Πολυφαινόλες και άλλα βιοδραστικά μόρια στα προϊόντα της ελιάς. Αικατερίνη Τερμεντζή, PhD

Transcript

1 SAGE10: Το Έργο που αποτιμά το αποτύπωμα της Ελαιοκαλλιέργειας στο περιβάλλον Πολυφαινόλες και άλλα βιοδραστικά μόρια στα προϊόντα της ελιάς. Αικατερίνη Τερμεντζή, PhD Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας & Χημείας Φυσικών Προϊόντων, Τμήμα Φαρμακευτικής, Ε.Κ.Π.Α PharmaGnose SA

2 Η Ελιά Βοτανική Ταξινόμηση : Βασίλειο : Plantae Διαίρεση : Tracheophyta Τάξη : Magnoliopsida Οικογένεια : leaceae Γένος : lea L. Είδος : lea europaea L. Καλλιέργεια σημαντικής οικονομικής σημασίας στη Μεσόγειο Ευδοκιμεί σε εύκρατα κλίματα π.χ. Ελλάδα, Ιταλία, Ισπανία, Τουρκία, Αλγερία Η Ελλάδα είναι η τρίτη ελαιοπαραγωγός χώρα παγκοσμίων με ετήσια παραγωγή τ (15%) Έκταση (10 6 ha) Παραγόμενος Παραγόμενο Ελαιοκαρπός Ελαιόλαδο (10 6 τόνοι) (10 6 τόνοι) Ισπανία 2,1 3,8 0,95 Ιταλία 1,14 2,2 0,45 Ελλάδα 0,73 1,9 0,43 Πορτογαλία 0,32 0,29 0,04 2

3 Δευτερογενείς Μεταβολίτες της Ελιάς > 200 ενώσεις που απομονώθηκαν από την ελιά> 120 πολικά συστατικά phenyl alcohols secoiridoids lignans flavonoids phenolic acids and derivatives lactones triterpenoids others

4 INFLAMMATIN Arachidonic acid CX LX Βιολογική αξία του ελαιολάδου ATHERSCLERSIS Prostaglandins Leukotrienes H C H 3 H H H ANTICANCER PRPERTIES Cytokines ( - ) LX ( - ) CX Leukotrien B 4 H H C H 3 H H H ANTIMICRBIAL ACTIVITY Platelet aggregation LDL xidation Cholesterol synthesis Thromboxane METABLIC SYNDRME Glucose DNA xidation Antiproliferative and proapoptotic effects Diabetes Leukemia hypoglycemic activity in vitro Colon cancer Breast cancer Gastric ulcer Intestinal microbita Arterial Hypertension

5 Οδηγία σχετικά με την κατανάλωση εξτρα παρθένου ελαιολάδου n the basis of the data presented, the Panel concludes that a cause and effect relationship has been established between the consumption of olive oil polyphenols (standardised by the content of hydroxytyrosol and its derivatives) and protection of LDL particles from oxidative damage. The Panel considers that in order to bear the claim, 5 mg of hydroxytyrosol and its derivatives (e.g. oleuropein complex and tyrosol) in olive oil should be consumed daily. These amounts, if provided by moderate amounts of olive oil, can be easily consumed in the context of a balanced diet. The concentrations in some olive oils may be too low to allow the consumption of this amount of polyphenols in the context of a balanced diet. The target population is the general population.

6 EU Register on nutrition and health claims Claim: live oil polyphenols contribute to the protection of blood lipids from oxidative stress Conditions for use: The claim may be used only for olive oil which contains at least 5 mg of hydroxytyrosol and its derivatives (e.g. oleuropein complex and tyrosol) per 20 g of olive oil. In order to bear the claim information shall be given to the consumer that the beneficial effect is obtained with a daily intake of 20 g of olive oil. Health relationship: protection of LDL particles from oxidative damage

7 Πρόβλημα Νο1 Τα βιοδραστικά μόρια στο ελαιόλαδο μεταβάλλονται (ποιοτικά & ποσοτικά) Δύο άξονες: Ποσοτική και Ποιοτική διακύμανση Α. Παράγοντες στον αγρό Ποικιλία Γεωγραφική εξάπλωση Κλιματικές συνθήκες Φυτοπροστατευτικές μεθοδολογίες- στρες Λίπανση ελαιώνων Στάδιο ωρίμανσης του καρπού κατά τη συλλογή Β. Παράγοντες κατά την ελαιοποίηση Χρόνος παραμονής ελαιοκάρπου πριν την ελαιοποίηση Τύπος ελαιοτριβείου (Διφασικά-Τριφασικά-Παραδισιακά) Χρονοι μάλαξης Θερμοκρασίες

8 Πρόβλημα Νο2 Η Ανάλυση... Η μέτρηση των ολικών πολυφαινολών (Folin ciocalteu) δεν καλύπτουν την οδηγία της EFSA, γιατί προσμετρούν όλες τις φαινόλες και όχι μόνο τα παράγωγα της υδροξυτυροσόλης. Ο όρος παράγωγα της υδροξυτυροσόλης κατά πάσα πιθανότητα περιλαμβάνει μια πολύ συγκεκριμένη χημική ομάδα ενώσεων, που δίνουν θεωρήτικά με υδρόλυση υδροξυτυροσόλη R H H R=H, Tyrosol (4) R=H, Hydroxytyrosol (3) R R' H H R=H, R'=H, Nuzhenide (20) R=H, R'=H, Neo-Nuzhenide (17) R=H, R'=11-methyl oleoside (34) H H H H H R=H, leocanthal (30) R=H, leacein (22) H H CCH 3 Πρόφατη επιστημονική εργασία: προτείνει υδρόλυση του πολυφαινολικού κλάσματος και ποσοστικοποίηση της υδροξυτυροσόλης. R H HC CCH 3 CH 3 R=H, Monoaldehydic form of Ligstroside aglycon (38) R=H, Monoaldehydic form of leuropein aglycon (35) R H H H H H CCH 3 R=H, Ligstroside (32) R=H, leuropein (24)

9 Πρόβλημα Νο3 Η έλλειψη πιστοποιημένων προτύπων ενώσεων και ενώσεων αναφοράς Σύμφωνα με τον ICH (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use): The purity of the reference standard used to prepare spiked samples can affect study data For this reason, an authenticated analytical reference standard of known identity and purity should be used to prepare solutions of known concentrations The source and lot number, expiration date, certificates of analyses when available, and/or internally or externally generated evidence of identity and purity should be furnished for each reference standard Three types of reference standards are usually used: (1) certified reference standards (e.g., USP compendial standards); (2) commercially supplied reference standards obtained from a reputable commercial source; (3) other materials of documented purity custom-synthesized by an analytical laboratory or other noncommercial establishment USP: Very strict rules for reference standards All accepted come from a strictly tested positive list

10 Work-flow

11 Πρόβλημα Νο1 Τα βιοδραστικά μόρια στο ελαιόλαδο μεταβάλλονται (ποιοτικά & ποσοτικά) Δύο άξονες: Ποσοτική και Ποιοτική διακύμανση

12 Ποιοτικές και Ποσοτικές μελέτες Καταγραφή των ποιοτικών και ποσοτικών μεταβολών των δευτερογενών μεταβολιτών στο ελαιόλαδο σε μια και μόνο γραμμή παραγωγής Καρποί Ποικ. Κορωνέικη Στερεά απόβλητα Πάστα από Μάλαξη Υγρά απόβλητα Πρώτο λάδι Προέκυψαν ενδιαφέρουσες πληροφορίες σχετικά με τη διακύμανση του φαινολικού κλάσματος κατά την ελαιοποίηση Προσδιορίστηκε τι καταλληλότερο υλικό για την απομίνωση αυτών των ενώσεων. Τελικό λάδι Photos and Samples from RENIERIS live Groves in Lakonia,

13 Καταγραφή ποιοτικού προφίλ live paste HPLC-ESI(-)-LTQ-rbitrap platform Sample cleaning with Diol catridges Column: Ascentis Express Fused-Core C18 column ( mm i.d., 2.7 μm, Supelco). Flow rate: 400 μl/min, Inj. Vol.: 5μL Solvent system: (A) 0.1% AA, (B) ACN Gradient System: 5%B for 2min, then to 10%B in 2.5min, to 25% B in 11.5 min, to 95%B in 13min and hold for 2min, back to 5%B in 0.5min and hold for 2.5min. Mass range (FS & MS/MS) Mass resolving power Normalized collision energy 35.0% (Act.Q 0.250) ESI conditions: capillary temperature 350 C; capillary voltage -3V; tube lens V. Sheath gas nitrogen (30 arb. units); auxiliary gas nitrogen (10 arb. units) Column: Ascentis Express Fused-Core C18 column ( mm i.d., 2.7 μm, Supelco).

14 Διευκρίνηση δομής live fruits, paste, oil 52 Compounds were identified Rt, ECs, RDBeq. values, RIA Δm 1-3ppm HRMS/MS spectra in-house MS-based libraries

15 Ποσοτικές μεταβολές Ποσοτικές μεταβολές των κύριων δευτερογενών μεταβολιτών του ελαιολάδου στα διάφορα παραγωγικά στάδια. LC-HRMS

16 Ποσοτικές μεταβολές Ποσοτικές μεταβολές των κύριων δευτερογενών μεταβολιτών του ελειολάδου στα διάφορα παραγωγικά στάδια. LC-HRMS Απομόνωση βιοδραστικών μορίων

17 Εργαστήριο Φαρμακογνωσίας & Χημείας Φυσικών Προϊόντων Τμήμα Φαρμακευτικής Εθνικό & Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών ΠΑΒΕΤ 2013 Εγκεκριμένη πρόταση για έρευνα πάνω στο λάδι και την τελική ποιότητά του Ανάπτυξη μεθοδολογιών για τον πλήρη ποιοτικό έλεγχο-χαρακτηρισμό βιοδραστικών μορίων των εξαιρετικά παρθένων ελαιολάδων και επιτραπέζιων ελαιών, με τη χρήση σύγχρονων τεχνικών ανάλυσης και χημειομετρίας. ΟΛΑ.ΛΑ. Στοχος της πρότασης ΟΛΑ.ΛΑ. είναι μια συντονισμένη προσπάθεια χαρακτηρισμού των βιοδραστικών μορίων της ελιάς με σύγχρονες τεχνικές χρωματογραφίας, καθώς και η δημιουργία ενός μοντέλου πρόβλεψης και ελέγχου της τελικής ποιότητας του προϊόντος μέσα από μοντέρνες τεχνικές χημειομετρίας.

18 Δημιουργία βάσης δεδομένων Στο εργαστήριο Φαρμακογνωσίας ΕΚΠΑ στήνεται μια μεγάλη βάση δεδομένων, που στηρίζεται πάνω σε εκλεπτυσμένα αναλυτικά συστήματα ανίχνευσης βιοδραστικών μορίων της ελιάς. Σκοπός: Η καταγραφή του φαινολικού προφίλ του μεγαλύτερου δυνατού αριθμού ελαιολάδων, από όλα τα μέρη της Ελλάδας και από διάφορες περιοχές του κόσμου. Τα αποτελέσματα κατατάσσονται με βάση: Γεωγραφική προέλευση Ποικιλία Ετος παραγωγής Χρονική διάρκεια παραμονής του ελαιοκάρπου πριν την ελαιοποίηση Ειδος ελαιοτριβείου Τύπος καλλιέργειας (συμβατική, εντατική, ολοκληρωμένη, βιολογική) Δημιουργία βάσης δεδομένων. Τα αποτελεσματα θα επεξεργαστούν με βάση εργαλεία μεταβολομικής με σκοπό τη δημιουργία ενός μοντέλου που θα περιγράφει, όχι μονο ποιοτικά, αλλά και ποσοτικά τις διακυμάνσεις των βιοδραστικών μορίων της ελιάς σε συναρτηση με διάφορους καλλιεργητικούς-γεωγραφικούς-παραγωγικούς παράγοντες. Αναμένεται να βγουν πολύτιμα συμπεράσματα σε σχέση με την παραγωγή βιοδραστικών ενώσεων και τη συνάρτησή τους με τις παραγωγικές παραμέτρους.

19 Κορωνέικη Μανάκι Μαυρολιά Χαλκιδικής Λιανολιά Αγριελιά Συμβατική Βιολογική Ολοκληρωμένη Διφασικά Τριφασικά Κίνα Ν. Αφρική Χιλή Μαγιόρκα Ισπανία

20 mau mau mau mau Μαυρολιά, Συμβατική καλλιέργεια ολοκληρωμένη διαχείρισης Παραδείγματα Νηλέας Detector 1-235nm Ολεασεϊνη Ολεασεϊνη Ολεοκανθάλη Ολεοκανθάλη LE063_MeH_H Φλαβονοειδή, Λιγνάνια, Σεκοϊριδοειδή Φλαβονοειδή, Λιγνάνια, Σεκοϊριδοειδή Εμπλουτισμένο σε διαλδεϋδικά σεκοϊριδοειδή, όπως είναι η Ολεασεΐνη και η Ολεοκανθάλη, τα οποία εμφανίζονται σε σχεδόν παρόμοια επίπεδα Minutes Κορωνέικη, Συμβατική καλλιέργεια ολοκληρωμένη διαχείρισης 800 Detector 1-235nm Ολεασεϊνη Ολεασεϊνη Ολεοκανθάλη Ολεοκανθάλη LE064_MeH_H Φλαβονοειδή, Λιγνάνια, Φλαβονοειδή, Σεκοϊριδοειδή Λιγνάνια, Σεκοϊριδοειδή Σημαντική είναι η παρουσία και των διαλδεϋδικών σεκοϊριδοειδών Ολεασεΐνη και Ολεοκανθάλη, σε μικρότερα ποσοστά σε σχέση με τη Μαυρολιά

21 mau mau mau Παραδείγματα Νηλέας Μαυρολιά, Βιολογική 1200 Detector 1-235nm Ολεοκανθάλη Ολεοκανθάλη Ολεασεϊνη LE065_MeH_H Παρόμοια επίπεδα Ολεασεΐνης και Ολεοκανθάλης, με τη συμβατική Φλαβονοειδή, Λιγνάνια, Φλαβονοειδή, Σεκοϊριδοειδή Λιγνάνια, Σεκοϊριδοειδή Κορωνέικη, Βιολογική Minutes Ολεασεϊνη Detector 1-235nm Ολεασεϊνη Ολεοκανθάλη Ολεοκανθάλη Φλαβονοειδή, Λιγνάνια, Φλαβονοειδή, Σεκοϊριδοειδή Λιγνάνια, Σεκοϊριδοειδή LE066_MeH_H Παρόμοια επίπεδα Ολεασεΐνης και Ολεοκανθάλης, με τη συμβατική Minutes

22 mau mau mau Μαυρολιά, Συμβατική καλλιέργεια ολοκληρωμένη διαχείρισης Detector 1-280nm LE063_MeH_H2_AA Παραδείγματα Νηλέας Υδροξυτυροσόλη Τυροσόλη Μέτρια επίπεδα Υδροξυτυροσόλης και Τυροσόλης Minutes Κορωνέικη, Συμβατική καλλιέργεια ολοκληρωμένη διαχείρισης Detector 1-280nm Υδροξυτυροσόλη LE064_MeH_H2_AA Τυροσόλη Μέτρια επίπεδα Υδροξυτυροσόλης και Τυροσόλης, παρόμοια με αυτά της μαυρολιάς

23 mau mau mau Μαυρολιά, Βιολογική Παραδείγματα Νηλέας 450 Detector 1-280nm LE065_MeH_H2_AA Υδροξυτυροσόλη Τυροσόλη Minutes Κορωνέικη, Βιολογική Αισθητά αυξημένα επίπεδα επίπεδα Υδροξυτυροσόλης και Τυροσόλης σε σχέση με τη συμβατική καλλιέργεια κ σε σχέση με την κορωνέικη 200 Detector 1-280nm LE066_MeH_H2_AA Υδροξυτυροσόλη Τυροσόλη Ελαφρώς μειωμένα επίπεδα Υδροξυτυροσόλης σε σχέση με τη συβατική

24 Παρατηρήσεις σχετικά με τα προκαταρκτικά αποτελέσματα... Οι αποδόσεις των ελαιολάδων σε δευετερογενή συστατικά (ολικές πολυφαινόλες ή βιοφαινόλες) κυμαίνεται από 10 έως 40mg/ 20g ελαιολάδου, με ένα συντριπτικό αριθμό ελληνικών δειγμάτων να κυμαίνεται γύρω στα 20mg/ 20g. * Οι αριθμοί αυτοί αντιστοιχούν σε ολικές φαινόλες και άλλα συστατικά, και σε καμία περίπτωση δεν μπορούν να σχετιστούν απευθείας με την οδηγία της EFSA. Τα επίπεδα των δευτερογενών μεταβολιτών είναι εξαιρετικά ευμετάβλητα, και η μεταβολή τους οπωσδήποτε επηρεάζεται από περισσότερους του ενός παραγόντων. Για την έκδοση ασφαλών συμπερασμάτων μεταξύ περιεκτιότητας (ποιοτικά και ποσοτικά) δευτερογενών μεταβολιτών και καλλιεργητικών-ελαιοποιητικών παραγόντων, απαιτείται ένας πολύ μεγάλος αριθμός δειγμάτων, ώστε να επεξεργαστεί με εργαλεία χημειομετρίας (μεταβολομική) και να προκύψουν ασφαλείς αλγόριθμοι συσχετισμού. Ενα λάδι το οποίο είναι πλούσιο σε κάποια βιοδραστικά μόρια, δε σημαίνει ότι αυτόματα είναι και υψηλότερης ποιότητας. Τα μέχρι τώρα δείγματα έχουν δείξει ότι ένα ισορροημένο λάδι όσο αφορά τα δευτερογενή του συστατικά, είναι και το πιο ισορρόπημένο οργανοληπτικά, ενώ η αυξημένη παρουσία κάποιων δευτερογενών μπορεί να συνδέεται με ανεπιθύμητα οργανοληπτικά χαρακτηριστικά

25 Απομόνωση ολεοκανθάλης από ένα κακό λάδι...

26 NMR screening of Greek olive oils Classification by harvesting year based on 1 H-NMR spectra* of 278 Greek olive oils * all with multiple signal suppression and 13 C-decoupling

27 NMR screening of Greek olive oils Differentiation of geographical origin based on 1 H-NMR spectra of 249 Greek olive oils despite the small number of samples, group assignment is significantly away from random il profiles of Euboea and Ionian Islands samples similar to that of Peloponnese samples

28 Πρόβλημα Νο2 Η Ανάλυση...

29 Ανάλυση & Ελεγχος Ποιότητας Δύο άξονες Ποιοτικός προσδιορισμός του φαινολικού προφίλ (σε λάδι, καρπούς, πάστα, φύλλα, απόβλητα, βλαστούς κλπ) και γρήγορος προσδιορισμός όσο το δυνατό μεγαλύτερου αριθμού δευτερογενών μεταβολιτών. Ασφαλείς ποσοτικοί προσδιορισμοί επιλεγμένων συστατικών.

30 Αναλυτικές πλατφόρμες 1 HPTLC system, (CAMAG) 3 HPLC-DAD devices (ThermoFinnigan) 1 HPLC-ELSD devices (ThermoFinnigan) 1 HPLC-RI devices (ThermoFinnigan) 3 GC-MS, 1 GC-FID, 1 GC-MS/MS EI CI (CH 4, NH 3 ) 1 LC-MS (Q -MSQ Plus /ThermoFinnigan) 1 UHPLC LTQ-rbitrap (ThermoFinnigan) ESI APCI APPI 1 UPLC-DAD-FLD (Acuity - Waters) 1 SFC-DAD-MS (Waters) live parts rgans Products and By-products

31 mau mau 1800 Detector 1-235nm Ανάπτυξη μεθολολογίας σε σύστημα HPLC-DAD (IC accepted methodology) leacein leocanthal Minutes ther typical oil phenyl-secoiridoids

32 Sample preparation Γρήγορες & αξιόπιστες μεθοδολογίες UPLC-DAD-FLD 1) Freeze-drying 2) Extraction by sonication - defatting using Hexane - extraction of polyphenols using MeH 3) Solid Phase Extraction (Diol catriges) UPLC conditions Column: Acquity UPLC BEH C18 (2.1x50mm, 1.7 µm) Injection of 10 mg/ml solution (0,5 µl) Flow 0,700 µl/min Column temperature 50 C Solvent A: H 2 0,1%FA Solvent B: ACN 0,1% FA Time (min) A (%) B (%) , ,

33 Μια γρήγορη, μέθοδος ανάλυσης των δευτερογενών μεταβολιτών της ελιάς σε πλατφόρμα UHPLC-DAD (8min).

34 HPTLC Πολύ γρήγοροι ποιοτικοί και ποσοτικοί προσδιορισμοί Αυξημένη ακρίβεια και επαναληψιμότητα μεθόδων Ευκολη τεχνική, χαμηλού κόστους ανισαλδεύδη 365nm Method Validation

35 Πρόβλημα Νο3 Η έλλειψη πιστοποιημένων προτύπων ενώσεων και ενώσεων αναφοράς

36 Χημειοθήκη ΕΚΠΑ VisionMate SR Single Rack 2D Barcode Reader and 2D Matrix 36

37 Ενώσεις από την ελιά live parts & organs live fruits (stone & flesh) live roots (diff. varieties) live leaves live branches & bark live products Edible olives live oil live paste > 50 isolated compounds > 200 different extracts (& enriched) > 100 synthetic derivatives live by-products live Mill Waste Waters live Mill Wastes Table olive waste water

38 Η ερευνητική ομάδα Prof. Leandros Skaltsounis Dr. Maria Halabalaki Ass. Prof. Evagelos Gikas Dr. Panagiotis Stathopoulos Mrs. Maria Lalioti Mr. Periklis Kanakis Dr. Thomas Michel Mr. Nikolaos Lemonakis Mrs. Ines Khlif Ass. Prof. Nektarios Aligiannis Ass. Prof. Nikolas Fokialakis

39 THANK YU FR YUR ATTENTIN