποµονώθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε εναιωρήµατα θρεπτικού µέσου Grace. Στην συνέχεια τα αιµοκύτταρα λύθηκαν και σε πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα των 300γ έγιναν ανοσοκατακρηµνίσεις για τις ERK και FAK. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι του µεταγραφικού παράγοντα Elk-1 (Εικόνα 122). 212

219 Αποτελέσµατα Υπερ κ. Ανοσ. Ανοσοΐζηµα Υπερκ. Ανοσ. Anti-ERK Υπερκ. Ανοσ. Ανοσοΐζηµα Υπερκ. Ανοσ. Anti-FAK Ολικό εκχ. αιµοκυττάρων C.c. WB Elk IP ERK IP FAK Εικόνα 122. ιαπίστωση της αλληλεπίδρασης του µεταγραφικού παράγοντα Elk-1 µε την ERK και µε την FAK σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων, του 3 ου προνυµφικού σταδίου, της Ceratitis capitata. Έγινε ανοσοκατακρήµνιση της ERK και της FAK σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι του Elk-1. IP ERK: ιαδροµή 1. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της ERK. ιαδροµή 2. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για ERK. ιαδροµή 3. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της ERK. ιαδροµή 4. Αντίσωµα έναντι της ERK. IP FAK: ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της FAK. ιαδροµή 6. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για FAK. ιαδροµή 7. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της FAK. ιαδροµή 8. Αντίσωµα έναντι της FAK. ιαδροµή 9. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata. Από την παραπάνω εικόνα διαπιστώνουµε ότι ο µεταγραφικός παράγοντας Elk- 1 αλληλεπιδρά τόσο µε την ERK, µια αλληλεπίδραση που ήταν αναµενόµενη επειδή υποστηρίζεται και βιβλιογραφικά, αλλά και µε την FAK γεγονός που είναι εντυπωσιακό. Φυσικά, η ανοσοκατακρήµνιση ως τεχνική δεν µας επιτρέπει να υποστηρίξουµε την άµεση ή έµµεση αλληλεπίδραση των δυο πρωτεϊνών. Για να επαληθευτεί, όµως, αυτή η σχέση µελετήσαµε µε ανοσοφθορισµό την κατανοµή του Elk-1 στα αιµοκύτταρα της φρουτόµυγας προκειµένου να διαπιστωθεί ενδεχόµενη κοινή κατανοµή των πρωτεϊνών, η οποία πιθανότατα θα δικαιολογούσε συνεντοπισµό και αλληλεπίδραση µεταξύ τους. Έτσι, η ανίχνευση του µεταγραφικού παράγοντα Elk-1 έγινε σε αιµοκύτταρα του σταδίου περιπλάνησης αµέσως µετά την προσκόλλησή τους σε αντικειµενοφόρους για 10 λεπτά. Το συγκεκριµένο αντιγόνο εντοπίζεται στο 213

220 Αποτελέσµατα εσωτερικό του κυττάρου. Για το λόγο αυτό, µετά την παρασκευή των µονόστοιβων, τα κύτταρα κατέστησαν διαπερατά (επώαση µε 0,01% Triton-X-100 σε TBS για µερικά δευτερόλεπτα) και ακολούθησε η µονιµοποίησή τους σε µεθανόλη (όπως έχει περιγραφεί νωρίτερα) προκειµένου να αποµακρυνθεί η διαλυτή πρωτεΐνη. Η ανίχνευση έγινε µε αντισώµατα έναντι του Elk-1 θηλαστικών. Το δεύτερο αντίσωµα ήταν συζευγµένο µε FITC (Εικόνα 123). Εικόνα 123. Προσδιορισµός της κατανοµής του µεταγραφικού παράγοντα Elk-1 στα αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata µε ανοσοφθορισµό. Αιµοκύτταρα του σταδίου περιπλάνησης καλλιεργήθηκαν σε µονόστοιβα για 10 λεπτά και µετά από µονιµοποίηση (µεθανόλη για 30 λεπτά στους -20 ο C), έγιναν διαπερατά µε επώαση σε Triton-X-100. Για την ανίχνευση του Elk-1 χρησιµοποιήθηκε αντιορός έναντι του Elk-1 θηλαστικών (επώαση για 1 ώρα σε 37 ο C). Το δεύτερο αντίσωµα ήταν συζευγµένο µε FITC. Η κατανοµή του µεταγραφικού παράγοντα όπως απεικονίζεται στην εικόνα είναι περισσότερο περιφερειακή παρά κεντρική (ενν. στον πυρήνα) όπως αναµενόταν θεωρητικά. Το αποτέλεσµα του ανοσοφθορισµού φαίνεται πως συµφωνεί µε το πρότυπο της κατανοµής της FAK. Αυτός ο ενδεχόµενος συνεντοπισµός ίσως δικαιολογεί την αλληλεπίδραση που αποκαλύφθηκε από την ανάλυση κατά Western. Από τα τελευταία δεδοµένα µας δόθηκε η αφορµή να εξετάσουµε την συµπεριφορά της αλληλεπίδρασης ανάµεσα στις δυο αυτές πρωτεΐνες (δηλ. FAK και Elk-1) κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων. Ως γνωστόν, αιµοκύτταρα από το στάδιο περιπλάνησης αποµονώθηκαν και καλλιεργήθηκαν ως εναιώρηµα υπό την επίδραση βακτηρίων E.coli (15, 4 o C). Ακολουθώντας την γνωστή διαδικασία έγιναν ανοσοκατακρηµνίσεις σε πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα (300 γ) για την Elk-1 και την p. 214

221 Αποτελέσµατα Elk-1 (φωσφορυλιωµένη µορφή της Elk-1). Ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p. Y397. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα τα οποία καλλιεργήθηκαν απουσία βακτηρίων (Εικόνα 124). Υ περ. Α νοσ. Α νοσοΐζηµα Υ περ. Α νοσ. A nti-elk -1 Υ περ. Α νοσ. E.coli Α νοσοΐζηµα Υ περ. Α νοσ. Υ περ. Α νοσ. Α νοσοΐζηµα Υ περ. Α νοσ. A nti-p. Elk -1 Υ περ. Α νοσ. E.coli Α νοσοΐζηµα Υ περ. Α νοσ. Ο λικό εκχ. αιµοκυττάρων C.c. WB p. FAK Y IP Elk-1 IP p. Elk-1 Εικόνα 124. ιαπίστωση της αλληλεπίδρασης του µεταγραφικού παράγοντα Elk-1 µε την FAK σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων, του 3 ου προνυµφικού σταδίου, της Ceratitis capitata. Σε εναιωρήµατα αιµοκυττάρων έγινε επώαση µε βακτήρια E.coli για 15 λεπτά, στους 4 ο C. Ακολούθησε φυγοκέντρηση, αποµάκρυνση του υπερκειµένου και λύση των αιµοκυττάρων. Έπειτα έγινε ανοσοκατακρήµνιση της Elk-1 και της p. Elk-1 στο πρωτεϊνικό εκχύλισµα των αιµοκυττάρων. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p. Y397. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που είχαν καλλιεργηθεί σε θρεπτικό µέσο Grace απουσία των βακτηρίων. IP Elk-1: ιαδροµή 1. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της ELK-1 απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 2. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για ELK-1 απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 3. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της ELK-1 απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 4. Αντίσωµα έναντι της ELK-1. ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της ELK-1 µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 6. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για ELK-1 µετά από επώαση µε E. coli. ιαδροµή 7. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της ELK-1 µετά από επώαση µε E.coli. IP p. Elk-1: ιαδροµή 8. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.elk-1 απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 9. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για p.elk-1 απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 10. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.elk-1 απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 11. Αντίσωµα έναντι της p.elk-1. ιαδροµή 12. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.elk-1 µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 13. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για p.elk-1 µετά από επώαση µε E. coli. ιαδροµή 14. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.elk-1 µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 15. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata. ιαπιστώνουµε από την εικόνα 124 ότι η FAK p. Y397 σχηµατίζεί σύµπλοκο µε τον µεταγραφικό παράγοντα Elk-1 υπό κανονικές συνθήκες. Μάλιστα στην 215

222 Αποτελέσµατα δεδοµένη κατάσταση φαίνεται ότι µόρια του Elk-1 που αλληλεπιδρούν µε την FAK είναι φωσφορυλιωµένα και πιθανότατα ενεργοποιηµένα (διαδροµή 9). Το αντίθετο συµβαίνει στις περιπτώσεις όπου στα αιµοκύτταρα έχουµε επιδράσει µε τα βακτήρια. Συγκεκριµένα, φαίνεται ότι ο µεταγραφικός παράγοντας αποµακρύνεται από το σύµπλοκο της FAK p.y397 µετά από την επίδραση των βακτηρίων. Επειδή η ίδια παρατήρηση ισχύει και για την ολική αλλά και την φωσφορυλιωµένη Elk-1 θα µπορούσε να ισχυριστεί κανείς ότι µετά την διέγερση των κυττάρων µε τα βακτήρια κάποιο σήµα προκαλεί την απελευθέρωση του µεταγραφικού παράγοντα από τα σύµπλοκα της ενεργοποιηµένης FAK ( ιαδροµές 6 & 13 αντίστοιχα). Η συµπεριφορά του µεταγραφικού παράγοντα συµφωνεί µε αυτή της p. ERK, η οποία αποδεσµεύεται από το σύµπλοκο µε την FAK κατά την κυτταροφαγία, αποτελώντας µια ακόµα ένδειξη της προαναφερόµενης αλληλεπίδρασης ανάµεσα στις δυο αυτές πρωτεΐνες.. Συµµετοχή της παξιλίνης, µιας πρωτεΐνης-συνδετήρα, στα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα που σχηµατίζει η FAK κατά την κυτταροφαγία της E.coli. Η παξιλίνη όπως εξηγήσαµε νωρίτερα είναι µια πρωτεΐνη συνδετήρας η οποία αλληλεπιδρά µε την FAK και πιθανότατα αποτελεί µια γέφυρα ανάµεσα στην FAK και τις ιντεγκρίνες. Έχοντας διαπιστώσει την ύπαρξη της και την συµπλοκοποίηση της µε την FAK, µελετήσαµε την σχέση αυτή µετά από επίδραση βακτηρίων E.coli στα αιµοκύτταρα της µεσογειακής µύγας. Για αυτό τον λόγο χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα της από το στάδιο περιπλάνησης. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε εναιωρήµατα µε την επίδραση βακτηρίων E.coli για 15 λεπτά στους 4 o C. Ακολούθησε η γνωστή προετοιµασία των δειγµάτων για ανοσοκατακρήµνιση. Έτσι, λοιπόν, σε πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα των 300γ έγινε ανοσοκατακρήµνιση της παξιλίνης και της φωσφορυλιωµένης στην θέση Υ120 παξιλίνης. Στην συνέχεια πραγµατοποιήθηκε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της ολικής FAK (Εικόνα 125). Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν εναιωρήµατα αιµοκυττάρων στα οποία δεν έγινε επώαση µε βακτήρια. Στην εικόνα 125 παρατηρούµε ότι η παξιλίνη παραµένει συνδεδεµένη µε την FAK κατά την επίδραση µε τα βακτήρια. Ανάλογη συµπεριφορά παρατηρείται και για την φωσφορυλιωµένη παξιλίνη στην θέση Υ120. Ωστόσο φαίνεται ότι ενισχύεται 216

223 Αποτελέσµατα λίγο η αλληλεπίδραση τους µε την επίδραση των βακτηρίων. Όσον αφορά την έντονη ζώνη που φαίνεται σε όλες τις διαδροµές των ανοσοϊζηµάτων αποτελεί πειραµατικό θόρυβο που προέρχεται από την χρήση των σφαιριδίων σεφαρόζης (διαδροµή 13) που χρησιµοποιούµε για τις ανοσοκατακρηµνίσεις των αντισωµάτων που έχουν παρασκευαστεί σε ποντίκια. Anti-Paxillin Αν οσ οΐζηµα Υπερκ. Ανοσ. Ανοσοΐζηµα E.coli Υπερκ. Ανοσ. Anti-p. paxillin Ανοσοΐζηµα Υπερκ. Ανοσ. Ανοσοΐζηµα E.coli Υπερκ. Ανοσ. Ολικό εκχ. αιµοκυττάρων C.c. Ολικό εκχ. λευκών αιµοσφ. Σφαιρίδια Σεφαρόζης FAK: WB IP Paxillin IP p. paxillin Εικόνα 125. Έλεγχος της αλληλεπίδρασης της παξιλίνης µε την FAK σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων, του 3 ου προνυµφικού σταδίου, της Ceratitis capitata κατά την κυτταροφαγία βακτηρίων E. coli. Σε εναιωρήµατα αιµοκυττάρων έγινε επώαση µε βακτήρια E.coli για 15 λεπτά, στους 4 ο C. Ακολούθησε φυγοκέντρηση, αποµάκρυνση του υπερκειµένου και λύση των αιµοκυττάρων. Έπειτα έγινε ανοσοκατακρήµνιση της παξιλίνης και της py120 παξιλίνης στο πρωτεϊνικό εκχύλισµα των αιµοκυττάρων. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της ολικής FAK. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που είχαν καλλιεργηθεί σε θρεπτικό µέσο Grace απουσία των βακτηρίων. IP Paxillin: ιαδροµή 1. Αντίσωµα έναντι της Paxillin. ιαδροµή 2. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για Paxillin απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 3. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της Paxillin απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 4. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για Paxillin µετά από επώαση µε E. coli. ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της Paxillin µετά από επώαση µε E.coli. IP p. Paxillin: ιαδροµή 6. Αντίσωµα έναντι της p.y120 Paxillin. ιαδροµή 7. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για p.y120 Paxillin απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 8. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.y120 Paxillin απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 9. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για p.y120 Paxillin µετά από επώαση µε E. coli. ιαδροµή 10. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.y120 Paxillin µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 11. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata. ιαδροµή 12. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από λευκά αιµοσφαίρια ανθρώπου. ιαδροµή 13. Κατακρήµνιση σφαιριδίων σεφαρόζης. 217

224 Αποτελέσµατα Ε. Συµµετοχή της PI3Κ και της Akt στα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα που σχηµατίζει η FAK κατά την κυτταροφαγία της E.coli. Οι πρωτεΐνες PI3k και Akt είναι γνωστό πως συµµετέχουν σε κυτταρικές οδούς µεταβίβασης µηνυµάτων αύξησης και επιβίωσης. Η αλληλεπίδραση FAK p.υ397- PI3k υποστηρίζεται βιβλιογραφικά µε πολλές αναφορές (Schlaepfer et al. 1994, Chen et al. 1994, Reiske et al. 1999). Υπό αυτό το πρίσµα εξετάσαµε τυχόν αλληλεπιδράσεις των παραπάνω πρωτεϊνών µε την FAK, στα αιµοκύτταρα της φρουτόµυγας, σε φυσιολογικές συνθήκες και ύστερα από επίδραση βακτηρίων E.coli. Συγκεκριµένα, σε εναιωρήµατα αποµονωµένων αιµοκυττάρων WS επιδράσαµε µε βακτήρια E.coli για 15 λεπτά στους 4 o C. Στα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα αιµοκυττάρων (300γ), που προέκυψαν µε την διαδικασία που έχει περιγραφεί διεξοδικά νωρίτερα, έγιναν ανοσοκατακρηµνίσεις για την PI3Κκαι την p.pi3κ. Ακολούθησε ανοσοαποτύµωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK py397 (Εικόνα 126). Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν εναιωρήµατα κυττάρων χωρίς την επίδραση των βακτηρίων. Παρατηρούµε ότι η PI3Κ συγκατακρηµνίζεται µε την FAK p.y397 στα αιµοκύτταρα της φρουτόµυγας υπό κανονικές συνθήκες. Αυτό σηµαίνει ότι η PI3Κ συµµετέχει φυσιολογικά στα σύµπλοκα που σχηµατίζονται από την FAK. Εκτός από την ζώνη στα 120 KDa υπάρχει και το θραύσµα της FAK που βλέπουµε στα 66 KDa το οποίο συγκατακριµνίζεται µε την PI3Κ. Αντίθετα, όταν επιδρούµε µε τα βακτήρια διαπιστώνουµε ότι χάνεται η ζώνη των 120 KDa ενώ παραµένει και ενισχύεται η κατώτερη ζώνη. Πιθανότατα λοιπόν, η επίδραση µε τα βακτήρια οδηγεί στην αποδέσµευση της PI3Κ από τα λειτουργικά σύµπλοκα της FAK. Η αλληλεπίδραση PI3Κ-FAK p.y397 φαίνεται να παραµένει σε αυτή την περίπτωση µόνο για θραύσµατα της FAK p. Y397 που είναι του µεγέθους των 66 KDa. Αυτά τα µόρια µπορεί να προϊόντα πρωτεόλυσης. Ανάλογα είναι τα συµπεράσµατα που προκύπτουν από την ανοσοκατακρήµνιση της p.pi3κ. Συγκεκριµένα, σε φυσιολογικές συνθήκες παρατηρούµε ότι η FAK p.y397 κατακρηµνίζεται από την p. PI3Κ. Η ζώνη των 66 KDa βεβαίως, σε αυτή την περίπτωση είναι εντονότερη από την ζώνη της ολόκληρης πρωτεΐνης. Με την επίδραση των βακτηρίων εξαφανίζεται η ζώνη των 120 KDa της FAK ενώ διατηρείται, µειωµένη σε µεγάλο βαθµό ωστόσο, η ζώνη των 66 KDa. Συνεπώς, η 218

225 Αποτελέσµατα φωσφορυλιωµένη PI3Κ αποµακρύνεται από το σύµπλοκο της FAK µε την επίδραση της E.coli ενώ παραµένει σε αλληλεπίδραση µε τµήµατα της FAK τα οποία προέρχονται από θραύση των λειτουργικών µορίων, γεγονός που µάλλον δεν σχετίζεται µε την παρουσία της E.coli αφού η συγκεκριµένη αλληλεπίδραση ανιχνεύεται και στην κατάσταση ελέγχου. Η διαδροµή 10 έρχεται σε αντίθεση µε την διαδροµή 2 σε ότι αφορά την ένταση των ζωνών της FAK ενώ οι διαδροµές 6 και 13 φαίνεται πως είναι σε πλήρη συµφωνία. Υπερ. Ανο σ. Ανοσοΐζηµα Υπερ. Ανοσ. Anti-PI3k Υπερ. Ανοσ. E.coli Ανοσοΐζηµα Υπερ. Ανοσ. Anti-p. PI3k Υπερ. Ανοσ. Ανοσοΐζηµα Υπερ. Ανοσ. Υπερ. Ανοσ. E.coli Ανοσοΐζηµα Υπερ. Ανοσ. Ολικό εκχ. αιµοκυττάρων C.c. WB p. FAK Y IP PI3k IP p. PI3k Εικόνα 126. ιαπίστωση της αλληλεπίδρασης της PI3Κµε την FAK σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων, του 3 ου προνυµφικού σταδίου της Ceratitis capitata σε φυσιολογικές συνθήκες και µετά από επίδραση µε βακτήρια. Σε εναιωρήµατα αιµοκυττάρων έγινε επώαση µε βακτήρια E.coli για 15 λεπτά, στους 4 ο C. Ακολούθησε φυγοκέντρηση, αποµάκρυνση του υπερκειµένου και λύση των αιµοκυττάρων. Έπειτα έγινε ανοσοκατακρήµνιση της PI3Κ και της p. PI3Κ στο πρωτεϊνικό εκχύλισµα των αιµοκυττάρων. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p.y397. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που είχαν καλλιεργηθεί σε θρεπτικό µέσο Grace απουσία των βακτηρίων. IP PI3k: ιαδροµή 1. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της PI3K απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 2. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για PI3K απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 3. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της PI3K απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 4. Αντίσωµα έναντι της PI3K. ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της PI3K µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 6. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για PI3K µετά από επώαση µε E. coli. ιαδροµή 7. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της PI3K µετά από επώαση µε E.coli. IP p. PI3k: ιαδροµή 8. Αντίσωµα έναντι της p.pi3k. ιαδροµή 9. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.pi3k απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 10. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για p.pi3k απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 11. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.pi3k απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 12. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.pi3k µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 13. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για p.pi3k µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 14. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.pi3k µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 15. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata. 219

226 Αποτελέσµατα Η Akt είναι µια πρωτεΐνη µε αντιαποπτωτική λειτουργία της οποίας η δράση φέρεται πως ρυθµίζεται από την PI3Κ. Αυτή η σχέση ανάµεσα σε Akt-PI3Κ συνδυασµένη µε τα παραπάνω δεδοµένα µας ώθησε να ερευνήσουµε την αλληλεπίδραση ανάµεσα στην Akt και στην FAK p. Y397. Για αυτό το λόγο αιµοκύτταρα από το τρίτο προνυµφικό στάδιο της Ceratitis capitata επωάστηκαν υπό ανάδευση µε την επίδραση βακτηρίων E. coli για 15 λεπτά στους 4 o C. Σε πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα που προέκυψαν από τα αιµοκύτταρα (300γ) έγινε ανοσοκατακρήµνιση για την Akt και την p. Akt. Ακολούθησε ηλεκτροφορητική ανάλυση των δειγµάτων και ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p. Y397 (Εικόνα 127). Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν εναιωρήµατα αιµοκυττάρων τα οποία καλλιεργήθηκαν απουσία βακτηρίων. Υπερ. Α νοσ. Ανοσοΐζηµα Υπερ. Ανοσ. Anti-Akt Υπερ. Ανοσ. E.coli Ανοσοΐζηµα Υπερ. Ανοσ. Υπερ. Ανοσ. Ανοσοΐζηµα Υπερ. Ανοσ. Anti-p. Akt Υπερ. Ανοσ. E.coli Ανοσοΐζηµα Υπερ. Ανοσ. Ολικό εκχ. αιµοκυττάρων C.c. WB p. FAK Y IP Akt IP p. Akt Εικόνα 127. ιαπίστωση της αλληλεπίδρασης της Akt µε την FAK σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων, του 3 ου προνυµφικού σταδίου, της Ceratitis capitata σε φυσιολογικές συνθήκες και µετά από επίδραση µε βακτήρια. Σε εναιωρήµατα αιµοκυττάρων έγινε επώαση µε βακτήρια E.coli για 15 λεπτά, στους 4 ο C. Ακολούθησε φυγοκέντρηση, αποµάκρυνση του υπερκειµένου και λύση των αιµοκυττάρων. Έπειτα έγινε ανοσοκατακρήµνιση της Akt και της p. Akt στο πρωτεϊνικό εκχύλισµα των αιµοκυττάρων. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p. Y397. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που είχαν καλλιεργηθεί σε θρεπτικό µέσο Grace απουσία των βακτηρίων. IP Akt: ιαδροµή 1. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της Akt απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 2. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για Akt απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 3. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της Akt απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 4. Αντίσωµα έναντι της Akt. ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της Akt µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 6. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για Akt µετά από επώαση µε E. coli. ιαδροµή 7. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της Akt µετά από επώαση µε E.coli. IP p. Akt: ιαδροµή 8. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.akt απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 9. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για p.akt απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 10. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.akt απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 11. Αντίσωµα έναντι της p.akt. ιαδροµή 12. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.akt µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 13. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για p.akt µετά από επώαση µε E. coli. ιαδροµή 14. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της p.akt µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 15. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata. 220

227 Αποτελέσµατα Η Akt παρουσιάζει διαφορετική συµπεριφορά, από ότι φαίνεται, σε σχέση µε την PI3Κ. Ειδικότερα, η Akt βρίσκεται σε αλληλεπίδραση µε την FAK p. Y397 υπό φυσιολογικές συνθήκες αλλά και υπό την επίδραση της E.coli. Μάλιστα, µετά από την διέγερση των βακτηρίων η αλληλεπίδραση των δυο πρωτεϊνών δείχνει να ενισχύεται. Επίσης, παρατηρούµε και σε αυτή την περίπτωση δυο ζώνες για την FAK, που αντιστοιχούν στο πλήρες-λειτουργικό µόριο (120 KDa) και σε κάποιο θραύσµα της FAK, περίπου στα 66 KDa. Για το φωσφορυλιωµένο κλάσµα της Akt παρατηρούµε ότι αλληλεπιδρά υπό συνθήκες ελέγχου µε την FAK p. Y397. Αντίθετα, µετά από την επώαση µε τα βακτήρια η δεδοµένη αλληλεπίδραση χάνεται. Αυτό σηµαίνει πως τα µόρια της Akt που παραµένουν σε αλληλεπίδραση µε την FAK δεν είναι φωσφορυλιωµένα. Ε. Συµµετοχή της Src στα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα που σχηµατίζει η FAK κατά την κυτταροφαγία της E.coli. Βιβλιογραφικά η αλληλεπίδραση της FAK µε την Src υποστηρίζεται πολύ έντονα µε πάµπολλες αναφορές σε πολλούς κυτταρικούς τύπους (Schaller et al. 1994, Calalb et al. 1995). Μάλιστα, η Src θεωρείται ως η πρωτεΐνη που φωσφορυλιώνει πολλαπλά αµινοξέα τυροσίνης στην FAK δηµιουργώντας θέσεις πρόσδεσης άλλων πρωτεϊνών πάνω στο αρχικό σύµπλοκο των FAK-Src. Επίσης, υποστηρίζεται ένθερµα ότι η Src αλληλεπιδρά µε την FAK όταν πραγµατοποιηθεί η (αυτό)φωσφορυλίωση στην θέση Y397, η οποία αποτελεί θέση πρόσδεσης για την Src. Τα παραπάνω δεδοµένα και πολλά ακόµα στοιχεία µας ώθησαν να διερευνήσουµε την σχέση ανάµεσα στα δυο αυτά µόρια στα αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata υπό φυσιολογικές συνθήκες αλλά και µετά από επίδραση βακτηρίων E.coli στα αιµοκύτταρα. Για το σκοπό αυτό συλλέξαµε αιµοκύτταρα από το τρίτο προνυµφικό στάδιο της µεσογειακής µύγας, τα οποία καλιεργήθηκαν σε εναιώρηµα µε την επίδραση βακτηρίων E.coli για 15 λεπτά στους 4 o C. Στα πρωτεινικά εκχυλίσµατα (300γ), που προέκυψαν ακολουθώντας την διαδικασία που περιγράψαµε προηγουµένως, έγινε ανοσοκατακρήµνιση για την ολική Src. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν εναιωρήµατα αιµοκυττάρων στα οποία δεν πραγµατοποιήθηκε επώαση µε την παρουσία βακτηρίων. Επιπλέον, σε πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα (300γ) αιµοκυττάρων 221

228 Αποτελέσµατα που καλλιεργήθηκαν απουσία βακτηρίων έγινε ανοσοκατακρήµνιση για την non phosphor (np) Src (Tyr 527). Ολοκληρώνοντας το πείραµα λοιπόν, τα δείγµατα αναλύθηκαν σε 10% SDS PAGE και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντισώµατα έναντι της FAK p.y397 (Εικόνα 128). Υπερ. Ανοσ. Ανοσοΐζηµα Υπερ. Ανοσ. Anti-Src Υπερ. Ανοσ. E.coli Ανοσοΐζηµα Υπερ. Ανοσ. Υπερ. Ανοσ. Ανοσοΐζηµα Υπερκ. Σφαιρ. Μαγν. Σφαιρ. Ολικό εκχ. αιµοκυττάρων C.c. WB p. FAK Y IP Src IP non p. Src Εικόνα 128. ιαπίστωση της αλληλεπίδρασης της Src µε την FAK σε πρωτεϊνικό εκχύλισµα αιµοκυττάρων, του 3 ου προνυµφικού σταδίου, της Ceratitis capitata σε φυσιολογικές συνθήκες και µετά από επίδραση µε βακτήρια. Σε εναιωρήµατα αιµοκυττάρων έγινε επώαση µε βακτήρια E.coli για 15 λεπτά, στους 4 ο C. Ακολούθησε φυγοκέντρηση, αποµάκρυνση του υπερκειµένου και λύση των αιµοκυττάρων. Έπειτα έγινε ανοσοκατακρήµνιση της Src στο πρωτεϊνικό εκχύλισµα των αιµοκυττάρων. Τα δείγµατα αναλύθηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα πολυακρυλαµιδίου 10% και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p. Y397. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που είχαν καλλιεργηθεί σε θρεπτικό µέσο Grace απουσία των βακτηρίων. Στα δείγµατα µάρτυρες έγινε ανοσοκατακρήµνιση για ολική Src αλλά και για την non phospho Src (npsrc). IP Src: ιαδροµή 1. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της Src απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 2. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για Src απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 3. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της Src απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 4. Αντίσωµα έναντι της Src. ιαδροµή 5. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της Src µετά από επώαση µε E.coli. ιαδροµή 6. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για Src µετά από επώαση µε E. coli. ιαδροµή 7. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της Src µετά από επώαση µε E.coli. IP n.p. Src: ιαδροµή 8. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από την ανοσοκατακρήµνιση της np Src απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 9. Ανοσοΐζηµα της ανοσοκατακρήµνισης για np Src απουσία βακτηρίων. ιαδροµή 10. Υπερκείµενο εκχύλισµα από κατακρήµνιση σφαιριδίων σεφαρόζης. ιαδροµή 11. Κατακρήµνιση σφαιριδίων σεφαρόζης ιαδροµή 12. Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata. 222

229 Αποτελέσµατα Η δράση της Src, όπως έχει αναφερθεί και στην εισαγωγή, ρυθµίζεται µε δυο φωσφορυλιώσεις σε αµινοξέα τυροσίνης. Η τυροσίνη στην θέση 527 όταν φωσφορυλιωθεί από την κινάση Csk καθιστά το µόριο ανενεργό λόγω στερεοδοµικής παρεµπόδισης (Εικόνα 129). Συνεπώς, το αντίσωµα έναντι της n.p. Src (Tyr 527) αλληλεπιδρά µόνο µε ενεργά µόρια της Src. Εικόνα 129. Ο µηχανισµός ενεργοποίησης της Src. Από την εικόνα 128 διαπιστώνουµε ότι η Src συµµετέχει στα σύµπλοκα που σχηµατίζει η FAK στα αιµοκύτταρα δίχως την ενεργοποίηση των κυττάρων από κάποιο εξωγενές ερέθισµα. Επίσης, από την διαδροµή 9 µπορούµε να εκτιµήσουµε ότι µέρος από τα αλληλεπιδρώντα µε την FAK µόρια της Src είναι στην ενεργή τους κατάσταση αφού παρατηρούµε ότι το αντίσωµα έναντι του µη φωσφορυλιωµένου στην θέση Υ527, κλάσµατος της Src συγκατακρηµνίζει την FAK p.y397. Τέλος, η επίδραση των βακτηρίων στα αιµοκύτταρα φαίνεται ότι ενισχύει την αλληλεπίδραση της Src µε την FAK p. Y397 (διαδροµή 6), γεγονός που µπορεί να σχετίζεται µε την αύξηση της φωσφορυλίωσης στην FAK Υ397 και γενικότερα µε την ενεργοποίηση της FAK κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων από τα αιµοκύτταρα του εντόµου. Συµπερασµατικά, λοιπόν, παρατηρούµε ότι η Src συµµετέχει στα προσχηµατισµένα πολυπρωτεϊνικά σύµπλοκα της FAK στα αιµοκύτταρα, όπως ήταν αναµενόµενο, ενώ η αλληλεπίδραση αυτή ενισχύεται κατά την κυτταροφαγία. 223

230 Αποτελέσµατα 12. Μεταγωγή σηµάτων κατά την κυτταροφαγία της E.coli από τα αιµοκύτταρα της Ceratitis capitata διαµέσου της FAK. Ο ρόλος της FAK είναι διττός αφού µπορεί να δράσει ως κινάση φωσφορυλιώνοντας άλλες πρωτεΐνες στόχους αλλά και ταυτόχρονα µπορεί να συνιστά πρωτεΐνη ικρίωµα στην οποία αγκυροβολούν άλλες σηµατοδοτικές ή δοµικές πρωτεΐνες. Έως εδώ διαπιστώσαµε τη συµµετοχή της FAK στη µεταγωγή σηµάτων κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων από τα αιµοκύτταρα της φρουτόµυγας. Η συµµετοχή της διαφαίνεται από την αύξηση στη φωσφορυλίωση της τυροσίνης Υ397 που ακολουθεί την επώαση των αιµοκυττάρων µε βακτήρια. Επίσης, διαπιστώσαµε την ύπαρξη στα αιµοκύτταρα προσχηµατισµένων συµπλεγµάτων της FAK µε άλλες πρωτεΐνες. Η σύσταση αυτών των σηµατοδοτικών (λόγω της φύσης των πρωτεϊνών που τα συνθέτουν) συµπλόκων τροποποιείται κατά την κυτταροφαγία της E.coli. Συνεπώς η FAK αποτελεί, πιθανότατα, ένα κοµβικό σηµείο στο οποίο φθάνουν σήµατα, επεξεργάζονται και µεταβιβάζονται προς τα κατάλληλα µονοπάτια ενδοκυτταρικής επικοινωνίας. Με βάση τις παραπάνω παρατηρήσεις θελήσαµε να µελετήσουµε την ροή των σηµάτων, έχοντας ως κέντρο αναφοράς την FAK. Συγκεκριµένα, χρησιµοποιώντας διάφορους φαρµακολογικούς αναστολείς σηµαντικών µορίων των µονοπατιών ενδοκυτταρικής επικοινωνίας, προσπαθήσαµε να εντοπίσουµε τη σχετική θέση της FAK σε αυτά τα µονοπάτια. Ειδικότερα, µελετήσαµε την ενεργοποίηση της FAK (ή καλύτερα την επαγόµενη φωσφορυλίωση της FAK Y397) µε ανάλυση κατά Western κατά την κυτταροφαγία, των αρνητικών κατά Gram, βακτηρίων E. coli σε εναιωρήµατα αιµοκυττάρων τα οποία είχαν προεπωαστεί µε αναστολείς σηµατοδοτικών, ρυθµιστικών και δοµικών πρωτεϊνών. Α). Αναστολείς του κυτταροσκελετού ακτίνης και των µικροσωληνίσκων (κυτταροσκελετός τουµπουλίνης). Είναι γενικά αποδεκτό και καλά τεκµηριωµένο ότι ο κυτταροσκελετός συµµετέχει ενεργά στην κυτταροφαγία (π.χ. σχηµατισµός ψευδοποδίων και άλλων συναφών δοµών). Σήµατα που προέρχονται από τους διεγερµένους µεµβρανικούς υποδοχείς του κυττάρου, φτάνουν µέσω σηµατοδοτικών πρωτεϊνών στις κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες επάγοντας την αναδιοργάνωση των κυτταροσκελετικών δοµών που έχει ως συνέπεια την έκταση µεµβρανικών 224

231 Αποτελέσµατα υποστηριζόµενων από τον κυτταροσκελετό σχηµατισµών (ψευδοπόδια) που περιβάλλουν και εγκολπώνουν τη λεία των φαγοκυττάρων. Εξάλλου, η FAK έχει πολλές θέσεις στο µόριο της που τις επιτρέπουν να αλληλεπιδρά µε διάφορες περιοχές του κυτταροσκελετού. Στο αµινοτελικό της άκρο υπάρχει η FERM οµόλογη περιοχή (Girault et al., 1999), η οποία επιτρέπει στη FAK να αλληλεπιδρά µε την πρωτεΐνη ezrin η οποία σχετίζεται µε τον κυτταροσκελετο (Poullet et al., 2001). Επίσης, στο καρβοξυτελικό της άκρο επίσης υπάρχει η FAT περιοχή όπου υπάρχουν θέσεις πρόσδεσης για την ταλίνη και την παξιλίνη (Parsons et al., 2000). Είναι φανερό λοιπόν, ότι η FAK σχετίζεται και συνεργάζεται άµεσα µε τον κυτταροσκελετό για τη µεταγωγή µηνυµάτων και την τελική απόκριση των κυττάρων. Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήσαµε αναστολείς του κυτταροσκελετού και µελετήσαµε τις συνέπειες στην ενεργοποίηση της FAK µετά από επώαση µε βακτήρια. Συγκεκριµένα, αιµοκύτταρα του σταδίου περιπλάνησης προεπωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου, µε αναστολείς του κυτταροσκελετού ακτίνης και τουµπουλίνης. Ως αναστολείς του κυτταροσκελετού της ακτίνης χρησιµοποιήσαµε τη λατρουνκουλίνη Α και τις κυτταροχαλασίνες Β και D (Cytochalasin B (Cyt B), Cytochalasin D (Cyt. D), Latrunculin A (Latr.Α)). Σε ότι αφορά τους αναστολείς του κυτταροσκελετού τουµπουλίνης χρησιµοποιήθηκαν οι ουσίες νοκονταζόλη και ντεµεκολχικίνη (Nocodazole (Noc.) και Demecolcine (Dem.)). Η κυτταροχαλασίνη Β, D είναι τοξίνη που παράγεται από µύκητες (Drechslera) και µπορεί να διαπερνά τα κύτταρα. Αποτελεί ένα ισχυρό αναστολέα του πολυµερισµού της ακτίνης, διακόπτοντας τα µικροϊνίδια της ακτίνης. Όπως έχει βρεθεί (Lamprou et al., 2005) η κυτταροχαλασίνη D αναστέλλει, εµποδίζοντας την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, την ενεργοποίηση της MAPK p38 κατά την κυτταροφαγία της E. coli (αλλά και του LPS και των Latex σφαιριδίων). Οµοίως, η λατρουνκουλίνη παρεµποδίζει τις κυτταρικές διαδικασίες στις οποίες συµµετέχουν τα µικροϊνίδια της ακτίνης, όπως είναι η κυτταροφαγία. Από την άλλη πλευρά, η νοκονταζόλη είναι ένας αντιµιτωτικός παράγοντας που διασπά τους µικροσωληνίσκους αλληλεπιδρώντας µε τη β-τουµπουλίνη, συνεπώς αναστέλλει τη δυναµική του κυτταροσκελετού τουµπουλίνης. Επίσης, ο έτερος αναστολέας για τους 225

232 Αποτελέσµατα µικροσωληνισκούς, δηλαδή η ντεµεκολχικίνη, προκαλεί αποπολυµερισµό των µικροσωληνίσκων. Στα εναιωρήµατα των αιµοκυττάρων µετά από την προεπώαση µε τους προαναφερόµενους αναστολείς έγινε επώαση για 10 και 30 λεπτά µε βακτήρια E.coli. Στην συνέχεια τα εναιωρήµατα φυγοκεντρήθηκαν και το ίζηµα αναδιαλύθηκε σε διάλυµα λύσης των κυττάρων, για να διαλυθούν τελικά τα αιµοκύτταρα µε την χρήση υπερήχων. Ακολούθησε, προσδιορισµός της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης στα εκχυλίσµατα των κυττάρων µε την µέθοδο Bradford. Τέλος, ίσες ποσότητες από τα δείγµατα αναλύθηκαν σε 10% SDS PAGE και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p. Y397 (Εικόνα 130). Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν δίχως την παρουσία των βακτηρίων και των αναστολέων στους συνδυασµούς που απαιτούνται για την αξιολόγηση των αποτελεσµάτων. Η µεµβράνη µετά από αποµάκρυνση των αντισωµάτων (Stripping) επανεµφανίστηκε µε αντίσωµα έναντι της ακτίνης για διαπίστωση των ισοπρωτεϊνικών δειγµάτων. Grace 10 Gra ce 3 0 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 FAK Y Actin Nocodazole Demecolcine Latrunculin A Cytochalasin D Cytochalasin B Εικόνα 130. Επίδραση των αναστολέων του κυτταροσκελετού ακτίνης και τουµπουλίνης στην ενεργοποίηση της FAK Y397. Αιµοκύτταρα σε εναιώρηµα προεπωάστηκαν µε τους αναστολείς Cyt. B, Cyt. D, Latr. A, Noc., Dem. για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια διεγέρθηκαν µε βακτήρια E.coli για 10 και 30 λεπτά. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που επωάστηκαν σε µόνο σε θρεπτικό µέσο (διαδροµές 1, 2), µόνο µε τους αναστολείς (διαδροµές 5, 10, 13, 16) και µόνο µε την E.coli (διαδροµές 3, 4). Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα αναλύθηκαν σε 10 % SDS PAGE και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p.y397. H παρουσία ισόποσων δειγµάτων επιβεβαιώθηκε επανεµφανίζοντας τη µεµβράνη για ακτίνη. Όπως φαίνεται στην εικόνα 130, η επίδραση µε τους αναστολείς του κυτταροσκελετού ακτίνης έχει ως συνέπεια την αναστολή της επαγόµενης από την 226

233 Αποτελέσµατα E.coli ενεργοποίηση της FAK. Τόσο η κυτταροχαλασίνη Β όσο και η D αναστέλλουν σηµαντικά τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης Υ397 της FAK. Οµοίως, το αποτέλεσµα από τη χρήση του τρίτου αναστολέα του πολυµερισµού της ακτίνης, δηλαδή της λατρουνκουλίνης Α, δείχνει ότι παρεµποδίζεται η ενεργοποίηση της FAK, µε τη διαφορά ότι η αναστολή σε αυτήν την περίπτωση είναι µικρότερου βαθµού. Αντίθετα από τους αναστολείς των µικροϊνιδίων της ακτίνης συµπεριφέρονται οι αναστολείς των µικροσωληνίσκων. Συγκεκριµένα, παρατηρούµε στην εικόνα 130 ότι η ενεργοποίηση της FAK που επάγεται από την E.coli, µετά από τη χρήση των Noc. και Dem. παραµένει στα ίδια, περίπου, επίπεδα µε εκείνη των δειγµάτων που χρησιµοποιούνται ως θετικοί µάρτυρες για την ενεργοποίηση της FAK (διαδροµές 3, 4). Από τα παραπάνω µπορούµε να συµπεράνουµε ότι για τη φωσφορυλίωση της FAK και επαγωγή µηνύµατος µέσω αυτής, κατά την κυτταροφαγία της E.coli, είναι απαραίτητη η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης ενώ από ότι φαίνεται ο κυτταροσκελετός της τουµπουλίνης δε συµµετέχει ιδιαίτερα σε αυτές τις διαδικασίες. Β). Συµβολή των Rho, Ras, c-raf 1, MEK 1/2 πρωτεϊνών στην ενεργοποίηση της FAK µετά από επώαση µε βακτήρια E.coli. Πρωτεΐνες-κλειδιά στη ρύθµιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης είναι µέλη της οικογένειας των Rho πρωτεϊνών. Αρχικά παρατηρήθηκε ότι µέλη της Rho οικογένειας ρυθµίζουν το σχηµατισµό ειδικών δοµών της ακτίνης. Τώρα είναι γνωστό ότι ελέγχουν ποικίλα κυτταρικά γεγονότα συµπεριλαµβανοµένης της µεταγραφής, της κυτταρικής αύξησης, της ανάπτυξης, της προόδου του κυτταρικού κύκλου και της εξωκυττάρωσης (Hancock, 2003). Αρκετές µελέτες έχουν δείξει ότι ενεργοποίηση των Rho επάγει φωσφορυλίωση στις τυροσίνες της FAK, ενώ αναστολή τους οδηγεί σε παρεµπόδιση της φωσφορυλίωσης κατά την απόκριση σε ορισµένα ερεθίσµατα (Seckl et al., 1995). Τα αποτελέσµατα αυτά δείχνουν ότι η φωσφορυλίωση της FAK στην τυροσίνη πρέπει να ελέγχεται από Rho-εξαρτώµενες αλλαγές στον κυτταροσκελετό της ακτίνης. Με βάση αυτά τα δεδοµένα, θέλαµε να εξετάσουµε αν ισχύει η ίδια σχέση και στα αιµοκύτταρα της C. capitata µετά από επώαση µε τα βακτήρια. Για το λόγο αυτό, αιµοκύτταρα του σταδίου περιπλάνησης καλλιεργήθηκαν σε εναιώρηµα και 227

234 Αποτελέσµατα προεπωάστηκαν µε τους αναστολείς τοξίνη Α (Toxin A), µανουµικίνη (Manumycin), GW5074 και PD Η προεπώαση µε τους αναστολείς έγινε για µισή ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Η τοξίνη Α είναι µια τοξίνη από το Clostridium difficile η οποία απενεργοποιεί την Rho οικογένεια των µικρών GTPασών µε συνέπεια, εκτός των άλλων, την απορρύθµιση του κυτταροσκελετού της ακτίνης. Η µανουµικίνη (Manumycin Α) προέρχεται από το Streptomyces parvulus και αποτελεί έναν ισχυρό αναστολέα της Ras. Ο GW5074 είναι αναστολέας της οδού µεταγωγής σηµάτων Raf/MEK/ERK2, µπλοκάροντας και απενεργοποιώντας την c-raf-1. Τέλος, ο PD98059 είναι ένας πολύ ειδικός αναστολέας της MEK1. Ο PD98059 δεσµεύεται σε ανενεργά µόρια της MEK1 και εµποδίζει µε αυτό τον τρόπο την ενεργοποίηση της από τις κινάσες-ενεργοποιητές της όπως η c-raf. Στα εναιωρήµατα των αιµοκυττάρων µετά από την προεπώαση µε τους προαναφερόµενους αναστολείς έγινε επώαση για 10 και 30 λεπτά µε βακτήρια E.coli. Αφού ακολουθήθηκε η γνωστή διαδικασία αναλύθηκαν ίσες ποσότητες από τα δείγµατα σε 10% SDS PAGE και έγινε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p. Y397 (Εικόνα 131). Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν δίχως την παρουσία των βακτηρίων και των αναστολέων στους συνδυασµούς που απαιτούνται για την αξιολόγηση των αποτελεσµάτων. Η µεµβράνη µετά από stripping επανεµφανίστηκε µε αντίσωµα έναντι της ακτίνης για διαπίστωση των ισοπρωτεϊνικών δειγµάτων. G race 10 G race 3 0 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 FAK Y Actin PD GW Toxin A Manumycin Εικόνα 131. Επίδραση αναστολέων του σηµατοδοτικού µονοπατιού της ERK στην ενεργοποίηση της FAK µετά από επίδραση µε βακτήρια E.coli. Αιµοκύτταρα σε εναιώρηµα προεπωάστηκαν µε τους αναστολείς PD98059, GW5074, τοξίνη Α και µανουµικίνη Α για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια διεγέρθηκαν µε βακτήρια E. coli για 10 και 30 λεπτά. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που επωάστηκαν σε µόνο σε θρεπτικό µέσο (διαδροµές 1, 2), µόνο µε τους αναστολείς (διαδροµές 5, 8, 11, 14) και µόνο µε την E.coli (διαδροµές 3, 4). Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα αναλύθηκαν σε 10 % SDS PAGE και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p.y397. H παρουσία ισόποσων δειγµάτων επιβεβαιώθηκε επανεµφανίζοντας τη µεµβράνη για ακτίνη. 228

235 Αποτελέσµατα Από την εικόνα 131 φαίνεται ότι ο αναστολέας της c-raf-1 (GW5074) δεν προκαλεί αναστολή στην ενεργοποίηση της FAK. Αυτό το γεγονός υποδηλώνει ότι η Raf δε συνδέεται άµεσα µε τη φωσφορυλίωση της FAK στην Υ397 κατά την κυτταροφαγία της E. coli από τα αιµοκύτταρα. Μάλιστα, επειδή έχει διαπιστωθεί ότι η Raf είναι η MKKK που οδηγεί στη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της ERK, συµπεραίνουµε από το παραπάνω αποτέλεσµα ότι η δεδοµένη σηµατοδοτική οδός Raf-MEK1-ERK δε συµµετέχει στη διαδικασία ενεργοποίησης της FAK κατά την κυτταροφαγία της E.coli. Η τοξίνη Α και η µανουµικίνη Α παρουσιάζουν το ίδιο πρότυπο σε ότι αφορά τη φωσφορυλίωση της FAK στην τυροσίνη 397 µετά από την κυτταροφαγία των βακτηρίων. Συγκεκριµένα, παρατηρούµε στην εικόνα 131 ότι η αναστολή της Rho και της Ras από την τοξίνη Α και τη µανουµικίνη αντίστοιχα, προκαλούν µείωση στην φωσφορυλίωση της FAK Y397. Η Ras ως γνωστόν, είναι µια µονοµερής κυτταροπλασµατική G-πρωτεΐνη η οποία αποτελεί κοµβικό σηµείο για την ενεργοποίηση πολλών οδών µεταγωγής σήµατος. Το αποτέλεσµα που προκύπτει από την εικόνα 131 δείχνει ότι η Ras (και ίσως και άλλα µέλη της Rho οικογένειας) βρίσκονται πριν από την FAK στο µονοπάτι της µεταγωγής σήµατος που εκκινεί από την κυτταροφαγία της E.coli. Ο αναστολέας PD98057 που αναστέλλει την MEK1 παρουσιάζει µια αµφιλεγόµενη συµπεριφορά σε ότι αφορά την ενεργοποίηση της FAK. Στην εικόνα 131 παρατηρούµε ότι η φωσφορυλίωση της FAK Y397 αναστέλλεται από την δράση του PD στα 10 λεπτά επώασης µε την E.coli. Αντίθετα στα 30 λεπτά επώασης µε τα βακτήρια η δράση του αναστολέα δεν εµποδίζει την φωσφορυλίωση της FAK Y397. Για να αξιολογηθούν καλύτερα αυτά τα αποτελέσµατα χρησιµοποιήσαµε έναν ακόµα αναστολέα των MEK 1/2, τον U0126 (Εικόνα 132). Ο U0126 αναστέλλει αποτελεσµατικότερα MEK1 από τον PD. Προκειµένου να διαπιστώσουµε τη συµπεριφορά του αναστολέα, πραγµατοποιήσαµε κινητική ενεργοποίησης της FAK για διαφορετικούς χρόνους επώασης µε βακτήρια. Συγκεκριµένα, αιµοκύτταρα από το στάδιο περιπλάνησης προεπωάστηκαν µε τον U0126 για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Στη συνέχεια στα εναιωρήµατα των κυττάρων προστέθηκαν βακτήρια E. coli για χρόνους 2, 5, 10, 15, 20, 25 και 30 λεπτά. Η θερµοκρασία επώασης ήταν 25 o C. Ακολούθησε η λύση των κυττάρων και η ανάλυση των πρωτεϊνικών εκχυλισµάτων σε 10 % SDS PAGE. Το ανοσοαποτύπωµα έγινε µε αντίσωµα έναντι 229

236 Αποτελέσµατα της FAK p. Y397. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν απουσία βακτηρίων. Η µεµβράνη µετά από stripping επανεµφανίστηκε µε αντίσωµα έναντι της ολικής FAK για διαπίστωση των ισοπρωτεϊνικών δειγµάτων. Grace + U0126 Επώαση µε E. coli στους 25 ο C p. FAK Y397 U min FAK Εικόνα 132. Κινητική ενεργοποίησης της FAK µετά από διέγερση των αιµοκύττάρων µε βακτήρια E.coli, παρουσία του αναστολέα της MEK 1, U0126. Αιµοκύτταρα σε εναιώρηµα προεπωάστηκαν µε τον αναστολέα U0126 για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια διεγέρθηκαν µε βακτήρια E. coli για 2, 5, 10, 15, 20, 25 και 30 λεπτά. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που επωάστηκαν µόνο µε τον αναστολέα (διαδροµή 1). Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα αναλύθηκαν σε 10 % SDS PAGE και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p.y397. Η παρουσία ισόποσων δειγµάτων επιβεβαιώθηκε επανεµφανίζοντας τη µεµβράνη για την ολική FAK. Η χρήση του αναστολέα U0126 φαίνεται ότι δεν προκαλεί κάποια αλλαγή στην επαγόµενη από τα βακτήρια, φωσφορυλίωση της FAK. Όπως φαίνεται από την εικόνα 132, διατηρείται το πρότυπο φωσφορυλίωσης της FAK Y397 που προκύπτει από τη διέγερση των αιµοκυττάρων µε τα βακτήρια, συνεπώς, οι MEK δε συµµετέχουν στη διαδικασία ενεργοποίησης της FAK κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων. Συµπερασµατικά λοιπόν, το µονοπάτι Raf-MEK ½-ERK1 είτε έπεται της FAK στη µεταγωγή σήµατος που προκαλείται από την παρουσία των βακτηρίων, είτε είναι ένα παράλληλο µονοπάτι, εντελώς ξεχωριστό από αυτό στο οποίο συµµετέχει η FAK. 230

237 Αποτελέσµατα Γ). Η συµβολή της PI3k και της Akt στην ενεργοποίηση της FAK κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων της E.coli. Η PI3K έχει βρεθεί ότι συµµετέχει σε πολλές οδούς µεταγωγής σήµατος που επάγουν την αύξηση, τον πολλαπλασιασµό ή την επιβίωση των κυττάρων. Οµοίως, η κινάση Akt βρίσκεται παρακάτω (downstream) της PI3K σε µονοπάτι επιβίωσης των κυττάρων. Όπως φάνηκε από τα προηγούµενα αποτελέσµατα τόσο η PI3K όσο και η Akt σχηµατίζουν σύµπλοκο µε την FAK p.y397 δίχως να προηγηθεί επίδραση κάποιου ερεθίσµατος. Επίσης, οι σχέσεις ανάµεσα σε αυτές τις πρωτεΐνες τροποποιούνται κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων από τα αιµοκύτταρα. Για να διαλευκάνουµε τον ρόλο των πρωτεϊνών αυτών στην ενεργοποίηση της FAK κατά την κυτταροφαγία της E. coli από τα αιµοκύτταρα, µελετήθηκε η φωσφορυλίωση της FAK Y397 σε αυτές τις συνθήκες παρουσία των αναστολέων της PI3Κ: LY και βορτµανίνη (Wortmannin), όπως και του αναστολέα της Akt (Akt inhibitor). Έτσι, κατά τη συνήθη διαδικασία, αιµοκύτταρα WS αποµονώθηκαν και προ- επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου µε τους παραπάνω αναστολείς (LY, Wortmannin, Akt inhibitor). Ο LY είναι ένας πολύ ειδικός αναστολέας της κινάσης της 3-φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης. Οµοίως, η βορτµανίνη αποτελεί έναν ισχυρό και ειδικό αναστολέα της οδού µεταγωγής σηµάτων PI3k-Akt επάγοντας τον αποπτωτικό µηχανισµό των κυττάρων. Η βορτµανίνη µπλοκάρει την PI-3 κινάση. Όσoν αφορά τον Akt inhibitor αναστέλλει επιλεκτικά την κινάση Akt, όµως ενδέχεται να προκαλεί και µικρή αναστολή στην PI3k. Ακολουθώντας πιστά λοιπόν, το πειραµατικό πρωτόκολλο, τα αιµοκύτταρα διεγέρθηκαν µε βακτήρια E. coli για χρόνο 10 και 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (25 o C). Στη συνέχεια τα εναιωρήµατα των κυττάρων φυγοκεντρήθηκαν και το ίζηµα των αιµοκυττάρων επαναιωρήθηκε σε διάλυµα λύσης. Το πρωτεϊνικά φορτία των εκχυλισµάτων προσδιορίστηκαν ποσοτικά µε Bradford και ίσοπρωτεϊνικά δείγµατα αναλύθηκαν σε 10 % SDS PAGE. Ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p.y397 (Εικόνα 133). Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν δίχως την παρουσία των βακτηρίων και των αναστολέων στους συνδυασµούς που απαιτούνται για την αξιολόγηση των αποτελεσµάτων. Η µεµβράνη µετά από stripping επανεµφανίστηκε µε αντίσωµα έναντι της ακτίνης για διαπίστωση των ισοπρωτεϊνικών δειγµάτων. 231

238 Αποτελέσµατα Grace 10 Grace 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 FAK Y Actin LY Wortmannin Akt inhibitor Εικόνα 133. Επίδραση αναστολέων της PI3Κ και της Akt στην ενεργοποίηση της FAK Y397 µετά από επίδραση µε βακτήρια E.coli. Αιµοκύτταρα σε εναιώρηµα προεπωάστηκαν µε τους αναστολείς της PI3Κ: LY, βορτµανίνη (Wortmannin) και τον αναστολέα της Akt, για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια διεγέρθηκαν µε βακτήρια E. coli για 10 και 30 λεπτά. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που επωάστηκαν σε µόνο σε θρεπτικό µέσο (διαδροµές 1, 2), µόνο µε τους αναστολείς (διαδροµές 5, 8, 11) και µόνο µε την E.coli (διαδροµές 3, 4). Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα αναλύθηκαν σε 10 % SDS PAGE και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p.y397. Η παρουσία ισόποσων δειγµάτων επιβεβαιώθηκε επανεµφανίζοντας τη µεµβράνη για ακτίνη. ιαπιστώνουµε από την παραπάνω εικόνα ότι οι αναστολείς της PI3Κ: LY και βορτµανίνη προκαλούν µια ελαφρά αναστολή στη φωσφορυλίωση της FAK p.y397 που επάγεται από την επώαση των αιµοκυττάρων µε τα βακτήρια. Παροµοίως, ο αναστολέας της Akt δείχνει να εµποδίζει την επαγόµενη από τα βακτήρια φωσφορυλίωση της FAK Y397, αποτέλεσµα που επιβεβαιώνει κατά κάποια έννοια τα αποτελέσµατα των αναστολέων της PI3Κ. Συµπερασµατικά, λοιπόν, προκύπτει ότι οι PΙ3Κ και Akt προηγούνται της FAK στην οδό µεταγωγής του σήµατος που προκαλεί την φωσφορυλίωση στην Υ397 της FAK ή µε κάποιο τρόπο επηρεάζουν τη φωσφορυλίωση της FAK κατά την κυτταροφαγία της E.coli από τα αιµοκύτταρα. ). Η συµβολή της Src και άλλων κινασών τυροσίνης, αλλά και πρωτεϊνασών όπως την καλπαΐνη στην ενεργοποίηση της FAK κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων της E.coli. Μια σηµαντική προϋπόθεση για την ενζυµική ενεργοποίηση της FAK είναι η φωσφορυλίωση αµινοξέων τυροσίνης στο βρόγχο ενεργοποίησης. Τα αµινοξέα αυτά δεν αποτελούν θέσεις αυτοφωσφορυλίωσης της FAK αλλά φωσφορυλιώνονται από µέλη της οικογένειας Src κινασών τυροσίνης. Έχει διαπιστωθεί ότι αναστολή της Src αναστέλλει την φωσφορυλίωση στις τυροσίνες της FAK (Salazar & Rozengurt, 1999). Για να µελετήσουµε τη συµµετοχή της Src στην ενεργοποίηση της FAK στο 232

239 Αποτελέσµατα πειραµατικό µας σύστηµα, δηλαδή τα αιµοκύτταρα, στην κυτταροφαγία των βακτηρίων χρησιµοποιήσαµε τον αναστολέα της Src, PP2, ο οποίος αναστέλλει ισχυρά και ειδικά τις κινάσες τυροσίνης της οικογένειας Src. Μάλιστα, επεκτείνοντας πεδίο µελέτης και προς άλλες κινάσες τυροσίνης χρησιµοποιήσαµε τον αναστολέα genistein, ο οποίος εµποδίζει τη φωσφορυλίωση αµινοξέων τυροσίνης γενικότερα, αναστέλλοντας περισσότερες κινάσες τυροσίνης. Επιπλέον, χρησιµοποιώντας έναν αναστολέα του ενζύµου καλπαΐνη, ενός από τα βασικότερα ένζυµα που εµπλέκονται στην υδρόλυση της FAK, µελετήσαµε την επίδραση της ρυθµιστικής διαδικασίας της πρωτεόλυσης στην ενεργοποίηση της FAK κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων E. coli από τα αιµοκύτταρα. Επίσης, για να διερευνηθεί η συµµετοχή άλλων πρωτεΐνασών στην ενεργοποίηση ή ρύθµιση της FAK κατά την κυτταροφαγία, χρησιµοποιήθηκε ο αναστολέας PMSF, ο οποίος αναστέλλει την δράση πρωτεΐνασών σερίνης κατά κύριο λόγο και επιπρόσθετα πρωτεΐνασών κυστεΐνης. Για τον σκοπό αυτό, αιµοκύτταρα του εντόµου από το στάδιο περιπλάνησης καλλιεργήθηκαν ως εναιώρηµα και προεπωάστηκαν µε τους προαναφερόµενους αναστολείς για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Αµέσως µετά, τα αιµοκύτταρα διεγέρθηκαν µε βακτήρια για 10 και 30 λεπτά σε θερµοκρασία 25 o C. Ακολούθησε η γνωστή διαδικασία για να καταλήξουµε σε πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα δεδοµένου πρωτεϊνικού φορτίου από τα οποία αναλύθηκαν ισοπρωτεΐνικές ποσότητες σε 10 % SDS PAGE ώστε να ακολουθήσει ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p.y397 (Εικόνα 134). Ως µάρτυρες του πειράµατος χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν δίχως την παρουσία των βακτηρίων και των αναστολέων στους συνδυασµούς που απαιτούνται για την αξιολόγηση των αποτελεσµάτων. Για διαπίστωση των ισοπρωτεϊνικών δειγµάτων η µεµβράνη µετά από stripping επανεµφανίστηκε µε αντίσωµα έναντι της ακτίνης. Από την εικόνα 134 διαπιστώνουµε ότι η Src συνεισφέρει στη φωσφορυλίωση της Υ397 FAK αφού η χρήση του αναστολέα PP2 προκαλεί την µείωση της φωσφορυλίωσης της Υ397 σε σχέση µε τις διαδροµές ελέγχου (διαδροµές 3, 4). Η παρατηρούµενη αναστολή της ενεργοποίησης της FAK από τον PP2 θέτει την κινάση Src πιο πάνω (upstream) από την FAK στη µεταγωγή σηµάτων προς την FAK κατά την κυτταροφαγία της E. coli από τα αιµοκύτταρα της µεσογειακής µύγας. Παρόλα αυτά η χρήση του genistein, ως γενικού αναστολέα των γεγονότων φωσφορυλίωσης 233

240 Αποτελέσµατα αµινοξέων τυροσίνης, δεν επηρεάζει σηµαντικά την επαγόµενη από τα βακτήρια φωσφορυλίωση της FAK Y397. Αυτό σηµαίνει ότι στην ενεργοποίηση της FAK πιθανότατα δε συµµετέχουν άλλες κινάσες τυροσίνης πλην της Src. Grace 10 G race 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 E. coli 10 E. coli 30 FAK Y Actin PP2 ALLN Genistein PMSF Εικόνα 134. Επίδραση αναστολέων των πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης και των πρωτεΐνασων στην φωσφορυλίωση της FAK Y397 µετά από διέγερση των αιµοκυττάρων µε βακτήρια E.coli. Αιµοκύτταρα σε εναιώρηµα προεπωάστηκαν µε τους αναστολείς των πρωτεϊνικών κινασών τυροσίνης PP2 και genistein και τους αναστολείς των πρωτεϊνασών, για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια διεγέρθηκαν µε βακτήρια E. coli για 10 και 30 λεπτά. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που επωάστηκαν σε µόνο σε θρεπτικό µέσο (διαδροµές 1, 2), µόνο µε τους αναστολείς (διαδροµές 5, 8, 11, 14) και µόνο µε την E.coli (διαδροµές 3, 4). Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα αναλύθηκαν σε 10 % SDS PAGE και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p.y397. H παρουσία ισόποσων δειγµάτων επιβεβαιώθηκε επανεµφανίζοντας τη µεµβράνη για ακτίνη. Στο άλλο µέτωπο, η χρήση των αναστολέων ALLN και PMSF υποδηλώνουν σε ότι αφορά την ενεργοποίηση της FAK, τη συµµετοχή ποικίλλων πρωτεϊνασών. Από ότι φαίνεται από την εικόνα 134, στη ρύθµιση της ενεργοποίησης της FAK συµµετέχει η καλπαΐνη (διαδροµές 9, 10). Η χρήση του ALLN δεν επηρεάζει την υδρόλυση της FAK, όσο µπορούµε να κρίνουµε από την εικόνα της FAK p.y397, αλλά φαίνεται ότι η καλπαΐνη είτε έµµεσα, υδρολύοντας άλλες πρωτεΐνες υποστρώµατα, είτε άµεσα πρωτεολύοντας την ίδια την FAK, ρυθµίζει την ενεργοποίηση της FAK κατά την κυτταροφαγία των βακτηρίων της E.coli. Το ίδιο συµπέρασµα προκύπτει από τη χρήση του PMSF, γεγονός που αποκαλύπτει τη συµµετοχή περισσοτέρων πρωτεϊνασών. Γνωρίζοντας, όµως, ότι η καλπαΐνη έχει ως υπόστρωµα την FAK περιµέναµε την ενίσχυση της ενεργοποίησης της FAK µετά από την χρήση αναστολέα έναντι του πρωτεολυτικού αυτού ενζύµου. Το γεγονός ότι παρατηρούµε ακριβώς το αντίθετο αποτέλεσµα, πιθανότατα, υποδεικνύει την συµµέτοχη, στο πολύπλοκο σύστηµα 234

241 Αποτελέσµατα ρύθµισης της ενεργοποιησης της FAK κατά την κυτταροφαγία, φωσφατασών που προκαλούν την αποφωσφορυλίωση και κατά συνέπεια απενεργοποίηση της FAK. Για να διαπιστώσουµε την συνεισφορά των φωσφατασών στην ενεργοποίηση της FAK χρησιµοποιήσαµε µείγµα από αναστολείς φωσφατασών (phosphatase inhibitors cocktail, pic). Ειδικότερα, εναιωρήµατα αιµοκυττάρων προεπωάστηκαν µε µείγµα αναστολέων φωσφατασών για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Στη συνέχεια έγινε διέγερση των αιµοκυττάρων µε βακτήρια E.coli για χρόνους 5, 10, 12, 15, 17, 20, 25 και 30 λεπτά. Ακολούθησε λύση των αιµοκυττάρων (κατά την γνωστή διαδικασία) και ανάλυση των πρωτεϊνικών εκχυλισµάτων σε 10 % SDS PAGE. Τέλος, πραγµατοποιήσαµε ανοσοαποτύπωµα µε αντισώµατα έναντι της FAK p. Y397 (Εικόνα 135). Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν απουσία βακτηρίων και αιµοκύτταρα που καλλιεργήθηκαν µόνο σε θρεπτικό µέσο Grace. Η µεµβράνη µετά από stripping επανεµφανίστηκε µε αντίσωµα έναντι της ακτίνης για διαπίστωση των ισοπρωτεϊνικών δειγµάτων. Grace + pic Επώαση µε E. coli στους 25 ο C Grace p. FAK Y397 pic G Actin Εικόνα 135. Κινητική ενεργοποίησης της FAK µετά από διέγερση των αιµοκυττάρων µε βακτήρια E.coli, παρουσία µείγµατος αναστολέων φωσφατασών (phosphatase inhibitor cocktail, pic). Αιµοκύτταρα σε εναιώρηµα προεπωάστηκαν µε αναστολείς φωσφατασών για 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου και στη συνέχεια διεγέρθηκαν µε βακτήρια E. coli για 5, 10, 12, 15, 17, 20, 25 και 30 λεπτά. Ως µάρτυρες χρησιµοποιήθηκαν αιµοκύτταρα που επωάστηκαν µόνο µε τους αναστολείς (διαδροµή 1) και απουσία βακτηρίων και αναστολέων (διαδροµή 10). Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα αναλύθηκαν σε 10 % SDS PAGE και ακολούθησε ανοσοαποτύπωµα µε αντίσωµα έναντι της FAK p.y397. Η παρουσία ισόποσων δειγµάτων επιβεβαιώθηκε επανεµφανίζοντας τη µεµβράνη για την ακτίνη. 235