ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΥΤΤΑΡΟΥ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ Συμμετοχή του γονιδίου wiser στο σχηματισμό του προσθοπίσθιου άξονα του φτερού κι αλληλεπίδρασή του με το γονίδιο Notch στη Drosophila melanogaster ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Ηλιάννα - Γεωργία Ρούσσου Βιολόγος ΠΑΤΡΑ, ΙΟΥΛΙΟΣ 2009

2 Τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής Γιαννόπουλος Γεώργιος Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Κίλιας Γεώργιος Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Σταμάτης Νικόλαος Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Ο Επιβλέπων Καθηγητής Γιαννόπουλος Γεώργιος Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών Η έγκριση της διατριβής για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης από το Τμήμα Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα. Ν. 5343/1392, άρθρο 202.

3 Πρόλογος Η μεταπτυχιακή αυτή διατριβή πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Γενετικής, στον Τομέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και Ανάπτυξης του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών, υπό την επίβλεψη του Καθηγητή Γεώργιου Γιαννόπουλου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον Καθηγητή μου Γεώργιο Γιαννόπουλο για την καθοδήγησή του, την εμπιστοσύνη του αλλά και την συμμετοχή του σε ένα μεγάλο μέρος της πειραματικής διαδικασίας και της συγγραφής αυτής της διατριβής. Η εμπειρία του και οι γνώσεις του αποτέλεσαν το σημαντικότερο παράγοντα για την ολοκλήρωση αυτής της εργασίας. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή Καθηγητή Γεώργιο Κίλια καθώς και τον Επίκουρο Καθηγητή Νικόλαο Σταμάτη για την συμμετοχή τους στην τριμελή επιτροπή, για τις συμβουλές και την παρότρυνσή τους αλλά και το ευχάριστο κλίμα που δημιουργούσαν στο εργαστήριο. Την κ. Αργυρή Χριστοπούλου για την πολύτιμη υποστήριξη που μας προσέφερε αλλά και την Καθηγήτρια Αντιγόνη Ζαχαροπούλου για την προθυμία της να βοηθήσει όποτε χρειάστηκε. Θα ήθελα να ευχαριστήσω επίσης, τα μέλη του εργαστηρίου Γενετικής, τον μεταπτυχιακό φοιτητή Παπαδημητρόπουλο Ματθαίο-Εμμανουήλ και τον προπτυχιακό φοιτητή Παπαλεωνιδόπουλο Βασίλη για την συνεργασία τους. Την υποψήφια διδάκτορα Ευθυμίου Μαρία και τη μεταπτυχιακή φοιτήτρια Συντιχάκη Ευαγγελία για την βοήθεια, την υποστήριξη αλλά και τη φιλία τους σε όλη τη διάρκεια της μεταπτυχιακής μου διατριβής. Τέλος, οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στους πολυαγαπημένους μου γονείς για την ηθική και υλική συμπαράσταση όλα αυτά τα χρόνια, χωρίς την οποία θα ήταν αδύνατη η ολοκλήρωση αυτής της προσπάθειας.

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α) ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 5 Α1) Η Γενετική και η Drosophila melanogaster. 6 A2) Από την προνύμφη στο ενήλικο άτομο- εμβρυικοί δίσκοι και εξωτερικά τμήματα (appendages)..7 Α3) Ανάπτυξη φτερού.9 Α4) Το γονίδιο Dpp στη Drosophila melanogaster..13 A5) Το γονίδιο Notch.17 Α6) Τα Ρ στοιχεία ως εργαλεία μοριακής γενετικής.20 Α7) Το γονίδιο wiser..24 A8) Σκοπός της διατριβής 26 Β) ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ.27 Β1) Βιολογικό υλικό..28 Β2) Μέθοδος καλλιέργειας...31 Β3) Στελέχη.32 Β4) In situ υβριδοποίηση σε πολυταινικά χρωμοσώματα προνυμφών 3 ου σταδίου 35 Β4.1) Παρασκευή χρωμοσωμικών παρασκευασμάτων 36 Β4.2) Σήμανση DNA ανιχνευτή με βιοτίνη με τη μέθοδο των τυχαίων εκκινητών 36 Β4.3) Προετοιμασία των χρωμοσωμάτων για την in situ υβριδοποίηση.37 Β4.4) Υβριδοποίηση 38 Β4.5) Χρώση και ανίχνευση του σήματος υβριδοποίησης 38

5 Β5) Χρώση με X-gal σε εμβρυικούς δίσκους προνυμφών τρίτου σταδίου 40 Β6) Δημιουργία μιτωτικών κλώνων με τη μέθοδο FLP-FRT...41 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ...43 Γ) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ..46 Γ1) Μελέτη της επίδρασης της εκτοπικής έκφρασης του γονιδίου wiser (UAS-wiser) με οδηγό το apgal4, στην έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στο σχηματισμό του προσθοπίσθιου άξονα του εμβρυικού δίσκου του φτερού.47 Γ2) Μελέτη της έκφρασης των παραπάνω γονιδίων ( Γ.1) που εμπλέκονται στο σχηματισμό του προσθοπίσθιου άξονα του εμβρυικού δίσκου του φτερού σε wiser tsl γενετικό υπόβαθρο...52 Γ3) Αλληλεπίδραση του γονιδίου wiser με το γονίδιο Notch 57 Γ3.1) Πρόκληση και συμπεριφορά μιας νέας μετάλλαξης Notch που προέκυψε από μετάθεση του στοιχείου P{LacW} του στελέχους PL26.58 Γ3.2) Δημιουργία του στελέχους Ν GY.60 Γ3.3) Αλληλεπίδραση του N GY με το wiser tsl.62 Γ4) Δημιουργία μιτωτικών κλώνων για τη μελέτη της μετάλλαξης PL28.64 Δ) ΣΥΖΗΤΗΣΗ..68 Ε) ΠΕΡΙΛΗΨΗ..76 ΣΤ) SUMMARY 78 Z) ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ..80

6

7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.1. Η Γενετική και η Drosophila melanogaster Η Γενετική αποτελεί έναν από τους σημαντικότερους κλάδους της Βιολογίας και ασχολείται με τα γονίδια και την κληρονομικότητα. Όλες οι έρευνες που αφορούν κάποια βιολογική διαδικασία, από το μοριακό επίπεδο ως το επίπεδο του πληθυσμού, χρησιμοποιούν γενετικές προσεγγίσεις για να μελετήσουν καλύτερα την διαδικασία αυτή. Επίσης η Γενετική κατέχει ιδιαίτερη θέση μεταξύ των βιολογικών επιστημών αφού αποφέρει σημαντικά οφέλη στον άνθρωπο. Οι έρευνές της έχουν συντελέσει στην βελτίωση της ποιότητας ζωής και της υγείας του ανθρώπου. Η Γενετική εξελίσσεται με ταχύτατους ρυθμούς. Από το 1860 που ο πατέρας της Γενετικής Gregor Mendel πραγματοποίησε τα πρώτα πειράματα έως σήμερα, οι γνώσεις μας για τα γονίδια και τις λειτουργίες τους ολοένα και αυξάνουν. Σε αυτό έχουν βοηθήσει και οι γενετιστές που χρησιμοποιούν ως πειραματόζωο τη Drosophila melanogaster. Από το έντομο αυτό, έχει προκύψει μεγάλος όγκος πληροφοριών ακόμη και για γονίδια που αφορούν τον άνθρωπο, αφού οι δύο αυτοί οργανισμοί αν κι απέχουν πολύ από εξελικτικής σκοπιάς, διαθέτουν πολλά κοινά γονίδια (ορθόλογα). Δεν είναι τυχαίο το γεγονός ότι ένα μεγάλο μέρος της έρευνας που γίνεται στη Γενετική, χρησιμοποιεί ως πειραματόζωο τη Drosophila melanogaster. Το πειραματόζωο αυτό απαιτεί μικρό κόστος και χώρο συντήρησης ενώ η καλλιέργειά του είναι απλή. Επίσης δίνει σχετικά μεγάλο αριθμό απογόνων σε μικρό χρονικό διάστημα και γι αυτό ενδείκνυται για στατιστική ανάλυση. Τέλος, έχει συντελέσει στην αποκωδικοποίηση μηχανισμών που εμπλέκονται σε διάφορες ασθένειες. Για όλους τους λόγους αυτούς, δίνεται μεγάλη βαρύτητα από τους επιστήμονες στην αποκάλυψη των μυστικών της Drosophila melanogaster που εκτιμάται ότι θα οδηγήσουν και στην αποκάλυψη μυστικών του ανθρώπινου οργανισμού

8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α.2. Από την προνύμφη στο ενήλικο άτομο - εμβρυικοί δίσκοι και εξωτερικά τμήματα (appendages). Η Drosophila melanogaster είναι ολομετάβολο έντομο, το οποίο διαθέτει έναν πολύπλοκο κύκλο ζωής που περιλαμβάνει το αυγό, την εμβρυική φάση που συμβαίνει σ αυτό, τρεις προνυμφικές περιόδους, τρία στάδια νύμφης και τέλος το ακμαίο άτομο. Κατά την διάρκεια της νύμφης, συμβαίνει μια ολοκληρωτική μεταμόρφωση κατά την οποία όλες σχεδόν οι προνυμφικές δομές ιστολύονται και αντικαθίστανται από τις δομές του ενήλικου εντόμου. Οι εξωτερικές δομές προκύπτουν από την ανάπτυξη των εμβρυϊκών δίσκων ενώ οι μεσοδερμικοί ιστοί προέρχονται από ένα ξεχωριστό στρώμα κυττάρων (adepithelial) ή από μεσοδερμικούς ιστούς της προνύμφης (Blair, 1995). Οι εμβρυικοί δίσκοι προκύπτουν κατά την εμβρυική ανάπτυξη ως δομές που μοιάζουν με μικρά συσσωματώματα κυττάρων τα οποία διαιρούνται κατά τα πρώτα προνυμφικά στάδια για να σχηματίσουν μεγάλους επιθηλιακούς σάκους που παίρνουν την τελική τους μορφή στο στάδιο της προνύμφης τρίτου σταδίου. Υπάρχουν 10 ζευγάρια εμβρυικών δίσκων. Το κάθε ζευγάρι έχει συγκεκριμένο σχήμα και μέγεθος και παίρνει το όνομά του από το μέρος του σώματος που σχηματίζει. Έτσι υπάρχουν οι εμβρυικοί δίσκοι των φτερών, των ποδιών, των ματιών-κεραιών των αλτήρων κλπ. (Εικόνα Α1)

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα Α1: Εμβρυικοί δίσκοι και οι δομές που προκύπτουν από αυτούς. Αριστερά: Προνύμφη τρίτου σταδίου και οι θέσεις όλων των εμβρυικών δίσκων. Σε μεγέθυνση φαίνονται όλοι οι εμβρυικοί δίσκοι. Δεξιά: Το σώμα της ώριμης μύγας όπου διακρίνεται το κυρίως σώμα και τα εξωτερικά τμήματά του. Κατά τη διάρκεια της μεταμόρφωσης, διαφορετικές περιοχές του επιθηλίου των δίσκων διαφοροποιούνται σε εξωδερμικούς ιστούς του κάθε άκρου, σχηματίζοντας δομές όπως σμήριγγες (bristles), αρθρώσεις, φλέβες και επιθηλιακά κύτταρα. Στους εμβρυικούς δίσκους δεν είναι πάντα προφανές το πού βρίσκεται το όριο μεταξύ των άκρων και του κυρίως σώματος. Στο πόδι για παράδειγμα, δεν υπάρχει ξεκάθαρο μορφολογικό όριο που να ξεχωρίζει τα δύο μέρη, ούτε στην ενήλικη δομή ούτε στον εμβρυικό δίσκο. Επίσης, το κυρίως σώμα και τα άκρα δεν προκύπτουν από διαφορετικές σειρές κυττάρων αφού τουλάχιστον μέχρι πολύ αργά κατά την ανάπτυξη οι απόγονοι ενός κυττάρου μπορούν να συνεισφέρουν και στις δύο δομές. Ο διαχωρισμός μεταξύ των άκρων και του κυρίως σώματος ελέγχεται από διαφορετικούς γενετικούς και αναπτυξιακούς μηχανισμούς που συμβαίνουν τόσο στο κυρίως σώμα όσο και στα άκρα

10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οι εμβρυικοί δίσκοι υποδιαιρούνται σε διαμερίσματα (compartments) που καθορίζονται από τους εμβρυικούς άξονες. Η θέση των εμβρυικών αξόνων καθορίζεται γενετικά. Α.3. Ανάπτυξη φτερού Τα φτερά στη Drosophila αναπτύσσονται από τους εμβρυϊκούς δίσκους του φτερού μέσω μιας εγκόλπωσης της εμβρυικής επιδερμίδας. Ο εμβρυικός δίσκος του φτερού αποτελείται από περίπου 20 κύτταρα όταν σχηματίζεται κατά την ανάπτυξη του εμβρύου. Αυτά τα κύτταρα πολλαπλασιάζονται κατά τη διάρκεια των τριών προνυμφικών σταδίων ώστε να σχηματίσουν έναν εμβρυικό δίσκο με κύτταρα στο τρίτο προνυμφικό στάδιο (περίπου 95 ώρες μετά την εκκόλαψη) (Εικόνα Α2). Ο ώριμος δίσκος είναι κατά βάση ένα μονόστοιβο επιθήλιο με δύο διαστάσεις. Έτσι προκύπτει το ίδιο πρόβλημα που αντιμετωπίζει κι ένας ζωγράφος: η ενσωμάτωση μιας τρίτης διάστασης σε ένα δισδιάστατο καμβά. Το πρόβλημα αυτό λύνεται στα έντομα με την οργάνωση του εμβρυικού δίσκου σε ομόκεντρους κύκλους με το αναπτυγμένο φτερό και την περιφέρεια του να αντιπροσωπεύονται από την περιοχή του κέντρου του εμβρυικού δίσκου (wing blade, margin) και η περιοχή της άρθρωσης στο κύριο σώμα του ατόμου να αντιπροσωπεύεται από τις δομές της περιφέρειας (hinge) του εμβρυικού δίσκου (Klein 2001). Η ανάπτυξη του φτερού ελέγχεται από μια σειρά γονιδίων με πιο σημαντικά τα engrailed (en), apterous (ap), vestigial (vg) καθώς και γονίδια που εμπλέκονται στα σηματοδοτικά μονοπάτια Notch (N), Decapentaplegic (Dpp), Wingless (Wg) και Hedgehog (Hh) (Klein 2001)

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ α β Εικόνα A2: Σχηματική παράσταση του εμβρυικού δίσκου του φτερού (α) και του ενήλικου φτερού (β). Τα χρώματα αντιστοιχούν στις διάφορες δομές και στα δύο αναπτυξιακά στάδια (Τροποποιημένη από: Campos-Ortega J.A. and Hartenstein V. 1997). Οι ιστοί των εντόμων αλλά και των σπονδυλωτών χωρίζονται σε σύνολα κυττάρων που ονομάζονται διαμερίσματα (compartments). Η επιφάνεια επαφής μεταξύ δύο γειτονικών διαμερισμάτων ονομάζεται όριο διαμερίσματος. Χαρακτηριστικό αυτών των ορίων είναι ότι διαθέτουν μηχανισμούς κυτταρικού διαχωρισμού. Τα κύτταρα του ενός διαμερίσματος δεν αναμειγνύονται με τα κύτταρα του γειτονικού διαμερίσματος γεγονός που οδηγεί στην ύπαρξη ξεκάθαρου ορίου. Τα όρια των διαμερισμάτων στους εμβρυικούς δίσκους αντιπροσωπεύονται από τους εμβρυικούς άξονες. Στον εμβρυικό δίσκο του φτερού υπάρχουν δύο κύριοι άξονες, ο προσθοπίσθιος (Α/Ρ axis) και o ραχιοκοιλιακός (D/V axis). Ο πρώτος αναπτύσσεται κατά το πρώτο προνυμφικό στάδιο και χωρίζει τον εμβρυικό δίσκο σε εμπρόσθιο και οπίσθιο διαμέρισμα. Ο δεύτερος άξονας σχηματίζεται κατά το δεύτερο προνυμφικό στάδιο και χωρίζει το δίσκο σε ραχιαίο και κοιλιακό διαμέρισμα

12 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η διαμερισματοποίηση αποτελεί μια συντηρημένη μορφογενετική στρατηγική των πολυκύτταρων οργανισμών για το σχεδιασμό και την διατήρηση της δομής τους κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Για το σχηματισμό του προσθοπίσθιου άξονα του εμβρυικού δίσκου του φτερού, υπεύθυνο αρχικά είναι το γονίδιο engrailed (en). Το γονίδιο en μαζί με το γονίδιο invected (inv) δρουν σαν γονίδια επιλογείς (selectors) για τα οπίσθια κύτταρα (Strigini and Cohen,1999) ενεργοποιώντας την έκφραση του ειδικού για τα οπίσθια κύτταρα μορίου Hedgehog (Hh). Τα γονίδια επιλογείς εκφράζονται στα κύτταρα του ενός διαμερίσματος και όχι στα κύτταρα του άλλου διαμερίσματος, δρώντας σαν διακόπτες που ελέγχουν την ταυτότητα των κυττάρων κάθε διαμερίσματος. Καθορίζουν δομές ειδικές για κάθε διαμέρισμα και εμποδίζουν την ανάμειξη των κυττάρων στα οποία εκφράζονται με τα κύτταρα του άλλου διαμερίσματος. Ταυτόχρονα, τα γονίδια en και inv καταστέλλουν την απόκριση των οπίσθιων κυττάρων στο Hh (Guillen et al., 1995). Αυτό επιτυγχάνεται με την καταστολή από το en του μεταγραφικού παράγοντα Cubitus interruptus (Ci) στα κύτταρα του οπίσθιου τμήματος. Το Ci είναι απαραίτητο για το μονοπάτι σηματοδότησης Hh (Tabata et al., 1992). Αντίθετα τα κύτταρα του εμπρόσθιου τμήματος εκφράζουν τον Ci και μπορούν να ανταποκριθούν στο Hh που εκκρίνεται από τα κύτταρα του οπίσθιου τμήματος. Απόκριση από τα κύτταρα του εμπρόσθιου τμήματος στη σηματοδότηση Hh έχει σαν αποτέλεσμα τα κύτταρα του τμήματος αυτού να αποκτήσουν μια συνάφεια που είναι διαφορετική από εκείνη των οπίσθιων κυττάρων με αποτέλεσμα να υπάρξει διαχωρισμός των κυττάρων των δύο τμημάτων. Η διαφορετική συνάφεια των οπίσθιων κυττάρων οφείλεται στη έκφραση του en σ αυτά (Rodriguez and Basler, 1997). To Hh επάγει επίσης την έκφραση του Decapentaplegig (Dpp) σε μια λωρίδα εμπρόσθιων κυττάρων κατά μήκος του προσθοπίσθιου άξονα (Basler and Struhl, 1994). Το Dpp ανήκει στην οικογένεια των TGF-β αυξητικών παραγόντων και δρα σαν μορφογόνο καθορίζοντας την κυτταρική μοίρα και στα δύο διαμερίσματα ανάλογα με την συγκέντρωσή του (Lecuit et al., 1996)

13 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στο φτερό, το προσθοπίσθιο όριο αυτό αναπτύσσεται στην περιοχή που μελλοντικά θα σχηματιστεί το επιθήλιο μεταξύ δύο φλεβών (Eικόνα A3) (Steiner 1976, Held 1979). Εικόνα A3: Διαμερισματοποίηση και έκφραση γονιδίων στο αναπτυσσόμενο φτερό. Α: εμπρόσθιο διαμέρισμα (anterior), Ρ: οπίσθιο διαμέρισμα (posterior), D: ραχιαίο διαμέρισμα (dorsal), V: κοιλιακό διαμέρισμα (ventral), margin: όριο φτερού, wing blade: περιοχή πτέρυγας, en: engrailed (μπλε) ap: apterous (κίτρινο). (Τροποποιημένη από: Blair, 1995). Για το σχηματισμό του ραχιοκοιλιακού άξονα υπεύθυνο είναι το γονίδιο-επιλογέας apterous (ap). Το γονίδιο αυτό κωδικοποιεί έναν LIMμεταγραφικό παράγοντα που εκφράζεται μόνο στο ραχιαίο διαμέρισμα του εμβρυικού δίσκου το οποίο και καθορίζει. Στο καθορισμό του ραχιοκοιλιακού άξονα εμπλέκονται και τα γονίδια Serrate (Ser) και Delta (Dl) που παράγουν προσδενόμενα μόρια (ligands) του υποδοχέα Νotch (N) και ρυθμίζουν την έκφρασή του. Η έκφραση του Notch ενεργοποιεί την παραγωγή του Wingless (Wg) στο ραχιοκοιλιακό άξονα. Το Wg δρα σε μεγάλη εμβέλεια για να ρυθμίσει την έκφραση γονιδίων στόχων του (Eικόνα Α4) (Milan and Cohen 2002)

14 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα Α4: Σχηματισμός του φτερού με τη βοήθεια δύο αξόνων και γονίδια που συμμετέχουν στο σχηματισμό των αξόνων αυτών. α. Προσθοπίσθιος άξονας. EN: Engrailed, HH: Hedgehog, DPP: Decapentaplegic, A: εμπρόσθιο διαμέρισμα, Ρ: οπίσθιο διαμέρισμα β. Ραχιοκοιλιακός άξονας. AP: Apterous, SER: Serrate, DL: Delta, WG: Wingless, D: ραχιαίο διαμέρισμα, V: κοιλιακό διαμέρισμα (Dahman and Basler 1999). Ο εμβρυικός δίσκος του φτερού καθορίζεται και από έναν τρίτο άξονα, τον εγγύς-απώτερο άξονα, για τον σχηματισμό του οποίου λίγα πράγματα είναι γνωστά (Dahman and Basler 1999). Α.4. Το γονίδιο Dpp στη Drosophila melanogaster. Το γονίδιο Dpp, μέλος της υπεροικογένειας των TGF-β αυξητικών παραγόντων, κωδικοποιεί μια εκκρινόμενη σηματοδοτική πρωτεΐνη που δρα σαν μορφογόνο, δηλαδή εκκρίνεται και σχηματίζει μεγάλου εύρους κλίσεις συγκέντρωσης (Singer et al., 1997) για να σχηματίσει τον προσθοπίσθιο άξονα του εμβρυικού δίσκου του φτερού της Drosophila. Επίσης ελέγχει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τον καθορισμό του κυτταρικού προορισμού, ενώ προάγει την κυτταρική επιβίωση και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό στην περιοχή του δίσκου από την οποία θα προκύψει το φτερό (wing pouch) της Drosophila (Capdevila and Guerrero, 1994). Η πρωτεΐνη Dpp παράγεται από κύτταρα του εμπρόσθιου τμήματος του εμβρυικού δίσκου του φτερού που βρίσκονται κοντά στο όριο των διαμερισμάτων αλλά δρα συμμετρικά και στα δύο διαμερίσματα σχηματίζοντας μια κλίση στη συγκέντρωσή του (Teleman and Cohen, 2000) (Εικόνα Α5)

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα Α5: Εμβρυικός δίσκος φτερού από προνύμφη τρίτου σταδίου Drosophila του διαγονιδιακού στελέχους dpp-lacz. Η καφέ περιοχή αποτελεί το οπίσθιο διαμέρισμα του δίσκου όπου εκφράζεται το en (έγινε χρώση με αντίσωμα έναντι του en) ενώ η μπλε λωρίδα κοντά στο προσθοπίσθιο όριο (διακεκομμένη λευκή γραμμή) που προέκυψε με χρώση X-gal, απεικονίζει την έκφραση του dpp. Α: εμπρόσθιο διαμέρισμα (anterior), Ρ: οπίσθιο διαμέρισμα (posterior), w: περιοχή πτέρυγας (wing blade), mn: μεσοθώρακας (mesonotum) (Morata, Sanchez- Herrero, 1999). Η πρωτεΐνη Dpp λειτουργεί ως προσδενόμενο μόριο και δεσμεύεται σε υποδοχείς που μεσολαβούν στην μεταγωγή του σήματος Dpp στο εσωτερικό του κυττάρου. Οι υποδοχείς του Dpp είναι δύο τύπων, του τύπου Ι που είναι ο Thick veins (Tkv) και του τύπου ΙΙ που είναι ο Punt (Brummel et al., 1994; Letsou et al., 1995). Σ αυτό το μονοπάτι σηματοδότησης, εμπλέκονται και άλλα γονίδια που μέσω περίπλοκων αλληλεπιδράσεων καταλήγουν στη ρύθμιση έκφρασης των γονιδίων στόχων του Dpp. Πιο συγκεκριμένα ο υποδοχέας Tkv που φωσφορυλιώνεται από τον Punt, φωσφορυλιώνει με τη σειρά του το Smad μεταγραφικό παράγοντα Mothers against dpp (Mad) που συμβολίζεται ως pmad (φωσφορυλιωμένη μορφή του Mad). O pmad προσδένει την πρωτεΐνη Medea (Med) και αυτό το σύμπλοκο μετατοπίζεται στον πυρήνα για να ρυθμίσει μεταγραφικά την έκφραση των γονιδίων στόχων του Dpp (Raftery and Sutherland, 1999). Στους εμβρυικούς δίσκους το σύμπλοκο Mad/Med και η zinc-finger πρωτεΐνη Schnurri (Shn) καταστέλλουν

16 ΕΙΣΑΓΩΓΗ την έκφραση του γονιδίου brinker (brk) που κωδικοποιεί έναν καταστολέα των γονιδίων στόχων του Dpp (Arora et al., 1995, Campbell and Tomlinson, 1999, Jazwinska et al., 1999). Ο καταστολέας Brk κατανέμεται σε μια κλίση αντίστροφη από αυτή του Dpp και λειτουργεί για να εμποδίσει την έκφραση των γονιδίων στόχων του Dpp, spalt (salm) και spalt-related (salr), (δύο γειτονικά και λειτουργικά σχετικά γονίδια που αναφέρονται μαζί και ως sal), και optomotor-blind (omb) (Campbell and Tomlinson, 1999, Minami et al., 1999, Muller et al., 2003). To γονίδιο Daughters against Dpp (Dad) κωδικοποιεί έναν αναστολέα της σηματοδότησης Dpp (Tsuneizumi et al.,1997) που μέσω μιας θηλιάς αρνητικής ανάδρασης, το Dpp επάγει την έκφραση του ανταγωνιστή του Dad. Όπως προαναφέρθηκε, μεταξύ των γονιδίων στόχων της σηματοδότησης Dpp είναι και τα γονίδια optomotor-blind (omb) και spalt (salm). Το γονίδιο omb δρα στα κύτταρα του εμπρόσθιου διαμερίσματος που εκφράζουν το Dpp και συμμετέχει στη διατήρηση του προσθοπίσθιου ορίου (del Alamo Rodriguez et al., 2004). Επομένως η σηματοδότηση Dpp είναι απαραίτητη για την διατήρηση του προσθοπίσθιου άξονα και χρειάζεται μόνο στα κύτταρα του εμπρόσθιου και όχι του οπίσθιου διαμερίσματος (Shen and Dahmann, 2005). Συμμετέχει επίσης στην ανάπτυξη του οπτικού λοβού (Pflugfelder and Heisenberg, 1995) καθώς και σε άλλες λειτουργίες όπως στην ενεργοποίηση των γονιδίων sal και vestigial (vg). Δηλαδή, το omb δρα καθοδικά του dpp τόσο στο σχηματισμό της κλίσης ενεργότητας όσο και στην ενεργοποίηση άλλων γονιδίων στόχων (del Alamo Rodriguez et al., 2004) και χρειάζεται για την διατήρηση του προσθοπίσθιου συνόρου. Ακόμη, το omb καταστέλλει το γονίδιο ap στο κοιλιακό διαμέρισμα που σημαίνει ότι η σηματοδότηση Dpp συμμετέχει και στον σχηματισμό του ραχιοκοιλιακού ορίου (Shen and Dahmann, 2005). Το γονίδιο spalt (salm) το οποίο κωδικοποιεί ένα zinc-finger μεταγραφικό παράγοντα, εκφράζεται σε μια ευρεία περιοχή του φτερού (wing pouch) όπου απλώνεται από την περιοχή που θα προκύψει η L2 φλέβα μέχρι το εμπρόσθιο όριο της περιοχής που θα προκύψει η L5 φλέβα και βοηθά

17 ΕΙΣΑΓΩΓΗ στην διατήρηση της σωστής απόστασης μεταξύ των φλεβών (de Celis and Barrio, 2000). Η δράση του salm εκτός της περιοχής του δίσκου που θα δώσει το φτερό καταστέλλεται από το γονίδιο Brk του οποίου η μη δράση στη περιοχή που εκφράζεται το salm, οφείλεται στο dpp (Campbell and Tomlinson, 1999, Jazwinska et al., 1999). Επίσης το γονίδιο dpp ενεργοποιεί την έκφραση του γονιδίου collier (col) που αποτελεί στόχο του Hh. Καταστέλλει επίσης τα γονίδια N/Wg εκτός των ορίων του ραχιοκοιλιακού άξονα. Ακόμη χρειάζεται για την διατήρηση της κανονικής έκφρασης του en και την καταστολή του ap στο κοιλιακό διαμέρισμα (Glise et al., 2002). Όλα τα παραπάνω δείχνουν ότι υπάρχει αλληλεπίδραση των μονοπατιών Hh, Dpp και Wg στο σχεδιασμό της περιοχής που θα δώσει το φτερό (wing pouch) (Εικόνα Α6). Πρόσφατα βρέθηκε (Foronda et al., 2009) ότι η έκφραση του dpp στο οπίσθιο τμήμα του εμβρυικού δίσκου του φτερού συμμετέχει στην κανονική ανάπτυξη του φτερού. Έλλειψη του Dpp στο οπίσθιο τμήμα, οδηγεί σε φτερά που τους λείπουν δομές όπως τα allula και axillary cord (δομές κάτω από την άρθρωση). Αντίστοιχο ρόλο με αυτόν του dpp, παίζει το wg στο σχηματισμό του ραχιοκοιλιακού άξονα του εμβρυικού δίσκου του φτερού της Drosophila melanogaster

18 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα Α6: Αλληλεπίδραση των μονοπατιών Hh, Dpp και Wg κατά μήκος του ραχιοκοιλιακού άξονα. (Christian Dahmann, 2004). Α.5.Το γονίδιο Notch Το γονίδιο Notch (N) είναι ένα από τα σπουδαιότερα γονίδια κι εμπλέκεται στην ανάπτυξη όλων σχεδόν των οργανισμών. Πρωτανακαλύφθηκε στη Drosophila melanogaster από το Morgan το 1917 και πήρε το όνομά του από τις εγκοπές που προκαλεί στα φτερά των ατόμων που φέρουν τη μετάλλαξή του. Χαρτογραφήθηκε γενετικά στη θέση και κυτταρολογικά στη θέση 3C. Καθώς συνεχιζόταν η μελέτη του, όλο και περισσότερα ενδιαφέροντα στοιχεία ανακαλύπτονταν σχετικά με τη δράση του. Οι τεχνικές του ανασυνδυασμένου DNA και οι μοριακές τεχνικές που αναπτύχθηκαν στη συνέχεια αποκάλυψαν ότι το γονίδιο Ν υπάρχει σ όλους τους οργανισμούς που μελετήθηκαν. Η μοριακή μελέτη του στη Drosophila

19 ΕΙΣΑΓΩΓΗ αποκάλυψε αρκετές λεπτομέρειες σχετικά με την έκφρασή του και τους μηχανισμού ς εμπλοκής του στην ανάπτυξη. Η πρωτεΐνη Νotch είναι διαμεμβρανικός υποδοχέας που αποτελείται από τρεις περιοχές, την εξωκυτταρική, τη διαμεμβρανική και τη ενδοκυττάρια. Μεσολαβεί στην τοπική επικοινωνία κυττάρου με κύτταρο και συντονίζει μια αλυσιδωτή σηματοδότηση που είναι παρούσα σε όλα τα ζωικά είδη που μελετήθηκαν μέχρι σήμερα. Η σηματοδότηση Ν εμπλέκεται ευρέως στον καθορισμό του προορισμού των κυττάρων και στον σχεδιασμό του προτύπου ανάπτυξης. Η δυσλειτουργία του έχει ως αποτέλεσμα μια τεράστια ποικιλία από αναπτυξιακές ανωμαλίες και παθολογικές καταστάσεις που εμφανίζονται στα ενήλικα άτομα. Πολλές γενετικές παθήσεις στον άνθρωπο καθώς και μορφές καρκίνου οφείλονται στη δυσλειτουργία της σηματοδότησης Notch. Η βασική λειτουργία της σηματοδότη σης Notch είναι να συντονίζει την έκφραση γονιδίων σε παρακείμενα κύτταρα. Αυτό το πετυχαίνει με έναν ιδιαίτερα άμεσο τρόπο. Το κύτταρο που στέλνει το σήμα για την ενεργοποίηση του Ν εκφράζει στην επιφάνειά του ένα Notch προσδέτη (ligand) που ανήκει είτε στην υποοικογένεια Delta ή στην υποοικογένεια Serrate. Ο προσδέτης δεσμεύεται στον υποδοχέα Notch που βρίσκεται στη μεμβράνη του κυττάρου που λαμβάνει το σήμα. Ακολουθεί η αποκοπή της ενδοκυτταρικής περιοχής και η μεταφορά της στον πυρήνα, όπου ενεργεί ως μεταγραφικός ρυθμιστής (Εικόνα Α7). Οι κύριοι, ή τουλάχιστον, οι καλύτερα μελετημένοι στόχοι που ρυθμίζονται από την ενδοκυτταρική περιοχή είναι τα μέλη της οικογένειας Hairy/E(spl). Αυτά κωδικοποιούν ανασταλτικούς μεταγραφικούς παράγοντες της δομής β-έλικα-θηλι ά-έλικα (bhlh), που μπορούν να ελέγξουν την έκφραση πολλών διαφορετικών δευτερογενών γονιδίων στόχων, συμπεριλαμβανομένων και των γονιδίων που κωδικοποιούν τους προσδέτες του Notch καθώς και των γονιδίων Hairy/E(spl) αυτών κάθε αυτών. Ο ρόλος της σηματοδότησης Notch στο σχεδιασμό της ανάπτυξης εξαρτάται από τους τρόπους με τους οποίους τα παραπάνω

20 ΕΙΣΑΓΩΓΗ στοιχεία αλλά και άλλα που συντονίζουν τη δράση της, είναι λειτουργικά συνδεδεμένα σε ρυθμιστικά ανατροφοδοτούμενα κυκλώματα (βρόχους). Εικόνα Α7: Σηματοδότηση Notch. NICD: ενδοκυτταρική περιοχή του Notch, NECD: εξωκυττάρια περιοχή του Notch (Τροποποιημένη από: Lewis et al, 2009). Σ ένα κύκλωμα ανατροφοδότησης όπου η ενεργοποίηση του Notch οδηγεί σε κατιούσα ρύθμιση την έκφραση των προσδετών του στο κύτταρο που λαμβάνει το σήμα, αυτή οδηγεί σε πλευρική αναστολή, ωθώντας παρακείμενα κύτταρα να γίνουν διαφορετικά το ένα από το άλλο και επομένως να δώσουν διαφορετικούς ιστούς (Εικόνα Α8). Σ ένα αντίθετο κύκλωμα η ενεργοποίηση του Ν μπορεί να διεγείρει την έκφραση του προσδέτη. Στην περίπτωση αυτή το αποτέλεσμα θα είναι αντίθετο, θα ωθήσει, δηλαδή παρακείμενα κύτταρα να είναι όμοια. Υπάρχουν και άλλα κυκλώματα ανατροφοδότησης που απαρτίζονται από τα ίδια στοιχεία και μπορούν να εκτελέσουν και άλλες λειτουργίες συμπεριλαμβανομένης της επαγωγής χρονικών ταλαντώσεων στην έκφραση γονιδίων. Με αυτό τον τρόπο ελέγχεται και η σωμιτογένεση κατά την ανάπτυξη (Lewis et al., 2009)

21 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Hairy/E(spl) Hairy/E(spl) Εικόνα A8 : Πλευρική αναστολή κατά την διαφοροποίηση μέσω της σηματοδότησης Notch (Τροποποιημένη από: Lewis et al, 2009). A6. Τα Ρ στοιχεία ως εργαλεία γενετικής και μοριακής ανάλυσης Τα ΜΓΣ είναι αυτόνομες αλληλουχίες DNA οι οποίες μπορούν να μετατίθενται, από μια θέση του γονιδιώματος σε άλλη, χωρίς να υπάρχει ομολογία μεταξύ αυτών και της θέσης ένθεσης. Πρωτανακαλύφθηκαν γενετικά στο καλαμπόκι από την Barbara McClintock στη δεκαετία του 1940 και από τότε βρέθηκαν προοδευτικά σε όλους του οργανισμούς που μελετήθηκαν, από τα βακτήρια μέχρι τον άνθρωπο. Πολλές φυσικές μεταλλάξεις σε όλους τους οργανισμούς οφείλονται σε ΜΓΣ. Στον άνθρωπο αρκετές γενετικές παθήσεις βρέθηκε πως οφείλονται σε μεταλλάξεις που προκλήθηκαν από την ένθεση ΜΓΣ. Ανάλογα με το μηχανισμό μετάθεσης, τα ΜΓΣ διακρίνονται στα DNA ΜΓΣ και στα RNA ΜΓΣ. Η Drosophila melanogaster έχει γύρω στις 50 οικογένειες ΜΓΣ. Όμως η καλύτερα μελετημένη, και η πιο χρήσιμη για τη μοριακή ανάλυση του γονιδιώματος της Drosophila melanogaster είναι η οικογένεια των Ρ ΜΓΣ

22 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η δομή του πλήρους Ρ στοιχείου που ανήκει στα DNA ΜΓΣ φαίνεται στην Eικόνα A9. Το πλήρες Ρ στοιχείο αποτελείται από τις αντίρροπες ακραίες επαναλήψεις που είναι απαραίτητες για τη μετάθεση του και το γονίδιο της τρανσποζάσης που αποτελείται από 4 εξόνια και 3 ιντρόνια ή κατ άλλους εσόνια. IR Ιντρόνια ή εσόνια Inverted Repeats IR Εξόνια Εικόνα A9: Δομή ενός Ρ ΜΓΣ. Οι γαλάζιες γραμμές αντιπροσωπεύουν τα εσόνια και τα ροζ κουτιά τα εξόνια. Οι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (Inverted Repeats) φαίνονται στα άκρα του σχήματος με κόκκινο χρώμα. Αξιοποιώντας την ιδιότητα των Ρ μεταθέσιμων γενετικών στοιχείων, να μετατίθενται σε οποιαδήποτε θέση του γονιδιώματος, παρουσία ενεργής Ρ τρανσποζάσης αρκεί τα άκρα του στοιχείου να μένουν ανέπαφα, έχουν δημιουργηθεί πολλές κατασκευές (τεχνητά Ρ στοιχεία constructs) οι οποίες χρησιμοποιούνται ευρέως σε πειράματα γενετικής και μοριακής ανάλυσης στη Drosophila melanogaster. Οι κατασκευές αυτές δημιουργούνται in vitro και είναι στην ουσία τροποποιημένα ελλειμματικά Ρ στοιχεία, δηλαδή φέρουν ανέπαφες τις ανεστραμμένες επαναλήψεις στα άκρα του Ρ (απαραίτητα για τη μετάθεση), όμως το γονίδιο της τρανσποζάσης έχει αντικατασταθεί από άλλα γονίδια, του ιδίου ή διαφορετικού είδους, με αποτέλεσμα την αδυναμία αυτόνομης μετάθεσής τους. Έτσι οι ενθέσεις των τροποποιημένων Ρ στοιχείων είναι σταθερές. Η μετακίνησή τους όμως είναι δυνατή παρουσία ενεργής Ρ τρανσποζάσης. Ως πηγή Ρ τρανσποζάσης χρησιμοποιείται το τεχνητό στοιχείο pp[δ2-3]. Το στοιχείο αυτό είναι ελλειμματικό για το ιντρόνιο 2-3 του γονιδίου της τρανσποζάσης, με αποτέλεσμα να παράγεται ενεργή

23 ΕΙΣΑΓΩΓΗ τρανσποζάση στα γεννητικά και στα σωματικά κύτταρα, ενώ το ίδιο δεν μπορεί να μετακινηθεί εξαιτίας κάποιας μετάλλαξης στο 3 άκρο. Τα τροποποιημένα Ρ στοιχεία χρησιμοποιούνται για το μετασχηματισμό ατόμων Drosophila, που επιτυγχάνεται με την ένθεσή τους στο γονιδίωμά τους. Για το σκοπό αυτό γίνεται ένεσή τους στον οπίσθιο πόλο προβλαστοδερμικών εμβρύων κατάλληλων στελεχών (Spradling and Rubin, 1982). Η ένθεσή τους στο γονιδίωμα της Drosophila γίνεται με την μετάθεσή τους από το πλασμίδιοφορέα στο οποίο βρίσκονται, με τη βοήθεια του τροποποιημένου Ρ στοιχείου Δ2-3 {P[ry +, Δ2-3]} (Robertson et al., 1988). To στοιχείο pp[ry +, Δ2-3] είναι ενσωματωμένο στη θέση 99Β του δεξιού βραχίονα του 3 ου χρωματοσώματος στο ισορροπημένο χρωμόσωμα Sb. Για το λόγο αυτό ενέσεις γίνονται σε άτομα (έμβρυα) που φέρουν το Sb χρωμόσωμα με το Δ2-3. Σαν πηγή τρανσποζάσης μπορεί να χρησιμοποιηθούν και πλασμίδια που φέρουν Ρ στοιχείο το οποίο φέρει το γονίδιο της Ρ τρανσποζάσης αλλά τροποποιημένα άκρα (IRs). Έτσι μπορούν να παράγουν τρανσποζάση δεν μπορούν όμως να μετατεθούν. Τα πλασμίδια αυτά (helper plasmids) ενίονται μαζί με τα πλασμίδια που φέρουν τα τροποποιημένo Ρ που φέρουν με τη σειρά τους το γονίδιο που θέλουμε να εισάγουμε στο γονιδίωμα της Drosophila melanogaster και να δημιουργήσουμε διαγονιδιακά άτομα. Το γονίδιο της τρανσποζάσης στα τροποποιημένα Ρ στοιχεία αντικαθίσταται από το γονίδιο που θέλουμε να εισάγουμε για μετασχηματισμό καθώς και από γονίδια ανιχνευτές που βοηθούν στην ανίχνευση των επιτυχώς μετασχηματισμένων ατόμων, αλλά και της μετακίνησης της ένθεσης σε διάφορες θέσεις στο γονιδίωμα. Επίσης αντικαθίστανται με γονίδια αναφοράς με τα οποία μπορεί να μελετηθεί η έκφραση του γονιδίου στο οποίο ενσωματώνονται τα τροποποιημένα Ρ. Σαν γονίδιο ανιχνευτής χρησιμοποιείται κυρίως το mini-white (mini-w + ), ένα τροποποιημένο κανονικό αλληλόμορφο του γονιδίου white και το rosy +. Η ένθεση του τροποποιημένου Ρ στο γονιδίωμα και η μετακίνησή του σε νέες θέσεις, ανιχνεύονται από το χρώμα των ματιών. Το mini-w + ανάλογα με τη θέση ένθεσης στο γονιδίωμα μπορεί να προκαλέσει χρώμα ματιών από

24 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ανοιχτό πορτοκαλί μέχρι σκούρο κεραμιδί λόγω του φαινομένου αποτελέσματος θέσης (position effect). Τα τροποποιημένα Ρ στοιχεία χρησιμοποιούνται σε πειράματα πρόκλησης μεταλλάξεων ένθεσης σε συγκεκριμένα γονίδια ή γενικά στο γονιδίωμα. Στην πρώτη περίπτωση, προκαλούνται μεταλλάξεις σε γονίδια άγνωστης λειτουργίας με την ένθεση των στοιχείων στη ρυθμιστική ή την κωδική περιοχή τους ή με τη δημιουργία ελλειμμάτων λόγω ανώμαλης αποκοπής. Για το σκοπό αυτό κινητοποιούνται τα στοιχεία εκείνα που έχουν ενσωματωθεί κοντά στα γονίδια-στόχους, καθώς τα Ρ στοιχεία έχουν την τάση να μετατίθενται σε γειτονικές θέσεις (Tower et al., 1993). Στη δεύτερη περίπτωση, όταν γίνει μετάθεση της Ρ ένθεσης, ανιχνεύονται μεταλλάξεις συγκεκριμένου τύπου (που να επηρεάζουν π.χ. το νευρικό σύστημα, τη γονιμότητα, τη βιωσιμότητα, ή φαινοτυπικά χαρακτηριστικά όπως τα φτερά ή τα μάτια). Με τον τρόπο αυτό δημιουργήθηκαν χιλιάδες μεταλλάξεις στο γονιδίωμα της Drosophila melanogaster (Bourbon et al., 2002, P Disruption project). Ως γονίδια αναφοράς χρησιμοποιούνται κυρίως το γονίδιο της β- γαλακτοσιδάσης (lacz) και το γονίδιο της GFP. Τα γονίδια αναφοράς βρίσκονται υπό τον έλεγχο ενός ασθενούς υποκινητή και εκφράζονται υπό την επίδραση ενισχυτών. Έτσι η έκφρασή τους αντικατοπτρίζει την έκφραση των γειτονικών στις θέσεις ένθεσης γονιδίων (O Kane and Gehring, 1987). Η ανίχνευση της β-γαλακτοσιδάσης γίνεται με χρώση Χ-gal. Τα τροποποιημένα Ρ στοιχεία εκτός από την πρόκληση μεταλλάξεων έχουν χρησιμοποιηθεί για την παγίδευση ενισχυτών (enhancer trapping) (O Kane and Gehring, 1987), την εκτοπική έκφραση των γονίδιων και τον έλεγχο αλληλεπίδρασης μεταξύ των γονιδίων με το σύστημα GAL4 UAS της ζύμης (Brand and Perrimon, 1993, Rorth, 1996, Phelps and Brand, 1998) αλλά και την πρόκληση μιτωτικών κλώνων με το σύστημα FLP-FRT της ζύμης (Xu and Rubin, 1993). Χρησιμοποιούνται ακόμα για την παγίδευση γονιδίων, την παγίδευση πρωτεϊνών, τη δημιουργία δίκλωνων μορίων RNA για την καταστολή της έκφρασης γονιδίων με το σύστημα RNAi, την παραγωγή

25 ΕΙΣΑΓΩΓΗ mirnas και για χίλιες δυο άλλες δουλειές (Lukacsovich et al., 2001, Morin et al., 2001). A7. Το γονίδιο wiser Η μετάλλαξη wiser tsl (wings scalloped eyes rough) είναι μια υποτελής φυλοσύνδετη θερμοευαίσθητη μετάλλαξη που οφείλεται σε ένθεση ενός φυσικού P στοιχείου στην 5 ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου wiser (CG32711) της Drosophila melanogaster (Mela et al., 2008). Προέκυψε από μια δυσγενική διασταύρωση με το 23.5 hobo MRF στέλεχος. Τα wiser tsl άτομα παρουσιάζουν εγκοπές στα φτερά και ελαφρώς αδρά μάτια (Eικόνα A10). Στους 29 ο C πεθαίνουν κατά το στάδιο της προνύμφης, της νύμφης, ή κατά την εκκόλαψη. Το γονίδιο wiser εκφράζεται κυρίως στο νευρικό και το τραχειακό σύστημα καθώς και στα αιμοκύτταρα. Μεταγράφεται σε δύο mrnas, που διαθέτουν το ίδιο ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης. Το μεγαλύτερο από αυτά οφείλεται σε εναλλακτική συρραφή. Από το γονίδιο wiser προκύπτουν δύο πρωτεϊνικές ισομορφές. Η μετάλλαξη wiser tsl οφείλεται στο διαφορετικό πρότυπο έκφρασης του γονιδίου wiser κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (Mela et al., 2008). Εικόνα A10: Φαινότυπος ατόμων wiser tsl. Δεξιά αδρά μάτια και αριστερά φτερά με εγκοπές

26 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το γονίδιο wiser είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη της Drosophila melanogaster και μεταξύ των άλλων εμπλέκεται στην ανάπτυξη του φτερού. Η φυσική Ρ ένθεση που ευθύνεται για την μετάλλαξη βρίσκεται 490 bp ανοδικά του προβλεπόμενου σημείου έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου CG32711 στην περιοχή 7Ε (7Ε Ρ). 95 bp καθοδικά της 7E P ένθεσης βρίσκεται μια P{lacW} ένθεση που ευθύνεται για την μετάλλαξη PL26 ενώ ~12000 βάσεις ανοδικά του γονιδίου wiser και ~400 βάσεις ανοδικά από το σημείο έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου trf χαρτογραφείται μια δεύτερη P{LacW} ένθεση που ευθύνεται για την μετάλλαξη PL28 (Eικόνα Α11). Και οι δύο είναι θανατογόνες και δεν δείχνουν συμπληρωματικότητα με τη μετάλλαξη wiser tsl στους 29ºC. Επίσης η υπερέκφραση του γονιδίου wiser (UAS-wiser) δεν διασώζει το θανατογόνο φαινότυπο της μετάλλαξης PL28. wiser tsl Εικόνα Α11: Χάρτης της γειτονικής περιοχής του γονιδίου wiser

27 ΕΙΣΑΓΩΓΗ A8. ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθεί περεταίρω η λειτουργία του γονιδίου wiser. Η μετάλλαξη wiser tsl, όπως αναφέραμε παραπάνω επηρεάζει την ανάπτυξη του φτερού. Για το σκοπό αυτό διερευνήσαμε εάν υπάρχει, αλληλεπίδραση του γονιδίου wiser με το γονίδιο Notch καθώς και με τα γονίδια hedgehog, patched, decapentaplegic, thick-veins, brinker, daughters against dpp, optomotor-blind και spalt που συμμετέχουν στον καθορισμό τoυ προσθοπίσθιου άξονα του εμβρυϊκού δίσκου του φτερού. Για την ύπαρξη τυχόν αλληλεπίδρασης μεταξύ των γονιδίων wiser και Notch εξετάσαμε το φαινότυπο των ατόμων που έφεραν τη μετάλλαξη Notch 55e11 και ήταν ομοζυγωτικά για τη μετάλλαξη wiser tsl. Το ίδιο κάναμε και με μια νέα μετάλλαξη Ν που προέκυψε από μετάθεση του P{lacW} στοιχείου του στελέχους PL26. Η μελέτη για τη ύπαρξη αλληλεπίδρασης με τα γονίδια που εκφράζονται στον προσθοπίσθιο άξονα έγινε με δύο τρόπους: α) Με τη μελέτη του προτύπου έκφρασης των διαγονιδίων hh-lacz, ptc-lacz, dpp-lacz, tkv-lacz, dad-lacz, brk-lacz, omb-lacz και salm-lacz σε άτομα που έφεραν το διαγονίδιο UAS-wiser υπό τον έλεγχο του apgal4 και β) με την μελέτη της έκφρασής τους σε άτομα ομοζυγωτικά για τη μετάλλαξη wiser tsl. Επειδή οι μεταλλάξεις wiser tsl και PL28 δε δείχνουν συμπληρωματικότητα στο θανατογόνο φαινότυπο στους 29 ο C, αλλά η εκτοπική έκφραση του γονιδίου wiser δε διασώζει το θανατογόνο φαινότυπο του PL28, εξετάσαμε μέσω της δημιουργίας μιτωτικών κλώνων, τι φαινότυπο θα είχαν τα μεταλλαγμένα άτομα PL28 αν ζούσαν

28

29 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B.1. Βιολογικό υλικό Η Drosophila melanogaster (γνωστή και ως μύγα του ξυδιού), αποτελεί έναν από τους πιο καλά μελετημένους οργανισμούς «μοντέλα» σε γενετικό, γονιδιωματικό και αναπτυξιακό επίπεδο. Βασικοί λόγοι που οδήγησαν στην ευρεία χρήση της ως πειραματόζωο είναι ο σύντομος κύκλος ζωής, η ευκολία στη διατήρηση διαφορετικών στελεχών σε μικρό χώρο, με λίγες απαιτήσεις και μικρό κόστος, ο μεγάλος αριθμός απογόνων και η διαθεσιμότητα πολλών και ποικίλων μεταλλάξεων. Σχετικά πρόσφατα (Adams et al., 2000), δημοσιεύτηκε η αποκωδικοποίηση του πλήρους γονιδιώματός της, γεγονός που δίνει τη δυνατότητα πληρέστερης μελέτης των γονιδίων σε μοριακό και λειτουργικό επίπεδο και κατ επέκταση των αλληλεπιδράσεων που συμβάλλουν στην ομαλή λειτουργία του οργανισμού. Η Drosophila melanogaster είναι ένα δίπτερο, ολομετάβολο έντομο που ανήκει στην Υποοικογένεια Drosophilanae της Οικογένειας Drosophilidae. Η συστηματική της κατάταξη είναι: Ομοταξία : Έντομα Υφομοταξία : Πτερυγωτά Ανθυφομοταξία : Νεόπτερα Υπέρταξη : Ολομετάβολα Τάξη : Δίπτερα Υπόταξη : Βραχύκερα Ανθυπόταξη : Κυκλόρραφα Οικογένεια : Drosophilidae Υποοικογένεια : Drosophilanae Γένος : Drosophila Είδος : D. melanogaster Το γένος Drosophila περιλαμβάνει περίπου 100 είδη. Η διάρκεια του βιολογικού κύκλου των ατόμων επηρεάζεται από τη θερμοκρασία. Στους 25 ο C ολοκληρώνεται σε ημέρες, στους 29 ο C σε 8-10 ημέρες και στους 19 ο C σε περίπου 20 ημέρες. Ο κύκλος ζωής του ατόμου περιλαμβάνει τα εξής στάδια:

30 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Εμβρυϊκό (διαρκεί περίπου ώρες ανάλογα με τη θερμοκρασία): αρχίζει με τη γονιμοποίηση του ωαρίου και τελειώνει με την εκκόλαψη της προνύμφης. Μετεμβρυϊκό : αρχίζει με την εκκόλαψη της προνύμφης και τελειώνει με την εκκόλαψη του ακμαίου ατόμου. Περιλαμβάνει: - στάδιο προνύμφης (larva) που διακρίνεται σε : προνύμφη 1 ου σταδίου (first instar larva), 2 ου σταδίου (second instar larva) και 3 ου σταδίου (third instar larva) - στάδιο νύμφης (pupa) που διακρίνεται σε : νύμφη 1 ου σταδίου (white pupa first instar pupa), 2 ου σταδίου (second instar pupa) και 3 ου σταδίου (third instar pupa). Ακμαίο : αρχίζει με την εκκόλαψη του ακμαίου ενηλίκου ατόμου. Τα στάδια του κύκλου ζωής της Drosophila melanogaster φαίνονται στην Εικόνα B1. (πρώιμη) Εικόνα B1: Κύκλος ζωής του πειραματικού εντόμου Drosophila melanogaster (τροποποιημένη από

31 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Η Drosophila melanogaster έχει 4 ζεύγη χρωμοσωμάτων: το ζεύγος των φυλετικών (ΧΧ στα θηλυκά, ΧΥ στα αρσενικά άτομα) και 3 ζεύγη αυτοσωμικών (2 ο, 3 ο και 4 ο ξεύγος). Το Υ και το 4 ο χρωμόσωμα είναι μικρά και αποτελούνται κυρίως από ετεροχρωματίνη κι έτσι μελετώνται κυρίως τα γονίδια στα χρωμοσώματα Χ, 2 ο και 3 ο. Μια ειδική κατηγορία χρωμοσωμάτων είναι τα πολυταινικά χρωμοσώματα που απαντώνται σε ορισμένους ιστούς (όπως είναι οι σιελογόνοι αδένες των προνυμφών 3 ου σταδίου) και εμφανίζουν χαρακτηριστική ζώνωση. Προκύπτουν από διαδοχικό διπλασιασμό και μη αποχωρισμό των ομολόγων χρωμοσωμάτων. Οι συνεχείς διπλασιασμοί δεν συνοδεύονται από κυτταρική ή πυρηνική διαίρεση, με αποτέλεσμα την αύξηση του γονιδιακού προϊόντος, χωρίς αύξηση του αριθμού των κυττάρων. Τα πολυταινικά χρωμοσώματα αποτελούν σημαντικό εργαλείο για την κυτταρογενετική και χρησιμοποιούνται για τον εντοπισμό και προσδιορισμό των χρωμοσωμικών μεταλλάξεων και την κυτταρολογική χαρτογράφηση των γονιδιακών μεταλλάξεων. Με βάση τη χαρακτηριστική ζώνωση των πολυταινικών χρωμοσωμάτων o Bridges (1935) κατασκεύασε τους κυτταρολογικούς χάρτες της Drosophila melanogaster, οι οποίοι υπήρξαν πολύ χρήσιμοι για την κυτταρολογική χαρτογράφηση των γονιδίων, την ανακάλυψη και προσδιορισμό των ρηγμάτων των χρωμοσωματικών μεταλλάξεων, την χαρτογράφηση των ενθέσεων με in situ υβριδοποίηση κ.λ.π. Όλα αυτά βοήθησαν στη αλληλούχιση του γονιδιώματος και γενικά στην ανάλυση του γονιδιώματος της Drosophila melanogaster. Με βάση τους κυτταρολογικούς χάρτες τα χρωμοσώματα έχουν χωριστεί στις εξής περιοχές: Χ χρωμόσωμα : ο χρωμόσωμα : (2L : και 2R : 41 60) 3 ο χρωμόσωμα : (3L : και 3R : ) 4 ο χρωμόσωμα : Κάθε περιοχή χωρίζεται σε 6 ζώνες (A F) και κάθε ζώνη σε γραμμές που συμβολίζονται με αριθμούς. Ο αριθμός των γραμμών ποικίλει σε κάθε ζώνη

32 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Έτσι μπορεί να προσδιοριστεί με σχετική ακρίβεια η θέση ενός γονιδίου είτε με τη βοήθεια ελλειμμάτων ή με in situ υβριδοποίηση. Ο προσδιορισμός των θέσεων γίνεται με τη βοήθεια των χαρτών του Lefevre (1976). Με βάση την in situ υβριδοποίηση, η Ρ ένθεση που είναι υπεύθυνη για τη μετάλλαξη wiser tsl χαρτογραφήθηκε στην περιοχή 7Ε6-7 όπου χαρτογραφήθηκε μοριακά και το προβλεπόμενο γονίδιο CG32711 (wiser). B.2. Μέθοδος καλλιέργειας Η Drosophila melanogaster καλλιεργήθηκε σε μικρούς πλαστικούς διαφανείς σωλήνες (φιαλίδια) με θρεπτικό υλικό δύο ειδών : Κοινό θρεπτικό μέσο: περιέχει καλαμποκάλευρο, άγαρ, ζάχαρη, νερό, προπιονικό οξύ (μυκητοκτόνο). Όταν μετά το μαγείρεμα το υλικό πήξει ρίχνουμε στην επιφάνεια μια σταγόνα νωπής ζύμης (προσέλκυση για ωοαπόθεση). Πλούσιο θρεπτικό μέσο: περιέχει εκτός από τα παραπάνω υλικά και νεκρή ζύμη (εμπλουτισμένη τροφή). Χρησιμοποιείται στις περιπτώσεις όπου η πειραματική διαδικασία απαιτεί την χρήση καλύτερα αναπτυγμένων προνυμφών για την απομόνωση σιελογόνων αδένων για πολυταινικά παρασκευάσματα ή απομόνωση εμβρυικών δίσκων κ.λ.π. Τα στελέχη και οι διασταυρώσεις διατηρηθήκαν σε επωαστικούς θαλάμους θερμοκρασιών 19+1 ο C, 24+1 ο C και 28+1 ο C ανάλογα με το σκοπό των πειραμάτων. Στις διασταυρώσεις που ακολούθησαν τα θηλυκά άτομα ήταν παρθένα ώστε να αποφευχθούν λανθασμένα αποτελέσματα που μπορεί να προκύψουν λόγω ανεπιθύμητων διασταυρώσεων

33 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ B.3. Στελέχη 1. wiser tsl Το στέλεχος αυτό φέρει σε ομοζυγωτία τη φυλοσύνδετη υποτελή θερμοευαίσθητη θανατογόνο μετάλλαξη wiser. Στους 19 ο C συμπεριφέρεται ως υποτελής ορατή και επηρεάζει τα μάτια (μικρότερα και σκουρότερα από τα κανονικά και με αδρή επιφάνεια) και τα φτερά (φαγωμένα στην περιφέρεια). Στους 29 ο C τα άτομα πεθαίνουν λίγο πριν ή κατά τη διάρκεια εκκόλαψης του ακμαίου ατόμου. Η μετάλλαξη προέκυψε από μια δυσγενική διασταύρωση με το 23.5Δ/CyL 4 στέλεχος. Το στέλεχος αυτό έχει hobo δυσγενική δράση, αλλά φέρει και Ρ στοιχεία τα οποία μετατίθενται στις δυσγενικές διασταυρώσεις. 2. PL26 και PL28 Διαγονιδιακά στελέχη που φέρουν ενθέσεις του στοιχείου P{lacW} στην περιοχή 7Ε. Συγκεκριμένα το στέλεχος PL26 στη θέση 7E6-7 ( ) και το PL28 στη θέση 7E7 ( ) (Μελά Α.,2005). Φέρουν θανατογόνες μεταλλάξεις τις οποίες συμβολίσαμε ως wiser PL26 (PL26) και PL28. Δεν δείχνουν συμπληρωματικότητα με τη μετάλλαξη wiser tsl (ευγενική προσφορά του Dr. Alain Vincent). 3. dpp-lacz (5527) Στέλεχος που φέρει ενσωματωμένο το P{BS3.0} στοιχείο στο γονίδιο decapentaplegic (dpp: 2-4.0, 22F1-22F3). Eκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση στο πρότυπο του γονιδίου dpp. Το γονίδιο decapentaplegic παράγει ένα συνδεόμενο μόριο (ligand), ομόλογο των TGF-β αυξητικών παραγόντων. Συμμετέχει στον προσδιορισμό του προσθοπίσθιου άξονα και στον σχηματισμό ορίων στον εμβρυικό δίσκο του φτερού. Εκφράζεται σε μια λεπτή λωρίδα κατά μήκος του προσθοπίσθιου άξονα του εμβρυικού δίσκου του φτερού. 4. hh-lacz (5530) Στέλεχος που φέρει ενσωματωμένο το P{PZ} στοιχείο στο γονίδιο hedgehog (hh: , 94E1-94E1). Eκφράζει την β-γαλακτοσιδάση στο πρότυπο του γονιδίου hh. Το γονίδιο hedgehog παράγει ένα εκκρινόμενο σηματοδοτικό μόριο, που στο φτερό δρα σε εύρος 8-10 κυττάρων για να επάγει την έκφραση των γονιδίων dpp και ptc. Είναι απαραίτητο και ικανό μόριο για τον

34 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ διαχωρισμό εμπρόσθιων οπίσθιων κυττάρων στο εμβρυικό δίσκο του φτερού. Εκφράζεται στο οπίσθιο τμήμα του εμβρυικού δίσκου του φτερού. 5. ptc-lacz/cyo Στέλεχος που φέρει ενσωματωμένο το P{A92} στοιχείο στο γονίδιο patched (ptc: , 44D5-44E1). Επειδή είναι υποτελές θανατογόνο διατηρείται σε ετεροζυγωτική κατάσταση με το ισορροπημένο χρωματόσωμα CyO. Eκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση στο πρότυπο του γονιδίου ptc. Το γονίδιο patched παράγει μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη που αποτελεί τον υποδοχέα του Hedgehog. Εκφράζεται κατά μήκος του προσθοπίσθιου άξονα του φτερού. 6. Notch 55e11 /FM7c Στέλεχος που φέρει την υπερέχουσα μετάλλαξη απώλειας λειτουργίας του Notch (Ν: 1-3.0, 3C7-3C9) Notch 55e11. Επειδή είναι θανατογόνος, διατηρείται σε ετεροζυγωτική κατάσταση με το ισορροπημένο χρωματόσωμα FM7c. 7. brk-lacz Στέλεχος που φέρει ενσωματωμένο το P{lacZ} στοιχείο στο γονίδιο brinker (brk: , 7B1-7B1). Eκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση στο πρότυπο του γονιδίου brk. Το γονίδιο brinker κωδικοποιεί έναν μεταγραφικό παράγοντα που ρυθμίζει αρνητικά τα γονίδια στόχους του dpp. Στο φτερό δείχνει συμπληρωματικό πρότυπο έκφρασης με αυτό του γονιδίου Daughters against dpp. Εκφράζεται στα εμπρόσθια και οπίσθια άκρα του εμβρυικού δίσκου του φτερού γεγονός που προκύπτει από μεταγραφική καταστολή του Dpp. 8. omb-lacz Στέλεχος που φέρει ενσωματωμένο το P{lacW} στοιχείο στο γονίδιο optomotorblind (omb: 1-7.5, 4C3-4C4). Eκφράζει την β-γαλακτοσιδάση στο πρότυπο του γονιδίου omb. Το γονίδιο optomotor-blind κωδικοποιεί έναν μεταγραφικό παράγοντα. Αποτελεί γονίδιο στόχο του Dpp. Το οmb εκφράζεται σε μια φαρδιά λωρίδα που απλώνεται πέρα από τα κύτταρα που εκφράζουν Dpp, όπως και το Dad, αλλά σε αντίθεση με το Dad, δεν εκφράζεται κατά μήκος ολόκληρου του προσθοπίσθιου ορίου. Εκφράζεται γύρω από την περιοχή έκφρασης του Dpp, πιο ευρέως από το salm. Το Dad καταστέλλει την έκφραση του Omb

35 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 9. dad-lacz /TM3,Sb (10305) Στέλεχος που φέρει ενσωματωμένο το P[lacW] στοιχείο στο γονίδιο daughters against dpp (dad : 89E11-89E11). Επειδή είναι υποτελές θανατογόνο διατηρείται σε ετεροζυγωτική κατάσταση με το ισορροπημένο χρωματόσωμα TM3,Sb. Eκφράζει την β-γαλακτοσιδάση στο πρότυπο του γονιδίου dad. Το γονίδιο daughters against dpp κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που ανήκει στην οικογένεια Smad και αναστέλλει την μεταγωγή του σήματος Dpp. Εκφράζεται σε μια φαρδιά ζώνη που απλώνεται ακατάστατα γύρω από τον προσθοπίσθιο άξονα. 10. salm-lacz/cyo (11340) Στέλεχος που φέρει ενσωματωμένο το P{PZ} στοιχείο στο γονίδιο spalt (salm: 2-44, 32F1-32F2). Επειδή είναι υποτελές θανατογόνο διατηρείται σε ετεροζυγωτική κατάσταση με το ισορροπημένο χρωματόσωμα CyO. Eκφράζει τη β-γαλακτοσιδάση στο πρότυπο του γονιδίου salm. Το γονίδιο spalt αποτελεί γονίδιο στόχο του Dpp. Εκφράζεται γύρω από την περιοχή έκφρασης του Dpp. 11. tkv-lacz /CyO (11191) Στέλεχος που φέρει ενσωματωμένο το P[lacW] στοιχείο στο γονίδιο thick-veins (tkv: 2-16, 25D1-25D2). Επειδή είναι υποτελές θανατογόνο διατηρείται σε ετεροζυγωτική κατάσταση με το ισορροπημένο χρωματόσωμα CyO. Eκφράζει την β-γαλακτοσιδάση στο πρότυπο του γονιδίου tkv. Το γονίδιο thick-veins κωδικοποιεί μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη που αποτελεί υποδοχέα serine/threonine του μορφογόνου μορίου Dpp. Το tkv εκφράζεται σε χαμηλά επίπεδα στο κέντρο του δίσκου και σε υψηλότερα επίπεδα στις άκρες του δίσκου. 12. y w ; P{w[+mW hs]=gawb}ap md544 /CyO Εργαστηριακό στέλεχος το οποίο φέρει στη θέση 41F-42A1 το διαγονίδιο P{w[+mW hs]=gawb}ap md544, που εκφράζει τον παράγοντα GAL4 υπό τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου ap (apterous)

36 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 13. wsn 3 Eργαστηριακό στέλεχος ομοζυγωτικό για τις υποτελείς ορατές φυλοσύνδετες w (white: 1-1.5, 3B6-3B6, άσπρο χρώμα ματιών) και sn 3 (sn 3 : , 7D1-7D2, καψαλισμένες σμήριγγες). 14. UAS-wiser Διαγονιδιακό στέλεχος που φέρει τη κωδική περιοχή του γονιδίου wiser (CG32711) υπό τον έλεγχο του ρυθμιστικού στοιχείου UAS (Μελά Α., 2005 Διδακτορική διατριβή). Συμβολίζεται και ως ΑΜ Canton-S Εργαστηριακό κανονικό στέλεχος χωρίς P ή hobo στοιχεία στο γονιδίωμά του. 16. (Δ2-3) Sb / Ubx Εργαστηριακό στέλεχος που χρησιμοποιείται ως πηγή Ρ τρανσποζάσης. Φέρει το τροποποιημένο Ρ στοιχείο Δ2-3 στη θέση 99Β του Sb ισορροπημένου χρωμοσώματος (Robertson et al., 1988) και είναι σε ετεροζυγωτία με το Ubx ισορροπημένο χρωμόσωμα. Φέρει τις υπερέχουσες θανατογόνες μεταλλάξεις Stubble (Sb: , 89Β4-6, κοντές σμήριγγες) και Ultrabithorax (Ubx: , 89D6-9, διογκωμένοι αλτήρες). Τα στελέχη 3,4,5,6 είναι ευγενική προσφορά του κ. Δελιδάκη από το Πανεπιστήμιο της Κρήτης. Τα στελέχη 7,8 είναι ευγενική προσφορά του κ. Basler από το πανεπιστήμιο της Ελβετίας. Τα στελέχη 9,10,11,12 είναι από το Bloomington stock center. B.4. In situ υβριδοποίηση σε πολυταινικά χρωμοσώματα σιελογόνων αδένων προνυμφών 3 ου σταδίου Η in situ υβριδοποίηση είναι μια τεχνική που επιτρέπει τον εντοπισμό συγκεκριμένων αλληλουχιών σε χρωμοσώματα, κύτταρα και ιστούς. Μια τυπική in situ υβριδοποίηση σε πολυταινικά χρωματοσώματα σιελογόνων προνυμφών 3 ου σταδίου περιλαμβάνει τα εξής στάδια:

37 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ - Σήμανση του ανιχνευτή με κάποιο μόριο αναφοράς (βιοτίνη, δικοξιγενίνη) και υβριδοποίηση στα πολυταινικά χρωμοσώματα. - Ανίχνευση του σήματος υβριδοποίησης μέσω αναγνώρισης του μορίου αναφοράς από κάποια χρωστική ή φθορίζουσα ουσία. B.4.1. Παρασκευή χρωμοσωμικών παρασκευασμάτων Τα πολυταινικά χρωμοσώματα απομονώνονται από τους σιελογόνους αδένες προνυμφών 3 ου σταδίου οι οποίες αναπτύσσονται στους 20 ο C σε πλούσιο θρεπτικό μέσο. Η ανατομία για την αφαίρεση των σιελογόνων αδένων γίνεται σε φυσιολογικό ορό σε ειδική αντικειμενοφόρο με κοίλωμα και μεταφέρονται στο διάλυμα μονιμοποίησης Α για 1 λεπτό περίπου. Στη συνέχεια μεταφέρονται σε μια σταγόνα διαλύματος Β σε καθαρή σιλικοναρισμένη καλυπτρίδα, όπου παραμένουν για 4-5 λεπτά. Μετά η καλυπτρίδα καλύπτεται με καθαρή αντικειμενοφόρο και ασκείται πίεση ώστε να σπάσουν οι πυρηνικές μεμβράνες των κυττάρων και να ανοίξουν τα χρωμοσώματα. Τα παρασκευάσματα τοποθετούνται στους -20 ο C όπου μπορούν να διατηρηθούν μέχρι την απομάκρυνση της καλυπτρίδας. Η απομάκρυνση της καλυπτρίδας γίνεται με εμβάπτιση του παρασκευάσματος σε υγρό άζωτο. Η καλυπτρίδα αφαιρείται προσεκτικά με ένα ξυράφι. Στη συνέχεια το παρασκεύασμα αφυδατώνεται σε αλκοόλη 95% για 30 λεπτά. Αφού στεγνώσουν, τα παρασκευάσματα μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία δωματίου για αρκετό διάστημα. Διαλύματα Διάλυμα μονιμοποίησης Α Διάλυμα μονιμοποίησης Β Φυσιολογικός ορός B.4.2. Σήμανση DNA ανιχνευτή με βιοτίνη με τη μέθοδο των τυχαίων εκκινητών Η μέθοδος στηρίζεται στη δράση του ενζύμου Klenow DNA πολυμεράση, η οποία χρησιμοποιεί ως μήτρα τις αλυσίδες αποδιαταγμένων

38 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ μορίων DNA, ως εκκινητές τα 3 -ΟΗ άκρα τυχαίων εξανουκλεοτίδιων και συνθέτει νέες αλυσίδες ενσωματώνοντας νουκλεοτίδια, μεταξύ των οποίων και σημασμένα. 1. Σε σωληνάκι eppendorf τοποθετείται ποσότητα DNA 50ng - 1μg διαλυμένη σε διάλυμα ΤΕ ph 7.4 μέχρι 5 μl. 2. Το DNA αποδιατάσσεται με βρασμό για 7-10 λεπτά και αμέσως τοποθετείται σε μισολιωμένο πάγο. 3. Προστίθενται με τη σειρά : 5 μl OLB, 0.5 μl BSA (10 mg/ml), 0.5 μl biotin-16-dutp, 9.5 μl dh 2 O και 0.5 μl DNA polymerase Klenow (10 units/μl). 4. Η αντίδραση επωάζεται από 2 μέχρι 16 ώρες στους 25 ο C. 5. Η αντίδραση σταματά με την προσθήκη 2μl 0.2M EDTA ph 8.0 και ο ανιχνευτής φυλάσσεται στους -20 ο C. Διαλύματα ΤΕ ph 7.4 OLB 0.2M EDTA ph 8.0 B.4.3. Προετοιμασία των χρωμοσωμάτων για την in situ υβριδοποίηση 1. Τα χρωμοσωμικά παρασκευάσματα που ετοιμάστηκαν όπως αναφέραμε παραπάνω (Β.4.1) επωάζονται για 30 λεπτά στους 65 ο C σε προθερμασμένο φρέσκο διάλυμα 2 x SSC. 2. Ακολουθεί αφυδάτωσή με επώαση 2 x 5 λεπτά σε 70% αιθανόλη και στη συνέχεια για 5 λεπτά σε 95% αιθανόλη σε RT. 3. Αφήνονται να στεγνώσουν στον αέρα. 4. Επωάζονται για 10 λεπτά σε διάλυμα 2 x SSC σε RT. 5. Η αποδιάταξη των χρωμοσωμάτων γίνεται με επώαση 2 λεπτά ακριβώς σε φρέσκο διάλυμα 0.07Ν NaOH σε RT. 6. Επωάζονται για 5 λεπτά σε διάλυμα 2 x SSC σε RT. 7. Ακολουθεί διαδοχική αφυδάτωσή τους με επώαση 2 x 5 λεπτά σε 70% αιθανόλη και στη συνέχεια 2 x 5 λεπτά σε 95% αιθανόλη