Νανοσωματίδια χρυσού για την στοχευμένη χορήγηση πακλιταξέλης σε καρκινικούς όγκους

Transcript

1 Πανεπιστήμιο Πατρών Τμήματα Χημείας, Ιατρικής και Φαρμακευτικής ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων» ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Νανοσωματίδια χρυσού για την στοχευμένη χορήγηση πακλιταξέλης σε καρκινικούς όγκους Αρβανίτη Αγγελική, Χημικός Επιβλέπων: Κωνσταντίνος Αυγουστάκης, Καθηγητής ΠΑΤΡΑ, 2018

2

3 University of Patras Department of Chemistry, Pharmacy and Medicine POSTGRADUATE PROGRAM «Medicinal Chemistry: Drug Discovery and Design» MASTER S THESIS Gold nanoparticles for tumor-targeted delivery of paclitaxel Angeliki Arvaniti, Chemist Supervisor: Konstantinos Avgoustakis, Professor Patras, 2018

4

5 Επιβλέπων: Κωνσταντίνος Αυγουστάκης, Καθηγητής Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή: Κωνσταντίνος Αυγουστάκης, Καθηγητής Παύλος Κλεπετσάνης, Επίκουρος Καθηγητής Χατζηαντωνίου Σοφία, Επίκουρη Καθηγήτρια Supervisor: Konstantinos Avgoustakis, Professor Examiners Committee: Konstantinos Avgoustakis, Professor Pavlos Klepetsanis, Assistant Professor Sofia Chatziantoniou, Assistant Professor

6 ... Αρβανίτη Αγγελική Χημικός Copyright Αρβανίτη Αγγελική, 2018 Με επιφύλαξη παντός δικαιώματος - All rights reserved Απαγορεύεται η αντιγραφή, αποθήκευση και διανομή της παρούσας εργασίας, εξ ολοκλήρου ή τμήματος αυτής, για εμπορικό σκοπό. Επιτρέπεται η ανατύπωση, αποθήκευση και διανομή για σκοπό μη κερδοσκοπικό, εκπαιδευτικής ή ερευνητικής φύσης, υπό την προϋπόθεση να αναφέρεται η πηγή προέλευσης και να διατηρείται το παρόν μήνυμα. Ερωτήματα που αφορούν τη χρήση της εργασίας για κερδοσκοπικό σκοπό πρέπει να απευθύνονται προς τον συγγραφέα. Οι απόψεις και τα συμπεράσματα που περιέχονται σε αυτό το έγγραφο εκφράζουν τον συγγραφέα και δεν πρέπει να ερμηνευθεί ότι αντιπροσωπεύουν τις επίσημες θέσεις του Πανεπιστημίου Πατρών.

7 Το πόνημά μου αφιερώνεται στους γονείς μου, Ζωή και Τάκη και σε όλους όσους ήταν δίπλα μου

8

9 Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Φαρμακευτικής Τεχνολογίας, του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών στα πλαίσια του Διατμηματικού Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών «Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων». Καθώς ολοκληρώνεται η συγγραφή της, μου δίνεται η ευκαιρία να εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όλους όσους με βοήθησαν για να την πραγματοποιήσω. Ευχαριστώ θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Κωνσταντίνο Αυγουστάκη, καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για το πολύ ενδιαφέρον και καινοτόμο θέμα που μου εμπιστεύτηκε με την παρούσα διπλωματική. Η εμπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπό μου και η καθοδήγηση και υποστήριξη που μου προσέφερε υπήρξαν καθοριστικής σημασίας για την επιτυχή ολοκλήρωση της εργασίας μου. Ευχαριστώ επίσης τους επίκουρους καθηγητές του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, κ. Παύλο Κλεπετσάνη και κα. Σοφία Χατζηαντωνίου για την τιμή που μου έκαναν να αποτελέσουν μέλη της τριμελούς μου επιτροπής και για τις επιστημονικές τους υποδείξεις. Επιπλέον ευχαριστώ την Αθηνά Λιασκώνη, διπλωματούχο μεταπτυχιακού τίτλου ειδίκευσης για τη συμβολή στην διεκπεραίωση της εργασίας μου στο πειραματικό στάδιο. Πολλά ευχαριστώ οφείλω στην κάτοχο διδακτορικού τίτλου ειδίκευσης, Ευσταθία Βούλγαρη και την ερευνήτρια Αθηνά Αγγελοπούλου, για την καθοδήγηση που μου παρείχαν κατά τη διάρκεια της διπλωματικής μου εργασίας. Οι κατευθύνσεις που μου έδωσαν και η υπομονή τους αποτέλεσαν πολύτιμη βοήθεια για εμένα. i

10 Παράλληλα θέλω να εκφράσω τις ευχαριστίες μου και στα μέλη του Εργαστηρίου Φαρμακευτικής Τεχνολογίας με τα οποία μοιραστήκαμε τον ίδιο εργαστηριακό χώρο και ειδικότερα στις Χριστίνα Γιαννούλη, Λυγερή Παπαιωάννου, Νικολέττα Νομικού, Αγγελική Λιακοπούλου και Ελένη Γιαννή. Η συνύπαρξη και η αλληλεπίδραση μαζί τους δημιουργούσε καθημερινά ένα ευχάριστο κλίμα. Φυσικά δεν θα μπορούσα να παραλείψω τους φίλους μου Έλενα Ζήκου, Αφροδίτη Χαμαλάκη και Ανδρέα Σταμελάκη για την ηθική συμπαράσταση, κατανόηση και υποστήριξη της προσπάθειας μου με κάθε τρόπο. Τέλος, το πιο μεγάλο ευχαριστώ ανήκει δικαιωματικά στους γονείς μου, Τάκη Αρβανίτη και Ζωή Καρατσαπή, που με εμπιστεύονται, με στηρίζουν στην υλοποίηση κάθε στόχου, θέτουν ως προτεραιότητα τα όνειρά μου και πιστεύουν σε εμένα, καθώς και στον αγαπημένο αδερφό μου, Διονύση, για την αδιάλειπτη παρουσία στα εύκολα και στα δύσκολα. Ήταν πάντα δίπλα μου σε όλη τη διάρκεια των φοιτητικών μου χρόνων, υποστηρίζοντας και ενθαρρύνοντας κάθε βήμα μου. ii

11 Περίληψη Η πακλιταξέλη (PTX), μέλος της οικογένειας των ταξανίων, είναι ένας από τους πιο χρήσιμους και αποτελεσματικούς αντινεοπλασματικούς παράγοντες για τη θεραπεία πολλών μορφών προχωρημένων και ανθεκτικών καρκίνων. Η επιτυχία της PTX σε αυτές τις ασθένειες οφείλεται στις μοναδικές ιδιότητές της όπως ευρύ φάσμα αντικαρκινικής δράσης, αποτελεσματικότητα τόσο στους συμπαγείς όσο και στους μεταστατικούς όγκους και ιδιαίτερο μηχανισμό δράσης. Αυτό το φάρμακο έχει παίξει κρίσιμο ρόλο στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών και του μαστού, ακόμη και ως μεμονωμένος παράγοντας ενώ παράλληλα έχει σημειώσει σημαντική πρόοδο στη θεραπεία ασθενών με μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Ωστόσο, οι σημαντικές παρενέργειες που παρουσιάζονται από το συμβατικό τρόπο χορήγησης της πακλιταξέλης έχουν οδηγήσει στην εισαγωγή της σε Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης (DDS). Τα συγκεκριμένα συστήματα επιτρέπουν την εκλεκτική μεταφορά του φαρμάκου στον καρκινικό ιστό με μηχανισμούς παθητικής ή ενεργητικής στόχευσης, καθώς και τον έλεγχο του φαρμακοκινητικού προφίλ. Πρόσφατα, έχουν αναπτυχθεί εναλλακτικές μορφές χορήγησής της μέσω νανοδομών, ικανές να ξεπεράσουν αυτούς τους περιορισμούς. Ιδιαίτερα ελπιδοφόρα φαίνεται να είναι η ενσωμάτωση της PTX σε νανοσωματίδια χρυσού. Τα νανοσωματίδια χρυσού διαθέτουν εύκολα ελεγχόμενη επιφανειακή χημεία επιτρέποντας τη τροποποίησή τους, προκειμένου να καταστούν λειτουργικά, με διάφορα βιολογικά μόρια για την αποφυγή ανίχνευσης από το ανοσοποιητικό σύστημα, τη βελτίωση της σταθερότητας τους, τη στόχευση όγκων και τη διέλευση βιοφυσικών φραγμών. Η δυνατότητα τροποποίησης της επιφάνειας των νανοσωματιδίων χρυσού παρέχει τη δυνατότητα εγκλωβισμού σε αυτά πολλαπλών θεραπευτικών παραγόντων ή βιομακρομορίων μέσω ομοιοπολικής ή μη σύνδεσης στην επιφάνειά τους. Παράλληλα μπορεί να επιτευχθεί ειδική κυτταρική σύνδεση όταν μόρια ενεργούς στόχευσης, όπως το φυλλικό οξύ, συνδεθούν στην επιφάνεια των νανοφορέων. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκε φόρτωση της πακλιταξέλης σε νανοσωματιδία χρυσού σταθεροποιημένα με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ και τροποποιημένα με φυλλικό οξύ (AuNP MOA FA), με σκοπό την αποδέσμευση του φαρμάκου εκλεκτικά σε καρκινικούς όγκους που υπερεκφράζουν υποδοχείς φυλλικού iii

12 οξέος. Η παρασκευή υδατοδιαλυτών νανοσωματιδίων χρυσού που προστατεύονται από μονοστοιβάδες (AuNP-MOA) πραγματοποιήθηκε με αναγωγή του HAuCl 4 από ισχυρό αναγωγικό παράγοντα (βοροϋδρίδιο του νατρίου, NaBH 4 ) παρουσία μορίων με ομάδες θειόλης (μερκαπταοκτανοϊκό οξύ, ΜΟΑ), γνωστή και ως Brust-Schiffrin μέθοδος. Η επιλογή του διλειτουργικού συνδέτη (μερκαπτοοκτανοϊκό οξύ, ΜΟΑ), ως προστατευτικού παράγοντα, παρέχει αρκετά πλεονεκτήματα. Η ομάδα θειόλης δρα ως παράγοντας σταθεροποίησης του πυρήνα του χρυσού λόγω του ισχυρού χημικού δεσμού που σχηματίζεται μεταξύ του χρυσού και του θείου (S-Au), ενώ οι καρβοξυλικές ομάδες μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν ως πεδίο σύζευξης με μόρια στόχευσης μέσω δεσμών εστέρα ή αμιδίου, Στη συνέχεια διεξήχθη σύνδεση με μόριο βιολογικού σηματοδότη (φυλλικό οξύ, FA) που αποτελεί έναν ευρέως χρησιμοποιούμενο υδρόφιλο συνδέτη για στόχευση του υποδοχέα φυλλικού οξέος των καρκινικών κυττάρων. Ειδικότερα η βιο-στόχευση επιτεύχθηκε με σύζευξη των καρβοξυλομάδων της τελικής αλυσίδας των νανοσωματιδίων χρυσού με το φυλλικό οξύ, ενισχύοντας την υδροφιλικότητα των νανοσωματιδίων και να προσδίδοντας τους ικανότητα επιλεκτικής στόχευση όγκων. Πιο συγκεκριμένα έγινε σύνθεση νανοσωματιδίων χρυσού με τη μέθοδο Brust-Schiffrin των οποίων η επιφάνεια στη συνέχεια τροποποιήθηκε με φυλλικό οξύ. Η σύνδεση των υποκαταστατών στα νανοσωματίδια χρυσού επιβεβαιώθηκε ποιοτικά και προσδιορίστηκε ποσοτικά με φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό. Επιπλέον, εξετάστηκε η σταθερότητα των διασπορών πριν και μετά τη σύνδεση του φυλλικού οξέος παρουσία ηλεκτρολυτών (NaCl) με μέτρηση της υδροδυναμικής διαμέτρου και του επιφανειακού φορτίου, χρησιμοποιώντας την τεχνική της δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS). Ακολούθησε μορφολογική εκτίμηση των διασπορών με τη βοήθεια ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διάδοσης (ΤΕΜ). Σε επόμενο στάδιο, μετρήθηκε φασματοφωτομετρικά το ποσοστό φόρτωσης της ΡΤΧ στα τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού και πραγματοποιήθηκε μελέτη αποδέσμευσης σε διάλυμα φωσφορικών αλάτων (ph =7.4) στους 37 C για 48 h. Τέλος, εξετάστηκε η κυτταροτοξικότητα των «φορτωμένων» (με ΡΤΧ) νανοσωματιδίων χρυσού και συγκρίθηκε με εκείνη των «κενών» νανοφορέων, αλλά και του φαρμάκου. Ο έλεγχος αυτός πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ΜΤΤ στις καρκινικές σειρές MDA-MB 231 και MCF-7, από τις οποίες η πρώτη εκφράζει υποδοχείς φυλλικού οξέος ενώ η δεύτερη όχι. iv

13 Τα σταθεροποιημένα με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματίδια χρυσού (AuNP MOA) είχαν με βάση το ΤΕΜ εύρος μεγέθους 4,76-14,82 nm και με βάση τις μελέτες αντίστασης στην επαγόμενη από ηλεκτρολύτη συσσωμάτωση δεν εμφάνισαν επαρκή κολλοειδή σταθερότητα. Τα τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού (ΑuNP MOA FA) είχαν με βάση το ΤΕΜ εύρος μεγέθους 5,02 18,23 nm και εμφάνισαν υψηλή κολλοειδή σταθερότητα παρουσία ηλεκτρολυτών. Η ικανότητα φόρτωσης πακλιταξέλης στα νανοσωματίδια χρυσού (AuNP MOA FA) ήταν 5,49%±0,13 w/w για θεωρητική φόρτωση 9,09% και μπορεί να θεωρηθεί ικανοποιητική. Οι συγκεκριμένοι νανοφορείς παρουσίασαν παρατεταμένη αποδέσμευση (Controlled Drug Release) του φαρμάκου σε συνθήκες που προσομοιάζουν τις βιολογικές (ph = 7.4) με μία απελευθέρωση της τάξης 80% σε 48 ώρες. Τα νανοσωματίδια χρυσού χωρίς πακλιταξέλη (blank ΑuNPs) δεν παρουσίασαν κυτταροτοξικότητα και στις δύο καρκινικές σειρές, μόνο στις μεγάλες συγκεντρώσεις εμφάνισαν μικρή τοξικότητα στα MCF7. Τα «φορτωμένα» με φάρμακο νανοσωματίδια χρυσού προκάλεσαν μεγαλύτερη τοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα και από το ελεύθερο φάρμακο, ιδιαίτερα στις υψηλές συγκεντρώσεις του φαρμάκου. Τα παραπάνω αποτελέσματα δικαιολογούν την περαιτέρω διερεύνηση της πιθανής χρησιμοποίησης των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (ΑuNP MOA FA) ως φορείς στοχευμένης χορήγησης της Πακλιταξέλης. Λέξεις κλειδιά: ελεγχόμενη αποδέσμευση φαρμάκων, νανοσωματίδια χρυσού, φυλλικό οξύ, πακλιταξέλη, καρκίνος v

14 vi

15 Summary Paclitaxel (PTX), a member of taxane family, is one of the most useful and effective antineoplastic agents for treatment of many forms of advanced and refractory cancers. The success of PTX in these diseases has been due to its singular properties: a broad spectrum of antitumor activity, effectiveness on both solid and disseminated tumors and a unique mechanism of action. This drug has played a crucial role in the treatment of ovarian and breast cancer, even as a single agent whereas has also made important progress in the treatment of patients with lung cancer. However, the significant side effects produced by the conventional method delivery of PTX have led to its formulation in Targetable Drug Delivery Systems (TDDS). These systems allow selective delivery of drug in the tumor tissue by passive or active targeting mechanisms and control of the pharmacokinetic profile. Recently, alternative PTX nanoformulations have been developed to minimize or overcome these limitations. Particularly promising appears to be the encapsulation of PTX in gold nanoparticles. Gold nanoparticles possess easily controllable surface chemistry allowing functionalization with various biologically useful molecules to help evade immune detection and improve stability, tumor-targeting, and crossing of biophysical barriers. The ability to modify the surface of gold nanoparticles offer the diversity to incorporate multiple therapeutic drugs or biomacromolecules by covalent or non-covalent conjugation on their surface. Simultaneously, specific cell binding can be achieved when active targeting molecules, such as folic acid, are attached to the gold surface. The aim of this study was the synthesis of paclitaxel-loaded stabilized with mercaptooctanoic acid and functionalized with folic acid gold nanoparticles (AuNP MOA FA) in order to release their drug load selectively to tumors overexpressing the folate receptor. The synthesis of water soluble gold nanoparticles protected by monolayers (AuNP- MOA) was performed by gold reduction with a strong reducing agent (NaBH 4 ) in the presence of thiol capped molecules, known as Brust-Schiffrin method. The choice of bifunctional mercaptoalkanoic acid molecules, such as mercaptooctanoic acid, as a ligand provides several advantages. The thiol group acts as a gold core stabilizing agent because of the strong chemical bond formed between the gold and sulfur (S-Au), while the carboxylic acid groups provide water solubility to the gold nanoparticle and can also vii

16 be utilized as a conjugation domain with targeting molecules via ester or amide couplings. Conjugation was then performed with a biological signal molecule (folic acid, FA), a widely used hydrophilic ligand for drug-conjugate targeted therapeutics. Biotargeting of these nanoparticles was achieved by coupling the end chain carboxyl groups with folic acid in order to enhance hydrophilicity and impart selective tumor targeting. Specifically, gold nanoparticles were synthesized with the Brust-Schiffrin method and their surface was then modified with folic acid. The ligands binding in gold nanoparticles was qualitatively confirmed and quantitatively determined by UVspectrophotometer. In addition, the colloidal stability of dispersions before and after the binding of folic acid in an electrolyte solution (NaCl) was evaluated by measuring their hydrodynamic diameter and surface charge using the Dynamic Light Scattering (DLS). Then, the morphological characteristics of both dispersions were evaluated by transmission electron microscopy (TEM). In the next step, the Paclitaxel loading was determined with UV-spectrophotometer and release study was conducted in phosphate buffer (ph = 7.4) at 37 C for 48 h. Finally, the cytotoxicity of drug-loaded (with PTX) gold nanoparticles was tested and compared to that of blank (without drug) nanocarriers and free drug. This test was performed by the MTT chemosensitivity assay on the MDA-MB 231 and MCF-7 cancer cell lines. The former expresses folic acid receptors while the latter does not. The stabilized with mercapto-octanoic acid gold nanoparticles (AuNP MOA) were in the range of size between nm by TEM analysis and did not show sufficient colloidal stability based on the electrolyte-induced aggregation resistance studies. The functionalized with folic acid gold nanoparticles (AuNP MOA FA) were in the range of size between nm by TEM analysis and exhibited high colloidal stability in the presence of the electrolyte. The loading of PTX in gold nanoparticles (AuNP MOA FA) was measured to be 5.49% ± 0.13 w / w for a theoretical loading of 9.09% and can be considered satisfactory. These specific nanocarriers exhibited controlled release properties under conditions similar to biological (ph = 7.4) with a release rate of 80% in 48 hours. «Blank» gold nanoparticles did not exhibit cytotoxicity in both cancer lines. Only at high concentrations they showed low toxicity in MCF7. Τhe drug-loaded nanoparticles caused higher toxicity than the free drug, particularly at high drug concentrations. These results justify further investigation of the functionalized with folic viii

17 acid gold nanoparticles (AuNP MOA FA) as controlled drug delivery systems of Paclitaxel. Key words: controlled drug delivery systems, gold nanoparticles, folic acid, paclitaxel, cancer ix

18 x

19 Πίνακας Συντμήσεων Σύντμηση Ονομασία ΑCN AuNP MOA AuNP MOA FA CDDs DCM dh 2 O DLS DMSO EDC EPR EtOH FA HAuCl 4 K 2 HPO 4 KH 2 PO 4 MOA NaBH 4 NaCl NaOH NHS PTX TEM WHO Ακετονιτρίλιο Νανοσωματίδια χρυσού τα οποία έχουν σταθεροποιηθεί με 8- μερκαπτοοκτανοϊκό οξύ Νανοσωματίδια χρυσού τα οποία έχουν σταθεροποιηθεί με 8- μερκαπτοοκτανοϊκό οξύ και σταθεροποιηθεί με φυλλικό οξύ Συστήματα Ελεγχόμενης Χορήγησης Φαρμάκων Διχλωρομεθάνιο Απεσταγμένο νερό Δυναμικός Σκεδασμός του φωτός Διμεθυλοσουλφοξείδιο 1-αιθυλ-3-(3-διμεθυλαμινοπροπυλ) καρβοδιϊμίδιο Φαινόμενο Ενισχυμένης Διαπερατότητας και Συγκράτησης Αιθανόλη Φυλλικό οξύ Τετραχλωροχρυσικό οξύ Όξινο φωσφορικό κάλιο Δισόξινο φωσφορικό κάλιο 8-μερκαπτοοκτανοϊκό οξύ Βοροϋδρίδιο του νατρίου Χλωριούχο νάτριο Υδροξείδιο του νατρίου Ν-υδροξυσουξινιμίδιο Πακλιταξέλη Ηλεκτρονικό Μικροσκόπιο Διέλευσης Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας xi

20 Πίνακας περιεχομένων Ευχαριστίες... i Περίληψη... iii Summary... vii Πίνακας Συντμήσεων... xi Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 1 Α.1. Θεωρία Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης στη Φαρμακευτική Επιστήμη... 1 Α.1.1. Εισαγωγή... 1 Α.1.2. Κατηγορίες Συστημάτων Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης... 8 Α.2. Νανοφορείς A.2.1. Εισαγωγή Α.2.2. Κατηγορίες Νανοφορέων Α.2.3. Φυσικοχημικά Χαρακτηριστικά Νανοφορέων Α.3. Νανοσωματίδια Χρυσού A.3.1. Εισαγωγή A.3.2. Φαρμακευτική-Θεραπευτική χρήση του χρυσού δια μέσου των αιώνων A.3.3. Ιδιότητες νανοσωματιδίων χρυσού A.3.4. Μέθοδοι σύνθεσης νανοσωματιδίων χρυσού A.3.5. Νανοσωματίδια χρυσού ως οχήματα παράδοσης φαρμάκων- μέθοδοι φόρτωσης και αποδέσμευσης θεραπευτικών μέσων A.3.6. Νανοσωματίδια χρυσού και Καρκίνος Α.4. Φυλλικό οξύ A.4.1. Εισαγωγή A.4.2. Μεταβολισμός φυλλικού οξέος A.4.3. Υποδοχείς φυλλικού οξέος και καρκίνος Α.5. Πακλιταξέλη Α.5.1. Ανακάλυψη πακλιταξέλης Α.5.2 Ιδιότητες πακλιταξέλης Α.5.3. Μηχανισμός δράσης Α.5.4. Κλινικές εφαρμογές Χορήγηση Β. ΣΚΟΠΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ xii

21 Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Γ.1. Αντιδραστήρια Γ.2. Χρησιμοποιούμενα Όργανα Γ.3. Διαλύματα- Διεργασίες Γ.4. Τεχνικές Χαρακτηρισμού Γ.4.1. Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (ΤΕΜ) Γ.4.2. Φασματοφωτομετρία Ορατού-Υπεριώδους Γ.4.3. Δυναμική Σκέδαση Φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS) Γ.4.4. Ηλεκτροφορητική σκέδαση φωτός (Electrophoretic Light Scattering, ELS) Γ.5. Σύνθεση τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού Γ.5.1. Σύνθεση νανοσωματιδίων χρυσού ( AuNP MOA) Γ.5.2. Απομάκρυνση περίσσειας ΜΟΑ από τα νανοσωματίδια χρυσού (AuΝP MOA) Γ.5.3. Παρασκευή διαλύματος νανοσωματιδίων χρυσού (AuΝP MOA) συγκέντρωσης 1 mg/ml Γ.5.4. Σύνδεση φυλλικού οξέος στα νανοσωματίδια χρυσού (παρασκευή διαλύματος AuΝP MOA FA συγκέντρωσης 1mg/ml) Γ.6. Χαρακτηρισμός των σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (Transmission Electron Microscopy, TEM) Γ.7. Χαρακτηρισμός των σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) με την τεχνική του Δυναμικού Σκεδασμού του Φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS) Γ.8. Έλεγχος της σταθερότητας των σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού παρουσία ηλεκτρολυτών Γ.9. Φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός φυλλικού οξέος (FA) στα νανοσωματίδια χρυσού (ΑuMOA FA) Γ.9.1. Έλεγχος της σύνδεσης του φυλλικού οξέος στα νανοσωματίδια χρυσού Γ.9.2. Ποσοτικός προσδιορισμός της περιεκτικότητας φυλλικού οξέος στα νανοσωματίδια χρυσού Γ.10. Χαρακτηρισμός των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (Transmission Electron Microscopy, TEM) Γ.11. Χαρακτηρισμός των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού με την τεχνική του Δυναμικού Σκεδασμού του Φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS) Γ.12. Προσδιορισμός της απόδοσης των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού Γ.13. Έλεγχος της σταθερότητας των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού παρουσία ηλεκτρολυτών xiii

22 Γ.14. Μελέτη των παραμέτρων της φόρτωσης και αποδέσμευσης Πακλιταξέλης (PTX) από τα τροποποιήμενα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού Γ.14.1 Διαδικασία φόρτωσης της πακλιταξέλης σε τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού Γ Προσδιορισμός φόρτωσης της πακλιταξέλης σε τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού Γ Μελέτη αποδέσμευσης της πακλιταξέλης από τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού Γ.15. Μελέτες Κυτταροτοξικότητας Δ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Δ.1. Μορφολογία, φυσικοχημικά χαρασκτηριστικά και μελέτη σταθερότητας σε NaCl των σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA). 147 Δ.2. Μορφολογία και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA-FA) Δ.3. Μελέτη σταθερότητας σε NaCl των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA FA) Δ.4. Φόρτωση Πακλιταξέλης σε τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού (AuNP MOA FA) Δ.5. Απελευθέρωση πακλιταξέλης από τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού (AuNP MOA FA) Δ.6. Κυτταρικές Μελέτες Ε. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ xiv

23 xv

24 xvi

25 Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α.1. Θεωρία Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης στη Φαρμακευτική Επιστήμη Η επιστήμη της ελεγχόμενης αποδέσμευσης φαρμάκων αντιπροσωπεύει έναν από τους ταχύτερα αναπτυσσόμενους τομείς της επιστήμης με σημαντική συμβολή στην φαρμακοθεραπεία. Αυτά τα συστήματα, τα οποία προσφέρουν πολλά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τα συμβατικά φάρμακα, αναλύονται σε αυτό το κεφάλαιο. Α.1.1. Εισαγωγή Κάθε ουσία ή μίγμα ουσιών, που παράγεται, προσφέρεται προς πώληση, ή παρουσιάζεται για χρήση στη διάγνωση, στη θεραπεία, στον μετριασμό ή στην πρόληψη νόσου, μη φυσιολογικής φυσικής κατάστασης, ή των συμπτωμάτων τους στον άνθρωπο ή στα ζώα καθώς και για χρήση στην αποκατάσταση, την διόρθωση, ή την μεταβολή οργανικών λειτουργιών στον άνθρωπο ή τα ζώα χαρακτηρίζεται ως φάρμακο σύμφωνα με τον ορισμό του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (WHO) [1]. 1

26 Ένα σύστημα χορήγησης φαρμάκου ορίζεται ως η σύνθεση ή η συσκευή που επιτρέπει την εισαγωγή μιας θεραπευτικής ουσίας στο σώμα και βελτιώνει την αποτελεσματικότητα και την ασφάλεια της, ελέγχοντας τον ρυθμό, τον χρόνο και τον τόπο απελευθέρωσης του φαρμάκου στο σώμα. Αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει τη χορήγηση του θεραπευτικού προϊόντος, την απελευθέρωση των δραστικών συστατικών από το προϊόν και την επακόλουθη μεταφορά του δραστικού συστατικού κατά μήκος της βιολογικής μεμβράνης στην θέση δράσης [2]. Το ιδανικό σύστημα χορήγησης φαρμάκου φέρει τα εξής χαρακτηριστικά [2], [3] : Επιτρέπει τον έλεγχο του μεγέθους και του σχήματος του συστήματος χορήγησης. Έχει μηχανική αντοχή. Είναι βιοσυμβατό, μη τοξικό, μη ανοσογονικό. Διαθέτει ικανότητα υψηλού εγκλεισμού του φαρμάκου. Επιτυγχάνει κατάλληλη κυτταρική προσκόλληση, ενδοκυττάρωση και ενδοκυτταρική διακίνηση ώστε να επιτραπεί η απελευθέρωση της δραστικής ουσίας. Διαθέτει αποδεκτή βιολογική αποικοδόμηση ή βιοαποικοδόμηση. Πραγματοποιεί ελεγχόμενη ή ενεργοποιούμενη απελευθέρωση φαρμάκου. Προσφέρει προστασία του φαρμάκου από την αδρανοποίηση. Στερείται προσμίξεων και είναι απλό στην σύνθεση και παραγωγή του. Για πολλές δεκαετίες η θεραπευτική αγωγή μιας οξείας ή χρόνιας ασθένειας βασιζόταν κυρίως στην συχνή λήψη φαρμάκων από τους ασθενείς σε διάφορες φαρμακομορφές όπως ταμπλέτες, κάψουλες, χάπια, κρέμες, σιρόπια, υπόθετα και ενέσεις. Ακόμη και σήμερα τα συμβατικά αυτά συστήματα μεταφοράς φαρμάκων φαίνεται να κυριαρχούν στην αγορά. Παρόλα αυτά, για να επιτευχθεί αλλά και να διατηρηθεί η συγκέντρωση του φαρμάκου στον οργανισμό μέσα στα απαραίτητα θεραπευτικά επίπεδα, είναι συχνά απαραίτητη η λήψη των παραπάνω φαρμάκων πολλές φορές την ημέρα. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα μια ανεπιθύμητη αυξομείωση στα επίπεδα του φαρμάκου στο αίμα [4]. Ένα ιδανικό δοσολογικό σχήμα στη φαρμακευτική θεραπεία οποιασδήποτε ασθένειας είναι αυτό που επιτυγχάνει γρήγορα την επιθυμητή θεραπευτική συγκέντρωση του φαρμάκου στο πλάσμα και τη διατηρεί σταθερή για όλη τη διάρκεια της θεραπείας. Αυτό είναι δυνατό μέσω της χορήγησης συμβατικών μορφών δοσολογίας σε μία 2

27 συγκεκριμένη δόση και συχνότητα. Η συχνότητα χορήγησης ή το διάστημα δόσης οποιουδήποτε φαρμάκου εξαρτάται από το χρόνο ημιζωής του ή τον μέσο χρόνο παραμονής καθώς και από τον θεραπευτικό του δείκτη. Όμως σε πολλές περιπτώσεις, το μεσοδιάστημα χορήγησης είναι πολύ μικρότερο από το χρόνο ημιζωής του φαρμάκου, με αποτέλεσμα την εμφάνιση κάποιων περιορισμών [5]. Τα κυριότερα μειονεκτήματα των συμβατικών συστημάτων χορήγησης φαρμάκου είναι τα εξής [6], [7], [8] : 1. Απαιτείται συχνή χορήγηση φαρμάκου. 2. Εμφανίζουν αδυναμία αποτελεσματικού ελέγχου των επιπέδων του φαρμάκου στο αίμα. 3. Δημιουργούν δυσκολία συμμόρφωσης των ασθενών. Εικόνα Α.1.1: Διάγραμμα στο οποίο απεικονίζεται η συγκέντρωση του φαρμάκου στο πλάσμα συναρτήσει του χρόνου ύστερα από απλή και πολλαπλή δόση συμβατικού συστήματος χορήγησης φαρμάκου. Για να επιτευχθούν και να διατηρηθούν θεραπευτικά αποτελεσματικές συγκεντρώσεις στο πλάσμα, χρειάζονται αρκετές δόσεις ημερησίως, οι οποίες μπορεί να προκαλέσουν σημαντικές διακυμάνσεις στα επίπεδα πλάσματος. Λόγω αυτών των διακυμάνσεων το επίπεδο του 3

28 φαρμάκου θα μπορούσε να πέσει κάτω από την ελάχιστη αποτελεσματική συγκέντρωση (MEC) ή να υπερβεί την ελάχιστη τοξική συγκέντρωση (MTC). Τέτοιες διακυμάνσεις οδηγούν σε ανεπιθύμητες παρενέργειες ή ελάττωση του θεραπευτικού οφέλους για τον ασθενή [9]. Τα παραπάνω μειονεκτήματα οδήγησαν στην ανάπτυξη των συστημάτων ελεγχόμενης αποδέσμευσης, τα οποία στοχεύουν στην βελτιστοποίηση της φαρμακοθεραπείας και της ποιότητας ζωής των ασθενών. Ο τομέας της ελεγχόμενης απελευθέρωσης άρχισε στις αρχές της δεκαετίας του 1950 με την ανάπτυξη πολυμερικών συστημάτων που ήταν ικανά να απελευθερώνουν φάρμακα με συγκεκριμένο ρυθμό με χορήγηση δια του στόματος [10], [11], [12], [13]. Η ελεγχόμενη απελευθέρωση μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε τομείς όπως τα καλλυντικά, τα φυτοφάρμακα, η γεωργία, τα φαρμακευτικά προϊόντα και η επιστήμη των τροφίμων. Το συμβατικό σύστημα απελευθέρωσης (π.χ. δισκία, κάψουλες κ.λπ.) απελευθερώνει το φάρμακο πολύ γρήγορα όταν χορηγείται στο σώμα, με αποτέλεσμα μια απότομη αύξηση της συγκέντρωσης του φαρμάκου στην κυκλοφορία του αίματος και γρήγορη μείωση σε σύντομο χρονικό διάστημα. Αυτό οδηγεί στην ανάγκη για επανειλημμένη δόση προκειμένου να διατηρηθεί η συγκέντρωση του φαρμάκου στην περιοχή επιθυμητού εύρους. Αυτή η αυξομείωση του επιπέδου του φαρμάκου στο πλάσμα μπορεί να είναι τοξική και / ή να έχει ως αποτέλεσμα ελαττωμένη αποτελεσματικότητα του φαρμάκου. Η συχνή χορήγηση του φαρμάκου μπορεί επίσης να προκαλέσει δυσκολία συμμόρφωσης στους ασθενείς. Αντίθετα, τα συστήματα ελεγχόμενης απελευθέρωσης έχουν σχεδιαστεί για να βελτιώνουν την κινητική απελευθέρωσης του φαρμάκου και έτσι την ασφάλεια και την αποτελεσματικότητα της φαρμακευτικής θεραπείας. Σε αυτά η ποσότητα του φαρμάκου στην κυκλοφορία του αίματος αρχικά αυξάνεται και στη συνέχεια παραμένει σταθερή στην αποτελεσματική περιοχή, μεταξύ των ελάχιστων αποτελεσματικών και των μέγιστων επιθυμητών επιπέδων, με παρατεταμένο τρόπο, όπως απεικονίζεται στην Eικόνα Α.1.2 [14], [15], [16]. 4

29 Εικόνα Α.1.2: Διάγραμμα στο οποίο απεικονίζονται τα επίπεδα φαρμάκου στο πλάσμα συναρτήσει του χρόνου. Η μπλε διακεκομμένη καμπύλη αναφέρεται στην απελευθέρωση φαρμάκου από ένα συμβατικό σύστημα αποδέσμευσης ύστερα από πολλαπλή χορήγηση ενώ η κόκκινη συνεχής καμπύλη για ένα σύστημα ελεγχόμενης απελευθέρωσης μετά από απλή χορήγηση [17]. Τα συστήματα ελεγχόμενης αποδέσμευσης (CDDS) σχεδιάζονται για την ενίσχυση της φαρμακευτικής θεραπείας. Υπάρχουν πολλά κίνητρα για την ανάπτυξή τους, τα οποία μπορεί να εξαρτώνται από το εκάστοτε φάρμακο. Τα συστήματα αυτά έχουν σχεδιαστεί για να επιτρέπουν καλύτερο έλεγχο της έκθεσης του φαρμάκου με την πάροδο του χρόνου [18] έτσι ώστε να οδηγούν σε σχετικά σταθερές συγκεντρώσεις φαρμάκου στο πλάσμα ανεξάρτητα από το βιολογικό περιβάλλον της εφαρμογής [19]. Παράλληλα βοηθούν το φάρμακο στη διέλευση των φυσιολογικών φραγμών, το προστατεύουν από την πρόωρη αποβολή/αποικοδόμηση και το οδηγούν στην επιθυμητή θέση δράσης καθώς ελαχιστοποιούν την έκθεσή του σε άλλα μέρη του σώματος. Επίσης συμβάλλουν στην αύξηση της συμμόρφωσης του ασθενούς μειώνοντας τη συχνότητα χορήγησης και προσθέτουν εμπορική αξία στα φάρμακα που διατίθενται στην αγορά διευρύνοντας την προστασία των ευρεσιτεχνιών. Τέλος, η χρήση τεχνολογίας ελεγχόμενης αποδέσμευσης μπορεί να μειώσει τη μεταβλητότητα της δράσης των φαρμάκων [18]. 5

30 Η δημιουργία των CDDS χορηγούμενων ενδοφλεβίως προϋποθέτει τον εγκλεισμό μίας φαρμακευτικής ουσίας σε ένα μη τοξικό, βιοσυμβατό και ει δυνατόν βιοαποικοδομήσιμο φορέα, ο οποίος θα χαρακτηρίζεται από παρατεταμένη παραμονή στη γενική κυκλοφορία (stealth system) και εκλεκτική συσσώρευση στο όργανο - στόχο με σκοπό την εκλεκτική αποδέσμευση του φαρμάκου στην πάσχουσα περιοχή. Στα συστήματα αυτά, εκτός από το φάρμακο, μπορούν να ενσωματωθούν και άλλα λειτουργικά συστατικά, τα οποία είτε θα συμβάλλουν στη στοχευμένη χορήγηση, είτε θα επιτρέψουν την ανίχνευσή τους από διάφορες φασματοσκοπικές ή άλλες μεθόδους. Ένα τέτοιο σύστημα παρουσιάζεται στην Εικόνα Α.1.3. Διαθέτει ένα αδρανές και υδρόφιλο κέλυφος, το οποίο θα το προστατεύει, αλλά συγχρόνως θα προσφέρει σταθερότητα σε βιολογικά συστήματα και μακρούς χρόνους κυκλοφορίας στο καρδιαγγειακό σύστημα. Επιπλέον, μπορούν να χρησιμοποιηθούν κάποιες φθορίζουσες ουσίες, καθιστώντας εφικτή την ανίχνευση των συστημάτων στο σώμα, καθώς και κάποια βιοαποκρινόμενα στοιχεία, προκειμένου η αποδέσμευση του φαρμάκου να μπορεί να αποκρίνεται σε βιολογικά ερεθίσματα. Τέλος, το συγκεκριμένο σύστημα περιλαμβάνει ομάδα στόχευσης (targeting ligand), π.χ. ένα αντίσωμα, η οποία βοηθά στην εκλεκτική συσσώρευση του συστήματος στον ιστό στόχο και διευκολύνει την ενδοκυττάρωση του από τα κύτταρα στόχο. Μπορεί όμως το σύστημα να διαθέτει και μαγνητικό υλικό για μαγνητική στόχευση [20]. Εικόνα Α.1.3: Απεικόνιση ενός πολυλειτουργικού μαγνητικού νανοφορέα [20]. 6

31 Τα πλεονεκτήματα των συστημάτων ελεγχόμενης αποδέσμευσης είναι [2], [8], [21], [22], [23] : Ελεγχόμενη χορήγηση μιας θεραπευτικής δόσης με επιθυμητό ρυθμό απελευθέρωσης. Διατήρηση της συγκέντρωσης του φαρμάκου εντός ενός βέλτιστου θεραπευτικού εύρους για παρατεταμένη διάρκεια της θεραπείας. Λιγότερη συσσώρευση του δραστικού παράγοντα στον οργανισμό και ελαχιστοποίηση της συσσώρευσης του φαρμάκου μετά από χρόνια χορήγηση. Μεγιστοποίηση της σχέσης αποτελεσματικότητας-δόσης. Ελαχιστοποίηση ή εξάλειψη των ανεπιθύμητων παρενεργειών. Προστασία του δραστικού παράγοντα από πιθανή αποικοδόμηση και απενεργοποίηση από το σώμα. Οικονομία του δραστικού παράγοντα. Ελαχιστοποίηση της ανάγκης για συχνή λήψη δόσης. Συνεχής θεραπεία, χωρίς νυκτερινή χορήγηση. Βελτίωση της συμμόρφωσης των ασθενών. Βελτιωμένη βιοδιαθεσιμότητα ορισμένων φαρμάκων. Μειωμένη διακύμανση της συγκέντρωσης του φαρμάκου στο πλάσμα του αίματος με αποτέλεσμα την επίτευξη σχετικά σταθερών συγκεντρώσεων για παρατεταμένο χρόνο. Αύξηση της αποτελεσματικότητας και την αξιοπιστίας της θεραπείας λόγω της παρατεταμένης αποδέσμευσης του φαρμάκου. Μείωση της τοξικότητας. Παρά τα σημαντικά πλεονεκτήματά της, η μέθοδος ελεγχόμενης αποδέσμευσης κατά την εφαρμογή της στην φαρμακευτική, εμφανίζει και κάποια μειονεκτήματα τα κυριότερα των οποίων είναι [2], [21], [24], [25], [26] : Δυσκολία (αδυναμία) ταχείας διακοπής της φαρμακολογικής δράσης σε περίπτωση δηλητηρίασης ή δυσανεξίας. Κίνδυνος συσσώρευσης φαρμάκου σε περίπτωση βραδείας αποβολής. Αύξηση πιθανότητας να συμβεί μεταβολισμός πρώτης διόδου (χορήγηση από το στόμα). 7

32 Αδύνατη ή μηδενική αποτελεσματικότητα σε περίπτωση δυσκολίας απορρόφησης του φαρμάκου. Δυσκολία προσαρμογής της δοσολογίας σε διαφορετικές φαρμακοκινητικές ιδιότητες. Εξάρτηση της κινητικής απελευθέρωσης του φαρμάκου από την ακεραιότητα της μορφής δοσολογίας. Ελαττωμένη βιοδιαθεσιμότητα σε ορισμένες περιπτώσεις. Υψηλότερο κόστος σε σύγκριση με τα συμβατικά φαρμακευτικά σκευάσματα καθώς τα υλικά, οι διαδικασίες και ο εξοπλισμός που απαιτούνται για την παρασκευή τους κοστίζουν περισσότερο. Αυξημένος κίνδυνος τοξικότητας και μη βιοσυμβατότητας του φορέα. Καθυστέρηση στην έναρξη δράσης του φαρμάκου η οποία μπορεί να επιβραδύνει το θεραπευτικό αποτέλεσμα και να επιμηκύνει τυχόν παρενέργειες. Α.1.2. Κατηγορίες Συστημάτων Ελεγχόμενης Αποδέσμευσης Με βάση το μηχανισμό λειτουργίας τους τα συστήματα ελεγχόμενης αποδέσμευσης φαρμάκου (CDDSs) μπορούν να ταξινομηθούν ως εξής [27] : 1. Συστήματα προκαθορισμένου ρυθμού αποδέσμευσης. 2. Συστήματα ενεργοποιούμενης αποδέσμευσης. 3. Συστήματα αποδέσμευσης φαρμάκου που ρυθμίζονται από μηχανισμό ανάδρασης. 4. Συστήματα στόχευσης. 8

33 Εικόνα Α.1.4: Κατηγορίες συστημάτων ελεγχόμενης αποδέσμευσης [28]. Α Συστήματα προκαθορισμένου ρυθμού αποδέσμευσης Σε αυτή την κατηγορία συστημάτων ελεγχόμενης αποδέσμευσης η απελευθέρωση των μορίων της δραστικής ουσίας έχει προκαθοριστεί ώστε να γίνεται με συγκεκριμένο ρυθμό. Αυτό επιτυγχάνεται με τον κατάλληλο σχεδιασμό του συστήματος, κατά τον οποίο ο ρυθμός αποδέσμευσης της εγκλωβισμένης ουσίας ελέγχεται από την διάχυση της τελευταίας ή τη διείσδυση του διαλύτη (μέσο εμβάπτισης). Για την ρύθμιση της διάχυσης ακολουθούνται οι νόμοι του Fick. Τα ελεγχόμενα μέσω διάχυσης συστήματα διαχωρίζονται στα συστήματα δεξαμενής (reservoir) και μήτρας (matrix) [22]. Το σύστημα δεξαμενής είναι ένα από τα πιο κοινά ελεγχόμενα συστήματα χορήγησης φαρμάκων μέχρι σήμερα. Aυτά τα συστήματα αποτελούνται από τον πυρήνα, ο οποίος περιέχει τη δραστική ουσία, και από την πολυμερική μεμβράνη που περιβάλλει τον πυρήνα. Το φάρμακο διαχέεται από την εσωτερική στην εξωτερική στοιβάδα του πολυμερούς λόγω της διαφοράς συγκέντρωσης.ο ρυθμός απελευθέρωσης του 9

34 φαρμάκου εξαρτάται από τις ιδιότητες του πολυμερούς (π.χ. σύνθεση, μοριακό βάρος), το πάχος της μεμβράνης και τις φυσικοχημικές ιδιότητες του φαρμάκου, όπως η διαλυτότητα, το μέγεθος των σωματιδίων και το μοριακό βάρος [29], [30]. Όταν το σύστημα τοποθετηθεί σε ένα μέσο εμβάπτισης απαιτείται κάποιο χρονικό διάστημα προκειμένου να επέλθει ισορροπία και μπορεί να παρατηρηθεί ένας χρόνος καθυστέρησης (Lag time) ή αντίθετα μία ξαφνική απελευθέρωση μεγάλης ποσότητας του φαρμάκου (Burst effect). Συνεχή σταθερή μεταφορά κατά μήκος της μεμβράνης συμβαίνει μόνο στην περίπτωση που η ποσότητα της δραστικής ουσίας στον πυρήνα διατηρείται σε επίπεδα κορεσμού [22]. Τα συστήματα αυτά χρησιμοποιούνται κυρίως για μεσοπρόθεσμη / μακροπρόθεσμη χορήγηση ενός φαρμάκου που εντοπίζεται σε μια συγκεκριμένη περιοχή (δηλ. όργανο, κοιλότητα σώματος κλπ.). στην οποία το φάρμακο είναι δύσκολο να φτάσει σε θεραπευτικά επίπεδα μέσω συστημικής χορήγησης (δηλ., οφθαλμού, αυτιού) ή τα φάρμακα που χορηγούνται είναι τοξικά και μπορεί να απαιτούν μακρόχρονη χορήγηση της δόσης, π.χ θεραπείες για καρκίνο [31]. Εικόνα Α.1.5: Κατηγοριοποίηση των συστημάτων δεξαμενής βάσει μορφολογίας [31]. 10

35 Τα συστήματα μήτρας Στα συστήματα αυτά ένα στερεό φάρμακο διασπείρεται ομοιογενώς σε μία αδιάλυτη μήτρα και ο ρυθμός απελευθέρωσής του εξαρτάται από τον ρυθμό διάχυσης του φαρμάκου και όχι από την ταχύτητα της στερεής διάλυσης [32]. Χαρακτηριστικό των συγκεκριμένων συστημάτων είναι ότι ο ρυθμός αποδέσμευσης μειώνεται με το χρόνο ως αποτέλεσμα της αύξησης της απόστασης διάχυσης, που απαιτείται να διανύσουν τα μόρια του φαρμάκου από τον πυρήνα προς την επιφάνεια του συστήματος. Εκτός από τη διαπέραση μέσω της μεμβράνης, τα μόρια της εγκλωβισμένης ουσίας μπορούν να βρουν διέξοδο μέσω των καναλιών, που σχηματίζονται από τη διαλυτοποίηση και απομάκρυνση της ποσότητας της δραστικής ουσίας, που έχει ήδη αποδεσμευτεί. Μάλιστα στην περίπτωση των μακρομορίων, η αποδέσμευσή τους επιτυγχάνεται σχεδόν αποκλειστικά μέσω αυτών των πόρων, καθώς ο όγκος τους δεν επιτρέπει τη διαπέραση από το πολυμερικό πλέγμα. Όπως και στα συστήματα δεξαμενής, η κινητική αποδέσμευσης εξαρτάται, εκτός από τις φυσικοχημικές ιδιότητες του ενεργού συστατικού, και από το σχήμα του πολυμερικού συστήματος, το οποίο φαίνεται πως έχει μεγάλη επίδραση στην ταχύτητα αποδέσμευσης της δραστικής ουσίας [22]. Εικόνα Α.1.6: Σχηματική αναπαράσταση αποδέσμευσης της δραστικής ουσίας από συστήματα: Α. Μήτρας και Β. Δεξαμενής (a. σφαιρικού σχήματος, b. μεμβράνης με μία ελεύθερη επιφάνεια) [33]. 11

36 Α Συστήματα ενεργοποιούμενης αποδέσμευσης Σε αυτή την κατηγορία, η απελευθέρωση του ενεργού συστατικού από το σύστημα απελευθέρωσης ελέγχεται ή ενεργοποιείται από κάποια φυσική, χημική και βιολογική διαδικασία ή από οποιαδήποτε εξωτερική πηγή ενέργειας. Με βάση τη φύση της εφαρμοζόμενης διαδικασίας και το είδος της χρησιμοποιούμενης ενέργειας τα συστήματα ενεργοποιούμενης αποδέσμευσης μπορούν να ταξινομηθούν στις ακόλουθες κατηγορίες όπως φαίνεται στον Πίνακα Α.1.1 [34], [35]. Πίνακας Α.1.1: Κατηγορίες συστημάτων ενεργοποιούμενης αποδέσμευσης Φυσικές μέθοδοι Στα συστήματα ενεργοποιούμενης αποδέσμευσης από την οσμωτική πίεση, η οσμωτική πίεση χρησιμοποιείται ως η κινητήρια δύναμη για την απελευθέρωση του φάρμακου με ελεγχόμενο τρόπο. Τα συστήματα αυτά χρησιμοποιούνται τόσο για χορήγηση από το στόμα όσο και για εμφύτευση. Ο πυρήνας που περιέχει το φάρμακο, το οποίο μπορεί να είναι είτε σε υγρή είτε σε στερεή μορφή, περικλείεται από ένα ημιπερατό περίβλημα με ελεγχόμενη διαπερατότητα νερού. Η αποδέσμευση των 12

37 μορίων του φαρμάκου πραγματοποιείται με σταθερό ρυθμό, ο οποίος καθορίζεται από τη διαπερατότητα του περιβλήματος, το εμβαδόν της επιφάνειας του ημιπερατού περιβλήματος, καθώς και από τη διαφορά της οσμωτικής πίεσης [36], [37]. Εικόνα 1.7: Απεικόνιση ενός συστήματος οσμωτικής πίεσης [38]. Τα συστήματα ενεργοποιούμενης αποδέσμευσης με υδροδυναμική πίεση μπορούν να κατασκευαστούν με τοποθέτηση ενός υγρού σκευάσματος φαρμάκου μέσα σε ένα πτυσσόμενο, αδιαπέραστο διαμέρισμα προκειμένου να σχηματίσει μια δεξαμενή φαρμάκου η οποία περιβάλλεται από ένα άκαμπτο περίβλημα. Ένα απορροφητικό στρώμα και διογκώσιμο, υδρόφιλο πολυμερές στρώμα τοποθετείται μεταξύ της δεξαμενής του φαρμάκου και του περιβλήματος. Στο γαστρεντερικό σωλήνα, αυτό το στρώμα θα απορροφήσει το γαστρεντερικό υγρό μέσω των δακτυλιοειδών ανοιγμάτων στο κατώτερο άκρο του περιβλήματος και θα διογκωθεί. Αυτό δημιουργεί μια υδροδυναμική πίεση στο σύστημα η οποία ωθεί τη δεξαμενή φαρμάκου να μειωθεί σε όγκο και προκαλεί την απελευθέρωση του υγρού σκευάσματος φαρμάκου μέσω του ανοίγματος χορήγησης [39]. Τα συστήματα που ενεργοποιούνται από την τάση ατμών αποτελούνται από μία συσκευή η οποία χρησιμοποιείται για την ελεγχόμενη δημιουργία πίεσης και αποτελείται από δύο θαλάμους. Ο ένας περιέχει το διάλυμα φαρμάκου και ο δεύτερος ένα εξατμιζόμενο ρευστό. Μετά τη λήψη του φαρμάκου, το πτητικό υγρό εξατμίζεται στη θερμοκρασία του σώματος και δημιουργεί πίεση ατμών που συμπιέζει τον κατώτερο θάλαμο, ο οποίος απελευθερώνει το φάρμακο με ελεγχόμενη παροχή [40], [41]. 13

38 Στο μαγνητικά ενεργοποιούμενο σύστημα η δεξαμενή φαρμάκου αποτελείται από ένα πεπτίδιο ή σκόνη πρωτεΐνης σε πολυμερική μήτρα. Αυτή η δεξαμενή περιέχει το μακρομοριακής σύστασης φάρμακο και διεγείρεται μαγνητικά έτσι ώστε να πραγματοποιηθεί απελευθέρωση της δραστικής. Σε ορισμένες περιπτώσεις χρησιμοποιείται επίσης μηχανισμός ηλεκτρομαγνητικής δόνησης [42], [43]. Στο σύστημα που ενεργοποιείται από υπερήχους (σονοφόρηση) χρησιμοποιείται μια συσκευή υπερήχων για την ενεργοποίηση της χορήγησης του φαρμάκου. Για την παροχή του μέσω του δέρματος χρησιμοποιείται μια πολύ χαμηλή συχνότητα (55 khz) για πολύ μικρό χρονικό διάστημα (15 δευτερόλεπτα). Αυτή η συσκευή κατασκευάζεται από βιοδιασπώμενο και μη αποικοδομήσιμο πολυμερές [44]. Στα συστήματα ενεργοποίησης με ιοντοφόρηση χρησιμοποιείται ηλεκτρικό ρεύμα το οποίο ενεργοποιεί το σύστημα και προκαλεί τη διάχυση των φορτισμένων μορίων του φαρμάκου μέσω μιας βιολογικής μεμβράνης. Η διείσδυση του φαρμάκου είναι ευθέως ανάλογη με την τάση του ρεύματος που εφαρμόζεται [45] [46]. Η τελευταία φυσική μέθοδος είναι η ενεργοποίηση μέσω ενυδάτωσης. Σε αυτή η δεξαμενή του φαρμάκου διασπείρεται ομοιογενώς σε μια διογκούμενη πολυμερική μήτρα παρασκευασμένη από ένα υδρόφιλο πολυμερές. Η απελευθέρωση του φαρμάκου ελέγχεται από το ρυθμό διόγκωσης της πολυμερικής μήτρας [34]. Χημικές μέθοδοι Τα συστήματα που ενεργοποιούνται από την μεταβολή του ph στοχεύουν στην παράδοση φαρμάκων μόνο στην εντερική οδό και όχι στο στομάχι. Τα επικαλυμμένα φάρμακα έχουν αντοχή έναντι του γαστρικού υγρού (ρη <3) και έτσι προστατεύονται από την όξινη αποικοδόμηση. Στο λεπτό έντερο, το εντερικό υγρό διαλύει την επικαλυμμένη μεμβράνη των φαρμάκων λόγω του υψηλού ph του εντερικού υγρού (ph> 6) [34]. Ένας άλλος χημικός τρόπος ενεργοποίησης είναι η υδρόλυση. Προκαλεί σταδιακή in vivo διάλυση του φραγμού (μήτρας ή δεξαμενής), επιτρέποντας την αποδέσμευση του φαρμάκου. 14

39 Τέλος, αναφέρονται συστήματα για μεταφορά ιονικού ή ιοντιζόμενου φαρμάκου, τα οποία κατασκευάζονται με συμπλοκοποίηση ενός τέτοιου φαρμάκου και μίας ρητίνης ανταλλαγής ιόντων. Το σχηματισμένο σύμπλοκο διασπάται όταν έρχεται σε επαφή με άλλα ιόντα, με αποτέλεσμα να αποδεσμεύεται το φάρμακο. Δεδομένου ότι το γαστρεντερικό υγρό διατηρεί σε σχετικά σταθερά επίπεδα την συγκέντρωση των ιόντων, μπορεί να διαμορφώσει, θεωρητικά, και σταθερό ρυθμό απελευθέρωσης του φαρμάκου [47]. Βιοχημικές μέθοδοι Σε αυτές συναντάται η ελεγχόμενη αποδέσμευση του φαρμάκου η οποία ενεργοποιείται από ενζυμική δραστηριότητα και από βιοχημική αντίδραση [48] Συστήματα στα οποία η αποδέσμευση ελέγχεται από μηχανισμό ανάδρασης Η κατηγορία αυτή αποτελεί την τρίτη γενιά συστημάτων ελεγχόμενης αποδέσμευσης δραστικών ουσιών, στην οποία μια φυσιολογική απόκριση ενεργοποιεί την απελευθέρωση φαρμάκων από τον φορέα [49]. Ένας παράγοντας ενεργοποίησης, όπως μια βιοχημική ουσία ρυθμίζει τη διαδικασία απελευθέρωσης του φαρμάκου στο σώμα μέσω ορισμένων μηχανισμών ανάδρασης και ανιχνεύεται από έναν αισθητήρα. Ο ρυθμός απελευθέρωσης του φαρμάκου ρυθμίζεται από τη συγκέντρωση του παράγοντα ενεργοποίησης και από ένα βιοχημικά ανταποκρινόμενο αισθητήρα. Ο αισθητήρας αυτός συνήθως ανιχνεύει μια βιοχημική ουσία μέσα στο σώμα, η οποία δρα ως ενεργοποιητής για το σύστημα. Ανάλογα με τη συγκέντρωση αυτής της ουσίας, ο μηχανισμός ανάδρασης του συστήματος ρυθμίζει κατάλληλα και τον ρυθμό αποδέσμευσης του εγκλωβισμένου συστατικού [34]. 15

40 Εικόνα Α.1.8: Απεικόνιση ενός συστήματος ενεργοποιούμενης αποδέσμευσης ελεγχόμενου από μηχανισμό ανάδρασης [50]. Αυτά τα συστήματα υποδιαιρούνται σε τρεις κατηγορίες: i. Ρυθμιζόμενα συστήματα μέσω βιοδιάσπασης (bioerosion-regulated). ii. Βιο-αποκρινόμενα (bioresponsive) συστήματα. iii. Αυτό-ρυθμιζόμενα (self-regulated) συστήματα i) Ρυθμιζόμενα συστήματα μέσω βιοδιάσπασης Το σύστημα αυτό αποτελείται από ένα βιοδιασπώμενο πολυμερικό πλέγμα από poly(vinyl methyl ether) half-ester μέσα στο οποίο βρίσκεται διεσπαρμένο το προς μεταφορά φάρμακο, ενώ εξωτερικά περιβάλλεται από ένα στρώμα ακινητοποιημένης ουρεάσης. Σε διάλυμα ουδέτερου ph το πολυμερικό πλέγμα διασπάται πολύ αργά. Παρουσία όμως ουρίας, η ουρεάση στο περίβλημα της φαρμακομορφής μεταβολίζει την ουρία προς σχηματισμό αμμωνίας. Με αυτό τον τρόπο το ph αυξάνεται και αυτό συνεπάγεται μια ραγδαία αποικοδόμηση του πολυμερούς με ταυτόχρονη απελευθέρωση του φαρμάκου [51]. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αυτής της κατηγορίας αποτελεί το σύστημα μεταφοράς υδροκορτιζόνης (hydrocortisone) (Εικόνα Α.1.9). 16

41 Εικόνα Α.1.9: Βιοδιασπώμενο σύστημα μεταφοράς υδροκορτιζόνης [51] ii) Βιο-αποκρινόμενα συστήματα Σε αυτό το CDDS, η δραστική ουσία περιέχεται σε δεξαμενή η οποία περικλείεται από μια βιοαποκρυνόμενη πολυμερική μεμβράνη. Η διαπερατότητα της μεμβράνης ελέγχεται από τη συγκέντρωση ενός βιοχημικού παράγοντα στον ιστό όπου έχει τοποθετηθεί το σύστημα. Ένα τυπικό παράδειγμα βιοαποκρινόμενου συστήματος είναι το ενεργοποιούμενο από γλυκόζη (glucose-triggered) σύστημα μεταφοράς ινσουλίνης (εικόνα). Εδώ η δεξαμενή ινσουλίνης περιέχεται μέσα σε μία μεμβράνη υδροπηκτώματος που φέρει ομάδες NR 2. Σε ένα αλκαλικό διάλυμα, οι ομάδες -NR 2 υπάρχουν σε ουδέτερη κατάσταση και η μεμβράνη είναι μη διογκωμένη και συνεπώς αδιαπέραστη από την ινσουλίνη. Καθώς η γλυκόζη διεισδύει στη μεμβράνη, οξειδώνεται από το ένζυμο οξειδάση γλυκόζης, το οποίο βρίσκεται στην μεμβράνη, για το σχηματισμό γλυκονικού οξέος. Η διαδικασία αυτή ενεργοποιεί την πρωτονίωση των -NR 2 για τον σχηματισμό -NR 2 H + και η μεμβράνη υδροπηκώματος διογκώνεται και καθίσταται διαπερατή στα μόρια της ινσουλίνης. Η ποσότητας της ινσουλίνης που απελευθερώνεται στον οργανισμό είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της γλυκόζης που διαπερνά την μεμβράνη του συστήματος [52]. 17

42 Εικόνα Α.1.10: Το βιοαποκρινόμενο σύστημα μεταφοράς ινσουλίνης, που ελέγχεται από την συγκέντρωση της γλυκόζης [52]. iii) Αυτό-ρυθμιζόμενα συστήματα Αυτό το είδος συστημάτων βασίζεται σε έναν αναστρέψιμο μηχανισμό ανταγωνιστικής σύνδεσης (competitive binding), ο οποίος ενεργοποιεί και ρυθμίζει την αποδέσμευση του φαρμάκου στον οργανισμό. Εδώ η δραστική ουσία βρίσκεται αποθηκευμένη σε ένα πλέγμα που περιβάλλεται από μια ημιπερατή μεμβράνη και η αποδέσμευσή του ενεργοποιείται όταν μία βιοχημική ουσία από τον περιβάλλοντα ιστό διαπεράσει την μεμβράνη. Ένα από τα πρώτα παραδείγματα αυτo-ρυθμιζόμενου συστήματος χρησιμοποιούσε τον μηχανισμό αναστρέψιμης σύνδεσης μορίων σακχάρου με λεκτίνη (lectin). Ένα σύμπλοκο ινσουλίνης-σακχάρου-λεκτίνης τοποθετείται μέσα σε μια ημιπερατή μεμβράνη. Καθώς η γλυκόζη του αίματος διαχέεται μέσα στην συσκευή ανταγωνιστικά (competitively) συνδέεται στις θέσεις σύνδεσης σακχάρου πάνω στα μόρια λεκτίνης (κονκαναβαλίνης Α) και ταυτόχρονα ενεργοποιείται η απελευθέρωση των μορίων ινσουλίνης-σακχάρου. Τα απελευθερωμένα τότε σύμπλοκα διαχέονται έξω 18

43 από την συσκευή, προς το αίμα. Έχουμε έτσι ένα αυτορυθμιζόμενο σύστημα μεταφοράς στο οποίο η δοσολογία του δραστικού συστατικού, της ινσουλίνης στην περίπτωσή μας, ρυθμίζεται ανάλογα με την συγκέντρωση της γλυκόζης στο αίμα [34]. Εικόνα Α.1.11: Αναπαράσταση ενός αυτορυθμιζόμενου συστήματος χορήγησης ινσουλίνης [53]. Α Συστήματα στόχευσης Τα συστήματα αυτά είναι μια προηγμένη μέθοδος χορήγησης φαρμάκων στους ασθενείς, η οποία οδηγεί στη συσσώρευση του χορηγούμενου φαρμάκου στο στοχευόμενο μέρος του σώματος μόνο (όργανα / ιστούς / κύτταρα). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας με τη μείωση των παρενεργειών. Ο σκοπός ενός συστήματος στόχευσης είναι να παρατείνει, να εντοπίσει, να στοχεύσει και να έχει μια προστατευμένη αλληλεπίδραση του φάρμακου με τον ασθενή ιστό [54]. 19

44 Εικόνα Α.1.12: Απεικόνιση ενός συστήματος στόχευσης [55]. Το ιδανικό σύστημα στόχευσης (κατά τον Ringsdorf -1978) περιλαμβάνει μια μηανοσογονική βιοδιασπώμενη πολυμερική αλυσίδα στην οποία έχουν προσδεθεί τα εξής: i) Μία κατευθυντήρια ομάδα (targeting moiety), η οποία θα οδηγήσει το σύστημα στον στόχο. ii) Ένας διαλυτοποιητής (solubiliser) ο οποίος καθιστά δυνατή τη μεταφορά του συστήματος χορήγησης φαρμάκου και την πρόσληψη από τον ιστόστόχο. iii) Ένας βραχίονα (spacer), ο οποίος φέρει χημικούς δεσμούς με τους οποίους συνδέονται τα μόρια του φαρμάκου και μπορούν να διασπασθούν μόνο από ένζυμα που βρίσκονται στην περιοχή του κυττάρου στόχου, ελευθερώνοντας το φάρμακο [56]. 20

45 Εικόνα Α.1.13: Ιδανικό Σύστημα Ελεγχόμενης Χορήγησης και στόχευσης φαρμακευτικών ουσιών, σύμφωνα με τον Ringsdorf [56]. Επιπλέον τα χαρακτηριστικά που πρέπει να διαθέτει είναι τα εξής [57], [58], [59] : 1) Βιοχημικά αδρανές (μη τοξικό). 2) Μη ανοσογονικό. 3) Φυσικά και χημικά σταθερό σε in vivo και in vitro συνθήκες. 4) Αποκλειστική κατανομή του φαρμάκου σε στοχευμένα κύτταρα ή ιστούς ή όργανα στόχους. 5) Ελεγχόμενος και προβλέψιμος ρυθμός απελευθέρωσης φαρμάκου. 6) Η απελευθέρωση φαρμάκου δεν πρέπει να επηρεάζει τη δράση του φαρμάκου. 21

46 7) Η ποσότητα φαρμάκου που αποδεσμεύεται να είναι επαρκής για να επιφέρει θεραπευτικό αποτέλεσμα. 8) Ελάχιστη διαρροή φαρμάκου κατά τη διάρκεια της μεταφοράς προς τον στόχο. Ένα από τα σημαντικότερα στοιχεία σε ένα σύστημα στόχευσης είναι ο φορέας φαρμάκου. Ο φορέας είναι ένα ειδικό μόριο ή σύστημα, η παρουσία του οποίου κρίνεται αναγκαία για την αποτελεσματική μεταφορά του φορτωμένου φαρμάκου μέχρι τις προεπιλεγμένες θέσεις. Κύριος σκοπός του είναι να συγκρατεί το φάρμακο μέσα ή πάνω του και να το μεταφέρει ή να το παραδίδει κοντά σε κύτταρα-στόχους. Έτσι αποφεύγεται η μεταφορά φαρμάκου σε μη στοχευόμενο σημείο οδηγώντας στη μείωση των παρενεργειών [60], [61], [62]. Υπάρχουν διάφοροι τύποι φορέων διανομής φαρμάκων, όπως πολυμερικά μικκύλια, λιποσώματα, φορείς φαρμάκων με βάση λιποπρωτεΐνη, νανοσωματιδιακοί φορείς, δενδριμερή κλπ. Ένα ιδανικό μέσο διανομής φαρμάκων πρέπει να είναι μη τοξικό, βιοσυμβατό, μη ανοσογονικό, βιοδιασπώμενο [63] και ικανό να αποφεύγει την αναγνώρισή του από τους αμυντικούς μηχανισμούς του ανθρώπινου σώματος [64]. Εικόνα Α.1.14: Παραδείγματα φορέων που χρησιμοποιούνται σε συστήματα στόχευσης [65]. 22

47 Όπως αναφέρθηκε, η στόχευση του φαρμάκου σε μια συγκεκριμένη περιοχή δεν αυξάνει μόνο τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα των φαρμάκων, αλλά επιδιώκει να μειώσει την τοξικότητα που σχετίζεται με το φάρμακο για να επιτρέψει τη χρήση χαμηλότερων δόσεων του φαρμάκου στη θεραπεία. Για την εκπλήρωση τέτοιων συνθηκών, χρησιμοποιούνται εκτεταμένα δύο προσεγγίσεις [57], [61], [62] : 1) Παθητική στόχευση (passive targeting). 2) Ενεργητική στόχευση (active targeting). Η παθητική στόχευση βρίσκει ευρεία εφαρμογή στην περίπτωση των καρκινικών όγκων. Εκμεταλλευόμενη τα μοναδικά παθοφυσιολογικά χαρακτηριστικά τους επιτρέπει στους νανοφορείς να συγκεντρωθούν στους όγκους. Πιο συγκεκριμένα, τα καρκινικά κύτταρα πολλαπλασιάζονται πολύ πιο γρήγορα από τα υγιή, με αποτέλεσμα να απαιτείται γρήγορος σχηματισμός νέων αιμοφόρων αγγείων. Μη μπορώντας να καλυφθούν οι ανάγκες κανονικής αγγείωσης, δημιουργούνται ατελή και διάτρητα με μικρούς πόρους αγγεία, τα οποία επιτρέπουν την είσοδο μακρομορίων και νανοσωματιδίων στο εσωτερικό των όγκων [66]. Ταυτόχρονα, η λεμφική παροχέτευση δεν έχει αναπτυχθεί πλήρως με αποτέλεσμα μεγάλα μόρια να μην μπορούν να απομακρυνθούν και να παραμένουν στους όγκους. Αυτή η ιδιαιτερότητα ονομάζεται φαινόμενο ενισχυμένης διαπερατότητας και συγκράτησης (Enhanced Permeability and Retention, EPR) [67], [68], [69]. Για την βέλτιστη αξιοποίηση του φαινομένου EPR είναι σημαντικό οι νανοφορείς να μπορούν να αποφύγουν την ανίχνευσή τους από το ανοσοποιητικό σύστημα και να παραμείνουν για μεγάλο χρονικό διάστημα στην κυκλοφορία του αίματος. Πολύ υψηλές τοπικές συγκεντρώσεις νανοφορέων φορτωμένων με φάρμακο μπορούν να επιτευχθούν στο σημείο του όγκου για παράδειγμα φορές υψηλότερες από ό, τι στους φυσιολογικούς ιστούς εντός 1-2 ημερών [68]. Για το σκοπό αυτό, τουλάχιστον τρεις ιδιότητες των νανοφορέων είναι ιδιαίτερα σημαντικές [70], [71] : 23

48 1) Το ιδανικό μέγεθος θα πρέπει να είναι κάπου μεταξύ 10 και 100 nm. Για την αποτελεσματική εξαγγείωση από τα ανοίγματα στα αγγεία των όγκων το μέγεθός τους θα πρέπει να είναι πολύ λιγότερο από 400 nm. Από την άλλη πλευρά, για να αποφευχθεί η διήθηση από τους νεφρούς, πρέπει να είναι μεγαλύτεροι από 10 nm και για να αποφευχθεί δέσμευση από το ήπαρ, οι νανοφορείς πρέπει να είναι μικρότεροι από 100 nm. 2) Το φορτίο τους θα πρέπει να είναι ουδέτερο ή ανιονικό για την αποτελεσματική αποφυγή της νεφρικής αποβολής. 3) Οι νανοφορείς πρέπει να μπορούν να ξεφεύγουν από το δικτυοενδοθηλιακό σύστημα (reticulo-endothelial system, RES), το οποίο καταστρέφει οποιοδήποτε ξένο υλικό μέσω της οψωνινοποίησης, ακολουθούμενη από φαγοκυττάρωση. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα Α τα νανοσωματίδια τείνουν να διαχέονται παθητικά μέσω της διαρροής αγγείων του όγκου και να συσσωρεύονται κυρίως μέσω του φαινομένου ενισχυμένης διαπερατότητας και συγκράτησης. Εικόνα Α.1.15: Σχηματική απεικόνιση του μηχανισμού παθητικής στόχευσης [72]. 24

49 Ενεργητική στόχευση Η ενεργητική στόχευση αναφέρεται στην αλληλεπίδραση τύπου συνδέτη-υποδοχέα μετά την άφιξη των νανοσωματιδίων στη θέση-στόχο μέσω της συστημικής κυκλοφορίας και απαιτεί αποτελεσματική αλληλεπίδραση μεταξύ του συνδέτη και του υποδοχέα αφού τα νανοσωματίδια συναντήσουν το κύτταρο-στόχο τους. Η αποτελεσματική αυτή αλληλεπίδραση εξαρτάται από μια ποικιλία παραγόντων που περιλαμβάνουν: την έκταση της εκλεκτικής έκφρασης του υποδοχέα σε κύτταραστόχους σε σχέση με μη-στοχευόμενα κύτταρα, τη διαθεσιμότητα του υποδοχέα στην επιφάνεια του κυττάρου στόχου και την αναλογία πρόσληψης-απόρριψης του επιφανειακού υποδοχέα ως προς τον συνδέτη [73], [74], [75]. Μετά την πρόσδεση των νανοφορέων στην επιφάνεια των κυττάρων - στόχων ακολουθεί είτε ενδοκυττάρωσή τους, είτε προσκόλλησή τους στην επιφάνεια, ανάλογα με το είδος του συνδέτη, που επιλέγεται. Η ενδοκυττάρωση πλεονεκτεί στις περιπτώσεις που η αποδέσμευση του φαρμάκου πρέπει να γίνει εντός του κυττάρου, ενώ η προσκόλληση στην επιφάνεια κρίνεται αναγκαία σε συμπαγείς όγκους, όπου χρειάζεται να σκοτωθούν και γειτονικά καρκινικά κύτταρα, τα οποία μπορεί να μην εκφράζουν τον υποδοχέα με το οποίο έχουν προσδεθεί οι νανοφορείς [72]. Εικόνα Α.1.16: Σχηματική απεικόνιση ενεργητικής στόχευσης σε αγγεία (αριστερά) και σε καρκινικά κύτταρα (δεξιά) [72]. 25

50 Στην Εικόνα Α.1.16 φαίνεται ότι η παρουσία υποκαταστατών στην επιφάνεια των σωματιδίων διευκολύνει την αλληλεπίδρασή τους με υποδοχείς που είναι παρόντες σε καρκινικά κύτταρα ή άλλου είδους κύτταρα, οδηγώντας σε αυξημένη συσσώρευση και υψηλή κυτταρική πρόσληψη μέσω αλληλεπιδράσεων συνδέτη-υποδοχέα [76]. Πιο συγκεκριμένα μόλις τα σωματίδια φτάσουν στον ιστό-στόχο, η παρουσία μονάδων στόχευσης στην επιφάνειά τους μπορεί να οδηγήσει σε ενεργή στόχευση σωματιδίων σε υποδοχείς που είναι παρόντες στο κύτταρο στόχο ή στον ιστό με αποτέλεσμα αυξημένη συσσώρευση και πρόσληψη κυττάρων μέσω ενδοκυττάρωσης. Αυτή η διαδικασία, που αναφέρεται ως "ενεργητική στόχευση", μπορεί να ενισχύσει τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα των φαρμάκων, ειδικά αυτών που δεν διαπερνούν εύκολα την κυτταρική μεμβράνη και απαιτούν ενδοκυτταρική θέση δράσης για βιοδραστικότητα (δεξιά). Τα σωματίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν και για αγγειακή στόχευση με την ενσωμάτωση μονάδων στόχευσης που δεσμεύονται στους υποδοχείς ενδοθηλιακών κυτταρικών επιφανειών. Η παρουσία διαρροής των αγγείων δεν απαιτείται για την αγγειακή στόχευση, ωστόσο όταν υπάρχει, όπως στην περίπτωση όγκων και φλεγμονής, αυτή η στρατηγική μπορεί ενδεχομένως να λειτουργήσει συνεργικά για την απελευθέρωση φαρμάκου με την στόχευση τόσο του αγγειακού ιστού όσο και των καρκινικών κυττάρων του ασθενούς ιστού για ενισχυμένη θεραπευτική δράση. (αριστερά) [72]. Η ενεργητική στόχευση διαιρείται σε διαφορετικές κατηγορίες με βάση το είδος των θεραπευτικών συστημάτων που χρησιμοποιούνται για την παράδοση του φαρμάκου [77]. Η βασική, κοινή αρχή όλων αυτών των συστημάτων είναι η ακριβής χορήγηση φαρμάκου σε καρκινικά κύτταρα. Οι κύριες κατηγορίες θεραπευτικών συστημάτων που χρησιμοποιούνται στην ενεργητική στόχευση απεικονίζονται Εικόνα Α.1.17 και είναι οι εξής [78] : 1) Τα αντισώματα (μονοκλωνικά αντισώματα ή θραύσματα) (Α) τα οποία στοχεύουν σε έναν ειδικό υποδοχέα, παρεμβαίνοντας σε οδούς μεταγωγής σήματος, ρυθμίζοντας πρωτο-ογκογονίδια που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Σε αυτή την περίπτωση, το δραστικό μόριο παίζει το ρόλο και του προσδέματος στόχου και του φαρμάκου. 26

51 2) Οι ανοσολογικές δομές (B) που σχηματίζονται με τη σύνδεση αντισωμάτων ή θραυσμάτων σε θεραπευτικά μόρια. 3) Οι νανοφορείς στόχευσης (C) οι οποίοι διαθέτουν ειδικούς συνδέτες στην επιφάνειά τους και περιέχουν φάρμακο. Οι συνδέτες είναι είτε μονοκλωνικά αντισώματα και θραύσματα αντισωμάτων (ανοσολογικοί νανοφορείς) είτε μη προσδέματα αντισώματος (πεπτιδικά ή μη). Εικόνα Α.1.17: Απεικόνιση των κύριων θεραπευτικών συστημάτων στην ενεργητική στόχευση [78] 27

52 28

53 Α.2. Νανοφορείς Σε ένα νανο-σύστημα ελεγχόμενης απελευθέρωσης φαρμάκου καθοριστικό ρόλο διαδραματίζει ο νανοφορέας, προκειμένου να πραγματοποιηθεί επιτυχημένη μεταφορά και παράδοση του φαρμάκου. Τόσο η σύσταση του νανοφορέα όσο και τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του αποτελούν βασικά στοιχεία για την κατάλληλη επιλογή του και θα αναλυθούν σε αυτό το κεφάλαιο. A.2.1. Εισαγωγή Η Νανοτεχνολογία είναι ένας ταχέως αναπτυσσόμενος τομέας που επικεντρώνεται στη δημιουργία λειτουργικών υλικών, συσκευών και συστημάτων μέσω του ελέγχου της ύλης στη νανοκλίμακα και την εκμετάλλευση νέων φαινομένων και ιδιοτήτων σε αυτή τη κλίμακα μεγέθους [79]. Ο όρος νανοτεχνολογία αναφέρεται ως επί το πλείστον στην κατασκευή νέων υλικών με τουλάχιστον μία διάσταση σε μέγεθος που κυμαίνεται μεταξύ 1 και 100 νανόμετρα (nm), δηλαδή ένα δισεκατομμυριοστό ενός μέτρου. Χρησιμοποιείται ήδη σε μια ποικιλία προϊόντων σε διάφορες βιομηχανίες όπως η γεωργία, τα καλλυντικά, τα ηλεκτρονικά, τα τεχνητά πλακάκια, η ανακύκλωση, η ενέργεια, τα χημικά, καθώς και η υγεία [80], [81]. 29

54 Εικόνα Α.2.1: Η Νανοκλίμακα [82] Στην Εικόνα Α.2.1, αποτυπώνεται ακριβώς η νανοκλίμακα, σε αντιδιαστολή με άλλες κλίμακες μεγέθους, ενώ φαίνονται και οι διαστάσεις χαρακτηριστικών αντικειμένων για καλύτερη αντίληψη της σχέσης μεταξύ των μεγεθών. Ειδικότερα για τον σαφή προσδιορισμό της Νανοτεχνολογίας, έχει επικρατήσει ότι αυτή αφορά διαστάσεις από το ένα έως τα εκατό νανόμετρα (1-100 nm) [82]. Τα τελευταία χρόνια, το ενδιαφέρον για την επιστήμη της νανοκλίμακας ή τη νανοεπιστήμη έχει αυξηθεί κατακόρυφα. Η νανοεπιστήμη αναφέρεται στη μελέτη των ιδιοτήτων, των φαινομένων και της απόκρισης των υλικών στην κλίμακα των υπομικρών. Στη νανοκλίμακα, οι ιδιότητες της ύλης έχουν βρεθεί να είναι πολύ διαφορετικές από αυτές της μικροσκοπικής ή μακροσκοπικής κλίμακας. Τα κβαντικά φαινόμενα παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στην περιοχή νάνο λόγω της μεγάλης αναλογίας επιφάνειας προς όγκο σε σύγκριση με τα μεγάλα σωματίδια. Οι εφαρμογές της νανοεπιστήμης-νανοτεχνολογίας, προσφέρουν τεράστιες δυνατότητες στην τεχνολογία της πληροφορίας και της επικοινωνίας, στη βιολογία και στην ιατρική. Η νανοϊατρική περιλαμβάνει την επιστήμη και την τεχνολογία που χρησιμοποιεί μοριακά εργαλεία και γνώση της λειτουργίας του ανθρώπινου σώματος για [83] : 30

55 Παραγωγή νέων θεραπευτικών μεθόδων (νέες μέθοδοι θεραπείας ασθενειών και επιδιόρθωσης ιστών). Ανάπτυξη διαγνωστικών για ταχεία παρακολούθηση (συστοιχίες υψηλής απόδοσης, συσκευές απεικόνισης, ετικέτες νανοσωματιδίων, υπερευαίσθητοι ανιχνευτές ή νανοβιοαισθητήρες). Ανάπτυξη βιοφαρμακευτικών προϊόντων (συστήματα χορήγησης πρωτεϊνών) και συστημάτων γονιδιακής θεραπείας. Βελτίωση αλληλεπιδράσεων κυττάρου-υλικού (εμφυτεύσιμα υλικά για επούλωση ιστών, εμφυτεύματα αμφιβληστροειδούς). Ανάπτυξη χειρουργικών εργαλείων και χειρουργικών βοηθημάτων (χειρουργικά εργαλεία και ρομπότ). Ο ευφυής σχεδιασμός του υλικού στη νανοκλίμακα μας έδωσε νανοϋλικά που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως νανοφορείς για αποτελεσματική παράδοση φαρμάκων [84]. Τα βασικά πλεονεκτήματα των νανοφορέων έναντι άλλων φορέων φαρμάκων είναι [87], [88],[89], [90] : [85], [86], Το μικρό τους μέγεθος, το οποίο τους βοηθά να ξεπεράσουν τα φυσιολογικά εμπόδια και να εισέλθουν στα κύτταρα. Η δυνατότητα να συσσωρεύονται σε συγκεκριμένες θέσεις στόχους με ελεγχόμενη απελευθέρωση του φαρμάκου που περιέχουν μέσω διάφορων μηχανισμών. Αποτελεσματική χορήγηση πρωτεϊνών, νουκλεϊνικών οξέων και άλλων μικρών μορίων. Υψηλή σταθερότητα-μεγάλη διάρκεια ζωής. Υψηλή ικανότητα φορέα (π.χ. πολλά μόρια φαρμάκων μπορούν να ενσωματωθούν σε κάθε σωματίδιο). Ικανότητα ενσωμάτωσης τόσο υδρόφιλων όσο και υδρόφοβων ουσιών και χρήση για στοματική εφαρμογή. 31

56 Με βάση αυτές τις ιδιότητες, τα συστήματα χορήγησης φαρμάκων με νανοφορείς προσφέρουν πολλά πλεονεκτήματα, όπως [91] : 1. Βελτίωση της βιοκατανομής και της φαρμακοκινητικής, με αποτέλεσμα την αύξηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας. 2. Μείωση των παρενεργειών ως συνέπεια της εκλεκτικής συσσώρευσης του φαρμάκου στις θέσεις-στόχους. 3. Ελάττωση της τοξικότητας με τη χρήση βιοσυμβατών νανοϋλικών. Εικόνα Α.2.2: Απεικόνιση συστημάτων απελευθέρωσης φαρμάκου με νανοσωματίδια συγκριτικά με άλλες κλίμακες μεγέθους [91]. Α.2.2. Κατηγορίες Νανοφορέων Οι νανοφορείς είναι υπερμοριακά συστήματα (ειδικά σχεδιασμένα νανοσωματίδια) με τη χρήση των οποίων μπορεί να γίνει στόχευση καρκινικών όγκων, μεταφορά θεραπευτικών ενώσεων, γονιδίων ή σκιαγραφικών παραγόντων. Το μέγεθος τους είναι συγκρίσιμο με αυτό των αντισωμάτων (15-30 nm), ιών ( nm), υποδοχέων στην 32

57 επιφάνεια της πλασματικής μεμβράνης, γονιδίων (2nm πλάτος, nm μήκος), πρωτεϊνών (5-50nm) και άλλων βιομορίων. Αυτά τα συστήματα μπορούν να μεταφέρουν μόρια φαρμάκου μέσω της σύνδεσης ή απορρόφησης του φαρμάκου στην επιφάνεια τους, μέσω της ενκαψακίωσης της δραστικής ουσίας μέσα σε λιπίδια/πολυμερή ή και μέσω της διάλυσης των μορίων του φαρμάκου σε μήτρα. Αποτέλεσμα των παραπάνω σχηματισμών είναι η προστασία του φαρμάκου από το περιβάλλον και η αντικατάσταση των μη επιθυμητών βιοφαρμακευτικών ιδιοτήτων του με τις επιθυμητές ιδιότητες των νανοσωματιδίων [92]. Οι νανοφορείς ανάλογα με τη σύσταση τους διακρίνονται σε: i. Οργανικούς νανοφορείς, η σύνθεση των οποίων πραγματοποιείται εξ ολοκλήρου από οργανικά μόρια. Παραδείγματα τέτοιων νανοφορέων είναι τα λιποσώματα, τα μικκύλια, τα δενδριμερή, οι νανοσφαίρες, οι νανοκάψουλες και τα συζεύγματα πολυμερών και φαρμάκων (Εικόνα Α.2.3) [93], [94]. ii. Ανόργανους νανοφορείς, με κυριότερους εκπροσώπους τα νανοσωματίδια χρυσού, τις κβαντικές τελείες, νανοσωματίδια οξειδίων του σιδήρου και άλλων μετάλλων, τους νανοσωλήνες άνθρακα καθώς και νανοσωματίδια πυριτίου (silica) (Εικόνα Α. 2.4) [94]. iii. Υβριδικούς νανοφορείς, οι οποίοι απαρτίζονται από δύο διαφορετικά οργανικά τμήματα ή ένα οργανικό τμήμα μαζί με ένα ανόργανο [95]. Πολλοί υβριδικοί νανοφορείς έχουν δομή πυρήνα-κελύφους (core-shell) και αποτελούνται από διάφορους τύπους βιοϋλικών οι οποίοι τους προσδίδουν διάφορες επιθυμητές ιδιότητες, όπως ενκαψακίωση φαρμάκων με υψηλή φόρτωση, βελτιωμένη σταθερότητα, ρυθμιζόμενη και παρατεταμένη απελευθέρωση, ενίσχυση της πρόσληψης από τα κύτταρα ή ενδοκυτταρική απελευθέρωση φαρμάκου και δυνατότητα σύζευξης με μονάδες στόχευσης (Εικόνα Α.2.5) [96]. 33

58 Εικόνα Α.2.3: Οι κυριότεροι οργανικοί νανοφορείς [97]. Εικόνα Α.2.4: Ανόργανοι νανοφορείς [94]. Εικόνα Α.2.5: Παραδείγματα υβριδικών νανοφορέων με δομή πυρήνα-κελύφους [96]. 34

59 Οργανικοί Νανοφορείς Λιποσώματα Τα λιποσώματα είναι αυτοσυναρμολογούμενα τεχνητά κυστίδια που αποτελούνται από διπλοστοιβάδες λιπιδίων και σχηματίζονται από φωσφολιπίδια και χοληστερόλη που περιβάλλουν έναν υδατικό πυρήνα. Τα φωσφολιπίδια αποτελούνται από υδρόφιλες κεφαλές και υδρόφοβες ουρές. Άρα η δομή τους επιτρέπει την ενκαψακίωση υδρόφιλων μορίων εντός των εσωτερικών τμημάτων, ενώ οι υδρόφοβες ενώσεις ενκαψακιώνονται εντός της υδρόφοβης διπλοστοιβάδας [98], [99], [100]. Εικόνα Α.2.6: Απεικόνιση ενός λιποσώματος [101]. Τα λιποσώματα μπορούν να ταξινομηθούν με βάση το μέγεθος και τον αριθμό των διπλοστοιβάδων τους σε τρεις κατηγορίες (Εικόνα Α.2.7) [102] : 1. Μικρά μονοστοιβαδιακά κυστίδια (Small Unilamellar Vesicle, SUV) : αποτελούνται από μια υδατική φάση που περιβάλλεται από ένα στρώμα (στοιβάδα) λιπιδίων και είναι nm σε διάμετρο. 2. Μεγάλα μονοστοιβαδιακά κυστίδια (Large Unilamellar Vesicle, LUV): είναι ίδια με τα SUV και το μέγεθός τους κυμαίνεται από nm. 3. Πολυστοιβαδιακά κυστίδια (ΜultiLamellar Vesicle, MLV): αποτελούνται από πολλές ομόκεντρες λιπιδικές στοιβάδες, οι οποίες διαχωρίζονται από ένα στρώμα υδατικής φάση. Αυτά είναι μεγάλα σε μέγεθος και μπορεί να φτάσουν έως και 5 μm. 35

60 Εικόνα Α.2.7: Διάκριση λιποσωμάτων ανάλογα με το μέγεθός τους [103]. Ένα φάρμακο ενσωματώνεται σε ένα λιπόσωμα με τη διαδικασία της ενθυλάκωσης [104]. Στη συνέχεια η διπλοστιβάδα του λιποσώματος μπορεί να συγχωνευθεί με άλλες διπλοστοιβάδες όπως η κυτταρική μεμβράνη, η οποία προάγει την απελευθέρωση του περιεχόμενού της, καθιστώντας το λιπόσωμα ικανό σύστημα απελευθέρωσης φαρμάκων (Εικόνα Α.2.8) [105], [106]. Η απελευθέρωση εξαρτάται από τη λιποσωματική σύνθεση, το ρη, την οσμωτική βαθμίδα και το περιβάλλον [104]. Εικόνα Α.2.8: Απεικόνιση της απελευθέρωσης φαρμάκου ενός λιποσώματος [92]. Τα λιποσώματα είναι γενικά βιοσυμβατά, προκαλούν πολύ μικρές ή και καθόλου ανοσογονικές, πυρετογόνες, αλλεργικές και τοξικές αντιδράσεις (εκτός αν περιέχουν ακαθαρσίες ή μολύνσεις), υποβάλλονται εύκολα σε βιοαποικοδόμηση, προστατεύουν 36

61 τον ξενιστή από οποιεσδήποτε ανεπιθύμητες ενέργειες του ενκαψακιωμένου φαρμάκου και το προστατεύουν από πρόωρη απενεργοποίηση από το φυσιολογικό μέσο [107]. Επιπλέον αυξάνουν τη διαλυτότητα των φαρμάκων και βελτιώνουν τις φαρμακοκινητικές τους ιδιότητες, όπως ο θεραπευτικός δείκτης των χημειοθεραπευτικών παραγόντων, ο ταχύς μεταβολισμός, η μείωση των επιβλαβών παρενεργειών και η αύξηση της in vitro και in vivo αντικαρκινικής δράσης [104]. Η πιθανή χρήση των λιποσωμάτων σαν συστήματα χορήγησης έγκειται στο γεγονός ότι παρέχουν μια αργή και παρατεταμένη απελευθέρωση, βελτιώνοντας την συσσώρευση των παγιδευμένων σε αυτά φαρμακομορίων σε επιθυμητές θέσεις στο σώμα. Επίσης, είναι ικανά να μειώνουν την κυτταροτοξικότητα των μορίων του φαρμάκου που φέρουν, καθώς μπορούν να ρυθμίσουν τη βιοκατανομή και τη φαρμακοκινητική του [22], [108]. Λαμβάνοντας υπόψη τη βιοσυμβατότητα, τη βιοαποικοδομησιμότητα και την ικανότητα τους να διασχίζουν λιπιδικές διπλοστοιβάδες και κυτταρικές μεμβράνες, τα λιποσώματα έχουν προταθεί ως μορφές χορήγησης για εμβόλια, αντικαρκινικά φάρμακα και γονιδιακή θεραπεία [109]. Για να αυξηθεί η συσσώρευση λιποσωματικών φαρμάκων στις επιθυμητές περιοχές, επιχειρήθηκε η χρήση στοχευμένων λιποσωμάτων με επιφανειακές μονάδες στόχευσης (ligands) ικανές για αναγνώριση και δέσμευση σε κύτταρα-στόχους. Οι πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες μονάδες στόχευσης αποτελούν τα αντισώματα (ανοσοσφαιρίνες της κατηγορίας IgG) και τα Fab τμήματα αυτών, τα οποία μπορούν να συνδεθούν στα λιποσώματα χωρίς να επηρεαστούν οι ιδιότητες των αντισωμάτων ή των λιποσωμάτων [110]. Ωστόσο, ένα από τα σημαντικότερα μειονεκτήματα των συμβατικών λιποσωμάτων είναι ο σύντομος χρόνο κυκλοφορίας, καθώς απομακρύνονται ταχέως από τα φαγοκύτταρα του δίκτυο-ενδοθηλιακού συστήματος (RES). Tα παραδοσιακά "λιποσώματα πρώτης γενιάς" που βασίζονται σε μεμβράνες διπλής στοιβάδας φωσφολιπιδίων εμφανίζουν κακή σταθερότητα και ταχεία απομάκρυνση. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι συμβατικές μεμβράνες ενός λιποσώματος επηρεάζονται έντονα από φυσικές αλληλεπιδράσεις με τις κυκλοφορούντες πρωτεΐνες στο αίμα (οψωνίνες), οι οποίες συμβάλλουν στην απομάκρυνση των λιποσωμάτων. Για να 37

62 βελτιωθούν αυτές οι αδυναμίες, αναπτύχθηκαν λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας ρυθμίζοντας τη σύνθεση, το μέγεθος και το φορτίο των συνηθισμένων λιποσωμάτων. Η τροποποίηση της επιφάνειας των λιποσωμάτων με προσθήκη αδρανών υδρόφιλων πολυμερών, όπως πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG), οδήγησε στη δημιουργία λιποσωμάτων με μεγαλύτερη κυκλοφορία, τα οποία αποδείχθηκαν ότι μειώνουν την προσρόφηση διαφόρων πρωτεϊνών του αίματος και συνεπώς παρατείνουν τον χρόνο κυκλοφορίας τους (stealth liposomes). Τα λιποσώματα μακράς κυκλοφορίας διαθέτουν ανεξάρτητη από τη δόση, μη κορεσμένη, λογαριθμο-γραμμική φαρμακοκινητική και αυξημένη βιοδιαθεσιμότητα [111]. Πολυμερικά μικύλλια Τα πολυμερικά μικύλλια είναι αυτο-συναρμολογούμενοι σφαιρικοί νανοφορείς που σχηματίζονται αυθόρμητα όταν αμφίφιλα συμπολυμερή βρεθούν σε υδατικό περιβάλλον. Έχουν μια δομή πυρήνα-κελύφους, στην οποία ένας εσωτερικός πυρήνας που παρέχει χώρο για την ενκαψακίωση υδρόφοβων φαρμάκων, πρωτεΐνης ή DΝΑ, περιβάλλεται από ένα εξωτερικό κέλυφος που αποτελείται από υδρόφιλα πολυμερή, όπως η πολυ(αιθυλενογλυκόλη) (PEG) [112], [113], [114], [115], [116]. Χάρη στο υδρόφιλο κέλυφός τους, τα πολυμερικά μικκύλια μπορούν και αποφεύγουν την αναγνώριση από το RES και οδηγούν στην παράταση της κυκλοφορίας των φαρμάκων στο αίμα. Το μικρό μέγεθος (<100 nm) επιτρέπει στα μικκύλια την αποτελεσματική συσσώρευση σε παθολογικούς ιστούς με διαπερατό αγγειακό σύστημα μέσω του φαινομένου EPR [117]. Επιπλέον διαθέτουν μια σειρά από μοναδικά χαρακτηριστικά, όπως το μέγεθός τους στη νανοκλίμακα, ο εύκολος χειρισμός της επιφάνειας, οι λειτουργίες που προσφέρει ο πυρήνας, καθώς και η ευκολία κατασκευής τους, καθιστώντας τα κατάλληλα ως φορείς για την ενκαψακίωση και τη χορήγηση αδιάλυτων στο νερό παραγόντων [118]. Για την ελεγχόμενη απελευθέρωση του φαρμάκου σε καρκινικά κύτταρα σχεδιάζονται πολυμερικά μικκύλια που ανταποκρίνονται σε μηχανισμούς διέγερσης, προκαλούμενους από εξωτερικά ερεθίσματα, όπως είναι η θερμοκρασία, το ph, οι υπέρηχοι και κάποια ειδικά ένζυμα [119], [120]. 38

63 Τα πιο αντιπροσωπευτικά ερεθίσματα είναι το ph και η θερμοκρασία, επειδή το εξωτερικό ph του καρκινικού ιστού τείνει να είναι χαμηλότερο και η θερμοκρασία είναι υψηλότερη σε σύγκριση με τον περιβάλλοντα φυσιολογικό ιστό λόγω του μη φυσιολογικού μεταβολισμού των καρκινικών ιστών [118]. Εικόνα Α.2.9: Απεικόνιση σύνθεσης ενός πολυμερικού μικκυλίου [121]. Δενδριμερή Τα δενδριμερή ορίζονται ως συνθετικά μακρομόρια που χαρακτηρίζονται από υψηλό επίπεδο διακλάδωσης, τρισδιάστατο σφαιρικό σχήμα, μονοδιασπορά μεγέθους και εύρος μεγέθους στην νανοκλίμακα [122], [123]. Η χαρακτηριστική αρχιτεκτονική των δενδριμερών παρέχει μια καλά καθορισμένη διακλαδισμένη δομή με σφαιρικό σχήμα, στην οποία υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός επιφανειακών ομάδων που μπορούν να διασπαστούν in vivo προκειμένου να επιτευχθεί η απελευθέρωση του φαρμάκου [123]. Ένα τυπικό δενδριμερές μπορεί να χαρακτηριστεί ως ένα σφαιρικό μόριο νανοκλίμακας με τρεις κύριες περιοχές (Εικόνα Α.2.10). Η πρώτη περιοχή είναι ο κεντρικός πυρήνας 39

64 του δενδριμερούς, ο οποίος μπορεί να είναι ένα μόνο άτομο ή ένα μόριο που έχει τουλάχιστον δύο ίδιες λειτουργικές ομάδες. Τη δεύτερη περιοχή του δενδριμερούς απαρτίζουν οι διακλαδώσεις του, οι οποίες ξεκινούν από τον πυρήνα του μορίου και καταλήγουν στο εξωτερικό του μακρομορίου. Οι διακλαδώσεις των δενδριμέρων αναπτύσσονται ακτινωτά, αποτελούνται από επαναλαμβανόμενες δομικές μονάδες και ονομάζονται γενεές. Η τρίτη περιοχή του δενδριμερούς είναι οι τερματικές λειτουργικές μονάδες που βρίσκονται στο εξωτερικό αυτού του μακρομορίου και είναι ζωτικής σημασίας για τον προσδιορισμό των ιδιοτήτων του δενδριμερούς [124]. Εικόνα Α.2.10: Απεικόνιση ενός δενδριμερούς [125]. Η επιλογή του πυρήνα, των επιφανειακών λειτουργικών ομάδων καθώς και ο τύπος του μονομερούς καθορίζουν τη χρησιμότητα των δενδριμερών σε ιατρικές εφαρμογές. Η απουσία κυτταροτοξικότητας και η πολυλειτουργικότητά τους έχει ιδιαίτερη σημασία για τους βιοϊατρικούς σκοπούς. Η κυτταροτοξικότητα του δενδριμερούς εξαρτάται από το υλικό του πυρήνα και επηρεάζεται έντονα από τη φύση της επιφάνειας των δενδριμερών. Για παράδειγμα, η αλλαγή ομάδων αμίνης της επιφάνειας σε ομάδες υδροξυλίων μπορεί να οδηγήσει σε χαμηλότερα επίπεδα κυτταροτοξικότητας. Ο όρος πολυλειτουργικότητα ορίζει τον αριθμό των ενεργών ομάδων που υπάρχουν στην επιφάνεια. Η παρουσία αρκετών επιφανειακών λειτουργικών ομάδων καθιστά δυνατή την αλληλεπίδραση με ένα πλήθος υποδοχέων και συνεπώς ενισχύει τη βιολογική δραστικότητα των δενδριμερών [126]. Τα δενδριμερή χρησιμοποιούνται εκτεταμένα ως φορείς σε συστήματα χορήγησης φαρμάκων. Αν και το μικρό τους μέγεθος (έως 10 nm) περιορίζει την εκτεταμένη 40

65 ενσωμάτωση του φαρμάκου στα δενδριμερή, η δενδριτική τους φύση με τις διακλάδωσεις επιτρέπει τη φόρτωση φαρμάκων στις εξωτερικές επιφάνειες της πολυμερικής δομής [127]. Το φάρμακο μπορεί να ενθυλακωθεί στην εσωτερική δομή τους [126] ή να προσκολληθεί χημικά ή να απορροφηθεί φυσικά στην επιφάνεια τους [128]. Η επιλογή της μεθόδου σύνδεσης εξαρτάται από τις ιδιότητες του φαρμάκου. Η ενκαψακίωση χρησιμοποιείται όταν τα φάρμακα είναι ασταθή, τοξικά ή ελάχιστα διαλυτά ενώ η χημική σύνδεση παρέχει τη δυνατότητα επίβλεψης της ποσότητας των φαρμάκων στην επιφάνεια των δενδριμερών με τον έλεγχο του αριθμού των ομοιοπολικών δεσμών [129]. Η επιλεκτικότητα και των δύο μεθόδων μπορεί να ενισχυθεί με την προσάρτηση στην επιφάνεια των δενδριμερών παραγόντων στόχευσης, όπως το φυλλικό οξύ [126], [129]. Η χρήση των δενδριμερών ως φορείς φαρμάκων και άλλων βιολογικά δραστικών ουσιών προσφέρει πολλά πλεονεκτήματα με κυριότερα το υψηλό επίπεδο μονοδιασποράς μεγέθους, την αποτελεσματική διείσδυση μέσω του δικτύου των αγγείων σε έναν ιστό-στόχο, π.χ. σε ένα νεοπλασματικό ιστό, λόγω του μικρού τους μεγέθους, και τέλος τη σύνδεση ενός συγκεκριμένου αριθμού φαρμακευτικών μορίων στην επιφάνεια του φορέα σε στοιχειομετρική αναλογία χάρη στον καθορισμένο αριθμό επιφανειακών λειτουργικών ομάδων [130]. Συζευγμένα με φάρμακο πολυμερή Ένα άλλο είδος συστημάτων μεταφοράς φαρμάκου είναι τα συζευγμένα με φάρμακο πολυμερή τα οποία έχουν μελετηθεί εκτενώς [131]. Μικρομοριακοί θεραπευτικοί παράγοντες και πρωτεΐνες συνήθως έχουν δύο μη επιθυμητές ιδιότητες: μικρό χρόνο κυκλοφορίας στο αίμα, γεγονός που οδηγεί στην ανάγκη για συχνή χορήγηση και μη ειδική στόχευση, με αποτέλεσμα την εκδήλωση ανεπιθύμητων παρενεργειών. Η σύζευξη των φαρμάκων στους διαλυτούς πολυμερικούς νανοφορείς μπορεί να μειώσει αυτές τις ανεπιθύμητες επιπτώσεις αφού όχι μόνο παρατείνει τον in vivo χρόνο κυκλοφορίας στο αίμα από μερικά λεπτά έως αρκετές ώρες, αλλά ταυτόχρονα μπορεί να μειώσει την μη-ειδική κυτταρική πρόσληψη. Αυτά τα 41

66 χαρακτηριστικά βοηθούν την παθητική μεταφορά των φαρμάκων σε ιστούς με διαπερατά αιμοφόρα αγγεία, όπως είναι για παράδειγμα οι όγκοι [132], [133]. Οι μεγάλες προκλήσεις (προβλήματα) των περισσότερων συζευγμένων με φάρμακο πολυμερών περιλαμβάνουν τη τοξικότητα, την ανοσογονικότητα, τη μη-ειδική βιοκατανομή, την in vivo αστάθεια, τη χαμηλή ικανότητα φόρτωσης με φάρμακο, την ταχεία αποδέσμευση του φαρμάκου, καθώς επίσης και προκλήσεις που σχετίζονται με τη σύνθεση τους. Η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) η οποία εισήχθη για πρώτη φορά στην κλινική χρήση στις αρχές του 1990, ενισχύει τη σταθερότητα και τη διαλυτότητα του φαρμάκου (π.χ. πρωτεΐνης), μειώνοντας παράλληλα την ανοσογονικότητά του [134]. Πολυμερικά νανοσωματίδια Τα πολυμερικά νανοσωματίδια είναι σωματίδια με διάμετρο μικρότερη από 1 μm που παρασκευάζονται από φυσικά ή συνθετικά πολυμερή. Ανάλογα με τη μέθοδο παρασκευής, τα νανοσωματίδια διαθέτουν διαφορετικές ιδιότητες και χαρακτηριστικά ως προς την απελευθέρωση, με τη δημιουργία δομής τύπου μήτρας (matrix) ή δεξαμενής (reservoir) που ονομάζονται νανοσφαίρες ή νανοκάψουλες αντίστοιχα [135]. Nανοσφαίρες Οι νανοσφαίρες είναι σφαιρικές δομές που αποτελούνται από ένα σύστημα μήτρας, στην οποία το φάρμακο κατανέμεται κατά τον εγκλωβισμό ή τη σύνδεση. Η επιφάνεια της σφαίρας μπορεί να τροποποιηθεί με την προσθήκη πολυμερών και βιολογικών υλικών, ενώ μπορούν να συνδεθούν αντισώματα για ενεργητική στόχευση [136]. Νανοκάψουλες Οι νανοφορείς αυτοί είναι κυστικά συστήματα με μια κεντρική κοιλότητα ή πυρήνα στον οποίο εγκλείεται το φάρμακο. Ο πυρήνας περιβάλλεται από μια εξωτερική πολυμερική μεμβράνη, στην επιφάνεια της οποίας μπορούν να προσδεθούν ομάδες στόχευσης ή αντισώματα. Το υλικό του πυρήνα μπορεί να είναι στερεό, υγρό ή αέριο, ενώ το περιβάλλον του πυρήνα μπορεί να είναι υδατικό ή λιπαρό [136]. 42

67 Εικόνα Α.2.11: Σχηματική απεικόνιση των νανοσφαιρών και των νανοκαψουλών [101]. Θεωρούνται πολλά υποσχόμενοι φορείς για την παροχή φαρμάκων επειδή μπορούν να βελτιώσουν τη δράση των φαρμάκων αλλάζοντας την κατανομή των δραστικών ουσιών στους ιστούς και τη φαρμακοκινητική τους [137]. Έχουν διαδραματίσει κεντρικό ρόλο στην παροχή αντικαρκινικών φαρμάκων με στοχευμένο τρόπο στα κακοήθη καρκινικά κύτταρα, μειώνοντας έτσι τη συστημική τοξικότητα και αυξάνοντας την θεραπευτική τους αποτελεσματικότητα. Λόγω του δίκτυο-ενδοθηλιακού συστήματος (RES) και του φαινομένου διαπερατότητας και συγκράτησης (EPR), τα νανοσωματίδια μπορούν να διαμορφωθούν για παθητική απελευθέρωση στο λεμφικό σύστημα, στον εγκέφαλο, στα αρτηριακά τοιχώματα και στους πνεύμονες [137], [138], [139]. Ανόργανοι Νανοφορείς Νανοσωματίδια πυριτίας (silica) Τα μεσοπορώδη νανοσωματίδια πυριτίας (MSN) αντιπροσωπεύουν μια νέα γενιά ανοργάνων νανοφορέων για την απελευθέρωση φαρμάκων [140] και οι μοναδικές ιδιότητές τους έχουν προσελκύσει μεγάλη προσοχή στην έρευνα για διάφορες εφαρμογές ελεγχόμενης απελευθέρωσης. 43

68 Οι ιδιότητες αυτές είναι οι εξής [141] : i. Ρυθμιζόμενο μέγεθος σωματιδίων. Το μέγεθος των σωματιδίων του MSN μπορεί να ρυθμιστεί από 50 έως 300 nm επιτρέποντας μια εύκολη ενδοκυττάρωση από ζωικά και φυτικά κύτταρα χωρίς σημαντική κυτταροτοξικότητα. ii. Σταθερό και άκαμπτο πλαίσιο. Σε σύγκριση με άλλους φορείς φαρμακευτικών ουσιών που βασίζονται στο πολυμερές, τα MSN είναι πιο ανθεκτικά στη θερμότητα, στο ph, στο μηχανικό στρες και στη διάσπαση που προκαλείται από την υδρόλυση. iii. Ενιαίο και ρυθμιζόμενο μέγεθος πόρων. Η κατανομή μεγέθους των πόρων του MSN είναι πολύ οριακή και η διάμετρος των πόρων μπορεί να ρυθμιστεί μεταξύ 2 και 6 nm. Αυτά τα χαρακτηριστικά επιτρέπουν την προσαρμογή της φόρτωσης διαφορετικών μορίων φαρμάκου και τη μελέτη της κινητικής απελευθέρωσης με μεγάλη ακρίβεια. iv. Υψηλή επιφάνεια και μεγάλη όγκος πόρων. Η συνολική επιφάνεια (> 900 m 2 / g) και ο όγκος των πόρων (> 0,9 cm 3 / g) είναι πολύ μεγάλα, γεγονός που επιτρέπει υψηλή φόρτωση φαρμακευτικών μορίων. v. Δύο λειτουργικές επιφάνειες. Τα MSN έχουν εσωτερική επιφάνεια, δηλαδή κυλινδρικούς πόρους και εξωτερική επιφάνεια σωματιδίων. Αυτό το χαρακτηριστικό επιτρέπει την επιλεκτική λειτουργικότητα των εσωτερικών και / ή εξωτερικών επιφανειών των MSN με διαφορετικά τμήματα. vi. Μοναδική πορώδης δομή. Πολλά υλικά απελευθέρωσης φαρμάκου έχουν πορώδεις δομές, όπως δενδριμερή με πορώδη δομή διακλάδωσης και λιποσώματα με μεγάλο κενό πυρήνα και πορώδες κέλυφος. Στα περισσότερα συστήματα για να επιτευχθεί η επιθυμητή μηδενική «πρόωρη» απελευθέρωση του φαρμάκου είναι απαραίτητη η παρουσία ενός φραγμού (καλύμματος), επειδή τα εγκλεισμένα με πόρους φιλοξενούμενα μόρια μπορούν να διαρρεύσουν μέσω της διασυνδεδεμένης πορώδους μήτρας όταν ορισμένοι από τους πόρους δεν καλύπτονται. Αντίθετα, τα MSN αποτελούνται από 2D εξαγωνική πορώδη δομή κυψελοειδούς μορφή, με κυλινδρικούς πόρους που εκτείνονται από το ένα άκρο της σφαίρας στο άλλο (εικόνα 2.12) και δεν υπάρχει διασύνδεση μεταξύ μεμονωμένων πορωδών καναλιών. Αυτό το μοναδικό 44

69 χαρακτηριστικό καθιστά δυνατή την αποφυγή διαρροής ακόμη και στην περίπτωση μη ολοκληρωμένου καλύμματος, πράγμα που σημαίνει ότι οι μεμονωμένοι κυλινδρικοί πόροι μπορούν να χρησιμεύσουν ως ανεξάρτητες δεξαμενές για την εγκλεισμό και την απελευθέρωση φαρμάκων, εφόσον καλύπτονται και τα δύο άκρα ενός δεδομένου καναλιού. Εικόνα Α.2.12: Εικόνες TEM των υλικών MSNs με κατεύθυνση (α) παράλληλη (β) κάθετη προς τον μακρύ άξονα των μεσοκαναλιών [141]. Νανοσωλήνες άνθρακα Οι νανοσωληνές άνθρακα (CNTs), που ανακαλύφθηκαν από τον Ιάπωνα επιστήμονα Iijim το 1991 [142], είναι αλλοτροπικές μορφές του άνθρακα και αποτελούνται από εξαγωνικά δαχτυλίδια ατόμων άνθρακα κανονικής διάταξης, τα οποία ενώνονται σε ένα λεπτότατο φύλλο γραφίτη (δύο διαστάσεων) σε κυλινδρική μορφή [143], [144], [145]. Χρησιμοποιώντας ως κριτήριο τον αριθμό των γραφιτικών τοιχωμάτων που τους απαρτίζουν, οι CNTs μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο κατηγορίες: a) Τους νανοσωλήνες άνθρακα μονού τοιχώματος ή μονοφλοιικούς (Single Wall Nanotubes, SWNTs) b) Τους νανοσωλήνες άνθρακα πολλαπλού τοιχώματος ή πολυφλοιικούς (Multiple Wall Nanotubes, MWNTs) 45

70 Όπως φαίνεται και στην Εικόνα Α.2.13, ένας μονοφλοιικός νανοσωλήνας (SWNT) δεν είναι παρά ένα φύλλο γραφίτη (γνωστό και ως γραφένιο) το οποίο τυλίγεται και σχηματίζει έναν ενιαίο κύλινδρο και έχει διάμετρο της τάξης του 1 nm, ενώ ένας πολυφλοιικός νανοσωλήνας αποτελείται από μια σειρά μονοφλοιικών, που ο ένας βρίσκεται μέσα στον άλλον και συγκρατούνται με δυνάμεις Van der Walls [146], [147]. Εικόνα Α.2.13: Απεικόνιση μονοφλοιικού (αριστερά) και πολυφλοιικού νανοσωλήνα άνθρακα (δεξιά) [148]. Οι νανοσωλήνες άνθρακα διαθέτουν εντυπωσιακές δομικές, μηχανικές και ηλεκτρονικές ιδιότητες που οφείλονται στο μικρό μέγεθος και τη μάζα τους, στην απίστευτη μηχανική τους αντοχή και στην υψηλή ηλεκτρική και θερμική τους αγωγιμότητα [149], [150]. Οι CNTs χρησιμοποιήθηκαν για πρώτη φορά ως πρόσθετα σε διάφορα δομικά υλικά για ηλεκτρονικά, οπτικά, πλαστικά και άλλα υλικά των πεδίων νανοτεχνολογίας. Από τις αρχές του 21ου αιώνα, έχουν αρχίσει να μελετώνται στη φαρμακευτική και την ιατρική για συστήματα χορήγησης φαρμάκων. Χάρη στη μεγάλη ειδική επιφάνεια, την εξαιρετική χημική σταθερότητα και την πλούσια σε ηλεκτρόνια πολυαρωματική δομή τους, τα CNTs είναι σε θέση να προσροφούν ή να συζεύγνυνται με μια μεγάλη ποικιλία θεραπευτικών μορίων (φάρμακα, πρωτεΐνες, αντισώματα, DNA, ένζυμα κλπ.). Έχουν αποδειχθεί εξαιρετικοί φορείς για την απελευθέρωση φαρμάκων διεισδύοντας άμεσα στα κύτταρα και διατηρώντας το φάρμακο άθικτο χωρίς να πραγματοποιείται μεταβολισμός κατά τη διάρκεια της μεταφοράς του στο σώμα [149], [150], [151], [152]. Νανοσωματίδια σιδήρου Πολλά υλικά παρουσιάζουν μαγνητικές ιδιότητες, όπως μέταλλα (σίδηρος, νικέλιο, μαγγάνιο, κοβάλτιο), κράματα μετάλλων (FePt) και οξείδια μετάλλων. Περιορίζοντας 46

71 το ευρύ πεδίο εφαρμογής των μαγνητικών νανοσωματιδίων μόνο στις ιατρικές εφαρμογές, η επιλογή των υλικών και η μέθοδος σύνθεσης καθίσταται σημαντικά περιορισμένη. Αυτό οφείλεται κυρίως στην έλλειψη βιοσυμβατότητας ορισμένων υλικών, προκαλώντας κυτταροτοξικές αντιδράσεις στο σώμα καθώς και στην απουσία γνώσης για τη βιομετατροπή ορισμένων υλικών. Μεταξύ όλων των μαγνητικών νανοφορέων, η απαίτηση για βιοσυμβατότητα ικανοποιείται μόνο από τα νανοσωματίδια σιδήρου, ειδικά από τα δύο οξείδια (μαγνητίτη και μαγκαιμίτη) που προκύπτει από το γεγονός ότι ο σίδηρος υπάρχει σε πολλές δομές του ανθρώπινου σώματος (ήπαρ, σπλήνα, καρδιά) και αποτελεί δομική βάση για σημαντικές βιολογικές ενώσεις: αιμοσφαιρίνη, μυοσφαιρίνη και φερριτίνη. Χάρη στις μαγνητικές τους ιδιότητες, τα νανοσωματίδια σιδήρου χρησιμοποιούνται σε έναν αυξανόμενο αριθμό νέων κλάδων της ιατρικής. Χρησιμοποιούνται τόσο στο διαγνωστικό όσο και στο θεραπευτικό επίπεδο. Ως διαγνωστικό εργαλείο μπορούν να χρησιμοποιηθούν για: διαχωρισμό και διαλογή κυττάρων, καθαρισμό βιολογικών υλικών, ακινητοποίηση πρωτεϊνών, ενζύμων και νουκλεϊνικών οξέων καθώς και ως σκιαγραφικά μέσα MRI. Για θεραπευτικούς σκοπούς δοκιμάζονται ως φορείς φαρμάκων, για την πρόκληση υπερθερμίας και σε ακτινοθεραπεία με καθοδήγηση μέσω μαγνητικής τομογραφίας Τα μαγνητικά αυτά νανοσωματίδια πέρα από απλοί φορείς (χωρίς κέλυφος, γυμνές δομές) μπορούν να αποτελούν βασικό μέρος σε δομή πυρήνα-κελύφους (υβριδικοί νανοφορείς) [153]. Νανοσωματίδια χρυσού (GNPs) Τα νανοσωματίδια χρυσού έχουν μελετηθεί εκτενώς για χρήση σε βιοϊατρικές εφαρμογές λόγω των ιδιαίτερων φυσικοχημικών και οπτικών ιδιοτήτων τους που εξαρτώνται από το μέγεθος. Διαθέτουν μοναδικές οπτικές και ηλεκτρικές ιδιότητες, καλή βιοσυμβατότητα, χαμηλή τοξικότητα, ελεγχόμενο μέγεθος και υψηλή συγγένεια με ομάδες θειόλης καθιστώντας τα κατάλληλα για παράδοση φαρμάκων και για διάγνωση [154]. 47

72 Κβαντικές τελείες. (QD) Οι κβαντικές κουκίδες (QDs) είναι νανοκρύσταλλοι ημιαγώγιμων υλικών μεγέθους περίπου 2-10 nm, που αποτελούνται από έναν οργανικό ημιαγώγιμο πυρήνα (CdSe), και ένα υδατικό οργανικό επικαλυμμένο κέλυφος (π.χ. ZnS) για τη βελτίωση των οπτικών ιδιοτήτων και μπορούν να φτιαχτούν σε φθορισμό όταν διεγείρονται από το φως. Επιπλέον οι κβαντικές κουκίδες φέρουν ένα κάλυμμα το οποίο τους επιτρέπει την βελτίωση της διαλυτότητάς τους σε υδατικά ρυθμιστικά διαλύματα. Αυτά τα συστήματα βρίσκονται σε μια κατάσταση μεταξύ του μοριακού και του bulk υλικού. Ο πυρήνας τους προσδιορίζει το εκπεμπόμενο χρώμα και το εξωτερικό υδατικό κέλυφος είναι διαθέσιμο για σύζευξη με βιομόρια. Η βιομοριακή αυτή σύζευξη μπορεί να τροποποιηθεί σύμφωνα με τον στοχευόμενο βιοδείκτη [155]. Οι QD παρουσιάζουν ξεχωριστές ιδιότητες με κυριότερες τη περιορισμένη εκπομπή, τον έντονο φθορισμό, την υψηλή φωτοσταθερότητα και το ευρύ φάσμα διέγερσης με υπεριώδη ακτινοβολία και χάρη σε αυτές έχουν χρησιμοποιηθεί για την παρακολούθηση ενδοκυτταρικών διεργασιών για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα αλλά και σε πραγματικό χρόνο καθώς και για in vitro βιοαπεικόνιση. Οι κύριες χρήσεις τους περιλαμβάνουν την απεικόνιση μαγνητικού συντονισμού και την επισήμανση των κυττάρων για ανίχνευση και ανάλυση in vitro και in vivo βιομορίων. Επιπλέον επιστρατεύονται για τη θεραπεία του καρκίνου λειτουργώντας ως νανοφορείς φαρμάκων καθώς και στην ανάπτυξη μη ιϊκών φορέων για γονιδιακή θεραπεία [156]. Α.2.3. Φυσικοχημικά Χαρακτηριστικά Νανοφορέων Μέγεθος-κατανομή μεγέθους Το μέγεθος και η κατανομή μεγέθους των σωματιδίων είναι τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά των νανοσωματιδιακών συστημάτων. Καθορίζουν την in vivo 48

73 κατανομή, τη βιολογική πορεία, την τοξικότητα και την ικανότητα στόχευσης των νανοσωματιδίων. Επιπλέον επηρεάζουν τη φόρτωση και την αποδέσμευση του φαρμάκου, τη σταθερότητα των νανοφορέων [157] ενώ παράλληλα διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στον τρόπο ενδοκυττάρωσης, στην κυτταρική πρόσληψη και στην αποτελεσματικότητα της επεξεργασίας των σωματιδίων στην ενδοκυτταρική οδό [158], [159]. Για την αποτελεσματική χορήγηση φαρμάκων σε ασθενή ιστό (π.χ. όγκους), τα νανοσωματίδια θα πρέπει να αποφεύγουν την κάθαρση από το RES ή τη διήθηση από τον πνεύμονα, το ήπαρ ή την σπλήνα. Το μέγεθος των νανοσωματιδίων έχει παρατηρηθεί ότι έχει ισχυρή επίδραση στην οψωνινοποίηση και συνεπώς στην φαγοκυττάρωση. Γενικά, μικρά σωματίδια είναι λιγότερο πιθανό να προσληφθούν από μακροφάγα σε σχέση με τα πιο μεγάλα λόγω της κατάλληλης γεωμετρικής διαμόρφωσης για αποτελεσματική ενεργοποίηση συμπληρώματος, η οποία μπορεί να επιτευχθεί πιο δύσκολα στις πιο καμπυλωμένες επιφάνειες των μικρότερων σωματιδίων από ό, τι σε μεγαλύτερες. Παράλληλα η κυκλοφορία και η βιοκατανομή των νανοσωματιδίων, καθορίζονται από το μέγεθος, με τα μικρά νανοσωματίδια (10-20 nm) να εμφανίζουν ευρεία εξάπλωση σε διάφορα όργανα με διέλευση των στενών ενδοθηλιακών συνδέσεων και να εκκρίνονται γρήγορα μέσω των σπειραμάτων του νεφρού σε αντίθεση με τα μεγάλα (π.χ.> 1 μm), ο ρυθμός απομάκρυνσης των οποίων είναι υψηλός. Τα μεγάλα σωματίδια τείνουν να συσσωματώνονται υπό φυσιολογικές συνθήκες και να συγκρατούνται μηχανικά από τα τριχοειδή αγγεία. Ωστόσο, όταν το μέγεθος των σωματιδίων εμπίπτει ανάμεσα σε αυτά τα δύο άκρα (20 nm <d <1 μm), όλοι αυτοί οι μηχανισμοί απομάκρυνσης ελαχιστοποιούνται και ο χρόνος κυκλοφορίας είναι παρατεταμένος (Εικόνα Α.2.14). Επομένως, τα συστηματικά χορηγούμενα νανοσωματίδια πρέπει να έχουν διάμετρο από 20 έως 100 nm με διάμετρο μεγαλύτερη από 20 nm για να αποφευχθεί η διήθηση από τους νεφρούς και μικρότερα από 100 nm για να αποφευχθεί η πρόσληψη από τα μακροφάγα του σπληνός και τα κύτταρα Kupffer του ήπατος [160]. 49

74 Εικόνα Α.2.14: Το μέγεθος των σφαιρικών νανοσωματιδίων καθορίζει το μηχανισμό και το ρυθμό απομάκρυνσης. Σφαίρες μικρότερες από 20 nm περνούν εύκολα διαμέσου των στενών ενδοθηλιακών συνδέσεων, με αποτέλεσμα ένα σχετικά ταχύ ρυθμό κάθαρσης από την κυκλοφορία ενώ τα μεγάλα σωματίδια (π.χ.> 1 μm) υπόκεινται σε γρήγορη πρόσληψη από το μονοπύρηνο φαγοκυτταρικό σύστημα.. Ωστόσο, όταν το μέγεθος των σωματιδίων πέφτει μεταξύ των δύο παραπάνω ακραίων τιμών, όλοι αυτοί οι μηχανισμοί κάθαρσης ελαχιστοποιούνται και οι χρόνοι κυκλοφορίας παρατείνονται (το πάχος των βέλων αντιπροσωπεύει την ισχύ της δύναμης) [160]. Όσον αφορά την κυτταρική πρόσληψη, εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το μέγεθος των σωματιδίων, γεγονός που μπορεί να επηρεάσει την κυτταρική κατανομή και την την πορεία της πρόσληψης νανοσωματιδίων μέσω της αλληλεπίδρασης των νανοσωματιδίων με τα κύτταρα, έχοντας αντίκτυπτο στην αποτελεσματικότητα της πρόσληψης. Για παράδειγμα, η κινητική της πρόσληψης και η συγκέντρωση κορεσμού των νανοσωματιδίων χρυσού ποικίλλουν ανάλογα με το μέγεθος και οι νανοφορείς με 50 nm δείχνουν μέγιστη πρόσληψη από τα κύτταρα στα 14, 50 και 74 nm, το οποίο υποδεικνύει ότι μπορεί να υπάρχει ένα βέλτιστο μέγεθος για την αποδοτική πρόσληψη νανοσωματιδίων στα κύτταρα, που μπορεί να καθορίσει και τον τρόπο εισόδου [160]. Το μέγεθος των νανοφορέων δεν επηρεάζει μόνο την βιοκατανομή και την κυτταρική πρόσληψή τους, αλλά και την ικανότητα αποδέσμευσης του φαρμάκου. Μικρότερα σωματίδια έχουν μεγαλύτερη επιφάνεια, και ως εκ τούτου το μεγαλύτερο μέρος του φαρμάκου θα είναι συνδεδεμένο στην επιφάνεια των σωματιδίων (ή κοντά σε αυτήν), 50

75 οδηγώντας έτσι σε ταχεία αποδέσμευση του φαρμάκου. Τα μεγαλύτερα σωματίδια έχουν μεγάλους πυρήνες που επιτρέπουν μεγαλύτερη ενκαψακίωση του φαρμάκου αλλά και πιο αργή αρχική αποδέσμευση, εξαιτίας της μεγαλύτερης απόστασης που πρέπει να διανύσει το φάρμακο για να ευρεθεί εκτός του νανοφορέα. Μικρότερα σωματίδια έχουν επίσης μεγαλύτερο κίνδυνο συσσωμάτωσης κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης και της μεταφοράς τους. Αποτελεί πρόκληση ο σχηματισμός νανοσωματιδίων με το μικρότερο δυνατό μέγεθος, αλλά με τη μέγιστη σταθερότητα [161]. Σχήμα Ένα άλλο σημαντικό χαρακτηριστικό που μπορεί να επηρεάσει την κυτταρική πρόσληψη και τη βιοκατανομή αποτελεί το σχήμα των νανοφορέων. Έχει αποδειχθεί ότι μη σφαιρικά σωματίδια παρουσιάζουν αυξημένο χρόνο κυκλοφορίας στο αίμα, λόγω μειωμένης φαγοκυττάρωσης, αλλά ταυτόχρονα χαρακτηρίζονται και από μειωμένη κυτταρική πρόσληψη, σε σύγκριση με σφαιρικά σωματίδια. Σύμφωνα με τους Gratton et al., μεγαλύτερη απόδοση πρόσληψης παρουσιάζουν τα ραβδοειδή σωματίδια, ακολουθούν τα σφαιρικά, τα κυλινδρικά και τέλος τα κυβικά [162]. Υδροφοβικότητα Εκτός από το μέγεθος και το σχήμα των νανοσωματιδίων, η υδροφοβικότητα της επιφάνειάς τους καθορίζει την ποσότητα των συστατικών του αίματος που προσροφώνται, κυρίως των πρωτεϊνών (οψωνίνες). Αυτό με τη σειρά του επηρεάζει την in vivo τύχη των νανοσωματιδίων [163], [164]. Η σύνδεση αυτών των οψωνινών στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων που ονομάζεται οψωνινοποίηση δρα ως γέφυρα μεταξύ των νανοσωματιδίων και των φαγοκυττάρων. Η σύνδεση ενός φαρμάκου με συμβατικούς φορείς οδηγεί σε τροποποίηση του προφίλ βιοκατανομής του, καθώς αποδεσμεύεται κυρίως στο σύστημα μονοπυρηνικών φαγοκυττάρων (MPS) όπως στο ήπαρ, στον σπλήνα, στους πνεύμονες και στον μυελό των οστών. Πράγματι, όταν βρεθούν στην κυκλοφορία του αίματος, νανοσωματίδια μη τροποποιημένα επιφανειακά (συμβατικά νανοσωματίδια) υπόκεινται σε οψωνινοποίηση γρήγορα και μαζική κάθαρση από τα μακροφάγα των οργάνων που είναι πλούσια σε MPS [165]. 51

76 Επομένως, για να αυξηθεί η πιθανότητα επιτυχίας της στοχευμένης χορήγησης φαρμάκων από νανοσωματίδια, είναι απαραίτητο να ελαχιστοποιηθεί η οψωνινοποίηση και να παραταθεί ο χρόνος παραμονής τους στην κυκλοφορία του αίματος. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με επιφανειακή επικάλυψη των νανοφορέων με υδρόφιλα πολυμερή / επιφανειοδραστικές ουσίες ή με σύνθεση νανοφορέων με βιοαποικοδομήσιμα συμπολυμερή με υδρόφιλα τμήματα, όπως η πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) [166]. Οι αλυσίδες PEG στην επιφάνεια των νανοφορέων σχηματίζουν ένα «σύννεφο» υδρόφιλου στερικού φραγμού, λόγω της υψηλής υδροφιλικότητάς τους, της ευκαμψίας των αλυσίδων, της ηλεκτρικής ουδετερότητας και της απουσίας λειτουργικών ομάδων, το οποίο οδηγεί στην παρεμπόδιση των αλληλεπιδράσεων με τις πρωτεΐνες του πλάσματος ή τα μακροφάγα με αποτέλεσμα την παρατεταμένη παραμονή στην κυκλοφορία του αίματος [160]. Επιφανειακό φορτίο Η εμφάνιση επιφανειακού φορτίου στα περισσότερα εναιωρήματα σωματιδίων σε υδατικά μέσα οφείλεται στην ύπαρξη φορτισμένων ομάδων στα σωματίδια ή/και στην προσρόφηση ιόντων από το μέσο διασποράς. Το είδος και η ένταση του φορτίου είναι από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά των νανοφορέων, καθώς καθορίζουν την αλληλεπίδρασή τους με το βιολογικό περιβάλλον, αλλά και την ηλεκτροστατική αλληλεπίδρασή τους με βιοενεργά συστατικά. Η κολλοειδής σταθερότητα των συστημάτων σχετίζεται με το ζήτα δυναμικό, το οποίο αποτελεί έμμεση εκτίμηση του επιφανειακού φορτίου. Απαιτούνται υψηλές τιμές του ζήτα δυναμικού, θετικές ή αρνητικές, προκειμένου να εξασφαλιστεί η σταθερότητα των διασπορών και να αποφευχθεί η συσσωμάτωσή τους [167]. Από την άλλη πλευρά όμως, το υψηλό επιφανειακό φορτίο οδηγεί σε φαγοκυττάρωση μεγαλύτερης έκτασης, που έχει ως επακόλουθο τη μείωση του χρόνου παραμονής των νανοφορέων στη γενική κυκλοφορία. Επιπλέον, μελέτες δείχνουν ότι νανοφορείς αρνητικά φορτισμένοι παρουσιάζουν μικρότερη κυτταρική πρόσληψη, λόγω ηλεκτροστατικής άπωσης από τις αρνητικά φορτισμένες κυτταρικές μεμβράνες του οργανισμού [168]. Αντιθέτως, το θετικό επιφανειακό φορτίο προάγει τη μη ειδική προσκόλληση των νανοφορέων στις βιολογικές μεμβράνες μέσω ηλεκτροστατικής έλξης, ενώ παράλληλα 52

77 εμποδίζει τη βαθύτερη διάχυσή τους στους όγκους και την ανακατανομή τους στην συστηματική κυκλοφορία. Όλοι αυτοί οι λόγοι εξηγούν τη μεγαλύτερη τοξικότητα, που παρουσιάζουν τα κατιονικά νανοσωματίδια σε σχέση με τα ανιονικά [169]. Ωστόσο, η αλληλεπίδραση των νανοφορέων με τα κύτταρα εξαρτάται από πολλούς παράγοντες και μερικές μελέτες έχουν αναφέρει την παρουσία ουδέτερων νανοσωματιδίων στο ενδοπλασματικό δίκτυο, γεγονός που υποδηλώνει την ικανότητά τους να αποφύγουν την διάσπαση στο λυσοσωμικό-ενδοσωμικό διαμέρισμα [170]. Εικόνα Α.2.15: Η κάθαρση των σωματιδίων επηρεάζεται από τις ιδιότητες της επιφάνειας. Τα φορτισμένα νανοσωματίδια μπορούν να αλληλεπιδράσουν με το αγγειακό τοίχωμα μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων, αυξάνοντας έτσι τον ρυθμό κάθαρσης. Για παράδειγμα, τα θετικά φορτισμένα νανοσωματίδια έχουν υψηλή συγγένεια για την ανιοντική κυτταρική μεμβράνη (A) και τα αρνητικά φορτισμένα νανοσωματίδια αν και παρουσιάζουν μικρότερη κυτταρική πρόσληψη λόγω ηλεκτροστατικής άπωσης, μπορούν δυνητικά να δεσμευτούν με τις διαθέσιμες κατιονικές θέσεις στην κυτταρική επιφάνεια (Β). Αυτό πιθανά μπορεί να οδηγήσει στην σύγκρουση με τα τοιχώματα των αιμοφόρων αγγείων και την πρόσληψη από τα μακροφάγα. Ωστόσο, τα ουδέτερα σωματίδια (π.χ. αυτά που είναι επικαλυμμένα με υδρόφιλα πολυμερή, πχ PEG) μπορούν να αποτρέψουν την αλληλεπίδραση με το αγγειακό τοίχωμα, οδηγώντας σε απομάκρυνση μικρότερης έκτασης και παρατεταμένο χρόνο κυκλοφορίας (C) [160]. 53

78 Φόρτωση φαρμάκου Ιδανικά ένα επιτυχημένο νανοσωματιδιακό σύστημα θα πρέπει να έχει υψηλή ικανότητα φόρτωσης φαρμάκου και κατ επέκταση να μειώνει την ποσότητα των συστατικών της μήτρας. Η φόρτωση του φαρμάκου μπορεί να γίνει με δύο τρόπους: είτε με ενσωμάτωση της δραστικής ουσίας κατά την σύνθεση των νανοσυστημάτων (μέθοδος ενσωμάτωσης), είτε με προσρόφηση του φαρμάκου από ήδη σχηματισμένους φορείς, επωάζοντάς τους σε πυκνό διάλυμα του φαρμάκου (μέθοδος προσρόφησης/ απορρόφησης). Η φόρτωση και η αποτελεσματικότητα εγκλωβισμού του φαρμάκου εξαρτώνται από τη διαλυτότητα της δραστικής ουσίας στα υλικά της μήτρας ή στο πολυμερές, την σύνθεση του πολυμερούς, το μοριακό βάρος του φαρμάκου και την αλληλεπίδρασή του με το πολυμερές, αλλά και από την ύπαρξη τελικών λειτουργικών ομάδων όπως αμινομάδες και καρβοξύλια [171], [172], [173]. Μελέτες δείχνουν ότι για μικρά μόρια, η ιοντική αλληλεπίδραση μεταξύ του φαρμάκου και των υλικών της μήτρας μπορεί να είναι ένας πολύ αποτελεσματικός τρόπος για αύξηση της φόρτωσης του φαρμάκου [174], [175]. Απελευθέρωση φαρμάκου και βιοαποικοδόμηση Η απελευθέρωση του φαρμάκου όσο και η βιοαποικοδόμηση του νανοφορέα αποτελούν σημαντικούς παράγοντες που πρέπει να ληφθούν υπόψη για την ανάπτυξη ενός επιτυχημένου συστήματος νανοσωματιδίων. Γενικά, ο ρυθμός απελευθέρωσης φαρμάκου εξαρτάται από: τη διαλυτότητα του φαρμάκου, την εκρόφηση του δεσμευμένου στην επιφάνεια ή προσροφημένου φαρμάκου, τη διάχυση του φαρμάκου μέσω της μήτρας των νανοσωματιδίων, τη διάβρωση / αποικοδόμηση της μήτρας των νανοφορέων και τέλος τον συνδυασμό των διεργασιών της διάβρωσης και της διάχυσης. Συνεπώς, η διαλυτότητα, η διάχυση και η βιοαποικοδόμηση των υλικών μήτρας καθορίζουν τη διαδικασία αποδέσμευσης του φαρμάκου. Στην περίπτωση των νανοσφαιρών, όπου το φάρμακο είναι ομοιόμορφα κατανεμημένο εντός του συστήματος, η απελευθέρωση λαμβάνει χώρα με διάχυση ή διάβρωση της μήτρας υπό συνθήκες δεξαμενής. Εάν η διάχυση του φαρμάκου είναι ταχύτερη από τη διάβρωση της μήτρας, ο μηχανισμός απελευθέρωσης ελέγχεται σε μεγάλο βαθμό από 54

79 τη διαδικασία διάβρωσης. Η ταχεία αρχική απελευθέρωση (burst effect) οφείλεται κατά κύριο λόγο σε ασθενώς συνδεδεμένο ή προσροφημένο φάρμακο στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων [176]. Επιπλέον, η μέθοδος φόρτωσης του φαρμάκου μπορεί να επηρεάσει το προφίλ της απελευθέρωσης. Όταν το φάρμακο φορτωθεί με τη μέθοδο ενσωμάτωσης, τότε το σύστημα δεν παρουσιάζει «burst effect», αλλά χαρακτηριστικά παρατεταμένης αποδέσμευσης [177]. Ακόμη αν το νανοσωματίδιο είναι επικαλυμμένο με πολυμερές, η απελευθέρωση μπορεί να ελέγχεται από τη διάχυση του φαρμάκου μέσω της πολυμερικής μεμβράνης. Η επικάλυψη αυτή ενεργεί ως ένα εμπόδιο για την απελευθέρωση, ως εκ τούτου, η διαλυτότητα και ικανότητα διάχυσης του φαρμάκου στην πολυμερική μεμβράνη αποτελεί καθοριστικό παράγοντα στην απελευθέρωση του φαρμάκου [178]. 55

80 56

81 Α.3. Νανοσωματίδια Χρυσού Το κεφάλαιο αυτό αφιερώνεται στα νανοσωματίδια χρυσού (AuNPs) τα οποία αποτελούν σημαντικά συστατικά για βιοϊατρικές εφαρμογές αφού έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως τόσο για διαγνωστικούς όσο και για θεραπευτικούς σκοπούς χάρη στις μοναδικές ιδιότητες που διαθέτουν. A.3.1. Εισαγωγή Ο αναδυόμενος τομέας της βιονανοτεχνολογίας ή της νανοβιοτεχνολογίας προσφέρει τη δυνατότητα ανάπτυξης πολύ ευαίσθητων συστημάτων για διαγνωστικό σκοπό και στοχευμένη θεραπεία παρέχοντας μια ποικιλία εργαλείων νανοκλίμακας για την ιατρική. Μεταξύ αυτών οι νανοσωματιδιακοί φορείς έχουν φέρει επανάσταση στον τομέα της χορήγησης φαρμάκων και μπορεί να είναι πολυμερικοί, λιπιδικοί ή μεταλλικοί. Τα νανοσωματίδια χρυσού μπορούν να θεωρηθούν ως ανώτερες πλατφόρμες για θεραπευτικές και διαγωνιστικές εφαρμογές λόγω των μοναδικών ιδιοτήτων τους, όπως η αντοχή στη διάβρωση, η βιοσυμβατότητά τους και οι οπτικές και ηλεκτρονικές ιδιότητες, οι οποίες εξαρτώνται από το μέγεθος [179], [180]. Τα νανοσωματίδια χρυσού όταν έρχονται σε επαφή με το ορατό φως παράγουν ζωηρά χρώματα, ιδιότητα η οποία έχει διερευνηθεί περαιτέρω και χρησιμοποιηθεί σε αισθητήρες ανίχνευσης, σε συστήματα χορήγησης φαρμάκων, στη νανοϊατρική, στην θεραπεία του καρκίνου, στην κατάλυση και στην παρακολούθηση βιολογικών συστημάτων [179], [181]. Όπως οι πολυμερικοί και λιπιδικοί νανοφορείς, τα μεταλλικά νανοσωματίδια μπορούν να φορτώθουν (encapsulate) με υψηλότερη συγκέντρωση 57

82 φαρμάκου και να το παραδώσουν στις θέσεις-στόχους στο σώμα. Υπάρχει μεγάλο ενδιαφέρον για την χρήση νανοϋλικών στις βιοϊατρικές εφαρμογές, διότι το μέγεθός τους είναι ισοδύναμο ή μικρότερο από αυτό βιολογικών οντοτήτων όπως τα γονίδια (πάχος 2 nm και μήκος nm), πρωτεϊνών (5-50 nm), ιών nm), ή κυττάρων ( μm) [180], [182], [183], [184]. Έτσι τα νανοσωματίδια μπορούν εύκολα να προσπελαύνουν δυσπρόσιτες περιοχές του οργανισμού, να αλληλεπιδρούν σε μοριακό επίπεδο ή να παραδίδουν το φάρμακο που περιέχουν (loaded drug) επηρεάζοντας σημαντικά την ολοένα διευρυνόμενη φάση του βιοϊατρικού πεδίου. Μια επιβεβαίωση αυτής της πρόβλεψης είναι η πληθώρα ερευνών που προωθούν την ανάπτυξη νανοσωματιδίων και νανο-δομών για βιοαισθητήρες, διαγνωστικά μέσα, χορήγηση φαρμάκων και θεραπευτικούς σκοπούς. Τα κολλοειδή νανοσωματίδια χρυσού αναδύονται ως μια νέα πλατφόρμα για την ανάπτυξη πολυλειτουργικών στοχευμένων νανοθεραπευτικών φαρμάκων. A.3.2. Φαρμακευτική-Θεραπευτική χρήση του χρυσού δια μέσου των αιώνων Η χρήση του χρυσού στα φάρμακα είναι γνωστή από αρχαιοτάτων χρόνων σε πολιτισμούς όπως της Κίνας, της Αιγύπτου και της Ινδίας. Οι πολιτισμοί της Ανατολικής Ευρώπης χρησιμοποιούσαν φυτικά σκευάσματα με βάση το χρυσό για τη διατήρηση της υγείας τους [185]. Στη Δύση, τα φάρμακα που βασίζονταν στον χρυσό έχουν χρησιμοποιηθεί ιστορικά για νευρικές διαταραχές, την επιληψία, τη λέπρα, τη σύφιλη, την πανώλη και τη διάρροια [186]. Η βακτηριοστατική επίδραση του χρυσού διερευνήθηκε αρχικά στις αρχές του 20ου αιώνα, όταν βρέθηκε ότι είναι δραστικός έναντι του Bacillus tuberculosis, οδηγώντας στη θεραπεία της φυματίωσης Αυτό έθεσε τα θεμέλια της σύγχρονης φαρμακοθεραπείας με βάση το χρυσό. Αργότερα, τα σκευάσματα με χρυσό εισήχθησαν στην κλινική πρακτική για τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών όπως η ψωρίαση, η αρθρίτιδα και οι ρευματοπάθειες [185]. Η πρώτη γενιά αυτών των φαρμάκων συμπεριελάμβανε το aurothiomalate sodium και το aurothioglucose sodium, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν κυρίως για τη ρευματοειδή αρθρίτιδα. Τα φάρμακα αυτά ήταν υδατοδιαλυτά, και η κατανομή και η κάθαρσή τους πραγματοποιούνταν από τα νεφρά, το ήπαρ και τον σπλήνα. Εντούτοις, αναφέρθηκαν 58

83 αρκετές παρενέργειες, όπως νεφροτοξικότητα, ηπατοτοξικότητα και δερματικές αντιδράσεις. Ένα φάρμακο χρυσού δεύτερης γενιάς, το auranofin, το οποίο περιείχε συνδέτη φωσφίνης (phosphine ligand) και ήταν περισσότερο λιπόφιλο, παρουσίασε καλύτερο χρόνο κατακράτησης και μειωμένη νεφροτοξικότητα [187]. Πρόσφατα, ο χρυσός έχει χρησιμοποιηθεί σε πολλά σύγχρονα ιατρικά βοηθήματα, όπως επιχρυσωμένα στεντ, βηματοδότες καθώς και σε πολλά νανοσύνθετα συστήματα τα οποία αναμένεται να έχουν αντιμικροβιακές, αντικαρκινικές, ανθελονοσιακές, αντιρευματικές και αντι-ηiv εφαρμογές [188]. A.3.3. Ιδιότητες νανοσωματιδίων χρυσού Τα νανοσωματίδια χρυσού διακρίνονται από πολλούς άλλους τύπους νανοσωματιδίων, επειδή ο χρυσός διαθέτει πολλά πλεονεκτήματα. Αρχικά είναι ένα αδρανές υλικό, το οποίο δεν υφίσταται οξείδωση σε θερμοκρασίες κάτω από το σημείο τήξης του και δεν αντιδρά με το ατμοσφαιρικό Ο 2 καθώς και με πολλές χημικές ουσίες. Αυτές οι ιδιότητες καθιστούν δυνατό τον χειρισμό και τον έλεγχό του υπό ατμοσφαιρικές συνθήκες [189]. Επιπλέον ο χρυσός είναι βιοσυμβατός αφού πολυάριθμες μελέτες έχουν αποδείξει την ασφάλεια και τη βιοσυμβατότητά του τόσο in vitro όσο και in vivo, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα νανοσωματίδια χρυσού μπορούν να χορηγηθούν με ασφάλεια προκαλώντας ελάχιστη φλεγμονώδη ενεργοποίηση και λίγες τοπικές ή συστηματικές παρενέργειες. Παράλληλα, ο υψηλός ατομικός αριθμός του χρυσού (Au, 79) επιτρέπει την υψηλή απορρόφηση και ενίσχυση της ιονίζουσας ακτινοβολίας, καθώς και την εξασθένηση των ακτίνων Χ για εφαρμογές απεικόνισης. [190]. Ένας άλλος λόγος για τη συχνή χρήση του χρυσού στη σύνθεση νανοσωματιδίων είναι οι καλά καθορισμένες συνθετικές μέθοδοι για την παρασκευή και τον χειρισμό τους. Πράγματι, μπορούν να συντίθενται σύντομα με διάφορους τρόπους, είτε σε υδατικό, είτε σε οργανικό διαλύτη ακολουθώντας μονο- ή διφασικές μεθόδους [191]. Μια σύνθεση νανοσωματιδίων χρυσού σε ποικίλα σχήματα και μεγέθη σχήματα παρουσιάζεται στην Εικόνα Α

84 Εικόνα Α.3.1: Νανοσωματίδια χρυσού σε διάφορα σχήματα και μεγέθη. Μικρές (a) και μεγάλες (b) νανοσφαίρες (nanospheres), (c) νανοράβδοι (nanorods), (d) νανοράβδοι με λεπτυσμένα άκρα (sharpened nanorods), e) νανοκυψέλες (nanoshells), (f) νανοκλωβοί (nanocages/frames), (g) κοίλες νανοσφαίρες (hollow nanospheres), (h) τετραέδρα/οκταεδρά/κύβοι/εικοσάεδρα, (tetrahedra/octahedra/cubes/icosahedra), (i) ρομβοειδή δωδεκάεδρα (rhombic dodecahedra, (j) οκτάεδρα (octahedra), (k) κοίλοι νανοσωλήνες (concave nanocubes), (l) τετραεξάεδρα (tetrahexahedra), (m) ρομβοειδή δωδεκάεδρα (rhombic dodecahedra), (n) αμβλείες τριγωνικές διπυραμίδες (obtuse triangular bipyramids), (o) τριςοκτάεδρα (trisoctahedra), και (p) νανοπρίσματα (nanoprisms) [192]. Επίσης, ο χρυσός διαθέτει εύκολα ελεγχόμενη επιφανειακή χημεία επιτρέποντας τη τροποποίησή της, προκειμένου να καταστεί λειτουργική, με διάφορα βιολογικά μόρια για την αποφυγή ανίχνευσης από το ανοσοποιητικό σύστημα, τη βελτίωση της σταθερότητας, της στόχευσης όγκων και τη διέλευση βιοφυσικών φραγμών [190]. Η δυνατότητα τροποποίησης της επιφάνειας των νανοσωματιδίων χρυσού παρέχει τη δυνατότητα εγκλωβισμού σε αυτά πολλαπλών θεραπευτικών παραγόντων ή βιομακρομορίων μέσω ομοιοπολικής ή μη σύνδεσης στην επιφάνειά τους. DNA, ένζυμα, αντισώματα και λειτουργικά πολυμερή μπορούν να συνδεθούν εύκολα στα νανοσωματίδια χρυσού, παρέχοντας μια πολλά υποσχόμενη πλατφόρμα για διάφορους τύπους εφαρμογών στη βιονανοτεχνολογία. Παράλληλα μπορεί να επιτευχθεί ειδική 60

85 κυτταρική σύνδεση όταν μόρια ενεργούς στόχευσης συνδεθούν στην επιφάνεια των νανοφορέων, όπως το φυλλικό οξύ, το υαλουρονικό οξύ και τα πεπτίδια [193]. Ωστόσο, για την επιτυχή σύζευξη των νανοσωματιδίων χρυσού με διάφορους λειτουργικούς μοριακούς συνδέτες απαιτούνται κατάλληλες χημικές ομάδες πρόσδεσης (anchoring groups) που χρησιμοποιούνται για τη σύνδεση αυτών των μορίων στην επιφάνεια του χρυσού και περιλαμβάνουν: θειόλες, διθειόλες, διθειοκαρβαμικά, αμίνες, καρβοξυλικά, σεληνίδια, ισοθειοκυανικά ή τμήματα φωσφίνης [192]. Ιδιαίτερα η δέσμευση θειολών με υψηλή συγγένεια, έχει καθοριστική σημασία για το σχηματισμό αυτοσυναρμολογούμενων µονοµοριακών στρωµάτων (self-assembly monolayer, SAM) [194]. Από τα σημαντικότερα χαρακτηριστικά των νανοσωματιδίων χρυσού αποτελούν η υψηλή αναλογία επιφάνειας προς όγκο καθώς και οι οπτικές και ηλεκτρονικές ιδιότητες οι οποίες επηρεάζονται σε μεγάλο βαθμό από το μέγεθος και το σχήμα των νανοσωματιδίων (Εικόνα 3.3). Ο συντονισμός επιφανειακών πλασμονίων (SPR) είναι ένα ειδικό φαινόμενο που παρατηρείται σε AuNPs όταν η συχνότητα των ταλαντούμενων ηλεκτρονίων που υπάρχουν στη ζώνη αγωγιμότητας του χρυσού συναρμοσθεί με τη συχνότητα της εισερχόμενης ακτινοβολίας οδηγώντας σε μια ζώνη πλασμονίου. Η στενή περιοχή συχνοτήτων της ακτινοβολίας φωτός, που είναι υπεύθυνη για την επίτευξη SPR σε AuNPs, συνήθως εμπίπτει στην ορατή και στην εγγύς υπέρυθρη περιοχή (NIR) του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος. Γενικά, παρατηρείται μια μονή ζώνη πλασμονίου για τα σφαιρικά νανοσωματίδια χρυσού στα ~ 520 nm, ενώ για τα ανισότροπα νανοσωματίδια όπως οι νανοράβδοι, παρατηρούνται δύο ζώνες πλασμονίου λόγω της ταλάντωσης ηλεκτρονίων κατά μήκος δύο αξόνων, ενός διαμήκους και ενός εγκάρσιου. Η εγκάρσια ζώνη πλασμονίου εμφανίζεται στα ~ 520 nm ενώ η διαμήκης εμφανίζεται σε μεγαλύτερο μήκος κύματος ανάλογα με το λόγο διαστάσεων (λόγος μήκους / πλάτους) (Εικόνα 3.4). Η ένταση και η κορυφή της ζώνης SPR εξαρτάται από παράγοντες που επηρεάζουν κυρίως την πυκνότητα του φορτίου των ηλεκτρονίων στην επιφάνεια των σωματιδίων όπως ο τύπος του μετάλλου, το μέγεθος των σωματιδίων, το σχήμα, η δομή, η σύνθεση και η διηλεκτρική σταθερά του περιβάλλοντος μέσου. Έτσι το SPR χρησιμεύει ως ένα βασικό εργαλείο για την παρακολούθηση της μορφολογίας των συντιθέμενων νανοσωματιδίων χρυσού [207]. 61

86 Εικόνα Α.3.2: Ευελιξία των νανοσωματιδίων χρυσού. Τα AuNPs μπορούν να ρυθμίζονται σε διάφορα σχήματα και μεγέθη, να συνδεθούν με διάφορα βιομόρια και είναι γενικά ασφαλή και μη τοξικά in vitro και in vivo. Έχουν επίσης την ικανότητα να ενισχύουν τη θεραπεία ακτινοβολίας των όγκων, καθώς και να χρησιμεύουν ως παράγοντες αντίθεσης υψηλής απεικόνισης [190]. 62

87 Εικόνα Α.3.3: Φωτογραφίες TEM από νανοσφαίρες και νανοράβδους χρυσού με αυξανόμενη σειρά διαστάσεων (κόκκινη ράβδος 100 nm). Το διάλυμα εμφανίζεται σε διαφορετικό χρώμα με βάση το μέγεθος ή τον λόγο διαστάσεων (λόγος μήκους / πλάτους) που είναι πιο σημαντικός για τις νανοράβδους σε σύγκριση με τις νανοσφαίρες, όπως φαίνεται από την ένταση της αλλαγής χρώματος. Το μέγεθος για τις νανοσφαίρες χρυσού (A-E) κυμαίνεται από 4-40 nm ενώ για τις νανοράβδους χρυσού (F-K) ο λόγος διαστάσεων κυμαίνεται από 1,5 έως 20 [195]. 63

88 Εικόνα Α.3.4: Νανοράβδοι χρυσού (NRs) με συντονισμένες οπτικές απορροφήσεις σε μήκη κύματος ορατής και εγγύς υπέρυθρης περιοχής. a) Φάσματα οπτικής απορρόφησης των νανοράβδων χρυσού με διαφορετικούς λόγους διαστάσεων (a-e). b) Έγχρωμος τροχός ο οποίος αναφέρεται στις NRs με ετικέτες α-ε, όπου TR ο εγκάρσιος συντονισμός [195]. A.3.4. Μέθοδοι σύνθεσης νανοσωματιδίων χρυσού Γενικές Αρχές Οι τεχνικές για την παραγωγή διαφορετικών AuNPs μπορούν να κατηγοριοποιηθούν σε δύο αρχές, τη μέθοδο "bottom up" και τη μέθοδο "top down" [196]. Η μέθοδος "bottom up" περιλαμβάνει τη λιθογραφία νανοσφαίρας και τεχνικές χημικής, φωτοχημικής, ηλεκτροχημικής, υπερηχητικής και θερμικής αναγωγής [197], [198], [199], [200], [201], [202]. Οι διαδικασίες "bottom up" οδηγούν από την ατομική διάσταση σε νανοδομημένα υλικά και βασίζονται στη χημική σύνθεση και στην οργάνωση της δομής από τη «φυσική» σκοπιά και στο φαινόμενο της αυτοοργάνωσης. Οι μέθοδοι "top down", όπως η φωτολιθογραφία και η λιθογραφία ηλεκτρονικής ακτινοβολίας [203], [204], στηρίζονται στη μείωση του μεγέθους για την δημιουργία υλικών νανομετρικής διάστασης. Ενώ και οι δύο μέθοδοι μπορούν να παράγουν νανοσωματίδια χρυσού επιθυμητού σχήματος και μεγέθους, καθεμία έχει τα δικά της μειονεκτήματα, όπως δυσκολία λήψης σωματιδίων με ίδιο μέγεθος (μονοδιασποράς) στην περίπτωση της "bottom up" μεθόδου και εκτεταμένα απόβλητα υλικού στη "top down". Ορισμένες από τις συνηθέστερα 64

89 χρησιμοποιούμενες τεχνικές "bottom up" για την σύνθεση νανοσωματιδίων χρυσού αναφέρονται παρακάτω. Εικόνα Α.3.5: Σχηματική απεικόνιση των μεθόδων "bottom up" και "top down" για τη σύνθεση νανοσωματιδίων χρυσού [205]. ΣΥΝΘΕΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ Χημική μέθοδος Γενικά, η παρασκευή των ΑuΝΡs με τη μέθοδο χημικής αναγωγής περιλαμβάνει δύο κύρια μέρη [206] : αναγωγή η οποία πραγματοποιείται με διάφορους παράγοντες, όπως βοροϋδρίδια, αμινοβοράνες, φορμαλδεΰδη, υδραζίνη, υδροξυλαμίνη, πολυόλες, κιτρικά και οξαλικά οξέα, σάκχαρα, υπεροξείδιο του υδρογόνου, μονοξείδιο του άνθρακα, θειώδη άλατα, υδρογόνο, ακετυλένιο και ηλεκτρονικά αναγωγικά μέσα. χρήση σταθεροποιητικών μέσων, όπως, διένυδρο κιτρικό τρινάτριο, συνδέτες θείου (συγκεκριμένα θειόλες), προσδέματα φωσφόρου, προσδέματα με βάση το οξυγόνο και το άζωτο (συμπεριλαμβανομένων των ετεροκυκλικών ενώσεων), δενδριμερή, πολυμερή και επιφανειοδραστικά (συγκεκριμένα βρωμιούχο 65

90 κετυλοτριμεθυλαμμώνιο, CTAB). Έτσι μπορεί να αποφευχθεί η συσσωμάτωση των σωματιδίων. Mέθοδος Turkevich Η μέθοδος Turkevich περιγράφηκε αρχικά το 1951 και είναι μία από τις συνηθέστερα χρησιμοποιούμενες μεθόδους για τη σύνθεση σφαιρικών νανοσωματιδίων χρυσού στην κλίμακα μεγεθών 10 nm-20 nm. Η αρχή αυτής της μεθόδου περιλαμβάνει την αναγωγή των ιόντων χρυσού (Au 3+ ) σε άτομα χρυσού (Au 0 ) παρουσία αναγωγικών παραγόντων όπως κιτρικό, αμινοξέα, ασκορβικό οξύ ή υπεριώδες φως. Το μέγεθος των AuNPs σταθεροποιείται περαιτέρω χρησιμοποιώντας διάφορους παράγοντες κάλυψης / σταθεροποίησης. Αρχικά η μέθοδος Turkevich περιορίστηκε από το μικρό εύρος μεγεθών των AuNPs που θα μπορούσαν να δημιουργηθούν με αυτή τη μέθοδο. Ωστόσο, αρκετές εξελίξεις στην αρχική μέθοδο επέτρεψαν στους ερευνητές να επεκτείνουν την περιοχή μεγέθους των σωματιδίων που μπορούν να παραχθούν μέσω αυτής της μεθόδου. Το 1973, ο Frens διαπίστωσε ότι μεταβάλλοντας την αναλογία των μέσων αναγωγής προς τους σταθεροποιητές, μπορούν να επιτευχθούν νανοσωματίδια χρυσού συγκεκριμένου μεγέθους, που κυμαίνονται από 16 nm-147 nm. Αργότερα, οι ρόλοι του pη, της θερμοκρασίας και της συγκέντρωσης κιτρικού νατρίου κατανοήθηκαν καλύτερα, επιτρέποντας τη δημιουργία ενός μοντέλου ανάπτυξης σωματιδίων [207]. Εικόνα Α.3.6: Σύνθεση νανοσωματιδίων χρυσού με τη μέθοδο του Turkevich και τη χρήση κιτρικού οξέος [208]. 66

91 Μέθοδος Brust Η μέθοδος Brust περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1994 και είναι μια διεργασία δύο φάσεων για τη δημιουργία νανοσωματιδίων χρυσού μεγέθους 1,5 nm-5.2 nm χρησιμοποιώντας οργανικούς διαλύτες (Εικόνα Α.3.7) και μεταβάλλοντας την αναλογία θειόλης προς χρυσό. Η μέθοδος Brust βασίστηκε στο σύστημα δύο φάσεων του Faraday. Περιλαμβάνει μεταφορά άλατος χρυσού από υδατικό διάλυμα σε οργανικό διαλύτη (π.χ. τολουόλιο) με τη χρήση ενός παράγοντα μεταφοράς φάσης (π.χ. βρωμιούχο τετραοκτυλαμμώνιο, ΤΟΑΒ). Ο χρυσός στη συνέχεια ανάγεται χρησιμοποιώντας βοροϋδρίδιο του νατρίου (NaBH 4 ) παρουσία αλκανοθειόλης, με αποτέλεσμα την αλλαγή χρώματος της αντίδρασης από πορτοκαλί σε καφέ [ ]. Εικόνα Α.3.7: Μια λεπτομερής σχηματική αναπαράσταση των βημάτων σύνθεσης νανοσωματιδίων χρυσού με τη μέθοδο Brust. Σε αυτή τη διαδικασία, το μέταλλο (Au 3+ ) που είναι το διάλυμα τετραχλωροχρυσικού οξέος (HAuCl 4 ) μεταφέρεται σε οργανική φάση (τολουόλιου) με τη βοήθεια του ΤΟΑΒ ακολουθούμενη από την αναγωγή του σε Au O παρουσία NaBH 4 για να δώσει νανοσωματίδια με μέγεθος 5 ± 1 nm [209]. 67

92 Μέθοδος ανάπτυξης σπόρων (Seeded growth method) Ενώ οι μέθοδοι Turkevich και Brust μπορούν να παράγουν σφαιρικά AuNPs, τα νανοσωματίδια χρυσού μπορούν επίσης να υπάρχουν σε ποικιλία νανοδομών όπως ράβδοι, κύβοι, σωλήνες. Η πιο συχνά προτιμώμενη τεχνική για να ληφθούν σε άλλα σχήματα είναι η μεσολαβούμενη από πολύ μικρά νανοσωματίδια χρυσού (σπόρους, seeds) ανάπτυξη (Εικόνα Α.3.8). Η βασική αρχή αυτής της τεχνικής είναι πρώτα η παραγωγή σωματιδίων σπόρου με αναγωγή των αλάτων χρυσού με ισχυρό αναγωγικό παράγοντα όπως το βοροϋδρίδιο του νατρίου (NaBH 4 ). Τα σωματίδια σπόρου στη συνέχεια προστίθενται σε διάλυμα μεταλλικού άλατος παρουσία ενός ασθενούς αναγωγικού παράγοντα (ασκορβικό οξύ) και ενός παράγοντα καθοδήγησης της δομής για την πρόληψη περαιτέρω πυρήνωσης και την επιτάχυνση της ανισοτροπικής ανάπτυξης των νανοσωματιδίων. Η γεωμετρία των νανοδομών χρυσού μπορεί να μεταβληθεί με μεταβολή της συγκέντρωσης των σπόρων, των αναγωγικών παραγόντων και των παραγόντων καθοδήγησης της δομής [ ]. Εικόνα Α.3.8: Μια διαγραμματική αναπαράσταση για τη σύνθεση των νανοράβδων χρυσού και των νανοσφαιρών χρυσού χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ανάπτυξης «σπόρων» μαζί με εικόνες TEM των νανοσωματιδίων που προκύπτουν. Το στάδιο 1 περιλαμβάνει τη σύνθεση σπόρων χρυσού που στη συνέχεια αναμιγνύονται με διάλυμα ανάπτυξης που συντίθεται στο στάδιο 2 για να αποδώσει σφαιρικά νανοσωματίδια χρυσού και νανοσωλήνες χρυσού (στάδιο 3) [210]. 68

93 Μέθοδος ηλεκτροχημικής παραγωγή (Electrochemical method) Η ηλεκτροχημική παραγωγή νανοσωματιδίων μελετήθηκε για πρώτη φορά από τον Reetz και την ομάδα του το Οι μελέτες τους έδειξαν ότι τα σωματίδια μεταβατικού μετάλλου που βρίσκονται στη νανοκλίμακα, μπορούν να παραχθούν ηλεκτροχημικά, χρησιμοποιώντας άλατα τετρααλκυλαμμωνίου ως σταθεροποιητές μεταλλικών συστάδων σε μη υδατικό μέσο. Τα AuNPs μπορούν να παρασκευαστούν στην επιφάνεια νανοσωλήνων άνθρακα πολλαπλών τοιχωμάτων με υαλώδη ηλεκτρόδια άνθρακα χρησιμοποιώντας την τεχνική ηλεκτροχημικής σύνθεσης. H σύνθεση πραγματοποιείται σε ένα απλό κύτταρο δύο ηλεκτροδίων, στο οποίο συντελείται οξείδωση στην άνοδο και ανάγωγη στη κάθοδο. Η εικόνα απεικονίζει σχηματικά την ηλεκτροχημική συσκευή. Η μέθοδος αυτή έχει επιβεβαιωθεί ότι είναι ανώτερη από άλλες μεθόδους παραγωγής νανοσωματιδίων, λόγω του χαμηλού κόστους, της επεξεργασίας που γίνεται σε χαμηλότερη θερμοκρασία, της υψηλής ποιότητας και τέλος της ευκολίας ελέγχου της απόδοσης [211]. Εικόνα Α.3.9: Σχηματική αναπαράσταση του ηλεκτροχημικού συστήματος για τη σύνθεση νανοσωματιδίων χρυσού [207]. 69

94 Για τη σύνθεση νανοσωματιδίων χρυσού έχουν χρησιμοποιηθεί και άλλες μέθοδοι όπως η σολβοθερμική μέθοδος [212], η φωτοχημική αναγωγή [213] καθώς και διεργασίες που χρησιμοποιούν υπέρηχους [214] και μικροκύματα [215]. ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΜΕΘΟΔΟΣ Ενώ οι μέθοδοι που περιγράφηκαν παραπάνω μπορούν να είναι αποτελεσματικές στην πααργωγή νανοσωματιδίων χρυσού, παρουσιάζουν ένα σημαντικό μειονέκτημα το οποίο είναι η δημιουργία τοξικών παραπροϊόντων που μπορεί να έχει αρνητικές περιβαλλοντικές συνέπειες κατά την παραγωγή μεγάλης κλίμακας. Επιπλέον, η χρήση τοξικών χημικών ουσιών και διαλυτών σε αυτές τις μεθόδους μπορεί να αποδειχθεί εμπόδιο για τις βιολογικές εφαρμογές των νανοσωματιδίων χρυσού. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα να αναπτύσσονται νέες στρατηγικές για την παραγωγή σωματιδίων χρυσού χωρίς την χρήση ή δημιουργία τοξικών χημικών ουσιών. Η ανάπτυξη αυτών των μεθόδων έχει υιοθετήσει τις αρχές της «πράσινης χημείας», όπως η χρήση ταχέως βιοαποικοδομήσιμων αντιδραστηρίων, ο περιορισμός των αποβλήτων, η σύνθεση σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και πίεσης καθώς και η χαμηλή τοξικότητα των χημικών προϊόντων. Η βιολογική σύνθεση των AuNPs, χρησιμοποιώντας συστατικά όπως υδατάνθρακες, λιπίδια, νουκλεϊνικά οξέα ή πρωτεΐνες που παράγονται στη φύση, είναι μια ταχέως αναπτυσσόμενη περιοχή έρευνας για τη σύνθεση των νανοσωματιδίων χρυσού με μια καθαρή, φιλική προς το περιβάλλον, μη τοξική μέθοδο. Εκτός από τη μείωση των ζητημάτων τοξικότητας που σχετίζονται με τη σύνθεση των νανοσωματιδίων, τα βιοσυστατικά έχουν επιπλέον πλεονεκτήματα όπως η ευρεία διαθεσιμότητα, το χαμηλό κόστος παραγωγής, η ευκολία σύνθεσης και η περιβαλλοντική ασφάλεια. Μέχρι σήμερα έχουν δημοσιευθεί πολλές μελέτες που αφορούν τη σύνθεση νανοσωματιδίων χρυσού διάφορων μεγεθών και σχημάτων χρησιμοποιώντας τις παραπάνω βιολογικές πηγές (Εικόνα 3.10) [207]. Χρήση συστατικών από φυτά Τα φυτά αποδεικνύονται εξαιρετικές πηγές για τη βιοσύνθεση των νανοσωματιδίων χρυσού με καθαρό, αξιόπιστο και φιλικό τρόπο. Υπάρχουν πολλά άρθρα που αναφέρουν τη βιοσύνθεση των νανοσωματιδίων χρυσού χρησιμοποιώντας διαφορετικά φυτά ή φυτικά εκχυλίσματα. Ορισμένα από τα 70

95 «πράσινα» πλεονεκτήματα περιλαμβάνουν τη χρήση μη τοξικών βιοσυστατικών για την αναγωγή και επικάλυψη των νανοσωματιδίων χρυσού, περιορίζοντας έτσι τον σχηματισμό αποβλήτων και μειώνοντας την ανάγκη για πρόσθετα βήματα καθαρισμού με αποτέλεσμα την ευκολία διαθεσιμότητας. Διάφορα βιοσυστατικά που υπάρχουν σε φυτά όπως φλαβονοειδή, φυτοστερόλες, κινόνες κ.α εμπλέκονται στη σύνθεση επειδή διαθέτουν λειτουργικές ομάδες οι οποίες καταλύουν την αναγωγή και τη σταθεροποίηση των AuNPs. Η διαδικασία περιλαμβάνει την ανάμιξη του άλατος χρυσού με εκχυλίσματα φυτού για καθορισμένο χρονικό διάστημα υπό ποικίλες συνθήκες αντίδρασης όπως pη, χρόνος επώασης και θερμοκρασία για να ληφθούν συγκεκριμένα σχήματα και μεγέθη [207]. Χρήση μικροοργανισμών Τα βακτήρια και η ζύμη είναι ευρέως γνωστά για την αλληλεπίδρασή τους με ανόργανα μέταλλα και χρησιμοποιούνται συνήθως στην βιοαποικοδόμηση ορυκτών από τα μεταλλεύματά τους όπως ο χρυσός, ο ψευδάργυρος και το ασήμι. Πρόσφατα, μια ποικιλία μικροοργανισμών έχει χρησιμοποιηθεί ως «εργοστάσιο» για την παραγωγή των νανοσωματιδίων χρυσού τόσο ενδοκυτταρικά όσο και εξωκυτταρικά. Τα μικροβιακά κύτταρα κατά την επεξεργασία με άλατα χρυσού συνθέτουν νανοδομές χρυσού οι οποίες στη συνέχεια απομονώνονται και καθαρίζονται χρησιμοποιώντας διάφορες τεχνικές. Ο έλεγχος του μεγέθους και του σχήματος μπορεί να επιτευχθεί με κατάλληλη επιλογή των σημαντικών παραμέτρων ανάπτυξης [207]. Χρήση βιομορίων Τα μόρια που παράγονται από ζωντανούς οργανισμούς για τη κατάλυση των βιολογικών λειτουργιών του σώματος είναι γνωστά ως βιομόρια και περιλαμβάνουν αμινοξέα, νουκλεϊνικά οξέα, υδατάνθρακες και λιπίδια. Αυτά διαθέτουν λειτουργικές ομάδες υδροξυλίου και καρβονυλίου οι οποίες μπορούν να ανάγουν τα ιόντα Au 3+ σε ουδέτερα άτομα Au 0. Τα Αu 0 τότε επικαλύπτονται για να σχηματίσουν σταθεροποιημένα AuNPs. Αυτή η μέθοδος μπορεί να 71

96 ξεπεράσει το πρόβλημα της βιο-ασφάλειας των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται [207]. Εικόνα Α.3.10: Μια απεικόνιση που δείχνει διαφορετικές βιολογικές πηγές που χρησιμοποιούνται στην «πράσινη» σύνθεση νανοσωματιδίων χρυσού [207]. A.3.5. Νανοσωματίδια χρυσού ως οχήματα παράδοσης φαρμάκων- μέθοδοι φόρτωσης και αποδέσμευσης θεραπευτικών μέσων Τα νανοσωματίδια έχουν χρησιμοποιηθεί σε διερευνητικές εφαρμογές χορήγησης φαρμάκων λόγω των ακόλουθων λόγων (πιθανές ιδιότητες): (i) Διαθέτουν μεγάλη ειδική επιφάνεια η οποία παρέχει θέσεις για τη φόρτωση φαρμάκων και ενισχύουν τη διαλυτότητα και τη σταθερότητα των φορτωμένων φαρμάκων. 72

97 (ii) Έχουν την ικανότητα να συνδεθούν με μονάδες στόχευσης. (iii) Μπορούν να επιτυγχάνουν πολλαπλές αλληλεπιδράσεις με τους επιφανειακούς υποδοχείς κυττάρων ή με άλλα βιομόρια. (iv) Μεταβάλλουν την φαρμακοκινητική των φαρμάκων και ενισχύουν την συσσώρευση στους καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με τα ελεύθερα φάρμακα εξαιτίας του φαινομένου EPR. Κλασικά νανοσωματίδια όπως τα λιποσώματα και τα πολυμερικά νανοσωματίδια διαθέτουν φυσικές ιδιότητες όπως το μέγεθος και η υψηλή ειδική επιφάνεια, αλλά στερούνται τις μοναδικές οπτικές και φωτοθερμικές ιδιότητες των νανοσωματιδίων χρυσού. Έτσι, τα νανοσωματίδια χρυσού αποτελούν αποτελεσματικούς παράγοντες για τη χορήγηση φαρμάκων και τη θεραπεία καρκίνου. Μια συνοπτική παρουσίαση που παρουσιάζει τις διαφορετικές προσεγγίσεις για τη φόρτωση και απελευθέρωση των θεραπευτικών ουσιών με τα νανοσωματίδια χρυσού απεικονίζεται στην Εικόνα Α Εικόνα Α.3.11: Παρουσιάζονται διάφορες προσεγγίσεις για τη φόρτωση των θεραπευτικών ουσιών στα νανοσωματίδια χρυσού, καθώς και την απελευθέρωση από αυτά. Κατανομή και απελευθέρωση με διάχυση (Partitioning and difusion-driven) υδρόφοβων φαρμάκων σε (a) διπλοστοιβάδα επιφανειοδραστικής ουσίας (a surfactant bilayer) ή (b) αμφίφιλη κορώνα (amphiphilic corona layer) (c) πρόσδεση φαρμάκων (Anchoring drugs) απευθείας στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων χρυσού μέσω δεσμών Au-S ή Au-N (ο παράγοντας κάλυψης σε μπλε χρώμα είναι υδρόφιλο πολυμερές, π.χ. PEG, για να ενισχυθεί η συνολική υδατοδιαλυτότητα του συστήματος). Η απελευθέρωση ενεργοποιείται από το φωτοθερμικό 73

98 φαινόμενο, την ανταλλαγή θειόλης (π.χ. ανταλλαγή γλουταθειόνης) ή από απλή διάσπαση στις κυτταρικές μεμβράνες (στην περίπτωση του Au-N). (d-e) νανοσωματίδια χρυσού φορτωμένα με DNA μέσω δεσμών Au-S. Η απελευθέρωση του δίκλωνου (d) ή ενός μονόκλωνου (e) DNA ελέγχεται με την εφαρμογή λέιζερ. (f) Οι θεραπευτικοί παράγοντες συζεύγνυνται / συμπλέκονται με τερματικές λειτουργικές ομάδες του παράγοντα κάλυψης μέσω ενός διασπάσιμου συνδέτη (cleavable linker). Η απελευθέρωση μπορεί να ενεργοποιηθεί με υδρόλυση, φως, θερμότητα και / ή αλλαγές ph. (g) Φόρτωση φορτισμένων βιομορίων (π.χ. DNA ή sirna) στις επιφάνειες των νανοσωματιδίων χρυσού με ηλεκτροστατική συναρμολόγηση (LbL coating). Η απελευθέρωση του φορτωμένου βιοδραστικού μορίου μπορεί να ενεργοποιηθεί με αντιστροφή του φορτίου των πολυηλεκτρολυτών σε συνδυασμό με την αλλαγή του ρη. (h) Μόρια φαρμάκου ενσωματώνονται στη μήτρα (δίκτυο) ενός θερμοευαίσθητου πολυμερούς. Η απελευθέρωση μπορεί να ενεργοποιηθεί με φωτοθερμική θέρμανση από τα νανοσωματίδια χρυσού τα οποία είναι ενσωματωμένα στη μήτρα [192]. Φόρτωση μέσω κατανομής (Loading by partitioning) (Εικόνα Α.3.11 a-b). Τα νανοσωματίδια χρυσού διαθέτουν μία ή δύο στοιβάδες του παράγοντα κάλυψης, ο οποίος χρησιμεύει ως σταθεροποιητικός παράγοντας κατά της συσσωμάτωσης ή σε ορισμένες περιπτώσεις ως παράγοντας καθοδήγησης του σχήματος κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης νανοσωματιδίων. Η παρουσία αυτής της μονής ή διπλής στoιβάδας είναι πλεονεκτική για τη φόρτωση φαρμάκων και στη συνέχεια την απελευθέρωσή τους στην επιθυμητή περιοχή του σώματος. Μία ή δύο στρώσεις παραγόντων κάλυψης στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων χρυσού μπορεί να θεωρηθεί ως ένα λεπτό στρώμα οργανικού διαλύτη, το οποίο είναι ικανό να διαχωρίζει υδρόφοβα φάρμακα από το υδατικό μέσο διασποράς. Φόρτωση με επιφανειακή συμπλοκοποίηση (Loading by surface complexation) (Εικόνα Α.3.11 c-e). Η μέθοδος φόρτωσης βασίζεται στη συγγένεια των θειολών και των αμινών για την επιφάνεια των νανοσωματιδίων χρυσού. Τα φάρμακα με θειόλες ή ελεύθερες αμίνες (ως μέρος της αρχικής δομής του φαρμακομορίου ή προστιθέμενες, χωρίς ελάττωση της εγγενούς δραστικότητας του φαρμάκου) μπορούν να προσδεθούν στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων χρυσού μέσω του σχηματισμού δεσμών Au-S ή Au-N. Αυτή η προσέγγιση έχει χρησιμοποιηθεί για την σύνδεση φαρμάκων, DNA και sirna στην επιφάνεια των νανοσωματιδίων χρυσού. Το φάρμακο ή βιομόριο μπορεί στη συνέχεια να απελευθερωθεί με διάφορους τροπους, όπως διάσπαση σε κυτταρικές 74

99 μεμβράνες (στην περίπτωση ασθενέστερου Au-N), ανταλλαγή θειόλης (όπως με ενδοκυτταρική γλουταθειόνη) και εξωτερικό φως που ενεργοποιεί την απελευθέρωση με το φωτοθερμικό φαινόμενο (είτε με το σπάσιμο του δεσμού Au-S ή / και την τήξη του ίδιου του νανοσωματιδίου). Αξίζει να σημειωθεί εδώ ότι ο τρόπος της συμπλοκοποίησης του φαρμάκου στην επιφάνεια του χρυσού επηρεάζει το προφίλ της απελευθέρωσής του. Στην περίπτωση φαρμάκων που έχουν θειόλες, ο δεσμός Au-S μπορεί να είναι αρκετά ισχυρός ώστε να αποτρέψει την απελευθέρωση του φαρμάκου με απλή διάλυση. Πράγματι, τα συμπλεγμένα θεραπευτικά μέσα μέσω δεσμών Au-S συχνά χρειάζονται τη βοήθεια εξωτερικών ερεθισμάτων προκειμένου να απελευθερωθούν, όπως ανταλλαγή θειόλης ή τη χρήση εξωτερικού φωτός. Στην περίπτωση των αμινών, ο δεσμός Au-N είναι πολύ ασθενέστερος από τον Au-S και αυτό μπορεί να προσφέρει ένα πλεονέκτημα για πιο αποτελεσματική απελευθέρωση του φαρμάκου με διάχυση. Φόρτωση με σύνδεση σε παράγοντες κάλυψης (Loading by attachment to capping agents) (Εικόνα Α.3.11 f). Τα φάρμακα μπορούν να συνδεθούν με νανοσωματίδια χρυσού μέσω συμπλοκοποίησης ή σύζευξης με τερματικές λειτουργικές ομάδες των παραγόντων κάλυψης. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η επιφάνεια είναι πλήρης με διάφορες λειτουργικές ομάδες και η προσκόλληση του φαρμάκου προχωρά στο εξωτερικό στρώμα πάνω στα σωματίδια. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί όταν η σύνδεση του υδρόφοβου φαρμάκου πραγματοποιείται με σύζευξη, καθώς υπάρχει η πιθανότητα συσσωμάτωσης των νανοσωματιδίων. Φόρτωση με μηχανισμό συναρμολόγησης στρώση με στρώση (Loading by layerby-layer assembly) (Εικόνα Α.3.11 g). Συνήθως, τα νανοσωματίδια χρυσού (η σύνθεση των οποίων έχει γίνει σε νερό) φορτίζονται λόγω της παρουσίας φορτισμένων παραγόντων κάλυψης στις επιφάνειές τους. Έτσι, φορτισμένα φάρμακα μπορούν εύκολα να συνδεθούν με τις επιφάνειες των συμπληρωματικών φορτισμένων νανοσωματιδίων χρυσού με ηλεκτροστατική σύζευξη ή με την συναρμολόγηση στρώση με στρώση (LbL). Το καλύτερο παράδειγμα για αυτόν τον τύπο φόρτωσης είναι η προσκόλληση νουκλεϊνικών οξέων (DNA ή sirna) στις επιφάνειες των νανοσωματιδίων χρυσού με συμπλοκοποίηση φορτίου. Τα μόρια DNA ή sirna, που θεωρούνται βιολογικοί πολυηλεκτρολύτες με υψηλό αρνητικό φορτίο, μπορούν να συναρμολογηθούν σε νανοσωματίδια χρυσού θετικού φορτίου για την παράδοση in vivo γονιδίων και την γονιδιακή σίγαση. 75

100 Φόρτωση στο εσωτερικό των νανοσωματιδίων (Εικόνα Α.3.11 h). Λόγω της μεγάλης επιφάνειας και της παρουσίας εσωτερικών δεξαμενών για τη φόρτωση των θεραπευτικών μέσων, οι κοίλες νανοδομές χρυσού, όπως οι νανοκλωβοί και οι νανοκυψέλες, μελετώνται για εφαρμογές χορήγησης φαρμάκων [192]. A.3.6. Νανοσωματίδια χρυσού και Καρκίνος Το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου προβλέπει ότι τα επόμενα χρόνια η νανοτεχνολογία θα οδηγήσει σε σημαντική πρόοδο την έγκαιρη ανίχνευση, τη μοριακή απεικόνιση, τη στοχευμένη και πολυλειτουργική θεραπευτική, την πρόληψη και τον έλεγχο του καρκίνου [216]. Η νανοτεχνολογία προσφέρει πολυάριθμα εργαλεία για τη διάγνωση και θεραπεία του καρκίνου, όπως νέους παράγοντες απεικόνισης, πολυλειτουργικά συστήματα ικανά να ξεπεράσουν τα βιολογικά εμπόδια για την παράδοση θεραπευτικών παραγόντων απευθείας στα κύτταρα και στους ιστούς που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του καρκίνου και στη μετάσταση καθώς και συσκευές ικανές να προβλέπουν μοριακές μεταβολές προκαρκινικών κυττάρων [217]. Τα συστήματα χορήγησης με βάση τα νανοσωματίδια στη Θεραγνωστική (Διάγνωση & Θεραπεία) παρέχουν καλύτερη διείσδυση θεραπευτικών και διαγνωστικών ουσιών στο σώμα με μειωμένο κίνδυνο σε σύγκριση με τις συμβατικές θεραπείες [218], [219]. Οι περιορισμοί στην ιατρική πρακτική σχετίζονται στενά με το γεγονός ότι υπάρχει διαχωρισμός μεταξύ της διάγνωσης, της θεραπείας και των θεραπευτικών οδηγιών. Εδώ, η Θεραγνωστική ενώνει τα τρία αυτά στάδια σε μια ενιαία διαδικασία, ενισχύοντας τη διάγνωση και τη θεραπεία σε πρώιμο στάδιο [220], [221]. Προς το παρόν, υπάρχει μια αυξανόμενη ανάγκη να ενισχυθεί η ικανότητα των θεραγνωστικών διαδικασιών όπου νανοσωματιδιακοί αισθητήρες μπορούν να παρέχουν την ταυτόχρονη ανίχνευση αρκετών γονιδιακών αλλαγών και νανοσυσκευές που διαθέτουν την ικανότητα παρακολούθησης της δράσης φαρμάκων σε πραγματικό χρόνο. Αυτοί οι καινοτόμοι πολυλειτουργικοί νανοφορείς μπορούν να επιτρέψουν την ανάπτυξη διαγνωστικών συστημάτων όπως χρωματομετρικές ή ανοσολογικές δοκιμές καθώς και να παρέχουν θεραπεία μέσω γονιδιακής θεραπείας, χορήγησης φαρμάκων και συστημάτων στόχευσης όγκων (Εικόνα Α.3.12). 76

101 Σήμερα η κύρια πρόκληση είναι να αναπτυχθεί ένα σύστημα μοριακής θεραπείας ικανό για συνεχή ροή στην κυκλοφορία του αίματος, μη ανιχνεύσιμο από το ανοσοποιητικό σύστημα, το οποίο μπορεί να αναγνωρίσει τον επιθυμητό στόχο και να τον «σηματοδοτήσει» για αποτελεσματική παροχή φαρμάκου ή γονιδιακή σίγαση. Έτσι η νανοτεχνολογία παίζει ρόλο στην παροχή νέων νανοθεραπευτικών συστημάτων για τον καρκίνο, τα οποία έχουν τη δυνατότητα να παρέχουν αποτελεσματικές θεραπείες με ελάχιστες παρενέργειες και με υψηλές προδιαγραφές [222]. Τα νανοσωματίδια χρυσού (AuNPs) είναι ένα από τα νανοσυστήματα που παρέχουν μη-τοξικούς φορείς για εφαρμογές φαρμάκων και γονιδίων [223], [224]. Είναι πολυδύναμοι παράγοντες με ποικιλία βιοϊατρικών εφαρμογών, συμπεριλαμβανομένης της χρήσης σε πολύ ευαίσθητες διαγνωστικές δοκιμασίες [225], στη φωτοθερμικη θεραπεία, στην ενίσχυση της ακτινοθεραπείας [226], [227], [228] καθώς και στην παράδοση φαρμάκων και γονιδίων [229], [230]. Τα μοναδικά χαρακτηριστικά των νανοσωματιδίων χρυσού, όπως η υψηλή αναλογία επιφάνειας προς όγκο ή οι εξαρτώμενες από το μέγεθος οπτικές ιδιότητες, διαφέρουν πολύ από εκείνα των υλικών bulk και βρίσκουν κλινική εφαρμογή για τη θεραπεία ασθενειών [231], [222]. Τα νανοσωματίδια που εμφανίζουν αυτές τις μοναδικές και ευρείας βάσης οπτικές ιδιότητες, ευκολία σύνθεσης, εύκολη επιφανειακή χημεία, δυνατότητα τροποποίησης και κατάλληλη κλίμακα μεγέθους, αποτελούν βασικούς παράγοντες στην κλινική διάγνωση και θεραπεία. Οι πιο συνηθισμένες εφαρμογές στις οποίες έχουν χρησιμοποιηθεί μέχρι στιγμής οι νανοφορείς χρυσού είναι η σήμανση, η παράδοση, η υπερθερμία και η ανίχνευση [232]. 77

102 Εικόνα Α.3.12: Νανοφορείς για την Θεραγνωστική του καρκίνου. Οι στρατηγικές με βάση τα νανοσωματίδια μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη βιοαισθησία χρησιμοποιώντας πλασμονικούς νανοαισθητήρες, για χρωματομετρικές δοκιμές (colorimetric assays) και βιογραμμοκώδικες(bio-barcodes) για ανίχνευση πρωτεϊνών ή ετικέτες για ανοσοδοκιμασίες (immunoassays). Επιπλέον, η χρήση μεταλλικών επιφανειών για τη βελτίωση του σήματος σκέδασης Raman των μορίων στόχων μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάγνωση του καρκίνου. Επιπλέον οι νανοφορείς μπορούν να δρουν ως θεραπευτικοί παράγοντες μέσω συστημάτων σίγασης γονιδίων και παροχής φαρμάκων ενώ παράλληλα μπορούν να συνδεθούν με συγκεκριμένους στόχους για επιλεκτική βλάβη σε καρκινικά κύτταρα [233]. A Νανοσωματίδια χρυσού και διάγνωση καρκίνου Ο καρκίνος είναι μια από τις πρωταρχικές αιτίες θνησιμότητας στον σύγχρονο κόσμο, με περισσότερα από 10 εκατομμύρια νέα περιστατικά κάθε χρόνο [234], [235]. Μερικοί εξακολουθούν να υποστηρίζουν ότι η αναζήτηση της προέλευσης και της θεραπείας αυτής της νόσου θα συνεχιστεί μέσα στο επόμενο τέταρτο του αιώνα, προσθέτοντας διαδοχικά στρώματα πολυπλοκότητας σε μια έρευνα που είναι από μόνη της πολύ περίπλοκη. Στην πραγματικότητα, η πρόοδος στη διάγνωση και τη θεραπεία αυτής της 78

103 ασθένειας που σκοτώνει εκατομμύρια ανθρώπους κάθε χρόνο σε όλο τον κόσμο δεν ήταν τόσο αποτελεσματική όσο για άλλες χρόνιες ασθένειες και μόνο για κάποιους τύπους καρκίνου υπάρχουν αποτελεσματικές μέθοδοι ανίχνευσης [234]. Το υψηλό ποσοστό θνησιμότητας συνήθως αποδίδεται στις δυσκολίες ανίχνευσης της νόσου σε πρώιμο θεραπεύσιμο στάδιο. Η κύρια πρόκληση είναι να βρεθούν νέοι και πιο αποτελεσματικοί διαγνωστικοί παράγοντες για την παρακολούθηση των προγνωστικών κυτταρικών μεταβολών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του όγκου, προκειμένου να επιτευχθεί έγκαιρη και ακριβής διάγνωση, επιφέροντας αποτελεσματική θεραπεία του [236]. Στο σημείο αυτό εισέρχεται η νανοτεχνολογία προσφέροντας μια "μεγάλη επανάσταση" στα νέα διαγνωστικά συστήματα ιατρικής και υγειονομικής περίθαλψης [237]. Τα AuNPs είναι ένα από τα νανοσυστήματα που παρέχουν μη τοξικούς φορείς με μια ποικιλία βιοϊατρικών εφαρμογών συμπεριλαμβανομένης της χρήσης σε πολύ ευαίσθητες διαγνωστικές δοκιμασίες [238], [239]. Αρχικά τα νανοσωματίδια χρυσού βρίσκουν εφαρμογή σε δοκιμές πολυπεπτιδικών πρωτεΐνικών δεικτών (multiplexed marker protein assays) οι οποίες είναι κρίσιμες για τη διάγνωση σύνθετων ασθενειών, όπως ο καρκίνος. Πιο συγκεκριμένα οι ανιχνευτές AuNPs γραμμοκωδικοποιημένοι με DNA ανταποκριτές και ένα αντίσωμα έχουν χρησιμοποιηθεί εκτενώς με καλές προοπτικές. Επιπλέον, τα AuNPs χρησιμοποιούνται εκτενώς σε ανοσοαναλύσεις (immunoassays) που αποτελούν πολύ αποτελεσματικά νανοσυστήματα στην ανίχνευση του καρκίνου. Ειδικότερα, όταν τα νανοσωματίδια χρυσού συνδυάζονται με DLS μπορούν να καταστούν πολύ χρήσιμα για την ανίχνευση και ανάλυση βιοδεικτών ορού. Μια διαφορετική προσέγγιση της χρήσης τους στην ανίχνευση βιολογικών δεικτών καρκίνου είναι η εφαρμογή συζευγμένων νανοσωματιδίων χρυσού με αντισώματα σε διάφορους τύπους καρκίνου, όπως ο καρκίνος του μαστού, του παγκρέατος, του προστάτη, του τραχήλου της μήτρας και του στόματος. Η εκλεκτικότητα και η ταχύτητα των παραπάνω ανοσολογικών δοκιμών ανοίγουν μια νέα δυνατότητα ταχείας, απλής, καθαρής, εύκολης, οικονομικά συμφέρουσας, μη τοξικής και αξιόπιστης διάγνωσης του καρκίνου [233]. Μια άλλη μέθοδος που παρέχει άμεση ανίχνευση καρκινικών κυττάρων αποτελεί η χρωματομετρική δοκιμή με τα AuNPs, η οποία έχει χρησιμοποιηθεί σε μεγάλη κλίμακα λόγω της απλότητας και της ευελιξίας της και βασίζεται στον συντονισμό των 79

104 επιφανειακών πλασμονίων (LSPR). Τα χρησιμοποιούμενα νανοσωματίδια χρυσού τροποποιούνται συνήθως με βιομόρια (π.χ. DNA, RNA, πεπτίδια, ένζυμα) και είναι ικανά να αναγνωρίσουν τα μοριακά συμβάντα που σχετίζονται με την ανάπτυξη καρκίνου μέχρι το φεμτομοριακό επίπεδο, με ανάλυση διακριτικής ικανότητας μιας βάσης (single base discrimination resolution). Τα μοριακά νανοδιαγνωστικά που εφαρμόζονται στον καρκίνο μπορεί να παρέχουν ταχεία και ευαίσθητη ανίχνευση μοριακών μεταβολών, επιτρέποντας έτσι την έγκαιρη ανίχνευση ακόμη και όταν αυτές οι αλλοιώσεις εμφανίζονται μόνο σε μικρό ποσοστό κυττάρων. Για παράδειγμα, ο Conde και οι συνεργάτες του, παρουσίασαν μια προσέγγιση βασισμένη σε AuNPs για τη μοριακή αναγνώριση και ποσοτικοποίηση του αντίγραφου της συγχώνευσης των γονιδίων BCR-ABL (fusion transcript), το οποίο είναι υπεύθυνο για τη χρόνια μυελογενή λευχαιμία (CML). Αυτή η ανέξοδη και πολύ εύκολη στην εκτέλεση μέθοδος επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό του μη-ενισχυμένου ολικού ανθρώπινου RNA και την ειδική ανίχνευση της μεταγραφής ογκογονιδίων (Εικόνα Α.3.13). Έτσι, ο προσδιορισμός του μπορεί να αποτελέσει ένα πολλά υποσχόμενο εργαλείο για την έγκαιρη διάγνωση της CML και να επεκταθεί σε περαιτέρω γονίδια-στόχους με αποδεδειγμένη συμμετοχή στην ανάπτυξη καρκίνου [233]. 80

105 Εικόνα Α.3.13: Η χρωματομετρική ανάλυση (The colorimetric assay) (a) Ολιγονουκλεοτιδικός ανιχνευτής και αλληλουχίες-στόχοι σχεδιασμένοι για τη σύνδεση του BCR-ABL b3a2 (e14a2) και για τα γονίδια BCR και ABL. Συμπληρωματικές και μη συμπληρωματικές αλληλουχίες στόχοι χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της ειδικής αλληλεπίδρασης μεταξύ του στόχου και των νανο-ανιχνευτών χρυσού. Θετική σύντηξη BCR-ABL (100% συμπληρωματική). Οι γονιδιακές αλληλουχίες BCR και ABL χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (controls) (50% μη συμπληρωματικές) και μια εντελώς ανεξάρτητη αλληλουχία (100% μη συμπληρωματική) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας (negative control). (b) Η δοκιμασία βασίζεται στην αυξημένη σταθερότητα των νανοανιχνευτών (Au nanoprobes) κατά την υβριδοποίηση με τον συμπληρωματικό στόχο σε διάλυμα, ενώ οι μη υβριδοποιημένοι Au-nanoprobes συσσωματώνονται εύκολα μόλις αυξηθεί η ιοντική ισχύς του διαλύματος. Η απουσία πλήρους συμπληρωματικότητας αποκαλύπτεται από την αλλαγή του χρώματος από το κόκκινο στο μπλε εξαιτίας της συσσωμάτωσης Au-nanoprobe η οποία επιβεβαιώνεται και από τη Φασματοσκοπία UV / vis. BCR-ABL θετικό: παρουσία συμπληρωματικού στόχου στο δείγμα (το διάλυμα παραμένει κόκκινο). BCR-ABL αρνητικό: παρουσία μη συμπληρωματικού στόχου στο δείγμα (το διάλυμα γίνεται μπλε) [233]. 81

106 Εξίσου σημαντική και με πολλές προοπτικές αποτελεί η χρήση των νανοσωματιδίων χρυσού σε συνδυασμό με την επιφανειακά ενισχυμένη σκέδαση Raman (SERS) καθιστώντας τα ικανά να στοχεύουν και να παρέχουν ανίχνευση όγκων in vivo. Η τεχνική SERS έχει χρησιμοποιηθεί εκτεταμένα για εφαρμογές ανίχνευσης και βιοαποικοδόμησης μορίων και ιόντων, καθώς ελαχιστοποιεί το φωτο-αποχρωματισμό ή τη μη σταθερή ένταση χρώματος των συμβατικών φθοριζουσών ουσιών, ελαττώνει τον λόγο σήματος προς θόρυβο in vitro και in vivo και συνήθως οι σκεδαστές Raman είναι σταθεροί και επιφέρουν μεγάλες οπτικές βελτιώσεις. Όταν οι σκεδαστές Raman συνδυάζονται με AuNPs μπορούν να προκαλέσουν μια οπτική αντίθεση για τη διάκριση μεταξύ καρκινικών και φυσιολογικών κυττάρων και η σύζευξή τους με αντισώματα επιτρέπει τη χαρτογράφηση της έκφρασης σχετικών βιοδεικτών για μοριακή απεικόνιση καθώς και την ανίχνευση και τον χαρακτηρισμό της κυκλοφορίας των κυττάρων όγκου [233]. Ο Πίνακας Α.3.1 συνοψίζει τους πιο πρόσφατους τύπους βιοαισθητήρων με βάση τα νανοσωματίδια χρυσού για τη διάγνωση του καρκίνου, σύμφωνα με την αρχή της μεθοδολογίας ανίχνευσης. Ορισμένα από τα περιγραφόμενα νανοσυστήματα πιθανότατα πρόκειται να φέρουν επανάσταση στην κατανόηση των βιολογικών μηχανισμών και θα βελτιώσουν την κλινική πράξη με την εισαγωγή τους σε μελλοντικές πλατφόρμες διάγνωσης. Παρ 'όλα αυτά, ελάχιστα μέχρι σήμερα έδωσαν επιτυχή αποτελέσματα ή έφτασαν σε κλινικές δοκιμές. Συνεπώς, απαιτούνται νέες μέθοδοι σύνθεσης, κατασκευής και χαρακτηρισμού για την ανάπτυξη AuNPs ικανών να χρησιμοποιηθούν σε ευαίσθητες και πολλαπλές μεθόδους ανίχνευσης με αμελητέα τοξικότητα και υψηλή ευαισθησία. Στο μέλλον, είναι πιθανό να εφαρμοστούν όλες οι ιδιότητες των AuNPs μαζί και να εξελιχθεί περαιτέρω η χημεία για τη σύνθεση έξυπνων υλικών για διαγνωστικές εφαρμογές [233233]. 82

107 Πίνακας Α.3.1: Απεικόνιση των πιο πρόσφατων βιοαισθητήρων με βάση τα νανοσωματίδια χρυσού που χρησιμοποιούνται στη διάγνωση του καρκίνου [233]. A Νανοσωματίδια χρυσού και θεραπεία του καρκίνου Επί του παρόντος, οι πιο επιτυχημένες μέθοδοι θεραπείας του καρκίνου συνήθως περιλαμβάνουν επεμβατικές διεργασίες με κυριότερες την χημειοθεραπεία, την θεραπεία με ακτινοβολία και τη χειρουργική επέμβαση για την απομάκρυνση του όγκου. Παρόλο που η επιστημονική κοινότητα έχει καταβάλει τεράστιες προσπάθειες για την ενίσχυση αυτών των παραδοσιακών μεθόδων, απαιτούνται επιλεκτικές 83

108 διεργασίες, οι οποίες να μπορούν να βλάψουν τα καρκινικά κύτταρα χωρίς να καταστρέφουν τους υγιείς ιστούς. Ο ερευνητικός τομέας της νανοϊατρικής που αναπτύχθηκε ταχέως, αποτελεί ένα ελπιδοφόρο μέσο για την καταπολέμηση του καρκίνου. Ειδικά κατά την τελευταία δεκαετία έχουν πραγματοποιηθεί πολλές έρευνες για τη χρήση των νανοσωματιδίων χρυσού στον τομέα αυτό και έχει αποδειχτεί το τεράστιο δυναμικό τους για τη βελτίωση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας του καρκίνου [242]. Όσον αφορά τις διαθέσιμες θεραπευτικές προσεγγίσεις με βάση τα νανοσωματίδια χρυσού, μπορούν να ταξινομηθούν σε τέσσερις βασικούς τύπους (Εικόνα Α.3.14): 1. Φωτοθερμική θεραπεία 2. Φωτοδυναμική θεραπεία 3. Θεραπεία ακτινοευαισθησίας 4. Στοχευμένη χορήγηση (μεταφορά) αντικαρκινικών φαρμάκων Εικόνα Α.3.14: Μέθοδοι θεραπείας καρκίνου με βάση τα νανοσωματίδια χρυσού [240]. 84

109 ΦΩΤΟΘΕΡΜΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ Η μη επεμβατική φωτοθερμική θεραπεία είναι μια πολύ σημαντική εφαρμογή των νανοσωματιδίων χρυσού στη νανοιατρική που έχει δείξει θετικά αποτελέσματα στη θεραπεία καρκίνων. Παραδοσιακά, η θερμότητα έχει χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία του καρκίνου μέσω της πρόκλησης υπερθερμίας, μιας κατάστασης στην οποία τα καρκινικά κύτταρα υποβάλλονται σε υψηλές θερμοκρασίες με αποτέλεσμα το θάνατό τους. Ενώ οι πηγές θερμότητας ποικίλλουν από μικροκύματα, ακτινοβολίες, κύματα υπερήχων έως φως λέιζερ στο παρελθόν, τέτοιες προσεγγίσεις στην θεραπεία του καρκίνου δεν έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως λόγω της επακόλουθης βλάβης στους φυσιολογικούς ιστούς που περιβάλλουν τον στοχευόμενο όγκο. Με την έλευση της νανοτεχνολογίας, διάφορες νανοδομές έχουν κατασκευαστεί για τους σκοπούς της φωτοθερμικής θεραπείας. Τα NPs ευγενών μετάλλων όπως τα AuNPs προσελκύουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον διότι διαθέτουν ενισχυμένες διατομές απορρόφησης. Η ισχυρή τους απορρόφηση επιτρέπει την αποτελεσματική θεραπεία με λέιζερ με ελάχιστη "παράπλευρη βλάβη" στον περιβάλλοντα υγιή ιστό. Ο μηχανισμός με τον οποίο οι AuNPs ασκούν το φωτοθερμικό αποτέλεσμα είναι μέσω του SPR. Αυτό οδηγεί στο σχηματισμό ενός θερμαινόμενου αερίου ηλεκτρονίων που στη συνέχεια ψύχεται γρήγορα σε περίπου 1 ps μέσω εναλλαγής ενέργειας με το πλέγμα των νανοσωματιδίων (NPs). Το πλέγμα NPs με τη σειρά του θερμαίνει το περιβάλλοντα χώρο μέσω της ταχείας μεταφοράς ενέργειας διάρκειας μόνο περίπου 100 ps. Η ταχύτητα με την οποία η ενέργεια μετατρέπεται και διασκορπίζεται στο περιβάλλον αποτελεί ένα αποτελεσματικό μέσο ταχείας πρόκλησης υπερθερμίας σε περιοχές κοντά στα AuNPs μετά από ακτινοβόληση με το φως. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα την μη αναστρέψιμη βλάβη των κυττάρων λόγω της μετουσίωσης των πρωτεϊνών και της διαταραχή της διαπερατότητας της κυτταρικής μεμβράνης [241]. ΦΩΤΟΔΥΝΑΜΙΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ Μια πολλά υποσχόμενη θεραπεία για τους όγκους και άλλες κακοήθεις ασθένειες είναι η φωτοδυναμική θεραπεία (PDT), γνωστή και ως φωτοχημειοθεραπεία. Η PDT χαρακτηρίζεται από χαμηλή νοσηρότητα και καλή ανοχή καθώς αποτελεί ελάχιστα 85

110 επεμβατική διαδικασία και μπορεί να χρησιμοποιείται επανειλημμένα στην ίδια θέση προκαλώντας πολύ μικρές λειτουργικές διαταραχές. Περιλαμβάνει την καταστροφή κυττάρων που προκαλείται από δραστική μορφή οξυγόνου [singlet oxygen] ή / και άλλες ελεύθερες ρίζες (ROS) που παράγονται από μια ακολουθία φωτοχημικών και φωτοβιολογικών διεργασιών. Αυτές οι διαδικασίες αρχίζουν με την αντίδραση ενός φωτοευαισθητοποιητή (photosensitizer PS) με οξυγόνο ιστού ύστερα από έκθεση σε φως συγκεκριμένου μήκους κύματος, στην περιοχή ορατού ή εγγύς υπέρυθρου (NIR). Σύμφωνα με μελέτες τα νανοσωματίδια χρυσού τα οποία φέρουν φωτοευαίσθητους παράγοντες, αποτελούν σημαντικό εργαλείο για τη ρύθμιση των δραστικών ειδών οξυγόνου ενώ μπορούν να ενισχύσουν την παραγωγή δραστικού (κυτταροτοξικού) οξυγόνου ή την αποτελεσματικότητα της φωτοδυναμικής θεραπείας διαφόρων PS [242], [243]. ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΑΚΤΙΝΟΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ Μια άλλη θεραπεία που χρησιμοποιείται για τον καρκίνο είναι η ακτινοθεραπεία, δηλαδή η χρήση ακτίνων Χ και παρόμοιων ακτίνων (όπως ακτίνες γ, δέσμες ηλεκτρονίων και πρωτόνια) υψηλής ενέργειας για τη θεραπεία ασθενειών. Λειτουργεί με την καταστροφή των καρκινικών κυττάρων στην περιοχή που εφαρμόζεται, επιβραδύνοντας ή ακόμη και εμποδίζοντας την ανάπτυξη ενός όγκου. Παρόμοια με την φωτοθερμική και την φωτοδυναμική θεραπεία, η ακτινοθεραπεία ακτίνων Χ είναι μια μέθοδος για ειδική θεραπεία που επηρεάζει μόνο την ακτινοβολημένη περιοχή. Ωστόσο, οι ακτίνες Χ που χρησιμοποιούνται στην ακτινοθεραπεία προσφέρουν πολύ μεγαλύτερη διείσδυση συγκριτικά με το φως NIR που χρησιμοποιείται για την ενεργοποίηση των PTT και PDT. Το σημαντικότερο πρόβλημα αυτής της θεραπείας είναι η έλλειψη εκλεκτικότητας καθώς προκαλείται καταστροφή όχι μόνο του καρκινικού ιστού αλλά και του φυσιολογικού ιστού που περιβάλλει τον όγκο. Σε αντίθεση με τη κλασική ακτινοθεραπεία, η ακτινοθεραπεία μεσολαβούμενη από ραδιοευαισθητοποιητές μπορεί να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα της βλάβης του όγκου επειδή τα ραδιοευαισθητοποιητικά βοηθητικά μπορούν να βελτιώσουν τη δόση που απορροφάται ειδικά από τον ιστό του όγκου. Ειδικότερα, τα νανοσωματίδια χρυσού έχουν αποδειχθεί 86

111 σημαντικοί ραδιοευαισθητοποιητές χάρις την υψηλή πυκνότητα, τον μεγάλο συντελεστή απορρόφησης ενέργειας και τη χαμηλή τοξικότητά τους [242]. ΣΤΟΧΕΥΜΕΝΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΑΝΤΙΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ Η στοχευμένη (εκλεκτική) μεταφορά αντικαρκινικών φαρμάκων στην περιοχή του όγκου αποτελεί μια από τις πιο ελπιδοφόρες εφαρμογές των νανοσωματιδίων χρυσού στην θεραπεία του καρκίνου. Τα AuNPs έχουν συζευχθεί με μια ποικιλία αντικαρκινικών ουσιών όπως paclitaxel, cisplatin, oxaliplatin και doxorubicin. Ένας κατάλογος με χημειοθεραπευτικές ουσίες που έχουν συζευχθεί με AuNPs, μαζί με τη μέθοδο σύζευξης, παρατίθενται στον Πίνακα Α.3.2. Η σύζευξη γίνεται τόσο με απλή φυσική προσρόφηση όσο και με τη χρήση συνδετών αλκανοθειόλης (alkanethiol linkers) [244]. Όσον αφορά την εκλεκτική διάθεση των αντικαρκινικών φαρμάκων στην περιοχή του όγκου, αυτή στηρίζεται σε διάφορους μηχανισμούς διαπερατότητας περιλαμβανομένης της παθητικής στόχευσης, της ενεργητικής στόχευσης ή ενός συνδυασμού των δύο αυτών μεθόδων. Η παθητική στόχευση απλώς εκμεταλλεύεται το φαινόμενο EPR για την συσσώρευση των χημειοθεραπευτικών ουσιών σε όγκους και αποτελεί ένα σύνηθες χαρακτηριστικό της χορήγησης φαρμάκων με βάση τα νανοσωματίδια στον καρκίνο. Από την άλλη η ενεργητική στόχευση χρησιμοποιεί ΑuNPs που είναι προ-συζευγμένα με διάφορους παράγοντες στόχευσης, όπως αντισώματα, μικρά μόρια ή πεπτιδία, που αναγνωρίζουν μοριακούς στόχους (υποδοχείς) στα καρκινικά κύτταρα [245]. 87

112 Πίνακας Α.3.2: Αντικαρκινικές ουσίες συζευγμένες με νανοσωματίδια χρυσού [244]. Τέλος, πρέπει να αναφερθεί ότι τα νανοσωματίδια χρυσού μπορούν επίσης να εμφανίζουν εγγενείς αντικαρκινικές ιδιότητες. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι τα νανοσωματίδια χρυσού είναι ικανά να μεταβάλλουν τον κυτταρικό κύκλο, περιλαμβανομένης της κυτταρικής διαίρεσης, της σηματοδότησης και του πολλαπλασιασμού, και μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως κυτταροτοξικοί παράγοντες υψηλής εκλεκτικότητας για διάφορους τύπους καρκίνου [246]. Πιο συγκεκριμένα διαπιστώθηκε ότι νανοσφαίρες διαμέτρου 1.4 nm προκαλούν νέκρωση και μιτοχονδριακή βλάβη σε διάφορες κυτταρικές σειρές μέσω μηχανισμών οξειδωτικού στρες. Έτσι, αν αυτά τα άκρως τοξικά νανοσωματίδια στοχεύουν επιλεκτικά σε κακοήθεις ή νοσούντες ιστούς μπορούν να οδηγήσουν σε απόπτωση των καρκινικών κυττάρων [192]. Επιπλέον τα νανοσωματίδια χρυσού (διάμετρος 5 nm) παρουσιάζουν αντι-αγγειογόνες ιδιότητες (αναστέλλουν την ογκογενετική ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων) 88

113 σύμφωνα με μελέτες τόσο σε in vitro όσο και in vivo συνθήκες. Οι μηχανισμοί που σχετίζονται με αυτές τις νέες ιδιότητες βασίζονται στην ικανότητα των AuNPs να δεσμεύουν επιλεκτικά τις γλυκοπρωτεΐνες, που δεσμεύουν την ηπαρίνη, στις επιφάνειες των ενδοθηλιακών κυττάρων με αποτέλεσμα την επακόλουθη αναστολή της δραστηριότητάς τους [247]. Παράλληλα κλινικές μελέτες έχουν επιβεβαιώσει ότι ο παράγοντας νέκρωσης όγκου [TNF], μια κυτοκίνη που έχει εμφανίσει αντικαρκινικές ιδιότητες, μπορεί να χορηγηθεί στον ιστό-στόχο μέσω της συμπλοκοποίησης του με νανοσωματίδια χρυσού. Ο TNF είναι ικανός να αυξάνει σημαντικά τη διαπερατότητα του αγγειακού συστήματος του όγκου επιτρέποντας αυξημένη συσσώρευση άλλων χημειοθεραπευτικών φαρμάκων στον όγκο [246]. 89

114 90

115 Α.4. Φυλλικό οξύ Το φυλλικό οξύ (FA) είναι μια οργανική ένωση που ανήκει στο σύμπλεγμα υδατοδιαλυτών βιταμινών Β και καθίσταται ζωτικής σημασίας θρεπτικό συστατικό που απαιτείται από όλα τα ζωντανά κύτταρα για τη βιοσύνθεση των νουκλεοτιδίων και για τη σωστή μεταβολική διατήρηση μονοπατιών άνθρακα. Επίσης εμφανίζει υψηλή συγγένεια για τον υποδοχέα φυλλικού οξέος (FR), ο οποίος αποτελεί αναγνωρισμένο αντιγόνο/βιοδείκτης. Αυτό το φαινόμενο έχει προσφέρει τη δυνατότητα σύνδεσης σωματιδίων με το φυλλικό οξύ, το οποίο στη συνέχεια θα ενεργήσει ως μονάδα στόχευσης κυττάρων που υπερ-εκφράζουν τον FR. A.4.1. Εισαγωγή Το φυλλικό οξύ είναι ένα μικρό μόριο, γνωστό και ως βιταμίνη Β9. Αποτελεί βασικό συστατικό που συμμετέχει σε πολλές σημαντικές βιοχημικές διεργασίες στον άνθρωπο, κυρίως στην ιοντική του μορφή, όπως στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, στη ρύθμιση της δραστηριότητας των γονιδίων, στην παραγωγή των ερυθρών και των λευκών αιμοσφαιρίων, στην ανανέωση του δέρματος καθώς και στη σύνθεση χημικών ουσιών που ρυθμίζουν τη λειτουργία του εγκεφάλου. Είναι διαθέσιμο τόσο σε φυσική όσο και σε συνθετική μορφή. Το φολικό (folate ) είναι η ανιονική μορφή του φυλλικού οξέος και αναφέρεται στα διάφορα παράγωγα τετραϋδροφoλικών (THF) που 91

116 απαντώνται φυσιολογικά στα τρόφιμα ενώ ο όρος "φυλλικό οξύ" αναφέρεται στην πλήρως οξειδωμένη συνθετική ένωση που χρησιμοποιείται στα διατροφικά συμπληρώματα [248]. Δηλαδή, η διαφορά μεταξύ φολικού και φυλλικού οξέος είναι μόνο ένα πρωτόνιο. Ωστόσο, ο όρος φυλλικό οξύ γενικά εφαρμόζεται στη συνθετική μορφή αυτής της Β-βιταμίνης, η οποία είναι επίσης η πιο σταθερή μορφή [249], [250]. Η ανακάλυψη του φυλλικού οξέος πραγματοποιήθηκε τη δεκαετία του 1930, όταν η Wills ανέφερε την παρουσία μίας ουσίας στη ζύμη, που ονομάστηκε παράγοντας Wills, η οποία θα μπορούσε να αποτρέψει την μεγαλοβλαστική αναιμία που αποτελεί μια δυνητικά θανατηφόρο κατάσταση [251]. Το 1941, ο όρος "φυλλικό οξύ" δημιουργήθηκε από τη λατινική λέξη folium, που σημαίνει φύλλα, αφού το φυλλικό οξύ υπάρχει σε αφθονία στα πράσινα φύλλα συμπεριλαμβανομένου του γρασιδιού [252]. Η επακόλουθη έρευνα που διεξήχθη κατά τις επόμενες δεκαετίες βοήθησε στη λήψη πληροφοριών για τα συστατικά και το μεταβολισμό του φυλλικού οξέος, για την αλληλεπίδρασή του με τη βιταμίνη Β12 και τον μεταβολισμό της μεθειονίνης καθώς και για τον ρόλο του στην σύνθεση πυριμιδίνης και πουρίνης [253]. Η μοριακή δομή του φυλλικού οξέος μπορεί να χωριστεί σε τρία μέρη: ένα τμήμα γλουταμικού οξέος (Glu), ένα τμήμα p-αμινοβενζοϊκού οξέος (ΡΑΒΑ) και ένα τμήμα πτερίνης. Η μονάδα πτερίνης συνδέεται με το ΡΑΒΑ με μια γέφυρα μεθυλενίου και με τη σειρά του το ΡΑΒΑ συνδέεται με πεπτιδικό δεσμό με το Glu για τον σχηματισμό φυλλικού οξέος (Εικόνα Α.4.1) [254]. Εικόνα Α.4.1: Χημική δομή φυλλικού οξέος [255]. 92

117 Έχει χαμηλή διαλυτότητα στο νερό και στους 25 C, είναι πρακτικά αδιάλυτο (0,01 mg / ml). Η διαλυτότητά του βελτιώνεται σε αλκαλικό ή όξινο περιβάλλον, αν και έχει περιγραφεί ότι είναι πιο σταθερό σε αλκαλικό μέσο [256]. Το φυλλικό οξύ είναι ζωτικής σημασίας για την εξασφάλιση φυσιολογικών λειτουργιών του ανθρώπινου σώματος σε διάφορες μεταβολικές και βιοχημικές διεργασίες. Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη σύνθεση των πουρινών και των πυριμιδινών, στον μεταβολισμό της ομοκυστεΐνης και στην αντιγραφή και μεθυλίωση του DNA. Είναι επίσης απαραίτητο για την φυσιολογική ανάπτυξη των ιστών, ιδιαίτερα αυτών που συνδέονται με ταχεία κυτταρική διαίρεση όπως στην εμβρυολογία [257], [258]. Στην περίπτωση έλλειψης φυλλικού οξέος, εμφανίζονται ορισμένες σημαντικές επιπλοκές στην υγεία, συμπεριλαμβανομένης της ανδρικής υπογονιμότητας, δυσλειτουργιών του νευρικού σωλήνα στο αναπτυσσόμενο έμβρυο και άλλων επιπλοκών της εγκυμοσύνης, οι οποίες είναι επιβλαβείς για την ανθρώπινη εξέλιξη [259]. Το φυλλικό οξύ χρησιμοποιείται επίσης ευρέως ως φορέας για στοχευμένη θεραπεία και διάγνωση [260], [261] και έχουν διεξαχθεί πολυάριθμες κλινικές εφαρμογές όσον αφορά συστήματα χορήγησης φαρμάκων φυλλικού οξέος με στοχευμένο τρόπο, ιδιαίτερα στον τομέα της αντικαρκινικής έρευνας. Σε δραστικά διαιρούμενα καρκινικά κύτταρα, οι υποδοχείς φολικού οξέος (FRα, FRβ και FRδ) εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό για να ικανοποιήσουν τη ζήτηση φυλλικού οξέος [262], [263], [264] σε σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα. A.4.2. Μεταβολισμός φυλλικού οξέος Το φυλλικό οξύ με την είσοδό του σε ένα κύτταρο ανάγεται σε διϋδροφυλλικό (DHF) και έπειτα σε τετραϋδροφυλλικό (THF) με τη δράση του ενζύμου αναγωγάση του διϋδροφυλλικού (DHFR) και στα δυο βήματα. Το τετραϋδροφυλλικό είναι ένας πολυσχιδής φορέας ενεργοποιημένων μονοανθρακικών μονάδων και αποτελείται από τρεις ομάδες : μια υποκατεστημένη πτεριδίνη (6-μέθυλοπτερίνη), π-αμινοβενζοϊκό και γλουταμικό (Εικόνα Α.4.2) [265], [266], [267]. 93

118 Εικόνα Α.4.2: Χημική δομή τετραϋδροφυλλικού [267]. Η μονοανθρακική μονάδα που μεταφέρεται από το τετραϋδροφυλλικό συνδέεται στο Ν-5 ή στο Ν-10 άτομο αζώτου του (σημειώνονται ως Ν 5 και Ν 10 ) ή και στα δύο. Η μονάδα αυτή μπορεί να υπάρξει σε τρεις οξειδωτικές καταστάσεις (Πίνακας Α.4.1). Η περισσότερο ανηγμένη μορφή μεταφέρει μια μεθυλική ομάδα, ενώ η ενδιάμεση μορφή μεταφέρει μια μεθυλενική ομάδα. Οι περισσότερο οξειδωμένες μορφές μεταφέρουν μια φορμυλική, φορμινική ή μεθυλενική ομάδα. Πίνακας Α.4.1: Μονοανθρακικές μονάδες που μεταφέρονται με το τετραϋδροφυλλικό [266]. 94

119 Εικόνα Α.4.3: Μετατροπές μονοαθρακικών ομάδων πάνω στο τετραϋδροφυλλικό. Οι διαφορετικές μοριακές οντότητες ομαδοποιούνται σύμφωνα με την κατάσταση οξείδωσης: οι πιο ανηγμένες βρίσκονται προς τα πάνω, ενώ οι πιο οξειδωμένες προς τα κάτω. Όλες οι οντότητες μέσα στο ίδιο σκιασμένο πλαίσιο βρίσκονται στην ίδια κατάσταση οξείδωσης. Η μετατροπή του Ν 5,Ν 10 - μεθυλενοτετραϋδροφυλλικού σε Ν 5 -μεθυλοτετραϋδροφυλλικού είναι μη αντιστρεπτή. Κατά την ενζυμική μεταφορά φορμυλομάδων (π.χ στη σύνθεση πουρινών) αντί του Ν 5 -φορμυλοτετραϋδροφυλλικού γενικά χρησιμοποιείται το Ν 10 - φορμυλοτετραϋδροφυλλικό, επειδή είναι πιο ασταθές και συνεπώς καλύτερος δότης φορμυλομάδων [267]. Τα παράγωγα αυτά του τετραϋδροφυλλικού χρησιμεύουν ως δότες μονοανθρακικών μονάδων σε μια ποικιλία βιοσυνθέσεων με κυριότερες τις : Αναγέννηση μεθειονίνης από ομοκυστεΐνη με μεταφορά της μεθυλικής ομάδας του Ν 5 -μεθυλοτετραϋδροφυλλικού. 95

120 Συμμετοχή στη σύνθεση της θυμίνης. Η μεθυλική ομάδα της προέρχεται από το Ν 5,Ν 10 - μεθυλενοτετραϋδροφυλλικό. Συμμετοχή στην σύνθεση πουρινών. Μερικά άτομα άνθρακα των πουρινών προέρχονται από παράγωγα του Ν 10 -φορμυλοτετραϋδροφυλλικού [266]. A.4.3. Υποδοχείς φυλλικού οξέος και καρκίνος Ο κύκλος του φυλλικού οξέος διατηρεί βασικές μεταβολικές αντιδράσεις και είναι απαραίτητος για τα ταχέως αναπτυσσόμενα κύτταρα. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, τα εξωγενή ανηγμένα φολικά (υδατοδιαλυτές βιταμίνες Β) μεταφέρονται κατά κύριο λόγο σε κύτταρα μέσω ενός φορέα χαμηλής συγγένειας και υψηλής ικανότητας, που ονομάζεται ανηγμένος φορέα φολικού (RFC). Μόλις βρεθούν στο κύτταρο, οι διάφορες μορφές του φυλλικού παίζουν σημαντικό ρόλο στη βιοσύνθεση των πουρινών και της θυμιδίνης, τα οποία με τη σειρά τους απαιτούνται για τη σύνθεση, τη μεθυλίωση και την επισκευή του DNA. Το φυλλικό οξύ, μεταφέρεται επίσης από υποδοχείς φυλλικού οξέος (FR) υψηλής συγγένειας. Στους ανθρώπους, υπάρχουν τέσσερις ισομορφές FR (FRα, FRβ, FRγ, και FRδ). Οι FRα, FRβ και FRδ συνδέονται στην κυτταρική επιφάνεια με μια «άγκυρα» γλυκοζυλοφωσφατιδυλινοσιτόλης, ενώ ο FRγ είναι μια εκκρινόμενη πρωτεΐνη. Όταν το φυλλικό οξύ ή το φολικό δεσμεύεται στον FR, το σύμπλοκο υποδοχέα-συνδέτη της κυτταρικής επιφάνειας μεταφέρεται στο εσωτερικό του κυττάρου μέσω της ενδοκυττάρωσης με μεσολάβηση του υποδοχέα (FR) για την απελευθέρωση του συνδέτη (FA). Σε φυσιολογικές συνθήκες, η κατανομή του FRα στους ιστούς περιορίζεται σε συγκεκριμένο αριθμό πολικών επιθηλίων (μήτρα, πλακούντα, χοριοειδές πλέγμα, πνεύμονα και νεφρά), με έκφραση εντοπισμένη στην επιφάνεια κορυφής των πολικών αυτών κυττάρων, αποκλείοντας την επαφή με την κυκλοφορία. Αντίθετα, ο FRα υπερεκφράζεται στην πλειοψηφία των όγκων των ωοθηκών, της μήτρας, του εγκεφάλου και των κακοήθων μεσοθηλιωμάτων του υπεζωκότα ενώ ταυτόχρονα υπερεκφράζεται σε ένα μεταβλητό ποσοστό καρκίνων του πνεύμονα, των νεφρών, του μαστού και του παχέος εντέρου. Στο πλαίσιο της κακοήθειας, αξίζει να 96

121 σημειωθεί ότι ο FRα χάνει την πολωμένη κυτταρική θέση του και αντιθέτως, ολόκληρη η κυτταρική επιφάνεια καλύπτεται με πρωτεΐνες FRa. Επειδή ο υποδοχέας φυλλικού οξέος FRa εκφράζεται στην κυτταρική επιφάνεια με ειδικό τρόπο για τον όγκο, παρέχει τη δυνατότητα για επιλεγμένη παροχή θεραπευτικών παραγόντων στον κακοήθη ιστό, ελαχιστοποιώντας παράπλευρες τοξικές παρενέργειες. Υπάρχουν ορισμένα μοναδικά πλεονεκτήματα στην εκμετάλλευση του FR ως θεραπευτικού στόχου με κυριότερα τα εξής : Στους περισσότερους φυσιολογικούς πολλαπλασιαστικούς ιστούς βρίσκεται στην επιφάνεια των πολικών επιθηλιακών κυττάρων και δεν είναι προσβάσιμος στην κυκλοφορία ενώ αντίθετα σε κακοήθη ιστό εκφράζεται σε ολόκληρο το κύτταρο και είναι προσβάσιμος από το αίμα. Ο υποδοχέας φυλλικού οξέος έχει την ικανότητα να συνδέεται με το φυλλικό οξύ, το οποίο μπορεί να διεισδύσει γρήγορα σε συμπαγείς όγκους και είναι επιδεκτικό χημικής σύζευξης με άλλα μόρια. Μόλις το σύζευγμα φυλλικού οξέος και θεραπευτικού μορίου συνδεθεί με τον FR, εσωτερικεύεται στο κύτταρο και ο FRα ανακυκλώνεται ταχέως στην κυτταρική επιφάνεια μέσω της ενδοκυτταρικής οδού με τη μεσολάβηση FR, όπως απεικονίζεται στην Εικόνα Α.4.4 [268]. Εικόνα Α.4.4: Σχηματική παρουσίαση της πρόσληψης του φυλλικού συζεύγματος σε καρκινικό κύτταρο [268]. 97

122 Επομένως, οι υποδοχείς φυλλικού οξέος αποτελούν έναν ελκυστικό θεραπευτικό στόχο για τη στοχευμένη χορήγηση θεραπευτικών παραγόντων απ ευθείας σε καρκινικούς ιστούς. Ειδικότερα η ενδοκυττάρωση με τη μεσολάβηση υποδοχέα φυλλικού οξέος έχει εξελιχθεί ως ελκυστική στρατηγική για την παροχή αντικαρκινικών φαρμάκων λόγω τόσο της υπερέκφρασης του υποδοχέα φυλλικού οξέος στα καρκινικά κύτταρα, εν αντιθέσει με την περιορισμένη κατανομή τους στους φυσιολογικούς ιστούς, όσο και της ταχείας εσωτερίκευσης του φυλλικού υποδοχέα. 98

123 99

124 100

125 Α.5. Πακλιταξέλη Η πακλιταξέλη (ταξόλη) είναι ένας από τους πιο χρήσιμους και αποτελεσματικούς αντινεοπλασματικούς παράγοντες για τη θεραπεία πολλών μορφών προχωρημένων και ανθεκτικών καρκίνων και αποτελεί το κύριο θέμα αυτού του κεφαλαίου. Α.5.1. Ανακάλυψη πακλιταξέλης Η πακλιταξέλη (PTX) είναι ένας από τους πιο μελετημένους και αποτελεσματικούς θεραπευτικούς παράγοντες που διατίθενται έναντι ευρέος φάσματος συμπαγών όγκων [269]. Αυτό το φάρμακο ανακαλύφθηκε στις αρχές της δεκαετίας του '60, ως συνέπεια ενός προγράμματος φυτοπροστασίας που ξεκίνησε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου (NCI) των Ηνωμένων Πολιτειών για τον εντοπισμό νέων ουσιών με κυτταροτοξική δράση. Αρχικά, η PTX απομονώθηκε από τον φλοιό του Pacific Yew Tree (Taxus brevifolia), δηλαδή από το Έλατο του Ειρηνικού, το οποίο είναι ένας αργά αναπτυσσόμενος αειθαλής θάμνος ή μικρό δέντρο, από τους Monroe E. Wall και Mansukh C. Wani. Οι επιστήμονες το ονόμασαν "ταξόλη" και το 1971, διασαφήνισαν τη χημική της δομή [270]. Αν και η ΡΤΧ προήλθε αρχικά από την Τ. Brevifolia, αναφέρθηκε επίσης ότι υπάρχει και σε άλλα είδη Taxus όπως το Ευρωπαϊκό Έλατο (Τ. Baccata) ή το Ιαπωνικό (Τ. Cuspidata). Ωστόσο, οι βοτανικές μελέτες οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι το Έλατο του Ειρηνικού ήταν η καλύτερη πηγή ταξόλης, επειδή έδειξε τη μικρότερη διακύμανση περιεκτικότητας σε φάρμακο [271]. Το 1979, η Susan Horwitz ανακάλυψε το μηχανισμό δράσης του PTX και μερικά χρόνια αργότερα άρχισαν οι κλινικές δοκιμές [272]. Ωστόσο το 1992, η Υπηρεσία 101

126 Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) των Ηνωμένων Πολιτειών επέτρεψε την εμπορευματοποίησή της αρχικά για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Αυτός ο παράγοντας αναπτύχθηκε εμπορικά από την Bristol-Myers Squibb, η οποία κατοχύρωσε το όνομα "Taxol" ενώ η κοινή (generic) ονομασία της χημικής ένωσης είναι "paclitaxel" [273]. Εικόνα Α.5.1: To Έλατο του Ειρηνικού (Taxus brevifolia) α) δέντρο, β) κορμός, γ) φυλλώματα και δ) καρποί [274]. Α.5.2 Ιδιότητες πακλιταξέλης Σχέση δομής-δραστικότητας Η PTX παρουσιάζει σημαντικό ενδιαφέρον λόγω της ασυνήθιστης δομής της. Είναι ένα τρικυκλικό διτερπενοειδές που περιέχει ένα δακτύλιο "ταξάνης" και μια αμιδική λειτουργία, επομένως θεωρείται περιστασιακά ως ψευδο-αλκαλοειδές. Ο Wani και οι συνεργάτες του παρουσίασαν τα πρώτα δεδομένα δομής-δραστικότητας που έδειξαν ότι τόσο ο δακτύλιος ταξάνης όσο και η πλευρική αλυσίδα C-13 ήταν ουσιώδεις για την κυτταροτοξική δράση της [270] και αποτελούν σημαντικά χαρακτηριστικά προκειμένου να επιτευχθεί μια επαρκής αλληλεπίδραση φαρμάκου-υποδοχέα (Εικόνα Α.5.2) [275]. Εκτός αυτού, η θέση C-2 της ομάδας υδροξυλίου παίζει σημαντικό ρόλο για την αύξηση της δραστικότητας και αντιπροσωπεύει μία ιδανική θέση για την εισαγωγή λειτουργικών ομάδων για τη δημιουργία προφαρμάκων ή πολυμερικών συζευγμάτων. Αντιθέτως, η ομάδα υδροξυλίου στη θέση C-7 δεν είναι απαραίτητη για την αντικαρκινική δραστηριότητα, καθώς μπορεί να εστεροποιηθεί, να επιμερισθεί ή ακόμη 102

127 και να αποκλειστεί, χωρίς σημαντική απώλεια της δραστικότητας. Παρόμοια, η ακετυλίωση της ομάδας C-10 δεν επηρεάζει την αντικαρκινική ισχύ αυτών [276]. Εικόνα Α.5.2: Χημική δομή της πακλιταξέλης [277]. Φυσικοχημικά χαρακτηριστικά Η PTX είναι μια λευκή κρυσταλλική σκόνη που τήκεται σε θερμοκρασία ºC [278] και έχει μοριακό τύπο C 47 H 51 NO 14 και σχετική μοριακή μάζα g/mol. Είναι ένα μη ιοντικό μόριο και είναι πρακτικά αδιάλυτο σε υδατικά μέσα (0,3-0,5μg / ml) [279]. Ωστόσο, είναι διαλυτό σε πολλούς μη υδατικούς διαλύτες όπως το μεθυλενοχλωρίδιο (~ 17,1 mg / ml), η αιθανόλη (~ 39,4 mg / ml), η μεθανόλη (~ 50 mg / ml) και το διμεθυλοσουλφοξείδιο (~ 50mg / ml) [278], [280], [281]. Α.5.3. Μηχανισμός δράσης Η ταξόλη έγινε ευρύτερα γνωστή το 1979, μετά τη δημοσίευση των ερευνητικών αποτελεσμάτων της ερευνήτριας Susan B. Horwitz (Albert Einstein College of Medicine). Οι έρευνες της ομάδας της Horwitz απέδειξαν ότι η ταξόλη δρα με ένα άγνωστο μέχρι τότε μηχανισμό : προκαλούσε ένα είδος υπερβολικής σταθεροποίησης των κυτταρικών μικροσωληνίσκων. 103

128 Οι μικροσωληνίσκοι είναι σωληνοειδείς διατάξεις από ετεροδιμερή των πρωτεϊνών α- και β- τουμπουλίνης. Αποτελούν μια από τις κύριες δομές του κυτταροσκελετού και διαδραματίζουν σημαντικό οργανωτικό και λειτουργικό ρόλο σε όλα τα ευκαρυωτικά κύτταρα [274]. Η ΡΤΧ δρα ως χημειοθεραπευτικός παράγοντας δεσμεύοντας επιλεκτικά την υπομονάδα β των πρωτεϊνών τουμπουλίνης, προάγοντας τον πολυμερισμό και τη συναρμολόγησή τους, σταθεροποιώντας έτσι τον σχηματισμό των μικροσωληνίσκων. Αυτή η επίδραση οδηγεί στο σχηματισμό μιας δυσλειτουργικής μιτωτικής ατράκτου, η οποία προκαλεί μιτωτική διακοπή μεταξύ των σταδίων G2 / M και τελικά οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο μέσω της απόπτωσης [282], [283]. Παράλληλα η ΡΤΧ περιορίζει την καρκινική αγγειογένεση και επάγει την έκφραση γονιδίων και κυτοκινών που οδηγούν στην αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και στην απόπτωσης [284]. Ο συνδυασμός τόσο των αντι-πολλαπλασιαστικών όσο και των κυτταροτοξικών ιδιοτήτων συμβάλλει στην αντικαρκινική αποτελεσματικότητα της PTX [285]. Εικόνα Α.5.3: Απεικόνιση της ελικοειδούς μορφής των μικροσωληνίσκων [286]. Α.5.4. Κλινικές εφαρμογές Χορήγηση Τaxol Παρά την πολλά υποσχόμενη αντικαρκινική δράση της, η ανάπτυξη ενδοφλέβιας μορφής της πακλιταξέλης παρουσίασε αρκετές δυσκολίες λόγω της χαμηλής διαλυτότητάς της στο νερό. Η πρώτη διαθέσιμη φόρμουλα στο εμπόριο που περιέχει πακλιταξέλη είναι το Taxol, το οποίο διατίθεται ως διάλυμα αποτελούμενο από πολυοξυαιθυλιωμένο καστορέλαιο (Cremophor EL) και αφυδατωμένη αλκοόλη σε ίσα μέρη (αναλογία 1:1). Το Taxol συνδέεται με μια ποικιλία παρενεργειών όπως η 104

129 υπερευαισθησία, η νεφροτοξικότητα και η νευροτοξικότητα, οι οποίες αποδόθηκαν κυρίως στην παρουσία του συστατικού Cremophor EL [287]. Αυτό το έκδοχο έχει άμεση επίδραση στα κύτταρα του πνευμονικού και αγγειακού ενδοθηλίου, προκαλώντας αναπνευστικά προβλήματα και αγγειοδιαστολή ενώ έχουν αναφερθεί σοβαρές αντιδράσεις όπως ο βρογχόσπασμος και η υπόταση. Συνεπώς, όλοι οι ασθενείς που θα λάβουν Taxol πρέπει να ακολουθήσουν χημειοθεραπευτική φαρμακευτική αγωγή με κορτικοειδή, ανταγωνιστές H 2 και αντιισταμινικά για την πρόληψη, μερικές φορές θανατηφόρων, αντιδράσεων υπερευαισθησίας [278]. Γενικά, ο κύριος λόγος για τη διακοπή της PTX δεν είναι η έλλειψη αποτελεσματικότητας αλλά η τοξικότητα [288]. Η περιφεριακή αισθητηριακή νευροπάθεια είναι η συχνότερα αναφερθείσα νευροτοξική επίδραση της πακλιταξέλης, η οποία σχετίζεται με τη δόση και τη διάρκεια της έγχυσης [289]. Η άλλη σημαντική ανεπιθύμητη ενέργεια είναι η μυελοκαταστολή, η οποία οφείλεται κυρίως στην ουδετεροπενία, που αποτελεί την κύρια περιορίζουσα την δόση τοξικότητα της πακλιταξέλης [290]. Νανο-συστήματα για την μεταφορά πακλιταξέλης Τα τελευταία χρόνια, η νανοτεχνολογία έχει προσφέρει στους ερευνητές την ευκαιρία να λύσουν τα προβλήματα που προκαλούνται από τον φορέα του πρώτου και πρότυπου σκευάσματος πακλιταξέλης (Taxol), μεγιστοποιώντας ταυτόχρονα την αποδεδειγμένη αντινεοπλασματική δράση του φαρμάκου έναντι πολλών συμπαγών όγκων. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικοί τύποι νανοφορέων για τη βελτίωση της αποτελεσματικóτητας, της ασφάλειας, των φυσικοχημικών ιδιοτήτων και του φαρμακοκινητικού / φαρμακοδυναμικού προφίλ αυτού του φαρμάκου. Μέχρι σήμερα, η πακλιταξέλη είναι το μοναδικό φάρμακο που διατίθεται στο εμπόριο σε τρεις διαφορετικές νανο-πλατφόρμες για παρεντερική παράδοσή της: πολυμερικά νανοσωματίδια (Abraxane), λιποσώματα (Lipusu) και πολυμερικά μικύλλια (Genexol, Nanoxel και Paclical). Σύντομα μπορεί να είναι διαθέσιμος ένας τέταρτος νανοφορέας, αφού οι μελέτες φάσης ΙΙΙ του Opaxio, που είναι πολυμερικό σύζευγμα, είναι σχεδόν ολοκληρωμένες. Επιπλέον, άλλες αρκετές νανομορφές βρίσκονται σήμερα σε διάφορα στάδια κλινικών δοκιμών [291]. 105

130 Εικόνα Α.5.4: Οι κυριότεροι νανοφορείς πακλιταξέλης [291]. Ενδείξεις πακλιταξέλης Σήμερα, οι ενδείξεις της πακλιταξέλης σύμφωνα με τον FDA περιλαμβάνουν: Σάρκωμα Kaposi (δεύτερη γραμμή), καρκίνο του μαστού (μεταστατικό ή μη μεταστατικό), προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών (πρώτη γραμμή), μικροκυτταρικό κακόηθες νεοπλάστιο (μεταστατικό ή μη μεταστατικό). Επιπλέον, δεδομένου ότι ΡΤΧ επιδεικνύει μία ισχυρή αντινεοπλασματική δραστικότητα, χρησιμοποιείται συχνά και για τη θεραπεία του καρκίνου του οισοφάγου, της ουροδόχου κύστης, του προστάτη, του τραχήλου της μήτρας, του στομάχου, της κεφαλής και του λαιμού, των όρχεων καθώς και για κακοήθεια του ενδομητρίου και για ολιγοδενδρογλοίωμα (πρωτοπαθής όγκος εγκεφάλου) [273]. 106

131 Εικόνα Α.5.6: Παραδείγματα νανοτεχνολογικών πλατφορμών για χορήγηση ΡΤΧ που είτε είναι κλινικά εγκεκριμένες είτε βρίσκονται σε διάφορα στάδια κλινικών δοκιμών για θεραπεία διάφορων ειδών καρκίνου [291]. 107

132 108

133 Β. ΣΚΟΠΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασίας είναι η παρασκευή και μελέτη μιας βιοσυμβατής μορφής χορήγησης της πακλιταξέλης με βάση τα νανοσωματίδια χρυσού. Αρχικά, πραγματοποιείται σύνθεση υδατοδιαλυτών νανοσωματιδίων χρυσού των οποίων η επιφάνεια σταθεροποιείται με μερκαπτο-οκτανοικό οξύ και τροποποιείται με φυλλικό οξυ. Έτσι τα νανοσωματίδια αποκτούν ικανότητα στόχευσης καρκινικών κυττάρων που υπερεκφράζουν υποδοχείς φυλλικού οξέος ενώ παράλληλα επιτρέπουν τη φόρτωση της πακλιταξέλης στις υδρόφοβες θέσεις μέσα στη μονοστοιβάδα των νανοφορέων χάρις τη δομή τους, η οποία χαρακτηρίζεται από ένα υδρόφιλο εξωτερικό περιβάλλον και ένα υδρόφοβο εσωτερικό. Στη συνέχεια πραγματοποιείται πλήρης φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των νανοφορέων πριν και μετα τη σύνδεση φυλλικού οξέος καθώς και μελέτη της κολλοειδούς σταθερότητάς τους παρουσία ηλεκτρολύτη. Ακολουθεί μελέτη της φόρτωσης και της αποδέσμευσης του υδρόφοβου φαρμάκου στα τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού. Τέλος, γίνεται κυτταρική μελέτη της in vitro αντικαρκινικής δραστικότητας των νανοσωματιδίων φορτωμένων με φάρμακο σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. 109

134 110

135 Γ. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Το πειραματικό μέρος της μεταπτυχιακής αυτής εργασίας περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια : 1. Σύνθεση νανοσωματιδίων χρυσού σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ (AuNP MOA) και τροποποιημένων με φυλλικό οξύ (AuNP-MOA-FA). 2. Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) (προσδιορισμός μέσου μεγέθους, μορφολογίας, ζήτα δυναμικού, μελέτη κολλοειδούς σταθερότητας σε υδατικά διαλύματα χλωριούχου νατρίου διαφορετικής συγκέντρωσης). 3. Φυσικοχημικός χαρακτηρισμός των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA FA) (αξιολόγηση αποδόσεων, προσδιορισμός μέσου μεγέθους, περιεκτικότητας σε φυλλικό οξύ, μορφολογίας, ζήτα δυναμικού, μελέτη κολλοειδούς σταθερότητας σε υδατικά διαλύματα χλωριούχου νατρίου διαφορετικής συγκέντρωσης). 4. Φόρτωση του φαρμάκου Πακλιταξέλης (PTX) στα νανοσωματίδια χρυσού (AuNP MOA FA). 5. Απελευθέρωση φαρμάκου Πακλιταξέλης (PTX) από τα νανοσωματίδια χρυσού (AuNP MOA FA) σε ph 7,4. 6. Διερεύνηση της αντικαρκινικής δραστικότητας των τροποποιημένων με φυλλικό οξυ νανοσωματιδίων φορτωμένων με φάρμακο σε καρκινικές κυτταρικές σειρές (έλεγχος της κυτταροτοξικότητας). 111

136 Γ.1. Αντιδραστήρια Τα χημικά αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα στάδια της πειραματικής διαδικασίας, καθώς και η εταιρεία προμήθειάς τους είναι τα παρακάτω : Τετραχλωροχρυσικό οξύ ( HAuCl 4 ) από τη Sigma-Aldrich 8 μερκαπτοοκτανοϊκό οξύ ( C 8 H 16 O 2 S, MOA ) 95% από τη Sigma-Aldrich Βοροϋδρίδιο του νατρίου ( ΝaBH 4 ) από την Fluka Analytics 1-αιθυλ-3-(3-διμεθυλαμινοπροπυλ) καρβοδιϊμίδιο ( C 8 H 17 N 3 EDC ) από τη Sigma-Aldrich Ν-υδροξυσουξινιμίδιο ( C 4 H 5 NO 3, NHS ) 98% ) από τη Sigma-Aldrich Φυλλικό οξύ ( C 19 H 19 N 7 0 6, FA ) από τη Sigma-Aldrich Αιθανόλη ( CH 3 CH 2 OH, EtOH ) από τη Sigma-Aldrich Υδροξείδιο του νατρίου ( NaOH) από τη Sigma-Aldrich Χλωριούχο νάτριο ( NaCl) από τη Merck Μεμβράνες κυτταρίνης ( dialysis tubing cellulose membrane ), MW=14 kda avg.flat width 25mm (1.0 in) από τη Sigma-Aldrich Πακλιταξέλη ( C 47 H 51 NO 14, Paclitaxel, PTX ) από LC Laboratories Διχλωρομεθάνιο ( CH 2 Cl 2, DCM ) από τη Sigma-Aldrich Ακατονιτρίλιο ( CH 3 CN, ACN ) από τη Carlo erba Όξινο φωσφορικό κάλιο ( K 2 HPO4 ) από τη Sigma-Aldrich Δισόξινο φωσφορικό κάλιο ( ΚΗ 2 PO4 ) από τη Merck Διμεθυλoσουλφοξείδιο ( Sigma, D4540 ) Methyl-tetrazolium dye ( Sigma, M2128 ) Απεσταγμένο νερό Γ.2. Χρησιμοποιούμενα Όργανα Τα όργανα που χρησιμοποιήθηκαν σε όλα τα στάδια της πειραματικής διαδικασίας παρουσιάζονται παρακάτω: Λουτρό υπερήχων (bath sonication), Power Sonic 405 Ακίδα υπερήχων (probe sonication), Sonics Vibra-cell 112

137 Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας, Mettler AE 166, Delta Range Μαγνητικός αναδευτήρας, hotplate stirrer SB 162-3, Stuart Μηχανικός αναδευτήρας (vortex), Labinco L46 Φυγόκεντρος, Hermle Z32HK (16000 rpm max) Φούρνος, WTC binder Υδατόλουτρο ρυθμιζόμενης θερμοκρασίας, BioLine Περιστροφικός εξατμιστήρας υπό κενό (rotary evaporator), Rotavapor R-114, Buchi, Waterbath B-480 Λυοφιλοποιητής (freeze-dryer), Labconco Φασματοφωτόμετρο ορατού-υπεριώδους φωτός, UV-Spectrophotometer UV- 1800, Shimadzu Συσκευή μέτρησης μεγέθους (υδροδυναμικής διαμέτρου) και ζήτα δυναμικού Nano Zeta Sizer (Nano-Zs), Malvern Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Διελεύσεως (Transmission Electron Microscopy, TEM), JEOL JEM-2100 Φασματοφωτόμετρο μquant (μquant biomolecular spectrophotometer MQX200) Λογισμικό Gen5 (Gen5 TM Microplate Data Collection & Analysis software, BioTek Instruments. Inc, April 2008) Γ.3. Διαλύματα- Διεργασίες ΔΙΑΛΥΜΑ NaOH 1M Σε 10 ml dh 2 O διαλύονται 500 mg NaOH υπό μαγνητική ανάδευση (400 rpm) στους 50 C για 30 min. Έπειτα πραγματοποιείται μηχανική ανάδευση (vortex) για ομογενοποίηση του διαλύματος και έλεγχος του ph με πεχάμετρο. Τέλος φυλάσσεται σε ντουλάπι για περαιτέρω χρήση. ΔΙΑΛΥΜΑ PB ΧΑΜΗΛΗΣ ΙΟΝΙΚΗΣ ΙΣΧΥΟΣ ( 1mM ) ph =7,4 Σε 1000 ml dh 2 O διαλύονται 0,0534 gr. KH 2 PO4 και 0,1058 gr. K 2 HPO 4 υπό μαγνητική ανάδευση (400 rpm) στους 100 C για 1 hr. Μετά το πέρας της μιας ώρας αν έχει εξατμιστεί ορισμένη ποσότητα dh 2 O συμπληρώνεται με dh 2 O ώστε το διάλυμα να 113

138 έχει τελικό όγκο 1000 ml και ελέγχεται το ph του αν είναι 7,4 με πεχάμετρο. Σε περίπτωση που το ph <7,4 προστίθεται κατάλληλη ποσότητα διαλύματος ΝaOH προκειμένου να αποκτήσει την επιθυμητή τιμή ph. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΜΕΜΒΡΑΝΗΣ ΔΙΑΠΙΔΥΣΗΣ Αρχικά κόβεται μεμβράνη διαπίδυσης επιθυμητού μεγέθους και με κατάλληλο μέγεθος πόρων και τοποθετείται σε ποτήρι ζέσεως κάτω από τρεχούμενο νερό βρύσης για 2 hr. Σκοπός αυτού του βήματος είναι η απομάκρυνση των υδατικών στερεωτικών της μεμβράνης. Στη συνέχεια, η μεμβράνη ξεπλένεται μέσα κι έξω με απεσταγμένο νερό και τοποθετείται σε ποτήρι ζέσεως με προζεσταμένο απεσταγμένο νερό στους 65 C υπό μαγνητική ανάδευση (250 rpm) για 20 min προκειμένου να απομακρυνθούν τα υδατικά στερεωτικά που φεύγουν με θερμότητα. Τέλος, η μεμβράνη ξεπλένεται εσωτερικά και εξωτερικά με απεσταγμένο νερό και είναι έτοιμη προς χρήση στα πειράματα. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δοθεί καθόλη τη δίαρκεια της διεργασίας, έτσι ώστε η μεμβράνη να παραμένει καλυμμένη πάντα από νερό. Σε διαφορετική περίπτωση ξεραίνεται και είναι ακατάλληλη για χρήση. ΛΥΟΦΙΛΟΠΟΙΗΣΗ ( Freeze- Drying- Lyophilization) H λυοφιλοποίηση αποτελεί μέθοδο ξήρανσης, κατά την οποία το παγωμένο νερό που περιέχεται στο υλικό διέρχεται απευθείας από την στέρεα φάση στην αέρια. Αναλυτικά τα στάδια της λυοφιλοποίησης είναι τα εξής τρία : Ψύξη: Το υλικό ψύχεται σε θερμοκρασία χαμηλότερη από εκείνη που η στερεή και η υγρή φάση συνυπάρχουν. Η συνήθης τελική θερμοκρασία ψύξης είναι γύρω στους -40 C, ενώ η χαμηλότερη πιθανή είναι -80 C. Μετά την ψύξη συχνά ακολουθεί και μια επιπλέον φάση που ονομάζεται ανόπτηση. Κατά τη διάρκεια της ανόπτησης το υλικό παραμένει για κάποιο χρονικό διάστημα στην τελική θερμοκρασία ψύξης, γεγονός που επιτρέπει την κρυσταλλοποίηση παραγόντων διόγκωσης που μπορεί να έχουν προστεθεί στο υλικό, όπως η μανιτόλη. Ο τελικός σκοπός είναι η αποφυγή κατάρρευσης του λυοφιλοποιημένου υλικού. Ανόπτηση μπορεί να λάβει χώρα και πριν την επίτευξη της τελικής θερμοκρασίας ψύξης, σε μια ενδιάμεση θερμοκρασία κατά το στάδιο της ψύξης [292]. 114

139 Πρωτοταγής ξήρανση: Σ αυτό το στάδιο έχουμε μείωση της περιβάλλουσας πίεσης και άνοδο της θερμοκρασίας ώστε να πραγματοποιηθεί η εξάχνωση. Ο ρυθμός πρόσδοσης θερμότητας στο υλικό είναι αργός ώστε να μην αλλάξουν οι ιδιότητες ή η δομή του και η τελική θερμοκρασία μετά απ αυτό το στάδιο είναι πάντα χαμηλότερη του σημείου ισορροπίας (0 C). Σε αυτή τη φάση εξαχνώνεται γύρω στο 95% του υπάρχοντος αρχικά νερού [293]. Δευτεροταγής ξήρανση: Σε αυτήν τη φάση πραγματοποιείται άνοδος της θερμοκρασίας μέχρι και τη θερμοκρασία περιβάλλοντος με σκοπό να αφαιρεθούν τα μόρια του νερού που δεν ψύχθηκαν αρχικά. Συνήθως το υλικό μένει στην τελική θερμοκρασία για τουλάχιστον δύο ώρες ώστε να επέλθει ισορροπία. Το τελικό ποσοστό νερού που παραμένει στο λυοφιλοποιημένο προϊόν είναι μόνο περίπου 1% [293]. Γ.4. Τεχνικές Χαρακτηρισμού Γ.4.1. Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (ΤΕΜ) Σε ένα συμβατικό ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης (TEM = Transmission Electron Microscopy) ένα λεπτό δείγμα ακτινοβολείται από μία δέσμη ηλεκτρονίων ομοιόμορφης πυκνότητας ρεύματος. Το δυναμικό επιτάχυνσης σε ένα τυπικό μικροσκόπιο είναι kv. Μικροσκόπια υψηλότερης διακριτικής ικανότητας λειτουργούν με δυναμικά kv, ενώ τα μικροσκόπια υψηλής τάσης φτάνουν μέχρι τα 3MV. Τα ηλεκτρόνια εκπέμπονται από μία κάθοδο είτε με θερμιονική εκπομπή, είτε με εκπομπή τύπου Schottky, είτε με εκπομπή πεδίου. Στη συνέχεια, με τη βοήθεια συγκεντρωτικών μαγνητικών φακών, ελέγχεται η περιοχή που φωτίζεται καθώς και η εστίαση της δέσμης. Μετά το δείγμα τα ηλεκτρόνια οδηγούνται, με τη βοήθεια συγκεντρωτικών φακών (επίσης μαγνητικού τύπου) σε μια φθορίζουσα οθόνη. Επειδή τα ηλεκτρόνια υφίστανται ισχυρή ελαστική και μη ελαστική σκέδαση από τα άτομα του δείγματος, για αυτό το δείγμα πρέπει να είναι αρκούντως λεπτό, ανάλογα βέβαια, και με την πυκνότητα και την στοιχειακή του σύνθεση (π.χ nm για ηλεκτρόνια 100 kv). 115

140 Στην εικόνα Γ.1 παρουσιάζεται σχηματικά η μορφή ενός ηλεκτρονικού μικροσκοπίου διέλευσης στο οποίο διακρίνονται τα κύρια μέρη του αλλά και η πορεία της ηλεκτρονικής δέσμη. Εικόνα Γ.1: Σχηματική παράσταση ενός ηλεκτρονικού μικροσκοπίου διέλευσης [294]. Στο επάνω μέρος μιας στήλης κενού, υπάρχει πηγή ηλεκτρονίων (ή ηλεκτρικό πυροβόλο) το οποίο είναι είτε ένα θερμαινόμενο νήμα βολφραμίου (περίπτωση θερμοηλεκτρικής εκπομπής), είτε μία λεπτή μεταλλική ακίδα παρουσία ισχυρού ηλεκτρικού πεδίου (περίπτωση εκπομπής πεδίου). Για την αποφυγή ασταθειών στην εκπομπή ηλεκτρονίων, η πρώτη αυτή βαθμίδα βρίσκεται σε υπερυψηλό κενό (της τάξης του mbar). H εκπεμπόμενη δέσμη ηλεκτρονίων επιταχύνεται με τη βοήθεια ηλεκτροδίων που βρίσκονται σε υψηλή τάση (kv-mv). Ακολουθούν, συνήθως δύο, συγκεντρωτικοί φακοί μαγνητικού τύπου, με τη βοήθεια των οποίων εστιάζεται η δέσμη ηλεκτρονίων. Οι μαγνητικοί φακοί είναι ηλεκτρομαγνητικά πηνία τοποθετημένα έτσι ώστε η δέσμη των ηλεκτρονίων να περνά κατά μήκος του άξονά τους. Στην περιοχή των μαγνητικών φακών το κενό είναι της τάξης του 10-7 έως 10-4 mbar, έτσι ώστε να ελαχιστοποιούνται οι συγκρούσεις των ηλεκτρονίων με τα μόρια του αέρα. Οι συγκεντρωτικοί φακοί προκαλούν εστίαση της 116

141 δέσμης ηλεκτρονίων, σε μια περιοχή διαστάσεων ολίγων τετραγωνικών μικρομέτρων (μm2), στο επίπεδο που βρίσκεται το αντικείμενο. Το αντικείμενο στην περίπτωση της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας διέλευσης, έχει τη μορφή λεπτού δίσκου, το πάχος του οποίου είναι από μερικές δεκάδες μέχρι εκατοντάδες nm. Για την προετοιμασία των δειγμάτων χρησιμοποιούνται διάφορες τεχνικές όπως : α) λέπτυνση με δέσμη ηλεκτρονίων, β) χρήση μικροτόμων υψηλής λεπτότητας, γ) χημική λέπτυνση, δ) σχισμός παράλληλα σε κρυσταλλικά επίπεδα, ε) βομβαρδισμός με δέσμες ιόντων. Η πλευρική διάσταση του δείγματος, το οποίο έχει συνήθως τη μορφή δίσκου, είναι μερικά mm. Το δείγμα εισάγεται στο θάλαμο του μικροσκοπίου μέσω ειδικής θυρίδας που εξασφαλίζει τη διατήρηση του κενού, και τοποθετείται σε διάταξη μικρομετρικών μετατοπίσεων. Τα ηλεκτρόνια, τα οποία διέρχονται από το δείγμα, υφίστανται περίθλαση (σύμφωνα με το νόμο του Bragg), σε διαφορετικές γωνίες ανάλογα με τα κρυσταλλικά χαρακτηριστικά της κάθε περιοχής του. Ο αντικειμενικός φακός ο οποίος βρίσκεται αμέσως μετά το δείγμα, σχηματίζει στο εστιακό του επίπεδο την περίθλαση του μακρινού πεδίου του δείγματος (περίθλαση Fraunhofer), η οποία αποτελεί τον μετασχηματισμό Fourier (σε αντίστροφο χώρο) των κρυσταλλικών χαρακτηριστικών του δείγματος. Αυτό επιτρέπει να μελετηθεί η κρυσταλλική δομή του αντικειμένου, με έναν τρόπο ανάλογο εκείνου που χρησιμοποιείται στην περίπτωση της περίθλασης ακτίνων Χ. Στη συνέχεια, τα ηλεκτρόνια διέρχονται από ένα ενδιάμεσο φακό, με τη βοήθεια του οποίου σχηματίζεται ένα ενδιάμεσο είδωλο, το οποίο αποτελεί μεγεθυσμένη απεικόνιση (σε ευθύ χώρο) του αντικειμένου. Το ενδιάμεσο αυτό είδωλο, μέσω ενός τελευταίου φακού (φακός προβολής), προβάλλεται μετά από μια τελευταία μεγέθυνση, σε φθορίζουσα οθόνη για παρατήρηση ή φωτογράφηση [295]. Γ.4.2. Φασματοφωτομετρία Ορατού-Υπεριώδους Η Φασματοφωτομετρία Ορατού Υπεριώδους (Spectrophotometer UV-Visible) χαρακτηρίζεται ως μια από τις χρησιμότερες αναλυτικές τεχνικές τόσο στο πεδίο της έρευνας όσο και σε αναλυτικά εργαστήρια ελέγχου ποιότητας και εφαρμόζεται για τον ποσοτικό κυρίως προσδιορισμό χημικών ουσιών. 117

142 Η Αρχή λειτουργίας της Φασματοφωτομετρίας Ορατού Υπεριώδους βασίζεται στην απορρόφηση μονοχρωματικής ακτινοβολίας από την προς ανάλυση ουσία. Πιο συγκεκριμένα, όταν μονοχρωματική ακτινοβολία, αρχικής ισχύος Ρ 0, προσπίπτει σε διάλυμα το οποίο περιέχει την απορροφούσα ουσία, τότε εξέρχεται από το διάλυμα με μειωμένη ισχύ, Ρ. Η μείωση αυτή είναι ανάλογη με τη συγκέντρωση της ουσίας και ο νόμος Lambert-Beer περιγράφει τη σχέση απορρόφησης-συγκέντρωσης σύμφωνα με την εξίσωση : (εξίσωση Γ.1) Όπου Α: (Absorbance) είναι η απορρόφηση, P 0 : η ισχύς της προσπίπτουσας ακτινοβολίας, P: η ισχύς της εξερχόμενης ακτινοβολίας, ε: είναι ο συντελεστής απόσβεσης ή συντελεστής μοριακής απόσβεσης (extinction coefficient or molar extinction coefficient) του διαλύματος της ουσίας. Ο συντελεστής ε είναι ανεξάρτητος από τη συγκέντρωση της προσδιοριζόμενης ουσίας και εκφράζεται σε L/mol cm -1 b: είναι η οπτική διαδρομή της ακτινοβολίας που διέρχεται μέσω του διαλύματος του αναλύτη (cm) c: η συγκέντρωση του αναλύτη (απορροφούσα ουσία). Όταν ο συντελεστής μοριακής απόσβεσης (ο οποίος εξαρτάται από την ατομική ή μοριακή δομή) και η οπτική διαδρομή διατηρούνται σταθερά, η απορρόφηση από τον αναλύτη θα είναι ευθέως ανάλογη της συγκέντρωσης του απορροφούντος είδους του αναλύτη. Αυτό οδηγεί σε μια γραμμική συσχέτιση της συγκέντρωσης και της απορρόφησης και επιτρέπει τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης άγνωστων διαλυμάτων με βάση γραφήματα δεδομένων που προέρχονται από πρότυπα γνωστών συγκεντρώσεων. Αν στο εξεταζόμενο διάλυμα υπάρχουν περισσότερα του ενός χημικά 118

143 είδη, η απορρόφηση θα είναι το άθροισμα των απορροφήσεων των απορροφούντων ειδών, υπό την προϋπόθεση ότι δεν υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ των διαφόρων ειδών [296], [297], [298]. Ένα φασματοφωτόμετρο μπορεί να είναι απλής ή διπλής δέσμης. Τα βασικά τμήματα ενός φασματοφωτομέτρου είναι [299] : Η πηγή της ακτινοβολίας. Για την περιοχή του υπεριώδους, χρησιμοποιείται συνήθως λυχνία δευτερίου, ενώ για την περιοχή του ορατού χρησιμοποιούνται λυχνίες πυρακτώσεως ή λυχνίες Nernst και λυχνίες Laser. Ο μονοχρωμάτορας. Είναι το βασικότερο τμήμα του φασματοφωτομέτρου, καθώς μετατρέπει τη δέσμη των ακτινοβολιών που εκπέμπεται από την πηγή, σε μονοχρωματική δέσμη ακτινοβολίας συγκεκριμένου μήκους κύματος. Ως μονοχρωμάτορες χρησιμοποιούνται είτε διαθλαστικά πρίσματα, είτε ανακλαστικά φράγματα ή φράγματα διαπερατότητας. Ο φωτοανιχνευτής. Δέχεται την ακτινοβολία που εξέρχεται από το διάλυμα, και αφού την ενισχύσει (με τη βοήθεια ενός ενισχυτή), τη μετατρέπει σε μορφή μεταβολής δυναμικού ηλεκτρικού ρεύματος για να οδηγηθεί στην έξοδο του οργάνου. Ως φωτοανιχνευτές χρησιμοποιούνται τα φωτοκύτταρα, οι φωτοπολλαπλασιαστές, τα φωτοστοιχεία και οι φωτολυχνίες. Διαφανείς κυψελίδες. Τα εξεταζόμενα διαλύματα τοποθετούνται στις κυψελίδες, οι οποίες έχουν ορθογώνιο σχήμα και εσωτερικό πλάτος 1 cm. Συνήθως, είναι κατασκευασμένες από υψηλής ποιότητας χαλαζία, καθόσον το κοινό γυαλί και το πλαστικό απορροφούν στο υπεριώδες περιορίζοντας τη χρησιμότητά τους σε ορατά μήκη κύματος. Ο ηλεκτρονικός υπολογιστής. Εμφανίζει με αναλογική ή ψηφιακή μορφή τις τιμές της απορρόφησης ή της διαπερατότητας. 119

144 Εικόνα Γ.2: Βασικά τμήματα ενός φασματοφωτόμετρου UV-Visible [299]. Γ.4.3. Δυναμική Σκέδαση Φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS) Μια από τις πιο δημοφιλείς τεχνικές σήμερα για την μέτρηση του μεγέθους κολλοειδών νανοσωματιδίων είναι η Δυναμική Σκέδαση Φωτός, (Dynamic Light Scattering, DLS), καθώς μπορεί να μετρηθεί το μέγεθος σωματιδίων σε διασπορά, ταχύτατα και απαιτώντας ελάχιστη προετοιμασία δείγματος. Η DLS ανιχνεύει τη συχνότητα της ταλάντωσης του μοτίβου που καταγράφεται στον ανιχνευτή από τη σκέδαση του φωτός στα σωματίδια (Εικόνα Γ.3α). Η ενισχυτική και καταστρεπτική συμβολή του φωτός από τη σκέδαση (Εικόνα Γ.3β), είναι υπεύθυνη για την εμφάνιση σκοτεινών και φωτεινών περιοχών σε αυτό το μοτίβο. Η συχνότητα αυτή είναι ανάλογη της θερμικής κίνησης Brown των σωματιδίων, η οποία με τη σειρά της εξαρτάται από το μέγεθος των σωματιδίων (όσο μικρότερα τα σωματίδια τόσο γρηγορότερη είναι η κίνηση Brown) και από το ιξώδες του διαλύτη. Το ιξώδες ενός υγρού συσχετίζεται άμεσα με την θερμοκρασία του, άρα για να μετρηθεί η κινητικότητα των σωματιδίων μέσα σε ένα διάλυμα είναι απαραίτητο οι μετρήσεις να διεξάγονται κάτω από μια γνωστή και σταθερή θερμοκρασία. Η ανάλυση της χρονικής εξάρτησης της διακύμανσης/συσχέτισης του μοτίβου ταλάντωσης-τρεμοπαίγματος μπορεί επομένως να αποδώσει το συντελεστή διάχυσης των σωματιδίων μέσω του οποίου, χρησιμοποιώντας την εξίσωση Stokes-Einstein (Σχέση Γ.1), και γνωρίζοντας το ιξώδες του μέσου, μπορεί να υπολογιστεί η υδροδυναμική διάμετρος των σωματιδίων. Η διάμετρος που μετράται μέσω της τεχνικής DLS ονομάζεται υδροδυναμική διάμετρος και είναι η διάμετρος μιας ιδεατής σφαίρας που έχει τον ίδιο συντελεστή διάχυσης με το σωματίδιο [300]. 120

145 Εικόνα Γ.3: α) Σχηματική αναπαράσταση ενός μοτίβου τρεμοπαίγματος, β) Το παρατηρούμενο σήμα εξαρτάται από την συμβολή των φάσεων του σκεδαζόμενου φωτός που προσπίπτει στον ανιχνευτή: β1) δύο ακτίνες συμβάλουν και ακυρώνονται μεταξύ τους με συνέπεια να ανιχνεύεται μειωμένη ένταση (σκοτεινή περιοχή), β2), δύο ακτίνες συμβάλλουν ενισχυτικά με συνέπεια να ανιχνεύεται αυξημένη ένταση (φωτεινή περιοχή) [300]. Εξίσωση Stokes-Einstein [301] : (εξίσωση Γ.2) Όπου, k: σταθερά Boltzman T: απόλυτη θερμοκρασία n: ιξώδες διαλύματος R h : υδροδυναμική ακτίνα. Ένα τυπικό αναλυτικό σύστημα δυναμικής σκέδασης φωτός αποτελείται από έξι κύρια τμήματα (Εικόνα Γ.4) [300] : Την πηγή φωτεινής δέσμης laser, τα φωτόνια της οποίας περνούν μέσα από κυψελίδα που περιέχει το εκάστοτε δείγμα. Τη διάταξη ανιχνευτή σκεδαζόμενης ακτινοβολίας. Μία πλατφόρμα ψηφιακής επεξεργασίας του σήματος από την ανιχνευτική διάταξη όπου τελικά αναλύεται και καταγράφεται η πληροφορία της έντασης της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας και το μοτίβο ταλάντωσης. Έναν ηλεκτρονικό υπολογιστή σε διασύνδεση με την πλατφόρμα ψηφιακής επεξεργασίας, όπου με το κατάλληλο λογισμικό και κώδικες μοντελοποίησης 121

146 αναλύονται τα δεδομένα και εξάγονται πληροφορίες για το μέγεθος των σωματιδίων. Εικόνα Γ.4: Σχηματική απεικόνιση ενός σχήματος δυναμικής σκέδασης φωτός [300]. Γ.4.4. Ηλεκτροφορητική σκέδαση φωτός (Electrophoretic Light Scattering, ELS) Όταν ένα φορτισμένο σωματίδιο ή μακρομόριο βρεθεί σε περιβάλλον πολικού διαλύτη, τα επιφανειακά φορτία του σωματιδίου αλληλεπιδρούν με τα ιόντα του διαλύτη μέσω ηλεκτροστατικών δυνάμεων, με αποτέλεσμα το σχηματισμό γύρω από το σωματίδιο μίας ηλεκτρικής διπλοστοιβάδας (Electrical Double Layer, EDL), η οποία καλείται και στοιβάδα Debye. Η διπλοστοιβάδα αυτή αποτελείται κυρίως από ιόντα αντίθετου φορτίου ως προς το επιφανειακό φορτίο του σωματιδίου, των οποίων η συγκέντρωση μειώνεται καθώς αυξάνεται η απόσταση από την επιφάνεια του φορτίου. Ως αποτέλεσμα, το δυναμικό της διπλοστοιβάδας παρουσιάζει εκθετική μείωση συναρτήσει της απόστασης από την επιφάνεια του σωματιδίου. Η ηλεκτρική διπλοστοιβάδα αποτελείται από δύο επιμέρους στοιβάδες, τη στοιβάδα Stern και τη στοιβάδα διάχυσης. Η στοιβάδα Stern αποτελείται αποκλειστικά από ιόντα αντίθετου φορτίου ως προς το επιφανειακό φορτίο, τα οποία είναι ισχυρά προσδεμένα στην επιφάνεια του σωματιδίου και κινούνται μαζί με αυτό. Αντίθετα, η στοιβάδα διάχυσης αποτελείται από ελεύθερα ιόντα, τα οποία κινούνται στο διάλυμα υπό την 122

147 επίδραση της ηλεκτροστατικής έλξης και για το λόγο αυτό είναι χαλαρά συνδεδεμένη με το σωματίδιο. Μέρος της στοιβάδας διάχυσης μπορεί να κινηθεί υπό την επίδραση ενός εξωτερικού πεδίου. Το υποθετικό επίπεδο το οποίο διαχωρίζει τα ιόντα της στοιβάδας διάχυσης τα οποία μπορούν να κινηθούν, από τα ιόντα που παραμένουν προσκολλημένα στην επιφάνεια του σωματιδίου ονομάζεται επίπεδο ολίσθησης. Το δυναμικό στο όριο του επιπέδου ολίσθησης ορίζεται ως το δυναμικό ζήτα και αποτελεί σαφή ένδειξη του φορτίου της ηλεκτρικής διπλοστιβάδας. Η σχηματική αναπαράσταση της ηλεκτρικής διπλοστοιβάδας για την περίπτωση ενός αρνητικά φορτισμένου σωματιδίου, καθώς και των επιμέρους επιπέδων και αντίστοιχων δυναμικών παρουσιάζεται στην Εικόνα Γ.5. Εικόνα Γ.5: Σχηματική απεικόνιση της ηλεκτρικής διπλοστοιβάδας (στοιβάδα Debye), που σχηματίζεται γύρω από ένα αρνητικά φορτισμένο σωματίδιο σε περιβάλλον πολικού διαλύτη, των επιμέρους επιπέδων που την αποτελούν, του δυναμικού συναρτήσει της απόστασης από την επιφάνεια του σωματιδίου και των χαρακτηριστικών τιμών του [302]. Ένας τρόπος υπολογισμού του δυναμικού ζήτα είναι μέσω πειραμάτων ηλεκτροφόρησης, δηλαδή εφαρμογής ενός εξωτερικού ηλεκτρικού πεδίου στο διάλυμα 123

148 των φορτισμένων σωματιδίων. Η εφαρμογή του πεδίου εξαναγκάζει τα φορτισμένα σωματίδια να κινηθούν προς το αντίθετα φορτισμένο ηλεκτρόδιο και η ταχύτητά τους είναι ανάλογη της έντασης του πεδίου, συγκεκριμένα: (εξίσωση Γ.3) όπου υ η ταχύτητα του σωματιδίου, Ε η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου και μ e η ηλεκτροφορητική κινητικότητα του σωματιδίου. Μέσω της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας και με τη χρήση θεωρητικών μοντέλων, καθίσταται δυνατός ο υπολογισμός του δυναμικού ζήτα. Το πλέον διαδεδομένο θεωρητικό μοντέλο για τον υπολογισμό του δυναμικού ζήτα, είναι αυτό του Smoluchowski, το οποίο ισχύει στην περίπτωση που το μέγεθος του φορτισμένου σωματιδίου είναι πολύ μεγαλύτερο από το πάχος της ηλεκτρικής διπλοστοιβάδας, δηλαδή στο όριο κα >> 1. Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα συνδέεται με το δυναμικό ζήτα μέσω της σχέσης: (εξίσωση Γ.4) όπου ε η διηλεκτρική σταθερά και η το ιξώδες του διαλύτη, αντίστοιχα και ζ P το δυναμικό ζήτα [302]. Γ.5. Σύνθεση τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού Τα σφαιρικά νανοσωματίδια με μεταβαλλόμενα μεγέθη πυρήνων παρασκευάζονται με την αναγωγή των αλάτων χρυσού για τη δημιουργία μηδενικού σθένους μετάλλου παρουσία κατάλληλων σταθεροποιητικών παραγόντων που εμποδίζουν την συσσωμάτωση των σωματιδίων. Ο μηχανισμός για τον σχηματισμό νανοσωματιδίων βασίζεται στη πυρήνωση (σχηματισμό πυρήνων), ανάπτυξη και σταθεροποίηση. 124

149 Αρχικά, στο πρώτο στάδιο πυρήνωσης, το μεταλλικό άλας ανάγεται για να δώσει μηδενικά άτομα μετάλλου. Αυτά μπορούν να συγκρούονται σε διάλυμα με άλλα μεταλλικά ιόντα, άτομα μετάλλων ή συστάδες για να σχηματίσουν πυρήνες. Προστατευτικοί παράγοντες είναι απαραίτητοι για τη σταθεροποίηση νανοδομημένων κολλοειδών μετάλλων και για την πρόληψη της συσσωμάτωσης. Η παρασκευή υδατοδιαλυτών νανοσωματιδίων χρυσού που προστατεύονται από μονοστοιβάδες πραγματοποιήθηκε με αναγωγή του HAuCl 4 από ισχυρό αναγωγικό παράγοντα (βοροϋδρίδιο του νατρίου, NaBH 4 ) παρουσία μορίων με ομάδες θειόλης (μερκαπταοκτανοϊκό οξύ, ΜΟΑ), γνωστή και ως Brust-Schiffrin μέθοδος. Η επιλογή του διλειτουργικού συνδέτη (μερκαπτοοκτανοϊκό οξύ, ΜΟΑ), ως προστατευτικού παράγοντα, παρέχει αρκετά πλεονεκτήματα. Η ομάδα θειόλης δρα ως παράγοντας σταθεροποίησης του πυρήνα του χρυσού λόγω του ισχυρού χημικού δεσμού που σχηματίζεται μεταξύ του χρυσού και του θείου (S-Au), ενώ οι ομάδες καρβοξυλικού οξέος μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν ως πεδίο σύζευξης με μόρια στόχευσης, όπως φυλλικό οξύ, μέσω δεσμών εστέρα ή αμιδίου. Περαιτέρω, ο σκελετός, που αποτελείται από αλυσίδες άνθρακα, είναι βιοχημικώς αδρανής και η εγγενής υδροφοβία του δημιουργεί ένα επιφανειακό στρώμα το οποίο μπορεί να δρα ως φορέας για ενσωματωμένα υδρόφοβα μόρια. Μια μελέτη σε βάθος των νανοσωματιδίων χρυσού που καλύπτονται από μερκαπτοοκτανοϊκό οξύ έχει δείξει εγγενή πλεονεκτήματα όπως η υδατοδιαλυτότητα, η βιοσυμβατότητα, η φωτοσταθερότητα, η ανθεκτικότητα και η δυνατότητα επεξεργασίας [193]. Εικόνα Γ.6: Μηχανισμός σύνθεσης των επιφανειακά τροποποιημένων νανοσωματιδίων χρυσού μέσω ομάδων θειόλης [303]. 125

150 Εικόνα Γ.7: Απεικόνιση νανοσωματιδίων χρυσού σταθεροποιημένων με μερκαπτοοκτανοικό οξύ. Αποτελούνται από τα σωματίδια χρυσού (metal substrate), τον συνδέτη-ομάδα θειόλης (ligand or Head Group), την ανθρακική αλυσίδα (Spacer, alkain chain) και τις τερματικές αλυσίδες-ομάδες καρβοξυλικού οξέος (Terminal Functional Group) [304]. Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα είναι οι παρακάτω : - HAuCl 4 + H 2 O AuCl 4 + H 3 O + Au BH 4 Au + 3 BH H + x Au + y SR Au x (SR) y n Au x (SR) y [Au x (SR) y ] n Στη συνέχεια διεξήχθη σύζευξη με μόριο βιολογικού σηματοδότη (φυλλικό οξύ, FA) που αποτελεί έναν ευρέως χρησιμοποιούμενο υδρόφιλο συνδέτη για στόχευση του υποδοχέα φυλλικού οξέος των κυττάρων. Ειδικότερα η βιο-στόχευση επιτεύχθηκε με σύζευξη των καρβοξυλομάδων της τελικής αλυσίδας των νανοσωματιδίων χρυσού με το φυλλικό οξύ, ενισχύοντας την υδροφιλικότητα των νανοσωματιδίων καινπροσδίδοντας τους ικανότητα επιλεκτικής στόχευση όγκων. Τα EDC και NHS χρησιμοποιήθηκαν για την ενεργοποίηση των καρβοξυλομάδων του ΜΟΑ, σχηματίζοντας ένα εξαιρετικά δραστικό ενδιάμεσο (ΝΗS-καρβοξυλικό άλας). Οι ενεργοποιημένες καρβοξυλικές ομάδες αντέδρασαν στη συνέχεια με την ελεύθερη αμινομάδα που παρουσιάζεται στο φυλλικό οξύ, με αποτέλεσμα το σχηματισμό νανοσωματιδίων τροποποιημένων με φυλλικό οξύ (AuNP ΜΟΑ-FΑ) (Εικόνα Γ.8) [193 ]. 126

151 Εικόνα Γ.8: Αντίδραση σύζευξης του φυλλικού οξέος με τα σταθεροποιημένα με μερκαπτοοκτανοικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού. Γ.5.1. Σύνθεση νανοσωματιδίων χρυσού ( AuNP MOA) Αρχικά τα υάλινα σκεύη που επρόκειτο να χρησιμοποιηθούν για τη σύνθεση των νανοσωματιδιων χρυσού πλύθηκαν με φρεσκοπαρασκευασμένο βασιλικό ύδωρ (HNO 3 /HCl 1:3, % v/v). Στη συνέχεια ξεπλύθηκαν με άφθονο απεσταγμένο νερό και τοποθετήθηκαν σε φούρνο για να στεγνώσουν. Αρχικά πραγματοποιήθηκε διάλυση 5,41 mg NaBH 4 (0,143 M) σε 1 ml dh 2 O, ανάμιξη 25,6 μl MOA με 0,9 ml EtOH και ανάμιξη 62,56 μl HAuCl 4 (0,012 M) με 4,54 ml dh 2 O (Εικόνα Γ.9α) υπό μαγνητική ανάδευση (100 rpm) σε θερμοκρασία δωματίου για 20 min. Μετά το πέρας των 20 min, το διάλυμα του ΜΟΑ προστίθεται αργά στο διάλυμα του HAuCl 4 υπό ήπια μαγνητική ανάδευση (100 rpm) και το μείγμα αφήνεται υπό μαγνητική ανάδευση (600 rpm) για 5 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Σε αυτό το στάδιο, παρατηρείται αλλαγή στο χρώμα του διαλύματος του HAuCl 4, από κίτρινο σε πορτοκαλί, με την προσθήκη του διαλύματος ΜΟΑ (Εικόνα Γ.9β). Στη συνέχεια πραγματοποιείται στάγδην η προσθήκη του διαλύματος του NaBH 4 και το διάλυμα που προκύπτει αφήνεται για όλο το βράδυ υπό μαγνητική ανάδευση (600 rpm) σε 127

152 θερμοκρασία περιβάλλοντος. Με την προσθήκη του διαλύματος του NaBH 4 γίνεται αναγωγή του HAuCl 4 και παρατηρείται απελευθέρωση αέριου H 2 υπό μορφή φυσαλίδων. Το χρώμα του τελικού διαλύματος αλλάζει και γίνεται σκούρο μοβ (Εικόνα Γ.9γ). Την επόμενη ημέρα το διάλυμα απομακρύνεται από το μαγνητικό αναδευτήρα. α β γ Εικόνα Γ.9: α) Αρχικά διαλύματα μερκαπτοοκτανοϊκού οξέος (MOA), τετραχλωροχρυσικού οξέος (HAuCl 4 ), Βοροϋδριδίου του νατρίου (NaBH 4 ). β) Διάλυμα HAuCl 4 μετά την προσθήκη του ΜΟΑ γ) Διάλυμα HAuCl 4 μετά την προσθήκη και του NaBH 4. Γ.5.2. Απομάκρυνση περίσσειας ΜΟΑ από τα νανοσωματίδια χρυσού (AuΝP MOA) Η απομάκρυνση της περίσσειας του ΜΟΑ πραγματοποιείται μέσω καταβύθισης των σχηματισμένων νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) σε αιθανόλη (EtOH). Σε μία προζυγισμένη κωνική φιάλη προστίθεται υπό ήπια μαγνητική ανάδευση (100 rpm) το διάλυμα των AuNP MOA σε 90 ml αιθανόλης (EtOH) και αφήνεται για 5 min σε θερμοκρασία δωματίου. Με την πάροδο των 5 λεπτών η κωνική φιάλη απομακρύνεται από το μαγνητικό αναδευτήρα και αφήνεται σε ηρεμία σε θερμοκρασία περιβάλλοντος για τρεις ημέρες. Τα νανοσωματίδια χρυσού είναι υδατοδιαλυτά και καταβυθίζονται στην EtOH, ενώ το ΜΟΑ είναι διαλυτό στην EtOH. Μετά από τρεις ημέρες απομακρύνεται προσεκτικά το υπερκείμενο διάλυμα της αιθανόλης. Τα νανοσωματίδια χρυσού έχουν καταβυθιστεί στον πυθμένα της κωνικής φιάλης ως ίζημα σκούρο μωβμπορντό (Εικόνα Γ.10). Η κωνική φιάλη τοποθετείται στον φούρνο στους 50 C μέχρι να απομακρυνθεί όλη η ποσότητα της αιθανόλης. Μετά από 4-5 ημέρες περίπου η 128

153 κωνική φιάλη ζυγίζεται, οπότε είναι δυνατός ο υπολογισμός της ποσότητας των AuMOA που έχουν σχηματιστεί. Εικόνα Γ.10: Νανοσωματίδια χρυσού που έχουν καταβυθιστεί με την προσθήκη αιθανόλης. Γ.5.3. Παρασκευή διαλύματος νανοσωματιδίων χρυσού (AuΝP MOA) συγκέντρωσης 1 mg/ml Στη συνέχεια πραγματοποιείται επαναιώρηση των νανοσωματιδίων χρυσού με προσθήκη PB με ph 7,4 (1Mm) ώστε να προκύψει διάλυμα συγκέντρωσης 1 mg/ml. Η διασπορά τοποθετείται για probe sonication σε 83 % amplitude για 2 hr και για bath sonication για 3 hr, μέχρι να επαναιωρηθούν πλήρως τα νανοσωματίδια χρυσού από τον πυθμένα της κωνικής φιάλης. Αρχικά το διάλυμα είναι διαυγές, ενώ στο τέλος, που έχουν επαναιωρηθεί και διαλυθεί τα νανοσωματίδια χρυσού στο PB είναι σκούρο μπλεμωβ (Εικόνα Γ.11). Ακολούθως ελέγχεται και ρυθμίζεται το ph του διαλύματος των AuNP MOA, καθώς πρέπει να είναι βασικό (ph 7,4), γιατί σε όξινο ph τα νανοσωματίδια του χρυσού καταβυθίζονται. Τέλος 1 ml από αυτό χρησιμοποιείται για λυοφιλοποίηση και ζύγιση του λαμβανόμενου στερεού ώστε να επιβεβαιωθεί ότι το διάλυμα έχει συγκέντρωση 1 mg/ml. 129

154 Εικόνα Γ.11: Νανοσωματίδια χρυσού που έχουν επαναιωρηθεί σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών αλάτων. Γ.5.4. Σύνδεση φυλλικού οξέος στα νανοσωματίδια χρυσού (παρασκευή διαλύματος AuΝP MOA FA συγκέντρωσης 1mg/ml) Ένα υδατικό διάλυμα EDC (30 mg EDC σε 4 ml dh 2 O) προστίθεται στο διάλυμα AuNP MOA (15 ml, 1 mg/ml) στο λουτρό υπερήχων (bath sonication) και αφήνεται για 10 min. Στη συνέχεια, ένα υδατικό διάλυμα NHS (30 mg NHS σε 4 ml dh 2 O) προστίθεται στο μείγμα και αφήνεται στον bath sonication για 30 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Στη συνέχεια, πραγματοποιείται διάλυση 33mg FA (0,3 mm) σε 6 ml dh 2 O με τη χρήση vortex. Το διάλυμα αυτό προστίθεται στο διάλυμα των AuMOA, τοποθετείται στο bath sonication για 30 min και έπειτα μεταφέρεται στο μαγνητικό αναδευτήρα όπου και αφήνεται σε σκοτάδι για όλο το βράδυ, υπό ήπια μαγνητική ανάδευση (250 rpm), σε θερμοκρασία δωματίου. Την επόμενη ημέρα το διάλυμα AuNP MOA FA απομακρύνεται από το μαγνητικό αναδευτήρα και υποβάλλεται σε φυγοκέντρηση στις 4000 rpm για 6 min προκειμένου να απομακρυνθεί η περίσσεια του FA, καθώς η ποσότητα του φυλλικού οξέος είναι μεγαλύτερη από αυτή που μπορεί να διαλυθεί από το dh 2 Ο (Εικόνα Γ.12α). Στη συνέχεια το υπερκείμενο τοποθετείται σε μεμβράνη διαπίδυσης με εξωτερικό διάλυμα PB με ph 7,4 υπό μαγνητική ανάδευση (400 rpm) σε σκοτάδι για 24hr. Το εξωτερικό 130

155 διάλυμα ανανεώνεται ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Στο στάδιο αυτό παρατηρείται μεταβολή του χρώματος του διαλύματος από κίτρινο σε ανοικτό κίτρινο, η οποία αποτελεί ένδειξη της απομάκρυνσης της περίσσειας του FA που δεν συνδέθηκε με το MOA (Εικόνα Γ.12β), Μετά το πέρας 24hr συλλέγεται το διάλυμα από τη μεμβράνη διαπίδυσης και 1ml από αυτό χρησιμοποιείται για λυοφιλοποιήση, ώστε να υπολογιστεί η συγκέντρωση των νανοσωματιδίων χρυσού στο τελικό διάλυμα. α β Εικόνα Γ.12: Τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού μετά την απομάκρυνση της περίσσειας του φυλλικού οξέος με α) φυγοκέντρηση β) διαπίδυση Γ.6. Χαρακτηρισμός των σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (Transmission Electron Microscopy, TEM) Η μελέτη της μορφολογίας και ο προσδιορισμός του μεγέθους των σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού πραγματοποιήθηκε με TEM. Μια σταγόνα δείγματος τοποθετείται σε δειγματοφορέα χαλκού επικαλυμμένο με υμένιο άνθρακα (formvar). Οι φωτογραφίες ΤΕΜ λήφθηκαν με τη χρήση του ηλεκτρονικού 131

156 μικροσκοπίου διέλευσης της εταιρείας JEOL, μοντέλο JEM-2100, χρησιμοποιώντας δυναμικό επιτάχυνσης 200kV. Γ.7. Χαρακτηρισμός των σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) με την τεχνική του Δυναμικού Σκεδασμού του Φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS) Μετρήθηκε το ζήτα δυναμικό και η υδροδυναμική διάμετρος των σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού με χρήση της LDV (Laser Doppler velocimetry) και με την προσέγγιση Smoluchowski. Ειδικότερα 0,7 ml διαλύματος νανοσωματιδίων χρυσού τοποθετήθηκαν σε ειδική κυψελίδα και πραγματοποιήθηκαν 3 μετρήσεις όπου λήφθηκε η μέση τιμή αυτών. Οι μετρήσεις έλαβαν χώρα σε 25 C, ορίζοντας ως δείκτη διάθλασης (Refractive Index, RI) εκείνον του νερού. Το όργανο που χρησιμποποιήθηκε ήταν της εταιρείας Malvern (Nano Zeta Sizer), εφοδιασμένο με laser He-Ne 4wM, μήκους κύματος 633 nm. Το συγκεκριμένο όργανο χρησιμοποιεί μία φωτοδίοδο ως ανιχνευτή, ενώ η σκεδαζόμενη ακτινοβολία μετριέται σε γωνία Γ.8. Έλεγχος της σταθερότητας των σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού παρουσία ηλεκτρολυτών Ελέγχθηκε η κολλοειδής σταθερότητα των σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού παρουσία ηλεκτρολυτών (NaCl) με μέτρηση του μεγέθους (υδροδυναμικής διαμέτρου) τους και του ζήτα δυναμικού τους με την τεχνική του δυναμικού σκεδασμού του φωτός. Για τη μέτρηση της υδροδυναμικής διαμέτρου και του ζήτα δυναμικού παρουσία ηλεκτρολυτών, πρώτα παρασκευάστηκε διάλυμα NaCl συγκέντρωσης 2Μ με τη διάλυση 233,8 mg χλωριούχου νατρίου σε 2 ml dh 2 O υπό μαγνητική ανάδευση (2 rpm) 132

157 και θέρμανση (50 C) για 10 min. Στη συνέχεια ακολούθησαν κατάλληλες αραιώσεις του παραπάνω διαλύματος για την παρασκευή διαλυμάτων με συγκεντρώσεις 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,0 M τελικού όγκου 900 μl το καθένα. Έπειτα έγινε προσθήκη 100 μl του διαλύματος των σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού και τέθηκαν υπό μαγνητική ανάδευση (vortex) προκειμένου να ομογενοποιηθούν. Ύστερα αφέθηκαν σε ηρεμία για 1h σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν οι μετρήσεις μεγέθους (υδροδυναμικής διαμέτρου) τους και του ζήτα δυναμικού τους με τη χρήση ειδικής κυψελίδας. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε όργανο της εταιρείας Malvern (Nano Zeta Sizer), εφοδιασμένο με laser He-Ne 4wM, μήκους κύματος 633 nm. Το συγκεκριμένο όργανο χρησιμοποιεί μία φωτοδίοδο ως ανιχνευτή, ενώ η σκεδαζόμενη ακτινοβολία μετριέται σε γωνία 173 Ο. Οι μετρήσεις έλαβαν χώρα σε 25 C, ορίζοντας ως δείκτη διάθλασης (Refractive Index, RI) εκείνον του νερού και οι αναφερόμενες υδροδυναμικές διάμετροι, όπως και οι τιμές του ζήτα δυναμικού, είναι το αποτέλεσμα τριών μετρήσεων. Το ζήτα δυναμικό των φορέων μετρήθηκε με χρήση της LDV (Laser Doppler velocimetry) και με την προσέγγιση Smoluchowski. Γ.9. Φασματοφωτομετρικός προσδιορισμός φυλλικού οξέος (FA) στα νανοσωματίδια χρυσού (ΑuMOA FA) Γ.9.1. Έλεγχος της σύνδεσης του φυλλικού οξέος στα νανοσωματίδια χρυσού Για τον έλεγχο της σύνδεσης του φυλλικού οξέος στα νανοσωματίδια χρυσού πραγματοποιείται μέτρηση της έντασης της απορρόφησης του διαλύματος των νανοσωματιδίων χρυσού πριν και μετά την προσθήκη φυλλικού οξέος σε αυτά, στο μήκος κύματος που απορροφούν τα νανοσωματίδια χρυσού (520 nm) και το φυλλικό οξύ (365 nm). 133

158 absorption Ως τυφλό διάλυμα χρησιμοποιήθηκε PB με ph 7,4 (αποτελεί τον διαλύτη των νανοσωματιδίων χρυσού). Γ.9.2. Ποσοτικός προσδιορισμός της περιεκτικότητας φυλλικού οξέος στα νανοσωματίδια χρυσού Για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας φυλλικού οξέος στα νανοσωματίδια χρυσού είναι απαραίτητη η κατασκευή της καμπύλης βαθμονόμησης (Εικόνα Γ.13) με τη χρήση πρότυπων διαλυμάτων φυλλικού οξέος σε PB με ph 7,4. Ειδικότερα παρασκευάζεται διάλυμα φυλλικού οξέος συγκέντρωσης 3 mg/ml με τη διάλυση 45 mg φυλλικού οξέος σε 15 ml PB με ph 7,4 (1Mm) μέσω vortex. Στη συνέχεια ακολουθούν κατάλληλες αραιώσεις του παραπάνω διαλύματος για την παρασκευή διαλυμάτων με συγκεντρώσεις 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 ppm. 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Equation : y = A+ B*X Parameter Value Error A 0, ,00168 B 0, ,40507E [FA] (ppm) Εικόνα Γ.13: Πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης για την ποσοτικοποίηση του φυλλικού οξέος στα νανοσωματίδια χρυσού. Πραγματοποιείται μέτρηση της έντασης της απορρόφησης του διαλύματος των νανοσωματιδίων χρυσού στο μήκος κύματος που παρουσιάζει το φυλλικό οξύ την μέγιστη απορρόφηση, δηλαδή στα 365 nm. Ως τυφλό διάλυμα χρησιμοποιείται διάλυμα 134

159 νανοσωματίδιων χρυσού, το οποίο δεν έχει τροποποιηθεί με φυλλικό οξύ σε PB με ph 7,4, ίδιας συγκέντρωσης με το υπό μελέτη διάλυμα. Με τη βοήθεια της πρότυπης καμπύλης βαθμονόμησης γίνεται μετατροπή της τιμής της απορρόφησης του διαλύματος των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού σε συγκέντρωση φυλλικού οξέος, καθιστώντας δυνατή την ποσοτικοποιήσή του στα νανοσωματίδια χρυσού. Η εξίσωση βάσει της οποίας έγινε ο υπολογισμός της περιεκτικότητας σε φυλλικό οξύ στα νανοσωματίδια χρυσού είναι η εξής : (εξίσωση Γ.5) Γ.10. Χαρακτηρισμός των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (Transmission Electron Microscopy, TEM) Η μελέτη της μορφολόγιας και ο προσδιορισμός του μεγέθους των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού πραγματοποιήθηκε με TEM. Μια σταγόνα δείγματος τοποθετείται σε δειγματοφορέα χαλκού επικαλυμμένο με υμένιο άνθρακα (formvar). Οι φωτογραφίες ΤΕΜ λήφθηκαν με τη χρήση του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου διέλευσης της εταιρείας JEOL, μοντέλο JEM-2100, χρησιμοποιώντας δυναμικό επιτάχυνσης 200kV. 135

160 Γ.11. Χαρακτηρισμός των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού με την τεχνική του Δυναμικού Σκεδασμού του Φωτός (Dynamic Light Scattering, DLS) Μετρήθηκε το ζήτα δυναμικό των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού με χρήση της LDV (Laser Doppler velocimetry) και με την προσέγγιση Smoluchowski. Ειδικότερα 0,7 ml διαλύματος νανοσωματιδίων χρυσού τοποθετήθηκαν σε ειδική κυψελίδα και πραγματοποιήθηκαν 3 μετρήσεις όπου λήφθηκε η μέση τιμή αυτών. Οι μετρήσεις έλαβαν χώρα σε 25 C, ορίζοντας ως δείκτη διάθλασης (Refractive Index, RI) εκείνον του νερού. Το όργανο που χρησιμποποιήθηκε ήταν της εταιρείας Malvern (Nano Zeta Sizer), εφοδιασμένο με laser He-Ne 4wM, μήκους κύματος 633 nm. Το συγκεκριμένο όργανο χρησιμοποιεί μία φωτοδίοδο ως ανιχνευτή, ενώ η σκεδαζόμενη ακτινοβολία μετριέται σε γωνία Γ.12. Προσδιορισμός της απόδοσης των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού Δείγμα τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού συγκεκριμένου όγκου (σε μορφή διαλύματος σε dh 2 O) τοποθετείται σε υγρό άζωτο προκειμένου να επιτευχθεί ταχεία και υψηλή ψύξη. Έπειτα πραγματοποιείται λυοφιλοποίηση του δείγματος και ξήρανση για 24 h. Μετά το πέρας των 24 h, το λυοφιλοποιημένο δείγμα το οποίο βρίσκεται σε μορφή σκόνης ζυγίζεται για να μετρηθεί η διαφορά μάζας με το αρχικό διάλυμα. Η απόδοση (% yield) υπολογίζεται με τη βοήθεια της παρακάτω εξίσωσης: 136

161 (εξίσωση Γ.6) Γ.13. Έλεγχος της σταθερότητας των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού παρουσία ηλεκτρολυτών Ελέγχθηκε η κολλοειδής σταθερότητα των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού παρουσία ηλεκτρολυτών (NaCl) με μέτρηση του μεγέθους (υδροδυναμικής διαμέτρου) τους και του ζήτα δυναμικού τους με την τεχνική του δυναμικού σκεδασμού του φωτός καθώς και με τη λήψη φάσματος με φασματοφωτομετρική ανάλυση. Για τη μέτρηση της υδροδυναμικής διαμέτρου και του ζήτα δυναμικού παρουσία ηλεκτρολυτών, πρώτα παρασκευάστηκε διάλυμα NaCl συγκέντρωσης 2Μ με τη διάλυση 233,8 mg χλωριούχου νατρίου σε 2 ml dh 2 O υπό μαγνητική ανάδευση (2 rpm) και θέρμανση (50 C) για 10 min. Στη συνέχεια ακολούθησαν κατάλληλες αραιώσεις του παραπάνω διαλύματος για την παρασκευή διαλυμάτων με συγκεντρώσεις 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,0 M τελικού όγκου 900 μl το καθένα. Έπειτα έγινε προσθήκη 100 μl του διαλύματος των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού και τέθηκαν υπό μαγνητική ανάδευση (vortex) προκειμένου να ομογενοποιηθούν. Ύστερα αφέθηκαν σε ηρεμία για 1h σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, πραγματοποιήθηκαν οι μετρήσεις μεγέθους (υδροδυναμικής διαμέτρου) τους και του ζήτα δυναμικού τους με τη χρήση ειδικής κυψελίδας και έγινε λήψη του φάσματος των νανοσωματιδίων χρυσού από 200 έως 700 nm για τον έλεγχο τυχόν μεταβολής της κορυφής στα 365 nm και στα 280 nm. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν σε όργανο της εταιρείας Malvern (Nano Zeta Sizer), εφοδιασμένο με laser He-Ne 4wM, μήκους κύματος 633 nm. Το συγκεκριμένο όργανο χρησιμοποιεί μία φωτοδίοδο ως ανιχνευτή, ενώ η σκεδαζόμενη ακτινοβολία μετριέται σε γωνία Οι μετρήσεις έλαβαν χώρα σε 25 C, ορίζοντας ως δείκτη διάθλασης (Refractive Index, RI) εκείνον του νερού και οι αναφερόμενες υδροδυναμικές διάμετροι, όπως και οι τιμές του ζήτα δυναμικού, είναι το αποτέλεσμα τριών 137

162 μετρήσεων. Το ζήτα δυναμικό των φορέων μετρήθηκε με χρήση της LDV (Laser Doppler velocimetry) και με την προσέγγιση Smoluchowski. Γ.14. Μελέτη των παραμέτρων της φόρτωσης και αποδέσμευσης Πακλιταξέλης (PTX) από τα τροποποιήμενα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού Στο κεφάλαιο αυτό της παρούσας διπλωματικής μελετήθηκε η φόρτωση του αντικαρκινικού φαρμάκου Πακλιταξέλη (Paclitaxel, PTX) σε νανοσωματίδια χρυσού τροποποιημένα με φυλλικό οξύ και ακολούθως η αποδέσμευση του φαρμάκου από τους νανοφορείς. Η φόρτωση της πακλιταξέλης πραγματοποιήθηκε με μη-ομοιοπολική σύνδεση του φαρμάκου σε μονοστοιβάδες AuNP MOA FA. Αυτή η στρατηγική βασίζεται στη δομή των χρησιμοποιούμενων υδατοδιαλυτών νανοσωματιδίων χρυσού, τα οποία χαρακτηρίζονται από ένα υδρόφοβο εσωτερικό και ένα υδρόφιλο εξωτερικό περιβάλλον. Έτσι η ανθρακική μονοστοιβάδα του ΜΟΑ σε συνδυασμό με την ακτινωτή φύση των υποκαταστατών δημιουργεί υδρόφοβες θέσεις μέσα στην μονοστοιβάδα, στις οποίες μπορούν να συνδεθούν υδρόφοβες ουσίες, όπως η πακλιταξέλη. Για την αποδέσμευση της πακλιταξέλης χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της διαπίδυσης. Tο μέσο αποδέσμευσης (release medium) που επιλέχθηκε, ήταν το PB (1mM, ph:7.4) και οι μεμβράνες διαπίδυσης (Dialysis bag) που χρησιμοποιήθηκαν ήταν της εταιρείας Sigma Aldrich, με μοριακό βάρος αποκλεισμού (MWCO) τα 14kDa. Στην Εικόνα Γ.13, απεικονίζεται η διαδικασία απελευθέρωσης της PTX από τα νανοσωματίδια χρυσού (ΑuNPs-FA) και η διάχυσή της στο μέσο αποδέσμευσης μέχρις ότου εξισορρόπηθουν οι συγκεντρώσεις από τις 2 πλευρές της μεμβράνης (κατάσταση ισορροπίας). 138

163 Εικόνα Γ.14: Αποδέσμευση PTX από τα νανοσωματίδια χρυσού και διάχυσής της διαμέσου της μεμβράνης, μέχρι να επέλθει κατάσταση ισορροπίας (305). Γ.14.1 Διαδικασία φόρτωσης της πακλιταξέλης σε τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού Σε πρώτο στάδιο παρασκευάστηκε διάλυμα πακλιταξέλης συγκέντρωσης 0,25 mg/ml με διάλυση 2,5 mg πακλιταξέλης σε 10 ml ακετονιτρίλιο με τη χρήση υπερήχων (bath sonication) για 5 min. Σε δεύτερο στάδιο πραγματοποιείται η διαδικασία φόρτωσης της πακλιταξέλης ως εξής : Αρχικά, σε 5 ml διαλύματος νανοσωματιδίων χρυσού συγκέντρωσης 1 mg/ml προστίθενται 2 ml του διαλύματος της πακλιταξέλης συγκέντρωσης 0,25 mg/ml υπό μαγνητική ανάδευση (100 rpm) και το μίγμα αφήνεται υπό ανάδευση (100 rpm) για 10 min σε θερμοκρασία περιβάλλοντος. Έπειτα υποβάλλεται σε υπέρηχους ακίδας (probe sonication) σε 83 % amplitude για 10 min. Στη συνέχεια γίνεται εξάτμιση του οργανικού διαλύτη (ακετονιτριλίου) του παραπάνω δείγματος με τη χρήση περιστροφικού εξατμιστήρα υπό κενό (rotary evaporator) για 2 h στους 30 C. Τέλος ακολουθεί φυγοκέντρηση του δείγματος σε 3000 rpm για 5 min στους 25 C και λαμβάνεται το υπερκείμενο, το οποίο περιέχει τα νανοσωματίδια χρυσού με τη δεσμευμένη πακλιταξέλη για περαιτέρω χρήση. 139

164 Εικόνα Γ.15: Τροποποιημένα με φυλλικό νανοσωματίδια χρυσού στα οποία έχει φορτωθεί πακλιταξέλη. Γ Προσδιορισμός φόρτωσης της πακλιταξέλης σε τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού Ο προσδιορισμός της φόρτωσης της Πακλιταξέλης στα τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού έγινε φασματοφωτομετρικά. H πειραματική διαδικασία είναι η ακόλουθη: Παρασκευή των φορτωμένων με πακλιταξέλη νανοσωματιδίων χρυσού σύμφωνα με την πειραματική διαδικασία της παραγράφου Γ Λυοφιλοποίηση του δείγματος για 24 h και ζύγιση του ξηραθέντος υλικού. Διάλυση του ξηραθέντος δείγματος με 1,8 ml ακετονιτρίλιο (ACN) και τοποθέτησή του σε λουτρό υπερήχων (bath sonication) για 40 min. Προσθήκη 1,2 ml dh 2 O και ομογενοποίηση με bath sonication για 10 min. Εισαγωγή του δείγματος σε φασματοφωτόμετρο ορατού-υπεριώδους για την πραγματοποίηση μετρήσεων. Η μέτρηση της έντασης της απορρόφησης του διαλύματος πραγματοποιείται στο μήκος κύματος που παρουσιάζει η πακλιταξέλη την μέγιστη απορρόφηση, δηλαδή στα 230 nm. Ως τυφλό διάλυμα χρησιμοποιείται διάλυμα τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματίδιων χρυσού σε ACN-H 2 O (60% - 40 %). 140

165 Absorption Το όργανο που χρησιμοποιήθηκε για τις μετρήσεις είναι της εταιρείας Shimadzu (UV- Spectrophotometer UV-1800). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ΡΤΧ στα δείγματα απαραίτητη είναι η χρήση πρότυπων δειγμάτων και η κατασκευή καμπύλης βαθμονόμησης (Εικόνα Γ.16). Για την παρασκευή αυτών των δειγμάτων, 1 mg ΡΤΧ διαλύθηκε αρχικά σε 12 ml ACN με τη χρήση bath sonication για 10 min. Έπειτα έγινε προσθήκη 8 ml dh 2 O και το διάλυμα παρέμεινε στο λουτρό υπερήχων ακόμα 5 min. Έτσι προέκυψαν 20 ml διαλύματος πακλιταξέλης 50 ppm. Στην συνέχεια ακολούθησαν κατάλληλες αραιώσεις με μείγμα ACN-H 2 O (60% - 40 %) προκειμένου να παρασκευαστούν πρότυπα διαλύματα πακλιταξέλης συγκεντρώσεων 1, 2, 4, 5, 10, 11, 12, 15, 18, 20 ppm. 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Equation : y = A + B*X Parameter Value Error A -0, ,00697 B 0, ,97849E [ PTX ] (ppm) Εικόνα Γ.16: Πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της πακλιταξέλης. Οι υπολογισμοί της πραγματικής φόρτωσης (% drug loading), της θεωρητικής φόρτωσης (% theoretical drug loading) και της ενκαψακίωσης (% drug encapsulation) του φαρμάκου στα νανοσωματίδια χρυσού προκύπτουν με βάση τις ακόλουθες εξισώσεις : 141

166 (εξίσωση Γ.7) (εξίσωση Γ.8) (εξίσωση Γ.9) Γ Μελέτη αποδέσμευσης της πακλιταξέλης από τροποποιημένα με φυλλικό οξύ νανοσωματίδια χρυσού Για τη μελέτη αποδέσμευσης της πακλιταξέλης από τα τροποποιημένα με φυλλικό νανοσωματίδια χρυσού ακολουθήθηκε η παρακάτω διαδικασία : Δείγματα φορτωμένων με πακλιταξέλη νανοσωματιδίων χρυσού (0,5 ml) τοποθετήθηκαν σε μεμβράνη διαπίδυσης και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε φιαλίδια, τα οποία περιείχαν 10 ml ρυθμιστικού διαλύματος PB (1 mm, ph =7.4) και είχαν τοποθετηθεί μέσα σε ήπια ανακινούμενο υδατόλουτρο 37 C. Πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες στις 0,5, 1, 2, 3, 6, 9, 24 και 48 h με παραλαβή όλης της ποσότητας του PB και προσθήκη εκ νέου της ίδιας ποσότητας PB, προκειμένου να διατηρηθεί σταθερός ο όγκος καθ όλη τη διαδικασία. Στα ληφθέντα δείγματα έγινε εκχύλιση του φαρμάκου με 2 ml DCM [ανακίνηση επί 3 λεπτά σε vortex, άφεση για διαχωρισμό των δύο φάσεων σε ηρεμία για 24 h και απομάκρυνση του ΡΒ (πάνω φάση)]. 142

167 Εξάτμιση του DCM στους 50 C και διάλυση υπολείμματος σε 1,8 ml ACN με τη βοήθεια υπερήχων (bath sonication) για 5 min. Παραμονή των διαλυμάτων σε ηρεμία για 30 min και έπειτα τοποθέτησή τους στο bath sonication για 1 min. Προσθήκη 1,2 ml dh 2 O και χρήση vortex και λουτρού υπερήχων για να γίνουν ομοιογενή τα δείγματα. Λήψη μετρήσεων των διαλυμάτων που έχουν προκύψει με τη βοήθεια φασματοφωτόμετρου ορατού-υπεριώδους φωτός. Η μέτρηση της έντασης της απορρόφησης των δειγμάτων πραγματοποιείται στο μήκος κύματος που παρουσιάζει η πακλιταξέλη την μέγιστη απορρόφηση, δηλαδή στα 230 nm. Ως τυφλό διάλυμα χρησιμοποιείται διάλυμα ACN- dh 2 O (60% - 40 %). Το όργανο που χρησιμοποιήθηκε για τις μετρήσεις είναι της εταιρείας Shimadzu (UV- Spectrophotometer UV-1800). Το αθροιστικό ποσοστό αποδέσμευσης του φαρμάκου (Cumulative Release) υπολογίζεται από την παρακάτω σχέση : (εξίσωση Γ.10) όπου t είναι οι χρονικές στιγμές δειγματοληψίας. Γ.15. Μελέτες Κυτταροτοξικότητας Μελετήθηκε η κυτταροτοξικότητα των νανοσωματιδίων χρυσού, φορτωμένα και μη με πακλιταξέλη, σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές που λήφθηκαν από την ECACC-ΗΡΑ (Ευρωπαϊκή Συλλογή Κυτταροκαλλιεργειών - Οργανισμός Προστασίας της Υγείας, Ηνωμένο Βασίλειο). Ειδικότερα χρησιμοποιήθηκαν οι καρκινικές σειρές MDA-MB 231 και MCF-7, από τις οποίες η πρώτη εκφράζει υποδοχείς φυλλικού οξέος ενώ η δεύτερη όχι. Η μελέτη κυτταροτοξικότητας πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο ΜΤΤ. Η μέθοδος αυτή περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Mosmann το 1983 και βασίζεται στη μετατροπή 143

168 των αλάτων τετραζολίου σε μη διαλυτά παράγωγα φορμαζάνης. Η τεχνική του ΜΤΤ ( 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) είναι μια χρωματογραφική μέθοδος (μετράει χρωματικές αλλαγές) η οποία χρησιμοποιείται είτε για την μελέτη του πολλαπλασιασμού των κυττάρων είτε για την μελέτη κυτταροτοξικότητας. Βασίζεται στην ικανότητα των ζωντανών κυττάρων να μετατρέπουν το διαλυτό κίτρινο άλας τετραζολίου (κίτρινη χρωστική) σε αδιάλυτους πορφυρούς κρυστάλλους φορμαζάνης. Συγκεκριμένα το ΜΤΤ οξειδώνεται από τις αφυδρογονάσες των μιτοχονδρίων των ζωντανών κυττάρων και παράγονται πορφυρού χρώματος κρύσταλλοι φορμαζάνης, οι οποίοι συσσωρεύονται στα μιτοχόνδρια του κυττάρου. Η οξείδωση του ΜΤΤ πραγματοποιείται μόνο όταν τα μιτοχονδριακά ένζυμα είναι μεταβολικά ενεργά και συνεπώς η παραγωγή κρυστάλλων φορμαζάνης είναι απ ευθείας ανάλογη του αριθμού βιώσιμων κυττάτων (306), (307). Εικόνα Γ.17: Αντίδραση αναγωγής του κίτρινου άλατος τετραζολίου (ΜΤΤ) σε πορφυρού χρώματος κρυστάλλους φορμαζάνης από το ένζυμο ρεδουκτάση (308). Οι κρύσταλλοι φορμαζάνης που παράγονται, διαλύονται σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και παράγουν ένα χρωματικό διάλυμα του οποίου η ένταση είναι ανάλογη της μεταβολικής δραστηριότητας των κυττάρων. Με την φασματοφωτομετρική ανάλυση (μέγιστη οπτική απορρόφηση σε μήκος κύματος 570 nm) εξάγονται συμπεράσματα για τη μεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων και κατ επέκταση για τη βιωσιμότητά τους. 144

169 Εικόνα Γ.18: Πλάκα 96 φρεατίων μετά από μια δοκιμασία ΜΤΤ (308). Η πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε για τον προσδιορισμό της κυτταροτοξικότητας είναι η ακόλουθη: Διαφορετικές συγκεντρώσεις νανοσωματίδιων χρυσού που αντιστοιχούσαν σε συγκεντρώσεις πακλιταξέλης από 0,1 μμ έως 50 μμ και ελεύθερη πακλιταξέλη από 0,1 μμ έως 50 μμ επωάστηκαν με τα κύτταρα για 24 ώρες. Το αντιδραστήριο ΜΤΤ προστέθηκε στα πηγαδάκια (wells) σε συγκεντρώσεις 5 mg/ml και τα πλακίδια (plates) επωάστηκαν για τρεις ώρες στους 37 C. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο απορρίφθηκε και τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PB. Οι κρύσταλλοι της φορμαζάνης που σχηματίστηκαν διαλύθηκαν με DMSO. Η απορρόφηση των πλακιδίων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο μquant (ΜQuant Biomolecular Spectrophotometer ΜQΧ200) και τα δεδομένα αναλύθηκαν με το πρόγραμμα Gen5 (Gen5 Microplate Data Collection & Analysis software, BioTek Instruments Inc., April 2008). Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 570 nm καθώς και στα 630 nm (απορρόφηση υποστρώματος, background) η οποία αφαιρέθηκε από την αντίστοιχη απορρόφηση στα 570nm. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. 145

170 146

171 Δ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΖΗΤΗΣΗ Δ.1. Μορφολογία, φυσικοχημικά χαρασκτηριστικά και μελέτη σταθερότητας σε NaCl των σταθεροποιημένων με μερκαπτο-οκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) Μετά τη σύνθεση των σταθεροποιημένων με μερκαπτοοκτανοϊκό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (ΑuNP MOA) και την απομάκρυνση της περίσσειας του ΜΟΑ, στο φάσμα των νανοσωματιδίων χρυσού εμφανίζεται μια απορρόφηση στα 520 nm που επιβεβαιώνει την επιτυχή σύνθεσή τους. Εικόνα Δ.1: Γραφική παράσταση απορρόφησης των νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) σε συνάρτηση με το μήκος κύματος. Στις παρακάτω φωτογραφίες Δ.2 και Δ.3 το ζ-δυναμικό των νανοσωματιδίων χρυσού (ΑuNP MOA) είναι αρνητικό με τιμή -24,1±1,13 mv και το μέγεθος της υδροδυναμικής διαμέτρου τους κυμαίνεται στα 94,80±0,422 nm. Πάντως οι μετρήσεις μεγέθους των νανοσωματιδίων χρυσού με DLS δεν είναι ακριβείς και για αυτό το μέγεθός τους προσδιορίστηκε με ακρίβεια με ΤΕΜ. 147

172 Εικόνα Δ.2: Κατανομή ζ-δυναμικού των νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) με DLS (3 επαναλήψεις). Εικόνα Δ.3: Κατανομή υδροδυναμικής διαμέτρου νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) με DLS (3 επαναλήψεις). Η περαιτέρω μελέτη του μεγέθους και της μορφολογίας των νανοσωματιδίων χρυσού πραγματοποιήθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (ΤΕΜ). 148

173 Παρουσιάζονται φωτογραφίες από ΤΕΜ των νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) (Εικόνα Δ.4), οι οποίες παρέχουν πληροφορίες της μορφολογίας και του μεγέθους τους. Παρατηρούνται ομοιόμορφοι σφαιρικοί σχηματισμοί με εύρος μεγέθους 4,76-14,82 nm. Εικόνα Δ.4: Εικόνες των νανοσωματιδίων χρυσού ΑuNP MOA (ράβδος = 100 nm στην πάνω εικόνα και ράβδος = 50 nm στην κάτω εικόνα). Μετά από μελέτη σταθερότητας των νανοσωματιδίων χρυσού σε διαφορετικές συγκεντρώσεις NaCl η υδροδυναμική διάμετρος, το ζ-δυναμικό και η πολυδιασπορά μεταβλήθηκαν ως εξής: 149

174 Size Average (nm) Zeta-potential (mv) -50 AuNP MOA ,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 [NaCl] (M) Εικόνα Δ.5: Μετρήσεις ζ-δυναμικού των νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) αυξανόμενων των συγκεντρώσεων ΝaCl AuNP MOA ,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 [NaCl] (M) Εικόνα Δ.6: Μετρήσεις μεγέθους (υδροδυναμικής διαμέτρου) των νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) αυξανόμενων των συγκεντρώσεων ΝaCl. 150

175 Εικόνα Δ.7: Μετρήσεις πολυδιασποράς των νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA) αυξανόμενων των συγκεντρώσεων ΝaCl. Το ζ-δυναμικό δεν είχε σημαντική μεταβολή όμως το μέγεθος αυξήθηκε σημαντικά με αύξηση της συγκέντρωσης του ηλεκτρολύτη υποδεικνύοντας τη συσσωμάτωση των σωματιδίων χρυσού (ΑuNP MOA). Δ.2. Μορφολογία και φυσικοχημικά χαρακτηριστικά των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA-FA) Πραγματοποιήθηκε έλεγχος της σύνδεσης του φυλλικού οξέος στα νανοσωματίδια χρυσού με φασματοφωτομετρική μέτρηση όπου η παρουσία απορρόφησης στα 365 nm, επιβεβαιώνει την επιτυχή σύνδεσή του. Επιπλέον παρατηρείται απορρόφηση στα 280 nm η οποία επιβεβαιώνει και την επιτυχή σύνδεσή του μερκαπτοοκτανοικού οξέος στα νανοσωματίδια χρυσού (Εικόνα Δ.8). 151

176 Εικόνα Δ.8: Φάσμα των νανοσωματιδίων χρυσού πριν και μετά τη σύνδεσή φυλλικού οξέος. Σύμβολα: GNP MOA: νανοσωματίδια χρυσού χωρίς φυλλικό οξύ, GNP MOA FA: νανοσωματίδια χρυσού τροποποιημένα με φυλλικό οξύ. Η ποσότητα του φυλλικού οξέος που προσδέθηκε στα νανοσωματίδια χρυσού υπολογίστηκε με τη βοήθεια της εξίσωσης Γ.4 και βρέθηκε 33,1±6,13 % w/w. Όπως φαίνεται στις παρακάτω εικόνες Δ.9 και Δ.10 η τιμή του ζ-δυναμικού των νανοσωματιδίων χρυσού που έχει προσδεθεί φυλλικό είναι αρνητική στα -12,4±1,11 mv, ενώ η τιμή της υδροδυναμικής διαμέτρου τους κυμαίνεται στα 263,2±14,6237 nm. Παρατηρείται μία ευρεία κατανομή της υδροδυναμικής διαμέτρου που σημαίνει ότι υπάρχουν νανοσωματίδια χρυσού με διάφορα μεγέθη. Πάντως οι μετρήσεις μεγέθους των νανοσωματιδίων χρυσού με DLS δεν είναι ακριβείς και για αυτό το μέγεθός τους προσδιορίστηκε με ακρίβεια με ΤΕΜ. 152

177 Εικόνα Δ.9: Κατανομή ζ-δυναμικού των νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA FA) με DLS (3 επαναλήψεις). Εικόνα Δ.10: Κατανομή υδροδυναμικής διαμέτρου νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA FA)με DLS. (3 επαναλήψεις) Η περαιτέρω μελέτη του μεγέθους και της μορφολογίας των νανοσωματιδίων χρυσού πραγματοποιήθηκε με ηλεκτρονική μικροσκοπία διέλευσης (ΤΕΜ). Στην Εικόνα Δ.11 παρουσιάζονται μικροφωτογραφίες από ΤΕΜ των νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA FA), οι οποίες δίνουν πληροφορίες της γεωμετρίας και του 153

178 μεγέθούς τους. Παρατηρούνται ομοιόμορφοι σφαιρικοί σχηματισμοί με εύρος μεγέθους 5,02 18,23 nm. Εικόνα Δ.11: Εικόνες των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού ΑuNP MOA FA (ράβδος = 100 nm στην αριστερή εικόνα και ράβδος = 50 nm στη δεξιά εικόνα). Η απόδοση της παρασκευής των νανοσωματιδίων χρυσού, η οποία υπολογίστηκε με τη βοήθεια της εξίσωσης Γ.6 κυμαίνεται μεταξύ 17,4 % και 18,8%. Ο μέσος όρος της απόδοσης είναι 18,17 ± 0,71%. Δ.3. Μελέτη σταθερότητας σε NaCl των τροποποιημένων με φυλλικό οξύ νανοσωματιδίων χρυσού (AuNP MOA FA) Ελέγχθηκε η κολλοειδής σταθερότητα των νανοσωματιδίων χρυσού (ΑuNP MOA FA) παρουσία ηλεκτρολύτη, χλωριούχου νατρίου (NaCl), σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Η σταθερότητα των νανοφορέων είναι ιδιαίτερα σημαντική, καθώς με τον τρόπο αυτό εξασφαλίζεται ότι η πιθανή χορήγησή τους in vivo θα είναι ασφαλής και θα διατηρηθούν οι εκτιμώμενες, με βάση τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά τους, ιδιότητες βιοκατανομής. Πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις της υδροδυναμικής διαμέτρου, του ζ-δυναμικού και της πολυδιασποράς με την τεχνική του δυναμικού σκεδασμού φωτός (DLS) (Εικόνα Δ.12, 154