AYTOMATOI ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΟΙ ΑΝΑΛΥΤΕΣ. ΜΑΡΙΑ ΖΕΡΒΑ Αναπληρώτρια Διευθύντρια Αιματολογικού Τμήματος Γ.Ν.Α. «O ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ»

Transcript

1 AYTOMATOI ΑΙΜΑΤΟΛΟΓΙΚΟΙ ΑΝΑΛΥΤΕΣ ΜΑΡΙΑ ΖΕΡΒΑ Αναπληρώτρια Διευθύντρια Αιματολογικού Τμήματος Γ.Ν.Α. «O ΕΥΑΓΓΕΛΙΣΜΟΣ»

2

3 Αυτοματισμός στο αιματολογικό εργαστήριο 1956 Wallace Coulter Κατασκευή πρώτου αιματολογικού αναλυτή Coulter model A με αρχή μεταβολής ηλεκτρικής αντίστασης Οι αιματολογικοί αναλυτές επιβλήθηκαν με την ταχύτητά τους,την ακρίβεια και την εντυπωσιακή σε αριθμούς ανάλυση κυττάρων

4 Λειτουργία αιματολογικών αναλυτών: αρχές κυτταρομετρίας ροής Κυτταρομετρία ροής: μέθοδος αυτοματοποιημένης κυτταρικής ανάλυσης που επιτρέπει τη μέτρηση, ανάλυση και διαλογή μικρών και μεμονωμένων σωματιδίων (κύτταρα, πυρήνες), καθώς διέρχονται από ένα σταθερό σημείο όπου προσπίπτει μία φωτεινή ακτίνα, π.χ.laser

5 Ανάλυση κυττάρων αίματος Αριθμός Όγκος Πυκνότητα Αρχές Μέθοδοι ανάλυσης Μεταβολήηλεκτρικήςαντίστασηςοπής (aperture impedance)-ηλεκτρονική μέτρηση Αρχήσκεδασμούακτίναςφωτός(light-scatter)- οπτική μέτρηση Κυτταροχημεία ροής Κυτταρομετρία φθορισμού (φθοριοχρώματα)

6 Μεταβολή ηλεκτρικής αντίστασης οπής Οπή μέτρησης: μικροσκοπική (<100μm), κυλινδρική Συνδέει δύο δοχεία γεμάτα με ηλεκτρικά αγώγιμο ισότονο διάλυμα το οποίο γεμίζει και την οπή Στα άκρα της οπής εφαρμόζεται συνεχές ρεύμα (DC-direct current) Όταν δεν περνά κάποιο σωματίδιο μέσα από την οπή η αντίσταση είναι σταθερή Δίοδος κυττάρου από την οπή αυξάνεται η αντίσταση και μεταβάλλεται η διαφορά δυναμικού στα άκρα της οπής, ανάλογα με τον όγκο του κυττάρου

7 Η μεταβολή δυναμικού ως προς το χρόνο αντιστοιχεί σε ένα παλμό Αριθμός παλμών αριθμός κυττάρων Ο όγκος του κυττάρου υπολογίζεται με βάση το ύψος του παραγόμενου παλμού, με την προϋπόθεση ότι τα κύτταρα διέρχονται κάθετα και ένα-ένα από την οπή (το ύψος του παλμού εξαρτάται από την τροχιά του κυττάρου) Η υδροδυναμική εστίαση εξασφαλίζει την αξονική τροχιά των κυττάρων μέσα στην οπή

8

9 Αρχή αγωγιμότητας Τεχνολογική εξέλιξη ηλεκτρονικής αρχής Εναλλασσόμενο ρεύμα υψηλής συχνότητας (RF-radio frequency) Πληροφορίες για εσωτερικό κυττάρου Μέγεθος,σχήμα, αριθμός λοβών πυρήνα Κοκκία πρωτοπλάσματος

10

11 Ηλεκτρονική αρχή (DC,RF) μέτρηση κυττάρων(rbc,wbc,plt) μέσοςόγκοςερυθρών(mcv) υποπληθυσμοί λευκοκυττάρων έμμεσα ο αιματοκρίτης (HCT=RBCxMCV)

12 Σκεδασμός ακτίνας φωτός Οπή μέτρησης:ακτίνα laser ή λυχνία αλογόνου Δίοδος κυττάρων από την οπή μέτρησης διακόπτουν και σκεδάζουν (διασκορπίζουν) τη φωτεινή ακτίνα Σήματα σκεδασμού ανιχνευτές ηλεκτρικοί παλμοί Ένταση σημάτων σκεδασμού ανάλογη της γωνίας όπου γίνεται η μέτρηση Κάθε κύτταρο δύο σήματα σκεδασμού Πρόσθιος σκεδασμός (0.5-5,FS-Forward Scatter)-όγκος κυττάρου Πλάγιος σκεδασμός (15-150,SS-Side Scatter)- πυκνότητα πρωτοπλάσματος και κοκκίωση

13 Οπτική αρχή Μέτρηση κυττάρων(rbc,wbc,plt) Mέτρηση MCV,Hct Λευκοκυτταρικός τύπος τριών πληθυσμών (ουδετερόφιλα,λεμφοκύτταρα,μεσαία κύτταρα)

14

15 Γενική αίματος Μετρήσεις ή παράμετροι αιματολογικού αναλυτή (CBC-Complete Blood Count) Κλασικές (αριθμός έμμορφων στοιχείων,ποσοστά λευκοκυτταρικών πληθυσμών,ερυθροκυτταρικοί δείκτες) Στατιστικές(RDW,MPV,PDW) Τελευταίων ετών (ΔΕΚ,IRF,εμπύρηνα ερυθρά) Χαρακτηριστικό ορισμένης μόνο τεχνολογίας (RET-He) Ερευνητικές

16 Ιστογράμματα Kατανομές συχνότητας μιας παραμέτρου (κατ όγκον ανάλυση) Νεφελογράμματα ή κυτταρογράμματα ή στικτογράμματα Απεικονίζονται οι πληθυσμοί των κυττάρων που πέρασαν από την οπή μέτρησης, με τη μορφή νεφελωμάτων

17 Μέτρηση ερυθροκυττάρων RBC,Red blood cells Αρχή μεταβολής αντίστασης Οπτική αρχή σκεδασμού ακτίνας laser Φ.Τ. Άνδρες Γυναίκες x 10¹²/l x 10¹²/l

18 Μέτρηση αιμοσφαιρίνης Μετατροπή αιμοσφαιρίνης σε κυανιομεθαιμοσφαιρίνη, μετά τη λύση των ερυθρών (μέθοδος αναφοράς) Μέτρηση σε φωτόμετρο της οπτικής πυκνότητας του διαλύματος Σύγχρονοι αναλυτές: αντιδραστήριο ελεύθερο κυανίου, ατοξικό και φιλικό προς το περιβάλλον Πολύ καλή επαναληπτικότητα Φ.Τ.άνδρες g/dl,γυναίκες g/dl

19 Ht-ερυθροκυτταρικοί δείκτες Αιματοκρίτης ( Ht ) Ο όγκος που καταλαμβάνουν τα ερυθροκύτταρα σε 100 ml αίματος Προκύπτει έμμεσα Ht=MCVxRBC (μαθηματικό ολοκλήρωμα) Φ.Τ.άνδρες 40-51%,γυναίκες 37-47%

20 Μέσος όγκος ερυθροκυττάρων MCV, Mean Corpuscular Volume Δείκτης εκτίμησης όγκου ερυθροκυττάρων Φ.Τ fl,ορθοκυττάρωση Yπολογίζεται άμεσα διαιρώντας το μέσο όρο του ύψους των ηλεκτρικών παλμών με τον αριθμό των ερυθροκυττάρων MCV< 78 fl,μικροκυττάρωση MCV> 100 fl,μακροκυττάρωση

21 Μέση ποσότητα Hb ανά ερυθροκύτταρο MCH,Mean Corpuscular Hemoglobin Εκφράζει το μέσο ποσό της αιμοσφαιρίνης που περιέχεται ανά ερυθροκύτταρο Hb/RBCx10 Φ.Τ pg Αξιόπιστος δείκτης μέτρου υποχρωμίας ερυθροκυττάρων

22 Μέση συγκέντρωση Hb στα ερυθροκύτταρα του δείγματος MCHC,Mean Corpuscular Concentration Hb / Ht = Hb/RBCxMCV Φ.Τ.32-36% Δείκτης μέτρου υποχρωμίας ερυθροκυττάρων όχι αξιόπιστος λόγω διαφορετικού τρόπου υπολογισμού στους διάφορους αναλυτές MCHC : σφαιροκύτταρα,ψυχροσυγκολλητίνες MCH,MCHC κ.φ. -ορθοχρωμία MCH,MCHC -υποχρωμία

23 Εύρος κατανομής όγκου ερυθροκυττάρων RDW,Red Cell Distribution Width Στατιστική παράμετρος (RDW-CV, RDW-SD) Εκφράζει την ομοιογένεια ή ετερογένεια του όγκου των ερυθροκυττάρων Ασυμφωνία τιμών μεταξύ διαφόρων αναλυτών RDW : διπλός ερυθροκυτταρικός πληθυσμός,στην πράξη ανισοκυττάρωση

24 RDW-CV Φ.Τ. 13±1% RDW-SD Φ.Τ. 42±5 fl RDW-διπλός ερυθροκυτταρικός πληθυσμός Ομόζυγηβ-θαλασσαιμία Ομόζυγη,ετερόζυγη δβ-θαλασσαιμία Σιδηροπενική αναιμία Δρεπανοκυτταρική αναιμία Ετερόζυγη β-θαλασσαιμία : RDW κ.φ Συσχέτιση RDW,MCV χρήσιμη στη διαγνωστική προσέγγιση αναιμίας (Διάκριση ετεροζυγωτών β-μα και σιδηροπενικής αναιμίας)

25

26 Δικτυοερυθροκύτταρα Μέτρηση-ανάλυση ΔΕΚ Χρησιμοποιούνται οι ίδιες αρχές με τα άλλα κύτταρα.διαφέρουν στους αναλυτές Οπτική αρχή και φθορισμός - Sysmex ΔΕΚ % και # Φ.Τ. 0,2-2% Με τον απόλυτο αριθμό των ΔΕΚ με τους αναλυτές δεν χρειάζεται διόρθωση του ποσοστού τους με βάση τον Ht ή τηνhb

27 Δικτυοερυθροκυτταρικοί δείκτες MCVr, MCHCr, RDWr, IRF, CHr ή RET-He Άωρα ΔΕΚ περισσότερο RNA εντονότερος σκεδασμός με χρήση φθοριοχρωμάτων ΔΕΚ: άωρα (HFR), ενδιάμεσα (MFR), ώριμα(lfr) Κλάσμα άωρων ΔΕΚ,IRF (Immature Reticulocyte Fraction) IRF=HFR+MFR,Sysmex Ευαίσθητος δείκτης έναρξης ερυθροποίησης πολύ πριν την αύξηση των ΔΕΚ στο περιφερικό αίμα

28 Προγνωστική σημασία IRF >0.2 HFR+MFR >20 % Πρώτη ένδειξη εγκατάστασης μυελικού μοσχεύματος Ανταπόκριση στη θεραπεία με: Σίδηρο,βιταμίνη Β12 Ερυθροποιητίνη (νεφρική ανεπάρκεια) Κυκλοσπορίνη (απλαστική αναιμία)

29

30 Δείκτης αιμοσφαιρινοποίησης ΔΕΚ RET-He Reticulocyte haemoglobin content-sysmex Παράμετρος ισοδύναμη με CHr(mean of the reticulocyte cellular content histogram),technicon- Bayer Πρώιμος δείκτης σιδηροπενικής ερυθροποίησης Ret-He<28pg Ευκολία προσδιορισμού στη γενική αίματος Δεν επηρεάζεται από ανεξάρτητους παράγοντες (π.χ.φλεγμονή)

31 Ο δείκτης RET-He χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με το δείκτη stfr/log ferritin Διάκριση κλασσικής από λειτουργική ανεπάρκεια σιδήρου (αναιμία χρόνιας νόσου) Παρακολούθηση θεραπείας με σίδηρο ή ερυθροποιητίνη Πρώιμη, σε τρία 24ωρα,αντίληψη αποτελέσματος αγωγής

32 Σχιστοκύτταρα FRC - Fragmented Red Cells Νεφελόγραμμα ΔΕΚ - περιοχή μεταξύ RBC και PLT,Sysmex-ερευνητική παράμετρος % και # ΘΘΠ,ΔΕΠ,βαλβιδικές προθέσεις

33

34 Eμπύρηνα ερυθρά NRBC-Nucleated Red Blood Cells Οπτική αρχή και φθορισμός % και # Αυτόματη διόρθωση αριθμού λευκοκυττάρων

35

36 Μέτρηση λευκοκυττάρων Αρχή μεταβολής αντίστασης οπής Οπτική αρχή Φ.Τ /μl

37 Λευκοκυτταρικός τύπος Αρχήαντίστασηςοπής Σκεδασμός φωτεινής ακτίνας Αρχή αγωγιμότητας Ανοσοκυτταροχημικές μέθοδοι (χρώση υπεροξειδάσης) Κυτταρομετρία φθορισμού Λευκοκυτταρικός τύπος 5 πληθυσμών σύγχρονοι υβριδικοί αναλυτές,1990 ουδετερόφιλα, λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, ηωσινόφιλα, βασεόφιλα % και #

38 Στα παθολογικά δείγματα κανένας αναλυτής δεν δίνει πλήρη λευκοκυτταρικό τύπο. Χρησιμοποιούν επισημάνσεις (flags) οι οποίες κατευθύνουν τον εργαστηριακό γιατρό στη διάγνωση (left shift, blasts, atyp) Ο χαρακτηρισμός του λευχαιμικού κυττάρου πρέπει να γίνεται πάντα με τη μορφολογική επιβεβαίωση από το επίχρισμα

39

40 Άωρα κοκκιοκύτταρα IG-Immature Granulocytes Άθροισμα άωρων κυττάρων κοκκιώδους σειράς: προμυελοκύτταρα,μυελοκύτταρα, μεταμυελοκύτταρα # και % (ΙΜΙ, Ιmmature Myeloid) Information-Sysmex)

41 CD4,CD8 λεμφοκύτταρα Στο θάλαμο μέτρησης και μελέτης του λευκοκυτταρικού τύπου σε αναλυτές ορισμένης τεχνολογίας-coulter Σκεδασμός ακτίνας laser και μονοκλωνικά αντισώματα

42 Αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα HPC-Haemopoietic Progenitor Cells (ΙΜΙ channel,sysmex) # και % HPC - CD34 Γρήγορος και οικονομικός προσδιορισμός Κλινική σημασία ανεύρεσητουκατάλληλουχρόνουσυγκομιδήςτωνhpc από το περιφερικό αίμα μετά από κινητοποίηση με χημειοθεραπεία ή αυξητικούς παράγοντες και χορήγησή τους για αυτόλογη μεταμόσχευση μυελού

43

44

45 Αιμοπετάλια Αρχές μέτρησης Ηλεκτρονική-Μεταβολή ηλεκτρικής αντίστασης Οπτική-Σκεδασμός ακτίνας laser Οπτική μέτρηση με φθορισμό (Sysmex,φθοριόχρωμα πολυμεθίνη ) ιδιαίτερα αξιόπιστη σε θαλασσαιμικά σύνδρομα, ύπαρξη μεγάλων ΑΜΠ Ανοσολογική μέτρηση (αντι-cd61 αντισώματα) Φ.Τ /μl

46 Παράμετροι ΑΜΠ Μέσος όγκος ΑΜΠ, MPV (Mean Platelet Volume) Φ.Τ fl Ασυμφωνία μεταξύ αναλυτών Παραμονή δείγματος MPV (αλλοίωση σχήματος ΑΜΠ) MPV- Ιδιοπαθής θρομβοπενική πορφύρα MPV-Θρομβοπενία λόγω μυελικής απλασίας

47 Άωρα ΑΜΠ Δικτυοαιμοπετάλια: νεαρά ΑΜΠ μεγάλα με άφθονο RNA Κλάσμα άωρων ΑΜΠ,IPF (Immature Platelet Fraction Sysmex ) Κυτταρομετρία φθορισμού Φ.Τ % IPF ( %) Αυτοάνοση θρομβοπενική πορφύρα

48

49 Ανάλυση μυελού σε αιματολογικούς αναλυτές Bone marrow fluid, μυελικό εναιώρημα, EDTA ή ηπαρίνη κυτταροβρίθεια μυελού λόγος λευκής προς ερυθρά σειρά λευκοκυτταρικός τύπος

50 Σφάλματα στη μέτρηση ερυθροκυττάρων Ψευδώς ΜεγάλαΑΜΠ Λευκοκυττάρωση >50.000/μl Κρυοσφαιρίνες Φυσσαλίδες, σωματίδια, μικρόβια στο διάλυμα Ο αριθμός των ερυθροκυττάρων δεν επηρεάζεται σημαντικά Ψευδώς Μικροπήγματα,αιμόλυση Μικροκυττάρωση, σχιστοκυττάρωση Ψυχροσυγκολλητίνες (ασυμφωνία Hb- Ht,διόρθωση μετά επώαση 15 λεπτών στους 37 C)

51 Σφάλματα στον προσδιορισμό του MCV Ψευδής MCV Ψυχροσυγκολλητίνες Λευκοκυττάρωση Σακχαρώδηςδιαβήτης,αιμοληψία κοντά σε παροχή με γλυκόζη (ωσμωτική διόγκωση ερυθροκυττάρων) Υπερχρωμία (σφαιροκύτταρα μικρή παραμορφωσιμότητα πλασματικά μεγαλύτερα-ύψος παλμών εξαρτάται από το σχήμα που παίρνει το ερυθρό στην οπή )

52 Τασφάλματαστιςμετρήσειςτων ερυθροκυττάρων και του MCV επηρεάζουν και τον Ht Για τον προσδιορισμό της αναιμίας θα πρέπει να ενθαρρύνεται η χρήση της Hb παρά του Ht

53 Σφάλματα στη μέτρηση της αιμοσφαιρίνης Μέθοδος μέτρησης χρωματομετρική-επηρεάζεται από θολερότητα δείγματος Λευκοκυττάρωση Υπερτριγλυκεριδαιμία (>1000 mg/dl) Υπερχολερυθριναιμία Παραπρωτεϊναιμία (IGM>3g/l) Σύγχρονοι αναλυτές-ο προσδιορισμός της Hb δεν επηρεάζεται από την θολερότητα του δείγματος

54 Σφάλματα στη μέτρηση των ΔΕΚ Ψευδής ΔΕΚ Ερυθρά με έγκλειστα (σωμάτια Howell-Jolly, Heinz, βασεόφιλος στίξη, αιμοσφαιρίνη Η) Λεμφοκυττάρωση Θρομβοκυττάρωση με μεγάλα ΑΜΠ Εμπύρηνα ερυθροκύτταρα Παράσιτα ελονοσίας

55 Σφάλματα στη μέτρηση των λευκοκυττάρων Ψευδώς Μεγάλα ΑΜΠ Εμπύρηνα ερυθροκύτταρα Ερυθρά ανθεκτικά στα λυτικά αντιδραστήρια (ηπατικά ή νεφρικά νοσήματα, θαλασσαιμικά ή δρεπανοκυτταρικά σύνδρομα ) Υπερλιπιδαιμία, κρυοσφαιρίνες, παραπρωτειναιμία, μικροοργανισμοί Ψευδώς Μικροπήγματα (ανεπαρκής ανακίνηση) Χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (λύση εύθραυστων λεμφοκυττάρων-οι πυρήνες τους μετριούνται σαν εμπύρηνα ερυθροκύτταρα) Παλιόδείγμα,περίσσεια EDTA

56 Σφάλματα στη μέτρηση των ΑΜΠ Ψευδής ΑΜΠ Μικροποικιλοκυττάρωση (θαλασσαιμικά σύνδρομα) Μικροσφαιροκύτταρα (βαριά εγκαύματα) ή σχιστοκύτταρα Θραύσματα λευκών (μετά από χημειοθεραπεία σε λευχαιμίες και λεμφώματα) Κρυοσφαιρίνες (μικροκρύσταλλοι) Βακτήρια, μύκητες, λιπίδια,φυσσαλίδες

57 Ψευδής ΑΜΠ Πήγμα (αιμοληψία,ανακίνηση,αντιπηκτικό) EDTA ψευδοθρομβοπενία αντιαιμοπεταλιακές συγκολλητίνες έναντι γλυκοπρωτεϊνης ΑΜΠ,απτινική δράση EDTA συγκόλληση ΑΜΠ (0.1% γενικού πληθυσμού) Διόρθωση με κιτρικό Na,ηπαρίνη ΓιγάντιαΑΜΠ (διάμετρος μεγαλύτερη από την οπή μέτρησης ΑΜΠ)

58

59 Χαμηλός αριθμός λευκοκυττάρων και ιδιαίτερα ΑΜΠ απαιτεί επαλήθευση, εκτίμηση και μορφολογική επιβεβαίωση από επίχρισμα περιφερικού αίματος

60 Ποιοτικός έλεγχος αιματολογικών αναλυτών Αυτοματισμός στο αιματολογικό εργαστήριο ταχύτατη παραγωγή αποτελεσμάτων κίνδυνος διαφυγής αναξιόπιστων μετρήσεων απαραίτητος ο ποιοτικός έλεγχος Εσωτερικός ποιοτικός έλεγχος Απαραίτητος ο καθημερινός έλεγχος των αναλυτών με τα παρασκευάσματα ελέγχου (controls) Ανταλλαγή δειγμάτων μεταξύ δύο παρόμοιας τεχνολογίας αιματολογικών αναλυτών του εργαστηρίου Εξωτερικός ποιοτικός έλεγχος (κρατικά προγράμματα- NEQAS, National External Quality Assessment Scheme), διεθνή προγράμματα-sysmex-iqas, International Quality Assurance System,IQAS on line)

61 Συμπέρασμα Οι αυτόματοι αιματολογικοί αναλυτές προσφέρουν γρήγορα και αξιόπιστα αποτελέσματα Ο γιατρός που εγκρίνει το αποτέλεσμα μιας γενικής αίματοςπρέπειναγνωρίζεικαλάτατεχνικά χαρακτηριστικά του αναλυτή που χρησιμοποιεί, για να μπορεί να αξιολογεί τα ευρήματα και να αναγνωρίζει και να διορθώνει τις ψευδείς μετρήσεις H παραδοσιακή αιματολογία δεν μπορεί να καταργηθεί και οι αυτόματοι αναλυτές δεν μπορούν να λειτουργήσουν ανεξάρτητα από το οπτικό μικροσκόπιο

62