D5. Training course material

Transcript

1 D5. Training course material Development of novel methods for the toxicity assessment of multicomponent chemical mixtures to humans and the ecosystem (PENEK/0609/24) The Project PENEK/0609/24 is co-financed by the European Regional Development Fund and the Republic of Cyprus through the Research Promotion Foundation

2 Το Έργο ΝΕΑ ΥΠΟΔΟΜΗ/ΣΤΡΑΤΗ/0308/09 συγχρηματοδοτείται από το Ευρωπαϊκό Ταμείο Περιφερειακής Ανάπτυξης και την Κυπριακή Δημοκρατία μέσω του Ιδρύματος Προώθησης Έρευνας ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΥΓΡΩΝ ΜΗΤΡΩΝ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ Μάρλεν Ι. Βάσκες, Υποψήφια Διδάκτωρ

3 Εισαγωγή Παράκελσος ( ) All substances are poisons; there is none that is not a poison. The right dose differentiates a poison and a remedy

4 Παράγοντες που επηρεάζουν την «τοξικότητα» Τοξικότητα της ίδιας ουσίας της ουσίας σε συνδυασμό με άλλες ουσίες βιοδιαθεσιμότητα Βαθμός Έκθεσης Περίοδος έκθεσης Ευαισθησία του οργανισμού

5

6 Είδη τοξικότητας Οξεία τοξικότητα (έκθεση θ σε μεγάλες συγκεντρώσεις) Θάνατο Χρόνια τοξικότητα (έκθεση σε μικρές συγκεντρώσεις) ) Θάνατο Μεταλλάξογονιμότητα, Βλάβες στο αναπαραγωγικό σύστημα, νευροτοξικότητα, κ.α. Μικτή τοξικότητα

7 Μέθοδοι εκτίμησης τοξικότητας Διαφορετικοί οργανισμοί στην τροφική αλυσίδα Παραγωγοί Καταναλωτές 1 ης τάξης, 2 ης τάξης, 3 ης Αποικοδομητές Διαφορετικές επιδράσεις στη λειτουργία του οργανισμού (end points) Διαφορετικά κύτταρα ή μεταβολικά μονοπάτια στους οργανισμούς

8 Ενεργειακή πυραμίδα the-sea/sci-media/images/marine-trophicpyramid

9 Πλεονεκτήματα εφαρμογών βιολογικών μεθόδων Συμπληρωματικές χημικών μεθόδων Μειώνει το χάσμα μεταξύ αναλυτικών δοκιμών και περιβάλλοντος Μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την εκτίμηση κινδύνου Αρκετές φορές είναι πιο κατανοητά Εξετάζουν την ολική τοξικότητα, έστω και αν η σύσταση της μήτρας δεν μπορεί να προσδιοριστεί επακριβώς Δεν είναι χρονοβόρες ή πολύ ακριβές δοκιμές

10 Μεθοδολογία Μθδλ για την εκτίμηση οικοτοξικότητας

11 Μέθοδοι εκτίμησης τοξικότητας Πρότυποι μέθοδοι οργανισμοί (ISO, OECD, EPA) KITS με οργανισμούς (Daphtox, Microtox, Abratox, Algaltox ) Αυτόχθονα είδη - βιοδείκτες Βιοχημικές μέθοδοι (ELISA) Μοριακές μέθοδοι EC50, TU, NOEC, PNEC

12 Μεθοδολογία

13 Βιοδοκιμές σε παραγωγούς

14 Βιολογία-Οικολογία P. subcapitata (Selenastrum l t sp) Φύκος γλυκού νερού Ικανότητα φωτοσύνθεσης Αναπαραγωγή με διαίρεση ρη Εβδομαδιαία εκκίνηση νέας αποικίας Βασίλειο: Plantae Υπόφυλο: Φύκη Διαίρεση: Chlorophyta py Κλάση: Chlorophyceae Τάξη: Triceratiales Οικογένεια: Brachysiraceae Γένος: Pseudokirchneriella Είδος: P. subcapitata

15

16 Πειράματα χρόνιας τοξικότητας Διατήρηση αποικίας Επιλογή ατόμων σε εκθετική ανάπτυξη Ετοιμασία διαλυμάτων διαφόρων συγκεντρώσεων με Προσθήκη αρχικού αριθμού ατόμων cells/ml Προσθήκη ιχνοστοιχείων και βιταμινών Επώαση με έντονο φωτισμό (> 4000 lux) και ανάδευση Θερμοκρασία 24 ± 1 ºC Καταμέτρηση η πληθυσμού στις 72 και 96 ώρες Πλύσιμο και φύλαξη υαλικών Καθάρισμα πάγκων Καλό πλύσιμο χεριών

17 Burk cells

18 KITS Selenastrum capricornutum

19 Διαχείριση αποτελεσμάτων (OECD, 2006) Κριτήρια Μέσος ειδικός εγκυρότητας ρυθμός ανάπτυξης Αύξηση βιομάζας 16x (Average specific growth rate) Συντελεστής απόκλισης < 35% στο ειδικό ρυθμό ανάπτυξης στο πείραμα ελέγχου για κάθε μέρα Συντελεστής απόκλισης < 7% κάθε μέρα Απόδοση (Yield) Y = X t X 0

20 Βιολογία Οικολογία Lepidium sativum Συγγενικό είδος με τη μουστάρδα Εδώδιμο, κυρίως ως γαρνιτούρα ρ Μεγαλώνει σε υδροπονικές συνθήκες και ελάχιστα αλκαλικό περιβάλλον Βασίλειο: Plantae Φύλο: Angiosperms (unranked): Eudicots (unranked): Rosids Τάξη: Brassicales Οικογένεια: Brassicaceae Γένος: Lepidium Είδος : L. sativum

21 Πειράματα χρόνιας τοξικότητας Ετοιμασία τρυβλίων Μεταφορά Petri συγκεκριμένου Ετοιμασία αριθμού σπερμάτων διαλυμάτων Κλείσιμο τρυβλίων διαφόρων Petri Pti συγκεντρώσεων Επώαση στους 22 ºC Εμποτισμός στο σκοτάδι για 72 διηθητικού χαρτιού ώρες Επιλογή σπερμάτων Υπολογισμός φύτρωσης

22

23

24 Βιοδοκιμές σε αποικοδομητές

25 Πειράματα χρόνιας τοξικότητας Δημιουργία υγρής καλλιέργειας από καλλιέργεια σε τρυβλίο Petri Έκθεση των βακτηρίων για 16 ή 24 ώρες Μέτρηση OD σε καθορισμένο μήκος κύματος

26 KITS Vibrio fischeri

27 Έλεγχος οιστρογονικότητας με ΓΤΖ Σύνθεση β- γαλακτοσιδάσης, η οποία εξαρτάται από την παρουσία οιστργονικών ενώσεων από μεταλλαγμένο στέλεχος Saccharomyces cerevisiae Η παραγωγή προκαλεί χρωματική αλλαγή στο CPRG, η οποία υπολογίζεται χρωματομετρικά στα 540 nm

28 Στερεά εκχύλιση οργανικών ενώσεων Condition the cartridges before extraction by passing through ddh20 (2 x 3ml), methanol (2 x 3 ml) and ddh20 (2 x 3 ml) by applying a slight vacuum Elution in methanol Dry and dilution in ethanol

29

30 Διαχείριση αποτελεσμάτων Για να διορθωθεί η θολερότητα η πιο κάτων εξίσωση χρησιμοποιείται: Corrected value = OD s (540 nm) - [OD s (620 nm)-od b (620 nm)] Τα αποτελέσματα μετατρέπονται σε αντίστοιχες συγκεντρώσεις 17α-εθινυλ οιστραδιόλης χρησιμοποιώντας μια πρότυπη καμπύλη

31 Βιοδοκιμές σε καταναλωτές

32 Πρότυποι μέθοδοι Daphnia sp. Το μέγεθος είναι 5-6 mm Έχει ευρεία εξάπλωση σε γλυκά νερά (κυρίως λίμνες) 4 αναπτυξιακά στάδια (αυγό, ανώριμα στάδια 3-5, πρώιμα ώριμο στάδιο 1, ώριμα στάδια 6-22) Ζει γύρω στις 55 μέρες στους 20 C Χρειάζονται 6-10 μέρες για να ωριμάσουν σεξουαλικά Συνήθως παράγουν 6-10 αυγά σε κάθε ώριμο στάδιο Βασίλειο: Ζώα Φύλο: Αρθρόποδα Υποφύλο: Καρκινοειδή Κλάση: Βραγχιόποδα Τάξη: Cladocera στάδιο Family: Daphnidae Genus: Daphnia

33 Οικολογία Daphnia sp. Σκληρότητα μέχρι 150 mg/l (CaCO3) CO Διαλυμένο οξυγόνο άνω των 3-4 mg/l Θερμοκρασία νερού άνω των 6 C ρη 7-8 Τρέφονται με φύκη Αύξηση πληθυσμού κατά την άνοιξη Πληθυσμοί με πλειοψηφία θηλυκών ατόμων Τα αρσενικά παράγονται συνήθως όταν οι συνθήκες δεν είναι ευνοϊκές

34 Κύκλος ζωής Daphnia sp. Παρθενογένεση Σε δυσμενείς συνθήκες σεξουαλική αναπαραγωγή που παράγει ανενεργά αυγά (ephippia)

35 Βιολογία-Οικολογία A. salina Το μέγεθος είναι 8-10 mm Έχει ευρεία εξάπλωση σε αλμυρά νερά (αλυκές) 4 αναπτυξιακά στάδια (αυγό, ναύπλιο, ώριμα στάδια ~15) Ζει καλύτερα σε θερμοκρασίες από ºC Βασίλειο: Ζώα Αλατότητα μέχρι 300 Φύλο: ρη 7-8 Υποφύλο: Τρέφεται από βακτήρια και φύκη Κλάση: Τροφή για ψάρια, πουλιά Τάξη: Anostraca και έντομα Οικογένεια: Artemiidae Αρθρόποδα φ Καρκινοειδή Βραγχιόποδα Γένος: Artemia

36 Κύκλος ζωής Artemia sp.

37

38

39 Πειράματα οξείας τοξικότητας 1. Χρήση προστατευτικού 6. Μεταφορά 20 ατόμων ρουχισμού στο πείραμα ελέγχου. 2. Υπολογισμός όγκου 7. 5 στη θήκη Α-D D διαλύματος/δείγματος 8. Επώαση στους 20 ºC για να ετοιμαστούν τα για 48 ώρες ρς στο διαλύματα σκοτάδι 3. Υπολογισμός ρη, DO 9. Πλύσιμο και φύλαξη 4. Ρύθμιση αλατότητας υαλικών 5. Ετοιμασία διαλυμάτων 10. Καθάρισμα πάγκων και μεταφορά στο 11. Καλό πλύσιμο χεριών multiwell plate 0%, %, 50%, 100% Μέτρηση ακίνητων/νεκρών στις 24 και 48 ώρες

40

41 KITS Daphnia sp.

42 KITS Artemia sp.

43 Βιοδοκιμές με ανθρώπινα κύτταρα

44 Γονοτοξικότητα σε ανθρώπινα κύτταρα Μέθοδος μικροπυρήνων Εντοπισμός βλαβών κατά τη διαίρεση κυττάρων OECD, 2010

45 Μεθοδολογία Day 0 Preparatio n Day 1 Exposure Preparation of initial cultures (trypsinisation, counting) Incubation for 24 hrs in growth medium Removal of growth medium Exposure for 24 hrs to samples by adding fresh growth medium spiked with samples (Initial concentration 0.4 mg/l) Day 2 Cytokinesi sblock Removal of growth medium, double washing with PBS Exposure for 26 hrs to CytoB (Concentration 3 μg/ml) Day 3 Fixation Day 4 Staining Removal of growth medium, double washing with PBS, trypsinisation, addition of PBS to neutralize trypsin Centrifugation 170 g for 4 min at 20 C, discard supernatant and resuspension in hypotonic KCl (75 mm) Addition of Methanol/Acetate acid (25:1) (-20 C), centrifugation 170 g for 4 min at 20 C, discard supernatant and resuspension in Methanol/Acetate acid (25:1) Dispersal in microscope slides and leave to dry overnight Acidic treatment (HCl 1N) to dissolve cytoplasm proteins Neutralisation in Milli-Q water and isotonic (Weiss) solution Giemsa staining for min Fixation of cover slide

46 Διαχείριση αποτελεσμάτων Σύγκριση του αριθμού μικροπυρήνων σε πείραμα ελέγχου με τον αριθμό μικροπυρήνων στο υπό εξέταση δείγμα 000 binucleate ed cells * ** ** ** ** ** ** ** ** PL PC MN / Irradiation time [min]

47 Μεθοδολογία Μθδλ για την εκτίμηση κινδύνου

48 Όρια απόρριψης σε μεγάλους βιολογικούς σταθμούς Παράμετρος Λεμεσός Λάρνακα Πάφος, Τοξικότητα -- 75% των δειγμάτων θα πρέπει να συμμορφώνονται με τα πιο κάτω: Microtox TU50<1 και/ ή TU20<1,5 Daphnia TU50<1 Algae TU50<1 Mutatox: τα επεξεργασμένα λύματα δεν θα πρέπει να είναι θετικά στο S9 Mutatox t test t Παραλίμνι Αγία Νάπα -- TU50 = Toxicity Units = 100/EC50 EC50 = Συγκέντρωση που θα προκαλέσει επίδραση στο 50% του πληθυσμού. Υπολογίζεται στατιστικά.

49

50

51 Old pollutants, New concerns New Pollutants, t Unknown issues C. G. Daughton, Chief, Environmental Chemistry Branch, US EPA

52 Περαιτέρω βιβλιογραφία Βαλανίδης, Οικοτοξικολογία και Περιβαλλοντική Τοξικολογία Βαλανίδης, Περιβαλλοντική Χημεία και Οικοτοξικολογία. Διαχείριση Οικοσυστημάτων-Εκτίμηση Οικολογικού Κινδύνου h / / t EPA Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms Short-term term Methods for Estimating Chronic Toxicity to Freshwater Organisms Short-term term Methods for Estimating the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Marine and Estuarine Organisms EMEA