ΜΑΘΗΜΑΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ 3 ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ

Transcript

1 ΜΑΘΗΜΑΤΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ 3 ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Αργυρώ Σγουρού, Assistant Prof. Laboratory of Biology School of Science and Technology Hellenic Open University

2 Μονογονιδιακά νοσήματα, εντοπισμός και ανίχνευση με μοριακά τεστ Με τις Μοριακές αναλύσεις DNA προσδιορίζεται αν ένα άτομο που εμφανίζει συμπτώματα ή διατρέχει υψηλό κίνδυνο εκδήλωσης γενετικής ασθένειας λόγω βεβαρημένου οικογενειακού ιστορικού φέρει (γνωστή) συγκεκριμένη μεταλλαγή σε κάποιο γονίδιο

3 Τεχνική Συνοπτική περιγραφή Εφαρμογή Στύπωμα κατά Southern Πέψη εξεταζόμενου DNA με ένζυμο περιορισμού, ανάλυση των τμημάτων σε ηλεκτροφόρηση αγαρόζης, μεταφορά του DNA σε νάϋλον μεμβράνη και υβριδοποίηση των τμημάτων DNA με σημασμένο μόριο-ανιχνευτή Ανίχνευση ενθέσεων, ή ελλείψεων, ανακατανομών συναρμολόγηση τμημάτων DNA σε φυσικό χάρτη Άμεση ανάλυση της αλληλουχίας του DNA Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του εξεταζόμενου DNA που ανιχνεύεται από χημική διάσπαση, λήξη της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας με διδεόξυδη, ή με φθορισμόχρωμα (fluorochrome) Ανίχνευση ενθέσεων, ή ελλείψεων, σημειακών μεταλλαγών, ανακατανομών Ανάλυση πολυμορφισμού μονόκλωνης διαμόρφωσης (SSCP) Διαφορική ηλεκτροφορητική κινητικότητα του μονόκλωνου εξεταζόμενου DNA με τις διαφορετικές δευτεροταγείς δομές (conformations) μέσω ενός μη αποδιατακτικού πηκτώματος Ανίχνευση μικρών ενθέσεων, ή ελλείψεων, σημειακών μεταλλαγών Ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πήκτωμα με αποδιατακτική κλίση (DGGE) Δίκλωνα μόρια DNA μετακινούνται ηλεκτροφορητικά μέσω πηκτώματος αυξανόμενης αποδιατακτικής κλίσης (π.χ., χημικά, θερμοκρασία) μέχρι την αποδιάταξη των κλώνων του DNA, τα αλληλόμορφα αναλύονται σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης Ανίχνευση μικρών ενθέσεων ή ελλείψεων, σημειακών μεταλλαγών Σχάση αταίριαστου ζεύγους DNA Υβριδοποίηση σημασμένου μορίου-ανιχνευτή στο εξεταζόμενο DNA, σχάση του DNA σε ασύζευκτα σημεία ζεύγους βάσεων Ανίχνευση μικρών ενθέσεων ή ελλείψεων, σημειακών μεταλλαγών Υβριδισμός ειδικού ολιγονουκλεοτιδικού αλληλόμορφου (ASO) Φασματομετρία μάζας Υβριδισμός μικροσυστοιχιών DNA Πρωτεϊνική αποκοπή Επιλεκτική υβριδοποίηση σημασμένου ελέγχου στο εξεταζόμενο DNA με τη μοναδική συμπληρωματική σύσταση βάσεων Ανίχνευση της φυσικής μάζας των παράλληλων και αντιπαράλληλων κλώνων του εξεταζόμενου DNA Υβριδισμός εξεταζόμενου DNA σε ολιγονουκλεοτιδικές σειρές που διατάσσονται σε τσιπ σιλικόνης ή γυάλινα πλακάκια Το εξεταζόμενο DNA χρησιμοποιείται για να συνθέσει συμπληρωματικό DNA (cdna) με RT-PCR με 5 εκκινητή που περιέχει τον υποκινητή του γονίδιου T7, το DNA μεταφράζeται και το προϊόν αναλύεται σε SDS-PAGE Ανίχνευση των αλληλόμορφων γονιδίων της γνωστής σύνθεσης Ανίχνευση μικρών ενθέσεων ή ελλείψεων, σημειακών μεταλλαγών Ανίχνευση εξεταζόμενου DNA δοκιμής γνωστής σύνθεσης Ανίχνευση μετατόπισης πλαισίου ανάγνωσης, περιοχής ματίσματος, ή ανερμηνεύσιμων μεταλλαγών, που οδηγούν σε περικοπή του πρωτεϊνικού προϊόντος

4 Ιδιότητες των νουκλεϊκών οξέων-υβριδισμός Οι δύο έλικες του DNA μπορούν να διαχωρίζονται με την ταυτόχρονη διάσπαση των δεσμών υδρογόνου που συγκρατούν τις βάσεις ζευγαρωμένες. Αυτό επιτυγχάνεται in vitro είτε με θέρμανση σε θερμοκρασία τήξης (Tm), είτε με την προσθήκη οξέων ή βάσης. Οι διαχωρισμένες συμπληρωματικές αλυσίδες του DNA ξανασυνδέονται αυτομάτως και φιάχνουν την διπλή έλικα μόλις η θερμοκρασία γίνει χαμηλότερη από το Tm ή βρεθούν ξανά σε ουδέτερο υδατικό περιβάλλον. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται επαναδιάταξη και είναι πολύ ουσιαστική για τη βιολογική σημασία του DNA

5 Υβριδισμός in situ Εντοπισμός αλληλουχιών ενώ βρίσκονται ακόμα στη φυσιολογική τους θέση στα χρωμοσώματα Τα νουκλεϊκά οξέα ανιχνευτές σημαίνονται με χημικές ουσίες που ανιχνεύονται με φθορίζοντα αντισώματα για τον χημικό δείκτη Με Η συμβολίζεται ο ανιχνευτής, ο οποίος είναι σημασμένος με μόρια βιοτίνης και πάνω σε αυτά προσκολλώνται φθορίζοντα μόρια στρεπταβιδίνης. Το τελικό σήμα ενισχύεται με φθορίζοντα αντισώματα έναντι της αβιδίνης Η τεχνική αυτή είναι γνωστή με την ονομασία FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) και χρησιμοποιείται ιδιαίτερα σαν διαγνωστική μέθοδος π.χ. στον προγεννητικό έλεγχο διαφόρων γενετικών νοσημάτων

6 Ανίχνευση τρισωμίας του χρωμοσώματος 10 Υβριδισμός in situ Ανίχνευση τρισωμιών με FISH

7 Μονονουκλεοτιδικοί Πολυμορφισμοί Πολλές γενετικές ασθένειες οφείλονται σε αλλαγές ενός μόνο ζεύγους βάσεων ενός γονιδίου. Όταν το αντίστοιχο αλληλόμορφο συναντάται στον ανθρώπινο πληθυσμό με συχνότητα μεγαλύτερη του 1% η θέση αυτή (της αλλαγής) χαρακτηρίζεται ως μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός (SNP: Single Noucleotide Polymorphism)

8 Η κληρονόμηση των μονογονιδιακών νοσημάτων: το παράδειγμα της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας Όταν στο γονίδιο που κωδικοποιεί το πολυπεπτίδιο της ανθρώπινης β- σφαιρίνης υπάρχει στο ένα αλληλόμορφο η αλλαγή στο ζεύγος βάσεων ΤΑ αντί για ΑΤ, που φέρει το φυσιολογικό ανθρώπινο αλληλόμορφο, αυτό έχει ως συνέπεια το κωδικόνιο GAG να μετατρέπεται σε GUG στο mrna, με τελικό αποτέλεσμα ένα γλουταμινικό οξύ στην πολυπεπτιδική αλυσίδα να αντικαθίσταται από το αμινοξύ βαλίνη

9 Ανίχνευση μεταλλάξεων που τροποποιούν θέσεις αναγνώρισης ενζύμων περιορισμού Σε μερικές περιπτώσεις η σημειακή μεταλλαγή που προκαλεί μία γενετική ασθένεια έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια ή τη δημιουργία μιας θέσης αναγνώρισης κάποιου ενζύμου περιορισμού. Το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο για τη δρεπανοκυτταρική αναιμία καταστρέφει τη θέση αναγνώρισης για το ένζυμο περιορισμού DdeI. Με μία απλή κατάτμηση του DNA ενός ατόμου στο συγκεκριμένο γονιδιακό τόπο με το ένζυμο DdeI, μπορούμε να ξεχωρίσουμε το παθολογικό από το φυσιολογικό αλληλόμορφο και να διαγνώσουμε τους ετερόζυγους (φορείς) για τη νόσο.

10 Πολυμορφισμοί μήκους τμημάτων περιορισμού (RFLP) Τα ένζυμα περιορισμού κόβουν τα μόρια του DNA σε κομμάτια αναγνωρίζοντας συγκεκριμένες αλληλουχίες. Όταν οι θέσεις περιορισμού εμφανίζουν διαφορετικά πρότυπα κατανομής στα δύο αλληλόμορφα ενός γενετικού τόπου, προκύπτουν πολυμορφισμοί μήκους τμημάτων περιορισμού (RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism). Εδώ φαίνεται το παράδειγμα για τη δρεπανοκυτταρική αναιμία

11 Ένζυμα περιορισμού Τύπος Ι: Διασπούν μια αλληλουχία DNA πολύ πιο μακριά (~1000 ζεύγη βάσεων) από τη θέση αναγνώρισης, απαιτούν τόσο ΑΤΡ όσο και S-αδενοσυλ-L-μεθειονίνη για να λειτουργήσουν και εκτός της ενδονουκλεολυτικής ενεργότητας εμφανίζουν και ενεργότητα μεθυλάσης Τύπος ΙΙ: Διασπούν μια αλληλουχία DNA στο σημείο αναγνώρισης, οι περισσότερες απαιτούν Mg ++ για να λειτουργήσουν και δεν έχουν ενεργότητα μεθυλάσης Τύπος ΙΙΙ: Διασπούν μια αλληλουχία DNA πιο μακριά (~20-30 ζεύγη βάσεων) από τη θέση αναγνώρισης, απαιτούν ΑΤΡ για να λειτουργήσουν και αποτελούν τμήμα συμπλόκων με τροποποιημένες μεθυλάσες Τύπος IV: Έχουν ως στόχο τροποποιημένο DNA, π.χ. μεθυλιωμένο και υδροξυμεθυλιωμένο DNA.

12 Ένζυμα περιορισμού: τρόπος πέψης ενζύμων τύπου ΙΙ Η πιθανότητα εμφάνισης μιας θέσης περιορισμού σε ένα τμήμα DNA με 50% περιεκτικότητα σε GC, στο οποίο τα ζεύγη βάσεων κατανέμονται τυχαία υπολογίζεται από τον τύπο (1/4) n, όπου n ο αριθμός των ζευγών βάσεων της αλληλουχίας αναγνώρισης. Η πιθανότητα εμφάνισης μιας θέσης αναγνώρισης 4 νουκλεοτιδικών βάσεων είναι (1/4) 4 = 1/256, δηλ. στατιστικά η αλληλουχία αυτή αναμένεται να βρίσκεται 1 φορά ανά 256 βάσεις. Στην πράξη ωστόσο, τα γονιδιώματα δεν έχουν 50% περιεκτικότητα σε GC καθ όλο το μήκος τους, ούτε τα ζεύγη βάσεων είναι τυχαία κατανεμημένα.

13 Ανάλυση νουκλεϊκών οξέων κατά μέγεθος με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Το δείγμα DNA τοποθετείται σε ειδικά πηγαδάκια ενός πηκτώματος αγαρόζης, στο οποίο έχει προστεθεί φθοριόχρωμα με την ιδιότητα να προσδένεται στις έλικες του DNA Το πήκτωμα υποβάλλεται σε ηλεκτρικό πεδίο και το DNA κινείται από τον αρνητικό προς το θετικό πόλο Το πήκτωμα ακτινοβολείται με υπεριώδες φως και σε οποιοδήποτε σημείο του πηκτώματος υπάρχει σύμπλοκο DNA-φθοριοχρώματος παράγεται φθορισμός (απεικονίζεται και φωτογραφικά με κάμερα)

14 Πολυμορφισμοί μήκους τμημάτων περιορισμού (RFLP), στη δρεπανοκυτταρική αναιμία Το πρότυπο των ζωνών που αποκαλύπτονται μετά από πέψη DNA γονιδιώματος με το ένζυμο DdeI και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, υποδεικνύει τον γονότυπο του άγνωστου DNA δείγματος

15 Πολυμορφισμοί μήκους τμημάτων περιορισμού (RFLP), ανίχνευση μετά από αντίδραση PCR Προϋπόθεση είναι η αλληλουχία του DNA γύρω από την περιοχή που εδράζεται η μετάλλαξη να είναι γνωστή ώστε να είναι δυνατός ο σχεδιασμός εκκινητών

16 Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PCR Συστατικά μιας αντίδρασης PCR: DNA το οποίο περιέχει την αλληλουχία που θέλουμε να ενισχύσουμε (γονιδιωματικό, πλασμιδιακό, ιικό, κ.α.) Ζεύγος εκκινητών που οριοθετούν την προς ανάλυση αλληλουχία (μικρού μήκους μονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια) Τριφωσφορική δεοξυ-αδενοσίνη (datp), Τριφωσφορική δεοξυ-κυτιδίνη (dctp), Τριφωσφορική δεοξυ-γουανοσίνη (dgtp), Τριφωσφορική δεοξυ-θυμιδίνη (dttp). Το μείγμα τους αναφέρεται ως dntps. Θερμοάντοχη DNA πολυμεράση Ρυθμιστικό διάλυμα και MgCl2

17 Βήμα 1: Θέρμανση στους 95 C.Τα μόρια δίκλωνου DNA αποδιατάσσονται, ενώ η DNA πολυμεράση δεν καταστρέφεται Βήμα 2: Ψύξη στους C. Οι εκκινητές (πρόσθιος και ανάστροφος) προσδένονται στις συμπληρωματικές με αυτούς περιοχές των μορίων αποδιαταγμένου (μονόκλωνου) DNA Βήμα 3: Θέρμανση στους C. Η DNA πολυμεράση επιμηκύνει τους εκκινητές προσθέτοντας σταδιακά dntps, συνθέτοντας συμπληρωματικές αλυσίδες

18 Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης PCR Θεωρητική απόδοση της PCR Στο τέλος κάθε κύκλου παράγονται τα διπλάσια μόρια αλληλουχίας στόχου από αυτά που υπήρχαν στην αρχή του κύκλου Αυτό οδηγεί στην εκθετική αύξηση των προϊόντων Ποσότητα της αλληλουχίας στόχου που παράγεται: N = 2 t (N 0 ) N: ο αριθμός των αντιγράφων στο τέλος της PCR t: ο αριθμός των κύκλων της αντίδρασης Ν 0 είναι ο αριθμός των μορίων μήτρας DNA στην αρχή της PCR Παράδειγμα Αν t=35 και N 0 =10 2 τότε N = 2 35 (10 2 ) = 6.9x10 12

19 Ανάλυση του προϊόντος της PCR με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1: Τμήματα DNA γνωστού Μεγέθους (μάρτυρας μεγεθών) 2: Αρνητικός μάρτυρας (δεν περιέχει DNA έλεγχος επιμόλυνσης) 3, 4: Προϊόντα PCR (305 νουκλεοτιδικές βάσεις, bp) 7: Θετικός μάρτυρας (περιέχει την αλληλουχία στόχο έλεγχος απόδοσης της αντίδρασης)

20 Εφαρμογές της PCR PCR ARMS (PCR Amplification-Refractory Mutation System) Ανίχνευση πολυμορφικής θέσης Ταυτόχρονη χρήση δύο ζευγών εκκινητών: Ένα εξωτερικό ζεύγος, συμπληρωματικό της φυσιολογικής αλληλουχίας και ένα εσωτερικό, στο οποίο ο ένας εκκινητής είναι συμπληρωματικός προς την φυσιολογική και ο άλλος προς την πολυμορφική θέση Με την ανάλυση των PCR προϊόντων στο πήκτωμα αγαρόζης αποτυπώνεται ο γονότυπος των ατόμων που εξετάζονται στην συγκεκριμένη πολυμορφική θέση

21 Εφαρμογές της PCR RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) Απομόνωση RNA από ιστό (ποσοτική ανίχνευση π.χ. έκφραση γονιδίου στον ιστό, ανίχνευση ιών με γονιδίωμα RNA κτλ) Μετατροπή σε cdna Πολλαπλασιασμός με αντίδραση PCR

22 Real Time PCR (SYBR green / Taqman assays) Αντίδραση PCR με ανίχνευση προϊόντων σε πραγματικό χρόνο (επιτρέπει τον ακριβή υπολογισμό της αρχικής ποσότητας RNA-ποσοτική PCR) Η ανίχνευση των προϊόντων γίνεται μέσω της φθορίζουσας χρωστικής που εκπέμπει σε συγκεκριμένο μήκος κύματος. Μπορεί να γίνει χρήση διαφόρων φθοριζουσών χρωστικών και ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών διαφορετικών PCR προϊόντων στον ίδιο κύκλο αντίδρασης

23 Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης με μικροσυστοιχίες DNA Το σύνολο των μεταγράφων που υπάρχουν σε ένα κύτταρο μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή αποτελούν το μεταγράφωμα. Ο καθορισμός των γονιδίων που εκφράζονται σε κάθε διαφορετικό ιστό ή σε δεδομένες στιγμές στη διάρκεια ζωής ενός κυττάρου είναι θεμελιώδους σημασίας για την κατανόηση των κυτταρικών λειτουργιών Οι μικροσυστοιχίες DNA χρησιμοποιούνται για τη μελέτη του προτύπου της γονιδιακής έκφρασης π.χ. κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου

24 Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης με μικροσυστοιχίες DNA Απομόνωση του συνόλου των μεταγράφων που υπάρχουν σε ένα κύτταρο μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή π.χ. κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Μετατροπή σε cdna και σήμανση με πράσινο φθοριόχρωμα (cdna αναφοράς) Απομόνωση του συνόλου των μεταγράφων που υπάρχουν στο κύτταρο στις υπόλοιπες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Μετατροπή σε cdna και σήμανση με κόκκινο φθοριόχρωμα (cdnas πειραματικά)

25 Ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης με μικροσυστοιχίες DNA Η μέτρηση της έντασης των φθοριοχρωμάτων, που παράγονται από διέγερση με ακτίνα λέιζερ επιτρέπει τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισμό της γονιδιακής έκφρασης στα διάφορα δείγματα Το κόκκινο ή το πράσινο σήμα σημαίνει ότι το συγκεκριμένο γονίδιο υπερεφράζεται στο συγκεκριμένο χρονικό σημείο αντίστοιχα Το κίτρινο σήμα σημαίνει ότι τα δύο γονίδια εκφράζονται εξίσου, ενώ το μαύρο στίγμα σημαίνει ότι το γονίδιο δεν εκφράζεται

26 Αλληλούχιση του DNA: Μέθοδος Sanger Χρήση τριφωσφορικών διδεοξυνουκλοετιδίων

27 Αλληλούχιση του DNA: Μέθοδος Sanger Χρήση τριφωσφορικών διδεοξυνουκλοετιδίων

28 Αλληλούχιση του DNA: Next-generation sequencing ή highthroughput sequencing

29 Αλληλούχιση όλου του ανθρώπινου γονιδιώματος με την προσέγγιση τυφλής στόχευσης Απομόνωση DNA γονιδιώματος και μηχανική θραύση για την δημιουργία πληθυσμού αλληλοεπικαλυπτόμενων θραυσμάτων μεγέθους περίπου 2kb Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης και απομόνωση της ζώνης των 2kb. Ενσωμάτωση σε πλασμιδιακό φορέα. Δημιουργία βιβλιοθήκης με όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα

30 Αλληλούχιση όλου του ανθρώπινου γονιδιώματος με την προσέγγιση τυφλής στόχευσης Απομόνωση DNA γονιδιώματος και δημιουργία βιβλιοθήκης με όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα

31 Αλληλούχιση όλου του ανθρώπινου γονιδιώματος με την προσέγγιση τυφλής στόχευσης Αλληλούχιση 500 νουκλ. βάσεων στα άκρα κάθε αλληλουχίας 2kb, με εκκινητές συπληρωματικούς προς τον φορέα Η τελική διάταξη των τμημάτων που έχουν αλληλουχιθεί σε σειρά γίνεται με τη βοήθεια αλγορίθμων και υπολογιστικά συστήματα. Συναρμολογούνται όλα τα επικαλυπτόμενα τμήματα που καλύπτουν τη μεγαλύτερη έκταση του γονιδιώματος. Μερικά κενά που μένουν πιθανά πρόκειται για αλληλουχίες που τυχαία δεν εκπροσωπούνται στη βιβλιοθήκη

32 Πρόγραμμα του Ανθρώπινου Γονιδιώματος (Human Genome Project, HGP) Στόχοι: Να αναγνωριστούν όλα τα γονίδια του ανθρώπου Να προσδιοριστεί η αλληλουχία των 3 δισεκατομμυρίων ζευγών βάσεων DNA, που αποτελούν το συνολικό γονιδίωμα του ανθρώπου Να αποθηκευτούν οι πληροφορίες που συλλέγονται σε δημόσιες βάσεις δεδομένων Να αναπτυχθούν εργαλεία για την ανάλυση των δεδομένων Να προσδιοριστούν τα ηθικά, νομικά και κοινωνικά θέματα που προκύπτουν από αυτή την έρευνα και τη χρήση της στον άνθρωπο Η ολοκληρωμένη αλληλουχία που προήλθε από το HGP, το 2003, κάλυψε το 99% του ανθρώπινου γονιδιώματος

33 Χρήση DNA microarrays (μικροσυστοιχιών DNA) για την ανίχνευση των μεταλλαγών Για να κατασκευαστεί μία μικροσυστοιχία DNA, τοποθετούνται ρομποτικά τα ολιγονουκλεοτίδια σε ένα μικρό γυάλινο πλακάκι. Μια επιφάνεια (1 cm 2 ) μπορεί να περιέχει εκατοντάδες χιλιάδες διαφορετικά ολιγονουκλεοτίδια. Αυτά τα ολιγονουκλεοτίδια αποτελούνται από κανονικές ακολουθίες DNA καθώς επίσης και ακολουθίες DNA που περιέχουν γνωστές μεταλλαγές που προκαλούν ασθένεια. DNA ενός ατόμου σημασμένο με φθορίζουσα ουσία υβριδοποιείται με τα ακινητοποιημένα ολιγονουκλεοτίδια στη γυάλινη πλάκα για να προσδιοριστεί εάν το DNA υβριδοποιείται με τα κανονικά ή με τα μεταλλαγμένα ολιγονουκλεοτίδια, και το σχέδιο των σημάτων υβριδοποίησης αναλύεται από έναν υπολογιστή.

34 Ανίχνευση των μεταλλαγών Η αποκωδικοποίηση του ανθρώπινου γονιδιώματος αποκάλυψε ότι δύο οποιαδήποτε άτομα διαφέρουν σε επίπεδο γονιδιώματος κατά 0.1%, ήτοι 3 εκατ. ζευγάρια βάσεων DNA περίπου Αυτή η ποικιλότητα αποτελεί τη γονιδιωματική βάση της ιδιοσυγκρασίας, η οποία μπορεί να προδιαθέτει στην εμφάνιση συγκεκριμένων ασθενειών σε κάποιους και να προστατεύει άλλους Ο γρίφος τώρα, είναι η ταυτοποίηση των γονιδίων και πολυμορφισμών που προδιαθέτουν ή προστατεύουν από την εκδήλωση ασθενειών. Η υπόσχεση είναι ότι στο μέλλον θα εφαρμόζονται ως ρουτίνα γενετικά τεστ με στόχο την ανίχνευση των προδιαθεσικών γενετικών παραγόντων, ώστε να διαπιστώνεται εγκαίρως εάν κάποιος είναι ευάλωτος σε συγκεκριμένα νοσήματα Οι εξατομικευμένες θεραπείες ακόμα δεν έχουν προχωρήσει αρκετά, όμως είναι βέβαιο πως τα επόμενα χρόνια θα εφαρμοστούν ευρύτατα. Η Μοριακή Ιατρική βαδίζει σε μια επανάσταση. Δεν το εισπράττει ακόμα ο κλινικός γιατρός, ωστόσο οι γνώσεις μας για την πρόληψη και θεραπεία διαρκώς εμπλουτίζονται

35 Αποκατάσταση γενετικών νοσημάτων μέσω γονιδιακής θεραπείας

36 Εισαγωγή φαρμάκων ή θεραπευτικών γονιδίων με λιποσώματα

37 Οι αρχές της γονιδιακής θεραπείας Η Γονιδιακή Θεραπεία αποσκοπεί στην επιδιόρθωση ή την αντικατάσταση των γονιδίων που προκαλούν γενετικές παθήσεις ή ακόμα και στην εισαγωγή φυσιολογικών γονιδίων παραπλεύρως μη φυσιολογικών (γονιδιακή ενίσχυση) σε ζωντανά κύτταρα. Το λειτουργικό αλληλόμορφο εισάγεται στα κύτταρα του προσβεβλημένου ιστού. Αυτό είναι εύκολο για ιστούς όπως το αίμα ή ο μυελός των οστών, που συλλέγονται εύκολα, υποβάλλονται σε εργαστηριακούς χειρισμούς και εγχέονται ξανά στον οργανισμό. Σε άλλους ιστούς όπως το ήπαρ, οι πνεύμονες ή ο εγκέφαλος το λειτουργικό αλληλόμορφο μεταφέρεται με ειδικά οχήματα (συνήθως ιϊκά) που παρουσιάζουν εξειδίκευση για την επιμόλυνση των συγκεκριμένων ιστών ή με λιποσώματα. Πολύ συχνά εμφανίζονται παράπλευρα δυσάρεστα συμπτώματα, όπως εμφάνιση λευχαιμιών κτλ., που οφείλονται στην ένθεση του θεραπευτικού γονιδίου σε περιοχές του γονιδιώματος που παρεμποδίζουν τη φυσιολογική λειτουργία άλλων γονιδίων Η Γονιδιακή Θεραπεία επιτρέπεται μέχρι στιγμής μόνο για τα σωματικά κύτταρα ενός ατόμου ( Σωματική Γονιδιακή Θεραπεία), αλλά όχι και για την τροποποίηση των γεννητικών κυττάρων των ανθρώπων (Θεραπεία της γεννητικής κυτταρικής σειράς), που θα μπορούσε να επηρεάσει και τις επόμενες γενεές.

38 Ασκήσεις σχετικές με την κληρονόμηση μονογονιδιακών νοσημάτων 1. Μια μορφή αχρωματοψίας (c) στον άνθρωπο προκαλείται από ένα φυλλοσύνδετο υποτελές μεταλλαγμένο γονίδιο. Μια γυναίκα με φυσιολογική όραση (c+), της οποίας ο πατέρας είχε αχρωματοψία παντρεύεται άντρα με φυσιολογική όραση, του οποίου ο πατέρας είχε επίσης αχρωματοψία. Ποιο ποσοστό των απογόνων τους θα έχει αχρωματοψία; (δώστε ξεχωριστή απάντηση για τα θηλυκά και αρσενικά άτομα) 2. Η κυστική ίνωση κληρονομείται ως αυτοσωματικό υποτελές χαρακτηριστικό. Δυο γονείς χωρίς κυστική ίνωση έχουν δύο παιδιά με κυστική ίνωση και τρία χωρίς κυστική ίνωση. Οι γονείς έρχονται για γενετική συμβουλή: α. Τι πιθανότητα υπάρχει το επόμενο παιδί τους να έχει κυστική ίνωση; β. Τα παιδιά τους που δε νοσούν ανησυχούν μήπως είναι ετερόζυγοι φορείς. Τι πιθανότητες έχει κάθε ένα από τα υγιή παιδιά της οικογένειας να είναι ετερόζυγο; 3. Η νόσος του Huntington κληρονομείται ως επικρατές αυτοσωμικό χαρακτηριστικό. Στους φορείς του χαρακτηριστικού, η ασθένεια εμφανίζεται σε ηλικία από 15 έως 65 ετών. Ο Αμερικανός τραγουδιστής Woody Guthrie πέθανε από τη νόσο του Huntington, όπως και ο ένας από τους δύο γονείς του. Στην οικογένεια της Marjorie Mazia, συζύγου του Woody, δεν υπήρχε ιστορικό για την ασθένεια. Απέκτησαν 3 παιδιά. Τι πιθανότητα υπάρχει κάποιο από τα παιδιά τους να πεθάνει από τη νόσο Huntington;

39 Ασκήσεις σχετικές με την κληρονόμηση μονογονιδιακών νοσημάτων 4. Μια γενετική ασθένεια προκαλείται από ένα αυτοσωμικό επικρατές αλληλόμορφο. Ποια από τις παρακάτω προτάσεις είναι αληθής και ποια λανθασμένη; Εξηγείστε και στις δύο περιπτώσεις α. Πατέρας που νοσεί έχει μόνο παιδιά που νοσούν. β. Μητέρα που νοσεί δεν έχει ποτέ γιους που νοσούν. γ. Αν και οι δύο γονείς νοσούν, όλοι οι απόγονοί τους νοσούν. δ. Αν ένα παιδί νοσεί, ένας από τους παππούδες ή τις γιαγιάδες του είχε την ασθένεια. 5. Γυναίκες που είναι γνωστό πως φέρουν το συνδεδεμένο με το Χ, υποτελές γονίδιο της αιμοφιλίας μελετήθηκαν για να προσδιοριστεί ο χρόνος που απαιτείται για την πήξη του αίματος. Βρέθηκε πως ο χρόνος που απαιτείται για την πήξη διέφερε σημαντικά από άτομο σε άτομο. Οι τιμές που προέκυψαν κυμαίνονται από το φυσιολογικό χρόνο πήξης στο ένα άκρο ως την κλινική αιμοφιλία στο άλλο άκρο. Ποια είναι η πιο πιθανή εξήγηση γι' αυτά τα ευρήματα;

40 Ασκήσεις σχετικές με τις μεθόδους προσδιορισμού των μονογονιδιακών νόσων 1. Το ένζυμο Tsp45I αναγνωρίζει την αλληλουχία 5'- GT(C/G)AC-3', δηλαδή το 3ο νουκλεοτίδιο μπορεί να είναι C ή G.Η θέση αυτή εμφανίζεται στο εξόνιο 4 του ανθρώπινου γονιδίου της α-συνουκλεϊνης, όμως σε μια σπάνια μορφή της νόσου Πάρκινσον καταστρέφεται λόγω μιας μεταλλαγής G προς A. α. Έστω ότι διαθέτετε κατάλληλους εκκινητές για τον πολλαπλασιασμό με PCR ενός τμήματος 200bp του εξονίου 4, το οποίο περιέχει την παραπάνω αλληλουχία. Υποθέστε πως η πολυμορφική θέση απέχει περίπου 80bp από τον δεξιό εκκινητή. Περιγράψτε τα βήματα που θα ακολουθήσετε για να προσδιορίσετε αν ένας ασθενής με Πάρκινσον φέρει αυτή τη μεταλλαγή στο γονίδιο της α-συνουκλεϊνης. β. Σε τι θα διέφεραν τα αποτελέσματα που θα παρατηρούσατε σε άτομα ομόζυγα ως προς το φυσιολογικό αλληλόμορφο από αυτά που θα παρατηρούσατε σε άτομα ομόζυγα ως προς το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο και σε ετερόζυγα άτομα; γ. Στα ετερόζυγα άτομα πώς θα μπορούσατε να ελέγξετε αν το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο εκφράζεται σε ένα συγκεκριμένο ιστό;

41 Ασκήσεις σχετικές με τις μεθόδους προσδιορισμού των μονογονιδιακών νόσων 2. Στην περίπτωση γενετικών διαταραχών που οφείλονται σε ένα μόνο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο, είναι σχετικά εύκολο να πραγματοποιηθούν ειδικές μοριακές αναλύσεις για τον προσδιορισμό του γονοτύπου ενός ατόμου. Παρ' όλα αυτά, για πολλές κοινές γενετικές διαταραχές όπως η Μεσογειακή αναιμία που οφείλεται σε μεταλλαγές της α- ή της β-σφαιρίνης, η μυϊκή δυστροφία Duchenne που προκαλείται από μεταλλαγές του γονιδίου της δυστροφίνης και η κυστική ίνωση που προκαλείται από μεταλλαγές του γονιδίου CFTR, υπάρχουν πολλά διαφορετικά αλληλόμορφα ενός γονιδίου που συνδέονται με διαφορετικούς παθολογικούς φαινότυπους. Εκ των πραγμάτων, στην περίπτωση των ασθενειών αυτών δεν επαρκούν μοριακά τεστ που εντοπίζουν μία μόνο μεταλλαγή. Προτείνετε τρόπους με τους οποίους θα μπορούσε να αντιμετωπισθεί αυτή η δυσκολία.