Πολυλειτουργικά νανοκαψάκια για την στοχευμένη χορήγηση ιξαμπεπιλόνης: Σύνθεση και in vitro μελέτες

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας Πολυλειτουργικά νανοκαψάκια για την στοχευμένη χορήγηση ιξαμπεπιλόνης: Σύνθεση και in vitro μελέτες ΚΟΥΤΣΟΣΠΥΡΟΥ ΝΕΦΕΛΗ του Ηλία, Χημικός Μηχανικός Πάτρα, Ιούνιος

2 Τριμελής εξεταστική επιτροπή Καθηγητής, Κ. Αυγουστάκης (Επιβλέπων Καθηγητής) Λέκτορας, Α. Μπακανδρίτσος Επικ. Καθηγητής, Π. Κλεπετσάνης 2

3 3

4 Ευχαριστίες Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο της Φαρμακευτικής Τεχνολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. Η εκπόνηση της εργασίας, έγινε υπό την επίβλεψη του Καθηγητή της Φαρμακευτικής Τεχνολογίας κ. Κων/νου Αυγουστάκη, τον οποίο θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά για την ευκαιρία, που μου έδωσε να συνεργαστώ με την ομάδα του, και την συνεχή καθοδήγηση και επίβλεψη του, κατά τη διάρκεια των πειραμάτων, όπως και τη βοήθεια που μου προσέφερε σε όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Λέκτορα του Τμήματος Επιστήμης των Υλικών, της Σχολής Θετικών Επιστημών του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Αριστείδη Μπακανδρίτσο, για την συνεργασία, την πολύτιμη βοήθεια του σε ερευνητικό επίπεδο και την απαραίτητη τεχνική υποστήριξη, κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων, όπως και τον Επίκουρο Καθηγητή Φυσικοφαρμαρμακευτικής του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Παύλο Κλεπετσάνη, για τη βοήθεια του σε ερευνητικό επίπεδο, καθώς και για τις πολύτιμες συμβουλές του. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την διδακτορική φοιτήτρια Ευσταθία Βούλγαρη, για την ευχάριστη συνεργασία και την σημαντική βοήθεια για τη διεξαγωγή των κυτταρικών μελετών, όπως και την χειριστή του Ηλεκτρονικού Μικροσκοπίου Διελεύσεως, κ. Μαίρη Κόλλια, για το αποτέλεσμα της αποτύπωσης της εικόνας των νανοκαψακίων. Ιδιαίτερες ευχαριστίες αποδίδονται και στον κ. Ιωάννη Σαρηγιάννη, μεταδιδάκτωρ ερευνητή του Τμήματος Επιστήμης των Υλικών την περίοδο που διενεργούνταν η εργασία, για τον πολύτιμο χρόνο που διέθεσε, μεταλαμπαδεύοντας τις γνώσεις του. Ακόμα, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου της Φαρμακευτικής Τεχνολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, τους αγαπητούς μεταπτυχιακούς φοιτητές, Μύρια Παπαχριστοδούλου, Καλλιόπη Κουτσιούκη, Αντρέα Σεργίδη, Αθηνά Λιασκώνη, Θεοδώρα Παναγιωτοπούλου και τις μεταδιδάκτορες Ειρήνη Ιωάννου και Αθηνά Αγγελοπούλου για την όμορφη συνεργασία, και την ανταλλαγή γνώσεων. Οι τελευταίες μου ευχαριστίες θα έχουν ως παραλήπτη την οικογένεια και τους φίλους μου, οι οποίοι στηρίζουν, υποστηρίζουν και ενθαρρύνουν τις επιλογές μου. 4

5 Περιεχόμενα 1. Θεωρία 1.1. Ελεγχόμενη χορήγηση και στόχευση φαρμάκων Εισαγωγή Τύποι νανοφορέων για στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων Βασικές έννοιες Νανοσωματίδια με βάση τα πολυμερή Νανοσωματίδια λιπιδικής φύσης Ιϊκά νανοσωματίδια Νανοσωλήνες άνθρακα 1.2. Υβριδικοί νανοφορείς για την διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου 1.3. Μαγνητικά νανοσωματίδια Μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίων σιδήρου Μαγνητισμός Είδη μαγνητισμού Οξείδια του σιδήρου Σύνθεση υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων Υπερθερμία 1.4. Σύνθεση πολυμερικών νανοσωματίδιων Μέθοδοι παρασκευής πολυμερικών νανοσωματιδίων/ νανοκαψακίων Επίδραση του μεγέθους Επίδραση του πυρήνα Επίδραση της λειτουργικότητας της επιφάνειας και του φορτίου 1.5. Πολυγαλακτικό οξύ 1.6. Πολυαιθυλενογλυκόλη 1.7. Πεπτίδιο ΤΑΤ 1.8. Ιξαμπεπιλόνη Βασικά χαρακτηριστικά και δράση της Ιξαμπεπιλόνης Παρενέργειες κατά την συμβατική χορήγηση της Ιξαμπεπιλόνης 5

6 2. Σκοπός εργασίας 3. Πειραματικό μέρος 3.1. Υλικά 3.2. Οργανολογία 3.3. Σύνθεση νανοκαψακίων Σύνθεση μαγνητικών νανοκρυστάλλων τριοξειδίου του σιδήρου Σύνθεση μαγνητικών νανοκαψακίων Ιξαμπεπιλόνης Σύνθεση μαγνητικών κενών νανοκαψακίων Σύνθεση μη μαγννητικών κενών νανοκαψακίων Σύνθεση μαγνητικών νανοκαψακίων Ιξαμπεπιλόνης με την πρόσδεση πεπτιδίου ΤΑΤ Σύνθεση μαγνητικών κενών νανοκαψακίων φορτωμένων με Ροδαμίνη 3.4. Χαρακτηρισμός νανοκαψακίων Τεχνικές χαρακτηρισμού Δυναμική σκέδαση φωτός (Dynamic Light Scattering) Φασματομετρία μοριακής απορρόφησηφς υπεριώδουςορατού (UV-Vis) Ηλεκτροφόρηση Θερμοσταθμική ανάλυση (Thermo Gravimetric Analysis) Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (High Pressure Liquid Chromatography) Κυτταρομετρία ροής (Flow cytometry) Ηλεκτρονική μικροσκοπία διελεύσεως (Transmission Electron Microscopy) 3.5. Μέθοδοι χαρακτηρισμού των νανοκαψακίων Προσδιορισμός μεγέθους νανοκαψακίων Προσδιορισμός ζ-δυναμικού νανοκαψακίων Προσδιορισμός απόδοσης νανοκαψακίων Προσδιορισμός φόρτωσης και ενακαψακίωσης της Ιξαμπεπιλόνης στα νανοκαψάκια Προσδιορισμός κολλοειδούς σταθερότητας των μαγνητικών νανοκαψακίων Προσδιορισμός σταθερότητας των μαγνητικών νανοκαψακίων σε Χλωριούχο Νάτριο 6

7 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης των μαγνητικών νανοκρυστάλλων Προσδιορισμός αποδέσμευσης της Ιξαμπεπιλόνης από τα νανοκαψάκια Έλεγχος αιμοσυμβατότητας Κυτταρικές μελέτες Καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων Μέτρηση κυττάρων Μελέτη της in vitro αντικαρκινικής δραστικότητας των νανοκαψακίων Ιξαμπεπιλόνης 4. Πειραματικά αποτελέσματα 4.1. Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των νανοκαψακίων Έλεγχος του μεγέθους και του ζ-δυναμικού των νανοκαψακίων Έλεγχος κολλοειδούς σταθερότητας των μαγνητικών νανοκαψακίων Έλεγχος μορφολογίας μέσω ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διελεύσεως Έλεγχος της απόδοσης κατά την παρασκευή των νανοκαψακίων 4.2. Φόρτωση μαγνητικών νανοκρυστάλλων στα νανοκαψάκια 4.3. Φόρτωση και ενακψακίωση Ιξαμπεπιλόνης στα νανοκαψάκια 4.4. Αποδέσμευση της Ιξαμπεπιλόνης από τα μαγνητικά νανοκαψάκια Αποδέσμευση της Ιξαμπεπιλόνης απουσία εναλλασσόμενου εξωτερικού μαγνητικού πεδίου Αποδέσμευση της Ιξαμπεπιλόνης παρουσία εναλλασσόμενου εξωτερικού μαγνητικού πεδίου 4.5. Αποτελέσματα αιμοσυμβατότητας 4.6. Μελέτες κυτταροτοξικότητας 5. Συμπεράσματα 7

8 6. Βιβλιογραφία 8

9 9

10 Περίληψη Στην παρούσα εργασία παρουσιάζεται η σύνθεση και ο χαρακτηρισμός πολυλειτουργικών μαγνητικών νανοκαψακίων, για την στοχευμένη χορήγηση αντικαρκινικών ουσιών. Συγκεκριμένα, οι νανοφορείς που συντέθηκαν, φορτώθηκαν με την αντικαρκινική δραστική ουσία Ιξαμπεπιλόνη, με σκοπό την στοχευμένη χορήγηση της για την αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού. Η σύνθεση έγινε με την τεχνική της νανοσυγκαταβύθισης, με βασική πρώτη ύλη τα συμπολυμερή πολυγαλακτικού οξέος-πολυαιθυλενογλυκόλης. Η προσθήκη μαγνητικών νανοκρυστάλλων στα νανοκαψάκια, συμβάλει στην επίτευξη στοχευμένης χορήγησης σε ιστούς-στόχους με την εφαρμογή εξωτερικού μαγνητικού πεδίου στην περιοχή του ιστού-στόχου, όπως και στην απεικόνιση της πορείας των νανοφορέων αυτών μέσω μαγνητικής τομογραφίας. Επίσης, επιτρέπει την εφαρμογή υπερθερμίας εκλεκτικά στα καρκινικά κύτταρα-στόχο, παραμερίζοντας το βασικό μειονέκτημα που παρουσιάζε ως τεχνική, και εμπόδιζε την ευρεία εφαρμογή της μέχρι σήμερα. Κατά τη διάρκεια της παρούσας μελέτης, εξετάστηκαν οι φυσικοχημικές ιδιότητες των νανοκαψακίων, όπως η υδροδυναμική τους διάμετρος, το ζ- δυναμικό τους, η κολλοειδής τους σταθερότητα, και η σταθερότητα τους παρουσία ηλεκτρολύτη (χλωριούχου νατρίου). Επίσης, ελέγχθηκε η μορφολογία των φορέων, μέσω της Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας Διελεύσεως. Σε επόμενο βήμα της μελέτης, προσδιορίστηκαν, η απόδοση των νανοκαψακίων, μετά από διαδικασία λυοφιλοποίησης, καθώς και η φόρτωση και η ενκαψακίωση της Ιξαμπεπιλόνης στα νανοκαψάκια, όπως επίσης και η συγκέντρωση τους σε μαγνητικούς νανοκρυστάλλους. Πραγματοποιήθηκαν στην πορεία πειράματα αποδέσμευσης του ενκαψακιωμένου φαρμάκου από τα νανοκαψάκια, με και χωρίς την επίδραση εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου. Τελικά, ελέγχθηκε η κυτταροτοξικότητα των κενών μαγνητικών νανοκαψακίων, όπως και των νανοκαψακίων Ιξαμπεπιλόνης, με σκοπό τον προσδιορισμό της τοξικότητας τους σε επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα πνεύμονα, και τη σύγκριση της με αυτή της ελεύθερης Ιξαμπεπιλόνης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα PLA-PEG πολυλειτουργικά μαγνητικά νανοκαψάκια εμφανίζουν κατάλληλες φυσικοχημικές ιδιότητες και υψηλή κολλοειδή σταθερότητα. Παρατηρήθηκε παρατεταμένη αποδέσμευση του φαρμάκου, με τον ρυθμό αποδέσμευσης να επηρεάζεται από την σύσταση του PLA-PEG συμπολυμερούς που χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή των νανκαψακίων. Η εφαρμογή εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου βρέθηκε να αυξάνει τον ρυθμό αποδέσμευσης. Τα κενά (χωρίς δραστική ουσία) νανοκαψάκια εμφάνισαν χαμηλή τοξικότητα, ενώ τα φορτωμένα με ιξαμπεπιλόνη νανοκαψάκια εμφάνισαν συγκρίσιμη με το ελεύθερο φάρμακο κυτταροτοξικότητα, έναντι 10

11 ανθρώπινης καρκινικής σειράς. Με βάση τα αποτελέσματα που λήφθηκαν, συμπεραίνεται ότι τα PLA-PEG πολυλειτουργικά μαγνητικά νανοκαψάκια ιξαμπεπιλόνης έχουν κατάλληλες in vitro ιδιότητες που δικαιολογούν την περαιτέρω διερεύνηση της πιθανής εφαρμογής τους για την στοχευμένη χημειοθεραπεία καρκίνου του μαστού. H εργασία είχε οικονομική υποστήριξη από το πρόγραμμα ΣΥΝΕΡΓΑΣΙΑ: "Ανάπτυξη Καινοτόμων Νανοφορέων ΙΞΑΜΠΕΠΙΛΟΝΗΣ και Μελέτη της Δυνατότητας Εφαρμογής τους στην Αντιμετώπιση του Καρκίνου του Μαστού" [ΝΑΝΟΜΠΙΛΟΝ, 09ΣΥΝ ] Abstract This thesis is about the composition and characterization of multifunctional magnetic nanocapsules, for targeted delivery of anticancer substances. Specifically, the composed nanoparticles were loaded with the anticancer active substance Ixabepilone, aiming at the ixabepilone targeted delivery for cancer treatment. The composition was held through nanoprecipitation method, using PLA-PEG. The addition of magnetic nanocrystals in the nanocapsule formation, contributes to the achievement of targeted delivery at target-tissues with the application of external magnetic field at the target-tissue, just like as the illustration of the nanoparticles' course, through MRI. Further, it allows the selective apply of hyperthermia at the targeted tumor cells, overcoming the basic disadvantage of the technique, that was a barrier for its wide use until nowadays. Within this study, the physicochemical properties of the nanocapsules, like as hydrodynamic diameter, zeta potential, colloidal stability, and stability in the presence of electrolyte (NaCl) were investigated. Furthermore, the morphology of the particles was checked by Transmission Electron Microscopy (TEM). The next step was the determination of nanocapsules' yield after freeze-drying, just like as nanocapsules' loading and encapsulation efficiency of Ixabepilone, and magnetic nanocrystals. Also, release experiments were performed, to check the percentage of the released encapsulated substance with or without the application of alternating magnetic field. The final check was about the cytotoxicity of blank magnetic and loaded magnetic nanocapsules, with purpose the determination of their toxicity at epithelial lung cells, and the comparison of it with the toxicity of the nonencapsulated drug. The results indicated that the PLA-PEG multifunctional magnetic nanocapsules display suitable physicochemical properties and high colloidal stability. It was observed suspended ixabepilone release, while the rate seemed to be effected by 11

12 the composition of the PLA-PEG copolymer used. The application of alternating magnetic field increased the release rate. Blank nanocapsules showed up low toxicity, whereas the ixabepilone loaded ones showed up cytotoxixity comparable with that of the non-encapsulated drug, against human cancer cell line. Based on the above results, it is concluded that the PLA-PEG multifunctional magnetic ixabepilone nanocapsules, display suitable in vitro properties, that justify further investigation of their possible application, for the targeted chemotherapy of breast cancer. 12

13 1.Θεωρία 1.1. Ελεγχόμενη χορήγηση και στόχευση των φαρμάκων Εισαγωγή Κάθε ουσία ή μίγμα ουσιών, που παράγεται, προσφέρεται προς πώληση, ή παρουσιάζεται για χρήση, στη διάγνωση, στη θεραπεία, στον μετριασμό ή στην πρόληψη νόσου, μη φυσιολογικής φυσικής κατάστασης, ή των συμπτωμάτων τους στον άνθρωπο ή στα ζώα καθώς και για χρήση στην αποκατάσταση, την διόρθωση, ή την μεταβολή οργανικών λειτουργιών στον άνθρωπο ή τα ζώα, ορίζεται ως φάρμακο, σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό Υγείας (W.H.O.). Τα φάρμακα στον οργανισμό βρίσκονται σε δυναμική φάση. Κινούνται ανάμεσα στους ιστούς, σε βιολογικά υγρά, συνδέονται με πρωτεΐνες και κυτταρικά στοιχεία ή μεταβολίζονται. Κατά τη συμβατική χορήγηση των φαρμακευτικών ουσιών γίνεται είσοδος της ουσίας σε ένα κεντρικό διαμέρισμα, που αντιπροσωπεύει τη συστηματική κυκλοφορία του αίματος, είτε άμεσα, είτε έμμεσα μετά από μια διαδικασία απορρόφησης. Η είσοδος της κάθε ουσίας στο κεντρικό διαμέρισμα ακολουθείται από την κατανομή της στα άλλα διαμερίσματα που αντιστοιχούν σε ιστούς ή όργανα του σώματος. Κατά την συμβατική χορήγηση των φαρμακευτικών ουσιών, είναι αδύνατο να καθοριστεί ανεξάρτητα η συγκέντρωση ή ο χρόνος διάθεσης τους στο επιθυμητό σημείο δράσης. Το στοιχείο που μπορεί να καθοριστεί είναι η χορηγούμενη δόση, καθώς και η συχνότητα της χορήγησης της, ώστε να επιτευχθούν θεραπευτικά επίπεδα των ουσιών στο στόχο για μία ορισμένη χρονική περίοδο. 'Όμως, ο κλασικός αυτός τρόπος χορήγησης φαρμακευτικών ουσιών εμφανίζει μειονεκτήματα, με σημαντικότερα των οποίων την επαγωγή παρενεργειών από την δράση του φαρμάκου στους υγιείς ιστούς και τη δυσκολία συμμόρφωσης των ασθενών στην φαρμακευτική αγωγή. Για τον λόγο αυτό, αναπτύχθηκαν συστήματα ελεγχόμενης χορήγησης των φαρμακευτικών ουσιών, με σκοπό τόσο την βελτιστοποίηση της φαρμακοθεραπείας, όσο και της ποιότητας ζωής των ασθενών. Η ελεγχόμενη χορήγηση των φαρμακευτικών ουσιών μπορεί να επιτευχθεί είτε με την διάθεση του φαρμάκου στο κεντρικό διαμέρισμα (γενική κυκλοφορία αίματος) με προκαθορισμένο ρυθμό, είτε με την εφαρμογή της φαρμακομορφής στην περιοχή του στόχου όπου το φάρμακο αποδεσμεύεται με συγκεκριμένο και προκαθορισμένο ρυθμό (τοπική ελεγχόμενη χορήγηση), ή τέλος με την εισαγωγή του φαρμάκου στην συστηματική κυκλοφορία του αίματος και την εκλεκτική μεταφορά του στον στόχο (στοχευμένη χορήγηση). Η εκλεκτική μεταφορά του φαρμάκου με τη βοήθεια κατάλληλου φορέα στο όργανο / ιστό στόχο (στόχευση 13

14 του φαρμάκου) επιτυγχάνεται με τη σύνδεση / εγκλεισμό του φαρμάκου σε κατάλληλο φορέα, ο οποίος με τη βοήθεια ενεργητικού ή παθητικού μηχανισμού συσσωρεύεται εκλεκτικά στην περιοχή δράσης του φαρμάκου. Τα συστήματα ελεγχόμενης χορήγησης φαρμακευτικών μορφών εμφανίζουν τα παρακάτω οφέλη σε σχέση με τα συμβατικά συστήματα χορήγησης: α) Παρατείνουν τα θεραπευτικά επίπεδα των φαρμακευτικών ουσιών, οπότε δίνεται παράταση στην κλινική απόκριση του ασθενούς που τα λαμβάνει. β) Οι δραστικές ουσίες με μικρό χρόνο ημίσειας ζωής, όπως τα πεπτίδια ή οι πρωτεΐνες, απαιτούν εγκλεισμό τους σε συστήματα ελεγχόμενης χορήγησης ώστε να εξασφαλιστεί παρατεταμένη αποτελεσματικότητα. γ) Χάρη στον σταθερότερο ρυθμό εισόδου του φαρμάκου στη συστηματική κυκλοφορία, τα επίπεδα του φαρμάκου στο αίμα δεν παρουσιάζουν αξιοσημείωτες αυξομειώσεις, όπως συμβαίνει στα πολλαπλών χορηγήσεων συμβατικά συστήματα, οπότε μειώνονται οι εμφανιζόμενες ανεπιθύμητες ενέργειες, που συχνά οδηγούν σε μη συμμόρφωση των ασθενών. δ) Εξασφαλίζεται καλύτερη συνεργασία του ασθενούς, λόγω της μείωσης του αριθμού των δόσεων. ε) Αποφεύγεται ο ερεθισμός είτε του γαστρεντερικού συστήματος από προϊόντα εσωτερικής λήψης, είτε του δέρματος από προϊόντα εξωτερικής χρήσης. Ωστόσο, τα συστήματα αυτά εμφανίζουν και κάποια μειονεκτήματα, λόγω του ότι περιέχουν μεγαλύτερες ποσότητες δραστικής ουσίας σε σχέση με τα συμβατικά: α) Υπάρχει κίνδυνος εμφάνισης τοξικότητας. β) Πιθανά να υπάρχει καθυστέρηση στην έναρξη του θεραπευτικού αποτελέσματος. γ) Παρουσιάζεται δυσκολία στην αντιμετώπιση πιθανών παρενεργειών. δ) Υπάρχει πιθανότητα ατελούς απορρόφησης της δραστικής ουσίας (ελαττωμένης βιοδιαθεσιμότητας), όταν η διέλευση της φαρμακοτεχνικής μορφής από το γαστρεντερικό σωλήνα είναι γρηγορότερη από τη χρονική διάρκεια της αποδέσμευσης ή όταν εμφανίζεται «παράθυρο απορρόφησης» της δραστικής ουσίας. Το ιδανικό σύστημα ελεγχόμενης χορήγησης (drug delivery system) πρέπει να έχει τις παρακάτω ιδιότητες: α) Μηχανική αντοχή 14

15 β) Βιοσυμβατότητα γ) Ασφάλεια για τον ασθενή από περίπτωση τυχαίας, μη αναμενόμενης απελευθέρωσης δ) Απλότητα στην κατασκευή και την εφαρμογή ε) Ικανότητα να επιτύχει υψηλό εγκλεισμό φαρμάκου και ελεγχόμενη αποδέσμευση Τα περισσότερα συστήματα ελεγχόμενης αποδέσμευσης λειτουργούν με έναν συνδυασμό διαδικασιών με βάση την διάλυση (dissolution), την διόγκωση (swelling), και την διάχυση (diffusion). Ο πιο σημαντικός παράγοντας είναι η υδατοδιαλυτότητα του φαρμάκου, η οποία επηρεάζει όλους τους μηχανισμούς απελευθέρωσης των φαρμακευτικών ουσιών. Ανάλογα με την πολυπλοκότητα που παρουσιάζουν στην τεχνολογία τους, τα συστήματα παρατεταμένης αποδέσμευσης χωρίζονται στις εξής κατηγορίες [1]: 1. Συστήματα προκαθορισμένου ρυθμού αποδέσμευσης (predetermined-releaserate systems) Ο ρυθμός αποδέσμευσης του φαρμάκου καθορίζεται από την κατασκευή του συστήματος. Ο έλεγχος επιτυγχάνεται, εισάγoντας φραγμό (barrier) στο σύστημα, μέσω του οποίου ελέγχεται ο ρυθμός διάχυσης των μορίων του φαρμάκου από το σύστημα στο περιβάλλον υγρό. Ανάλογα με τη φύση του φραγμού χωρίζονται σε δύο κατηγορίες: α) τα συστήματα μεμβράνης (membrane/reservoir systems), στα οποία ο φραγμός είναι μια πολυμερική μεμβράνη που περιβάλλει το σύστημα. β) τα συστήματα τύπου μήτρας (matrix systems) όπου το φάρμακο βρίσκεται διαλυμένο ή διεσπαρμένο εντός πολυμερικής ή κηρώδους μήτρας. Οι δύο αυτές μορφές συστημάτων ελεγχόμενης αποδέσμευσης είναι οι απλούστερες μορφές που συναντούνται και πολλά συστήματα αυτού του τύπου χρησιμοποιούνται σήμερα στη θεραπευτική. 2. Συστήματα ενεργοποιούμενης αποδέσμευσης (activation modulated systems) Στα συστήματα αυτά η ενεργοποίηση της αποδέσμευσης του φαρμάκου επιτυγχάνεται μέσω παρέμβασης κάποιας φυσικής, χημικής ή βιοχημικής διεργασίας, ή ακόμα και με την παροχή κάποιας εξωτερικής προερχόμενης ενέργειας. Στους φυσικούς τρόπους ενεργοποίησης τέτοιων συστημάτων περιλαμβάνονται μεταξύ άλλων, η οσμωτική πίεση, η οποία βρίσκει εφαρμογή σε συστήματα σταθερού ρυθμού αποδέσμευσης τύπου οσμωτικής αντλίας, η εφαρμογή 15

16 ηλεκτρομαγνητικού πεδίου για την επιτάχυνση της αποδέσμευσης από συστήματα στα οποία έχουν εγκλειστεί μαγνητικά σωματίδια, η εφαρμογή ασθενούς ηλεκτρικού πεδίου (ιοντοφόρεσης) σε διαδερμικά συστήματα με σκοπό την διευκόλυνση διόδου των φαρμάκων μέσω του δέρματος και η ενυδάτωση υδρόφιλης πολυμερικής μήτρας που προκαλεί διόγκωση επιτρέποντας την αποδέσμευση του φαρμάκου με ρυθμό χρήσιμο θεραπευτικά. Στους χημικούς τρόπους ενεργοποίησης της αποδέσμευσης περιλαμβάνονται, η υδρόλυση, η οποία προκαλεί την σταδιακή in vivo διάσπαση του φραγμού, που περιορίζει την αποδέσμευση του φαρμάκου, καθώς επίσης και η ph-εξαρτώμενη υδρόλυση, η οποία οδηγεί στην εκλεκτική διάλυση του φραγμού όταν βρίσκεται σε περιβάλλον με συγκεκριμένο ph. 3. Συστήματα στα οποία η αποδέσμευση ελέγχεται από μηχανισμό ανάδρασης (feed back regulated systems) Η αποδέσμευση της δραστικής ουσίας από τα συστήματα αυτά επάγεται από την ενεργοποίηση ενός βιοχημικού παράγοντα in vivo. Ο ρυθμός αποδέσμευσης εξαρτάται από την συγκέντρωση του βιοχημικού παράγοντα, μέσω μηχανισμού ανάδρασης. Η πιο εξελιγμένη μορφή τέτοιων συστημάτων είναι τα συστήματα αυτορυθμιζόμενης αποδέσμευσης (self-regulated systems). 4. Συστήματα στόχευσης (drug targeting systems) Με τα συστήματα αυτά επιχειρείται η εκλεκτική αποστολή της δραστικής ουσίας στην θέση δράση της. Η εκλεκτική αποστολή στα κύτταρα-στόχο, έχει ως αποτέλεσμα την βελτίωση του θεραπευτικού δείκτη του φαρμάκου και είναι ιδιαίτερα σημαντική σε ισχυρά φάρμακα με αυξημένη τοξικότητα, όπως είναι τα αντικαρκινικά. Παράλληλα συντελεί στη μείωση της εμφάνισης των παρενεργειών αφού ο στόχος αυτών των συστημάτων είναι η καταστροφή των κυττάρων που βρίσκονται στον ιστό στόχο χωρίς να προκαλούν βλάβες στα υγιή κύτταρα. Τα συστήματα στόχευσης μπορεί να περιλαμβάνουν τα εξής μέρη: α) Τη δραστική ουσία που είναι συνδεμένη σε υδατοδιαδιαλυτό πολυμερικό σύστημα ή εγκλεισμένη σε αδιάλυτο σωματιδιακό φορέα. β) Μία μη-ανοσολογική βιοδιασπώμενη πολυμερική αλυσίδα ή ένα πολυμερικό σωματίδιο στην οποία ή στο οποίο έχει προσδεθεί μια κατευθυντήρια ομάδα (targeting moiety), η οποία θα βοηθήσει στη συσσώρευση του συστήματος στον στόχο. γ) Ένα υδρόφιλο εύκαμπτο πολυμερές στην επιφάνεια του σωματιδίου (π.χ. πολυαιθυλενογλυκόλη) ή ένας διαλυτοποιητής (solubiliser) συνδεμένος με την πολυμερική αλυσίδα και ο οποίος θα ενισχύσει τη διαλυτότητα του συστήματος στα βιολογικά υγρά. 16

17 Η εκλεκτική διάθεση του συστήματος στον ιστό στόχο συμβαίνει είτε παθητικά (α) (passive targeting), είτε ενεργητικά (β) (active targeting). α) Η "παθητική" στόχευση βασίζεται στη διαφορετική μορφολογία των αγγείων μεταξύ του υγιούς ιστού και του ιστού στόχου. Συγκεκριμένα, σε περίπτωση συμπαγών όγκων, η παθητική στόχευση βασίζεται στην εμφάνιση ιδιαίτερων παθοφυσιολογικών χαρακτηριστικών που δεν παρατηρούνται στους φυσιολογικούς ιστούς, όπως η εκτεταμένη αγγειογένεση προκειμένου να καλυφθούν οι συνεχώς αυξανόμενες ανάγκες του όγκου σε οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά. Αυτή όμως η υπερ-αγγείωση που δημιουργείται έχει δομικές ατέλειες, με διεσταλμένα, ακανόνιστα ή διαπερατά αιμοφόρα αγγεία καθώς και απουσία λεμφικής παροχέτευσης. Έτσι αυτή η ελαττωματική αρχιτεκτονική των αιμοφόρων αγγείων του όγκου, σε συνδυασμό με τον ευρύ αυλό τους, έχει σαν αποτέλεσμα την εκτεταμένη διαρροή συστατικών του πλάσματος του αίματος μέσα στον όγκο (Eικ.1.1). Μέσω του μηχανισμού αυτού, δηλαδή του φαινομένου αυξημένης διαπερατότητας και συγκράτησης (Enhanced Permeability and Retention effect, EPR) τα συστήματα στόχευσης μπορούν να συγκεντρωθούν στον καρκινικό ιστό[2]. Εικόνα 1.1. Το φαινόμενο της ενισχυμένης διαπερατότητας και συγκράτησης (EPR) Τα νανοσωματίδια εξαγγειώνονται στους όγκους μέσω του ανοργάνωτου και με διαρροές αγγειακού συστήματος τους [2]. β) Στην "ενεργητική" στόχευση στο σύστημα στόχευσης είναι συνδεδεμένο ένα μόριο (αντίσωμα, υδατάνθρακας, πεπτίδιο ή ολιγονουκλεοτίδιο), το οποίο αναγνωρίζεται ειδικά από υποδοχείς στην κυτταρική μεμβράνη του ιστού-στόχου. Η μεγαλύτερη δυσκολία αυτού του μηχανισμού για την χορήγηση φαρμάκων αποτελεί η εύρεση μη ανοσολογικών και εξαιρετικά εξειδικευμένων μονάδων στόχευσης. Το ιδανικό σύστημα στόχευσης περιλαμβάνει μία μη-ανοσογονική βιοδιασπώμενη πολυμερική αλυσίδα, στην οποία έχει προσδεθεί μια 17

18 κατευθυντήρια ομάδα (targeting moiety), η οποία θα οδηγήσει το σύστημα στον στόχο, και ένας διαλυτοποιητής (solubiliser) αν χρειάζεται, για την διάλυση του συστήματος στα βιολογικά υγρά. Τα μόρια του φαρμάκου συνδέονται στο σύστημα μέσω ενός βραχίονα (spacer), ο οποίος φέρει χημικούς δεσμούς, που μπορούν να διασπασθούν μόνο από ένζυμα που βρίσκονται στην περιοχή του κυττάρου στόχου, ελευθερώνοντας το φάρμακο. 18

19 Νανοφορείς για στοχευμένη χορήγηση Φαρμάκων Βασικές έννοιες Το πρόθεμα νάνο- προέρχεται από την ελληνική γλώσσα και την λέξη νάνος. Ένα νανόμετρο είναι ίσο με το ένα δισεκατομμυριοστό του μέτρου, 10-9 m (Eικ.1.2). Το εύρος της νανοκλίμακας, το οποίο παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, είναι από τα 200 έως τα 0.2 nm, που είναι το επίπεδο των ατόμων, και αυτό διότι σε αυτά τα μεγέθη τα υλικά παρουσιάζουν ιδιότητες, οι οποίες είναι είτε διαφορετικές, είτε ενισχυμένες συγκρινόμενα με τα ίδια υλικά σε μεγαλύτερες διαστάσεις. Οι δύο βασικότεροι λόγοι για αυτήν την αλλαγή είναι αφενός μεν, η αύξηση της σχετικής επιφάνειας σε σχέση με τον συνολικό όγκο και αφετέρου η επικράτηση των κβαντικών φαινομένων. Η αύξηση της σχετικής επιφάνειας έχει ως αποτέλεσμα, την αύξηση της χημικής δραστικότητας, καθιστώντας ορισμένα νανοϋλικά πολύτιμα. Καθώς το μέγεθος της ύλης μικραίνει σε μερικές δεκάδες νανόμετρα, τα κβαντικά φαινόμενα,διαδραματίζουν ολοένα και αυξανόμενο ρόλο με αποτέλεσμα να αλλάζουν σημαντικά οι οπτικές, ηλεκτρικές και μαγνητικές ιδιότητες του υλικού. Εικόνα 1.2 : Κλίμακα μήκους στην οποία απεικονίζεται η έννοια του νανόμετρου. Οι εφαρμογές της νανοτεχνολογίας, που ενδιαφέρουν την φαρμακευτική επιστήμη αφορούν φαρμακομορφές, που περιέχουν ενεργά συστατικά σε διαστάσεις νανομέτρων, πρωτοποριακά συστήματα χορήγησης φαρμάκων, που επιτρέπουν την εναπόθεση φαρμάκων σε προηγουμένως μη προσβάσιμες περιοχές του σώματος, και βελτιωμένες διαγνωστικές μεθόδους και ιατρικές συσκευές. Η νανοϊατρική είναι ένα από τα πιο δραστήρια πεδία της νανοτεχνολογίας, η οποία επί του παρόντος κυριαρχείται από τα συστήματα χορήγησης φαρμάκων, που αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 75% των συνολικών πωλήσεων [3]. Ο τομέας της νανοτεχνολογίας λοιπόν, περιλαμβάνει νανοσυστήματα που συχνά βασίζονται σε νανοσωματίδια. Τα νανοσωματίδια (nanoparticles, nps) είναι 19

20 γενικός όρος για όλα τα συστήματα, των οποίων το μέγεθος είναι της τάξης ορισμένων νανομέτρων. Ωστόσο, σωματίδια μεγαλύτερα από 200 nm δεν προτιμώνται ιδιαίτερα στον τομέα της νανοϊατρικής, λόγω του περιορισμένου πλάτους των μικροτριχοειδών. Σε γενικές γραμμές, το μέγεθος των σωματιδίων είναι προεπιλεγμένο, ώστε τα nps να μπορούν να διέρχονται μέσα από τα κενά του διαρρηγμένου καρκινικού ενδοθηλίου. Αυτό βοηθά στην επίτευξη των επιθυμητών συγκεντρώσεων των nps στην περιοχή του όγκου. Τα συστήματα των νανοσωματιδίων έχουν μέγεθος παρόμοιο με αυτό των ιών. Τα νανοσωματίδια που χρησιμοποιούνται ως φορείς φαρμάκων είναι στην ουσία μικρά σωματίδια (3-200 nm), συσκευές ή συστήματα που παρασκευάζονται από διάφορα υλικά, όπως πολυμερή (πολυμερικά νανοσωματίδια, μικύλλια ή δενδριμερή), λιπίδια (λιποσώματα), ιούς (ιικά σωματίδια), αλλά και αλλοτροπικές μορφές άνθρακα (νανοσωλήνες) που παρουσιάζουν διαφορετικά χαρακτηριστικά [4] Νανοσωματίδια με βάση τα πολυμερή Στην κατηγορία αυτή, νανοσωματιδίων, αναλόγως την μέθοδο παρασκευής που ακολουθείται, το φάρμακο είναι είτε εγκλεισμένο μέσω φυσικοχημικών διαδικασιών στο εσωτερικό των νανοσωματιδίων, είτε προσδεδεμένο χημικά στην πολυμερική μήτρα. Τα σωματίδια που προκύπτουν μπορούν να έχουν τη δομή κάψουλας (πολυμερικά νανοσωματίδια, α), να αποτελούνται από έναν πυρήνα και εξωτερικές αλυσίδες (πολυμερικά μικύλλια, β), ή να αποτελούνται από πολυμερισμένα μακρομόρια (δενδριμερή, γ). Τα πολυμερή που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή νανοσωματιδίων με βάση τα πολυμερή μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες, στα φυσικά και τα συνθετικά πολυμερή. α) Πολυμερικά νανοσωματίδια Τα πολυμερικά νανοσωματίδια έχουν ευρεία χρήση σε εφαρμογές για την στοχευμένη συγχορήγηση διαγνωστικών αλλά και θεραπευτικών παραγόντων (theranostics) εξαιτίας της βιοσυμβατότητας τους, της σταθερότητας κατά την αποθήκευση, της προστασίας του φορτωμένου θεραπευτικού/διαγνωστικού παράγοντα, και της ελεγχόμενης και παρατεταμένης αποδέσμευσης [5]. Για την προετοιμασία των νανοσωματιδίων χρησιμοποιούνται βιοδιασπώμενα πολυμερή, ώστε να εξασφαλιστεί η βιολογική συμβατότητα με την ελάχιστη κυταροτοξικότητα. Τα βιοδιασπώμενα πολυμερικά νανοσωματίδια πλεονεκτούν σε σχέση με τα μικύλλια και τα λιποσώματα στην άριστη σταθερότητα τους, κατά την αποθήκευση. Τα Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA), PLA-TPGS και poly(d,l-lactide-co-glycolide) -polyethylene glycol (PLGA-PEG) είναι τα πιο συχνά αναφερόμενα βιοδιασπώμενα πολυμερή, για τις παραπάνω εφαρμογές. Τα PLA και PLGA υδρολύονται εύκολα στα μονομερή τους, γαλακτικό οξύ και 20

21 γλυκολικό οξύ αντίστοιχα, και αποβάλονται από τον ανθρώπινο οργανισμό μέσω των μεταβολικών οδών. 'Οσον αφορά τα συνθετικά αυτά πολυμερή, όπως το συμπολυμερές Ν-(2-υδροξυπροπυλ)-του μεθυλακριλαμιδίου (HPMA), την πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) και το πολυ-l-γλουταμινικό οξύ (PGA), το PGA ήταν το πρώτο βιοαποικοδομήσιμο πολυμερές που χρησιμοποιήθηκε για σύνθεση συμπολυμερών. Το HPMA και το PEG, αποτελούν τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα μη βιοαποδομήσιμα συνθετικά πολυμερή. Τα πολυμερικά νανοσωματίδια λοιπόν, προετοιμάζονται είτε με πολυμερισμό των μονομερών (μέθοδος γαλακτώματος), είτε με διασπορά των πολυμερών (π.χ. μέθοδοι νανοσυγκαταβίθυσης. εξαλάτωσης και εξάτμισης διαλύτη) (Εικ.1.3Β). β) Πολυμερικά μικύλλια Οι χημικές ουσίες οι οποίες έχουν αμφίφιλη συμπεριφορά, όπως τα αμφίφιλα συμπολυμερή (φέρουν στο μόριο υδρόφιλες και υδρόφοβες περιοχές), εγγενώς έχουν την ικανότητα να διαμορφώνουν μικύλλια, σε υδατικά διαλύματα. Τα μικύλλια αυτά δημιουργούνται, καθώς οι υδρόφοβες περιοχές διατάσσονται προς το εσωτερικό, ενώ οι υδρόφιλες προς το εξωτερικό υδατικό περιβάλλον. Τα πολυμερικά μυκύλλια λοιπόν, χρησιμοποιούνται στην στοχευμένη χορήγηση, καθώς το υδρόφοβο εσωτερικό τμήμα έχει την δυνατότητα να συγκρατεί υδρόφοβες δραστικές ουσίες (φάρμακα), οι οποίες είναι ελάχιστα διαλυτές σε υδατικά διαλύματα. Στον υδρόφοβο πυρήνα, λοιπόν, εσωκλείονται τα υδρόφοβα φάρμακα, ενώ η εξωτερική υδρόφιλη περιοχή σταθεροποιεί τον υδρόφοβο πυρήνα και καθιστά το μικύλλιο υδατοδιαλυτό και άρα τα πολυμερικά μικύλλια ικανά για χορήγηση. Το φάρμακο μπορεί να φορτωθεί στα πολυμερικά μικύλλια είτε με φυσική ενκαψακίωση είτε με χημική σύνδεση. Επιπλέον, η ανάπτυξη πολυλειτουργικών πολυμερικών μικυλλίων που περιέχουν απεικονιστικούς και θεραπευτικούς παράγοντες ερευνάται εντατικά σήμερα [6] (Εικ.1.3F). γ) Δενδριμερή Το δενδριμερές είναι ένα συνθετικό πολυμερικό μακρομόριο, που αποτελείται από επαναλαμβανόμενες διακλαδώσεις, και έχει πάρει το όνομα του από την ελληνική λέξη δένδρο. Έχει διαστάσεις μερικών νανομέτρων, και δημιουργείται από μονομερή μεγάλων αλυσίδων που ξεκινούν από έναν κεντρικό πυρήνα. Αντίθετα με τα κλασσικά πολυμερή, τα δενδριμερή έχουν υψηλό βαθμό μοριακής ομοιομορφίας, στενή κατανομή μοριακού βάρους, συγκεκριμένα χαρακτηριστικά σχήματος και αυστηρά καθορισμένο μεγέθος και μια υψηλά- ενεργοποιημένη επιφάνεια. Για αυτούς τους λόγους, την υδατοδιαλυτότητα τους και το γεγονός ότι δημιουργούν μία εσωτερική κοιλότητα στην οποία μπορούν να ενκαψακιωθούν τα μεταφερόμενα φάρμακα, αποτελούν αντικείμενο μελέτης, όσον αφορά την μεταφορά φαρμάκων. Οι εύκολα μεταβλητές ιδιότητες των δενδριμερών επιτρέπουν την άμεση σύζευξη τους με διαφόρων ειδών μόρια, όπως παράγοντες 21

22 απεικόνισης, προσδέτες στόχευσης, καθώς επίσης και θεραπευτικούς παράγοντες (Εικ.1.3D) Νανοσωματίδια λιπιδικής φύσης Τα λιποσώματα είναι μικρά τεχνητά κυστίδια σφαιρικού σχήματος,που μπορούν να δημιουργηθούν από χοληστερόλη και φυσικά, μη τοξικά φωσφολιπίδια. Λόγω του μεγέθους τους και του υδρόφοβου και υδρόφιλου χαρακτήρα τους (μαζί με την βιοσυμβατότητα), τα λιποσώματα είναι πολλά υποσχόμενα συστήματα για την μεταφορά φαρμάκων. Οι ιδιότητες των λιποσωμάτων διαφέρουν αναλόγως με την λιπιδική σύνθεση, το επιφανειακό φορτίο, το μέγεθος και την μέθοδο παρασκευής. Επιπλέον, η επιλογή των συστατικών της διπλοστοιβάδας, καθορίζει την ''ρευστότητα'' και το φορτίο της διπλοστοιβάδας. Τα φωσφολιπίδια αυθόρμητα σχηματίζουν κλειστές δομές, όταν βρεθούν σε υδατικά διαλύματα. Τέτοια κυστίδια, που έχουν μία ή περισσότερες λιπιδικές διπλοστοιβάδες, μπορούν να μεταφέρουν υδατικά ή λιπιδικά φάρμακα, αναλόγως τη φύση τους. Επειδή τα λιπίδια είναι αμφίφιλα ( υδρόφοβα και υδρόφιλα) σε υδατικό μέσο, οι θερμοδυναμικές τους ιδιότητες και τα χαρακτηριστικά της αυτοσυγκρότησης τους, επηρεάζουν την οργάνωση, κυρίως λόγω εντροπίας, των υδρόφοβων τμημάτων σε σφαιρικές διπλοστοιβάδες. Γενικά, τα λιποσώματα ορίζονται ως σφαιρικά κυστίδια, με μεγέθη που κυμαίνονται από 30 nm, έως μερικά μικρόμετρα. Απαρτίζονται, λοιπόν, από μία ή περισσότερες λιπιδικές διπλοστοιβάδες, περιβαλλόμενες από υδατικό περιβάλλον, όπου οι πολικές κεφαλές προσανατολίζονται στο μονοπάτι των εσωτερικών και εξωτερικών υδατικών φάσεων. Όμως ορισμένες φορές δημιουργούνται και μη-συμβατικές διπλοστοιβαδικές δομές, αλλά διάφοροι τύποι κολλοειδών σωματιδίων. [7](Εικ.1.3E) Ιικά νανοσωματίδια Σε μεγάλο αριθμό ιών γίνονται δοκιμές για χρήση σε βιοιατρικές και νανοτεχνολογικές εφαρμογές που περιλαμβάνουν την στόχευση ιστών και τη μεταφορά φαρμάκων. Στα ιικά νανοσωματίδια μπορούν να εγκλειστούν μόρια και πεπτιδία, με χημικά ή γενετικά μέσα. Επιπρόσθετα, διαφόρων ειδών προσδέτες ή αντισώματα, όπως η τρανσφερίνη, το φολικό οξύ και οι μονές αλυσίδες αντισωμάτων μπορούν να συνδεθούν σε ιούς για ειδική στόχευση καρκινικών όγκων in vivo. Επίσης, υπάρχουν ιικά οχήματα με φυσική συγγένεια για υποδοχείς όπως ο υποδοχέας της τρανσφερίνης, ο οποίος υπερεκφράζεται σε πολλούς καρκινικούς όγκους [2]. 22

23 Νανοσωλήνες Άνθρακα Οι νανοσωλήνες Άνθρακα (Carbon nanotubes, CNTs) είναι αλλότροπα του άνθρακα, που παίρνουν την μορφή κυλινδρικών μορίων άνθρακα και έχουν πρωτότυπες ιδιότητες που τους κάνουν πιθανώς χρήσιμους σε ευρεία ποικιλία εφαρμογών στην νανοτεχνολογία. Όντας στην οικογένεια των νανοϋλικών, οι νανοσωλήνες αυτοί, έχουν προκύψει ως ένα νέο εναλλακτικό και αποτελεσματικό υλικό για την μεταφορά και μετάθεση θεραπευτικών μορίων. Συγκεκριμένα, μπορούν να φορτωθούν με βιοενεργά πεπτίδια, πρωτεΐνες, νουκλεϊκά οξέα και φάρμακα, και χρησιμοποιούνται για να μεταφέρουν το φορτίο τους σε κύτταρα και όργανα. Αξίζει να σημειωθεί πως σε κάθε νανοσωλήνα μπορούν να προσδεθούν την ίδια στιγμή πολλαπλά μόρια, γεγονός που αποτελεί πλεονέκτημα για τη θεραπεία του καρκίνου. Οι ενεργοποιημένοι με λειτουργικές ομάδες νανοσωλήνες παρουσιάζουν χαμηλή τοξικότητα και δεν είναι ανοσογονικά, οπότε φαίνεται να έχουν μεγάλες προοπτικές στο πεδίο της νανοτεχνολογίας και νανοϊατρικής [8] (Εικ.3H). Εικόνα 1.3. Ορισμένοι τύποι νανομεταφορέων για στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων (Α: σύζευξη πολυμερούς-φαρμάκου, Β: πολυμερικό νανοσωματίδιο, C: στερεό λιπιδικό νανοσωματίδιο, D: δενδριμερές, Ε: λιπόσωμα, F: πολυμερικό μικύλλιο, G: νανοσωματίδιο χρυσού, H: νανοσωλήνας άνθρακα.) 23

24 1.2. Υβριδικοί νανοφορείς για την διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου Τα τελευταία χρόνια γίνεται μια πολύ σημαντική προσπάθεια να ενσωματωθούν και διαγνωστικές και θεραπευτικές ιδιότητες, σε ένα μόνο σύστημα στο επίπεδο της νανοκλίμακας, με σκοπό φυσικά την αποτελεσματικότερη θεραπεία του καρκίνου. Τα νανοσωματίδια έχουν υψηλές προοπτικές στο να πετύχουν τέτοιες διπλές λειτουργίες, ειδικά αν παραπάνω από ένας τύπος νανοδομής ενσωματωθεί σε μια ευρύτερη ''νανοσυγκρότηση'', την οποία αποκαλούμε υβριδικό νανοφορέα [9]. Οι υβριδικοί νανοφορείς λοιπόν, αποτελούνται από τον συνδυασμό οργανικών και ανόργανων ενώσεων και υλικών, κατάλληλα επιλεγμένων, με σκοπό τον συνδυασμό των ιδιοτήτων των δύο αυτών τύπων υλικών στον ίδιο νανοφορέα. Στην παρούσα εργασία θα ασχοληθούμε με τους πολυλειτουργικούς μαγνητικούς υβριδικούς νανοφορείς, οι οποίοι βασίζονται σε (ανόργανα/οργανικά) μικυλλιακού τύπου σωματίδια, τα οποία χαρακτηρίζονται από: παρατεταμένη παραμονή στη γενική κυκλοφορία μετά από συστηματική (ενδοφλέβια) χορήγηση (long-circulating properties, ''stealth'' properties), ικανότητα αυξημένης εντόπισης (συσσώρευσης) στην περιοχή του όγκου, ικανότητα ''στόχευσης'' του όγκου, λόγω της αυξημένης διαπερατότητας και συγκράτησης (enhanced permeability and retention, EPR) που εμφανίζουν, και αυξημένη ικανότητα εισόδου στα καρκινικά κύτταρα, με τη βοήθεια ειδικών πεπτιδίων (cell penetrating peptides), όπως το HIV πεπτίδιο TAT. Η αυξημένη ικανότητα των μαγνητικών νανοφορέων να σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα, οφείλεται πρωτίστως στην στοχευμένη δράση του αντικαρκινικού φαρμάκου, που αυτοί θα περιέχουν, και στη θερμική καταστροφή (thermo-ablation) των καρκινικών κυττάρων, μέσω της παραγωγής θερμότητας από την αλληλεπίδραση των μαγνητικών νανοσωματιδίων με το εξωτερικό εναλλασσόμενο μαγνητικό πεδίο. 24

25 1.3. Μαγνητικά νανοσωματίδια Τα μαγνητικά νανοσωματίδια είναι καθιερωμένα νανο-υλικά, που προσφέρουν ελεγχόμενο μέγεθος, ικανότητα χειρισμού από εξωτερικό μαγνητικό πεδίο και βελτίωση της αντίθεσης στην διαγνωστική απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (magnetic resonance imaging,mri). Ως αποτέλεσμα, τα συγκεκριμένα νανοσωματίδια, θα μπορούσαν να έχουν άπειρες εφαρμογές στην βιολογία και την ιατρική, συμπεριλαμβανομένων και του καθαρισμού πρωτεϊνών, της χορήγησης φαρμάκων, και της ιατρικής απεικόνισης. Τα μαγνητικά υλικά έχουν χρησιμοποιηθεί σε μεγέθη της νανοκλίμακας για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα από οποιοδήποτε άλλο υλικό. Και αυτό γιατί είναι θεμελιώδεις οι αλλαγές που υπεισέρχονται στην δομή των μαγνητικών υλικών όταν μειώνεται το μέγεθος των κόκκων. Έτσι, σταδιακά μειώνοντας το μέγεθος και ειδικότερα κάτω από το μέγεθος των 100 nm, η φυσιολογική δομή πολλών μαγνητικών περιοχών μετατρέπεται σε δομή μιας μαγνητικής περιοχής [10]. Στην διεθνή βιβλιογραφία διακρίνουμε δύο ειδών μαγνητικά νανοσωματίδια για βιοϊατρικές εφαρμογές: (α) τα σωματίδια πολλών περιοχών στα οποία η παραγωγή θερμότητας οφείλεται στις απώλειες υστέρησης. (β) τα υλικά τα οποία αποτελούνται από σωματίδια μιας περιοχής, και όταν αποκτήσουν πολύ μικρό μέγεθος (10-15 nm) ονομάζονται υπερπαραμαγνητικά (superparamagnetics) και παρουσιάζουν στροφή της μαγνητικής ροπής με μεταβολές της θερμότητας Μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίων σιδήρου Τα επιφανειακώς ενεργοποιημένα μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίων σιδήρου (MNPs), ως πρωτότυπα υλικά, για να έχουν πρακτικές βιοιατρικές εφαρμογές, πρέπει να έχουν τις παρακάτω συνδυαστικές ιδιότητες: α) μαγνητικός κορεσμός β) σταθερότητα γ) βιοσυμβατότητα και δ) επιφανειακές διαδραστικές λειτουργίες. Επιπλέον, η επιφάνεια των νανοσωματιδίων αυτών θα μπορούσε να τροποποιηθεί από οργανικά ή ανόργανα υλικά, όπως πολυμερή, βιομόρια, μέταλλα κλπ. Συγκεκριμένα, και με πλεονέκτημα το γεγονός, ότι τα υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια (SPIONs) παρουσιάζουν μαγνητικές ιδιότητες μόνο με παρουσία εφαρμοζόμενου μαγνητικού πεδίου, χρησιμοποιήθηκαν και στον μαγνητικό διαχωρισμό in vitro και σε in vivo εφαρμογές, όπως η υπερθερμία (Hyperthermia, HT), η μαγνητική στόχευση φαρμάκων (magnetic drug targeting, MDT), η απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού (magnetic resonance imaging, MRI), η μεταφορά γονιδίων (gene delivery, GD) και η νανοίατρική. 25

26 Οι επιτυχημένες εφαρμογές των SPIONs βασίζονται στον ακριβή έλεγχο του σχήματος, του μεγέθους και της κατανομής μεγέθους των σωματιδίων και στις διάφορες συνθετικές οδούς, που έχουν ανακαλυφθεί, για την προετοιμασία των νανοσωματιδίων. Συχνά απαιτούνται ειδικά σχεδιασμένες επιφανειακές ιδιότητες για την κυτταρική στόχευση, παρότι η γενική στρατηγική εμπεριέχει την δημιουργία βιοσυμβατού πολυμερικού ή μη- καλύμματος και ακόλουθη σύζευξη βιοενεργών μορίων [11] (εικ.1.4). Εικόνα 1.4. Βιοϊατρικές εφαρμογές των μαγνητικών νανοσωματιδίων Μαγνητισμός Μαγνητικά φαινόμενα παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά πριν από τουλάχιστον 2500 χρόνια, σε κομμάτια μαγνητισμένου σιδηρομεταλλεύματος που βρίσκονταν κοντά στην πόλη Μαγνησία, της Μικράς Ασίας. Ανακαλύφθηκε πως όταν μια ράβδος σιδήρου αγγίζει ένα φυσικό μαγνήτη, η ράβδος μαγνητίζεται. Όταν μια μαγνητισμένη ράβδος εξαρτάται από το κέντρο της με ένα νήμα, τείνει να προσανατολιστεί στην κατεύθυνση Βορρά-Νότου, όπως η βελόνα μιας πυξίδας. Ο μαγνητισμός είναι ένα φυσικό φαινόμενο, που συνδέεται με την κίνηση των ηλεκτρικών φορτίων. Αυτή η κίνηση μπορεί να λάβει διάφορες μορφές, όπως του ηλεκτρικού ρεύματος μέσα σε έναν αγωγό, ή φορτισμένα μόρια που κινούνται στο χώρο, ή ακόμα η κίνηση ενός ηλεκτρονίου σε μια ατομική τροχιά. Ο μαγνητισμός επίσης σχετίζεται με στοιχειώδη σωματίδια, όπως τα ηλεκτρόνια, που έχουν μια ιδιότητα που ονομάζεται ιδιοπεριστροφή (spin).συγκεκριμένα, κάθε ηλεκτρόνιο έχει δύο μαγνητικές ροπές οφειλόμενες στις δύο περιστροφικές κινήσεις του: γύρω από τον πυρήνα του ατόμου, αλλά και γύρω από τον άξονά του. 26

27 Οι μαγνητικές αλληλεπιδράσεις μπορούν να περιγραφούν, ως εξής: α) Ένα κινούμενο φορτίο ή ένα ηλεκτρικό ρεύμα δημιουργεί ένα μαγνητικό πεδίο στον χώρο (επιπρόσθετα με το ηλεκτρικό του φορτίο). β) Το μαγνητικό πεδίο ασκεί δύναμη, F, πάνω σε κάθε κινούμενο φορτίο ή ηλεκτρικό ρεύμα που βρίσκεται μέσα στο πεδίο. Το μαγνητικό πεδίο είναι ένα διανυσματικό πεδίο, δηλαδή μία διανυσματική ποσότητα, που σχετίζεται με κάθε σημείο του χώρου. Θα χρησιμοποιήσουμε το σύμβολο B για την ένταση του μαγνητικού πεδίου. Τα χαρακτηριστικά της μαγνητικής δύναμης, που ασκείται πάνω σε ένα κινούμενο φορτίο, είναι ότι το μέτρο της είναι ανάλογο του φορτίου, και η δύναμη είναι ανάλογη του μέτρου ή της έντασης του πεδίου. Η μαγνητική δύναμη είναι επίσης ανάλογη του μέτρου της ταχύτητας του σωματιδίου. Όμως η μαγνητική δύναμη F δεν έχει την ίδια κατεύθυνση με το μαγνητικό πεδίο Β, αλλά είναι πάντα κάθετη στο Β όσο και στην ταχύτητα, u. Συγκεκριμένα, η δύναμη που ασκείται πάνω σε φορτίο q, που κινείται με μέση ταχύτητα u, μέσα σε ένα μαγνητικό πεδίο B δίνεται, τόσο σε μέτρο όσο και σε κατέυθυνση από τη σχέση [12]:, επομένως στο σύστημα μονάδων SI, η μονάδα του Β είναι το Tesla. 1 tesla=1 T=1 N/A m Ένα μαγνητικό πεδίο μπορεί να παρασταθεί γραφικά με τις γραμμές μαγνητικού πεδίου. Σε κάθε σημείο μια γραμμή είναι εφαπτόμενη στην κατεύθυνση του B, στο σημείο εκείνο, και ο αριθμός των γραμμών ανά μονάδα επιφάνειας κάθετης στο B, είναι ανάλογος του μέτρου του Β. Η μαγνητική ροή Φ Β μέσα από μία επιφάνεια ορίζεται ως:,και στο σύστημα μονάδων SI, έχει ως μονάδα το Weber. 1 Weber=1 Wb= 1 T m 2, όπου φ: η γωνία μεταξύ της κατεύθυνσης του Β, και της ευθείας που είναι κάθετη στην επιφάνεια στο σημείο εκείνο, και da: ένα στοιχείο επιφάνειας Όσον αφορά τα φαινόμενα της επαγωγής, που μας ενδιαφέρουν, το κοινό χαρακτηριστικό τους είναι η μαγνητική ροή που διαπερνά ένα κύκλωμα. Σύμφωνα με το νόμο του Faraday, η ηλεκτρεγερική δύναμη (ΗΕΔ), που επάγεται σε ένα 27

28 κύκλωμα είναι ανάλογη του ρυθμού μεταβολής της μαγνητικής ροής, που διαπερνά το κύκλωμα. Είναι γνωστό ότι οι μετασχηματιστές, οι κινητήρες, οι γεννήτριες, και οι ηλεκτρομαγνήτες σχεδόν πάντα περιέχουν πηνία με σιδηρένιους πυρήνες, που αυξάνουν το μαγνητικό πεδίο, και το περιορίζουν στις επιθυμητές περιοχές του χώρου. Είναι επομένως σκόπιμο να εξετάσουμε και τις μαγνητικές ιδιότητες των υλικών, αυτών καθ'εαυτών. Τα άτομα από τα οποία αποτελείται η ύλη περιέχουν κινούμενα ηλεκτρόνια, τα οποία αντιστοιχούν σε μικροσκοπικούς βρόχους ρευμάτων οι οποίοι δημιουργούν το δικό τους πεδίο ο καθένας. Σε πολλά υλικά αυτά τα ρεύματα είναι προσανατολισμένα κατά τυχαίο τρόπο, οπότε η συνισταμένη όλων των επιμέρους μαγνητικών πεδίων είναι μηδέν. Σε ορισμένα όμως υλικά, ένα εξωτερικό πεδίο μπορεί να εξαναγκάσει τους μικροσκοπικούς βρόχους να προσανατολιστούν κατά τέτοιο τρόπο ως προς το πεδίο, ώστε το αντίστοιχο μαγνητικό τους πεδίο να ''προστίθεται'' στο εξωτερικό τους πεδίο [13] Είδη μαγνητισμού α) Παραμαγνητισμός Σε ένα άτομο, οι περισσότερες από τις διάφορες μαγνητικές ροπές λόγω περιφοράς ή σπιν των ηλεκτρονίων του έχουν συνισταμένη μηδέν. Σε μερικές περιπτώσεις όμως, το άτομο διαθέτει συνισταμένη μαγνητική ροπή της τάξης του μ Β. Όταν ένα τέτοιο υλικό τεθεί μέσα σε μαγνητικό πεδίο, σε κάθε μαγνητική ροπή ασκείται από το πεδίο μια επίσης μαγνητική ροπή που είναι ίση με τ=μ x B [14]. Οι ροπές αυτές τείνουν να ευθυγραμμίσουν τις μαγνητικές ροπές με το πεδίο, ώστε να ελαχιστοποιείται η δυναμική τους ενέργεια. Στη θέση αυτή ο προσανατολισμός των μικροσκοπικών βρόχων ρεύματος είναι τέτοιος, ώστε το δημιουργούμενο από αυτούς πεδίο να επιπροστίθεται στο εξωτερικά εφαρμοζόμενο μαγνητικό πεδίο. Το πρόσθετο πεδίο Β, που δημιουργείται από αυτούς τους μικροσκοπικούς βρόχους ρεύματος, προκύπτει ότι είναι ανάλογο της ολικής μαγνητικής ροπής μ tot ανά μονάδα όγκου V στο υλικό. Τη διανυσματική αυτή ποσότητα ονομάζουμε μαγνήτιση του υλικού και την συμβολίζουμε με M. Το επιπλέον μαγνητικό πεδίο που προκαλείται από τη μαγνήτιση του υλικού αποδεικνύεται ότι είναι ίσο με μ 0 Μ, όπου μ 0 σταθερά από νόμο Biot-Savart [15]. Στην τάση των μαγνητικών ροπών να προσανατολίζονται προς το μαγνητικό πεδίο (όπου η δυναμική τους ενέργεια ελαχιστοποιείται) αντιτίθεται η τυχαία θερμική κίνηση, που τείνει να κατανέμει τους προσανατολισμούς τους κατά τυχαίο τρόπο. Η μαγνητική επιδεκτικότητα ελαττώνεται με αύξηση της θερμοκρασίας. Σε 28

29 πολλές περιπτώσεις είναι αντιστρόφως ανάλογη της απόλυτης θερμοκρασίας Τ, και η μαγνήτιση Μ, μπορεί να γραφτεί με την παρακάτω μορφή, η οποία είναι γνωστή ως Νόμος του Curie, με το C ως σταθερά, που διαφέρει από υλικό σε υλικό : β) Διαμαγνητισμός Σε κάποια υλικά η ολική μαγνητική ροπή κάθε ατόμου, που προκαλείται από τους ατομικούς βρόχους ρεύματος, είναι μηδέν εφόσον δεν υπάρχουν εξωτερικά μαγνητικά πεδία. Ακόμα και αυτά τα υλικά όμως εμφανίζουν μαγνητικές ιδιότητες, γιατί ένα εξωτερικό μαγνητικό πεδίο μπορεί να τροποποιήσει την κίνηση των ηλεκτρονίων μέσα στα άτομα, οπότε δημιουργούνται πρόσθετοι βρόχοι ρεύματος και επαγόμενες μαγνητικές ροπές, σε πλήρη αντιστοιχία με τα επαγόμενα ηλεκτρικά δίπολα. Στην περίπτωση αυτή, το πρόσθετο πεδίο αυτών των βρόχων ρεύματος έχει πάντοτε κατεύθυνση αντίθετη από εκείνη του εξωτερικού πεδίου. Τέτοια υλικά ονομάζονται διαμαγνητικά, και η σχετική τους διαπερατότητα ελαφρώς μικρότερη της μονάδας. γ) Σιδηρομαγνητισμός Υπάρχει μια τρίτη κατηγορία υλικών, που ονομάζονται σιδηρομαγνητικά. Σε αυτά τα υλικά, οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ατομικών μαγνητικών ροπών είναι τόσο ισχυρές, ώστε μπορούν να ευθυγραμμίζονται μεταξύ τους σε τοπικές ενότητες, που ονομάζονται μαγνητικές περιοχές, ακόμα και χωρίς την παρουσία εξωτερικών πεδίων. Χωρίς κανένα εξωτερικό πεδίο, οι μαγνητίσεις των περιοχών έχουν τυχαίο προσανατολισμό. Όταν εφαρμόζεται κάποιο πεδίο τείνουν να προσανατολιστούν παράλληλα με αυτό. Επίσης, τα όρια μεταξύ μαγνητικών περιοχών μετακινούνται, δηλαδή οι περιοχές εκείνες, που η μαγνήτιση τους συμβαίνει να είναι παράλληλη στο πεδίο, μεγαλώνουν, ενώ οι υπόλοιπες συρρικνώνονται. Επειδή η ολική μαγνητική ροπή μιας περιοχής μπορεί να είναι πολλές χιλιάδες μαγνητόνες του Bohr, οι ροπές στρέψης που τείνουν να τις ευθυγραμμίσουν είναι πολύ ισχυρότερες από ότι στα παραμαγνητικά υλικά. Η σχετική διαπερατότητα είναι κατά πολύ μεγαλύτερη της μονάδας, συνήθως της τάξης του 1000 ως Ο σίδηρος, το κοβάλτιο, το νικέλιο και πολλά από τα κράματα τους είναι σιδηρομαγνητικά. Καθώς αυξάνει το εξωτερικό πεδίο, τα σιδηρομαγνητικά υλικά φτάνουν κάποτε στο σημείο που όλες σχεδόν οι μαγνητικές ροπές είναι προσανατολισμένες παράλληλα με αυτό, οπότε και έχουμε μαγνήτιση κόρου. Όσο το σύστημα βρίσκεται σε κόρο κάθε παραπάνω αύξηση του μαγνητικού πεδίου δεν επιφέρει καμμία αύξηση στη μαγνήτιση ή στο πρόσθετο πεδίο που αυτή 29

30 δημιουργεί. Καθώς προσεγγίζεται ο κόρος, η μαγνήτιση Μ παύει να είναι ανάλογη του εξωτερικού πεδίου Β 0. Σε πολλά σιδηρομαγνητικά υλικά η σχέση ανάμεσα στη μαγνήτιση και το εξωτερικό πεδίο είναι διαφορετική όταν αυξάνει το πεδίο, από εκείνη όταν ελαττώνεται. Αν, με το υλικό σε κατάσταση κόρου, το εξωτερικό πεδίο μηδενιστεί, η μαγνήτιση του δεν μηδενίζεται. Τέτοια ακριβώς συμπεριφορά χαρακτηρίζει τους μόνιμους μαγνήτες, οι οποίοι διατηρούν σχεδόν όλη τους τη μαγνήτιση κόρου όταν μηδενιστεί το πεδίο που τους μαγνήτισε. Για να απαλλαγεί το υλικό από τη μαγνήτιση αυτή θα πρέπει να του εφαρμοστεί ένα μαγνητικό πεδίο προς την αντίθετη κατεύθυνση. Η παραπάνω συμπεριφορά ονομάζεται υστέρηση, και οι αντίστοιχες καμπύλες, βρόχοι υστέρησης. Τόσο η διαδικασία για τη μαγνήτιση, όσο και εκείνη για την απομαγνήτιση υλικού που παρουσιάζει υστέρηση, συνεπάγονται κατανάλωση ενέργειας με αποτέλεσμα και στις δύο περιπτώσεις να αυξάνει η θερμοκρασία του. Τα κυριότερα σιδηρομαγνητικά υλικά είναι οι φερρίτες οι οποίοι είναι μικτά οξείδια του σιδήρου με άλλα μέταλλα, και τα μαγνητικά πεδία που παράγονται σε αυτούς είναι αρκετά ισχυρά οπότε και χρησιμοποιούνται σε διάφορες εφαρμογές. δ)υπερπαραμαγνητισμός Ο υπερπαραμαγνητισμός (Superparamagnetism, SPM) είναι ένας τύπος μαγνητισμού, τον οποίο αποκτούν όλα τα πολύ μικρά σιδηρομαγνητικά ή σιδηριμαγνητικά νανοσωματίδια. Αυτό υπονοεί μεγέθη από λίγα μέχρι κάποιες δεκάδες νανόμετρα, αναλόγως το υλικό. Με μια απλή προσέγγιση, η ολική μαγνητική ροπή του νανοσωματιδίου, μπορεί να θεωρηθεί σαν μια γιγάντια μαγνητική ροπή, συνισταμένη όλων των μεμονομένων μαγνητικών ροπών των ατόμων των νανοσωματιδίων. Για το λόγο αυτό ο συγκεκριμένος μαγνητισμός έχει αυτό το όνομα, μοιάζει με τον παραμαγνητισμό αλλά με αρκετά μεγαλύτερες μαγνητικές ροπές (Εικ.1.5). 30

31 Εικόνα 1.5. Διαφορές στην μαγνήτιση σιδηρομαγνητικών σωματιδίων, και υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων Οξείδια του σιδήρου α) Μαγνητίτης Ο Μαγνητίτης (Fe 3 O 4 ) είναι ένα μεταλλικό οξείδιο του σιδήρου (όπως π.χ. και ο αιματίτης). Είναι ένας φυσικός μαγνήτης, εξού και το όνομα, και ανήκει στην κατηγορία των κεραμικών οξειδίων, που ονομάζονται φερρίτες, και εμφανίζει τις ισχυρότερες μαγνητικές ιδιότητες από όλα τα οξείδια του σιδήρου. Τα μέταλλα αυτής της κατηγορίας σχηματίζουν σιδηρόμαυρα προς μαύρα, μεταλλικά, υπόσκληρα οκτάεδρα σε μάζες πυριγενών και μεταμορφωμένων πετρωμάτων, και σε πηγματίτες γρανίτη, πετρώδεις μετεωρίτες, και υψηλής θερμοκρασίας φλέβες σουλφιδίου. Ο Μαγνητίτης, ο οποίος συχνότατα έχει ξεκάθαρους βόρειους και νότιους πόλους, είναι γνωστός για αυτή του την ιδιότητα από το 500 π.χ Η σημαντικότερη ιδιότητα του μαγνητίτη είναι ότι διαθέτει ιόντα σιδήρου σε δισθενή και τρισθενή οξειδωτική βαθμίδα με αποτέλεσμα να μπορεί να λειτουργήσει και ως οξειδωτικό και ως αναγωγικό μέσο. Το ορυκτό αυτό είναι μέλος της ομάδας των σπινελίων ΑΒ 2 Ο 4 ( Α= δισθενές άτομο και Β= τρισθενές άτομο) και περιέχει περίπου 72,4% σίδηρο (Fe) και 27,6% οξυγόνο (O 2 ) [16]. 31

32 β) Μαγκεμίτης Ο μαγκεμίτης (γ-fe 2 O 3 ), ως μεταλλικό οξείδιο του σιδήρου και αυτός, έχει σύνθεση κοντινή σε αυτή του φερρίτη (Fe 2 O 3 ) και παρουσιάζει ισχυρή μαγνήτιση και υστέρηση. Η δομή του είναι ισομετρική, με μορφή ελλιπούς σπινελίου, και σχετικά ελλιπής σιδήρου. Συγκεκριμένα μόνο τα 5/6 των συνολικών τετραεδρικών και οκταεδρικών θέσεων καταλαμβάνονται από άτομα σιδήρου. Ο μαγκεμίτης μετασχηματίζεται σε αιματίτη και σχηματίζει ένα συνεχώς μετασταθές στερεό διάλυμα με μαγνετίτη. Ο φυσικός μαγκεμίτης δημιουργείται από την οξείδωση του μαγνητίτη, με αρκετά περίπλοκο μηχανισμό, ενώ ο συνθετικός παράγεται αφυδατώνοτας λεπιδοκροκίτη ή οξειδωτικό μαγνητίτη σε χαμηλή θερμοκρασία. H βασική διαφορά του με τον μαγνητίτη είναι ότι όλα τα κατιόντα σιδήρου του μαγκεμίτη βρίσκονται στην τρισθενή κατάσταση (Fe +3 ) [16] Σύνθεση υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων Την τελευταία δεκαετία η σύνθεση υπερπαραμαγνητικών νανοσωματιδίων έχει μελετηθεί εντατικά, και μέχρι σήμερα έχουν αναπτυχθεί διάφορες μέθοδοι φυσικές και χημικές για τη σύνθεση μαγνητικών νανοσωματιδίων με ελεγχόμενη σύσταση, μέγεθος και σχήμα. Στις φυσικές μεθόδους περιλαμβάνονται η φυσική εναπόθεση ατμών, η λιθογραφία ηλεκτρονικής δέσμης και η εναπόθεση με ιοντοβολή/sputtering, ενώ στις χημικές, η τεχνική sol-gel, η συγκαταβύθιση, τα μικρο- νανο-γαλακτώματα, η μέθοδος της πολυόλης και η μέθοδος της θερμόλυσης. Στα βασικά πλεονεκτήματα των χημικών μεθόδων σε διαλύματα περιλαμβάνονται η απλότητα, η ικανότητα ελέγχου του μεγέθους, του σχήματος, και η μεγάλη ποικιλία επιφανειακής τροποποίησης, που πραγματοποιείται ρυθμίζοντας κάποιες κινητικές παραμέτρους, όπως είναι για παράδειγμα το ph, η θερμοκρασία αντίδρασης, ο ρυθμός ανάδευσης και η συγκέντρωση των πρόδρομων ενώσεων. Καθοριστικό ρόλο στη χημική σύνθεση των σωματιδίων παίζει και η παρουσία επιφανειοδραστικών ενώσεων [17-21]. Θερμολυτική μέθοδος Στην παρούσα εργασία τα οργανόφιλα κολλοειδή μαγνητικά νανοσωματίδια (ΜΝΣ) παρασκευάζονται μέσω της θερμολυτικής οδού, η οποία βασίζεται στη θερμική αποικοδόμηση οργανομεταλλικών ενώσεων του σιδήρου σε οργανικούς διαλύτες υψηλού σημείου ζέσεως ( ο C). Τα νανοσωματίδια που λαμβάνονται με αυτή την μέθοδο είναι συνήθως μεγέθους 4 nm έως 20 nm. Η διάσπαση οργανομεταλλικών συμπλόκων σιδήρου παρουσία επιφανειοδραστικών μορίων, χρησιμοποιώντας οργανικούς διαλύτες με υψηλές θερμοκρασίες βρασμού, έχει σαν αποτέλεσμα την παραγωγή μαγνητικών νανοσωματιδίων με πολύ καλό έλεγχο μεγέθους και πολύ μικρή διασπορά. Τα 32

33 δομικά χαρακτηριστικά των προϊόντων εξαρτώνται από παράγοντες, όπως η θερμοκρασία σύνθεσης και ο ρυθμός αύξησής της, η συγκέντρωση των αντιδραστηρίων, η φύση του διαλύτη και των προδρόμων μεταλλικών ενώσεων, ακόμη και της ταχύτητας με την οποία προστίθενται τα αντιδραστήρια [18-20] Υπερθερμία Τα μαγνητικά νανοσωματίδια προσφέρουν ορισμένες ελκυστικές πιθανότητες στην βιοιατρική, όπως προαναφέραμε, καθώς διαθέτουν συνδυασμό χρήσιμων ιδοτήτων. Υπακούουν στο νόμο του Coulomb, και μπορούν να καθοδηγηθούν από ένα εξωτερικό μαγνητικό πεδίο. Αυτή η ''εξ αποστάσεως δράση'', συνδυασμένη με την εγγενή διαπερατότητα των μαγνητικών πεδίων στους ανθρώπινους ιστούς ανοίγει τον δρόμο για πολλές εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένων την μεταφορά ή/και την ακινητοποίηση των μαγνητικών νανοσωματιδίων. Τα μαγνητικά νανοσωματίδια μπορούν, επίσης, να ανταποκρίνονται συντονισμένα σε ένα χρόνομεταβαλλόμενο μαγνητικό πεδίο, με τα πλεονεκτικά αποτελέσματα, που σχετίζονται με την μεταφορά της ενέργειας από το εκπέμπον μαγνητικό πεδίο στο νανοσωματίδιο. Για παράδειγμα, το σωματίδιο μπορεί να θερμανθεί, το οποίο οδηγεί στην χρήση του για τοπική υπερθερμία, παραδίδοντας τοξικά ποσά θερμικής ενέργειας σε στοχευμένα σώματα, όπως οι όγκοι [10]. Η πιθανότητα να θεραπεύσουμε τον καρκίνο μέσω τεχνητά προκαλούμενης υπερθερμίας, έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη πολλών διαφορετικών συσκευών, σχεδιασμένες έτσι ώστε να θερμαίνουν κακοήθη κύτταρα, ενώ διαφυλάσσουν τον περιβάλλον υγιή ιστό. Πειραματικές έρευνες πάνω στην εφαρμογή των μαγνητικών υλικών για υπερθερμία, χρονολογούνται πίσω στο 1957 όταν οι Gilchrist κ.α. [22], θέρμαναν διάφορα δείγματα ιστών με σωματίδια γ -Fe 2 O 3 μεγέθους nm, εκτεθειμένα σε μαγνητικό πεδίο 1.2 MHz. Από τότε έχουν υπάρξει πάρα πολλές δημοσιεύσεις, που περιγράφουν μια ποικιλία συνδυασμών, κάνοντας χρήση διαφορετικών τύπων μαγνητικών υλικών, διαφορετικές εντάσεις και συχνότητες πεδίου και διαφορετικές μεθόδους ενκαψακίωσης και μεταφοράς των σωματιδίων. Σε ευρείς όρους, η διαδικασία εμπεριέχει την διασπορά μαγνητικών σωματιδίων διαμέσου του ιστού-στόχου, και στην πορεία την εφαρμογή εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου επαρκούς έντασης και συχνότητας, ώστε να προκληθεί θέρμανση των σωματιδίων. Αυτή η θέρμανση του άμεσα περιβαλλόμενου ασθενή ιστού, αν η θερμοκρασία μπορέσει να διατηρηθεί πάνω από το θεραπευτικό όριο των 42 C για 30 λεπτά ή περισσότερο, μπορεί να προκαλέσει την εξουδετέρωση του καρκίνου. Ενώ η πλειοψηφία των συσκευών υπερθερμίας είναι περιορισμένης ωφέλειας λόγω της συγκυριακής θέρμανσης και των υγιών ιστών, η υπερθερμία μέσω μαγνητικών νανοσωματιδίων είναι ελκυστική, επειδή προσφέρει έναν τρόπο ώστε να σιγουρευτεί το ότι μόνο ο επιδιωκόμενος ιστός-στόχος θα θερμανθεί. 33

34 Η πρόκληση όμως βρίσκεται, στο να γίνει εφικτή η μεταφορά επαρκούς ποσότητας των μαγνητικών σωματιδίων, για να δημιουργηθεί μεγάλη θερμοκρασία στον ιστό, χρησιμοποιώντας ιδιότητες εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου, που να είναι κλινικά αποδεκτές. Όσον αφορά την επιλογή μαγνητικών σωματιδιών, ο μαγνητίτης (Fe 3 O 4 ) και ο μαγκεμίτης (γ-fe 2 O 3 ), που προαναφέραμε, είναι τα πιο μελετημένα έως σήμερα, λόγω των γενικά κατάλληλων μαγνητικών ιδιοτήτων και βίο-συμβατότητας, ενώ πολλά άλλα έχουν επίσης ερευνηθεί. Για την αποτελεσματική μεταφορά στην περιοχή του καρκίνου, πραγματοποιείται ενκαψακίωση σε ένα μεγαλύτερο συγκρότημα ή αιώρημα σε ένα τύπο υγρού φορέα. Τα νανοσωματίδια μπορούν να συνδεθούν με αντισώματα, για να διευκολυνθεί η στόχευση σε συγκεκριμένο τύπο κυττάρων. Τα υποψήφια υλικά για αυτές τις εφαρμογές χωρίζονται σε δύο βασικές κατηγορίες: σιδηρομαγνητικά ή σιδηριμαγνητικά (FM) μονού ή πολλαπλού τομέα σωματίδια, και η παραγωγή θερμότητας που συνδέεται με την κάθε κατηγορία είναι διαφορετική, προσφέροντας συγκεκριμένα πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. 34

35 1.4. Σύνθεση πολυμερικών νανοσωματιδίων Όπως προαναφέραμε, έχει αποδειχθεί ότι τα συζεύγματα πολυμερούς-φαρμάκου μπορούν να βελτιώσουν ουσιαστικά την παραμονή στο αίμα και να αποδυναμώσουν τις παρενέργειες. Είναι προσδοκώμενη λοιπόν, η προσέγγιση ιστών στοχεύοντας τους όπως και η μεταφορά ενός πιο ουσιαστικού ωφέλιμου φορτίου φαρμάκου, μέσω τεχνικά τροποποιημένων πολυλειτουργικών νανοσωματιδίων Μέθοδοι παρασκευής πολυμερικών νανοσωματιδίων/ νανοκαψακίων Πολλές μέθοδοι παρασκευής νανοσωματιδίων περιλαμβάνουν δύο βασικά βήματα. Η παρασκευή ενός γαλακτωματοποιημένου συστήματος αποτελεί το πρώτο βήμα, ενώ τα νανοσωματίδια σχηματίζονται κατά το δεύτερο βήμα της διαδικασίας. Ο σχηματισμός των νανοσωματιδίων επιτυγχάνεται είτε μέσω νανοκαταβύθισης, είτε μέσω ζελατινοποίησης του πολυμερούς, είτε μέσω πολυμερισμού των μονομερών του. Η γενική αρχή του βήματος αυτού δίνει και το όνομα της μεθόδου. Σε κάποιες περιπτώσεις, τα νανοσωματίδια σχηματίζονται τη στιγμή που ξεκινά η γαλακτωματοποίηση του συστήματος. Τα καταλληλότερα συστήματα γαλακτωματοποίησης περιλαμβάνουν γαλακτώματα, μινι γαλακτώματα, νανο γαλακτώματα και μίκρο γαλακτώματα [23]. Κάποιες άλλες μέθοδοι δεν απαιτούν το σχηματισμό γαλακτώματος για την παρασκευή νανοσωματιδίων [24]. Οι μέθοδοι αυτές βασίζονται είτε στην καταβύθιση του πολυμερούς κάτω από συνθήκες που επιτρέπουν την άμεση κατανομή του, ή στον αυτόματο σχηματισμό μακρομορίων και τον σχηματισμό πολυηλεκτρολυτικών δομών από το πολυμερικό διάλυμα [25]. Όμως, επειδή στην παρούσα εργασία μας ενδιαφέρει περισσότερο η σύνθεση νανοκαψακίων, γενικά υπάρχουν οι έξι παρακάτω κλασσικές μέθοδοι για την προετοιμασία τους: νανοσυγκαταβίθηση (nanoprecipitation) (α), γαλακτώματοποίηση και διάχυση του διαλύτη (emulsion diffusion) (β), διπλή γαλακτωματοποίηση (double emulsification) (γ), γαλακτωματοποίησηςσυνάθροισης (emulsion-coacervation) (δ), επικάλυψης με πολυμερές (polymercoating) (ε), και στοιβαδωτής επικάλυψης (layer-by-layer) (στ). Εν τούτοις, κι άλλες μέθοδοι έχουν χρησιμοποιηθεί, όπως η εξάτμιση γαλακτώματος, και οι μεθοδολογίες που ακολουθούνται για την προετοιμασία των πολυμερικών λιποσωμάτων. Τυπικά, οι διαδικασίες για την παραγωγή των λιποσωμάτων αυτών, μπορούν να ταξινομηθούν σε αυτές, της απομάκρυνσης του διαλύτη και σε αυτές της εκτόπισης του. Στις πρώτες, το ξηρό αμφίφιλο πολυμερές έρχεται σε επαφή με το υδατικό μέσο και τότε ενυδατώνεται για να δημιουργηθούν κυστίδια. Στις 35

36 δεύτερες, το συμπολυμερές διαλύεται σε οργανικούς διαλύτες, προστίθεται νερό και στη συνέχεια ο οργανικός διαλύτης απομακρύνεται. Με στόχο να επιτευχθούν στενές κατανομές μεγέθους στα πολυμερικά κυστίδια, το αποκτηθέν εναιώρημα μπορούμε να το υποβάλλουμε σε υπερήχους, σε δίνη (vortex), εξώθηση ή σε κύκλους ψύξης-απόψυξης, ή συνδυασμό αυτών των τεχνικών [26]. Όσον αφορά την ενκαψακίωση των ενεργών ουσιών στα κυστίδια, χρησιμοποιούνται τεχνικές επώασης. Η υδρόφιλη ή λιπόφιλη φύση του ενεργού μορίου καθορίζει την επιλογή της φύσης του πυρήνα, η οποία με τη σειρά της καθορίζεται από το συμπολυμερές που έχει επιλεχτεί και της τεχνικής της ''συναρμολόγησης''. Στην πορεία ακολουθεί μια γενική ανασκόπηση, των μεθοδολογιών, των πρώτων υλών, και των βασικών αρχών μηχανικής από κάθε κλασσική μέθοδο για την προετοιμασία των νανοκαψακίων. α) Μέθοδος νανοσυγκαταβίθησης (Nanoprecipitation method) Η μέθοδος νανοσυγκαταβίθησης αλλιώς αποκαλείται μέθοδος απομάκρυνσης διαλύτη ή διεπιφανειακής εναπόθεσης. Η σύνθεση νανοκαψακίων χρειάζεται και φάσεις διαλύτη και φάσεις μη-διαλύτη (solvent and non-solvent phases) [27]. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι φάσεις διαλύτη και μη- καλούνται οργανικές και υδατικές φάσεις, αντίστοιχα, επειδή συνήθως ως διαλύτης χρησιμοποιείται ένα οργανικό μέσο, ενώ ο μη-διαλύτης είναι κυρίως νερό. 'Όμως είναι πιθανό να χρησιμοποιηθούν είτε δύο οργανικές φάσεις, είτε δύο υδατικές, αρκεί να είναι ικανοποιητικές οι συνθήκες διαλυτότητας και αναμιξιμότητας. Όσον αφορά τις πρώτες ύλες, παρότι στη θεωρία μπορεί να χρησιμοποιηθεί ποικιλία υλών [28], στην πράξη έχει γίνει έρευνα για πολύ μικρό αριθμό τους. Στη μέθοδο της νανοσυγκαταβίθησης, τα νανοκαψάκια λαμβάνονται ως κολλοειδές αιώρημα, που σχηματίζεται, όταν η οργανική φάση προστίθεται αργά και με μέτρια ανάδευση στην υδατική φάση (Eικ. 1.6). Εικόνα 1.6. Σύστημα για την παρασκευή νανοκαψακίων μέσω νανοσυγκαταβίθησης. Οι βασικές μεταβλητές της διαδικασίας είναι αυτές που συνδέονται με τις συνθήκες, με τις οποίες προστίθεται η οργανική φάση στην υδατική, όπως ο ρυθμός προσθήκης της οργανικής φάσης, ο ρυθμός της αναδιάταξης της υδατικής φάσης, η μέθοδος της προσθήκης της οργανικής φάσης και η αναλογία 36

37 οργανικής/υδατικής φάσης. Επίσης, τα χαρακτηριστικά των νανοκαψακίων επηρεάζονται από τη φύση και την συγκέντρωση των συστατικών τους. Η διαδικασία του σχηματισμού των σωματιδίων στην νανοσυγκαταβίθηση αποτελείται από τρία στάδια: τον σχηματισμό πυρήνων, την ανάπτυξη, και την συνάθροιση. Ο ρυθμός του κάθε βήματος καθορίζει το μέγεθος των σωματιδίων και η κινητήρια δύναμη αυτού του φαινομένου είναι ο υπερκορεσμός, που προσδιορίζεται ως η αναλογία της συγκέντρωσης του πολυμερούς, πάνω από τη διαλυτότητα του πολυμερούς, στο μίγμα των διαλυτών. Ο διαχωρισμός του πρώτου και του δεύτερου σταδίου είναι ο παράγοντας-κλειδί, για τον σχηματισμό ομοιόμορφων σωματιδίων. Ιδανικά, απαιτείται υψηλός ρυθμός σχηματισμού πηρύνων, εξαρτώμενος από τον υπερκορεσμό, και χαμηλός ρυθμός ανάπτυξης. Από την άλλη, ένα υγρό με υψηλή επιφανειακή τάση (υδατική φάση), έλκεται πιο έντονα από τον περιβάλλον υγρό, σε σχέση με ένα με χαμηλή επιφανειακή τάση (διαλύτης οργανικής φάσης). Αυτή η διαφορά μεταξύ των επιφανειακών τάσεων, προκαλεί διεπιφανειακή ανατάραξη και θερμικές ανισότητες στο σύστημα, που οδηγούν σε συνεχή σχηματισμό δινών διαλύτη στην διεπιφάνεια των 2 υγρών. Συνεπώς, η βίαιη επέκταση παρατηρείται εξαιτίας της αμοιβαίας αναμιξιμότητας των διαλυτών, και οι διαλύτες ρέουν μακριά από περιοχές με χαμηλή επιφανειακή τάση και το πολυμερές τείνει να συσσωματώνεται στην ελαιώδη επιφάνεια και να δημιουργεί νανοκαψάκια. Σύμφωνα με αυτή την εξήγηση, ο σχηματισμός των καψακίων συμβαίνει λόγω της συσσωμάτωσης των πολυμερών σε σταθεροποιημένα σταγονίδια γαλακτώματος, ενώ προφανώς τα στάδια του σχηματισμού πυρήνων και της ανάπτυξης δεν περιλαμβάνονται. β) Μέθοδος γαλακτωματοποίησης και διάχυσης του διαλύτη (Emulsion diffusion method) Βάση μελετών, η μέθοδος αυτή επιτρέπει την ενκαψακίωση τόσο λιπόφιλων όσο και υδρόφιλων δραστικών ουσιών [29,30]. Η πειραματική διαδικασία που ακολουθείται για το επιθυμητό αποτέλεσμα αποτελείται από 3 φάσεις: την οργανική, την υδατική, και του διαλύματος. Όταν το αντικείμενο είναι η ενκαψακίωση μίας λιπόφιλης ενεργής ουσίας, η οργανική φάση περιλαμβάνει το πολυμερές, την ενεργή ουσία, το έλαιο και έναν οργανικό διαλύτη, μερικώς αναμίξιμο με το νερό, που πρέπει να είναι υδατικά κορεσμένος. Αυτό το οργανικό μέσο λειτουργεί ως διαλύτης για τα διαφορετικά συστατικά της οργανικής φάσης. Αν απαιτείται, η οργανική φάση μπορεί επίσης να περιλαμβάνει και ένα διαλύτη της ενεργής ουσίας ή του ελαίου. Η υδατική φάση συμπεριλαμβάνει το υδατικό διάλυμα του σταθεροποιητικού παράγοντα που προετοιμάζεται χρησιμοποιώντας νερό κορεσμένο με διαλύτη, ενώ η φάση του διαλύματος είναι συνήθως υδατική (νερό). Η εσωτερική φάση περιέχει το έλαιο σε συνδυασμό με την ενεργή ουσία και τον διαλύτη (π.χ. οξικό αιθυλεστέρα, βενζυλική αλκοόλη, διχλωρομεθάνιο). Όσον αφορά την εξωτερική φάση όμως, ο διαλύτης που χρησιμοποιείται είναι το νερό και η πολυ-βινυλ-αλκοόλη (PVA) προτιμάται ως σταθεροποιητικός 37

38 παράγοντας. Η φάση του διαλύματος είναι συχνά το νερό, αν και με σκοπό να αποκτήσουμε καλύτερη νανοδιασπορά, μπορεί να χρησιμοποιηθούν και σταθεροποιητικοί παράγοντες σε αραιωμένα διαλύματα. Για την προετοιμασία νανοκαψακίων χρησιμοποιώντας την παραπάνω μέθοδο, η οργανική φάση γαλακτωματοποιείται με έντονη ανατάραξη με την υδατική φάση (Εικ.1.7). Εικόνα 1.7. Σύστημα, για την παρασκευή νανοκαψακίων μέσω της μεθόδου γαλακτωματοποίησης και διάχυσης του διαλύτη. Η μεταγενέστερη προσθήκη νερού στο σύστημα προκαλεί την διάχυση του οργανικού διαλύτη του πολυμερούς στην εξωτερική φάση, που έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό των νανοκαψακίων. Έχει αποδειχθεί ότι το μέγεθος των νανοκαψακίων σχετίζεται με τον ρυθμό διάτμησης που χρησιμοποιείται στην διαδικασία της γαλακτωματοποίησης, την χημική σύνθεση της οργανικής φάσης, την συγκέντρωση του πολυμερούς, την αναλογία ελαίου-πολυμερούς και το μέγεθος της σταγόνας του πρωταρχικού γαλακτώματος [31,32]. Ο σχηματισμός των νανοκαψακίων λοιπόν, είναι μια δυναμική διαδικασία που σχετίζεται με την διάχυση του διαλύτη από την σταγόνα στην εξωτερική φάση, που προκαλείται από την προσθήκη νερού στο διάλυμα και έχει ως αποτέλεσμα τον μετασχηματισμό κάθε σταγόνας σε σωματίδιο μικρότερου μεγέθους. γ) Μέθοδος διπλού γαλακτώματος (Double emulsification method) Τα διπλά γαλακτώματα είναι περίπλοκα συστήματα ετεροδιασποράς, που καλούνται ''γαλακτώματα γαλακτωμάτων'', που μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο κύριες κατηγορίες: νερού-ελαίου-νερού (water-oil-water emulsion (w/o/w) ) και ελαίου-νερού-ελαίου (oil-water-oil emulsion(o/w/o)) [33,34]. Έτσι, η φάση της 38

39 διασποράς είναι η ίδια ένα γαλάκτωμα, και η εσωτερικά διασπαρμένη σταγόνα διαχωρίζεται από την εξωτερική υγρή φάση, από ένα στρώμα άλλης φάσης. Τα διπλά γαλακτώματα παράγονται συνήθως από μια διαδικασία γαλακτωματοποίησης δύο βημάτων με την χρήση δύο επιφανειοδραστικών, ενός υδρόφοβου σχεδιασμένου ώστε να σταθεροποιεί την διεπιφάνεια του w/o εσωτερικού γαλακτώματος, και ενός υδρόφιλου, που σταθεροποιεί την εξωτερική φάση των ελαιωδών σφαιριδίων για τα w/o/w γαλακτώματα. Στο πρωταρχικό w/o γαλάκτωμα, το έλαιο αντικαθιστάται από μια οργανική φάση, που περιέχει έναν διαλύτη, που είναι εξ ολοκλήρου ή μερικώς αναμίξιμος με το νερό, το πολυμερές και το w/o επιφανειοδραστικό. Στη συνέχεια το πρώτο γαλάκτωμα προστίθεται υπό ανάδευση σε υδατική φάση που περιέχει υδατοδιαλυτό γαλακτωματοποιητή. Έχει βρεθεί ότι η αποτελεσματικότητα της ενκαψακίωσης του φαρμάκου, και το μέσο σωματιδιακό μέγεθος, επηρεάζονται από την αλλαγή του τύπου και της συγκέντρωσης και του w/o γαλακτώματος, και του σταθεροποιητικού παράγοντα. Γενικά, σε μια τυπική διαδικασία για την παραγωγή των νανοκαψακίων μέσω του διπλού γαλακτώματος, το πρωταρχικό γαλάκτωμα σχηματίζεται με τη βοήθεια υπερήχων και το w/o επιφανειοδραστικό σταθεροποιεί την διεπιφάνεια του w/o εσωτερικού γαλακτώματος (Εικ.1.8). Το δεύτερο γαλάκτωμα επίσης σχηματίζεται, με την βοήθεια υπερήχων και η διασπορά των νανοκαψακίων σταθεροποιείται με την προσθήκη ενός σταθεροποιητικού παράγοντα. Εικόνα 1.8. Σύστημα, για την παρασκευή νανοκαψακίων με τη μέθοδο του διπλού γαλακτώματος. Τελικά, οι διαλύτες απομακρύνονται με απλή εξάτμιση ή υπό κενό, αφήνοντας νανοκάψουλες σε υδατικό μέσο. Σαν προαιρετικό βήμα, το αιώρημα των νανοκαψακίων μπορεί να αραιωθεί πριν την εξάτμιση υπό κενό, για να διασφαλιστεί η πλήρης διάχυση του διαλύτη. 39

40 δ) Μέθοδος γαλακτωματοποίησης-συνάθροισης (Emulsion-coacervation method) Η διαδικασία της γαλακτωματοποίησης-συνάθροισης κυρίως παρουσιάζεται σαν μέθοδος για την παραγωγή νανοκαψακίων από φυσικά πολυμερικά υλικά. Η διαδικασία συμπεριλαμβάνει την o/w γαλακτωματοποίηση μιας οργανικής φάσης (ελαίου, ενεργής ουσίας, και διαλύτη ενεργής ουσίας, αν είναι απαραίτητο), με μια υδατική φάση (νερό, πολυμερές, σταθεροποιητικό παράγοντα), με μηχανική ανάδευση ή υπερήχους [35,36]. Τότε, ξεκινάει μια απλή διαδικασία διαχωρισμόυ φάσης, χρησιμοποιώντας ηλεκτρολύτες, με ένα σύστημα χλωριούχου νατρίου αλγινικού-ασβεστίου, με την προσθήκη ενός μη-διαλύτη αναμίξιμου με το νερό, ή ενός αφυδατικού παράγοντα, ή με θερμική τροποποίηση [37]. Τελικά, η διαδικασία μπορεί να συμπληρώνεται με επιπρόσθετα βήματα σταυρωτής διασύνδεσης των πολυμερικών αλυσίδων, που καθιστούν δυνατή την δημιουργία άκαμπτης δομής κελύφους στις νανοκάψουλες (Εικ.1.9). Εικόνα 1.9. Σύστημα, για την παρασκευή νανοκαψακίων με τη μέθοδο του γαλακτωματοποίησης-συνάθροισης. Ο σχηματισμός νανοκαψακίων με την παραπάνω μέθοδο, χρησιμοποιεί το γαλάκτωμα ως μια πρωταρχική φάση και στην συνέχεια επάγεται διαχωρισμός φάσης του πολυμερούς ώστε να σχηματιστεί ένα πολυμερικό φίλμ γύρω από τα σταγονίδια ε) Μέθοδος επικάλυψης με πολυμερές (Polymer-coating method) Πολλές διαφορετικές μεθοδολογικές στρατηγικές μπορούν να χρησιμοποιηθούν, ώστε να εφαρμοστεί η μέθοδος επικάλυψης πολυμερούς, δηλαδή στην ουσία να εναποτεθεί μια λεπτή στρώση πολυμερούς στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων. Το παραπάνω μπορεί να πραγματοποιηθεί, με την προσρόφηση του πολυμερούς 40

41 πάνω σε διασπορά σταγονιδίων ελαίου, υπό προκαθορισμένη ανάδευση και χρονικές συνθήκες [38] (Εικ.1.10). Παρομοίως, τα πολυμερή που είναι σχεδιασμένα ως στρώση, μπορούν να προστεθούν κατά την διάρκεια του τελικού σταδίου των συμβατικών μεθόδων, όπως η νανοσυγκαταβίθηση και η μέθοδος διπλού-γαλακτώματος. Όμως, οι παραπάνω μέθοδοι τροποποιούνται έτσι ώστε να είναι δυνατή η προσθήκη του πολυμερούς-στρώσης, στο εξωτερικό υδατικό μέσο και να επιτρέπεται ο ταυτόχρονος σχηματισμός στρώσης, λόγω της συγκαταβίθησης του φορτισμένου πολυμερούς ( κυρίως αρνητικά, στη φύση) και της διάχυσης του διαλύτη. Εικόνα Σύστημα, για την παρασκευή νανοκαψακίων με τη μέθοδο της επίκαλυψης με πολυμερές. 'Όπως και στην μέθοδο γαλακτωματοποίσης-συνάθροισης, έτσι και στην παρούσα μέθοδο, λαμβάνοντας υπ όψιν τον περιορισμένο αριθμό ερευνών, δεν μπορούν να εξαχθούν συγκεκριμένα κριτήρια για την επιλογή των πρώτων υλών και των αναλογιών συνθέσης. στ) Μέθοδος στοιβαδωτής επικάλυψης (Layer-by-layer method) Η μέθοδος στοιβαδωτής επικάλυψης, για την παρασκευή κολλοειδών σωματιδίων, καθιστά ικανή και την δημιουργία σφαιρικών σωματιδίων, που αποκαλούνται κάψουλες πολυηλεκτρολύτη, με πολύ καλά καθορισμένες χημικές και δομικές ιδιότητες. Περιληπτικά, ο μηχανισμός του σχηματισμού των νανοκαψακίων βασίζεται σε ηλεκτροστατική έλξη, η οποία οδηγεί σε προσρόφηση πολυηλεκρολυτών σε υπερκορεσμένο όγκο συγκεντρώσεων πολυηλεκτρολυτών. Αυτή η μέθοδος απαιτεί ένα κολλοειδές σύστημα, πάνω στο οποίο είναι προσροφημένη μια στοιβάδα πολυμερούς, είτε με επώαση στο διάλυμα του πολυμερούς, είτε μειώνοντας την διαλυτότητα του πολυμερούς με προσθήκη σταγόνα-σταγόνα ενός μη διαλύτη του πολυμερούς [39]. Αυτή η διαδικασία 41

42 επαναλαμβάνεται τότε με στοιβάδες πολυμερούς, που εναποτίθενται διαδοχικά η μία μετά την άλλη. Ως κολλοειδές σύστημα, μπορεί να χρησιμοποιηθεί η στερεή μορφή της ενεργής ουσίας, όπως και κάποια ανόργανα μόρια και βιολογικά κύτταρα (Εικ.1.11). Εικόνα Σύστημα, για την παρασκευή νανοκαψακίων με τη μέθοδο της στοιβαδωτής επικάλυψης. Η διαδικασία που ακολουθείται περιληπτικά είναι η παρακάτω: Αρχικά, ένα γαλάκτωμα, που περιέχει τροποποιημένο άμυλο, και έλαιο, ετοιμάζεται με ομογενοποίηση υψηλής πίεσης. Το τροποποιημένο άμυλο χρησιμοποιείται και ως γαλακτωματοποιητής της ελαιώδους φάσης και ως η πρώτη, αρνητικά φορτισμένη στρώση πολυηλεκτρολύτη του κελύφους. Τότε, το διάλυμα του δεύτερου πολυηλεκτρολύτη προστίθεται υπό ανάδευση και όταν η προσρόφηση τερματιστεί, ένα διάλυμα τρίτου πολυηλεκτρολύτη εγχέεται στο σύστημα, υπό τις ίδιες συνθήκες. Με το που τελειώνει η προσθήκη των πολυηλεκτρολυτών, η διασπορά των νανοκαψακίων τροποποιείται πάλι, με ομογενοποίηση υψηλής πίεσης, και το διάλυμα τελικά φυγοκεντρείται. Συνεπώς, παρότι η έρευνα πάνω στην συγκεκριμένη μέθοδο έχει επιφέρει μεγάλη βελτίωση στην τεχνική, αναγνωρίζεται, ότι το μεγαλύτερο μέρος των βημάτων της διαδικασίας είναι αρκετά περίπλοκο και χρονοβόρο, ειδικά για την σύνθεση πολυμερικών νανοκαψακίων με παχιά τοιχώματα. Επιπλέον, λαμβάνοντας υπόψη, ότι η έρευνα γύρω από αυτή τη μέθοδο μόλις ξεκίνησε δεν είναι δυνατόν να προταθεί ένα συγκεκριμένος σύστημα, ως μοντέλο. 42

43 1.4.2 Επίδραση του μεγέθους Όσον αφορά τις φυσιολογικές παραμέτρους, όπως η ηπατική διήθηση, η εξαγγείωση και η διάχυση των ιστών, και η νεφρική απέκκριση, είναι ξεκάθαρο ότι μαζί με τη σύνθεση της επιφάνειας, το μέγεθος είναι ένας παράγοντας -κλειδί στην βιοκατανομή των νανοσωματιδίων και την αποτελεσματικότητα της θεραπείας. Σε μια μελέτη που πραγματοποιήθηκε, τα in vivo αποτελέσματα της βιοκατανομής, νανοσωματιδίων πολυστυρενίου με μεγέθη, που κυμαίνονται από 50 έως 500 nm, έδειξαν υψηλότερα επίπεδα συσσώρευσης των μεγαλύτερων νανοσωματιδίων στο συκώτι [40]. Προτάθηκε λοιπόν, ότι ο μηχανισμός της ηπατικής πρόσληψης διαμεσολαβήθηκε από την προσρόφηση των πρωτεϊνών, που οδηγεί στην οψονοποίηση. Όμως, η επίδραση της θερμοκρασίας (37 C σε αντίθεση με 4 C) στον ηπατικό αποκλεισμό έδειξε απρόσμενα ταχύτερη πρόσληψη των νανοσωματιδίων των 50 nm στην χαμηλότερη θερμοκρασία. Παρομοίως, το μέγεθος των νανοσωματιδίων φάνηκε ότι έχει μια ουσιαστική επίδραση στην προσρόφηση των πρωτεϊνών. Επίσης, μικρά (200 nm) πεγκυλιωμένα PHDCA νανοσωματίδια, που έχουν επωαστεί με πρωτεΐνη ορού για 2 ώρες, έδειξαν σημαντική συσχέτιση μεταξύ του μεγέθους και της προσρόφησης των πρωτεϊνών [41]. Η προσρόφηση πρωτεϊνών, σε μικρά νανοκαψακίων (80 nm) ποσοτικοποιήθηκε (6%) και συγκρίθηκε με αυτή νανοσωματιδίων ίδιας μορφής με μεγαλύτερο μέγεθος (171 και 243 nm, 23% και 34%, αντίστοιχα). Η επίδραση της προσρόφησης πρωτεϊνών στα νανοσωματίδια πολυστυρενίου διαφορετικών μεγεθών, επιβεβαιώθηκε επίσης, με την ανάλυση της πρόσληψης των νανοκαψακίων από μακροφάγα και την κινητική της απομάκρυνσης από το αίμα σε ποντίκια. Η απομάκρυνση των μικρότερων νανοσωματιδίων ήταν διπλά πιο αργή σε σχέση με αυτή των μεγαλύτερων νανοσωματιδίων. Επιπλέον, το ποσό του ενκαψακιωμένου στα νανοσωματίδια φαρμάκου (TNF-a), που συσσωρεύτηκε στον όγκο μέσα σε διάστημα 24 h, ήταν διπλάσιο με τα μικρότερα νανοσωματίδια από αυτό των μεγαλύτερων νανοσωματιδίων. Τα αποτελέσματα ίσως προτείνουν λοιπόν, ότι αυτό συμβαίνει εξαιτίας της μεγαλύτερης επιφανειακής πυκνότητας PEG, στην επιφάνεια των μικρότερων νανοσωματιδίων πολυστυρενίου. Αντίστοιχα, μελέτες έχουν δείξει ότι το μέγεθος και η πολυδιασπορά μπορούν να επηρεάσουν και την βιοκατανομή των μικκυλίων. Συγκεντρωτικά, έχει δειχτεί ότι τα πεγκυλιωμένα νανοσωματίδια μικρότερα των 100 nm παρουσίασαν μείωση στην προσρόφηση πρωτεϊνών πλάσματος στην επιφάνεια τους, και επίσης μειωμένο ηπατικό φιλτράρισμα. Επιπλέον, είχαν μακρά παραμονή στο αίμα και υψηλό ρυθμό εξαγγείωσης σε διαπερατούς ιστούς, αποδεικνύοντας την σημασία του μεγέθους και σύστασης της επιφάνειας για την επίτευξη αποτελεσματικής στοχευόμενης χορήγησης [41]. 43

44 1.4.3 Επίδραση του πυρήνα Τα αποτελέσματα πολλών ερευνών έδειξαν, ότι η σύσταση του πυρήνα έχει σημαντική επίδραση στον χρόνο παραμονής στο αίμα [42]. Συγκεκριμένα έχει ερευνηθεί η επίδραση της σύστασης του πυρήνα στην φύση των προσροφούμενων πρωτεϊνών, χρησιμοποιώντας μια σειρά συμπολυμερών με την ίδια πυκνότητα PEG. Επίσης, ενδιαφέροντα συμπεράσματα σε σχέση με την σύσταση του πυρήνα και τις σχετικές τοξικότητες των νανοσωματιδίων έχουν εξαχθεί και αξιοποιώντας μια in vitro, πολυδιάστατη ανάλυση για τις ποικίλες συγκεντρώσεις αξιοποιώντας πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους και πολλαπλές μελετές της κυτταρικής φυσιολογίας [43]. Αυτή η γενικευμένη, συστηματική προσέγγιση, αποδεικνύει τις βιολογικές επιδράσεις που προκύπτουν από τις συνδυαστικές επιπτώσεις των πολλών πτυχών της σύνθεσης των νανοσωματιδίων, συμπεριλαμβανομένης και της σύνθεσης του πυρήνα που βρέθηκε να έχει κάπως απρόσμενο αντίκτυπο στις βιολογικές ιδιότητες. Μελλοντικές εργασίες, όπως πάνω στις σχέσεις των δομής-δράσης, ίσως ρίξουν περισσότερο φως στην πολύπλοκη αλληλεπίδραση μεταξύ των ιδιοτήτων των νανοσωματιδίων και τις επαγόμενες βιολογικές επιδράσεις. Συνοπτικά,έχει βρεθεί, ότι οι φυσικοχημικές ιδιότητες του πυρήνα είναι κρίσιμες παράμετροι στην βιολογική τύχη των νανοσωματιδίων. Ακριβείς τροποποιήσεις αυτών των ιδιοτήτων είναι ικανές στο να επηρεάσουν δραματικά την έκταση των αλληλεπιδράσεων με το αίμα και την βιοκατανομή των νανοσωματιδίων Επίδραση της σύνθεσης της επιφάνειας και του φορτίου Έχει πλέον καθιερωθεί, ότι τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά ενός πολυμερικού νανοσωματιδίου, όπως το επιφανειακό φορτίο και οι λειτουργικές ομάδες, μπορούν να επηρεάσουν την πρόσληψη του από τα κύτταρα του φαγοκυτταρικού συστήματος. Παραδείγματος χάριν, έχει αποδειχθεί ότι τα μικροσωματίδια πολυστυρενίου με μια πρωτοβάθμια αμινομάδα στην επιφάνεια, υπέστησαν πολύ περισσότερη φαγοκυττάρωση, σε σύγκριση με τα μικροσωματίδια, τα οποία είχαν θειώδεις, υδροξυλικές- και καρβοξυλικές- ομάδες [44]. Ως εκ τούτου, έχουμε αποδεχτεί ότι τα θετικώς φορτισμένα νανοσωματίδια, παρουσιάζουν υψηλότερη κυτταρική πρόσληψη, συγκριτικά με τα ουδέτερα ή αρνητικώς φορτισμένα. Τα νανοσωματίδια που διαθέτουν θετικά φορτισμένη επιφάνεια, επίσης αναμένεται να παρουσιάζουν υψηλό ρυθμό μη εξειδικευμένης κυτταρικής πρόσληψης και μικρό χρόνο ημιζωής στο αίμα. Νανοκελύφη με αρνητικό επιφανειακό φορτίο, όμως, έχουν δείξει μια αξιοσημείωτη μείωση στον ρυθμό πρόσληψης. 44

45 Όμως, δεν φαίνεται να υπάρχει συγκεκριμένη τάση όσον αφορά την επίδραση στο ζ-δυναμικό (zeta-potential), που εκφράζει το φορτίο, παραδείγματος χάριν, όσον αφορά τις νανοκάψουλες. Συγκεκριμένα, το ζ-δυναμικό κυρίως εξαρτάται από την χημική φύση του πολυμερούς, την χημική φύση του οποιουδήποτε σταθεροποιητικού παράγοντα και το ph του μέσου. Επομένως, όταν οι νανοκάψουλες παρασκευάζονται με πολυεστερικά πολυμερή ή μεθακρυλικά παράγωγα, χρησιμοποιώντας μη -ιοντικούς σταθεροποιητικούς παράγοντες παρατηρούνται αρνητικές τιμές ζ-δυναμικού, λόγω της παρουσίας καρβοξυλικών ομάδων στην επιφάνεια των νανοκαψακίων. Παρομοίως, θετικές τιμές παρατηρήθηκαν, όταν χρησιμοποιήθηκαν κατιονικά πολυμερή και μη-ιοντικοί σταθεροποιητικοί παράγοντες. Από την άλλη, όταν οι νανοκάψουλες παρασκευάζονται με την χρήση αρνητικά φορτισμένων σταθεροποιητικών παραγόντων, παρατηρούνται αρνητικά ζ-δυναμικά με απόλυτες τιμές υψηλότερες από όταν χρησιμοποιούνται σταθεροποιητές χωρίς φορτίο, και αντίστοιχα το ζ- δυναμικό είναι θετικό, αν επιλεχθεί θετικά φορτισμένος σταθεροποιητικός παράγοντας [45]. Η συμπεριφορά αυτή οφείλεται στην προσρόφηση των σταθεροποιητικών παραγόντων στην επιφάνεια των νανοκαψακίων, όπως για παράδειγμα στην περίπτωση αυτών από πολυκαπρολακτόνη (PCL), που εξηγείται και από την υδρόφοβη φύση του. Οι υδρόφοβες αλυσίδες του επιφανειοδραστικού αντιδρούν με τις υδρόφοβες περιοχές του PCL και η υδρόφιλη περιοχή του επιφανειοδραστικού εισχωρά στην υδατική φάση, προκαλώντας αρνητικό ή θετικό ζ-δυναμικό ανάλογα με την χημική του φύση [45]. Επιπρόσθετα, το μέγεθος του ζ-δυναμικού εξαρτάται και από το ph του διαλύματος, ανεξάρτητα της φύσης του σταθεροποιητικού παράγοντα. Επίσης έχει προταθεί ότι το ζ- δυναμικό των νανοκαψακίων, δεν παρουσιάζει καμία εξάρτηση με την φύση του ενεργού μορίου, δηλαδή του φαρμάκου, και την συγκέντρωση του πολυμερούς ή του σταθεροποιητή [46,47]. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των μελετών αυτών, λοιπόν, και λαμβάνοντας υπ όψιν ότι το ενεργό μόριο μπορεί να παγιδευτεί στον πυρήνα του νανοκαψακίου, το τελικό ζ-δυναμικό πιθανόν εξαρτάται από τον συνδυασμό των υλικών ή/και στις συγκεκριμένες συνθήκες παραγωγής που ακολουθούνται. 45

46 1.5. Πολυ(γαλακτικό) οξύ (PLA) Το πολυ(γαλακτικό) οξύ (PLA) (Εικ. 1.12) ανήκει στην οικογένεια των αλειφατικών πολυεστέρων, που προκύπτουν από α-υδρόξυ-οξέα, και θεωρούνται βιοαποικοδομήσιμα. Εικόνα Δομή μορίου πολυ-γαλακτικού οξέος Είναι ένα θερμοπλαστικό, υψηλής αντοχής, υψηλής ελαστικότητας πολυμερές, που μπορεί να παραχθεί από ετησίως ανανεώσιμες πηγές. Χρησιμοποιείται είτε στον βιομηχανικό χώρο της συσκευασίας, είτε στην αγορά των βιοσυμβατών/βιοαπορροφήσιμων ιατρικών ''συσκευών''. Γίνεται ευρεία χρήση του σε καθιερωμένους πλαστικούς εξοπλισμούς, γιατί αποδίδει μορφοποιημένα μέρη, μεμβράνες ή υφάσματα [48]. Το PLA βρίσκεται σε 3 στερεοχημικές μορφές : πολύ-(l- γαλακτίδιο) (PLLA), πολύ- (D- γαλακτίδιο) (PDLA) και πολύ- (DL- γαλακτίδιο) (PDLLA) (Εικ. 1.13) Εικόνα 1.13 : Στερεοισομερείς μορφές του γαλακτικού οξέος και των γαλακτιδίων του. 46

47 Είναι ένα από τα ελάχιστα πολυμερή, στα οποία η στερεοχημική δομή μπορεί εύκολα να τροποποιηθεί, πολυμερίζοντας ένα ελεγχόμενο μίγμα, από L- και D- ισομερή για να αποδώσουν υψηλού μοριακού βάρους άμορφα ή κρυσταλλικά πολυμερή, που μπορούν να χρησιμοποιηθούν και σε επαφή με τρόφιμα και είναι γενικά αναγνωρίσιμα ως ασφαλή. Το PLA αποικοδομείται με απλή υδρόλυση του εστερικού δεσμού και δεν απαιτεί την παρουσία ενζύμων για την κατάλυση της υδρόλυσης. Ο βαθμός της αποικοδόμησης εξαρτάται από το μέγεθος και το σχήμα του πολυμερούς, όπως και από την θερμοκρασία της υδρόλυσης. Με στόχο να προωθηθεί το PLA σε παραγωγικές γραμμές μεγάλης κλίμακας σε εφαρμογές όπως η χύτευση μέσω έγχυσης, ή μέσω εμφύσησης, η θερμοδιαμόρφωση και η εξώθηση, το πολυμερές πρέπει να χαρακτηρίζεται από επαρκή θερμική σταθερότητα, ώστε να αποφεύγεται η αποικοδόμηση του πολυμερούς και να διατηρεί το μοριακό του βάρος και τις ιδιότητες του. Το PLA υφίσταται θερμική αποικοδόμηση σε θερμοκρασίες πάνω από τους 200 C (392 F). μέσω υδρόλυσης, αναμόρφωσης του γαλακτιδίου, οξειδωτική σχάση της κύριας αλυσίδας, και έσω- ή διαμοριακές μετεστεροποιητικές αντιδράσεις. Η αποικοδόμηση του PLA λοιπόν, εξαρτάται από τον χρόνο, την θερμοκρασία, ακαθαρσίες μικρού μοριακού βάρους, καθώς και από την συγκέντρωση του καταλύτη. Οι καταλύτες και τα ολιγομερή μειώνουν την θερμοκρασία και αυξάνουν τον ρυθμό αποικοδόμησης του PLA. Επιπλέον, μπορούν να προκαλέσουν αλλαγές στο ιξώδες και στην ρεολογία, και να οδηγήσουν σε ασθενείς μηχανικές ιδιότητες του πολυμερούς. Το υψηλού μοριακού βάρους PLA είναι ένα γυαλιστερό, άκαμπτο, θερμοπλαστικό πολυμερές με ιδιότητες παρόμοιες με αυτές του πολυστυρενίου. Το άμορφο PLA θεωρούνταν διαλυτό στους περισσότερους οργανικούς διαλύτες, όπως το τετραυδροφουράνιο (THF), οι χλωριωμένοι διαλύτες, το βενζόλιο, το ακετονιτρίλιο και η διοξάνη. Από μελέτες διαλυτότητας, που πραγματοποιήθηκαν αργότερα, το PLA ήταν διαλυτό στο βενζόλιο, το χλωροφόρμιο, την 1,4-διοξάνη, και το THF. Ο πιο κατάλληλος διαλύτης έχει φανεί, μέσω της σκέδασης φωτός πολλαπλών γωνιών (Multi-Angle Laser Light Scattering, MALLS), ότι είναι το 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP). Και αυτό λόγω της μικρής διαφοράς στο δείκτη διάθλασης μεταξύ του PLA με (1.44) και του HFIP με (1.275). Το κρυσταλλικό PLA είναι διαλυτό στου χλωριωμένους διαλύτες και τον βενζόλιο, σε ανεβασμένες θερμοκρασίες. Το PLA μπορεί να κρυσταλλωθεί με αργή ψύξη άγοντας το κάτω από την θερμοκρασία υαλώδους μετάπτωσης (Tg). Καταληκτικά, οι φυσικοχημικές του ιδιότητες παρουσιάζονται στον πίνακα (Πίνακας 1.1). 47

48 Physical properties Melt Flow Rate (g/ 10 min) 4,3 2,4 Density (g/cm3) 1,25 Haze 2,2 Yellowness index Mechanical properties Tensile strength at yield (Mpa) 53 Elongation at yield (%) Flexular modulus (Mpa) Thermal properties HDT ( o C) GTT ( o C) Melting point ( o C) Πίνακας 1.1. Φυσικοχημικές ιδιότητες πολυ-γαλακτικού οξέος Πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) Εισαγωγή Η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG), ή αλλιώς πολυοξυαιθυλένιο, αναφέρεται σε ένα ολιγομερές ή πολυμερές του αιθυλενοξειδίου σε γραμμικές ή διακλαδισμένες δομές. Το PEG είναι ένα υδρόφιλο πολυμερές, που μπορεί να προσροφηθεί ή να προσδεθεί ομοιοπολικά στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων [49]. Υπάρχουν πολλοί τύποι πολυαιθυλενογλυκόλης, ανάλογα με τη γεωμετρία του πολυμερούς. Έτσι, συναντώνται διακλαδισμένα μόρια πολυαιθυλενογλυκόλης, αλυσίδες μορίων πολυαιθυλενογλυκόλης με βάση ένα κεντρικό μόριο PEG, αλλά και αλυσίδες πολυαιθυλενογλυκόλης συνδεδεμένες με πολυμερικούς κορμούς. Παραδείγματος χάριν, έχει περιγραφεί ο σχηματισμός PLA-PEG νανοσωματιδίων, σε μία δομή πυρήνα στέμματος, με ένα στερεό πυρήνα και αγκιστρωμένες 48

49 αλυσίδες PEG στην επιφάνεια [50]. Στην ίδια μελέτη τα αποτελέσματα έδειξαν για πρώτη φορά, ότι οι αλυσίδες PEG, που είναι προσδεμένες ομοιοπολικά στην επιφάνεια ενός σωματιδίου, μπορούν να παρουσιάσουν ευελιξία παρόμοια με αυτή του ελεύθερου PEG πολυμερούς διαλυμένου σε νερό. Επιπλέον, το PEG έδειξε ουσιώδη μείωση των μη-ειδικών αλληλεπιδράσεων με πρωτεϊνες, μέσω της υδροφιλικότητας του και των επιδράσεων της στερικής άπωσης, μειώνοντας έτσι την οψονοποίηση και την συμπληρωματική ενεργοποίηση. Το μήκος της αλυσίδας, το σχήμα και η πυκνότητα του PEG στην επιφάνεια των μορίων, είναι οι σημαντικότερες παράμετροι που επηρεάζουν την υδροφιλικότητα της επιφάνειας των νανοσωματιδίων και την φαγοκύτωση [51]. Η τυπική δομή της πολυαιθυλενογλυκόλης είναι η εξής (Εικ. 1.14): HO-CH2-(Ο-CH2-CH2-)n-OH. Εικόνα Δομή μορίου πολυαιθυλενογλυκόλης Ανάλογα με τη μέθοδο πολυμερισμού παρασκευάζονται διάφορες μορφές της πολυαιθυλενογλυκόλης, με πιο κοινή την μεθόξυ πολυαιθυλενογλυκόλη (mpeg). Χαμηλού μοριακού βάρους PEG είναι επίσης διαθέσιμα ως ολιγομερή. Το υψηλής καθαρότητας PEG είναι κρυσταλλικό, ενώ πρόσφατα έγινε απεικόνιση της δομής του με κρυσταλλογραφία ακτινών Χ. Ωστόσο, λόγω της δυσκολίας στον καθαρισμό και τον διαχωρισμό των ολιγομερών, η τιμή της πολύ υψηλής ποιότητας PEG είναι φορές μεγαλύτερη από αυτή της πολυαιθυλενογλυκόλης, χαμηλότερης καθαρότητας. Η πολυαιθυλενογλυκόλη είναι διαλυτή στο νερό, τη μεθανόλη, το βενζόλιο, το διχλωρομεθάνιο και αδιάλυτη στον διαιθυλαιθέρα και το εξάνιο. Μετά από τη σύνδεση της με υδρόφοβα μόρια παράγονται μη ιονικά επιφανειοδραστικά. Συγκεκριμένα, το PEG παρουσιάζει τις παρακάτω ιδιότητες: α) Είναι μη τοξικό και μη ανοσογονικό, και μπορεί να προστεθεί σε μέσα και να προσαρτηθεί σε επιφάνειες ή να προσδεθεί σε μόρια, χωρίς να επεμβαίνει στις κυτταρικές λειτουργίες. β) Είναι υδρόφιλο, υδατοδιαλυτό, και η προσκόλληση του σε πρωτείνες ή άλλα βιομόρια μειώνει την συσσωμάτωση και αυξάνει την διαλυτότητα. 49

50 γ) Είναι πολύ ευμετάβλητο και προτιμάται για την επικάλυψη επιφανειών ή για βιοσύζευξη, χωρίς στερεοχημική παρεμπόδιση Διαδικασία σύζευξης της Πολυαιθυλενόγλυκολης με άλλα πολυμερή (πεγκυλίωση) Ο όρος πεγκυλίωση (PEGylation) αναφέρεται στη διαδικασία ένωσης μίας δομής πολυαιθυλενογλυκόλης με κάποιο μεγαλύτερο μόριο, όπως για παράδειγμα μία θεραπευτική πρωτεΐνη. Παραδείγματος χάριν, η πεγκυλιωμένη ιντερφερόνη α 2α ή 2β, χρησιμοποιείται ευρέως σε ενέσιμη μορφή για τη θεραπεία της ηπατίτιδας-γ [52]. Η πεγκυλίωση αποτελεί ένα καθιερωμένο σύστημα χορήγησης, για βιοφαρμακευτικές ουσίες, όπως πεπτίδια, πρωτεΐνες, τμήματα αντιγόνων και άλλα. Είναι μια μέθοδος που μπορεί να βελτιώσει τις φαρμακολογικές και φυσικοχημικές ιδιότητες των φαρμάκων. Συγκεκριμένα, η πεγκυλίωση χρησιμοποιείται για την τροποποίηση των βιολογικών ενώσεων, όπως οι κυττοκίνες, οι ιντερλευκίνες, οι ορμόνες, τα ολιγονουκλεοτίδια, και κάποιες πρωτεΐνες και πεπτίδια. Η πεγκυλίωση πραγματοποιείται συνήθως, έπειτα από επώαση της πολυαιθυλενογλυκόλης με το μόριο στόχο [53]. Η σύζευξη των θεραπευτικών πρωτεϊνών ή φαρμακευτικών παραγόντων με μόρια πολυαιθυλενογλυκόλης μπορεί να «αποκρύψει» τους παράγοντες αυτούς από το ανοσοποιητικό σύστημα, αλλά και να αυξήσει το υδροδυναμικό τους μέγεθος, γεγονός που οδηγεί σε αυξημένο χρόνο κυκλοφορίας στο αίμα αλλά και σε μειωμένη ηπατική κάθαρση. Επιπλέον, η διαδικασία της πεγκυλίωσης οδηγεί σε αύξηση της υδατοδιαλυτότητας των υδρόφοβων φαρμάκων και πρωτεϊνών. Η διαδικασία αυτή, με την αύξηση του μοριακού βάρους των μορίων οδηγεί σε σημαντικά φαρμακολογικά πλεονεκτήματα, σε σχέση με τις μη-πεγκυλιωμένες μορφές τους, όπως: α) Βελτίωση της βιοδιαθεσιμότητας β) Αύξηση της διαλυτότητας των φαρμάκων γ) Παράταση του χρόνου κυκλοφορίας στο αίμα δ) Βελτιστοποίηση των φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων ε) Αύξηση της σταθερότητας των φαρμάκων στ) Μείωση ανοσογονικότητας ζ) Μείωση της συχνότητας των δόσεων, χωρίς ταυτόχρονη μείωση δραστικότητας και δυνητική μείωση της τοξικότητας. 50

51 Τα πεγκυλιωμένα φαρμακευτικά σκευάσματα παρουσιάζουν επίσης εμπορικά πλεονεκτήματα όπως : α) Η δυνατότητα δημιουργίας νέων οχημάτων μεταφοράς φαρμάκων και νέων δοσολογικών οχημάτων β) Αύξηση της διάρκειας της πατέντας για φάρμακα που έχουν ήδη εγκριθεί 'Όσον αφορά τη διαδικασία, το πρώτο βήμα της πεγκυλίωσης είναι η κατάλληλη ενεργοποίηση του πολυμερούς της πολυαιθυλενογλυκόλης στο ένα ή και στα δύο άκρα του. Τα πολυμερή πολυαιθυλενογλυκόλης που έχουν και τα δύο άκρα ενεργοποιημένα χρησιμοποιώντας την ίδια αντιδρούσα ομάδα είναι γνωστά με τον όρο «ομολειτουργικά», ενώ αν οι αντιδρούσες ομάδες είναι διαφορετικές χρησιμοποιείται ο όρος «ετερολειτουργικά». Με τον τρόπο αυτό, τα χημικώς ενεργά παράγωγα της πολυαιθυλενογλυκόλης είναι έτοιμα για τη σύνδεση τους με το επιθυμητό μόριο. Η πιο ευρέως διαδεδομένη μέθοδος πεγκυλίωσης, περιλαμβάνει την ανάμιξη των αντιδραστηρίων σε ένα κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα και ακολούθως τον διαχωρισμό και καθαρισμό του επιθυμητού προϊόντος με τη χρήση κατάλληλων τεχνικών με βάση τις φυσικοχημικές ιδιότητες των μορίων, όπως η χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (size exclusion chromatography SEC), η χρωματογραφία ιονανταλλαγής (ion exchange chromatography ΙΕΧ), η χρωματογραφία υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων (hydrophobic interaction chromatography HIC) και τα μεμβρανικά συστήματα διαχωρισμού. Η επιλογή των κατάλληλων ομάδων για την ενεργοποίηση των παραγώγων της αιθυλενογλυκόλης βασίζεται στις ελεύθερες προς αντίδραση ομάδες του μορίου με το οποίο θα συζευχθεί η πολυαιθυλενογλυκόλη. Όσον αφορά τις πρωτεΐνες, χρησιμοποιούνται αμινοξέα όπως η λυσίνη, κυστεΐνη, ιστιδίνη, αργινίνη, ασπαρτικό οξύ, σερίνη, κρεονίνη και τυροσίνη. Το Ν τελικό αμινοάκρο και το C τελικό αμινοάκρο μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν σαν σημείο σύνδεσης με πολυμερή με αλδευδικές λειτουργικές ομάδες. Οι τεχνικές, που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή 1 ης γενιάς παραγώγων πολυαιθυλενογλυκόλης, περιλαμβάνουν την αντίδραση του πολυμερούς της πολυαιθυλενογλυκόλης με ομάδες που περιέχουν ενεργές υδροξυλομάδες, ανυδρίτες, χλωρίδια, και οξικά οξέα. Αντίθετα, στα 2 ης γενιάς παράγωγα, χρησιμοποιούνται λειτουργικές ομάδες όπως αλδευδομάδες, εστέρες και αμίδια. Επιπλεόν, όσο οι εφαρμογές της πεγκυλιοποίησης γίνονται πιο εξελιγμένες, αυξάνεται η χρήση των ετερολειτουργικών μορίων πολυ-αιθυλενογλυκόλης. Αυτά τα μόρια χρησιμοποιούνται ως ενδιάμεσα μόρια για την ένωση άλλων ομάδων, όπου απαιτείται η χρήση υδρόφιλων και βιοσυμβατών μορίων. Σε αυτή την περίπτωση, τα μόρια για την ενεργοποίηση των άκρων της πολυαιθυλενογλυκόλης περιλαμβάνουν μαλεϊμίδια, βινυλικά σουλφίδια, αμίνες και καρβοξυλικά οξέα. 51

52 Τελευταία, είναι διαθέσιμοι 3 ης γενιάς παράγοντες πεγκυλιοποίησης, που επιτρέπουν τη λήψη διακλαδισμένων μορίων [54] Συστήματα χορήγησης βιοδραστικών ουσιών με βάση τα PLA PEG συμπολυμέρη Τα PLA PEG συμπολυμερή, συνδυάζουν την ικανότητα βιοδιάσπασης του PLA τμήματος με την υψηλή βιοσυμβατότητα και την υδροφιλικότητα του PEG τμήματος αυτών, και ήδη ερευνώνται εντατικά για την παρασκευή συστημάτων ελεγχόμενης χορήγησης και στόχευσης βιοδραστικών ουσιών [55]. Η υδροφιλικότητα τους προκαλεί αύξηση του ρυθμού βιοδιάσπασης τους και γι'αυτόν το λόγο μπορούν να κατασκευαστούν συστήματα χορήγησης, που επιτρέπουν την αποδέσμευση της δραστικής ουσίας με γρηγορότερους ρυθμούς από ότι τα συστήματα των αντίστοιχων ομοπολυμερών (PLA). Όσον αφορά την παρασκευή νανοσωματιδίων επικαλυμένων με PEG, χρησιμοποιούνται κυρίως δισυσταδικά συμπολυμερή της μορφής PEG R και όχι τρισυσταδικά συμπολυμερή R PEG R. Τα R PEG R οδηγούν στην δημιουργία σπειρών στην επιφάνεια των σωματιδίων με δύο σημεία σύνδεσης με τον πυρήνα του σωματιδίου. Γι αυτό τον λόγο, για αλυσίδα PEG ίδιου μήκους, η επικάλυψη που προκύπτει είναι περίπου μισή σε πάχος με αυτή που θα δημιουργούνταν αν χρησιμοποιούνταν δισυσταδικά συμπολυμερή. Το αποτέλεσμα είναι η επικάλυψη που προκύπτει από τρισυσταδικά συμπολυμερή να είναι λιγότερο δραστική από αυτή των σωματιδίων, που αποτελούνται από PEG R συμπολυμερή. Τα δισυσταδικά συμπολυμερή πολυ(γαλακτικού) οξέος, πολυ(αιθυλενογλυκόλης) (PLA-PEG) δοκιμάζονται για την παρασκευή νανοσωματιδιακών συστημάτων στόχευσης χορηγούμενων ενδοφλέβια, ενώ ήδη κυκλοφορούν εμπορικά σκευάσματα τέτοιας τεχνολογίας. Τα νανοσωματίδια PLA-PEG, όπως προαναφέραμε, εμφανίζουν παρατεταμένη παραμονή στο αίμα, ιδιότητα που αποτελεί προϋπόθεση για την εφαρμογή τους στην εκλεκτική αποστολή δραστικών ουσιών σε συγκεκριμένο τύπο κυττάρων. 52

53 1.7 Πεπτίδιο TAT Τα τελευταία χρόνια, αρκετά πεπτίδια ερευνήθηκαν εκτενώς για την δυνατότητα τους να διαπερνούν την κυτταρική μεμβράνη. Αυτά τα πεπτίδια, που διεισδύουν στα κύτταρα, αποκαλούνται με τους αγγλικούς όρους cell penetrating peptides (CPP) ή protein transduction domains (PTD). Τα συγκεκριμένα πεπτίδια, επίσης προωθούν την κυτταρική πρόσληψη διαφόρων σωματιδιακών φορέων συνδεδεμένων με αυτά. Ο μηχανισμός με τον οποίο εισέρχονται στα κύτταρα παρουσιάζει πολύ ενδιαφέρον, μιας και οι περισσότερες δημοσιεύσεις στο πεδίο αυτό επέδειξαν μια διαδικασία ενεργειακά ανεξάρτητη. Πράγματι, η κυτταρική πρόσληψη αυτών των πεπτιδίων παρατηρήθηκε και σε μικροσκόπιο φθορισμού σε χαμηλή θερμοκρασία, αλλά και υπό την παρουσία ποικίλων φαρμάκων, γνωστά ως ανασταλτικά της ενεργούς μεταφοράς. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε πολύ πιο γρήγορη ενδοκυττάρωση, από ότι συμβαίνει κανονικά [55]. Tο πεπτίδιο ΤΑΤ (HCys-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg- NH 2 ) (Εικ. 1.15) [56], ανήκει στην παραπάνω ειδική κατηγορία πεπτιδίων, που διεισδύουν στα κύτταρα (cell penetrating peptides, CPP). Tα πεπτίδια αυτά περιέχουν και αλληλουχίες που επάγουν την συσσώρευση στον πυρήνα του κυττάρου (nuclear localization signals), οπότε οι φορείς που φέρουν τέτοια πεπτίδια μπορούν να οδηγήσουν το φορτίο τους στο εσωτερικό του πυρήνα, ιδιότητα ιδιαίτερα σημαντική για φορτία όπως η Ιξαμπεπιλόνη, η οποία έχει ως περιοχή δράσης της τον πυρήνα. Εικόνα Σύμπλεγμα 5 δομών ιού ανοσοανεπάρκειας, ΤΑΤ. 53

54 1.8. Ιξαμπεπιλόνη Βασικά χαρακτηριστικά και δράση της ιξαμπεπιλόνης Οι ταξάνες αποτελούν σημαντικά φάρμακα στην χημειοθεραπεία του καρκίνου του μαστού. Όμως, επειδή όλοι οι ασθενείς τελικά αποκτούν ανθεκτικότητα σε αυτές, χρειάζονται νέες στρατηγικές. Το φάρμακο που έχει δείξει αποτελεσματικότητα, τόσο προκλινικά όσο και κλινικά, σε περιστατικά ανθεκτικά στην Ντοσεταξέλη (docetaxel) ή/και στην Πακλιταξέλη (paclitaxel) είναι η Ιξαμπεπιλόνη (ixabepilone). Η Ιξαμπεπιλόνη (Εικ. 1.16) ανήκει στη νέα κατηγορία χημειοθεραπευτικών φαρμάκων, τις εποθιλόνες. Οι εποθιλόνες αρχικά ανακαλύφθηκαν, όταν παρατηρήθηκε αντιμυκητιακή δράση από το μυκοβακτήριο Sorangium cellolosum, και στην πορεία οι ίδιοι παράγοντες βρέθηκαν ότι αλληλεπιδρούν με τους μικροσωληνίσκους και τους σταθεροποιούν [57]. Όταν τα κύτταρα διαιρούνται (και πολλαπλασιάζονται), δομές που ονομάζονται μικροσωληνίσκοι χρειάζονται, για να διαχωρίσουν και να αποσπάσουν τα χρωμοσώματα στα καινούρια κύτταρα. Πιο συγκεκριμένα, οι μικροσωληνίσκοι βοηθούν στον σχηματισμό του κυτταροσκελετού και έχουν ζωτικούς ρόλους σε διάφορες κυτταρικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων και της κυτταρικής σηματοδότησης αλλά και της μίτωσης. Οι μικροσωληνίσκοι αποτελούν έναν ελκυστικό στόχο για αρκετά χημειοθεραπευτικά φάρμακα, όπως και για τις εποθιλόνες, που ασκούν τις κυτταροτοξικές τους επιδράσεις μέσω της σταθεροποίηση τους ή μη [58]. Η Ιξαμπεπιλόνη, συγκεκριμένα, είναι ένα ημίσυνθετικό ανάλογο της εποθιλόνης Β (με logp=3,39), που δημιουργείται από την υποκατάσταση μιας ομάδας αζιδίου με οξυγόνο στον δακτύλιο του μακρολιδίου. Οι εποθιλόνες συνδέονται στους μικροσωληνίσκους και κατα συνέπεια τους πολυμερίζουν και τους σταθεροποιούν, κι έτσι αποτρέπεται η μίτωση και επέρχεται η απόπτωση [59]. Ειδικότερα, οι εποθιλόνες συνδέονται με την β- τουμπουλίνη, αν και η ακριβής θέση της σύνδεσης δεν είναι γνωστή [60]. Παρά το γεγονός ότι θεωρούνταν, ότι οι εποθιλόνες συνδέονται δίπλα ή και ακριβώς στο σημείο πρόσδεσης της πακλιταξέλης, υπάρχουν δεδομένα από τελευταίες έρευνες που υποδεικνύουν ότι το σημείο σύνδεσης τους στην τουμπουλίνη και τον ακόλουθο σχηματισμό του μικροσωληνίσκου μπορεί να είναι μακριά από το αντίστοιχο της πακλιταξέλης [61]. 54

55 Εικόνα Χημική δομή Ιξαμπεπιλόνης Σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και μοντέλα ξενομοσχευμάτων, η ιξαμπεπιλόνη έδειξε τιμές κυτταροτοξικότητας, που κυμαίνονται από 1.4. σε 45 nm, και επέδειξε μεγαλύτερη κυτταροτοξικότητα από την Πακλιταξέλη [62,63]. Πόσιμα αλλά και ενδοφλέβια σκευάσματα ιξαμπεπιλόνης περάσαν από κλινικές μελέτες, αν και μόνο η ενδοφλέβια μορφή εγκρίθηκε για την θεραπεία του καρκίνου του μαστού, και αναμένονται περεταίρω μελέτες για την πόσιμη χορήγηση. Στην πορεία των ερευνών αναφέρθηκαν και κυτταρικές σειρές ανθεκτικές στις εποθιλόνες, που ανήκουν σε διάφορους τύπους κακοήθειας συμπεριλαμβανομένων και καρκίνου των ωοθηκών αλλά και άλλων, οι οποίοι ήταν ανθεκτικοί και στις ταξάνες. Φαρμακοκινητικές μελέτες με την Ιξαμπεπιλόνη χορηγούμενη σε καθημερινή βάση, έδειξαν μια γρήγορη λογαριθμική (1-log) μείωση μετά από την διάχυση του φαρμάκου, αργότερα επακολουθούμενη από μια παρατεταμένη φάση αποβολής, παρόμοια με των ταξανών. Ο μέσος όρος χρόνου ημιζωής του φαρμάκου ήταν οι 16.8 ώρες. Η κάθαρση ήταν ταχύτατη, ανεξάρτητη της δόσης, και μη σχετιζόμενη με το σωματικό βάρος του ασθενούς ή την περιοχή της επιφάνειας. Η χορήγηση δόσεων κάθε 21 ημέρες, παρουσίασε μια παρόμοια καμπύλη στη συγκέντρωση του πλάσματος και ανεξαρτησία όσον αφορά την κάθαρση, την αποβολή και τη δόση [64,65]. Συγκεκριμένα, ο μέσος χρόνος ημιζωής ήταν 38.5 ώρες για μια δόση των 40 mg/m 2 που χορηγούνταν κάθε 21 ημέρες. Οι φαρμακοδυναμικές μελέτες, με καθημερινή χορήγηση δόσεων, δεν έδειξαν καμία συσχέτιση μεταξύ της περιοχής κάτω από την καμπύλη (area under the curve (AUC)) και την ουδετεροπενία [66]. Ως ουδετεροπενία χαρακτηρίζεται η πτώση του απόλυτου αριθμού των κυκλοφορούντων ουδετερόφιλων του περιφερικού αίματος(ααο), σε επίπεδα κατώτερα των δύο σταθερών αποκλίσεων από τη φυσιολογική μέση τιμή για την ηλικία και τη φυλή. Για άτομα, που ανήκουν στη λευκή φυλή [67] τα επίπεδα αυτά αντιστοιχούν σε 1000/mm 3, όταν αναφερόμαστε σε νεογνά και βρέφη, και 1500/mm 3 για μεγαλύτερα παιδιά και ενήλικες. Ανάλογα με τον ΑΑΟ η ουδετεροπενία διακρίνεται σε βαριά (ΑΑΟ: <500/mm 3 ), μέτρια (ΑΑΟ: /mm 3 ), και ήπια ( ΑΑΟ: /mm 3 ). Παρομοίως, δεν υπήρχε συσχέτιση με την ουδετεροπενία, στο πρόγραμμα δόσεων 55

56 των 21 ημερών. Παρόλα αυτά, η επί τοις εκατό αλλαγή στον απόλυτο αριθμό των ουδετερόφιλων ήταν σημαντικά αρνητικά συσχετισμένη με τις αυξανόμενες δόσεις της ιξαμπεπιλόνης. Φαρμακοδυναμικές έρευνες, που ερευνούν την δέσμη των μικροσωληνίσκων και τις επικείμενες επιδράσεις στην συγκέντρωση της ιξαμπεπιλόνης στο πλάσμα, έχουν πραγματοποιηθεί [68,69]. Ο σχηματισμός της δέσμης των μικροσωληνίσκων είναι ένα υποκατάστατο για τη σύνδεση της ixa στην β-τουμπουλίνη, και η δέσμευση του φαρμάκου αυξάνει καθώς αυξάνει η συγκέντρωση της ixa. Αυτή η σύνδεση συσχετίζεται με την επιφάνεια κάτω από την καμπύλη (AUC). Ενδιαφέρον, παρουσιάζει το γεγονός ότι φαίνεται, πως υπήρχαν περισσότερα καρκινικά κύτταρα με σχηματισμό μικροσωληνίσκων, απ' ότι περιφερειακά μονοπυρηνικά κύτταρα αίματος, μετά την δόση του φαρμάκου [69]. Επίσης, ο βαθμός της ουδετεροπενίας έχει βρεθεί, ότι συνδέεται με την επέκταση του σχηματισμού μικροσωληνίσκων στα περιφερειακά μονοπυρηνικά κύτταρα του αίματος Παρενέργειες κατά την συμβατική χορήγηση της Ιξαμπεπιλόνης Το μεγάλο πλεονέκτημα της Ιξαμπεπιλόνης είναι η ισχυρή αντικαρκινική της δράση, η οποία συνοδεύεται όμως από σημαντικές παρενέργειες. Οι πιο κοινές από αυτές είναι: α) Πόνοι στο σώμα β) Κάψιμο, μούδιασμα, μυρμήγκιασμα, ή επώδυνες αισθήσεις γ) Πόνο καψίματος κατά τη διούρηση, ή/και δύσκολη διούρηση δ) Πόνους στο στήθος ε) Ρίγη στ) Βήχας, και δύσκολη ή και υποβοηθούμενη αναπνοή, ή/και άσθμα ζ) συμφόρηση στο αυτί, ή/και ρινική συμφόρηση η) πυρετός, ή πονοκέφαλος θ) απώλεια φωνής ι) πόνοι χαμηλά στην πλάτη ή στα πλευρά ια) χλωμό, ή κόκκινο και πρησμένο δέρμα ιβ) πόνοι χαμηλά στην πλάτη ή στα πλευρά ια) καταρροή 56

57 ιγ) πόνοι χαμηλά στην πλάτη ή στα πλευρά ιδ) φτέρνισμα ιε) πονόλαιμος, ή/και πρησμένοι αδένες ιστ) απολέπιση του δέρματος στα χέρια και στα πόδια, ή και πρήξιμο ιζ) σφίξιμο στο στήθος ιη) μη σταθερότητα και αδεξιότητα, όπως και ασυνήθιστη κούραση και αδυναμία ιθ) ασυνήθιστη αιμορραγία, ή αιματώματα (μελανιές) Υπάρχουν και κάποιες λιγότερο συνήθεις, όπως η αιμάτωση των ούλων, η σύγχυση, ή/και ζαλάδα, ή/και λιποθυμία, ξηροστομία, ταχυκαρδία, βραχνάδα, φαγούρα, πόνοι ή/και πρήξιμο στις αρθρώσεις, εξανθήματα, ή/και προβλήματα με την κατάποση. Οι παραπάνω αναφορές στις παρενέργειες, επιδεικνύουν την έντονη ανάγκη για την χορήγηση τόσο ισχυρών φαρμάκων, όπως και η Ιξαμπεπιλόνη, στοχευόμενα, ώστε να αποφεύγεται η υποβολή του ασθενούς σε τεράστια ταλαιπωρία. 2. Σκοπός εργασίας Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η σύνθεση και η μελέτη μαγνητικών νανοκαψακίων ιξαμπεπιλόνης με βάση δισυσταδικά συμπολυμερή PLA-PEG σε μία προσπάθεια να αναπτυχθούν νανοφορείς για στοχευμένη χορήγηση ιξαμπεπιλόνης σε καρκινικούς όγκους. Για το σκοπό αυτό εγκλείστηκαν υπερπαρμαγνητικοί νανοκρύσταλλοι οξειδίου του σιδήρου (SPIONs) και ιξαμπεπιλόνη σε PLA-PEG νανοκαψάκια και μελετήθηκαν οι βασικές φυσικοχημικές τους ιδιότητες, η σταθερότητα τους και οι ιδιότητες αποδέσμευσης του φαρμάκου απουσία και παρουσία εξωτερικού μαγνητικού πεδίου. Επίσης διερευνήθηκε η in vitro αντικαρκινική δραστικότητα των μαγνητικών νανοκαψακίων ιξαμπεπιλόνης σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. 57

58 3. Πειραματικό μέρος 3.1 Υλικά PLA(10)mPEG(5), Advanced Polymer Materials Inc. PLA(20)mPEG(5), Advanced Polymer Materials Inc. PLA(40)mPEG(5), Advanced Polymer Materials Inc. PLA(20)PEG(5)mal Ιξαμπεπιλόνη (Ixabepilone), BOC sciences, purity 99,8 % Glyceryl tridecanoate oil, Sigma Aldrich, 99%, MW: 554,84 NH 4 OH, Sigma Aldrich NaCl, Sigma Aldrich Μεμβράνη Κυτταρίνης (Dialysis tubing cellulose membrane), 10 mm width, 8451 MW Διχλωρομεθάνιο,(DCM) (HPLC Grade), Sigma Aldrich Μεθανόλη, (MeOH) (HPLC Grade), Sigma Aldrich Αιθανόλη (EtOH), Sigma Aldrich Ακετονιτρίλιο (ACN) (HPLC Grade), Sigma Aldrich Τετραυδροφουράνιο, (THF) Sigma Aldrich HCl (37% v/v) Διάλυμα Φαινανθρολίνης (1g/L) Διάλυμα Υδροξυλαμίνης (100g/L) Διάλυμα Οξικού Νατρίου 1,2Μ Ρυθμιστικό Διάλυμα Φωσφoρικών (ph = 7,4, 10mM) Εξάνιο, (Hexane) Εξαένυδρος χλωριούχος σίδηρος (Iron (III) Chloride hexahydrate) Ελαϊκό Νάτριο (Sodium Oleate) Απεσταγμένο Νερό, dh 2 O Απιονισμένο Νερό Θρεπτικό μέσο RPMI 1640,Biochrom. Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (Phosphate buffered saline, PBS), Biochrom. Ορός βοός (Fetal Bovine Serum, FBS) από την Biochrom. Διάλυμα πενικιλίνης στρεπτομυκίνης (10000 U/ 1000μg / ml) από την Biochrom. Διάλυμα αμφοτερικίνης Β (2,5mg/ ml) από την Biochrom Ιωδιούχο προπίδιο, Sigma Aldrich. Θρυψίνη (Trypsin/EDTA), Biochrom Διμεθυλ- σουλφοξείδιο (DMSO) Rhodamine B base, 97% (Dye content), Aldrich Chemical Company TAT peptide (HCys-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg- NH2), Storkbio Ltd, Estonia 58

59 3.2 Οργανολογία Ζυγός Ακριβείας, Mettler AE166 Μαγνητικός Αναδευτήρας, Hot plate Stirrer SB 162-3, Stuart Rotary Evaporator, Buchi Rotevapor R-114 Φυγόκεντρος, Heraeus Seratech Biofuge 28RS HPLC UV-Vis, Waters 2695 Separations Module Φασματοφωτόμετρο Υπεριώδους - Ορατού, Shimadzu UV-1205 Συσκευή Μέτρησης Μεγέθους και ζ Δυναμικού, Nano z-sizer, Malvern Instruments Συσκευή Λυοφιλοποίησης, Labconco Freeze Dryer 4,5 Επωαστήρας, Thermoforma Θάλαμος Νηματικής Ροής, Microflow Οπτικό Μικροσκόπιο, Leica DMLB Υδατόλουτρο, Bioline scientific Ακίδα Υπερήχων (Probe Sonicator), Ultrasonic Processor Λουτρό Υπερήχων (Bath Sonicator), Tuttnauer Μηχανικός Αναδευτήρας (vortex), Labinco 456 Πεχάμετρο Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Διελεύσεως (Τransmission Εlectron Μicroscopy) Συσκευή κυτταρομετρίας ροής (FACS), EPICS XL, Coulter Συσκευή θερμοστατικής ανάλυσης (TGA, TA instruments) 59

60 3.3 Σύνθεση νανοκαψακίων Σύνθεση μαγνητικών νανοκρυστάλλων τριοξειδίου του σιδήρου Οι νανοκρύσταλλοι του τριοξειδίου του σιδήρου παρασκευάστηκαν σε δύο βασικά βήματα. Πρώτον έγινε η σύνθεση του συμπλόκου του ελαϊκού σιδήρου, και ακολούθως η σύνθεση των μαγνητικών νανοκρυστάλλων. Αρχικά πραγματοποιείται η σύνθεση του συμπλόκου του ελαϊκού σιδήρου, τοποθετώντας μια τρίλαιμη φιάλη (των 250 ml), σε πολυμερικό λουτρό, η οποία δεν εφάπτεται στον πάτο του λουτρού, και πραγματοποιείται μαγνητική ανάδευση στις 150 στροφές (rpms). Στον πρώτο λαιμό τοποθετείται θερμόμετρο, στον δεύτερο ψυκτήρας, και στον τελευταίο πώμα. Η αιθανόλη και το νερό προστίθενται στην φιάλη, που περιέχει ελαϊκό νάτριο και εξαυδρικό χλωριούχο Σίδηρο (Iron (III) Chloride hexahydrate), και αναδεύονται για 10 λεπτά. Τελικά προστίθεται εξάνιο σε θερμοκρασία δωματίου, οπότε και δημιουργούνται δύο φάσεις. Εφαρμόζεται θέρμανση με βήματα των 10 o C με αναρροή, ( 70 o C σύμφωνα με τον αισθητήρα του λουτρού), μια θερμοκρασία στην οποία το μίγμα αρχίζει να βράζει. Ο κύριος ρυθμός θέρμανσης προσδιορίζεται στον 1 o C/λεπτό. Στο εν τω μεταξύ, η πορτοκαλί χαμηλότερη φάση (υδατική φάση) φαίνεται να καθαρίζει και η υψηλότερη οργανική φάση, που περιέχει το σύμπλοκο, γίνεται κοκκινό-μαυρη. Η θερμοκρασία στην φιάλη είναι τώρα 56 o C. Μετά από αντίδραση τεσσάρων ωρών το μίγμα αφήνεται να ψυχρανθεί σε θερμοκρασία δωματίου (25 o C). Το μίγμα τότε μεταφέρεται σε διαχωριστική χοάνη, και η ανώτερη οργανική φάση, που περιέχει το σύμπλοκο διαχωρίζεται από την υδατική. Το κατώτερο υδατικό κιτρινωπό στρώμα απορρίπτεται. Τότε η οργανική φάση πλένεται τρείς φορές με 50ml νερό, και σε κάθε πλύση το νερό ανακατεύται με την οργανική στοιβάδα, καθώς αναδεύουμε την χοάνη απαλά, και την αφήνουμε για λεπτά, έτσι ώστε οι δύο φάσεις να διαχωριστούν ξανά και να απομακρυνθεί η υδατική φάση, η οποία είναι αρκετά καθαρή. Στην πορεία, η οργανική φάση μεταγγίζεται σε κωνική φιάλη, και το ποσό του οργανικού υλικού που έμεινε στα τοιχώματα της χοάνης απομακρύνθηκε με 1-2 ml εξανίου και μεταφέρθηκε στη φιάλη. Μετά, προστίθεται άνυδρο θειϊκό νάτριο (περίπου μια κουταλιά) στην φιάλη, και αφέθηκε για περίπου 15 λεπτά, με σκοπό να απομακρυνθεί οτιδήποτε νερό, μπορεί να έχει απομείνει. Η οργανική φάση, λοιπόν, φιλτράρεται και μεταφέρεται σε σφαιρική φιάλη. Τότε, το εξάνιο απομακρύνεται από το μίγμα με τη χρήση περιστροφικού εξατμιστήρα (rotary evaporator), έχοντας ως αποτέλεσμα ένα σύμπλοκο ελαϊκού σιδήρου, σε κηρώδη στερεή μορφή. Το συντεθειμένο αυτό προϊόν αποθηκεύεται σε ξηραντήρα. Στην πορεία προχωράμε στην σύνθεση των μαγνητικών νανοκρυστάλλων, χρησιμοποιώντας ως πρώτες ύλες, g σύμπλοκο ελαϊκού σιδήρου (4.0 60

61 mmol) και ελαϊκό οξύ 1.130g (4.0 mmol) διαλυμένο σε 20.0 g 1-Oκταδεκάνιο σε θερμοκρασία δωματίου, σε τρίλαιμη φιάλη. Το μίγμα αναδεύεται (400 rpm), σε θερμοκρασία δωματίου για μία ώρα, και στην πορεία η θέρμανση πραγματοποιείται σε θερμαντικό μανδύα υπό μαγνητική ανάδευση (350rpm). Στον μεσαίο λαιμό τοποθετήθηκε ψυκτήρας, και στους άλλους δύο λαιμούς, θερμόμετρο και αισθητήρας θερμοκρασίας αντίστοιχα. Με την χρήση βελόνας μέσω του ψυκτήρα, εφαρμόστηκε ροή αζώτου (1 bubble/min), από τη στιγμή που άρχισε η θέρμανση μέχρι το τέλος της αντίδρασης. Το μίγμα θερμαίνεται μέχρι τους 100 o C (με βήματα των 20 o C), και παραμένει σε αυτή τη θερμοκρασία για 30 λεπτά, και στην πορεία θερμαίνεται επιπλέον (με βήματα των 10 o C-15 o C) μέχρι τους 318 o C ( σύμφωνα με το εξωτερικό θερμόμετρο), για μια ώρα για να δώσει μια μαύρη διασπορά σε τελική θερμοκρασία 318 o C, με κύριο ρυθμό θέρμανσης 3.4 o C/ λεπτό. Ο ψυκτήρας, που τοποθετήθηκε κατά την αρχή της θέρμανσης, απομακρύνθηκε πριν την θερμοκρασία βρασμού, για 30 δευτερόλεπτα, για την αποφυγή τυχόν εκρήξεων. Το μίγμα γίνεται μαύρο πάνω από τους 280 o C, και μετά από μια ώρα αφήνεται να ψυχθεί σε θερμοκρασία δωματίου. Στο τέλος προστίθενται 6ml Διχλωρομεθανίου και το προϊόν μοιράζεται σε 6 διαφορετικά φιαλίδια. Η καθαρότητα του παρασκευάσματος προσδιορίσθηκε με την μέθοδο TGA, και το μέγεθος των νανοκρυστάλλων με το μικροσκόπιο TEM Σύνθεση μαγνητικών νανοκαψακίων Ιξαμπεπιλόνης Τα μαγνητικά νανοκαψάκια της Ιξαμπεπιλόνης (mag IXA ncs) παρασκευάσθηκαν με τη μέθοδο της νανοσυγκαταβίθησης (nanoprecipitation), με ορισμένες τροποποιήσεις. Το γαλάκτωμα που παρασκευάζεται αποτελείται από μία πολυμερική φάση, μια ελαιώδη και μία υδατική. α) Η πολυμερική φάση αποτελείται από 20 mg πολυμερούς (PLA(10)mPEG(5), PLA(20)mPEG(5), PLA(40)mPEG(5)), τα οποία διαλύονται σε 1,4 ml Τετραυδροφουρανίου (THF). Στην πολυμερική φάση επίσης προστίθεται ποσότητα 1 mg μαγνητικών νανοκρυστάλλων, οι οποίοι αρχικά είναι διαλυμένοι σε διχλωρομεθάνιο (DCM), το οποίο εξατμίζουμε και αντικαθιστούμε με THF, πριν την προσθήκη στο διάλυμα του πολυμερούς στο THF. β) Η ελαιώδης φάση αποτελείται από 60 mg ελαίου ( glyceryl tridecanoate oil), διαλυμένα σε 300 μl αιθανόλης (EtOH), στο οποίο διάλυμα προστίθεται και η ποσότητα της Ιξαμπεπιλόνης (1-3 mg). γ) Τέλος, η υδατική φάση αποτελείται από 4 ml υπερκάθαρου νερού. Η πολυμερική φάση προστίθεται στάγδην στην ελαιώδη, και το μίγμα αυτό μεταφέρεται πάλι στάγδην στην υδατική φάση, υπό ήπια μαγνητική ανάδευση. Το γαλάκτωμα που προκύπτει μεταφέρεται σε σφαιρική φιάλη και τοποθετείται σε 61

62 συσκευή συμπύκνωσης (rotary evaporator), όπου αφήνονται για περίπου 3 ώρες υπό χαμηλή πίεση, την οποία ελαττώνουμε σταδιακά, και υπό θέρμανση 35 C, ώστε να εξατμιστούν οι οργανικοί διαλύτες. Στο τέλος αυτής της διαδικασίας παραλαμβάνουμε το γαλάκτωμα των νανοκαψακίων, το οποίο στην πορεία υφίσταται διαδικασία καθαρισμού (φιλτράρισμα/φυγοκέντρηση). Καθ' όλη την διάρκεια της διαδικασίας της παρασκευής, γίνεται οπτικός έλεγχος του παρασκευάσματος, για τυχόν εμφάνιση συσσωματωμάτων ή/ και ιζήματος στα φιαλίδια Σύνθεση μαγνητικών κενών νανοκαψακίων Για την παρασκευή μαγνητικών κενών νανοκαψακίων (mag blank ncs), ακολουθείται πάλι η μέθοδος της νανοσυγκαταβίθησης (nanoprecipitation), με ακριβώς τα ίδια βήματα, που αναφέρθηκαν στην προηγούμενη ενότητα ( 3.3.2), με την μόνη διαφορά ότι στην ελαιώδη φάση δεν προστίθεται φάρμακο (ixa) Σύνθεση μη μαγνητικών κενών νανοκαψακίων Για την παρασκευή κενών νανοκαψακίων (blank ncs), ακολουθείται και πάλι η μέθοδος της νανοσυγκαταβίθησης (nanoprecipitation), με τα ίδια βήματα, που αναφέρθηκαν στην ενότητα 3.3.2, με τη διαφορά ότι στην πολυμερική φάση δεν γίνεται προσθήκη μαγνητικών νανοκρυστάλλων, και στην ελαιώδη φάση δεν προστίθεται φάρμακο (ixa) Σύνθεση μαγνητικών νανοκαψακίων Ιξαμπεπιλονής με την πρόσδεση πεπτιδίου ΤAT Τα μαγνητικά νανοκαψάκια της Ιξαμπεπιλόνης, με προσδεδεμένο το πεπτίδιο ΤΑΤ (mag IXA ΤΑΤ ncs) παρασκευάσθηκαν με τη μέθοδο της νανοσυγκαταβίθησης (nanoprecipitation), με ορισμένες τροποποιήσεις. Το γαλάκτωμα που παρασκευάζεται αποτελείται από μία πολυμερική φάση, μια ελαιώδη και μία υδατική. α) Η πολυμερική φάση αποτελείται από 12 mg πολυμερούς PLA(10)mPEG(5) και 6 mg πολυμερούς PLA(20)PEG(5)-maleimide, τα οποία διαλύονται σε 1,4 ml Τετραυδροφουρανίου (THF). Στην πολυμερική φάση επίσης προστίθεται ποσότητα 1 mg μαγνητικών νανοκρυστάλλων, οι οποίοι αρχικά είναι διαλυμένοι 62

63 σε διχλωρομεθάνιο (DCM), το οποίο εξατμίζουμε και αντικαθιστούμε με THF, πριν την προσθήκη στο διάλυμα του πολυμερούς στο THF. β) Η ελαιώδης φάση αποτελείται από 60 mg ελαίου (glyceryl tridecanoate oil), διαλυμένα σε 300 μl αιθανόλης (EtOH), στο οποίο διάλυμα προστίθεται και η ποσότητα της Ιξαμπεπιλόνης (1-3 mg). γ) Τέλος, η υδατική φάση αποτελείται από 4 ml υπερκάθαρου νερού. Η πολυμερική φάση προστίθεται στάγδην στην ελαιώδη, και το μίγμα αυτό μεταφέρεται πάλι στάγδην στην υδατική φάση, υπό ήπια μαγνητική ανάδευση. Το γαλάκτωμα που προκύπτει μεταφέρεται σε σφαιρική φιάλη και τοποθετείται σε συσκευή συμπύκνωσης (rotary evaporator), όπου αφήνονται για περίπου 3 ώρες υπό χαμηλή πίεση, την οποία ελαττώνουμε σταδιακά, και υπό θέρμανση 35 C, ώστε να εξατμιστούν οι οργανικοί διαλύτες. Στο τέλος αυτής της διαδικασίας παραλαμβάνουμε το εναιώρημα των νανοκαψακίων, το οποίο στην πορεία υφίσταται διαδικασία καθαρισμού (φιλτράρισμα/φυγοκέντρηση). Στην πορεία προσδένεται το πεπτίδιο ΤΑΤ, στο μαλεϊμίδιο του PEG των νανοκαψακίων, μέσω ενός θειοαιθερικού δεσμού. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιείται προσθέτοντας μικρή περίσσεια διαλύματος του πεπτιδίου ΤΑΤ στα νανοκαψάκια υπό ατμόσφαιρα αζώτου [70]. Η διαδικασία πραγματοποιείται υπό μαγνητική ανάδευση στο σκοτάδι για 48 h, και όταν τελειώσει η αντίδραση τοποθετείται σε μεμβράνη διαπίδυσης και ακολουθείται η διαδικασία πλύσης (dialysis), ώστε να απομακρυνθεί η περίσσεια του πεπτιδίου. Καθ' όλη την διάρκεια της διαδικασίας της παρασκευής, γίνεται οπτικός έλεγχος του παρασκευάσματος, για τυχόν εμφάνιση συσσωματωμάτων ή/ και ιζήματος στα φιαλίδια Σύνθεση μαγνητικών κενών νανοκαψακίων, φορτωμένων με Ροδαμίνη Για την παρασκευή μαγνητικών κενών νανοκαψακίων με Ροδαμίνη (mag blank rhod ncs), ακολουθείται πάλι η μέθοδος της νανοσυγκαταβίθησης (nanoprecipitation), με ακριβώς τα ίδια βήματα, που αναφέρθηκαν στην προηγούμενη ενότητα ( 3.3.2), με την μόνη διαφορά ότι στην ελαιώδη φάση προστίθονται 200 μl από stock παρασκεύασμα 1mg/ml ροδαμίνης σε αιθανόλη. Μετά την καθιερωμένη διαδικασία καθαρισμού (φιλτράρισμα), το γαλάκτωμα φυγοκεντρείται για 1 h στα rpm. Μετά την φυγοκέντρηση παραλαμβάνεται 63

64 το ίζημα, και επανασυστάται σε απεσταγμένο νερό, έχοντας έτσι απομακρύνει την περίσσεια Ροδαμίνης από τα νανοκαψάκια Χαρακτηρισμός νανοκαψακίων Μετά την παρασκευή των νανοκαψακίων, ακολουθούν οι διαδικασίες χαρακτηρισμού τους, κατά τις οποίες γίνεται προσδιορισμός του μεγέθους τους, του ζ-δυναμικού, καθώς και ο προσδιορισμός της απόδοσης τους, και η παρατήρηση τους με μικροσκόπιο ΤΕΜ. Στα καψάκια που φέρουν και ενεργή ουσία (ixa), γίνεται επίσης προσδιορισμός της φόρτωσης του φαρμάκου και της ενκαψακίωσης, καθώς και μελέτη της αποδέσμευσης του. Επίσης, μετρήθηκε η συγκέντρωση των μαγνητικών νανοκρυστάλλων, στα νανοκαψάκια, έγινε προσδιορισμός της κολλοειδής σταθερότητας των νανοκαψακίων, αλλά και της σταθερότητας σε χλωριούχο νάτριο, που προσομοιάζει τις συνθήκες στο αίμα. Τελευταίες πραγματοποιήθηκαν οι κυτταρικές μελέτες Τεχνικές χαρακτηρισμού Δυναμική σκέδαση φωτός (Dynamic light scattering) Η δυναμική σκέδαση φωτός (DLS), γνωστή και ως ημιελαστική σκέδαση φωτός (Quasi-Elastic Light Scattering (QELS)), ή και ως φασματοσκοπία συσχέτισης φωτονίων (photon correlation spectroscopy) είναι μία ευρέως διαδεδομένη τεχνική μέτρησης του μεγέθους των κολλοειδών νανοσωματιδίων σε αραιά διαλύματά τους. Είναι μία μη-επεμβατική, γρήγορη και καθιερωμένη χαμηλού κόστους τεχνική, η οποία απαιτεί ελάχιστη προετοιμασία του δείγματος. Όταν αναφερόμαστε σε προσδιορισμό μεγέθους νανοσωματιδίων, αναφερόμαστε συγκεκριμένα στον προσδιορισμό της υδροδυναμικής διαμέτρου. Η υδροδυναμική διάμετρος, ή αλλιώς η διάμετρος Stokes, είναι η διάμετρος μιας σκληρής σφαίρας που διαχέεται με τον ίδιο ρυθμό όπως το σωματίδιο που παρατηρούμε, μέσα στο διάλυμα. Έχει επονομαστεί από τον μαθηματικό και φυσικό George Gabriel Stokes ( ), και είναι στενά συνδεδεμένη με την κινητική των σωματιδίων σε ρευστά, που έχει να κάνει όχι μόνο με το μέγεθος, αλλά και με τις επιδράσεις του διαλύτη. 64

65 Σύμφωνα με τον νόμο του Stokes, μια τέλεια σφαίρα που κινείται διαμέσου ενός παχύρευστου υγρού, υφίσταται μια ελκτική δύναμη, αναλογική του συντελεστή τριβής, f:, όπου η είναι το ιξώδες του υγρού, s είναι η ταχύτητα της παρασυρόμενης σφαίρας, και α, η υδροδυναμική ακτίνα. Λόγω του ότι η κίνηση των ιόντων, μ, είναι ανάλογη της ταχύτητας και αντιστρόφως ανάλογη του συντελεστή τριβής:,όπου το ze αντιπροσωπεύει το ιοντικό φορτίο σε ακέραια πολλαπλάσια των φορτίων των ηλεκτρονίων. Το 1905 ο Albert Einstein βρήκε τον συντελεστή διάχυσης D, ενός ιόντος ίσο με :,όπου k Β, η σταθερά Boltzman και q το ηλεκτρικό φορτίο. Υποκαθιστώντας τον συντελεστή τριβής της τέλειας σφαίρας από τον νόμο του Stokes:, που λύνεται ως προς την ακτίνα, α [71] : Τα νανοκαψάκια, στα οποία προσδιορίζουμε το μέγεθος, στην πραγματικότητα δεν υφίστανται ως σκληρές σφαίρες, οπότε η υδροδυναμική διάμετρος αντανακλά όσο πλησιέστερα γίνεται, το φαινομενικό μέγεθος του κινούμενου σωματιδίου. Κατά την διάρκεια της τεχνικής, πηγή φωτός laser φωτίζει το δείγμα, που έχει τοποθετηθεί στην κυψελίδα. Το σκεδαζόμενο σήμα φωτός συλλέγεται με έναν από τους πιθανούς δύο ανιχνευτές, ή αυτόν που βρίσκεται στις 90 ο (ορθή γωνία) ή στις 173 ο (πίσω γωνία) (Εικ.3.1). Τα σωματίδια μπορούν να βρίσκονται σε διασπορά σε ποικιλία υγρών. Τα μόνα που είναι απαραίτητο να είναι γνωστά είναι ο δείκτης διάθλασης του υγρού και το ιξώδες του, για να εξαχθούν τα αποτελέσματα της μέτρησης. 65

66 Εικόνα 3.1. Οπτική απεικόνιση της διάταξης για τη μέτρηση μεγέθους στο nanosizer Η τεχνική μέτρησης, με την οποία λειτουργεί το nano z sizer της Malvern, το οποίο χρησιμοποιείται στην παρούσα εργασία είναι η ΝIBS (Non Invasive Back Scatter), η οποία επεκτείνει το εύρος των μεγεθών και των συγκεντρώσεων, που μπορούν να μετρηθούν. Το μηχάνημα έχει την δυνατότητα να διακρίνει τις πληροφορίες σε γωνία σκέδασης 173 ο (back scatter), και η τεχνική θεωρείται μη καταστροφική γιατί το οπτικό σύστημα δεν είναι σε επαφή με το δείγμα. Τα πλεονεκτήματα της NIBS είναι τα παρακάτω: α) Αυξάνεται η ευαισθησία της μεθόδου. β) Ο όγκος του δείγματος, που επεξεργάζεται. είναι δέκα φορές μεγαλύτερος από αυτόν των κοινών συστημάτων των 90 μοιρών. γ) Υπάρχει δυνατότητα μέτρησης μεγάλου φάσματος συγκεντρώσεων του δείγματος. δ) Η ακτίνα laser δεν χρειάζεται να περάσει όλο το δείγμα εξαλείφοντας το φαινόμενο της πολλαπλής σκέδασης, οπότε είναι δυνατή η μέτρηση πιο πυκνών δειγμάτων. ε) Η επίδραση της σκόνης είναι μειωμένη, καθώς σκεδάζει περισσότερο φως στην αντίθετη κατεύθυνση Φασματοσκοπία μοριακής απορρόφησης υπεριώδους ορατού (UV-Vis) Η φασματοσκοπία μοριακής απορρόφησης είναι μια φασματοχημική τεχνική. Σε όλες τις φασματοχημικές τεχνικές απαιτείται η μέτρηση της ισχύος, P, της ακτινοβολίας, η οποία είναι η ενέργεια της δέσμης ακτινοβολίας, που φθάνει σε μια συγκεκριμένη επιφάνεια ανά δευτερόλεπτο [72]. Η ενέργεια της ακτινοβολίας μετατρέπεται σε ηλεκτρικό σήμα, το οποίο στην ιδανική περίπτωση είναι ανάλογο 66

67 προς την ηλεκτρική ισχύ. Στις ποσοτικές τεχνικές απορρόφησης απαιτούνται δύο μετρήσεις ισχύος, μία πριν περάσει η δέσμη από το δείγμα που έχει τον αναλύτη (P 0 ), και μία μετά (P). Δύο έννοιες, που συνδέονται με τη φασματοσκοπία απορρόφησης και σχετίζονται με τα μεγέθη P 0 και P, είναι η διαπερατότητα (Τ) και η απορρόφηση (Α). Εικόνα 3.2. Εξασθένιση δέσμης ακτινοβολίας, που διέρχεται μέσω απορροφούντος διαλύματος. Η φασματοσκοπία μοριακής απορρόφησης λοιπόν, στηρίζεται στη μέτρηση της διαπερατότητας, T, ή της απορρόφησης A, διαλυμάτων που τοποθετούνται σε διαφανείς κυψελίδες οπτικής διαδρομής b (cm) (Εικ.3.2). Η διαπερατότητα του υλικού ορίζεται ως το κλάσμα της εισερχόμενης ακτινοβολίας, το οποίο διέρχεται από το μέσον. Σε αντίθεση με την διαπερατότητα, η απορρόφηση του οπτικού μέσου αυξάνει, όσο εξασθενεί η διερχόμενη δέσμη. Συνήθως η συγκέντρωση c, ενός αναλυτή που απορροφά συνδέεται γραμμικά με την απορρόφηση, σύμφωνα με την εξίσωση:, η οποία αποτελεί τον νόμο του Beer, και όπου ε, ο συντελεστής γραμμομοριακής απορροφητικότητας. Για αντιστάθμιση των απωλειών, λόγω σκέδασης, ανάκλασης, απορρόφησης από τα τοιχώματα της κυψελίδας, κ.α., γίνεται σύγκριση με την ισχύ της δέσμης, που διαπερνά την κυψελίδα, όταν αυτή περιείχε μόνο διαλύτη. Επίσης, συχνά παρουσιάζονται αποκλίσεις από την γραμμικότητα στον νόμο του Beer, μεταξύ της μετρούμενης απορρόφησης και της συγκέντρωσης. Ορισμένες από αυτές αντιπροσωπεύουν πραγματικούς περιορισμούς του νόμου, ενώ άλλες εμφανίζονται ως συνέπεια του τρόπου μέτρησης της απορρόφησης, ή ως αποτέλεσμα χημικών μεταβολών που συνδέονται με αλλαγές της συγκέντρωσης (οργανολογικές και χημικές αποκλίσεις αντίστοιχα). Οι πραγματικοί περιορισμοί είναι οι εξής: 67

68 α) σε μεγάλες συγκεντρώσεις αναλυτή (>0,01 Μ), η αλληλεπίδραση μεταξύ των μορίων του αναλυτή μπορεί να μεταβάλλει την ικανότητα τους να απορροφούν ακτινοβολία σε ένα δεδομένο μήκος κύματος. β) η παρουσία άλλων ουσιών στο δείγμα σε μεγάλες συγκεντρώσεις έχει παρόμοια επίδραση γ) απόκλιση παρατηρείται και, όταν μεταβολές στην συγκέντρωση προκαλούν μεταβολές στον δείκτη διάθλασης, n, του διαλύματος. Χημικές αποκλίσεις από τον νόμο του Beer, εμφανίζονται όταν ο αναλύτης διίσταται, συζευγνύεται, ή αντιδρά με τον διαλύτη και παράγει προϊόντα, που έχουν διαφορετικό από αυτόν φάσμα απορρόφησης. Επίσης, η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα των φασματομετρικών αναλύσεων συχνά καθορίζεται από τις αβεβαιότητες ή τον θόρυβο, που συνδέονται με το ίδιο το όργανο. Η ακρίβεια των φωτομετρικών μετρήσεων περιορίζεται σημαντικά σε χαμηλές και υψηλές τιμές απορρόφησης. Το φασματόμετρο UV-Vis αποτελείται από την πηγή ακτινοβολίας, τον μονοχρωμάτορα, την κυψελίδα απορρόφησης, τον ανιχνευτή, και τον καταγραφέα/μετρητή. Οι πηγές ακτινοβολίας αποτελούνται από υλικά που διεγείρονται σε υψηλές ενεργειακές καταστάσεις, τα οποία κατά την αποδιέγερση τους, εκμπέμπουν φωτόνια χαρακτηριστικής ενέργειας. Ως πηγές υπεριώδους ακτινοβολίας χρησιμοποιούνται οι λυχνίες υδρογόνου και δευτερίου ( nm), ή η λυχνία ξένου ( nm). Ενώ, ως πηγές ορατής ακτινοβολίας χρησιμοποιούνται η λυχνία νήματος βολφραμίου ( nm), ή το τόξο άνθρακα. Οι μονοχρωμάτορες ( ή τα φίλτρα) χρησιμοποιούνται για τον διαχωρισμό της συνεχούς (πολυχρωματικής) ακτινοβολίας της πηγής, σε στενές ζώνες ή σε μονοχρωματική ακτινοβολία. Οι κυψελίδες που περιέχουν το δείγμα ή τον διαλύτη πρέπει να κατασκευάζονται από υλικό, το οποίο επιτρέπει την διέλευση της ακτινοβολίας στην περιοχή εργασίας. Για εργασία στην υπεριώδη περιοχή (κάτω από 350 nm) απαιτούνται κυψελίδες από χαλαζία ή τηγμένη πυρίτια. Και τα δύο υλικά είναι διαπερατά από ορατή και υπέρυθρη ακτινοβολία μέχρι τα 3 μm. 68

69 Ηλεκτροφόρηση Οι τρείς βασικές καταστάσεις της ύλης είναι η στερεή, η υγρή και η αέρια. Εάν μία από αυτές τις καταστάσεις διασπαρεί σε μία άλλη, τότε έχουμε ένα ''κολλοειδές'' σύστημα. Όλα τα σωματίδια που βρίσκονται σε εναιώρημα, παρουσιάζουν ένα ζ-δυναμικό ή επιφανειακό φορτίο (Εικ.3.3). Εικόνα 3.3 Σχηματική απεικόνιση της κατανομής των ιόντων, γύρω από ένα φορτισμένο σωματίδιο. Στο διάλυμα, η παρουσία ενός καθαρού φορτίου στο σωματίδιο επηρεάζει την κατανομή των ιόντων, που το περιβάλλουν, έχοντας ως αποτέλεσμα μια αύξηση στην συγκέντρωση των αντίθετων ιόντων. Η περιοχή στην οποία υπάρχει αυτή η επίδραση καλείται η ηλεκτρική διπλοστοιβάδα. Συμβατικά, θεωρούμε ότι η στοιβάδα αυτή αποτελείται από δύο ξεχωριστές περιοχές: α) Μια εσωτερική στοιβάδα από στενά συνδεδεμένα ιόντα, γνωστή ως στοιβάδα Stern. β) Μια εξωτερική στοιβάδα από χαλαρά συνδεμένα ιόντα, ονομαζόμενη Gouy- Chapman. Καθώς το σωματίδιο κινείται διαμέσου του διαλύματος, εξαιτίας της βαρύτητας ή μιας εφαρμοζόμενης τάσης, τα ιόντα κινούνται με αυτό. Σε κάποια απόσταση από το σωματίδιο υπάρχει ένα ''σύνορο'', πέρα από το οποίο τα ιόντα δεν μετακινούνται με το σωματίδιο. Η διαφορά δυναμικού που αναπτύσσεται μεταξύ της εξωτερικής στοιβάδας και της ηλεκτρο-ουδέτερης περιοχής του διαλύματος ονομάζεται ηλεκτροκινητικό ή ζ-δυναμικό και μπορεί να μετρηθεί εύκολα πειραματικά. Η μέτρηση και η γνώση του ζ-δυναμικού αυτού είναι κρίσιμη για την βελτιστοποίηση της διαδικασίας, που θα ακολουθηθεί, της πρόβλεψης της σταθερότητας της παρασκευής και των αλληλεπιδράσεων, και επίσης ως απλή 69

70 μέθοδος για ποιοτικό έλεγχο. Οι μέθοδοι μέτρησης εξαρτώνται από την φύση και των σωματιδίων, αλλά και της σύνθεσης του εναιωρήματος. Γενικά, το μέγεθος και η συγκέντρωση των σωματιδίων είναι οι παράγοντες-κλειδιά, που καθορίζουν ποια τεχνική είναι εφαρμόσιμη. H ηλεκτροφόρηση είναι η πιο διαδεδομένη τεχνική για την μέτρηση του ζ- δυναμικού. Κατά την εφαρμογή της, ένα ηλεκτρικό πεδίο εφαρμόζεται στο δείγμα, που ωθεί τα φορτισμένα σωματίδια σε κίνηση. Η κατεύθυνση και η ταχύτητα (ηλεκτροφορητική κινητικότητα) των σωματιδίων εξαρτάται από το εφαρμοζόμενο πεδίο [73]. Συγκεκριμένα, η ταχύτητα του σωματιδίου σε ένα ηλεκτρικό πεδίο εξαρτάται από την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου, την διηλεκτρική σταθερά του υγρού, το ιξώδες του, και το ζ-δυναμικό. Οπότε, μετρώντας άμεσα την ηλεκτροφορητική κινητικότητα του διαλύματος, το ζ- δυναμικό μπορεί να προσδιοριστεί μέσω της εξίσωσης Henry:, όπου η U E είναι η ηλεκτροφορητική κινητικότητα, ε η διηλεκτρική σταθερά, ζ το ζ-δυναμικό, f(k a ) είναι η σταθερά Henry, και η το ιξώδες. Η σταθερά Henry γενικά έχει τιμές ή 1.0 ή 1.5. Για την μέτρηση του ζ-δυναμικού σε υδατικά διαλύματα μέτριας συγκέντρωσης ηλεκτρολυτών, χρησιμοποιείται η τιμή του 1.5, και αναφέρεται ως προσέγγιση Smoluchowski. Η κύρια διαφορά μεταξύ των οργάνων που χρησιμοποιούν ως τεχνική την ηλεκτροφόρηση είναι ο τρόπος, με τον οποίο ανιχνεύεται η κίνηση των σωματιδίων. Η διαδικασία της μέτρησης της ηλεκτροφορητικής ικανότητας πραγματοποιείται με την χρήση μιας τριχοειδούς κυψελίδας με ηλεκτρόδια στο κάθε άκρο και στα οποία εφαρμόζεται ένα δυναμικό. Τα σωματίδια κινούνται προς το ηλεκτρόδιο, μετριέται η ταχύτητα τους και εκφράζεται σε ενιαία ένταση πεδίου, όπως και η κινητικότητα τους. Πιο πρόσφατες μέθοδοι συμπεριέλαβαν την διαδικασία της άμεσης παρατήρησης μεμονωμένων σωματιδίων χρησιμοποιώντας τεχνικές υπερ-μικροσκοπίου και χειροκίνητα καταγράφοντας την πρόοδο τους σε μια υπολογισμένη απόσταση [74]. Αυτή η μέθοδος όμως παρουσιάζει πολλά μειονεκτήματα. Η τεχνική που χρησιμοποιείται στο όργανο της Malvern, το Zetasizer Nano range, στο οποίο γίνεται χρήση στην παρούσα εργασία είναι η ηλεκτροφόρηση laser Doppler σε συνδυασμό με την M3-PALS [75]. Το Zetasizer Nano range χρησιμοποιεί έναν συνδυασμό του μετρητή ταχύτητας laser Doppler και ανάλυσης φάσης μέσω σκέδασης του φωτός ( phase analysis light scattering (PALS)) σε μια πατενταρισμένη τεχνική που καλείται M3-PALS, για να μετρηθεί η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των σωματιδίων. Η εκτέλεση της τεχνικής της M3-PALS καθιστά εφικτή την ανάλυση ακόμα και δειγμάτων, πολύ χαμηλής κινητικότητας, όπως και τον υπολογισμό των κατανομών της κίνησης τους. Η PALS μπορεί να παρέχει αυξημένη αναπαράσταση έως και

71 φορές περισσότερο σε σχέση με τις καθιερωμένες τεχνικές μέτρησης, κάτι που επιτρέπει την μέτρηση δειγμάτων υψηλής αγωγιμότητας, και επιπλέον την δυνατότητα της ακριβής μέτρησης δειγμάτων με χαμηλή κινητικότητα σωματιδίων, όπως δείγματα που είναι διεσπαρμένα σε μη υδατικούς διαλύτες. Μπορούν, λοιπόν να εφαρμοστούν χαμηλές τάσεις, για να αποφευχθεί οποιοδήποτε ρίσκο επιδράσεων στο δείγμα λόγω της θέρμανσης Joule. Ένα σύστημα μέτρησης ζ-δυναμικού απαρτίζεται από 6 κύρια στοιχεία (Εικ. 3.4). Αρχικά, ένα λέιζερ (1) χρησιμοποιείται για να παρέχει μια πηγή φωτός ώστε να φωτίσει τα σωματίδια του δείγματος. Για μετρήσεις του ζ-δυναμικού, αυτή η πηγή φωτός διαχωρίζεται για να παρέχει μια προσπίπτουσα δέσμη και μια δέσμη αναφοράς. Η προσπίπτουσα δέσμη περνά διαμέσου του κέντρου της κυψελίδας του δείγματος (2), και το σκεδαζόμενο φως, σε γωνία περίπου 13 ανιχνεύεται( 3). Όταν εφαρμόζεται ηλεκτρικό πεδίο στην κυψελίδα, ότι σωματίδια κινούνται μέσα στον όγκο μέτρησης, θα προκαλέσουν την ένταση του φωτός που ανιχνεύεται να κυμαίνεται με μια συχνότητα ανάλογη με την ταχύτητα των σωματιδίων, και αυτή η πληροφορία μεταφέρεται σε έναν ψηφιακό επεξεργαστή δείγματος (4) και μετά σε έναν υπολογιστή (5). Το λογισμικό του οργάνου παράγει ένα φάσμα συχνοτήτων μέσω του οποίου υπολογίζεται η ηλεκτροφορητική κινητικότητα και κατά συνέπεια το ζ-δυναμικό. Η ένταση του ανιχνευόμενου, σκεδαζόμενου φωτός πρέπει να είναι μεταξύ ορισμένων τιμών για να είναι επιτυχής η μέτρηση της από τον ανιχνευτή. Αυτό επιτυγχάνεται με τη χρήση ενός εξασθενητή σήματος (6), που προσαρμόζει την ένταση του φωτός που φτάνει στο δείγμα και κατά συνέπεια την σκέδαση του σκεδαζόμενου φωτός. Για να διορθώνονται τυχόν διαφορές στο πάχος της κυψελίδας, και στην ανάκλαση του μέσου διασποράς, ενσωματώνονται οπτικοί αντισταθμιστές (7), για να διατηρηθεί η βέλτιστη οπτική ευθυγράμμιση. Εικόνα 3.4. Σχηματική απεικόνιση του Zetasizer Nano Series, για τις μετρήσεις του ζ-δυναμικού. 71

72 Θερμοσταθμική ανάλυση (ThermoGravimetric Analysis) H Θερμοσταθμική ανάλυση (TGA) ή Θερμοβαρυμετρία αποτελεί μία τεχνική χαρακτηρισμού υλικών αλλά και ποσοτικής ανάλυσης. Είναι μια αναλυτική τεχνική λοιπόν, που χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της θερμικής σταθερότητας και του κλάσματος των πτητικών συστατικών, παρακολουθώντας την αλλαγή, που προκύπτει στο βάρος, καθώς ένα δείγμα θερμαίνεται. Η μέτρηση φυσιολογικά πραγματοποιείται σε αέρα, ή σε ατμόσφαιρα ευγενούς αερίου, όπως Ήλιο ή Αργό, και το βάρος καταγράφεται σαν συνάρτηση της αυξανόμενης θερμοκρασίας. Μερικές φορές, η μέτρηση πραγματοποιείται σε ισχνή ατμόσφαιρα οξυγόνου (1 με 5 % O 2 σε Ν 2 ή He) για να κατευναστεί η οξείδωση. Επιπρόσθετα με τις αλλαγές στο βάρος, κάποια όργανα καταγράφουν επίσης την θερμοκρασιακή διαφορά μεταξύ του δείγματος και ενός ή περισσότερων δειγμάτων αναφοράς (differential thermal analysis, ή DTA), ή την ροή θερμότητας στον υποδοχέα (pan) με το δείγμα, συγκρινόμενη με αυτή του υποδοχέα αναφοράς (reference pan) (differential scanning calorimetry, ή DSC). Τα όργανα που χρησιμοποιούνται στην TGA, μπορούν να χωριστούν σε δύο γενικούς τύπους: κάθετης ισορροπίας (α) (Εικ.3.5), και οριζόντιας ισορροπίας (β). α) Τα όργανα κάθετης ισορροπίας απαρτίζονται από έναν ειδικό υποδοχέα δείγματος, που κρέμεται από τον ισορροπιστή (TA Instruments, κ.α), ή που τοποθετείται πάνω από τον ισορροπιστή σε ''μίσχο'' δείγματος (Netzsch). Αυτά τα όργανα, κρίνεται απαραίτητο να βαθμονομούνται, με σκοπό την αντιστάθμιση των επιδράσεων άνωσης, λόγω της μεταβολής στην πυκνότητα του καθαρού αερίου με τη θερμοκρασίας. Τα όργανα κάθετης ισορροπίας δεν έχουν υποδοχέα αναφοράς και είναι ανίκανα για πραγματικές μετρήσεις DTA ή DSC. Εικόνα 3.5. Όργανο TA, που χρησιμοποιήθηκε για την Θερμοσταθμική Ανάλυση. 72

73 β) Τα όργανα οριζόντιας ισορροπίας (TA, Perkin Elmer, κ.α.) φυσιολογικά έχουν δύο υποδοχείς (έναν δείγματος και έναν αναφοράς), και πραγματοποιούν και μετρήσεις DTA ή DSC. Θεωρούνται ελεύθερα από επιδράσεις άνωσης, αλλά απαιτείται βαθμονόμηση για να αντισταθμιστεί η διαφορική θερμική διαστολή των βραχιόνων ισορροπίας. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η ανάλυση μέσω TGA πραγματοποιείται σε οξειδωμένη ατμόσφαιρα (αέρα ή οξυγόνο σε μείγματα αδρανούς αερίου) με γραμμική θερμοκρασιακή ράμπα. Η μέγιστη θερμοκρασία επιλέγεται έτσι ώστε το βάρος του δείγματος να είναι σταθερό κατά το τέλος του πειράματος, υπονοώντας ότι όλες οι χημικές αντιδράσεις έχουν πραγματοποιηθεί. Αυτή η προσέγγιση παρέχει δύο σημαντικές αριθμητικές πληροφορίες: την περιεκτικότητα σε τέφρα. (υπολειπόμενη μάζα, Μοριακά Βάρη), και την θερμοκρασία οξείδωσης (T o ). Ενώ ο προσδιορισμός της περιεκτικότητας σε τέφρα είναι αδιαμφισβήτητος, η θερμοκρασία οξείδωσης μπορεί να καθοριστεί με πολλούς τρόπους, συμπεριλαμβανομένης και της θερμοκρασίας του μέγιστου ρυθμού απώλειας βάρους (dm/dt max ) και της θερμοκρασίας έναρξης (T onset ). Η πρώτη αναφέρεται στην θερμοκρασία του μέγιστου ρυθμού οξείδωσης, ενώ η δεύτερη στη θερμοκρασία που η οξείδωση ξεκινά. Οι μετρήσεις θερμοσταθμικής ανάλυσης εκτελούνται με τη βοήθεια μικροζυγού ακριβείας, σε κλίβανο όπου η θερμοκρασία μπορεί να προγραμματιστεί και να ελεγχθεί απόλυτα. Η θερμοκρασία του δείγματος μετράται και καταγράφεται με ακρίβεια. Το διάγραμμα της μάζας ή του ποσοστού της μάζας, ως συνάρτηση του χρόνου ή/και της θερμοκρασίας, ονομάζεται θερμογράφημα ή καμπύλη θερμικής διάσπασης. Μία εναλλακτική και συμπληρωματική παρουσίαση είναι η χρήση της πρώτης παραγώγου της καμπύλης TGA σε συνάρτηση με τη θερμοκρασία ή το χρόνο. Αυτό δείχνει το ρυθμό με τον οποίο η μάζα μεταβάλλεται και είναι γνωστή ως διαφορική θερμοσταθμική καμπύλη (Differential Thermo Gravimetric curve DTG) [76] Υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) Η HPLC είναι μια μέθοδος διαχωρισμού και ποσοτικής ανάλυσης η οποία στηρίζεται στη διαφορετική κατανομή των συστατικών ενός μίγματος μεταξύ δύο φάσεων, μιας ακίνητης (stationary phase) και μιας κινητής (mobile phase). Η κινητή φάση μετακινεί τα συστατικά του μίγματος επί της ακίνητης με διαφορετική ταχύτητα. Στην μέθοδο χρησιμοποιούνται στήλες με πολύ μικρά σωματίδια υλικού πλήρωσης (συνήθως 3-5 μm), με αποτέλεσμα την απαίτηση λειτουργίας σε υψηλή πίεση. Έτσι βελτιώνεται σημαντικά η απόδοση, χωρίς ανάλογη αύξηση του χρόνου που απαιτείται για τον διαχωρισμό. Η HPLC είναι σήμερα η πιο διαδεδομένη από όλες τις τεχνικές διαχωρισμού και ποσοτικής ανάλυσης, με τα παρακάτω βασικά πλεονεκτήματα: 73

74 α) ευαισθησία β) εύκολη προσαρμογή σε ακριβείς ποσοτικούς διαχωρισμούς γ) κατάλληλη για διαχωρισμό μη πτητικών ή θερμικά ευαίσθητων συστατικών δ) εφαρμοσιμότητα σε προσδιορισμούς ουσιών μεγάλου βιομηχανικού και ερευνητικού ενδιαφέροντος Για να αναπτυχθούν ικανοποιητικές ταχύτητες ροής του υγρού έκλουσης, όταν χρησιμοποιούνται υλικά πλήρωσης της τάξης μεγέθους των 3-10 μm, οι απαιτούμενες πιέσεις από τις αντλίες φτάνουν τα μερικές χιλιάδες psi. H HPLC λειτουργεί με δύο τρόπους: α) ισοκρατική έκλουση, με διαλύτη σταθερής σύστασης β) βαθμιδωτή έκλουση, με μίγματα 2-3 διαλυτών μεταβαλλόμενης σύστασης Όσον αφορά την οργανολογία, το σύστημα της HPLC αποτελείται από μια αναλυτική στήλη, μια προστατευτική, και τον θερμοστάτη της στήλης. Η αναλυτική στήλη συνήθως έχει μήκος 25 cm, εσωτερική διάμετρο 4-10 mm, και μέγεθος υλικού πλήρωσης το προαναφερθέν. Επίσης αποτελείται από συστήματα άντλησης (αντλία), έγχυσης δείγματος, και ανιχνευτή/ές [76]. Ένας ανιχνευτής HPLC πρέπει να έχει τον ελάχιστο δυνατό εσωτερικό όγκο, αλλά δεν απαιτείται να αποκρίνεται σε μεγάλη περιοχή θερμοκρασιών. Υπάρχουν δύο βασικοί τύποι ανιχνευτών στην υγρή χρωματογραφία: α) αυτοί που ανταποκρίνονται σε μια βασική ιδιότητα της κινητής φάσης (δείκτης διάθλασης, διηλεκτρική σταθερά, πυκνότητα κλπ), η οποία επηρεάζεται από την παρουσία των εκλουόμενων συστατικών. β) αυτοί που αποκρίνονται σε ιδιότητα του εκλουόμενου συστατικού (π.χ. απορρόφηση στο υπεριώδες, φθορισμός, ρεύμα διάχυσης). Την ιδιότητα αυτή δεν πρέπει να έχει η κινητή φάση. Όσον αφορά την ποσοτική ανάλυση, η οποία και μας ενδιαφέρει στην παρούσα εργασία, η ποσοτική χρωματογραφία στήλης βασίζεται σε σύγκριση του ύψους της κορυφής ή της επιφάνειας κάτω από την κορυφή του αναλύτη (υπό προσδιορισμό ουσίας) στα άγνωστα δείγματα με τις αντίστοιχες κορυφές προτύπων (γνωστής συγκέντρωσης) δειγμάτων. Με κατάλληλο έλεγχο των συνθηκών, οι παράμετροι αυτές μεταβάλλονται γραμμικά με την συγκέντρωση. Η πιο άμεση και απλή μέθοδος είναι η χρήση μιας σειράς πρότυπων διαλυμάτων, με σύνθεση που προσεγγίζει την σύνθεση των αγνώστων. Σημαντικότερη πηγή σφάλματος αποτελεί η αβεβαιότητα στον όγκο του δείγματος. Για την λήψη της καμπύλης βαθμονόμησης, εισάγεται στο όργανο σειρά πρότυπων διαλυμάτων, με ακριβώς γνωστές συγκεντρώσεις του αναλύτη και καταγράφεται η ένδειξη του οργάνου. Στην πορεία ακολουθεί διόρθωση των ενδείξεων ως προς το τυφλό. Τα δεδομένα 74

75 αυτά χρησιμοποιούνται για τη σχεδίαση διαγράμματος της διορθωμένης ένδειξης ως προς την συγκέντρωση του αναλύτη Κυτταρομετρία ροής (Flow Cytometry) Όπως υπονοεί το όνομα, η κυτταρομετρία ροής είναι η μέτρηση κυττάρων σε ένα σύστημα ροής, που προωθεί τα κύτταρα μεμονωμένα σε ένα σημείο μέτρησης. Πιο συγκεκριμένα, η κυτταρομετρία ροής είναι μια τεχνική αυτοματοποιημένης κυτταρικής ανάλυσης, που επιτρέπει τη μέτρηση μεμονωμένων σωματιδίων (κυττάρων, πυρήνων, χρωμοσωμάτων κλπ), καθώς διέρχονται σε νηματική ροή από ένα σταθερό σημείο, όπου προσπίπτει μια ακτίνα laser [77]. Η ανάλυση γίνεται με βάση τον εκπεμπόμενο φθορισμό και την σκέδαση του φωτός. Η κυτταρομετρία ροής ξεκίνησε σαν εργαλείο κυτταρικής ανάλυσης στο πεδίο της βασικής έρευνας, αλλά γρήγορα άρχισαν να αναπτύσσονται πρακτικές εφαρμογές και στο κλινικό πεδίο. Για τη μέτρηση της αναλογίας του υπό μελέτη πληθυσμού σε ένα σύνολο κυττάρων, χρησιμοποιούνται κυτταρομετρητές ροής, που επιτρέπουν τη διάκριση κυτταρικών πληθυσμών, με βάση κάποιο αντιγονικό χαρακτηριστικό της κυτταρικής μεμβράνης, του κυτταροπλάσματος ή του πυρήνα, το οποίο αναγνωρίζεται από ένα συγκεκριμένο μονοκλωνικό αντίσωμα. Τέτοια αντιγονικά χαρακτηριστικά επιτρέπουν, επιπλέον, την αξιολόγηση της κυτταρικής προέλευσης ενός άωρου πληθυσμού, το ποσοστό των κυττάρων που βρίσκονται σε συγκεκριμένο στάδιο του κυτταρικού κύκλου, σε φάση πολλαπλασιασμού, διαφοροποίησης, απόπτωσης κλπ. Η απομόνωση ενός επιλεγμένου αντιγονικά κυτταρικού πληθυσμού από σύνολο κυττάρων, ονομάζεται κυτταρικός διαχωρισμός και επιτυγχάνεται με ειδικά όργανα, που χρησιμοποιούν επίσης την αρχή της κυτταρομετρίας ροής και ονομάζονται κυτταροδιαχωριστές ροής (flow cell sorting). Η χρησιμότητά της μεθόδου είναι σημαντική, στην απόκτηση και περαιτέρω μελέτη καθαρών πληθυσμών κυττάρων, που ανευρίσκονται σε μικρή αναλογία σε ένα κυτταρικό εναιώρημα (αίμα, μυελός, εξιδρωματικές συλλογές κλπ). Απαραίτητη προϋπόθεση για την κυτταρομετρία ροής είναι τα κύτταρα, να βρίσκονται υπό μορφή εναιωρήματος, ώστε ένα-ένα να εστιάζονται στο σημείο ανάλυσης, όπου γίνεται η μέτρηση των διαφόρων παραμέτρων τους. Στο σημείο ανάλυσης περνούν μερικές εκατοντάδες κύτταρα ανά δευτερόλεπτο [78]. Ένας κυτταρομετρητής ροής αποτελείται από τρία τμήματα (Εικ.3.6): α) υδροδυναμικό σύστημα ροής, που επιτρέπει τη ροή των κυττάρων σε μονήρη διάταξη 75

76 β) οπτικό σύστημα, όπου ακτίνα laser προσπίπτει στην κυτταρική διάταξη και προκαλείται σκεδασμός του προσπίπτοντος φωτός. γ) ηλεκτρονικό σύστημα ανάλυσης δεδομένων, δηλαδή μετατροπής των φωτεινών σημάτων σε πληροφορίες. Εικόνα 3.6. Σχηματική απεικόνιση της οπτικής διάταξης ενός κυτταρομετρητή ροής Ηλεκτρονική μικροσκοπία διελεύσεως (Transmission Electron Microscopy) Ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διελεύσεως (ΤΕΜ) (Εικ. 3.7) χρησιμοποιεί τα διεγερμένα ηλεκτρόνια για να παρέχει μορφολογικές πληροφορίες, όπως και πληροφορίες σύνθεσης και κρυσταλλογραφικές όσον αφορά το προς ανάλυση δείγμα [79]. Το ΤΕΜ έχει τρία απαραίτητα συστήματα: α) έναν "πομπό'' ηλεκτρονίων, που παράγει την δέσμη ηλεκτρονίων, και ένα σύστημα πυκνωτή, που συγκεντρώνει την δέσμη στο αντικείμενο. β) το σύστημα αναπαράστασης της εικόνας, που αποτελείται από τους αντικειμενικούς φακούς, την κινητή φάση του δείγματος, και ενδιάμεσους φακούς, καθώς και φακούς προβολής, που συγκεντρώνουν τα ηλεκτρόνια που περνούν μέσω του δείγματος, για να σχηματίσουν μια αληθινή, υψηλά μεγεθυμένη εικόνα, και γ) το σύστημα καταγραφής της εικόνας, που μετατρέπει την ηλεκτρονική εικόνα, σε μια τύπου αποδεκτή για το ανθρώπινο μάτι. Το σύστημα αυτό συνήθως συνιστάται από μια φθορίζουσα οθόνη, για να παρατηρείται και να εστιάζεται η εικόνα, και από μια ψηφιακή κάμερα για μόνιμες καταγραφές. 76

77 Επιπρόσθετα, απαιτείται ένα σύστημα κενού, που απαρτίζεται από αντλίες και τα σχετικά τους μανόμετρα, και βαλβίδες, και παροχείς ενέργειας. Εικόνα 3.7. Τμήματα ηλεκτρονικού μικροσκοπίου διάδοσης. 77

78 3.5. Μέθοδοι χαρακτηρισμού των νανοκαψακίων Προσδιορισμός μεγέθους νανοκαψακίων Ο προσδιορισμός του μεγέθους, αλλά και της κατανομής του μεγέθους των νανοκαψακίων, που παρασκευάστηκαν, έγινε με τη μέθοδο του δυναμικού σκεδασμού του φωτός ( Dynamic Light Scattering, DLS ), κάνοντας χρήση της συσκευής Nano Z-sizer ( Malvern, UK ) (Εικ.3.8) Εικόνα 3.8. Συσκευή DLS, Nano Z-sizer ( Malvern, UK). Η διαδικασία που ακολουθείται για τη μέτρηση του μεγέθους, και συγκεκριμένα της υδροδυναμικής διαμέτρου, είναι η εξής: Το διάλυμα των νανοκαψακίων αραιώνεται με απεσταγμένο νερό (0,1 ml ncs + 0, 7 ml dh 2 O), και τοποθετείται σε ειδική κυψελίδα. Όσον αφορά τις ρυθμίσεις του οργάνου, ως δείκτης διάθλασης (Refractive Index, RI) λαμβάνεται ο δείκτης διάθλασης του νερού, για τα νανοκαψάκια που δεν περιέχουν μαγνητικούς νανοκρυστάλλους, ενώ για τα μαγνητικά νανοκαψάκια λαμβάνεται υπόψη η περιεκτικότητα τους σε μαγκεμίτη. Οι μετρήσεις λαμβάνουν χώρα στους 25 ο C, ενώ για κάθε παρτίδα πραγματοποιήθηκαν 3 μετρήσεις (των 15 επαναλήψεων) και λήφθηκε η μέση τιμή των μετρήσεων αυτών, καθώς και η μέση τιμή της τυπικής απόκλισης (PDI). 78

79 Προσδιορισμός ζ-δυναμικού νανοκαψακίων Όλα τα σωματίδια σε διαλύματα παρουσιάζουν ένα ζ-δυναμικό, ή επιφανειακό φορτίο. Ο προσδιορισμός και η γνώση του είναι κρίσιμα για την βελτιστοποίηση της διαδικασίας, και την πρόβλεψη της σταθερότητας της παρασκευής και των αλληλεπιδράσεων που μπορεί να έχει, όπως προαναφέρθηκε. Για τον προσδιορισμό του ζ-δυναμικού των νανοκαψακίων Ιξαμπεπιλόνης, που παρασκευάστηκαν, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της ηλεκτροφόρησης, επίσης με τη χρήση της συσκευής nano z-sizer και της (Malvern, UK) (Εικ.3.8). Η διαδικασία που ακολουθείται για τη μέτρηση του ζ-δυναμικού, είναι η παρακάτω: Το διάλυμα των νανοκαψακίων αραιώνεται με απεσταγμένο νερό (0,1 ml ncs + 0, 7 ml dh 2 O), και τοποθετείται σε ειδική κυψελίδα, ειδική για τη μέτρηση αυτή. Όσον αφορά τις ρυθμίσεις του οργάνου, ως δείκτης διάθλασης (Refractive Index, RI) λαμβάνεται ο δείκτης διάθλασης του νερού και για τα νανοκαψάκια που δεν περιέχουν μαγνητικούς νανοκρυστάλλους επιλέγεται η επιλογή "πολυμερές" ενώ για τα μαγνητικά νανοκαψάκια λαμβάνεται η επιλογή "μαγκεμίτη". Οι μετρήσεις λαμβάνουν χώρα στους 25 ο C. Η μέθοδος αυτή είναι καταστροφική για το δείγμα Προσδιορισμός απόδοσης νανοκαψακίων Για τον προσδιορισμό της απόδοσης των νανοκαψακίων, έγινε χρήση της τεχνικής της λυοφιλοποίησης (freeze drying), κατά την οποία : Tο δείγμα μας, συγκεκριμένου μετρημένου όγκου, σε μορφή διαλύματος, τοποθετείται σε υγρό άζωτο για ταχεία και βαθιά ψύξη. Στην πορεία τοποθετείται στον λυοφιλοποιητή, ο οποίος ενεργοποιείται για 24 h. Μετά την λυοφιλοποίηση, και όντας πλέον το δείγμα σε μορφή λυοφιλοποιημένης σκόνης, ζυγίζεται για να μετρηθεί η διαφορά μάζας, με το αρχικό διάλυμα ώστε να υπολογιστεί η απόδοση. 79

80 Η απόδοση υπολογίζεται μέσω της παρακάτω σχέσης: Προσδιορισμός φόρτωσης και ενκαψακίωσης της Ιξαμπεπιλόνης στα νανοκαψάκια Ο προσδιορισμός της φόρτωσης και την ενκαψακίωσης της Ixa στα νανοκαψάκια, στην παρούσα εργασία, γίνεται με μέτρηση της συγκέντρωσης της Ιξαμπεπιλόνης στα νανοκαψάκια., χρησιμοποιώντας την τεχνική της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (High Pressure Liquid Chromatography, HPLC). Συγκεκριμένα, παρασκευάζονται πρότυπα διαλύματα με διαδοχικές αραιώσεις ενός πρότυπου διαλύματος Ixa, διαλυμένης σε ACN:H 2 O (70:30), ώστε να επιτευχθεί η επιθύμητη συγκέντρωση, και να κατασκευαστέι η καμπύλη αναφοράς. Οι συνθήκες, που επιλέχθηκαν για την ανάλυση των δειγμάτων της Ιξαμπεπιλόνης, παρουσιάζονται στον πίνακα 3.1. Πίνακας 3.1: Συνθήκες της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης, για τον προσδιορισμό της φόρτωσης και ενκαψακίωσης των νανοκαψακίων Ιξαμπεπιλόνης. Σύσταση στατικής φάσης Στήλη Supelco C18, 15 cm x 4.6 mm, 5 μm particle size Σύσταση κινητής φάσης ACN:H 2 O (70:30) Ροής κίνητης φάσης 0,5 ml/min Χρόνος χρωματογραφημάτος 6 min Ανίχνευση 254 nm Για τον προσδιορισμό της φόρτωσης και της ενκαψακίωσης της Ιξαμπεπιλόνης, συγκεκριμένος όγκος του διαλύματος των μαγνητικών νανοκαψακίων λυοφιλοποιείται και η στερεή μάζα των νανοκαψακίων, που προκύπτει, ζυγίζεται για τον προσδιορισμό της απόδοσης, και ακολούθως επαναιωρείται σε 0,7 ml ACN και 0,3 ml d H2O. Το επαναιώρημα φιλτράρεται με τα ειδικά φίλτρα της HPLC (sartorius, RC 0,45μm), και αναλύεται χρωματογραφικά για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του φαρμάκου. 80

81 Για τον προσδιορισμό της φόρτωσης σε φάρμακο (loading) των νανοκαψακίων, χρησιμοποιείται η εξής σχέση: Ενώ για τον προσδιορισμό της ενκαψακίωσης (encapsulation efficiency) της Ixa στα νανοκαψάκια χρησιμοποιείται η ακόλουθη εξίσωση: Προσδιορισμός κολλοειδούς σταθερότητας των μαγνητικών νανοκαψακίων Η μελέτη της κολλοειδούς σταθερότητας των μαγνητικών νανοκαψακίων Ιξαμπεπιλόνης, πραγματοποιήθηκε με την παρασκευή διαφορετικών παρτίδων μαγνητικών νανοκαψακίων, χρησιμοποιώντας πολυμερή διαφορετικών αναλογιών πολύ(γαλακτικού)οξέος/πολυ(αιθυλενογλυκόλης): PLA(10)mPEG(5), PLA(20)mPEG(50 και PLA(40)mPEG(5). Οι παρτίδες αποθηκεύτηκαν σε θερμοκρασία 4-8 C και πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις του μεγέθους και του ζ- δυναμικού των νανοκαψακίων σε διάφορα χρονικά διαστήματα. Η μελέτη της κολλοειδούς σταθερότητας των μαγνητικών νανοκαψακίων πραγματοποιήθηκε σε διάρκεια ενός μήνα Προσδιορισμός σταθερότητας των μαγνητικών νανοκαψακίων σε Χλωριούχο Νάτριο Η σταθερότητα των μαγνητικών νανοκαψακίων σε ηλεκτρολύτες αξιολογήθηκε έπειτα από επώαση κενών νανοκαψακίων, με αυξανόμενες συγκεντρώσεις NaCl στους 37 C για μία ημέρα. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η παρακάτω: 100μl διαλύματος μαγνητικών νανοκαψακίων αραιώνονται με απεσταγμένο νερό Στη συνέχεια προστίθεται stock διάλυμα NaCl, συγκέντρωσης 2Μ σε τέτοιο όγκο ώστε για τελικό όγκο 1ml, οι τελικές συγκεντρώσεις του 81

82 NaCl, στο τελικό διάλυμα να είναι 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.0 και 1.8 Μ. Τα διαλύματα αυτά επωάζονται σε ανακινούμενο υδατόλουτρο σε θερμοκρασία 37 C για 24 ώρες Τελικά μετράται το μέσο μέγεθος και το ζ-δυναμικό των παραπάνω διαλυμάτων Προσδιορισμός συγκέντρωσης μαγνητικών νανοκρυστάλλων Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των μαγνητικών νανοκρυστάλλων στα μαγνητικά νανοκαψάκια Ιξαμπεπιλόνης γίνεται με την μέτρηση της απορρόφησης του συμπλόκου Fe-φαιναθρολίνης σε φασματοφωτόμετρο μοριακής απορρόφησης υπεριώδους-ορατού [80]. Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του Fe2O3 στα μαγνητικά νανοκαψάκια Ιξαμπεπιλόνης: α) σε 200μL δείγματος νανοκαψακίων γίνεται προσθήκη 200μL πυκνού υδροχλωρικού οξέος (37% w/v), ώστε να γίνει διάλυση του τριοξειδίου του σιδήρου σε ιόντα σιδήρου (Fe3 +). β) Το διάλυμα επωάζεται στους 37 C για 15 λεπτά περίπου, ώστε να διαλυθεί όλη η ποσότητα του τριοξειδίου του σιδήρου. γ) Αφού ο σίδηρος του τριοξειδίου του σιδήρου μετατραπεί σε τρισθενή σίδηρο, ακολουθεί προσθήκη 200 μl υπεροξειδίου (Η 2 Ο 2 ), (100 μl αρχικά και αφού παρατηρήσουμε αφρό, τα υπόλοιπα 100 μl), υπό θέρμανση 100 o C σε λουτρό έλαιου, και αναμονή 20 λεπτών. δ) Στην πορεία προστίθενται 100 μl υδροξυλαμίνης (100g/l), ώστε να μετατραπεί ο τρισθενής σίδηρος σε δισθενή. ε) Στη συνέχεια προστίθεται 1ml φαιναθρολίνης (1g/l) στ ) Μετά προστίθενται 1,5 ml οξικού νατρίου (1,2M, 16,4g/100ml) ζ) Το δείγμα φωτομετρείται στα 509 nm, όπου είναι το βέλτιστο μήκος κύματος για τον προσδιορισμό της απορρόφησης του συμπλόκου σιδήρου φαιναθρολίνης. Η τελική συγκέντρωση των μαγνητικών νανοκρυστάλλων στα μαγνητικά νανοκαψάκια Ιξαμπεπιλόνης προσδιορίζεται με τη βοήθεια πρότυπης καμπύλης, η οποία έχει παρασκευαστεί από τη μέτρηση της συγκέντρωσης μαγνητικών νανοκρυστάλλων σε πρότυπα διαλύματα σιδήρου. 82

83 Προσδιορισμός αποδέσμευσης Ιξαμπεπιλόνης από τα νανοκαψάκια Ο προσδιορισμός της αποδέσμευσης της Ιξαμπεπιλόνης από τα μαγνητικά νανοκαψάκια πραγματοποιείται με την τοποθέτηση συγκεκριμένου όγκου δείγματος της παρτίδας σε μεμβράνη διαπίδυσης, η οποία βρίσκεται εντός ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PB, 0,01 M, ph=7,4), σε ανακινούμενο υδατόλουτρο θερμοκρασίας 37 C. Σε τακτά και συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα (0min, 30min,1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, και 24h) 0,5ml του εξωτερικού υγρού της μεμβράνης συλλέγεται, και πραγματοποείται ανάλυση με την μέθοδο της υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC), για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της δραστικής ουσίας IXA στο εξωτερικό διάλυμα στα συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα, και της ποσόστωσης σε σχέση με την αρχική ποσότητα Ιξαμπεπιλόνης που φορτώθηκε κατά την παρασκευή των νανοκαψακίων. Ο παραπάνω προσδιορισμός πραγματοποιείται με την χρήση της καμπύλης βαθμονόμησης, η οποία προκύπτει από την ανάλυση πρότυπων δειγμάτων, τα οποία έχουν υποστεί την ίδια ακριβώς επεξεργασία με τα ''άγνωστα''. Εκτός από τον προσδιορισμό της απλής αποδέσμευσης φαρμάκου, έγινε προσδιορισμός και της αποδέσμευσης, υπό την εφαρμογή εναλλασσόμενου μαγνητικού πεδίου (διαρκείας 10 min), συχνότητας 109 khz, τάσης 28,8 V και έντασης 12,5 Α, σε χρονικά διαστήματα μιας ώρας Έλεγχος αιμοσυμβατότητας Διαφορετικές συγκεντρώσεις μαγνητικών νανοκαψακίων επωάσθηκαν με ανθρώπινο αίμα και προσδιορίστηκε μικροσκοπικά το ποσοστό αιμόλυσης των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Αιμόλυση ορίζεται ως η καταστροφή των ερυθροκυττάρων (RBCs), λόγω νόσων των RBCs (π.χ., σφαιροκυττάρωση ή δρεπανοκυτταρική νόσος) ή λόγω της έκθεσής τους σε φάρμακα, τοξίνες, τεχνητές καρδιακές βαλβίδες, αντισώματα, κάποιες λοιμώξεις ή δηλητήρια φιδιών. Όταν παρουσιάζεται, οι κυτταρικές μεμβράνες καταστρέφονται άμεσα ή μέσω λύσης που διαμεσολαβείται από αντισώματα. Τα αντισώματα του δότη στα προϊόντα του αίματος προκαλούν αιμόλυση που σχετίζεται με αντιδράσεις μετάγγισης. Τα αυτοαντισώματα αναπτύσσονται ως αποτέλεσμα νόσου (ειδ. αιματολογικών καρκίνων), σε απάντηση σε συγκεκριμένα φάρμακα (άλφα-μεθυλντόπα) ή σε Rh-αρνητικές μητέρες που φέρουν ένα Rh-θετικό έμβρυο [81]. 83

84 Όταν καταστρέφονται τα RBCs, η αιμοσφαιρίνη απελευθερώνεται στο περιβάλλον πλάσμα και χάνεται μέσω των νεφρών, καθιστώντας τα ούρα ερυθρά (αιμοσφαιρινουρία) Κυτταρικές μελέτες Τελικό στάδιο της μελέτης μας αποτέλεσε ο έλεγχος της κυτταροτοξικότητας των κυττάρων στα μαγνητικά νανοκαψάκια που συντέθηκαν με και χωρίς τη φόρτωσή τους με Ιξαμπεπιλόνη, σε σύγκριση με την τοξικότητα του ελεύθερου φαρμάκου. Για την ανώτερη διαδικασία, χρησιμοποιήθηκε η καρκινική σειρά ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων πνεύμονα A549, τα οποία κατά την καλλιέργεια τους in vitro προσκολλώνται στη φλάσκα δημιουργώντας μονοστοιβάδα Καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων Με τον όρο κυτταροκαλλιέργεια ορίζουμε, τη διατήρηση ή ανάπτυξη των κυττάρων για χρονικό διάστημα μεγαλύτερο των 24 ωρών σε ελεγχόμενες συνθήκες. Οι κυτταρικές σειρές θηλαστικών προέρχονται από καρκινικά κύτταρα, που έχουν ληφθεί κατευθείαν από τον πάσχοντα οργανισμό ή από καλλιεργούμενα κύτταρα, τα οποία έχουν υποστεί κάποια αλλαγή και συμπεριφέρονται ως καρκινικά κύτταρα (μετασχηματισμένα κύτταρα). Αυτά τα κύτταρα μπορούν να αποθηκεύονται στους -80 C για μεγάλο χρονικό διάστημα και όταν αποψυχθούν, να αναπτυχθούν ξανά. Τα κύτταρα μπορούν να αναπτυχθούν σε συνθήκες εναιωρήματος (suspension cells) ή σε συνθήκες προσκόλλησης στην επιφάνεια του δοχείου καλλιέργειας (adherent, tissue culture cells), όπως τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μεταπτυχιακή εργασία. Η παρασκευή του θρεπτικού μέσου για τα καρκινικά κύτταρα A549 γίνεται με την προσθήκη στο θρεπτικό υλικό RPMI, δύο διαλυμάτων αντιβιοτικών: διαλύματος πενικιλίνης στρεπτομυκίνης (10000 U/ 1000μg / ml (Biochrom, AG) σε ποσοστό 1% v/v και διαλύματος αμφοτερικίνης Β (2,5mg/ ml (Biochrom, AG) σε ποσοστό 0,1%. Στο διάλυμα που προκύπτει προστίθεται ορός νεογέννητου βοός (Fetal Bovine Serum, FBS, Biochrom, AG) σε ποσοστό 10%, ο οποίος πριν προστεθεί είχε απενεργοποιηθεί με θέρμανση του σε υδατόλουτρο στους 56 C για 30 λεπτά. 84

85 Τα κύτταρα ανά δύο με τρεις μέρες χρειάζονται αλλαγή θρεπτικού. Πιο συγκεκριμένα, αρχικά απομακρύνεται το παλιό θρεπτικό υλικό, έπειτα πραγματοποιούνται δύο πλύσεις με 5 ml διάλυμα φωσφορικών και τέλος προστίθεται 10 ml καινούργιο θρεπτικό υλικό. Όταν τα κύτταρα κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας καλύψουν το 80-90% της επιφάνειας της φλάσκας, τότε είναι αναγκαία η αποκόλλησή τους από τη φλάσκα με τον εξής τρόπο: Απομάκρυνση του θρεπτικού υλικού από τη φλάσκα. Πλύσεις της φλάσκας με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) δύο φορές, ώστε να απομακρυνθεί όλο το θρεπτικό υλικό. Προσθήκη στα κύτταρα, που είναι προσκολλημένα στην επιφάνεια, 0,25% θρυψίνης και τοποθέτηση της φλάσκας στον κλίβανο στους 37 C για 5 λεπτά μέχρι να αποκολληθούν τα κύτταρα από την επιφάνεια. Προσθήκη 3 ml θρεπτικού υλικού στη φλάσκα για να απενεργοποιηθεί η θρυψίνη. Συλλογή του θρεπτικού με τα κύτταρα από την φλάσκα, και φυγοκέντρηση στις 1600 rpm για 6 λεπτά. Ρήψη του υπερκειμένου και αναδιάλυση του ιζήματος σε 6-8 ml θρεπτικό. Τοποθέτηση κλασμάτων από το παραπάνω διάλυμα σε φλάσκες (75 cm 2 ). Όλες οι διαδικασίες έγιναν σε άσηπτες συνθήκες σε εστία νηματικής ροής (hood).τα κύτταρα επωάστηκαν σε κλίβανο σε περιβάλλον 37 C, με υγρασία και 5% CO 2. Τα Α549 καρκινικά κύτταρα διπλασιάζονται ταχέως, οπότε η ανακαλλιέργεια τους γίνεται περίπου κάθε 4-6 μέρες. Ο αριθμός των κυττάρων στη φλάσκα δεν πρέπει να ξεπερνάει τα 7*10 4 κύτταρα / cm Μέτρηση κυττάρων Το αιμοκυτταρόμετρο είναι μια τροποποιημένη αντικειμενοφόρος πλάκα (Neubauer), που έχει δύο κατάλληλα επεξεργασμένες λείες επιφάνειες (Εικ. 3.9). Κάθε μια από αυτές έχει ένα τετραγωνισμένο πλέγμα, το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα με μήκος πλευράς 1 mm (εμβαδόν 1 mm 2 ). Κάθε τετράγωνο ορίζεται από παράλληλες γραμμές, των οποίων η μεταξύ απόσταση είναι 2,5 μm, που χρησιμεύουν για να καθοριστεί εάν τα κύτταρα βρίσκονται μέσα ή έξω από το πλέγμα. Κάθε ένα από τα αρχικά τετράγωνα έχει επιπλέον διαβαθμίσεις, για να διευκολύνεται η μέτρηση των κυττάρων. Το επίπεδο του πλέγματος βρίσκεται 0,1 mm χαμηλότερα από δυο προεξοχές στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Υπάρχει μια κοίλη επιφάνεια μεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισμένης γυαλισμένης επιφάνειας και των σημείων όπου στηρίζεται η καλυπτρίδα. Στην 85

86 κοίλη αυτή επιφάνεια τοποθετείται το κυτταρικό εναιώρημα και με τριχοειδικά φαινόμενα απλώνεται στην τετραγωνισμένη επιφάνεια. Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήματος που θα καλύπτει ένα από εννέα τετράγωνα είναι 0,1 mm 3 (1,0 mm 2 = επιφάνεια x 0,1 mm= βάθος) ή 1 x 10-4 ml. Εικόνα 3.9 Πλάκα Neubauer Η μέτρηση των κυττάρων γίνεται στις τέσσερις αντιδιαμετρικές περιοχές της πλάκας Neubauer (Eικ. 3.9) και η συγκέντρωση των κυττάρων στο αρχικό εναιώρημα ανά ml υπολογίζεται από τον τύπο: C cell (Αριθμός κυττάρων/4) x 10 4 κύτταρα/ml, και ακολουθεί αναγωγή στον όγκο του κυτταρικού διαλύματος [82]. Πριν προβούμε στη μέτρηση των κυττάρων κάνουμε έλεγχο της βιωσιμότητάς τους με trypan blue. Συγκεκριμένα, προσθέτουμε 10μl από το κυτταρικό μας εναιώρημα σε 10μl trypan blue και τα μεταφέρουμε στο αιμοκυτταρόμετρο Neubauer. Το πλήθος των χρωματισμένων με μπλε χρώμα κυττάρων αποτελεί τα νεκρά κύτταρα. Ο χρωματισμός τους οφείλεται στο ότι η χρωστική εισχωρεί στο εσωτερικό τους λόγω ασυνέχειας της κυτταρικής μεμβράνης και βάφει τα ενδοκυττάρια συστατικά Μελέτη in vitro αντικαρκινικής δραστικότητας των νανοκαψακίων ιξαμπεπιλόνης Η μελέτη της κυτταροτοξικότητας, που προκαλεί η Ιξαμπεπιλόνη, τα μαγνητικά νανοκαψάκια και τα φορτωμένα με Ιξαμπεπιλόνη μαγνητικά νανοκαψάκια, σε καρκινικά κύτταρα (Α549), πραγματοποιήθηκε ύστερα από επώαση των κυττάρων 86

87 στον κλίβανο για 24 ώρες ώστε τα κύτταρα να προσκολληθούν στην επιφάνεια των well plates. Αμέσως μετά προστέθηκαν στα κύτταρα συγκεκριμένες ποσότητες από Ιξαμπεπιλόνη, κενά μαγνητικά νανοκαψάκια, και φορτωμένα μαγνητικά νανοκαψάκια και αφέθηκαν για επώαση για 48 ώρες στους 37 C, με υγρασία και 5% CO 2 (συνθήκες κλίβανου). Οι συγκεντρώσεις Ιξαμπεπιλόνης βασίστηκαν στο IC 50 του φαρμάκου, δηλαδή στην μισή μέγιστη ανασταλτική συγκέντρωση (half maximal inhibitory concentration. Ακολούθως οι συγκεντρώσεις των νανοκαψακίων που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τέτοιες ώστε να δημιουργούν ίδιες συγκεντρώσεις ιξαμπιπιλόνης με αυτές που χρησιμοποιήθηκαν στην μελέτη της ελεύθερης ιξαμπεπιλόνης. Μετά το τέλος της επώασης, ακολούθησε ο προσδιορισμός της νέκρωσης των κυττάρων μέσω της τεχνικής της κυτταρομετρίας ροής. Αναλυτικότερα, για την εκτίμηση του ποσοστού νέκρωσης των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε το ιωδιούχο προπίδιο. Το ιωδιούχο προπίδιο (propidium iodide, PI) είναι ένα μόριο, το οποίο φθορίζει, όταν δεσμεύεται με το DNA. Ωστόσο δεν είναι διαπερατό στα υγιή κύτταρα, αλλά μπορεί και εισέρχεται μόνο στα νεκρά. Επομένως, χρησιμοποιείται ευρέως ως δείκτης νέκρωσης κυττάρων [83]. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε για τον έλεγχο κυτταροτοξικότητας, είναι η εξής: με την ολοκλήρωση της επώασης των κυττάρων, απομακρύνεται το θρεπτικό υλικό από τα wells, το οποίο περιέχει και τις προς μελέτη για κυτταροτοξικότητα ουσίες. πραγματοποιείται πλύση των κυττάρων, που είναι προσκολλημένα στην επιφάνεια, με διάλυμα φωσφορικών. προστίθεται θρυψίνη και μεταφέρονται στον κλίβανο για 2 λεπτά. προστίθεται θρεπτικό για απενεργοποίηση της θρυψίνης. μεταφέρονται σε ειδικά σωληνάρια για τον κυτταρομετρητή ροής (facs tubes) πραγματοποιείται φυγοκέντρηση σε 1600 rpm για 5 λεπτά απορρίπτεται το υπερκείμενο, και αναδιαλύονται σε 3 ml διαλύματος φωσφωρικών. πραγματοποιείται πάλι φυγοκέντρηση σε 1600 rpm για 5 λεπτά (επανάληψη πλύσης) απορρίπτεται το υπερκείμενο και προστίθονται στο ίζημα 5 μl ιωδιούχου προπιδίου από αρχικό διάλυμα 1 mg/1 ml. προστίθεται 1 ml διαλύματος φωσφωρικών και φυγοκεντρούνται σε 1600 rpm για 5 λεπτά. απορρίπτεται το υπερκείμενο και ανασυστάται το ίζημα σε 400 μl διαλύματος φωσφωρικών. 87

88 μετράται το ποσοστό των νεκρών κυττάρων στον κυτταρομετρητή ροής. Τα κενά μαγνητικά νανοκαψάκια εκτιμώνται ως κυτταροσυμβατά, στην περίπτωση που σκοτώνουν μικρό ποσοστό των κυττάρων. 88

89 4. Πειραματικά αποτελέσματα 4.1. Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των νανοκαψακίων Κατά την σύνθεση των μαγνητικών νανοκαψακίων, χρησιμοποιήθηκαν τρείς διαφορετικοί τύποι συμπολυμερών, τα οποία διέφεραν ως προς το μήκος των συστάδων PLA. Με αυτόν τον τρόπο εξετάστηκε η επίδραση της σύνθεσης του συμπολυμερούς στις φυσικοχημικές ιδιότητες των νανοκαψακίων και στις ιδιότητες φόρτωσης με φάρμακο και αποδέσμευσης 'Ελεγχος του μεγέθους και του ζ-δυναμικού των νανοκαψακίων Η σύνθεση νανοκαψακίων από διαφορετικού μοριακού βάρους συμπολυμερή επιδρά σημαντικά στο τελικό μέγεθος των νανοκαψακίων, όπως διαπιστώθηκε μετά από μετρήσεις με την μέθοδο της δυναμικής σκέδασης του φωτός, (DLS) (Γράφημα 4.1,4.2 Πίνακας 4.1). Γράφημα 4.1. Κατανομή υδροδυναμικών διαμέτρων, για τα PLA-PEG/IXA νανοκαψάκια: PLA(10)-PEG(5), PLA(20)-PEG(5), PLA(40)-PEG(5). 89

90 average size (nm) Πίνακας 4.1. Μέσο μέγεθος και δείκτης πολυδιασποράς των νανοκαψακίων. Mag ncs:μαγνητικά νανοκαψάκια, Blank ncs:κενά νανοκαψάκια, Ixa ncs:νανοκαψάκια Ιξαμπεπιλόνης. Νανοκαψάκια PLA(10)mPEG(5) blank ncs PLA(10)mPEG(5) mag ncs PLA(10)mPEG(5) ixa ncs PLA(20)mPEG(5) blank ncs PLA(20)mPEG(5) mag ncs PLA(20)mPEG(5) ixa ncs PLA(40)mPEG(5) blank ncs PLA(40)mPEG(5) mag ncs PLA(40)mPEG(5) ixa ncs Υδροδυναμική διάμετρος d, (nm) Δείκτης πολυδιασποράς, PDI 256 ± 39,5 0,196 ± 0, ± 44,7 0,327 ± 0, ± 34,8 0,259 ± 0, ± 60,3 0,281 ± 0, ± 49,3 0,330 ± 0, ± 84,3 0,298 ± 0, ± 42,4 0,268 ± 0, ± 19,5 0,438 ± 0, ± 13,1 0,279 ± 0, PLA(10)mPEG(5)ncs PLA(20)mPEG(5)ncs PLA(40)mPEG(5)ncs blank mag blank mag IXA sample (PLA(10) PEG(5), PLA(20)PEG(5), PLA(40)PEG(5)) Γράφημα 4.2. Διαφοροποίηση μέσου μέγεθους των νανοκαψακίων, μετά την προσθήκη μαγνητικών νανοκρυστάλλων και Ιξαμπεπιλόνης. 90

91 Παρατηρείται ότι (Πίνακας 4.1, Γράφημα 4.2): Tα νανοκαψάκια, που παρασκευάστηκαν από το πολυμερές με το χαμηλότερο μοριακό βάρος της συστάδας PLA (PLA(10)mPEG(5) ncs) εμφανίζουν το μικρότερο μέσο μέγεθος, ενώ τα νανοκαψάκια, που παρασκευάστηκαν από το υψηλότερου μοριακού βάρους PLA, πολυμερές, (PLA(40)mPEG(5) ncs) εμφανίζουν αρκετά μεγαλύτερο μέγεθος. Είναι πιθανό, ότι τα μεγαλύτερου μοριακού μεγέθους συμπολυμερή σχηματίζουν παχύτερες μεμβράνες («κελύφη»), λόγω μεγαλύτερου μοριακού όγκου. Παρατηρείται επίσης, ότι η εγκαψακίωση των μαγνητικών νανοκρυστάλλων και του φαρμάκου, οδηγεί σε μικρή αύξηση του μεγέθους των λαμβανομένων νανοκαψακίων. O δείκτης πολυδιασποράς, (PDI), είναι σχετικά χαμηλός, και δείχνει ότι η μέθοδος παρασκευής αποδίδει νανοκαψάκια με στενή κατανομή μεγεθών. Αντίθετα, η σύνθεση του συμπολυμερούς δεν επιδρά σημαντικά, στο ζ- δυναμικό των νανοκαψακίων, όπως διαπιστώθηκε μετά από μετρήσεις, με την μέθοδο της δυναμικής σκέδασης του φωτός, (DLS) (Γράφημα 4.3.,4.4., Πίνακας 4.2 ). Οι χαμηλές τιμές του ζ-δυναμικού, κάτω από -10mV, που παρατηρήθηκαν, επιτρέπουν την πρόβλεψη καλής κολλοειδούς σταθερότητας, λόγω του υψηλού ενεργειακού φράγματος μεταξύ των σωματιδίων. Γράφημα 4.3. Κατανομή ζ-δυναμικού, για τα PLA-PEG/IXA νανοκαψάκια, PLA(10)-PEG(5), PLA(20)-PEG(5), PLA(40)-PEG(5). 91

92 zeta potential (mv) Πίνακας 4.2. Μέσο ζ-δυναμικό των νανοκαψακίων. Mag ncs:μαγνητικά νανοκαψάκια, Blank ncs:κενά νανοκαψάκια, Ixa ncs:νανοκαψάκια Ιξαμπεπιλόνης. Νανοκαψάκια ζ-δυναμικό, (mv) PLA(10)mPEG(5) blank ncs PLA(10)mPEG(5) mag ncs PLA(10)mPEG(5) ixa ncs PLA(20)mPEG(5) blank ncs PLA(20)mPEG(5) mag ncs PLA(20)mPEG(5) ixa ncs PLA(40)mPEG(5) blank ncs PLA(40)mPEG(5) mag ncs PLA(40)mPEG(5) ixa ncs -18,8 ± 0,9-22,5 ± 9,8-38,5 ± 13,7-20,1 ± 2,3-25,3 ± 18,4-28,9 ± 19,9-19,9 ± 11,6-23,4 ± 19,8-37,4 ± 9, PLA(10)mPEG(5) PLA(20)mPEG(5) PLA(40)mPEG(5) blank mag blank mag IXA sample (PLA(10)mPEG(5), PLA(20)mPEG(5), PLA(40)mPEG(5)) Γράφημα 4.4. Τιμές ζ-δυναμικού νανοκαψακίων, μετά την προσθήκη μαγνητικών νανοκρυστάλλων και Ιξαμπεπιλόνης. 92

93 hydrodynamic diameter (nm) Έλεγχος κολλοειδούς σταθερότητας των μαγνητικών νανοκαψακίων Η σταθερότητα των μαγνητικών νανοκαψακίων εξετάστηκε στο χρόνο, και παρουσία Χλωριούχου Νατρίου (NaCl), σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, συμπεριλαμβανομένης και της συγκέντρωσης, στην οποία βρίσκεται φυσιολογικά στο αίμα, η οποία μετρήθηκε στα 0,135 Μ, ώστε να εξασφαλιστεί η ασφαλής, πιθανή in vivo χορήγηση των νανοκαψακίων. Πραγματοποιήθηκαν, λοιπόν, επαναλαμβανόμενες μετρήσεις της υδροδυναμικής διαμέτρου και του ζ-δυναμικού των υβριδίων, που συντέθηκαν σε χρονικό βάθος 30 ημερών καθώς και μετρήσεις μεγέθους ζ-δυναμικού, παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων Xλωριούχου Nατρίου μέχρι 2 M. Σύμφωνα με τις μετρήσεις DLS που έγιναν (Γραφήματα 4.5, 4.6, 4.7), υφίσταται μεγάλη σταθερότητα της υδροδυναμικής διαμέτρου και της κατανομής του μεγέθους, και του επιφανειακού φορτίου, όλων των τύπων των μαγνητικών υβριδίων που παρασκευάστηκαν, σε χρονικό διάστημα τουλάχιστον ενός μήνα. Όπως παρατηρήσαμε και στην προηγούμενη ενότητα, η παρασκευή νανοκαψακίων από διαφορετικού μοριακού βάρους συμπολυμερή επιδρά σημαντικά στο τελικό μέγεθος των νανοκαψακίων, όπως και το ζ-δυναμικό τους, κάτι το οποίο και όταν αποθηκεύονται με τη μορφή διασποράς, σε απεσταγμένο νερό, στους 4-8 C για ένα μήνα PLA(10)mPEG(5) ncs PLA(20)mPEG(5) ncs PLA(40)mPEG(5) ncs time (days) Γράφημα 4.5. Μεταβολή του μέσου μεγέθους των νανοκαψακίων, μετά από αποθήκευση τους στους 4-8 C για 30 ημέρες 93

94 zeta potential (mv) PDI 1,0 0,9 0,8 PLA(10)mPEG(5) ncs PLA(20)mPEG(5) ncs PLA(40)mPEG(5) ncs 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, time (days) Γράφημα 4.6. Μεταβολή του δείκτη πολυδιασποράς των νανοκαψακίων, μετά από αποθήκευση τους στους 4-8 C για 30 ημέρες 0-10 PLA(10)mPEG(5) ncs PLA(20)mPEG(5) ncs PLA(40)mPEG(5) ncs time (days) Γράφημα 4.7. Μεταβολή του ζ-δυναμικού των νανοκαψακίων, μετά από αποθήκευση τους στους 4-8 C για 30 ημέρες Σε επόμενο στάδιο εξετάστηκε η σταθερότητα των μαγνητικών νανοφορέων παρουσία Χλωριούχου Νατρίου, όπως προαναφέρθηκε, οπότε και πραγματοποιήθηκαν επιπλέον μετρήσεις της υδροδυναμικής διαμέτρου και του επιφανειακού φορτίου των νανοκαψακίων, παρουσία αυξανόμενων 94

95 συγκεντρώσεων Χλωριούχου Νατρίου (ΝaCl), καθώς το ανθρώπινο αίμα περιέχει χλωριούχο νάτριο συγκέντρωσης περίπου 0,135 Μ. Για τον λόγο αυτό, έγινε μελέτη σταθερότητας συμπεριλαμβανομένων και συγκεντρώσεων υψηλότερων της φυσιολογικής, προκειμένου να έχουμε αυξημένη βεβαιότητα ότι η χορήγηση τους είναι ασφαλής (δεν συμβαίνει συσσωμάτωση των νανοκαψακίων όταν ευρεθούν στο αίμα) Τα δείγματα επωάστηκαν, μετά την προσθήκη των αντίστοιχων συγκεντρώσεων NaCl, για 24 ώρες στους 37 C, και κατόπιν μετρήθηκαν το μέγεθος και το ζ- δυναμικό (Γράφημα 4.8). Παρατηρήθηκε υψηλή κολλειδής σταθερότητα των νανοκαψακίων ακόμη και σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις NaCl, η οποία μπορεί να αποδοθεί στην στερεοχημική σταθεροποίηση των νανοκαψακίων από τις αλυσίδες PEG στην επιφάνεια των νανοκαψακίων. Συγκεκριμένα, η σταθερότητα σε αρκετά υψηλές τιμές της συγκέντρωσης NaCl αποδεικνύει και την πυκνότητα των αλυσιδών PEG στα νανοκαψάκια. Η λειτουργία στερεοχημικής σταθεροποίησης, και όχι ηλεκτροστατικής, υποστηρίζεται από το γεγονός πως παρά την ελάττωση των αρνητικών τιμών ζ-δυναμικού, που προσεγγίζουν το μηδέν, παρουσία NaCl, δεν έχουμε συσσωμάτωση των νανοκαψακίων. Παρατηρείται μόνο μία μικρή τάση αύξησης του μεγέθους στα νανοκαψάκια που έχουν συντεθεί με το συμπολυμερές PLA(40)mPEG(5), που ίσως οφείλεται σε μικρότερη στερεοχημική σταθεροποίηση των νανοκαψακίων από το συμπολυμερές αυτό που έχει την μικρότερη αναλογία PEG/PLA από τα τρία συμπολυμερή που χρησιμοποιήθηκασν στην παρούσα μελέτη, λαμβανομένου υπόψη ότι η στερεοχημικη σταθεροποίηση των νανοκαψακίων οφείλεται στην PEG. 95

96 zeta potential (mv) sizes (nm) PLA(10)-mPEG(5) ncs PLA(20)-mPEG(5) ncs PLA(40)-mPEG(5) ncs ,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 C NaCl (M) 6 3 PLA(10)mPEG(5)ncs PLA(20)mPEG(5)ncs PLA(40)mPEG(5)ncs ,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 C (NaCl) (M) Γράφημα 4.8. Επίδραση της παρουσίας Χλωριούχου Νατρίου στην υδροδυναμική διαμέτρο και το ζ-δυναμικό των μαγνητικών νανοκαψακίων. 96

97 'Ελεγχος μορφολογίας μέσω ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διελεύσεως Μετά τη σύνθεση των νανοκαψακίων πραγματοποιήθηκε παρατήρηση τους, αλλά και αποτύπωση των εικόνων, τόσο για τα μαγνητικά νανοκαψάκια (Εικ.4.1) (PLA(20)mPEG(5) mag ncs), για να γίνει επιβεβαίωση της ενκαψακίωσης των μαγνητικών νανοκρυστάλλων, όσο και για τα κενά (PLA(20)mPEG(5) blank ncs)(εικ. 4.2), με την τεχνική της αρνητικής χρώσης, ώστε να είναι εμφανές το σφαιρικό σχήμα, που τα χαρακτηρίζει. Εικόνα 4.1. Απεικόνιση μαγνητικών νανοκαψακίων (PLA(20)mPEG(5)mag ncs), μέσω ΤΕΜ. 97

98 Εικόνα 4.2. Απεικόνιση κενών νανοκαψακίων (PLA(20)mPEG(5)blank ncs), με την τεχνική της αρνητικήςχρώσης (negative staining), μέσω ΤΕΜ. Όπως αποτυπώθηκε και στην φωτογραφία (Εικ.4.1), οι μαγνητικοί νανοκρύσταλλοι του τριοξειδίου του σιδήρου έχουν ενκαψακιωθεί στα νανοκαψάκια. Το εξωτερικό πολυμερικό περίβλημα φαίνεται σαν σκιά, λόγω της πολύ έντονης αντίθεσης σε σχέση με τους μαγνητικούς νανοκρυστάλλους. Επίσης, οι παραπάνω φωτογραφίες ταυτοποιούν την αναμενόμενη σφαιρική μορφολογία των νανοκαψακίων, καθώς και συμφωνούν με το μέγεθος που έχει προσδιοριστεί μέσω της δυναμικής σκέδασης του φωτός. Με την μέθοδο του TEM ελέγχθηκε επίσης και η μορφολογία και το μέγεθος των μαγνητικών νανοκρυστάλλων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρασκευή των νανοκαψακίων (Εικ. 4.3), το οποίο είναι της τάξης των 7 nm. Εικόνα 4.3. Απεικόνιση μαγνητικών νανοκρυστάλλων, μέσω ΤΕΜ. 98

99 Απόδοση λυοφιλοποιημένων δειγμάτων ncs % Έλεγχος της απόδοσης κατά την παρασκευή των νανοκαψακίων Πραγματοποιήθηκε έλεγχος της απόδοσης των νανοκαψακίων, μετά την παρασκευή τους, με την μέθοδο της λυοφιλοποίησης, δηλαδή την διαδικασία αφυδάτωσης παγωμένων δειγμάτων, σε συνθήκες κενού, και την μετέπειτα ζύγιση τους. Ο προσδιορισμός της απόδοσης έγινε λοιπόν, σε νανοκαψάκια παρασκευασμένα από τρία συμπολυμερή διαφορετικού μοριακού βάρους, στα οποία έχουν προστεθεί μαγνητικοί νανοκρύσταλλοι ή/και Ιξαμπεπιλόνη Blank Ncs Mag Blank Ncs IXA Mag Nc PLA(10)PEG(5) PLA(20)PEG(5) PLA(40)PEG(5) Nanocapsule samples Γράφημα 4.9. Συγκριτικό γράφημα της απόδοσης των Νανοκαψακίων, από διαφορετικού Μ.Β. πολυμερή, παρουσία και απουσία Ιξαμπεπιλόνης, και μαγνητικών νανοκρυστάλλων. Όπως παρατηρείται και στο γράφημα, η απόδοση κυμαίνεται μεταξύ 60% και 80%, με τα νανοκαψάκια που έχουν παρασκευαστεί από το μεγαλύτερο μοριακού βάρους συμπολυμερές τα νανοκαψάκια που έχουν παρασκευαστεί από το μεγαλύτερο μοριακού βάρους συμπολυμερές PLA(40)PEG(5), να έχουν λίγο υψηλότερη απόδοση. H αύξηση του μοριακού βάρους της συστάδας PLA στο συμπολυμερές, και συνεπώς η ελλάτωση της υδατοδιαλυτότητας του πολυμερούς, οδηγεί σε αύξηση της απόδοσης της παρασκευής των νανοκαψακίων. Η παρουσία 99

100 των μαγνητικών νανοκρυστάλλων ή του φαρμάκου δεν φαίνεται να επηρεάζει την απόδοση της παρασκευής των νανοκαψακίων Φόρτωση μαγνητικών νανοκρυστάλλων στα νανοκαψάκια Η ποσότητα των μαγνητικών νανοκρυστάλλων, που ενκαψακιώνονται στα υβριδικά νανοκαψάκια, προσδιορίζεται μέσω του υπολογισμού της συγκέντρωσης του τριοξειδίου του σιδήρου (Fe 2 O 3 ), καθώς και της ποσότητας στοιχειακού σιδήρου (Fe) στο τελικό διάλυμα των νανοκαψακίων. Στον πίνακα 4.3., που ακολουθεί, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα για τις τρείς διαφορετικές συνθέσεις νανοκαψακίων. Με βάση τα αποτελέσματα που λήφθηκαν, η εγκαψακίωση των μαγνητικών νανοκρυστάλλων ήταν ικανοποιητική, κυμαινόμενη μεταξύ 40% και 56%. Πίνακας 4 3. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης τριοξειδίου του σιδήρου και στοιχειακού σιδήρου στα Μαγνητικά Νανοκαψάκια Φόρτωση και ενκαψακίωση Ιξαμπεπιλόνης στα νανοκαψάκια Η φόρτωση των νανοκαψακίων με την δραστική ουσία, Ιξαμπεπιλόνη, έγινε κατά την διάρκεια της παρασκευής των νανοκαψακίων. Η τελική φόρτωση 100