ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ Λευκής Π. Ψώνη Πτυχιούχος Γεωπόνος - Τεχνολόγος Τροφίµων «ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΜΙΚΡΟΧΛΩΡΙ ΑΣ ΤΟΥ ΤΥΡΙΟΥ «ΜΠΑΤΖΟΣ» ΑΠΟ ΝΩΠΟ ΓΙ ΙΝΟ ΓΑΛΑ ΚΑΙ ΕΠΙΛΟΓΗ «ΑΓΡΙΩΝ» ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΟΞΥΓΑΛΑΚΤΙΚΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΩΝ ΑΠΟ ΠΑΡΑ ΟΣΙΑΚΟ ΤΥΡΙ ΩΣ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ΓΙΑ ΤΗ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗ ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΟΥ» Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Επιβλέπoυσα Καθηγήτρια: Λιτοπούλου-Τζανετάκη Ευανθία Καθηγήτρια του τοµέα Ε.Τ.Τ. του Α.Π.Θ. ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2006

2 Λευκής Π. Ψώνη Πτυχιούχος Γεωπόνος - Τεχνολόγος Τροφίµων «Μελέτη της µικροχλωρίδας του τυριού «Μπάτζος» από νωπό γίδινο γάλα και επιλογή «άγριων» στελεχών οξυγαλακτικών βακτηρίων από παραδοσιακό τυρί ως καλλιέργεια για τη βιοµηχανική παρασκευή του» ιδακτορική ιατριβή Υποβλήθηκε στο Τµήµα Γεωπονίας Τοµέας Επιστήµης και Τεχνολογίας Τροφίµων Ηµεροµηνία Προφορικής Εξέτασης: 18 Οκτωβρίου 2006 Εξεταστική Επιτροπή Καθηγήτρια Ε. Λιτοπούλου-Τζανετάκη, Επιβλέπουσα Καθηγητής Ν. Τζανετάκης, Μέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής Αν. Καθ. Μ. Γιάγκου, Μέλος Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής Επ. Καθ. Ι. Βλάχος, Εξεταστής Καθηγητής Κ. Μπιλιαδέρης, Εξεταστής Καθηγητής Γ. Νυχάς, Εξεταστής Αν. Καθ. Ε. Τσακαλίδου, Εξετάστρια ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2006

3 στις ψυχές των παιδιών που χάθηκαν τόσο άδικα στον πόλεµο του Λιβάνου

4 Λευκή Π. Ψώνη Α.Π.Θ. «Μελέτη της µικροχλωρίδας του τυριού «Μπάτζος» από νωπό γίδινο γάλα και επιλογή «άγριων» στελεχών οξυγαλακτικών βακτηρίων από παραδοσιακό τυρί ως καλλιέργεια για τη βιοµηχανική παρασκευή του» ISBN «Η έγκριση της παρούσης ιδακτορικής ιατριβής από το Τµήµα Γεωπονίας του Αριστοτέλειου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωµών του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2)

5 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Θα ήθελα να ευχαριστήσω ολόψυχα τους καθηγητές µου Κ. Νικόλαο Τζανετάκη και την Κα Εύα Λιτοπούλου-Τζανετάκη για την επιστηµονική και ανθρώπινη υποστήριξη τους κατά τη διάρκεια της διδακτορικής µου εργασίας. Είναι οι άνθρωποι που µου δίδαξαν τι σηµαίνει έρευνα και µε έκαναν να αγαπήσω την µικροβιολογία τροφίµων. Σας ευχαριστώ για την καθοδήγηση και την καθηµερινή σας ενασχόληση, για το χρόνο που µου διαθέσατε, για τις επιστηµονικές γνώσεις που µου δώσατε, για τις ευκαιρίες που µου προσφέρατε αλλά προπάντων για την αγάπη και τη ζεστασιά που µου δείξατε κατά τη διάρκεια όλων αυτών των χρόνων..σταθήκατε πολλές φορές, εκτός από καθηγητές, σαν «γονείς» και σαν φίλοι δίπλα µου! Σας ευχαριστώ για όλα! Θα ήθελα ιδιαίτερα να ευχαριστήσω τον Κ. Μηνά Γιάγκου, αναπληρωτή καθηγητή του τµήµατος Βιολογίας, Α.Π.Θ. για το χρόνο, το ενδιαφέρον και την προθυµία που έδειξε όποτε τη χρειάστηκα. Με τις γνώσεις του και την διάθεση για βοήθεια συνέβαλε καθοριστικά στην διεκπεραίωση της εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Κ. Κωνσταντίνο Μπιλιαδέρη, καθηγητή του τοµέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ. και τον Κ. Βλάχο Ιωάννη, επίκουρο καθηγητή του τοµέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ., οι οποίοι µου πρόσεφεραν γνώσεις και βοήθεια και κατά τη διάρκεια της διδακτορικής µου διατριβής αλλά και κατά τη διάρκεια των φοιτητικών µου χρόνων. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω και τα υπόλοιπα µέλη της επταµελούς επιτροπής, τον Κ. Γεώργιο Νυχά, καθηγητή του τµήµατος Επιστήµης Τροφίµων του Γ.Π.Α. και την Κα Έφη Τσακαλίδου, αναπληρώτρια καθηγήτρια του τµήµατος Επιστήµης Τροφίµων του Γ.Π.Α., για την τιµή που µου έκαναν να είναι µέλη της επταµελούς επιτροπής. Χίλια ευχαριστώ στην Μάγδα Χατζηκαµάρη, µέλος ΕΕ ΙΠ του τοµέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ, για την απλόχερη επιστηµονική βοήθεια της όποτε την χρειάστηκα και για τις εφευρετικές της λύσεις πάνω στα διάφορα προβλήµατα που προέκυπταν κατά τη διεξαγωγή των πειραµάτων. Επίσης, ευχαριστώ την Ευγενία Χαριτωνίδου, µέλος ΕΕ ΙΠ του τοµέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ, για την προθυµία της, την αµέριστη βοήθεια της για ότι και αν συνέβαινε και για την ευγένια της. Ευχαριστώ και τις δύο, επίσης, για την αγάπη που µου δείξανε. Ευχαριστώ τον Στράτο Νικολάου, υποψήφιο διδάκτορα του τοµέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ, για τις συµβουλές του και τις γνώσεις του αλλά και για την ζωντάνια και την αισιοδοξία του. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω όλους τους ανθρώπους που εργάζονται στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Υγιεινής i

6 Τροφίµων, Α.Π.Θ., Γιούλα Κολέτσου, Μαρία Σαµολαδά, Χρυσάνθη Χάϊδα, Παύλο Αµπατζίδη και Κώστα Βαµβακά, για την βοήθεια και την φιλία τους. Ευχαριστώ πολύ τον Κοτζαµανίδη Χαράλαµπο, υποψήφιο διδάκτορα του τµήµατος Βιολογίας, για τις γνώσεις του και την διάθεση του για βοήθεια και για τις επιστηµονικές µας συζητήσεις. Τον ευχαριστώ επίσης καθώς και ευχαριστώ τον Κ. Γεώργιο Σκαράκη, πρώην ιευθυντή Σχεδιασµού -Μελετών και Ελέγχου στην Ελληνική Βιοµηχανία Ζάχαρης Α.Ε. για τη δυνατότητα που µου δώσανε να διδαχθώ την µέθοδο της Ηλεκτροφόρησης πηκτής παλλόµενου πεδίου (PFGE) στο ερευνητικό κέντρο της Ελληνικής Βιοµηχανίας Ζάχαρης, στην Σίνδο. Ευχαριστώ πολύ τους Christian Andrighetto και Κα Angiolella Lombardi για την ζεστή υποδοχή τους στο εργαστήριο Istituto per la Qualita e le Tecnologie Agroalimentari, στο Thiene της Ιταλίας και την καθοριστική βοήθεια τους στην διεκπεραίωση των πειραµάτων της µεθόδου RAPD-PCR και τις πολύτιµες συµβούλες τους. Ευχαριστώ την Αλεξάνδρα Μιχαηλίδου, λέκτορα του τοµέα Ε.Τ.Τ., Α.Π.Θ, για την βοήθεια της να κατανοήσω το στατιστικό πρόγραµµα SPSS. Θα ήθελα, επίσης, µέσα από την καρδιά µου να ευχαριστήσω τον Ανέστη ελέπογλου για την ψυχολογική στήριξη καθ όλη τη διάρκεια της διδακτορικής µου εργασίας. Τον ευχαριστώ για την υποµονή και την κατανόηση που έδειξε όλο αυτόν τον καιρό, που ανέχτηκε τη γκρίνια και τα νεύρα µου όταν δεν πήγαιναν καλά τα πειράµατα, που µοιραζόταν τις συγκινήσεις και τη χαρά µου και που ήταν πάντα δίπλα µου σε ότι και αν συνέβαινε. Τον ευχαριστώ για τις συζητήσεις µας και τις ωραίες ιδέες που πάντα είχε. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω όλους µου τους φίλους για την συµπαράσταση και την κατανόηση τους αλλά προπάντων για τη φιλία τους! Ευχαριστώ τον αδελφό µου Βασίλη για την βοήθεια του σε θέµατα υπολογιστών και τις πετυχηµένες λύσεις που πάντα είχε! Τον ευχαριστώ όµως και για τις στιγµές χαλάρωσης στο σπίτι και την καλή παρέα που µου έκανε. Τέλος, θέλω να ευχαριστήσω τους δύο ανθρώπους που µου χάρισαν, πρώτα απ όλα, τη ζωή και κάνουν ότι περνάει από το χέρι τους για να την οµορφύνουν. Μαµά, Μπαµπά, ευχαριστώ για την απέραντη αγάπη που µου προσφέρετε και την κατανόηση που έχετε δείξει τα τελευταία 32 περίπου χρόνια! Σας ευχαριστώ για τις ευκαιρίες που µου έχετε δώσει για µόρφωση από τα µαθητικά µου χρόνια µέχρι τώρα, για την συµπαράσταση σας και για τις πολύτιµες συµβουλές σας για να µπορέσω να γίνω ii

7 ένας καλύτερος άνθρωπος. Αλλά, κυρίως, σας ευχαριστώ για την οµορφιά που νοιώθω µέσα στην ψυχή µου όταν σας αντικρύζω! iii

8 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Μελετήθηκε η µικροβιακή µικροχλωρίδα και κάποια χηµικά χαρακτηριστικά (ph, % υγρασία, % λίπος και % αλάτι) του παραδοσιακού τυριού Μπάτζος, από νωπό κατσικίσιο γάλα, κατά τη διάρκεια της παρασκευής, συντήρησης και ωρίµασης του τυριού καθ όλη τη γαλακτική περίοδο. Πραγµατοποιήθηκαν 9 τυροκοµήσεις, 3 σε καθεµιά εποχή, χειµώνας, άνοιξη και καλοκαίρι. Τα γαλακτικά βακτήρια ήταν η επικρατέστερη µικροχλωρίδα κατά τη διάρκεια της ωρίµασης σε όλη τη γαλακτική περίοδο. Παρατηρήθηκαν υψηλοί πληθυσµοί εντεροβακτηριοειδών και κολοβακτηριοειδών στα πρώτα στάδια της παρασκευής και ωρίµασης του τυριού µε την τάση να µειώνονται σηµαντικά (Ρ<0.05) κατά την ωρίµαση και συντήρηση και στις τρεις εποχές. Ο υψηλός συντελεστής άλατος, είναι πιθανόν, να είναι ο κύριος παράγοντας που έλεγχε την εξέλιξη των µικροβιακών οµάδων. Η εποχή δεν επηρέασε σηµαντικά τον αριθµό και την εξέλιξη των βακτηριακών οµάδων ενώ επηρέασε σηµαντικά τη σύνθεση της γαλακτικής µικροχλωρίδας. Αποµονώθηκαν γαλακτικά βακτήρια από τα διάφορα στάδια παρασκευής, ωρίµασης και συντήρησης του τυριού καθ όλη τη γαλακτική περίοδο και ταυτοποιήθηκαν µε φαινοτυπικές µεθόδους. Έτσι, το χειµώνα επικρατούσαν οι εντερόκοκκοι και οι λακτόκοκκοι ενώ την άνοιξη και το καλοκαίρι, οι λακτοβάκιλλοι εµφανίζονταν συχνότερα. Από τους εντερόκοκκους, το πιο συχνά εµφανιζόµενο είδος ήταν ο Ent. durans ενώ από τους λακτοβάκιλλους, οι Lb. plantarum και Lb. paraplantarum. Ανάµεσα στους λακτοκόκκους, ο Lc. lactis subsp lactis ήταν το επικρατέστερο υποείδος στο τυρί. Η συχνή παρουσία του υποδηλώνει τη πιθανή χρήση του ως καλλιέργεια εκκίνησης για την παρασκευή του τυριού Μπάτζος. Για την απόκτηση της κατάλληλης καλλιέργειας για την παρασκευή του τυριού Μπάτζος, µελετήθηκε η ετερογένεια στα φαινοτυπικά και γενοτυπικά χαρακτηριστικά 40 στελεχών Lc. lactis, αποµονωµένα από τρεις τυροκοµήσεις, µία καθεµιά εποχή, χειµώνα, άνοιξη και καλοκαίρι. Η γενοτυπική τους διαφοροποίηση προσεγγίστηκε µε τη βοήθεια τριών µοριακών µεθόδων, την αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης βασισµένη στον πολυµορφισµό τυχαία πολλαπλασιαζόµενου DNA (Randomly Amplified Polymorpic DNA-PCR, RAPD-PCR), την ανάλυση του πλασµιδιακού περιεχοµένου και την Ηλεκτροφόρηση πηκτής παλλόµενου πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE). Τα αποτελέσµατα έδειξαν µεγάλο ποσοστό ετερογένειας ανάµεσα στα στελέχη. Σύµφωνα µε τη PFGE, όλα τα στελέχη πλην ενός, οµαδοποιούνται µε ποσοστό οµολογίας κατά ~50% µε το στέλεχος αναφοράς iv

9 Lc. lactis subsp lactis και διαµορφώθηκαν έντεκα οµάδες από 2 µε 8 αποµονώσεις η καθεµία. Η ανάλυση του πλασµιδιακού προφίλ οµαδοποίησε 23 αποµονώσεις σε 6 οµάδες. Οκτώ αποµονώσεις δεν παρουσίασαν πλασµιδιακό προφίλ ενώ εννιά στελέχη παρουσίασαν µοναδικό πλασµιδιακό προφίλ. Παρατηρήθηκε µια ενδιαφέρουσα συσχέτιση των οµαδοποιήσεων της ανάλυσης του πλασµιδιακού προφίλ και της PFGE. Επίσης, για την πλειονότητα των αποµονώσεων, οι οµαδοποιήσεις που έγιναν σύµφωνα µε την RAPD-PCR συµφωνούσαν µε τα αποτελέσµατα της ανάλυσης του πλασµιδιακού προφίλ και της PFGE. Επιπλέον, αξίζει να σηµειωθεί ότι παρατηρήθηκε µια συσχέτιση των οµαδοποιήσεων των µοριακών µεθόδων και την εποχής από όπου αποµονώθηκαν τα στελέχη. Όλα τα στελέχη παρουσίασαν αντιβακτηριακή δράση έναντι της E. coli O157:H7. Σε παράλληλη ανάπτυξη στελέχους λακτοκόκκου και E. coli O157:H7 σε γάλα, παρατηρήθηκε µείωση του πληθυσµού της E. coli O157:H7 κατά 1 και 2 δεκαδικούς λογάριθµους έπειτα από 8 και 24 ώρες, αντίστοιχα. Το ph του γάλακτος ήταν 5,2 και 4,38 στις 8 και 24 ώρες, αντίστοιχα. Η αντιβακτηριακή ικανότητα των στελεχών έναντι των Y. enterocolitica, S. aureus, B. cereus, L. monocytogenes και Ent. faecalis ποίκιλε ανάλογα µε το στέλεχος. Το 42,5% των στελεχών, κυρίως αποµονώσεις από φρέσκο τυρί, έδειξαν υψηλή ικανότητα οξίνισης σε γάλα µετά από 24 ώρες. Το 75% των αποµονώσεων από τυρί που παρασκευάστηκε το χειµώνα, παρουσίασε µεγαλύτερη αµινοπεπτιδασική δραστηριότητα έναντι της λυσίνης σε σύγκριση µε τη λευκίνη ενώ το 67% των αποµονώσεων του καλοκαιριού έδειξε το ακριβώς αντίθετο. Η καζεϊνολυτική δραστηριότητα των στελεχών ήταν αρκετά αξιόλογη µετά από ανάπτυξη σε γάλα για 24 ώρες και τα στελέχη αποικοδοµούσαν κατά προτίµηση την αs-καζεΐνη. Το 90% των στελεχών µπορούσαν να παράγουν µεθανοθειόλη από την µεθειονίνη και η ένταση της ιδιότητας αυτής ποίκιλε ανάλογα µε το στέλεχος. Τα αποτελέσµατα δείχνουν ότι συγκεκριµένα στελέχη χαρακτηρίζονται από αξιόλογες ιδιότητες για να χρησιµοποιηθούν ως καλλιέργεια για την παρασκευή του τυριού Μπάτζος. Λόγω του υψηλού ποσοστού εµφάνισης των εντεροκόκκων στο τυρί, µελετήθηκαν τα φαινοτυπικά και γενοτυπικά χαρακτηριστικά 34 στελεχών εντεροκόκκων, αποµονωµένων από το παραδοσιακό τυρί Μπάτζος από νωπό κατσικίσιο γάλα, για την διερεύνηση της συνεισφοράς τους στη διαµόρφωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών του τυριού και την πιθανή χρήση τους ως συµπληρωµατική καλλιέργεια. Τα στελέχη είχαν ταυτοποιηθεί µε βάση φαινοτυπικές v

10 µεθόδους, ως Ent. durans. Η γενοτυπική τους ετερογένεια διερευνήθηκε µε τη βοήθεια 3 µοριακών µεθόδων, RAPD-PCR, ανάλυση του πλασµιδιακού περιεχοµένου και PFGE. Για τα 29 στελέχη παρατηρήθηκε οµολογία µεταξύ της φαινοτυπικής και γενοτυπικής ταυτοποίησης τους µε την RAPD-PCR. Ένα στέλεχος ταυτοποιήθηκε ως Lc. lactis subsp lactis ενώ 4 στελέχη ταυτοποιήθηκαν ως Ent. faecium, µε την RAPD-PCR. Όλα τα στελέχη περιείχαν πλασµιδιακές ζώνες. Τα αποτελέσµατα της PGFE επιβεβαίωσαν την τυποποίηση που αποκτήθηκε µε το πλασµιδιακό προφίλ για την πλειονότητα των στελεχών και οι οµάδες που σχηµατίστηκαν ταίριαζαν µε αρκετές οµάδες της RAPD-PCR. Όλα τα στελέχη παρουσίασαν αντιβακτηριακή δράση έναντι των B. cereus, S. aureus, E. coli και L. monocytogenes και η πλειονότητα των στελεχών έναντι του Ent. faecalis. εν παρατηρήθηκε υψηλή ικανότητα παραγωγής οξέος σε γάλα. ιαπιστώθηκε, επίσης, χαµηλή πρωτεολυτική δραστηριότητα µετά από ανάπτυξη σε γάλα για 24 ώρες. Ωστόσο, παρουσίασαν αξιόλογη καζεϊνολυτική δραστηριότητα µετά από ανάπτυξη σε γάλα για 7 ηµέρες µε ιδιαίτερη προτίµηση στην αs-καζεΐνη. Όλα τα στελέχη ήταν ευαίσθητα στην βανκοµυκίνη ενώ το 29,4% των στελεχών παρουσίασε αιµολυτική ικανότητα σε αίµα ανθρώπου και το 88,9% έδειξε ικανότητα αποκαρβοξυλίωσης της τυροσίνης. Κατά την τελευταία φάση της πειραµατικής διαδικασίας, µελετήθηκε η επίδραση της καλλιέργειας και της θερµικής επεξεργασίας στα µικροβιολογικά και οργανοληπτικά χαρακτηριστικά του τυριού Μπάτζος µε σκοπό την τυποποίηση του τυριού από άποψη καλλιέργειας. Παρασκευάστηκαν 4 διαφορετικοί τύποι τυριών, τυρί από νωπό κατσικίσιο γάλα µε (RS) ή χωρίς καλλιέργεια (R) και τυρί από παστεριωµένο (PS) ή στανταρισµένο ως προς το λίπος, παστεριωµένο (PSS) κατσικίσιο γάλα µε καλλιέργεια. Τρία στελέχη Lc lactis subsp lactis, αποµονωµένα από το παραδοσιακό νωπό τυρί Μπάτζος χρησιµοποιήθηκαν ως καλλιέργεια. Η προσθήκη καλλιέργειας στο νωπό γάλα δεν επηρέασε σηµαντικά τον πληθυσµό των µικροβιακών οµάδων. Παρατηρήθηκε σηµαντικά (Ρ<0.05) µεγαλύτερη ανάπτυξη της καλλιέργειας στο τυρί PSS σε σύγκριση µε τους άλλους τύπους τυριών. Η θερµική επεξεργασία είχε ως αποτέλεσµα τη µείωση των επιπέδων των περισσότερων µικροβιακών οµάδων. Ωστόσο, τα επίπεδα της ολικής µεσόφιλης χλωρίδας και των γαλακτικών βακτηρίων ήταν σηµαντικά (Ρ<0.05) µεγαλύτερα στο τυρί PSS ενώ η τιµή του ph σηµαντικά (Ρ<0.05) µικρότερη σε σύγκριση µε τους άλλους τύπους τυριών. Στον συγκεκριµένο τύπο τυριού παρατηρήθηκε, επίσης, µεγαλύτερος ρυθµός µείωσης του πληθυσµού της ανεπιθύµητης µικροχλωρίδας. Τα αποτέλεσµα της vi

11 διερεύνησης της καζεϊνολυτικής δραστηριότητας έδειξαν µεγαλύτερη αποικοδόµηση της αs-καζεΐνης στο τυρί R σε σχέση µε το τυρί RS και στο τυρί PS σε σχέση µε το τυρί PSS, ενώ παρατηρήθηκε χαµηλή ικανότητα αποικοδόµησης της β-καζεΐνης κατά τη διάρκεια της ωρίµασης και συντήρησης όλων των τυριών. Η ποσότητα των παραγόµενων ελεύθερων αµινοξέων αυξάνονταν κατά τη διάρκεια της ωρίµασης και συντήρησης των τυριών καθώς και ο βαθµός λιπόλυσης. vii

12 SUMMARY The changes of microbial flora and some chemical characteristics (ph, % moisture and % salt-in-moisture) in Batzos, raw goat s milk cheese, were studied during ripening, throughout the whole lactation season in nine cheese batches manufactured three in each, winter, spring and summer. High counts of Enterobacteriaceae and coliforms were recorded early in ripening, but their levels decreased significantly (P<0.05) on ripening and storage. Lactic acid bacteria predominated over the other microbial groups throughout ripening, during the whole lactation season. It seems possible, that high NaCl content of the cheese was the main agent that regulated the microbial survival. No significant differences were observed in the counts related to the season when the cheeses were ripened and stored. However, the season affected the composition of the lactic microflora. Thus, in winter enterococci were abundant, while in spring and summer lactobacilli isolates were found more frequently. The main Enterococcus species was Ent. durans while among Lactobacillus, were Lb. plantarum and Lb. paraplantarum. Lactococcus lactis subsp lactis was the most frequently isolated species in the cheese and its use as starter seems promising. During the second experimental phase, the genotypic and phenotypic variability of 40 Lactococcus lactis isolates obtained from three cheese-making trials of Batzos cheese made one in each, winter, spring and summer was investigated, in order to find the appropriate culture for the production of Batzos cheese. The genotypic and phenotypic heterogeneity of the lactococcal isolates was investigated. RAPD-PCR, plasmid profiling and PFGE were used to study the genetic variability and distinguish closely related isolates. Results showed a high degree of heterogeneity among strains. According to PFGE data, all strains except one were clustered together (at a similarity level of ~50%) with the L. lactis subsp. lactis reference strain and eleven groups of isolates consisting of 2-8 strains each were distinguished. Plasmid profiling results revealed that there were eight isolates lacking plasmids and nine having unique plasmids. Twenty-three isolates were allocated into six groups. There was an interesting similarity between the plasmid profiling groups and those formed according to PFGE. Clustering of strains according to RAPD-PCR was in agreement with results obtained by both plasmid profiling and PFGE for the majority of the strains. In addition, results obtained by molecular methods indicate a grouping of most of the strains according to the season of cheese production. All strains inhibited viii

13 the growth of E.coli O157:H7. Their ability to affect the growth of Y.enterocolitica, S.aureus, B.cereus, L.monocytogenes and E.faecalis was strain dependent. In 42.5% of the isolates high acidifying ability in milk after 24h was recorded and these were isolates, mainly, from fresh cheese. The 75% of the isolates from winter cheese exhibited higher Lys- than Leu- aminopeptidase activity while the ~67% of the isolates from summer cheese showed higher Leu- than Lys- aminopeptidase activity. Their caseinolytic activity after growth in milk for 24h was significant with preference for αs-casein degradation. The majority (90%) of the strains formed methanethiol from methionine and this ability was strain dependent. These results suggest that among the wild lactococcal population from Batzos cheese there are interesting strains appropriate to be used as starters for the dairy industry. Due to the high levels of enterococci in Batzos cheese, during the third phase of our investigation, the genotypic and phenotypic diversity in 34 isolates of enterococci obtained during ripening of Batzos cheese from raw goat milk and characterized phenotypically as Enterococcus durans, was studied, in order to investigate their contribution to the organoleptic characteristics of Batzos cheese and study their genotypic and phenotypic heterogeneity. RAPD-PCR, plasmid profiling and PFGE were used to study the genetic variability and distinguish closely related isolates. Species recognition by means of RAPD-PCR was in agreement with the phenotypic identification for 29 strains. One strain was characterized as Lactococcus lactis subsp lactis by RAPD-PCR and four strains were grouped with the Enterococcus faecium reference strain. All strains were vancomycin sensitive, while 10 strains showed β-haemolytic reaction on human blood and the majority of them (88.9%) showed decarboxylase activity on tyrosine. All strains exhibited antagonistic activity against Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Listeria monocytogenes and the majority inhibited Enterococcus faecalis. Isolates displayed weak acidifying ability and low proteolytic activities when grown in milk for 24 h. However, their caseinolytic activity after growth in milk for seven days was significant with preference for αs-casein degradation. The influence of the addition of starter culture and the heat treatment on the microbiological and organoleptic characteristics of Batzos cheese was finally studied. Experimental cheeses were made from raw (R), raw with starter (RS), pasteurized with starter (PS) and standardized, pasteurized with starter (PSS) goat milk to study the influence of the starter and pasteurization on the quality of Batzos cheese. ix

14 Lactococcus lactis subsp lactis strains from raw milk cheese used as starter proliferated significantly (P<0.05) only in PSS cheese. Heat treatment lowered (P<0.05) the levels of most microbial groups. However, TC and LAB counts were higher (P<0.05) in PSS cheese and this was accompanied by lower (P<0.05) ph; thus, a higher rate of decrease of undesirable microorganisms in PSS cheese was recorded. Degradation of αs-casein was in R>RS and in PS>PSS, while a small reduction of β- casein during ripening and storage was recorded. The proportions of aminoacids and lipolysis products increased throughout ripening and storage. x

15 Ευρετήριο πινάκων Πίνακας Ελληνικά παραδοσιακά τυριά ΠΟΠ.. 8 Πίνακας Επικρατέστερα είδη της οξυγαλακτικής µικροχλωρίδας των Ελληνικών παραδοσιακών τυριών 12 Πίνακας Παραδείγµατα παραγόµενων βακτηριοσινών από γαλακτικά βακτήρια.. 47 Πίνακας Χαρακτηριστικά των ειδών και υποειδών του γένους Lactococcus. 54 Πίνακας Είδη του γένους Enterococcus. 60 Πίνακας Οι 6 τύποι ανθεκτικότητας στη βανγκοµυκίνη. 66 Πίνακας Ταξινόµηση του γένους Lactobacillus.. 71 Πίνακας Στελέχη λακτοκόκκων από τυρί Μπάτζος 109 Πίνακας Στελέχη εντεροκόκκων από τυρί Μπάτζος Πίνακας Πίνακας Πίνακας Πίνακας Πίνακας Πίνακας Μεταβολή της µικροχλωρίδας (log cfu/g, x ± sd) κατά την παρασκευή και ωρίµαση τυριού Μπάτζος από νωπό κατσικίσιο γάλα το χειµώνα 128 Μεταβολή της µικροχλωρίδας (log cfu/g, x ± sd) κατά την παρασκευή και ωρίµαση τυριού Μπάτζος από νωπό κατσικίσιο γάλα την άνοιξη 129 Μεταβολή της µικροχλωρίδας (log cfu/g, x ± sd) κατά την παρασκευή και ωρίµαση τυριού Μπάτζος από νωπό κατσικίσιο γάλα το καλοκαίρι. 130 Μεταβολή των χηµικών χαρακτηριστικών (x ± SD) κατά την παρασκευή και ωρίµαση Μπάτζου από νωπό κατσικίσιο γάλα το χειµώνα, άνοιξη και καλοκαίρι. 133 Είδη γαλακτικών βακτηρίων (αριθµός των αποµονώσεων από MRS άγαρ και %) που αποµονώθηκαν από τυρί Μπάτζο από νωπό κατσικίσιο γάλα κατά τη διάρκεια της ωρίµασης σε όλη τη γαλακτική περίοδο. 135 Ικανότητα οξίνισης των 40 στελεχών λακτοκόκκων αποµονωµένων από το τυρί Μπάτζος από νωπό κατσικίσιο γάλα xi

16 Πίνακας Υδρόλυση της αs- και β-καζεΐνης των στελεχών λακτοκόκκων Πίνακας Αντιβακτηριακή δράση στελεχών λακτοκόκκων 144 Πίνακας Παραγωγή µεθανοθειόλης από L-Μεθειονίνη από τα στελέχη λακτοκόκκων που αποµονώθηκαν από το τυρί Μπάτζος. 145 Πίνακας Γενότυποι ανάµεσα στα στελέχη λακτοκόκκων σύµφωνα µε το συνδυασµό των τριών µοριακών µεθόδων 151 Πίνακας Πρωτεολυτική δραστηριότητα στελεχών εντεροκόκκων σε τρυβλίο Πίνακας Καζεϊνολυτική δραστηριότητα στελεχών εντεροκόκκων µετά από 24 ώρες και 7 ηµέρες επώαση σε γάλα Πίνακας Αιµολυτική ικανότητα στελεχών εντεροκόκκων Πίνακας Ικανότητα παραγωγής βιογενών αµινών στελεχών εντεροκόκκων. 159 Πίνακας Ετερογένεια στην παραγωγή αντιµικροβιακών ουσιών από στελέχη εντεροκόκκων από Μπάτζο Πίνακας Πίνακας Πίνακας Πίνακας Πίνακας Πίνακας Η % γενετική ετερογένεια σε στελέχη εντεροκόκκων σύµφωνα µε τις τρεις µοριακές µεθόδους Μεταβολή της µικροχλωρίδας (log cfu/g, x ± sd) κατά την παρασκευή και ωρίµαση τυριού Μπάτζος από παστεριωµένο τυποποιηµένο κατσικίσιο γάλα µε προσθήκη καλλιέργειας (PSS) Μεταβολή της µικροχλωρίδας (log cfu/g, x ± sd) κατά την παρασκευή και ωρίµαση τυριού Μπάτζος από παστεριωµένο κατσικίσιο γάλα µε προσθήκη καλλιέργειας (PS). 171 Μεταβολή της µικροχλωρίδας (log cfu/g, x ± sd) κατά την παρασκευή και ωρίµαση τυριού Μπάτζος από νωπό κατσικίσιο γάλα µε προσθήκη καλλιέργειας (RS). 172 Μεταβολή της µικροχλωρίδας (log cfu/g, x ± sd) κατά την παρασκευή και ωρίµαση τυριού Μπάτζος από νωπό κατσικίσιο γάλα (R) Επίδραση της προσθήκης καλλιέργειας και της θερµικής επεξεργασίας στην εξέλιξη των µικροβιακών οµάδων κατά τη xii

17 Πίνακας Πίνακας Πίνακας Πίνακας Πίνακας Πίνακας διάρκεια της παρασκευής, ωρίµασης και συντήρησης του τυριού Μπάτζος Μεταβολή των χηµικών χαρακτηριστικών κατά την παρασκευή και ωρίµαση Μπάτζου από παστεριωµένο τυποποιηµένο κατσικίσιο γάλα µε προσθήκη καλλιέργειας (PSS) 178 Μεταβολή των χηµικών χαρακτηριστικών κατά την παρασκευή και ωρίµαση Μπάτζου από παστεριωµένο µε προσθήκη καλλιέργειας κατσικίσιο γάλα (PS) Μεταβολή των χηµικών χαρακτηριστικών κατά την παρασκευή και ωρίµαση Μπάτζου από νωπό µε προσθήκη καλλιέργειας κατσικίσιο γάλα (RS). 180 Μεταβολή των χηµικών χαρακτηριστικών κατά την παρασκευή και ωρίµαση Μπάτζου από νωπό κατσικίσιο γάλα (R) 181 Eπίδραση της θερµικής επεξεργασίας, της προσθήκης καλλιέργειας και του χρόνου στα χηµικά χαρακτηριστικά κατά την παρασκευή και ωρίµαση τυριού Μπάτζος από κατσικίσιο γάλα Καζεϊνολυτική δραστηριότητα (µέσοι όροι και τυπικό σφάλµα) στο τυρί Μπάτζος. 184 Α.4.2.9β. Ποσοτικοποίηση και έλεγχος καθαρότητας του DNA 255 xiii

18 Ευρετήριο διαγραµµάτων ιάγραµµα Πρωτεολυτική δράση στελεχών λακτοκόκκων εκφρασµένη σε ppm L-γλυκίνης ιάγραµµα Αµινοπεπτιδασική δραστηριότητα στελεχών λακτοκόκκων αποµονωµένων από τυρί Μπάτζος ιάγραµµα Πλασµιδιακά πρότυπα των στελεχών λακτοκόκκων ιάγραµµα ενδρόγραµµα των στελεχών λακτοκόκκων σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της RAPD-PCR ιάγραµµα ενδρόγραµµα στελεχών λακτοκόκκων σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της PFGE. 149 ιάγραµµα ph στελεχών εντεροκόκκων µετά από 6, 16 και 24 ώρες επώαση σε γάλα ιάγραµµα Πρωτεολυτική δραστηριότητα στελεχών εντεροκόκκων εκφρασµένη σε ppm L-glycine ιάγραµµα ενδρόγραµµα προϊόντων της RAPD-PCR των στελεχών εντεροκόκκων από τυρί Μπάτζος 163 ιάγραµµα Πλασµιδιακό πρότυπο στελεχών εντεροκόκκων. 164 ιάγραµµα ενδρόγραµµα στελεχών εντεροκόκκων σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της PFGE. 166 ιάγραµµα Επίδραση του τύπου του τυριού και του χρόνου στο λογαριθµικό πληθυσµό των (α) εντεροκόκκων, (β) Gramβακτηρίων, (γ) ζυµών και (δ) πρωτεολυτικών βακτηρίων ιάγραµµα Πορεία του συντελεστή άλατος στο τυρί Μπάτζος. 183 ιάγραµµα Πορεία της τιµής του ph στο τυρί Μπάτζος 183 ιάγραµµα Πρωτεολυτική δραστηριότητα εκφρασµένη σε mg L- glycine/kg στο τυρί Μπάτζος ιάγραµµα Πορεία βαθµού λιπόλυσης στο τυρί Μπάτζος. 186 xiv

19 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ Σελίδες Κατάλογος δηµοσιευµένων εργασιών Συντµήσεις 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΗ ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ Ελληνικά Παραδοσιακά τυριά (ΠΟΠ) Αυτόχθονη οξυγαλακτική µικροχλωρίδα των Ελληνικών παραδοσιακών τυριών Επίδραση της οξυγαλακτική µικροχλωρίδας στην ποιότητα των τυριών Μεταβολισµός των συστατικών του γάλακτος κατά την παρασκευή 18 και ωρίµαση των τυριών από οξυγαλακτικά βακτήρια Α. Μεταβολισµός της λακτόζης και του κιτρικού οξέως 18 Β. Μεταβολισµός πρωτεϊνών 24 Πρωτεϊνάσες.. 26 Ενδοπεπτιδάσες.. 27 Συστήµατα µεταφορά πεπτιδίων Αµινοπεπτιδάσες 30 Γ. Μεταβολισµός αµινοξέων 33 Τρανσαµίνωση 34 Απαµίνωση. 35 Αποκαρβοξυλίωση. 36. Μεταβολισµός λίπους Καλλιέργεια εκκίνησης, συµπληρωµατική καλλιέργεια και NSLAB.. 39 Καλλιέργειες εκκίνησης Κριτήρια επιλογής καλλιεργειών 41 Α). Ικανότητα παραγωγής οξέος σε γάλα.. 41 Β). Πρωτεολυτική δραστηριότητα και παραγωγή αρωµατικών ενώσεων.. 42 Γ). Αλληλεπίδραση µεταξύ τους και παραγωγή αντιβακτηριακών ουσιών 42 Γα). Αντιβακτηριακή δράση. 43 Γβ). Βακτηριοσίνες 43 ). Γενοτυπικά χαρακτηριστικά 46 Αδυναµία ανάπτυξης της καλλιέργειας.. 47 Α). Αναχαίτιση από ανοσοσφαιρίνες. 47 Β). Αναχαίτιση από το σύστηµα λακτοπεροξειδάση θειοκυανιούχο υπεροξείδιο του υδρογόνου (LPS).. 48 Γ). Αναχαίτιση από τα ελεύθερα λιπαρά οξέα ). Αναχαίτιση από αντιβιοτικά και άλλα χηµικά υπολείµµατα 49 Ε). Αναχαίτιση από βακτηριοφάγους. 49 Γαλακτικά βακτήρια που δεν ανήκουν στην καλλιέργεια (NSLAB) 50 Συµπληρωµατική καλλιέργεια Ιδιότητες και σηµασία της παρουσίας των λακτοκόκκων στα τρόφιµα. 52 xv

20 Ιδιότητες και σηµασία της παρουσίας των εντεροκόκκων στα τρόφιµα Ιδιότητες και σηµασία της παρουσίας των λακτοβακίλλων στα τρόφιµα Επίδραση των ενδογενών ενζύµων του γάλακτος, της χυµοσίνης και της θερµικής επεξεργασίας στην ωρίµαση του τυριού Πρωτεόλυση.. 74 Ενδογενή ένζυµα του γάλακτος Πλασµίνη και πλασµινογόνο.. 76 Όξινη πρωτεάση. 77 Φωσφατάσες Πηκτικό ένζυµο. 78 Λιπόλυση Παστερίωση Πολυφασική ταξινόµηση. 84 Φαινοτυπικές Μέθοδοι 84 Ανάλυση του πρωτεϊνικού προφίλ του κυττάρου (Whole-cell protein analysis). 85 Χηµειοταξινοµικές µέθοδοι 85 Γενοτυπικές Μέθοδοι.. 86 Ανάλυση πλασµιδίων 86 Ανάλυση µε ένζυµο περιορισµού (Restriction Endonuclease Analysis, REA).. 87 Ηλεκτροφόρηση πηκτής παλλόµενου πεδίου (Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE).. 88 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (Polymerase Chain reaction, PCR) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης βασισµένη στον πολυµορφισµό τυχαία πολλαπλασιαζόµενου DNA (Randomly Amplified Polymorpic DNA-PCR, RAPD-PCR). 93 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης βασισµένη στο πολλαπλασιασµό συγκεκριµένων περιοχών του DNA (Species specific PCR) 94 Άλλες γενοτυπικές µέθοδοι.. 95 Επιλογή της κατάλληλης µεθόδου ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ. 99 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υλικά και Μέθοδοι ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΠΑΡΑ ΟΣΙΑΚΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ Παρασκευή παραδοσιακού τυριού Μικροβιολογικές αναλύσεις Χηµικές αναλύσεις Στατιστική επεξεργασία Αποµόνωση γαλακτικών βακτηρίων Φαινοτυπική ταυτοποίηση. 105 Α). Ταξινόµηση σε γένος xvi

21 Β). Ζύµωση σακχάρων ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΚΑΙ ΓΕΝΟΤΥΠΙΚΗ ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑ 108 ΛΑΚΤΟΚΟΚΚΩΝ Στελέχη και συνθήκες ανάπτυξης Έλεγχος της παραγωγής οξέος σε γάλα Πρωτεολυτική δραστηριότητα Πεπτιδολυτική δραστηριότητα άθικτων/ανέπαφων κυττάρων Λιπολυτική ικανότητα Αντιβακτηρική δράση Έλεγχος παραγωγής µεθανοθειόλης Ανάλυση πλασµιδιακού προτύπου 114 Α). Αποµόνωση πλασµιδιακού περιεχοµένου Β). Ηλεκτρόφορηση RAPD-PCR 116 Α). Εξαγωγή του DNA Β). Ποσοτικοποίηση και έλεγχος καθαρότητας του DNA 117 Γ). Αντίδραση RAPD-PCR Ηλεκτροφόρηση πηκτής παλλόµενου πεδίου (Pulsed Field Gel 118 Electrophoresis). Α). Προετοιµασία χρωµοσωµικού DNA Β). Συνθήκες ηλεκτροφόρησης ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΚΑΙ ΓΕΝΟΤΥΠΙΚΗ ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑ ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΩΝ Στελέχη και συνθήκες ανάπτυξης Έλεγχος της παραγωγής οξύτητας σε γάλα Πρωτεολυτική δραστηριότητα Πεπτιδολυτική δραστηριότητα άθικτων κυττάρων Προσδιορισµός πρωτεΐνης Λιπολυτική ικανότητα Έλεγχος για ανθεκτικά στην βανκοµυκίνη γονίδια Προσδιορισµός της αιµόλυσης Ικανότητα αποκαρβοξυλίωσης αµινοξέων Αντιβακτηριακή δράση Ανάλυση πλασµιδιακού προτύπου RAPD-PCR Pulsed Field Gel Electrophoresis ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΠΑΡΑ ΟΣΙΑΚΟΥ ΤΥΡΙΟΥ ΑΠΟ ΑΠΟΨΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Παρασκευή τυριών Μικροβιολογικές αναλύσεις Χηµικές αναλύσεις. 125 Α). Προσδιορισµός λιποπεριεκτικότητας Β). Προσδιορισµός λιπόλυσης (ADV) Γ). Μελέτη της πρωτεόλυσης των τυριών Προσδιορισµός της πρωτεόλυσης µε τη φασµατοφωτοµετρική µέθοδο της ο-φθαλδιαλδεϋδης (ΟΡΑ) και Μέθοδος ουρίας-page. 126 xvii

22 Στατιστική επεξεργασία ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΠΑΡΑ ΟΣΙΑΚΟΥ ΠΡΟΪΟΝΤΟΣ Εξέλιξη της µικροχλωρίδας κατά την παρασκευή και ωρίµαση του παραδοσιακού τυριού Μπάτζος Χηµικές αναλύσεις Μεταβολή της οξυγαλακτικής µικροχλωρίδας ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΚΑΙ ΓΕΝΟΤΥΠΙΚΗ ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑ ΛΑΚΤΟΚΟΚΚΩΝ 137 Α. ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑ υνατότητα οξίνισης σε γάλα Πρωτεολυτική δραστηριότητα Λιπολυτική ικανότητα Αντιβακτηριακή δράση Χρησιµοποίηση κιτρικών Έλεγχος παραγωγής µεθανοθειόλης Β. ΓΕΝΟΤΥΠΙΚΗ ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑ Ανάλυση πλασµιδιακού προφίλ RAPD-PCR Ηλεκτροφόρηση Παλλόµενου Πεδίου ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΚΑΙ ΓΕΝΟΤΥΠΙΚΗ ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑ ΕΝΤΕΡΟΚΟΚΚΩΝ. 152 A. ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑ Έλεγχος της παραγωγής οξύτητας σε γάλα Πρωτεολυτική και πεπτιδολυτική δραστηριότητα Λιπολυτική δραστηριότητα Έλεγχος για ανθεκτικά στην βανκοµυκίνη γονίδια και αιµολυτική ικανότητα Ικανότητα αποκαρβοξυλίωσης αµινοξέων Αντιβακτηριακή δράση B. ΓΕΝΟΤΥΠΙΚΗ ΕΤΕΡΟΓΕΝΕΙΑ RAPD-PCR Ανάλυση πλασµιδιακού προφίλ Ηλεκτροφόρηση παλλόµενου πεδίου (PFGE) ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΟΥ ΠΑΡΑ ΟΣΙΑΚΟΥ ΤΥΡΙΟΥ ΑΠΟ ΑΠΟΨΗ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ Μικροβιολογικές αναλύσεις Φυσικοχηµικά χαρακτηριστικά ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ xviii

23 8. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 222 Α. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Β. ΗΜΟΣΙΕΥΜΕΝΕΣ ΕΡΓΑΣΙΕΣ xix

24 ηµοσιευµένες εργασίες 1. Psoni, L., Tzanetakis, N., Litopoulou-Tzanetaki, E. (2003). Microbiological characteristics of Batzos, a traditional Greek cheese from raw goat s milk. Food Microbiology 20: Psoni, L., Kotzamanidis, C., Andrighetto, C., Lombardi, A., Tzanetakis, N., Litopoulou-Tzanetaki, E. (2006). Genotypic and phenotypic heterogeneity in Enterococcus isolates from Batzos, a raw goat milk cheese. International Journal of Food Microbiology 109: Psoni, L., Tzanetakis, N., Litopoulou-Tzanetaki, E. (2006). Characteristics of Batzos cheese made from raw, pasteurized and/or pasteurized standardized goat milk and a native culture. Food Control 17(7): Psoni, L., Kotzamanidis, C., Yiangou, M., Tzanetakis, N., Litopoulou- Tzanetaki, E. Genotypic and phenotypic diversity of Lactococcus lactis from Batzos, a Greek PDO raw goat milk cheese. International Journal of Food Microbiology, δεκτή για δηµοσίευση. xx

25 Συντµήσεις AFLP Αmplified fragment length polymorphism AOC Appelation d Origine Contrôlée ARDRA Amplification και restriction analysis of the 16S rdna C. Clostridium ddl D-alanine:D-alanine ligase E. coli Escherichia coli Ent. Enterococcus FAO Food and Agriculture Organization Gly Glycine Igs Ανοσοσφαιρίνες ITS-PCR Internally Transcribed Spacer PCR L. Listeria Lb. Lactobacillus Lc. Lactococcus Ln. Leuconostoc LPS Σύστηµα λακτοπεροξειδάση θειοκυανιούχο υπεροξείδιο του υδρογόνου Met Methionine NSLAB Non Starter Lactic Acid Bacteria PCR Polymerase Chain Reaction PDO Protected Designation of Origin PFGE Pulsed Field Gel Electrophoresis Phe Phenylalanine Pro Proline RAPD- Randomly Amplified Polymorphic DNA PCR PCR rdna ribosomal DNA Rep-PCR Repetitive Extragenic Palindromic PCR RFLP Restriction-Fragment Length Polymorphism S. Staphylococcus Str. Streptococcus WHO World and Health Organization αs-cn αs-καζεΐνη β-cn β-καζεΐνη γ-cn γ-καζεΐνη κ-cn κ-καζεΐνη ΠΟΠ Προστατευόµενη Ονοµασία Προέλευσης xxi

26 1. Εισαγωγή Η Ελλάδα είναι µια χώρα µε µεγάλη παραγωγή πρόβειου και κατσικίσιου γάλακτος και των προϊόντων τους και µία από τις πρώτες, αν όχι η πρώτη, στην κατανάλωση γαλακτοκοµικών προϊόντων. ιαθέτει πλήθος παραδοσιακών τυριών, τα οποία, πρώτα απ όλα, πρέπει να τα γνωρίσουµε εµείς οι Έλληνες και έπειτα να τα προωθήσουµε σωστά στο εξωτερικό. Είναι ο γευστικός και πολιτιστικός πλούτος της χώρας µας και αποτελεί διαβατήριο για την αναγνώριση της σε ολόκληρο τον κόσµο. Η ονοµασία τυρί προέρχεται από το ρήµα τορέω που σηµαίνει τρυπώ λόγω πιθανόν των τρυπών που διαθέτει στο σώµα του ή από το ρήµα τορεύω που σηµαίνει καλουπώνω, λόγω πιθανόν του γεγονότος ότι µερικά τυριά µπαίνουν σε καλούπια. Τυρί είναι το προϊόν που προκύπτει έπειτα από συµπύκνωση των συστατικών του γάλακτος µε γαλακτική ζύµωση µε σκοπό την περαιτέρω συντήρηση του. Το γάλα είναι αναµφίβολα µια πολύ πλούσια τροφή για τον άνθρωπο αλλά δυστυχώς αλλοιώνεται εύκολα. Η µεταποίηση του σε τυρί µας δίνει την δυνατότητα της περαιτέρω συντήρησης και συνάµα απόκτησης ενός προϊόντος µε υψηλή βιολογική αξία. Η ιστορία του τυριού χρονολογείται από πάρα πολύ παλιά. Είναι ένα από τα πιο παλιά τρόφιµα για τον άνθρωπο. Αρχίζει το π.χ. στα οροπέδια του Ιράν, όταν για πρώτη φορά εξηµερώθηκαν τα πρώτα µηρυκαστικά, η κατσίκα και το πρόβατο. Χίλια χρόνια µετά στην βόρειο Ευρώπη εξηµερώνεται η άγρια αγελάδα. Τα ζώα αυτά αποτέλεσαν τα πρώτα κοπάδια που οι νοµάδες χρησιµοποιούσαν για το κρέας τους, το γάλα τους, το δέρµα τους, τα κόκαλα, ακόµα και τα κόπρανα τους ως καύσιµη ύλη. Την 8η χιλιετηρίδα π.χ. µαζί µε τους νοµαδικούς πληθυσµούς η κατσίκα και η προβατίνα έρχονται στις ακτές της Μεσογείου. Η ιστορία του τυριού σχεδόν ταυτίζεται αλλά και εξελίσσεται µε αυτήν της Ευρώπης και κυρίως της νοτίου πλευράς της. Υπάρχουν αναφορές της ύπαρξης του από τους Σουµέριους, το περίπου π.χ., οι οποίοι αναφέρουν περισσότερα από 15 είδη φρέσκων τυριών. Βρέθηκαν, επίσης, σχετικά σκεύη εκείνης της εποχής, σε Ευρώπη και Ασία, που προδίδουν την κατανάλωσή του από τους ανθρώπους. Σύµφωνα µε έναν αρχαίο µύθο, το τυρί ανακαλύφθηκε συµπτωµατικά καθώς κάποιος έµπορος µετέφερε γάλα µέσα σε στοµάχι προβάτου διασχίζοντας την έρηµο και η ζέστη προκάλεσε πήξιµο του γάλακτος και διαχωρισµό του σε πήγµα και τυρόγαλα. Ο έµπορος χόρτασε την πείνα του µε το τυρόγαλα και το πήγµα και, σύµφωνα µε το µύθο, ενθουσιάστηκε από τη γεύση τους. Κάπως έτσι περιγράφεται η πρώτη επαφή του ανθρώπου µε το τυρί. 1

27 Πρώτη µαρτυρία διατροφής µε γάλα µηρυκαστικού είναι αυτή της ελληνικής µυθολογίας. Ο ίας κυνηγηµένος από τον πατέρα του Κρόνο, κρύβεται από τη µητέρα του Ρέα στα δύσβατα βουνά της Κρήτης και τρέφεται αποκλειστικά µε γάλα και µέλι. Το γάλα ήταν προσφορά της κατσίκας Αµάλθειας. Και πάλι ο ίας θέλοντας να θρέψει το γιο του Ηρακλή µε θεϊκό γάλα για να γίνει αθάνατος, έκανε τον ουρανό να κατακλυστεί από γάλα. Από τότε, τον ουρανό γέµισαν οι Γαλαξίες. Ο Όµηρος στην «Οδύσσεια» (Θ κεφάλαιο, στιχ , ) περιγράφει λεπτοµερώς τον βοσκό και τυροκόµο Πολύφηµο και δίνει περιγραφές των τυριών που ωρίµαζαν µέσα στην σπηλιά του: «ταρσοὶ µὲν τυρῶν βρῖθον, στείνοντο δὲ σηκοὶ ἀρνῶν ἠδ ἐρίφων διακεκριµέναι δὲ ἕκασται ἔρχατο, χωρὶς µὲν πρόγονοι, χωρὶς δὲ µέτασσαι, χωρὶς δ αὖθ ἕρσαι. ναῖον δ ὀρῷ ἄγγεα πάντα, γαυλοί τε σκαφίδες τε, τετυγµένα, τοῖς ἐνάµελγεν», «ἑζόµενος δ ἤµελγεν ὄις καὶ µηκάδας αἶγας, πάντα κατὰ µοῖραν, καὶ ὑπ ἔµβρυον ἧκεν ἑκάστῃ. αὐτίκα δ ἥµισυ µὲν θρέψας λευκοῖο γάλακτος πλεκτοῖς ἐν ταλάροισιν ἀµησάµενος κατέθηκεν, ἥµισυ δ αὖτ ἔστησεν ἐν ἄγγεσιν, ὄφρα οἱ εἴη πίνειν αἰνυµένῳ καί οἱ ποτιδόρπιον εἴη» 1 (Μετάφραση: «Και στην σπηλιά άµα µπήκαµε, βλέπαµε ό,τι είχε µέσα. Γεµάτα τα τυρόβολα κι οι µάντρες στοιβαγµένες, από κατσίκια κι απ'αρνιά, και χώρια µαντρισµένα τα πρώιµα αλλού, τα µέσα αλλού, κι αλλού τα όψιµα ήταν. Κι ήταν από τυρόγαλο γεµάτα όλα τα αγγεία του, σκάφες, καρδάρες, που άρµεγε µέσα σ'αυτά το γάλα», «Και το µισό όταν έπηξε τ'άσπρο χιονάτο γάλα, το σύναξε και το'βαλε µες στα πλεχτά καλάθια, και στις καρδάρες φύλαξε τ άλλο µισό να πίνει». 2 Στην αρχαία Ελλάδα, επίσης, υπάρχουν αρκετές µαρτυρίες για τη σηµασία του τυριού στη διατροφή του ανθρώπου. Στα κείµενα των αρχαίων κωµωδιογράφων βρίσκουµε άφθονες περιγραφές από τυριά της Ελλάδας και στην αγορά των Αθηνών υπήρχε χώρος ειδικά αφιερωµένος στα τυριά. Στην αρχαία Σπάρτη υπήρχε ολόκληρη τελετουργική γιορτή µε επίκεντρο την κλοπή τυριών για να δείξουν το ταλέντο τους στον κλεφτοπόλεµο οι νεαροί Σπαρτιάτες. Αργότερα, οι Ρωµαίοι έφθασαν στο σηµείο να εµπλουτίζουν την γεύση του ταΐζοντας τα ζώα µε αρωµατικά φυτά. Κατακτώντας την Ευρώπη µάθαιναν στους κατοίκους κάθε περιοχής να τυροκοµούν και να Οι τροφές µέσα από την Ποίηση και άλλα Αρχαία Ελληνικά Συγγράµµατα» 2

28 εκµεταλλεύονται το γάλα των ζώων. Κατά την διάρκεια της Βυζαντινής αυτοκρατορίας στον Ελληνικό χώρο η τυροκοµία ήταν πολύ εκτεταµένη. Οι λίγες µαρτυρίες που υπάρχουν, οµιλούν για το βλάχικο τυρί, τις µυζήθρες (απ' όπου πήρε το όνοµά του και ο Μυζηθράς - Μιστράς). Στο τέλος του 19ου αιώνα και έπειτα, σπουδαίοι τυροκόµοι της Ελλάδας, όπως ο Ραϋµόνδος ηµητριάδης, οι µεγάλοι τυροκόµοι Ζυγούρης και Πολυχρονιάδης δίδαξαν τους νέους τυροκόµους της χώρας µας και το έργο τους συνεχίζεται µέχρι τώρα. Η βακτηριολογική κατάσταση του νωπού γάλακτος στην σηµερινή Ελλάδα δεν είναι πάντα η καλύτερη. Ο Ραϋνόλδος ηµητριάδης 3, το 1900, αναφερόµενος στο Κεφαλοτύρι, που φαίνεται να ήταν το µοναδικό σκληρό τυρί που παρασκευαζόταν στη χώρα µας την περίοδο εκείνη, γράφει τα εξής: «Εάν θέλη τις µε µίαν λέξιν να χαρακτηρίση την βάρβαρον κατάστασιν της γαλακτοµικής αναπτύξεως του τόπου, ας προφέρη την λέξιν κεφαλοτύρι εξάγεται εις την Ιταλίαν κατά µεγάλας ποσότητας, διότι µόνον η πτώχια των εργατικών πληθυσµών της Νοτίου Ιταλίας και η χρήσις του τυρού τετριµµένου (δια τα µακαρόνια) εξηγούσι το θαύµα πως ευρίσκονται ακόµη θνητοί αγοράζοντες το φροµάτζιο γκρέκο Το κεφαλοτύρι εξαγοράζει τας πολλάς αµαρτίας του δι ενός µόνον πλεονεκτήµατος, είναι, αφού ξηραθή, σχεδόν απρόσβλητον από οιανδήποτε ασθένειαν, και µετακοµίζεται µετά τόσης ευκολίας µεθ ής µετακοµίζονται τα ορυκτά, εις το βασίλειον των οποίων ούτως ειπείν ανήκει. Οικονοµολογικώς δε έχει σχέσιν προς τον λευκόν τυρόν, οίαν ο ξηρός βακαλάος προς τους νωπούς ιχθύς». Βέβαια, έχει υπάρξει σηµαντική βελτίωση στη σηµερινή εικόνα της τυροκοµίας αλλά µάλλον αυτό δεν αρκεί. Η τάση που υπάρχει σήµερα στην παγκόσµια αγορά, για σταθερή ποιότητα και γεύση στα παραδοσιακά µας τυριά καθώς και για διασφάλιση της δηµόσιας υγείας, αναγκάζει τους παραγωγούς να καταφύγουν στην θερµική επεξεργασία του γάλακτος. Με τη θερµική επεξεργασία καταστρέφεται το µεγαλύτερο µέρος της µικροχλωρίδας του νωπού γάλακτος µε αποτέλεσµα την απώλεια της τυπικής και έντονης γεύσης των τυριών. Η τήρηση των νόµων της αγοράς και των κανόνων της υγιεινής χωρίς συγχρόνως να χάνεται ο ιδιαίτερος χαρακτήρας ενός προϊόντος είναι το ζητούµενο. Το νωπό γάλα διαθέτει γαλακτικά βακτήρια (LAB) µε έντονη πρωτεολυτική δραστηριότητα που συνεισφέρουν στη διαµόρφωση του αρώµατος των τυριών (Tzanetakis και Litopoulou-Tzanetaki, 1989)

29 Πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στις συνθήκες παραγωγής, µεταφοράς και αποθήκευσης του γάλακτος καθώς και στις συνθήκες τυροκόµησης για να µειωθεί ο αρχικός πληθυσµός των εντεροβακτηριοειδών και κολοβακτηριοειδών και να εξαλειφθεί η παρουσία ανεπιθύµητων µικροοργανισµών. Τα στελέχη LAB που αποµονώνονται από ζυµωµένα γαλακτοκοµικά προϊόντα στα οποία δεν έχει προστεθεί κάποια καλλιέργεια, χαρακτηρίζονται ως «άγρια» στελέχη (Wouters et al., 2002). Με τις πρωτεολυτικές τους ιδιότητες συνεισφέρουν στη δηµιουργία της τυπικής γεύσης και αρώµατος του κάθε τύπου τυριού. Η προσεκτική µελέτη των τεχνολογικών, λειτουργικών και γενοτυπικών ιδιοτήτων της επικρατούσας οξυγαλακτικής µικροχλωρίδας του τυριού, δίνει τη δυνατότητα αποµόνωσης και χρησιµοποίησης επιλεγµένων στελεχών για τη ρύθµιση της ωρίµασης του τυριού. Επιπλέον, η προσθήκη βακτηριοσινογόνων στελεχών ως καλλιέργεια εκκίνησης ή ως συµπληρωµατική καλλιέργεια στη παρασκευή ενός τυριού, είναι πιθανά ένα σηµαντικό «όπλο» καταπολέµησης της επιβίωσης και ανάπτυξης παθογόνων µικροοργανισµών για τον άνθρωπο. 4

30 2. ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑΣ 5

31 2.1. ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΤΥΡΙΑ ΠΟΠ (ΠΑΡΑ ΟΣΙΑΚΑ ΤΥΡΙΑ) Υπάρχει µια µεγάλη ποικιλία παραδοσιακών τυριών στην χώρα µας από κατσικίσιο, αγελαδινό ή πρόβειο γάλα, µη γνωστά δυστυχώς στο ευρύ κοινό. Τυριά µε έντονη προσωπικότητα, γεµάτη γεύση και άρωµα που «οµορφαίνουν» την παραδοσιακή µας κουζίνα και µας χαρίζουν αξέχαστες στιγµές γαστρονοµικής απόλαυσης. Τυρί ΠΟΠ (Προστατευόµενη Ονοµασία Προέλευσης) ή αλλιώς PDO (Protected Designation of Origin) µπορεί να χαρακτηριστεί το τυρί που παράγεται σε µια συγκεκριµένη περιοχή µιας χώρας, από γάλα που παράγεται µόνο στην περιοχή αυτή και η ποιότητα και τα χαρακτηριστικά του οφείλονται κυρίως ή αποκλειστικά στο γεωγραφικό περιβάλλον που περιλαµβάνει φυσικούς και ανθρώπινους παράγοντες. Η ιδέα να προστατεύονται και να διατηρούνται τα παραδοσιακά προϊόντα της κάθε περιοχής είναι αρκετά παλιά και χρονολογείται από το 1883, οπότε η συνθήκη του Παρισιού πρότεινε τον όρο Appelation d Origine Contrôlée (AOC, Ονοµασία ελεγχόµενης προέλευσης), όρος που χρησιµοποιείται ακόµα και σήµερα από τους Γάλλους (Bertozzi και Panari, 1993). Αυτή η ιδέα διαδόθηκε σε όλη την Ευρώπη και ο όρος AOC αντικαταστήθηκε από τον όρο PDO. Ο FAO/WHO (Food και Agriculture Organization/World και Health Organization) έχει δηµοσιεύσει πρότυπα για πολλά είδη τυριών σε διάφορες εκδόσεις του Κώδικα περί Προτύπων Ποιότητας για Τυριά ως µέλος του FAO/WHO Κώδικα Τροφίµων 1. Η ιδέα του Κώδικα Τροφίµων διαµορφώθηκε από µια συνάντηση των Ευρωπαϊκών κυβερνήσεων στην Ιταλική πόλη Stresa, το 1951, αλλά η ιδέα προϋπήρχε από το τέλος του 19 ου αιώνα, οπότε η Αυστροουγγρική αυτοκρατορία είχε θεσπίσει πρότυπα και είχε εκδόσει τα χαρακτηριστικά πολλών προϊόντων µιας ευρείας γκάµας τροφίµων (Codex Alimentarius Austriacus). Είκοσι Ελληνικά παραδοσιακά τυριά έχουν κατοχυρωθεί ως τυριά ΠΟΠ στην Ελλάδα και φαίνονται στον πίνακα To 1992, η Ευρωπαϊκή Ένωση εξέδωσε 2 κανονισµούς, 2081/92 και 2082/92 και 2 οδηγίες 46/92 και 47/92 που σκοπό έχουν την προστασία των παραδοσιακών τροφίµων της κάθε χώρας-µέλους της. Οι κανονισµοί αναφέρονται στα προϊόντα αυτά και στην κατοχύρωση τους και οι οδηγίες αναφέρονται στις συνθήκες παραγωγής του γάλακτος και τα χαρακτηριστικά τους

32 Ο κανονισµός 2081/92 έχει ως σκοπό την προστασία των γεωγραφικών ενδείξεων και των ονοµασιών ενώ ο κανονισµός 2082/92 τη βεβαίωση της µοναδικότητας των προϊόντων και την προστασία των παραδοσιακών συνταγών. Γενικά προβλέπεται σύστηµα ελέγχου και πιστοποίησης, ώστε αφενός οι καταναλωτές να είναι σίγουροι ότι τα προϊόντα παράγονται µε συγκεκριµένες προδιαγραφές και κυκλοφορούν µε ενδείξεις που δεν τους παραπλανούν και αφετέρου οι παραγωγοί να προστατεύουν το προϊόν τους από αποµιµήσεις και αθέµιτο ανταγωνισµό. υστυχώς ακόµα, η ισχύουσα νοµοθεσία δεν περιλαµβάνει χώρες εκτός της Ευρωπαϊκής ένωσης όπου τα κατοχυρωµένα ως ΠΟΠ προϊόντα µπορούν να παράγονται και να διακινούνται ελεύθερα. Έτσι, µπορεί ένας αµερικάνος τυροκόµος να παράγει τυρί φέτα ή τυρί Roquefort και να τα ονοµάζει µε το συγκεκριµένο όνοµα. Η ευρωπαϊκή ένωση κάνει ιδιαίτερες προσπάθειες, στο πλαίσιο του Παγκόσµιου Οργανισµού Εµπορίου, να επιβάλλει σε παγκόσµιο επίπεδο την κατοχύρωση των παραδοσιακών της προϊόντων. Για το τυρί Φέτα υπήρξε µεγάλη διαµάχη επειδή παραγόταν και από άλλες ευρωπαϊκές χώρες. Παρόλο που από 1994 γίνεται σηµαντική προσπάθεια για την κατοχύρωση της Φέτας ως Ελληνικού προϊόντος και τον Οκτώβριο του 2002 (ΕΚ 1829/2002), η Ευρωπαϊκή Επιτροπή εξέδωσε ρύθµιση που επιβάλλει την παραγωγή Φέτας από την Ελλάδα, το ζήτηµα λύθηκε µόλις τον Οκτώβριο του 2005 τελικά στο Ευρωπαϊκό ικαστήριο, έπειτα από προσφυγή της ανίας και της Γερµανίας µε την υποστήριξη της Γαλλίας και της Μεγάλης Βρετανίας, και η Φέτα χαρακτηρίστηκε τελικά ως Ελληνικό ΠΟΠ τυρί 2. Οι παραγωγοί τυριού Φέτας σε άλλες χώρες έχουν περιθώριο µέχρι τον Οκτώβριο του 2007 να προσαρµοστούν στην συγκεκριµένη απόφαση. Ένα από τα παραδοσιακά µας ΠΟΠ τυριά, όπως φαίνεται και στον πίνακα 2.1.1, είναι και το τυρί Μπάτζoς. Παραδοσιακό τυρί της υτικής Μακεδονίας, συγκεκριµένα των νοµών Γρεβενών και Κοζάνης. Σύµφωνα µε τον Ανυφαντάκη (1991), είναι τυρί ηµίσκληρο, άλµης, αρκετά αλµυρό και πικάντικο µε έναν µεγάλο αριθµό οπών στο σώµα του. Παρασκευάζεται, είτε από κατσικίσιο γάλα, είτε από πρόβειο, είτε από ανάµιξή τους. 2 htpp://curia.eu.int/el/actu/communiqués/cp05/aff/cp50092.pdf 7

33 Πίνακας Ελληνικά παραδοσιακά τυριά ΠΟΠ 1,2 Όνοµα τυριού Περιοχή Tύπος γάλακτος Ανεβατό Νοµός Γρεβενών και Επαρχία Βοϊου Κοζάνης (Γάλα πρόβειο ή γίδινο ή µίγµατα αυτών Γαλοτύρι Ήπειρος & Θεσσαλία Γάλα πρόβειο, γίδινο ή µίγµατα αυτών Φέτα Μακεδονία, Θράκη, Ήπειρος, Στερεά Ελλάδα, Πελοπόννησος, Ν. Λέσβου & Θεσσαλία. Γάλα πρόβειο ή µίγµα πρόβειου και γίδινου έως 30% κ.β. Γραβιέρα Αγράφων Γραβιέρα Κρήτης Γραβιέρα Νάξου Καλαθάκι Λήµνου Περιοχή Αγράφων Κρήτη Νάξος Λήµνος Γάλα πρόβειο ή µίγµα πρόβειου µε γίδινο έως 30% κ.β. Γάλα πρόβειο ή µίγµα πρόβειου µε γίδινο έως 20% κ.β. Γάλα αγελαδινό, ή µίγµα αυτού µε γάλα πρόβειο και γίδινο µέχρι 20% κ.β. Γάλα πρόβειο ή µίγµα πρόβειου µε γίδινο έως 30% κ.β. Κασέρι Μακεδονία, Θεσσαλία & Νοµοί Λέσβου και Ξάνθης Γάλα πρόβειο ή µίγµα πρόβειου και γίδινου έως 20% κ.β. Κατίκι οµοκού οµοκός Γάλα γίδινο ή µίγµα αυτού µε πρόβειο Κεφαλογραβιέρα υτικής Μακεδονία, Ήπειρος, Ν. Αιτωλοακαρνανία & Ν. Ευρυτανία Γάλα πρόβειο ή µίγµα πρόβειου και γίδινου έως 10% κ.β. Κοπανιστή Κυκλάδες Γάλα αγελαδινό, πρόβειο ή γίδινο Λαδοτύρι Μυτιλήνης Μυτιλήνη Γάλα πρόβειο ή µίγµα αυτού µε γίδινο Μανούρι Θεσσαλία, Κεντρική & υτική Μακεδονία Τυρόγαλα από πρόβειο ή γίδινο γάλα ή µίγµα αυτών και γάλα Μετσοβόνε Μπάτζος Μέτσοβο Θεσσαλία, Κεντρική & υτική Μακεδονία πρόβειο ή γίδινο ή κρέµα αυτού Γάλα αγελαδινό, ή µίγµα αυτού µε γάλα πρόβειο και γίδινο µέχρι 20% κ.β. Γάλα πρόβειο ή γίδινο ή µίγµατα αυτών Τυρόγαλα από γάλα πρόβειο, γίδινο ή µίγµα αυτών Ξυνοµυζήθρα Κρήτη Κρήτης Πηχτόγαλο Κρήτη Χανίων Σαν Μιχάλη Σύρος Γάλα αγελαδινό Σφέλα Νοµός Μεσσηνίας και Νοµός Λακωνίας Φορµαέλλα Αράχωβας Παρνασσού Αράχωβα Γάλα γίδινο ή πρόβειο ή µίγµατα αυτών Γάλα πρόβειο ή γίδινο ή µίγµατα αυτών Γάλα γίδινο ή πρόβειο ή µίγµατα αυτών Πιο συγκεκριµένα, για την παρασκευή του τυριού Μπάτζος χρησιµοποιείται αµιγώς κατσικίσιο γάλα ή ανάµικτο µε πρόβειο µέχρι και 30% εάν το τυρόγαλα πρόκειται να γίνει µανούρι, ενώ αµιγώς πρόβειο χρησιµοποιείται εάν πρόκειται να 8

34 παραχθεί βούτυρο από τον ορό. Ήταν γνωστό παλαιότερα ως παραπροϊόν του Μανουριού. Ο πρωταρχικός σκοπός ήταν η παρασκευή υψηλής περιεκτικότητας σε λίπος και άριστης ποιότητας τυριού Μανούρι ή πολύ καλής ποιότητας βουτύρου, από τον ορό του γάλακτος. Το τυρί Μπάτζος είναι τυρί µε χαµηλή περιεκτικότητα σε λίπος καθ ότι το µεγαλύτερο µέρος του λίπους του γάλακτος µεταφέρεται στον ορό. Σύµφωνα µε τον Ζυγούρη (1952), το γάλα πήζει στους C σε 50 λεπτά (προσθήκη πυτιάς τόσης ώστε η πήξη να γίνει σε 50 λεπτά). Με την έναρξη της πήξης, ο τυροκόµος χτυπάει το γάλα µε έµβολο φορές και έπειτα το αφήνει σε ησυχία για λεπτά, οπότε ολοκληρώνεται η πήξη. Επαναλαµβάνεται το χτύπηµα για φορές, οπότε το µεγαλύτερο µέρος του λίπους αποβάλλεται από το τυρόπηγµα και πηγαίνει στο τυρόγαλα. Στη συνέχεια το τυρόπηγµα αφήνεται να κατακαθίσει και µε την βοήθεια µιας σανίδας συγκεντρώνεται στο µέσο ή σε µια µεριά του δοχείου. Μερικοί παραγωγοί εφάρµοζαν ήπια θέρµανση στο πήγµα πριν τοποθετηθεί στην τσαντήλα. Έπειτα το τυρόπηγµα κόβεται σε τεµάχια, τα οποία τοποθετούνται σε τσαντήλες µε ταυτόχρονη υποβοήθηση της εξόδου του τυρογάλακτος µε πίεση. Κατόπιν οι τσαντήλες δένονται και το τυρί κρεµιέται για να στραγγίσει για 24 ώρες. Την επόµενη µέρα το τυρί κόβεται σε κοµµάτια, αλατίζεται (συνήθως 4 αλατίσµατα) και µπαίνει σε τενεκέδες µε άλµη 10-12%, ωσότου να πουληθεί. Ο Μπάτζος καταναλώνονταν φρέσκος ή συντηρούνταν στους 4 C. Στις µέρες µας, παρόλο που νέες τεχνολογίες έχουν εισαχθεί στη βιοµηχανία γαλακτοκοµικών προϊόντων για την παρασκευή του τυριού Μπάτζος, η παραγωγή του περιορίζεται σε µικρές βιοµηχανίες της υτικής Μακεδονίας και της γειτονικής Θεσσαλίας. Η ετήσια παραγωγή Μπάτζου για το έτος 2005 ήταν 8 τόννοι στο Νοµό Κοζάνης και 6 τόννοι στο Νοµό Γρεβενών. 9