ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ & ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Φαινοτυπική ανάλυση των κυτταρικών πληθυσμών της φυσικής και επίκτητης ανοσίας σε ασθενείς με νεφρική νόσο ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Παναγιώτα-Μαρίνα Καλαθά Βιολόγος ΠΑΤΡΑ, Ιούλιος 2015

2 ΜΕΛΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Κατσώρης Παναγιώτης Μαργιωλάκη Ειρήνη Ροσμαράκη Ελευθερία Επιβλέπουσα Ελευθερία Ροσμαράκη Λέκτορας Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστημίου Πατρών Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης (Διδακτορικής Διατριβής) από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1392, άρθρο

3 Ευχαριστίες Η παρούσα Μεταπτυχιακή εργασία με τίτλο «Φαινοτυπική ανάλυση των κυτταρικών πληθυσμών της φυσικής και επίκτητης ανοσίας σε ασθενείς με νεφρική νόσο», πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Ανοσολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών υπό την επίβλεψη της κυρίας Ροσμαράκη Ελευθερίας. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ειλικρινά και μέσα από την καρδιά μου την κυρία Ροσμαράκη καταρχάς που μου έδωσε την ευκαιρία και τη δυνατότητα να δουλέψω στον τομέα της Ανοσολογίας ο οποίος είναι ο τομέας που με ενδιαφέρει πάρα πολύ. Επιπλέον, θα ήθελα να την ευχαριστήσω για την πολύ καλή συνεργασία που είχαμε αυτά τα χρόνια, για το εξαιρετικά φιλικό περιβάλλον που επικρατούσε και για το γεγονός ότι ήταν πάντα διαθέσιμη να με βοηθήσει τόσο σε θεωρητικό όσο και σε πρακτικό επίπεδο, καθ όλη τη διάρκεια του μεταπτυχιακού και παρά τις δυσκολίες που αντιμετωπίσαμε τόσο πρακτικά όσο και οικονομικά μου προσέφερε εναλλακτικές ώστε να υπάρξει μια ομαλή πορεία στο μεταπτυχιακό. Επίσης, θα ήθελα να πω ένα μεγάλο ευχαριστώ στα άλλα δύο μέλη της τριμελούς επιτροπής, τον κύριο Κατσώρη Παναγιώτη και την κυρία Μαργιωλάκη Ειρήνη, την οποία την ευχαριστώ όχι μόνο ως μέλος της επιτροπής αλλά για ακόμα μία φορά για τη συνεργασία που είχαμε κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διπλωματικής μου εργασίας στο προπτυχιακό επίπεδο και για το ειλικρινές της ενδιαφέρον για εμένα από τότε. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κύριο Τσάκα Σωτήρη η βοήθεια του οποίου ήταν πολύ σημαντική για την πορεία των πειραμάτων, καθώς εξασφάλιζε το αίμα που απαιτούνταν για τη διεξαγωγή τους, αλλά και για τη βοήθειά του σχετικά με τη στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω και το Νεφρολογικό Τμήμα του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών για την παροχή των δειγμάτων. Θα ήταν παράλειψή μου αν δεν ευχαριστούσα την κυρία Στάμου Παναγιώτα, Μεταδιδακτορική ερευνήτρια στο Εργαστήριο μεταμόσχευσης μυελού των οστών του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, για την 2

4 πολύτιμη βοήθειά της σε διάφορες περιπτώσεις κατά τη χρήση του κυτταρομετρητή ροής. Ευχαριστώ πραγματικά, τους Κοττόρου Αναστασία, Μουστόγιαννη Άννα, Παπαϊωάννου Χαρίκλεια, Παύλου Ουρανία, Τσαρουχά Θεμιστοκλή, για τη συνεργασία, βοήθεια, παρέα και συζητήσεις που είχαμε κατά καιρούς και τους εύχομαι τα καλύτερα από καρδιάς. Κλείνοντας, θα ήθελα κυρίως να ευχαριστήσω τους γονείς μου, για την υποστήριξή τους όλον αυτό τον καιρό τόσο σε υλικό όσο και σε πνευματικό και ψυχικό επίπεδο και τη δύναμη που μου δίνουν να συνεχίζω. Η συγκεκριμένη εργασία πραγματοποιήθηκε στα πλαίσια του προγράμματος τριετούς χρηματοδότησης του Ιδρύματος Καραθεοδωρή και της Επιτροπής Ερευνών του Πανεπιστημίου Πατρών (Επιστημονική Υπεύθυνη: Ελευθερία Ροσμαράκη, Λέκτορας). Τίτλος: Ανάλυση του φαινομένου της ανοχής των φυσικών φονικών κυττάρων (Natural Killer cells) σε μοριακό και κυτταρικό επίπεδο - Κωδικός Έργου: D

5 Πίνακας περιεχομένων Περίληψη... 6 Abstract... 6 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΠΡΩΤΟ: ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Μη ειδική ή εγγενής ανοσία Ειδική ή επίκτητη ανοσία ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Προέλευση των κυττάρων Τ Λεμφοκύτταρα Ανάπτυξη των Τ λεμφοκυττάρων Δράση των Τ λεμφοκυττάρων CD4 (βοηθητικά Τ κύτταρα) CD8 (κυτταροτοξικά Τ κύτταρα - CTLs) Β λεμφοκύτταρα Προέλευση των Β λεμφοκυττάρων Υποσύνολα Β λεμφοκυττάρων Αντισώματα Ισότυποι των αντισωμάτων Λειτουργίες των αντισωμάτων Φυσικά φονικά κύτταρα (ΝΚ) Ενεργοποίηση και δράση των ΝΚ κυττάρων Υποδοχείς ενεργοποίησης των ΝΚ κυττάρων Ανασταλτικοί υποδοχείς των ΝΚ κυττάρων Φυσικά φονικά Τ κύτταρα (ΝΚ-Τ) Τύποι ΝΚ-Τ κυττάρων Ενεργοποίηση και δράση NK-T κυττάρων ΟΙ ΝΕΦΡΟΙ ΚΑΙ ΟΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΟΥΣ Δομή των νεφρών Οι λειτουργίες των νεφρών Διαταραχές της νεφρικής λειτουργίας Χρόνια νεφρική νόσος

6 Σπειραματονεφρίτιδα ΣΧΕΣΗ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΜΕ ΤΙΣ ΝΕΦΡΟΠΑΘΕΙΕΣ Ο ρόλος των κυττάρων ΣΚΟΠΟΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ΥΠΑΡΧΟΥΣΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΔΕΥΤΕΡΟ: ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΟΝΟΠΥΡΗΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ (PBMCs) Υλικά Πειραματική πορεία ΜΕΤΡΗΣΗ ΑΡΙΘΜΟΥ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΟ ΑΙΜΟΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΟ ΣΗΜΑΝΣΗ ΜΕ ΤΑ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ (ΧΡΩΣΗ, STAINING), ΓΙΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΝΚ, ΝΚ-Τ ΚΑΙ Τ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Υλικά Πειραματική πορεία ΣΗΜΑΝΣΗ ΜΕ ΤΑ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΓΙΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ CD4T, CD8 T ΚΑΙ B ΚΥΤΤΑΡΩΝ Υλικά Πειραματική πορεία ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΤΡΙΤΟ: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΟΣΟΣΤΑ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΙΚΩΝ ΤΥΠΩΝ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΤΕΤΑΡΤΟ: ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΕΣ ΠΗΓΕΣ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το περιεχόμενο της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας αφορά τη μελέτη των ποσοστών των λεμφοκυτταρικών πληθυσμών σε μορφές της νεφρικής νόσου. Πιο συγκεκριμένα στη σπειραματονεφρίτιδα, η οποία θεωρείται αρχικό στάδιο της νόσου και της μεταμόσχευση (τελικό στάδιο). Τα κύτταρα τα οποία μελετήθηκαν είναι τα Τ λεμφοκύτταρα, τα βοηθητικά CD4 + Τ και κυτταροτοξικά CD8 + Τ κύτταρα, τα φυσικά φονικά κύτταρα ΝΚ, τα ΝΚ dim και NK bright, τα ΝΚ-Τ και τα Β λεμφοκύτταρα. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων έγινε απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων από δείγματα περιφερικού αίματος από τις παραπάνω ομάδες ασθενών, καθώς και από φυσιολογικά δείγματα (control). Στη συνέχεια, η χρώση με τα κατάλληλα αντισώματα κατέστησε τα προς μελέτη κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος ανιχνεύσιμα από τον κυτταρομετρητή ροής. Ως αποτέλεσμα, ήταν δυνατός ο προσδιορισμός των ποσοστών των κυττάρων. Τέλος, έγινε στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων. ABSTRACT The content of this Master thesis has to do with the study of the percentages of lymphocyte populations in renal disease. In particular in glomerulonephritis which is considered to be an initial stage of renal disease and in transplantation (final stage). The cells we studied are Τ lymphocytes, helper CD4 + Τ and cytotoxic CD8 + Τ cells, natural killer cells ΝΚ, ΝΚ dim and NK bright, ΝΚ-Τ and Β lymphocytes. During experiments, mononuclear cells were isolated from peripheral blood samples of these two patient groups as well as from control samples. Then, staining using the appropriate antibodies made the studied cells of the immune system detectable by the flow cytometer. As a result, the determination of the cell percentages was possible. In the end, statistical analysis was performed for all the results. 6

8 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΠΡΩΤΟ: ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1. ΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Η Ανοσολογία είναι η μελέτη της άμυνας του οργανισμού ενάντια στη μόλυνση. Ζούμε περιτριγυρισμένοι από μικροοργανισμούς, πολλοί από τους οποίους προκαλούν ασθένειες, αλλά παρά τη συνεχή έκθεση ασθενούμε σπάνια. Η απόδειξη πως οι μολυσματικές ασθένειες προκαλούνται από μικροοργανισμούς καθένας από τους οποίους είναι υπεύθυνος για διαφορετική ασθένεια, έγινε στα τέλη του 19 ου αιώνα από τον Robert Koch. Πλέον αναγνωρίζουμε τέσσερεις ευρείες κατηγορίες αυτών των μικροοργανισμών, ή παθογόνων: τους ιούς, τα βακτήρια, τους μύκητες και τους μονοκύτταρους και πολυκύτταρους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, συνολικά γνωστούς ως παράσιτα. Στις αρχές της δεκαετίας του 1890, οι Emil von Behring και Shibasaburo Kitasato ανακάλυψαν πως ο ορός από ζώα που είχαν ανοσία στη διφθερίτιδα ή τον τέτανο περιείχε μια συγκεκριμένη αντιτοξική δραστηριότητα η οποία μπορούσε να παρέχει μικρής διάρκειας προστασία ενάντια στις επιπτώσεις των τοξινών τους, στους ανθρώπους. Αυτή η δραστηριότητα οφειλόταν σε πρωτεΐνες, γνωστές σήμερα ως αντισώματα. Οι αποκρίσεις του οργανισμού εναντίον μολύνσεων από δυνητικά παθογόνα είναι γνωστές ως ανοσολογικές αποκρίσεις (Murphy, 2012). Η είσοδος ενός παθογόνου σε ένα οργανισμό δε σημαίνει αυτόματα και ασθένεια του παρασιτούμενου οργανισμού. Αυτό συμβαίνει γιατί τα σπονδυλωτά έχουν αναπτύξει ανοσία έναντι των παθογόνων εισβολέων. Οι αμυντικοί μηχανισμοί των σπονδυλωτών, γνωστοί και ως ανοσοποιητικό σύστημα, φαίνεται επίσης ότι συμμετέχουν στην προσπάθεια του οργανισμού να απομακρύνει γερασμένα κύτταρα ή κύτταρα που έχουν υποστεί κάποια βλάβη, καθώς και να καταστρέφει τα καρκινικά κύτταρα. Μερικές φορές στρέφεται εναντίον των ιστών του ίδιου οργανισμού. Το ανοσοποιητικό σύστημα αναγνωρίζει και καταστρέφει τους ξένους εισβολείς και τις τοξικές ουσίες με μια διαδικασία γνωστή ως ανοσοαπόκριση. Το μόριο που προκαλεί 7

9 την ανοσοαπόκριση καλείται αντιγόνο. Η αντιμετώπιση των παθογόνων πραγματοποιείται με δύο γραμμές άμυνας, τη μη ειδική ή εγγενή (innate immunity) και την ειδική ή επίκτητη (adaptive immunity) (Εικόνα 1) (Μαρμάρας και Λαμπροπούλου, 2005). Εικόνα 1: Μηχανισμοί ειδικής και μη ειδικής άμυνας (Μαρμάρας και Λαμπροπούλου, 2005). Στην ειδική ανοσολογική απόκριση, τα λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνται και δημιουργούν ισχυρές για το παθογόνο αποκρίσεις (αντισώματα και κυτταροτοξικά Τ κύτταρα). Η μη ειδική ανοσολογική απόκριση είναι εξελικτικά παλαιότερη και εξυπηρετεί ως πρώτη γραμμή άμυνας των οργανισμών, παρέχοντας μια άμεση προστατευτική απόκριση ενάντια στη μόλυνση και βοηθώντας στην εκκίνηση της ειδικής άμυνας (Hwang & McKenzie, 2013) Μη ειδική ή εγγενής ανοσία Η μη ειδική ανοσία είναι η πρώτη γραμμή άμυνας ενάντια στη μόλυνση από εξωτερικούς παράγοντες ή στη βλάβη κάποιου ιστού που προκαλείται 8

10 από τον ίδιο τον οργανισμό. Τα κύτταρα και τα μόριά της ενεργοποιούνται γρήγορα από την επαφή με μικρόβια ή άλλα «σήματα κινδύνου», με την ταχύτητα αυτής της απόκρισης να είναι πολύ σημαντική λόγω του μικρού χρόνου διπλασιασμού των περισσότερων βακτηρίων (Hwang & McKenzie, 2013). Σε πρώτη φάση, υπάρχουν οι φυσικοί φραγμοί στους οποίους συμπεριλαμβάνονται το δέρμα και οι βλεννογόνοι, που εμποδίζουν την είσοδο στα περισσότερα παθογόνα, τα διάφορα αντιμικροβιακά εκκρίματα, όπως είναι η λυσοζύμη στα δάκρυα, τον ιδρώτα και το σάλιο, τα γαστρικά υγρά που καταστρέφουν πολλούς παθογόνους μικροοργανισμούς εξαιτίας του όξινου περιβάλλοντος και η φυσιολογική χλωρίδα που ανταγωνίζεται τους παθογόνους μικροοργανισμούς για την πρόσληψη τροφής και έτσι τους κρατά υπό έλεγχο. Όταν όμως οι φυσικοί φραγμοί παραβιαστούν, όπως στην περίπτωση τραυματισμού, τότε ενεργοποιούνται τα άλλα συστήματα άμυνας (Μαρμάρας και Λαμπροπούλου, 2005). Στα συστατικά του εγγενούς ανοσοποιητικού συστήματος περιλαμβάνονται διαλυτά μόρια αναγνώρισης, όπως είναι τα φυσικά αντισώματα, πενταξίνες (π.χ. C-reactive protein, C αντιδρώσα πρωτεΐνη) και το σύστημα του συμπληρώματος (complement system). Τα κυτταρικά συστατικά συνίστανται από φαγοκυτταρικά κύτταρα (macrophages, μακροφάγα), αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (dendritic cells, δενδριτικά κύτταρα) και κύτταρα που σκοτώνουν (Natural Killer cells, φυσικά φονικά κύτταρα). Επιπλέον, υποσύνολα Τ και Β κυττάρων με περιορισμένη πολυμορφία του αντιγονικού τους υποδοχέα συμμετέχουν στην εγγενή ανοσία (π.χ. ink-t, γδτ και Β-1 Β κύτταρα) (Hato & Dagher, 2014). Στα λευκοκύτταρα που συνιστούν τη μη ειδική ανοσία περιλαμβάνονται επίσης και τα ιστιοκύτταρα (mast cells), τα εωσινόφιλα κοκκιοκύτταρα (eosinophil granulocytes) και τα βασεόφιλα (basophil granulocytes). Όλα τα παραπάνω λευκά αιμοσφαίρια συνεργάζονται για την καταπολέμηση των μολυσματικών παραγόντων εκκρίνοντας κυτταροκίνες, χυμοκίνες και αντιμικροβιακές ουσίες, κάτι που οδηγεί στη φλεγμονή, τη φαγοκυττάρωση των μικροοργανισμών και των μολυσμένων κυττάρων, την επεξεργασία και παρουσίαση των αντιγόνων και τελικά την ενεργοποίηση της ειδικής ανοσίας (Hwang & McKenzie, 2013). 9

11 Ο κύριος σκοπός του εγγενούς ανοσοποιητικού συστήματος είναι να παρέχει γρήγορη εποπτεία της κατάστασης του οργανισμού, χρησιμοποιώντας κωδικοποιημένες από τη γαμετική σειρά πρωτεΐνες, οι οποίες καλούνται υποδοχείς ανίχνευσης μοτίβων (pattern recognition receptors, PRRs). Αυτές λειτουργούν αναγνωρίζοντας κάποια σήματα κινδύνου και κατόπιν εκκινώντας κατάλληλη εγγενή ανοσολογική απόκριση. Αυτά τα σήματα μπορούν να προκύψουν τόσο από ξένα παθογόνα όσο και από ενδογενείς πηγές όπως είναι τα κύτταρα που υποβάλλονται σε λύση. Οι PRRs περιλαμβάνουν τέσσερεις κύριες οικογένειες πρωτεϊνών, κάποιες προσδεδεμένες στην πλασματική μεμβράνη και άλλες ως διαλυτές κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες, οι οποίες αναγνωρίζουν μόρια (ή μοριακά μοτίβα) σχετιζόμενα με μικρόβια τα αποκαλούμενα PAMPs (pathogenassociated molecular patterns). Η ενεργοποίηση των PRRs με την πρόσδεση στα PAMPs αποτελεί την έναρξη για ενδοκυτταρικά σηματοδοτικά μονοπάτια και αλλαγμένα πρότυπα έκφρασης γονιδίων, τα οποία οδηγούν σε μια πρώτη γραμμή άμυνας ενάντια στους εισβάλλοντες μικροοργανισμούς, καθώς επίσης και προώθηση της ενεργοποίησης και ωρίμανσης (πιο αργά, σε ημέρες έως εβδομάδες) της επίκτητης ανοσολογικής απόκρισης. Με αυτή την αλληλεπίδραση, τα κύτταρα της εγγενούς ανοσίας αποκρίνονται παράγοντας φλεγμονώδεις κυτταροκίνες και χυμοκίνες οι οποίες προκαλούν απόκριση από άλλους τύπους κυττάρων. Με βάση τα δομικά χαρακτηριστικά και τον τύπο του PAMP που αναγνωρίζουν, οι PRRs διακρίνονται σε: Toll-like υποδοχείς (Toll-like receptors, TLRs), υποδοχείς λεκτίνης τύπου C (C-type lectin receptors, CLRs), υποδοχείς NOD-like (NOD-like receptors, NLRs) και υποδοχείς RIGlike ελικάσης (RIG-like helicase receptors RLRs). Μία από τις μεγαλύτερες οικογένειες είναι αυτή των TLRs (Εικόνα 2), οι οποίοι αναγνωρίζουν πεπτιδογλυκάνες βακτηρίων (bacterial peptidoglycan, PGN), λιποπρωτεΐνες, λιποπολυσακχαρίτες (lipopolysaccharides, LPS), ουσίες μυκοβακτηρίων (lipoarabinomannan) και ζύμης (zymosan), βακτηριακή φλαγγελίνη καθώς και παθολογικά προερχόμενα νουκλεϊκά οξέα και έχουν αναφερθεί 10 TLRs στον άνθρωπο και 13 στα ποντίκια. Είναι τύπου Ι ενσωματωμένες στη μεμβράνη γλυκοπρωτεΐνες και βρίσκονται είτε στην εξωτερική κυτταρική μεμβράνη (TLR1, 2, 4, 5, 6, 10, 11, 12) είτε στις ενδοσωμικές μεμβράνες, με την 10

12 εξωτερική περιοχή τους να βρίσκεται στο εσωτερικό τμήμα του ενδοσώματος (TLR3, 7, 8, 9, 13). Αποτέλεσμα των αλληλεπιδράσεων με PAMPs είναι η ενεργοποίηση μεταγραφικών παραγόντων όπως ο NFkB και/ή μελών της οικογένειας των ρυθμιζόμενων από ιντερφερόνη παραγόντων (interferonregulated factors, IRFs), οι οποίοι με τη σειρά τους οδηγούν σε αλλαγμένα πρότυπα έκφρασης των γονιδίων (Robinson & Moehle, 2014). Εικόνα 2: Όταν τα PAMPs προσδένονται στην εξωτερική επικράτεια του TLR, τότε μεταφέρονται σήματα μέσα στο κύτταρο μέσω των ενδοκυτταρικών επικρατειών (TIR domains), τα οποία προσδένονται και ενεργοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες (NFkB, IRFs). Οι μεταγραφικοί παράγοντες προωθούν την έκφραση πολυάριθμων γονιδίων τα οποία αλλάζουν την κατάσταση ενεργοποίησης του κυττάρου όπως επίσης και τις φλεγμονώδεις κυτταροκίνες και χυμοκίνες που εξέρχονται και αποτελούν σήμα για άλλα κύτταρα (προσαρμογή από Robinson & Moehle, 2014). 11

13 1.2. Ειδική ή επίκτητη ανοσία Αν και το εγγενές ανοσοποιητικό σύστημα έχει εξελιχθεί να αναγνωρίζει και να εκτελεί γρήγορα την απαλοιφή ενός ευρέος φάσματος παθογόνων, ο αριθμός των κοινών παθογόνων μοριακών μοτίβων που μπορεί να αναγνωρίσει είναι περιορισμένος. Η εντυπωσιακή μεταβλητότητα των αντιγονικών δομών, όπως επίσης και η ικανότητα των παθογόνων να μεταλλάσσονται ώστε να αποφεύγουν την ανίχνευσή τους από τον ξενιστή, οδήγησαν στην εξέλιξη της επίκτητης ανοσίας (Bonilla & Oettgen, 2010). Η δράση της βασίζεται στα Τ και Β κύτταρα, τα οποία είναι τύποι λευκών αιμοσφαιρίων και καλούνται λεμφοκύτταρα (Reece et al., 2011). Η επίκτητη ανοσολογική απόκριση σχετίζεται κυρίως με τη δημιουργία ποικιλομορφίας στους υποδοχείς των Τ κυττάρων (T-cell receptor, TCR) και Β κυττάρων (B-cell receptor, BCR). Επιτυγχάνει δύο στόχους τους οποίους δεν πληροί το εγγενές ανοσοποιητικό: τη δημιουργία ενός ρεπερτορίου υποδοχέων πολύ πιο ποικιλόμορφου σε σχέση με αυτό των PRRs και την ενίσχυση συγκεκριμένων κυτταρικών πληθυσμών ειδικών για το παθογόνο σαν αποτέλεσμα της έκθεσης σε αυτό (δηλαδή τη δημιουργία συγκεκριμένης ανοσολογικής μνήμης). Αν και η λειτουργία της εγγενούς ανοσίας βασίζεται σε μόρια που κωδικοποιούνται από τη γαμετική σειρά, η επίκτητη ανοσολογική απόκριση προκύπτει από σωματικές μεταλλάξεις στα γονίδια των TCR και BCR, που συμβαίνουν κατά την ανάπτυξη των Β και Τ λεμφοκυττάρων. Αυτή η διαδικασία οδηγεί σε μια αξιοσημείωτη ποικιλομορφία και ενίσχυση του ρεπερτορίου των μορίων που αναγνωρίζουν συγκεκριμένα παθογόνα (Powell et al., 2013). Τα Β και τα Τ λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν αντιγόνα χρησιμοποιώντας τους υποδοχείς τους που βρίσκονται στην πλασματική μεμβράνη. Ένα μοναδικό Β ή Τ λεμφοκύτταρο έχει περίπου από αυτούς τους αντιγονικούς υποδοχείς στην επιφάνειά του. Τα Β κύτταρα δίνουν γένεση στα πλασματοκύτταρα τα οποία εκκρίνουν μια διαλυτή μορφή του υποδοχέα. Αυτή η εκκρινόμενη πρωτεΐνη καλείται αντίσωμα (antibody, Ab) ή ανοσοσφαιρίνη (immunoglobulin, Ig). Οι αντιγονικοί υποδοχείς και τα αντισώματα αναγνωρίζουν μόνο ένα μικρό προσβάσιμο τμήμα του αντιγόνου, τον επίτοπο. Ένα αντιγόνο συνήθως 12

14 έχει αρκετούς διαφορετικούς επιτόπους, κάθε ένας ικανός να επάγει απόκριση από ένα λεμφοκύτταρο που τον αναγνωρίζει. Όλοι οι αντιγονικοί υποδοχείς σε ένα λεμφοκύτταρο είναι πανομοιότυποι κι έτσι αναγνωρίζουν τον ίδιο επίτοπο. Κάθε λεμφοκύτταρο του οργανισμού εκφράζει επομένως εξειδίκευση για έναν συγκεκριμένο επίτοπο, προστατεύοντας από το παθογόνο το οποίο εκφράζει μόρια που τον περιέχουν (Campbell et al., 2008). Υπάρχουν δύο τύποι επίκτητης ανοσίας, η χυμική και η κυτταρική. Η χυμική εκτελείται με τη μεσολάβηση αντισωμάτων τα οποία παράγονται από τα Β κύτταρα και αποτελεί το βασικό αμυντικό μηχανισμό ενάντια σε εξωκυτταρικά μικρόβια και τις τοξίνες τους, με τα εκκρινόμενα αντισώματα να προσδένονται σε αυτά επάγοντας την εξάλειψή τους. Η κυτταρική ανοσία πραγματοποιείται με τη βοήθεια των Τ κυττάρων με τα δενδριτικά κύτταρα να παίζουν σημαντικό ρόλο στην αντιγονοπαρουσίαση (Εικόνα 3) (Rabb, 2002). Εικόνα 3: Οι δύο κλάδοι της επίκτητης ανοσολογικής απόκρισης, η χυμική και η κυτταρική ανοσία (προσαρμογή από Kumar et al., 2007). 13

15 2. ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ 2.1. Προέλευση των κυττάρων Τόσο οι εγγενείς όσο και οι επίκτητες ανοσολογικές αποκρίσεις βασίζονται στις δραστηριότητες των λευκών αιμοσφαιρίων ή λευκοκυττάρων. Όλα αυτά τα κύτταρα προέρχονται από το μυελό των οστών και πολλά από αυτά επίσης αναπτύσσονται και ωριμάζουν εκεί. Αφού ωριμάσουν, μεταναστεύουν για να προστατεύσουν τους περιφερικούς ιστούς. Κάποια από αυτά μένουν μέσα σε αυτούς τους ιστούς, ενώ άλλα κινούνται στην κυκλοφορία του αίματος και σε ένα εξειδικευμένο σύστημα αγγείων, το λεμφικό σύστημα, το οποίο αποστραγγίζει εξωκυτταρικό υγρό και κύτταρα από τους ιστούς, τα μεταφέρει μέσω του σώματος ως λέμφο και τελικά τα αδειάζει πάλι πίσω στο αιμοποιητικό σύστημα. Όλα τα κυτταρικά συστατικά του αίματος, συμπεριλαμβανομένων των ερυθροκυττάρων που μεταφέρουν το οξυγόνο, των αιμοπεταλίων που είναι υπεύθυνα για την πήξη του αίματος στους κατεστραμμένους ιστούς και των λευκών αιμοσφαιρίων του ανοσοποιητικού συστήματος, προκύπτουν από αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα του μυελού των οστών. Επειδή αυτά τα βλαστικά κύτταρα μπορούν να δώσουν γένεση σε όλους τους διαφορετικούς τύπους κυττάρων του αίματος, είναι γνωστά ως πολυδύναμα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα. Αυτά δίνουν γένεση σε κύτταρα πιο περιορισμένου αναπτυξιακού δυναμικού, σε αυτά της λεμφοειδούς και της μυελοειδούς κυτταρικής σειράς, τα οποία είναι οι άμεσοι πρόγονοι των ερυθρών αιμοσφαιρίων, των αιμοπεταλίων και των δύο βασικών κατηγοριών λευκών αιμοσφαιρίων (Εικόνα 4). Ο κοινός μυελοειδής πρόγονος αποτελεί τον πρόδρομο των μακροφάγων, των κοκκιοκυττάρων, των ιστιοκυττάρων και των δενδριτικών κυττάρων της εγγενούς ανοσολογικής απόκρισης και επίσης των μεγακαρυοκυττάρων και των ερυθροκυττάρων. Αντίθετα, ο κοινός λεμφοειδής πρόγονος θα δώσει τα λεμφοκύτταρα της επίκτητης ανοσίας, με την ικανότητα να αναγνωρίζουν ένα συγκεκριμένο αντιγόνο, αλλά και τα φυσικά φονικά 14

16 κύτταρα (ΝΚ) τα οποία είναι λεμφοκύτταρα αλλά χωρίς την ικανότητα να αναγνωρίζουν ένα συγκεκριμένο αντιγόνο (Murphy, 2012). Εικόνα 4: Αιμοποίηση: η διαφοροποίηση των πολυδύναμων κυττάρων. ( Τ Λεμφοκύτταρα Τα Τ λεμφοκύτταρα συνιστούν το 60% με 70% των λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα και είναι τα κύτταρα-τελεστές της κυτταρικής ανοσίας και τα βοηθητικά για τις αποκρίσεις με αντίσωμα σε πρωτεϊνικά αντιγόνα (Kumar et al., 2013). Χαρακτηρίζονται από την έκφραση στην επιφάνειά τους του TCR, 15

17 μιας διαμεμβρανικής ετεροδιμερούς πρωτεΐνης η οποία προσδένει επεξεργασμένο αντιγόνο εκτεθειμένο από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (antigen-presenting cells, APCs) (Chaplin, 2010). Πιο συγκεκριμένα, ο TCR αποκρίνεται σε αντιγονικά πεπτίδια τα οποία παρουσιάζονται σε μακροφάγα μετά από φαγοκυττάρωση των παθογόνων (όπως βακτήρια) και σε πεπτίδια από κυτοσολικά παθογόνα (όπως ιοί) που παρουσιάζονται σε μολυσμένα κύτταρα (Rabb, 2002). Για ένα Τ λεμφοκύτταρο ο αντιγονικός υποδοχέας αποτελείται από δύο διαφορετικές πολυπεπτιδικές αλυσίδες, μία α αλυσίδα και μία β αλυσίδα οι οποίες συνδέονται με μία δισουλφιδική γέφυρα. Κοντά στη βάση του υποδοχέα βρίσκεται μια διαμεμβρανική περιοχή με ρόλο να αγκιστρώνει το μόριο στην πλασματική μεμβράνη του κυττάρου (Εικόνα 5α). Στο εξωτερικό άκρο του μορίου οι μεταβλητές (variable, V) περιοχές των α και β αλυσίδων μαζί, σχηματίζουν μία μοναδική θέση πρόσδεσης του αντιγόνου. Το υπόλοιπο απαρτίζεται από τις σταθερές (constant, C) περιοχές (Reece et al., 2011). Εικόνα 5: α) Η δομή του αντιγονικού υποδοχέα των Τ κυττάρων (προσαρμογή από Reece et al., 2011). β) Οι τέσσερεις αλυσίδες (ε, δ, γ, ε), οι οποίες συλλογικά καλούνται CD3, μαζί με τις ζ αλυσίδες (οι οποίες σχηματίζουν ομοδιμερές), μετάγουν το σήμα αφού γίνει η πρόσδεση του αντιγόνου (προσαρμογή από Στο Τ κύτταρο ο TCR συνδέεται με ένα σύμπλεγμα μεμβρανικών πρωτεϊνών συνολικά γνωστών ως CD3 (αποτελείται από γ-, δ-, ε- και ζ- 16

18 υπομονάδες) (Εικόνα 5β). Η κυτοσολική περιοχή αυτού του συμπλέγματος είναι υπεύθυνη για τη μεταγωγή ενός ενδοκυτταρικού σήματος επακόλουθου της πρόσδεσης του TCR στο αντιγόνο. Κάθε TCR επίσης συνδέεται είτε με έναν CD4 είτε με έναν CD8 συνυποδοχέα, κάτι που εξαρτάται από τον τύπο του Τ κυττάρου και γίνεται έτσι ένας γενικός διαχωρισμός των Τ ο οποίος αποδίδει στα CD4 κύτταρα τις βοηθητικές και στα CD8 τις κυτταροτοξικές λειτουργίες (Pennock et al., 2013) Ανάπτυξη των Τ λεμφοκυττάρων Η ανάπτυξη Τ λεμφοκυττάρων ικανών να παρέχουν ανοσία ενάντια σε ένα ευρύ σύνολο μικροβιακών και περιβαλλοντικών αντιγόνων πρέπει να είναι προσεκτικά ισορροπημένη με τη διαγραφή πιθανών αυτο-αντιδρώντων κυττάρων. Η δημιουργία αυτών των λειτουργικά ώριμων, ανθεκτικών στον εαυτό Τ κυττάρων πραγματοποιείται σε ανατομικά και λειτουργικά διακριτές περιοχές του θύμου αδένα, με την καθεμία τους να περιέχει εξειδικευμένες εσοχές οι οποίες ρυθμίζουν τα διαδοχικά στάδια της διαφοροποίησης και ωρίμανσης των θυμοκυττάρων (Halkias et al., 2014). Ο θύμος παρέχει ένα μοναδικό μικροπεριβάλλον για την ανάπτυξη και την ωρίμανση των Τ κυττάρων. Με βάση την έκφραση των CD4 και CD8, η Τ λεμφοποίηση μπορεί να διαχωριστεί χονδρικά σε τρία κύρια στάδια, δηλαδή τα διπλά αρνητικά CD4 - CD8 - (double negative, DN), διπλά θετικά CD4 + CD8 + (double positive, DP) και μονά θετικά κύτταρα CD4 + ή CD8 + (single positive, SP) (Εικόνα 6). Τα βασικά γεγονότα κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας περιλαμβάνουν την είσοδο των προγονικών λεμφικών κυττάρων από τον μυελό των οστών στο θύμο αδένα και τη διαφοροποίησή τους σε πρόδρομα Τ κύτταρα, το σχηματισμό λειτουργικών υποδοχέων TCR και τη θετική και αρνητική επιλογή ώστε να γίνει εκκαθάριση των αυτοαντιδρώντων κυττάρων. Τα SP θυμοκύτταρα στο μυελό του θύμου πρέπει να επιβιώσουν από την αρνητική επιλογή πριν την έξοδό τους. Είναι μια διαδικασία κατά την οποία τα θυμοκύτταρα με υψηλά αυτοαντιδρώντες TCR υφίστανται απόπτωση. Αυτό αποτρέπει την ωρίμανση και μετανάστευση ισχυρά αυτοαντιδρώντων Τ κυττάρων και επακόλουθα την πιθανή έναρξη αυτοάνοσης αντίδρασης στην περιφέρεια. Μετά από μία υψηλά ελεγχόμενη αναπτυξιακή διαδικασία στο 17

19 θύμο, περίπου μόνο το 1% των θυμοκυττάρων είναι ικανά να μεταναστεύσουν και να γίνουν μέρος του συνόλου των περιφερικών λεμφοκυττάρων (Xu et al., 2013). Εικόνα 6: Στάδια της ανάπτυξης των Τ λεμφοκυττάρων: αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα (hematopoietic stem cells, HSC), πολυδύναμοι πρόγονοι (multipotent progenitors, MPP), κοινοί λεμφοειδείς πρόγονοι (common lymphoid progenitors, CLPs), πρώιμοι πρόγονοι Τ κυττάρων (early T-cell precursors, ΕTP) (προσαρμογή από Litt et al., 2013) Δράση των Τ λεμφοκυττάρων Αφού τα Τ κύτταρα ολοκληρώσουν την ανάπτυξή τους στο θύμο, εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος. Με την άφιξή τους σε ένα περιφερικό λεμφικό όργανο, αφήνουν το αίμα για να μεταναστεύσουν μέσω του λεμφικού ιστού, επιστρέφοντας μέσω των λεμφαγγείων στην κυκλοφορία του αίματος, για να επανακυκλοφορήσουν μεταξύ αίματος και περιφερικών λεμφικών ιστών. Τα ώριμα επανακυκλοφορούντα Τ κύτταρα τα οποία δεν έχουν ακόμα συναντήσει τα ειδικά για αυτά αντιγόνα είναι γνωστά ως αθώα Τ 18

20 κύτταρα (naïve T cells). Για να συμμετάσχει σε μία ειδική ανοσολογική απόκριση, ένα αθώο Τ κύτταρο πρέπει να συναντήσει το ειδικό του αντιγόνο το οποίο του παρουσιάζεται ως ένα σύμπλοκο πεπτιδίου-mhc (Major Histocompatibility Complex, μείζον σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας) στην επιφάνεια ενός αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου. Τα μόρια του MHC είναι ένα σύνολο γλυκοπρωτεϊνών που εκφράζονται σχεδόν σε κάθε κύτταρο του σώματος και διακρίνονται σε δύο κύριες τάξεις. Τα μόρια της τάξης Ι εκφράζονται στα περισσότερα από τα κύτταρα του σώματος (εκτός από τα ερυθρά αιμοσφαίρια), ενώ τα μόρια της τάξης ΙΙ έχουν μια πολύ πιο περιορισμένη κατανομή (Murphy, 2012) και βρίσκονται στα δενδριτικά, τα φαγοκύτταρα, μερικά ενδοθηλιακά, τα θυμικά επιθηλιακά και τα Β κύτταρα. Μεταξύ των APCs, τα δενδριτικά κύτταρα (DCs) θεωρούνται πως είναι τα πιο σημαντικά εξαιτίας της ενισχυμένης ικανότητάς τους να διεγείρουν τα αθώα T λεμφοκύτταρα και θεωρούνται κατ εξοχήν αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (Luckheeram et al., 2012). Στους περιφερικούς ιστούς, τα παθογόνα ανιχνεύονται από τα δενδριτικά κύτταρα τα οποία στη συνέχεια καθοδηγούν μια κατάλληλη πρωτογενή απόκριση των Τ κυττάρων στα δευτερογενή λεμφικά όργανα (Geginat et al., 2013). Η αναγνώριση αντιγονικών πρωτεϊνών από τα Τ κύτταρα ξεκινά όταν ένα παθογόνο ή ένα τμήμα αυτού είτε μολύνει είτε προσλαμβάνεται από ένα κύτταρο ξενιστή. Μέσα στο κύτταρο τα ένζυμα διασπούν το αντιγόνο σε μικρότερα πεπτίδια. Κάθε πεπτίδιο, αποκαλούμενο αντιγονικό θραύσμα, στη συνέχεια προσδένεται σε ένα μόριο MHC μέσα στο κύτταρο. Η κίνηση του μορίου και του προσδεδεμένου σε αυτό αντιγονικού θραύσματος προς την κυτταρική επιφάνεια έχει ως αποτέλεσμα την αντιγονική παρουσίαση, την έκθεση δηλαδή του θραύσματος του αντιγόνου σε μια αυλάκωση του μορίου του MHC. Αν αυτό το κύτταρο έρθει σε επαφή με ένα Τ λεμφοκύτταρο το οποίο έχει την κατάλληλη εξειδίκευση, ο TCR μπορεί να προσδεθεί τόσο στο αντιγονικό θραύσμα όσο και στο μόριο MHC (Reece et al., 2011). Αφού γίνει η παρουσίαση του συμπλόκου πεπτίδιο-mhc, τα αθώα Τ λεμφοκύτταρα πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται σε κύτταρα τα οποία έχουν αποκτήσει νέες δραστηριότητες συνεισφέροντας έτσι στην απομάκρυνση του αντιγόνου. Αυτά καλούνται κύτταρα-τελεστές και σε αντίθεση με τα αθώα Τ κύτταρα εκτελούν τη λειτουργία τους από τη στιγμή 19

21 που έρθουν σε επαφή με το συγκεκριμένο για αυτά αντιγόνο σε άλλα κύτταρα. Με την αναγνώριση του αντιγόνου τα αθώα Τ κύτταρα διαφοροποιούνται σε αρκετές λειτουργικές κατηγορίες κυττάρων-τελεστών, εξειδικευμένων για διαφορετικές δραστηριότητες. Τα CD8 + T κύτταρα αναγνωρίζουν πεπτίδια παθογόνων παρουσιαζόμενα από μόρια της τάξης Ι του MHC (Εικόνα 7) και τα αθώα CD8 + T κύτταρα διαφοροποιούνται σε κυτταροτοξικά κύτταρατελεστές που αναγνωρίζουν και σκοτώνουν μολυσμένα κύτταρα (Murphy, 2012). Εικόνα 7: Η αλληλεπίδραση των Τ κυττάρων με τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. (α) Τα μόρια της τάξης Ι του MHC εκθέτουν θραύσματα των αντιγόνων στα κυτταροτοξικά Τ κύτταρα. (β) Τα μόρια της τάξης ΙΙ του MHC εκθέτουν θραύσματα των αντιγόνων τόσο στα κυτταροτοξικά όσο και στα βοηθητικά Τ κύτταρα. Και στις δύο περιπτώσεις ο TCR προσδένεται με ένα σύμπλοκο μορίου MHC-αντιγονικού θραύσματος. Τα μόρια της τάξης Ι συντίθενται στα περισσότερα εμπύρηνα κύτταρα, ενώ αυτά της τάξης ΙΙ κυρίως στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (μακροφάγα, δενδριτικά και Β κύτταρα) (προσαρμογή από Campbell et al., 2008). Τα CD4 + T κύτταρα έχουν ένα πιο ευέλικτο ρεπερτόριο εκτελεστικών διαδικασιών. Μετά την αναγνώριση των παθογόνων πεπτιδίων που παρουσιάζονται σε αυτά από τα μόρια της τάξης ΙΙ του MHC, τα αθώα CD4 + T κύτταρα μπορούν να διαφοροποιηθούν (Εικόνα 8) σε διακριτά μονοπάτια τα 20

22 οποία δημιουργούν υποσύνολα κυττάρων-τελεστών με διαφορετικές ανοσολογικές λειτουργίες (Murphy, 2012). Εικόνα 8: Διαφοροποίηση Τ κυττάρων. Επάνω: Αναγνώριση από APC (δενδριτικό κύτταρο) ενός φάσματος παθογόνων μέσω ειδικών υποδοχέων με αποτέλεσμα την απελευθέρωση κυτταροκινών από το APC. Παράλληλα με τη δέσμευση του TCR, οι κυτταροκίνες του περιβάλλοντος (μέση) εκκινούν τη διαφοροποίηση σε κάποια από τις κατηγορίες των Τ κυττάρων, διαδικασία προγραμματισμένη από μεταγραφικούς παράγοντες για την ειδική απόκριση στο φάσμα των παθογόνων (στην εικόνα υπάρχει συντονισμός χρώματος παθογόνου και Τh υποσυνόλου). Με τη διαφοροποίηση, τα Τ κύτταρα παράγουν κυτταροκίνες οι οποίες ανατροφοδοτούν το κυτταρικό περιβάλλον ενισχύοντας και εξισορροπώντας την ανοσοαπόκριση ώστε να προωθήσουν την εκκαθάριση του παθογόνου και την επιβίωση του ξενιστή. Υπερβολική έκφραση ανοσολογικής απόκρισης από τις υποκατηγορίες των Τ κυττάρων οδηγεί σε μια σειρά από ανοσοπαθολογίες, από αυτοανοσία σε αλλεργία μέχρι και καρκίνο (κάτω) (προσαρμογή από Pennock et al., 2013). 21

23 Ως απάντηση σε συγκεκριμένο περιβάλλον κυτταροκινών, τα ενεργοποιημένα από αντιγόνο Τ κύτταρα είναι γενετικά προγραμματισμένα να διαφοροποιηθούν σε μια ποικιλία πιθανών υποσυνόλων τα οποία διαθέτουν εκτελεστικούς μηχανισμούς κατάλληλους για την απαλοιφή των παθογόνων. Έτσι, οι αποκρίσεις των βοηθητικών CD4 + T κυττάρων κατηγοριοποιούνται σε Τ βοηθητικά υποσύνολα (T helper, Th) με βασικότερα τα Th1, Th2, Th17, Th9, Tfh και Tregs. Τα υποσύνολα Th1 και Th2 ονομάστηκαν έτσι γιατί ήταν τα δύο πρώτα που ανακαλύφθηκαν. Τα τελευταία χρόνια ακολουθείται ένας τρόπος ονομασίας βασιζόμενος στο προφίλ των παραγόμενων κυτταροκινών (Th9, Th17) ή της βιολογικής σημασίας (Tfh-θυλακικά και Τregs-ρυθμιστικά) (Pennock et al., 2013). Άπαξ και γίνει η απαλοιφή του παθογόνου η πλειοψηφία των ενεργοποιημένων κυττάρων-τελεστών πεθαίνει, αλλά κάποια από αυτά επιβιώνουν και γίνονται μακρόβια Τ κύτταρα μνήμης τα οποία μπορούν να μεσολαβήσουν στην προστασία έναντι δευτερογενών μολύνσεων. Κάποια από τα επιζώντα Τ κύτταρα μένουν ως κύτταρα μνήμης σε μη λεμφικούς ιστούς και μπορούν να ξεκινήσουν άμεσες αποκρίσεις κατά τις δευτερογενείς μολύνσεις, ενώ άλλα συνεχώς κυκλοφορούν μεταξύ αίματος και δευτερογενών λεμφικών οργάνων. Τα Τ κύτταρα μνήμης μπορούν να καταπολεμήσουν το ίδιο παθογόνο πιο γρήγορα και αποτελεσματικά μετά από την επαναμόλυνση, καθώς μεταναστεύουν γρήγορα στο μολυσμένο ιστό και παράγουν τις κατάλληλες κυτταροκίνες (Geginat et al., 2013) CD4 (βοηθητικά Τ κύτταρα) Τα CD4 + T κύτταρα παίζουν ένα κεντρικό ρόλο στην προστασία του ανοσοποιητικού συστήματος. Αυτό το επιτυγχάνουν μέσω της ικανότητάς τους να βοηθούν τα Β κύτταρα στην παραγωγή αντισωμάτων, να επάγουν τα μακροφάγα να αναπτύσσουν ενισχυμένη μικροβιοκτόνα δράση, να προσελκύουν ουδετερόφιλα, εωσινόφιλα και βασεόφιλα στις περιοχές μόλυνσης και φλεγμονής και μέσω της παραγωγής κυτταροκινών και χυμοκινών, να ενορχηστρώνουν ολόκληρο το οπλοστάσιο των ανοσοαποκρίσεων (Zhu & Paul, 2008). Με την έκκριση κατάλληλων κυτταροκινών και την έκφραση μιας ποικιλίας συνδιεγερτικών μορίων, τα 22

24 CD4 + T κύτταρα είναι απαραίτητα για τη δημιουργία υψηλής συγγένειας αποκρίσεων σε παθογόνα και το σχηματισμό μακρόβιων πλασματοκυττάρων και Β κυττάρων μνήμης. Επίσης χρειάζονται στη δημιουργία CD8 + T κυττάρων μνήμης τα οποία έχουν την ικανότητα να πληθαίνουν κατά τη δεύτερη έκθεση στο αντιγόνο (Magombedze et al., 2013). Στην εικόνα 9 φαίνεται ο ρόλος και η δράση γενικά των βοηθητικών CD4 + T κυττάρων τόσο στη χυμική όσο και την κυτταρική ανοσία. Εικόνα 9: Ο κεντρικός ρόλος των βοηθητικών Τ κυττάρων στη χυμική και την κυτταρική ανοσολογική απόκριση. Σε αυτό το παράδειγμα ένα βοηθητικό Τ κύτταρο απαντά σε ένα δενδριτικό κύτταρο το οποίο εκθέτει ένα μικροβιακό αντιγόνο (προσαρμογή από Reece et al., 2011). Τα CD4 + T κύτταρα των ενηλίκων είναι ένας πολύ ετερογενής πληθυσμός, καθώς έχουν δημιουργηθεί ως απόκριση σε ένα μεγάλο αριθμό διαφορετικών παθογόνων και ανήκουν σε ένα προοδευτικά αυξανόμενο σύνολο υποομάδων με εξειδικευμένες λειτουργίες. Όπως αναφέρθηκε και πιο πάνω, υπάρχουν πέντε κύριες υποκατηγορίες οι Th1, Th2, Th17, Τregs και Τfh (Geginat et al., 2014). Τα Th1 (T helper 1) εμπλέκονται στην απαλοιφή ενδοκυτταρικών παθογόνων και σχετίζονται με την αυτοανοσία συγκεκριμένων οργάνων. Παράγονται υπό την παρουσία IL-12 και κυρίως εκκρίνουν IFN-γ (Interferon-γ, 23

25 ιντερφερόνη γ), LT-a (Lymphotoxin-alpha, λεμφοτοξίνη α) και IL-2 (Interleukin 2, ιντερλευκίνη 2) (Εικόνα 8). Η IFN-γ είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση μονοπύρηνων φαγοκυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των μακροφάγων και των κυττάρων της μικρογλοίας, ενισχύοντας έτσι την φαγοκυτταρική δραστηριότητα. Επίσης προωθεί την παραγωγή IL-12 από τα DCs ανατροφοδοτώντας θετικά την παραγωγή Th1. Η LT-a είναι μέλος της υπεροικογένειας του TNF (Tumor necrosis factor, παράγοντας νέκρωσης όγκων) και σχετίζεται με τις αυτοάνοσες ασθένειες. Η IL-2 προωθεί τον πολλαπλασιασμό των CD8 + T κυττάρων και την ανάπτυξη CD8 + κυττάρων μνήμης (Luckheeram et al., 2012; Geginat et al., 2013). Τα Th2 (T helper 2) παράγονται υπό την παρουσία IL-4, επάγουν την άμυνα του οργανισμού έναντι εξωκυτταρικών παρασίτων στα οποία περιλαμβάνονται και οι έλμινθες και παίζουν σημαντικό ρόλο στην πρόκληση και παραμονή του άσθματος καθώς και άλλων αλλεργικών ασθενειών. Τα κύτταρα αυτά παράγουν IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13, IL-25 και αμφιρεγκιουλίνη (amphiregulin) (Εικόνα 8). Η IL-4 είναι η κυτταροκίνη θετικής ανατροφοδότησης για τη διαφοροποίηση των Th2 και για παραγωγή IgE από τα Β κύτταρα. Η IL-5 προσελκύει εωσινόφιλα και η IL-9 συμμετέχει ενεργά στην ανοσοπαθογένεια του άσθματος και ενεργοποιεί τη λειτουργία αρκετών κυττάρων (ιστιοκύτταρα, Β, εωσινόφιλα, ουδετερόφιλα) καθώς και τα επιθηλιακά κύτταρα του αεραγωγού. Η IL-13 καταπολεμά γαστροεντερικούς έλμινθες, έχει ρόλο στην επαγωγή αλλεργικού άσθματος και πιθανή συμμετοχή στην πρόκληση ινώσεων στους ιστούς με φλεγμονή. Η IL-10 είναι μια αντιφλεγμονώδης κυτταροκίνη με την ικανότητα να καταστέλλει τη δράση των DCs. H IL-25 ενισχύει την παραγωγή IL-4, IL-5 και IL-13 και παράγεται από τα επιθηλιακά κύτταρα των πνευμόνων ως απόκριση στα αλλεργιογόνα. Τέλος, η αμφιρεγκιουλίνη είναι μέλος της οικογένειας EGF (epidermal growth factor, επιδερμικοί αυξητικοί παράγοντες) και επάγει τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων (Zhu & Paul, 2008; Luckheeram et al., 2012; Geginat et al., 2013). Τα Th17 (T helper 17) είναι υπεύθυνα για την ανοσολογική απόκριση ενάντια σε εξωκυτταρικά βακτήρια και μύκητες. Επίσης εμπλέκονται στη δημιουργία αυτοάνοσων ασθενειών. Οι κυτταροκίνες που παράγουν είναι οι IL-17A, IL-17F, IL-2 και IL-22. Η IL-17 οδηγεί στην επαγωγή 24

26 προφλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-6, IL-1 και TNFα) και χυμοκινών. Η IL-21 ενισχύει την παραγωγή των Th17, ενεργοποιεί τα Τ κύτταρα, προκαλεί τα Β κύτταρα να διαφοροποιηθούν σε πλασματοκύτταρα και κύτταρα μνήμης και ενεργοποιεί τα ΝΚ κύτταρα. Η IL-22 συμμετέχει στην άμυνα έναντι βακτηρίων στο βλεννογόνο επάγοντας αντιμικροβιακά πεπτίδια και αυξάνοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Luckheeram et al., 2012). Τα θυλακιακά, Τfh (follicular helper), CD4 + T βοηθητικά κύτταρα είναι οι εξειδικευμένοι πάροχοι βοήθειας στα Β λεμφοκύτταρα. Μεταξύ άλλων μορίων εκφράζουν CXCR5 (υποδοχέας της χυμοκίνης CXCL13), PD-1, SAP (SH2D1A), IL-21 και τα συνδιεγερτικά μόρια CD40L, ICOS (inducible costimulator) και OX40. Είναι σημαντικά για το σχηματισμό των βλαστικών κέντρων και αφού αυτά σχηματιστούν, τα Τfh είναι απαραίτητα για τη διατήρησή τους και για τη διαφοροποίηση των Β κυττάρων σε πλασματοκύτταρα και Β κύτταρα μνήμης. Τα συνδιεγερτικά μόρια που παράγουν ενισχύουν τη διαφοροποίηση των Β κυττάρων και γι αυτό το λόγο γίνεται και ο συσχετισμός των Τfh με τη διευκόλυνση παραγωγής αντισωμάτων από τα Β λεμφοκύτταρα (Crotty, 2011; Carty et al., 2013). Τα ρυθμιστικά Τ κύτταρα, (T regulatory cells, Tregs), είναι ένα υποσύνολο των CD4 + T κυττάρων και αποτελούν μεσολαβητές-κλειδιά της ανοσολογικής ανοχής (Coomes et al., 2013). Καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και την παραγωγή κυτταροκινών των ενεργοποιημένων Τ κυττάρων των οποίων οι TCRs έχουν δεσμευτεί σε σύμπλοκο πεπτιδίου-mhc (Carty et al., 2013). Για πρώτη φορά αναγνωρίστηκαν ως Τ κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του επιφανειακού μορίου CD25 και έχουν την ικανότητα της καταστολής των αυτοάνοσων αντιδράσεων. Στη συνέχεια έγινε ανίχνευση και άλλων επιφανειακών δεικτών όπως οι GITR (glucocorticoidinduced TNF receptor), CTLA4 (cytotoxic T lymphocyte antigen 4) και κυρίως ο μεταγραφικός παράγοντας Foxp3 (Forkhead box transcription factor) (Engel et al., 2013). Έχουν περιγραφεί αρκετοί πληθυσμοί Tregs, όπως τα ntreg (Foxp3 natural Treg) τα οποία αναπτύσσονται στο θύμο ως απόκριση σε αυτοαντιγόνα και τα itreg (inducible Foxp3 Treg) τα οποία αναπτύσσονται στην περιφέρεια ως απόκριση σε εξωγενή αντιγόνα και τον αυξητικό παράγοντα TGF-β. Επίσης έχουν αναγνωριστεί και κάποια Τ ρυθμιστικά που δεν εκφράζουν τον παράγοντα Foxp3 όπως τα Th3 (εκκρίνουν TGF-β), τα Τr1 25

27 (IL-10) και τα Tr35 (IL-35) (Coomes et al., 2013). Τα ρυθμιστικά κύτταρα εκφράζουν τις ανοσοκατασταλτικές τους λειτουργίες σε μια ποικιλία κυττάρων στο μικροπεριβάλλον τους, όπως τα CD4 + και CD8 +, τα DCs, τα B, τα μακροφάγα και τα ΝΚ. Τα Τregs μεσολαβούν σε αυτά τα ανοσοκατασταλτικά φαινόμενα μέσω της έκκρισης κατασταλτικών κυτταροκινών όπως είναι η IL- 10 και ο TGF-β, τη μείωση των τοπικών συγκεντρώσεων της IL-2 και την επαγωγή απόπτωσης ή την αναστολή του κυτταρικού κύκλου μέσω άμεσης επαφής κυττάρου με κύτταρο (Εικόνα 10) (Carty et al., 2013). Στέρηση κυτταροκινών Ανασταλτικές κυτταροκίνες Απόπτωση μέσω κυτταρικής επαφής Εικόνα 10: Δράσεις των Τ ρυθμιστικών κυττάρων. Τα Tregs δρουν καταστέλλοντας άλλα κύτταρα μέσω διάφορων μηχανισμών όπως η έκκριση των κατασταλτικών κυτταροκινών IL-10 και TGF-β, την κατανάλωση των τοπικών συγκεντρώσεων IL-2 και την αναστολή του κυτταρικού κύκλου ή την απόπτωση (προσαρμογή από Carty et al., 2013) CD8 (κυτταροτοξικά Τ κύτταρα - CTLs) Στην κυτταρική ανοσολογική απόκριση, τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα είναι τα κύτταρα-τελεστές. Ο όρος κυτταροτοξικό, αναφέρεται στη χρήση τοξικών γονιδιακών προϊόντων για την καταστροφή μολυσμένων 26

28 κυττάρων. Για να ενεργοποιηθούν, απαιτούν σηματοδοτικά μόρια από τα βοηθητικά Τ κύτταρα καθώς επίσης και αλληλεπίδραση με ένα κύτταρο το οποίο παρουσιάζει ένα αντιγόνο. Από τη στιγμή που θα ενεργοποιηθούν, τα κυτταροτοξικά Τ μπορούν να απαλείψουν κύτταρα μολυσμένα από ιούς ή άλλα ενδοκυτταρικά παθογόνα (Reece et al., 2011). Επίσης έχουν την ικανότητα να καταστρέφουν τα κύτταρα του οργανισμού που έχουν υποστεί καταστρεπτικές αλλαγές όπως για παράδειγμα τη μεταμόρφωσή τους σε κακοήθη κύτταρα (Carty et al., 2013). Όπως συμβαίνει και με βοηθητικά κύτταρα, έτσι και τα κυτταροτοξικά διαθέτουν μια βοηθητική πρωτεΐνη η οποία προσδένεται στο MHC μόριο και βοηθά στη διατήρηση των δύο κυττάρων σε επαφή καθώς το Τ κυτταροτοξικό ενεργοποιείται (Εικόνα 11). Εικόνα 11: Ένα ενεργοποιημένο κυτταροτοξικό Τ απελευθερώνει μόρια τα οποία δημιουργούν πόρους στη μεμβράνη ενός μολυσμένου κυττάρου και ένζυμα που καταστρέφουν πρωτεΐνες, προωθώντας τον κυτταρικό θάνατο (προσαρμογή από Reece et al., 2011). Η στοχευμένη καταστροφή ενός μολυσμένου κυττάρου του ξενιστή περιλαμβάνει την έκκριση πρωτεϊνών οι οποίες διακόπτουν τη μεμβρανική συνοχή και σηματοδοτούν την απόπτωση του κυττάρου. Ο θάνατος του μολυσμένου κυττάρου όχι μόνο στερεί από το παθογόνο ένα μέρος για να αναπαραχθεί, αλλά και εκθέτει τα κυτταρικά περιεχόμενα στα κυκλοφορούντα αντισώματα με αποτέλεσμα αυτά να σημαδεύονται για καταστροφή. Αφού 27

29 καταστρέψει ένα μολυσμένο κύτταρο, το κυτταροτοξικό Τ κύτταρο μπορεί να μετακινηθεί και να σκοτώσει και άλλα κύτταρα μολυσμένα με το ίδιο παθογόνο (Reece et al., 2011) Β λεμφοκύτταρα Ένας απλός ορισμός για τα Β λεμφοκύτταρα είναι πως αποτελούν έναν κυτταρικό πληθυσμό που εκφράζει στην επιφάνειά του κλωνικά διαφορετικές ανοσοσφαιρίνες (Ig) υποδοχείς οι οποίοι αναγνωρίζουν συγκεκριμένους αντιγονικούς επιτόπους (LeBien & Tedder, 2008). Αποτελούν κομμάτι του επίκτητου ανοσοποιητικού συστήματος και συγκεκριμένα ενορχηστρώνουν τη χυμική απόκριση στα αντιγονικά ερεθίσματα. Ο κύριος ρόλος τους είναι να εκκρίνουν αντισώματα ενάντια στα αντιγόνα τα οποία προσδένονται στους επιφανειακούς τους υποδοχείς (BCR). Αναπτύσσονται από αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα στο μυελό των οστών και υφίστανται μια αναπτυξιακή διαδικασία η οποία περιλαμβάνει αναδιατάξεις γονιδίων, με σκοπό την παραγωγή ενός μεγάλου ρεπερτορίου BCR για την αναγνώριση αντιγόνων (Hickling et al., 2014). Ο BCR παρέχει στα Β λεμφοκύτταρα την ικανότητα αναγνώρισης αντιγόνου, επιτρέποντάς τους έτσι να δεσμεύουν πιθανά επικίνδυνα παθογόνα και είναι άμεσα υπεύθυνος για τη δημιουργία σημάτων τα οποία οδηγούν σε μία κατάλληλη επαγόμενη από αντιγόνο απόκριση των Β κυττάρων. Είναι ένα διαμεμβρανικό πρωτεϊνικό σύμπλοκο, αποτελούμενο από πολλαπλές υπομονάδες στις οποίες συμπεριλαμβάνεται μια βαριά αλυσίδα των ανοσοσφαιρινών (immunoglobulin heavy chain, IgHC) ομοιοπολικά συνδεδεμένη με δισουλφιδικούς δεσμούς με μία ελαφριά αλυσίδα (immunoglobulin light chain, IgLC). Η αμινοτελική περιοχή αυτών των αλυσίδων χαρακτηρίζεται από εκτεταμένη ποικιλομορφία η οποία προκύπτει από γονιδιακό ανασυνδυασμό, προσθήκη νουκλεοτιδίων και σωματική υπερμετάλλαξη (somatic hypermutation). Αυτή η περιοχή είναι υπεύθυνη για την κλωνική ειδικότητα της αντιγονικής αναγνώρισης από τον υποδοχέα, καθώς και για τη συγγένεια της δέσμευσης του προσδέτη. Επιπλέον, ο BCR διαθέτει και μια υπομονάδα α (Iga) και μια β (Igβ), υπεύθυνες για τη μεταγωγή 28

30 σήματος. Ένας επιφανειακός υποδοχέας BCR διαθέτει δύο βαριές, δύο ελαφρές αλυσίδες, μία α και μία β υπομονάδα (Εικόνα 12). Το καρβοξυτελικό αμετάβλητο τμήμα των αλυσίδων καλείται σταθερή περιοχή και είναι αυτή που καθορίζει τους πέντε διαφορετικούς ισοτύπους του BCR: IgM, IgD, IgG, IgA και IgE. Τα IgM και IgD εκφράζονται από τα προσφάτως δημιουργημένα και μη ενεργοποιημένα Β κύτταρα, ενώ οι άλλοι ισότυποι τυπικά εκφράζονται μόνο στα ενεργοποιημένα ή τα Β κύτταρα μνήμης (Monroe & Brezski, 2008). Εικόνα 12: Οι BCRs είναι ενσωματωμένοι στις μεμβράνες των Β κυττάρων και προσδένουν μια ποικιλία αντιγόνων μέσω των μεταβλητών περιοχών τους. Η περιοχή μεταγωγής σήματος, είναι υπεύθυνη για τη μεταφορά του σήματος μέσα στο κύτταρο (προσαρμογή από Η ενεργοποίηση των Β κυττάρων ξεκινά από την πρόσδεση του αντιγόνου στον BCR (Εικόνα 13). Τα Β κύτταρα συναντούν το αντιγόνο είτε σε διάλυμα είτε στην επιφάνεια ενός APC και η πρόσδεσή του εκκινεί σηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία οδηγούν στην ενεργοποίηση μιας ποικιλίας γονιδίων που συνδέονται με την ενεργοποίηση των Β κυττάρων. Επιπρόσθετα, ο BCR υπό την επίδραση των σημάτων που δημιουργούνται 29

31 μεταφέρει αντιγόνα σε ενδοκυτταρικά διαμερίσματα όπου αυτά επεξεργάζονται και παρουσιάζονται σε μόρια της τάξης ΙΙ του MHC, για την αναγνώριση από τα βοηθητικά Τ κύτταρα (Chaturvedi et al., 2013).. Εικόνα 13: Επισκόπηση της ενεργοποίησης των Β κυττάρων από αντιγόνο (προσαρμογή από Chaturvedi et al., 2013) Προέλευση των Β λεμφοκυττάρων Στους ενήλικους ανθρώπους, όπως και σε όλα τα θηλαστικά, τα Β λεμφοκύτταρα αναπτύσσονται στο μυελό των οστών από αιμοποιητικά πρόδρομα κύτταρα. Κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ζωής, ο μυελός των οστών τροφοδοτείται από αιμοποιητικά αρχέγονα κύτταρα παραγόμενα στο εμβρυϊκό ήπαρ (Pieper et al., 2013). Η ανάπτυξη των Β κυττάρων στο μυελό των ενηλίκων πραγματοποιείται σε αρκετά καλά χαρακτηρισμένα στάδια και ακολουθείται από τη μετανάστευση στους δευτερογενείς λεμφικούς ιστούς, όπως είναι ο σπλήνας και οι λεμφαδένες (Ichii et al., 2014), όπου και συνεχίζεται η ανάπτυξή τους. Στο μυελό των οστών η ανάπτυξη προχωρά 30

32 μέσω των σταδίων pro-b, pre-b και ανώριμων B λεμφοκυττάρων (Εικόνα 14). Κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης, οι αναδιατάξεις στο γονιδιακό τόπο της ανοσοσφαιρίνης έχουν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία και έκφραση στην επιφάνεια του υποδοχέα pre-bcr (ο οποίος αποτελείται από μία βαριά αλυσίδα και υποκατάστατες ελαφρές αλυσίδες, VpreB ή Vλ5) και τελικά ενός ώριμου BCR (αποτελούμενος από αναδιαταγμένα γονίδια βαριών και ελαφρών αλυσίδων) ο οποίος έχει την ικανότητα να δεσμεύει το αντιγόνο (Cambier et al., 2007). Οι αναδιατάξεις γίνονται μεταξύ των V H, D H και J H γονιδιακών τμημάτων της βαριάς αλυσίδας και των γονιδιακών τμημάτων V L - J L της ελαφριάς αλυσίδας, δημιουργώντας έτσι ένα ρεπερτόριο Β κυττάρων που εκφράζουν αντιγόνα ικανά να αναγνωρίζουν περισσότερα από 5x10 13 διαφορετικά αντιγόνα (Pieper et al., 2013). Εικόνα 14: Στάδια της ανάπτυξης των Β λεμφοκυττάρων (προσαρμογή από Cambier et al., 2007). Σε αυτό το ανώριμο στάδιο της ανάπτυξης, τα Β λεμφοκύτταρα υφίστανται μια διαδικασία επιλογής ώστε να αποφευχθεί κάποια πιθανή ανάπτυξή τους σε αυτό-αντιδρώντα κύτταρα, με την επεξεργασία του υποδοχέα και την κλωνική απαλοιφή να παίζουν βασικό ρόλο. Τα κύτταρα τα 31

33 οποία ολοκληρώνουν επιτυχημένα αυτό το σημείο ελέγχου, αφήνουν το μυελό των οστών ως μεταβατικά (transitional) Β κύτταρα (Cambier et al., 2007). Τα λειτουργικά ανώριμα Β κύτταρα, γνωστά και ως αθώα Β τα οποία συνεκφράζουν IgM και IgD, μεταναστεύουν στον σπλήνα όπου διαφοροποιούνται μέσω των μεταβατικών σταδίων σε Β1 κύτταρα (αν και δεν προέρχονται όλα τα Β1 από το μυελό), θυλακιακά Β κύτταρα ή Β κύτταρα της οριακής ζώνης (marginal zone, MZ) (Fettke et al., 2014). Τα Τ3 Β λεμφοκύτταρα πιστεύεται πως είναι ένα σύνολο αυτοάνοσων κυττάρων των οποίων ωστόσο οι ιδιότητες μετάδοσης σήματος δεν έχουν μελετηθεί λεπτομερώς (Liubchenko et al., 2012). Στην εικόνα 14 εκτός από τα στάδια της ανάπτυξης των Β λεμφοκυττάρων παρουσιάζονται και τα επιφανειακά μόρια (πρωτεΐνεςμάρτυρες) του κάθε σταδίου, ένα από τα οποία είναι και το Β220. Η Β220 ισομορφή του CD45, αποτελεί μάρτυρα για όλα τα Β λεμφοκύτταρα στα ποντίκια, αλλά εκφράζεται μόνο από ένα υποσύνολο ανθρώπινων Β κυττάρων τα οποία δεν εκφράζουν το μάρτυρα των Β κυττάρων μνήμης, CD27 (Rodig et al., 2005). Η CD45 η οποία καλείται και κοινό λευκοκυτταρικό αντιγόνο (leucocyte common antigen, LCA), έχει τουλάχιστον τέσσερεις ισομορφές με μοριακό βάρος από 220 μέχρι 180 kda, είναι μία ομοιάζουσα με υποδοχέα τυροσίνη-φωσφατάση η οποία εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στην επιφάνεια όλων των εμπύρηνων αιμοποιητικών κυττάρων και παίζει κρίσιμο ρόλο στη λειτουργία αυτών. Ποντίκια με CD45 ανεπάρκεια παρουσιάζουν ελαττώματα τόσο στα Τ όσο και στα Β λεμφοκύτταρα (Clement 1992; Altin & Sloan, 1997; Zikherman et al., 2012) Υποσύνολα Β λεμφοκυττάρων Όπως αναφέρθηκε και πιο πάνω, τα αθώα Β κύτταρα διαχωρίζονται γενικά σε τρεις υποκατηγορίες, τα Β1 Β κύτταρα, τα θυλακιακά Β και τα ΜΖ Β κύτταρα. Αυτά διαφέρουν όσον αφορά την τοποθεσία τους, την ικανότητά τους να μεταναστεύουν και την πιθανότητά τους να ενεργοποιηθούν με Τ-εξαρτώμενο ή Τ-ανεξάρτητο τρόπο (Allman & Pillai, 2008). Η Τ-ανεξάρτητη απόκριση προκαλείται από πολυμερικά αντιγόνα (π.χ. πολυσακχαρίτες) τα οποία αποτελούνται από επαναλαμβανόμενους αντιγονικούς επιτόπους 32

34 (Εικόνα 15). Τα ΜΖ Β κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο σε αυτές τις αποκρίσεις καθώς με την πρόσδεση του αντιγόνου υφίστανται γρήγορο πολλαπλασιασμό και ωρίμανση σε πλασματοκύτταρα τα οποία εκκρίνουν χαμηλής συγγένειας IgM (Dorshkind & Rawlings, 2013). Εικόνα 15: Τα Τ-ανεξάρτητα αντιγόνα φέρουν επαναλαμβανόμενες μονάδες (επίτοπους) οι οποίοι μπορούν να συνδέσουν διασταυρούμενα πολλούς αντιγονικούς υποδοχείς στο Β κύτταρο. Αυτά τα αντιγόνα διεγείρουν το Β κύτταρο να φτιάξει αντισώματα χωρίς τη βοήθεια των Τ βοηθητικών κυττάρων. Παράδειγμα τέτοιων αντιγόνων είναι οι πολυσακχαρίτες στις βακτηριακές κάψες (προσαρμογή από Tortora et al., 2013). Μετά την πρόσδεση ενός Τ-εξαρτώμενου αντιγόνου (ως διαλυτό αντιγόνο, έμμεσα μέσω παρουσίασης από ένα τοπικό APC, ή ως ένα ανοσοσύμπλοκο), κάποια από τα ώριμα αθώα Β κύτταρα των πρωτογενών θυλακίων στο σπλήνα, ωριμάζουν σε πλασματοκύτταρα που εκκρίνουν IgM για την παροχή μιας γρήγορης αρχικής απόκρισης στη μόλυνση. Ως απόκριση στη βοήθεια από τα Τ κύτταρα, ωστόσο, άλλα Β κύτταρα υφίστανται περεταίρω πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση (Dorshkind & Rawlings, 2013) (Εικόνα 16). Πέρα από τον ευρέως αναγνωρισμένο ρόλο των Β λεμφοκυττάρων να επάγουν τη χυμική ανοσολογική απόκριση, μπορούν επίσης να εκκρίνουν κυτταροκίνες και έχουν την ικανότητα να παρουσιάζουν αντιγόνα στα αθώα Τ λεμφοκύτταρα. 33

35 Διέγερση από κυτταροκίνες Εικόνα 16: Ανοσία επαγόμενη από αντισώματα (προσαρμογή από Οι περισσότερες από τις γνώσεις που υπάρχουν για τα Β1 κύτταρα προέρχονται από μελέτες σε ποντίκια (Allman & Pillai, 2008). Τα Β1 είναι υπεύθυνα για την παραγωγή των φυσικών αντισωμάτων (πολυειδικά 34

36 αντισώματα χαμηλής συγγένειας και κυρίως του ισοτύπου IgM) και αποτελούν μια πρώτη γραμμή άμυνας ενάντια σε μικροβιακά αντιγόνα, ενώ δυσλειτουργία στην παραγωγή αυτών των αντισωμάτων μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη αυτοανοσίας. Ενεργοποιούνται με Τ-ανεξάρτητο τρόπο (Covens et al., 2013), και δεν αναπτύσσονται σε Β κύτταρα μνήμης. Στα ενήλικα άτομα βρίσκονται κυρίως στο περιφερικό αίμα και στα ποντίκια διακρίνονται από την έκφραση των επιφανειακών δεικτών CD45 (B220 low ), IgM hi, CD23 -, CD43 + και IgD low (Fettke et al., 2014). Εκτός από τα Β1 κύτταρα, υπάρχουν και τα Β2 τα οποία προκύπτουν και διαφοροποιούνται στο μυελό των οστών, όπου υπάρχει το σημείο ελέγχου για απομάκρυνση των αυτοαντιδρώντων κυττάρων (κεντρική ανοχή). Τα ανώριμα κύτταρα που επιβιώνουν και φέρουν λειτουργικούς BCRs, μεταναστεύουν στο σπλήνα όπου συμβαίνει περαιτέρω επιλογή κατά τα μεταβατικά στάδια (περιφερική ανοχή). Τα κύτταρα σε αυτό το σημείο κατευθύνονται σε πρόγραμμα είτε για ώριμα θυλακιακά είτε για ΜΖ Β κύτταρα. Τα θυλακιακά κύτταρα κινούνται μέσω των δευτερογενών λεμφικών οργάνων και αποτελούν τον πυρήνα της επίκτητης χυμικής απόκρισης. Τα αθώα θυλακιακά Β κύτταρα συναντούν τα αντιγόνα στα δευτερογενή λεμφικά όργανα και σε συνδυασμό με τη βοήθεια από τα Τ κύτταρα, ενεργοποιούνται και πολλαπλασιάζονται. Τα ενεργοποιημένα Β κύτταρα μεταναστεύουν στο θυλάκιο των Β, όπου συνενώνονται σε μια σταθερή δομή που καλείται βλαστικό κέντρο (germinal centre, GC) (Browning, 2006) (Εικόνα 17). Ένα ενεργοποιημένο Β λεμφοκύτταρο πολλαπλασιάζεται σε ένα μεγάλο κλώνο κυττάρων, κάποια από τα οποία θα διαφοροποιηθούν σε πλασματοκύτταρα τα οποία παράγουν αντιγόνα, ενώ άλλοι κλώνοι του ενεργοποιημένου Β κυττάρου θα γίνουν μακρόβια κύτταρα μνήμης, υπεύθυνα για την ενισχυμένη δευτερογενή απόκριση σε ένα αντιγόνο. Το φαινόμενο αυτό καλείται κλωνική επιλογή (clonal selection) (Tortora et al., 2013). Κατόπιν, εποικίζουν το σπλήνα, τα θυλάκια των λεμφαδένων και άλλους περιφερικούς λεμφικούς ιστούς (Εικόνα 18). 35

37 Εικόνα 17: Συμπεριφορά Β κυττάρων μετά την έκθεση στο αντιγόνο. (1) Εντός ωρών, η πρόσδεση του αντιγόνου στον BCR προκαλεί τη μετακίνηση των Β κυττάρων στην περιοχή μεταξύ θυλακίου και ζώνης Τ κυττάρων, όπου τα Β κύτταρα παρουσιάζουν αντιγονικά πεπτίδια στα CD4 + Τ κύτταρα. Κατά τη διάρκεια των επόμενων 2-3 ημερών, τα Β κύτταρα μεταναστεύουν ενεργά, σχηματίζουν επαναλαμβανόμενα σταθερά συζεύγματα με τα CD4 + Τ λεμφοκύτταρα και πολλαπλασιάζονται στην περιφέρεια του θυλακίου. (2) 3-4 ημέρες μετά την έκθεση στο αντιγόνο, τα Β κύτταρα αποφασίζουν για διαφοροποίησή τους σε πλασματοκύτταρα, GC Β κύτταρα ή κύτταρα μνήμης. Τα GC B κύτταρα συνεχίζουν να διαιρούνται γρήγορα, υπερμεταλλάσσοντας τις V περιοχές του BCR τους και αλληλεπιδρούν με τα θυλακιακά DCs που φέρουν αντιγόνο και τα T FH. (3) Τα GC B κύτταρα αποφασίζουν μεταξύ επιβίωσης ή θανάτου κάτι που εξαρτάται από τη συγγένεια του BCR τους για τα ξένα αντιγόνα και για τα αντιγόνα του εαυτού. (4) Τα πλασματοκύτταρα ενσωματώνουν τις εισροές για να αποφασίσουν μεταξύ επιβίωσης ή θανάτου για να καθορίσουν την ποσότητα και τη διάρκεια του αντισώματος στην κυκλοφορία (προσαρμογή από Goodnow et al., 2010). 36

38 Εικόνα 18: Σχηματική αναπαράσταση της ανατομίας του σπλήνα (προσαρμογή από Pillai & Cariappa, 2009). Τα ΜΖ Β κύτταρα (Εικόνα 18) απαντούν γρήγορα σε μεταφερόμενα από το αίμα αντιγόνα και δρουν ως λεμφοκύτταρα ομοιάζοντα με της εγγενούς ανοσίας. Αρκετά από αυτά εκφράζουν πολυδραστικούς BCRs οι οποίοι προσδένονται σε πολλαπλά μικροβιακά μοριακά μοτίβα. Σε πολλές περιπτώσεις, το προφίλ της αναγνώρισης αυτών των πολυδραστικών BCRs είναι σε γενικές γραμμές παρόμοιο με αυτό των TLRs. Επιπροσθέτως, τα ΜΖ Β κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα TLRs (με παρόμοιο τρόπο με τα DCs, μακροφάγα και κοκκιοκύτταρα), κάτι το οποίο τους επιτρέπει να προσπερνούν τα τυπικά όρια που υπάρχουν μεταξύ εγγενούς και επίκτητου ανοσοποιητικού συστήματος. Πράγματι, από κοινού δέσμευση των BCRs και TLRs από συντηρημένα μικροβιακά μόρια, όπως είναι οι LPS ή οι πεπτιδογλυκάνες, προκαλούν τα MZ Β κύτταρα να ξεκινήσουν χαμηλής συγγένειας αποκρίσεις με αντισώματα, οι οποίες γεφυρώνουν τη χρονική διαφορά που απαιτείται για την επαγωγή της παραγωγής αντισωμάτων υψηλής συγγένειας από τα συμβατικά θυλακιακά Β κύτταρα (Cerutti et al., 2013). 37

39 Αντισώματα Τα αντισώματα ή ανοσοσφαιρίνες έχουν την ίδια δομική οργάνωση σχήματος Υ με τον υποδοχέα των Β κυττάρων BCR, μόνο που αποτελούν την εκκρινόμενη και όχι την συνδεδεμένη με τη μεμβράνη μορφή του. Στην ουσία είναι τα αντισώματα παρά τα Β κύτταρα αυτά καθ αυτά που πραγματικά βοηθούν στην άμυνα εναντίον των παθογόνων (Reece et al., 2011). Όπως και ο BCR, έτσι και τα αντισώματα αποτελούνται από δύο ελαφρές (light, L) και δύο βαριές (heavy, H) πολυπεπτιδικές αλυσίδες, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με δισουλφιδικούς δεσμούς (Εικόνα 19). Σε κάθε μόριο αντισώματος οι δύο L αλυσίδες είναι πανομοιότυπες, όπως και οι δύο H. Έτσι, οι δύο θέσεις πρόσδεσης του αντιγόνου είναι πανομοιότυπες. Η περιοχή της άρθρωσης επιτρέπει στους δύο βραχίονες να κινούνται στο χώρο διευκολύνοντας την αλληλεπίδραση του αντισώματος με το αντιγόνο (Russell, 2009). Εικόνα 19: Δομή της ανοσοσφαιρίνης G (IgG). Ζεύγη βαριών και ελαφρών αλυσίδων συνδυάζονται για να σχηματίσουν ένα μόριο σχήματος Υ. Δύο θέσεις πρόσδεσης αντιγόνου σχηματίζονται από το συνδυασμό των μεταβλητών επικρατειών από μία ελαφριά (V L ) και μία βαριά αλυσίδα (V H ). Επεξεργασία με παπαΐνη, χωρίζει την πρωτεΐνη σε Fab και Fc τμήματα στην περιοχή της άρθρωσης. Το Fc κομμάτι επίσης περιέχει δεσμευμένο υδατάνθρακα (προσαρμογή από Nelson & Cox, 2004). 38

40 Υπάρχουν πέντε διαφορετικές βαριές αλυσίδες, οι α, δ, ε, γ και μ οι οποίες δίνουν αντίστοιχα τους πέντε διαφορετικούς ισοτύπους αντισωμάτων IgA, IgD, IgE, IgG και IgM και δύο κατηγορίες ελαφρών αλυσίδων, οι κ και οι λ, με κάθε αντίσωμα να φέρει είτε δύο όμοιες αλυσίδες κ είτε δύο όμοιες λ αλλά ποτέ δύο διαφορετικές ελαφρές αλυσίδες. Οι αλυσίδες οργανώνονται σε επικράτειες και κάθε L αλυσίδα διαθέτει δύο επικράτειες, μία μεταβλητή (V L ) και μία σταθερή (C L ) ενώ για την H αλυσίδα οι γ, δ και α αποτελούνται από μία μεταβλητή (V Η ) και τρεις σταθερές (C H 1 έως C H 3). Οι μ και ε αλυσίδες εμφανίζουν μια επιπλέον σταθερή επικράτεια (C H 4) (Zouali, 2001; Russell, 2009). Στα πρώτα πειράματα που έγιναν, διαπιστώθηκε πως το πρωτεολυτικό ένζυμο παπαΐνη υδρολύει τους πεπτιδικούς δεσμούς της IgG και κόβει το αντίσωμα σε τρία θραύσματα. Δύο από αυτά ήταν πανομοιότυπα, διατηρούσαν την ικανότητα να δεσμεύουν αντιγόνο και ονομάστηκαν Fab (fragments of antigen-binding). Το τρίτο θραύσμα που παράχθηκε από την πέψη με παπαΐνη δεν πρόσδενε αντιγόνο, κρυσταλλωνόταν κατά την αποθήκευσή του σε ψυχρό περιβάλλον και ονομάστηκε Fc (fragment crystallizable) (Εικόνα 19) (Elgert, 1998). Οι αλληλεπιδράσεις ανοσοσφαιρίνης αντιγόνου, συνήθως λαμβάνουν χώρα μεταξύ παράτοπου (η περιοχή στην ανοσοσφαιρίνη όπου προσδένεται το αντιγόνο) και επίτοπου (η περιοχή του αντιγόνου η οποία προσδένεται) (Schroeder & Cavacini, 2010). Η θέση πρόσδεσης του αντιγόνου στο αντίσωμα έχει ένα μοναδικό σχήμα το οποίο παρέχει μία εφαρμογή για ένα συγκεκριμένο επίτοπο, όπως το κλειδί στην κλειδαριά (Εικόνα 20) (Reece et al., 2011). Η εξειδίκευση της δέσμευσης καθορίζεται από τα κατάλοιπα των αμινοξέων στις μεταβλητές επικράτειες των βαριών και ελαφρών αλυσίδων του αντισώματος. Πολλά κατάλοιπα σε αυτές τις επικράτειες είναι μεταβλητά αλλά όχι εξίσου (Nelson & Cox, 2004). Υπάρχουν τρεις περιοχές ακραίας μεταβλητότητας (complementarity-determining regions, CDRs) οι οποίες περιλαμβάνουν κατάλοιπα που μπορούν να έρθουν σε επαφή με το αντιγόνο χάρη στην αμοιβαία συμπληρωματικότητα. Στο τρισδιάστατο επίπεδο, οι τρεις CDRs κάθε αλυσίδας συγκλίνουν για να σχηματίσουν τον παράτοπο ο οποίος θα αναγνωρίσει τον αντιγονικό καθοριστή, δηλαδή τον επίτοπο (Zouali, 2001). 39

41 Εικόνα 20: Η γενική δομή της ανοσοσφαιρίνης και η δομή της ρωγμής όπου βρίσκεται η θέση πρόσδεσης του αντιγόνου. Οι αντιγονικοί καθοριστές είναι παρόντες στην επιφάνεια του αντιγόνου, ενώ η θέση πρόσδεσής του βρίσκεται στη ρωγμή και προκύπτει και από την ελαφριά και από τη βαριά αλυσίδα (προσαρμογή από Ισότυποι των αντισωμάτων Οι πέντε διαφορετικοί ισότυποι των ανοσοσφαιρινών είναι παρόντες σε διαφορετικά σημεία κατά τη διάρκεια της ωρίμανσης των Β λεμφοκυττάρων. Για παράδειγμα, όλα τα αθώα Β κύτταρα εκφράζουν IgM και IgD, ενώ καθώς ωριμάζουν και υφίστανται αλλαγή κατηγορίας η πλειοψηφία αυτών εκκρίνει είτε IgG είτε IgA, οι οποίες είναι και οι πιο άφθονες ανοσοσφαιρίνες στο πλάσμα (Rajpal et al., 2014). Το IgM είναι το πρώτο αντίσωμα που εκφράζεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των Β κυττάρων και σχετίζεται με μια πρωτογενή ανοσολογική απόκριση. Τα αθώα Β κύτταρα εκφράζουν μονομερές IgM στην επιφάνειά τους, ενώ κατά την ωρίμανση και την αντιγονική έκθεση εκκρίνονται πολυμερικά IgM μόρια, συνήθως πενταμερή και πιο σπάνια εξαμερή (Εικόνα 21). Το πενταμερές επίσης περιλαμβάνει μια πολυπεπτιδική αλυσίδα, την J αλυσίδα, η οποία προσδένεται σε δύο από τα μονομερή μέσω ενός 40

42 δισουλφιδικού δεσμού. Γενικά, αν και τα μονομερή IgM μόρια έχουν χαμηλή συγγένεια λόγω της ανωριμότητάς τους, μπορεί να αποκτηθεί υψηλή ισχύς σύνδεσης μέσω πολυμερικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ του εκκρινόμενου πενταμερούς και του αντιγόνου, ειδικά αν αυτό το αντιγόνο περιέχει πολλαπλούς επαναλαμβανόμενους επίτοπους. Τα χαμηλής συγγένειας IgM μόρια, ονομάζονται και φυσικά αντισώματα και κάποια από αυτά δρουν ως πρώτη γραμμή άμυνας (Schroeder & Cavacini, 2010). Εικόνα 21: Πενταμερές IgM μόριο. Με κίτρινο υποδεικνύονται οι δισουλφιδικοί δεσμοί. Η αλυσίδα J είναι ένα πολυπεπτίδιο M r και βρίσκεται τόσο στην IgM όσο και στην IgA ανοσοσφαιρίνη (προσαρμογή από Nelson & Cox, 2004). Τα κυκλοφορούντα IgD αντισώματα βρίσκονται σε πολύ χαμηλά επίπεδα στον ορό, με μικρό χρόνο ημίσειας ζωής κάτι που μπορεί να αποδοθεί στην ευαισθησία του μορίου (της περιοχής της άρθρωσης πιο συγκεκριμένα) στην πρωτεόλυση. Ο λειτουργικός τους ρόλος δεν είναι ξεκάθαρος, καθώς δεν είναι γνωστή η συμμετοχή τους σε κάποιον από τους βασικούς μηχανισμούς δράσης των αντισωμάτων. Τα κυκλοφορούντα IgD μόρια μπορούν να αντιδράσουν με συγκεκριμένες βακτηριακές πρωτεΐνες, ανεξάρτητα από τις μεταβλητές περιοχές τους. Η πρόσδεση αυτών των βακτηριακών πρωτεϊνών 41

43 στη σταθερή περιοχή της IgD οδηγεί στη διέγερση και ενεργοποίηση των Β κυττάρων. Ακόμα και για τη μεμβρανόδετη μορφή της IgD η οποία έχει μελετηθεί πιο εκτεταμένα, η κατανόηση της λειτουργίας του δεν είναι πλήρως κατανοητή. Η IgG είναι ο κυρίαρχος ισότυπος ανοσοσφαιρίνης που υπάρχει στο σώμα. Έχει τη μεγαλύτερη διάρκεια ημίσειας ζωής στον ορό απ όλους τους ισότυπους και είναι η πλέον εκτεταμένα μελετημένη τάξη ανοσοσφαιρινών. Με βάση δομικές, αντιγονικές και λειτουργικές διαφορές στη σταθερή περιοχή της βαριάς αλυσίδας (C H 1 και C H 3 συγκεκριμένα), έχουν αναγνωριστεί τέσσερις υποκατηγορίες IgG (οι IgG1, IgG2, IgG3 και IgG4), με διαφορετικές λειτουργικές δραστηριότητες. Υπάρχουν ωστόσο και ομοιότητες μεταξύ τους, όπως είναι η μεταφορά μέσω του πλακούντα και η συμμετοχή στη δευτερογενή ανοσολογική απόκριση (Schroeder & Cavacini, 2010). Απόκριση σε διαλυτά πρωτεϊνικά αντιγόνα και μεμβρανικές πρωτεΐνες επάγει κυρίως την IgG1, ενώ απόκριση σε βακτηριακούς πολυσακχαρίτες επάγει την IgG2 ανοσοσφαιρίνη. Τα IgG3 αντισώματα είναι ιδιαιτέρως αποτελεσματικά στην επαγωγή τελεστικών λειτουργιών και αποτελούν ισχυρά προ-φλεγμονώδη αντισώματα. Τα αλλεργιογόνα αποτελούν καλούς επαγωγείς για τα IgG1, αλλά και τα IgG4 αντισώματα τα οποία συχνά σχηματίζονται μετά από επαναλαμβανόμενη ή μακράς διάρκειας έκθεση στο αντιγόνο (Vidarsson et al., 2014). Τα επίπεδα στον ορό της IgA τείνουν να είναι υψηλότερα από αυτά της IgM αλλά σημαντικά χαμηλότερα από της IgG. Αντιστρόφως, τα επίπεδα της IgΑ ανοσοσφαιρίνης είναι πολύ πιο υψηλά από της IgG στους βλεννογόνους υμένες και στις εκκρίσεις, όπως είναι το σάλιο και το μητρικό γάλα. Συγκεκριμένα, η IgΑ μπορεί να συνεισφέρει μέχρι και το 50% των πρωτεϊνών στο πρωτόγαλα που δίνεται στο νεογνό από τη μητέρα. Υπάρχουν δύο υποκατηγορίες της, η IgΑ1 που κυριαρχεί στον ορό και η IgΑ2 η οποία κυριαρχεί στις βλεννώδεις εκκρίσεις. Αν και γενικά είναι μονομερής στον ορό, η IgΑ στο βλεννογόνο καλείται εκκρινόμενη IgA (secretory IgA, siga), είναι διμερής και κάποιες φορές τριμερής και τετραμερής. Συνδέεται με μια J αλυσίδα και με μία ακόμα πεπτιδική αλυσίδα, το εκκριτικό συστατικό (secretory component, SC) (Εικόνα 22). Η IgA είναι πολύ σημαντική για την προστασία των βλεννογόνων από τοξίνες, ιούς και βακτήρια, ενώ 42

44 ενδοκυτταρικά αποτρέπει βακτηριακή ή ιική μόλυνση, παθογένεση ή και τα δύο (Schroeder & Cavacini, 2010). Εικόνα 22: Σχηματικό διάγραμμα της δομής της εκκρινόμενης ανθρώπινης IgA. Με ροζ χρώμα είναι η αλυσίδα J ενώ με μωβ το εκκριτικό συστατικό (SC) (προσαρμογή από Acosta et al., 2014). Η ανοσοσφαιρίνη IgE αν και βρίσκεται στη χαμηλότερη συγκέντρωση στον ορό και έχει το μικρότερο χρόνο ημίσειας ζωής, είναι πολύ δραστική. Σχετίζεται με την υπερευαισθησία και τις αλλεργικές αντιδράσεις, καθώς επίσης και με την απόκριση σε μολύνσεις από παρασιτικούς σκώληκες. Προσδένεται με εξαιρετικά υψηλή συγγένεια στον υποδοχέα FcεRI, ο οποίος εκφράζεται στα ιστιοκύτταρα, τα βασεόφιλα, τα κύτταρα Langerhans και τα εωσινόφιλα. Τα κυκλοφορούντα IgE μόρια αυξορρυθμίζουν την έκφραση των FcεR σε αυτά τα κύτταρα. Ο συνδυασμός της ισχυρής πρόσδεσης και της αυξορρρύθμισης της έκφρασης FcεR, συνεισφέρει στην αξιοσημείωτη ισχύ αυτής της ανοσοσφαιρίνης (Schroeder & Cavacini, 2010). Στον πίνακα 1 συνοψίζονται οι δομές και τα χαρακτηριστικά των ανοσοσφαιρινών. 43

45 Πίνακας 1: Συνοπτική παρουσίαση των τάξεων των ανοσοσφαιρινών (προσαρμογή από Tortora et al., 2013) Λειτουργίες των αντισωμάτων Τα αντισώματα, στην εκκρινόμενη μορφή τους από τα Β λεμφοκύτταρα είναι υπεύθυνα για τη χυμική ανοσολογική απόκριση η οποία παίζει σημαντικό ρόλο στην καταστροφή των εξωκυτταρικών παθογόνων, πρόληψη ενάντια στη διασπορά των ενδοκυτταρικών μολύνσεων και προστασία ενάντια στις τοξίνες (Zouali, 2001). Η πρόσδεση ενός αντισώματος σε ένα αντιγόνο προστατεύει τον ξενιστή επισημαίνοντας ξένα κύτταρα και μόρια για καταστροφή από φαγοκύτταρα και το συμπλήρωμα. Το μόριο του αντισώματος από μόνο του δεν είναι καταστρεπτικό για το αντιγόνο. Ξένοι οργανισμοί και τοξίνες καθίστανται ακίνδυνοι μέσω μερικών μόνο μηχανισμών, όπως συνοψίζεται 44

46 στην Εικόνα 23. Αυτοί οι μηχανισμοί είναι η συγκόλληση (agglutination), η οψωνινοποίηση (opsonization), η ουδετεροποίηση (neutralization), η εξαρτώμενη από αντίσωμα επαγόμενη από κύτταρα κυτταροτοξικότητα (antibody-dependent cell-mediated Cytotoxicity, ADCC) και η ενεργοποίηση του συμπληρώματος που οδηγεί σε φλεγμονή και κυτταρική λύση (Tortora et al., 2013). Εικόνα 23: Το αποτέλεσμα της σύνδεσης αντιγόνου-αντισώματος. Η πρόσδεση αντισωμάτων σε αντιγόνα για το σχηματισμό συμπλόκων επισημαίνει τα ξένα κύτταρα και μόρια για καταστροφή από τα φαγοκύτταρα και τις πρωτεΐνες του συμπληρώματος (προσαρμογή από Tortora et al., 2013). 45

47 2.4. Φυσικά φονικά κύτταρα (ΝΚ) Τα φυσικά φονικά (Natural Killer, ΝΚ) κύτταρα είναι μεγάλα κοκκιοκύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος τα οποία συνιστούν το τρίτο μεγαλύτερο υποσύνολο λεμφοκυττάρων (Freud & Caligiuri, 2006). Τα ανθρώπινα ΝΚ κύτταρα αποτελούν περίπου το 15% όλων των κυκλοφορούντων λεμφοκυττάρων. Χάρη στην πρώιμη παραγωγή κυτταροκινών και χυμοκινών και την ικανότητά τους να λύουν κύτταραστόχους χωρίς προηγούμενη ευαισθητοποίηση, αποτελούν ζωτικής σημασίας συστατικά του εγγενούς ανοσοποιητικού συστήματος (Cooper et al., 2001). Ωστόσο, αν και μέχρι πρόσφατα θεωρούνταν ότι έχουν μικρό χρόνο ζωής, γίνεται όλο και πιο εμφανές ότι παρουσιάζουν χαρακτηριστικά που ομοιάζουν με αυτά των κυττάρων της επίκτητης ανοσίας, συμπεριλαμβανομένης της ικανότητας να δημιουργούν μακρόβια ΝΚ κύτταρα μνήμης ως απόκριση σε διάφορους τύπους αντιγόνων, όπως μόλυνση ποντικών με κυτταρομεγαλοϊό (MCMV) (Sun et al., 2011; Kamimura & Lanier, 2015). Τα ΝΚ κύτταρα περιγράφηκαν για πρώτη φορά το 1975 στο σπλήνα ποντικών και το ανθρώπινο αίμα και χαρακτηρίστηκαν ως τα κύτταρα τα οποία «αυθόρμητα» σκοτώνουν καρκινικά κύτταρα (Niedzwiedzka-Rystewj et al., 2012). Παίζουν ένα πολύ σημαντικό ρόλο στην άμυνα του οργανισμού ενάντια σε ιικές μολύνσεις και την καρκινογένεση και συνεισφέρουν άμεσα στην απομάκρυνση παθογόνων μέσω της κυτταροτοξικής τους δραστηριότητας. Αν και πρωταρχικά θεωρούνταν ως ένα αναπόσπαστο κομμάτι της εγγενούς ανοσίας, συμβάλλουν επίσης στη δημιουργία της συγκεκριμένης ειδικής ανοσολογικής απόκρισης μέσω της παραγωγής χυμοκινών και κυτταροκινών όπως είναι η IFN-γ ή ο TNF-α (tumor necrosis factor α, παράγοντας νέκρωσης όγκων α) και με την ενεργοποίηση δενδριτικών κυττάρων (Krzewski & Strominger, 2008). Εκτός του ότι είναι οι κύριοι παραγωγοί IFN-γ, τα ΝΚ παράγουν μια σειρά από προ-φλεγμονώδεις και ανοσοκατασταλτικές κυτταροκίνες όπως ο TNF-α και η IL-10 αντίστοιχα και αυξητικούς παράγοντες όπως ο παράγοντας διέγερσης αποικιών κοκκιοκυττάρων μακροφάγων (granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), ο παράγοντας διέγερσης αποικιών των κοκκιοκυττάρων (granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF) και IL-3. 46

48 Εκκρίνουν επίσης πολλές χυμοκίνες, συμπεριλαμβανομένων των CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP1-a), CCL4 (MIP1-b), CCL5 (RANTES), XCL1 (λεμφοτακτίνη) και CXCL8 (IL-8), οι οποίες αποτελούν το κλειδί για το συνεντοπισμό τους με άλλα αιμοποιητικά κύτταρα, όπως τα δενδριτικά, στις περιοχές της φλεγμονής (Vivier et al., 2011). Ο παραδοσιακός κυτταρικός επιφανειακός φαινότυπος που ξεχωρίζει τα ανθρώπινα ΝΚ κύτταρα από τα υπόλοιπα λεμφοκύτταρα σε μια ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, δείχνει απουσία CD3 (ως εκ τούτου αποκλείονται τα Τ κύτταρα) και έκφραση CD16 (FcγRIII) και CD56, της ισομορφής του μορίου προσκόλλησης των νευρικών κυττάρων (neural cell adhesion molecule, NCAM) μοριακού βάρους 140-kDa (Caligiuri, 2008). Με βάση την ένταση της επιφανειακής έκφρασης CD56, μπορούν να διακριθούν δύο λειτουργικά υποσύνολα ΝΚ κυττάρων, τα CD56 bright και CD56 dim. Τα CD56 dim ΝΚ κύτταρα συνιστούν το 85% με 90% των ΝΚ κυττάρων στην περιφερική κυκλοφορία και είναι ισχυροί μεσολαβητές της κυτταροτοξικότητας (Εικόνα 24). Περίπου 10% με 15% των ΝΚ κυττάρων στην κυκλοφορία είναι CD56 bright και μετά την ενεργοποίηση αυτό το υποσύνολο είναι ικανό για ισχυρή παραγωγή κυτοκινών και χυμοκινών (Benson & Caligiuri, 2013). IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-10 ADCC φυσική κυτταροτοξικότητα Εικόνα 24: Απλοποιημένη αναπαράσταση των υποκατηγοριών των ΝΚ κυττάρων, CD56 bright ΝΚ και CD56 dim ΝΚ. IL: interleukin, KIR: killer immunoglobulin-like receptor, R: receptor (προσαρμογή από Benson & Caligiuri, 2013). 47

49 Τα CD56 bright κυριαρχούν στους λεμφαδένες και στις περιοχές της φλεγμονής και έχουν μέτρια περιεκτικότητα σε κυτολυτικά κοκκία. Παράγουν άφθονες κυτταροκίνες και έχουν ανοσορυθμιστική δράση. Οι κύριες κυτταροκίνες οι οποίες απελευθερώνονται είναι IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-10 και IL-13, ανάλογα με τις συγκεκριμένες συνθήκες διέγερσης. Τα CD56 dim έχουν σημαντικά υψηλότερη κυτταροτοξική δραστηριότητα σε σχέση με τα CD56 bright και περιέχουν πολύ περισσότερη περφορίνη, γρανένζυμα και κυτολυτικά κοκκία. Παίζουν βασικό ρόλο στη φυσική κυτταροτοξικότητα και την κυτταροτοξικότητα εξαρτώμενη από αντίσωμα με την μεσολάβηση κυττάρων (ADCC) και φαίνεται να προέρχονται από τα CD56 bright του περιφερικού αίματος. Έχουν την ικανότητα να προκαλέσουν λύση των καρκινικών κυττάρων μέσω τριών τουλάχιστον διαφορετικών μηχανισμών. Πρώτον, μέσω εξωκυττάρωσης κοκκίων περφορίνης και γρανενζύμων, δεύτερον μέσω FasL και TRAIL σε συνδυασμό με παραγωγή κυτταροκινών (IFN-γ, TNF-α, GM- CSF) και τρίτον, μπορούν να επάγουν ADCC μέσω της υψηλής επιφανειακής έκφρασης του CD16 (FcγRIII υποδοχέας) (Chan et al., 2007; Poli et al., 2009; Moretta, 2010; Benson & Caligiuri, 2013). Τα ΝΚ κύτταρα προέρχονται από CD34 + HSCs μέσω διακριτών σταδίων ανάπτυξης, με τη διαδοχική απόκτηση υποδοχέων και λειτουργιών (Montaldo et al., 2013). Η πρωταρχική θέση για την ανάπτυξή τους γενικά θεωρείται πως είναι ο μυελός των οστών. Ωστόσο, δεν έχει περιγραφεί ένα πλήρες μονοπάτι για την ανάπτυξη και την ωρίμανσή τους στο μυελό και είναι πιθανό προγονικά ΝΚ κύτταρα να μετακινούνται από εκεί προς άλλους ιστούς για την τελική διαφοροποίησή τους in situ. Το 2005 οι Freud et al. αναγνώρισαν τέσσερα διακριτά στάδια για την ανάπτυξη των ΝΚ κυττάρων στους δευτερογενείς λεμφικούς ιστούς με βάση την έκφραση των μορίων επιφανείας CD34, CD117 και CD94. Αυτά είναι το στάδιο 1 (CD34 + CD117 - CD94 - ), το στάδιο 2 (CD34 + CD117 + CD94 - ), το στάδιο 3 (CD34 - CD117 + CD94 - ) και το στάδιο 4 (CD34 - CD117 +/- CD94 + ). Ακολούθως της ανάπτυξης των ΝΚ, η δέσμευση στην ΝΚ κυτταρική σειρά συμβαίνει κατά το στάδιο 3, στο οποίο εμφανίζεται στην κυτταρική επιφάνεια το CD56 και δίνει γένεση στα CD56 bright κύτταρα στο στάδιο 4 (Εικόνα 25) (Eissens et al., 2012). 48

50 Εικόνα 25: Σχηματική αναπαράσταση των κυτταρικών ενδιάμεσων της ανάπτυξης των ανθρώπινων ΝΚ κυττάρων. Η ανάπτυξή τους από HSCs σε ώριμα σταδίου 5 CD56 dim NK κύτταρα παρουσιάζεται σαν γραμμικό μονοπάτι από αριστερά προς δεξιά. Τα ΝΚ κύτταρα μνήμης παρουσιάζονται σαν ένα πιθανό τελικό στάδιο ωρίμανσης (στάδιο 6) με πειραματικές αποδείξεις ότι αυτά μπορεί να προέρχονται από τα CD56 bright καθώς και από τα CD56 dim. Για κάθε αναπτυξιακό στάδιο απεικονίζεται η έκφραση κάθε επιφανειακού αντιγόνου χρήσιμου για τη διάκριση των αναπτυξιακών ενδιάμεσων ΝΚ πληθυσμών. Η έκφραση προσδιορίζεται ως + (έκφραση), - (μη έκφραση), hi (υψηλή έκφραση) ή lo (χαμηλή έκφραση) (προσαρμογή από Yu et al., 2013) Ενεργοποίηση και δράση των ΝΚ κυττάρων Τα ΝΚ κύτταρα συνεισφέρουν άμεσα στην ανοσολογική άμυνα, μέσω των εκτελεστικών λειτουργιών τους όπως είναι η κυτταροτοξικότητα και η έκκριση κυτταροκινών και έμμεσα, ρυθμίζοντας τα APCs και τις ειδικές αποκρίσεις από τα Τ λεμφοκύτταρα (Long et al., 2013). Τα ενεργοποιημένα ΝΚ εξυπηρετούν στο να περιορίζουν τις ιικές μολύνσεις (Εικόνα 26) όσο η επίκτητη ανοσολογική απόκριση δημιουργεί ειδικά για το αντιγόνο κυτταροτοξικά Τ κύτταρα και αντισώματα για την ουδετεροποίηση, τα οποία μπορούν να καθαρίσουν τη μόλυνση (Murphy, 2012). 49

51 Εικόνα 26: Τα ΝΚ κύτταρα αποτελούν ένα πρώιμο συστατικό της απόκρισης του ξενιστή σε ιική μόλυνση (προσαρμογή από Murphy, 2012). Τα κυκλοφορούντα ΝΚ κύτταρα βρίσκονται κυρίως σε κατάσταση ηρεμίας, αλλά ενεργοποίησή τους από κυτταροκίνες οδηγεί σε διήθηση αυτών των κυττάρων στους περισσότερους ιστούς που περιέχουν κύτταρα μολυσμένα από παθογόνα ή κακοήθη κύτταρα. Τα ΝΚ στους δευτερογενείς λεμφικούς ιστούς, όπως είναι οι αμυγδαλές, οι λεμφαδένες και ο σπλήνας, είναι διαφορετικά από αυτά του περιφερικού αίματος, καθώς ενεργοποιούνται από δενδριτικά κύτταρα και εκκρίνουν κυτταροκίνες όπως η ιντερφερόνη, η οποία προκαλεί μια πιο αποτελεσματική απόκριση για τη θανάτωση κυττάρων από τα Τ λεμφοκύτταρα (Mandal & Viswanathan, 2015). Τα δενδριτικά κύτταρα αποτελούν μια πηγή αρκετών κυτταροκινών γνωστών για το έναυσμα των λειτουργιών των ΝΚ, όπως είναι οι ιντερλευκίνες IL-12, IL-18, IL-15 και ιντερφερόνες τύπου Ι (Walzer et al., 2005). Ως απόκριση στην IL-12, τα NK παράγουν κυρίως IFN-γ, TNF-α και GM-CSF. Η IFN τύπου Ι αυξάνει την κυτταροτοξικότητα των ΝΚ και η IL-18 λειτουργεί συνεργιστικά με την IL-12 στην έκκριση της IFN-γ (Murphy, 2012; Chijioke & Münz, 2013). Με τη σειρά τους, τα ΝΚ επηρεάζουν την ωρίμανση των δενδριτικών κυττάρων μέσω του TNF και της IFN-γ. Ο TNF ενισχύει την έκφραση των συνδιεγερτικών μορίων στα δενδριτικά και λειτουργεί συνεργιστικά με την IFN-γ συνεισφέροντας στην παραγωγή IL-12 από αυτά, 50

52 ενώ η επαγόμενη από την IFN-γ έκφραση της μεμβρανόδετης μορφής της IL- 15 στην επιφάνειά τους, στηρίζει την επιβίωση και ενεργοποίηση τόσο των Τ όσο και των ΝΚ κυττάρων. Υπάρχει δηλαδή μια αμφίδρομη σχέση (Εικόνα 27) μεταξύ των δενδριτικών και των ΝΚ κυττάρων, γνωστή ως cross-talk (Ferlazzo & Morandi, 2014). Εικόνα 27: Cross-talk ΝΚ και δενδριτικών κυττάρων. Η αλληλεπίδραση μεταξύ ΝΚ και δενδριτικών κυττάρων έχει ως αποτέλεσμα την αμοιβαία ενεργοποίηση: ώριμα δενδριτικά απελευθερώνουν κυτταροκίνες ικανές να προωθούν την ενεργοποίηση των ΝΚ. Με τη σειρά της η IFN-γ που απελευθερώνεται από τα ενεργοποιημένα ΝΚ προωθεί την πόλωση των Th1 και μαζί με τον TNF, την ωρίμανση των DCs και τη μετανάστευσή τους στους λεμφαδένες. Τα ενεργοποιημένα ΝΚ επίσης προκαλούν λύση καρκινικών κυττάρων, με αποτέλεσμα τη δημιουργία καρκινικού αντιγονικού υλικού, το οποίο εγκολπώνεται από τα δενδριτικά κύτταρα, επεξεργάζεται και παρουσιάζεται από τα ώριμα δενδριτικά τόσο στα CD8 + όσο και στα CD4 + T κύτταρα (προσαρμογή από Ferlazzo & Morandi, 2014). 51

53 Η δραστηριότητα των ΝΚ κυττάρων ρυθμίζεται μέσω της εξισορρόπησης των εισροών από τους υποδοχείς ενεργοποίησης και τους ανασταλτικούς υποδοχείς. Οι πιο σημαντικοί προσδέτες για τους ανασταλτικούς υποδοχείς είναι τα μόρια της τάξης Ι του MHC. Επειδή τα φυσιολογικά κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα αυτών των μορίων, τις περισσότερες φορές προστατεύονται από τη θανάτωση από τα ΝΚ κύτταρα. Αντίθετα, τα κύτταραστόχοι που εκφράζουν μειορυθμισμένα επίπεδα MHC τάξης Ι αντιμετωπίζονται ως «απώλεια εαυτού» και θανατώνονται (Sternberg-Simon et al., 2013). Η υπόθεση της απώλειας εαυτού (missing-self hypothesis) αναφέρει πως τα ΝΚ κύτταρα ενεργοποιούνται να σκοτώσουν κύτταρα-στόχους, συμπεριλαμβανομένων καρκινικών κυττάρων και κυττάρων μολυσμένων από ιούς, όταν συναντούν ένα κύτταρο του οργανισμού το οποίο στερείται μόρια MHC-I του εαυτού. Όπως φαίνεται και στην εικόνα 28, όταν τα ΝΚ συναντούν κύτταρα τα οποία δεν φέρουν προσδέτες για τους υποδοχείς ενεργοποίησής τους (28α και 28β), τότε δεν ξεκινά κάποια απόκριση. Αντίθετα, όταν τα ΝΚ κύτταρα αλληλεπιδρούν με κύτταρα μολυσμένα από ιό ή μετασχηματισμένα, τα οποία εκφράζουν προσδέτες για τους υποδοχείς ενεργοποίησής τους (28γ και 28δ), τότε η απόκρισή τους διαμορφώνεται από τα σήματα που λαμβάνονται από τους ανασταλτικούς υποδοχείς για τα MHC-I μόρια. Στην περίπτωση των ιών που μειορυθμίζουν τα MHC-I μόρια στο μολυσμένο κύτταρο, μπορεί να υπάρχει μια ισχυρή απόκριση από τα ΝΚ εξαιτίας της έλλειψης της δέσμευσης των ανασταλτικών υποδοχέων τους. Για τους ιούς οι οποίοι δεν μειορυθμίζουν τα MHC-I μόρια ή αυξάνουν την έκφρασή τους στο μολυσμένο κύτταρο, τα ΝΚ μπορεί ακόμα να είναι σε θέση να επιτεθούν στα μολυσμένα κύτταρα υπό την προϋπόθεση ότι τα σήματα από τους υποδοχείς ενεργοποίησης μπορούν να υπερνικήσουν τα ανασταλτικά σήματα (Lodoen & Lanier, 2005). Tα καρκινικά κύτταρα (Εικόνα 29), συχνά μειορυθμίζουν την έκφραση των MHC-I μορίων για να αποφύγουν την αναγνώριση από τα κυτταροτοξικά Τ λεμφοκύτταρα, με αποτέλεσμα να γίνονται ευάλωτα στην επίθεση από τα ΝΚ κύτταρα (Mandal & Viswanathan, 2015). Παράλληλα, το κυτταρικό στρες και η καταστροφή του DNA οδηγούν στην αυξορύθμιση των προσδετών για τους ΝΚ υποδοχείς ενεργοποίησης στο καρκινικό κύτταρο. Σε συνδυασμό αυτά τα γεγονότα οδηγούν στη θανάτωση του κυττάρου-στόχου (Ljunggren & Malmberg, 2007). 52

54 Εικόνα 28: Η υπόθεση απώλειας εαυτού (προσαρμογή από Lodoen & Lanier, 2005). Εικόνα 29: Αναγνώριση καρκινικών κυττάρων με βάση την απώλεια εαυτού (προσαρμογή από Ljunggren & Malmberg, 2007). 53

55 Τα ΝΚ κύτταρα πρέπει να συσσωρεύσουν σήματα από πολλούς υποδοχείς (κωδικοποιημένους από τη γαμετική σειρά), ώστε να ανιχνεύσουν το περιβάλλον τους και να αποκριθούν κατάλληλα σε αλλαγές που προκαλούνται από μολύνσεις, κυτταρικό στρες και μετασχηματισμό κυττάρων. Οι υποδοχείς αυτοί λειτουργούν συνδυαστικά, με συνεργιστικά σήματα, χωρίς να υπάρχει κάποιος που να επικρατεί των υπολοίπων. Όπως φαίνεται και στην εικόνα 30, η λειτουργία των ΝΚ κυττάρων μεσολαβείται και ρυθμίζεται από διαλυτούς παράγοντες στους οποίους συμπεριλαμβάνονται χυμοκίνες, κυτταροκίνες και άλλοι εκκρινόμενοι προσδέτες των υποδοχέων τους και ως απόκριση σε αυτούς τα ΝΚ εκκρίνουν IFN-γ, TNF-α, άλλες κυτταροκίνες, και χυμοκίνες (Long et al., 2013). Κυτταροκίνες όπως η IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 και IFN-α,β μπορούν να επάγουν τον πολλαπλασιασμό των ΝΚ όπως και την προώθηση της κυτταροτοξικότητας και/ή παραγωγής IFN-γ (Smyth et al., 2005). Για τη θανάτωση του κυττάρου-στόχου απαιτούνται σήματα για την πόλωση και αποκοκκίωση κοκκίων λύσης (Long et al., 2013). Εικόνα 30: Πολλαπλά σήματα ρυθμίζουν τις αποκρίσεις των ΝΚ. Μία σειρά από ενεργοποιητικούς υποδοχείς συνδέεται στους προσδέτες σε άλλα κύτταρα. Οι ανασταλτικοί παράγοντες (κόκκινο) για τα MHC-I μόρια ασκούν αναστολή της κυταροτοξικότητας και της έκκρισης (προσαρμογή από Long et al., 2013). 54

56 Η λύση των κυττάρων-στόχων από τα ΝΚ κύτταρα περιλαμβάνει ένα εκκριτικό και έναν μη εκκριτικό μηχανισμό. Ο εκκριτικός μηχανισμός προκύπτει από ρυθμισμένη έκκριση εξειδικευμένων λυσοσωμάτων, τα οποία επάγουν τη γρήγορη απόπτωση των κυττάρων-στόχων (Εικόνα 31) (Mocchegiani & Malavolta, 2004). Εικόνα 31: Το κυτολυτικό μονοπάτι περφορίνης-γρανενζύμων. Το γρανένζυμο Β μπορεί να εισέλθει στο κύτταρο-στόχο και χωρίς τη βοήθεια του καναλιού περφορίνης (πιθανόν μέσω της πρόσδεσής του στον υποδοχέα mannose 6-phosphate/insulin-like growth factor II) με την ενδοκυττάρωση να ακολουθεί (προσαρμογή από Van den Brink & Burakoff, 2002). Τα λυσοσώματα περιέχουν περφορίνη (perforin), η οποία καταστρέφει την κυτταρική μεμβράνη και απαιτείται για τη μεταφορά στα κύτταρα-στόχους 55

57 των σερινών πρωτεασών γρανενζύμων (granzymes) Β και Η, τα οποία με τη σειρά τους εκκινούν τον αποπτωτικό «καταρράκτη», διασπώντας υποστρώματα στο κυτοσόλιο των κυττάρων (Mocchegiani & Malavolta, 2004). Με την αναγνώριση του κυττάρου-στόχου, το περιεχόμενο των κοκκίων απελευθερώνεται με εξωκυττάρωση και τα μονομερή περφορίνης εισέρχονται στη μεμβράνη του κυττάρου-στόχου, όπου πολυμερίζονται σε συσσωματώματα σχηματίζοντας πόρους. Οι πόροι προκαλούν ωσμωτική λύση του κυττάρου και επιτρέπουν την είσοδο των γρανενζύμων επάγοντας έτσι την απόπτωσή του στόχου (Van den Brink & Burakoff, 2002). Οι μη εκκριτικοί μηχανισμοί αφορούν τη σύνδεση μορίων υποδοχέων ομοιαζόντων με τον TNF (TNF receptor-like) όπως ο Fas/CD95, με τους αντίστοιχους προσδέτες τους (FasL). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση προ-αποπτωτικών μορίων (π.χ. κασπάση-3) και την επακόλουθη επαγωγή μονοπατιών προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου (Mocchegiani & Malavolta, 2004). Επίσης, η ADCC μπορεί να είναι ένας μηχανισμός για τη θανάτωση καρκινικών κυττάρων από τα ΝΚ καθώς αυτά εκφράζουν έναν χαμηλής συγγένειας Fc υποδοχέα για την IgG, τον FcγRIII (CD16) (Mandal & Viswanathan, 2015). Η ADCC αφορά τη θανάτωση ενός καλυμμένου με αντισώματα κυττάρου-στόχου (Εικόνα 32), μέσω μη φαγοκυτταρικής διαδικασίας και χαρακτηρίζεται από την απελευθέρωση του περιεχομένου των κυτταροτοξικών κοκκίων από τα κύτταρα-τελεστές ή της έκφρασης μορίων που επάγουν τον κυτταρικό θάνατο. Ενεργοποιείται με την αλληλεπίδραση των προσδεδεμένων στο στόχο IgG ή IgA ή IgE αντισωμάτων με συγκεκριμένους Fc υποδοχείς, δηλαδή τις γλυκοπρωτεΐνες που βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων-τελεστών και δένουν στην Fc περιοχή των ανοσοσφαιρινών (Teillaud, 2012). 56

58 Εικόνα 32: Λύση οψωνινοποιημένου από ανοσοσφαιρίνη κυττάρου, από ΝΚ κύτταρα. Το κύτταρο θανατώνεται από την έκκριση των γρανενζύμων τα οποία εισέρχονται σε αυτό από τους πόρους περφορίνης (προσαρμογή από Υποδοχείς ενεργοποίησης των ΝΚ κυττάρων Ένα συγκεκριμένο ΝΚ κύτταρο τυπικά εκφράζει δύο έως τέσσερεις ανασταλτικούς υποδοχείς, πέραν της σειράς υποδοχέων ενεργοποίησης (Εικόνα 33). Καθώς διαφορετικά ΝΚ εκφράζουν διαφορετικούς συνδυασμούς ανασταλτικών ή ενεργοποιητικών υποδοχέων, υπάρχει σημαντική ετερογένεια εντός του πληθυσμού των ΝΚ κυττάρων. Για το λόγο αυτό, τα ΝΚ θεωρούνται πως έχουν την ικανότητα να αποκρίνονται σε μια ποικιλία ερεθισμάτων και να συμμετέχουν στις ανοσολογικές αποκρίσεις κάτω από διαφορετικές παθολογικές συνθήκες (Mandal & Viswanathan, 2015). Τα ερεθίσματα για την ενεργοποίηση μπορούν να μεταφέρονται στα ΝΚ κύτταρα μέσω των TLRs (TLR2, TLR3, TLR7/8, TLR9), των υποδοχέων ιντερλευκίνης (IL-2, IL-12, IL-15, IL-18) και συνδυασμό αυτών (π.χ. IL-2+IL-15, IL-2+IL12, IL-12+IL-18) ή μέσω ενεργοποιητικών υποδοχέων που αντιπροσωπεύουν μια σειρά από διαφορετικά μόρια εκφραζόμενα στην επιφάνεια των ΝΚ, συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων φυσικής κυτταροτοξικότητας (natural 57

59 cytotoxicity receptors, NCRs), του NKG2D, του NKG2C (τύπου λεκτίνης υποδοχέας ο οποίος διμερίζεται με το CD94), 2B4 (CD244), NKp80, DNAM-1, NTB-A και του υποδοχέα για την IgFc (CD16) (Marras et al., 2011). Εικόνα 33: Υποδοχείς των ΝΚ κυττάρων και οι συγγενείς προσδέτες τους (προσαρμογή από Chan et al., 2014). Η σύνδεση του υποδοχέα με τον προσδέτη πυροδοτεί την αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων Ca 2+, την αυξορύθμιση της επαγόμενης από ιντεγκρίνη προσκόλλησης και την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, οδηγώντας έτσι στο σχηματισμό ακτινωτά συμμετρικής επαφής κυττάρου με κύτταρο που καλείται κυτολυτική σύναψη. Διαλυτοί κυτταροτοξικοί παράγοντες, όπως είναι η περφορίνη και τα γρανένζυμα που αναφέρθηκαν πιο πριν, εκκρίνονται από το ΝΚ κύτταρο μέσα στη σύναψη για τη θανάτωση 58

60 του στόχου (Abeyweera et al., 2011). Στη συνέχεια ακολουθεί η περιγραφή κάποιων από τους υποδοχείς ενεργοποίησης. TLRs Οι TLRs μπορούν να επάγουν την ενεργοποίηση των ΝΚ μέσω της ενσωμάτωσης με τους αντίστοιχους προσδέτες τους. Έχει αναφερθεί πως σχεδόν όλοι οι TLRs εκφράζονται διαφοροποιημένα στα ανθρώπινα ΝΚ κύτταρα. Οι TLR2, TLR3, TLR5 και TLR6 έχουν την πρωταρχική έκφραση, ενώ υπάρχει σχετικά χαμηλή έκφραση των TLR4, TLR7, TLR8 ή TLR9. Το προφίλ της έκφρασης μπορεί να διαφέρει μεταξύ των διαφορετικών ΝΚ πληθυσμών. Για παράδειγμα τα CD56 bright ΝΚ έχει βρεθεί πως εκφράζουν κατά προτίμηση TLR2, ενώ τα CD56 dim εκφράζουν TLR3 (Guo & Zhang, 2012). Ωστόσο, υπάρχουν ακόμα διαμάχες σχετικά με την έκφραση των TLRs στα ΝΚ και την απόκρισή τους στους αγωνιστές, ειδικά στην απαίτηση για την παρουσία βοηθητικών κυττάρων όπως τα δενδριτικά κύτταρα ή κυτταροκινών (IL-2, IL-12, IL-15 και IL-18) (Adib-Conquy et al., 2014). NCRs Στους NCRs ανήκουν ο ΝΚp30 (επίσης γνωστός ως NCR3, NCTR3 και CD337), ο NKp44 (γνωστός ως NCR2, NCTR2 και CD336) και ο NKp46 (γνωστός και ως NCR1, NCTR1 και CD335) (Koch et al., 2013). Η έκφρασή τους περιορίζεται κυρίως στα ΝΚ κύτταρα και αποτελούν, ιδιαίτερα στην περίπτωση του NKp46, τους πιο ακριβείς επιφανειακούς μάρτυρες για την αναγνώριση των ανθρώπινων ΝΚ κυττάρων (Marras et al., 2011). Η αποτελεσματικότητα της θανάτωσης των καρκινικών κυττάρων από τα ΝΚ κύτταρα έχει δειχθεί να συσχετίζεται με τα επίπεδα έκφρασης των NCRs, καθορίζοντας τον NCR bright ή NCR dull φαινότυπο. Οι υποδοχείς αυτοί είναι τύπου Ι μεμβρανικές πρωτεΐνες και ανήκουν στην υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών. Όλοι οι NCRs αποτελούνται από μία εξωκυτταρική περιοχή η οποία δένει σε κυτταρικούς και εξωγενείς προσδέτες, μια διαμεμβρανική και μια μικρή κυτοσολική περιοχή. Στερούνται μιας λειτουργικής ενδοκυτταρικής περιοχής σηματοδότησης και για το λόγο αυτό σχετίζονται με κατάλληλες πρωτεΐνες-προσαρμογείς μέσω ενός φορτισμένου καταλοίπου στην διαμεμβρανική τους περιοχή. Τα σηματοδοτικά μονοπάτια των NCRs 59

61 εμπλέκουν πολλά από τα γνωστά σηματοδοτικά μόρια εξαρτώμενα από μοτίβα ΙΤΑΜ (intracellular immunoreceptor tyrosine based activation motifs). Αυτά περιλαμβάνουν την SRC οικογένεια κινασών, οι οποίες φωσφορυλιώνουν τα ΙΤΑΜ των μορίων-προσαρμογέων του NCR, με αποτέλεσμα τη στρατολόγηση και ενεργοποίηση της ΖΑΡ 70 (zeta chainassociated protein kinase 70) και της SYK (spleen tyrosine kinase). Αυτές οι κινάσες φωσφορυλιώνουν διαμεμβρανικά μόρια-προσαρμογείς όπως είναι τα LAT (linker for the activation of T cells) και NTAL (non-t cell activation linker), οδηγώντας στη σύνδεση, φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση σηματοδοτικών μορίων όπως η PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase), η φωσφολιπάση C (PLC-γ1), PLC-γ2, VAV2 και VAV3. Μέσω αυτών των σηματοδοτικών πρωτεϊνών, επάγονται ροή Ca 2+ και αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, που καταλήγουν σε κυτταρική κυτταροτοξικότητα και έκκριση κυτταροκινών όπως είναι η IFN-γ και ο TNF-α (Koch et al., 2013). Στον πίνακα 2 αναφέρονται οι NCRs και οι προσδέτες τους. Πίνακας 2: Οι ανθρώπινοι NCRs και οι προσδέτες τους (Koch et al., 2013). 60

62 NKG2D Ο NKG2D είναι μία τύπου ΙΙ διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, εκφραζόμενη στην κυτταρική επιφάνεια ως ομοδιμερές συνδεδεμένο με δισουλφιδικούς δεσμούς. Λειτουργεί ως ένας πρωταρχικός υποδοχέας ενεργοποίησης, πράγμα που σημαίνει ότι η σύνδεσή του μπορεί να υπερισχύσει των ανασταλτικών σημάτων κατά την απουσία της αναγνώρισης απώλειας εαυτού (Slavuljica et al., 2011). O υποδοχέας NKG2D στον άνθρωπο, εκφράζεται σε όλα τα ΝΚ, τα CD8 + TCR-αβ, τα TCR-γδ Τ κύτταρα και τα περισσότερα ΝΚ-Τ (Mistry & O Callaghan, 2007; Slavuljica et al., 2011). Μετά από αλληλεπίδραση με τους προσδέτες του, ο NKG2D μπορεί να ενεργοποιήσει την επαγόμενη από ΝΚ κυτταροτοξικότητα ενάντια στους στόχους τους (Chan et al., 2014). Στους ανθρώπους έχουν αναγνωριστεί δύο οικογένειες προσδετών, η MIC (MHC class I chain-related protein family) στην οποία ανήκουν οι MIC-A και MIC-B πρωτεΐνες και η ULBP1-6 (HCMV UL16- binding proteins) (Spear et al., 2013). Οι προσδέτες του NKG2D είναι γενικά απόντες από την κυτταρική επιφάνεια των υγιών κυττάρων, αλλά συχνά αυξορυθμίζονται κατόπιν κυτταρικού στρες το οποίο σχετίζεται με ιική μόλυνση και κακοήθη μετασχηματισμό (Chan et al., 2014). Όπως και πολλοί άλλοι υποδοχείς ενεργοποίησης, έτσι και ο NKG2D σχετίζεται με μια πρωτεΐνη-προσαρμογέα για την έναρξη μεταγωγής σήματος και την κυτταρική ενεργοποίηση (Εικόνα 34). Μία θετικά φορτισμένη αργινίνη στη διαμεμβρανική περιοχή του υποδοχέα, συνδέεται με ένα αρνητικά φορτισμένο ασπαρτικό οξύ της διαμεμβρανικής περιοχής της πρωτεΐνηςπροσαρμογέα DNAX- ενεργοποιητικής πρωτεΐνης (DAP10). Αν και αρκετές πρωτεΐνες-προσαρμογείς περιέχουν ένα κυτταροπλασματικό μοτίβο ΙΤΑΜ για τη μεταγωγή σήματος, η DAP10 περιέχει ένα ΥΧΧΜ βασιζόμενο σε τυροσίνη μοτίβο (χρησιμοποιείται ο κώδικας ενός γράμματος για τα αμινοξέα και το X υποδηλώνει οποιοδήποτε αμινοξύ) το οποίο στρατολογεί και ενεργοποιεί την p85 υπομονάδα της PI3K και την Grb2 (growth factor receptor-bound protein 2). Κάθε ομοδιμερές NKG2D συνδέεται με δύο ομοδιμερή DAP10, σχηματίζοντας έτσι μια εξαμερή δομή (Lanier, 2003; Spear et al., 2013). 61

63 Εικόνα 34: Με τη σύνδεση του προσδέτη, ο NKG2D ξεκινά καταρράκτες μεταγωγής σήματος μέσω των μορίων-προσαρμογέων. Η σχετιζόμενη με τη DAP10 μορφή του NKG2D ενεργοποιεί PI3K και Grb2/Vav, ενώ στο ποντίκι η σχετιζόμενη με την DAP12 μορφή ενεργοποιεί SYK και ZAP70 (προσαρμογή από Spear et al., 2013). akirs Οι υποδοχείς ενεργοποίησης KIR (activating killer cell Ig-like receptors, akir) περιλαμβάνουν τους KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS4, KIR2DS5 και KIR3DS1. Η εξειδίκευση του κάθε υποδοχέα, καθώς επίσης και η έκφρασή τους στην επιφάνεια των κυττάρων δεν έχουν ακόμα διαλευκανθεί παρά το γεγονός ότι οι εξωκυτταρικές περιοχές τους μοιάζουν πάρα πολύ με τους ανασταλτικούς ομολόγους τους, όσον αφορά την αλληλουχία και την τρισδιάστατη δομή. Είναι πιθανό πως οι κύριοι προσδέτες τους είναι τα μόρια HLA της τάξης Ι. Ωστόσο, παραμένει επίσης πιθανό πως αυτοί οι υποδοχείς θα μπορούσαν να αναγνωρίζουν αλλαγμένα σύμπλοκα HLA τάξης Ι, όπως για παράδειγμα σύμπλοκα με ιικές πρωτεΐνες (Ivarsson et al., 2014). DNAM-1 Ο επιφανειακός υποδοχέας DNAM-1, γνωστός και ως CD226, είναι ένα μέλος της οικογένειας των ανοσοσφαιρινών και εμπλέκεται στην αναγνώριση κυττάρων-στόχων από κυτταροτοξικά κύτταρα. Έχει δύο γνωστούς 62

64 προσδέτες, τον CD112 (Nectin-2) και τον CD155 (PVR- Poliovirus receptor). Οι CD112 και CD155 κατανέμονται ευρέως στα αιμοποιητικά, επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα σε διαφορετικές ποσότητες σε πολλούς ιστούς, καθώς και σε πολλούς τύπους όγκων στον άνθρωπο και στο ποντίκι. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ του υποδοχέα και των προσδετών του στα κύτταραστόχους, αυξάνουν την επαγόμενη από κύτταρα κυτταροτοξικότητα (El- Sherbiny et al., 2007; Nabekura et al., 2010). CD16 (FCγRIII) Ο υποδοχέας CD16 (FCγRIII) προσδένεται στην Fc περιοχή των IgG αντισωμάτων. Ένας τύπος αυτού, ο CD16A, είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη η οποία συνεντοπίζεται με τις πρωτεΐνες-προσαρμογείς CD3ζ και Fc-εRI-γ στα ΝΚ κύτταρα. Μετά από τη σύνδεση επάγει μια ισχυρή σειρά από σήματα με αποτέλεσμα την παραγωγή κυτταροκινών και κυτταροτοξική δραστηριότητα μέσω ADCC. Τα περισσότερα CD56 bright ΝΚ στο περιφερικό αίμα εκφράζουν λίγο έως καθόλου CD16A, ενώ η πλειοψηφία των CD56 dim εκφράζουν ενιαία υψηλά επίπεδα του CD16A (Romee et al., 2013) Ανασταλτικοί υποδοχείς των ΝΚ κυττάρων Στους υποδοχείς ενεργοποίησης των ΝΚ αντιτίθεται μια ομάδα ανασταλτικών υποδοχέων, οι οποίοι περιέχουν ένα κυτταροπλασματικό μοτίβο σηματοδότησης γνωστό ως ΙΤΙΜ (immunotyrosine-based inhibitory motif). Αν και οι ΙΤΙΜ υποδοχείς ρυθμίζουν πολλαπλούς κυτταρικούς τύπους, είναι ιδιαίτερα σημαντικοί για τον έλεγχο της δραστηριότητας των λεμφοκυττάρων και την πρόληψη της αυτοανοσίας. Στα ΝΚ κύτταρα παρεμποδίζουν την κυτταρόλυση του φυσιολογικού υγιούς ιστού αναγνωρίζοντας την τάξη Ι του MHC, το οποίο εκφράζεται στην επιφάνεια των περισσότερων κυτταρικών τύπων και εξυπηρετεί ως μάρτυρας για τον εαυτό (Abeyweera et al., 2011). Όταν ένα ώριμο ΝΚ κύτταρο συναντήσει ένα σπάνιο μη φυσιολογικό κύτταρο το οποίο έχει έλλειψη MHC-I, οι υποδοχείς αναστολής δεν είναι δεσμευμένοι και τα μη κατασταλμένα σήματα ενεργοποίησης πυροδοτούν τη στοχευμένη επίθεση (Campbell & Hasegawa, 2013). Η σύνδεση με το MHC επάγει τη φωσφορυλίωση του ΙΤΙΜ και την επακόλουθη στρατολόγηση των 63

65 SHP-1 και SHP-2, οι οποίες είναι τυροσίνες-φωσφατάσες και αποφωσφορυλιώνουν τα σηματοδοτικά μόρια που απαιτούνται για τις αποκρίσεις ενεργοποίησης (Abeyweera et al., 2011). Γενικά, η αναστολή που ασκείται από τους υποδοχείς ΙΤΙΜ είναι μόνο τοπική και παροδική. Δεν επάγει μία μη-απόκριση σε όλη την έκταση του κυττάρου ή παρατεταμένη, αλλά ακυρώνει τα σήματα ενεργοποίησης όταν και όπου συμβούν (Long, 2008). Μεταξύ των ανασταλτικών υποδοχέων, οι KIR (killer cell immunoglobulin-like receptors) συνδέονται με τα κλασικά τάξης Ia μόρια του MHC, ενώ τα ετεροδιμερή CD94/NKG2A αναγνωρίζουν τα μη κλασικά μόρια MHC τάξης Ib (Jaeger & Vivier, 2012). Οι KIR (Εικόνα 35) χαρακτηρίζονται από δύο (KIR2D) ή τρεις (KIR3D) εξωκυτταρικές Ig-like περιοχές (Moretta et al., 2009). Εικόνα 35: Οικογένεια ανασταλτικών (κόκκινο) και ενεργοποιητικών (πράσινο) KIR υποδοχέων (προσαρμογή από Rajagopalan & Long, 2012). Οι ανασταλτικοί KIR έχουν μια διαμεμβρανική περιοχή η οποία περιέχει μόνο υδρόφοβα αμινοξέα και μία μακριά κυτταροπλασματική ουρά (KIR2DL και KIR3DL) με ΙΤΙΜ μοτίβο για τη μεταγωγή αρνητικού σήματος (Biassoni et 64

66 al., 2012). Οι γνωστοί προσδέτες γι αυτούς τους υποδοχείς αντιπροσωπεύονται όλοι από τα MHC-I μόρια: έτσι, το HLA-C αναγνωρίζεται από τους KIR2DL1, KIR2DL2 και KIR2DL3, το HLA-B από τον KIR3DL1 και το HLA-A από τον KIR3DL2, ενώ το HLA-G αναγνωρίζεται από τον KIR2DL4 (Moretta et al., 2009). Ο KIR2DL4 παρά το γεγονός ότι έχει μία μακριά κυτταροπλασματική ουρά, φέρει μόνο ένα μοτίβο ΙΤΙΜ και παρουσιάζει πολύ χαμηλό ανασταλτικό δυναμικό, με τη δέσμευσή του να οδηγεί σε ενεργοποίηση των ΝΚ όχι για κυτταροτοξικότητα, αλλά για παραγωγή κυτταροκινών και χυμοκινών. Ο KIR2DL4 βρίσκεται στα ενδοσώματα, ωστόσο, τα επιφανειακά επίπεδά του μπορούν να αυξορυθμιστούν παροδικά έπειτα από καλλιέργεια ΝΚ κυττάρων παρουσία IL-2 (Rajagopalan & Long, 2012). Ο CD94/NKG2A είναι ένας υποδοχέας λεκτίνης τύπου C, ο οποίος μετά από αλληλεπίδραση με τον προσδέτη του HLA-E, που εκφράζεται στα φυσιολογικά κύτταρα, καταστέλλει τις διαδικασίες μεταγωγής σημάτων ενεργοποίησης (Borrego et al., 2005). O NKG2A είναι μία διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη με δύο ΙΤΙΜ στην κυτταροπλασματική ουρά και συνδέεται με δισουλφιδικό δεσμό με την CD94 γλυκοπρωτεΐνη στην επιφάνεια των ΝΚ κυττάρων σχηματίζοντας ετεροδιμερές (Brooks et al., 1997; Borrego et al., 2002; Srivastava et al., 2003) Φυσικά φονικά Τ κύτταρα (ΝΚ-Τ) Ο όρος ΝΚ-Τ κύτταρα δημοσιεύτηκε για πρώτη φορά το 1995 και χρησιμοποιούταν γενικά για να καθορίσει ένα υποσύνολο Τ κυττάρων στο ποντίκι, το οποίο μοιραζόταν κάποια χαρακτηριστικά με τα ΝΚ κύτταρα, ιδιαιτέρως την έκφραση του δείκτη ΝΚ1.1 (Νkrp1 ή CD161c) (Godfrey et al., 2004). Τα ΝΚ-Τ κύτταρα είναι ένα υποσύνολο Τ λεμφοκυττάρων που εκφράζει επιφανειακούς υποδοχείς χαρακτηριστικούς των Τ και ΝΚ κυτταρικών γενεών. Όπως και τα συμβατικά Τ λεμφοκύτταρα, έτσι και τα ΝΚ-Τ εκφράζουν έναν TCR, αλλά σε αντίθεση με τα συμβατικά Τ τα οποία αντιδρούν με πεπτιδικά αντιγόνα σε σύμπλοκο με μόρια MHC I ή ΙΙ, τα ΝΚ-Τ αντιδρούν με λιπιδικά ή γλυκολιπιδικά αντιγόνα που παρουσιάζονται από τη σχετιζόμενη με τα MHC-I 65

67 μόρια γλυκοπρωτεΐνη, CD1d (Εικόνα 36). Η CD1d εκφράζεται κυρίως από αιμοποιητικά κύτταρα και είναι πιο άφθονη στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, τα CD4 + CD8 + θυμοκύτταρα και τα ΜΖ Β κύτταρα (Van Kaer et al., 2011). Επίσης, τα ΝΚ-Τ κύτταρα χαρακτηρίζονται από την έκφραση CD56 στην επιφάνειά τους (Van Der Vliet et al., 1999). Εικόνα 36: Τα inkt (invariant NK-T) εκφράζουν έναν ημι-αμετάβλητο TCR μαζί με επιφανειακές πρωτεΐνες όπως NK1.1 (ποντίκι) ή CD161 (άνθρωπος) και Ly49 (ποντίκι). Τα περισσότερα ink-t επίσης εκφράζουν τον συνυποδοχέα CD4 (προσαρμογή από Van Kaer et al., 2011). Τα ΝΚ-Τ είναι στη μοναδική θέση να μπορούν να ρυθμίζουν τόσο τις πρώιμες εγγενείς διαδικασίες της φλεγμονής, όσο και την επαγωγή των μετέπειτα ειδικών αποκρίσεων και έχουν την ικανότητα να ενισχύουν τις προφλεγμονώδεις λειτουργίες άλλων εγγενών λεμφοκυτταρικών πληθυσμών, όπως τα ΝΚ και συνεισφέρουν στον καθαρισμό μιας ποικιλίας μικροβιακών μολύνσεων (Fox et al., 2010). Θεωρούνται ως ένας σημαντικός σύνδεσμος μεταξύ εγγενούς και επίκτητης ανοσολογικής απόκρισης (Juno et al., 2012). Τα κύτταρα αυτά έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον επειδή, όπως και τα ΝΚ, είναι πολύ σημαντικά στη ρύθμιση της ανοσίας μέσω της απελευθέρωσης κυτταροκινών. Όπως και τα ΝΚ, έτσι και τα ΝΚ-Τ συνθέτουν και εκκρίνουν IFN-γ, η οποία προωθεί τις Th1 αποκρίσεις και είναι ικανά να παράγουν σημαντικές ποσότητες IL-4, η οποία προκαλεί μία Th2 απόκριση. Με αυτό τον τρόπο, μπορούν να κατευθύνουν την Τ ανοσολογική απόκριση είτε προς την Th1 είτε προς την Th2 κατεύθυνση (Seaman, 2000). Αν και αποτελούν μόνο ένα μικρό ποσοστό των λεμφοκυττάρων, της τάξης του 0,01-2% των 66

68 ανθρώπινων μονοπύρηνων κυττάρων του περιφερικού αίματος (PBMCs), παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο καθώς μπορούν να ρυθμίσουν πολλούς άλλους κυτταρικούς τύπους όπως τα μακροφάγα, δενδριτικά, CD8 + T και τα ΝΚ κύτταρα (O' Konek et al., 2012) Τύποι ΝΚ-Τ κυττάρων Έχουν αναγνωρισθεί δύο υποσύνολα ΝΚ-Τ κυττάρων, τα τύπου Ι και τύπου ΙΙ, τα οποία και τα δύο αναγνωρίζουν τα λιπιδικά αντιγόνα που προέρχονται από παθογόνα, καθώς επίσης και ενδογενή αντιγόνα τα οποία εκφράζονται κατά τη διάρκεια των φλεγμονωδών αποκρίσεων. Τα τύπου Ι ΝΚ-Τ, τα οποία καλούνται και ink-t (invariant NK-T) (Juno et al., 2012), εκφράζουν έναν αμετάβλητο TCR (Vα24Jα18) και αυτή η περιορισμένη μορφή του, τους επιτρέπει να αναγνωρίζουν ξένα και ενδογενή λιπιδικά αντιγόνα με δομικές ομοιότητες. Τα ink-t στον άνθρωπο μπορεί να είναι CD4 + CD8 -, CD4 - CD8 - ή CD4 - CD8 + και βρίσκονται σε ιστούς όπου φυσιολογικά απαντώνται τα λεμφοκύτταρα, συμπεριλαμβανομένων του σπλήνα, του αίματος, του μυελού των οστών, των λεμφαδένων, του θύμου και του ήπατος, με την υψηλότερη συγκέντρωσή τους περίπου στο 0,5% να βρίσκεται στο ήπαρ. Τα τύπου ΙΙ ΝΚ-Τ (variant NK-T, vnk-t) είναι λιγότερο μελετημένα, γιατί δεν είναι διαθέσιμα τα αντιδραστήρια που ανιχνεύουν ειδικά αυτά τα κύτταρα. Είναι είτε CD4 + CD8 - είτε CD4 - CD8 + και στον άνθρωπο αποτελούν την πλειοψηφία των ΝΚ-Τ, ενώ βρίσκονται στους ίδιους ιστούς με τα τύπου Ι (Subleski et al., 2011). Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της ενεργοποίησης των ink-t είναι η γρήγορη παραγωγή ενός ευρέος φάσματος κυτταροκινών και χυμοκινών, συμπεριλαμβανομένων των IFN-γ, TNF-α, TGF-β, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, IL-21, RANTES, εοταξίνη, MIP-1α και MIP-1β. Τα CD4 + inkt παράγουν και Th1 και Th2 κυτταροκίνες, ενώ τα CD4 - γενικά παράγουν μόνο Th1 κυτταροκίνες. Άλλες εκτελεστικές λειτουργίες των ink-t περιλαμβάνουν την απελευθέρωση περφορίνης/γρανενζύμων και κυτταροτοξικότητα μέσω Fas/FasL. Τα ink-t μπορούν να παίξουν ένα σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση και ρύθμιση πολλαπλών υποσυνόλων κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος (Εικόνα 37) όπως είναι τα ΝΚ, τα 67

69 Τ, τα ρυθμιστικά Τ και τα Β λεμφοκύτταρα. Διέγερση των ink-t σε συνδυασμό με διαλυτό Τ κυτταρικό αντιγόνο, ενισχύει τόσο τις CD4 + όσο και τις CD8 + ειδικές για το αντιγόνο αποκρίσεις μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει μεταγωγή σήματος μέσω του CD40. Με παρόμοιο τρόπο, η ενεργοποίησή τους βελτιώνει τη συγκέντρωση των αντισωμάτων, δρα ως υποκατάστατο της βοήθειας των CD4 + Τ στα Β κύτταρα και ενισχύει τα Β κύτταρα μνήμης στα ποντίκια (Juno et al., 2012). Εικόνα 37: Ρύθμιση από τα ink-t της ενεργοποίησης των ΝΚ, Τ και Β κυττάρων (προσαρμογή από Juno et al., 2012) Ενεργοποίηση και δράση NK-T κυττάρων Ο κύριος ανοσολογικός ρόλος των ΝΚ-Τ είναι ο εναρμονισμός των κυττάρων επίκτητης και εγγενούς ανοσίας, μέσω της έκφρασης στην κυτταρική τους επιφάνεια συνδιεγερτικών μορίων και έκκρισης κυτταροκινών, παρά η απευθείας δράση τους ως κύτταρα-τελεστές. Τα ΝΚ-Τ ανιχνεύουν αλλαγές στο τοπικό μικροπεριβάλλον τους μέσω πολλαπλών μέσων τα οποία λειτουργούν 68

70 ατομικά ή σε συνδυασμό το ένα με το άλλο, για να επηρεάσουν τον τύπο και το μέγεθος της απόκρισης. Αυτά τα μονοπάτια ενεργοποίησης επιτελούνται κυρίως με τη μεσολάβηση κυτταροκινών, μοριακών μοτίβων σχετιζόμενων με παθογόνα και γλυκολιπιδικών αντιγόνων (Subleski et al., 2011). Ένας κρίσιμος παράγοντας για την παραγωγή κυτταροκινών από τα ΝΚ- Τ κύτταρα είναι τα επίπεδα του CD1d που εκφράζονται από το αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο σε συνδυασμό με την ταυτότητα και την αφθονία των παρουσιαζόμενων αντιγόνων. Αυτές οι μεταβλητές έρχονται όλες μαζί να καθορίσουν την ισχύ της διέγερσης των ΝΚ-Τ από τον TCR (Εικόνα 38). Έτσι, ενώ τα ΝΚ-Τ παράγουν μια ποικιλία κυτταροκινών (π.χ. GM-CSF, IL-13, IFN-γ, IL-4, IL-2) ως απόκριση σε ισχυρή διέγερση από τον TCR που προκύπτει από έκθεση σε υψηλές δόσεις σε ένα υψηλής συγγένειας αντιγόνο, παράγουν ένα πιο περιορισμένο σύνολο (κυρίως GM-CSF και IL-13) ως απάντηση σε χαμηλά επίπεδα TCR διέγερσης. Επιπλέον, οι αποκρίσεις των ΝΚ-Τ κυττάρων επηρεάζονται από τις κυτταροκίνες που βρίσκονται στο περιβάλλον τους (Fox et al., 2010). Εικόνα 38: Μεταβλητές που επηρεάζουν την παραγωγή κυτταροκινών από τα ΝΚ-Τ. (1) επίπεδα εκφραζόμενου CD1d, (2) τύπος και ποιότητα αντιγόνου, (3) ισχύς σήματος μέσω του TCR και (4) συνδιεγερτικά μόρια ενισχύουν τις ΝΚ-Τ αποκρίσεις σε σπάνια ή αδύναμα αντιγόνα και ενισχύουν την παραγωγή IFN-γ (προσαρμογή από Fox et al., 2010). Η αντιγονική ενεργοποίηση των ΝΚ-Τ κυττάρων μπορεί να συμβεί άμεσα ή έμμεσα (Εικόνα 39). Η άμεση ενεργοποίηση περιλαμβάνει την 69

71 ενδοκυττάρωση γλυκολιπιδικών αντιγόνων όπως το αgalcer (ink-t) ή το σουλφατίδιο (vnk-t), από τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα και την παρουσίασή τους στα ΝΚ-Τ σε σύμπλοκα CD1d-αντιγόνου. Αυτό το μονοπάτι οδηγεί στη γρήγορη έκφραση ρυθμιστικών/th2 (π.χ. IL-13, IL-10 και IL-4) και προφλεγμονωδών (IFN-γ και TNF) κυτταροκινών από τα ink-t. Η αμοιβαία σχέση (cross-talk) μεταξύ δενδριτικών και ink-t κυττάρων περιλαμβάνει την αυξορύθμιση του CD154 (CD40L) το οποίο με τη σειρά του πυροδοτεί τη CD40 σηματοδότηση στα δενδριτικά κύτταρα, επάγοντας την ωρίμανσή τους και την έκκριση IL-12. Η εκκρινόμενη από τα δενδριτικά IL-12 στη συνέχεια ενεργοποιεί ΝΚ και ΝΚ-Τ κύτταρα για παραγωγή IFN-γ που με τη σειρά της κι αυτή διαμορφώνει τη δραστηριότητα των ΝΚ και CD8 + T κυττάρων. Η έμμεση οδός ενεργοποίησης των ΝΚ-Τ από αντιγόνα συμβαίνει όταν τα APCs ενεργοποιούνται μέσω TLRs οι οποίοι πυροδοτούν το «φόρτωμα» των CD1d μορίων με ενδογενή γλυκολιπιδικά αντιγόνα και στη συνέχεια παρουσιάζονται στα NK-T. Ωστόσο, παραμένει ακόμα να διερευνηθεί εάν άλλα φλεγμονώδη σήματα που ενεργοποιούν τα APCs μπορούν επίσης να επάγουν και την έμμεση ενεργοποίηση των ΝΚ-Τ (Subleski et al., 2011). Εικόνα 39: Μονοπάτια της ενεργοποίησης των ink-t. (α) άμεσο μονοπάτι ενεργοποίησης μέσω λιπιδικών ή γλυκολιπιδικών αντιγόνων που συνδέονται με το CD1d και αλληλεπιδρούν με τον αμετάβλητο TCR, (β) έμμεσο μονοπάτι, μέσω αγωνιστών των TLRs και κυτταροκινών (προσαρμογή από Van Kaer et al., 2011). 70

72 Στην εικόνα 40 φαίνεται η θέση που έχουν τα ΝΚ-Τ κύτταρα στο ανοσοποιητικό σύστημα, καθώς και όλα τα υπόλοιπα κύτταρα του συστήματος, διακρινόμενα σε αυτά της εγγενούς και αυτά της επίκτητης ανοσολογικής απόκρισης. Εικόνα 40: Ο εγγενής και επίκτητος βραχίονας του ανοσοποιητικού συστήματος (προσαρμογή από 3. ΟΙ ΝΕΦΡΟΙ ΚΑΙ ΟΙ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΟΥΣ 3.1. Δομή των νεφρών Οι νεφροί (Εικόνα 41) είναι τα όργανα εκείνα τα οποία επεξεργάζονται το πλάσμα του αίματος, απομακρύνοντας από αυτό ουσίες και σε μερικές περιπτώσεις προσθέτοντας συστατικά σε αυτό (Widmaier et al., 2014). Οι δύο 71

73 νεφροί κείνται στο πίσω μέρος του κοιλιακού τοιχώματος, αλλά πραγματικά δεν εμπεριέχονται μέσα στην κοιλιακή χώρα. Είναι οπισθοπεριτοναϊκά στοιχεία, δηλαδή βρίσκονται μόλις πίσω από το περιτόναιο, τον υμένα ο οποίος επενδύει την κοιλιακή χώρα. Το εξωτερικό μέρος του νεφρού ονομάζεται νεφρικός φλοιός και το εσωτερικό του νεφρικός μυελός (Vander et al., 2001). Εικόνα 41: Εμπρόσθια τομή του δεξιού νεφρού (προσαρμογή από Καθένας νεφρός περιέχει περίπου ένα εκατομμύριο όμοιες μονάδες που ονομάζονται νεφρώνες (Εικόνα 42). Κάθε νεφρώνας αποτελείται από ένα αρχικό διηθητικό οργανίδιο το οποίο ονομάζεται νεφρικό σωμάτιο και ένα σωληνάριο το οποίο αποτελεί φυσική προέκταση του νεφρικού σωματίου. Το νεφρικό σωμάτιο σχηματίζει από το αίμα, ένα διήθημα το οποίο δεν περιέχει 72

74 ούτε κύτταρα ούτε πρωτεΐνες. Το διήθημα αυτό εγκαταλείπει το νεφρικό σωμάτιο και εισέρχεται στο σωληνάριο. Καθώς αυτό ρέει μέσα στο σωληνάριο, διάφορες ουσίες προστίθενται ή αφαιρούνται. Τελικά, το υγρό από όλους τους νεφρώνες συλλέγεται και εξέρχεται ως ούρα. Κάθε νεφρικό σωμάτιο περιέχει ένα θύσανο αλληλοσυνδεμένων τριχοειδών βρόχων ο οποίος ονομάζεται νεφρικό σπείραμα (glomerulus). Κάθε σπείραμα τροφοδοτείται με αίμα από ένα προσαγωγό αρτηρίδιο. Το νεφρικό σπείραμα θηλυκώνει μέσα σε μια κάψουλα γεμάτη υγρό, γνωστή ως κάψα του Bowman. Μεταξύ κάψας και σπειράματος δημιουργείται ένας χώρος γεμάτος με υγρό, ο χώρος του Bowman ή η καψική κοιλότητα, μέσα στον οποίο το υγρό διηθείται από τα σπειραματικά τριχοειδή. Ο συνδυασμός ενός σπειράματος και μιας κάψας αποτελεί το νεφρικό σωμάτιο. Καθώς το αίμα ρέει μέσα στο σπείραμα ένα μέρος του πλάσματος διηθείται μέσα στην κάψα του Bowman. Το υπόλοιπο του αίματος εξέρχεται από το σπείραμα με ένα άλλο αρτηρίδιο, το απαγωγό αρτηρίδιο (Vander et al., 2001). Εικόνα 42: Ο νεφρώνας είναι η λειτουργική μονάδα του νεφρού. Το σπείραμα και τα εσπειραμένα σωληνάρια του νεφρώνα εντοπίζονται στο φλοιό του νεφρού, ενώ οι αθροιστικοί πόροι στις πυραμίδες του μυελού του νεφρού (προσαρμογή από 73

75 Το νεφρικό σωληνάριο αποτελεί συνέχεια του έξω πετάλου της κάψας του Bowman (Εικόνα 43) και είναι ένας στενός κοιλώδης κύλινδρος φτιαγμένος από μια στιβάδα επιθηλιακών κυττάρων τα οποία στηρίζονται πάνω σε μια βασική μεμβράνη. Το τμήμα του σωληναρίου στο οποίο εισρέει το υγρό από την κάψα του Bowman ονομάζεται εγγύς σωληνάριο και αποτελείται από τα σωληνάρια εγγύς εσπειραμένο και εγγύς ευθύ (Εικόνα 42). Το επόμενο τμήμα του σωληναρίου είναι η αγκύλη του Henle, μία οξεία φουρκετοειδής αγκύλη αποτελούμενη από ένα κατιόν σκέλος, το οποίο προέρχεται από το εγγύς σωληνάριο και ένα ανιόν σκέλος το οποίο οδηγεί στο επόμενο μέρος του νεφρώνα, το άπω εσπειραμένο σωληνάριο. Από το άπω εσπειραμένο σωληνάριο τα ενδοσωληναριακά υγρά ρέουν μέσα στο σύστημα των αθροιστικών πόρων, το πρώτο μέρος των οποίων αποτελεί το συνδετικό σωληνάριο, ακολουθούμενο από το φλοιώδη και το μυελώδη αθροιστικό πόρο (Vander et al., 2001). Εικόνα 43: Ανατομία του νεφρικού σωματίου (προσαρμογή από Vander et al., 2001). Από την κάψα του Bowman μέχρι το σύστημα των αθροιστικών πόρων, ο κάθε νεφρώνας είναι εντελώς ξεχωριστός από τον άλλο. Ο διαχωρισμός αυτός τερματίζεται όταν συγχωνεύονται οι πολλαπλοί φλοιώδεις αθροιστικοί 74

76 πόροι. Από αυτό το σημείο και μετά επέρχονται επιπρόσθετες συγχωνεύσεις ώστε τα σχηματιζόμενα ούρα να διοχετεύονται μέσα στην κεντρική νεφρική κοιλότητα, τη νεφρική πύελο, μέσω μόνο αρκετών εκατοντάδων μεγάλων μυελωδών αθροιστικών πόρων. Ο αποχετευτικός ουρητήρας ενός νεφρού θεωρείται φυσική συνέχεια της νεφρικής πυέλου. Εκτός από τα σπειραματικά, υπάρχουν και τα περισωληναριακά τριχοειδή, τα οποία περιβάλλουν τα σωληνάρια. Οι δύο ομάδες αγγείων μέσα σε ένα νεφρό συνδέονται μεταξύ τους με ένα απαγωγό αρτηρίδιο, δηλαδή ένα αγγείο το οποίο απομακρύνει αίμα από το σπείραμα. Έτσι, η νεφρική κυκλοφορία αποτελεί ένα ασυνήθιστο φαινόμενο όπου τριχοειδή αποχετεύονται με απαγωγό αρτηρίδιο και όχι φλεβίδιο. Μετά την τροφοδοσία των σωληναρίων με αίμα, τα περισωληναριακά τριχοειδή συμπτύσσονται και σχηματίζουν φλέβες, μέσα από τις οποίες το αίμα εγκαταλείπει το νεφρό (Vander et al., 2001) Οι λειτουργίες των νεφρών Οι νεφροί επιτελούν ρυθμιστικές και εκκριτικές λειτουργίες. Με τη ρύθμιση της αποβολής ύδατος και διαλυμένων ουσιών κατορθώνουν να διατηρούν τον όγκο και τη σύσταση των υγρών του σώματος μέσα σε ένα πολύ στενό φάσμα αποκλίσεων, παρ' όλο που η πρόσληψη ύδατος και τροφής εμφανίζουν μεγάλες μεταβολές. Αποτέλεσμα του ομοιοστατικού ρόλου των νεφρών είναι το γεγονός ότι οι ιστοί και τα κύτταρα του σώματος έχουν τη δυνατότητα να λειτουργούν φυσιολογικά μέσα σε σταθερό, σχετικά, περιβάλλον. Οι νεφροί ρυθμίζουν την κατά βάρος ωσμωγραμμομοριακότητα των υγρών του σώματος, κάτι που είναι απαραίτητο για τη διατήρηση του φυσιολογικού όγκου των κυττάρων σε όλους τους ιστούς του σώματος. Η ρύθμιση του όγκου των υγρών είναι απαραίτητη προκειμένου να υπάρχει φυσιολογική λειτουργία του καρδιαγγειακού συστήματος. Οι νεφροί επιτυγχάνουν τους παραπάνω στόχους ρυθμίζοντας την απέκκριση ύδατος και NaCl, σε συνεργασία με το καρδιαγγειακό, το ενδοκρινικό και το κεντρικό νευρικό σύστημα. Επίσης, οι νεφροί παίζουν ουσιαστικό ρόλο στη ρύθμιση της 75

77 συγκέντρωσης ορισμένων σημαντικών ανόργανων ιόντων του σώματος όπως είναι τα Na +, K +, Cl -, HCO - 3, H +, Ca 2+, Mg 2+ και PO 3-4. Προκειμένου να διατηρηθεί το κατάλληλο ισοζύγιο, η απέκκριση καθενός ηλεκτρολύτη πρέπει να ισούται με την ημερήσια πρόσληψή του. Επιπλέον, οι νεφροί είναι υπεύθυνοι για τη ρύθμιση του οξεοβασικού ισοζυγίου, καθώς πολλές από τις μεταβολικές λειτουργίες του σώματος είναι εξαιρετικά ευαίσθητες στο ph, έτσι πρέπει αυτό να διατηρείται μέσα σε πολύ στενά όρια. Αυτό επιτυγχάνεται με τα ρυθμιστικά διαλύματα του σώματος και με τη συντονισμένη λειτουργία των πνευμόνων και των νεφρών (Berne & Levy, 2004). Οι νεφροί απεκκρίνουν ορισμένα από τα τελικά προϊόντα του μεταβολισμού που είναι άχρηστα για τον οργανισμό, τα ονομαζόμενα κατάλοιπα. Σε αυτά περιλαμβάνονται η ουρία (προέρχεται από το μεταβολισμό των αμινοξέων), το ουρικό οξύ (προέρχεται από το μεταβολισμό των νουκλεϊκών οξέων), η κρεατινίνη (προέρχεται από το μεταβολισμό της κρεατίνης των μυών), τα τελικά προϊόντα του μεταβολισμού της αιμοσφαιρίνης και οι μεταβολίτες των ορμονών. Οι νεφροί απομακρύνουν αυτές τις ουσίες από τον οργανισμό με ρυθμό που αντιστοιχεί στο ρυθμό παραγωγής τους, ρυθμίζοντας έτσι τη συγκέντρωσή τους στα υγρά του οργανισμού. Οι νεφροί αποτελούν επίσης σημαντική οδό απομάκρυνσης ξένων ουσιών από το σώμα, όπως είναι τα φάρμακα, τα παρασιτοκτόνα και άλλες ουσίες που προσλαμβάνονται με την τροφή (Berne & Levy, 2004). Ο σχηματισμός των ούρων άρχεται με τη διήθηση του πλάσματος από τα σπειραματικά τριχοειδή στην κάψα του Bowman. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται σπειραματική διήθηση και το παράγωγό της σπειραματικό διήθημα. Το υγρό αυτό είναι ακύτταρο και περιέχει όλες τις ουσίες του πλάσματος, εκτός από τις πρωτεΐνες, σε ισόποση συγκέντρωση. Ο όγκος των υγρών τα οποία διηθούνται από το σπείραμα στην καψική κοιλότητα εκφρασμένος ανά χρονική μονάδα είναι γνωστός ως ρυθμός σπειραματικής διήθησης (Glomerular Filtration Rate, GFR). Σε ένα άτομο 70 κιλών ο GFR ανέρχεται κατά μέσο όρο σε 180 λίτρα ημερησίως (125 ml/λεπτό) και για να γίνει αντιληπτό αυτό, γίνεται σύγκριση με τα 4 λίτρα την ημέρα τα οποία αποτελούν τον καθαρό όγκο που διηθείται κατά μήκος όλων των άλλων τριχοειδών του σώματος (Vander et al., 2001). 76

78 Τέλος, οι νεφροί είναι σημαντικά ενδοκρινή όργανα τα οποία συνθέτουν και εκκρίνουν ρενίνη, προσταγλανδίνες, κινίνες, 12,5 διυδροξυβιταμίνη D 3 και ερυθροποιητίνη. Η ρενίνη ενεργοποιεί το σύστημα ρενίνης-αγγειοτασίνηςαλδοστερόνης, το οποίο παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης καθώς και στο ισοζύγιο του νατρίου και του καλίου. Οι προσταγλανδίνες και οι κινίνες είναι αγγειοδραστικές ουσίες σημαντικές για τη ρύθμιση και την τροποποίηση της νεφρικής ροής του αίματος και μαζί με την αγγειοτασίνη επηρεάζουν τη συστηματική πίεση του αίματος. Η 12,5 διυδροξυβιταμίνη D 3 είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική απορρόφηση των Ca 2+ από το γαστρεντερικό σωλήνα και την εναπόθεσή τους στα οστά, ενώ η ερυθροποιητίνη διεγείρει την παραγωγή των ερυθροκυττάρων στο μυελό των οστών (Berne & Levy, 2004) Διαταραχές της νεφρικής λειτουργίας Γενικά, νοσηρές καταστάσεις που προσβάλλουν τους νεφρούς είναι: Σπειραματονεφρίτιδες Κληρονομικές παθήσεις, όπως η πολυκυστική νόσος Δυσμορφίες που δημιουργούνται εκ γενετής Παθήσεις γενικευμένες του οργανισμού που προσβάλλουν το ανοσοποιητικό (π.χ. συστηματικός ερυθηματώδης λύκος) Απόφραξη του απαγωγού συστήματος από λίθους, καρκίνο ή από τον προστάτη στους άνδρες Συχνές επαναλαμβανόμενες ουρολοιμώξεις Κατάχρηση φαρμάκων και απαγορευμένων ουσιών (ΙΙ) Οι διαταραχές της νεφρικής λειτουργίας διακρίνονται αδρά σε δύο μεγάλες κατηγορίες, τις αναστρέψιμες και τις μη αναστρέψιμες. Η πρώτη κατηγορία μπορεί να οδηγήσει σε οξεία νεφρική ανεπάρκεια, ενώ η δεύτερη σε χρόνια νεφρική ανεπάρκεια. Ένα ποσοστό ανθρώπων που πάσχουν από χρόνια νεφρική νόσο θα οδηγηθούν τελικά σε κάποια θεραπεία εξωνεφρικής 77

79 υποστήριξης, όπως είναι η χρόνια περιοδική αιμοκάθαρση ή περιτοναϊκή κάθαρση ή μεταμόσχευση νεφρού (Ι). Η κατάσταση και τα στάδια της ασθένειας τόσο στα οξέα όσο και στα χρόνια νεφρικά σύνδρομα οριοθετούνται με βάση τη συγκέντρωση της κρεατινίνης στον ορό ή τον GFR. Μελέτες δείχνουν ότι τα δύο αυτά σύνδρομα δεν αποτελούν ξεχωριστές οντότητες, αλλά διασυνδέονται στενά. Η χρόνια νεφρική νόσος είναι ένας παράγοντας κινδύνου για οξεία νεφρική βλάβη, η οξεία νεφρική βλάβη είναι ένας παράγοντας κινδύνου για την ανάπτυξη χρόνιας νεφρικής νόσου και οι δύο σε συνδυασμό αποτελούν συντελεστή κινδύνου για καρδιαγγειακές παθήσεις (Chawla et al., 2014). Η οξεία νεφρική ανεπάρκεια (Acute Kidney Injury/Failure, ΑΚΙ) είναι μια πολύπλοκη διαταραχή και χαρακτηρίζεται από απότομη απώλεια της νεφρικής λειτουργίας. Ο όρος ΑΚΙ χρησιμοποιείται για να αντιπροσωπεύσει ολόκληρο το φάσμα της οξείας νεφρικής βλάβης. Τα διαγνωστικά κριτήρια τα οποία προτείνονται για την ΑΚΙ βασίζονται σε οξείες αλλαγές της συγκέντρωσης της κρεατινίνης στον ορό ή της παραγωγής ούρων. Επίσης, έχει αναπτυχθεί ένα σύστημα σταδιοποίησης για την ΑΚΙ το οποίο αντανακλά ποσοτικές αλλαγές στην κρεατινίνη του ορού και την παραγωγή των ούρων (Mehta et al., 2007). Σε κλινικές μελέτες αναγνωρίζονται και αξιολογούνται πιθανοί βιομάρτυρες για την πρόβλεψη του κινδύνου, της διάγνωσης, της πρόγνωσης και της θεραπευτικής απόκρισης των ασθενών με ΑΚΙ. Παρά την πρόοδο που έχει σημειωθεί, ο στόχος για βιομάρτυρες οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ταξινόμηση και το διαχωρισμό των ασθενών σύμφωνα με τον κίνδυνο δεν έχει ακόμα επιτευχθεί (Chawla et al., 2014). Υπάρχουν πολλά αίτια που μπορούν να οδηγήσουν σε ΑΚΙ, όπως προνεφρικά (αφυδάτωση, ελαττωμένη αιματική ροή στον νεφρό), νεφρικά (απόφραξη νεφρικής αρτηρίας ή φλέβας, σπειραματονεφρίτιδες, ενδογενείςεξωγενείς τοξίνες, ενδονεφρική απόφραξη, ενδονεφρικές αγγειακές παθήσεις), ή μετανεφρικά αίτια (απόφραξη ουροποιητικού συστήματος, όπως όγκοι, λιθίαση). Όταν δεν αποκαθίσταται η συνολική νεφρική λειτουργία μετά από επεισόδιο οξείας νεφρικής ανεπάρκειας για διάστημα μεγαλύτερο από έξι μήνες, τότε μεταπίπτει σε χρόνια νεφρική ανεπάρκεια (Ι). 78

80 Χρόνια νεφρική νόσος Η χρόνια νεφρική νόσος (Chronic kidney disease, CKD) καθορίζεται από την παρουσία δομικών ή λειτουργικών διαταραχών του νεφρού με ή χωρίς μία συνοδευόμενη μείωση στον GFR (Baumgarten & Gehr, 2011). Περιλαμβάνει ένα σύνολο παθολογιών στο οποίο διακυβεύεται χρόνια η νεφρική απεκκριτική λειτουργία, κυρίως ως αποτέλεσμα της βλάβης των νεφρικών δομών. Οι περισσότερες, αλλά όχι όλες οι μορφές της CKD είναι μη αναστρέψιμες και προοδευτικές. Η νεφρική βλάβη περιλαμβάνει (α) απώλεια νεφρώνα εξαιτίας απαλοιφής σπειραματικών ή σωληνοειδών κυττάρων, (β) ίνωση που επηρεάζει τόσο τα σπειράματα όσο και τα σωληνάρια και (γ) αλλαγές στο αγγειακό σύστημα των νεφρών. Η CDK προκύπτει από μια ποικιλία αιτιών όπως είναι ο διαβήτης, η υπέρταση, η νεφρίτιδα, φλεγμονώδεις και διηθητικές ασθένειες, νεφρικές και συστημικές μολύνσεις (π.χ. μόλυνση από στρεπτόκοκκο), η πολυκυστική νόσος, αυτοάνοσες ασθένειες, νεφρική υποξία, νεφρολιθίαση και απόφραξη των κατώτερων ουροποιητικών οδών, χημική τοξικότητα και άλλα. Σε ένα ποικίλο αριθμό περιπτώσεων, η νεφρική κάκωση από οποιαδήποτε από τις παραπάνω αιτίες εξελίσσεται προς ένα χρόνιο, προοδευτικό και μη αναστρέψιμο στάδιο αυξανόμενης βλάβης και νεφρικής δυσλειτουργίας, όπου τελικά γίνεται απαραίτητη η θεραπεία νεφρικής αντικατάστασης (αιμοκάθαρση ή μεταμόσχευση νεφρού) (López-Novoa et al., 2011). Στη χρόνια νεφρική νόσο μειώνεται η λειτουργία των νεφρών για διάστημα μεγαλύτερο των τριών μηνών, με αποτέλεσμα να μην μπορεί να γίνει η σωστή διατήρηση της ομοιοστασίας του νερού, των ηλεκτρολυτών του οργανισμού, της ρύθμισης αποβολής οξέων και επαναρρόφησης βάσεως, της αποβολής των άχρηστων-τελικών προϊόντων αποδόμησης του μεταβολισμού, καθώς και της ορμονικής λειτουργίας των νεφρών (παραγωγή βιταμίνης-d, ερυθροποιητίνης) (ΙΙΙ). Οι διαταραχές στους νεφρούς μπορεί να επιφέρουν επιπλοκές στον οργανισμό. Μάλιστα, οι βλάβες των νεφρών στα αρχικά στάδια δεν εντοπίζονται εγκαίρως, με αποτέλεσμα όχι μόνο να μην αντιμετωπίζονται αλλά και να επιδεινώνονται (ΙΙ). Στην CKD ένα πολύ σημαντικό βήμα για τον καθορισμό της πρόγνωσης, την αξιολόγηση και τη διαχείρησή της, αποτελεί η σταδιοποίηση. Η σταδιοποίηση βασίζεται στο 79

81 επίπεδο του εκτιμώμενου GFR ανεξαρτήτως από τη διάγνωση (Baumgarten & Gehr, 2011). Έτσι η νόσος κατηγοριοποιείται σε πέντε στάδια (Πίνακας 3). Στο στάδιο 5 οι νεφροί δεν μπορούν να αντεπεξέλθουν στις λειτουργίες τους και η νεφρική λειτουργία χρειάζεται υποκατάσταση (Ι). Πίνακας 3: Τα στάδια της χρόνιας νεφρικής νόσου και προτεινόμενο σχέδιο δράσης (προσαρμογή από Baumgarten & Gehr, 2011). Η θεραπεία της χρόνιας νεφρικής νόσου περιλαμβάνει: Αναγνώριση και αναστολή, εάν είναι δυνατόν, των παραγόντων εξέλιξης (έλεγχος επιπέδων σακχάρου, αρτηριακής πιέσεως, λευκωματουρίας, χοληστερολαιμίας, παχυσαρκίας, ειδική θεραπεία έναντι σπειραματικών ή σωληναριο-διάμεσων νοσημάτων). Θεραπεία των ίδιων των επιπλοκών της νεφρικής νόσου (αρτηριακή υπέρταση, λευκωματουρία, αναιμία, οστική νόσος, διαταραχή της θρέψης). Φαρμακευτική αγωγή ανάλογα με το γενεσιουργό αίτιο, αλλά και για τις επιπλοκές της νόσου. Θεραπεία υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας όταν 80

82 πρόκειται για χρόνια νεφρική νόσο τελικού σταδίου. Οι επιλογές σε αυτή την περίπτωση είναι η αιμοκάθαρση (κάθαρση του αίματος από τις άχρηστες μεταβολικά ουσίες συνήθως τρείς φορές την εβδομάδα), η περιτοναϊκή κάθαρση (κάθαρση από τις άχρηστες μεταβολικά ουσίες μέσω ειδικών διαλυμάτων που εισέρχονται στην περιτοναϊκή κοιλότητα, καθημερινά) και τέλος η νεφρική μεταμόσχευση οπότε και ο ασθενής δεν χρειάζεται να συνεχίσει αιμοκάθαρση ή περιτοναϊκή κάθαρση. Είναι επιβεβλημένη όμως η συνεχής χορήγηση ανοσοκατασταλτικών φαρμάκων, προκειμένου να αποτραπεί η απόρριψη του νεφρικού μοσχεύματος από τον οργανισμό. Η χρόνια νεφρική νόσος αποτελεί σοβαρό πρόβλημα δημόσιας υγείας. Η Διεθνής Ένωση Νεφρολογικών Ιδρυμάτων εκτιμά ότι περισσότεροι από 500 εκατομμύρια άνθρωποι παγκοσμίως έχουν κάποιου βαθμού Χρόνια Νεφρική Νόσο, δηλαδή σχεδόν ένα στα 10 άτομα του γενικού πληθυσμού, ενώ η ασθένεια διαγιγνώσκεται σε περίπου νέους ασθενείς κάθε χρόνο. Σε όλο τον κόσμο περίπου 1,7 εκατομμύρια άτομα λαμβάνουν θεραπεία για νεφροπάθεια τελικού σταδίου (ΙΙ). Σε αυτό το σημείο θα γίνει αναφορά ειδικά στη Σπειραματονεφρίτιδα καθώς αποτελεί κομμάτι της μελέτης της παρούσας πτυχιακής εργασίας Σπειραματονεφρίτιδα Η σπειραματονεφρίτιδα (Glomerulonephritis, GN), είναι μία ετερογενής ομάδα κλινικών καταστάσεων οι οποίες γενικά, αλλά όχι πάντα, χαρακτηρίζονται από φλεγμονή των σπειραμάτων, με δευτερογενείς διαμεσοσωληναριακές και αγγειακές αλλαγές (Jin et al., 2014). Ο όρος χρησιμοποιείται για να περιγράψει όλους τους τύπους των σπειραματικών ασθενειών, ακόμα και αν μερικές από αυτές δε σχετίζονται με φλεγμονή. Οι περισσότεροι τύποι σπειραματονεφρίτιδας είναι ανοσολογικά επαγόμενοι και αρκετοί αποκρίνονται σε ανοσοκατασταλτικά φάρμακα (Goddard et al., 2014). Οι διαταραχές μπορεί να είναι είτε πρωτογενείς είτε δευτερογενείς εκδηλώσεις συστημικών ασθενειών. Η σπειραματονεφρίτιδα αποτελεί μια κοινή αιτία της 81

83 νεφρικής νόσου τελικού σταδίου (End Stage Renal Disease, ESRD) παγκοσμίως και ειδικά σε αναπτυσσόμενες χώρες όπως είναι η Κίνα και η Ινδία και συμβάλλει σημαντικά στην κλιμακούμενη επιβάρυνση της υγείας που σχετίζεται με τη χρόνια νεφρική νόσο (Jin et al., 2014). Στην πρωτογενή σπειραματονεφρίτιδα, η ασθένεια σχεδόν ολοκληρωτικά περιορίζεται στους νεφρούς (όπως στην IgA νεφροπάθεια ή τη σπειραματονεφρίτιδα μετά από μόλυνση από στρεπτόκοκκο) ενώ η δευτερογενής συμβαίνει σε συνδυασμό με πιο διάχυτη φλεγμονή (όπως στο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο ή τη συστηματική αγγειίτιδα). Η έγκαιρη διάγνωση της σπειραματονεφρίτιδας είναι ζωτικής σημασίας καθώς ακόμα και ασθενείς με ελαφρώς μειωμένη νεφρική λειτουργία, υπέρταση και διαταραχές του ουροποιητικού, μπορεί να χάσουν πολύ γρήγορα τη λειτουργία των νεφρών τους αν δεν τους χορηγηθεί άμεσα κάποια θεραπεία (Vinen & Oliveira, 2003). Η ταξινόμηση της σπειραματονεφρίτιδας σε υποκατηγορίες γίνεται με βάση την ιστοπαθολογική εξέταση (Goddard et al., 2014). Η IgA νεφροπάθεια (IgAΝ) είναι η πιο κοινή μορφή πρωτογενούς σπειραματονεφρίτιδας, με το κλινικό φάσμα της να καλύπτει μια ευρεία σειρά χαρακτηριστικών, από μικρές διαταραχές του ουροποιητικού έως ταχέως εξελισσόμενη νεφρική ανεπάρκεια. Γενικά, περίπου ένα 20-40% των ασθενών με IgAΝ αναπτύσσουν ESRD μέσα σε 20 χρόνια από τη διάγνωση (Caliskan & Kiryluk, 2014). Η σπειραματονεφρίτιδα μπορεί επίσης να είναι οξεία ή χρόνια. Η οξεία μορφή αναπτύσσεται ξαφνικά και αυτό μπορεί να συμβεί έπειτα από μία μόλυνση για παράδειγμα στο λαιμό ή στο δέρμα (από στρεπτόκοκκο). Κάποιες φορές μπορεί να ξεπεραστεί από μόνη της, ενώ άλλες φορές οι νεφροί μπορεί να σταματήσουν να λειτουργούν μέχρι να ξεκινήσει η κατάλληλη θεραπεία. Τα πρώιμα συμπτώματα της οξείας μορφής περιλαμβάνουν πρήξιμο στο πρόσωπο το πρωί, αιματουρία και μικρότερη ποσότητα ούρων. Η χρόνια μορφή μπορεί να εμφανιστεί σιωπηλά (χωρίς συμπτώματα) κατά τη διάρκεια αρκετών ετών και συχνά οδηγεί σε ολοκληρωτική νεφρική ανεπάρκεια. Κάποια από τα πρώιμα συμπτώματα της χρόνιας μορφής μπορεί να περιλαμβάνουν αιματουρία ή πρωτεϊνουρία, υψηλή αρτηριακή πίεση και οίδημα στους αστραγάλους. Η χρόνια μορφή κάποιες φορές είναι κληρονομική, ενώ σε πολλές περιπτώσεις η αιτία δεν είναι γνωστή. Μπορεί να υπάρξει μία οξεία 82

84 επίθεση της ασθένειας και να αναπτυχθεί στη χρόνια μορφή της χρόνια αργότερα (Εικόνα 44) (ΙV). Εικόνα 44: Φυσιολογική δομή σπειράματος, οξεία και χρόνια σπειραματονεφρίτιδα (προσαρμογή από Οι θεραπευτικές επιλογές για τη σπειραματονεφρίτιδα με εφαρμογή σε όλες τις περιπτώσεις κυρίως περιλαμβάνουν συμπτωματική θεραπεία και στρατηγικές για την καθυστέρηση της εξέλιξής της. Τακτική κλινική παρακολούθηση, έλεγχος της αρτηριακής πίεσης και χρήση ενός αναστολέα του ενζύμου μετατροπής της αγγειοτασίνης, έχουν αποδειχθεί ευεργετικά ως θεραπευτικά μέσα. Παραδοσιακές ανοσοκατασταλτικές θεραπείες περιλαμβάνουν κορτικοστεροειδή και κυτταροτοξικούς παράγοντες, οι οποίοι χρησιμοποιούνται από τη δεκαετία του Τα κορτικοστεροειδή είναι 83

85 αποτελεσματικά σε αρκετούς τύπους σπειραματονεφρίτιδας, λόγω της ικανότητάς τους να παρεμποδίζουν τη δραστηριότητα του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB και επακόλουθα τις προφλεγμονώδεις επιδράσεις των κυτταροκινών οι οποίες είναι γνωστές ότι προωθούν ενεργά τη σπειραματική φλεγμονή (IL-1β, TNF-α). Ωστόσο, άλλες δράσεις των κορτικοστεροειδών οδηγούν σε καλά αναγνωρισμένες παρενέργειες που περιορίζουν τη χρησιμότητα αυτών των φαρμάκων. Σήμερα, οι ανοσοκατασταλτικές θεραπείες που χρησιμοποιούνται δεν είναι ομοιόμορφα αποτελεσματικές και συχνά σχετίζονται με σοβαρές παρενέργειες. Μελέτες σε ζωικά μοντέλα και ασθενείς έχουν προσπαθήσει να βρουν νέα θεραπεία, η οποία θα μπορούσε να ρυθμίζει τη φλεγμονή, να μειώνει τη βλάβη, να συνεισφέρει στη νεφρική αναγέννηση και να είναι λιγότερο τοξική (Jin et al., 2014). 4. ΣΧΕΣΗ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΜΕ ΤΙΣ ΝΕΦΡΟΠΑΘΕΙΕΣ Οι νεφροί συχνά στοχεύονται από παθογόνες ανοσολογικές αποκρίσεις εναντίον νεφρικών αυτοαντιγόνων ή από τοπικές εκδηλώσεις συστημικής αυτοανοσίας. Πρόσφατες μελέτες σε μοντέλα τρωκτικών και σε ανθρώπους, έχουν αποκαλύψει αρκετούς βασικούς μηχανισμούς οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να εξηγήσουν την προηγουμένως αινιγματική ανοσοπαθολογία αρκετών νεφρικών ασθενειών. Αυτοί οι μηχανισμοί περιλαμβάνουν μοριακά μοτίβα ειδικά για τους νεφρούς σχετιζόμενα με βλάβη τα οποία προκαλούν στείρα φλεγμονή, cross-talk μεταξύ νεφρικών δενδριτικών κυττάρων και Τ κυττάρων, ανάπτυξη αυτοαντισωμάτων τα οποία στοχεύουν τους νεφρούς και μοριακή μιμητική με μικροβιακά παθογόνα. Αντιστρόφως, η νεφρική ανεπάρκεια επηρεάζει τη γενική ανοσία, προκαλώντας δυσλειτουργία του εντερικού φραγμού, συστημική φλεγμονή και ανοσοανεπάρκεια, τα οποία συνεισφέρουν στη νοσηρότητα και θνησιμότητα των ασθενών με νεφρική νόσο (Kurts et al., 2013). Η νέκρωση νεφρικών κυττάρων ή προγραμματισμένες μορφές φλεγμονώδους κυτταρικού θανάτου, απελευθερώνουν μοριακά μοτίβα σχετιζόμενα με βλάβη (damage-associated molecular patterns, DAMPs) στον εξωκυτταρικό χώρο, όπου ενεργοποιούν PRRs. Τα νεφρικά δενδριτικά 84

86 κύτταρα και μακροφάγα εκφράζουν πολυάριθμους PRRs, ενώ η έκφραση αυτών είναι περιορισμένα στα νεφρικά μη ανοσολογικά κύτταρα. Η σύνδεση του PRR ενεργοποιεί το κύτταρο, γεγονός που οδηγεί σε ειδικές για τον κυτταρικό τύπο συνέπειες όπως είναι η έκκριση προφλεγμονωδών μεσολαβητών οι οποίοι προάγουν τη νεφρική ανοσοπαθολογία. Στο σπείραμα, η ενεργοποίηση PRR στα μεσαγγειακά κύτταρα επίσης διεγείρει τον πολλαπλασιασμό τους (π.χ. στη νεφρίτιδα του λύκου, στην IgA νεφροπάθεια) και στα ενδοθηλιακά και επιθηλιακά κύτταρα (ποδοκύτταρα και σωληνοειδή επιθηλιακά κύτταρα), αυξάνει τη διαπερατότητά τους, με αποτέλεσμα την πρωτεϊνουρία (έναν κλινικά χρήσιμο βιομάρτυρα της διαπερατότητας των σπειραματικών αγγείων), τη φλεγμονή και τη βλάβη (Εικόνα 45) (Kurts et al., 2013). Εικόνα 45: Μηχανισμοί εγγενούς ανοσίας στη νεφρική φλεγμονή. CXCL2: CXCchemokine ligand 2, HUS: haemolytic uraemic syndrome, IC-GN: immune complex glomerulonephritis, ROS: reactive oxygen species (προσαρμογή από Kurts et al., 2013). 85

87 Η σπειραματονεφρίτιδα η οποία είναι μια κοινή αιτία ESRD παγκοσμίως, πιστεύεται ότι προκύπτει από ανοσολογικά επαγόμενο φλεγμονώδη τραυματισμό στο σπείραμα. Κάποιες περιπτώσεις είναι αποτέλεσμα αυτοάνοσων αποκρίσεων σε σπειραματικά αντιγόνα, όπως είναι η σπειραματική βασική μεμβράνη (Glomerular basement membrane, GBM) κι έτσι είναι εκ φύσεως αυτοάνοσες ασθένειες. Ιστορικά, η συμμετοχή του ανοσοποιητικού συστήματος στη σπειραματονεφρίτιδα αποδείχθηκε για πρώτη φορά από την παρουσίαση εναποθέσεων αντισωμάτων εντός των σπειραμάτων. Αυτό επηρέασε αυτές τις πρώιμες ιδέες σε τόσο μεγάλο βαθμό, ώστε πίστευαν πως όλοι οι τύποι σπειραματονεφρίτιδας θα μπορούσαν να ερμηνευθούν με επαγόμενους από αντισώματα μηχανισμούς, είτε μέσω μιας άμεσης αντίδρασης με εγγενές σπειραματικό αντιγόνο (anti-gbm Ab) είτε από την εναπόθεση κυκλοφορούντων ανοσοσυμπλόκων, όπως παρατηρείται στο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (Wu et al., 2002). Η σπειραματική ανοσοπαθολογία συχνά εξελίσσεται από ενδοσπειραματική ενεργοποίηση του συμπληρώματος μέσω της κλασικής ή της εναλλακτικής οδού. Ανοσοσύμπλοκα μπορούν να σχηματιστούν σε διάφορα διαμερίσματα του σπειράματος (Εικόνα 46), κάτι το οποίο καθορίζει την προκύπτουσα ιστοπαθολογική βλάβη καθώς ενεργοποιούνται κατά κύριο λόγο διαφορετικοί σπειραματικοί κυτταρικοί τύποι σε κάθε διαμέρισμα. Οι ιστοπαθολογικές βλάβες που θα προκύψουν καθορίζουν την κατάταξη της σπειραματονεφρίτιδας. Έτσι για παράδειγμα, γραμμικές εναποθέσεις ανοσοσυμπλόκων υποδηλώνουν πρόσδεση αντισωμάτων σε αυτοαντιγόνα μέσα στη σπειραματική βασική μεμβράνη, όπως είναι τα αντισώματα κολλαγόνου IV στη νόσο anti-gmb. Ακόμα ένα παράδειγμα, η ANCA (Antineutrophil cytoplasmic antibody) - σχετιζόμενη σπειραματονεφρίτιδα η οποία εξελίσσεται απουσία εναποθέσεων ανοσοσυμπλόκων (pauci-immune), αφού καθοδηγείται από ANCAs και την κυτταρική ανοσία (Kurts et al., 2013). 86

88 Εικόνα 46: Τοπικά ανοσολογικά μονοπάτια στη σπειραματονεφρίτιδα. α3(iv)nc1: non-collagenous 1 (NC1) domain of the α3 chain of type IV collagen, LAMP2: lysosome-associated membrane protein 2, MPO: myeloperoxidase, PLA2R: secretory phospholipase A2 receptor, PR3: proteinase 3 (προσαρμογή από Kurts et al., 2013) Ο ρόλος των κυττάρων Η επαγόμενη από T κύτταρα κυτταρική ανοσία θεωρούνταν από καιρό πιθανώς ως ο πιο σημαντικός μεσολαβητής της σπειραματονεφρίτιδας. Εκτός από τη συμμετοχή ως T βοηθητικά κύτταρα στην Τ-εξαρτώμενη απόκριση με αντισώματα στα νεφρικά αυτοαντιγόνα, τα T κύτταρα μπορεί να εμπλέκονται απευθείας στη σπειραματική βλάβη. Τα πρώτα στοιχεία είχαν δείξει ότι τα T κύτταρα ήταν πραγματικά παρόντα στο σπείραμα σε ένα πλήθος ανθρώπινης 87

89 και πειραματικής σπειραματονεφρίτιδας. Τα αποτελέσματα μιας μελέτης (Wu et al., 2002) έδειξαν ότι η μεταφορά ειδικών για τη GMB CD4 + T κυττάρων, ήταν αρκετή για να επάγει σπειραματονεφρίτιδα σε naïve ζώα. Στη σοβαρή μορφή νεφρίτιδας του λύκου, καθώς και σε άλλες μορφές ταχέως εξελισσόμενης σπειραματονεφρίτιδας, τα CD4 + T κύτταρα είναι παρόντα μέσα στα σπειράματα (Murata et al., 2002; Ooi & Kitching, 2012). Τόσο η παρουσία Τ κυττάρων-τελεστών στις περιοχές βλάβης όσο και η λειτουργική τους συσχέτιση σε πειραματικά μοντέλα σπειραματονεφρίτιδας, υποδηλώνουν ένα ρόλο για τα CD4 + κύτταρα σε σοβαρές μορφές της ασθένειας, επιπλέον των ζημιογόνων χυμικών μεσολαβητών. Τα T βοηθητικά κύτταρα-τελεστές, με τη μορφή των Th1 ή Th17 κυττάρων ενεργοποιούν εγγενή κύτταρα-τελεστές και μπορεί επίσης να επηρεάζουν νεφρικούς ιστούς (Ooi & Kitching, 2012). Το υποσύνολο Th κυττάρων το οποίο προκαλεί μηνοειδή σπειραματονεφρίτιδα αποτελείται από τα Th1 κύτταρα, τα οποία παράγουν μεσολαβητές όπως είναι η IFNγ, για τη διέγερση μακροφάγων που προκαλούν νεφρική βλάβη (Tipping & Holdsworth, 2003; Kurts, 2011). Τα Th17 κύτταρα μέσω της κυτταροκίνης που τους αντιστοιχεί, της IL-17A, μπορούν να επάγουν πολλαπλασιαστική σπειραματονεφρίτιδα και υπάρχουν αυξανόμενα στοιχεία τα οποία τα εμπλέκουν στη νόσο anti-gbm, τη νεφρίτιδα του λύκου και την χωρίς εναποθέσεις (pauci-immune) σπειραματονεφρίτιδα (Ooi et al., 2010). Μελέτες σε πειραματική, ταχέως εξελισσόμενη σπειραματονεφρίτιδα (Kitching et al., 2000; Summers et al., 2009; Kitching & Holdsworth, 2011), έχουν δείξει ένα λειτουργικό ρόλο για CD4 + T κύτταρατελεστές και Th1 και Th17 τύπου, με επιπλέον ενεργοποίηση Τ κυττάρων να επάγεται από εγγενή νεφρικά κύτταρα (Ooi & Kitching, 2012). 5. ΣΚΟΠΟΣ ΠΑΡΟΥΣΑΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΚΑΙ ΥΠΑΡΧΟΥΣΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η φαινοτύπηση των διάφορων λεμφοκυτταρικών τύπων σε ασθενείς με νεφρική νόσο. Πιο συγκεκριμένα μελετήθηκαν τα ποσοστά έκφρασης των ΝΚ, ΝΚ-Τ, Τ, CD4 + T, CD8 + T και Β λεμφοκυττάρων σε ασθενείς με σπειραματονεφρίτιδα και σε μεταμοσχευμένους ασθενείς. Επίσης, υπάρχει και μια τρίτη ομάδα δειγμάτων 88

90 από φυσιολογικά ως προς οποιαδήποτε νεφροπάθεια άτομα (control) στα οποία προσδιορίστηκαν τα ποσοστά των προαναφερθέντων κυττάρων. Είναι γεγονός πως δεν υπάρχουν πολλές μελέτες σε σχέση με τα ποσοστά των λεμφοκυτταρικών τύπων στις διάφορες μορφές νεφρικής νόσου και όσες υπάρχουν παρουσιάζουν αντικρουόμενα αποτελέσματα (Fornasieri et al., 1982; Gagnoli et al., 1982; Bannister et al., 1983; Markovic-Lipkovski et al., 1990; Galante et al., 2005; Ramirez et al., 2009; Furuzawa-Carballeda et al., 2012; Baron et al., 2014; Peukert et al., 2014). Επίσης, η πλειοψηφία των μελετών αφορά ασθενείς οι οποίοι υπόκεινται σε αιμοκάθαρση (Nishimoto & Matsumoto, 2001; Griveas et al., 2005; Eleftheriadis et al., 2009 κ.ά.). Στα πειράματα για αυτή την εργασία δεν χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από αιμοκάθαρση λόγω δυσκολίας εύρεσης δειγμάτων. 89

91 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΔΕΥΤΕΡΟ: ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Τα πειράματα τα οποία πραγματοποιήθηκαν στα πλαίσια της παρούσας εργασίας περιλαμβάνουν την απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων από δείγματα περιφερικού αίματος (Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs) από ασθενείς με σπειραματονεφρίτιδα, από άτομα που έχουν κάνει μεταμόσχευση νεφρού και από φυσιολογικά (control) άτομα. Στη συνέχεια, αφού γίνει η μέτρηση των κυττάρων στο αιμοκυτταρόμετρο, γίνεται σήμανσή τους με τα κατάλληλα αντισώματα, ακολουθεί η μέτρησή τους στον κυτταρομετρητή ροής (Fluorescence- activated cell sorting, FACS) και η ανάλυση των μετρήσεων. 1. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΜΟΝΟΠΥΡΗΝΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ (PBMCs) Η απομόνωση των PBMCs πραγματοποιείται με τη χρήση ενός διαλύματος διαχωρισμού το οποίο ονομάζεται Biocoll και περιέχει φικόλη. Η φικόλη είναι ένας υδρόφιλος πολυσακχαρίτης με μοριακό βάρος περίπου 400 kda και χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό του αίματος στα συστατικά του με βάση την κλίση πυκνότητας. Για να επιτευχθεί λοιπόν ο διαχωρισμός των συστατικών του αίματος, γίνεται αραίωση περιφερικού αίματος με θρεπτικό μέσο RPMI σε αναλογία 1:1 και στη συνέχεια το αραιωμένο αίμα στοιβάζεται επάνω σε μια ποσότητα Biocoll, σε αναλογία 3:1 και ακολουθεί φυγοκέντρηση. Μετά τη φυγοκέντρηση είναι εμφανής ο διαχωρισμός του αίματος σε στιβάδες όπως φαίνεται στις εικόνες 1 και 2. 90

92 Εικόνα 1: Διαχωρισμός PBMCs με τη χρήση φικόλης (προσαρμογή από Lin et al., 2014). Εικόνα 2: Στρώματα αίματος μετά τη φυγοκέντρηση (εικόνα από ενδεικτικό πείραμα το οποίο πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο). 91

93 1.1 Υλικά Υλικά Θρεπτικό μέσο RPMI 1640 (2mM L-glutamine, 10mM HEPES) Biocoll separating solution (διάλυμα φικόλης) PBS Falcon 15 ml Πιπέτες αυτόματες και Pasteur Κωδικός Εταιρεία FG 1385 (Biochrom, 500 ml) L6113 (Biochrom, 100ml) F-256 (Diamedix Corporation) Greiner bio-one 1.2 Πειραματική πορεία 1. Σε μπουκαλάκι Falcon βάζουμε 2,5 ml θρεπτικού μέσου RPMI. 2. Προσθέτουμε 2,5 ml περιφερικού αίματος και αναδεύουμε με την αυτόματη πιπέτα. 3. Σε ένα άλλο Falcon βάζουμε 1,660 ml διαλύματος φικόλης. 4. Κρατώντας το Falcon με τη φικόλη σε κλίση, στοιβάζουμε επάνω σε αυτή 5 ml αραιωμένου αίματος, προσέχοντας να μη γίνει ανάμιξη αίματος και φικόλης. 5. Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 2200 rpm για 40 λεπτά. 6. Όσο γίνεται η φυγοκέντρηση, βάζουμε σε ένα Falcon 5 ml PBS. 7. Μετά τη φυγοκέντρηση, με μια πιπέτα Pasteur παίρνουμε το στρώμα των PBMCs με προσοχή ώστε να μην πάρουμε από το υπερκείμενο ή το υποκείμενο στρώμα και τα μεταφέρουμε στο Falcon που περιέχει το PBS. 8. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 1800 rpm για 10 λεπτά. 9. Απομακρύνουμε το υπερκείμενο και το ίζημα που απομένει είναι τα PBMCs. 10. Κάνουμε επαναιώρηση των PBMCs με 1 ml PBS. 11. Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 1800 rpm για 10 λεπτά. 12. Απομακρύνουμε το υπερκείμενο και επαναιωρούμε με 1 ml PBS. 13. Τοποθετούμε 10 λ εναιώρημα κυττάρων στο αιμοκυτταρόμετρο για υπολογισμό της συγκέντρωσης των κυττάρων/ml. 92

94 2. ΜΕΤΡΗΣΗ ΑΡΙΘΜΟΥ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΟ ΑΙΜΟΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΟ Η μέτρηση του αριθμού των κυττάρων γίνεται με τη χρήση αιμοκυτταρόμετρου Neubauer Improved. Οι περιοχές μέτρησης που χρησιμοποιούμε είναι οι τέσσερεις γωνιακές δεκαεξάδες (Εικόνα 3). Αφού υπολογίσουμε τον μέσο όρο (α), βρίσκουμε τη συγκέντρωση (c) των κυττάρων ανά ml με τη χρήση του τύπου c = α x Εικόνα 3: Ο χαρακτηριστικός σταυρός του αιμοκυτταρόμετρου Neubauer (προσαρμογή από 3. ΣΗΜΑΝΣΗ ΜΕ ΤΑ ΚΑΤΑΛΛΗΛΑ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ (ΧΡΩΣΗ, STAINING), ΓΙΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΩΝ ΝΚ, ΝΚ-Τ ΚΑΙ Τ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Μετά από τη μέτρηση των κυττάρων, υπολογίζουμε την ποσότητα του εναιωρήματος που αντιστοιχεί σε 2x10 6 κύτταρα και τη μεταφέρουμε σε eppendorf. Σε αυτό το σημείο, όταν έχουμε περισσότερα του ενός δείγματα προσθέτουμε την απαιτούμενη ποσότητα PBS ώστε όλα τα δείγματα να έχουν τον ίδιο όγκο. Στη συνέχεια, γίνεται σήμανση με τα κατάλληλα αντισώματα ώστε τα κύτταρα να γίνουν ανιχνεύσιμα από τον κυτταρομετρητή. 93