Δήμητρα Βαβουλίδου Μεταπτυχιακή Φοιτήτρια. Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Κατεύθυνση «Περιβαλλοντική Βιολογιά»

Transcript

1 Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Κατεύθυνση «Περιβαλλοντική Βιολογιά» Μεταπτυχιακή Διπλωματική Εργασία ΘΕΜΑ: Απομόνωση και χαρακτηρισμός μικροοργανισμών από αστικά λύματα που φέρουν υψηλή περιεκτικότητα σε χρώμιο Δήμητρα Βαβουλίδου Μεταπτυχιακή Φοιτήτρια Eπιβλέπoντες: κ. Μηνάς Γιάγκου, Αν. Καθηγητής κ. Πέτρος Σαμαράς, Αν. Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας Σχολή Θετικών Επιστημών Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης Θεσσαλονίκη, 2007

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ...2 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ...6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γενικά χαρακτηριστικά του χρωμίου Παρουσία του χρωμίου στο περιβάλλον Τοξικότητα του χρωμίου στον άνθρωπο Τοξικoκινητική και μεταβολισμός του χρωμίου στον άνθρωπο Όρια Νομοθεσία Μέθοδοι απομάκρυνσης του χρωμίου από τα υγρά απόβλητα Περιγραφή της διεργασίας της ενεργού ιλύος Βακτήρια ενεργού ιλύος Ανθεκτικότητα των βακτηρίων σε χρώμιο Απομόνωση και χαρακτηρισμός ανθεκτικών στο χρώμιο μικροοργανισμών ικανών για βιολογική απομάκρυνση του χρωμίου Παρουσία ανθεκτικών στο χρώμιο μικροοργανισμών και ικανότητα για βιολογική απομάκρυνση του χρωμίου σε συστήματα επεξεργασίας λυμάτων

3 1.11. Παρουσία ανθεκτικών στο χρώμιο μικροοργανισμών και ικανότητα για βιολογική απομάκρυνση του χρωμίου σε συστήματα επεξεργασίας λυμάτων στην Ελλάδα ΣΚΟΠΟΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Προέλευση δειγμάτων ενεργού ιλύος Θρεπτικό υλικό Πυκνό πρότυπο διάλυμα διχρωμικού καλίου (K 2 Cr 2 O 7 ) Πειραματική διάταξη Περιγραφή της λειτουργίας της πειραματική διάταξης Προσδιορισμός φυσικοχημικών παραμέτρων του συστήματος Προσδιορισμός χρωμίου Προσδιορισμός εξασθενούς χρωμίου Προσδιορισμός ολικού χρωμίου σε ξηρή μάζα ενεργού ιλύος Προσδιορισμός χημικά απαιτούμενου οξυγόνου (XAO COD) Προσδιορισμός αμμωνιακού αζώτου (Ν ΝΗ 4 ) Προσδιορισμός διαλυμμένου φωσφόρου με μορφή φωσφορικών (Ρ ΡΟ 4 ) Προσδιορισμός αιωρούμενων συστατικών του μικτού υγρού (ΑΣΜΥ MLSS) Απομόνωση μικροβιακών στελεχών ανθεκτικών σε χρώμιο (VI) Καθαρές καλλιέργειες μικροοργανισμών Καταμέτρηση καθαρών αποικιών και έλεγχος καθαρότητας Κατάψυξη καλλιέργειας βακτηριακών κυττάρων

4 3.8. Υπολογισμός της ελάχιστης συγκέντρωσης χρωμίου (VI), Νi(II), Zn(II) Cu(II), που αναστέλλει την ανάπτυξη των βακτηρίων (Minimum Inhibitory Concentration, ΜΙC) Ανθεκτικότα μικροοργανισμών σε αντιβιοτικά Βιοχημικές μέθοδοι ελέγχου των βακτηρίων Χρώση κατά Gram Έλεγχος οξειδάσης Έλεγχος καταλάσης Ταυτοποίηση μικροβιακών στελεχών με το σύστημα του Βιοlog Περιγραφή του συστήματος Βιοlog ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επίδραση του χρωμίου στην απόδοση της λειτουργίας των βιοαντιδραστήρων Απομάκρυνση οργανικού φορτίου COD Απομάκρυνση αμμωνιακού αζώτου Ν ΝΗ Απομάκρυνση φωσφόρου ΡΟ Αιωρούμενα στερεά MLSS Απομάκρυνση χρωμίου (VI) Βιοαντιδραστήρες που ενοφθαλμίστηκαν κατά την έναρξη της λειτουργίας τους με ενεργό βιομάζα μικροοργανισμών που προέρχονταν από το δείγμα της ενεργού ιλύος της Καστοριάς Βιοαντιδραστήρας που ενοφθαλμίστηκε κατά την έναρξη της λειτουργίας του με ενεργό βιομάζα μικροοργανισμών που προέρχονταν από το δείγμα της ενεργού ιλύος της Κοζάνης Απομόνωση και Χαρακτηρισμός βακτηριακών στελεχών Απομόνωση βακτηριακών στελεχών

5 Χαρακτηρισμός βακτηριακών στελεχών Χρώση Gram Βιοχημικός έλεγχος οξειδάσης και καταλάσης σε διαφορετικά θρεπτικά υποστρώματα ανάπτυξης των μικροοργανισμών Καταμέτρηση βακτηριακών κυττάρων Ταυτοποίηση βακτηριακών στελεχών Στέλεχος 3 (Σ3) Pseudomonas, Acinetobacter, Αcidovorax, Aquaspirilium, Lampropedia Στέλεχος 4 (Σ4) Microbacterium terregens Στέλεχος 5 (Σ5) Rodococcus rhodnii Υπολογισμός της ελάχιστης συγκέντρωσης χρωμίου (VI), Νi(II), Zn(II) Cu(II), που αναστέλλει την ανάπτυξη των βακτηρίων (Minimum Inhibitory Concentration, ΜΙC) Ελεγχος της ικανότητας ανάπτυξης σε άλλα μέταλλα Ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

6 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο τμήμα Βιολογίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, κατά το χρονικό διάστημα Σεπτέμβριος 2006 Νοέμβριος Μεγάλο μέρος της ερευνητικής εργασίας πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο περιβαλλοντικών και ενεργειακών διεργασιών, που στεγάζεται στο κτίριο του Εθνικού Κέντρου Έρευνας και Τεχνολογικής Ανάπτυξης (Ε.Κ.Ε.Τ.Α), ενώ μέρος της ερευνητικής εργασίας πραγματοποιήθηκε στο Ινστιτούτο Κτηνιατρικών Ερευνών του Εθνικού Ιδρύματος Αργοτικής Έρευνας (ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε). Θερμές ευχαριστίες οφείλω στον επιβλέποντα της διπλωματικής μου Αν. καθηγητή Γιάγκου Μηνά, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αναθέτοντάς μου την συγκεκριμένη ερευνητική εργασία. Τον ευχαριστώ πολύ για τις γνώσεις που μου προσέφερε, την καθοδήγησή του και το ιδιαίτερο ενδιαφέρον του, τόσο κατά την εκπόνηση όσο και κατά τη συγγραφή της παρούσας εργασίας. Επίσης, ένα μεγάλο ευχαριστώ στο συνεπιβλέποντα καθηγητή κ. Σαμαρά Πέτρο, για τη βοήθειά του και για τη δυνατότητα που μου έδωσε να ασχοληθώ με ένα τόσο ενδιαφέρον ερευνητικό αντικείμενο. Ακόμη, θα ήταν παράλειψή μου να μην ευχαριστήσω τον κ. Ζδράγκα Αντώνη που με δέχτηκε να εργαστώ στο ΕΘ.Ι.ΑΓ.Ε., καθώς και για την πολύτιμη βοήθειά του και το ιδιαίτερο ενδιαφέρον του για την πρόοδο της παρούσας εργασίας. Ευχαριστώ επίσης θερμά, την κ. Παπαδημητρίου Χρύσα, Υποψήφια διδάκτωρ, για το ενδιαφέρον της και για την εξαιρετική της προθυμία να με βοηθήσει όποτε ήταν απαραίτητο. Τέλος, ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω σε όλα τα μέλη του εργαστηρίου για τη συμπαράσταση και τη βοήθειά τους όλο αυτό το χρόνο, τόσο κατά την εκπόνηση όσο και κατά τη συγγραφή της παρούσας εργασίας. 6

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ως συνέπεια της ευρείας χρήσης του χρωμίου στη βιομηχανία, το στοιχείο αυτό διαφεύγει σε μεγάλες συγκεντρώσεις στα βιομηχανικά απόβλητα με αποτέλεσμα να αποτελεί έναν από τους πλέον επικίνδυνους ρύπους των φυσικών οικοσυστημάτων. Σε αρκετές περιπτώσεις τα παραπάνω βιομηχανικά απόβλητα επεξεργάζονται μαζί με αστικά λύματα και τελικά διοχετεύονται σε φυσικούς αποδέκτες. Η χρησιμοποίηση μικροοργανισμών σε μεθόδους βιοαπορρύπανσης των υγρών αποβλήτων από το χρώμιο αντί της απομάκρυνσης του με χημικές μεθόδους, αποτελεί ολοένα και πιο ελκυστική προσέγγιση. Σκοπός της συγκεκριμένης διπλωματικής ήταν η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός μικροβιακών στελεχών, που υπάρχουν στην ενεργό ιλύ μονάδας επεξεργασίας αστικών λυμάτων με υψηλή περιεκτικότητα σε χρώμιο (VI). Αρχικά, χρησιμοποιήθηκαν εργαστηριακής κλίμακας βιοαντιδραστήρες που τροφοδοτήθηκαν με συνθετικό λύμα, με διαφορετικές συγκεντρώσεις χρωμίου (VI) και ενοφθαλμίστηκαν με ενεργό ιλύ που προέρχονταν από τη δεξαμενή αερισμού της Μονάδας Επεξεργασίας Αστικών Λυμάτων (ΜΕΑΛ) της πόλης της Καστοριάς. Κατά τη διάρκεια της λειτουργίας των βιοαντιδραστήρων μετρούνταν οι χημικές παράμετροι οργανικός άνθρακας COD, αμμωνιακό άζωτο (NH4 Ν), φωσφόρος (PO4 P) και το περιεχόμενο των αιωρούμενων στερεών (MLSS). Τα αποτελέσματα από τις μετρήσεις αυτές έδειξαν ότι το χρώμιο, στις συγκεντρώσεις που μελετήθηκε (1 έως και 50 mg/l) δεν παρεμποδίζει την απομάκρυνση του COD, των NH4 και PO4 ιόντων μετά τον απαραίτητο χρόνο εγκλιματισμού των μικροοργανισμών στις συνθήκες του πειράματος και τα MLSS αυξάνονται. Βρέθηκε ότι στους 4 περίπου μήνες λειτουργίας του βιοαντιδραστήρα που λειτουργούσε με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση χρωμίου (VI) γινόταν 100% μετατροπή του σε χρώμιο (III). Η αναγωγή αυτή οφειλόταν στη δράση μικροβίων που αναπτύχθηκαν στο βιοαντιδραστήρα. Απομονώθηκε ένα στέλεχος το οποίο είχε την ικανότητα τόσο να αναπτύσσεται σε υψηλές συγκεντρώσεις χρωμίου όσο και να ανάγει το χρώμιο (VI) σε χρώμιο (III). Ακόμη περισσότερο προσδιορίστηκαν συγκεκριμένα φυσικά και χημικά χαρακτηριστικά του μικροοργανισμού ενώ με εφαρμογή του συστήματος BIOLOG δεν επιτεύχθηκε η ταυτοτποίησή του. 7

8 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1. Γενικά χαρακτηριστικά του χρωμίου Το χρώμιο ανήκει στα βαρέα μέταλλα. Υφίσταται σε δύο κύριες οξειδωτικές καταστάσεις: [Cr +3 ] και [Cr +6 ]( U.S EPA, 1998, Cervantes et al., 2001). Σε διαλύματα, το εξασθενές χρώμιο ή χρώμιο Cr (VI) υπάρχει με τη μορφή όξινων χρωμικών ΗCrO , χρωμικών CrO 4 και διχρωμικών Cr 2 O 7 ιόντων. Μεταξύ των ιόντων αυτών υπάρχει ισορροπία, η θέση της οποίας εξαρτάται από το ph (U.S EPA, 1998). Οι σύμπλοκες ενώσεις των ιόντων του χρωμίου Cr (VI) είναι υδατοδιαλυτές και μπορεί να παραμένουν διαλυμένες στο νερό για παρατεταμένα χρονικά διαστήματα. Αντίθετα, με τις ενώσεις του χρωμίου Cr (VI), το τρισθενές χρώμιο ή χρώμιο (III) σε υδατικά διαλύματα, έχει την τάση να καθιζάνει ως υδροξείδιο του χρωμίου Cr(OΗ) 3 ή ως ένυδρο οξείδιο του χρωμίου Cr 2 O 3 H 2 0. Μπορεί ακόμα να αντιδρά χημικά με άλλα ανόργανα και οργανικά μόρια, που είναι διαλυμένα στο νερό, σχηματίζοντας σταθερές σύμπλοκες ενώσεις (Ζayed & Terry, 2003). Κατά συνέπεια, ο χρόνος παραμονής του χρωμίου Cr (III) στο νερό είναι μικρός και υπάρχει σε μικρό ποσοστό σε ρυπασμένα ύδατα (U.S EPA, 1998, WHO, 2000) Παρουσία του χρωμίου στο περιβάλλον Στη φύση, το χρώμιο απαντάται κυρίως στην τρισθενή κατάσταση υπό μορφή ορυκτών (χρωμίτης FeCr 2 O 4, κροκοϊτης PbCrO 4 ), από όπου και εξορύσσεται. Αντίθετα, η παρουσία εξασθενούς χρωμίου στο περιβάλλον θεωρείται αποτέλεσμα της δραστηριότητας του ανθρώπου (U.S. EPA, 1998, Cohen et al., 1999, WHO, 2000, Mohan & Pittman, 2006). Οι ενώσεις του χρωμίου εμφανίζουν πληθώρα εφαρμογών στις βιομηχανικές διεργασίες. Οι κύριοι τομείς της βιομηχανίας στους οποίους χρησιμοποιείται το χρώμιο είναι (Baldi et al., 1990, Mohan & Pittman, 2006, Tadesse et al., 2006): βυρσοδεψία βαφική υφαντουργία μεταλλουργία 8

9 γαλβανοπλαστική φωτογραφική ξυλεία βιομηχανίες τσιμέντου, κεραμικών βιομηχανίες αυτοκινήτων πετροχημεία παρασκευή μαγειρικών σκευών παρασκευή χημικών, φαρμακευτικών και καλλυντικών προϊόντων παρασκευή λιπασμάτων. Ως συνέπεια της ευρείας βιομηχανικής χρήσης του χρωμίου, το στοιχείο αυτό έχει εξελιχθεί σε σοβαρό ρύπο των φυσικών οικοσυστημάτων, καθώς το χρώμιο διαφεύγει σε μεγάλες συγκεντρώσεις στα βιομηχανικά απόβλητα. Η ρύπανση των φυσικών οικοσυστημάτων με χρώμιο αποτελεί κίνδυνο για την ανθρώπινη υγεία (Cervantes et al., 2001, Mohan & Pittman, 2006) Τοξικότητα του χρωμίου στον άνθρωπο Το χρώμιο (ΙΙΙ) είναι η κύρια μορφή χρωμίου στα τρόφιμα, καθώς επίσης και η μορφή που χρησιμοποιείται από το σώμα (Mohan & Pittman, 2006). Σε μικροποσότητες αναγνωρίζεται ως θρεπτικά απαραίτητο μεταλλικό στοιχείο (Mahdi, 2004). Η ακριβής δομή της βιολογικά ενεργής μορφής του χρωμίου δεν είναι γνωστή, ωστόσο πιστεύεται ότι συμμετέχει στο μεταβολισμό της γλυκόζης, των λιπιδίων και των πρωτεϊνών, με την ενίσχυση της δράσης της ινσουλίνης (Αnderson, 1997, Vincent, 2004). Σε αντίθεση με το χρώμιο (ΙΙΙ), το χρώμιο (VI) είναι μια αναγνωρισμένη καρκινογόνος ουσία (U.S. EPA, 1998). Η έκθεση σε χρώμιο (VI) σε σκόνη συνδέεται με αυξημένη συχνότητα εμφάνισης καρκίνου των πνευμόνων (U.S. EPA, 1998, De Flora, 2000, Park et al., 2004). Επίσης, η πρόσληψη χρωμίου (VI) διαμέσου της στοματικής οδού σχετίζεται με αυξημένες συγκεντρώσεις του στοιχείου σε ιστούς και όργανα, καθώς και με περιπτώσεις καρκίνου του ήπατος (U.S. EPA, 1998). Άλλες σοβαρές βλάβες της υγείας του ανθρώπου, που έχουν αναφερθεί εξαιτίας της παρουσίας χρωμίου (VI) είναι: δερματοπάθειες, γαστρεντερικές διαταραχές, 9

10 αιμορραγικά επεισόδια, σπασμοί, ακόμα και θάνατος (Bruynzeel et al., 1988, Katz et al., 1993, U.S. EPA, 1998, Cohen et al., 1999, WHO, 2000). Μέσα στον οργανισμό είναι δυνατή η μετάπτωση της μιας χημικής μορφής χρωμίου στην άλλη, γεγονός που καθιστά τις επιδράσεις του συγκεκριμένου στοιχείου στον οργανισμό εξαιρετικά σύνθετες, δεδομένου ότι οι διάφορες ιοντικές μορφές χρωμίου έχουν και διαφορετική τοξικότητα. Σε γενικές, γραμμές οι ενώσεις του χρωμίου (VI) είναι οι πιο τοξικές για τον ανθρώπινο οργανισμό (Ishibashi et al., 1990, U.S EPA, 1998, Cohen et al., 1999, WHO, 2000) Τοξικoκινητική και μεταβολισμός του χρωμίου στον άνθρωπο Σε περίπτωση επαφής με το δέρμα, το χρώμιο έχει ως αποτέλεσμα τον ερεθισμό και την πρόκληση αλλεργικής αντίδρασης. Σε πρώτο στάδιο το χρώμιο απορροφάται από το δέρμα και προκαλεί ανοσοβιολογική απόκριση ευαισθητοποίηση. Τα εκτεθιμένα σε χρώμιο άτομα παρουσιάζουν δερματική αλλεργία και ο ερεθισμός θεωρείται γενικά αμετάκλητος. Τα συμπτώματα της αλλεργίας είναι κοκκίνισμα, οίδημα, φλύκταινες, ξηρότητα, κνησμός, απολέπιση, θλάση του επιδερμικού ιστού (Katz & Salem, 1993, Cohen et al., 1999, Vincent, 2000). Στην περίπτωση πρόσληψης υψηλών συγκεντρώσεων χρωμίου διαμέσου της στοματικής οδού μεγάλο μέρος του τοξικού απορροφάται από το γαστρεντερικό σωλήνα και περνά στο αίμα, ενώ ένα μέρος από αυτό που δεν απορροφάται αποβάλλεται με το απεκκριτικό σύστημα (ούρα, κόπρανα). Επιπλέον, στο στομάχι ένα μέρος του χρωμίου (VI) ανάγεται από το γαστρικό υγρό σε χρώμιο (ΙΙΙ), μειώνοντας το ποσοστό απορρόφησης από τον οργανισμό και αυξάνοντας το ποσοστό απέκκρισης με τα παραπροϊόντα του μεταβολισμού (U.S EPA, 1998, Cohen et al., 1999). Από τις διάφορες ιοντικές μορφές του χρωμίου, το χρώμιο (VI) απορροφάται σε μεγαλύτερο βαθμό. Από τη στιγμή που το χρώμιο θα απορροφηθεί και θα εισέλθει στα κύτταρα η περαιτέρω τύχη του εξαρτάται από το οξειδωτικό του σθένος. Το χρώμιο (VI) επειδή είναι υδατοδιαλυτό διαπερνά εύκολα τη μεμβράνη των κυττάρων κυρίως μέσω των αντλιών μεταφοράς ιόντων θείου. Στο εσωτερικό των κυττάρων το χρώμιο (VI) ανάγεται σε χρώμιο (ΙΙΙ), χρησιμοποιώντας διάφορους δότες ηλεκτρονίων, όπως είναι το ασκορβικό οξύ, η γλουταθειόνη, ένζυμα όπως το 10

11 κυτόχρωμα Ρ450, η ρεδουκτάση της γλουταθειόνης και η ριβοφλαβίνη. Ωστόσο, η ενδοκυτταρική αναγωγή του χρωμίου (VI) παράγει ενεργές ενδιάμεσες μορφές πεντασθενούς και τετρασθενούς χρωμίου, όπως επίσης και ρίζες υδροξυλίου και ελεύθερες ρίζες οξυγόνου. Οι ρίζες αυτές προκαλούν αλλοιώσεις του γενετικού υλικού, όπως οξειδωτική καταστροφή (παραγωγή 8 όξο δεόξυ γουανοσίνη) και αποδιάταξη της δομής του DNA (σπάσιμο γεφυρών θείου, μετουσίωση χρωμοσωμικών πρωτεϊνών, μετάλλαξη των πουρινών/πυριμιδινών) (Katz & Salem, 1993, Bridgewater et al., 1994, Hodges et al., 2001, Cervantes et al., 2001, Xu et al., 2004) Όρια Νομοθεσία Σύμφωνα με τη διεθνή πρακτική, έχουν αναπτυχθεί από Οργανισμούς, όπως ο Οργανισμός Τροφίμων και Γεωργίας των Ηνωμένων Εθνών FAO, η Υπηρεσία Περιβάλλοντος των Ηνωμένων Εθνών U.S ΕΡΑ, ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας WHO και άλλους φορείς, όρια ασφαλείας για την προστασία της υγείας του ανθρώπου. Με βάση την U.S EPA (1992), όλες οι χημικές ενώσεις κατηγοριοποιούνται σε πέντε κατηγορίες (κατηγορίες Ι, ΙΙΑ, ΙΙΒ, ΙΙΙ, ΙV), ως προς τη σχέση τους με την καρκινογένεση. Το χρώμιο (VI) ανήκει στην κατηγορία Ι (καρκινογόνο για τον άνθρωπο), ενώ το στοιχειακό χρώμιο και το χρώμιο (ΙΙΙ), στην κατηγορία ΙΙΙ (δεν έχουν ακόμα ταξινομηθεί ως προς την καρκινογένεση). Σύμφωνα με την ίδια Υπηρεσία και σε συμφωνία με τον Οργανισμό Τροφίμων και Γεωργίας των Ηνωμένων Εθνών, έχουν θεσπιστεί ανώτατα όρια συγκέντρωσης βαρέων μετάλλων σε επεξεργασμένα λύματα που προορίζονται να επαναχρησιμοποιηθούν στην γεωργία. Για το χρώμιο η προτεινόμενη ανώτατη συγκέντρωση κυμαίνεται από 0.1 έως 1 mg/l για μακροχρόνια και βραχυχρόνια χρήση αντίστοιχα. Σύμφωνα με τον WHO (2000), η ανώτατη επιτρεπτή συγκέντρωση χρωμίου στο πόσιμο νερό, είναι 0.5 mg/l, χωρίς να προσδιορίζεται η οξειδωτική κατάσταση του μετάλλου. Επειδή το χρώμιο (VI) είναι καρκινογόνο, η τιμή αυτή έχει αμφισβητηθεί. Έτσι, πολλές μη Ευρωπαϊκές χώρες, όπως οι χώρες της Ν. Αφρικής, η Ιαπωνία και η Αυστραλία, ακολουθούν διαδικασίες και εφαρμόζουν κριτήρια παρόμοια με αυτά της Πολιτείας της Καλιφόρνιας, των Ηνωμένων Εθνών και όχι αυτά που θέτει ο WHO, καθώς θεωρούνται μη επαρκή για την προστασία της 11

12 δημόσιας υγείας. Ωστόσο, οι χώρες που βρίσκονται γύρω από τη λεκάνη της Μεσογείου, όπως επίσης και Ευρωπαϊκές χώρες ακολουθούν τις κατευθυντήριες οδηγίες του WHO, παρόλο που οι αρμόδιες αρχές αναγνωρίζουν το γεγονός ότι απαιτείται επανεξέταση των κριτηρίων αυτών (Οδηγία 98/83/ΕΕ, σχετικά με την ποιότητα νερού ανθρώπινης κατανάλωσης). Η Ευρωπαϊκή νομοθεσία στερείται νομοθετικών ρυθμίσεων σχετικά με την απαιτούμενη ποιότητα των προς επαναχρησιμοποίηση λυμάτων. Επιπλέον, η ανάλυση της υπάρχουσας νομοθεσίας σχετικά με τη διαχείριση, απόρριψη και ανακύκλωση ιλύος, δείχνει ότι οι προδιαγραφές και τα όρια εστιάζουν κυρίως στη χρήση ιλύος στη γεωργία, ενώ άλλες χρήσεις ή τρόποι διάθεσης της ιλύος, εμπίπτουν σε πιο γενικές διατάξεις, που σχετίζονται με τη διαχείριση των αποβλήτων. Ειδική αναφορά στο χρώμιο γίνεται στην Οδηγία 02/95 της Ευρωπαικής Ένωσης (άρθρο 4, 1), όπου αναφέρεται ότι τα κράτη μέλη πρέπει να εξασφαλίζουν, από την 1η Ιουλίου 2006, περιορισμό στη βιομηχανική χρήση των εξής 6 εξαιρετικά επικίνδυνων χημικών: μόλυβδο, υδράργυρο, κάδμιο, εξασθενές χρώμιο, πολυβρωμοδιφαινύλια ή πολυβρωμοδιφαινυλαιθέρες. Σε Εθνικό επίπεδο, η σχετική νομοθεσία έχει ενσωματώσει την Οδηγία 86/278 της Ευρωπαικής Ένωσης, η οποία προβλέπει οριακές τιμές συγκέντρωσης βαρέων μετάλλων στο έδαφος, στην ιλύ και για τις ποσότητες βαρέων μετάλλων που μπορούν να υπεισέρχονται στο έδαφος σε ετήσια βάση. Στην περίπτωση του χρωμίου, επειδή η Οδηγία δεν πρόεβλεπε όρια για το χρώμιο, έγινε προσθήκη ορίων της τάξεως των 500 mg/kg ξηρού βάρους ιλύος, για το Cr (ΙΙΙ) και 10 mg/kg ξηρού βάρους ιλύος, για το Cr (VΙ) (ΚΥΑ 80568/4225/91). Όσον αφορά τη διάθεση των υγρών αποβλήτων, στην Ελλάδα η διάθεση των λυμάτων σε φυσικούς αποδέκτες καθορίζεται με Νομαρχιακές Αποφάσεις. Για παράδειγμα, στην περίπτωση του Νομού Θεσσαλονίκης οι ανώτατες επιτρεπτές συγκεντρώσεις χρωμίου στα επεξεργασμένα απόβλητα πριν αυτά διατεθούν στο Θερμαϊκό κόλπο είναι 3 mg/l για το χρώμιο (ΙΙΙ) και 1 mg/l για το Cr (VΙ) (Απόφαση Νομάρχη, ΝΑ, 22374/ ). Σύμφωνα με την ίδια ΝΑ, για τις λίμνες Αγίου Βασιλείου και Βόλβης Ενωτική τάφρος και Γαλλικός ποταμός οι αντίστοιχες τιμές είναι 1.5 και 0.3 mg/l, ενώ για τον Αξιό ποταμό 2 και 0.6 mg/l αντίστοιχα. 12

13 1.6. Μέθοδοι απομάκρυνσης του χρωμίου από τα υγρά απόβλητα Προκειμένου να μην υπερβαίνονται τα ανώτατα επιτρεπτά όρια συγκέντρωσης χρωμίου, οι μέθοδοι επεξεργασίας λυμάτων που χρησιμοποιούνται διεθνώς, για την απομάκρυνση των βαρέων μετάλλων από τα υγρά απόβλητα είναι οι εξής (Mohan & Pittman, 2006): χημική καθίζηση κροκίδωση/συγκαθίζηση χημική αναγωγή προσρόφηση ιοντοανταλλαγή διήθηση αντίστροφη ώσμωση εξάτμιση ηλεκτρόλυση επίπλευση βιολογικές μέθοδοι. Καθεμία από τις τεχνολογίες επεξεργασίας και απομάκρυνσης των μετάλλων που αναφέρθηκαν δίνει διαφορετικά επίπεδα εκροής των μετάλλων. Η αποδοτικότητα της επεξεργασίας που δίνεται από κάθε τεχνολογία εξαρτάται από τη φύση των χημικών και την αρχική συγκέντρωση του μετάλλου, όπως επίσης και από την παρουσία άλλων παραγόντων στα υγρά απόβλητα, που πιθανά να παρεμβαίνουν στη διαδικασία. Ειδικότερα για την απομάκρυνση των ιόντων χρωμίου από τα υγρά απόβλητα οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται, με τη μεγαλύτερη αποδοχή σε εφαρμογές μεγάλης κλίμακας, είναι η προσρόφηση, κυρίως ενεργού άνθρακα, η χημική αναγωγή και η ιοντοανταλλαγή (Fadali et al., 2004, Mohan & Pittman, 2006). Ωστόσο, κάθε τέτοια τεχνολογία επεξεργασίας μετάλλων εκτός του υψηλού κόστους εφαρμογής, δίνει ένα υπόλειμμα αποβλήτων το οποίο απαιτεί περαιτέρω διαχείριση. Οι τύποι των υπολειμμάτων αυτών είναι: ιλύς που παράγεται από τη χημική καθίζηση συγκεντρωμένα διαλύματα αλάτων, που χρησιμοποιούνται ως κροκιδωτικά χρησιμοποιημένος άνθρακας από τα προσροφητικά ενεργού άνθρακα. 13

14 Οι μέθοδοι που μπορούν να εφαρμοστούν για την αναγέννηση των μετάλλων από τα υπολείμματα αυτά έχουν επίσης υψηλό κόστος. Έτσι, τα τελευταία χρόνια δείχνεται όλο και περισσότερη προτίμηση για απομάκρυνση των μετάλλων με βιολογική επεξεργασία (Bierley, 1990, Wakatsuki, 1995, Lovley et al., 1997, Bonaventural & Johnson, 1997, Kratochvil & Volesky, 1998, Gutnick et al., 2000). Μία από τις πλέον κατάλληλες βιολογικές μεθόδους για την επεξεργασία υγρών αποβλήτων επιβαρημένων με Cr(VI), είναι η μέθοδος της ενεργού ιλύος, καθώς αυτό ανάγεται προς Cr(III), το οποίο προσροφάται σχεδόν ποσοτικά στις βιοκροκίδες και συσσωρεύεται στη λυματολάσπη. Έτσι, το τοξικό Cr(VI) απομακρύνεται από τη διαλυτή φάση και προστατεύεται ο τελικός υδάτινος αποδέκτης Περιγραφή της διεργασίας της ενεργού ιλύος Το σύστημα της ενεργού ιλύος είναι μια αερόβια διαδικασία όπου με τη βοήθεια μικροοργανισμών γίνεται αποδόμηση των οργανικών ρύπων των αποβλήτων. Το σύστημα της ενεργού ιλύος περιλαμβάνει (Tschobanoglous, 1995, Τραγανίτης & Σκουμπούρης, 1995): μια δεξαμενή που περιέχει τους μικροοργανισμούς, όπου εισέρχονται τα λύματα από την πρωτοβάθμια καθίζηση και ονομάζεται δεξαμενή αερισμού (ΔΑ) ένα αντλιοστάσιο ανακυκλοφορίας της λάσπης και απομάκρυνσης της περίσσειας αυτής εξοπλισμό για αερισμό και ανάμιξη της λάσπης. Η λάσπη που βρίσκεται σε αιώρηση στη δεξαμενή αερισμού λέγεται ενεργός ιλύ. Αυτή διαχωρίζεται από τα επεξεργασμένα νερά στον καθιζητήρα από μια φάση διαχωρισμού, που ακολουθεί της διεργασίας της ενεργού ιλύος. Για να διατηρηθεί η αναλογία τροφής προς τους μικροοργανισμούς (λόγος F/M), μια ποσότητα μικροοργανισμών απομακρύνεται καθημερινά από το σύστημα. Η ποσότητα αυτή καλείται περίσσεια. Αντίθετα, μια ποσότητα από την ιλύ που απομακρύνεται από τον καθιζητήρα, ανακυκλοφορεί και ανατροφοδοτεί την δεξαμενή αερισμού. Για να είναι επιτυχής ο σχεδιασμός της εγκατάστασης ενεργού ιλύος και να επιτευχθεί απομάκρυνση BOD μεγαλύτερη από 90%, απαιτείται λόγος F/M = 0.25, Kg BOD/Kg αιωρούμενων στερεών ημέρα (για χρόνο παραμονής στη δεξαμενή αερισμού 6 14

15 ημέρες). Εάν σε αυτό το σύστημα μεταβληθεί έστω και μία παράμετρος σχεδιασμού από την προκαθορισμένη της τιμή, τότε παρατηρείται σημαντική μείωση στην απομάκρυνση του BOD (Tschobanoglous, 1995). Οι μικροοργανισμοί, κυρίως βακτήρια, χρησιμοποιούν τις οργανικές ενώσεις των αποβλήτων ως θρεπτικά συστατικά, παράγουν νέα κύτταρα, διοξείδιο του άνθρακα και ενέργεια, την οποία χρησιμοποιούν για την κίνηση, τη συντήρηση και τον πολλαπλασιασμό τους. Οι μικροοργανισμοί αυτοί βρίσκονται στην ενεργό ιλύ με τη μορφή συσσωματωμάτων, που ονομάζονται βιοκροκίδες ή φλόκοι, και αποτελούν τους δραστικούς πυρήνες για την προσρόφηση, αφομοίωση και αποδόμηση των οργανικών ουσιών, που περιέχονται στο λύμα (Tschobanoglous, 1995, Τραγανίτης & Σκουμπούρης, 1995). Μέτρο της ποιότητας της ενεργού ιλύος αποτελούν τα αιωρούμενα στερεά (MLSS) ή τα αιωρούμενα πτητικά στερεά (MLVSS). O έλεγχος της ποσότητας των στερεών αποτελεί βασική παράμετρο για την επίτευξη της επιθυμητής απόδοσης σε ένα σύστημα ενεργούς ιλύος. Για να εξασφαλιστεί η επιθυμητή συγκέντρωση στερεών στο μικτό υγρό της ΔΑ γίνεται ανακυκλοφορία μέρους της ενεργού ιλύος από τον καθιζητήρα. Ο ρυθμός ανακυκλοφορίας καθορίζεται από το λόγο του διαθέσιμου υποστρώματος προς την ποσότητα των μικροοργανισμών (λόγος F/M). Παράλληλα, μια ποσότητα μικροοργανισμών απομακρύνεται καθημερινά από το σύστημα (περίσσεια ιλύος). Η ποσότητα αυτή ισούται με την ημερήσια παραγωγή νέας βιομάζας (κυτταρικού ιστού) (Tschobanoglous, 1995) Βακτήρια ενεργού ιλύος Οι μονάδες ενεργού ιλύος μπορεί να θεωρηθούν τεχνητά οικοσυστήματα στα οποία οι διάφορες ομάδες μικροοργανισμών αποτελούν το τροφικό πλέγμα (Madoni et al., 1994a, Chen et al., 2004). Όπως σε όλα τα βιολογικά συστήματα οι διάφορες ομάδες των μικροοργανισμών στη δεξαμενή αερισμού μιας μονάδας ενεργού ιλύος, αναπτύσσουν μεταξύ τους ποικίλες σχέσεις, μεταξύ των οποίων οι κυριότερες είναι ο ανταγωνισμός, η σχέση λείας θηρευτή και οι σχέσεις συμβίωσης (Μadoni et al., 1993). Μεταξύ των διαφόρων ομάδων μικροοργανισμών της ενεργού ιλύος, τα βακτήρια κατέχουν το σημαντικότερο ρόλο στη βιολογική επεξεργασία των αποβλήτων, καθώς εκτελούν τη βιοαποικοδόμηση της οργανικής ύλης. Τα βακτήρια 15

16 της ενεργού ιλύος είναι στελέχη που υπάρχουν συνήθως στο έδαφος, ενώ πολύ λιγότερα είναι εντερικής προέλευσης (Reynolds et al., 1996). Τα βακτήρια εντερικής προέλευσης δεν μπορούν να επιβιώσουν για μεγάλο χρονικό διάστημα στις συνθήκες που επικρατούν στο μικτό υγρό, εξαιτίας του ανταγωνισμού τους με τα βακτήρια της ενεργού ιλύος. Τα βακτήρια είναι στην πλειονότητά τους ετερότροφα, με εξαίρεση τα νιτροποιητικά βακτήρια, που συμμετέχουν στη βιολογική απομάκρυνση του αζώτου και είναι αυτότροφα, επειδή ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιούν τον άνθρακα που προέρχεται από τις οργανικές ενώσεις. Στην ενεργό ιλύ υπάρχουν και άλλα εξειδικευμένα στελέχη βακτηρίων, όπως τα θειοβακτήρια και τα σιδηροβακτήρια, που παρατηρούνται σε μικρούς συνήθως αριθμούς (Jenkins et al., 1993, Καϊμακαμίδου, 2002). Ο φυσικός εμπλουτισμός της ενεργού ιλύος με εξειδικευμένα βακτηριακά στελέχη ανθεκτικά σε χρώμιο που είναι ικανά να ανάγουν το χρώμιο αποτελεί ενδεχόμενη πιθανή λύση για απορρύπανση λυμάτων επιβαρημένων με χρώμιο Ανθεκτικότητα των βακτηρίων σε χρώμιο Το χρώμιο, σε οποιαδήποτε ιοντική του μορφή, δεν αποτελεί απαραίτητο θρεπτικό συστατικό για τα βακτήρια (Wong & Trevor, 1988). Η επίδραση της παρουσίας του μετάλλου στο περιβάλλον που αναπτύσσονται τα βακτήρια εξαρτάται από το οξειδωτικό σθένος του στοιχείου και το κυτταρικό διαμέρισμα στο οποίο εντοπίζεται. Σε γενικές γραμμές το χρώμιο είναι τοξικό για τα βακτήρια. Από τις ιοντικές μορφές του χρωμίου, το χρώμιο (ΙΙΙ) είναι δυσδυάλυτο, κατά συνέπεια παρουσιάζει χαμηλή κινητικότητα στα ζωντανά συστήματα (EPA, 1998, Mohan & Pittman, 2006). Όταν βρίσκεται εξωκυτταρικά είναι αβλαβές για τα κύτταρα, καθώς δεν μπορεί να διαπεράσει την κυτταρική μεμβράνη των βακτηρίων (Wong & Trevor, 1988, Katz & Salem, 1993). Μπορεί όμως να σχηματίζει σύμπλοκες ενώσεις με εξωκυτταρικά πολυμερή των βακτηρίων και να δεσμεύεται στην εξωτερική επιφάνεια των κυττάρων (Cary, 1982). Ενδοκυτταρικά, το χρώμιο (ΙΙΙ) μπορεί να προκαλεί αλλοιώσεις του γενετικού υλικού των βακτηρίων καθώς έχει την ιδιότητα να δεσμεύεται με τις φωσφορικές oμάδες του DNA (Kortenkamp et al., 1991, Bringewater et al., 1994, Plaper et al., 2002). Ακόμα, μπορεί να δεσμεύεται με τις καρβοξυλικές ομάδες ή τις σουλφυδρυλομάδες των πρωτεϊνών, γεγονός που ενισχύει την τοξική του δράση (Levis & Bianchi, 1982). 16

17 Το χρώμιο (VI) όταν εντοπίζεται εξωκυτταρικά θεωρείται εξαιρετικά τοξικό, καθώς εξαιτίας της υδατοδιαλυτής του φύσης, μπορεί πολύ εύκολα να διαπεράσει τη μεμβράνη του βακτηριακού κυττάρου και να βρεθεί στο κυτόπλασμα (Wong & Trevor, 1988, Katz & Salem, 1993). Μέσα στο κυτόπλασμα το χρώμιο (VI) με μια σειρά μηχανισμών που διαθέτουν τα κύτταρα ανάγεται σε ενδιάμεσες ενώσεις με χαμηλότερο οξειδωτικό σθένος, διαδικασία κατά την οποία παράγονται ενεργές ρίζες, που είναι τοξικές για τα κύτταρα και προκαλούν οξειδωτική βλάβη στο DNA (Kawanishi et al., 1986, Shi & Dalal, 1990, Kadiiska et al., 1994, Itoh et al., 1995, Luo et al., 1996). Ωστόσο, έχουν αναφερθεί περιπτώσεις βακτηριακών στελεχών ανθεκτικών στο χρώμιο (Silver, 1996, Francisco et al., 2002, Juhnke et al., 2002, Thacker, 2006, Brown et al., 2006, Ackerley et al., 2006, Giotta et al., 2006). Τα στελέχη αυτά διαθέτουν μηχανισμούς που τους προστατεύουν από τις τοξικές επιδράσεις του χρωμίου. Τρεις είναι οι κύριοι πιθανοί μηχανισμοί προστασίας των μικροοργανισμών από τη διαθεσιμότητα των ιόντων χρωμίου. Οι μηχανισμοί αυτοί είναι βιοχημικοί στη φύση τους και έχουν ως αποτέλεσμα την ανενεργοποίηση του ιόντος του χρωμίου. Οι μηχανισμοί περιλαμβάνουν (Oliver et al., 1974, Suzuki et al., 1992, Cervantes & Campos Garcia, 2007, Ramirez Diaz et al., 2007): αναγωγή και παγίδευση του χρωμίου εξωκυτταρικά ενζυματική αναγωγή του χρωμίου ενδοκυτταρικά, σε λιγότερο τοξικές μορφές μεταφορά εξωκυτταρικά διαμέσου της κυτταρικής μεμβράνης με τη βοήθεια μεταφορέων. Επιπλέον, τα κύτταρα διαθέτουν επιδιορθωτικούς μηχανισμούς με τους οποίους μπορούν να επιδιορθώνουν τυχόν βλάβες του γενετικού τους υλικού αλλά και μηχανισμούς που περιλαμβάνουν επαγωγική ενεργοποίηση σύνθεσης ενζύμων χάρη στα οποία καταφέρνουν να αποκαθιστούν ή/και να αποτρέπουν βλάβες σε κυτταρικά οργανίδια (Εικόνα 1). 17

18 Α E Γ Δ Αναγωγή B Γλουταθειόνη ΣΟΔ Αναγωγή Οξειδωτική καταπόνηση Καταλάση Ένζυμα Πλασμίδιο Μετουσίωση πρωτεινών Βλάβη DNA Ζ Μηχανισμοί επιδιόρθωσης Κυτόπλασμα Μεμβράνη Περίπλασμα Εικόνα 1. Μηχανισμοί προστασίας των μικροοργανισμών σε ενώσεις του χρωμίου. Α) Είσοδος μετάλλου μέσω αντλιών θείου, Β) Ενδοκυτταρική αναγωγή μετάλλου, Γ) Εξωκυτταρική αναγωγή μετάλλου, Δ) Ενεργοποίηση μηχανισμών οξειδωτικής καταπόνησης, Ε) Μεταφορά ιόντων μετάλλου έξω από το κύτταρο, Ζ) Ενεργοποίηση μηχανισμών επιδιόρθωσης βλαβών DNA (από Ramirez Diaz et al., 2007) Η γενετική πληροφορία που κωδικοποιεί την ιδιότητα της ανθεκτικότητας στο χρώμιο μπορεί να βρίσκεται τόσο σε πλασμιδιακό όσο και στο γονιδιωματικό DNA. Στην περίπτωση, που τα υπεύθυνα γονίδια εντοπίζονται σε πλασμιδιακό DNA, συνήθως η πληροφορία σχετίζεται με μεμβρανικούς υποδοχείς, που προάγουν τη μεταφορά των ιόντων του χρωμίου από το κυτόπλασμα στο εξωτερικό του κυττάρου. Αντίθετα, στην περίπτωση που η πληροφορία εντοπίζεται σε χρωμοσωμικό βακτηριακό DNA εμπλέκονται μηχανισμοί που σχετίζονται με ειδική ή μη ειδική αναγωγή του χρωμίου (VI), με διεργασίες αποτοξικοποίησης, με μηχανισμούς επιδιόρθωσης του DNA και διαδικασίες που σχετίζονται με την ομοιόσταση των ιόντων θείου και σιδήρου (Nies et al., 1998, Cervantes & Campos Garcia, 2007, Ramirez Diaz et al., 2007). 18

19 1.9. Απομόνωση και χαρακτηρισμός ανθεκτικών στο χρώμιο μικροοργανισμών ικανών για βιολογική απομάκρυνση του χρωμίου Γενικά, η απομόνωση βακτηριακών στελεχών ικανών να απομακρύνουν το χρώμιο αναφέρεται από πολλούς ερευνητές. Ορισμένοι από αυτούς μιλούν γαι απομόνωση μικροοργανισμών από ρυπασμένα περιβάλλοντα με χρώμιο, όπως εδάφη ή απόβλητα, ενώ άλλοι χρησιμοποιούν καθαρές καλλιέργειες εργαστηριακών βακτηριακών στελεχών και μέσα από ανάπτυξη των στελεχών αυτών σε εργαστηριακές συνθήκες απομονώνουν τα στελέχη εκείνα, που όταν αναπτύσσονται σε θρεπτικό μέσο με χρώμιο παρουσιάζουν την ικανότητα να το αφαιρούν από το μέσο. Σύμφωνα με τα παραπάνω, για πρώτη φορά οι Lebedeva & Lyalikova (1979) απομόνωσαν και προσδιόρισαν ένα είδος μικροοργανισμού, το Pseudomonas chromatophila, από ιλύ που προέρχονταν από υγρά απόβλητα επιβαρημένα με χρώμιο, που ήταν ικανό να ανάγει το χρώμιο κάτω από αναερόβιες συνθήκες. Έκτοτε, έχουν απομονωθεί πολλά ακόμα είδη βακτηρίων, διαφορετικών γενών, που μπορούν να απομακρύνουν το χρώμιο από το μέσο στο οποίο βρίσκονται, όπως αυτά που ανήκουν στα γένη Pseudomonas (Gopalan & Veeramani, 1993, Ganguli & Tripathi, 1999, Badar et al., 1999, Mclean & Beveridge, 2001, Viti & Giovannetti, 2005, Zagova et al., 2007), Acinetobacter (Francisco et al., 2002, Dermou et al., 2005), Αrthrobacter (Megharaj et al., 2003, Viti & Giovannetti, 2005), Desulfovibrio (Michel et al., 2001, Humphries & Macaskie, 2002, Goulhen et al., 2006), Aeromonas (Cervantes & Silver, 1992, Loukidou et al., 2004), Bacillus (Campos et al., 1995, Garbisu et al., 1998, Nurbakhsh et al., 2002, Camargo et al., 2003, Megharaj et al., 2003, Viti & Giovannetti, 2005, Sahin & Ozturk, 2005, Elangovan et al., 2006), Enterobacter (Rege et al., 1997), Microbacterium (Pattanapipitpaisal et al., 2001, Humphries & Macaskie, 2002), Serratia (Campos et al., 2005), Ochrobacterium (Francisco et al., 2002, Faisal & Hasnain., 2004, Thacker & Madamwar, 2005), Staphylococcus (Ilhan et al., 2004, Zagova et al., 2007), Thiobacillus (Sisti et al., 1996). Η απομόνωση των μικροοργανισμών γίνεται με μικροβιολογικές μεθόδους και ανάπτυξη των μικροοργανισμών σε θρεπτικά μέσα. Η ταυτοποίηση των άγνωστων ειδών των μικροοργανισμών γίνεται είτε με μοριακές μεθόδους, όπως απομόνωση DNA και ανάλυση της περιοχής του 16S rrna, είτε με διερεύνηση του μεταβολικού 19

20 προτύπου των μικροοργανισμών, με τεχνικές όπως εφαρμογή του συστήματος ΑΡΙ και του συστήματος Biolog. Συμπληρωματικά εφαρμόζονται βιοχημικές μέθοδοι ταυτοποίησης των μικροοργανισμών και χρησιμοποιούνται συστήματα βιολογικής ταξινόμησης των μικροοργανισμών (βιβλιοθήκες) για τη σύγκριση του άγνωστου μικροοργανισμού με αντίστοιχα γνωστά είδη Παρουσία ανθεκτικών στο χρώμιο μικροοργανισμών και ικανότητα για βιολογική απομάκρυνση του χρωμίου σε συστήματα επεξεργασίας λυμάτων Υπάρχουν αρκετές αναφορές για εφαρμογή ανθεκτικών βακτηριακών στελεχών σε πιλοτικές μονάδες επεξεργασίας υγρών αποβλήτων για την απομάκρυνση του χρωμίου. Οι περισσότερες από αυτές εξετάζουν το ενδεχόμενο της αποτοξικοποίησης ρυπασμένων με χρώμιο υγρών αποβλήτων χρησιμοποιώντας καθαρές καλλιέργειες βακτηριακών στελεχών ανθεκτικών σε χρώμιο. Η διαδικασία γίνεται τόσο κάτω από αερόβιες συνθήκες όσο και αναερόβιες, ανάλογα με το είδος του μικροοργανισμού, που χρησιμοποιούν (Wang et al., 1989, Flovera et al.,1993, Deleo et al., 1994, Wang & Xiao, 1995, Chirwa et al., 1997). Ωστόσο, οι συνθήκες που εφαρμόζονται σε μικρή κλίμακα κάτω από αυστηρά ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες χρησιμοποιώντας καθαρές καλλιέργειες συνήθως δεν συμβαδίζουν με αυτό που πραγματικά συμβαίνει σε μεγάλη κλίμακα σε συστήματα επεξεργασίας λυμάτων. Επιπλέον, η χρήση ενός συνόλου διαφορετικών ειδών μικροοργανισμών έχει καλύτερα αποτελέσματα έναντι της εφαρμογής ενός και μόνου είδους (Fude et al., 1994, Shakoori et al., 2000). Ακόμα περισσότερο, και δεδομένου ότι οι μονάδες ενεργού ιλύος θεωρούνται ως τεχνητά οικοσυστήματα, η χρήση αυτόχθονων έναντι αλλόχθονων ειδών βακτηρίων είναι αποτελεσματικότερη, καθώς τα αυτόχθονα είδη είναι καλύτερα προσαρμοσμένα στα συστήματα αυτά. Υπάρχουν αρκετές αναφορές που πραγματεύονται την επίδραση του χρωμίου στις φυσιολογικές λειτουργίες της ενεργού ιλύος και στη βιομάζα των μικροοργανισμών που την αποτελούν (Gokcay & Yetis, 1991, Battistoni et al., 1993, Mazierski et al., 1995, Dilek et al., 1998, Vankova et al., 1999). Τα αποτελέσματα από τις διάφορες αυτές ερευνητικές εργασίες παρουσιάζουν μεγάλη απόκλιση, όσον αφορά την επίδραση του χρωμίου στη διαδικασία της ενεργού ιλύος. Από τη μια μεριά παρουσιάζονται αποτελέσματα που υποστηρίζουν τη διατήρηση ενεργής βιομάζας μικροοργανισμών ακόμα και σε υψηλές συγκεντρώσεις χρωμίου (VI) της 20

21 τάξεως των 25 mg/l (Gokcay & Yetis, 1991) και από την άλλη υπάρχουν εργασίες που υποστηρίζουν ότι η προσθήκη ακόμη και 2 mg/l χρωμίου (VI) στο θρεπτικό μέσο έχει αρνητική επίδραση στους μικροοργανισμούς (Vankova et al., 1999). Η απόκλιση αυτή στα αποτελέσματα, μπορεί να οφείλεται σε πολλούς παράγοντες, όπως είναι ο τόπος προέλευσης της ενεργού ιλύος γεγονός που αντικατοπτρίζει τη διαφορετικότητα των μικροοργανισμών, το διαφορετικό μοντέλο που χρησιμοποιείται για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών (συνεχής ροή, εναλλασσόμενη ροή, με ή χωρίς ανακυκλοφορία λάσπης, κλπ), η ηλικία της λάσπης, ο εγκλιματισμός των μικροοργανισμών στο τοξικό ή και οι διαφορετικές μέθοδοι και τεχνικές μέτρησης που χρησιμοποιούνται σε κάθε περίπτωση Παρουσία ανθεκτικών στο χρώμιο μικροοργανισμών και ικανότητα για βιολογική απομάκρυνση του χρωμίου σε συστήματα επεξεργασίας λυμάτων στην Ελλάδα Γενικά, υπάρχουν πολύ λίγες πληροφορίες που να αφορούν τόσο τη χρησιμοποίηση της ενεργού ιλύος για την αποτοξικοποίηση λυμάτων από χρώμιο όσο και την απομόνωση και το χαρακτηρισμό μικροοργανισμών ανθεκτικών στο χρώμιο, που να το ανάγουν σε μη τοξική τρισθενή μορφή. Οι Gikas & Romanos (2006) έδειξαν την επίδραση του χρωμίου (ΙΙΙ) και του χρωμίου (VI) στην ανάπτυξη των μικροοργανισμών της ενεργού ιλύος σε συγκεντρώσεις μεταξύ 0 και 320 mg/l. Επίσης, οι Stasinakis et al. (2003) μελέτησαν την επίδραση του χρωμίου (VI) στους μικροοργανισμούς και στη απόδοση της ενεργού ιλύος, σε συγκεντρώσεις μεταξύ 0 και 5 mg/l. Στην πρώτη περίπτωση (Gikas & Romanos), όπως αποδείχτηκε το χρώμιο (VI) φάνηκε να επάγει την μικροβιακή ανάπτυξη για συγκεντρώσεις μέχρι 25 mg/l πέραν της οποίας ο ρυθμός αύξησης των βακτηρίων μειωνόταν σημαντικά, επιδεικνύοντας μέγιστο ρυθμό ανάπτυξης στα 10 mg/l. Το χρώμιο (ΙΙΙ) είχε επίσης θετική επίδραση στο ρυθμό αύξησης των μικροοργανισμών για συγκεντρώσεις χρωμίου (ΙΙΙ) μέχρι και 15 mg/l, επιδεικνύοντας μέγιστο ρυθμό ανάπτυξης στα 10 mg/l. Η θανατηφόρος δόση για το χρώμιο (VI) και (ΙΙΙ) κυμαίνονταν μεταξύ και mg/l αντίστοιχα. Συμπερασματικά, σύμφωνα με τη συγκεκριμένη εργασία, το χρώμιο (VI) είναι τοξικό για τους μικροοργανισμούς για υψηλές συγκεντρώσεις μεγαλύτερες των 70 mg/l, ενώ φαίνεται να ενισχύει τη μικροβιακή 21

22 ανάπτυξη σε συγκεντρώσεις μικρότερες των 25 mg/l. Τα αποτελέσματα προέκυψαν από πειράματα σε μικρής κλίμακας πειραματικές διατάξεις ενεργού ιλύος ασυνεχούς ροής (batch reactors). Στην δεύτερη περίπτωση (Stasinakis et al.), όπου εξετάστηκε η επίδραση του χρωμίου (VI) στην ενεργό ιλύ σε μεγάλης κλίμακας διατάξεις συνεχούς ροής ενεργού ιλύος (laboratory scale continuous flow activated sludge plants) τα αποτελέσματα είναι σε αντίθεση με όσα αναφέρθηκαν στην προηγούμενη περίπτωση, καθώς η προσθήκη 3 5 mg/l χρωμίου (VI) στο θρεπτικό μέσο της μονάδας είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση μέχρι και 10 % της ικανότητας των μικροοργανισμών της ενεργού ιλύος για βιολογική απομάκρυνση του οργανικού φορτίου. Σύμφωνα επίσης με τα αποτελέσματα της ίδιας εργασίας η προσθήκη 0.5 mg/l χρωμίου (VI) είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση της νιτροποίησης των δειγμάτων κατά 74 %, υποδηλώνοντας ότι οι ετερότροφοι νιτροποιητές είναι περισσότερο ευαίσθητοι στο χρώμιο (VI). Επιπλέον, οι Ziagova et al. (2007) απομόνωσαν από έδαφος ρυπασμένο με χρώμιο (περιοχή Στρατώνι Χαλκιδικής) δύο ανθεκτικά στο χρώμιο βακτηριακά στελέχη, το Staphylococcus xylosus και το Pseudomonas sp., και μελέτησαν το εύρος της ανθεκτικότητας σε χρώμιο των δύο αυτών βακτηριακών στελεχών καθώς και την ικανότητα τους για βιολογική απομάκρυνση του χρωμίου. Οι συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν κυμαίνονταν μεταξύ mg/l στην περίπτωση του Staphylococcus xylosus και mg/l στην περίπτωση του Pseudomonas sp. Με βάση τα αποτελέσματα η μέγιστη ικανότητα απομάκρυνσης χρωμίου του Staphylococcus xylosus και του Pseudomonas sp. ήταν 143 mg/l σε 90 λεπτά και 95 mg/l σε 165 λεπτά αντίστοιχα. Ακόμα, οι Dermou et al. (2005) χρησιμοποιήσαν αυτόχθονους πληθυσμούς βακτηρίων από την ενεργό ιλύ για τον ενοφθαλμισμό σε ηθμό οξικής κυτταρίνης (trickling filter) προκειμένου να μελετηθεί η απόδοση του ηθμού για αφαίρεση του χρωμίου από το λύμα σε τρεις διαφορετικές διατάξεις (ασυνεχής ροής batch, συνεχή ροής continuous και ασυνεχής ροής διαδοχικών φάσεων με ανακυκλοφορία ιλύος SBR with recirculation). Η διάταξη SBR έδειξε ποσοστά απομάκρυνσης του τοξικού της τάξης των 530 g Cr(VI)/m 2 /ημέρα. 22

23 2. ΣΚΟΠΟΣ Ως συνέπεια της ευρείας βιομηχανικής χρήσης του χρωμίου, το στοιχείο αυτό έχει εξελιχθεί σε σοβαρό ρύπο των φυσικών οικοσυστημάτων, καθώς το χρώμιο διαφεύγει σε μεγάλες συγκεντρώσεις στα βιομηχανικά απόβλητα. Tα απόβλητα αυτά που σε πολλές περιπτώσεις καταλήγουν να επεξεργάζονται μαζί με τα αστικά λύματα, τελικά διοχετεύονται σε φυσικούς αποδέκτες. Η ύπαρξη άμεσων απειλών υποβάθμισης των φυσικών οικοσυστημάτων εξαιτίας της ρύπανσης με χρώμιο δημιουργεί την ανάγκη αναπροσανατολισμού της διαχείρισης των αποβλήτων. Η χρήση μικροοργανισμών στις εγκαταστάσεις επεξεργασίας αποβλήτων, με σκοπό την απομάκρυνση μαζί με το οργανικό φορτίο επιπλέον και ρυπαντικών υλικών, όπως βαρέων μετάλλων μεταξύ των οποίων και του χρωμίου, βρίσκει όλο και μεγαλύτερη αποδοχή, καθώς υπάρχουν πολλά πλεονεκτήματα που ενθαρρύνουν την εφαρμογή της ως μεθόδου βιοαπορρύπανσης. Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας ήταν να διερευνηθεί η πιθανή ύπαρξη μικροβιακών στελεχών στην ενεργό ιλύ από τη ΜΕΑΛ Καστοριάς, που θα μπορούσαν να αναπτυχθούν σε συνθετικό λύμα με υψηλή περιεκτικότητα σε χρώμιο (VI). Επίσης, στόχος ήταν ο προσδιορισμός των φυσικών και χημικών χαρακτηριστικών αυτών των μικροοργανισμών καθώς και η ταυτοποίησή τους. 23

24 3. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3.1. Προέλευση δειγμάτων ενεργού ιλύος Τα δείγματα της ενεργού ιλύος που χρησιμοποιήθηκαν για την τροφοδοσία των βιοαντιδραστήρων με ενεργή βιομάζα μικροοργανισμών προέρχονταν από την δεξαμενή αερισμού (ΔΑ) της εγκατάστασης επεξεργασίας λυμάτων (ΕΕΛ) της πόλης της Καστοριάς και της Κοζάνης. Η συλλογή των δειγμάτων έγινε σε αποστειρωμένα δοχεία Θρεπτικό υλικό Ως θρεπτικό υλικό για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών της ενεργού ιλύος χρησιμοποιήθηκε αποστειρωμένο συνθετικό λύμα, με διαφορετικές συγκεντρώσεις χρωμίου (VI). Η σύσταση του συνθετικού λύματος που χρησιμοποιήθηκε παρουσιάζεται στον πίνακα 1. Η ρύθμιση των διαφορετικών συγκεντρώσεων χρωμίου έγινε με τη βοήθεια πρότυπου διαλύματος διχρωμικού καλίου (K 2 Cr 2 O 7 ). Η αποστείρωση του θρεπτικού υλικού έγινε σε αυτόκαυστο στους 121 C για 20 λεπτά. Πίνακας 1. Σύσταση συνθετικού λύματος ΣΥΣΤΑΤΙΚΟ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ g/l Ένυδρο οξικό νάτριο, CH 3 COONa 3H 2 O Χλωριούχο αμώνιο, NH 4 Cl 0.06 Όξινο φωσφορικό νατριο, Na 2 HPO Όξινο ανθρακικό νάτριο, NaHCO Χλωριούχο νάτριο, NaCl Ένυδρο χλωριούχο ασβέστιο, CaCl 2 2H 2 O 0.02 Ένυδρο θειικό μαγνήσιο, MgSO 4 7H 2 O 0.05 Χλωριούχο κάλιο, KCl 0.1 Ένυδρος τριχλωριούχος σίδηρος, FeCL 3 6H 2 O

25 3.3. Πυκνό πρότυπο διάλυμα διχρωμικού καλίου (K 2 Cr 2 O 7 ) Αποστειρωμένο πυκνό πρότυπο διάλυμα διχρωμικού καλίου (K 2 Cr 2 O 7 ), συγκέντρωσης 10 g/l, χρησιμοποιήθηκε ως πηγή χρωμίου (VI) για την ρύθμιση των διαφορετικών συγκεντρώσεων χρωμίου στο συνθετικό λύμα σε κάθε βιοαντιδραστήρα. Η αποστείρωση του πρότυπου διαλύματος Κ 2 Cr 2 O 7 έγινε με διήθηση μέσα από μικροβιοκρατείς ηθμούς διαμέτρου 22 μm Πειραματική διάταξη Η πειραματική διάταξη που χρησιμοποιήθηκε φαίνεται στην Εικόνα 2. Ως βιοαντιδραστήρες ενεργού ιλύος χρησιμοποιήθηκαν επτά γυάλινα αποστειρωμένα δοχεία συνολικής χωρητικότητας 2 λίτρων. Οι βιοαντιδραστήρες τοποθετήθηκαν σε θάλαμο σταθερής θερμοκρασίας, 25 C και σε αυτούς προσαρμόστηκαν αντλίες αέρα, για συνεχή παροχή αέρα και ανάμιξη του μικτού υγρού σε κάθε βιοαντιδραστήρα. Η συγκέντρωση του διαλυμένου οξυγόνου σε κάθε βιοαντιδραστήρα διατηρούνταν σταθερή και ίση με 3 mg/l. Στους έξι από τους επτά βιοαντιδραστήρες ενοφθαλμίστηκαν 50 ml δείγματος ενεργού ιλύος, που προέρχονταν από τη ΔΑ της ΕΕΛ της πόλης της Καστοριάς και 1450 ml συνθετικού λύματος σε συγκεντρώσεις χρωμίου (VI) 0, 1, 5, 10, 20 και 50 mg/l αντίστοιχα για κάθε ένα από τα έξι δοχεία. Στον έβδομο βιοαντιδραστήρα ενοφθαλμίστηκαν 50 ml ενεργού ιλύος, που προέρχονταν από την ΔΑ της ΕΕΛ της πόλης της Κοζάνης και 1450 ml συνθετικού λύματος με συγκέντρωση χρωμίου (VI) 50 mg/l. Εικόνα 2. Πειραματική διάταξη μονάδων ενεργού ιλύος 25

26 3.5. Περιγραφή της λειτουργίας της πειραματική διάταξης Κάθε βιοαντιδραστήρας λειτουργούσε σε διαδοχικούς κύκλους τροφοδοσίας. Η περίοδος λειτουργίας κάθε κύκλου ήταν τέσσερις ημέρες. Στο τέλος κάθε κύκλου το μικτό υγρό αφήνονταν να ηρεμήσει και να κατακαθίσει ως ίζημα. Στη συνέχεια απομακρύνονταν 400 ml από το υπερκείμενο υγρό και προσθέτονταν θρεπτικό υλικό με την επιθυμητή συγκέντρωση χρωμίου (VI) σε τελικό όγκο 1.5 λίτρο. Στο τέλος κάθε κύκλου λαμβανόταν η απαραίτητη ποσότητα δείγματος από κάθε βιοαντιδραστήρα και προσδιορίζονταν οι φυσικοχημικές παράμετροι ως συνάρτηση του χρόνου. Η συνολική διάρκεια λειτουργίας των βιοαντιδραστήρων ήταν τέσσερις μήνες (122 ημέρες) Προσδιορισμός φυσικοχημικών παραμέτρων του συστήματος Προσδιορισμός χρωμίου ήταν: Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό του χρωμίου 1. Διάλυμα NH 3. Χρησιμοποιείται αναλυτικώς καθαρή NH 3 2. Διάλυμα δείκτη πορτοκαλί του μεθυλίου (methyl orange). Σε 100 ml δις απεσταγμένο νερό διαλύεται 1 g πορτοκαλί του μεθυλίου 3. Διάλυμα H 2 SO 4 50 %. Σε 50 ml δις απεσταγμένο νερό προστίθενται 50 ml H 2 SO 4 (Μw = 98.08, ρ = 1.84 g/ ml, % v/v) 4. Διάλυμα H 2 SO 4 6 N. Σε 100 ml δις απεσταγμένο νερό διαλύονται 17 ml H 2 SO 4 5. Διάλυμα H 2 SO Ν. Σε 500 ml δις απεσταγμένο νερό αραιώνονται 17 ml διαλύματος 6Ν H 2 SO 4 6. Διάλυμα 1, 5 διφαινυλκαρβαζίδιο. Σε 50 ml αναλυτικώς καθαρή ακετόνη διαλύονται 0.25 g 1,5 διφαινυλκαρβαζίδιο 7. Διάλυμα KMnO 4. Σε 100 ml δις απεσταγμένο νερό διαλύονται 4 g KMnO 4 8. Διάλυμα ΝaN 3. Σε 100 ml δις απεσταγμένο νερό διαλύονται 0.5 g ΝaN 3 9. Διάλυμα Η 3 ΡΟ 4. Χρησιμοποιείται αναλυτικώς καθαρό Η 3 ΡΟ Διάλυμα Η 2 SO 4, ΗΝΟ 3, Σε 200 ml Η 2 SO 4 προσθέτονται 100 ml ΗΝΟ 3 26

27 Προσδιορισμός εξασθενούς χρωμίου Ο προσδιορισμός του εξασθενούς χρωμίου έγινε χρωματομετρικά με τη μέθοδο με 1,5 διφαινυλκαρβαζίδιο. Η μέθοδος βασίζεται στο ότι σε όξινο διάλυμα το 1,5 διφαινυλκαρβαζίδιο δίνει με το εξασθενές χρώμιο ένα ευδιάλυτο και χρωματισμένο ερυθροϊώδες παράγωγο. Το χρώμιο (VI) προσδιορίζεται με μέτρηση της οπτικής απορρόφησης των επεξεργασμένων δειγμάτων στα 540 nm. Οι μετρούμενες απορροφήσεις ανάγονται σε συγκεντρώσεις χρωμίου με τη βοήθεια πρότυπων διαλυμάτων (APHA, 1998) Προσδιορισμός ολικού χρωμίου σε ξηρή μάζα ενεργού ιλύος Αρχικά η λάσπη ξηραίνεται σε κλίβανο μέχρι την επίτευξη σταθερού βάρους, στους 105 ºC (χώνευση λάσπης). Στη συνέχεια η ξηρή μάζα επεξεργάζεται με μίγμα οξέων (2 Η 2 SO ΗΝΟ 3 ) σε υψηλή θερμοκρασία για την αποδέσμευση των ιόντων του μετάλλου από την οργανική μάζα. Στη συνέχεια προσδιορίζεται το ολικό χρώμιο. Για τον προσδιορισμό του ολικού χρωμίου λαμβάνεται ικανοποιητική ποσότητα δείγματος προς μέτρηση (20 ml). Το δείγμα επεξεργάζεται αρχικά με διάλυμα ασθενούς βάσης (ΝΗ 3 ) μέχρι αυτό να γίνει βασικό (κίτρινο χρώμα) και στη συνέχεια με διάλυμα ισχυρού οξέος (Η 2 SO 4 ) μέχρι να γίνει και πάλι όξινο (ροζ χρώμα). Ως δείκτης χρησιμοποείται το πορτοκαλί του μεθυλίου (methyl orange). Στη συνέχεια το δείγμα αραιώνεται με απεσταγμένο νερό, σε όγκο περίπου 40 ml, και θερμαίνεται σε υψηλές θερμοκρασίες ( C). Μόλις το διάλυμα θερμανθεί προστίθενται 2 σταγόνες υπερμαγγανικό κάλιο (KMnO 4 ), για την οξείδωση του χρωμίου (ΙΙΙ) και το διάλυμα αποκτά ένα σκούρο καφέ χρώμα. Η θέρμανση του διαλύματος συνεχίζεται για δύο ακόμα λεπτά και στην συνέχεια προστίθεται 1 ml διαλύματος αζιδίου του νατρίου (ΝaN 3 ) και το διάλυμα αποχρωματιζέται. Εάν ο αποχρωματισμός δεν είναι πλήρης προστίθεται ακόμα 1 ml διαλύματος αζιδίου του νατρίου (ΝaN 3 ). Η θέρμανση διακόπτεται και το διάλυμα ψύχεται. Προστίθενται 5 σταγόνες διαλύματος φωσφορικού οξέος (Η 3 ΡΟ 4 ) και το διάλυμα αραιώνεται με δις απεσταγμένο νερό σε τελικό όγκο 50 ml. Προστίθεται 1 ml διαλύματος 1,5 διφαινυλκαρβαζιδίου και το παρασκεύασμα αφήνεται για 10 λεπτά μέχρι την εμφάνιση του ερυθροϊώδους χρώματος. Στη συνέχεια το χρώμιο προσδιορίζεται χρωματομετρικά (APHA, 1998). 27

28 Προσδιορισμός χημικά απαιτούμενου οξυγόνου (XAO COD) Το χημικά απαιτούμενο οξυγόνο (XAO COD) είναι μία σημαντική, γρήγορα μετρούμενη παράμετρος, που χρησιμοποιείται για το χαρακτηρισμό αστικών και κυρίως βιομηχανικών αποβλήτων. Αποτελεί δείκτη του ρυπαντικού φορτίου και εκφράζει την ποσότητα του οξειδωτικού παράγοντα, που απαιτείται για τη χημική οξείδωση των οργανικών ουσιών ενός δείγματος (Tschobanoglous, 1995). Διαδικασία Για τη μέτρηση του COD χρησιμοποιήθηκαν κυβέτες (kits) της Αqualytic. Στην κυβέτα προστίθενται 2 ml δείγματος, ανακινούνται και στη συνέχεια η κυβέτα θερμαίνεται στους 148 ºC για δύο ώρες, κατά τις οποίες λαμβάνει χώρα η διάσπαση των ουσιών σε όξινο περιβάλλον. Μετά την πάροδο των δύο ωρών, γίνεται μέτρηση της απορρόφησης σε φωτόμετρο στα 620 nm για συγκεντρώσεις από mg/l COD (Aqualytic, 2001) Προσδιορισμός αμμωνιακού αζώτου (Ν ΝΗ 4 ) Η αμμωνία με τη μορφή NH + 4, NH 4 OH και NH 3, βρίσκεται στα αστικά λύματα και σε απόβλητα συγκεκριμένων βιομηχανικών κλάδων ως αποτέλεσμα της υδρόλυσης της ουρίας και της αποδόμησης αζωτούχων ενώσεων (Tschobanoglous, 1995). Διαδικασία Για τον υπολογισμό του αμμωνιακού αζώτου χρησιμοποιήθηκαν κυβέτες Αqualytic εύρους 0 50 mg/l N. Γίνεται προσθήκη 0.1 ml δείγματος και του αντιδραστηρίου Vario Ammonia Salicylate F5. Μετά από ανάδευση, επιπλέον προσθήκη του αντιδραστηρίου Vario Ammonia Cyanurate F5 και αναμονή 20 λεπτών για να αναπτυχθεί χρώμα. Μετράται η απορρόφηση στα 655 nm. Η ένδειξη παρουσιάζεται σε mg/l N (Aqualytic, 2001). 28

29 Προσδιορισμός διαλυμμένου φωσφόρου με μορφή φωσφορικών (Ρ ΡΟ 4 ) Ο φώσφορος υπάρχει στα λύματα κυρίως με τη μορφή φωσφορικών αλάτων. Τα τελευταία ταξινομούνται σε ορθοφωσφορικά, πολυφωσφορικά και φωσφορικά δεσμευμένα με οργανικά τμήματα. Με την παρακάτω μέθοδο μετράται ο φώσφορος με τη μορφή φωσφορικών (Tschobanoglous, 1995). Διαδικασία Γίνεται χώνευση του δείγματος σε θερμοαντιδραστήρα, προκειμένου να διασπαστούν τα σύμπλοκα που περιέχουν φώσφορο και οι φωσφορικές ενώσεις έτσι ώστε να ελευθερωθεί ο φώσφορος. Στη συνέχεια με την προσθήκη κατάλληλων αντιδραστηρίων στην κυβέτα της Αqualytic, η συνολική ποσότητα του φωσφόρου μετατρέπεται σε φωσφορικά, με αποτέλεσμα την αλλαγή του χρώματος στην κυβέτα με το δείγμα. Η μέτρηση της απορρόφησης γίνεται στα 690 nm. Τέλος, με τον κατάλληλο συντελεστή μπορεί να υπολογιστεί έμμεσα η τιμή του ολικού φωσφόρου (Aqualytic, 2001) Προσδιορισμός αιωρούμενων συστατικών του μικτού υγρού (ΑΣΜΥ MLSS) Για τη μέτρηση των αιωρούμενων στερεών της δεξαμενής αερισμού χρησιμοποιήθηκαν ηθμοί ινών υάλου (glass fiber) Whattman εξωτερικής διαμέτρου 47 mm. Αρχικά, ο ηθμός ξηραίνεται για 20 λεπτά και ζυγίζεται. Στη συνέχεια, 50 ml δείγματος διηθούνται διαμέσου του προζυγισμένου ηθμού και το υλικό που συγκρατείται ξηραίνεται σε κλίβανο μέχρι την επίτευξη σταθερού βάρους, στους 105 C για δύο ώρες. Στη συνέχεια ο ηθμός ζυγίζεται ξανά και η αύξηση του βάρους εκφράζει τα Συνολικά Αιωρούμενα Στερεά (Aqualytic, 2001) Απομόνωση μικροβιακών στελεχών ανθεκτικών σε χρώμιο (VI) Για την απομόνωση ανθεκτικών σε χρώμιο (VI) βακτηριακών στελεχών, χρησιμοποιήθηκε δείγμα από το μικτό υγρό του βιοαντιδραστήρα που λειτουργούσε με τη μεγαλύτερη συγκέντρωση χρωμίου (VI), 50 mg/l. Η δειγματοληψία έγινε όταν 29

30 η απόδοση του συστήματος είχε σταθεροποιηθεί σε υψηλά ποσοστά απομάκρυνσης χρωμίου (ποσοστό ίσο με 100 %). Για την ανάπτυξη των στελεχών που απομονώθηκαν από το μικτό υγρό χρησιμοποιήθηκε αποστειρωμένο θρεπτικό υπόστρωμα ίδιας σύστασης με το συνθετικό λύμα, με το οποίο έγινε η τροφοδοσία των βιοαντιδραστήρων (πίνακας 1), με τη διαφορά ότι για την παρασκευή στερεού υποστρώματος (τριβλία με θρεπτικό υπόστρωμα) προστίθετο επιπλέον άγαρ (bacto agar) σε συγκέντρωση 1.75 %. Επιπλέον, δοκιμάστηκε η ανάπτυξη σε Νutrient Broth. Η επώαση των τριβλίων για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών έγινε στους 25 C. Ανάλογα με το μικροοργανισμό ο χρόνος επώσης των τριβλίων κυμαίνονταν μεταξύ πέντε και επτά ημερών. Ο επιλεκτικός παράγοντας, το χρώμιο, προστίθετο και σε αυτήν την περίπτωση στο θρεπτικό μέσο, ώστε η συγκέντρωση του χρωμίου (VI) στο θρεπτικό υπόστρωμα να είναι 50 mg/l. Για τη ρύθμιση της συγκέντρωσης του χρωμίου χρησιμοποιήθηκε αποστειρωμένο πρότυπο διάλυμα διχρωμικού καλίου Κ 2 Cr 2 O 7, συγκέντρωσης 0.1 Μ ή 5.2 g/l σε χρώμιο (VI). Η αποστείρωση του πρότυπου διαλύματος Κ 2 Cr 2 O 7 έγινε με διήθηση μέσα από μικροβιοκρατείς ηθμούς διαμέτρου 22 μm Καθαρές καλλιέργειες μικροοργανισμών Αρχικά επιλέχθηκαν οι αποικίες εκείνες που ήταν πιο διακριτές και εμφανίζονταν με τη μεγαλύτερη συχνότητα στα τριβλία που είχαν μεγάλες ξεχωριστές αποικίες (τριβλία με επίστρωση). Κάθε μία από τις ξεχωριστές αποικίες που επιλέχθηκαν, ενοφθαλμίστηκαν εκ νέου χωριστά σε υγρά θρεπτικά μέσα και με διαδοχικές ανακαλλιέργειες έγιναν καθαρές καλλιέργειες μικροοργανισμών Καταμέτρηση καθαρών αποικιών και έλεγχος καθαρότητας Για την καταμέτρηση των αποικιών κάθε στελέχους στα τριβλία με θρεπτικό άγαρ εφαρμόστηκε η μέθοδος των διαδοχικών αραιώσεων. Τα βακτηριακά κύτταρα από την υγρή καλλιέργεια κάθε στελέχους αραιώθηκαν 10, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 και 10 6 φορές και ποσότητα 100 μl από κάθε αραίωση επιστρώθηκε σε τριβλίο με θρεπτικό άγαρ. Η μέτρηση του αριθμού των αποικιών έγινε σε εκείνη την αραίωση στην οποία ο αριθμός των αποικιών που αναπτύσσονταν στο αντίστοιχο τριβλίο ήταν 30