ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ Συχνότητα εμφάνισης των Turnip mosaic virus (TuMV) και Cauliflower mosaic virus (CaMV) σε φυτά της οικ. Brassicaceae, μερικός χαρακτηρισμός και μετάδοση με το είδος Myzus persicae ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΓΚΑΒΑΛΕΚΑ ΣΤΥΛΙΑΝΗ Γεωπόνος Δ.Π.Θ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ Συχνότητα εμφάνισης των Turnip mosaic virus (TuMV) και Cauliflower mosaic virus (CaMV) σε φυτά της οικ. Brassicaceae, μερικός χαρακτηρισμός και μετάδοση με το είδος Myzus persicae ΓΚΑΒΑΛΕΚΑ ΣΤΥΛΙΑΝΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Η διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή Ν. Ι. Κατής Καθηγητής Εισηγητής Α. Λαγοπόδη Επίκουρη Καθηγήτρια Μέλος Γ. Καραογλανίδης Λέκτορας Μέλος ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ 2011

3 Πρόλογος - Ευχαριστίες Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε κατά τα έτη στο εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ.), στα πλαίσια του προγράμματος μεταπτυχιακών σπουδών του τομέα Φυτοπροστασίας, υπό την επίβλεψη του καθηγητή Δρ Νικόλαου Ι. Κατή. Με την ολοκλήρωση της προσπάθειας αυτής θα ήθελα να ευχαριστήσω πρωτίστως τον καθηγητή Δρ Νικόλαο Κατή για τη συνεχή παρότρυνση και υποστήριξή του, ώστε να ολοκληρωθεί ομαλά η παρούσα διατριβή. Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στην επίκουρη καθηγήτρια Δρ Αναστασία Λαγοπόδη και στον λέκτορα Δρ Γεώργιο Καραογλανίδη, μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής, για την κριτική ανάγνωση της μεταπτυχιακής μου διατριβής. Θα ήθελα ακόμη να ευχαριστήσω σύσσωμο το εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Γεωπονικής Σχολής του Α.Π.Θ. και ιδιαίτερα τον υποψήφιο διδάκτορα Λώτο Λεωνίδα αλλά και τη μεταπτυχιακή φοιτήτρια Ορφανίδου Χρύσα για την πολύτιμη βοήθεια και συμπαράστασή τους κατά τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Επίσης, ευχαριστίες εκφράζονται στον λέκτορα Δρ Γ. Μενεξέ για την πραγματοποίηση της στατιστικής ανάλυσης των αποτελεσμάτων του πειράματος, καθώς και στον αναπληρωτή καθηγητή Δρ Α. Σιώμο για τις χρήσιμες συμβουλές στην καλλιέργεια των φυτών. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω την επίκουρη καθηγήτρια Δρ Ελισάβετ Χατζηβασιλείου για τη συνεχή συμπαράσταση και καθοδήγησή της αλλά και για την αμέριστη υποστήριξή της καθ όλη τη διάρκεια των προπτυχιακών και μεταπτυχιακών μου σπουδών. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου και ιδιαίτερα στους γονείς μου, που είναι πάντα δίπλα μου και με στηρίζουν σε κάθε μου προσπάθεια. 1

4 Περιεχόμενα Σελίδα Πρόλογος Ευχαριστίες 1 Περιεχόμενα 2 Ευρετήριο Εικόνων, Πινάκων και Διαγραμμάτων 6 Περίληψη Abstract Κεφάλαιο 1. Γενική Εισαγωγή 1.1 Η οικογένεια Brassicaceae - Το γένος Brassica Γεωργική σημασία του γένους Brassica στην Ελλάδα Ιοί που μολύνουν φυτά της οικογένειας Brassicaceae Ιοί των Brassica στην Ελλάδα Μικτές Μολύνσεις Η οικογένεια Caulimoviridae Χαρακτηριστικά των μελών της οικογένειας Caulimoviridae Συμπτώματα Το γένος Caulimovirus Χαρακτηριστικά των Caulimo-ιών Επιδημιολογία Kριτήρια διαχωρισμoύ των ειδών-μελών του γένους Ο ιός του μωσαϊκού του κουνουπιδιού (Cauliflower mosaic virus, CaMV) Χαρακτηριστικά του CaMV Συμπτώματα Ξενιστές Τρόπος Μετάδοσης Επιδημιολογία Διαχωρισμός στελεχών του CaMV Η οικογένεια Potyviridae Χαρακτηριστικά των μελών της οικογένειας Potyviridae Κριτήρια ένταξης στην οικογένεια Potyviridae Το γένος Potyvirus Χαρακτηριστικά των Poty-ιών Επιδημιολογία Kριτήρια διαχωρισμoύ των ειδών. 40 2

5 1.8 Ο ιός του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip Mosaic Virus, TuMV) Χαρακτηριστικά του TuMV Συμπτώματα Ξενιστές Τρόπος Μετάδοσης Επιδημιολογία Διαχωρισμός στελεχών του TuMV Οι αφίδες ως φορείς φυτικών ιών Ο ρόλος των αυτοφυών φυτών στην επιδημιολογία των ιών Φυτοπλάσματα Διάγνωση φυτοπλασματικών ασθενειών Επιδημιολογία Συμπτώματα Φυτοπλάσματα στην Ελλάδα Σκοπός της εργασίας.. 56 Κεφάλαιο 2. Γενικά Υλικά και Μέθοδοι 2.1 Προετοιμασία φυτοδεικτών Μηχανικές μολύνσεις Βιοδοκιμές Μετάδοση με αφίδες Προετοιμασία και σύζευξη αντισωμάτων Ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Άμεση ανοσοενζυμική δοκιμή DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich ELISA) Έμμεση ανοσοενζυμική δοκιμή TAS-ELISA (Triple Antibody Sandwich ELISA) Ανοσοενζυμική δοκιμή ACP-ELISA (Antigen Coated Plated ELISA) Μοριακές δοκιμές - Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) Εκχύλιση ολικού RNA-DNA (RNA-DNA Extraction) PCR για την ανίχνευση του CaMV και φυτοπλασμάτων Εστιασμένη PCR (nested-pcr) για την ανίχνευση φυτοπλασμάτων Αντίστροφη Μεταγραφή ακολουθούμενη από PCR (Reverse transcription PCR) σε ένα μικροσωλήνα (RT-PCR one tube)

6 2.6.5 Αντίστροφη Μεταγραφή ακολουθούμενη από PCR (Reverse transcription PCR) σε δύο μικροσωλήνες (RT-PCR two tubes) Ανίχνευση και αλληλούχιση προϊόντων της PCR. 70 Κεφάλαιο 3. Συχνότητα εμφάνισης των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV σε καλλιεργούμενα φυτά της οικ. Brassicaceae και σε αυτοφυή φυτά σε περιοχές της Ελλάδας και της Τουρκίας 3.1 Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι Δειγματοληψίες Έλεγχος των δειγμάτων Αποτελέσματα Παρουσία των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV σε καλλιεργούμενα φυτά της οικογένειας Brassicaceae Παρουσία των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV σε φυτά βιολέτας (Matthiola incana) Παρουσία των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV σε αυτοφυή είδη Συζήτηση. 81 Κεφάλαιο 4. Μερικός χαρακτηρισμός απομονώσεων των TuMV και CaMV από ξενιστές της οικογένειας Brassicaceae από περιοχές της Ελλάδας και της Τουρκίας 4.1 Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Χαρακτηρισμός απομονώσεων του TuMV Χαρακτηρισμός απομονώσεων του CaMV Αποτελέσματα Χαρακτηρισμός απομονώσεων του TuMV Χαρακτηρισμός απομονώσεων του CaMV Συζήτηση 93 Κεφάλαιο 5. Μελέτη της επίδρασης μικτής μόλυνσης με τους TuMV και CaMV στην πρόσληψη/μετάδοση κάθε ιού από το φορέα Myzus persicae 5.1 Εισαγωγή Υλικά και μέθοδοι 98 4

7 5.2.1 Αποικίες αφίδων Φυτικό υλικό - Μηχανικές μολύνσεις Απομονώσεις των ιών Δοκιμές μετάδοσης με αφίδες Δοκιμές ELISA Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων Αποτελέσματα Συζήτηση 101 Κεφάλαιο 6. Μοριακή ανίχνευση ενός φυτοπλάσματος της ομάδας "Aster yellows"σε φυτά λάχανου (Brassica oleracea var. capitata) 6.1 Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Δειγματοληψίες Έλεγχος των δειγμάτων Αποτελέσματα Συζήτηση Βιβλιογραφία Παράρτημα

8 Ευρετήριο Εικόνων, Πινάκων και Διαγραμμάτων Εικόνες Εικόνα 1.1: Φυτά και κεφαλή λάχανου. Εικόνα 1.2: Φυτά και ανθοκεφαλή κουνουπιδιού. Εικόνα 1.3: Φυτά και ανθοκεφαλή μπρόκολου. Εικόνα 1.4: Ηλεκτρονική μικρογραφία του Cauliflower mosaic virus του γένους Caulimovirus (1-2) και των Cacao swollen shoot virus (3) και Yucca bacilliform virus (4-5) του γένους Badnavirus. Εικόνα 1.5: Οργάνωση των γονιδιωμάτων των τυπικών ιών-μελών για κάθε γένος. Τα τμήματα των ORFs ή του ORF που κωδικοποιούν μια πρωτεΐνη αντιπροσωπεύονται από ορθογώνια σε διαφορετικά χρώματα σύμφωνα με τις διαφορετικές λειτουργίες των γονιδίων (μπλε MP, κόκκινο CP και κίτρινο RT). Εικόνα 1.6: Ηλεκτρονιακά-πυκνά (ed) και ηλεκτρονιακά-λαμπερά (el) έγκλειστα σωματίδια σε κύτταρο του μεσόφυλλου μολυσμένου φυτού γογγυλιού με τον CaMV. Εικόνα 1.7: Ηλεκτρονική μικρογραφία ιοσωματίων του ιού CaMV. Εικόνα 1.8: Κυκλική και γραμμική απεικόνιση του γονιδιώματος του CaMV. Τα τμήματα των ORFs που κωδικοποιούν μια πρωτεΐνη αντιπροσωπεύονται από ορθογώνια σε διαφορετικά χρώματα σύμφωνα με τις διαφορετικές λειτουργίες των γονιδίων (μπλε MP, κόκκινο CP και κίτρινο RT). Εικόνα 1.9: Το σύμπλεγμα του CaMV. Η ιική πρωτεΐνη P2 προσδένεται με τον υποδοχέα, που βρίσκεται στην επιδερμίδα στο εσωτερικό του πεπτικού σωλήνα, μέσα στο στιλέτο του φορέα και με την πρωτεΐνη P3, η οποία είναι στενά συνδεδεμένη με το ιοσωμάτιο. Στο ένθετο φαίνεται η διανομή της P3 (σκούρο γκρι) στην εξωτερική επιφάνεια του ιοσωματίου (ανοιχτό γκρι). Εικόνα 1.10: Συμπτώματα που σχετίζονται με μόλυνση φυτών στη φύση από τον CaMV. A) Περινεύριος μεταχρωματισμός με σκούρες πράσινες περιοχές κοντά στα νεύρα και διαφάνεια των νευρώσεων σε κουνουπίδι, B) Μωσαϊκό και περινεύριος μεταχρωματισμός με σκούρες πράσινες περιοχές κοντά στα νεύρα σε μπρόκολο, C) Παραμόρφωση και τραχύτητα φύλλων, ανάσχεση της ανάπτυξης και διαφάνεια των νευρώσεων σε κινέζικο λάχανο, D) Παραμόρφωση και κιτρίνισμα των νευρώσεων σε λάχανο. Εικόνα 1.11: Αφίδες φορείς του CaMV του είδους Myzus persicae (Α,Β) και του είδους Brevicoryne brassicae (C, D). Εικόνα 1.12: Ηλεκτρονική μικρογραφία των ραβδόμορφων ιικών σωματιδίων (Α) του Potato virus Y, PVY (Potyvirus) και (B) του Barley yellow mosaic virus, BaYMV (Bymovirus). 6

9 Εικόνα 1.13: Οργάνωση του γονιδιώματος μελών (α) του γένους Potyvirus και (β) του γένους Bymovirus, της οικογένειας Potyviridae. Φαίνεται η θέση του κάθε γονιδιακού προϊόντος στην πολυπρωτεΐνη καθώς και οι θέσεις τομής της (βέλη). Εικόνα 1.14: (Αριστερά) Σχηματικό διάγραμμα ενός ιοσωματίου του γένους Potyvirus. Το N-άκρο ~30 aa (μεγάλο ορθογώνιο) και το C-άκρο ~19 aa (μικρό ορθογώνιο) των μορίων της CP, βρίσκονται εκτεθειμένα στην επιφάνεια των ιοσωματίων. (Δεξιά) Ηλεκτρονική μικρογραφία ιοσωματίων μιας απομόνωσης του Plum pox virus. Η μπάρα αντιπροσωπεύει 200 nm. Εικόνα 1.15: Το γραμμικό, μονόκλωνο RNA (ssrna) και η οργάνωση του γονιδιώματος των ιών του γένους Potyvirus. P1 (30-60 kda): πρωτεϊνάση υπεύθυνη για τη διάσπαση της ένωσης P1-HC, HC-Pro (56 kda): βοηθητική πρωτεΐνη αφιδομετάδοσης (helper component), P3 (40 kda): πρωτεΐνη που παίζει ρόλο στην ένταση των συμπτωμάτων και στον καθορισμό του εύρους των ξενιστών, 6K1 (6 kda): απαραίτητη για την αναπαραγωγή του ιού, CI (70 kda): πρωτεΐνη κυλινδρικών έγκλειστων σωματιδίων, 6K2 (6 kda): πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην αναπαραγωγή του ιού, στη μετακίνηση και στην πρόκληση των συμπτωμάτων, NIa (28 kda): πρωτεϊνάση υπεύθυνη για τη διάσπαση των ενώσεων P3/6K1, 6K1/CI, CI/6K2, 6K2/VPg, VPg/NIa-Pro, NIa-Pro/NIb, NIb/CP το N-άκρο της είναι η VPg (21 kda): πρωτεΐνη που συνδέεται στο 5 άκρο του ιικού RNA, NIb (58 kda): πολυμεράση, CP (30-36 kda): καψιδιακή πρωτεΐνη. Εικόνα 1.16: Η βοηθητική πρωτεΐνη HC-Pro, απαραίτητη στη μετάδοση με το φορέα ιών του γένους Potyvirus. Εικόνα 1.17: (Α) Ηλεκτρονική μικρογραφία των εύκαμπτων, νηματοειδών σωματιδίων μήκους ~720 nm του TuMV. (Β) Έγκλειστα σωματίδια χαρακτηριστικής μορφής παρατηρούνται σε πολύ λεπτές τομές κυττάρου του μεσόφυλλου ενός προσβεβλημένου φυτού κοχλιαρίας (Armoracia rusticana). Μπάρες = 200 nm. Εικόνα 1.18: Σχηματικό διάγραμμα του γονιδιώματος του TuMV υποδεικνύοντας το μέγεθος του κάθε γονιδιακού προϊόντος καθώς και τις αμετάφραστες περιοχές. Εικόνα 1.19: Συμπτώματα που σχετίζονται με μόλυνση φυτών στη φύση από τον TuMV. (Α) Διάσπαση του χρώματος των ανθέων, μωσαϊκό και παραμόρφωση φύλλων σε φυτό βιολέτας, (Β, C) Μωσαϊκό, ποικιλοχλώρωση, νεκρωτικές περιοχές και χλωρωτικοί δακτύλιοι με ιώδη περίμετρο σε λάχανο, (D) Μαύρες νεκρωτικές κηλίδες (σαν κάψιμο από τσιγάρο) στα εξωτερικά και εσωτερικά φύλλα προσβεβλημένων με τον ιό κεφαλών λάχανου. Εικόνα 1.20: Σχηματικό διάγραμμα μιας αφίδας στο οποίο απεικονίζεται η πορεία των μη-κυκλοφορούντων και των κυκλοφορούντων ιών μετά την πρόσληψή τους. Ο τροφικός αγωγός και το πρόσθιο έντερο (σκιαγραφημένες περιοχές) είναι οι περιοχές διατήρησης των μη-κυκλοφορούντων ιών; τα βέλη απεικονίζουν το πέρασμα των κυκλοφορούντων ιών δια μέσω του πεπτικού σωλήνα (τροφικός αγωγός, πρόσθιο 7

10 έντερο, μέσο έντερο, οπίσθιο έντερο), του αιμόκοιλου και του βοηθητικού σιελογόνου αδένα της αφίδας, έως την έξοδο μέσω του σιελογόνου αγωγού. Το ένθετο στο κάτω μέρος της εικόνας απεικονίζει σε μεγέθυνση το ακραίο τμήμα του στιλέτου όπου ο σιελογόνος αγωγός συγχωνεύεται με τον τροφικό αγωγό. Εικόνα 1.21: Ηλεκτρονικές μικρογραφίες σε διαφορετικές μεγεθύνσεις διατομών ηθμοσωλήνων απεικονίζουν τον πολυμορφισμό σε σχήματα και διαστάσεις φυτοπλασμάτων. Εικόνα 1.22: (Αριστερά) Το κοινό καφέ τζιτζικάκι Orosius orientalis (Hemiptera: Cicadellidae) σημαντικός φορέας αρκετών φυτοπλασμάτων παγκοσμίως και έμμεσα υπεύθυνο για την πρόκληση της ασθένειας γιγαντοφθαλμία της ντομάτας, (Κέντρο) Ενήλικο άτομο του Hyalesthes obsoletus (Cixiidae), φορέας του φυτοπλάσματος που είναι υπεύθυνο για την ασθένεια Stolbur, (Δεξιά) Ενήλικο άτομο του Hishimonus phycitis (Cicadellidae), φορέας του φυτοπλάσματος που προκαλεί την ασθένεια σκούπα της μάγισσας της λιμετιάς. Εικόνα 1.23: Συμπτώματα ασθενειών που σχετίζονται με προσβολή από φυτοπλάσματα σε ξυλώδεις ξενιστές. Πρώτη σειρά: αμπέλι προσβεβλημένο με τη χρυσίζουσα χλώρωση (Flavescence dorée-fd), κερασιά με αποπληξία, ιαπωνική δαμασκηνιά προσβεβλημένη με λεπτονέκρωση εμφανίζει κατάπτωση του εμβολίου και σκούπα της μάγισσας στο υποκείμενο (δύο τελευταίες φωτογραφίες); Δεύτερη σειρά: καρποί μηλιάς προσβεβλημένης με «σκούπα της μάγισσας», μικροσκοπικοί βλαστοί μηλιάς ως αποτέλεσμα της ασθένειας «σκούπα της μάγισσας», λιμετιά με σύμπτωμα «σκούπα της μάγισσας» και αχλαδιά με κόκκινο φύλλωμα που υποδεικνύει την παρουσία μιας βραδείας κατάπτωσης η οποία σχετίζεται με την παρουσία φυτοπλάσματος. Εικόνα 2.1: Φυτοδείκτες του γένους Brassica. Εικόνα 2.2: Αποικία αφίδων του είδους Myzus persicae (κόκκινος κλώνος). Εικόνα 2.3: Κλωβός διατήρησης αποικίας αφίδων Myzus persicae. Εικόνα 2.4: Μικροπλάκα πολυστυρενίου 96 φρεατίων. Τα βοθρία με κίτρινο χρώμα αντιστοιχούν σε μολυσμένα δείγματα. Εικόνα 2.5: Τα 4 στάδια της DAS-ELISA. (1) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος IgG σε διάλυμα επιστρώσεως της πλάκας (coating buffer), (2) Προσθήκη του ομογενοποιημένου με διάλυμα εκχύλισης των δειγμάτων (PBS- Tween) δείγματος (αραιωμένο 1/10), (3) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος συζευγμένου με αλκαλική φωσφατάση IgG σε PBS-Tween (στην περίπτωση του CaMV σε PBS-Tween + 0.2% BSA), (4) Προσθήκη του υποστρώματος, φωσφορική παρανιτροφαινόλη PNPP (p-nitrophenylphosphate), 1 mgr/ml διαλύματος υποστρώματος (substrate buffer). Εικόνα 2.6: Τα 5 στάδια της TAS-ELISA. (1) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος IgG σε διάλυμα επιστρώσεως της πλάκας (coating buffer), (2) 8

11 Προσθήκη του ομογενοποιημένου με διάλυμα εκχύλισης των δειγμάτων (PBS- Tween) δείγματος (αραιωμένο 1/10), (3) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος των μονοκλωνικών αντισωμάτων (EMA 67) σε PBS-Tween + 0.2% BSA + 2% PVP, (4) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος αντι-αντιορού (anti-mouse) συζευγμένου με αλκαλική φωσφατάση σε PBS-Tween + 0.2% BSA + 2% PVP, (5) Προσθήκη του υποστρώματος, φωσφορική παρανιτροφαινόλη PNPP (pnitrophenylphosphate), 1 mgr/ml διαλύματος υποστρώματος (substrate buffer). Εικόνα 2.7: Τα 4 στάδια της ACP-ELISA. (1) Προσθήκη στα φρεάτια της πλάκας του ομογενοποιημένου με διάλυμα εκχύλισης των δειγμάτων (PBS-Tween) δείγματος (αραιωμένο 1/10), αφού προηγουμένως έχουν τοποθετηθεί 80 μl διαλύματος επιστρώσεως της πλάκας (Coating Buffer), (2) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος των μονοκλωνικών αντισωμάτων σε PBS-Tween, (3) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος αντι-αντιορού (anti-mouse) συζευγμένου με αλκαλική φωσφατάση σε PBS-Tween, (4) Προσθήκη του υποστρώματος, φωσφορική παρανιτροφαινόλη PNPP (p-nitrophenylphosphate), 1 mgr/ml διαλύματος υποστρώματος (substrate buffer). Εικόνα 4.1: Φυλογενετικό δέντρο που κατασκευάστηκε με το πρόγραμμα PhyML (έκδοση 3.0) με βάση το μοντέλο εξέλιξης HKY+I+G, δείχνει τη γενετική συγγένεια μεταξύ των αλληλουχιών του γονιδίου της CP των ελληνικών απομονώσεων και άλλων απομονώσεων του TuMV. Εικόνα 4.2: Διαφοροποίηση απομονώσεων του CaMV, που προέρχονται από διάφορες χώρες, με βάση την ανάλυση πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων περιορισμού (RFLP) χρησιμοποιώντας το περιοριστικό ένζυμο Hpy99I. (a) Προφίλ RFLP. Τα μεγέθη των θραυσμάτων περιορισμού (bp) δίνονται μεταξύ των θέσεων περιορισμού. (b) Τοποθέτηση των απομονώσεων σε διαφορετικές RFLP ομάδες. Εικόνα 4.3: Ηλεκτροφόρημα προϊόντων PCR τεσσάρων αντιπροσωπευτικών δειγμάτων (από αριστερά προς τα δεξιά: Ladder, 799, 780, 823 και 1091) για κάθε RFLP ομάδα, μετά από μεταχείριση με το περιοριστικό ένζυμο Hpy99I. Διακρίνονται τα διαφορετικά προφίλ των θραυσμάτων περιορισμού. Εικόνα 5.1: Διαδικασία μετάδοσης με το είδος αφίδας Myzus persicae. Εικόνα 6.1: Ηλεκτροφόρημα των δειγμάτων που βρέθηκαν θετικά για προσβολή από φυτόπλασμα, ενισχύοντας το προβλεπόμενο τμήμα bp. Πίνακες Πίνακας 1.1: Ιοί που μολύνουν φυτά της οικογένειας Brassicaceae. Δίνονται η οικογένεια, το γένος και ο τρόπος ή ο φορέας μετάδοσης για κάθε ιό. Πίνακας 1.2: Τα γένη-μέλη της οικογένειας Caulimoviridae. Δίνονται ο οργανισμόςφορέας, ο τρόπος μετάδοσης και το τυπικό μέλος για κάθε γένος. 9

12 Πίνακας 1.3: Πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από τον CaMV και οι λειτουργίες τους. Πίνακας 1.4: Καλλιεργούμενα φυτά-ξενιστές του CaMV που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae. Πίνακας 1.5: Αυτοφυή φυτά-ξενιστές του CaMV που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae. Πίνακας 1.6: Τα γένη-μέλη της οικογένειας Potyviridae. Δίνονται ο οργανισμόςφορέας, ο τρόπος μετάδοσης και το τυπικό μέλος για κάθε γένος. Πίνακας 1.7: Πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από ιούς του γένους Potyvirus και οι λειτουργίες τους. Αναφέρονται με τη σειρά που εμφανίζονται στην πολυπρωτεΐνη (από το N- στο C- άκρο). Πίνακας 1.8: Καλλιεργούμενα φυτά-ξενιστές του TuMV που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae. Πίνακας 1.9: Αυτοφυή φυτά-ξενιστές του TuMV που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae. Πίνακας 2.1: Οικογένειες και είδη φυτοδεικτών. Πίνακας 2.2: Αραιώσεις πολυκλωνικών αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανίχνευση των ιών CaMV, CMV, LMV, TSWV και AMV στην ανοσοενζυμική δοκιμή DAS-ELISA. Πίνακας 2.3: Αλληλουχίες εκκινητών για την ειδική και γενική ανίχνευση των ιών και του φυτοπλάσματος. Δίνονται τα Tm των εκκινητών καθώς και το μέγεθος του προβλεπόμενου προϊόντος. Πίνακας 3.1: Καλλιεργούμενα είδη της οικογένειας Brassicaceae από περιοχές της Ελλάδας και της Τουρκίας, που ελέγχθηκαν με δοκιμές ELISA για την παρουσία των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV. Πίνακας 3.2: Παρουσία των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV σε καλλιεργούμενα Brassicaceae. Μέσος όρος προσβολής σε περιοχές της Ελλάδας και της Τουρκίας. Πίνακας 3.3: Αυτοφυή φυτά από διάφορες περιοχές της Ελλάδας, που βρέθηκαν θετικά σε δοκιμές ELISA για την παρουσία κάποιου από τους ιούς CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV. Πίνακας 4.1: Ομοιότητα % σε επίπεδο νουκλεοτιδίων των απομονώσεων 4, 538, 544, 910 και 1059 του TuMV. Πίνακας 4.2: Ομοιότητα % σε επίπεδο νουκλεοτιδίων των απομονώσεων 780, 799, 823, 1044 και 1091 του CaMV. Πίνακας 5.1: Πίνακας ANOVA. Πίνακας 5.2: Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων του πειράματος. 10

13 Διαγράμματα Σχεδιάγραμμα 3.1: Μέσος όρος παρουσίας των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV σε καλλιέργειες φυτών της οικογένειας Brassicaceae σε περιοχές της Ελλάδας και της Τουρκίας. Σχεδιάγραμμα 5.1: Συγκριτική απεικόνιση των ποσοστών μετάδοσης των TuMV και CaMV, λαμβάνοντας υπόψη και το τυπικό σφάλμα του Μ.Ο., όταν η πρόσληψη των ιών πραγματοποιήθηκε από απλές μολύνσεις και από μικτή με τους δύο ιούς μόλυνση. 11

14 Περίληψη Η οικογένεια Brassicaceae περιλαμβάνει αρκετά καλλιεργούμενα είδη, σημαντικά για την οικονομία πολλών χωρών παγκοσμίως. Ωστόσο, τα φυτά της οικογένειας είναι ευπαθή σε πληθώρα παθογόνων μεταξύ των οποίων ιοί και φυτοπλάσματα. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε η παρουσία και η συχνότητα εμφάνισης των ιών Cauliflower mosaic virus (CaMV), Turnip mosaic virus (TuMV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Cucumber mosaic virus (CMV) και Lettuce mosaic virus (LMV) κυρίως στα τρία ευρέως καλλιεργούμενα είδη του γένους Brassica, Brassica oleracea var. capitata, Brassica oleracea var. botrytis και Brassica oleracea var. italica, καθώς και σε αυτοφυή φυτά διαφόρων οικογενειών. Τα δείγματα καλλιεργούμενων φυτών, από διάφορες περιοχές της Ελλάδας και από μια περιοχή της Τουρκίας, εξετάστηκαν με την ανοσοενζυμική δοκιμή της ELISA όπου διαπιστώθηκε η παρουσία και των πέντε ιών σε χαμηλά ποσοστά. Ωστόσο, η παρουσία των ιών επιβεβαιώθηκε μόνο για τους CaMV και TuMV, τόσο μοριακά (PCR) όσο και με βιοδοκιμές σε φυτοδείκτες. Σε δείγματα αυτοφυών φυτών από διάφορες περιοχές της χώρας μας που ελέγχθηκαν με ELISA, οι ιοί εντοπίστηκαν σε περιορισμένο αριθμό φυτών, χωρίς όμως να επιτευχθεί επιβεβαίωση της παρουσίας τους με μηχανικές μολύνσεις ή μοριακά. Σε καλλιεργούμενα Brassica με συμπτώματα ικτέρου εντοπίστηκε επίσης και ο Turnip yellows virus (TuYV) με τη μέθοδο της RT-PCR. Ορισμένες απομονώσεις των CaMV και TuMV χαρακτηρίστηκαν μερικώς. Οι απομονώσεις του TuMV βρέθηκε να ανήκουν στις ομάδες World-B και Basal-B, ενώ οι απομονώσεις του CaMV χωρίστηκαν σε τέσσερις διαφορετικές ομάδες, με βάση την ανάλυση πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων περιορισμού (RFLP) με χρήση του ενζύμου Hpy99I. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση μικτής μόλυνσης με δύο ελληνικές απομονώσεις των CaMV και TuMV, στην ικανότητα πρόσληψης/μετάδοσης κάθε ιού με τον φορέα Myzus persicae. Στις δοκιμές αφιδομετάδοσης ο TuMV μεταδόθηκε σε υψηλότερα ποσοστά σε σύγκριση με τον CaMV, δεν βρέθηκαν ωστόσο στατιστικώς σημαντικές διαφορές στην μετάδοση των δύο ιών από μονές και μικτές μολύνσεις. Τέλος, σε δείγματα λάχανου, ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά στη χώρα μας φυτόπλασμα και βρέθηκε ότι ανήκει στην ομάδα Aster yellows (AY). 12

15 Abstract Brassicaceae family contains a high number of cultivated species that are economically important worldwide. However, the plants of this family are susceptible to many pathogens including viruses and phytoplasmas. The present thesis studied the incidence of Cauliflower mosaic virus (CaMV), Turnip mosaic virus (TuMV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), Cucumber mosaic virus (CMV) and Lettuce mosaic virus (LMV) mainly in the three widely cultivated species of Brassica genus, Brassica oleracea var. capitata, Brassica oleracea var. botrytis and Brassica oleracea var. italica and also in arable weeds of various families. The samples of cultivated plants, collected from various regions of Greece and one region of Turkey, were examined by ELISA and the incidence of all five viruses was found in low rates. However, only the incidence of CaMV and TuMV was confirmed, with molecular methods (PCR) as well as with bioassays at indicator plants. Arable weeds from various regions of Greece were also examined by ELISA and the viruses were identified in a limited number of plants. However, virus presence has not been confirmed with mechanical inoculations or molecular methods. Finally, in Brassica plants exhibitng yellowing symptoms, Turnip yellows virus (TuYV) was also detected by RT-PCR. Some of the CaMV and TuMV isolates were partially characterized. TuMV isolates were found to belong in World-B and Basal-B groups whereas CaMV isolates were separated in four different groups based on the Restricted Fragment Length Polymorphism (RFLP) analysis using Hpy99I enzyme. The effect of mixed infection of CaMV and TuMV on the acquisition/transmission of each virus by Myzus persicae was also studied. The results showed that TuMV transmission efficiency was higher than CaMV. However, transmission of each virus from singly and doubly infected plants was similar. Finally, a phytoplasma belonging to the Aster Yellows (AY) group was detected in cabbage samples for the first time in Greece. 13

16 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1. Γενική Εισαγωγή 14

17 1.1 Η οικογένεια Brassicaceae - Το γένος Brassica Το γένος Brassica ανήκει στην οικογένεια Brassicaceae, η οποία αρχικά ονομαζόταν Cruciferae. Χαρακτηριστικό των φυτών της οικογένειας είναι η διάταξη των τεσσάρων πετάλων του άνθους σε σχήμα σταυρού. Όλα τα μέλη της οικογένειας θεωρούνται καλλιέργειες των ψυχρών εποχών (Decoteau, 2000). Η οικογένεια αυτή περιλαμβάνει δικοτυλήδονα, ετήσια ή διετή φυτά αρκετά από τα οποία είναι σημαντικά καλλιεργούμενα είδη (Βαρδαβάκης και Ζούζουλας, 2004). Στη χώρα μας καλλιεργούνται περισσότερο τρία είδη, το λάχανο (Brassica oleracea var. capitata), το κουνουπίδι (Brassica oleracea var. botrytis) και το μπρόκολο (Brassica oleracea var. italica). Λάχανο (Brassica oleracea var. capitata) Το λάχανο είναι ποώδες φυτό και έχει διετή βιολογικό κύκλο. Το εδώδιμο τμήμα του είναι η κεφαλή, η οποία αποτελείται από σαρκώδη φύλλα και σχηματίζεται κατά τον πρώτο χρόνο της καλλιέργειας του φυτού (Εικόνα 1.1). Καταναλώνεται νωπό ή μετά από βιομηχανική επεξεργασία (τουρσί). Το λάχανο καλλιεργείται τις δροσερές εποχές του έτους καθώς ευδοκιμεί κάτω από συνθήκες μέτριας θερμοκρασίας και επαρκούς υγρασίας. Για την άριστη ανάπτυξη του φυτού και την παραγωγή ποιοτικού προϊόντος, οι απαιτούμενες μέσες μηνιαίες θερμοκρασίες θα πρέπει να είναι >5 C, <25 C με άριστη C. Για αποφυγή ακραίων συνθηκών θερμοκρασίας οι καλλιέργειες λαχάνου σε περιοχές με βαρύ χειμώνα γίνονται την περίοδο άνοιξης-θέρους-φθινοπώρου, ενώ σε περιοχές με ήπιο χειμώνα και θερμό θέρος γίνονται την περίοδο φθινοπώρου-χειμώνα-άνοιξης. Ευδοκιμεί στους περισσότερους τύπους εδαφών με επαρκή γονιμότητα και υγρασία. Το άριστο ph του εδάφους είναι 6-6,8 ή και ελαφρώς αλκαλικό μέχρι 7,5. Ο πολλαπλασιασμός του φυτού γίνεται με απευθείας σπορά στον αγρό ή με μεταφύτευση στον αγρό φυτών που παρήχθησαν σε σπορεία, που είναι και ο συνήθης τρόπος που εφαρμόζεται στη χώρα μας. Υπάρχουν διάφοροι τύποι λάχανου, με κεφαλές διαφόρου σχήματος και χρώματος. Οι ποικιλίες και τα υβρίδια λάχανου ταξινομούνται σε ομάδες με βάση τα μορφολογικά χαρακτηριστικά της κεφαλής, την περίοδο συγκομιδής ή τον τρόπο κατανάλωσης. Οι συνηθέστεροι καλλιεργούμενοι τύποι λάχανων είναι οι εξής: α) τύπος Wakefield, β) τύπος Κοπεγχάγης, γ) τύπος Ολλανδίας, δ) τύπος Δανίας (η πιο αξιόλογη ομάδα ποικιλιών διεθνώς), ε) τύπος Savoy και στ) τύπος κόκκινου λάχανου. 15

18 Καλλιεργείται σε παγκόσμια κλίμακα και είναι ιδιαίτερα σημαντικό λαχανικό για τη Βόρεια και Ανατολική Ευρώπη καθώς και την ΒΑ Ασία. Η έκταση των καλλιεργειών στον κόσμο είναι περίπου στρέμματα και η παραγωγή περίπου τόνοι. Στην παραγωγή πρώτη είναι η Ασία με τόνους και ακολουθεί η πρώην Σοβιετική Ένωση με τόνους (Ντόγρας, 2005). Κουνουπίδι (Brassica oleracea var. botrytis) Το κουνουπίδι όπως και το λάχανο ανήκει στα ποώδη φυτά. Το εδώδιμο τμήμα του είναι η κεφαλή (ανθοκεφαλή, χρώματος λευκού-ιώδους) (Εικόνα 1.2) η οποία καταναλώνεται κατά κύριο λόγο νωπή ή μετά από βιομηχανική επεξεργασία (αφυδάτωση, τουρσί). Μεταξύ των βοτανικών ποικιλιών του είδους Brassica oleracea, το κουνουπίδι έχει τις πιο μεγάλες απαιτήσεις σε αυστηρώς καθορισμένες κλιματικές συνθήκες και καλλιεργητικές περιποιήσεις (Decoteau, 2000). Ευδοκιμεί σε περιόδους με μέτριες θερμοκρασίες και οι άριστες θερμοκρασίες για την ανάπτυξη ανθοκεφαλής είναι C. Οι απαιτήσεις του φυτού σε έδαφος και λίπανση είναι παρόμοιες με εκείνες του λάχανου. Ο πολλαπλασιασμός του κουνουπιδιού γίνεται κατά κανόνα με παραγωγή φυτών στο σπορείο και μεταφύτευσή τους στον αγρό. Αντιπροσωπεύεται από δύο «τύπους» ποικιλιών, τον πρώιμο (διεθνώς γνωστό ως snowball) που ωριμάζει το θέρος-αρχές φθινοπώρου και τον όψιμο που ωριμάζει το χειμώνα. Οι πρώιμες ποικιλίες σχηματίζουν ανθοκεφαλή χωρίς να υποστούν εαρινοποίηση, ενώ οι όψιμες (χειμερινές) μόνο αφότου εκτεθούν σε χαμηλές θερμοκρασίες. Με κριτήριο την απαίτηση για εαρινοποίηση για τον σχηματισμό κεφαλής, οι πρώιμες ποικιλίες θεωρούνται ετήσια φυτά ενώ οι όψιμες διετή. Οι πρώιμες ποικιλίες καλλιεργούνται σε μεγαλύτερη κλίμακα από τις όψιμες. Έχουν δημιουργηθεί αρκετά υβρίδια κουνουπιδιού αλλά οι κοινές ποικιλίες καλλιεργούνται σε μεγαλύτερη κλίμακα. Η καλλιέργεια καθώς και η κατανάλωση του κουνουπιδιού διεθνώς είναι σχετικά μικρή. Η έκταση που καλλιεργείται παγκοσμίως είναι περίπου στρέμματα και η ετήσια παραγωγή περίπου τόνοι. Η Ασία (Κίνα και Ινδία) προηγείται σε όγκο παραγωγής και ακολουθεί η Ευρώπη (Γαλλία, Ιταλία, Μ. Βρετανία) (Ντόγρας, 2005). 16

19 Μπρόκολο (Brassica oleracea var. italica) Το μπρόκολο όπως το λάχανο και το κουνουπίδι ανήκει στα ποώδη φυτά και έχει ετήσιο βιολογικό κύκλο. Το εδώδιμο τμήμα του είναι η κεφαλή (ανθοκεφαλή, χρώματος κυανούπράσινου) (Εικόνα 1.3) η οποία καταναλώνεται κατά κύριο λόγο νωπή ή μετά από βιομηχανική επεξεργασία (κατάψυξη). Το μπρόκολο δεν είναι τόσο απαιτητικό σε συγκεκριμένες συνθήκες περιβάλλοντος και καλλιεργητικές περιποιήσεις όσο το κουνουπίδι αλλά είναι πιο απαιτητικό από το λάχανο. Όπως και το κουνουπίδι, ευδοκιμεί σε συνθήκες μέτριων θερμοκρασιών και οι άριστες θερμοκρασίες για την ανάπτυξη ανθοκεφαλής είναι C. Η ανάπτυξη της ανθοκεφαλής δεν απαιτεί εαρινοποίηση, επιταχύνεται ωστόσο με την έκθεση του φυτού σε χαμηλές θερμοκρασίες. Οι απαιτήσεις του φυτού σε έδαφος και λίπανση είναι παρόμοιες με εκείνες του λάχανου και του κουνουπιδιού. Ο πολλαπλασιασμός του μπρόκολου γίνεται κατά κανόνα με παραγωγή φυτών στο σπορείο και μεταφύτευσή τους στον αγρό. Οι ποικιλίες του μπρόκολου κατατάσσονται σε πρώιμες, μεσοπρώιμες και όψιμες. Οι πρώιμες φυτεύονται από τέλη χειμώνα έως και αρχές θέρους και συγκομίζονται από τέλη άνοιξης έως το φθινόπωρο. Οι μεσοπρώιμες ποικιλίες φυτεύονται το θέρος ή νωρίς το φθινόπωρο και συγκομίζονται τέλη φθινοπώρου έως νωρίς το χειμώνα. Οι όψιμες ποικιλίες καλλιεργούνται σε περιοχές με ήπιο χειμώνα και η φύτευση γίνεται τέλος φθινοπώρου για συγκομιδή από τέλη χειμώνα έως αρχές άνοιξης. Επίσης, οι ποικιλίες μπρόκολου μπορεί να διαφοροποιούνται ανάλογα με το μέγεθος της ανθοκεφαλής και την ανάπτυξη νέων δευτερογενών κεφαλών μετά τη συγκομιδή της κύριας, που είναι εξίσου εμπορεύσιμες. Μεγάλης κλίμακας είναι η καλλιέργεια υβριδίων μπρόκολου. Παγκοσμίως, στην παραγωγή μπρόκολου προηγούνται οι ΗΠΑ (περίπου τόνοι ετησίως) και ακολουθούν η Ιταλία, διάφορες χώρες της ΒΔ Ευρώπης και χώρες της Άπω Ανατολής. Στη χώρα μας το μπρόκολο καλλιεργείται ακόμα σε μικρή κλίμακα και δεν υπάρχουν σχετικά στατιστικά στοιχεία. Πάντως, τα τελευταία χρόνια η καλλιέργειά του αυξάνεται λόγω του εντεινόμενου ενδιαφέροντος των καταναλωτών (Ντόγρας, 2005) Γεωργική σημασία του γένους Brassica στην Ελλάδα Στην Ελλάδα το λάχανο και το κουνουπίδι καλλιεργούνται σε όλους σχεδόν τους νομούς και κατέχουν σημαντική θέση μεταξύ των καλλιεργούμενων λαχανοκομικών ειδών. Η καλλιεργήσιμη έκταση λάχανου για το έτος 2006 ήταν στρέμματα 17

20 και η παραγωγή του τόνοι. Για το κουνουπίδι η καλλιεργήσιμη έκταση ήταν στρέμματα και η παραγωγή του τόνοι (Ε.Σ.Υ.Ε.). Για το 2008 η καλλιέργεια λάχανου και κουνουπιδιού σύμφωνα με την ελληνική Στατιστική Υπηρεσία Ελλάδος εκτάθηκε σε στρέμματα και η παραγωγή εκτιμήθηκε στους τόνους (Ε.Σ.Υ.Ε.). Η καλλιέργεια των δύο αυτών ειδών έρχεται δεύτερη αμέσως μετά την καλλιέργεια της τομάτας. Φαίνεται ότι η καλλιέργεια λάχανου και κουνουπιδιού τόσο όσον αφορά την καλλιεργούμενη έκταση όσο και την παραγωγή είναι περισσότερο συγκεντρωμένη στα γεωγραφικά διαμερίσματα της Στερεάς Ελλάδας μαζί με την Εύβοια, της Πελοποννήσου και της Μακεδονίας. Ο νομός Ευβοίας είναι πρώτος τόσο σε καλλιεργούμενη έκταση όσο και σε παραγωγή ( στρέμματα και τόνοι), δεύτερος έρχεται ο νομός Θεσσαλονίκης ( στρέμματα και τόνοι) και ακολουθούν οι νομοί Αργολίδος και Ηλείας (Ε.Σ.Υ.Ε.). 1.2 Ιοί που μολύνουν φυτά της οικογένειας Brassicaceae Οι καλλιέργειες φυτών της οικογένειας Brassicaceae μπορούν να φιλοξενήσουν αρκετούς ιούς (Πίνακας 1.1). Ορισμένοι από αυτούς επηρεάζουν σοβαρά την παραγωγή και ορισμένες φορές οδηγούν σε σημαντική μείωση της απόδοσης. Οι Beet western yellows virus (BWYV), Cauliflower mosaic virus (CaMV) και Turnip mosaic virus (TuMV) αποτελούν από τους πιο κοινούς και σοβαρούς (Gilligan et al., 1980; Tomlinson et al., 1981; Smith et al., 1985; Markham et al., 1987; Hardwick et al., 1994; Jay et al., 1999; Cho et al., 2002; Hunter et al., 2002; Shahraeen et al., 2003; Moreno et al., 2004; Farzadfar et al., 2007; Spense et al., 2007). Ορισμένες από τις ευρωπαϊκές κυρίως απομονώσεις του BWYV που έχουν την ικανότητα να μολύνουν φυτά του γένους Brassica της οικογένειας Brassicaceae, αλλά όχι τα τεύτλα που αποτελούν τον πρωταρχικό ξενιστή του, μετονομάστηκαν και αποτελούν πλέον ένα ξεχωριστό είδος που ονομάστηκε Turnip yellows virus (TuYV) (Hauser et al., 2000). Εκτός από τα καλλιεργούμενα, είναι γνωστό ότι και τα άγρια είδη της οικογένειας Brassicaceae και ιδιαίτερα του γένους Brassica, αποτελούν ξενιστές για ιούς οι οποίοι αποτελούν παθογόνα μεγάλης οικονομικής σημασίας, ιδιαίτερα όταν μολύνουν καλλιέργειες οπωροκηπευτικών φυτών (Thurston et al., 2001). Σε αυτοφυή φυτά της οικογένειας Brassicaceae έχουν βρεθεί οι TuMV, CaMV, BWYV καθώς και οι Turnip yellow mosaic virus (TYMV), Τurnip crinkle virus (TCV) και Τurnip rosette virus (TRosV) (Raybould et al., 1999; Thurston et al., 2001; Pallett et al., 2002). Από τους ιούς του πίνακα 1.1, περισσότερο διαδεδομένοι είναι ο TuMV και ο CaMV και συχνά παρατηρούνται στις εύκρατες ζώνες της Αφρικής, της Ασίας, της Νέας Ζηλανδίας, των ΗΠΑ, του Ηνωμένου Βασιλείου και αρκετών άλλων χωρών της ΕΕ, σε περιοχές όπου αναπτύσσονται τα φυτά ξενιστές τους. Και οι δύο ιοί είναι 18

21 κοινοί σε καλλιεργούμενα φυτά, καθώς και στους άγριους πληθυσμούς διαφόρων ξενιστών τους. Όσον αφορά το εύρος των ξενιστών, ο CaMV έρχεται δεύτερος μετά τον TuMV με βάση τον αριθμό των ευπαθών κηπευτικών φυτών του γένους Brassica (Spense et al., 2007) και είναι ιδιαίτερα επίφοβος λόγω της ευρείας εξάπλωσής του στις εύκρατες περιοχές (Farzadfar et al., 2007). Οι ιοί TuMV και CaMV κρίνονται ιδιαίτερα σημαντικοί και αναλύονται στα παρακάτω κεφάλαια. 19

22 Πίνακας 1.1: Ιοί που μολύνουν φυτά της οικογένειας Brassicaceae. Δίνονται η οικογένεια, το γένος και ο τρόπος ή ο φορέας μετάδοσης για κάθε ιό. Οικογένεια Γένος Είδος Τρόπος Βιβλιογραφική Πηγή Μετάδοσης Potyviridae Potyvirus Turnip mosaic virus (TuMV) αφίδες Tomlinson et al., 1981; Markham et al., 1987; Hardwick et al., 1994; Ishimoto et al., 1990; Cho et al., 2002; Hunter et al., 2002; Shahraeen et al., 2003; Moreno et al., 2004; Spense et al., 2007; Kirino et al., 2008 Lettuce mosaic virus αφίδες Moreno et al., 2004; Nebreda et al., 2004 (LMV) Caulimoviridae Caulimovirus Cauliflower mosaic virus (CaMV) Luteoviridae Polerovirus Beet western yellows virus (BWYV) αφίδες Tomlinson et al., 1981; Markham et al., 1987; Hardwick et al., 1994; Hunter et al., 2002; Shahraeen et al., 2003; Moreno et al., 2004; Farzadfar et al., 2007; Spense et al., 2007 αφίδες Gilligan et al., 1980; Hardwick et al., 1994; Jay et al., 1999; Hunter et al., 2002; Shahraeen et al., 2003; Moreno et al., 2004 Turnip yellows virus (TuYV) Bromoviridae Cucumovirus Cucumber mosaic virus (CMV) Comoviridae Comovirus Τurnip ringspot virus (TuRSV) Radish mosaic virus (RaMV) Tombusviridae Carmovirus Τurnip crinkle virus (TCV) Bunyaviridae Tospovirus Tomato spotted wilt virus (TSWV) Rhabdoviridae Cytorhabdovirus Broccoli necrotic yellows virus (BNYV) Hauser et al., 2000 αφίδες Ishimoto et al., 1990; Cho et al., 2002; Shahraeen et al., 2003; Moreno et al., 2004; Kirino et al., 2008 σκαθάρια Rajakaruna et al., 2007; Koloniuk et al., 2008; Khandekar et al., 2009; Koloniuk et al., 2009 σκαθάρια Shahraeen et al., 2003; Komatsu et al., 2008 σκαθάρια Broadbent et al., 1958; Shahraeen et al., 2003 θρίπες Shahraeen et al., 2003; Moreno et al., 2004 αφίδες Tomlinson et al., 1981; Shahraeen et al.,

23 Πίνακας 1.1 (συνέχεια): Ιοί που μολύνουν φυτά της οικογένειας Brassicaceae. Δίνονται η οικογένεια, το γένος και ο τρόπος ή ο φορέας μετάδοσης για κάθε ιό. Οικογένεια Γένος Είδος Τρόπος Βιβλιογραφική Πηγή Μετάδοσης Geminiviridae Begomovirus Cabbage leaf curl αλευρώδεις Hill et al., 1998 virus (CLCV) _ Tobamovirus Tobacco mosaic virus (TMV) μηχανική μετάδοση Shahraeen et al., 2003 Ribgrass mosaic virus μηχανική Cho et al., 2002 (RMV) μετάδοση _ Tymovirus Turnip yellow mosaic σκαθάρια Broadbent et al., 1958; Shahraeen et al., 2003; Kirino et al., 2008 virus (TYMV) _ Sobemovirus Τurnip rosette virus (TRosV) μηχανική μετάδοση Broadbent et al., 1958; Shahraeen et al.,

24 1.2.1 Ιοί των Brassica στην Ελλάδα Στην Ελλάδα, σε φυτά της οικογένειας Brassicaceae και ιδιαίτερα σε είδη του γένους Brassica από τους παραπάνω ιούς έχει εντοπιστεί μόνο ο TuMV (Jenner κ.ά., 1994; Μπερμπάτη κ.ά., 2006). Ο TuMV, από τους πιο κοινούς και σοβαρούς ιούς, έχει βρεθεί στο λάχανο, το κουνουπίδι, τη βιολέτα, το χείρανθο, τη ρόκα (Jenner κ.ά., 1994; Walkey and Pink, 1988; Sanchez et al., 2003; Μπερμπάτη κ.ά., 2006; Sanchez et al., 2007), αλλά και σε αυτοφυή είδη της συγκεκριμένης οικογένειας (Μπερμπάτη κ.ά., 2006). Ελληνικά στελέχη του CaMV έχουν χρησιμοποιηθεί σε μελέτες ξένων ερευνητών (Al-Kaff et al., 1995). Λόγω του περιορισμένου εύρους των ξενιστών του ιού υποθέτουμε ότι τα στελέχη προέρχονταν από είδη της οικογένειας Brassicaceae. Ωστόσο, έως σήμερα δεν υπήρξε κάποια επίσημη καταγραφή ξενιστών του ιού στη χώρα μας Μικτές Μολύνσεις Σε πολλές περιπτώσεις φυτά βρίσκονται μολυσμένα με περισσότερους από έναν ιούς ταυτόχρονα. Αυτή η συνύπαρξη των ιών μπορεί να οδηγήσει σε απρόβλεπτες διακυμάνσεις στα συμπτώματα, στη μολυσματικότητα, στη συσσώρευση των ιικών σωματιδίων και στη μετάδοση με το φορέα (Martin et al., 2009). Ο TuMV αρκετά συχνά συνυπάρχει σε μικτές μολύνσεις με τον CaMV (Spense et al., 2007; Martin et al., 2009) καθώς και με τον BWYV, ενώ και οι τρεις ιοί μεταδίδονται με αφίδες-φορείς (Raybould et al., 1999; Walsh et al., 2002). Οι μικτές μολύνσεις είναι πολύ περισσότερο κοινές σε αυτοφυή φυτά σε σύγκριση με τα καλλιεργούμενα (Raybould et al., 1999; Moreno et al., 2004). Σε φυτά Brassica nigra (μαύρο σινάπι) έχουν βρεθεί να συνυπάρχουν μέχρι και έξι διαφορετικοί ιοί ταυτόχρονα (TuMV, CaMV, BWYV, TYMV, TCV και TRoV) (Thurston et al., 2001). Μικτές μολύνσεις με περισσότερους από έναν ιούς, μπορεί να οδηγούν σε συνεργιστικές δράσεις μεταξύ των ιών που εμπλέκονται και να έχουν αρνητική επίδραση στο φυτό-ξενιστή τους. Οι Walkey & Webb (1978) ανέφεραν ότι ενώ η ανάπτυξη εσωτερικών νεκρωτικών κηλίδων στις κεφαλές των αποθηκευμένων λάχανων σχετιζόταν με μόλυνση από τον TuMV και όχι από τον CaMV, μικτές μολύνσεις που περιλαμβάνουν και τους δύο ιούς προκαλούν πιο σοβαρά εξωτερικά συμπτώματα στα φυτά (Hunter et al., 2002; Spense et al., 2007) και έχουν πιο σοβαρές επιπτώσεις σε καλλιεργούμενα λάχανα στο χωράφι (Spense et al., 2007). Μικτές μολύνσεις μπορεί όμως να οδηγούν και σε ανταγωνιστικές δράσεις μεταξύ των εμπλεκομένων ιών με θετικό αποτέλεσμα στο φυτό-ξενιστή. Για παράδειγμα, ο BWYV φαίνεται να αλληλεπιδρά με τον TuMV, με αποτέλεσμα αποθηκευμένα φυτά λάχανου που είναι μολυσμένα και με τους δύο ιούς, να παρουσιάζουν μειωμένη συχνότητα εμφάνισης εξωτερικών συμπτωμάτων και να έχουν λιγότερη εσωτερική 22

25 νέκρωση στις κεφαλές τους σε σύγκριση με φυτά που έχουν προσβληθεί μόνο από τον TuMV. Επίσης, τα φυτά εκδηλώνουν και ηπιότερα συμπτώματα στα χωράφι (Hunter et al., 2002). Συνεργισμός μεταξύ δύο διαφορετικών ιών υπάρχει όταν σε μια μικτή μόλυνση ενισχύεται η μολυσματική ικανότητα του ενός ή και των δύο ιών. Ποικίλες λειτουργίες και χαρακτηριστικά του ιού μπορούν να ενισχυθούν ως αποτέλεσμα του συνεργισμού, όπως η μηχανική μετάδοση, το εύρος ξενιστών, η μετάδοση με το σπόρο, η εξειδίκευση στη μολυσματικότητα, η διακυτταρική μετακίνηση και η μετακίνηση σε μεγαλύτερες αποστάσεις μέσα στο φυτό, η μετάδοση με τους φορείς και ο τίτλος του ιού. Ορισμένες από αυτές όπως η επίδραση στη μολυσματικότητα, στην ταχύτητα με την οποία πραγματοποιείται η μόλυνση, στην ικανότητα και αποτελεσματικότητα μετάδοσης με το φορέα και στη μετάδοση με το σπόρο, κρίνονται βιολογικά πολύ σημαντικές. Ωστόσο, ο συνεργισμός δεν αποτελεί τον κανόνα στη φύση και πολλές είναι οι περιπτώσεις ανταγωνισμού μεταξύ των εμπλεκομένων ιών (Latham et al., 2008; Martin et al., 2009). Οι πιθανοί συνδυασμοί της αλληλεπίδρασης δύο ιών σε μια μικτή μόλυνση, όσων αφορά τις παραπάνω βιολογικές λειτουργίες, είναι οι εξής: 1) και οι δύο ιοί να ωφελούνται από την αλληλεπίδρασή τους, 2) και οι δύο ιοί να βλάπτονται, 3) ο ένας από τους δύο ιούς να ωφελείται και ο άλλος να μην επηρεάζεται και 4) ο ένας από τους δύο ιούς να βλάπτεται και ο άλλος να μην επηρεάζεται (Martin et al., 2009). 1.3 Η οικογένεια Caulimoviridae Η οικογένεια Caulimoviridae (φυτικοί παραρετροϊοί) περιλαμβάνει ιούς, οι οποίοι μολύνουν μόνο φυτά και ανήκουν σε έξι γένη. Οι ιοί της οικογένειας, ανάλογα με το γένος που ανήκουν, διαφέρουν ως προς το είδος του οργανισμού-φορέα με τον οποίο μεταδίδονται καθώς και στον τρόπο μετάδοσης (Πίνακας 1.2) (Hull et al., 2005). Το εύρος ξενιστών για τα περισσότερα είδη της οικογένειας είναι περιορισμένο καθώς στη φύση συνήθως μολύνουν φυτά που ανήκουν σε μια μόνο οικογένεια (Schoelz, 2008). Οι ιοί των γενών Petuvirus, Soymovirus και Cavemovirus περιορίζονται μόνο σε δικοτυλήδονα φυτικά είδη, οι ιοί του γένους Tungrovirus μολύνουν μονοκοτυλήδονα φυτικά είδη και οι ιοί του γένους Badnavirus μολύνουν τόσο δικοτυλήδονα όσο και μονοκοτυλήδονα φυτικά είδη (Hull et al., 2005). Το γεωγραφικό εύρος πολλών από τους ιούς της οικογένειας Caulimoviridae είναι μεγάλο και σχετίζεται με τις περιοχές που αναπτύσσονται τα φυτά-ξενιστές τους. Στην οικογένεια όμως υπάρχουν και ιοί που περιορίζονται μόνο σε μια πολύ μικρή γεωγραφική έκταση όπως ο Stilbocarpa mosaic bacilliform virus (SMBV) ο οποίος έχει βρεθεί μόνο σε ένα μικρό νησί μεταξύ της Τασμανίας και της Ανταρκτικής και θεωρείται ότι είναι ο ιός με τη μικρότερη γεωγραφική κατανομή (Schoelz, 2008). 23

26 Πίνακας 1.2: Τα γένη-μέλη της οικογένειας Caulimoviridae. Δίνονται ο οργανισμός-φορέας, ο τρόπος μετάδοσης και το τυπικό μέλος για κάθε γένος. Οικογένεια Caulimoviridae Γένος Οργανισμός-Φορέας Τρόπος μετάδοσης Caulimovirus Αφίδες Μη-έμμονος ή Ημι-έμμονος Petuvirus Δεν εντοπίστηκαν έντομα _ φορείς Soymovirus Δεν εντοπίστηκαν έντομα _ φορείς Cavemovirus Δεν εντοπίστηκαν έντομα _ φορείς Badnavirus Ψευδόκοκκοι, αφίδες Ημι-έμμονος ή Tungrovirus * Schoelz, 2008 Τζιτζικάκια με ταυτόχρονη παρουσία του RNA ιού RTSV Μη-έμμονος Τυπικό μέλος * Cauliflower mosaic virus (CaMV) Petunia vein clearing virus (PVCV) Soybean chlorotic mottle virus (SbCMV) Cassava vein mosaic virus (CsVMV) Commelina yellow mottle virus (CoYMV) Rice tungro bacilliform virus (RTBV) Τα περισσότερα είδη των γενών Tungrovirus και Badnavirus βρίσκονται κυρίως σε τροπικές ή υποτροπικές περιοχές με μερικά είδη να βρίσκονται σε εύκρατες και υπο- Ανταρκτικές περιοχές, ενώ τα περισσότερα είδη των γενών Petuvirus, Caulimovirus, Soymovirus και Cavemovirus βρίσκονται σε εύκρατες περιοχές (Hull et al., 2005). Κανένα από τα μέλη των γενών Caulimovirus, Petuvirus, Soymovirus και Cavemovirus δε μεταδίδεται με το σπόρο ή τη γύρη ενώ τα περισσότερα από αυτά μεταδίδονται μηχανικά με φυτικό εκχύλισμα στο εργαστήριο. Επιπλέον, όλοι μεταδίδονται μέσω του αγενούς πολλαπλασιασμού και με εμβολιασμό. Στο γένος Badnavirus κάποια είδη μεταδίδονται μηχανικά, ενώ ορισμένα μεταδίδονται με το σπόρο και τη γύρη. Ο μοναδικός ιός του γένους Tungrovirus, Rice tungro bacilliform virus (RTBV) δε μεταδίδεται μηχανικά ούτε μεταφέρεται με το σπόρο ή τη γύρη, ενώ εξαρτάται από έναν RNA ιό για τη μετάδοσή του (Hull et al., 2005) Χαρακτηριστικά των μελών της οικογένειας Caulimoviridae Τα ιοσωμάτια των ιών-μελών της οικογένειας Caulimoviridae είναι ισοδιαμετρικά ή βακιλόμορφα ανάλογα με το γένος στο οποίο ανήκουν, δε φέρουν φάκελο και βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα των μολυσμένων κυττάρων (Hull et al., 2005). Τα γένη Caulimovirus, Petuvirus, Soymovirus και Cavemovirus περιλαμβάνουν είδη που έχουν εικοσαεδρικά ιοσωμάτια (Εικόνα 1.4) διαμέτρου 43 έως 50 nm που βρίσκονται συνήθως μέσα στα άμορφα έγκλειστα σωματίδια των μολυσμένων κυττάρων (Hull et al., 2005). Τα μέλη των γενών Badnavirus και Tungrovirus έχουν βακιλόμορφα ιοσωμάτια (Εικόνα 1.4) με πλάτος 30 nm και μήκος που κυμαίνεται από nm (πιο συχνά 24

27 παρατηρούνται ιοσωμάτια με μήκος 130 nm) τα οποία δε σχετίζονται με τα έγκλειστα σωματίδια (Schoelz, 2008). Τα ιοσωμάτια των μελών της οικογένειας είναι πολύ σταθερά σε ph 4 έως 9 καθώς και σε υψηλές συγκεντρώσεις αλατότητας (Hull et al., 2005). Εικόνα 1.4: Ηλεκτρονική μικρογραφία του Cauliflower mosaic virus του γένους Caulimovirus (1-2) και των Cacao swollen shoot virus (3) και Yucca bacilliform virus (4-5) του γένους Badnavirus. Το νουκλεϊκό οξύ αποτελείται από ένα μόνο μόριο κυκλικού, δίκλωνου DNA (dsdna) μεγέθους kbp. Κάθε κλώνος του γονιδιώματος φέρει ασυνέχειες στην αλληλουχία του σε συγκεκριμένες θέσεις, με αποτέλεσμα να μην μπορεί να κλείσει ομοιοπολικά. Ο ένας κλώνος φέρει μια ασυνέχεια ενώ ο άλλος κλώνος φέρει μια έως τρεις ασυνέχειες (Hull et al., 2005). Οι ασυνέχειες αυτές είναι μέρος της στρατηγικής αναπαραγωγής των ιών της συγκεκριμένης οικογένειας (Schoelz, 2008). Τα γονιδιώματα των μελών της οικογένειας περιέχουν από ένα έως επτά ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (Open Reading Frames, ORFs) (ανάλογα με το γένος του ιού), τα οποία βρίσκονται μόνο πάνω στον ένα από τους δύο κλώνους του DNA, ο οποίος και αποτελεί την κωδική αλληλουχία. Η οργάνωση του γονιδιώματος εξαρτάται από το κάθε γένος και είναι ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά που διαχωρίζουν τα γένη μεταξύ τους (Hull et al., 2005) (Εικόνα 1.5). Η αντιγραφή του γονιδιώματος γίνεται μέσω της αντίστροφης μεταγραφής ενός ενδιάμεσου RNA (Schoelz, 2008). Οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από τους ιούς της οικογένειας και είναι κοινές για όλα τα γένη είναι η καψιδιακή πρωτεΐνη (CP), μία ασπαρτική πρωτεάση, μια αντίστροφη μεταγραφάση (reverse transcriptase, RT) και μια RNAse H. Δεν έχει αναφερθεί ύπαρξη λιπιδίων σε κανένα μέλος του γένους, ενώ ύπαρξη υδατανθράκων έχει αναφερθεί μόνο για τον Cauliflower mosaic virus (CaMV) του οποίου η CP είναι γλυκοζυλιωμένη (Hull et al., 2005). Τα περισσότερα είδη της οικογένειας μολύνουν τους περισσότερους τύπους κυττάρων των ξενιστών τους αν και μερικά είδη που ανήκουν στα γένη Tungrovirus και Badnavirus περιορίζονται μόνο στο αγγειακό σύστημα. Τα γένη της οικογένειας Caulimoviridae διαχωρίζονται σε δύο μεγάλες ομάδες με βάση τη μορφολογία των ιοσωματίων τους (ισοδιαμετρικά και βακιλόμορφα). Περαιτέρω τα γένη μπορούν να διαχωριστούν λαμβάνοντας υπόψη διαφορές στην 25

28 οργάνωση των γονιδιωμάτων (διευθέτηση και αριθμός των ORFs) και διαφορές στα νουκλεοτίδια ομόλογων γονιδίων όπως το γονίδιο της RT (Schoelz, 2008). Εικόνα 1.5: Οργάνωση των γονιδιωμάτων των τυπικών ιών-μελών για κάθε γένος. Τα τμήματα των ORFs ή του ORF που κωδικοποιούν μια πρωτεΐνη αντιπροσωπεύονται από ορθογώνια σε διαφορετικά χρώματα σύμφωνα με τις διαφορετικές λειτουργίες των γονιδίων (μπλε MP, κόκκινο CP και κίτρινο RT) Συμπτώματα Τα συμπτώματα που προκαλούνται από τους ιούς της οικογένειας Caulimoviridae ποικίλουν ανάλογα με το είδος του ιού, το είδος του ξενιστή και τις κλιματολογικές συνθήκες. Συνήθως προκαλούν χλώρωση, ραβδώσεις και μωσαϊκό έως νέκρωση (Schoelz, 2008). Συμπτώματα μωσαϊκού των φύλλων προκαλούν κυρίως μέλη των γενών Petuvirus, Caulimovirus, Soymovirus και Cavemovirus, ενώ στα είδη των γενών Tungrovirus και Badnavirus τα πιο συχνά συμπτώματα είναι η μεσονεύρια ποικιλοχλώρωση και οι μεσονεύριες χλωρωτικές ραβδώσεις (Hull et al., 2005). 1.4 Το γένος Caulimovirus Το γένος Caulimovirus ανήκει στην οικογένεια Caulimoviridae και έχει ως τυπικό είδος τον ιό του μωσαϊκού του κουνουπιδιού (Cauliflower mosaic virus, CaMV). Στο γένος έχουν ενταχθεί έως σήμερα 8 φυτικοί ιοί και άλλοι 4 είναι προσωρινά μέλη (Hull et al., 2005) Χαρακτηριστικά των Caulimo-ιών Τα ιοσωμάτια καθώς και τα κυτταροπλασματικά έγκλειστα των μελών του γένους Caulimovirus είναι όμοια με εκείνα των ειδών των γενών Soymovirus, Petuvirus και Cavemovirus αλλά διαφέρουν από αυτά στην οργάνωση του γονιδιώματος. 26

29 Τα ισοδιαμετρικά, εικασαεδρικά ιοσωμάτια είναι περίπου διαμέτρου 50 nm, με μια Τ=7 (420 υπομονάδες) πολυεπίπεδη δομή και απαντώνται στο κυτταρόπλασμα αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις και στον πυρήνα των μολυσμένων κυττάρων. Τα ιοσωμάτια που βρίσκονται στο κυτταρόπλασμα σχετίζονται με ηλεκτρονιακά-πυκνά πρωτεϊνούχα έγκλειστα σωματίδια που είναι προϊόν του ORF6, ενώ το προϊόν του ORF2 σχηματίζει ηλεκτρονιακά-λαμπερά έγκλειστα σωματίδια (Blanc, 2007). Τα έγκλειστα σωματίδια μπορούν να γίνουν ορατά με οπτικό μικροσκόπιο καθώς και με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (Εικόνα 1.6). Το κυκλικό DNA των Caulimo-ιών οργανώνεται σε επτά ORFs, εκ των οποίων τα έξι εκφράζουν πρωτεΐνες, ενώ το ORF7 φαίνεται ότι παίζει ρυθμιστικό ρόλο στη μετάφραση (Hull et al., 2005). Η μετάδοση από τις αφίδες απαιτεί την έκφραση δύο πρωτεϊνών από τον ιό (παράγοντες αφιδομετάδοσης), της P2 που κωδικοποιείται από το ORF2 και της P3 που κωδικοποιείται από το ORF3. Η P3 σχηματίζει ένα τετραμερές το οποίο προσδένεται στο ιοσωμάτιο και στο C-άκρο της P2. Η P2 είναι υπεύθυνη για την πρόσδεση αυτού του συμπλέγματος στην αφίδα, καθώς το N-άκρο της προσδένεται σε μια περιοχή στο πρόσθιο έντερο της αφίδας (Blanc, 2007; Schoelz, 2008) Επιδημιολογία Τα περισσότερα είδη του γένους Caulimovirus μεταδίδονται από περίπου 27 διαφορετικά είδη αφίδων με ημι-έμμονο τρόπο (Schoelz, 2008). Τα ιοσωμάτια προσλαμβάνονται ταχύτατα από τις αφίδες και μπορούν να μεταδοθούν αμέσως μετά την πρόσληψή τους, ενώ οι αφίδες-φορείς διατηρούν την ιοφόρο ικανότητα πέντε ώρες έως και τρεις ημέρες, αλλά δεν διατηρούνται μετά από έκδυση και δεν μεταβιβάζονται στους απογόνους τους (Blanc, 2007; Schoelz, 2008) Kριτήρια διαχωρισμού των ειδών-μελών του γένους Τα κριτήρια με τα οποία γίνεται ο διαχωρισμός των ειδών είναι τα εξής (Hull et al., 2005): Διαφορές στο εύρος των ξενιστών. Διαφορές μεγαλύτερες από 20% στην νουκλεοτιδική αλληλουχία της πολυμεράσης (RT + RNAse H). Διαφορές στην αλληλουχία των προϊόντων των γονιδίων. 27

30 1.5 Ο ιός του μωσαϊκού του κουνουπιδιού (Cauliflower mosaic virus, CaMV) Ο CaMV είναι το τυπικό μέλος του γένους Caulimovirus της οικογένειας Caulimoviridae (Haas et al., 2002; Koike et al., 2007). Απαντάται στις περισσότερες εύκρατες περιοχές του κόσμου (Koike et al., 2007) και αποτελεί έναν από τους πιο κοινούς και σημαντικούς ιούς που μολύνουν φυτά της οικογένειας Brassicaceae (Al- Kaff et al., 1995; Farzadfar et al., 2007). Ήταν ο πρώτος από τους φυτικούς ιούς που αποδείχθηκε από τον Shepherd το 1968 ότι το εικοσαεδρικό ιοσωμάτιό του περιέχει δίκλωνο DNA (dsdna) και ήταν επίσης ο πρώτος από τους φυτικούς ιούς που αλληλουχήθηκε ολόκληρο το γονιδίωμά του και κλωνοποιήθηκε σε πλασμίδια βακτηρίων με μολυσματική μορφή. Ο CaMV αρχικά χρησιμοποιήθηκε ως φορέας για τη μεταφορά μικρού μεγέθους γονιδίων σε φυτά (π.χ. γονίδιο ιντερφερόνης) και τη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών. Στη συνέχεια, βρέθηκε ότι ο υποκινητής 35S μπορεί να δρομολογήσει την έκφραση γονιδίων σε διαγονιδιακά φυτά και έτσι σήμερα αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο στην βιοτεχνολογία των φυτών (Haas et al., 2002; Schoelz, 2008) Χαρακτηριστικά του CaMV Τα ιοσωμάτια του CaMV είναι ισομετρικά με διάμετρο 53 nm και δεν φέρουν φάκελο (Εικόνα 1.7). Η σύστασή τους αποτελείται από 420 υπομονάδες καψιδιακής πρωτεΐνης οι οποίες οργανώνονται ακολουθώντας την Τ = 7 εικοσαεδρική συμμετρία (Haas et al., 2002). Το γονιδίωμα του CaMV αποτελείται από ένα κυκλικό, δίκλωνο μόριο DNA (dsdna) με μέγεθος της τάξεως των 8000 bp και περιέχει τρεις μονόκλωνες ασυνέχειες. Η μια ασυνέχεια βρίσκεται στον αρνητικής πολικότητας κλώνο του DNA και κατά σύμβαση αυτή είναι η αρχή του DNA. Άλλες δύο ασυνέχειες βρίσκονται στον θετικής πολικότητας κλώνο του DNA, η μια στη νουκλεοτιδική θέση και η δεύτερη περίπου στη νουκλεοτιδική θέση Το γονιδίωμα του ιού αποτελείται από επτά ORFs, τα οποία βρίσκονται τοποθετημένα στον αρνητικό κλώνο του DNA (Haas et al., 2002) (Εικόνα 1.8). H αντιγραφή του γονιδιώματος του ιού γίνεται μέσω της αντίστροφης μεταγραφής ενός ενδιάμεσου RNA όπως και με τους υπόλοιπους ιούς του γένους (Haas et al., 2002; Schoelz, 2008). Δύο μετάγραφα παράγονται από το γονιδιωματικό DNA του CaMV. Το 19S RNA χρησιμεύει ως mrna για την έκφραση της P6, ενώ το 35S RNA χρησιμεύει ως πρότυπο για την αντίστροφη μεταγραφή καθώς και ως ένα πολυκιστρονικό mrna για τα ORFs 1-5 (Haas et al., 2002; Schoelz, 2008). Η σύνθεση των γονιδιακών προϊόντων του CaMV πιθανώς συμβαίνει στην επιφάνεια των κυτταροπλασματικών έγκλειστων σωματιδίων (viroplasms) τα οποία 28

31 συντίθενται από την πρωτεΐνη P6 του ιού και αποτελούν ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της μόλυνσης των φυτικών κυττάρων από Caulimo-ιούς (Haas et al., 2002). Οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από το κάθε ORF, καθώς και οι λειτουργία τους περιγράφονται στον πίνακα 1.3. Εικόνα 1.8: Κυκλική και γραμμική απεικόνιση του γονιδιώματος του CaMV. Τα τμήματα των ORFs που κωδικοποιούν μια πρωτεΐνη αντιπροσωπεύονται από ορθογώνια σε διαφορετικά χρώματα σύμφωνα με τις διαφορετικές λειτουργίες των γονιδίων (μπλε MP, κόκκινο CP και κίτρινο RT). Πίνακας 1.3: Πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από τον CaMV και οι λειτουργίες τους (Haas et al., 2002; Hohn, 2008). ORF Ονομασία πρωτεΐνης Λειτουργίες πρωτεΐνης ORF1 P1, Πρωτεΐνη διακυτταρικής Απαραίτητη στη διακυτταρική μετακίνηση μετακίνησης (Movement protein, MOV) ORF2 ORF3 ORF4 P2, Παράγοντας αφιδομετάδοσης (Aphid transmission factor, ATF) P3, Πρωτεΐνη σχετιζόμενη με τα ιοσωμάτια (Virion-Associated protein, VAP) Καψιδιακή πρωτεΐνη (coat protein, CP) Απαιτείται για την αφιδομετάδοση (προσδένεται στο στιλέτο της αφίδας), πρωτεΐνη των ηλεκτρονιακά-λαμπερών έγκλειστων σωματιδίων (για τη μετάδοση από τις αφίδες, το C-άκρο της P2 αλληλεπιδρά φυσικά με το N-άκρο της P3) Απαιτείται για την αφιδομετάδοση (συνδέεται με το ιοσωμάτιο), παίζει ρόλο στη διακυτταρική μετακίνηση και τη μετακίνηση σε μεγαλύτερες αποστάσεις (Haas et al., 2002) Δομικό συστατικό των ιοσωματίων, καψιδιώνει το ιικό DNA 29

32 ORF5 POL Πολυπρωτεΐνη (ασπαρτική πρωτεϊνάση και αντίστροφη μεταγραφάση (RT) / RNaseH) ORF6 P6 πρωτεΐνη (Transactivator of Translation / Viroplasmin, TAV) Απαραίτητη για την αντιγραφή του ιικού γονιδιώματος, αποτελείται από μια πρωτεάση (Protease) και μια αντίστροφη μεταγραφάση (Reverse transcriptase, RT) μέρος της οποίας αποτελεί η RNaseH (ribonuclease H) Σημαντική πρωτεΐνη των κυτταροπλασματικών έγκλειστων σωματιδίων (viroplasms), λειτουργεί ως ενεργοποιητής της μετάφρασης των ORF1 ORF5 (translational transactivator, TAV) από το πολυκιστρονικό 35S RNA, καθορίζει την έκφραση των συμπτωμάτων και το εύρος των ξενιστών, εμπλέκεται στη μεταμεταγραφική σίγηση των γονιδίων (Agama et al., 2002) ORF7 Δεν βρέθηκαν πρωτεϊνικά προϊόντα Παίζει ρυθμιστικό ρόλο στην ευθυγράμμιση των ριβοσωμάτων για τη μετάφραση των γονιδιακών προϊόντων του CaMV Για τη μετάδοση του ιού από τις αφίδες, δημιουργείται ένα σύμπλεγμα το οποίο προσκολλάται σε ένα πρωτεϊνικό υποδοχέα που βρίσκεται στα στιλέτα των αφίδων. Αυτό το σύμπλεγμα απαρτίζεται με τη βοήθεια μιας ιικής βοηθητικής πρωτεΐνης, της P2 (Markham et al., 1987). Η P2 βοηθητική πρωτεΐνη του CaMV δεν φαίνεται να έχει άλλη λειτουργία εκτός από την βοήθεια στη μετάδοση του ιού, καθώς μεταλλάξεις που στερούνται την P2 είναι απολύτως μολυσματικές αλλά δεν μεταδίδονται με αφίδες (Blanc, 2007; Martiniere et al., 2009). Η πρωτεΐνη P3 του ιού έχει επίσης ρόλο βοηθητικής πρωτεΐνης και είναι απαραίτητη στην αφιδομετάδοση. Οι δύο πρωτεΐνες δρουν ως γέφυρες μεταξύ των ιοσωματίων και της επιδερμίδας της αφίδας. Η P2 συνδέεται από τη μια με το στιλέτο της αφίδας και από την άλλη με την πρωτεΐνη P3 η οποία είναι συνδεδεμένη με το ιοσωμάτιο (Εικόνα 1.9). Πολλές είναι οι υποθέσεις σχετικά με το που δημιουργείται το σύμπλεγμα P2-P3- ιοσωμάτιο με την επικρατέστερη να είναι αυτή που υιοθετεί ότι δημιουργείται στα στοματικά μόρια του φορέα και όχι στα φυτικά κύτταρα όπως αρχικά εικαζόταν. Εκεί η P2 συνδέεται με το σύμπλεγμα P3-ιοσωμάτιο κατά τη διάρκεια της τροφικής δραστηριότητας της αφίδας (Palacios et al., 2002; James and Perry, 2004; Blanc, 2007; Brault et al., 2010). Εικόνα 1.9: Το σύμπλεγμα του CaMV. Η ιική πρωτεΐνη P2 προσδένεται με τον υποδοχέα, που βρίσκεται στην επιδερμίδα στο εσωτερικό του πεπτικού σωλήνα, μέσα στο στιλέτο του φορέα και με την πρωτεΐνη P3, η οποία είναι στενά συνδεδεμένη με το ιοσωμάτιο. Στο ένθετο φαίνεται η διανομή της P3 (σκούρο γκρι) στην εξωτερική επιφάνεια του ιοσωματίου (ανοιχτό γκρι). 30

33 1.5.2 Συμπτώματα Η μόλυνση με τον CaMV προκαλεί ποικίλα συμπτώματα, όπως χλώρωση, μωσαϊκό, διαφάνεια των νεύρων και ανάσχεση της ανάπτυξης (Haas et al., 2002; Farzadfar et al., 2007). Τα συμπτώματα εξαρτώνται από το στέλεχος του ιού, τον ξενιστή και τις περιβαλλοντικές συνθήκες (Al-Kaff et al., 1995; Haas et al., 2002). Σε νεαρά φυτά ο ιός συνήθως προκαλεί διαφάνεια των νευρώσεων και ανάσχεση της ανάπτυξης ενώ κάποιες φορές μπορεί να παρατηρηθεί και σχηματισμός γλωσσιδίων στα φύλλα (Koike et al., 2007). Στα ώριμα φυτά κουνουπιδιού τα συνήθη συμπτώματα που εμφανίζονται μετά από μόλυνση με τον CaMV είναι περινεύριος μεταχρωματισμός με σκούρες πράσινες περιοχές κοντά στα νεύρα και χλωρωτικές κηλίδες στο μεσονεύριο ιστό των φύλλων (Εικόνα 1.10). Στο μπρόκολο στα συνήθη συμπτώματα συγκαταλέγονται το μωσαϊκό και ο περινεύριος μεταχρωματισμός με σκούρες πράσινες περιοχές κοντά στα νεύρα (Farzadfar et al., 2007) (Εικόνα 1.10). Στο λάχανο ο ιός προκαλεί διάχυτη ποικιλοχλώρωση με μια ευδιάκριτη διαφάνεια των νευρώσεων (Εικόνα 1.10) σε θερμοκρασίες 28 C ή περινεύριο χλωρωτικό μεταχρωματισμό σε χαμηλότερες θερμοκρασίες (20 C) και οδηγεί σε σημαντική μείωση της απόδοσης (Hunter et al., 2002). Ο CaMV δεν έχει αναφερθεί να εμπλέκεται άμεσα σε διαταραχές των αποθηκευμένων λάχανων αλλά μπορεί να επιδεινώσει τα προβλήματα που προκαλούν άλλοι ιοί. Σε καλλιέργειες σποροπαραγωγής η άνθιση των φυτών μπορεί να παρεμποδίζεται (Farzadfar et al., 2007), τα άνθη μπορεί να είναι παραμορφωμένα και να εμφανίσουν μαύρες κηλίδες στους μίσχους και τους λοβούς (Koike et al., 2007), ενώ η απόδοση σε σπόρο είναι χαμηλή (Farzadfar et al., 2007). Τα λάχανα Βρυξελλών επιδεικνύουν αρκετά ήπια συμπτώματα και τα προσβεβλημένα φυτά μπορούν να διακριθούν από το ήπιο πράσινο χρωματισμό που αποκτούν. Στο κινέζικο λάχανο η λεύκανση των νευρώσεων βρίσκεται σε ολόκληρο το φύλλο και η μόλυνση με τον ιό μπορεί να οδηγεί σε πρόωρη γήρανση του φυτού. Τα εσωτερικά φύλλα δείχνουν εμφανή ανοιχτόχρωμη και σκούρα πράσινη μεσονεύρια ποικιλοχλώρωση (Koike et al., 2007). Επίσης, συνηθισμένα συμπτώματα είναι η παραμόρφωση και η τραχύτητα των φύλλων, καθώς και η ανάσχεση της ανάπτυξης του φυτού (Farzadfar et al., 2007) (Εικόνα 1.10). Στην περίπτωση των φυτών του γένους Brassica, ορισμένα είδη όπως το λάχανο kohlrabi (Brassica oleracea var. gongylodes) είναι γνωστό για την πλήρη ανάρρωση του μετά την προσβολή από τον ιό και αφού προηγουμένως είχαν αναπτυχτεί διασυστηματικά συμπτώματα (Haas et al., 2002; Al-Kaff et al., 1995). Στις περισσότερες περιπτώσεις ο ιός προκαλεί μόνο ήπια συμπτώματα, όμως σποραδικά μπορούν να συμβούν και απώλειες στην απόδοση από 20-50% (Koike et al., 31

34 2007) καθώς μπορεί εύκολα να υπερβεί σε ποσοστό μόλυνσης το 70% (Farzadfar et al., 2007). Εικόνα 1.10: Συμπτώματα που σχετίζονται με μόλυνση φυτών στη φύση από τον CaMV. A) Περινεύριος μεταχρωματισμός με σκούρες πράσινες περιοχές κοντά στα νεύρα και διαφάνεια των νευρώσεων σε κουνουπίδι, B) Μωσαϊκό και περινεύριος μεταχρωματισμός με σκούρες πράσινες περιοχές κοντά στα νεύρα σε μπρόκολο, C) Παραμόρφωση και τραχύτητα φύλλων, ανάσχεση της ανάπτυξης και διαφάνεια των νευρώσεων σε κινέζικο λάχανο, D) Παραμόρφωση και κιτρίνισμα των νευρώσεων σε λάχανο. Ορισμένα στελέχη του CaMV είναι ικανά να μολύνουν εκτός από φυτά της οικογένειας Brassicaceae, και ορισμένα είδη της οικογένειας Solanaceae. Ανάλογα με το φυτικό είδος, κάποια από τα στελέχη αυτά μπορούν να υπερβαίνουν την άμυνα του ξενιστή και να προκαλούν διασυστηματική μόλυνση, ενώ άλλα να προκαλούν μια αντίδραση υπερευαισθησίας. Για παράδειγμα, το στέλεχος W260 προκαλεί διασυστηματικό θάνατο των κυττάρων στο Νicotiana clevelandii αμέσως μετά την έναρξη των συμπτωμάτων μωσαϊκού, αλλά προκαλεί αντίδραση υπερευαισθησίας στο Ν. edwarsonii (Al-Kaff et al., 1995; Haas et al., 2002) Ξενιστές Ο CaMV έχει ένα αρκετά περιορισμένο εύρος ξενιστών καθώς συνήθως περιορίζεται σε φυτά της οικογένειας Cruciferae, δηλαδή κυρίως είδη του γένους Brassica. Στους πίνακες 1.4 και 1.5 αναφέρονται αντίστοιχα καλλιεργούμενα και αυτοφυή φυτάξενιστές του ιού που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae. Ορισμένα στελέχη του ιού μολύνουν και φυτά της οικογένειας Solanaceae, κυρίως είδη των γενών Datura και Nicotiana (Haas et al., 2002; Farzadfar et al., 2007). Πίνακας 1.4: Καλλιεργούμενα φυτά-ξενιστές του CaMV που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae. Ξενιστές του CaMV που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae (καλλιεργούμενα) Είδος Κοινή ονομασία Brassica oleracea var. botrytis Κουνουπίδι (Moreno et al., 2004; Farzadfar et al., 2005; Farzadfar et al., 2007) Brassica oleracea var. acephala Λαχανίδα (Farzadfar et al., 2005; Farzadfar et al., 2007; Spense et al., 2007) Brassica oleracea var. capitata conv. alba Άσπρο λάχανο (Farzadfar et al., 2007) B. oleracea var. capitata conv. rubra Κόκκινο λάχανο (Moreno et al., 2004) Brassica oleracea var. capitata Λάχανο (Moreno et al., 2004; Farzadfar et al., 2005) 32

35 Brassica. oleracea var. italica Μπρόκολο (Moreno et al., 2004; Farzadfar et al., 2005; Farzadfar et al., 2007) Brassica rapa ssp. pekinensis ή Brassica Κινέζικο Λάχανο (Farzadfar et al., 2007) pekinensis Brassica rapa Γογγυλοκράμβη ή γογγύλι (Farzadfar et al., 2005; Farzadfar et al., 2007) Brassica oleracea var. gongylodes Ραφανοκράμβη (Farzadfar et al., 2007) Raphanus sativus Ρεπάνι (Farzadfar et al., 2007) Brassica napus Νάπα ή ρέβα (Farzadfar et al., 2007) Brassica napus var. oleifera Ελαιοκράμβη (Hardwick et al., 1994; Shahraeen et al., 2003) Brassica juncea Σινάπι, Μουστάρδα (Shahraeen et al., 2003) Brassica oleracea var. gemmifera Λάχανο Βρυξελλών (Tomlinson et al., 1981) Πίνακας 1.5: Αυτοφυή φυτά-ξενιστές του CaMV που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae. Ξενιστές του CaMV που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae (αυτοφυή) Είδος Κοινή ονομασία Rapistrum rugosum Ράπιστρο (Farzadfar et al., 2007) Raphanus raphanistrum Ραφανίδα (Farzadfar et al., 2007) Sisymbrium loeselii Σισύμπριο (Farzadfar et al., 2007) Brassica campestris Αγριολάχανο (Farzadfar et al., 2007) Raphanus maritimus ή Raphanus - (Shahraeen et al., 2003) raphanistrum ssp. maritimus Brassica nigra Σινάπι το μαύρο (Thurston et al., 2001) Brassica rapa ssp. sylvestris ή Brassica Άγριο γογγύλι (Pallett et al., 2002) campestris Brassica oleracea Άγριο λάχανο (Raybould et al., 1999) Τρόπος Μετάδοσης - Επιδημιολογία Στη φύση ο CaMV μεταδίδεται με ημι-έμμονο τρόπο (υποκεφάλαιο 1.9) (Martiniere et al., 2009) από αφίδες φορείς σύμφωνα με τη στρατηγική της βοηθητικής πρωτεΐνης (Haas et al., 2002; Palacios et al., 2002; Blanc, 2007; Farzadfar et al., 2007). Η στρατηγική αυτή συνεπάγεται ότι η βοηθητική πρωτεΐνη (helper component, HC), μια μη-δομική ιική πρωτεΐνη, μεσολαβεί στην αλληλεπίδραση για την προσκόλληση και ως εκ τούτου για τη διατήρηση των ιικών σωματιδίων στην επιδερμίδα του στιλέτου της αφίδας (Palacios et al., 2002; Blanc, 2007). Αρχικά πίστευαν πως ο CaMV είναι ένας μη τυπικός, μη-έμμονα μεταδιδόμενος ιός ή ένας ιός που μεταδίδεται και με τους δύο τρόπους, όμως οι Markham et al. (1987) απέδειξαν ότι ανήκει στους ημι-έμμονους ιούς. Η αποτελεσματικότητα μετάδοσης του CaMV ποικίλη ανάλογα με το χρόνο πρόσληψης (Markham et al., 1987). Οι αφίδες μπορούν να προσλάβουν τον ιό από ιστούς που δεν βρίσκονται στο φλοίωμα μέσα σε 1-2 λεπτά και να τον μεταδώσουν αμέσως (Palacios et al., 2002; Koike et al., 2007). Ωστόσο, η πιθανότητα πρόσληψης αυξάνεται σημαντικά όταν οι αφίδες διατρέφονται στο φλοίωμα. 33

36 Ο CaMV μεταδίδεται με 27 είδη αφίδων (Farzadfar et al., 2007) και ιδιαίτερα από τα είδη Myzus persicae και Brevicoryne brassicae οι οποίες αποικίζουν τα σταυρανθή (Markham et al., 1987; Palacios et al., 2002; Farzadfar et al., 2007) (Εικόνα 1.11). Ο CaMV δεν μεταδίδεται από οποιοδήποτε άλλο είδος φορέα, με το σπόρο ή τη γύρη (Farzadfar et al., 2007), ενώ υπάρχουν ορισμένες απομονώσεις του ιού που δεν μεταδίδονται με αφίδες (Farzadfar et al., 2007). Ο ιός δεν μεταδίδεται μηχανικά στον αγρό αν και μεταδίδεται εύκολα μηχανικά στο εργαστήριο (Haas et al., 2002). Εικόνα 1.11: Αφίδες φορείς του CaMV του είδους Myzus persicae (Α,Β) και του είδους Brevicoryne brassicae (C, D) Διαχωρισμός στελεχών του CaMV Τα στελέχη του CaMV διαφοροποιούνται με βάση τις αντιδράσεις ορισμένων φυτοδεικτών, όπως οι Brassica rapa, B. oleracea var. gongylodes και κάποια είδη της οικογένειας Solanaceae. Επίσης, διαφοροποίηση των στελεχών μπορεί να γίνει και με αλληλούχιση των νουκλεοτιδίων του γονιδίου που εμπεριέχεται στο ORF6, δηλαδή του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη P6, σημαντική πρωτεΐνη των κυτταροπλασματικών έγκλειστων σωματιδίων (viroplasms). Το συγκεκριμένο ORF χαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα διαφοροποίησης σε σύγκριση με τα άλλα ORFs του ιού και για αυτό το λόγο χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό διαφορετικών στελεχών (Farzadfar et al., 2007). 1.6 Η οικογένεια Potyviridae Η οικογένεια Potyviridae περιλαμβάνει έξι γένη και αποτελεί την πολυπληθέστερη οικογένεια φυτικών ιών, ορισμένοι από τους οποίους είναι οικονομικά πολύ σημαντικοί (Ohshima et al., 2002). Ιοί μέλη της οικογένειας προσβάλουν και προκαλούν σημαντικές ζημιές σε καλλιέργειες σιτηρών, ψυχανθών, λαχανικών, φρούτων, καλλωπιστικών καθώς και φυτών που προορίζονται για ζωοτροφές (Lopez-Moya et al., 2008). Τα γένη διαφοροποιούνται μεταξύ τους με βάση βιολογικά και μοριακά κριτήρια. Ιοί που ανήκουν σε διαφορετικό γένος, μεταδίδονται με διαφορετικό οργανισμό-φορέα. Στον πίνακα 1.6 φαίνονται τα γένη-μέλη της οικογένειας, το είδος του οργανισμούφορέα και ο τρόπος που μεταδίδονται οι ιοί-μέλη του κάθε γένους (Berger et al., 2005). 34

37 Πίνακας 1.6: Τα γένη-μέλη της οικογένειας Potyviridae. Δίνονται ο οργανισμός-φορέας, ο τρόπος μετάδοσης και το τυπικό μέλος για κάθε γένος. Οικογένεια Potyviridae Γένος Οργανισμός-Φορέας Τρόπος μετάδ. Τυπικό μέλος * Potyvirus Αφίδες Μη-έμμονος Potato virus Y (PVY) Ipomovirus Αλευρώδεις Μη-έμμονος Sweet potato mild mottle virus (SPMMV) Macluravirus Αφίδες Μη-έμμονος Maclura mosaic virus (MacMV) Rymovirus Ακάρεα Οικ. Eriophyidae Ημι-έμμονος Ryegrass mosaic virus (RyMV) (Abacarus sp.) Tritimovirus Ακάρεα Οικ. Eriophyidae Ημι-έμμονος Wheat streak mosaic virus (WSMV) (Aceria sp.) Bymovirus Μύκητας (Polymyxa Έμμονος Barley yellow mosaic virus (BYMV) graminis) * Lopez-Moya et al., Χαρακτηριστικά των μελών της οικογένειας Potyviridae Τα ιοσωμάτια των μελών της οικογένειας Potyviridae είναι εύκαμπτα, νηματοειδή, πλάτους nm και μήκους που εξαρτάται ανάλογα με το γένος (Εικόνα 1.12). Τα γένη Potyvirus, Ipomovirus, Macluravirus, Rymovirus και Tritimovirus έχουν ιοσωμάτια μήκους nm και μονομερές γονιδίωμα, ενώ το γένος Bymovirus έχει διμερές γονιδίωμα το οποίο εμπεριέχεται σε ιοσωμάτια μήκους και nm. Εικόνα 1.12: Ηλεκτρονική μικρογραφία των ραβδόμορφων ιικών σωματιδίων (Α) του Potato virus Y, PVY (Potyvirus) και (B) του Barley yellow mosaic virus, BaYMV (Bymovirus). Οι ιοί-μέλη των πέντε πρώτων γενών έχουν ένα θετικής πολικότητας μόριο ssrna μεγέθους kb, ενώ το νουκλεϊκό οξύ των ιών του γένους Bymovirus αποτελείται από δύο θετικής πολικότητας μόρια ssrna (RNA-1 και RNA-2) με το πρώτο να κυμαίνεται σε μέγεθος στα kb και το δεύτερο στα kb (Εικόνα 1.13). Το νουκλεϊκό οξύ όλων των μελών της οικογένειας συνδέεται στο 5 άκρο του με την πρωτεΐνη VPg, ενώ στο 3 άκρο φέρει πολυαδενική ουρά. Τα ιοσωμάτια δομούνται από ένα τύπο καψιδιακής πρωτεΐνης που είναι της τάξεως των kda. Το μοναδικό ORF του γονιδιώματος εκφράζεται μέσω της στρατηγικής της πολυπρωτεΐνης 35

38 ( kda), η οποία διασπάται και δίνει αρκετές πρωτεΐνες κάποιες από τις οποίες σχηματίζουν χαρακτηριστικά κυλινδρικά έγκλειστα σωματίδια (CI) στο κυτταρόπλασμα των μολυσμένων κυττάρων (Berger et al., 2005). Εικόνα 1.13: Οργάνωση του γονιδιώματος μελών (α) του γένους Potyvirus και (β) του γένους Bymovirus, της οικογένειας Potyviridae. Φαίνεται η θέση του κάθε γονιδιακού προϊόντος στην πολυπρωτεΐνη καθώς και οι θέσεις τομής της (βέλη) Κριτήρια ένταξης στην οικογένεια Potyviridae Τα κριτήρια με τα οποία γίνεται η ένταξη των μελών στην οικογένεια Potyviridae είναι τα εξής (Lopez-Moya et al., 2008): 1. Ιδιότητες των ιοσωματίων: μακριά, νηματοειδή, εύκαμπτα ιοσωμάτια. 2. Κυτταροπαθολογικές εκδηλώσεις (manifestations): παρουσία χαρακτηριστικών κυλινδρικών έγκλειστων σωματιδίων στο κυτταρόπλασμα των μολυσμένων κυττάρων. 3. Δομή του γονιδιώματος και στρατηγική έκφρασης: θετικής πολικότητας, μονόκλωνο RNA γονιδίωμα που φέρει την πρωτεΐνη VPg στο 5 άκρο και πολυαδενική ουρά στο 3 άκρο και μεταφράζεται ως μια μεγάλη πολυπρωτεΐνη. 1.7 Το γένος Potyvirus Το γένος Potyvirus ανήκει στην οικογένεια των φυτικών ιών Potyviridae και αποτελεί το μεγαλύτερο γένος των φυτικών ιών (Ohshima et al., 2002). Περιλαμβάνει περισσότερους από 100 ιούς, ενώ άλλοι τόσοι είναι προσωρινά μέλη (Berger et al., 2005). 36

39 Τα μέλη του γένους συνήθως έχουν περιορισμένο εύρος ξενιστών, όμως υπάρχουν και ιοί-μέλη που προσβάλουν φυτικά είδη που ανήκουν σε περισσότερες από 30 φυτικές οικογένειες (Berger et al., 2005). Οι ιοί του γένους μεταδίδονται και εξαπλώνονται στη φύση με αφίδες με μη-έμμονο τρόπο, ενώ στο εργαστήριο μεταδίδονται και μηχανικά με φυτικό εκχύλισμα. Ορισμένοι ιοί μεταδίδονται και με το σπόρο (Berger et al., 2005). Ο ιός Υ της πατάτας (Potato virus Y, PVY) είναι το τυπικό μέλος του γένους (Berger et al., 2005) Χαρακτηριστικά των Poty-ιών Τα ιοσωμάτια των ιών του γένους Potyvirus είναι εύκαμπτα, νηματοειδή, με μήκος που κυμαίνεται από nm και πλάτος από nm, παρουσιάζουν ελικοειδή συμμετρία και δεν φέρουν φάκελο (Εικόνα 1.14). Τα καψομερή που δομούν την καψιδιακή πρωτεΐνη των ιοσωματίων αποτελούνται από μια πρωτεΐνη μεγέθους kda. Ύπαρξη λιπιδίων ή υδατανθράκων δεν έχει αναφερθεί για κανένα μέλος του γένους. Εικόνα 1.14: (Αριστερά) Σχηματικό διάγραμμα ενός ιοσωματίου του γένους Potyvirus. Το N-άκρο ~30 aa (μεγάλο ορθογώνιο) και το C-άκρο ~19 aa (μικρό ορθογώνιο) των μορίων της CP, βρίσκονται εκτεθειμένα στην επιφάνεια των ιοσωματίων. (Δεξιά) Ηλεκτρονική μικρογραφία ιοσωματίων μιας απομόνωσης του Plum pox virus. Η μπάρα αντιπροσωπεύει 200 nm. Το γονιδίωμα είναι ένα γραμμικό, μονόκλωνο μόριο RNA (ssrna) θετικής πολικότητας και το μέγεθός του είναι περίπου της τάξεως των 9.7 kb. Το γενωμικό RNA φέρει πολύ-α ουρά στο 3 άκρο του και μια VPg (genome-linked viral protein) πρωτεΐνη, μεγέθους 24 kda είναι συνδεδεμένη ομοιοπολικά στο 5 άκρο του γονιδιώματος. Η αντιγραφή του ιικού RNA πραγματοποιείται μέσω της παραγωγής ενός πλήρους μήκους, αρνητικής πολικότητας RNA. Οι γενετικές πληροφορίες, που κωδικοποιούνται από το RNA γονιδίωμα των Potyιών, είναι οργανωμένες σε ένα μόνο ORF (Εικόνα 1.15). Η μετάφρασή του αρχικά δίνει μια πολυπρωτεΐνη (~3000 aa), η οποία στη συνέχεια υφίσταται συ- και μεταμεταφραστικές μεταποιήσεις από τρεις κωδικοποιημένες από τον ιό πρωτεϊνάσες, οι οποίες τη διασπούν σε 10 δομικές και μη δομικές πρωτεΐνες (Πίνακας 1.7). Αρκετές από τις πρωτεΐνες αυτές είναι υπεύθυνες για το σχηματισμό έγκλειστων σωματιδίων στα φυτικά κύτταρα κατά τη διάρκεια της μόλυνσης (Berger et al., 2005). 37

40 Εικόνα 1.15: Το γραμμικό, μονόκλωνο RNA (ssrna) και η οργάνωση του γονιδιώματος των ιών του γένους Potyvirus. P1 (30-60 kda): πρωτεϊνάση υπεύθυνη για τη διάσπαση της ένωσης P1-HC, HC-Pro (56 kda): βοηθητική πρωτεΐνη αφιδομετάδοσης (helper component), P3 (40 kda): πρωτεΐνη που παίζει ρόλο στην ένταση των συμπτωμάτων και στον καθορισμό του εύρους των ξενιστών, 6K1 (6 kda): απαραίτητη για την αναπαραγωγή του ιού, CI (70 kda): πρωτεΐνη κυλινδρικών έγκλειστων σωματιδίων, 6K2 (6 kda): πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην αναπαραγωγή του ιού, στη μετακίνηση και στην πρόκληση των συμπτωμάτων, NIa (28 kda): πρωτεϊνάση υπεύθυνη για τη διάσπαση των ενώσεων P3/6K1, 6K1/CI, CI/6K2, 6K2/VPg, VPg/NIa-Pro, NIa-Pro/NIb, NIb/CP το N-άκρο της είναι η VPg (21 kda): πρωτεΐνη που συνδέεται στο 5 άκρο του ιικού RNA, NIb (58 kda): πολυμεράση, CP (30-36 kda): καψιδιακή πρωτεΐνη. Πίνακας 1.7: Πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από ιούς του γένους Potyvirus και οι λειτουργίες τους. Αναφέρονται με τη σειρά που εμφανίζονται στην πολυπρωτεΐνη (από το N- στο C- άκρο) (Ward et al., 1995; Adams et al., 2005; Berger et al., 2005). Ονομασία πρωτεΐνης 1. Πρωτεΐνη P1 (P1- protease) 2. Βοηθητική πρωτεΐνη (helper component, HC- Pro) 3. Πρωτεΐνη P3 (protein 3, P3) Λειτουργίες πρωτεΐνης Πολυλειτουργική πρωτεΐνη, το C- άκρο της είναι μια πρωτεϊνάση υπεύθυνη για τη διάσπαση της ένωσης P1- HC, η λειτουργία του N- άκρου της είναι ακόμα άγνωστη, παίζει ρόλο στην ενίσχυση του ιικού γονιδιώματος (Lopez-Moya et al., 2008) Πολυλειτουργική πρωτεΐνη: 1) απαιτείται για τη μετάδοση με αφίδες, 2) το C- άκρο της είναι μια πρωτεϊνάση (υπεύθυνη για τη διάσπαση της ένωσης HC-Pro/P3), 3) το C- και πιθανά το N- άκρο της διαδραματίζουν ρόλο στη διακυτταρική μετακίνηση (Rojas et al., 1997) αλλά και στη μετακίνηση σε μεγαλύτερες αποστάσεις μέσα στο φυτό, 4) δρα ως καταστολέας της μετα-μεταγραφικής σίγησης των γονιδίων (Kasschau et al., 2001; Blanc, 2007) Παίζει ρόλο στην ένταση των συμπτωμάτων (Walsh et al, 2006) και στον καθορισμό του εύρους των ξενιστών (Lopez-Moya et al., 2008) 4. 6K1 Απαραίτητη για την αναπαραγωγή του ιού (Merits et al., 2002) 5. Πρωτεΐνη κυλινδρικών έγκλειστων σωματιδίων (cylindrical inclusion protein, CI) Παίζει ρόλο στην αντιγραφή του RNA, φαίνεται να είναι μια ελικάση, τα κυλινδρικά έγκλειστά σωματίδια που παράγονται στο κυτταρόπλασμα είναι χαρακτηριστικά του γένους 6. 6K2 Εμπλέκεται στην αναπαραγωγή του ιού, στη μετακίνηση και στην πρόκληση των συμπτωμάτων (Tomimura et al., 2004; Lopez-Moya et al., 2008) 7. Πρωτεΐνη συνδεδεμένη στο ιικό γονιδίωμα (genome-associated protein,vpg) Συνδέεται ομοιοπολικά στο 5 άκρο του ιικού RNA και δρα ως εκκινητής για την αντιγραφή του, αποτελεί καθοριστικό παράγοντα παθογένειας και παίζει ρόλο στη μετακίνηση σε μεγάλες αποστάσεις μέσα στο φυτό (Tomitaka et al., 2007; Lopez-Moya et al., 2008) 38

41 8. Πρωτεΐνη μικρών πυρηνικών έγκλειστων (small nuclear inclusion protein, NIa) 9. Πρωτεΐνη μεγάλων πυρηνικών έγκλειστων (large nuclear inclusion protein, NIb) 10. Καψιδιακή πρωτεΐνη (coat protein, CP) Παίζει ρόλο στην αντιγραφή του RNA, το C- άκρο της είναι πρωτεϊνάση (υπεύθυνη για τη διάσπαση όλων των υπολοίπων ενώσεων πέραν των P1-HC και HC-Pro/P3, δηλαδή των P3/6K1, 6K1/CI, CI/6K2, 6K2/VPg, VPg/NIa-Pro, NIa-Pro/NIb, NIb/CP), σχηματισμός πυρηνικών έγκλειστων σωματιδίων, το N- άκρο της αποτελεί την VPg Πολυμεράση (RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) υπεύθυνη για τον πολλαπλασιασμό του ιού, σχηματισμός πυρηνικών έγκλειστων σωματιδίων Πολυλειτουργική πρωτεΐνη, κύριο δομικό συστατικό των ιοσωματίων, καψιδιώνει το ιικό RNA, εμπλέκεται στη μετάδοση με το φορέα, διαδραματίζει ρόλο στη διακυτταρική μετακίνηση και στη μετακίνηση σε μεγαλύτερες αποστάσεις μέσα στο φυτό (Rojas et al., 1997), επίσης μπορεί να επηρεάζει την εξειδίκευση ως προς τον ξενιστή, τη μόλυνση και τη σταυροειδή προστασία Για τη μετάδοση των ιών από τις αφίδες απαιτείται η έκφραση μιας μη δομικής βοηθητικής πρωτεΐνης, της HC-Pro (Markham et al., 1987; Powell, 2005), η οποία είναι παρούσα στα μολυσμένα φυτά ταυτόχρονα με τα ιοσωμάτια (Εικόνα 1.16). Επίσης, για τη μετάδοση με αφίδες βασική είναι και η ύπαρξη μιας συγκεκριμένης τριπλέτας αμινοξέων στη CP [π.χ. η DAG (aspartic acid - alanine - glycine) για μερικούς Poty-ιούς] (Blanc, 2007), όπως αποδεικνύεται μέσα από πειράματα με στελέχη ιών του γένους Poty- που έχασαν την ικανότητα μετάδοσης με αφίδες ύστερα από μετάλλαξη σε περιοχή του γονιδιώματος που κωδικοποιεί τμήμα της CP (Atreya et al., 1990; Blanc et al., 1997). Εικόνα 1.16: Η βοηθητική πρωτεΐνη HC-Pro, απαραίτητη στη μετάδοση με το φορέα ιών του γένους Potyvirus Επιδημιολογία Η εξάπλωση των Poty-ιών συνδέεται άμεσα με την παρουσία των αφίδων-φορέων τους με τις οποίες μεταδίδονται με μη-έμμονο τρόπο. Μεταδίδονται τόσο με αποικίζοντα όσο και με μη-αποικίζοντα είδη. Ωστόσο, οι μεταναστευτικές, πτερωτές μορφές αφίδων (alates) οι οποίες δεν αποικίζουν την καλλιέργεια αλλά μετακινούνται 39

42 από φυτό σε φυτό προς αναζήτηση του ξενιστή τους μπορεί να είναι υψίστης σημασίας στην επιδημιολογία των Poty-ιών. Αν και αυτές οι αφίδες μπορεί να αποτελούν ένα μικρό ποσοστό του συνολικού πληθυσμού, μπορούν να εισάγουν τον ιό μέσα στην καλλιέργεια ή να τον προσλάβουν από μολυσμένα μένα φυτά που βρίσκονται μέσα στην καλλιέργεια και να τον εξαπλώσουν ταχύτατα. Συνθήκες που ευνοούν την πρώιμη εμφάνιση, δραστηριότητα και αύξηση πληθυσμών αφίδων συντελούν άμεσα στην εκδήλωση και ένταση της μόλυνσης (Tomlinson, 1987) Kριτήρια διαχωρισμού των ειδών Τα κριτήρια με τα οποία γίνεται ο διαχωρισμός των ειδών μεταξύ του γένους είναι τα εξής (Berger et al., 2005) : ο βαθμός συγγένειας στη γονιδιωματική αλληλουχία - ομοιότητα μικρότερη από 80% στην αλληλουχία των αμινοξέων της CP, - ομοιότητα μικρότερη από 85% στην νουκλεοτιδική αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος, - διαφορετικές θέσεις τομής της πολυπρωτεΐνης το εύρος ξενιστών στη φύση - σημαντικό κυρίως για τη διαφοροποίηση στελεχών αλλά και για τη διαφοροποίηση ειδών η παθογένεια και η κυτταροπαθολογία - διαφορετική μορφολογία των έγκλειστων σωματιδίων, - έλλειψη σταυροειδούς προστασίας, - μετάδοση με το σπόρο, - ορισμένες πτυχές της αντίδρασης των ξενιστών μπορεί να είναι χρήσιμες (π.χ. διαφορετική ανταπόκριση σε είδη που αποτελούν βασικούς ξενιστές και συγκεκριμένες γενετικές αλληλεπιδράσεις) ο τρόπος μετάδοσης - διαφορετικοί βασικοί φορείς, ωστόσο το είδος του φορέα δεν είναι χρήσιμο στην ταυτοποίηση του είδους του ιού οι αντιγονικές ιδιότητες - ορολογικές διαφορές 1.8 Ο ιός του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip Mosaic Virus, TuMV) Ο ιός του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip Mosaic Virus, TuMV) θεωρείται ένας από τους πιο διαδεδομένους, σημαντικούς και οικονομικά επιζήμιους φυτικούς ιούς που μολύνουν καλλιέργειες λαχανικών και ιδιαίτερα φυτά της οικογένειας Brassicaceae (Cruciferae) στον αγρό παγκοσμίως (Walsh et al., 1985; Tomlinson, 1987; Kwon et al., 2000; Walsh et al., 2006; Koike et al., 2007; Pallet et al., 2008; Farzadfar et al., 2009). 40

43 Απαντάται στις περισσότερες χώρες του κόσμου και είναι ιδιαίτερα καταστρεπτικός σε καλλιέργειες φυτών του γένους Brassica κυρίως σε ημιτροπικές και εύκρατες περιοχές της Ασίας, Βορείου και Νοτίου Αμερικής, Αφρικής, Νέας Ζηλανδίας, Ωκεανίας και στην Ευρώπη (Feldman et al., 1972; Ohshima et al., 2002; Walsh et al., 2002; Spence et al., 2007; Farzadfar et al., 2009;). Ο TuMV αποτελεί ένα ιδιαίτερα ενδιαφέρον μέλος της οικογένειας Potyviridae καθώς έχει ένα πολύ μεγάλο εύρος ξενιστών συμπεριλαμβανομένων μονοκοτυλήδονων και δικοτυλήδονων φυτών και καθώς δείχνει διαφορετικούς βαθμούς προσαρμογής στις διάφορες ομάδες φυτών (Walsh et al., 2006). Ο TuMV είναι ο δεύτερος πιο σημαντικός ιός που μολύνει λαχανοκομικές καλλιέργειες στον αγρό μετά το μωσαϊκό του αγγουριού (Cucumber mosaic virus, CMV) σύμφωνα με έρευνα που πραγματοποιήθηκε σε 28 χώρες (Tomlinson, 1987; Walsh et al., 2002; Sanchez et al., 2007; Farzadfar et al., 2009), ενώ αναφέρεται ότι είναι ο μόνος ιός του γένους Potyvirus που μολύνει φυτά του γένους Brassica (Walsh et al., 2002). Ωστόσο, δεν υπάρχουν σημαντικές αναφορές για σοβαρές επιδημίες του ιού όσων αφορά Μεσογειακές χώρες με εξαίρεση την Ελλάδα και την Ιταλία. Ιολόγοι από την Ελλάδα σε έρευνα που πραγματοποιήθηκε κατέταξαν τον TuMV στην πρώτη τετράδα των σημαντικότερων οικονομικά φυτικών ιολογικών ασθενειών (Sanchez et al., 2007). Ο ιός για πρώτη φορά περιγράφηκε στις ΗΠΑ το 1921 σε φυτά γογγυλοκράμβης (Brassica rapa) (στην αγγλική γλώσσα turnip, από όπου και πήρε το όνομά του), ενώ στο Ηνωμένο Βασίλειο για πρώτη φορά περιγράφηκε σε φυτά λάχανου (Brassica oleracea) (Smith, 1935). Ακόμη αναφέρεται με κάποια αμφιβολία πως είναι ο πρώτος φυτικός ιός που αναγνωρίστηκε στην Ισλανδία (Walsh et al., 2002) Χαρακτηριστικά του TuMV Ο TuMV είναι μέλος του γένους Potyvirus της οικογένειας Potyviridae. Όπως και τα υπόλοιπα μέλη του γένους έχει εύκαμπτα, νηματοειδή ιοσωμάτια μήκους περίπου 720 nm (Walsh et al., 2002) (Εικόνα 1.17, Α) καθένα από τα οποία περιέχει ένα μονόκλωνο, θετικής πολικότητας μόριο RNA περίπου της τάξεως των νουκλεοτιδίων. Η οργάνωση του γονιδιώματος του είναι πανομοιότυπη με αυτή των υπολοίπων μελών του γένους Potyvirus και έχει περιγραφεί παραπάνω (Farzadfar et al., 2009) (Εικόνα 1.18). 41

44 Σε in vitro πειράματα που έγιναν με ακατέργαστο μολυσμένο φυτικό εκχύλισμα βρέθηκε ότι το σημείο θερμικής αδρανοποίησης του ιού βρίσκεται μεταξύ 60 και 65 o C και η μολυσματικότητα των ιοσωματίων διατηρείται στους 18 o C για 4 ημέρες. Το σημείο αραίωσης του ιού βρέθηκε να είναι μεταξύ 10-3 και Στα κύτταρα των μολυσμένων φυτών παρατηρούνται έγκλειστα σωματίδια χαρακτηριστικής μορφής που έχουν διαγνωστική αξία (Feldman et al., 1972; Eiras et al., 2007) (Εικόνα 1.17, Β). Εικόνα 1.18: Σχηματικό διάγραμμα του γονιδιώματος του TuMV υποδεικνύοντας το μέγεθος του κάθε γονιδιακού προϊόντος καθώς και τις αμετάφραστες περιοχές Συμπτώματα Σε καλλιεργούμενα φυτά της οικογένειας Brassicaceae, ο TuMV αναφέρεται ότι προκαλεί ποικιλοχλώρωση, μαύρες νεκρωτικές κηλίδες, δακτυλιοειδής κηλίδες και μωσαϊκό (Εικόνα 1.19). Μόλυνση των φυτών σε πρόωρο στάδιο προκαλεί σοβαρή τραχύτητα των φύλλων και ανάσχεση της ανάπτυξής τους και σε ορισμένες περιπτώσεις νέκρωση και θάνατο των φυτών (Koike et al., 2007). Στο φυτό κοχλιαρία (Armoracia rusticana) τα συμπτώματα του ιού περιλαμβάνουν ποικιλοχλώρωση του φυλλώματος, μωσαϊκό, δακτυλιοειδείς κηλίδες, σκουρόχρωμες ραβδώσεις στους μίσχους, νέκρωση και αποχρωματισμό των ριζών η οποία και οδηγεί σε εμπορικά ανεπιθύμητο προϊόν (Eiras et al., 2007). Στη λαχανίδα (Brassica oleracea var. acephala) προκαλεί ανάσχεση της ανάπτυξης και μείωση της φυλλικής επιφάνειας (Spence et al., 2007). Σε φυτά βιολέτας (Matthiola incana) καθώς και στο χείρανθο (Cheiranthus cheiri) προκαλεί διάσπαση του χρώματος των ανθέων, ένα ιδιαίτερα χαρακτηριστικό σύμπτωμα (Walsh et al., 2002) (Εικόνα 1.19). Πειράματα σε θερμοκήπια έδειξαν ότι μόλυνση φυτών λάχανου (Brassica oleracea var. capitata) με τον ιό οδηγεί σε μείωση του αριθμού και του βάρους των εμπορεύσιμων συγκομιζομένων κεφαλών. Πρώιμη μόλυνση, οδηγεί στην παραγωγή φυτών λάχανου 50% ελαφρύτερων από το κανονικό (Spence et al., 2007). Μετασυλλεκτικά, ο ιός μπορεί να προκαλεί εσωτερική νέκρωση και βυθισμένες 42

45 νεκρωτικές κηλίδες (5 έως 10 mm σε διάμετρο, αναφέρονται σαν κάψιμο από τσιγάρο) στις αποθηκευμένες προσβεβλημένες κεφαλές των λάχανων, που καθιστούν το προϊόν μη εμπορεύσιμο (Koike et al., 2007). Νεκρωτικές κηλίδες εμφανίζονται και όταν τα φυτά αναπτύσσονται στο χωράφι. Η παρουσία του ιού μπορεί να οδηγήσει σε σημαντική μείωση της απόδοσης της καλλιέργειας (Hunter et al., 2002). Σε ζιζάνια ξενιστές του ιού σαν συμπτώματα έχουν αναφερθεί παραμόρφωση φύλλων, μωσαϊκό, ποικιλοχλώρωση, νέκρωση, τραχύτητα φύλλων, ανάσχεση της ανάπτυξης, κιτρίνισμα των νεύρων και ίκτερος (Thurston et al., 2001; Farzadfar et al., 2009). Επίσης, αναφέρονται ζαρωμένα (με πτυχές) φύλλα με μειωμένο μέγεθος, ποικιλοχλώρωση, διαφάνεια των νεύρων και περινεύριος μεταχρωματισμός (Feldman et al., 1972). Εικόνα 1.19: Συμπτώματα που σχετίζονται με μόλυνση φυτών στη φύση από τον TuMV. (Α) Διάσπαση του χρώματος των ανθέων, μωσαϊκό και παραμόρφωση φύλλων σε φυτό βιολέτας, (Β, C) Μωσαϊκό, ποικιλοχλώρωση, νεκρωτικές περιοχές και χλωρωτικοί δακτύλιοι με ιώδη περίμετρο σε λάχανο, (D) Μαύρες νεκρωτικές κηλίδες (σαν κάψιμο από τσιγάρο) στα εξωτερικά και εσωτερικά φύλλα προσβεβλημένων με τον ιό κεφαλών λάχανου Ξενιστές Ο TuMV έχει απομονωθεί από ένα μεγάλο εύρος καλλιεργούμενων και αυτοφυών φυτικών ειδών. Είναι γνωστό ότι μολύνει περισσότερα από 318 διαφορετικά είδη σε περισσότερες από 43 οικογένειες δικοτυλήδονων φυτών συμπεριλαμβανομένων των οικογενειών Cruciferae, Compositae, Chenopodiaceae, Leguminosae και Caryophyllaceae καθώς και μονοκοτυλήδονα φυτά. Έχει το μεγαλύτερο εύρος ξενιστών στα περισσότερα φυτικά γένη και οικογένειες από οποιονδήποτε άλλο ιό του γένους Potyvirus (Walsh et al., 2002). Προσβάλει τα περισσότερα από τα καλλιεργούμενα φυτά του γένους Brassica καθώς και αυτοφυή και καλλωπιστικά φυτά της οικογένειας Brassicaceae (Sanchez et al., 2007). Στους πίνακες 1.8 και 1.9 αναφέρονται αντίστοιχα καλλιεργούμενα και αυτοφυή φυτά-ξενιστές του ιού που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae. 43

46 Πίνακας 1.8: Καλλιεργούμενα φυτά-ξενιστές του TuMV που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae. Ξενιστές του TuMV που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae (καλλιεργούμενα) Είδος Κοινή ονομασία Brassica napus var. oleifera Ελαιοκράμβη (Hardwick et al., 1994; Walsh et al., 2002; Shahraeen et al., 2003) Brassica napus var. Napobrassica ή Νάπα, ρουταμπάγκα ή ρέβα (Walsh et al., 2002) Brassica napobrassica Brassica rapa Γογγυλοκράμβη ή γογγύλι (Walsh et al., 2002) Brassica perviridis ή Brassica rapa var. Σινάπι (Feldman et al., 1972) perviridis Brassica rapa ssp. pekinensis ή Brassica pekinensis Κινέζικο Λάχανο (Walsh et al., 2002; Kirino et al., 2008) Brassica oleracea var. capitata Λάχανο (Walsh et al., 2002) B. oleracea var. capitata conv. alba Άσπρο λάχανο (Walkey et al., 1978) B. oleracea var. capitata conv. rubra Κόκκινο λάχανο (Walkey et al., 1978) B. oleracea var. italica Μπρόκολο (Benetti et al., 1978) Brassica oleracea var. gemmifera Λάχανο Βρυξελλών (Tomlinson et al., 1981; Walsh et al., 2002) Brassica oleracea var. botrytis Κουνουπίδι (Walsh et al., 2002) Brassica oleracea var. gongylodes Ραφανοκράμβη (Walsh et al., 2002) Brassica oleracea var. acephala Λαχανίδα (Walsh et al., 2002; Spense et al., 2007) Eruca sativa Ρόκα (Feldman et al., 1972; Sanchez et al., 2007; Farzadfar et al., 2009) Brassica juncea Σινάπι, Μουστάρδα (Shahraeen et al., 2003; Sanchez et al., 2007; Farzadfar et al., 2009) Raphanus sativus Ρεπάνι (Farzadfar et al., 2009) Lepidium sativum Κάρδαμο (Farzadfar et al., 2009) Cochlearia armoracia ή Armoracia Κοχλιαρία ή Χρένο (Eiras et al., 2007; Koike et al., rusticana 2007) Rorippa nasturtium - aquaticum ή Nasturtium officinale Νεροκάρδαμο ή Ρορίππα (Koike et al., 2007; Sanchez et al., 2007) Erysimum sp. Ερύσιμο (Sanchez et al., 2007) Matthiola incana Βιολέτα (Feldman et al., 1972) Cheiranthus cheiri Χείρανθος ή κίτρινη βιολέτα (Walsh et al., 2002) Πίνακας 1.9: Αυτοφυή φυτά-ξενιστές του TuMV που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae. Ξενιστές του TuMV που ανήκουν στην οικογένεια Brassicaceae (αυτοφυή) Είδος Κοινή ονομασία Sisymbrium irio Σισύμπριο ή Σκυλοβρούβα (Feldman et al., 1972; Farzadfar et al., 2009) Sisymbrium orientale Σκυλοβρούβα (Sanchez et al., 2007) Hirschfeldia incana Βρούβα (Farzadfar et al., 2009) Rapistrum rugosum Ράπιστρο (Feldman et al., 1972; Farzadfar et al, 2009) Sisymbrium loeselii Σισύμπριο (Farzadfar et al., 2009) Sinapis arvensis Σινάπι το άγριο (Stobbs et al., 1990) Sinapis alba Σινάπι το λευκό (Ochoa Corona et al., 2007) Brassica cretica Σκαρολάχανο (Sanchez et al., 2007) Alliaria officinalis Αλλιάρια (Sanchez et al., 2007) Brassica campestris Αγριολάχανο (Stobbs et al., 1990) Capsella bursa-pastoris Καψέλλα (Stobbs et al., 1990) 44

47 Cardaria draba Βρωμολάχανο (Stobbs et al., 1990) Diplotaxis tenuifolia Άγρια ρόκα (Stobbs et al., 1990) Erucastum gallicum - (Stobbs et al., 1990) Hesperis matronalis Εσπερίδα (Stobbs et al., 1990) Raphanus maritimus ή Raphanus - (Shahraeen et al., 2003) raphanistrum ssp. maritimus Rorippa indica - (Kwon et al., 2000) Rorippa islandica - (Kwon et al., 2000) Brassica nigra Σινάπι το μαύρο (Spak, 1991; Thurston et al., 2001) Bunias orientalis - (Kobylko et al., 2009) Brassica oleracea Άγριο λάχανο (Maskell et al., 1999; Raybould et al., 1999) Τρόπος Μετάδοσης - Επιδημιολογία Ο TuMV στη φύση μεταδίδεται με τουλάχιστον 89 είδη αφίδων, με κυριότερα τα είδη Myzus persicae και Brevicoryne brassicae, με μη-έμμονο τρόπο (Ohshima et al., 2002; Walsh et al., 2002; Koike et al., 2007; Sanchez et al., 2007) (Κεφάλαιο 1.9). Στο εργαστήριο μεταδίδεται επίσης μηχανικά με φυτικό εκχύλισμα (Eiras et al., 2007) Διαχωρισμός στελεχών του TuMV Ο TuMV έχει ένα ιδιαίτερα μεγάλο εύρος ξενιστών και εμφανίζει μεγάλο βαθμό ενδοειδικής παραλλακτικότητας με αποτέλεσμα να περιλαμβάνει πολλά στελέχη (Koike et al., 2007). Η παραλλακτικότητα του ιού αποδίδεται σε γενετικούς ανασυνδιασμούς μεταξύ των στελεχών (Sanchez et al., 2007). Τα στελέχη του TuMV μπορούν να διαχωριστούν με βάση την παραλλακτικότητα της αλληλουχίας της καψιδιακής πρωτεΐνης (CP) (Ohshima et al., 2002; Sanchez et al., 2003) ή με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων. Παρόμοιες ομάδες μπορούν επίσης να αναγνωριστούν με αλληλούχιση του ιικού γονιδιώματος. Η γενετική παραλλακτικότητα αντικατοπτρίζεται στην ικανότητα του ιού να μολύνει ορισμένους ξενιστές. Ειδικότερα, έχουν επισημανθεί γενετικές διαφορές μεταξύ στελεχών που μολύνουν Brassica spp. και εκείνων που μολύνουν Raphanus spp. (Walsh et al., 2006). Σύμφωνα με τους Sanchez et al. (2003) τα στελέχη του TuMV εντάσσονται σε δύο μεγάλες ομάδες. Στην ομάδα MB (κυρίως απομονώσεις Brassica) (ισοδύναμη με την ομάδα world-b που αναφέρεται παρακάτω) τοποθετούνται στελέχη που προέρχονται κυρίως από είδη του γένους Brassica και στην ομάδα MR (κυρίως απομονώσεις Radish) (ισοδύναμη με την ομάδα Asian-BR που αναφέρεται παρακάτω) εντάσσονται στελέχη που προέρχονται κυρίως από φυτά Raphanus sativus (ρεπάνια). Η εξειδίκευση του TuMV μπορεί να είναι τέτοια, που ορισμένες απομονώσεις που προέρχονται από Brassica spp. δεν είναι ικανές να μολύνουν το ρεπάνι. Απομονώσεις του TuMV που προέρχονται από ξενιστές που δεν ανήκουν στην οικογένεια των σταυρανθών (Brassica spp. και Raphanus sativus), προέρχονται κυρίως 45

48 από μεσογειακές χώρες και τείνουν να συγκεντρώνονται έξω από τις δύο κύριες γενετικές ομάδες, δηλαδή την MB και την MR. Αυτά τα στελέχη έχουν οριστεί από τους Sanchez et al. (2003) σαν OBR (ισοδύναμη ομάδα με την basal-b που αναφέρεται παρακάτω) ή σαν IBR (απομονώσεις εκτός των Brassica και Radish ή απομονώσεις ενδιάμεσες μεταξύ των Brassica και Radish) καθώς δεν ταιριάζουν με καμία από τις άλλες γενετικές ομάδες του TuMV και έχει προταθεί ότι πιθανότατα αντιπροσωπεύουν διαφορετικές γενεαλογίες της εξέλιξης του ιού (Sanchez et al., 2003; Sanchez et al., 2007). Έχει βρεθεί ότι οι απομονώσεις του TuMV ταξινομούνται βιολογικά σε τέσσερις τύπους ανάλογα με τον ξενιστή που μολύνουν: 1) τύπος [(B)]; εδώ ανήκουν απομονώσεις του ιού που μολύνουν φυτά του γένους Brassica σποραδικά και με λανθάνουσες μολύνσεις αλλά δεν μολύνουν φυτά του γένους Raphanus, 2) τύπος [B]; εδώ ανήκουν απομονώσεις που μολύνουν πολλά είδη του γένους Brassica διασυστηματικά προκαλώντας μωσαϊκό αλλά δεν μολύνουν φυτά του γένους Raphanus, 3) τύπος [B(R)]; εδώ ανήκουν απομονώσεις που μολύνουν πολλά είδη του γένους Brassica διασυστηματικά προκαλώντας μωσαϊκό αλλά μολύνουν και φυτά του γένους Raphanus σποραδικά χωρίς την εκδήλωση συμπτωμάτων και 4) τύπος [BR]; εδώ ανήκουν απομονώσεις που μολύνουν φυτικά είδη των γενών Brassica και Raphanus διασυστηματικά προκαλώντας μωσαϊκό (Ohshima et al., 2002). Επιπλέον, φυλογενετική ανάλυση διαφορετικών απομονώσεων του ιού που συλλέχθηκαν από διάφορες περιοχές του κόσμου απεκάλυψε τέσσερις κύριες γενετικές ομάδες του TuMV: 1) την ομάδα basal-brassica (basal-b), 2) την ομάδα basal-brassica/raphanus (basal-br), 3) την ομάδα Asian-Brassica/Raphanus (Asian- BR) και 4) την ομάδα world-brassica (world-b) (Ohshima et al., 2002; Farzadfar et al., 2009). 1.9 Οι αφίδες ως φορείς φυτικών ιών Η μετάδοση των φυτικών ιών είναι αποτέλεσμα αλληλεπιδράσεων μεταξύ του ιού, του ξενιστή του και του φορέα (Martiniere et al., 2009). Η πλειονότητα (88%) των ιών εξαρτάται από έντομα-φορείς για τη μετάδοση και την επιβίωσή τους (Power, 2000; Andret-Link and Fuchs, 2005). Οι αφίδες είναι υπεύθυνες για τη μετάδοση περίπου του 50% των εντομομεταδιδόμενων ιών και περισσότερα από 200 είδη αφίδων έχουν καταγραφεί ως φορείς φυτικών ιών (Andret-Link and Fuchs, 2005; Powell, 2005). Η πλειονότητα των αφίδων-φορέων ανήκουν στην υποοικογένεια Αphidinae της τάξεως Homoptera (James and Perry, 2004). Μια σειρά από μοναδικά χαρακτηριστικά συμβάλλουν στην επιτυχία των αφίδων ως φορέων ιών. Σε αυτά περιλαμβάνονται: 1) η πολυφάγα φύση για ορισμένα είδη αφίδων (π.χ. Myzus persicae) που τους επιτρέπει να τρέφονται με ένα ευρύ φάσμα φυτώνξενιστών 2) η παρθενογενετική αναπαραγωγή τους που οδηγεί στην γρήγορη ανάπτυξη 46

49 μεγάλων πληθυσμών ατόμων και 3) το είδος των στοματικών τους μορίων (μυζητικά) που δεν καταστρέφει τα φυτικά κύτταρα (James and Perry, 2004). Οι αφίδες με την μη-καταστροφική διατροφική συμπεριφορά τους είναι ιδανικοί φορείς για τους ιούς. Μόλις προσγειωθούν σε ένα φυτό αρχικά ελέγχουν εάν πρόκειται για τον κατάλληλο ξενιστή, εκτελώντας μικρής διάρκειας (μόνο λίγων δευτερολέπτων) ενδοκυτταρικές διατρήσεις στην επιδερμίδα και στα κύτταρα του μεσόφυλλου, χωρίς να νεκρώνουν τα κύτταρα που διατρυπούν. Μετά από αυτές τις διερευνητικές διατρήσεις και εάν το φυτό είναι κατάλληλο, εισάγουν το στοματικό μόριό τους (στιλέτο) μέσα στο φλοίωμα και τρέφονται από τον χυμό του για χρονικά διαστήματα που μπορεί να υπερβαίνουν τις μερικές ώρες (Martiniere et al., 2009; Brault et al., 2010). Ανάλογα με τον τύπο των ιστών που μολύνουν, οι φυτικοί ιοί μπορούν να προσληφθούν και να μεταδοθούν από τις αφίδες κατά τη διάρκεια και των δύο ή της μιας εκ των δύο φάσεων διάτρησης (Brault et al., 2010). Για παράδειγμα, οι ιοί του γένους Luteovirus προσλαμβάνονται μόνο από τους αγγειακούς ιστούς, οι ιοί του γένους Potyvirus από τους επιδερμικούς ιστούς, ενώ ο CaMV προσλαμβάνεται και από τους δύο τύπους ιστών (Martiniere et al., 2009). Οι περισσότεροι φυτικοί ιοί που μεταδίδονται με έντομα διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: 1) "κυκλοφορούντες" είναι οι ιοί που από τη στιγμή που προσλαμβάνονται από τον φορέα διαμέσου της διατροφής του στο φλοίωμα ασθενών φυτών, περνούν από το επιθήλιο του εντέρου στην αιμόλεμφο και από εκεί στους σιελογόνους αδένες και τέλος με το σίελο μεταφέρονται σε ένα νέο φυτό ξενιστή, 2) "μη-κυκλοφορούντες" είναι οι ιοί στην περίπτωση που τα ιοσωμάτια προσδένονται στο εξωτερικό των στοματικών μορίων ή του προσθίου εντέρου του εντόμου, από όπου και απελευθερώνονται κατά τη μετάδοση στο νέο ξενιστή και σε καμία περίπτωση δεν διασχίζουν τις κυτταρικές μεμβράνες του φορέα (Pirone and Blanc, 1996; Blanc, 2007; Martiniere et al., 2009) (Εικόνα 1.20). Οι κυκλοφορούντες ιοί χωρίζονται σε δύο υποκατηγορίες, στους κυκλοφορούντες-πολλαπλασιαζόμενους και στους κυκλοφορούντες-μη-πολλαπλασιαζόμενους ανάλογα με το εάν αναπαράγονται ή όχι στο σώμα του φορέα (James and Perry, 2004; Andret-Link and Fuchs, 2005; Blanc, 2007). Ενώ οι κυκλοφορούντες ιοί απαιτούν υψηλά εξειδικευμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ του ιού και του φορέα για να επιτραπεί η διέλευση και κυκλοφορία των ιοσωματίων στο σώμα του φορέα, οι μη-κυκλοφορούντες ιοί αρχικά θεωρούνταν ως ένα περισσότερο ή λιγότερο τυχαίο γεγονός, στο οποίο τα ιοσωμάτια προσκολλώνται μη εξειδικευμένα στα στοματικά μόρια του φορέα. Ωστόσο, γίνεται όλο και περισσότερο φανερό, ότι και αυτός ο τρόπος μετάδοσης είναι αποτέλεσμα εξειδικευμένων αλληλεπιδράσεων μεταξύ του ιού, του ξενιστή του και του φορέα του (Power, 2000). Στην περίπτωση του CaMV έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτέλεσμα ιδιαίτερα 47

50 εξειδικευμένων αλληλεπιδράσεων, όπου ο ιός "σκοπίμως" χρησιμοποιεί τα κυτταρικά μονοπάτια του φυτού για να βελτιστοποιήσει την πρόσληψή του από τον φορέα (Palacios et al., 2002). Η πλειονότητα των ιών είναι "μη-κυκλοφορούντες" (Martiniere et al., 2009) και το 75% των αφιδομεταδιδόμενων μη-κυκλοφορούντων ιών μεταδίδεται με μη-έμμονο τρόπο (Powell, 2005). Εικόνα 1.20: Σχηματικό διάγραμμα μιας αφίδας στο οποίο απεικονίζεται η πορεία των μηκυκλοφορούντων και των κυκλοφορούντων ιών μετά την πρόσληψή τους. Ο τροφικός αγωγός και το πρόσθιο έντερο (σκιαγραφημένες περιοχές) είναι οι περιοχές διατήρησης των μηκυκλοφορούντων ιών; τα βέλη απεικονίζουν το πέρασμα των κυκλοφορούντων ιών δια μέσω του πεπτικού σωλήνα (τροφικός αγωγός, πρόσθιο έντερο, μέσο έντερο, οπίσθιο έντερο), του αιμόκοιλου και του βοηθητικού σιελογόνου αδένα της αφίδας, έως την έξοδο μέσω του σιελογόνου αγωγού. Το ένθετο στο κάτω μέρος της εικόνας απεικονίζει σε μεγέθυνση το ακραίο τμήμα του στιλέτου όπου ο σιελογόνος αγωγός συγχωνεύεται με τον τροφικό αγωγό. Οι ιοί ανάλογα με το χρονικό διάστημα που παραμένουν στο σώμα του εντόμου φορέα διακρίνονται σε μη-έμμονους, ημι-έμμονους και έμμονους (Brault et al., 2010). Οι μη-κυκλοφορούντες ιοί περιλαμβάνουν τους μη-έμμονους και ημι-έμμονους ιούς, ενώ οι κυκλοφορούντες ιοί περιλαμβάνουν τους έμμονους ιούς. Μη-έμμονος τρόπος μετάδοσης: Η πρόσληψη και η μετάδοση του ιού επιτυγχάνεται με τα δοκιμαστικά νύγματα διάρκειας λίγων δευτερολέπτων ή λεπτών στα επιδερμικά κύτταρα του ξενιστή. Η μετάδοση του ιού είναι άμεση, δηλαδή δεν απαιτείται λανθάνουσα περίοδος. Οι αφίδες παραμένουν μολυσματικές για λίγα λεπτά έως μερικές ώρες. Η ιοφόρος ικανότητα χάνεται μετά την έκδυση. Η αποτελεσματικότητα μετάδοσης των μη-έμμονων ιών αυξάνεται μετά από νηστεία (James and Perry, 2004; Brault et al., 2010). Ημι-έμμονος τρόπος μετάδοσης: Η πρόσληψη του ιού επιτυγχάνεται με νύγματα διάρκειας μερικών λεπτών, ωστόσο αυξάνεται με παρατεταμένη τροφική δραστηριότητα μερικών ωρών συνήθως στο φλοίωμα των ασθενών φυτών (Palacios et al., 2002; James and Perry, 2004). Η μετάδοση του ιού επιτυγχάνεται με διατροφή 48

51 λεπτών έως ωρών και είναι άμεση, δηλαδή δεν απαιτείται λανθάνουσα περίοδος και οι αφίδες παραμένουν ιοφόρες λίγες ώρες έως ημέρες. Η ιοφόρος ικανότητα χάνεται μετά από έκδυση της αφίδας. Η αποτελεσματικότητα μετάδοσης των ημι-έμμονων ιών δεν αυξάνεται μετά από νηστεία (James and Perry, 2004; Brault et al., 2010). Έμμονος τρόπος μετάδοσης: Η πρόσληψη και η μετάδοση του ιού επιτυγχάνεται με διατροφή της αφίδας μεγάλης διάρκειας (6-24 ώρες) στο φλοίωμα. Η ύπαρξη λανθάνουσας περιόδου είναι απαραίτητη (συνήθως >12 ωρών). Η ιοφόρος ικανότητα του φορέα διατηρείται για μεγάλες περιόδους και συνήθως για όλη του τη ζωή. Η ιοφόρος ικανότητα διατηρείται και μετά την έκδυση της αφίδας. Η αποτελεσματικότητα μετάδοσης των έμμονων ιών δεν αυξάνεται μετά από νηστεία (James and Perry, 2004; Brault et al., 2010) O ρόλος των αυτοφυών φυτών στην επιδημιολογία των ιών Τα αυτοφυή φυτά συνήθως αναφέρονται ως ζιζάνια και αποτελούν μη επιθυμητά φυτά που αναπτύσσονται σε καλλιεργούμενη γη, παρεμποδίζοντας την ανάπτυξη των καλλιεργούμενων φυτών μέσω του ανταγωνισμού που αναπτύσσουν για χώρο, τροφή, νερό και φως (Duffus, 1971; Bos, 1981). Τα αυτοφυή φυτά, εκτός από την αρνητική επίδραση που έχουν στην ανάπτυξη των καλλιεργούμενων φυτών, παίζουν σημαντικό ρόλο και ως δεξαμενές φυτικών ιώσεων. Συνήθως οι ιοί που εντοπίζονται σε μια καλλιέργεια εντοπίζονται και στα αυτοφυή φυτά που βρίσκονται εκεί κοντά (Moreno et al., 2004). Η πιο σημαντική πηγή των φυτικών ιών είναι τα μολυσμένα φυτά. Τα ζιζάνια αποτελούν το σημαντικότερο μέσο διαχείμασης ή διαθερισμού πολλών ιών παγκοσμίως και χρησιμεύουν ως πρωταρχική πηγή μολύσματος για πολλές ιολογικές ασθένειες (Bos, 1981). Για αρκετές καλλιέργειες μικρής διάρκειας, ή που δεν καλλιεργούνται κατά τη διάρκεια του χειμώνα και του καλοκαιριού, τα ζιζάνια αποτελούν εναλλακτικούς ξενιστές ζωτικής σημασίας για την επιβίωση των ιών (Bos, 1981). Μια μεγάλη ποικιλία ζιζανίων δίνει σε έναν ιό πολύ περισσότερες ευκαιρίες να διατηρηθεί κατά την εναλλαγή των εποχών και να διαδοθεί ευρέως (Duffus, 1971; Kwon et al., 2000). Τα ζιζάνια χρησιμοποιούνται ως καταφύγια και αποτελούν πηγές και των εντόμων-φορέων με αποτέλεσμα σε κάποιες περιπτώσεις να χρησιμεύουν ταυτόχρονα ως δεξαμενές και των ιών αλλά και των εντόμων φορέων τους έχοντας ως αποτέλεσμα την ταχεία εξάπλωση στις καλλιέργειες (Bos, 1981). Ο βιολογικός κύκλος των ζιζανίων αλλά και ο τρόπος διάδοσής τους παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιβίωση και διασπορά των φυτικών ιώσεων. Οι ιοί με περιορισμένο εύρος ξενιστών μπορεί να επιβιώνουν είτε επειδή ο ξενιστής τους είναι πολυετής ή αγενώς πολλαπλασιαζόμενος είτε λόγω μετάδοσης με το σπόρο (Duffus, 1971). Τα ζιζάνια μπορεί να χρησιμοποιούν ριζώματα για τη διάδοσή τους ή να είναι πολυετή είδη και έτσι να εκτίθενται για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα σε μεγαλύτερο 49

52 αριθμό φορέων των ιών. Ως εκ τούτου μπορούν να συσσωρεύουν πολλές ιικές μολύνσεις έχοντας την δυνατότητα να δρουν σαν δεξαμενές πολλών ιώσεων ταυτόχρονα (Pallett et al., 2002; Moreno et al., 2004). Οπότε τα πολυετή ζιζάνια είναι ιδιαίτερα σημαντικά καθώς αποτελούν και την πλειοψηφία των μολυσμένων από ιούς ζιζανίων (Bos, 1981). Ωστόσο, και τα ετήσια ζιζάνια με τις επικαλυπτόμενες γενεές που μπορεί να έχουν κατά τη διάρκεια του χρόνου αλλά και στις περιπτώσεις που ο ιός μεταδίδεται με το σπόρο τους κρίνονται εξίσου σημαντικά για την επιβίωση, διατήρηση και διασπορά των φυτικών ιών (Bos, 1981; Kwon et al., 2000). Τα άγρια είδη του γένους Brassica, όπως το B. nigra, το B. rapa ssp. sylvestris και το B. oleracea είναι γνωστό ότι αποτελούν ξενιστές και πολύ συχνά βρίσκονται μολυσμένα με ιούς οι οποίοι αποτελούν παθογόνα ύψιστης οικονομικής σημασίας στην καλλιέργεια οπωροκηπευτικών ειδών, όπως οι TuMV και CaMV. Αυτοί οι ιοί συχνά είναι υπεύθυνοι για την πρόκληση σοβαρών επιδημιών σε καλλιεργούμενα φυτά (Maskel et al., 1999; Raybould et al., 1999; Thurston et al., 2001; Moreno et al., 2004). Τα είδη Rorippa indica και R. islandica της οικογένειας Brassicaceae είναι επίσης ιδιαίτερα σημαντικά στην επιδημιολογία του TuMV λόγω της αφθονίας τους, της σχετικά υψηλής συχνότητας μόλυνσης και της χρησιμότητας που έχουν για τη διαχείμαση του ιού. Αυτά τα είδη των ζιζανίων αποτελούν πρωτογενείς πηγές των ιών που καταστρέφουν τις καλλιέργειες (Kwon et al., 2000). Ο ρόλος των ζιζανίων στην ύπαρξη και διασπορά των ιολογικών ασθενειών είναι αναπόσπαστο κομμάτι της οικολογίας και της επιδημιολογίας τους (Bos, 1981; Farzadfar et al., 2009). Η κατανόηση της επιδημιολογίας των ιολογικών ασθενειών είναι σημαντική για την αντιμετώπισή τους (Duffus, 1971). Η καταστροφή των ζιζανίων, ως μέσο αντιμετώπισης των ιολογικών ασθενειών, στοχεύει στη μείωση τόσο των διαθέσιμων πηγών για τους ιούς όσο και για τους φορείς τους (Zitter and Simons, 1980). Ωστόσο, το γεγονός ότι συνήθως οι ιοί δεν προκαλούν συμπτώματα στα αυτοφυή φυτά, δυσχεραίνει τον εντοπισμό τους (Bos, 1981). Επιτυχής καταπολέμηση των ζιζανίων παρέχει μια άμεση μέθοδο για έλεγχο πολλών φυτικών ιολογικών ασθενειών. Η σημαντικότητα των ζιζανίων στον κύκλο της ασθένειας ιολογικών ασθενειών που μεταδίδονται με έντομα υποδεικνύει ότι ο έλεγχος των ζιζανίων θα μπορούσε πιθανά να είναι εξίσου αποτελεσματικός με την χημική καταπολέμηση των φορέων (Duffus, 1971). Γενικότερα, οι καλλιέργειες μπορούν να προστατευθούν ικανοποιητικά από τους ιούς αποφεύγοντας ή απομακρύνοντας τις πηγές της μόλυνσης, προλαμβάνοντας ή μειώνοντας την εξάπλωση των ιών και ενισχύοντας την αντοχή των καλλιεργειών. Τα αυτοφυή φυτά αποτελούν σημαντικές πηγές των ιολογικών ασθενειών των καλλιεργειών καθώς και των φορέων τους. Η απομάκρυνσή τους εξαλείφει τις πηγές της μόλυνσης, μειώνει τη διασπορά των ιών με το σπόρο (εάν ο ιός είναι 50

53 σπορομεταδιδόμενος) και προλαμβάνει την εκτροφή των εντόμων-φορέων επάνω σε αυτά (Bos, 1981). Ωστόσο, οι μεταβολές στη χλωρίδα ως συνέπεια της καταπολέμησης των ζιζανίων, μπορεί να έχουν και τελείως διαφορετικό αποτέλεσμα από τον αρχικό στόχο (Duffus, 1971). Η απομάκρυνση των ζιζανίων μπορεί να έχει αντίθετα αποτελέσματα για την καλλιέργεια, καθώς τα ζιζάνια δρουν σαν φυτά παγίδες ή αραιώνουν τον πληθυσμό του φορέα στα καλλιεργούμενα φυτά. Οπότε η παρουσία τους αποσπά τους φορείς από την καλλιέργεια και επομένως από τη μόλυνσή της με τους ιούς (Bos, 1981). Τέλος, τα αυτοφυή φυτά αποτελούν και μια σημαντική πηγή γονιδίων ανθεκτικότητας, για τη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών με αντοχή σε πολλές σοβαρές ιολογικές ασθένειες (Leppik, 1970; Duffus, 1971) Φυτοπλάσματα Τα φυτοπλάσματα είναι οι μικρότεροι ( nm) (Bertaccini, 2007) και απλούστεροι αυτο-πολλαπλασιαζόμενοι κυτταρικοί οργανισμοί και αποτελούν τα λιγότερο κατανοητά από όλα τα φυτικά παθογόνα (Harrison et al., 2008). Αρχικά επικρατούσε η άποψη ότι οι ασθένειες που σήμερα αποδίδονται σε φυτοπλάσματα προκαλούνται από ιούς, μέχρι που μια ερευνητική ομάδα στην Ιαπωνία το 1967 αναγνώρισε στα ασθενή φυτά πλειομορφικά σωματίδια (Εικόνα 1.21), τα οποία δεν διέθεταν κυτταρικό τοίχωμα και έμοιαζαν στη μορφολογία και στην υπερδομή με τα μυκοπλάσματα, γνωστά ζωικά παθογόνα (Lee et al., 1998; Lee et al., 2000; Bertaccini, 2007). Εξαιτίας αυτής της ομοιότητας αρχικά τα φυτοπλάσματα ονομάστηκαν «οργανισμοί παρόμοιοι των μυκοπλασμάτων» (Mycoplasma Like Organisms - MLO s) (Seemuller et al., 1998; Lee et al., 2000). Εικόνα 1.21: Ηλεκτρονικές μικρογραφίες σε διαφορετικές μεγεθύνσεις διατομών ηθμοσωλήνων απεικονίζουν τον πολυμορφισμό σε σχήματα και διαστάσεις φυτοπλασμάτων. Η πρόοδος στο μοριακό επίπεδο απεκάλυψε ότι αυτοί οι απόγονοι των Gramθετικών βακτηρίων αποτελούν ένα μοναδικό μονοφυλετικό κλάδο, το γένος "Candidatus Phytoplasma" σε μια τάξη μικροοργανισμών που στερούνται κυτταρικό τοίχωμα, γνωστοί σαν Mollicutes (Davis and Sinclair, 1998; Lee et al., 1998; Seemuller 51

54 et al., 1998; Lee et al., 2000; Lee et al., 2004; Bertaccini, 2007; Harrison et al., 2008). Η επίσημη ονομασία φυτόπλασμα υιοθετήθηκε το 1994 και αντικατέστησε οριστικά την ονομασία «οργανισμοί παρόμοιοι των μυκοπλασμάτων» (Lee et al., 1998; Lee et al., 2000; Bertaccini, 2007). Γεωγραφικά τα φυτοπλάσματα έχουν εμφανιστεί σε ολόκληρο τον κόσμο, με αναφορές για την παρουσία φυτοπλασμάτων σε τουλάχιστον 85 χώρες (Lee et al., 2000). Αποτελούν τα παθογόνα αίτια για περισσότερες από χίλιες ασθένειες παγκοσμίως, μεταξύ των οποίων ασθένειες που προσβάλλουν πολυετείς καλλιέργειες όπως καρποφόρα, καλλωπιστικά ή δασικά δένδρα. Αν και οι προσβολές δεν είναι πάντα μοιραίες, είναι εξουθενωτικές για τα φυτά και καταλήγουν σε σημαντική μείωση στην απόδοση της παραγωγής, στην ποιότητα καθώς και στη διάρκεια ζωής των φυτών (Lee et al., 2000; Bertaccini, 2007). Οι ασθένειες που οφείλονται σε φυτοπλάσματα αποτελούν σημαντικές ασθένειες των φυτών. Προσβάλλουν γιγαρτόκαρπα και πυρηνόκαρπα δένδρα, καθώς και κτηνοτροφικά, λαχανοκομικά (Lee et al., 2003; Bertaccini, 2007) και καλλωπιστικά φυτά στις εύκρατες περιοχές του κόσμου (Lee et al., 2000), ενώ οι ασθένειες του κοκκοφοίνικα, της παπάγιας και του ζαχαροκάλαμου αποτελούν μια διαρκή απειλή αυτών των σημαντικών τροπικών καλλιεργειών (Bertaccini, 2007). Από τα φυτά που προσβάλλονται από φυτοπλασματικές ασθένειες, το ζαχαροκάλαμο και το αμπέλι έχουν την μεγαλύτερη οικονομική σημασία (Harrison et al., 2008). Τα φυτοπλάσματα ταξινομούνται σε 14 ομάδες και 38 υποομάδες σύμφωνα με τις ομάδες που οριοθετούνται με τη φυλογενετική ανάλυση χρησιμοποιώντας γονιδιακές αλληλουχίες του 16S rrna (Lee et al., 1998; Lee et al., 2000). Οι ομάδες Aster yellow (16SrI) και X-disease (16SrIII) αποτελούν δύο από τις πιο διαφοροποιημένες ομάδες φυτοπλασμάτων στη φύση (Lee et al., 1998; Lee et al., 2000). Η ασθένεια Aster yellows (AY) είναι η πιο διαδεδομένη μεταξύ των ασθενειών των φυτών που προκαλούνται από φυτοπλάσματα. Τα φυτοπλάσματα της ομάδας AY (16SrI), που περιλαμβάνονται στο γένος Ca. Phytoplasma asteris, σχετίζονται με ασθένειες σε περισσότερα από 100 φυτικά είδη παγκοσμίως και ιδιαίτερα σε ποώδη, δικοτυλήδονα φυτά (Lee et al., 2003; Lee et al., 2004). Στελέχη που ανήκουν στις υποομάδες 16SrI-A, 16SrI-B και 16SrI-C είναι κατανεμημένα σε όλο τον κόσμο, σχετίζονται με περισσότερα από 80 είδη φυτών και μπορούν να μεταδοθούν με περισσότερα από 30 διαφορετικά είδη εντόμων φορέων. Στην ομάδα AY (16SrI), η υποομάδα 16SrI-B αποτελεί τη μεγαλύτερη και πιο διαφοροποιημένη (Lee et al., 2004) Διάγνωση φυτοπλασματικών ασθενειών Η αδυναμία για in vitro καλλιέργεια των φυτοπλασμάτων, καθώς και ο χαμηλός τίτλος και η άνιση κατανομή τους μέσα στο φυτό ξενιστή, καθιστούν δύσκολη την μελέτη και τον εντοπισμό τους. 52

55 Οι διαγνωστικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον εντοπισμό των φυτοπλασμάτων περιλαμβάνουν βιολογικές, ιστολογικές, ανοσολογικές και κυρίως μοριακές προσεγγίσεις, τόσο στους φυτικούς ξενιστές όσο και στα έντομα-φορείς (Harrison et al., 2008). Η μοριακή ανίχνευση και ταυτοποίηση των φυτοπλασμάτων μπορεί να γίνει με τη μέθοδο της PCR, με χρήση γενικών ή εξειδικευμένων εκκινητών που ανιχνεύουν την ομάδα του φυτοπλάσματος και έχουν σχεδιαστεί να αναγνωρίζουν την υψηλά συντηρημένη γονιδιακή αλληλουχία του 16S ριβοσωμικού RNA (rrna) (Lee et al., 1998; Lee et al., 2000). Άμεση-PCR (direct-pcr) ακολουθούμενη από εστιασμένη- PCR (nested-pcr) με χρήση εσωτερικού ζεύγους εκκινητών σχεδιασμένων να αναγνωρίζουν την 16S ριβοσωμική περιοχή του φυτοπλάσματος επιτρέπει την ανίχνευση φυτοπλασμάτων σε ποώδη και ξυλώδη φυτά-ξενιστές, καθώς και στα έντομα-φορείς τους (Bertaccini, 2007). Η ανάλυση πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων περιορισμού (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) επίσης χρησιμοποιείται, για την περαιτέρω διαφοροποίηση των στελεχών ενός φυτοπλάσματος (Lee et al., 1998; Lee et al., 2000) Επιδημιολογία Τα φυτοπλάσματα αποικίζουν το φλοίωμα των φυτών. Η μετάδοση και η διασπορά τους στην φύση γίνεται από τρεφόμενα στο φλοίωμα έντομα-φορείς κυρίως των οικογενειών Cicadellidae, Fulgoridae και Cixiidae (Εικόνα 1.22), καθώς και με αγενές πολλαπλασιαστικό υλικό και με εμβολιασμό (Bertaccini, 2007). Η διασπορά τους σε παγκόσμιο επίπεδο γίνεται με τη διακίνηση μολυσμένου πολλαπλασιαστικού υλικού (Lee et al., 1998; Lee et al., 2000; Harrison et al., 2008). Στο εργαστήριο μεταδίδονται και με το φανερόγαμο παράσιτο κουσκούτα. Δεν έχει αναφερθεί μετάδοση μηχανικά με φυτικό χυμό, ενώ υπάρχει αναφορά μετάδοσης φυτοπλάσματος με το σπόρο στη μηδική (Medicago sativa) (Bertaccini, 2007). Εικόνα 1.22: (Αριστερά) Το κοινό καφέ τζιτζικάκι Orosius orientalis (Hemiptera: Cicadellidae) σημαντικός φορέας αρκετών φυτοπλασμάτων παγκοσμίως και έμμεσα υπεύθυνο για την πρόκληση της ασθένειας γιγαντοφθαλμία της ντομάτας, (Κέντρο) Ενήλικο άτομο του Hyalesthes obsoletus (Cixiidae), φορέας του φυτοπλάσματος που είναι υπεύθυνο για την ασθένεια Stolbur, (Δεξιά) Ενήλικο άτομο του Hishimonus phycitis (Cicadellidae), φορέας του φυτοπλάσματος που προκαλεί την ασθένεια σκούπα της μάγισσας της λιμετιάς. 53

56 Ξενιστές φυτοπλασμάτων αποτελούν τόσο τα έντομα-φορείς όσο και τα φυτά. Το εύρος ξενιστών των φυτοπλασμάτων τόσο για τα έντομα-φορείς όσο και για τα φυτάξενιστές ποικίλει ανάλογα με το στέλεχος του φυτοπλάσματος. Ορισμένα φυτοπλάσματα έχουν μικρή εξειδίκευση ως προς τα έντομα-φορείς, ενώ άλλα πολύ μεγάλη. Το εύρος των φυτικών ξενιστών στη φύση για κάθε φυτόπλασμα, καθορίζεται σε μεγάλο βαθμό από τον αριθμό των εντόμων-φορέων που μεταδίδουν το συγκεκριμένο φυτόπλασμα, καθώς και από την διατροφική συμπεριφορά των φορέων (μονο-, ολίγο- ή πολυφάγοι). Η ευπάθεια των φυτών σε ένα συγκεκριμένο φυτόπλασμα, σε συνδυασμό με τις τροφικές προτιμήσεις του εντόμου-φορέα, καθορίζουν σε μεγάλο βαθμό το εύρος ξενιστών του φυτοπλάσματος (Lee et al., 1998; Lee et al., 2000). Τα ζιζάνια όπως και στην περίπτωση των ιών, παίζουν σημαντικό ρόλο στην επιδημιολογία και των φυτοπλασμάτων (Lee et al., 2003) Συμπτώματα Τα φυτά που είναι μολυσμένα από φυτοπλάσματα παρουσιάζουν μια σειρά συμπτωμάτων που υποδεικνύουν έντονες διαταραχές στην φυσιολογική ισορροπία των ορμονών ή των ρυθμιστών ανάπτυξης (Bertaccini, 2007). Τα συμπτώματα περιλαμβάνουν πρασίνισμα των ανθέων, απώλεια των φυσιολογικών χρωμάτων τους, δυσπλασία (Seemuller et al., 1998), φυλλωδία και στειρότητα, μεταχρωματισμό των φύλλων και των βλαστών και καρούλιασμα/συστροφή των φύλλων. Επίσης, συχνά παρατηρούνται αφύσικη επιμήκυνση των μεσογονατίων διαστημάτων που έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό λεπτών βλαστών, βλαστομανία (Lee et al., 2003; Duduk et al., 2007) και εμφάνιση του συμπτώματος «σκούπα της μάγισσας» (Εικόνα 1.23). Η προσβολή οδηγεί αρκετές φορές σε γενικότερη ανάσχεση της ανάπτυξης (μικρά άνθη, μικροφυλλία, βραχυγονάτωση και νανισμό) (Bertaccini, 2007) και σε προοδευτική νέκρωση (κιτρίνισμα ή κοκκίνισμα των φύλλων εκτός εποχής και κατάπτωση) των φυτών (Lee et al., 2000) (Εικόνα 1.23). Εσωτερικά η μόλυνση μπορεί να οδηγήσει σε εκτεταμένη νέκρωση του φλοιώματος και συχνά σε υπερβολικό σχηματισμό ιστού που καταλήγει σε διόγκωση των νευρώσεων. Τα συμπτώματα ποικίλουν ανάλογα με το είδος του φυτοπλάσματος, το στέλεχος (Lee et al., 2004) και το στάδιο της μόλυνσης (Lee et al., 2000). Γενικότερα τα συμπτώματα της μόλυνσης από φυτόπλασμα έχουν σαφή αρνητική επίδραση στα φυτά αν και ορισμένα φυτικά είδη είναι ανεκτικά ή ανθεκτικά στη μόλυνση. Οι οικονομικές απώλειες που προκαλούνται από τη μόλυνση με φυτοπλάσματα κυμαίνονται από μερική μείωση στην απόδοση και στην ποιότητα έως και σε ολική απώλεια της παραγωγής (Lee et al., 2000). 54

57 Εικόνα 1.23: Συμπτώματα ασθενειών που σχετίζονται με προσβολή από φυτοπλάσματα σε ξυλώδεις ξενιστές. Πρώτη σειρά: αμπέλι προσβεβλημένο με τη χρυσίζουσα χλώρωση (Flavescence dorée-fd), κερασιά με αποπληξία, ιαπωνική δαμασκηνιά προσβεβλημένη με λεπτονέκρωση εμφανίζει κατάπτωση του εμβολίου και σκούπα της μάγισσας στο υποκείμενο (δύο τελευταίες φωτογραφίες); Δεύτερη σειρά: καρποί μηλιάς προσβεβλημένης με «σκούπα της μάγισσας», μικροσκοπικοί βλαστοί μηλιάς ως αποτέλεσμα της ασθένειας «σκούπα της μάγισσας», λιμετιά με σύμπτωμα «σκούπα της μάγισσας» και αχλαδιά με κόκκινο φύλλωμα που υποδεικνύει την παρουσία μιας βραδείας κατάπτωσης η οποία σχετίζεται με την παρουσία φυτοπλάσματος Φυτοπλάσματα στην Ελλάδα Στη χώρα μας, οι ασθένειες που οφείλονται σε φυτοπλάσματα δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς. Οι περισσότερες καταγραφές φυτοπλασματικών προσβολών στην Ελλάδα αφορούν κυρίως καρποφόρα δέντρα (ροδακινιά, δαμασκηνιά, μηλιά, αχλαδιά, βερικοκιά) (Tsialis and Rumbos, 1980; Rumbos and Bosabalidis, 1985; Σαΐνης, 2006; Rumbou et al., 2008), το αμπέλι (Davis et al., 1997; Σαΐνης, 2006), την τομάτα (Alivizatos, 1993; Σαΐνης, 2006; Vellios and Lioliopoulou, 2007), καθώς και την ελαιοκράμβη (Maliogka et al., 2009). 55

58 1.12 Σκοπός της Εργασίας Αρκετά είδη της οικογένειας Brassicaceae αποτελούν οικονομικά σημαντικές καλλιέργειες, τόσο παγκοσμίως όσο και στη χώρα μας. Το εκτεταμένο εύρος ιολογικών ασθενειών και οι δυσμενείς συνέπειές τους στις καλλιέργειες ειδών Brassica παγκοσμίως, καθιστούν αναγκαία την καταγραφή της παρουσίας τους και στη χώρα μας. Για το σκοπό αυτό κρίθηκε απαραίτητη η διερεύνηση της παρουσίας και της συχνότητας εμφάνισης των ιών TuMV, CaMV, TSWV, CMV και LMV στα ευρέως καλλιεργούμενα είδη Brassica, B. oleracea var. capitata (λάχανο), B. oleracea var. botrytis (κουνουπίδι) και B. oleracea var. italica (μπρόκολο) και σε διάφορα αυτοφυή φυτά σε περιοχές της Ελλάδας, καθώς και σε μια γειτονική περιοχή της Τουρκίας (Κεφάλαιο 3). Εξίσου απαραίτητος κρίθηκε και ο μερικός χαρακτηρισμός των απομονώσεων των δύο σημαντικότερων από τους παραπάνω ιούς, δηλαδή του TuMV και του CaMV, που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της διατριβής, ως ένα δείγμα της παραλλακτικότητας και της εξέλιξης των στελεχών των δύο ιών στη χώρα μας (Κεφάλαιο 4). Επίσης, δεδομένου ότι οι ιοί TuMV και CaMV βρίσκονται πολύ συχνά σε μικτές μολύνσεις, μελετήθηκε και η επίδραση μικτής μόλυνσης με δύο ελληνικές απομονώσεις των ιών, στην ικανότητα πρόσληψης/μετάδοσης με το φορέα Myzus persicae (Κεφάλαιο 5). Τέλος, τα διαφορετικά συμπτώματα ορισμένων φυτών λάχανου που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της διατριβής, οδήγησαν στην ανίχνευση ενός φυτοπλάσματος, το οποίο και χαρακτηρίστηκε μερικώς (Κεφάλαιο 6). 56

59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2. Γενικά Υλικά και Μέθοδοι 57

60 2.1 Προετοιμασία φυτοδεικτών Τα είδη των φυτοδεικτών που χρησιμοποιήθηκαν ανήκαν στις οικογένειες Solanaceae, Brassicaceae και Asteraceae. (Πίνακας 2.1) (Εικόνα 2.1). Η σπορά των φυτοδεικτών γινόταν σε μίγμα τύρφης - περλίτη (3:1) και η μεταφύτευση σε γλαστράκια στο στάδιο του ενός - δύο πραγματικών φύλλων. Η μόλυνση των φυτοδεικτών γινόταν στο στάδιο των τριών - τεσσάρων πραγματικών φύλλων. Πριν από τη μόλυνση, οι φυτοδείκτες διατηρούταν για 24 περίπου ώρες στο σκοτάδι. Πίνακας 2.1: Οικογένειες και είδη φυτοδεικτών. Solanaceae Brassicaceae Nicotiana benthamiana Brassica oleracea var. capitata conv. alba N. rustica B. oleracea var. italica N. glutinosa B. oleracea var. botrytis N. tabacum cv Samsun B. rapa subsp. pekinensis N. clevelandii B. rapa N. cavicola Eruca sativa Physalis floridana Raphanus sativus Asteraceae Lactuca sativa Τα σπορεία και τα μεταφυτευμένα φυτά αναπτύσσονταν σε θάλαμο ανάπτυξης με θερμοκρασία C και φωτοπερίοδο φώς:σκοτάδι 16:8 h. 2.2 Μηχανικές μολύνσεις - Βιοδοκιμές Για τη μηχανική μετάδοση των ιών στο εργαστήριο το μολυσμένο φυτικό υλικό εκχυλίστηκε με φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (0,01 M NaH2PO4, ph 7,0) που περιείχε 0,01 Μ θειώδες νάτριο (Na2SO3). Σε δύο-τρία από τα φύλλα κάθε φυτοδείκτη έγινε επίπαση με ένα λεπτό στρώμα Carborundum (ανθρακοπυρίτιο) από ένα πλαστικό δοχείο καλυμμένο με τούλι και στη συνέχεια έγινε επάλειψη με το εκχύλισμα του φυτικού υλικού στα φύλλα των φυτοδεικτών. Τρία λεπτά μετά τη μόλυνση, τα φύλλα ξεπλύθηκαν με νερό βρύσης και τα φυτά μεταφέρθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης φυτών στους C, με φωτοπερίοδο φώς:σκοτάδι 16:8 h για τρεις-τέσσερις εβδομάδες. 58

61 2.3 Μετάδοση με Αφίδες Χρησιμοποιήθηκαν αφίδες του είδους Myzus persicae (κόκκινος κλώνος) (Εικόνα 2.2) οι οποίες παραχωρήθηκαν από το Εργαστήριο Εντομολογίας και Γεωργικής Ζωολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Στο εργαστήριο οι αφίδες διατηρήθηκαν σε αυτοσχέδιους κλωβούς οι οποίοι έφεραν ανοίγματα που καλύπτονταν από τούλι για τον αερισμό τους (Εικόνα 2.3). Ως ξενιστές των αφίδων χρησιμοποιήθηκαν υγιή φυτά λάχανου (Brassica oleracea var. capitata conv. αlba). Η θερμοκρασία στην οποία διατηρούταν η αποικία των αφίδων κυμαινόταν από C. Τα λάχανα που προορίζονταν ως ξενιστές πρόσληψης των ιών στις αφιδομεταδόσεις μολύνονταν μηχανικά στο στάδιο των τριών - τεσσάρων πραγματικών φύλλων. Τα λάχανα που προορίζονταν ως ξενιστές μετάδοσης στις αφιδομεταδόσεις σπέρνονταν ανά ένα ή ανά δύο σε γλαστράκια και δεν μεταφυτεύονταν για να αποφευχθεί το στρες της μεταφύτευσης. Χρησιμοποιούνταν στις αφιδομεταδόσεις στο στάδιο των 1-2 πραγματικών φύλλων. Τα λάχανα που χρησιμοποιούνταν για πρόσληψη του ιού ανήκαν στη ποικιλία Nobilis (Brassica oleracea var. capitata conv. alba cv Nobilis), ενώ για μετάδοση στην ποικιλία Μαγνησίας ντόπιο (Brassica oleracea var. capitata conv. alba cv Μαγνησίας ντόπιο). 2.4 Προετοιμασία και σύζευξη αντισωμάτων Απομάκρυνση της γλυκερόλης από ακατέργαστο (crude) αντιορό: Για την απομάκρυνση της γλυκερόλης από τον αντιορό χρησιμοποιήθηκαν οι μεμβράνες διαπίδυσης. Ο αντιορός τοποθετήθηκε εντός της μεμβράνης, αφού προηγουμένως το ένα άκρο της έκλεισε με μεταλικό συνδετήρα (κλιπάκι) και ακολούθως κατά τον ίδιο τρόπο έκλεισε και το άλλο άκρο. Η μεμβράνη με τον αντιορό τοποθετήθηκε σε ογκομετρικό κύλινδρο (250 ml) που ήταν γεμάτος με ½x PBS και τοποθετήθηκε να αναδεύεται στο ψυγείο. Το ρυθμιστικό διάλυμα ανανεώθηκε τρεις φορές. Καθαρισμός γ-σφαιρίνης από ακατέργαστο (crude) αντιορό: Ο καθαρισμός της γ- σφαιρίνης έγινε με πρωτεΐνη Α. Ο αντιορός τοποθετήθηκε εντός σύριγγας που έφερε την πρωτεΐνη Α, οπότε και τα αντισώματα συγκρατήθηκαν λόγω χημικής συγγένειας. Τα υπόλοιπα συστατικά του αντιορού εκλούστηκαν και απομακρύνθηκαν. 59

62 Ακολούθησαν διαδοχικά πλυσίματα με ½x PBS με ph 7-8. Για να επιτευχθεί η αποδέσμευση των αντισωμάτων από την πρωτεΐνη Α χρησιμοποιήθηκε διάλυμα με ph 3 (0,16 gr Na 2 HPO H 2 O και 0,525 gr κιτρικό οξύ σε απεσταγμένο νερό έως συμπληρώσεως του όγκου των 100 ml και ρύθμιση του ph στο 3). Για την επιβεβαίωση της παρουσίας των αντισωμάτων στο διάλυμα, έγινε μέτρηση με φωτόμετρο στα 280 nm. Η οπτική πυκνότητα (OD) του διαλύματος έπρεπε να είναι κοντά στο 1.4 που αντιστοιχεί σε 1 mg πρωτεΐνης ανά ml διαλύματος (Clark and Adams, 1977). Για την επαναφορά της δομής των αντισωμάτων χρησιμοποιήθηκαν μικροσωλήνες στους οποίους εισήχθησαν 100 μl 0,5 Μ K 2 HPO 4 με ph 9,5 ώστε το τελικό ph σε όγκο 1 ml να είναι γύρω στο 7-8 και τα αντισώματα να επανέλθουν στην αρχική τους μορφή. Η ποσότητα του αντισώματος που προοριζόταν για σύζευξη με την αλκαλική φωσφατάση χωρίστηκε και το υπόλοιπο αντίσωμα τοποθετήθηκε σε μεμβράνες διαπίδυσης μέσα σε ογκομετρικό κύλινδρο με διαλύτη ½x PBS και τοποθετήθηκε να αναδεύεται όλη νύχτα στο ψυγείο. Την επόμενη μέρα ο διαλύτης ανανεώθηκε και αφέθηκε να αναδεύεται για ακόμη μια νύχτα στο ψυγείο. Ακολούθως το αντίσωμα τοποθετήθηκε σε σωλήνα τύπου falcon, προστέθηκε αζίδιο 100x (1 μl αζίδιο για 100 μl αντιορού) και γλυκερόλη γύρω στο 40% (0,5 ml για 1,5 ml αντιορού), χωρίστηκε σε μικροσωλήνες επικαλυμμένους με σιλικόνη και αποθηκεύτηκε στο ψυγείο. Σύζευξη των ανοσοσφαιρινών με το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση: Για 1 ml αντιορού με οπτική πυκνότητα (OD) 1.4 χρειάστηκαν 1000 units αλκαλική φωσφατάση. Το αντίσωμα αναμείχτηκε με την αλκαλική φωσφατάση και εισήχθηκε σε μεμβράνη διαπίδυσης κατά τον ίδιο τρόπο που περιγράφηκε παραπάνω. Η μεμβράνη διαπίδυσης τοποθετήθηκε σε ογκομετρικό κύλινδρο (500 ml) που περιείχε ½x PBS, ο οποίος αφέθηκε να αναδεύεται όλη νύχτα στο ψυγείο. Την επόμενη μέρα ανανεώθηκε το ½x PBS και προστέθηκε η γλουτεραλδεΰδη (25% γλουτεραλδεΰδη, 600 μl σε 250 ml ½x PBS) για να γίνει η σύζευξη με το ένζυμο και ο ογκομετρικός κύλινδρος αφέθηκε να αναδεύεται 4-5 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως, ο διαλύτης αντικαταστάθηκε με ½x PBS για να απομακρυνθεί η περίσσεια της γλουτεραλδεΰδης και ο ογκομετρικός κύλινδρος αφέθηκε να αναδεύεται όλη νύχτα στο ψυγείο. Τέλος, το συζευγμένο αντίσωμα τοποθετήθηκε σε σωλήνα τύπου falcon, προστέθηκε αζίδιο 100x (1 μl αζίδιο για 100 μl αντιορού) και γλυκερόλη γύρω στο 40% (0,5 ml για 1,5 ml αντιορού), χωρίστηκε σε μικροσωλήνες επικαλυμμένους με σιλικόνη και αποθηκεύτηκε στο ψυγείο. 2.5 Ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Οι δοκιμές ELISA έγιναν σε μικροπλάκες πολυστυρενίου 96 φρεατίων (Εικόνα 2.4). Σε κάθε πλάκα δεν χρησιμοποιήθηκαν τα εξωτερικά φρεάτια και η ποσότητα του διαλύματος που τοποθετήθηκε σε κάθε στάδιο ανά φρεάτιο ήταν 100 μl. 60

63 Το πλύσιμο των μικροπλακών έγινε με PBS-Tween [0.5 ml/lt Tween-20 σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα ph 7.4 (1,4 M NaCl, 0,01 M KH 2 PO 4, 0,08 M Na 2 HPO 4.2H 2 0, 0,02 M KCl)] και πραγματοποιούταν στο τέλος κάθε σταδίου, σε τρείς φάσεις. Στην πρώτη πλύση το PBS- Tween απομακρυνόταν αμέσως, ενώ στις άλλες παρέμενε στις μικροπλάκες για τρία λεπτά. Σε κάθε δοκιμή ELISA εκτός από τα φυτικά δείγματα τοποθετήθηκαν 2 θετικοί, 2 αρνητικοί μάρτυρες και 2 βοθρία με PBS-Tween Άμεση ανοσοενζυμική δοκιμή DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich ELISA) Οι δοκιμές DAS-ELISA πραγματοποιήθηκαν για τους ιούς CMV, LMV, TSWV, CaMV και Alfalfa mosaic virus (AMV) και βασίστηκαν στο πρωτόκολλο των Clark & Adams (1977). Η κάθε δοκιμή ολοκληρωνόταν σε τέσσερα στάδια όπως περιγράφεται στην εικόνα 2.5. Οι αραιώσεις των αντισωμάτων (IgG και IgGc) που χρησιμοποιήθηκαν για κάθε ιό, δίνονται στον πίνακα 2.2. Εικόνα 2.5: Τα 4 στάδια της DAS-ELISA. (1) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος IgG σε διάλυμα επιστρώσεως της πλάκας (coating buffer), (2) Προσθήκη του ομογενοποιημένου με διάλυμα εκχύλισης των δειγμάτων (PBS-Tween) δείγματος (αραιωμένο 1/10), (3) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος συζευγμένου με αλκαλική φωσφατάση IgG σε PBS-Tween (στην περίπτωση του CaMV σε PBS-Tween + 0.2% BSA), (4) Προσθήκη του υποστρώματος, φωσφορική παρανιτροφαινόλη PNPP (p-nitrophenylphosphate), 1 mgr/ml διαλύματος υποστρώματος (substrate buffer). Σε κάθε στάδιο η επώαση των μικροπλακών πραγματοποιoύταν ως εξής: (1) στους 37 C για 3 h (στην περίπτωση του CaMV για 4 h), (2) στους 4 C για h (όλη νύχτα στο ψυγείο), (3) στους 37 C για 3 h (στην περίπτωση του CaMV για 1 h). Οι μικροπλάκες, μετά την προσθήκη του υποστρώματος (4 ο στάδιο) αφήνονταν σε θερμοκρασία δωματίου για 1-2 ώρες, ανάλογα με το αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε, για την ανάπτυξη του χρώματος. 61

64 Πίνακας 2.2: Αραιώσεις πολυκλωνικών αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανίχνευση των ιών CaMV, CMV, LMV, TSWV και AMV στην ανοσοενζυμική δοκιμή DAS-ELISA. Ιός Αραίωση αντισώματος Προέλευση αντισώματος IgG συζευγμένο IgG CaMV 1:200 1:200 Adgen phytodiagnostics CMV (crude) 1:750 1:750 Falk LMV 1:1000 1:1000 Adgen phytodiagnostics TSWV (crude) 1:500 1:500 Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας ΑΠΘ AMV 1:750 1: Έμμεση ανοσοενζυμική δοκιμή TAS-ELISA (Triple Antibody Sandwich ELISA) Οι δοκιμές TAS-ELISA πραγματοποιήθηκαν για τον TuMV με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων (MAbs) και ολοκληρωνόταν σε πέντε στάδια (Εικόνα 2.6). Οι αραιώσεις για το πολυκλωνικό αντίσωμα (1 ο στάδιο), το μονοκλωνικό αντίσωμα (EMA 67) (3 ο στάδιο) και το αντι-αντίσωμα (anti-mouse) (4 ο στάδιο) που χρησιμοποιήθηκαν, ήταν αντίστοιχα 1/1000, 1/2500 και 1/3000. Εικόνα 2.6: Τα 5 στάδια της TAS-ELISA. (1) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος IgG σε διάλυμα επιστρώσεως της πλάκας (coating buffer), (2) Προσθήκη του ομογενοποιημένου με διάλυμα εκχύλισης των δειγμάτων (PBS-Tween) δείγματος (αραιωμένο 1/10), (3) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος των μονοκλωνικών αντισωμάτων (EMA 67) σε PBS-Tween + 0.2% BSA + 2% PVP, (4) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος αντι-αντιορού (anti-mouse) συζευγμένου με αλκαλική φωσφατάση σε PBS-Tween + 0.2% BSA + 2% PVP, (5) Προσθήκη του υποστρώματος, φωσφορική παρανιτροφαινόλη PNPP (p-nitrophenylphosphate), 1 mg/ml διαλύματος υποστρώματος (substrate buffer). 62

65 Σε κάθε στάδιο η επώαση των μικροπλακών πραγματοποιούταν ως εξής: (1) στους 37 C για 3 h, (2) στους 4 C για h (όλη νύχτα στο ψυγείο), (3) στους 37 C για 3 h, (4) στους 37 C για 3 h. Οι μικροπλάκες, μετά την προσθήκη του υποστρώματος (5 ο στάδιο) αφήνονταν σε θερμοκρασία δωματίου για 1ώρα, για την ανάπτυξη του χρώματος Ανοσοενζυμική δοκιμή ACP-ELISA (Antigen Coated Plated ELISA) Οι δοκιμές ACP-ELISA πραγματοποιήθηκαν για την ανίχνευση ιών του γένους Potyvirus με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων (MAbs) (AGDIA) και ολοκληρωνόταν σε τέσσερα στάδια (Εικόνα 2.7). Το μονοκλωνικό αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε σε αραίωση 1:1500 και το αντιαντίσωμα (anti-mouse) σε αραίωση 1:3000, διαλυμένα και τα δύο σε PBS-Tween, χωρίς την προσθήκη BSA ή PVP. Εικόνα 2.7: Τα 4 στάδια της ACP-ELISA. (1) Προσθήκη στα φρεάτια της πλάκας του ομογενοποιημένου με διάλυμα εκχύλισης των δειγμάτων (PBS-Tween) δείγματος (αραιωμένο 1/10), αφού προηγουμένως έχουν τοποθετηθεί 80 μl διαλύματος επιστρώσεως της πλάκας (Coating Buffer), (2) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος των μονοκλωνικών αντισωμάτων σε PBS-Tween, (3) Τοποθέτηση στα φρεάτια της πλάκας του διαλύματος αντιαντιορού (anti-mouse) συζευγμένου με αλκαλική φωσφατάση σε PBS-Tween, (4) Προσθήκη του υποστρώματος, φωσφορική παρανιτροφαινόλη PNPP (p-nitrophenylphosphate), 1 mgr/ml διαλύματος υποστρώματος (substrate buffer). Σε κάθε στάδιο η επώαση των μικροπλακών πραγματοποιούταν ως εξής: (1) στους 4 C για h (όλη νύχτα στο ψυγείο), (2) στους 37 C για 3 h, (3) στους 37 C για 3 h. Οι μικροπλάκες, μετά την προσθήκη του υποστρώματος (4 ο στάδιο) αφήνονταν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, για την ανάπτυξη του χρώματος. Η οπτική πυκνότητα (Ο.Π.) τόσο στην DAS όσο και στις TAS και ACP-ELISA καταγράφηκε με ειδικό φωτόμετρο (Labsystems multiskan RC) στα 405 nm (ποσοτική εκτίμηση των αποτελεσμάτων). Ως θετικά θεωρήθηκαν τα δείγματα των οποίων η Ο.Π. ήταν τουλάχιστον η διπλάσια της Ο.Π. του υγιούς μάρτυρα. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στην ELISA και η σύστασή τους δίνονται στο παράρτημα Α (σελ. 119). 63

66 2.6 Μοριακές δοκιμές - Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Polymerase chain reaction, PCR) Εκχύλιση ολικού RNA-DNA (RNA-DNA Extraction) Η εκχύλιση ολικού RNA-DNA πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Chatzinasiou et al. (2010) ως εξής. Αρχικά, τα δείγματα εκχυλίστηκαν σε διάλυμα ομογενοποίησης (lysis buffer) σε αραίωση 1/10, τοποθετήθηκαν σε μικροσωλήνα και φυγοκεντρήθηκαν στις rpm για 1 λεπτό. Στη συνέχεια, 700 μl από το υπερκείμενο μεταφέρθηκαν σε νέο μικροσωλήνα και ακολούθησε θέρμανση στους 65 C για 10 λεπτά. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις rcf για 10 λεπτά και 500 μl του υπερκειμένου μεταφέρθηκαν σε νέο μικροσωλήνα. Για την εκχύλιση RNA, στον μικροσωλήνα προστέθηκαν 625 μl αιθανόλης (100%) και μετά από ανάμιξη τοποθετήθηκαν σε μικροστήλη που περιείχε silica (glass fiber- GF), για την δέσμευση του νουκλεϊκού οξέος. Για την εκχύλιση DNA τα 500 μl του υπερκειμένου μεταφέρθηκαν απευθείας στη μικροστήλη χωρίς να προηγηθεί ανάμιξη με αιθανόλη. Ακολούθησε φυγοκέντρηση στις rcf για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, ο μικροσωλήνας του κάτω μέρους της μικροστήλης μαζί με το διάλυμα που εκλούστηκε απορρίφθηκε και στη θέση του τοποθετήθηκε νέος κενός. Στη μικροστήλη προστέθηκαν 700 μl του πρώτου διαλύματος έκπλυσης (wash 1 buffer) και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις rcf για 1 λεπτό. Ο μικροσωλήνας του κάτω μέρους της μικροστήλης απορρίφθηκε. Η ίδια διαδικασία επαναλήφθηκε μόνο που αυτή τη φορά στη μικροστήλη προστέθηκαν 700 μl του δεύτερου διαλύματος έκπλυσης (wash 2 buffer) και ξανά ακολούθησε φυγοκέντρηση στις rcf για 1 λεπτό. Το δεύτερο διάλυμα έκπλυσης ήταν διαφορετικό ανάλογα εάν γινόταν εκχύλιση RNA ή εκχύλιση DNA (wash 2 RNA ή wash 2 DNA buffer). Στη συνέχεια, ο μικροσωλήνας του κάτω μέρους της μικροστήλης απορρίφθηκε όπως και προηγουμένως και στη θέση του μπήκε νέος κενός. Στη μικροστήλη προστέθηκαν 400 μl του δεύτερου διαλύματος έκπλυσης (wash 2) και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις rcf για 2 λεπτά. Ο μικροσωλήνας του κάτω μέρους της μικροστήλης απορρίφθηκε και στη θέση του μπήκε νέος κενός. Οι μικροστήλες έμειναν ανοιχτές για 30 λεπτά τουλάχιστον σε θερμοκρασία δωματίου, έως ότου εξατμιστεί όλη η αιθανόλη. Ακολούθησε προσθήκη 80 μl διαλύματος έκλουσης (elution buffer) [TE (1x)] αφού προηγουμένως είχε ζεσταθεί για 10 λεπτά στους 95 C. Οι μικροστήλες με το διάλυμα έκλουσης αφέθηκαν 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις rcf για 3 λεπτά. Το νουκλεϊκό οξύ αποδεσμεύτηκε από το silica, συσσωρεύτηκε στον κάτω μικροσωλήνα και ήταν έτοιμο 64

67 για χρήση ή αποθήκευση στην κατάψυξη στους -20 ºC. Το επάνω μέρος της μικροστήλης απορρίφθηκε. Τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στην εκχύλιση του ολικού RNA-DNA και η σύστασή τους δίνονται στο παράρτημα Β (σελ. 119) PCR για την ανίχνευση του CaMV και φυτοπλασμάτων Για την πραγματοποίηση της PCR ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκαν 5 μl εκχυλίσματος ολικού DNA από τα δείγματα που ήταν μολυσμένα με το φυτόπλασμα και 2 μl εκχυλίσματος ολικού DNA από τα δείγματα καλλιεργούμενων Brassica και ζιζανίων που είχαν θετική αντίδραση με τη μέθοδο ELISA στον CaMV. Η ανίχνευση του CaMV πραγματοποιήθηκε με δύο διαφορετικά ζεύγη εκκινητών (Πίνακας 2.3). Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε μικροσωλήνα των 0.2 ml σε ένα διάλυμα αντίδρασης τελικού όγκου 30 μl για το φυτόπλασμα και 20 μl για τον CaMV το οποίο περιείχε: 10 mm Tris-HCl ph 8.8, 50 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.2 mm από κάθε dntp, 0.4 μm από κάθε εκκινητή, από τους εκκινητές τόσο του φυτοπλάσματος όσο και του CaMV (P1, P7 για το φυτόπλασμα, CM42F, CM42R και CaMV-6-F, CaMV-6- R για τον CaMV), 1 μονάδα Dynazyme II DNA πολυμεράση και απεσταγμένο νερό που είχε υποστεί μεταχείριση με DEPC μέχρι συμπλήρωσης του όγκου των 25 μl στην περίπτωση του φυτοπλάσματος και μέχρι συμπλήρωσης του όγκου των 18 μl στην περίπτωση του CaMV. Η αντίδραση της PCR πραγματοποιήθηκε σε θερμοκυκλοποιητή με τα ακόλουθα θερμικά προφίλ: Φυτόπλασμα 10 στους 94 C, 40 κύκλοι αποτελούμενοι από 45 στους 94 C, 40 στους 55 C, 1.5 στους 72 C. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με επώαση για 10 στους 72 C. CaMV (εκκινητές: CM42F, CM42R) 10 στους 95 C, 40 κύκλοι αποτελούμενοι από 40 στους 95 C, 40 στους 50 C, 40 στους 72 C. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με επώαση για 5 στους 72 C. CaMV (εκκινητές: CaMV-6-F, CaMV-6-R) 10 στους 94 C, 35 κύκλοι αποτελούμενοι από 30 στους 94 C, 40 στους 60 C, 1 στους 72 C. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με επώαση για 10 στους 72 C Εστιασμένη PCR (nested-pcr) για την ανίχνευση φυτοπλασμάτων Στην περίπτωση του φυτοπλάσματος, για την παραγωγή επαρκούς ποσότητας του προϊόντος της PCR και αύξηση της ευαισθησίας της μεθόδου, την πρώτη PCR ακολούθησε και μια εστιασμένη PCR. Ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκαν 2 μl από το προϊόν της πρώτης PCR. Η διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε μικροσωλήνα των 0.2 ml σε ένα διάλυμα αντίδρασης τελικού όγκου 20 μl το οποίο περιείχε: 10 mm Tris-HCl ph 8.8, 50 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 65

68 0.2 mm από κάθε dntp, 0.4 μm από τον εκκινητή R16F2n, 0.4 μm από τον εκκινητή R16R2, 1 μονάδα Dynazyme II DNA πολυμεράση και απεσταγμένο νερό που είχε υποστεί μεταχείριση με DEPC μέχρι συμπλήρωσης του όγκου των 18 μl. Η αντίδραση της εστιασμένης PCR πραγματοποιήθηκε σε θερμοκυκλοποιητή με το ακόλουθο θερμικό προφίλ: 10 στους 94 C, 40 κύκλοι αποτελούμενοι από 45 στους 94 C, 40 στους 58 C, 1.5 στους 72. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με επώαση για 10 στους 72 C Αντίστροφη Μεταγραφή ακολουθούμενη από PCR (Reverse transcription PCR) σε ένα μικροσωλήνα (RT-PCR one tube) Για την ανίχνευση του TuMV η RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα στάδιο και η αντίδραση ολοκληρώθηκε σε ένα μικροσωλήνα. Ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκαν 2 μl εκχυλίσματος ολικού RNA από δείγματα καλλιεργούμενων Brassica, βιολέτας και ζιζανίων που είχαν θετική αντίδραση με τη μέθοδο ELISA για την παρουσία του TuMV. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε ένα μικροσωλήνα των 0.2 ml σε ένα διάλυμα αντίδρασης τελικού όγκου 25 μl το οποίο περιείχε: 10 mm Tris-HCl ph 8.8, 50 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.5 mm DTT, 0.25 mm από κάθε dntp, 0.2 μm από τον εκκινητή TuMV F, 0.2 μm από τον εκκινητή TuMV R, 1 μονάδα Dynazyme II DNA πολυμεράση, 25 μονάδες Rnase H αντίστροφη μεταγραφάση (MMLV) και απεσταγμένο νερό που είχε υποστεί μεταχείριση με DEPC μέχρι συμπλήρωσης του όγκου των 23 μl. Η αντίδραση της RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε θερμοκυκλοποιητή με το ακόλουθο θερμικό προφίλ: 1 h στους 42 C, 10 στους 95 C, 35 κύκλοι αποτελούμενοι από 20 στους 94 C, 30 στους 53.5 C και 1 στους 72 C. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με επώαση για 5 στους 72 C Αντίστροφη Μεταγραφή ακολουθούμενη από PCR (Reverse transcription PCR) σε δύο μικροσωλήνες (RT-PCR two tubes) Για την ανίχνευση ιών του γένους Potyvirus και Polerovirus (RNA ιοί), και στη συνέχεια δύο από τους ιούς του γένους Polerovirus (BWYV και TuYV) που προσβάλλουν είδη του γένους Brassica, η RT-PCR πραγματοποιήθηκε σε δύο χωριστά στάδια. Αρχικά έγινε η αντίστροφη μεταγραφή (Reverse transcription, RT) και στη συνέχεια ακολούθησε η PCR (RT-PCR two tubes). Αντίστροφη Μεταγραφή (Reverse transcription, RT) Για τον έλεγχο της παρουσίας ιών του γένους Polerovirus ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκαν 2 μl εκχυλίσματος ολικού RNA από δείγματα καλλιεργούμενων συμπτωματικών Brassica, που όμως έδωσαν αρνητική αντίδραση όταν εξετάστηκαν με τη μέθοδο ELISA για τους ιούς TuMV, CaMV, CMV, LMV και TSWV. 66

69 Για τον έλεγχο της παρουσίας ιών του γένους Potyvirus ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκαν 2 μl εκχυλίσματος ολικού RNA από δείγματα που έδωσαν θετική αντίδραση για τον TuMV με τη μέθοδο ELISA, αλλά δεν υπήρξε ενίσχυση με τους εξειδικευμένους εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τον ιό. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε ένα μικροσωλήνα των 0.2 ml σε ένα διάλυμα αντίδρασης τελικού όγκου 20 μl το οποίο περιείχε: 50 mm Tris-HCl ph 8.3, 75 mm KCl, 3 mm MgCl 2, 50 u M-MLV αντίστροφη μεταγραφάση (Invitrogen, The Netherlands), 15 u αναστολέα ριβουνοκλεασών (RNase inhibitor) (RNaseOUT TM, Invitrogen, The Netherlands), 10 mm DTT, 0.25 mm από κάθε dntp, 1 μm από τον εκκινητή PolGenDown2 στην περίπτωση των Polerovirus ή 2 μm από τον εκκινητή 28V στην περίπτωση των Potyvirus και απεσταγμένο νερό που είχε υποστεί μεταχείριση με DEPC μέχρι συμπλήρωσης του όγκου των 18 μl. Η αντίδραση της RT πραγματοποιήθηκε σε θερμοκυκλοποιητή με τα ακόλουθα θερμικά προφίλ: Polerovirus 60 στους 45 C και στη συνέχεια 10 στους 95 C. Potyvirus 50 στους 42 C και στη συνέχεια 5 στους 95 C. Γενική PCR για Polero-ιούς Τα δείγματα εξετάστηκαν για την παρουσία Polero-ιών και αφορούσαν καλλιεργούμενα συμπτωματικά Brassica, που όμως είχαν δώσει αρνητική αντίδραση για την παρουσία οποιουδήποτε από τους 5 ιούς (TuMV, CaMV, CMV, LMV και TSWV) όταν εξετάστηκαν με τη μέθοδο ELISA. Ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκαν 2 μl cdna από την RT που προηγήθηκε. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε ένα μικροσωλήνα των 0.2 ml σε ένα διάλυμα αντίδρασης τελικού όγκου 20 μl το οποίο περιείχε: 20 mm Tris-HCl ph 8.4, 50 mm KCl, 1 u Platinum Taq DNA πολυμεράση (Invitrogen, The Netherlands), 1.0 mm MgCl 2, 0.2 mm από κάθε dntp, 0.8 mm από τον ανοδικό εκκινητή PolGenUp2 μm, 1 μm από τον καθοδικό εκκινητή PolGenDown, 2.5% DMSO και απεσταγμένο νερό που είχε υποστεί μεταχείριση με DEPC μέχρι συμπλήρωσης του όγκου των 18 μl. Η αντίδραση της PCR πραγματοποιήθηκε σε θερμοκυκλοποιητή με το ακόλουθο θερμικό προφίλ: 5 στους 95 C, 40 κύκλοι αποτελούμενοι από 30 στους 95 C, 10 στους 58 C, 10 στους 54 C, 10 για 52 C και 30 στους 72 C. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με επώαση για 5 στους 72 C. Εξειδικευμένη PCR για τους Polero-ιούς BWYV και TuYV και για ιούς του γένους Potyvirus Τα δείγματα που εξετάστηκαν για ιούς του γένους Potyvirus (Poty-specific) είχαν δώσει θετική αντίδραση με τη μέθοδο ELISA για την παρουσία του TuMV αλλά δεν ενισχύθηκαν με τους εξειδικευμένους εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τον ιό. Δείγματα τα οποία είχαν δείξει θετικά όταν ελέγχτηκαν με γενική PCR για Poleroιούς στη συνέχεια ελέγχτηκαν εξειδικευμένα για τους BWYV και TuYV. 67

70 Ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκαν 2 μl cdna από την RT που προηγήθηκε. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε ένα μικροσωλήνα των 0.2 ml σε ένα διάλυμα αντίδρασης τελικού όγκου 20 μl το οποίο περιείχε: 10 mm Tris-HCl ph 8.8, 50 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.1% Triton x-100, 1 u Platinum Taq DNA πολυμεράση (Invitrogen, The Netherlands), 0.2 mm από κάθε dntp, 0.4 μm από τους εκκινητές BWYV-Up και BWYV-Down στην περίπτωση του BWYV ή 0.2 μm από τους εκκινητές TuYV-Up και TuYV-Down στην περίπτωση του TuYV ή 1 μm από τους εκκινητές 28V και Small στην περίπτωση του Poty-specific και απεσταγμένο νερό που είχε υποστεί μεταχείριση με DEPC μέχρι συμπλήρωσης του όγκου των 18 μl. Η αντίδραση της PCR πραγματοποιήθηκε σε θερμοκυκλοποιητή με τα ακόλουθα θερμικά προφίλ: BWYV και TuYV 5 στους 95 C, 40 κύκλοι αποτελούμενοι από 30 στους 95 C, 20 στους 60 C και 30 στους 72 C. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με επώαση για 5 στους 72 C. Poty-specific 10 στους 95 C, 40 κύκλοι αποτελούμενοι από 30 στους 95 C, 30 στους 51 C, 40 στους 72 C. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με επώαση για 5 στους 72 C. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για την ειδική και γενική ανίχνευση των ιών και του φυτοπλάσματος, καθώς και το μέγεθος του προβλεπόμενου κάθε φορά προϊόντος δίνονται στον πίνακα

71 Πίνακας 2.3: Αλληλουχίες εκκινητών για την ειδική και γενική ανίχνευση των ιών και του φυτοπλάσματος. Δίνονται τα Tm των εκκινητών καθώς και το μέγεθος του προβλεπόμενου προϊόντος. Ιός Εκκινητής Αλληλουχία 5 3 Tm ( C) Προϊόν TuMV TuMV F CAA GCA ATC TTT GAG GAT TAT G 52.2 TuMV R TAT TTC CCA TAA GCG AGA ATA C CaMV CM42F GGA AAC AGT GCT TCA TCC TC CM42R TCG CTG CAA CGG CTT CTA AG CaMV-6-F ACG CGT CGA CAT GGA GAA CAT AGA AAA AC CaMV-6-R ACG CGT CGA CTC AAT CCA CTT GCT TTG AA Polerovirus (RT) PolGenDown2 ACC TCG ACT TTR AAR CC * - Polerovirus (PCR) BWYV TuYV BMYV PolGenUp2 GAT GAR GGT CGY TAC CG * PolGenDown2 ACC TCG ACT TTR AAR CC * BWYV-Up ACC CTG CTY GCG CAG C * 59 BWYV-Down GTA TTT CCC YAG GTC GGT GCT AAC TG * 61 TuYV-Up GCA ATA GAC TTA CCA TCG ACC TCA ACC 60 TuYV-Down TTT GGG CTA AAA GGG TAC CAT CAC TC 59 BMYV-Up CGG ACA AGT CGT CGA TTT CAT GC 60 BMYV-Down GTA TCG ACT TAG GTC TGC ATC TAC AG 58 Potyvirus (RT) 28V CGA TCC CGG GTT TTT TTT TTT TTT TTT V * - Potyvirus (PCR) Φυτόπλασμα (PCR) Φυτόπλασμα 28V CGA TCC CGG GTT TTT TTT TTT TTT TTT V * Small ATG GTI TGG TGY ATH GAR AAY GG * P1 AAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG GAT T P7 CGT CCT TCA TCG GCT CTT R16F2n GAA ACG ACT GCT AAG ACT GG (nested-pcr) R16R2 TGA CGG GCG GTG TGT ACA AAC CCC G bp 724 bp bp 593 bp 168bp 114bp 424bp 750 bp bp bp [Για την εύρεση των θερμοκρασιών τήξεως (Tm) χρησιμοποιήθηκε το υπολογιστικό πρόγραμμα OligoCalc (Kibbe, 2007) ( *: Οι επεξηγήσεις των συμβόλων εκφυλισμού δίνονται στο παράρτημα Γ 69

72 2.6.6 Ανίχνευση και αλληλούχιση προϊόντων της PCR Η ανίχνευση των τελικών προϊόντων της PCR πραγματοποιήθηκε σε συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης με μέσο διαχωρισμού πηκτή αγαρόζης [1.5% w/v UltraPure TM αγαρόζης (Invitrogen, The Netherlands) σε 1x TAE] σε διάλυμα ηλεκτροφόρισης TAE 1x (Tris Acetate EDTA: 0.04 M Tris-Acetate, M EDTA ph 8). Δέκα (10) μl από το προϊόν της PCR αναμείχθηκαν με 1 μl διαλύματος φόρτωσης (loading buffer: 50% γλυκερόλη, 0.01 Μ NaH 2 PO 4 ph 7.0, 0.4% κυανούν της βρωμοφαινόλης) και τοποθετήθηκαν στα φρεάτια της πηκτής. Στην ηλεκτροφόριση συμπεριλήφθηκε και ένας δείκτης μοριακού βάρους (Μ.Β) (100 bp DNA Ladder, New England BioLabs). Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε σε τάση 110 V. Στη συνέχεια, η πηκτή εμβαπτίστηκε σε υδατικό διάλυμα βρωμιούχου αιθιδίου (0.5 mg/ml) για 20 λεπτά και τοποθετήθηκε σε τράπεζα φθορισμού υπεριώδους (UV transiluminator) για την απεικόνιση των φθοριζουσών ζωνών του DNA. Για να γίνει η αλληλούχιση των γονιδιακών περιοχών των ιών και του φυτοπλάσματος, η φθορίζουσα ζώνη αφαιρέθηκε από την πηκτή με τη βοήθεια αποστειρωμένης λεπίδας. Ακολούθησε καθαρισμός και εξαγωγή του DNA από την πηκτή με την χρήση του NucleoTrap purification kit (Macherey-Nagel, Duren, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, το καθαρό πλέον προϊόν στάλθηκε για αλληλούχιση στη GATC Biotech AG (Konstanz, Germany). 70

73 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3. Συχνότητα εμφάνισης των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV σε καλλιεργούμενα φυτά της οικ. Brassicaceae και σε αυτοφυή φυτά σε περιοχές της Ελλάδας και της Τουρκίας 71

74 3.1 Εισαγωγή Η καλλιέργεια φυτών της οικογένειας Brassicaceae και ειδικότερα του γένους Brassica αποτελεί για αρκετές χώρες σε ολόκληρο τον κόσμο από τις σημαντικότερες καλλιέργειες λαχανοκομικών φυτών (Decoteau, 2000; Nebreda et al., 2004; Farzadfar et al., 2007; Spence et al., 2007; Kirino et al., 2008). Στην Ελλάδα το λάχανο και το κουνουπίδι καλλιεργούνται σε όλους σχεδόν τους νομούς και όσων αφορά τα λαχανοκομικά είδη, η καλλιέργεια τους έρχεται δεύτερη μετά την καλλιέργεια της τομάτας (Ε.Σ.Υ.Ε.). Ωστόσο, πολλές ιολογικές ασθένειες προσβάλουν αυτές τις καλλιέργειες προκαλώντας μείωση της απόδοσης, υποβάθμιση της ποιότητας έως και ολοκληρωτική απώλεια της παραγωγής (Raybould et al., 1999; Hunter et al., 2002; Farzadfar et al., 2007; Spence et al., 2007). Οι TuMV και CaMV είναι οι επικρατέστεροι και σημαντικότεροι ιοί που μολύνουν είδη του γένους Brassica (Tomlinson and Ward, 1981; Farzadfar et al., 2007; Spence et al., 2007), ενώ μολύνονται και από τους CMV, LMV και TSWV οι οποίοι σε ορισμένες περιπτώσεις δημιουργούν σοβαρά προβλήματα (Moreno et al., 2004; Nebreda et al., 2004; Kirino et al., 2008). Οι TuMV, CMV, LMV και TSWV έχουν ένα αρκετά εκτεταμένο εύρος ξενιστών που περιλαμβάνει πολλές φυτικές οικογένειες και ενδημούν στη χώρα μας (Κυριακοπούλου, 1987; Chatzivassiliou et al., 1996; Salomon και Κατής, 1996; Σκλαβούνος κ.ά., 1998; Varveri and Boutsika, 1999; Chatzivassiliou et al., 2000; Δόβας κ.ά., 2000α, β; Chatzivassiliou et al., 2001; Dovas, 2001; Chatzivassiliou et al., 2004; Μπερμπάτη κ.ά., 2006). Ωστόσο, σε καλλιέργειες Brassica στην Ελλάδα έχει αναφερθεί μόνο ο TuMV (Jenner κ.ά., 1994; Walkey and Pink, 1988; Sanchez et al., 2003; Μπερμπάτη κ.ά., 2006; Sanchez et al., 2007). Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της παρουσίας και της συχνότητας εμφάνισης των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV σε καλλιέργειες φυτών της οικογένειας Brassicaceae και ειδικότερα φυτών του γένους Brassica (B. oleracea var. capitata, B. oleracea var. botrytis, B. oleracea var. italica) σε περιοχές της Ελλάδας και σε μια γειτονική περιοχή της Τουρκίας, καθώς και ο εντοπισμός τους σε ζιζάνια-ξενιστές. 72

75 3.2 Υλικά και μέθοδοι Δειγματοληψίες Καλλιεργούμενα φυτά της οικογένειας Brassicaceae και ιδιαίτερα του γένους Brassica (Πίνακας 3.1) και αυτοφυή φυτά διαφόρων οικογενειών συλλέχθηκαν από επτά νομούς της Ελλάδας (Πίνακας 3.2) και από την Ανδριανούπολη της Τουρκίας. Οι δειγματοληψίες έγιναν τυχαία και περιελάμβαναν δείγματα φύλλων, φυτών που εκδήλωναν συμπτώματα ή χωρίς συμπτώματα. Τα φυτά με συμπτώματα εμφάνιζαν μωσαϊκό, ποικιλοχλώρωση, ίκτερο, λεύκανση των νευρώσεων, μεσονεύρια χλώρωση, χλωρωτικά ή νεκρωτικά δαχτυλίδια, χλωρωτικές ή νεκρωτικές κηλίδες, παραμόρφωση φύλλων και νανισμό. Συνολικά συλλέχθηκαν 440 δείγματα καλλιεργούμενων φυτών από την Ελλάδα και την Τουρκία και 656 δείγματα αυτοφυών φυτών από διάφορες περιοχές της Ελλάδας. Πλέον αυτών συλλέχθηκαν και 24 φυτά βιολέτας (Matthiola incana) με συμπτώματα διάσπασης του χρώματος των ανθέων και μωσαϊκό φύλλων, τα οποία προέρχονταν από τους νομούς Πέλλας, Καρδίτσας και Πιερίας. Τα δείγματα συσκευάζονταν σε πλαστικές σακούλες και αποθηκεύονταν στην κατάψυξη στους -20 ή στους -80 C έως ότου ελεγχθούν. Ιστός από όλα τα δείγματα λυοφιλοποιήθηκε επίσης για μακροχρόνια αποθήκευση Έλεγχος των δειγμάτων Ορολογική ανίχνευση Η ορολογική ταυτοποίηση των ιών πραγματοποιήθηκε με την ανοσοενζυμική δοκιμή της άμεσης DAS-ELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (Clark and Adams, 1977) για τους CaMV, CMV, LMV, TSWV, AMV, της έμμεσης TAS-ELISA (Triple Antibody Sandwich ELISA) για τον TuMV και της ACP-ELISA (Antigen Coated Plated ELISA) για ιούς του γένους Potyvirus (Poty-specific) όπως περιγράφεται στο υποκεφάλαιο 2.5. Οι δοκιμές ELISA πραγματοποιήθηκαν για την ανίχνευση των ιών στα δείγματα που συλλέχθηκαν στον αγρό ή σε φυτά που μολύνθηκαν μηχανικά στο εργαστήριο. Στην περίπτωση των οροθετικών ζιζανίων στους CaMV και TuMV με την δοκιμή ELISA, τα δείγματα επανελέγχτηκαν και μοριακά μετά από ομαδοποίηση με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) όπως περιγράφεται παρακάτω. Καλλιεργούμενα φυτά με συμπτώματα ικτέρου τα οποία δεν αντέδρασαν θετικά για κανέναν από τους CaMV, TuMV, CMV, LMV, TSWV όταν ελέγχτηκαν με την δοκιμή ELISA, ελέγχτηκαν με PCR για την ανίχνευση της παρουσίας ιών του γένους Polerovirus, όπως περιγράφεται παρακάτω. 73

76 Μοριακή ανίχνευση Μοριακή ανίχνευση των CaMV και TuMV σε δείγματα αυτοφυών φυτών: Τα δείγματα αυτοφυών φυτών που έδωσαν ορολογική θετική αντίδραση για τους CaMV και TuMV επανελέγχτηκαν και μοριακά με τη μέθοδο της PCR. Η εκχύλιση του ολικού RNA-DNA των δειγμάτων έγινε όπως περιγράφεται στο υποκεφάλαιο 2.6 με τη μόνη διαφορά ότι ο ιστός που χρησιμοποιήθηκε ήταν λυοφιλοποιημένος και τα δείγματα ομαδοποιήθηκαν πριν την εκχύλιση. Η ομαδοποίηση των δειγμάτων πραγματοποιήθηκε για κάθε είδος φυτού και το κάθε δείγμα αποτελούνταν από 2 ή το πολύ 3 διαφορετικά φυτά του ίδιου είδους. Η μέθοδος της PCR, καθώς και η ανίχνευση των προϊόντων της πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο υποκεφάλαιο 2.6 για τους ιούς CaMV και TuMV. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση του CaMV ήταν οι CM42F και CM42R (Agama et al., 2002; Farzadfar et al., 2007) και του TuMV οι TuMV F και TuMV R (Sanchez et al., 2003). Τα προϊόντα της PCR για τους δύο ιούς ήταν αντίστοιχα 724 bp και 986 bp. Μοριακή ανίχνευση ιών του γένους Polerovirus: Δείγματα που έφεραν συμπτώματα αλλά δεν αντέδρασαν θετικά για την παρουσία κανενός εκ των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV με τη μέθοδο της ELISA, ούτε έδωσαν κάποιο αποτέλεσμα με τις μηχανικές μολύνσεις που να παραπέμπει ενδεχομένως σε κάποιον άλλο μηχανικώς μεταδιδόμενο ιό, ελέγχτηκαν με PCR για την παρουσία ιών του γένους Polerovirus που προσβάλλουν φυτά της οικογένειας Brassicaceae. Η εκχύλιση του ολικού RNA των δειγμάτων, η μέθοδος της PCR και η ανίχνευση των προϊόντων της πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο υποκεφάλαιο 2.6. Τα δείγματα που έδωσαν θετική αντίδραση στην γενική PCR για Polero-ιούς, στη συνέχεια ελέγχθηκαν με την εξειδικευμένη PCR για τους ιούς BWYV και TuYV. Η μέθοδος της PCR και οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την γενική και εξειδικευμένη ανίχνευση των ιών του γένους Polerovirus πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τον Λώτο (2009). Βιοδοκιμές Η μηχανική μετάδοση στο εργαστήριο και η ανάπτυξη των φυτοδεικτών πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο 2. Για τον CaMV χρησιμοποιήθηκαν κυρίως λάχανο (Brassica oleracea var. capitata conv. alba), κουνουπίδι (B. oleracea var. botrytis) και μπρόκολο (B. oleracea var. italica), ενώ για τον TuMV χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον τα είδη Nicotiana glutinosa και N. benthamiana. Για τον CMV χρησιμοποιήθηκαν κυρίως τα είδη N. glutinosa, N. tabacum cv Samsun, για τον LMV τα είδη N. benthamiana και Lactuca sativa και για τον TSWV τα N. rustica και N. tabacum cv Samsun. Εάν το μόλυσμα προερχόταν από 74

77 καλλιεργούμενα Brassica και για τους ιούς αυτούς στις μηχανικές μολύνσεις χρησιμοποιούνταν επιπλέον τα τρία Brassica που αναφέρονται παραπάνω. Στις περιπτώσεις των συμπτωματικών φυτών που δεν έδωσαν θετική ορολογική αντίδραση σε κανέναν από τους πέντε ιούς, πραγματοποιήθηκαν μηχανικές μολύνσεις στο σύνολο των φυτοδεικτών που αναφέρονται στο υποκεφάλαιο Αποτελέσματα Παρουσία των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV σε καλλιεργούμενα φυτά της οικογένειας Brassicaceae. Σε ένα σημαντικά μικρό αριθμό δειγμάτων καλλιεργούμενων φυτών διαπιστώθηκε η παρουσία των ιών σε διάφορες περιοχές της Ελλάδας και της Τουρκίας. Ωστόσο, και τα τρία βασικά είδη του γένους Brassica (Brassica oleracea var. capitata conv. alba, Brassica oleracea var. italica, Brassica oleracea var. botrytis) που ελέγχθηκαν βρέθηκαν να είναι μολυσμένα από ιούς. Ο CaMV ήταν ο πιο διαδεδομένος ιός σε όλους τους ξενιστές (Πίνακας 3.1). Συγκεκριμένα σε φυτά λάχανου (Brassica oleracea var. capitata conv. alba) ανιχνεύθηκαν οι CaMV, TuMV, CMV και TSWV. Τα ποσοστά των CaMV και TuMV ήταν αντίστοιχα 15,6% και 4,2%, ενώ οι CMV και TSWV βρέθηκαν σε ένα ποσοστό μόλυνσης της τάξεως του 1,2% (Πίνακας 3.1). Σε φυτά μπρόκολου (Brassica oleracea var. italica) ανιχνεύθηκαν και οι πέντε ιοί. Για τον CaMV το ποσοστό μόλυνσης, το οποίο αποτελεί και το υψηλότερο ποσοστό που καταγράφηκε σε καλλιεργούμενο ξενιστή, ήταν 19,5%. Για τον TuMV το ποσοστό μόλυνσης ήταν 8,7%, για τους CMV και LMV ήταν 1,3% και για τον TSWV ήταν 2,7% (Πίνακας 3.1). Σε κουνουπίδια (Brassica oleracea var. botrytis) ανιχνεύθηκαν οι CaMV, LMV και TSWV σε ποσοστά μόλυνσης 8,6%, 2,9% και 2,9% αντίστοιχα (Πίνακας 3.1). Όσον αφορά τα υπόλοιπα καλλιεργούμενα είδη, σε κόκκινο λάχανο (Brassica oleracea var. capitata conv. rubra) βρέθηκε ο TuMV (6,7%), σε ρόκα (Eruca sativa) ο CaMV, ενώ στην ελαιοκράμβη και σε σινάπι (Brassica juncea) δεν ανιχνεύθηκε κανένας από τους παραπάνω ιούς (Πίνακας 3.1). Τα οροθετικά δείγματα για τους CaMV και TuMV επιβεβαιώθηκαν στο μεγαλύτερο μέρος με μηχανικές μολύνσεις σε κατάλληλους φυτοδείκτες, αλλά και με μοριακές μεθόδους (PCR). Δείγματα που έδωσαν θετική αντίδραση στην ELISA αλλά δεν μπόρεσαν να επιβεβαιωθούν με μηχανικές μολύνσεις ελέγχτηκαν και με PCR. Τα οροθετικά δείγματα για τους CMV, LMV και TSWV δεν επιβεβαιώθηκαν με μηχανικές μολύνσεις. Σε δύο δείγματα με συμπτώματα ικτέρου, που δεν αντέδρασαν θετικά για την παρουσία κανενός εκ των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV με τη μέθοδο της 75

78 ELISA και με αρνητικά αποτελέσματα στις μηχανικές μολύνσεις, ανιχνεύθηκε ο TuYV. Η παρουσία των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV (Μέσος Όρος) σε καλλιεργούμενα φυτά της οικογένειας Brassicaceae στις διάφορες περιοχές της χώρας και της Τουρκίας απεικονίζεται στο σχεδιάγραμμα 3.1. Σχεδιάγραμμα 3.1: Μέσος όρος παρουσίας των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV σε καλλιέργειες φυτών της οικογένειας Brassicaceae σε περιοχές της Ελλάδας και της Τουρκίας. Αναλυτικότερα, ο CaMV ανιχνεύθηκε στο νομό Θεσσαλονίκης σε ποσοστό μόλυνσης 19%, στο νομό Καρδίτσας 4,2% και στην περιοχή Κάραγατς της Τουρκίας σε ποσοστό μόλυνσης 45,4%, ενώ δεν ανιχνεύτηκε στους νομούς Κοζάνης, Ροδόπης, Τρικάλων, Ημαθίας και Σερρών (Πίνακας 3.2). Ο TuMV ανιχνεύθηκε στο νομό Θεσσαλονίκης σε ποσοστό μόλυνσης 9,4%, στο νομό Καρδίτσας 2,6%, στο νομό Ροδόπης 8,3%, στην περιοχή Κάραγατς της Τουρκίας σε ποσοστό 3,2%, ενώ δεν ανιχνεύθηκε στους νομούς Κοζάνης, Τρικάλων, Ημαθίας και Σερρών (Πίνακας 3.2). Οι CMV, LMV και TSWV ανιχνεύθηκαν στο νομό Θεσσαλονίκης σε ποσοστά μόλυνσης 1,4%, 1,4% και 2,2% και Καρδίτσας σε ποσοστά μόλυνσης 0,5%, 1% και 1,5%. Οι CMV και TSWV ανιχνεύθηκαν επιπλέον και στο νομό Τρικάλων σε ποσοστά μόλυνσης 3,3% και 6,7% αντίστοιχα (Πίνακας 3.2). Από τις περιοχές που πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες καλλιεργούμενων φυτών της οικογένειας Brassicaceae, ο CaMV εμφάνισε το μεγαλύτερο μέσο ποσοστό προσβολής (45,4%) στην περιοχή Κάραγατς της Τουρκίας με τα ποσοστά μόλυνσης να κυμαίνονται από 14,3% έως 64,7%, ενώ ο TuMV εμφάνισε το μεγαλύτερο μέσο ποσοστό προσβολής (9,4%) στο νομό Θεσσαλονίκης με τα ποσοστά μόλυνσης να κυμαίνονται από 0% έως 17,1% (Πίνακας 3.2). 76

79 Πίνακας 3.1: Καλλιεργούμενα είδη της οικογένειας Brassicaceae από περιοχές της Ελλάδας και της Τουρκίας, που ελέγχθηκαν με δοκιμές ELISA για την παρουσία των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV. Ιός που ανιχνεύτηκε Είδος Κοινό όνομα CMV LMV TSWV TuMV CaMV Brassica oleracea var. capitata Λάχανο λευκό 2/165 (1,2%) 0/165 2/165 (1,2%) 7/165 (4,2%) 22/141 (15,6%) conv. alba Brassica oleracea var. capitata Λάχανο κόκκινο 0/15 0/15 0/15 1/15 (6,7%) 0/15 conv. rubra Brassica oleracea var. italica Μπρόκολο 2/149 (1,3%) 2/149 (1,3%) 4/149 (2,7%) 13/149 (8,7%) 29/149 (19,5%) Brassica oleracea var. botrytis Κουνουπίδι 0/68 2/68 (2,9%) 2/68 (2,9%) 0/68 5/58 (8,6%) Eruca sativa Ρόκα 0/32 0/32 0/32 0/32 1/15 (6,7%) Brassica juncea Σινάπι 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Brassica napus Ελαιοκράμβη 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 αριθμός θετικών δειγμάτων/αριθμός δειγμάτων που ελέγχθηκαν; ( ) εντός παρενθέσεως: ποσοστό μόλυνσης %; x: δεν ελέγχθηκαν Πίνακας 3.2: Παρουσία των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV σε καλλιεργούμενα Brassicaceae. Μέσος όρος προσβολής σε περιοχές της Ελλάδας και της Τουρκίας. Ιός που ανιχνεύτηκε Νομός Περιοχή / Πόλη, Χωριό CMV LMV TSWV TuMV CaMV Τουρκία Κάραγατς/ 0/52 0/52 0/52 2/52 (3,2%) 25/52 (45,4%) Ανδριανούπολη Θεσ/νίκη Θεσ/νίκη 2/138 (1,4%) 2/138 (1,4%) 3/138 (2,2%) 13/138 (9,4%) 24/126 (19%) Καρδίτσα Καρδίτσα 1/194 (0,5%) 2/194 (1%) 3/194 (1,5%) 5/194 (2,6%) 7/167 (4,2%) Κοζάνη Κοζάνη 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Ροδόπη Κομοτηνή 0/12 0/12 0/12 1/12 (8,3%) x Τρίκαλα Αγία Κυριακή/ Τρίκαλα 1/30 (3,3%) 0/30 2/30 (6,7%) 0/30 0/30 Ημαθία Νησί/ Αλεξάνδρεια 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Σέρρες Ροδολίβος/ Αμφίπολη 0/8 0/8 0/8 0/8 0/8 αριθμός θετικών δειγμάτων/αριθμός δειγμάτων που ελέγχθηκαν; ( ) εντός παρενθέσεως: ποσοστό μόλυνσης %; x: δεν ελέγχθηκαν 77

80 3.3.2 Παρουσία των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV σε φυτά βιολέτας (Matthiola incana) Δειγματοληψίες φυτών Βιολέτας (Matthiola incana) πραγματοποιήθηκαν από τους νομούς Πέλλας, Καρδίτσας και Πιερίας. Τα δείγματα ελέγχθηκαν για την παρουσία των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV με τη μέθοδο της ELISA. Όσα δείγματα δεν έδωσαν ορολογική θετική αντίδραση για κάποιον από τους ιούς αυτούς ελέγχθηκαν ορολογικά και για AMV αλλά και για ιούς του γένους Potyvirus (Potyspecific). Σε φυτά βιολέτας ταυτοποιήθηκε μόνο ο TuMV, σε δείγματα που προέρχονταν από τους νομούς Καρδίτσας (9/13, θετικά δείγματα/δείγματα που ελέγχθησαν) και Πιερίας (5/5) με το μέσο ποσοστό προσβολής σε κάθε νομό να είναι αντίστοιχα 69,2% και 100% αλλά όχι σε δείγματα από το νομό Πέλλας (6 δείγματα ελέγχθησαν). Μηχανική μετάδοση του ιού επιτεύχθηκε μόνο στο φυτοδείκτη Nicotiana glutinosa και τα φυτά εμφάνισαν ήπιο μωσαϊκό. Η μετάδοση από φυτοδείκτη σε φυτοδείκτη του ιδίου είδους ήταν αρκετά δύσκολη. Ο ορολογικός έλεγχος των φυτοδεικτών (ELISA) έδειξε ότι η συγκέντρωση του ιού στους ιστούς των μολυσμένων φυτών ήταν ιδιαίτερα χαμηλή, καθώς οι τιμές της Ο.Π. ήταν πολύ πιο χαμηλές από αυτής του θετικού μάρτυρα που ήταν λάχανο Παρουσία των CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV σε αυτοφυή είδη Συλλέχθηκαν συνολικά 35 διαφορετικά είδη ζιζανίων που ανήκαν σε 15 οικογένειες. Σε 19 φυτικά είδη που ανήκαν σε 10 οικογένειες ανιχνεύθηκε ένας από τους ιούς CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV. Ωστόσο οι μολύνσεις δεν επιβεβαιώθηκαν με μηχανική μετάδοση, αλλά ούτε και με PCR για τους ιούς CaMV και TuMV. Συγκεκριμένα, ο CaMV ανιχνεύτηκε στα είδη Sonchus oleraceus, Sinapis arvensis, Lamium amplexicaule και Rumex crispus που ανήκουν σε τέσσερις διαφορετικές οικογένειες και ο TuMV ανιχνεύτηκε στα είδη Amaranthus retroflexus, Silybum marianum, S. oleraceus, Sonchus asper, Anthemis arvensis και S. arvensis που ανήκουν σε τρεις διαφορετικές οικογένειες. Ο CMV ανιχνεύτηκε στα είδη S. oleraceus, L. amplexicaule και Solanum nigrum που ανήκουν σε τρεις διαφορετικές οικογένειες, ενώ ο LMV ανιχνεύτηκε στα είδη A. retroflexus, S. oleraceus, A. arvensis, Artemisia vulgaris, Capsella bursa-pastoris, S. arvensis, Chenopodium album, Convolvulus arvensis, Euphorbia helioscopia, Glechoma hederacea, R. crispus, Solanum eleagnifolium και S. nigrum που ανήκουν σε εννιά διαφορετικές οικογένειες. Τέλος, ο TSWV ανιχνεύτηκε στα είδη A. retroflexus, Conyza sp., Senecio vulgaris, S. marianum, S. oleraceus, S. asper, A. arvensis, Melissa officinalis, Abutilon theophrasti και R. crispus που ανήκουν σε πέντε διαφορετικές οικογένειες. (Πίνακας 3.3). 78

81 Στα παρακάτω είδη των αντίστοιχων οικογενειών δεν ανιχνεύθηκε κανένας ιός (στην παρένθεση ο αριθμός των δειγμάτων που ελέγχθησαν), Asteraceae: Conyza bonariensis (1), Lactuca serriola (5), Chamomilla recutita (2), Cirsium arvense (5), Boraginaceae: Asperugo procumbens (6), Brassicaceae: Cardaria draba L.(5), Sisymbrium spp. (28), Caprifoliaceae: Sambucus ebulus (1), Fumariaceae: Fumaria officinalis (8), Lamiaceae: Ballota nigra (6), Malvaceae: Malva sp. (3), Papaveraceae: Papaver rhoeas (36), Polygonaceae: Polygonum aviculare (3), Scrophulariaceae: Veronica hederifolia (2) και Solanaceae: Datura stramonium (13). 79

82 Πίνακας 3.3: Αυτοφυή φυτά από διάφορες περιοχές της Ελλάδας, που βρέθηκαν θετικά σε δοκιμές ELISA για την παρουσία κάποιου από τους ιούς CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV. Ιός που ανιχνεύθηκε Οικογένεια Είδος Κοινό όνομα CMV LMV TSWV TuMV CaMV Amaranthaceae Amaranthus Βλήτο τραχύ 0/33 16/33 1/33 2/33 x retroflexus Asteraceae Conyza sp. Κόνυζα 0/2 0/2 1/2 0/2 x Senecio vulgaris Μαρτιάκος 0/11 0/11 1/11 0/11 x Silybum Κουφάγκαθο 0/19 0/19 1/19 1/19 0/5 marianum Sonchus Ζωχός 1/96 27/96 16/96 29/96 29/90 oleraceus Sonchus asper Ζωχός τραχύς 0/15 0/15 8/15 4/15 x Anthemis arvensis Ανθεμίδα 0/7 1/7 3/7 2/7 x Artemisia Αρτεμίσια 0/2 1/2 0/2 0/2 x vulgaris Brassicaceae (Cruciferae) Capsella bursapastoris Sinapis arvensis Καψέλλα Άγριο σινάπι 0/36 0/160 1/36 1/160 0/36 0/160 0/36 1/160 0/17 1/145 Chenopodiaceae Chenopodium Λουβουδιά 0/31 5/31 0/31 0/31 0/3 album Convolvulaceae Convolvulus Περιπλοκάδα 0/6 2/6 0/6 0/6 x arvensis Euphorbiaceae Euphorbia Μεγάλη 0/5 1/5 0/5 0/5 0/5 helioscopia γαλατσίδα Lamiaceae Lamium Λάμιο 1/16 0/16 0/16 0/16 1/8 amplexicaule Melissa officinalis Μελισσόχορτο 0/1 0/1 1/1 0/1 x Glechoma - 0/13 2/13 0/13 0/13 0/13 hederacea Malvaceae Abutilon Αγριομπαμπακιά 0/15 0/15 1/15 0/15 x theophrasti Polygonaceae Rumex crispus Λάπαθο 0/37 14/37 1/37 0/37 1/26 Solanaceae Solanum eleagnifolium Σολανό 0/8 8/8 0/8 0/8 x Solanum nigrum Στύφνος, 2/19 1/19 0/19 0/19 x Αγριοτομάτα αριθμός θετικών δειγμάτων/αριθμός δειγμάτων που ελέγχθηκαν; x: δεν ελέγχθηκαν 80

83 3.4 Συζήτηση Τα καλλιεργούμενα φυτά της οικογένειας Brassicaceae και ειδικότερα του γένους Brassica αποτελούν ιδιαίτερα σημαντικά λαχανοκομικά φυτά παγκοσμίως (Decoteau, 2000; Nebreda et al., 2004; Farzadfar et al., 2007; Spence et al., 2007; Kirino et al., 2008), υποβαθμίζονται όμως σημαντικά από ιούς και συναφή παθογόνα. Ειδικότερα, οι ιοί CaMV και TuMV είναι από τους πιο επιβλαβείς, καθώς προκαλούν μείωση της απόδοσης και υποβάθμιση της ποιότητας των προϊόντων (Farzadfar et al., 2007; Spence et al., 2007; Tomlinson and Ward, 1981), ενώ μικρότερης σημασίας είναι οι CMV, LMV και TSWV (Moreno et al., 2004). Εκτός από τον CaMV που μολύνει μόνον φυτά της οικογένειας Brassicaceae (Haas et al., 2002; Farzadfar et al., 2007), οι άλλοι ιοί έχουν αρκετά εκτεταμένο εύρος ξενιστών, με τους CMV και TSWV να μολύνουν περισσότερα από φυτικά είδη (Varveri and Boutsika, 1999; Walsh et al., 2002; Peters, 2004; German-Retana et al., 2008). Στη χώρα μας οι TuMV, CMV, LMV και TSWV έχουν αναφερθεί σε διάφορα φυτά (Κυριακοπούλου, 1987; Chatzivassiliou et al., 1996; Salomon και Κατής, 1996; Σκλαβούνος κ.ά., 1998; Varveri and Boutsika, 1999; Chatzivassiliou et al., 2000; Δόβας κ.ά., 2000α,β; Dovas, 2001; Μπερμπάτη κ.ά., 2006). Στις καλλιέργειες των Brassica, αν και σημαντικός αριθμός φυτών φέρουν ιολογικά συμπτώματα, μέχρι σήμερα έχει ταυτοποιηθεί μόνο ο TuMV (Jenner κ.ά., 1994; Walkey and Pink, 1988; Sanchez et al., 2003; Μπερμπάτη κ.ά., 2006; Sanchez et al., 2007). Για το σκοπό αυτό, έγινε προσπάθεια ταυτοποίησης των ιών που απαντώνται στις καλλιέργειες του γένους αυτού. Στη μελέτη αυτή, αν και περιορισμένη ως προς την έκταση των δειγματοληψιών εντοπίστηκαν και οι πέντε ιοί. Τα ποσοστά μόλυνσης των CaMV και TuMV κυμάνθηκαν σε χαμηλά επίπεδα, αν και ο CaMV ήταν σχετικά πιο διαδεδομένος. Ο CaMV ανιχνεύθηκε στο νομό Θεσσαλονίκης σε ποσοστό μόλυνσης 19%, στο νομό Καρδίτσας 4,2% και στην περιοχή Κάραγατς της Τουρκίας σε ποσοστό 45,4%. Ωστόσο, ο ιός είναι ευρέως διαδεδομένος μεταξύ καλλιεργούμενων και αυτοφυών Brassica στο Ηνωμένο Βασίλειο, την Ισπανία και σε άλλες μεσογειακές χώρες (Raybould et al., 1999; Moreno et al., 2004; Spence et al., 2007). Ο TuMV ανιχνεύθηκε στο νομό Θεσσαλονίκης σε ποσοστό μόλυνσης 9.4%, στο νομό Καρδίτσας 2,6%, στο νομό Ροδόπης 8,3% και στην περιοχή Κάραγατς της Τουρκίας σε ποσοστό 3,2%. Τα χαμηλά ποσοστά μόλυνσης του TuMV προκαλούν εντύπωση, καθώς υπάρχουν αναφορές για εκδήλωση επιδημιών στη χώρα μας, όπου ο ιός κατετάχθη μέσα στους 4 οικονομικά σημαντικότερους ιούς που μολύνουν λαχανοκομικές καλλιέργειες (Sanchez et al.,2007). Επίσης, είναι ευρέως διαδεδομένος σε καλλιέργειες Brassica σε πολλές χώρες της Ευρώπης (Moreno et al., 2004; Spence et al., 2007). Τα υψηλότερα ποσοστά μόλυνσης των TuMV και CaMV στις άλλες χώρες ενδεχομένως 81

84 να οφείλονται στην ύπαρξη περισσότερων πηγών αλλά και φορέων των ιών, στην επικράτηση ευνοϊκότερων συνθηκών μόλυνσης των φυτών και στην καλλιέργεια περισσότερο ευπαθών ποικιλιών. Τα ποσοστά προσβολής για τους ιούς CMV, LMV και TSWV ήταν ιδιαίτερα χαμηλά. Είναι γεγονός ότι η οικογένεια Brassicaceae δεν είναι ιδιαίτερα ευπαθής στους ιούς αυτούς. Ωστόσο, σε άλλες χώρες έχουν καταγραφεί σε υψηλή συχνότητα σε είδη Brassica (Ισπανία) (Moreno et al., 2004). Τα χαμηλά ή μηδενικά μέσα ποσοστά προσβολής στους νομούς και στις περιοχές που ελέγχτηκαν δεν αποκλείουν βέβαια την ύπαρξη υψηλότερων ποσοστών σε άλλους νομούς και άλλες περιοχές της Ελλάδας. Άλλωστε είναι γνωστό ότι υπάρχουν σημαντικές διαφορές στη διακύμανση της συχνότητας εμφάνισης των ιών μεταξύ των διαφόρων περιοχών (Raybould et al., 1999). Λαμβάνοντας υπόψη τον περιορισμένο αριθμό νομών και περιοχών που ελέγχθηκαν, καθώς και τον σχετικά μικρό αριθμό δειγμάτων, μια περισσότερο εκτεταμένη έρευνα με δειγματοληψίες από περισσότερους νομούς και περιοχές της Ελλάδος αλλά και με μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων, θα έδινε μια πιο ξεκάθαρη εικόνα για την παρουσία τον παραπάνω ιών σε καλλιέργειες ειδών Brassica στη χώρα μας. Σημαντικό ρόλο στη παρουσία και την αφθονία κάθε ιού σε μια περιοχή παίζουν επίσης η παρουσία και η αφθονία αυτοφυών φυτών ξενιστών αλλά και των φορέων του ιού που απαντώνται στην συγκεκριμένη περιοχή. Τα ζιζάνια αποτελούν το σημαντικότερο μέσο διαχείμασης ή διαθερισμού για πολλούς σημαντικούς φυτικούς ιούς παγκοσμίως και χρησιμεύουν ως πρωταρχική πηγή μολύσματος για πολλές ιολογικές ασθένειες αλλά και ως καταφύγια και πηγές των εντόμων-φορέων τους (Bos, 1981). Στην παρούσα μελέτη ελέγχθηκαν 656 αυτοφυή φυτά που ανήκαν σε 35 είδη από 15 οικογένειες, εκ των οποίων 19 είδη που ανήκαν σε 10 οικογένειες βρέθηκαν μολυσμένα με έναν από τους ιούς CaMV, TuMV, CMV, LMV και TSWV. Συγκεκριμένα, ο TuMV ανιχνεύθηκε στα είδη Amaranthus retroflexus, Silybum marianum, Sonchus oleraceus, Sonchus asper, Anthemis arvensis, Sinapis arvensis και ο CaMV ανιχνεύθηκε στα είδη S. oleraceus, S. arvensis, Lamium amplexicaule και Rumex crispus. Τα S. oleraceus, S. asper και S. arvensis έχουν ήδη αναφερθεί ως ξενιστές του TuMV (Stobbs and Stirling, 1990; Brunt et al., 1996; Chivasa et al., 2002) ενώ τα A. retroflexus, S. marianum και A. arvensis αναφέρονται για πρώτη φορά. Αντίστοιχα, τα S. oleraceus και S. arvensis έχουν επίσης αναφερθεί ως ξενιστές του CaMV (Moreno et al., 2004; Dikova, 2008), ενώ τα L. amplexicaule και R. crispus αναφέρονται για πρώτη φορά. Ο CMV ανιχνεύτηκε στα είδη S. oleraceus, L. amplexicaule και Solanum nigrum (Tomlinson et al., 1970; Sacristan et al., 2004) και ο LMV στα είδη S. oleraceus, Chenopodium album και Capsella bursa-pastoris (Moreno et al., 2004; Dinant and 82

85 Lot, 1992), γνωστούς ξενιστές τους. Στα είδη A. retroflexus, A. arvensis, Artemisia vulgaris, S. arvensis, Convolvulus arvensis, Euphorbia helioscopia, Glechoma hederacea, R. crispus, Solanum eleagnifolium και S. nigrum αναφέρεται για πρώτη φορά η παρουσία του LMV. Ο TSWV ανιχνεύτηκε στα ήδη γνωστά είδη A. retroflexus, Conyza sp., Senecio vulgaris, S. marianum, S. oleraceus, S. asper, A. arvensis και R. crispus (Wilson, 1998; Chatzivassiliou et al., 2001; Groves et al., 2002) αλλά και στα είδη Melissa officinalis και Abutilon theophrasti όπου αναφέρεται για πρώτη φορά. Ωστόσο, σε κανένα από τα φυτά αυτά δεν επιβεβαιώθηκε η παρουσία με μηχανικές μολύνσεις σε φυτοδείκτες. Υποθέτουμε ότι ο χαμηλός τίτλος και η σταθερότητα του ιού, η παρουσία αναστολέων στο φυτικό χυμό, η ευπάθεια των φυτοδεικτών και η φυσιολογική τους ηλικία μπορεί να συναίνεσαν στην ανεπιτυχή μετάδοση του ιού (Chatzivassiliou et al., 2004). Στην περίπτωση των TuMV και CaMV, μοριακή ανίχνευση με PCR επίσης δεν επιβεβαίωσε τις θετικές αντιδράσεις της ELISA. Το αποτέλεσμα αυτό μπορεί να εξηγείται είτε από ψευδή θετικά δείγματα (μη ειδικές αντιδράσεις) της μεθόδου ELISA είτε από το γεγονός ότι τα πρωτόκολλα εξαγωγής των νουκλεϊκών οξέων δεν είναι προσαρμοσμένα στο ποικίλο φυτικό υλικό των ζιζανίων όπου εμπεριέχονται διάφοροι αναστολείς, με αποτέλεσμα τη λήψη αρνητικών αποτελεσμάτων. 83

86 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4. Μερικός χαρακτηρισμός απομονώσεων των TuMV και CaMV από ξενιστές της οικογένειας Brassicaceae από περιοχές της Ελλάδας και της Τουρκίας 84

87 4.1 Εισαγωγή Οι TuMV και CaMV αποτελούν σοβαρά παθογόνα των ειδών του γένους Brassica και προκαλούν μείωση της απόδοσης έως ή/και ολοκληρωτική απώλεια της παραγωγής (Tomlinson and Ward, 1981; Farzadfar et al., 2007; Spence et al., 2007). Ο TuMV έχει ένα ασυνήθιστα μεγάλο εύρος ξενιστών, προσβάλει περισσότερα από 318 είδη που ανήκουν σε τουλάχιστον 43 οικογένειες (Walsh et al., 2002) και εμφανίζει υψηλό βαθμό ενδοειδικής παραλλακτικότητας με αποτέλεσμα να απαντώνται πολλά στελέχη (Koike et al., 2007). Ενδημεί στις περισσότερες χώρες του κόσμου και είναι ιδιαίτερα καταστρεπτικός σε καλλιέργειες φυτών του γένους Brassica κυρίως σε ημιτροπικές και εύκρατες περιοχές της Ασίας, Βορείου και Νοτίου Αμερικής, Αφρικής, Νέας Ζηλανδίας, Ωκεανίας και Ευρώπης (Feldman et al., 1972; Ohshima et al., 2002; Walsh et al, 2002; Spence et al., 2007; Farzadfar et al., 2009), ενώ επιδημίες έχουν αναφερθεί και στην Ελλάδα (Sanchez et al., 2007). Η διάκριση των στελεχών του TuMV γίνεται με βάση την παραλλακτικότητα της αλληλουχίας της καψιδιακής πρωτεΐνης (CP) (Sanchez et al., 2003; Ohshima et al., 2002). Ο CaMV έχει αρκετά στενό κύκλο ξενιστών που περιορίζεται σε φυτά της οικογένειας Brassicaceae και ιδιαίτερα σε είδη του γένους Brassica, ενώ ορισμένα στελέχη του μολύνουν και φυτά της οικογένειας Solanaceae και κυρίως είδη των γενών Datura και Nicotiana (Haas et al., 2002; Farzadfar et al., 2007). Απαντάται στις περισσότερες χώρες του κόσμου και ιδιαίτερα σε εύκρατες περιοχές, όπου αναπτύσσονται τα φυτά-ξενιστές του (Farzadfar et al., 2007; Koike et al., 2007). Τα στελέχη του διαφοροποιούνται με βάση την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη P6 και εμπεριέχεται στο ORF6, σημαντική πρωτεΐνη των κυτταροπλασματικών έγκλειστων σωματιδίων (viroplasms) που δημιουργούνται στα μολυσμένα φυτικά κύτταρα (Farzadfar et al., 2007). Στο κεφάλαιο αυτό έγινε μερικός χαρακτηρισμός των απομονώσεων των TuMV και CaMV από φυτά της οικογένειας Brassicaceae και ιδιαίτερα του γένους Brassica. 4.2 Υλικά και Μέθοδοι Χαρακτηρισμός απομονώσεων του TuMV Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από Brassica και βιολέτες στα οποία ο ιός ανιχνεύθηκε με τη μέθοδο της ELISA (Κεφάλαιο 3) και μοριακά με RT-PCR. Η εκχύλιση του ολικού RNA, η PCR και η αλληλούχιση των προϊόντων της PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο υποκεφάλαιο 2.6. Οι εκκινητές TuMV F και TuMV R που χρησιμοποιήθηκαν, ενισχύουν ένα τμήμα 986 bp που περιλαμβάνει 54 bp του 3 -άκρου του γονιδίου NIb, ολόκληρο το γονίδιο της CP και 65 bp της 3 αμετάφραστης περιοχής (Sanchez et al., 2003). 85

88 Σε δύο δείγματα από την Τουρκία στα οποία ο ιός δεν ανιχνεύθηκε με τους εκκινητές TuMV F και TuMV R πραγματοποιήθηκε μια PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές εξειδικευμένους για το γένος του ιού (Poty-specific) (Υποκεφάλαιο 2.6). Οι νουκλεοτιδιακές αλληλουχίες των απομονώσεων αρχικά στοιχήθηκαν με τη χρήση του αλγόριθμου MAFFT έκδοση 6 ( (Katoh and Toh, 2009). Στη συνέχεια, εκτιμήθηκε το πλέον κατάλληλο μοντέλο αντικατάστασης νουκλεοτιδίων με βάση το πρόγραμμα JModeltest έκδοση (Posada, 2008), χρησιμοποιώντας το BIC (Bayesian Information Criterion) στατιστικό κριτήριο για την εύρεση του μοντέλου που περιγράφει καλύτερα τα δεδομένα. Για τις συγκρίσεις των αλληλουχιών ως προς την ομοιότητα των νουκλεοτιδιακών αλληλουχιών τους τόσο μεταξύ τους όσο και με άλλες δημοσιευμένες και καταχωρημένες αλληλουχίες του ιού στη βάση δεδομένων του NCBI (National Centre for Biotechnology Information, Bethesda, USA) ( χρησιμοποιήθηκε η παράμετρος p-distance του φυλογενετικού πακέτου MEGA, έκδοση 4.0 (Tamura et al., 2007; Kumar et al., 2008). Τέλος, το φυλογενετικό δέντρο της CP υπολογίστηκε με τη μέθοδο της μέγιστης πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood, ML) με τη βοήθεια του προγράμματος PhyML έκδοση 3.0 (Guindon and Gascuel, 2003). Για την κατασκευή του φυλογενετικού δέντρου της CP χρησιμοποιήθηκαν οι νουκλεοτιδιακές αλληλουχίες των απομονώσεων που δίνονται στον πίνακα του παραρτήματος Δ (σελ. 121) Χαρακτηρισμός απομονώσεων του CaMV Στη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από Brassica στα οποία ο ιός ανιχνεύθηκε με τη μέθοδο της ELISA (Κεφάλαιο 3) και μοριακά με PCR. Η εκχύλιση του ολικού DNA, η PCR και η αλληλούχιση των προϊόντων της PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο υποκεφάλαιο 2.6. Η ανίχνευση του ιού αρχικά έγινε με τους εκκινητές CM42F και CM42R (Agama et al., 2002; Farzadfar et al., 2007) οι οποίοι ενισχύουν τμήμα του γονιδίου II, μεγέθους 724 bp. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε μια PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές CaMV-6-F και CaMV-6-R οι οποίοι ενισχύουν ένα τμήμα bp που περιλαμβάνει ολόκληρο το γονίδιο VI εκτός από μικρές περιοχές των 3 και 5 άκρων (Farzadfar et al., 2007). Στα προϊόντα αυτής της PCR εφαρμόστηκε η μέθοδος της ανάλυσης πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων περιορισμού (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) και τα δείγματα ομαδοποιήθηκαν με βάση τα προφίλ που έδωσαν μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. 86

89 Ένα αντιπροσωπευτικό δείγμα από κάθε ομάδα καθαρίστηκε από την πηκτή και αλληλουχήθηκε. Από την νέα ομάδα με τον μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων, επιλέχτηκαν δύο δείγματα, ένα ελληνικό και ένα από την Τουρκία (799 και 1044). Δύο δείγματα, ένα από λάχανο και ένα από κουνουπίδι, που συλλέχθηκαν στα Βασιλικά Θεσσαλονίκης, έδωσαν θετική αντίδραση στην πρώτη PCR με τους εκκινητές CM42F και CM42R άλλα όχι στην δεύτερη PCR με τους εκκινητές CaMV- 6-F και CaMV-6-R. Το προϊόν των εκκινητών CM42F και CM42R καθαρίστηκε και αλληλουχήθηκε. Για τις συγκρίσεις των αλληλουχιών ως προς την ομοιότητα των νουκλεοτιδιακών αλληλουχιών τους, χρησιμοποιήθηκε η παράμετρος p-distance του φυλογενετικού πακέτου MEGA, έκδοση 4.0 (Tamura et al., 2007, Kumar et al., 2008). Οι αλληλουχίες συγκρίθηκαν με άλλες δημοσιευμένες και καταχωρημένες αλληλουχίες του ιού στην βάση δεδομένων του NCBI (National Centre for Biotechnology Information, Bethesda, USA) ( με εφαρμογή του αλγόριθμου BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). RFLP Ο χαρακτηρισμός των απομονώσεων πραγματοποιήθηκε με την ανάλυση RFLP. Η ανάλυση RFLP των προϊόντων της PCR έγινε χρησιμοποιώντας το ένζυμο Hpy99I (New England Biolabs) το οποίο αναγνωρίζει και κόβει την νουκλεοτιδική αλληλουχία στο σημείο 5 CGWCG 3. Χρησιμοποιήθηκαν 2 μονάδες ενζύμου και ακολούθησε επώαση στους 37 C για 3 h και στη συνέχεια στους 65 C για 20 min σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (για τελικό όγκο 10 μl: 1 μl 10x NEBuffer, 0.1 μl 100x BSA, 1 μl Hpy99I, 2.9 μl DEPC και 5 μl δείγμα). Τα διαφορετικά προφίλ των δειγμάτων προέκυψαν μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης όπως περιγράφεται στο υποκεφάλαιο Αποτελέσματα Χαρακτηρισμός απομονώσεων του TuMV Οι απομονώσεις του TuMV που χαρακτηρίστηκαν προέρχονταν όλες από την Ελλάδα. Συγκεκριμένα, οι απομονώσεις 910 και 1059 βρέθηκαν σε λάχανο (Brassica oleracea var. capitata conv. alba) και προέρχονταν από την Κομοτηνή και τα Βασιλικά Θεσσαλονίκης αντίστοιχα. Οι απομονώσεις 538, 544 και 4 βρέθηκαν σε βιολέτες (Matthiola incana) και προέρχονταν οι δύο πρώτες από περιοχές της Καρδίτσας και η τρίτη από την ορεινή Πιερία. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι απομονώσεις 910 και 1059 παρουσιάζουν μεταξύ τους τη μέγιστη ομοιότητα (98,7%), ενώ την ελάχιστη οι απομονώσεις 4 και 538 (87,2%). Οι ομοιότητες σε επίπεδο νουκλεοτιδίων μεταξύ των απομονώσεων του TuMV φαίνονται στον πίνακα

90 Πίνακας 4.1: Ομοιότητα % σε επίπεδο νουκλεοτιδίων των απομονώσεων 4, 538, 544, 910 και 1059 του TuMV. Απομόνωση ,2% 87,8% 97,3% 97,8% ,7% 88% 88% ,3% 88,1% ,7% Η φυλογενετική ανάλυση τοποθέτησε τις απομονώσεις 910, 1059 και 4 στην ομάδα World-B, ενώ τις απομονώσεις 538 και 544 στην ομάδα Basal-B, με βάση την ομαδοποίηση των Ohshima et al. (2002). Στο φυλογενετικό δέντρο της εικόνας 4.1 φαίνεται η γενετική συγγένεια των ελληνικών απομονώσεων του TuMV με απομονώσεις άλλων χωρών των οποίων οι αλληλουχίες είναι καταχωρημένες στην βάση δεδομένων του NCBI. Οι αλληλουχίες του TuMV που χαρακτηρίστηκαν στην παρούσα μελέτη δίδονται στο παράρτημα Ε (σελ. 123 ). Σε δύο δείγματα που προέρχονταν από την Ανδριανούπολη της Τουρκίας, στα οποία ο ιός ανιχνεύθηκε ορολογικά με μονοκλωνικά αντισώματα, δεν κατέστη δυνατή η μοριακή ανίχνευση με τους εκκινητές TuMV F και TuMV R (Sanchez et al., 2003, Sanchez et al., 2007). Για τα δείγματα αυτά χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές 28V και Small, εξειδικευμένοι για το γένος του ιού (Poty-specific), οι οποίοι επιβεβαίωσαν την παρουσία ενός ιού του γένους Potyvirus. 88

91 Εικόνα 4.1: Φυλογενετικό δέντρο που κατασκευάστηκε με το πρόγραμμα PhyML (έκδοση 3.0) με βάση το μοντέλο εξέλιξης HKY+I+G, δείχνει τη γενετική συγγένεια μεταξύ των αλληλουχιών του γονιδίου της CP των ελληνικών απομονώσεων και άλλων απομονώσεων του TuMV. 89

92 4.3.2 Χαρακτηρισμός απομονώσεων του CaMV Οι απομονώσεις του CaMV που χαρακτηρίστηκαν προέρχονταν από την Ελλάδα και από την Ανδριανούπολη της Τουρκίας. Συγκεκριμένα, οι απομονώσεις 1091, 1036, 1044 και 1037 προέρχονταν από τα Βασιλικά Θεσσαλονίκης, η πρώτη συλλέχθηκε από κουνουπίδι και οι άλλες από μπρόκολο. Οι απομονώσεις 780, 782, 814, 823, 811, 817, 799 και 819 προέρχονταν από την περιοχή Κάραγατς, της Ανδριανούπολης της Τουρκίας. Οι 780, 782, 814 και 823 βρέθηκαν σε λάχανα, ενώ συλλέχθηκαν από έναν αγρό οι 780 και 782 και από άλλο οι 814 και 823. Οι 811 και 817 βρέθηκαν σε κόκκινα λάχανα (Brassica oleracea var. capitata conv. Rubra) στον ίδιο αγρό και οι 799 και 819 βρέθηκαν σε μπρόκολα σε δύο διαφορετικούς αγρούς. Οι απομονώσεις 907 και 908 βρέθηκαν σε λάχανα από την Κομοτηνή και η απομόνωση 869 βρέθηκε σε λάχανο από την Καρδίτσα. Η ανάλυση RFLP χρησιμοποιώντας το περιοριστικό ένζυμο Hpy99I (Farzadfar et al. 2007) στο προϊόν bp της PCR έδειξε ότι οι παραπάνω απομονώσεις ομαδοποιούνται σε τέσσερις ομάδες σύμφωνα με την ομαδοποίηση των Farzadfar et al. (2007). Η μια από τις τέσσερις ομάδες που σχηματίστηκε, με βάση το προφίλ των θραυσμάτων είναι καινούρια, ενώ οι άλλες τρεις είναι όμοιες με τρεις από τις οκτώ ομάδες που αναφέρονται και από τους Farzadfar et al. (2007) (Εικόνα 4.2). Στην νέα ομάδα ανήκουν η πλειονότητα των απομονώσεων, δηλαδή οι 908, 1036, 817, 811, 1037, 1044, 782, 907, 814, 799 και 869, οι οποίες εμφάνισαν δύο θέσεις περιορισμού στα σημεία 471 και 801, με αποτέλεσμα την παραγωγή τριών προϊόντων μεγέθους 330, 471 και 779 bp. Από την ομάδα αυτή, λόγω του πλήθους των απομονώσεων, επιλέχθηκαν και αλληλουχήθηκαν μια ελληνική (1044) και μια τουρκική (799) απομόνωση. Όταν οι δύο απομονώσεις συγκρίθηκαν με άλλες δημοσιευμένες και καταχωρημένες στην βάση δεδομένων του NCBI αλληλουχίες του ιού, η απομόνωση 799 εμφάνισε μεγαλύτερη ομοιότητα με τις απομονώσεις από το Ιράν (Iranian) (92%) από κουνουπίδια (Brassica oleracea var. botrytis), ενώ η 1044 εμφάνισε μεγαλύτερη ομοιότητα με την κινέζικη απομόνωση Xinjing (96%) από Brassica oleracea. Με βάση την RFLP ανάλυση η απομόνωση 799 έφερε μια νέα θέση περιορισμού στη θέση 471 η οποία δεν εντοπίστηκε στις απομονώσεις του Ιράν, μια θέση περιορισμού στη θέση 801 η οποία εντοπίστηκε και στις απομονώσεις αυτές, ενώ δεν έφερε τις θέσεις 1487 και 439 οι οποίες εντοπίστηκαν στις απομονώσεις από το Ιράν (Εικόνα 4.2). Η απομόνωση 1044 από την άλλη έφερε μια νέα θέση περιορισμού στη θέση 471 και μια στη θέση 801 ήδη υπάρχουσα και σε άλλες απομονώσεις, οι οποίες δεν εντοπίστηκαν στην απομόνωση Xinjing, ενώ δεν έφερε την 1272 η οποία εντοπίστηκε στην απομόνωση Xinjing (Εικόνα 4.2). Όλες οι διαφοροποιήσεις ως προς το προφίλ των θραυσμάτων οφείλονταν σε σημειακές μεταλλαγές στις θέσεις περιορισμού του ενζύμου. 90

93 Εικόνα 4.2: Διαφοροποίηση απομονώσεων του CaMV, που προέρχονται από διάφορες χώρες, με βάση την ανάλυση πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων περιορισμού (RFLP) χρησιμοποιώντας το περιοριστικό ένζυμο Hpy99I. (a) Προφίλ RFLP. Τα μεγέθη των θραυσμάτων περιορισμού (bp) δίνονται μεταξύ των θέσεων περιορισμού. (b) Τοποθέτηση των απομονώσεων σε διαφορετικές RFLP ομάδες. Με βάση την RFLP ανάλυση οι απομονώσεις 819 και 780 ανήκουν στην ομάδα VIII στην οποία εντάσσονται και απομονώσεις από το Ιράν (Εικόνα 4.2), εμφανίζοντας τρεις θέσεις περιορισμού στα σημεία 439, 801 και 1487, οι οποίες οδηγούν στη παραγωγή τεσσάρων προϊόντων μεγέθους 100, 362, 439 και 686 bp. Με βάση τον αλγόριθμο Blast η απομόνωση 780 εμφάνισε τη μεγαλύτερη ομοιότητα με τις απομονώσεις από το Ιράν (96%) αλλά και με την ουγγρική απομόνωση D/H (96%) από Brassica oleracea. Η απομόνωση 1091 ανήκει στην ομάδα I στην οποία ανήκει και η απομόνωση B29 (Εικόνα 4.2) εμφανίζοντας μόνο τη θέση περιορισμού 801, οδηγώντας στην παραγωγή δύο προϊόντων μεγέθους 779 και 801 bp, ενώ και με βάση τον αλγόριθμο Blast εμφάνισε μεγαλύτερη ομοιότητα με την γαλλική απομόνωση B29 (97%) από κουνουπίδι. Τέλος, η απομόνωση 823 εμφάνισε δύο θέσεις περιορισμού στα σημεία 801 και 1487 με παραγωγή τριών προϊόντων μεγέθους 100, 686 και 801 bp και εντάσσεται στην ομάδα V στην οποία ανήκει και η απομόνωση D/H (Εικόνα 4.2). Με βάση τον αλγόριθμο Blast επίσης εμφάνισε τη μεγαλύτερη ομοιότητα με την απομόνωση D/H (97%). Στην εικόνα 4.3 φαίνεται η διασπορά των θραυσμάτων περιορισμού, μετά από χρήση του περιοριστικού ενζύμου Hpy99I στο bp προϊόν της PCR, τεσσάρων αντιπροσωπευτικών δειγμάτων (799, 823, 780 και 1091) για κάθε ομάδα σε πηκτή αγαρόζης. 91

94 Εικόνα 4.3: Ηλεκτροφόρημα προϊόντων PCR τεσσάρων αντιπροσωπευτικών δειγμάτων (από αριστερά προς τα δεξιά: Ladder, 799, 780, 823 και 1091) για κάθε RFLP ομάδα, μετά από μεταχείριση με το περιοριστικό ένζυμο Hpy99I. Διακρίνονται τα διαφορετικά προφίλ των θραυσμάτων περιορισμού. Από τη σύγκριση των αλληλουχιών των πέντε αντιπροσωπευτικών απομονώσεων (799,1044, 823, 780 και 1091), βρέθηκε ότι τη μεγαλύτερη ομοιότητα μεταξύ των γονιδίων του ORF VI παρουσιάζουν οι απομονώσεις 823 και 1091 (96,7%) και την ελάχιστη οι απομονώσεις 780 και 1044 (83%). Οι ομοιότητες σε επίπεδο νουκλεοτιδίων μεταξύ των απομονώσεων του CaMV παρουσιάζονται στον πίνακα 4.2. Οι αλληλουχίες του CaMV που χαρακτηρίστηκαν στην παρούσα μελέτη δίδονται στο παράρτημα Ε (σελ. 123). Πίνακας 4.2: Ομοιότητα % σε επίπεδο νουκλεοτιδίων των απομονώσεων 780, 799, 823, 1044 και 1091 του CaMV. Απομόνωση % 96,6% 83% 96,2% % 86% 91,7% ,6% 96,7% ,3%

95 Η αλληλούχιση του 724 bp προϊόντος των εκκινητών CM42F και CM42R των δύο δειγμάτων από τα Βασιλικά Θεσσαλονίκης (Παράρτημα Ε, σελ. 123), τα οποία έδωσαν θετική αντίδραση με τους εκκινητές CM42F και CM42R άλλα όχι με τους εκκινητές CaMV-6-F και CaMV-6-R επιβεβαίωσε την παρουσία του CaMV στα δύο δείγματα. 4.4 Συζήτηση Στο παρόν κεφάλαιο μελετήθηκε η γενετική παραλλακτικότητα 5 απομονώσεων του TuMV και 15 απομονώσεων του CaMV από ξενιστές της οικογένειας Brassicaceae από περιοχές της Ελλάδας και της Τουρκίας. Για το χαρακτηρισμό των απομονώσεων του TuMV χρησιμοποιήθηκε η αλληλουχία του γονιδίου της καψιδιακής πρωτεΐνης (CP), του οποίου η χρησιμότητα στην ταξινόμηση των στελεχών του ιού είναι αποδεδειγμένη (Sanchez et al., 2003, Sanchez et al., 2007). Η γενετική ανάλυση των ελληνικών απομονώσεων τις τοποθέτησε σε δύο διαφορετικές ομάδες σύμφωνα με την κατάταξη των Ohshima et al. (2002) και Sanchez et al. (2003). Οι απομονώσεις 910, 1059 και 4 ανήκουν στην ομάδα World-B (Ohshima et al. 2002) ή MB σύμφωνα με τους Sanchez et al. (2003), ενώ οι απομονώσεις 538 και 544 στην ομάδα Basal-B (Ohshima et al. 2002) ή OBR σύμφωνα με τους Sanchez et al. (2003). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν και με προηγούμενες έρευνες οι οποίες επίσης τοποθέτησαν απομονώσεις από την Ελλάδα στις ίδιες ομάδες (Μπερμπάτη κ.ά., 2006). Ελληνικές απομονώσεις οι οποίες βρέθηκαν σε ξενιστές εκτός του γένους Brassica ή και της οικογένειας Brassicaceae έχει βρεθεί ότι ανήκουν στην ομάδα OBR (Basal- B) (Ohshima et al., 2002; Sanchez et al., 2003; Tomimura et al., 2004; Sanchez et al., 2007) με αρκετές από αυτές να έχουν βρεθεί σε βιολέτες (Matthiola incana) ενώ άλλες που βρέθηκαν να μολύνουν φυτά του γένους Brassica ανήκουν στην ομάδα World-B (Tomimura et al., 2004; Farzadfar et al., 2009) και έχουν βρεθεί κυρίως σε είδη Brassica oleracea. Η ομάδα OBR (Basal-B) συνήθως περιλαμβάνει απομονώσεις που προέρχονται από ξενιστές εκτός από τα κοινά καλλιεργούμενα είδη του γένους Brassica spp. ή το Raphanus sativus, ενώ οι περισσότερες από αυτές προέρχονται από Μεσογειακές χώρες και επιδεικνύουν χαμηλό επίπεδο προσαρμογής σε σημαντικούς καλλιεργούμενους ξενιστές (Sanchez et al., 2007). Στην προκειμένη περίπτωση οι δύο απομονώσεις (538 και 544) βρέθηκαν σε φυτά βιολέτας από δύο διαφορετικές περιοχές της Καρδίτσας. Με βάση το φυλογενετικό δέντρο που κατασκευάστηκε, η πιο κοντινή γενετική συγγένεια της απομόνωσης 538 είναι με την ιταλική απομόνωση ITA3 από Brassica sp. και της απομόνωσης 544 με την ιρανική απομόνωση IRNTra6 από Rapistrum rugosum. 93

96 Οι άλλες τρείς απομονώσεις (910, 1059 και 4) ανήκουν στην ομάδα World-B. Η ομάδα World-B συνήθως περιλαμβάνει απομονώσεις του ιού οι οποίες προέρχονται από ξενιστές του γένους Brassica (Ohshima et al., 2002), γεγονός που υποδηλώνει μια βιολογική προσαρμογή της ομάδας σε ένα συγκεκριμένο τύπο ξενιστή (Sanchez et al., 2003). Οι απομονώσεις 910 και 1059 βρέθηκαν σε λάχανα (Brassica oleracea var. capitata conv. alba), το πρώτο από την Κομοτηνή και το δεύτερο από τα Βασιλικά Θεσσαλονίκης γεγονός που συμφωνεί και με προηγούμενες έρευνες όπου Ελληνικές απομονώσεις που βρέθηκαν σε είδη Brassica oleracea ανήκαν στην ομάδα World-B (Tomimura et al., 2004; Farzadfar et al., 2009). Βάση του φυλογενετικού δέντρου που κατασκευάστηκε διαπιστώνεται ότι η πιο κοντινή γενετική συγγένεια των απομονώσεων 910 και 1059 είναι με την απομόνωση GRC2 η οποία προέρχεται επίσης από την Ελλάδα και βρέθηκε σε ξενιστή Brassica oleracea. Οι τρείς απομονώσεις φαίνεται να εξελίχθηκαν από έναν κοινό πρόγονο και αποτελούν μια ομάδα ελληνικών απομονώσεων η οποία προσβάλει τα λάχανα. Η απομόνωση 4 βρέθηκε σε βιολέτα από την ορεινή Πιερία. Μέχρι σήμερα οι ελληνικές απομονώσεις που προέρχονταν από βιολέτες τοποθετούνταν στην ομάδα OBR (Basal-B) όπως συνέβη και με τις απομονώσεις 538 και 544. Η απομόνωση 4 ίσως εξαιτίας της γεωγραφικής θέσης του αγρού δειγματοληψίας (κοντά σε καλλιέργειες Brassica) να διαφοροποιήθηκε και να κατάφερε να μεταπηδήσει σε ξενιστή άλλου γένους. Βάση του φυλογενετικού δέντρου η απομόνωση 4 δεν τοποθετείται στον ίδιο κλάδο με τις απομονώσεις 910 και 1059 με τις οποίες, παρά τις μικρές διαφορές τους, προφανώς ακολούθησε διαφορετική εξελικτική πορεία. Επίσης, δεν ομαδοποιείται με καμιά από τις υπόλοιπες απομονώσεις ενώ εμφανίζει μεγαλύτερη συγγένεια με την απομόνωση UK1 από το Ηνωμένο Βασίλειο, η οποία βρέθηκε σε ξενιστή Brassica napus. Το γεγονός ότι η συγκεκριμένη απομόνωση βρέθηκε σε ξενιστή διαφορετικό των Brassica ίσως να αντανακλά το βαθμό της παραλλακτικότητας ή και τη σχετική προσαρμοστικότητα (fitness) ορισμένων απομονώσεων του ιού που υπάρχουν στη χώρα μας. Ο TuMV έχει ένα ασυνήθιστα μεγάλο εύρος ξενιστών και εμφανίζει υψηλό βαθμό ενδοειδικής παραλλακτικότητας που περιλαμβάνει πολλά στελέχη. Το μείζον κέντρο της ποικιλότητας του ιού βρίσκεται στην περιοχή της Ευρώπης-Μεσογείου-Μικράς Ασίας και συνεπώς αυτοί οι παλαιότεροι πληθυσμοί του πιθανώς παρουσιάζουν και τη μεγαλύτερη παραλλακτικότητα η οποία απόδίδεται κυρίως σε γενετικούς ανασυνδιασμούς στελεχών (Sanchez et al., 2007). Για ιούς του γένους Potyvirus η προσαρμογή των στελεχών στους διάφορους ξενιστές αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την ομαδοποίησή τους. Συγκεκριμένα για τον TuMV, γεωγραφικοί λόγοι θεωρείται επίσης ότι επηρεάζουν σημαντικά (Ohshima et al., 2002). Σημαντικές διαφορές έχουν βρεθεί μεταξύ στελεχών του ιού της Ανατολικής Ασίας και της Ευρασίας (Sanchez et al., 2007). Επίσης, υψηλός 94

97 βαθμός διαφοροποίησης του TuMV έχει βρεθεί και στη Νότια Ευρώπη (Sanchez et al., 2007). Η ύπαρξη στην Ελλάδα απομονώσεων που ανήκουν σε τουλάχιστον δύο διαφορετικές ομάδες αλλά και σε γένη ξενιστών εκτός του γένους Brassica αλλά και της οικογένειας Brassicaceae υποδεικνύει τη δυνατότητα έξαρσης κρουσμάτων του ιού και πιθανών μελλοντικών επιδημιών με δυσμενής συνέπειες κυρίως στην παραγωγή λαχανοκομικών καλλιεργειών. Για το χαρακτηρισμό των απομονώσεων του CaMV χρησιμοποιήθηκε η αλληλουχία του γονιδίου που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη P6 και εμπεριέχεται στο ORF6, σημαντική πρωτεΐνη των κυτταροπλασματικών έγκλειστων σωματιδίων (viroplasms). Το συγκεκριμένο ORF χαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα διαφοροποίησης μεταξύ των στελεχών, σε σύγκριση με τα άλλα ORFs του ιού και για αυτό το λόγο χρησιμοποιείται για τη διάκριση των στελεχών (Farzadfar et al., 2007). Οι ελληνικές απομονώσεις χωρίστηκαν σε τέσσερις διαφορετικές ομάδες με βάση την ανάλυση πολυμορφισμού μήκους θραυσμάτων περιορισμού (RFLP). Η μεγαλύτερη ομάδα που σχηματίστηκε, η οποία περιελάμβανε και τις περισσότερες απομονώσεις αποτελεί μια νέα ομάδα, καθώς η δράση του ενζύμου έδωσε δύο θέσεις περιορισμού στα σημεία 471 και 801 που οδήγησαν στη παραγωγή τριών προϊόντων μεγέθους 330, 471 και 779 bp, τα οποία δεν αντιστοιχούν στα προϊόντα καμιάς από τις οκτώ ομάδες που αναφέρονται από τους Farzadfar et al. (2007). Οι απομονώσεις 907 και 908 προέρχονται από λάχανα από την Κομοτηνή, οι 1036, 1037 και 1044 βρέθηκαν σε μπρόκολα από τα Βασιλικά Θεσσαλονίκης, η 869 βρέθηκε σε λάχανο από την Καρδίτσα και οι 782, 814, 811, 817 και 799 βρέθηκαν σε λάχανα, κόκκινα λάχανα (Brassica oleracea var. capitata conv. Rubra) και μπρόκολα από την Ανδριανούπολη της Τουρκίας. Οι υπόλοιπες απομονώσεις τοποθετούνται σε τρεις από τις ομάδες που αναφέρονται ήδη και από τους Farzadfar et al. (2007). Συγκεκριμένα, οι απομονώσεις 780 και 819 από λάχανο και μπρόκολο αντίστοιχα, με προέλευση από την Ανδριανούπολη της Τουρκίας ανήκουν στην ομάδα VIII στην οποία εντάσσονται και οι απομονώσεις από το Ιράν. Η απομόνωση 1091 από κουνουπίδι από τα Βασιλικά Θεσσαλονίκης ανήκει στην ομάδα I στην οποία ανήκει και η γαλλική απομόνωση B29. Τέλος, η απομόνωση 823 από λάχανο από την Ανδριανούπολη της Τουρκίας ανήκει στην ομάδα V στην οποία ανήκει και η ουγγρική απομόνωση D/H. Από τα παραπάνω γίνεται αντιληπτό ότι ελληνικές και τούρκικες απομονώσεις, από διαφορετικές περιοχές και διαφορετικούς ξενιστές τοποθετούνται στην ίδια ομάδα με βάση την ανάλυση RFLP. Επίσης, σε μια τόσο περιορισμένη έκταση η οποία περιλαμβάνει τις περιοχές δειγματοληψίας από την Ελλάδα και την Ανδριανούπολη της Τουρκίας υπάρχει μεγάλη διαφοροποίηση των απομονώσεων του ιού, οι οποίες στο σύνολό τους τοποθετούνται σε περισσότερες από μια ομάδες και 95

98 εμφανίζουν μεταξύ τους ομοιότητα στις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες του ORF6 η οποία κυμαίνεται από 83-96,7%. Με βάση την ανάλυση RFLP δε φαίνεται να υπάρχει κάποια ομαδοποίηση των απομονώσεων με βάση την περιοχή ή τον ξενιστή προέλευσης, ενώ φαίνεται ότι η χρήση του ενζύμου Hpy99I μπορεί να δώσει νέες ομάδες οι οποίες ορίζονται από διαφορετικές θέσεις περιορισμού καθώς και μέγεθος και αριθμό προϊόντων από τα ήδη υπάρχοντα. Η σύγκριση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών του ORF6 των απομονώσεων 799 και 1044 με άλλες κατατεθειμένες αλληλουχίες του ιού στη βάση δεδομένων του NCBI έδειξε μεγαλύτερη ομοιότητα αντίστοιχα με τις απομονώσεις από το Ιράν (92%) και με την απομόνωση Xinjing από την Κίνα (96%). Οι δύο απομονώσεις αν και τοποθετήθηκαν στην ίδια ομάδα με βάση την RFLP ανάλυση, βρέθηκε να παρουσιάζουν τη μεγαλύτερη ομοιότητα με βάση τον αλγόριθμο Blast, με απομονώσεις που ανήκουν σε διαφορετικές ομάδες με βάση την ομαδοποίηση με RFLP των Farzadfar et al. (2007). Το γεγονός αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το ένζυμο Hpy99I ίσως να μην είναι το πλέον κατάλληλο για τη διάκριση των απομονώσεων του ιού. Από την άλλη η απομόνωση 780, αντιπροσωπευτική απομόνωση αυτών που εντάχθηκαν στην ομάδα VIII εμφάνισε τη μεγαλύτερη ομοιότητα τόσο με τις απομονώσεις από το Ιράν (96%), όσο και με την απομόνωση D/H (96%), αλλά με βάση την RFLP ανάλυση τοποθετείται στην ομάδα των απομονώσεων από το Ιράν. Η μεγάλη ομοιότητα των αλληλουχιών του ORF6 των απομονώσεων από το Ιράν με το στέλεχος D/H (96,1-96,7%) (Farzadfar et al. 2007) πιθανώς ευθύνεται για το ίδιο ποσοστό ομοιότητας. 96

99 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5. Μελέτη της επίδρασης μικτής μόλυνσης με τους TuMV και CaMV στην πρόσληψη/μετάδοση κάθε ιού από το φορέα Myzus persicae 97

100 5.1 Εισαγωγή Οι ιολογικές ασθένειες που μεταδίδονται με έντομα και ιδιαίτερα από αφίδες, αποτελούν ένα από τα αναδυόμενα προβλήματα στις καλλιέργειες των Brassica και άλλων λαχανικών και συνδέονται με την εντατικοποίηση των καλλιεργειών (Moreno et al., 2004). Οι TuMV και CaMV μολύνουν φυτικά είδη της οικογένειας Brassicaceae και μεταδίδονται από ένα μεγάλο αριθμό αφίδων φορέων με μη-έμμονο τρόπο ο πρώτος (Ohshima et al., 2002; Koike et al., 2007; Sanchez et al., 2007) και με ημι-έμμονο τρόπο ο δεύτερος (Farzadfar et al., 2007). Από τους σημαντικότερους φορείς και των δύο αυτών ιών αποτελούν τα είδη Myzus persicae και Brevicoryne brassicae τα οποία αποικίζουν τα σταυρανθή (Markham et al., 1987; Palacios et al., 2002; Walsh et al., 2002; Farzadfar et al., 2007; Koike et al., 2007). Στη φύση, δύο ή περισσότεροι ιοί, μπορούν να συνυπάρχουν στο ίδιο φυτό ταυτόχρονα σε μικτές μολύνσεις. Αυτή η συνύπαρξη των ιών συχνά οδηγεί σε διακυμάνσεις στα συμπτώματα, στη μολυσματικότητα, στη συσσώρευση των ιικών σωματιδίων αλλά και στη μετάδοση με τις αφίδες-φορείς (Martin et al., 2009). Ο TuMV αρκετά συχνά συνυπάρχει σε μικτές μολύνσεις με τον CaMV (Spense et al., 2007; Martin et al., 2009), οι οποίες οδηγούν σε πιο σοβαρές επιπτώσεις σε καλλιεργούμενα λάχανα τόσο στο χωράφι (Spense et al., 2007) όσο και στην αποθήκη (Hunter et al., 2002; Spense et al., 2007). Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της επίδρασης μικτής μόλυνσης με τους TuMV και CaMV στην πρόσληψη/μετάδοση κάθε ιού με το φορέα Myzus persicae. 5.2 Υλικά και μέθοδοι Αποικίες αφίδων Χρησιμοποιήθηκε ο κόκκινος κλώνος της Myzus persicae που παραχωρήθηκε από το Εργαστήριο Εντομολογίας και Γεωργικής Ζωολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας (Δρ Ι. Μαργαριτόπουλος). Οι πληθυσμοί των αφίδων αναπτύχθηκαν όπως περιγράφεται στο υποκεφάλαιο Φυτικό υλικό - Μηχανικές μολύνσεις Ως φυτά πρόσληψης των ιών χρησιμοποιήθηκαν μολυσμένα φυτά λάχανου ποικιλίας Nobilis (Brassica oleracea var. capitata conv. alba cv Nobilis), ενώ για τη μετάδοση χρησιμοποιήθηκαν φυτά λάχανου ποικιλίας Μαγνησίας ντόπιο (Brassica oleracea var. capitata conv. alba cv Μαγνησίας ντόπιο). Οι παραγωγή των φυτών πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο υποκεφάλαιο 2.1. Η μηχανική μετάδοση των ιών πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο υποκεφάλαιο 2.2 τόσο για τις απλές όσο και για τη μικτή μόλυνση, μόνο που στην 98

101 περίπτωση της μικτής μόλυνσης για κάθε ιό χρησιμοποίηθηκαν 1-2 διαφορετικά φύλλα του φυτού. Τα φυτά χρησιμοποιήθηκαν 3-4 εβδομάδες μετά τη μόλυνση και αφού στα φύλλα τους είχαν αναπτυχθεί διασυστηματικά συμπτώματα Απομονώσεις των ιών Οι απομονώσεις των TuMV και CaMV που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονταν από δύο διαφορετικούς αγρούς στα Βασιλικά Θεσσαλονίκης. Το αρχικό μόλυσμα του TuMV απομονώθηκε από λάχανο, ενώ του CaMV από κουνουπίδι. Οι απομονώσεις διατηρήθηκαν στο εργαστήριο σε φυτά λάχανου, κουνουπιδιού και μπρόκολου μέσω μηχανικών μολύνσεων Δοκιμές μετάδοσης με αφίδες Για την πραγματοποίηση των αφιδομεταδόσεων έγινε συλλογή αφίδων σε ομάδες των ατόμων, οι οποίες υποβλήθηκαν σε νηστεία για 1 ώρα στο σκοτάδι. Μετά το πέρας της νηστείας οι αφίδες τοποθετήθηκαν πάνω στα μολυσμένα με TuMV, CaMV ή TuMV+CaMV (μικτή μόλυνση) φυτά λάχανου για 5 λεπτά. Στη συνέχεια μεταφέρθηκαν στα φυτά μετάδοσης (2 σε κάθε φυτό), τα οποία βρίσκονταν στο στάδιο του 1-2 πραγματικών φύλλων, όπου και αφέθηκαν για μια ημέρα και την επομένη θανατώθηκαν με εντομοκτόνο Imidacloprid (Confidor) (Εικόνα 5.1). Τα φυτά μεταφέρθηκαν σε θάλαμο με θερμοκρασία 22±2 ºC και φωτοπερίοδο 16:8 φως:σκοτάδι, όπου και παρέμειναν για διάστημα ενός περίπου μηνός και στη συνέχεια ελέγχθηκαν με ELISA για την παρουσία των ιών. Στην κάθε επανάληψη χρησιμοποιήθηκαν 10 φυτά για κάθε ιό καθώς και για τη μικτή μόλυνση και συνολικά πραγματοποιήθηκαν 14 επαναλήψεις. Τελικά, έγινε σύγκριση της αποτελεσματικότητας μετάδοσης των TuMV και CaMV όταν η πρόσληψη του κάθε ιού πραγματοποιήθηκε από φυτό με απλή μόλυνση και από φυτό με μικτή μόλυνση. Εικόνα 5.1: Διαδικασία μετάδοσης με το είδος αφίδας Myzus persicae. 99

102 5.2.5 Δοκιμές ELISA Όλα τα φυτά λάχανου που χρησιμοποιήθηκαν ως φυτά πρόσληψης ιών ελέγχθηκαν ορολογικά (ELISA) πριν από την πραγματοποίηση των δοκιμών, ενώ το ίδιο έγινε και με τα φυτά μετάδοσης των ιών για την καταγραφή των ποσοστών μετάδοσης κάθε ιού από τις μονές μολύνσεις και από τη μικτή μόλυνση. Ο έλεγχος των φυτών με την ELISA πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο υποκεφάλαιο Στατιστική ανάλυση αποτελεσμάτων Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ανάλυσης παραλλακτικότητας ANOVA. 5.3 Αποτελέσματα Μελετήθηκε συγκριτικά η αποτελεσματικότητα πρόσληψης/μετάδοσης των TuMV και CaMV σε απλή και μικτή μόλυνση όταν ως φορέας χρησιμοποιήθηκε το είδος Myzus persicae. Στις δοκιμές ο TuMV εμφάνισε μεγαλύτερα ποσοστά μετάδοσης σε σχέση με τον CaMV τόσο στην περίπτωση που η πρόσληψή του πραγματοποιήθηκε από απλή όσο και από μικτή μόλυνση. Πιο συγκεκριμένα, το ποσοστό μετάδοσης του TuMV όταν η πρόσληψή του πραγματοποιήθηκε από απλή μόλυνση ήταν 49±6%, ενώ από μικτή μόλυνση ήταν ελαφρώς μικρότερο (47±7,2%). Αντίθετα με τον TuMV, ο CaMV μεταδόθηκε σε υψηλότερο ποσοστό (23±4%) όταν η πρόσληψή του πραγματοποιήθηκε από μικτή μόλυνση και σε μικρότερο ποσοστό (19±3,4%) όταν η πρόσληψή του πραγματοποιήθηκε από απλή μόλυνση. Η ανάλυση παραλλακτικότητας (ANOVA) (Πίνακας 5.1) έδειξε ότι μεταξύ των τεσσάρων επεμβάσεων υπάρχουν στατιστικά σημαντικές διαφορές σε επίπεδο σημαντικότητας α=0,05 [F(3,52)=8,631, p<0,001]. Πίνακας 5.1: Πίνακας ANOVA. Πηγή Άθροισμα βαθμοί Μέσο Τετράγωνο F P παραλλακτικότητας Τετραγώνων (Α.Τ.) ελευθερίας (β.ε.) (Μ.Τ.) "Επεμβάσεις" 104, ,786 8,631 >0,001 Σφάλμα 209, ,030 Σύνολο 313, Ο έλεγχος αντιθέσεων (t-test) έδειξε ότι μεταξύ της μετάδοσης του TuMV από απλή (49±6%) και από μικτή μόλυνση (47±7,2%) δεν υπάρχουν στατιστικά σημαντικές διαφορές [t(52)=0,282, p=0,779] (Σχεδιάγραμμα 5.1). Μεταξύ της μετάδοσης του CaMV από απλή (19±3,4%) και από μικτή (23±4%) μόλυνση επίσης δεν υπάρχουν στατιστικά σημαντικές διαφορές [t(52)=0,229, p=0,821] 100

103 (Σχεδιάγραμμα 5.1). Με βάση την τιμή της Ελάχιστης Σημαντικής Διαφοράς (LSD 0,05 =1,5) διαπιστώνεται ότι στατιστικά σημαντικές διαφορές υπάρχουν μόνο μεταξύ της μετάδοσης του TuMV και της μετάδοσης του CaMV (Πίνακας 5.2) TuMV CaMV Απλή Μικτή Σχεδιάγραμμα 5.1: Συγκριτική απεικόνιση των ποσοστών μετάδοσης των TuMV και CaMV, λαμβάνοντας υπόψη και το τυπικό σφάλμα του Μ.Ο., όταν η πρόσληψη των ιών πραγματοποιήθηκε από απλές μολύνσεις και από μικτή με τους δύο ιούς μόλυνση. Πίνακας 5.2: Στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων του πειράματος. Μεταχειρίσεις (Treatments) Ελάχιστο Μέγιστο Διάμεσο Μ.Ο. Τυπικό σφάλμα Μ. Ο. Τυπική απόκλιση Αριθμός επαναλήψεων N TuMV 1 8 6,0 4,9,60 2,2 14 CaMV 0 4 2,0 1,9,34 1,3 14 TuMV (Μ) 0 8 6,0 4,7,72 2,7 14 CaMV (Μ) 0 5 2,0 2,3,40 1,5 14 Σύνολο 0 8 3,0 3,5,32 2,4 56 LSD ,5 5.4 Συζήτηση Η επίδραση των μικτών μολύνσεων στην επιδημιολογία πολλών σημαντικών ιών αποτέλεσε αντικείμενο εκτεταμένης έρευνας (Rochow, 1972). Η πρόσληψη ιών με αφίδες-φορείς από φυτά μολυσμένα με περισσότερους από έναν ιούς, μπορεί να επηρεάσει ή δεν επηρεάζει τη μετάδοσή τους με το φορέα και εξαρτάται από το συνδιασμό των ιών (Rochow, 1972). Έχει αποδειχθεί ότι η συγκέντρωση ενός ιού μπορεί να μεταβάλεται σημαντικά σε ένα μικτά μολυσμένο φυτό σε σύγκριση με την συγκέντρωσή του σε φυτό με απλή μόλυνση, ως αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης των ιών. Αυτή η μεταβολή στη συγκέντρωση ενός ιού επηρεάζει την πρόσληψή του και μετάδοσή του από φυτά μολυσμένα με περισσότερους από έναν ιό (Rochow, 1972; Zhang et al., 2001). 101

104 Συνήθως, μικτή μόλυνση με δύο ταξινομικά διαφορετικούς ιούς, εκ των οποίων ο ένας ανήκει στο γένος Potyvirus, καταλήγει σε συνεργισμό και σε αύξηση της συγκέντρωσης του άλλου ιού, ενώ στην πλειοψηφία των περιπτώσεων η συγκέντρωση του Poty-ιού δεν επηρεάζεται (Anjos et al., 1992; Fattouh, 2003; Malapi-Nelson et al., 2009). Οι TuMV και CaMV μολύνουν φυτά της οικογένειας Brassicaceae και ειδικότερα του γένους Brassica και προκαλούν σοβαρά προβλήματα (Tomlinson and Ward, 1981; Farzadfar et al., 2007; Spence et al., 2007). Τα είδη Myzus persicae και Brevicoryne brassicae, τα οποία αποικίζουν τα σταυρανθή είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικοί φορείς τους (Markham et al., 1987; Palacios et al., 2002; Walsh et al., 2002; Farzadfar et al., 2007; Koike et al., 2007). Αρκετά συχνά οι δύο ιοί συνυπάρχουν σε μικτές μολύνσεις τόσο σε καλλιεργούμενα όσο και σε αυτοφυή φυτά (Spense et al., 2007; Martin et al., 2009). Μελέτες που αφορούσαν μικτές μολύνσεις από τους δύο αυτούς ιούς εστίαζαν κυρίως στη μολυσματικότητα, στην παθογένεια και στη συγκέντρωση των ιικών σωματιδίων στο φυτό ξενιστή. Τα αποτελέσματα έδειξαν οκτώ φορές υψηλότερη συγκέντρωση του TuMV στις απλές μολύνσεις σε σύγκριση με τον CaMV. Ως άμεσο αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης των δύο ιών στα μικτά μολυσμένα φυτά η συγκέντρωση του TuMV ήταν 77% υψηλότερη σε σχέση με τις απλές μολύνσεις, ενώ του CaMV ήταν 56% χαμηλότερη. Ωστόσο, στις μικτές μολύνσεις δεν παρατηρήθηκαν συμπτώματα συνεργισμού (Martin et al., 2009). Στην παρούσα μελέτη η μετάδοση του TuMV από την Myzus persicae βρέθηκε να διαφέρει σημαντικά σε σχέση με του CaMV, όταν η πρόσληψη των ιών πραγματοποιήθηκε τόσο από απλές μολύνσεις, όσο και από τις μικτές μολύνσεις. Συγκεκριμένα, η συχνότητα μετάδοσης του TuMV από απλές και μικτές μολύνσεις ήταν αντίστοιχα 49±6% και 47±7,2%, ενώ του CaMV ήταν αντίστοιχα 19±3,4% και 23±4%. Τα χαμηλότερα ποσοστά μετάδοσης του CaMV, ίσως οφείλονται στην πολύ χαμηλότερη συγκέντρωσή του στα φυτά-ξενιστές σε σύγκριση με αυτή του TuMV όπως αναφέρουν οι Martin et al. (2009), αν και τα φυτά που χρησιμοποιήθηκαν ως ξενιστές πρόσληψης στις δύο μελέτες ήταν διαφορετικά. Επίσης, η διαφορά στην αποτελεσματικότητα μετάδοσης πιθανώς να εξηγείται και από τον χρόνο πρόσληψης που χρησιμοποιήθηκε (5 ) στην παρούσα μελέτη. Ως γνωστόν η μετάδοση του CaMV και γενικότερα των ημι-έμμονων ιών αυξάνεται όσο αυξάνεται ο χρόνος της τροφικής δραστηριότητας του εντόμου (Markham et al., 1987; Palacios et al., 2002; James and Perry, 2004). Ωστόσο, στα πειράματα έπρεπε να επιλεγεί χρόνος πρόσληψης που να ικανοποιεί και τους δύο ιούς. Επειδή η συγκεκριμένη μελέτη περιελάμβανε από την μια τον TuMV ο οποίος είναι ένας μη-έμμονος ιός (Ohshima et al., 2002; Koike et al., 2007; Sanchez et al., 2007) που απαιτεί χρόνους διατροφής δευτερολέπτων έως λίγων λεπτών για την πρόσληψή του και από την άλλη τον CaMV ο οποίος είναι ένας 102

105 ημι-έμμονος ιός (Farzadfar et al., 2007), που απαιτεί χρόνους διατροφής λεπτών έως ωρών για την πρόσληψή του, τα 5 λεπτά κρίθηκαν ως ο βέλτιστος χρόνος πρόσληψης. Σε αυτό συναίνεσε και το γεγονός ότι σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν προηγούμενα με φορέα την M. persicae δεν βρέθηκαν να υπάρχουν στατιστικά σημαντικές διαφορές στη μετάδοση του CaMV, όταν ο χρόνος πρόσληψης ήταν 5 και όταν ο χρόνος πρόσληψης ήταν 8 h και ο CaMV βρέθηκε να προσλαμβάνεται και από τα επιδερμικά κύτταρα του φυτού σε αντίθεση με άλλους ημι-έμμονους ιούς (Palacios et al., 2002). Τα ποσοστά μετάδοσης των ιών όταν η πρόσληψή τους πραγματοποιήθηκε από απλές μολύνσεις, σε σύγκριση με τα ποσοστά μετάδοσης από την μικτή μόλυνση δεν διέφεραν σημαντικά. Συγκεκριμένα, τα ποσοστά μετάδοσης από τις μικτές μολύνσεις ήταν 47±7,2% για τον TuMV, ελαφρώς χαμηλότερο από εκείνο της απλής μόλυνσης (49±6%) και 23±4% για τον CaMV, ελαφρώς υψηλότερο από εκείνο της απλής μόλυνσης (19±3,4%). Οπότε συμπεραίνουμε ότι μικτή μόλυνση με τους δύο αυτούς ιούς σε φυτά λάχανου δεν οδηγεί σε καμιά μεταβολή στην ικανότητα πρόσληψης κανενός εκ των δύο ιών όταν ως φορέας χρησιμοποιείται το είδος Myzus persicae, αν και η συγκέντρωση των ιών στα φυτά πρόσληψης διαφοροποιείται αρκετά μεταξύ των απλών και της μικτής μόλυνσης σύμφωνα με τη μελέτη των Martin et al. (2009). Ωστόσο, για πιο αξιόπιστα συμπεράσματα θα πρέπει το συγκεκριμένο πείραμα να επαναληφθεί χρησιμοποιώντας μεγαλύτερο εύρος φορέων και φυτών ξενιστών, καθώς και δοκιμάζοντας περισσότερους χρόνους πρόσληψης των ιών. Σε παρόμοιες μελέτες που έχουν γίνει και για ιούς του γένους Crinivirus έχει βρεθεί ότι η μετάδοση με το φορέα είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση του κάθε ιού στον κάθε ξενιστή, τόσο για τις απλές όσο και για τις μικτές μολύνσεις. Η συγκέντρωση κάθε ιού μπορεί να είναι διαφορετική στα διάφορα φυτά ξενιστές και να μεταβάλλεται στις μικτές μολύνσεις λόγω ανταγωνισμού μεταξύ των δύο ιών. Επιπλέον πειράματα επιβεβαιώνουν ότι η μετάδοση με το φορέα δεν επηρεάζεται μόνο από τον αριθμό των διαθέσιμων ατόμων για μετάδοση, αλλά και από τη συγκέντρωση των ιοσωματίων που είναι διαθέσιμα για τη μετάδοση (Wintermantel et al., 2008). Η επιδημιολογία των ιών μπορεί να επηρεάζεται όχι μόνο από την εξειδίκευση της μετάδοσης κάθε ιού με τους φορείς και τη συχνότητα εμφάνισης των ξενιστών αλλά και από τις αλληλεπιδράσεις των ιών στις μικτές μολύνσεις και της ικανότητάς τους να επικρατούν και να συσσωρεύονται μέσα στα φυτά ξενιστές (Wintermantel et al., 2008). 103

106 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6. Μοριακή ανίχνευση ενός φυτοπλάσματος της ομάδας "Aster yellows"σε φυτά λάχανου (Brassica oleracea var. capitata) 104

107 6.1 Εισαγωγή Τα φυτοπλάσματα αποτελούν ένα μοναδικό μονοφυλετικό κλάδο οργανισμών, το γένος "Candidatus Phytoplasma" σε μια τάξη μικροοργανισμών που στερούνται κυτταρικό τοίχωμα, γνωστοί ως Mollicutes (Davis and Sinclair, 1998; Lee et al., 1998; Seemuller et al., 1998; Lee et al., 2000; Lee et al., 2004; Bertaccini, 2007; Harrison et al., 2008). Γεωγραφικά έχουν εμφανιστεί σε ολόκληρο τον κόσμο και είναι η αιτία για περισσότερες από χίλιες ανίατες φυτικές ασθένειες (Lee et al., 2000). Στις εύκρατες περιοχές του κόσμου προσβάλλουν γιγαρτόκαρπα και πυρηνόκαρπα δένδρα, καθώς και κτηνοτροφικά, λαχανοκομικά (Lee et al., 2003; Bertaccini, 2007) και καλλωπιστικά φυτά (Lee et al., 2000). Οι προσβολές από φυτοπλάσματα είναι ιδιαίτερα σοβαρές καθώς μειώνουν σημαντικά την παραγωγή, την ποιότητα και τη διάρκεια ζωής των φυτών (Lee et al., 2000; Bertaccini, 2007). Μέρος της συγκεκριμένης διατριβής αποτέλεσε και ο μερικός χαρακτηρισμός ενός φυτοπλάσματος, που εντοπίστηκε σε φυτά λάχανου (Brassica oleracea var. capitata) με συμπτώματα καχεξίας, μικροφυλλίας, άνοιγμα της κεφαλής και "σκούπα της μάγισσας". 6.2 Υλικά και Μέθοδοι Δειγματοληψίες Συλλέχθηκε ιστός φύλλων από τρία φυτά λάχανου (Brassica oleracea var. capitata) από τα Βασιλικά Θεσσαλονίκης με συμπτώματα που περιγράφηκαν παραπάνω Έλεγχος των δειγμάτων Αρχικά τα δείγματα ελέγχτηκαν ορολογικά (ELISA) για τους ιούς TuMV, CaMV, CMV, LMV και TSWV όπως περιγράφεται στο υποκεφάλαιο 2.5, και στη συνέχεια μοριακά για την πιθανή παρουσία φυτοπλάσματος. Για την ανίχνευση του φυτοπλάσματος χρησιμοποιήθηκε η PCR. Η εκχύλιση του DNA των δειγμάτων, η PCR και η ανίχνευση των προϊόντων της πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο υποκεφάλαιο 2.6. Στην PCR συμπεριλήφθηκε και ένα αρνητικό για την παρουσία φυτοπλάσματος λάχανο ως μάρτυρας. Στην πρώτη PCR, οι γενικοί εκκινητές P1/P7 ενισχύουν ένα κομμάτι bp του ριβοσωμικού οπερονίου, το οποίο περιλαμβάνει το 16S rrna γονίδιο, την 16S-23S διαγονιδιακή διαχωριστική περιοχή (SR) και ένα τμήμα της 5 περιοχής του 23S rrna γονιδίου. Για την αύξηση της ευαισθησίας της μεθόδου, την πρώτη PCR ακολούθησε μια εστιασμένη PCR με χρήση των R16F2n/R16R2 γενικών εκκινητών, οι οποίοι ενισχύουν ένα κομμάτι bp του 16S rrna γονιδίου (Salehi et al., 2007). 105

108 Η ταυτοποίηση του φυτοπλάσματος που ανιχνεύθηκε έγινε με αλληλούχιση της γονιδιακής περιοχής που κωδικοποιεί το16s rrna (1.200 bp) και σύγκριση με άλλες δημοσιευμένες και καταχωρημένες αλληλουχίες φυτοπλασμάτων στη βάση δεδομένων του NCBI (National Centre for Biotechnology Information, Bethesda, USA) ( χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). 6.3 Αποτελέσματα - Συζήτηση Η εφαρμογή της PCR έδωσε προϊόν bp (Εικόνα 6.1) γεγονός που δείχνει την παρουσία φυτοπλάσματος στα φυτά λάχανου (Brassica oleracea var. capitata) με τα συμπτώματα που περιγράφηκαν. Η αλληλούχιση της γονιδιακής περιοχής του φυτοπλάσματος που κωδικοποιεί το 16S rrna (Salehi et al., 2007) και η σύγκριση της με άλλες δημοσιευμένες και καταχωρημένες αλληλουχίες φυτοπλασμάτων στη βάση δεδομένων του NCBI έδειξε ότι το φυτόπλασμα εμφανίζει 100% ομοιότητα με φυτοπλάσματα της ομάδας Aster yellows (AY) και επομένως εντάσσεται στη συγκεκριμένη ομάδα. Η αλληλουχία του φυτοπλάσματος που χαρακτηρίστηκε στην παρούσα μελέτη δίνεται στο παράρτημα Ε (σελ. 123). Πολλά λαχανοκομικά φυτά προσβάλλονται από φυτοπλάσματα της ομάδας Aster yellows (16SrI), η οποία αποτελεί την πιο διαδεδομένη και διαφοροποιημένη ομάδα φυτοπλασμάτων στη φύση (Lee et al., 1998; Lee et al., 2000; Lee et al., 2003; Lee et al., 2004). Τα φυτοπλάσματα της ομάδας AY (16SrI), που περιλαμβάνονται στο γένος Ca. Phytoplasma asteris, σχετίζονται με ασθένειες σε περισσότερα από 100 φυτικά είδη παγκοσμίως και ιδιαίτερα σε ποώδη, δικοτυλήδονα φυτά (Lee et al., 2003; Lee et al., 2004). Στο λάχανο ασθένειες που οφείλονται σε φυτοπλάσματα έχουν αναφερθεί στην Ευρώπη, τις Ηνωμένες Πολιτείες Αμερικής και την Κούβα και βρέθηκε ότι προκαλούνται από φυτοπλάσματα που ανήκουν κυρίως στην ομάδα 16SrI-Β αλλά και στην ομάδα 16SrI-C, ενώ μεταδίδονται με τζιτζικάκια (Fodor et al., 1999; Lee et al., 2001; Lee et al., 2003; Lee et al., 2004; Duduk et al., 2007; Salehi et al., 2007; Arocha et al., 2008;). Στο Ιράν βρέθηκαν μολυσμένα λάχανα από φυτόπλασμα της ομάδας 16SrVI, της οποίας και αποτελούν ένα νέο φυσικό ξενιστή (Salehi et al., 2007). 106

109 Το φυτόπλασμα που βρέθηκε κατά τη διάρκεια της μελέτης αυτής σε φυτά λάχανου, εμφανίζει 100% ομοιότητα με φυτοπλάσματα της ομάδας Aster yellows (AY). Ένα φυτόπλασμα της ίδια ομάδας (16SrI) εντοπίστηκε πρόσφατα σε φυτά ελαιοκράμβης (Brassica napus), στην περιοχή της Χαλάστρας Θεσσαλονίκης (Maliogka et al., 2009). Ωστόσο, στη χώρα μας οι ασθένειες που οφείλονται σε φυτοπλάσματα δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς, με τις περισσότερες καταγραφές να αφορούν κυρίως καρποφόρα δέντρα (ροδακινιά, δαμασκηνιά, μηλιά, αχλαδιά, βερικοκιά) (Tsialis and Rumbos, 1980; Rumbos and Bosabalidis, 1985; Σαΐνης, 2006; Rumbou et al., 2008), το αμπέλι (Davis et al., 1997; Σαΐνης, 2006) και την τομάτα (Alivizatos, 1993; Σαΐνης, 2006; Vellios and Lioliopoulou, 2007). Εξ όσων γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη φορά που διαπιστώνεται προσβολή φυτών λάχανου στην Ελλάδα από φυτόπλασμα. 107

110 Βιβλιογραφία 108

111 Ξενόγλωσση Βιβλιογραφία Adams M. J., J. F. Antoniw and F. Beaudoin Overview and analysis of the polyprotein cleavage sites in the family Potyviridae. Molecular Plant Pathology 6: Agama K., S. Beach, J. Schoelz and S. M. Leisner The 5 Third of Cauliflower mosaic virus Gene VI Conditions Resistance Breakage in Arabidopsis Ecotype Tsu-0. Phytopathology 92: Alivizatos A. S Association of mycoplasma-like organisms with tomato big bud disease in Greece. Plant Pathology 42: Al-Kaff N. S. and S. N. Covey Biological diversity of cauliflower mosaic virus isolates expressed in two Brassica species. Plant Pathology 44: Andret-Link P. and M. Fuchs Transmission Specificity of Plant Viruses by Vectors. Journal of Plant Pathology 87: Anjos R. J., U. Jarlfors and S. A. Ghabrial Soybean Mosaic Potyvirus Enhances the Titer of Two Comoviruses in Dually Infected Soybean Plants. Phytopathology 82: Arocha Y., B. Pinol, R. Almeida, K. Acosta, M. Quinones, T. Zayas, M. Varela, Y. Marrero, E. Boa and J. A. Lucas First report of phytoplasmas affecting organoponic crops in central and eastern Cuba. New Disease Reports 18:24. Atreya C. D., B. Raccah and T. P. Pirone A Point Mutation in the Coat Protein Abolishes Aphid Transmissibility of a Potyvirus. Virology 178: Benetti M. P., F. Desanctis and O. Lovisolo Occurrence of Turnip mosaic virus on broccoli rab in Italy. Phytopathologia mediterranea 17: Berger P. H., M. J. Adams, O. W. Barnett, A. A. Brunt, J. Hammond, J. H. Hill, R. L. Jordan, S. Kashiwazaki, E. Rybicki, N. Spence, D. C. Stenger, S. T. Ohki, I. Uyeda, A. van Zaayen, J. Valkonen and H. J. Vetten. Family Potyviridae. In: Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Eighth Report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses Edited by C. M. Fauquet, M. A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger and L. A. Ball. Elsevier Academic Press p Bertaccini A Phytoplasmas: diversity, taxonomy and epidemiology. Frontiers in Bioscience 12: Blanc S Virus Transmission-Getting Out and In. Plant Cell Monographs 7:1-28. Blanc S., J.-J. Lopez-Moya, R. Wang, S. Garcia-Lampasona, D. W. Thornbury and T. P. Pirone A Specific Interaction between Coat Protein and Helper Component Correlates with Aphid Transmission of a Potyvirus. Virology 231: Bos L. Wild plants in the ecology of virus diseases. In: Plant diseases and vectors: ecology and epidemiology. Edited by K. Maramorosch and K. F. Harris Academic Press Inc. (London) Ltd. P. Brault V., M. Uzest, B. Monsion, E. Jacquot and S. Blanc Aphids as transport devices for plant viruses. Comptes Rendus Biologies 333: Broadbent L. and G. D. Heathcote Properties and Host Range of Turnip crinkle, rosette and yellow mosaic viruses. Annals of Applied Biology 46: Brunt A., K.Crabtree, M. Dallwitz, A. Gibbs and L.Watson Viruses of Plants: Descriptions and Lists from the VIDE Database. CAB International, Cambridge, U.K. p

112 Chatzinasiou E., C.I. Dovas, M. Papanastassopoulou, M. Georgiadis, V. Psychas, I. Bouzalas, M. Koumbati, G. Koptopoulos and O. Papadopoulos Assessment of bluetongue viraemia in sheep by real-time PCR and correlation with viral infectivity. Journal of Virological Methods 169: Chatzivassiliou E. K., J. Livieratos, A. Avgelis, N. Katis and D. Lykouressis Occurrence of tomato spotted wilt virus in vegetable and ornamental crops in Greece. Acta Horticulturae 431: Chatzivassiliou E. K., I. Boubourakas, E. Drossos, I. Eleftherohorinos, G. Jenser, D. Peters and N. I. Katis Weeds in Greenhouses and Tobacco Fields are Differentially Infected by Tomato spotted wilt virus and Infested by its Vector Species. Plant Disease 85: Chatzivassiliou E. K., R. Weekes, J. Morris, K. R. Wood, I. Barker and N. I. Katis Tomato spotted wilt virus (TSWV) in Greece: its incidence following the expansion of Frankliniella occidendalis, and characterisation of isolates collected from various hosts. Annals of Applied Biology 137: Chatzivassiliou E. K., K. Efthimiou, E. Drossos, A. Papadopoulou, G. Poimenidis and N. I. Katis A survey of tobacco viruses in tobacco crops and native flora in Greece. European Journal of Plant Pathology 110: Chivasa S., E. J. A. Ekpo and R. G. T. Hicks New hosts of Turnip mosaic virus in Zimbabwe. Plant Pathology 51:386. Cho J.-D., H.-S. Choi, J.-S. Kim, Y.-J. La and K.-S. Kim Ultrastructural Aspects of Mixed Infections with Turnip mosaic virus (TuMV-AC18 and -C5) and Ribgrass mosaic virus (RMV-CA1) in Oriental Cabbage. Plant Pathology Journal 18: Clark M. F. and A. N. Adams Characteristics of the Microplate Method of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Plant Viruses. Journal of General Virology 34: Davis R. E. and W. A. Sinclair Phytoplasma Identity and Disease Etiology. Phytopathology 88: Davis R. E., E. L. Dally, E. Tanne and I. Ch. Rumbos Phytoplasmas associated with grapevine yellows in Israel and Greece belong to the Stolbur phytoplasma subgroup, 16SrXII- A. Journal of Plant Pathology 79: Decoteau D. R Vegetable Crops. Prentice Hall. p Dikova B. A Sinapis arvensis L. as a source of viruses Cauliflower mosaic virus (CaMV) and Turnip mosaic virus (TuMV) infecting oilseed rape. Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica 43: Dinant S. and H. Lot Review: Lettuce mosaic virus. Plant pathology 41: Dovas C.I Incidence of viruses infecting Allium spp. in Greece. European Journal of Plant Pathology 107: Duduk B., A. Bulajic, N. Duduk, A. Calari, S. Paltrinieri, B. Krstic and A. Bertaccini Identification of phytoplasmas belonging to aster yellows ribosomal group in vegetables in Serbia. Bulletin of Insectology 60: Duffus J. E Role of weeds in the incidence of virus diseases. Annual Review of Phytopathology 9:

113 Eiras M., A. L. R. Chaves, A. Colariccio and C. M. Chagas First Report of Turnip mosaic virus in Horseradish in Brasil. Fitopatologia Brasileira 32 (2). Farzadfar S., A. Ahoonmanesh, G. H. Mosahebi, K. Ohshima, M. Koohi-Habibi, R. Pourrahim and A. R. Golnaraghi Partial Biological and Molecular Characterization of Cauliflower mosaic virus Isolates in Iran. Plant Pathology Journal 6: Farzadfar S., A. Ahoonmanesh, G. H. Mosahebi, R. Pourrahim and A. R. Golnaraghi Occurrence and Distribution of Cauliflower mosaic virus on Cruciferous Plants in Iran. Plant Pathology Journal 6: Farzadfar S., R. Pourrahim, A. R. Golnaraghi and A. Ahoonmanesh Occurrence of Cauliflower mosaic virus in different cruciferous plants in Iran. Plant Pathology 54:810. Farzadfar S., Y. Tomitaka, M. Ikematsu, A. R. Golnaraghi, R. Pourrahim and K. Ohshima Molecular characterisation of Turnip mosaic virus isolates from Brassicaceae weeds. European Journal of Plant Pathology 124: Fattouh F. A Double Infection of a Cucurbit Host by Zucchini Yellow Mosaic Virus and Cucumber mosaic virus. Pakistan Journal of Plant Pathology 2: Feldman J. M. and O. Gracia Studies of Weed Plants as Sources of Viruses. II. Eruca sativa, Rapistrum rugosum and Sisymbrium irio, new natural hosts for turnip mosaic virus. Phytopath. Z. 73: Fodor M., O. Viczian, E. Mergenthaler and S. Sule Cabbage infected with phytoplasma from the aster yellows group in Hungary. Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica 34:1-6(6). German-Retana S., J. Walter and O. Le Gall Pathogen profile: Lettuce mosaic virus: from pathogen diversity to host interactors. Molecular Plant Pathology 9: Gilligan C. A., P. M. Pechan, R. Day and S. A. Hill New or unusnal records of plant diseases and pests. Plant Pathology 29:53. Groves R. L., J. F. Walgenbach, J. W. Moyer and G. G. Kennedy The role of weed hosts and tobacco thrips, Frankliniella fusca, in the epidemiology of Tomato spotted wilt virus. Plant Disease 86: Guindon S. and O. Gascuel A simple, fast and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Systematic Biology 52: Haas M., M. Bureau, A. Geldreich, P. Yot and M. Keller Cauliflower mosaic virus: still in the news. Molecular Plant Pathology 3: Hardwick N. V., J. M. L. Davies and D. M. Wright The incidence of three virus diseases of winter oilseed rape in England and Wales in the 1991/92 and 1992/93 growing. Plant Pathology 43: Harrison N. A., G. P Rao and C. Marcone Characterization, Diagnosis and Management of Phytoplasmas. Studium Press LLC, U.S.A. Hauser S., M. Stevens, C. Mougel, H. G. Smith, C. Fritsch, E. Herrbach and O. Lemaire Biological, serological, and molecular variability suggest three distinct polerovirus species infecting beet or rape. Phytopathology 90: Hill J. E., J. O. Strandberg, E. Hiebert and S. G. Lazarowitz Asymmetric Infectivity of Pseudorecombinants of Cabbage Leaf Curl Virus and Squash Leaf Curl Virus: Implications for Bipartite Geminivirus Evolution and Movement. Virology 250:

114 Hohn T. Caulimoviruses: Molecular Biology. In: Encyclopedia of virology. Third edition. Edited by Brian W. J. Mahy and Marc H. V. Van Regenmortel Elsevier Academic Press p Hull R., A. Geering, G. Harper, B. E. Lockhart and J. E. Schoelz. Family Caulimoviridae. In: Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses. Eighth Report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses Edited by C. M. Fauquet, M. A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger and L. A. Ball. Elsevier Academic Press p Hunter P. J., J. E. Jones and J. A. Walsh Involvement of Beet western yellows virus, Cauliflower mosaic virus, and Turnip mosaic virus in internal disorders of stored white cabbage. Phytopathology 92: Ishimoto M., Y. Sano and M. Kojima Increase in Cucumber Mosaic Virus Concentration in Japanese Radish Plants Co-infected with Turnip Mosaic Virus (II) Electron Microscopic and Immunohistochemical Observations. Annals of the Phytopathological Society of Japan 56: James C. K. Ng and K. L. Perry MicroReview: Transmission of plant viruses by aphid vectors. Molecular Plant Pathology 5: Jay C. N., S. Rossall and H. G. Smith Effects of beet western yellows virus on growth and yield of oilseed rape (Brassica napus). Journal of Agricultural Science 133: Jenner C. E. and J. A. Walsh Pathotypic variation in turnip mosaic virus with special reference to European isolates. Plant Pathology 45: Kasschau K. D. and J. C. Carrington Long-Distance Movement and Replication Maintenance Functions Correlate with Silencing Suppression Activity of Potyviral HC-Pro. Virology 285: Khandekar S., J. He and S. Leisner Complete nucleotide sequence of the Toledo isolate of turnip ringspot virus. Archives of Virology 154: Kibble W. A OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Research 35:W43-W46. Kirino N., K. Inoue, K. Tanina, Y. Yamazaki and S. T. Ohki Turnip yellow mosaic virus isolated from Chinese cabbage in Japan. Journal of General Plant Pathology 74: Kobylko T., Z. Maj and Z. Gajewski Bunias orientalis L. as a natural overwintering host of Turnip mosaic virus. Acta Agrobotanica 62: Koike S. T., P. Gladders and A. O. Paulus Vegetable Diseases. A colourful handbook. Manson Publishing p Koloniuk I., J. Spak and K. Petrzik Turnip ringspot virus recognised on Chinese cabbage in Russia. European Journal of Plant Pathology 122: Koloniuk I. and K. Petrzik Complete genome sequence of turnip ringspot virus. Archives of Virology 154: Komatsu K., K. Hatada, M. Hashimoto, J. Ozeki, K. Maejima, S. Kagiwada, Y. Yamaji and S. Namba Complete nucleotide sequence of a California isolate of Radish mosaic virus. Archives of Virology 153: Kumar S., M. Nei, J. Dudley and K. Tamura MEGA: a biologistcentric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Briefings in Bioinformatics 9:

115 Kwon S.-J., H.-S. Choi, J.-H. Han, Y.-J. La and K.-H. Kim Three Different Viruses Isolated from Typical Weed Plants that Grown Adjacent to Common Crop Fields. The Plant Pathology Journal 16: Latham J. R. and A. K. Wilson Review: Transcomplementation and synergism in plants: implications for viral transgenes?. Molecular Plant Pathology 9: Lee I.-M., D. E. Gundersen-Rindal and A. Bertaccini Phytoplasma: Ecology and genomic diversity. Phytopathology 88: Lee I.-M., D. E. Gundersen-Rindal, R. E. Davis, K. D. Bottner, C. Marcone and E. Seemuller Candidatus Phytoplasma asteris, a novel phytoplasma taxon associated with aster yellows and related diseases. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54: Lee I.-M., R.E. Davis and D.E. Gundersen-Rindal Phytoplasma: Phytopathogenic Mollicutes. Annual Review of Microbiology 54: Lee I.-M., R. A. Dane, M. C. Black and N. Troxclair First Report of an Aster Yellows Phytoplasma Associated with Cabbage in Southern Texas. Plant Disease 85:447. Lee I.-M., M. Martini, K. D. Bottner, R. A. Dane, M. C. Black and N. Troxclair Ecological implications from a molecular analysis of phytoplasmas involved in an aster yellows epidemic in various crops in Texas. Phytopathology 93: Leppik E. E Gene Centers of Plants as Sources of Disease Resistance. Annual Review of Phytopathology 8: Lopez-Moya J. J. and J. A. Garcia. Potyviruses. In: Encyclopedia of virology. Third edition. Edited by Brian W. J. Mahy and Marc H. V. Van Regenmortel Elsevier Academic Press p Malapi-Nelson M., R.-H. Wen, B. H. Ownley and M. R. Hajimorad Co-infection of Soybean with Soybean mosaic virus and Alfalfa mosaic virus Results in Disease Synergism and Alteration in Accumulation Level of Both Viruses. Plant Disease 93: Maliogka V. I., J. T. Tsialtas, A. Papantoniou, K. Efthimiou and N. I. Katis First report of a phytoplasma associated with an oilseed rape disease in Greece. Plant Pathology 58:792. Markham P. G., M. S. Pinner, B. Raccah and R. Hull The acquisition of a caulimovirus by different aphid species: comparison with a potyvirus. Annals of Applied Biology 111: Martin S. and S. F. Elena Application of game theory to the interaction between plant viruses during mixed infections. Journal of General Virology 90: Martiniere A., A. Zancarini and M. Drucker Aphid transmission of Cauliflower mosaic virus. The role of the host plant. Plant Signaling & Behavior 4: Maskell L. C., A. F. Raybould, J. I. Cooper, M-L Edwards and A. J. Gray Effects of turnip mosaic virus and turnip yellow mosaic virus on the survival, growth and reproduction of wild cabbage (Brassica oleracea). Annals of Applied Biology 135: Merits A., M-L. Rajamaki, P. Lindholm, P. Runeberg-Roos, T. Kekarainen, P. Puustinen, K. Makelainen, J. P. T. Valkonen and M. Saarma Proteolytic processing of potyviral proteins and polyprotein processing intermediates in insect and plant cells. Journal of General Virology 83:

116 Moreno Α., C. De Blas, R. Biurrun, M. Nebreda, I. Palacios, M. Duque and A. Fereres The incidence and distribution of viruses infecting lettuce, cultivated Brassica and associated natural vegetation in Spain. Annals of Applied Biology 144: Nebreda M., A. Moreno, N. Perez, I. Palacios, V. Seco-Fernandez and A. Fereres Activity of aphids associated with lettuce and broccoli in Spain and their efficiency as vectors of Lettuce mosaic virus. Virus Research 100: Ochoa Corona F. M., B. S. M. Lebas, D. R. Elliott, J. Z. Tang and B. J. R. Alexander New host records and new host family range for Turnip mosaic virus in New Zealand. Australasian Plant Disease Notes 2: Ohshima K., Y. Yamaguchi, R. Hirota, T. Hamamoto, K. Tomimura, Z. Tan, T. Sano, F. Azuhata, J. A. Walsh, J. Fletcher, J. Chen, A. Gera and A. Gibbs Molecular evolution of Turnip mosaic virus: evidence of host adaptation, genetic recombination and geographical spread. Journal of General Virology 83: Palacios I., M. Drucker, S. Blanc, S. Leite, A. Moreno and A. Fereres Cauliflower mosaic virus is preferentially acquired from the phloem by its aphid vectors. Journal of General Virology 83: Pallett D. W., J. I. Cooper, H. Wang, J. Reeves, Z. Luo, R. Machado, C. Obermeier, J. A. Walsh and M. J. Kearsey Variation in the pathogenicity of two Turnip mosaic virus isolates in wild UK Brassica rapa provenances. Plant Pathology 57: Pallett D. W., M. I. Thurston, M. Cortina-Borja, M. L. Edwards, M. Alexander, E. Mitchell, A. F. Raybould and J. I. Cooper The incidence of viruses in wild Brassica rapa ssp. sylvestris in southern England. Annals of Applied Biology 141: Peters D. Tospoviruses: a threat to the intensive agriculture in the tropics. In: Virus and Viruslike Diseases of Major Crops in Developing Countries Edited by Loebenstein G. and Thottapilly G. Kluwer Academic Publisher pp Pirone T. P and S. Blanc Helper-Dependent Vector Transmission of Plant Viruses. Annul Review of Phytopathology 34: Posada D JmodelTest: Phylogenetic Model Averaging. Molecular Biology and Evolution 25: Powell G Intracellular salivation is the aphid activity associated with inoculation of nonpersistently transmitted viruses. Journal of General Virology 86: Power A. G Insect transmission of plant viruses: a constraint on virus variability. Current Opinion in Plant Biology 3: Rajakaruna P., S. Khandekar, T. Meulia and S. M. Leisner Identification and host relations of Turnip ringspot virus, a novel comovirus from Ohio. Plant Disease 91: Raybould A. F., L. C. Maskell, M. L. Edwards, J. I. Cooper and A. J. Gray The prevalence and spatial distribution of viruses in natural populations of Brassica oleracea. New Phytologist 141: Rochow W. F The Role of Mixed Infections in the Transmission of Plant Viruses by Aphids. Annual review of Phytopathology 10: Rojas M. R., F. M. Zerbini, R. F. Allison, R. L. Gilbertson and W. J. Lucas Capsid Protein and Helper Component-Proteinase Function as Potyvirus Cell-to-Cell Movement Proteins. Virology 237:

117 Rumbos I. Ch. and A. M. Bosabalidis Mycoplasmalike organisms associated with declined plum trees in Greece. Zeitschrift fur Pflunzencrankheiten und Pflunzenscutz 92: Rumbou A., L. Carraro, G. Nanos, I. Boutla and I. C. Rumbos First Report of Candidatus Phytoplasma Mali in Greece and Correlation with Small Apple Fruit Disorder Occurring in the Orchards of the Pelion Mountain. Acta Horticulturae (ISHS) 781: Sacristan S., A. Fraile and F. Garcia-Arsenal Population dynamics of Cucumber mosaic virus in melon crops and in weeds in central Spain. Phytopathology 94: Salehi M., K. Izadpanah and M. Siampour Characterization of a phytoplasma associated with cabbage yellows in Iran. Plant Disease 91: Sanchez F., M. Rodriguez-Mateos, A. Tourino, J. Fresno, C. Gomez-Campo, C. E. Jenner, J. A. Walsh and F. Ponz Identification of new isolates of Turnip mosaic virus that cluster with less common viral strains. Archives of Virology 152: Sanchez F., X. Wang, C. E. Jenner, J. A. Walsh and F. Ponz Strains of Turnip mosaic potyvirus as defined by the molecular analysis of the coat protein gene of the virus. Virus Research 94: Schoelz J. E. Caulimoviruses: General Features. In: Encyclopedia of virology. Third edition Edited by Brian W. J. Mahy and Marc H. V. Van Regenmortel. Elsevier Academic Press p Seemuller E., C. Marcone, U. Lauer, A. Ragozzino and M. Goschl Invited Review. Current Status of Molecular Classification of the Phytoplasmas. Journal of Plant Pathology 80 (1):3-26. Shahraeen N., S. Farzadfar and D. E. Lesemann Incidence of Viruses Infecting Winter Oilseed Rape (Brassica napus ssp. oleifera) in Iran. Journal of Phytopathology 151: Smith K. M A virus disease of cultivated crucifers. Annals of Applied Biology 22: Spak J The efficiency of acquisition of Turnip mosaic virus by Myzus persicae and Brevicoryne brassicae from white and black mustard. Acta Entomologica Bohemoslovaca 88: Spense N. J., N. A. Phiri, S. L. Hughes, A. Mwaniki, S. Simons, G. Oduor, D. Chacha, A. Kuria, S. Ndirangu, G. N. Kibata and G. C. Marris Economic impact of Turnip mosaic virus, Cauliflower mosaic virus and Beet mosaic virus in three Kenyan vegetables. Plant Pathology 56: Stobbs L. W. and A. Stirling Susceptibility of Ontario weed species to Turnip mosaic virus. Canadian journal of Plant Pathology 12: Stobbs L. W. and A. Stirling Susceptibility of Ontario weed species to Turnip mosaic virus. Canadian Journal of Plant Pathology 12: Tamura K., J. Dudley, M. Nei and S. Kumar MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution 24: Thurston M. I., D. W. Pallet, M. Cortina-Borja, M. L. Edwards, A. F. Raybould and J. I Cooper The incidence of viruses in wild Brassica nigra in Dorset (UK). Annals of Applied Biology 139: Tomimura K., J. Spak, N. Katis, C. E. Jenner, J. A. Walsh, A. J. Gibbs and K. Ohshima Comparisons of the genetic structure of populations of Turnip mosaic virus in West and East Eurasia. Virology 330:

118 Tomitaka Y., T. Yamashita and K. Ohshima The genetic structure of populations of Turnip mosaic virus in Kyushu and central Honshu, Japan. Journal of General Plant Pathology 73: Tomlinson J. A. and C. M. Ward The reactions of some Brussels sprout F 1 hybrids and inbreds to cauliflower mosaic and turnip mosaic viruses. Annals of Applied Biology 97: Tomlinson J. A., A. L. Carter, W. T. Dale and C. J. Simpson Weed plants as sources of cucumber mosaic virus. Annals of Applied Biology 66: Tomlinson. J. A Epidemiology and control of virus diseases of vegetables. Annals of Applied Biology 110: Tsialis D. and I. Rumbos New Observations on a Peach Decline Disease in Greece and its Etiology. Acta Horticulturae (ISHS) 94: Varveri C. and K. Boutsika Characterization of cucumber mosaic cucumovirus isolates in Greece. Plant Pathology 48: Vellios E. and F. Lioliopoulou Detection and characterization of phytoplasmas infecting tomato plants in Greece. Bulletin of Insectology 60: Walkey D. G. A. and D. A. C. Pink Reactions of white cabbage (Brassica oleracea var. capitata) to four different strains of turnip mosaic virus. Annals of Applied Biology 112: Walkey D. G. A. and M. J. W. Webb Internal necrosis in stored white cabbage caused by Turnip mosaic virus. Annals of Applied Biology 85:435. Walsh J. A. and J. A. Tomlinson Viruses infecting winter oilseed rape (Brassica napus ssp. oleifera). Annals of Applied Biology 107: Walsh J. A. and C. E. Jenner Turnip mosaic virus and the quest for durable resistance. Molecular Plant Pathology 3: Walsh J. A. and C. E. Jenner. Resistance to Turnip mosaic virus in the Brassicaceae. In: Natural Resistance Mechanisms of Plants to Viruses Edited by G. Loebenstein and J. P. Carr. Springer p Ward C. W., G. F. Weiller, D. D. Shukla and A. Gibbs. Molecular systematics of the Potyviridae, the largest plant virus family. In: Molecular basis of virus evolution Edited by A. J. Gibbs, C. H. Calisher, F. Garcia-Arenal. Cambridge University Press p Wilson C. R Incidence of weed reservoirs and vectors of Tomato spotted wilt tospovirus on southern Tasmanian lettuce farms. Plant Pathology 47: Wintermantel W. M., A. A. Cortez, A. G. Anchieta, A. Gulati-Sakhuja and L. L. Hladky Coinfection by Two Criniviruses Alters Accumulation of Each Virus in a Host-Specific Manner and Influences Efficiency of Virus Transmission. Phytopathology 98: Zhang X.-S., J. Holt and J. Colvin Synergism between plant viruses: a mathematical analysis of the epidemiological implications. Plant Pathology 50: Zitter T. A. and J. N. Simons Management of viruses by alteration of vector efficiency and by cultural practices. Annal Review of Phytopathology 18:

119 Ελληνική Βιβλιογραφία Βαρδαβάκης Μ. και Ζούζουλας Δ., Γεωργική Συστηματική Βοτανική. Εκδόσεις Δημοκρίτειο Πανεπιστήμιο Θράκης σελ Δόβας Χ. Ι., Β. Φωτόπουλος, Α. Θεοχαρόπουλος, Ι. Λουμπουρδής, Γ. Διαμαντίδης, S. Winter και Ν. Ι. Κατής. 2000α. Ταυτοποίηση των ιών του σπανακιού (Spinacea oleracea) από διάφορες περιοχές της χώρας. 10 ο Πανελλήνιο Φυτοπαθολογικό Συνέδριο, Καλαμάτα. Δόβας Χ., Α. Θεοχαρόπουλος, Ι. Λουμπουρδής, Η. Σμυρνιούδης, Α. Π. Σκλαβούνος, Π. Η. Κυριακοπούλου και Ν. Ι. Κατής. 2000β. Ο κιτρινοϊός του δυτικού ικτέρου των τεύτλων (Beet western yellows virus, BWYV) στην Ελλάδα. 10 ο Πανελλήνιο Φυτοπαθολογικό Συνέδριο, Καλαμάτα. Κυριακοπούλου Π. Η Ο ιός του μωσαϊκού του μαρουλιού στην Ελλάδα: μια θανατηφόρος φυλή. 4 ο Πανελλήνιο Φυτοπαθολογικό Συνέδριο, Αθήνα. Λώτος Λ Ανάπτυξη μοριακής μεθόδου ανίχνευσης ιών του γένους Polerovirus και μερικός χαρακτηρισμός ενός Polero-ιού που σχετίζεται με τον ίκτερο της πιπεριάς. Μεταπτυχιακή Διατριβή. Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Γεωπονική Σχολή σελ Μπερμπάτη Μ. Γ., Ο. Γ. Μελιτά, Ι. Ε. Τζανετάκης, Η. Ι. Μπουμπουράκας, Μ. Ε. Γρατσιά, Μ. Σ. Καπώνη, Α. Ε. Βολουδάκης και Π. Η. Κυριακοπούλου Μελέτη ελληνικών απομονώσεων του ιού του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip mosaic virus, TuMV). 13 ο Πανελλήνιο Φυτοπαθολογικό Συνέδριο, Αθήνα. Ντόγρας Κ Ειδική Λαχανοκομία ΙΙ. Εκδόσεις Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης σελ Σαΐνης Π. Α Γενική και εξειδικευμένη μοριακή ταυτοποίηση φυτοπλασμάτων σε διάφορους ξενιστές στην Ελλάδα. Μεταπτυχιακή Διατριβή. Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης, Γεωπονική Σχολή σελ Σκλαβούνος Α. Π., Π. Η. Κυριακοπούλου και Γ. Βιδαλάκης Ταξινόμηση απομονώσεων του ιού του μωσαϊκού της αγγουριάς από τομάτα και άλλα φυτά στην Ελλάδα. 9 ο Πανελλήνιο Φυτοπαθολογικό Συνέδριο, Αθήνα. Jenner C., Κατής Ν.Ι. και Walsh G. A Κατανομή παθοτύπων του ιού του μωσαϊκού του γογγυλιού (Turnip mosaic virus, TuMV) στην Κ. και Β. Ελλάδα. 7 ο Πανελλήνιο Φυτοπαθολογικό Συνέδριο, Αθήνα. Salomon R. και Ν. Ι. Κατής Ιώσεις του σκόρδου (Allium sativum) στην Ελλάδα. 8 ο Πανελλήνιο Φυτοπαθολογικό Συνέδριο, Ηράκλειο Κρήτης. 117

120 Παράρτημα 118

121 Α. Αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στην ELISA και η σύστασή τους Διάλυμα Επιστρώσεως της πλάκας (Coating Buffer) 1.59 gr Na 2 CO gr NaHCO 3 Τα παραπάνω συστατικά διαλύονται σε αποσταγμένο νερό έως συμπληρώσεως του 1 lt. Η διατήρηση του διαλύματος γίνεται στο ψυγείο στους 4 C. Φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (Phosphate buffer) [PBS 10 x (πυκνό)] 80 gr NaCl 2 gr KH 2 PO gr Na 2 HPO 4. 2 H 2 O 2 gr KCl Τα παραπάνω συστατικά διαλύονται σε αποσταγμένο νερό έως συμπληρώσεως του 1 lt. Διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου, χωρίς την προσθήκη συντηρητικού ή αντιμικροβιακού. Διάλυμα Εκχύλισης των δειγμάτων και Πλύσης (PBS-Tween) 100 ml PBS 10 x 0.5 ml Tween ml αποσταγμένο νερό Διάλυμα Υποστρώματος (Substrate Buffer) 97 ml Diethanolamine (Διαιθανολαμίνη) 800 ml αποσταγμένο νερό Αφού ρυθμιστεί το ph ίσο με 9.8, συμπληρώνουμε με αποσταγμένο νερό μέχρι το διάλυμα να αποκτήσει τελικό όγκο 1 lt. Η διατήρηση του διαλύματος γίνεται στο ψυγείο στους 4 C. Β. Αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στην εκχύλιση του ολικού RNA-DNA και η σύστασή τους Διάλυμα Ομογενοποίησης (lysis buffer) 50 ml Tris-HCl 1 M (ph 7,4) 50 ml EDTA 0.5 M (ph 8) gr GuHCl 8 M 20 ml Triton-100x 2% 119

122 Προστίθεται απεσταγμένο νερό μέχρι συμπληρώσεως του όγκου του 1 lt. Διατηρείται στο ψυγείο στους 4 o C. Πρώτο διάλυμα Έκπλυσης (Wash 1 Buffer) 382 gr GuHCl 4 M 25 ml Tris-HCl 1 M (ph 7,4) 600 ml αιθανόλη 100% Προστίθεται απεσταγμένο νερό μέχρι συμπληρώσεως του όγκου του 1 lt. Διατηρείται στο ψυγείο στους 4 o C. Δεύτερο διάλυμα Έκπλυσης RNA (Wash 2 RNA Buffer) 5 ml NaCl 4 M 2 ml Tris-HCl 1 M (ph 7,4) 800 ml αιθανόλη 100% Προστίθεται απεσταγμένο νερό μέχρι συμπληρώσεως του όγκου του 1 lt. Διατηρείται στο ψυγείο στους 4 o C. Δεύτερο διάλυμα Έκπλυσης DNA (Wash 2 DNA Buffer) 25 ml NaCl 4 M 10 ml Tris-HCl 1 M (ph 7,4) 250 ml αιθανόλη 100% 250 ml ισοπροπανόλη 100% Προστίθεται απεσταγμένο νερό μέχρι συμπληρώσεως του όγκου του 1 lt. Διατηρείται στο ψυγείο στους 4 o C. Διάλυμα Έκλουσης (Elution Buffer) (Tris EDTA (TE) ph 7.4 1x) 100 ml Tris-HCl 1M (ph 7.4) 2 ml EDTA (ph 8.0) Τα παραπάνω συστατικά διαλύονται σε 1000 ml απεσταγμένο νερό. Διατηρείται στην κατάψυξη στους -20 o C. 120

123 Γ. Επεξήγηση νουκλεοτιδικών συμβόλων Δ. Απομονώσεις στελεχών του TuMV που χρησιμοποιήθηκαν στην κατασκευή του φυλογενετικού δέντρου της CP Ομάδα Απομόνωση Κωδικός Αριθμός Basal-B Asian-BR Basal-BR ITA3 AB IS1 AB St48 AB A102/11 AB Al AB A64 AB GRC42 AB IRN SS5 AB IRN TRa6 AB TUR9 AB HRD AB CH6 AB ITA7 AB Cal1 AB PV0104 AB KWB779J AB NID119J AB KYD81J AB CP845J AB