Ανατομία φύλλου, μεταβολικό προφίλ και αντιμικροβιακή δράση του Pistacia lentiscus (μαστιχόδεντρο)

Transcript

1 Ανατομία φύλλου, μεταβολικό προφίλ και αντιμικροβιακή δράση του Pistacia lentiscus (μαστιχόδεντρο) Μαμούχα Σ. (1), Τσαφαντάκης Ν. (2), Ιωαννίδης Τ. (3), Χατζηπαναγιώτου Σ. (3), Νικολάου Χ. (3), Σκαλτσούνης Λ. (2), Φωκιαλάκης Ν. (2) και Χριστοδουλάκης Ν. (1) 1:Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Βοτανικής Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών 2:Τμήμα Φαρμακευτικής, Τομέας Φαρμακογνωσίας και Φυσικών Προϊόντων Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών 3.Τμήμα Κλινικής Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή Αθηνών, Αιγινήτειο Νοσοκομείο, Αθήνα

2 Μηχανισμοί προσαρμογής της μεσογειακής βλάστησης στην αβιοτική καταπόνηση Αειφυλλία- Σκληροφυλλία Ρυθμίσεις της βιολογικής δραστηριότητας Ανατομικές & φαινοτυπικές αλλαγές Ρυθμίσεις μεταβολικών μονοπατιών προσαρμογή που εξυπηρετεί την εξοικονόμηση ύδατος, αντοχή σε ψηλές θερμοκρασίες, αντοχή στην καταπόνηση του Χειμώνα κλείσιμο των στομάτων (αναστολή διαπνοής) ανάπτυξη ριζικού συστήματος, πολλά και μικρά στόματα προστασία στομάτων με τρίχες απόπτωση φύλλων κ.ά. μεταβολικό μονοπάτι => βιοσυνθεση μεταβολιτών με προστατευτικό ρόλο

3 Συσχέτιση πρωτογενούς & δευτερογενούς μεταβολισμού => Οι ΔΜ δεν εμπλέκονται άμεσα σε ζωτικές διαδικασίες που σχετίζονται με την ανάπτυξη και τη διαχείριση ενέργειας των φυτικών κυττάρων Taiz 2011

4 Pistacia lentiscus & P. lentiscus var chia Μοναδική ιδιότητα των φυτών του είδους που καλλιεργούνται στη νήσο Χίο είναι να παράγουν την ρητίνη με το χαρακτηριστικό άρωμα. «Pistacia»: «πίσσα» (=πυκνόρευστος, κολλώδης χυμός) & «ακέομαι» (=θεραπεύω, επανορθώνω) «lentiscus»: προέρχεται από το λατινικό lentus (=κολλώδης) και το ρήμα lentesco (=κολλώ) Ευδοκιμεί σε πετρώδεις πλαγιές & πευκοδάση Αναπτύσσεται αργά, ολοκληρώνει ανάπτυξη μετά από χρόνια (5 μέτρα). Δίοικο φυτό με τον αρσενικό σχίνο να δίνει καλύτερη ποιότητα µαστίχας από τον θηλυκό =>µόνο αυτός καλλιεργείται στα Μαστιχοχώρια της Χίου Σαββίδης, 2000

5 Ενέργεια Διερευνήθηκαν τα εξής: Παρατήρηση Ανατομική μελέτη: Οπτική & Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Επιλέχθηκαν 12 φυτά τα οποία μελετήθηκαν ως προς τις εκκριτικές τους δομές. Λήψη φυτικών εκχυλισμάτων με τρεις διαφορετικούς διαλύτες Προσδιορισμός του φυτοχημικού προφίλ Έλεγχος βιοσύνθεσης βιοενεργών μορίων 3 ATCC strains Kλινικά στελέχη βακτηρίων και μυκήτων Aνθεκτικά κλινικά στελέχη Έξι από αυτά μελετήθηκαν περαιτέρω: προσδιορίστηκε το μεταβολικό τους προφίλ => λήψη εκχυλισμάτων (Accelerated Solvent Extraction) Έλεγχος παρουσίας βιοενεργών μορίων-μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν: Agar Diffusion Method Well Diffusion Method

6 Αποτελέσματα Ανατομικής μελέτης (1) Eπιδερμίδα μονόστρωμη, + εφυμενίδα. Υποστοματικό. Στο μεγάλο χυμοτόπιο των επ. κυττάρων => συμπυκνωμένες φαινόλες & λιποσταγονίδια. Kυτταρόπλασμα => περιορισμένο Πασσαλώδες & σπογγώδες παρέγχυμα => συμπυκνωμένες φαινόλες & λιποσταγονίδια. Ρητινοφόροι αγωγοί=>στο κατώτερο τμήμα μεσοφύλλου (=>προστασία από αβιοτική καταπόνηση), μίσχο, βλαστό, ρίζα

7 Αποτελέσματα Ανατομικής μελέτης (2) Εξωτερικά Ρ.Α.=>σκληρεγχυματικές ίνες (=>προστασία) Εμφανίζονται και στα νεαρά φύλλα και στα λέπια των οφθαλμών (=>εντομοαπωθητικός ρόλος) Ρ.Α. στο φλοίωμα της ρίζας

8 Διαδικασία έκκρισης της ρητίνης Σχηματισμός επί μέρους συστατικών στα επιθηλιακά κύτταρα Καταστροφή επιθηλιακών κυττάρων Απελευθέρωση συστατικών στο εσωτερικό του αγωγού

9 Αποτελέσματα Ιστοχημικής μελέτης (υποκυτταρικός εντοπισμός ΔΜ-ιστοχημικοί ανιχνευτές) Secondary Histochemical metabolite treatment Result Lipids OsO 4 + Terpenes Con. H 2 SO 4 + Flavonoids Vanillin / HCl + Steroids Antimony trichloride + Wagner s reagent + Alkaloids Iodine-Potassium iodide + Dittmar s reagent + Tannins Phenols (P.C) Potassium dichromate + Nitroso reaction + Ferric chloride + Vanillin test + 4-nitrosophenol + P.C. precursor Dimethoxybenzaldehyde (DMB) +

10 Λήψη Φυτικών Εκχυλισμάτων Accelerated Solvent Extractor system

11 Αποτελέσματα Φυτοχημείας (1) LC-MS

12 Αποτελέσματα Φυτοχημείας (2) LC-MS

13 RT (min) Αποτελέσματα Φυτοχημείας (3) GC-MS M + m/z Molecular formula MS fragments Assignment C 5 H 9 NO - 1-Methyl-2-pyrrolidinone C 10 H 18 O 71, 93, 136 Terpinen-4-ol C 12 H , 111, 85, 57 Dodecane C 10 H 18 O 121, 136, 93, 59 P-Menth-en-8-ol C 14 H , 85, 71,57 tetradecane C 15 H ,105 α-muurolene C 15 H , 134 δ-cadinene C 16 H 32 O 2 57, 60, 73, 129, 227, 171, Hexadecanoic acid C 19 H 34 O 2 263, 150, 135, 110, 95, 81 Methyl linoleate C 29 H 50 O 2 164, 165, 166, 205 α-tocopherol C 29 H 50 O 213, 255, 303, 329, 381 β-sitosterol C 30 H 48 O 69, 149, 205, 189, 313, 281 Lupenone C 30 H 50 O 189, 207, 147, 281, 393, Οlean-18-en-3-ol C 30 H 50 O 207, 135, 411, 189 Tirucalloil

14 we can affirm that it is possible to use the essential oil composition obtained from the different plant parts, leaves, and twigs to characterize the three species examined, particularly if these differences will be confirmed by further data obtained in different collection times and geographic and climatic factors.

15 Μικροοργανισμοί που χρησιμοποιήθηκαν Πρότυπα στελέχη βακτηρίων Θετικά κατά Gram Αρνητικά κατά Gram Staphylococcus aureus Escherichia coli ATCC25922 (1) ATCC29213 (1) Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 (1) Κλινικά στελέχηβακτηρίων Θετικά κατά Gram Αρνητικά κατά Gram S. aureus (7) P. aeruginosa (3) Str. pneumoniae (1) Candida albicans Klebsiella pneumoniae (3) Ανθεκτικά κλινικά στελέχη βακτηρίων Αρνητικά κατά Gram P. aeruginosa (1) MRSA K. pneumoniae (4) Acinetobacter sp Κλινικά στελέχη μυκήτων

16 Απομόνωση μικροοργανισμών Θρεπτικά υποστρώματα Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Candida albicans Mueller Hinton Άγαρ Mc Conkey Σοκολατόχρωμο Άγαρ (CO 2 ) Αιματούχο Άγαρ Sabouraud Αγαρ + Str. pneumonia +

17 Μέθοδος Διάχυσης αντιβιοτικής ουσίας σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα- Αgar Diffusion Method Παρασκευή θρεπτικού υποστρώματος Mueller Hinton Εναιώρημα κλινικού στελέχους (0,5 Mc Farland)

18 Αποτελέσματα Βιοδοκιμών στα πρότυπα Διαλύτης εκχύλισης στελέχη βακτηρίων (mm) 100 mg/ml Pistacia lentiscus (Καισαριανή) S. aureus ATCC29213 E. coli ATCC25922 Met 9,41 0 8,00 DCM 9, H 2 O 9,29 0 9,20 P. aeruginosa ATCC mg/ml Pistacia lentiscus var chia Διαλύτης εκχύλισης S. aureus ATCC29213 E. coli ATCC25922 Met 11,08 0 8,46 DCM 10, H 2 O 10,12 0 7,44 P. aeruginosa ATCC27853

19 Αποτελέσματα βιοδοκιμών σε κλινικά στελέχη 100 mg/ml βακτηρίων (mm) Δ/της εκχ. S. a. a 5224 S. a. a 6079 S. a. a 6062 S. a. a 5205 S. a. a 2846 S. a. a 2933 S. a. a 5548 P.a b (VIM) P.a b K.P. c MeOH 9,14 7,74 8,62 7,73 8,70 7,06 7,77 8,49 8,60 7,2 DCM 8,63 9,41 9,4 8,49 8,62 8,18 9,12 8,02 6,50 - H 2 O 7,5 7,00 8,2 8,0 8,65 9,33 7,20 7,80 8,80 7,01 a : S. aureus, b: P. aeruginosa, c: K. pneumoniae, θετικός μάρτυρας: AMC30: 22,01mm Αρνητικός μάρτυρας: DMSO

20

21 Πειράματα σε εξέλιξη. Σύγκριση μεταβολικού προφίλ των δυο φυτών Μαστίχα Χίου (προσδιορισμός μεταβολικού προφίλ και βιοδραστικότητας) Κλασμάτωση εκχυλισμάτων=>έλεγχος βιοδραστικότητας Απομόνωση καθαρών μορίων =>έλεγχος βιοδραστικότητας Ενίσχυση έκφρασης συγκεκριμένων συνθετασών=> αύξηση βιοσύνθεσης επιθυμητών μεταβολιτών Μελέτη αιθερίων ελαίων φυτοχημικό προφίλβιοδοκιμές

22 Συμπεράσματα Τα άτομα του Pistacia lentiscus παράγουν ρητίνη και άλλα βιοενεργά μόρια είτε προέρχονται από τη Χίο είτε από την Καισαριανή? Νέα αντιμικροβιακή ένωση?? Συνέργεια? =>Ενίσχυση δραστικότητας αντιβιοτικών εμπορίου

23 Ευχαριστώ.