ROH R OSi(CH ) Bu ROH CH2N2 R OCH3 N2

Transcript

1

2

3

4 ROH R OSi(CH ) Bu 3 2 Επειδή όμως τα σιλυλο-παράγωγα δε δίνουν πάντα καλές πληροφορίες, σχετικά με τη δομή των ενώσεων, από τα λαμβανόμενα φάσματα μάζας, για την παραγωγοποίηση. αλκοολών αλλά και αμινών γίνεται μετατροπή σε ακετυλο-, τριφθοροακετυλο- και μεθυλο-παράγωγα ROH (CF3CO) 2O R OCOCF3 CF3CO2H ROH (CH3CO) 2O R OCOCH3 CH3CO2H ROH CH2N2 R OCH3 N2 t

5

6 Οι κύριοι παράγοντες για την επιλογή ενός συγκεκριμένου παραγώγου για ανάλυση σε GC/MS είναι οι εξής: Η επίτευξη επαρκούς διαχωρισμού. Η ομάδα παραγώγου να προσδίδει μια σχετικά μικρή αύξηση του μοριακού βάρους (ΜΒ). Το παράγωγο που σχηματίζεται να δίνει ιόντα με μεγάλη ένταση στις υψηλές μονάδες μάζας. Μερικές φορές όμως χρησιμοποιείται μεγαλύτερη ομάδα για σχηματισμό παραγώγου ώστε η ένωση να διαχωριστεί πιο καλά από παρεμβαλλόμενες κορυφές (interference).

7

8

9 Σχήμα 6.4 Χρωματογραφήματα συνολικών ιόντων Α φυσικής ρητίνης πεύκου, Β και C ρητινών που έχουν εναποτεθεί

10

11

12

13

14

15

16

17 6.8 Εξέταση υδάτων με GC/MS για τη δυνατότητα χρησιμοποίησης τους σαν πόσιμα. Χρησιμοποιήθηκαν δύο τεχνικές δειγματοληψίας. Η SPME τεχνική χωρίς διαλύτη, κατά την οποία μια ίνα με πολυμερή επικάλυψη βυθίζεται στο δείγμα. Λόγω της μεγάλης συγγένειας των VOC (Volatile Organic Compounds, πτητικές οργανικές ενώσεις) με την επικάλυψη, προσροφώνται και συγκεντρώνονται στην ίνα, που με την είσοδό της στη θερμαινόμενη έκχυση δείγματος μιας GC, αποδίδει στη στήλη όλες τις πτητικές οργανικές ενώσεις. Η δεύτερη τεχνική που χρησιμοποιήθηκε είναι η HS (HeadSpace) ανάλυση. Σύμφωνα με την τεχνική αυτή 10ml του υδατικού δείγματος τοποθετούνται σε ειδικό φιαλίδιο καθώς και εσωτερικό πρότυπο τολουόλιο-d8 (1μg/ml). Τα κλειστά αυτά δείγματα τοποθετούνται σε ειδική συσκευή περιστρεφόμενη και θερμαίνονται για 40 min στους 85οC σε λάδι σιλικόνης οπότε στο επάνω μέρος του φιαλιδίου διαχωρίζεται το οργανικό τμήμα που εισάγεται σε GC/MS.

18

19

20

21 Ο συνδυασμός με υγρή χρωματογραφία (LC/MS) εφαρμόζεται σε περιπτώσεις, που η ανάλυση ενώσεων δεν είναι εφικτή με GC α) ενώσεων που είτε δεν είναι πτητικές β) διασπώνται σε αυξημένη θερμοκρασία. Στην κατηγορία αυτή ουσιαστικά εντάσσεται η πλειοψηφία των βιολογικά δραστικών ενώσεων, για αυτό το λόγο και η επίτευξη του δύσκολου αυτού συνδυασμού προκάλεσε πραγματική επανάσταση στις βιολογικές επιστήμες. Η τεχνική θεωρείται πια απαραίτητο εργαλείο σε μεγάλη σειρά αναλυτικών εργασιών και απαντάται σε πολλά εργαστήρια, φαρμακευτική ανάλυση, βιοανάλυση, έλεγχο τροφίμων, βιοτεχνολογία, πολυμερή κ.λπ.

22 Σήμερα με τη βοήθεια της LC/MS γίνεται ουσιαστικά διαχωρισμός μιας μεγάλης κλίμακας οργανικών ενώσεων: μικρά μόρια προϊόντα μεταβολισμού ναρκωτικών ουσιών πεπτίδια και πρωτεΐνες μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο για ποιοτικούς όσο και για ποσοτικούς προσδιορισμούς. Στην ουσία η μέθοδος έχει εκτοπίσει όλες τις παραδοσιακές μεθόδους ανίχνευσης, όπως φθορισμομετρία, συντελεστή διάθλασης, φασματομετρία UV-Vis, γιατί μπορεί να δώσει πληροφορίες για το μοριακό βάρος, τη δομή, την ποσότητα και την καθαρότητα των υπό εξέταση δειγμάτων.

23

24

25

26

27 Χρησιμοποιούνται κυρίως οι παρακάτω μέθοδοι ιονισμού, όπου στην ουσία δημιουργούνται τα ιόντα του δείγματος και διαχωρίζονται από την κινούμενη φάση. Μέθοδος με ψεκασμό εν θερμώ (ThermoSpray Ionization method, TSI) Μέθοδος με ψεκασμό σε δυναμικό (ElectroSpray Ionization method, ESI) Μέθοδος κινούμενης ταινίας (Moving Belt method) Χημικός ιονισμός σε ατμοσφαιρική πίεση (Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI) Φωτοϊονισμός σε ατμοσφαιρική πίεση (Atmospheric Pressure Photoionization, APPI) Διάταξη με δέσμη σωματιδίων

28 Όσον αφορά στους αναλυτές μάζας, αυτοί που μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην LC/MS είναι τεσσάρων τύπων: 1. Τετραπολικό (Quadropole) 2. Χρόνου πτήσεως (TOF/MS) 3. Παγίδευσης ιόντων (IT/MS) 4. Μετασχηματισμού Fourier-ιονικού κυκλοτρονιακού συντονισμού (FT-ICR)

29 Εφαρμογές φασματοσκοπίας μαζών Η LC/MS βρίσκει εφαρμογές από τη φαρμακευτική εξέλιξη μέχρι την ανάλυση περιβάλλοντος. Η ικανότητα της μεθόδου για την ανίχνευση μεγάλου αριθμού ενώσεων με μεγάλη ευαισθησία και εξειδίκευση, έχει σαν αποτέλεσμα την εφαρμογή της σε μεγάλο αριθμό επιστημονικών πεδίων. α. Εύρεση του μοριακού βάρους (Μ.Β.) Μια βασική εφαρμογή της LC/MS είναι η εύρεση του μοριακού βάρους. Η πληροφορία αυτή είναι ουσιαστική για την ταυτοποίηση μιας ένωσης. Στο παρακάτω σχήμα, δίνονται τα φάσματα δύο πεπτιδίων, των οποίων ο λόγος m/z διαφέρει κατά μία μονάδα.

30

31 . Εύρεση δομής (με τη βοήθεια MSn ανάλυσης) Μια δεύτερη εφαρμογή της LC/MS είναι η εύρεση της μοριακής δομής. Η ρίζα Ginseng, από ένα παραδοσιακό κινέζικο φυτό, περιέχει περισσότερες από 12 βιολογικά ενεργές σαπωνίνες, που περιέχουν πολλαπλές αλυσίδες ολιγοσακχαριτών σε διάφορες θέσεις του μορίου, με αποτέλεσμα η εύρεση της δομής των ενώσεων αυτών να είναι αρκετά πολύπλοκη.

32 Both American ginseng (Panax quinquefolius) and Asian ginseng (Panax ginseng) roots are taken orally as aphrodisiacs, nourishing stimulants and in the treatment of type II diabetes, as well as Sexual dysfunction in men. The root is most often available in dried form, either whole or sliced. Ginseng leaf, although not as highly prized, is sometimes also used; as with the root it is most often available in dried form. This ingredient may also be found in some popular energy drinks: usually the "tea" varieties or functional foods. It can also be found in cosmetic preparations.

33 Saponins are a class of chemical compounds, one of many secondary metabolites found in natural sources, with saponins found in particular abundance in various plant species. Solanine has fungicidal (μυκητοκτόνες) and pesticidal (μικροβιοκτόνες) properties, and it is one of the plant's natural defenses.

34 Στο σχήμα 6.17 δίνεται ολόκληρο το φάσμα μαζών, που λαμβάνεται από το πρώτο τετράπολο, της σαπωνίνης της ginseng Rb1 σαν ιόν προσθήκης με νάτριο, στα m/z=1131,7da..

35 στο δεύτερο τετράπολο, θραυσματοποιείται το συγκεκριμένο ιόν και δίνει το φάσμα του σχήματος 6.18 με θυγατρικό ιόν στα 789,7Da

36 Στο τρίτο τετράπολο λαμβάνεται το φάσμα θραυσματοποίησης του 789,7Da, σχήμα 6.19, οπότε και ταυτοποιείται η δομή της ένωσης

37 Ανίχνευση ναρκωτικών ουσιών και των μεταβολιτών τους, στα ούρα αλόγων κούρσας με τη βοήθεια LC/MS-MS. Στόχος 1. Είναι η ανάπτυξη μιας ταχείας μεθόδου αναγνώρισης του τρικυκλικού αγχολυτικού ημιπραμίνη και του κύριου μεταβολίτη της ντεσιπραμίνη στα ούρα αλόγων. 2. Η ανάπτυξη των πλεονεκτημάτων της τεχνικής MS-MS για την αναγνώριση της ημιπραμίνης και των μεταβολιτών της. 3. Η ανίχνευση και η διευκρίνιση της δομής των δευτερευόντων μεταβολιτών, με τη χρήση της LC/MS-MS ανάλυσης.

38 N N N Cl N N NH Σχήμα 6.23 Δομές των ενώσεων ιμιπραμίνης, κλομιπραμίνης και ντεσιπραμίνης

39

40

41 Προσδιορισμός της αμιτρόλης Το φυτοφάρμακο αμιτρόλη (amitrol) παρουσιάζει ιδιαίτερες δυσκολίες στη μελέτη του, αφενός μεν λόγω του μικρού του μοριακού βάρους (Μ.Β. 84, που δε δίνει ιδιαίτερο χαρακτηριστικό μοριακό ιόν) και αφετέρου λόγω της μεγάλης του διαλυτότητας στο νερό (δεν εκχυλίζεται εύκολα από το υδατικό υπόστρωμα). Τα προβλήματα αυτά μπορούν να ξεπεραστούν κάνοντας παραγωγοποίηση με n-εξυλοχλωροφορμικό εστέρα. Το παράγωγο δίνει (Μ+Η)+ στα 213 m/z και είναι υδρόφοβο λόγω της n-εξυλομάδας. Σαν εσωτερικό πρότυπο (IS) προστίθεται πριν από την παραγωγοποίηση το 3-αμινο-5-μεθυλοθειο-1Η-1,2,4- τριαζόλιο λόγω της παραπλήσιας δομής του.

42

43

44

45 Ηανίχνευση σεμικαρβαζιδίου (SEM) σε μεγάλο αριθμό τροφίμων, δημιουργεί το ερώτημα, αν αυτό σχηματίζεται στο τρόφιμο, είναι πρόσθετο ή προέρχεται από τη συσκευασία. Το SEM ανήκει στα χημικά της ομάδας της υδραζίνης, μερικά από τα οποία μπορεί να είναι καρκινογόνα. Οι πρώτες δοκιμές για την ανίχνευση παρουσίας SEM στα τρόφιμα, έγιναν επειδή το SEM χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της χρήσης αντιβιοτικών της νιτροφουραζόνης. Τα αντιβιοτικά αυτά είναι απαγορευμένα στην Ευρωπαϊκή Ένωση, χρησιμοποιούνται όμως σε μεγάλο ποσοστό στην νότια Αμερική. Επιπλέον το SEM βρέθηκε σε τρόφιμα, προερχόμενο κατά πάσα πιθανότητα από αζωδικαρβοναμίδιο που χρησιμοποιήθηκε σε πλαστικά συσκευασίας. Αζωδικαρβοναμίδιο: H2N-CO-N=N-CO-NH2 Σεμικαρβαζίδιο: H2N-NH-CO-NH2

46

47 Το SEM εκχυλίζεται από τα δείγματα τροφίμων (κρέας, ψάρι, παιδικές τροφές) χρησιμοποιώντας 0,2Μ υδροχλωρικό οξύ, σχήμα 6.29 Μια γνωστή ποσότητα τριπλά επισημασμένου SEM (13C15N2) προστίθεται σε κάθε δείγμα, σαν εσωτερικό πρότυπο. Το εκχυλισμένο SEM παραγωγοποιείται με 2-νιτροβενζαλδεϋδη και το εκχύλισμα εξουδετερώνεται. Το εκχύλισμα στη συνέχεια εισάγεται σε φυσίγγιο εκχύλισης στερεής φάσης (solid phase extraction, SPE), και το σχηματιζόμενο παράγωγο (σεμικαρβαζόνη της 2-νιτροβενζαλδεΰδης) εκχυλίζεται από το φυσίγγιο με οξικό αιθυλεστέρα. Το εκχύλισμα συμπυκνώνεται και η ποσότητα του SEM υπολογίζεται με τη χρήση υγρής χρωματογραφίας υψηλής πίεσης (HPLC) σε συνδυασμό με διαδοχική φασματοσκοπία μαζών (TANTEM MS). Χρησιμοποιώντας τις όξινες συνθήκες εκχύλισης, η μέθοδος ανιχνεύει όλη την ποσότητα του SEM (ελεύθερη και δεσμευμένη) στο δείγμα.

48