ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ: ΑΡΙΘΜ. Δ.Δ.: 3530

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΥΓΕΙΑΣ ΠΑΙΔΙΟΥ Α ΝΕΟΓΝΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΚΑΙ ΕΝΤΑΤΙΚΗ ΝΟΣΗΛΕΙΑ ΝΕΟΓΝΩΝ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΔΡΟΣΟΥ ΑΓΑΚΙΔΟΥ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ: ΑΡΙΘΜ. Δ.Δ.: 3530 ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΤΩΝ ΠΟΛΥΔΥΝΑΜΩΝ ΠΡΟΓΟΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΠΕΡΙΦΕΡΙΚΟΥ ΑΙΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΔΕΙΚΤΩΝ ΝΕΟΓΝΩΝ ΜΕ ΠΕΡΙΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΑΣΦΥΞΙΑ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΗ ΝΕΥΡΟΑΝΑΠΤΥΞΙΑΚΗ ΕΚΒΑΣΗ ΝΙΚΟΛΑΟΥ Γ. ΕΥΣΤΑΘΙΟΥ ΠΑΙΔΙΑΤΡΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2015

2 2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΣΟΥΜΠΑΣΗ ΓΡΙΒΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΟΛΙΑΚΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΖΑΦΕΙΡΙΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΣΟΥΜΠΑΣΗ ΓΡΙΒΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΟΛΙΑΚΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΖΑΦΕΙΡΙΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΔΡΟΣΟΥ ΑΓΑΚΙΔΟΥ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΙΩΑΝΝΗΣ ΤΣΑΝΑΚΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΥΡΙΑΖΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΟΣΜΑΣ ΣΑΡΑΦΙΔΗΣ, ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η έγκρισις της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως. (Νόμος 5343/32, αρθρ.202&2 καιν.1268/82,αρθρ.50&8)

3 3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ Δ. ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ

4 4

5 5 Στους γονείς μου, Γεώργιο και Ελένη, με ευγνωμοσύνη Στο Θεό για τα πάντα

6 6

7 7 Περιεχόμενα Περιεχόμενα... 7 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Προγονικά κύτταρα Εισαγωγικά Αιμοποιητικά Προγονικά Κύτταρα (HSCs, Haematopoietic stem cells) Very Small Embryonic like Stem Cells (VSELs) Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα (EPCs, endothelial progenitor cells) Μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα (MSCs, Mesenchymal Stem Cells) Νευροτροφικοί και χημειοτακτικοί παράγοντες Ερυθροποιητίνη (Erythropoietin, EPO) Iνσουλινόμορφος αυξητικός παράγων 1 (Insulin like Growth Factor 1, IGF 1) Stromal cell derived factor 1 (SDF 1 ή CXCL12) Άλλοι νευροτροφικοί παράγοντες Δείκτες εγκεφαλικής βλάβης S100b Ειδική νευρωνική ενολάση (NSE neuron specific enolase) Ενδογενής κυτταρική απάντηση μετά από εγκεφαλική βλάβη Πολλαπλασιασμός προγονικών κυττάρων Μετανάστευση προγονικών κυττάρων Διαφοροποίηση προγονικών κυττάρων Μηχανισμοί δράσης των βλαστικών κυττάρων στην εγκεφαλική βλάβη Εξωγενής χορήγηση προγονικών κυττάρων Γενικές αρχές Πειραματικές μελέτες μεταμόσχευσης προγονικών κυττάρων Κλινικές μελέτες Προγονικά κύτταρα και άλλες νευρολογικές νόσοι Περιορισμοί στη χορήγηση προγονικών κυττάρων Προβληματισμοί αποτελεσματικότητα και μέλλον των κυκλοφορούντων προγονικών κυττάρων Παθοφυσιολογία της εγκεφαλικής βλάβης Υποξική Ισχαιμική Εγκεφαλοπάθεια των τελειομήνων Ιδιαιτερότητες της εγκεφαλικής βλάβης στα πρόωρα... 69

8 8 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Μεθοδολογία Τύπος μελέτης και Πληθυσμός μελέτης Ορισμοί Εργαστηριακός έλεγχος Παρακολούθηση των νεογνών: κλινική, νευροαναπτυξιακή και απεικονιστική Στατιστική ανάλυση Αποτελέσματα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα (ΚΠΚ) Βιολογικοί δείκτες Εγκεφαλικής Βλάβης Χημειοτακτικοί / νευροτροφικοί παράγοντες Νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley III Αξιολόγηση βλαβών στη Μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου Συζήτηση Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα Βιολογικοί δείκτες Εγκεφαλικής Βλάβης Χημειοτακτικοί / νευροτροφικοί παράγοντες Νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley III και Αξιολόγηση βλαβών στη Μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου Επιφυλάξεις Περίληψη Summary Παράρτημα Α Παράρτημα Β ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

9 9 Συντομεύσεις ΑΕΦ ΒΓ ΒΠΔ ΔΚ ΝΕΚ ΚΝΣ ΚΠΚ ΠΡΕΥ ΣΑΔ ΥΙΕ aeeg BDNF bfgf CK BB ECFC EPCs eepcs lepcs ΕΡΟ GCSF GFAP GM CSF HGF HIF1a HSC IGF 1 IUGR IVH LIF MAPC MSCs NFP NGF NSC NSE PDA PVL ROP SDF 1 SVZ VEGF VSELs Αιματοεγκεφαλικός φραγμός Βάρος γέννησης Βρογχοπνευμονική δυσπλασία Διάρκεια κύησης Νεκρωτική εντεροκολίτιδα Κεντρικό Νευρικό Σύστημα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα Πρόωρη ρήξη εμβρυικών υμένων Σύνδρομο Αναπνευστικής Ανεπάρκειας Υποξική Ισχαιμική Εγκεφαλοπάθεια Amplitude integrated Electroencephalography Brain derived neurotrophic factor, νευροτροφικός παράγων προερχόμενος από τον εγκέφαλο Basic fibroblast growth factor, βασικός ινοβλαστικός αυξητικός παράγων Creatine kinase BB, κρεατινική κινάση ΒΒ Endothelial colony forming cells Endothelial progenitor cells, Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα early Endothelial progenitor cells, πρώιμα Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα late Endothelial progenitor cells, όψιμα Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα Erythropoietin, ερυθροποιητίνη Granulocyte colony stimulating factor Glial fibrillary acidic protein, νευρογλοιακή ινιδιακή όξινη πρωτεΐνη Granulocyte macrophage colony stimulating factor Hepatocyte growth factor Hypoxia inducible factor 1a, Επαγόμενος από την Υποξία Παράγοντας 1α Haematopoietic stem cells, Αιμοποιητικά Προγονικά Κύτταρα Insulin like Growth Factor 1, Ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγων 1 Intrauterine growth restriction, ενδομήτρια καθυστέρηση της αύξησης Intraventricular haemorrhage, ενδοκοιλιακή αιμορραγία leukaemia inhibitory factor, Ανασταλτικός παράγοντας της λευχαιμίας Multipotent adult progenitor cell Mesenchymal Stem Cells, Μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα Neurofilament protein, πρωτεΐνη νευρονηματίου Nerve growth factor, νευρωνικός αυξητικός παράγων Neural stem cells, νευρικά βλαστικά κύτταρα Neuron specific enolase, Ειδική νευρωνική ενολάση Patent ductus arteriosus, ανοιχτό βοτάλλειο πόρο Periventricular leukomalacia, περικοιλιακή λευκομαλακία Retinopathy of prematurity, αμφιβληστροειδοπάθεια της προωρότητας Stromal cell derived factor 1 Subventricular zone, υποκοιλιακή ζώνη (πλάγιας κοιλίας) Vascular endothelial growth factor, αυξητικός παράγοντας του ενδοθηλίου των αγγείων Very Small Embryonic like Stem Cells

10 10

11 11 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η περιγεννητική ασφυξία και η προκαλούμενη από αυτήν εγκεφαλοπάθεια αποτελεί μια από τις πιο συνήθεις αιτίες θανάτου και μακροχρόνιων νευρολογικών ελλειμμάτων (εγκεφαλική παράλυση, επιληψία, μαθησιακές δυσκολίες και νοητική υστέρηση) στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά. Η σύγχρονη θεραπεία για την εγκεφαλοπάθεια στα νεογνά είναι κυρίως υποστηρικτική, με εξαίρεση την υποθερμία, που έχει βρεθεί πως δρα νευροπροστατευτικά κυρίως στα τελειόμηνα με μετρίου βαθμού ΥΙΕ και όταν εφαρμοστεί τις πρώτες 6 ώρες της ζωής. Για τα υπόλοιπα νεογνά, που δεν ανήκουν σε αυτό το στενό πλαίσιο παρέμβασης (τελειόμηνα μεγαλύτερα των 6 ωρών και πρόωρα νεογνά), η υποστηρικτική θεραπευτική προσέγγιση έχει μικρή μόνο επίδραση στη μακροχρόνια έκβαση, με ποικίλες οικογενειακές και κοινωνικο οικονομικές συνέπειες 1. Έτσι, θεραπευτικές επιλογές που στοχεύουν στην αναγέννηση, όπως η κυτταρική μεταμόσχευση και η γονιδιακή παρέμβαση, προβάλλουν ως πιθανές λύσεις. Οι ραγδαίες εξελίξεις στην αναγεννητική ιατρική και οι αυξανόμενες γνώσεις όσον αφορά τη νευρογένεση διαφωτίζουν όλο και περισσότερο τις δυνατότητες αποκατάστασης της νευρωνικής βλάβης μετά από υποξική ισχαιμική εγκεφαλοπάθεια. Τα μέχρι στιγμής ερευνητικά δεδομένα αποκαλύπτουν πως το μέλλον της αντιμετώπισης της εγκεφαλικής βλάβης στα νεογνά είναι η αναγεννητική θεραπεία. Ειδικότερα, η εξωγενής χορήγηση προγονικών κυττάρων (progenitor/stem cells) αποτελεί πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική μετά από εγκεφαλική βλάβη. Τα προγονικά κύτταρα είναι κύτταρα αρχέγονης προέλευσης, τα οποία διαθέτουν την ικανότητα αυτο ανανέωσης και διαφοροποίησης σε ώριμα κύτταρα πολλών διαφορετικών σειρών (πολυδυναμικότητα και πλαστικότητα). Ο ρόλος τους στην εμβρυική περίοδο είναι η οργανογένεση, ενώ στην εξωμήτριο ζωή η αντικατάσταση των κυττάρων που αποπίπτουν ή νεκρώνονται και η ανάπλαση μετά από ιστική βλάβη. Τα κύτταρα αυτά σε προκλινικό επίπεδο βρέθηκαν να έχουν τη δυνατότητα να μειώσουν την έκταση της ιστικής βλάβης με τις αντιφλεγμονώδεις, ανοσοτροποποιητικές, νεο αγγειογενετικές και αναπλαστικές ιδιότητές τους. Πληθώρα μελετών σε πειραματικά μοντέλα αλλά και κλινικές μελέτες σε ενήλικες με εγκεφαλική βλάβη έχουν δείξει ευνοϊκά αποτελέσματα, ενώ μόλις πρόσφατα ολοκληρώθηκαν κλινικές μελέτες χορήγησης προγονικών κυττάρων φάσης Ι σε νεογνά με εγκεφαλική βλάβη και βρογχοπνευμονική δυσπλασία, οι οποίες έδωσαν ενδείξεις για την ασφάλεια της μεθόδου αλλά και για κλινική βελτίωση. Ωστόσο, υπάρχουν ακόμα κρίσιμα ζητήματα που αφορούν την αποτελεσματικότητα της μεθόδου, όπως ο καθορισμός του βέλτιστου κυτταρικού υποπληθυσμού προς μεταμόσχευση, της δοσολογίας, της οδού χορήγησης και του βέλτιστου χρονικού παραθύρου παρέμβασης.

12 12 Τα προγονικά κύτταρα όμως υπάρχουν εξ ορισμού και ενδογενώς στο νεογνό, τόσο τοπικά στον εγκέφαλο όσο και απομακρυσμένα στην περιφέρεια και κατ εξοχήν στο μυελό των οστών. Δεδομένων των πολλά υποσχόμενων δυνατοτήτων που έχει βρεθεί πως διαθέτουν, εύλογα ανακύπτουν τα εξής ερωτήματα: ποιος είναι ο ρόλος των κυττάρων αυτών ενδογενώς μετά από εγκεφαλική βλάβη στα νεογνά; Συμμετέχουν στην ενδογενή προσπάθεια ανάπλασης; Πώς διαφοροποιείται η συμπεριφορά τους ανάλογα με το βαθμό της βλάβης και ποια είναι η σχέση τους με την εμφάνιση νευροαναπτυξιακών προβλημάτων; Για την εύρεση απαντήσεων στα παραπάνω κρίσιμα ερωτήματα, τη διαπίστωση της παρουσίας αντιστοιχίας στα νεογνά των παρατηρήσεων που έγιναν σε πειραματικά μοντέλα, αλλά και για την πιθανή ανίχνευση βέλτιστων συνθηκών μεταμόσχευσης (βέλτιστου κυτταρικού πληθυσμού, δοσολογίας, οδού χορήγησης και χρονικού παραθύρου παρέμβασης), σχεδιάστηκε και πραγματοποιήθηκε μια κλινική μελέτη παρατήρησης σε νεογνά με εγκεφαλική βλάβη. Ειδικότερα μελετήθηκαν οι μεταβολές των νευροτροφικών παραγόντων και των ενδογενών προγονικών κυττάρων σε σχέση με τη νευροαναπτυξιακή και νευροαπεικονιστική έκβαση, ώστε να καλυφθεί εν μέρει το γνωστικό κενό ανάμεσα στην πληθώρα των πειραματικών δεδομένων και την έναρξη κλινικής χορηγήσεως προγονικών κυττάρων σε νεογνά. Θεωρήθηκε πως η μελέτη των ενδογενών μηχανισμών άμυνας και ανάπλασης θα μπορούσε να συνεισφέρει στην κατανόηση της παθοφυσιολογίας και στο σχεδιασμό νέων θεραπευτικών στρατηγικών στο μέλλον. Οι βασικοί σκοποί της παρούσας μελέτης ήταν δύο: (Α) Η διερεύνηση της παθοφυσιολογικής απάντησης του νεογνού με εγκεφαλική βλάβη όσον αφορά την αλληλουχία των μεταβολών των δεικτών της εγκεφαλικής βλάβης, των εκλυόμενων νευροτροφικών και χημειοτακτικών παραγόντων και της κινητοποίησης των προγονικών κυττάρων της περιφέρειας. (Β) Η πιθανή συσχέτιση των παραπάνω παραγόντων με τα μαιευτικά και περιγεννητικά χαρακτηριστικά, καθώς και με την κλινική και απεικονιστική έκβαση έως την ηλικία των δύο ετών. Η εκπόνηση της διδακτορικής αυτής διατριβής πραγματοποιήθηκε στην Α Νεογνολογική Κλινική του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, στο Ιπποκράτειο Γ.Ν.Θ., σε συνεργασία με το ανοσολογικό τμήμα της Πνευμονολογικής Κλινικής Α.Π.Θ. στο Παπανικολάου Γ.Ν.Θ.. Από τη θέση αυτή επιθυμώ να εκφράσω από καρδίας θερμές ευχαριστίες για την καθοριστική συμβολή στη διενέργεια της παρούσας διδακτορικής διατριβής σε όλους τους συνοδοιπόρους αυτής της προσπάθειας. Στην επιβλέπουσα της παρούσας διατριβής, στη μέντορά μου, οδηγό αλλά και συνοδοιπόρο σε όλο αυτό το ταξίδι, καθηγήτρια νεογνολογίας κα. Βασιλική Σούμπαση

13 13 Γρίβα, διευθύντρια της Β Νεογνολογικής Κλινικής Α.Π.Θ. στο Παπαγεωργίου ΓΝΘ, εκφράζω την εκ βαθέων ευγνωμοσύνη μου, γιατί αποτέλεσε για μένα πηγή έμπνευσης για το ήθος της, την αφοσίωσή της στο λειτούργημα που επιτελεί και την επιστημονική της επάρκεια. Γιατί δαπάνησε αμέτρητες πολύτιμες ώρες για να καθοδηγήσει κάθε στάδιο της παρούσας μελέτης και να συμβουλέψει με αγάπη. Ο ρόλος της ήταν τουλάχιστον καταλυτικός στην πορεία αυτή. Νομίζω πως η έκφραση «πνευματική μου μητέρα» προσπαθεί μετά βίας να συμπεριλάβει την ευγνωμοσύνη μου Βαθιά ευγνωμοσύνη εκφράζω στη διευθύντρια της Ά Nεογνολογικής Κλινικής ΑΠΘ, καθηγήτρια κα. Βασιλική Δρόσου Αγακίδου, για την αμέριστη πραγματικά συμπαράστασή της σε κάθε βήμα αυτής της προσπάθειας η οποία έλαβε χώρα στο τμήμα που διευθύνει, σε κάθε επίπεδο: ηθικό, υλικό, ακαδημαϊκό. Η επιστημονική καθοδήγησή της και οι συμβουλές που με προσέφερε συνέβαλαν αδιαμφισβήτητα καθοριστικά στη διενέργεια αυτής της μελέτης. Μα περισσότερο που περιέβαλε με αγάπη ένα νέο ερευνητή. Από καρδίας την ευχαριστώ. Στον αγαπητό καθηγητή μου, κ. Γεώργιο Κολιάκο, καθηγητή Βιοχημείας της Ιατρικής Σχολής ΑΠΘ, που μου ενέπνευσε την αγάπη για την έρευνα και με στήριξε με σταθερότητα στις απαρχές του εγχειρήματός μου, όταν εμφανίστηκαν οι πρώτες δυσκολίες. Αισθάνομαι πολύ τυχερός που τον συνάντησα στην πορεία μου αυτή. Είμαι ευγνώμων. Ευχαριστώ εκ καρδίας τον κ. Γεώργιο Κυριαζή, καθηγητή ανοσολογίας του Α.Π.Θ. στην πνευμονολογική κλινική του Γ.Ν.Θ. Παπανικολάου, στο τμήμα του οποίου διενεργήθηκαν οι κυτταρομετρήσεις και η μέτρηση του παράγοντα SDF 1. Τον ευχαριστώ για τις γνώσεις που μετέδωσε, τις συμβουλές του και τον πολύτιμο χρόνο που αφιέρωσε, πολύ δε περισσότερο για την περισσή αγάπη και φροντίδα που έδειξε κατά τη διενέργεια του εργαστηριακού μέρους της διατριβής. Ομοίως, θερμές ευχαριστίες στην ιατρό βιοπαθολόγο, διευθύντρια ΕΣΥ, κ. Όλγα Χατζηζήση, και στις τεχνολόγους ιατρικών εργαστηριών κ. Βιολέτα Κικιδάκη, Αλεξάνδρα Λιάκα και Βασιλική Τζιμούλη για την αμέριστη βοήθειά τους σε όλη αυτή την προσπάθεια. Αισθάνομαι βαθιά την ανάγκη να ευχαριστήσω τον κ. Δημήτριο Ζαφειρίου, καθηγητή παιδονευρολογίας στην Ά Παιδιατρική κλινική του Α.Π.Θ., γιατί με το ήθος και την επιστημονική του επάρκεια ενέπνευσε την αγάπη μου στην παιδιατρική νευρολογία αλλά και για την αμέριστη συμπαράστασή του από τα πρώτα μεταπτυχιακά μου χρόνια. Ο ρόλος του στην πορεία μου ήταν καθοριστικός. Τον ευχαριστώ εκ καρδίας. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον κ. Άρη Σλαβάκη, Κλινικό Βιοχημικό, Διευθυντή του Βιοχημικού Εργαστηρίου του Γ.Ν.Θ. Ιπποκρατείου, για την ουσιαστική συμβολή του στο εργαστηριακό σκέλος της διατριβής (ειδικότερα στη μέτρηση των παραγόντων S100b, NSE, EPO και IGF 1), καθώς και στην επιμελή συγγραφή των αντίστοιχων εργαστηριακών μεθόδων. Η αμέριστη συμπαράστασή του συνέβαλε καθοριστικά στη διενέργεια αυτής της μελέτης. Τον ευχαριστώ θερμά.

14 14 Στον άνθρωπο και επιστήμονα που μου δίδαξε τη γνώση στην παιδιατρική και με ενέπνευσε με τη στοργή του για το κάθε παιδί ξεχωριστά, για τις χρήσιμες συμβουλές του στην παρούσα μελέτη αλλά περισσότερο για την αγάπη του, τον κ. Ιωάννη Τσανάκα, καθηγητή παιδιατρικής παιδοπνευμονολογίας και διευθυντή της Γ Παιδιατρικής κλινικής του Α.Π.Θ., εκφράζω τη βαθιά ευγνωμοσύνη μου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον κ. Κοσμά Σαραφίδη, αναπληρωτή καθηγητή νεογνολογίας στην Α Νεογνολογική κλινική Α.Π.Θ., για την αμέριστη συμπαράστασή του καθ όλη τη διενέργεια της μελέτης. Τόσο οι χρήσιμες συμβουλές του, η επιστημονική του επάρκεια αλλά και η ηθική του συμπαράσταση σε μια επίπονη πορεία αποτέλεσαν ανεκτίμητο δώρο για μένα. Ευχαριστώ βαθιά τον κ. Δημήτριο Μπουγιουκλή, βιολόγο ειδικό στην κυτταρομετρία ροής, για την καθοριστική συμβολή του στη σχεδίαση του πρωτοκόλλου της κυτταρομετρίας και τις οδηγίες του στην εκτέλεση του πρωτοκόλλου αυτού. Εκφράζω την ευγνωμοσύνη μου γιατί με εισήγαγε και με καθοδήγησε στο γοητευτικό κόσμο της κυτταρικής βιολογίας. Ολόψυχες ευχαριστίες εκφράζω επίσης στην ακούραστη παιδίατρο κ. Κατερίνα Κάντζιου και στην εργοθεραπεύτρια κα. Ειρήνη Μιχαλέττου, για τη διενέργεια των αναπτυξιακών δοκιμασιών Bayley ΙΙΙ. Τους είμαι ευγνώμων για τις πολύτιμες ώρες που κατανάλωσαν για την εξειδικευμένη παρακολούθηση και καθοδήγηση των παιδιών. Θερμά ευχαριστώ την παιδοακτινολόγο κα. Βασιλική Δερμεντζόγλου του ακτινολογικού τμήματος του νοσοκομείου Παίδων «Η Αγία Σοφία», για την εκτίμηση των Μαγνητικών Τομογραφιών εγκεφάλου και την βαθμολόγηση του μεγέθους των βλαβών. Οι εξειδικευμένες γνώσεις της βοήθησαν σημαντικά στη μελέτη αυτή. Επίσης, εκφράζω τις ευχαριστίες μου στην κα. Άννα Μπεττίνα Χάιδιτς, επίκουρη καθηγήτρια Ιατρικής Στατιστικής στην Ιατρική Σχολή Α.Π.Θ., για τις πολυτιμότατες συμβουλές της και την εξειδικευμένη γνώση που προσέφερε αναφορικά με τη στατιστική επεξεργασία των δεδομένων. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς των παιδιών που δέχτηκαν πρόθυμα να συμπεριληφθούν στο ερευνητικό πρωτόκολλο της μελέτης.

15 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 15

16 16 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

17 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Προγονικά κύτταρα 1.1. Εισαγωγικά Τα προγονικά κύτταρα (progenitor/stem cells) είναι πολυδύναμα κύτταρα αρχέγονης προέλευσης που συμμετέχουν στην οργανογένεση κατά την εμβρυική περίοδο. Διαθέτουν την ικανότητα της αυτο ανανέωσης και της διαφοροποίησης τόσο σε ώριμα κύτταρα του ιστού προέλευσής τους όσο και σε ώριμα κύτταρα άλλων ιστών (πλαστικότητα). Πράγματι, εάν βρεθούν σε νέο περιβάλλον ή δεχτούν την επίδραση κατάλληλων αυξητικών παραγόντων μπορούν να τροποποιήσουν την κατεύθυνση διαφοροποίησής τους. Κατά την εξωμήτριο ζωή συναντώνται στην κυκλοφορία αλλά και σε διάφορους ιστούς σε κατάσταση «ηρεμίας», τόσο τοπικά στα όργανα στόχους όσο και στην περιφέρεια (κυρίως στο μυελό των οστών). Τα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα (ΚΠΚ) του αίματος και αυτά που βρίσκονται «αγκυροβολημένα» στους ιστούς βρίσκονται σε μια δυναμική ισορροπία μεταξύ τους, η οποία μπορεί να αλλάξει κάτω από ορισμένες φυσιολογικές ή παθολογικές συνθήκες. Έτσι, μετά από ιστική βλάβη τα κύτταρα αυτά κινητοποιούνται από την περιφέρεια και μεταναστεύουν προς την περιοχή της βλάβης μέσω χημειοτακτικών παραγόντων/κυτταροκινών συμμετέχοντας στην διαδικασία ανάπλασης 2 9. Μετά από ιστική βλάβη εκκρίνονται τοπικά χημειοτακτικοί παράγοντες που συνδέονται στους αντίστοιχους υποδοχείς που φέρουν τα προγονικά κύτταρα στην επιφάνειά τους (όπως για παράδειγμα ο παράγοντας SDF 1 συνδέεται στον υποδοχέα CD184/CXCR4). Το αποτέλεσμα αυτής της σύνδεσης είναι η χημειοτακτική μετανάστευση των κυττάρων αυτών προς την περιοχή της βλάβης. Αν και ο ρόλος των Κυκλοφορούντων Προγονικών Κυττάρων δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται είναι πολλαπλοί, με κυριότερους την αντιφλεγμονώδη δράση, τη νευροπροστασία, τη νεοαγγειογένεση και τη νευρογένεση Η βλάβη του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) που λαμβάνει χώρα κατά την περιγεννητική περίοδο και η εγκεφαλική παράλυση που συχνά ακολουθεί δεν είναι δυνατό να αντιμετωπισθούν ουσιαστικά με τις τρέχουσες θεραπευτικές μεθόδους και ως εκ τούτου αποτελούν στόχο της αναγεννητικής ιατρικής. Έχει δειχθεί σε ποικίλα πειραματικά μοντέλα πως μετά από εγκεφαλική βλάβη τόσο τα ενδογενή νευρικά βλαστικά κύτταρα του εγκεφάλου (neural stem cells, NSC) όσο και τα εξωγενώς χορηγηθέντα προγονικά κύτταρα (που έχουν απομονωθεί από το μυελό των οστών) συμμετέχουν σε μια διαδικασία ανάπλασης, με τα αποτελέσματα βέβαια να ποικίλουν ανάλογα με το είδος των κυττάρων που χρησιμοποιούνται, την οδό και κυρίως το χρόνο χορήγησης 6, Κρίνεται λοιπόν ουσιαστικής σημασίας να αποσαφηνιστούν οι παραπάνω παράγοντες που σχετίζονται με την αποτελεσματικότητα της θεραπείας πριν την εφαρμογή στην κλινική πράξη 17. Οι πρώτες κλινικές μελέτες μεταμόσχευσης προγονικών κυττάρων του ομφαλίου λώρου σε μεγαλύτερα παιδιά με εγκεφαλική παράλυση αλλά και σε νεογνά με βρογχοπνευμονική δυσπλασία (ΒΠΔ) ή υποξική ισχαιμική εγκεφαλοπάθεια (ΥΙΕ) δείχνουν ότι η μέθοδος είναι εφικτή και χωρίς επιπλοκές

18 18 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Στην προσιτή βιβλιογραφία δεν υπάρχουν μελέτες που να επικεντρώνονται στα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα σε σχέση με τη νεογνική εγκεφαλική βλάβη και να περιγράφουν αναλυτικά την κινητική των κυττάρων αυτών. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε με σκοπό να σκιαγραφήσει το χρονοδιάγραμμα της κινητοποίησης των ΚΠΚ στο νεογέννητο και τη σχέση των κυττάρων αυτών με χημειοτακτικούς παράγοντες μετά από εγκεφαλική βλάβη. Ιεραρχία των βλαστικών κυττάρων κατά τη διαδικασία της διαφοροποίησης Τα βλαστικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από τη δυναμικότητά τους, δηλαδή την δυνατότητα αυτοανανέωσης και διαφοροποίησης προς κύτταρα συγκεκριμένων κυτταρικών σειρών 20. Ιεραρχικά, τα κύτταρα αυτά διαχωρίζονται ανάλογα τη δυναμικότητά τους σε κύτταρα ολοδύναμα, παντοδύναμα, πολυδύναμα και μονοδύναμα. Πρακτικά, όσο τα πολύ αρχέγονα κύτταρα ωριμάζουν, αποκτούν μορφολογικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά περισσότερο εξειδικευμένων κυτταρικών σειρών (διαφοροποιούνται), αλλά ταυτόχρονα χάνουν τις ιδιότητες της πολυδυναμικότητας και στο τέλος δεσμεύονται προς μία μόνο συγκεκριμένη κυτταρική σειρά (μονοδύναμα). Παράδειγμα ολοδύναμου (totipotent) κυττάρου είναι ο ζυγώτης, από τον οποίο θα προκύψουν και το έμβρυο και ο πλακούντας. Όταν το βλαστομερίδιο φτάσει το στάδιο των 32 κυττάρων, το έμβρυο καλείται μορίδιο (morula), και τα κύτταρα του σταδίου αυτού έχουν ήδη χάσει την «ολοδυναμικότητά» τους. Θεωρούνται πλέον παντοδύναμα (pluripotent), δηλαδή μπορούν να δώσουν γένεση σε κύτταρα και των τριών βλαστικών στοιβάδων (ενδόδερμα, μεσόδερμα και εξώδερμα), αλλά όχι στην τροφοβλάστη (από την οποία προέρχεται ο πλακούντας). Από το μορίδιο θα προκύψει η βλαστοκύστη, από την έσω κυτταρική μάζα της οποίας προέρχονται τα Εμβρυονικά Βλαστικά Κύτταρα (embryonic stem cells), τα οποία είναι επίσης παντοδύναμα. Εν συνεχεία, σχηματίζονται οι τρεις βλαστικές στοιβάδες (ενδόδερμα, μεσόδερμα και εξώδερμα). Τα κύτταρα πλέον από κάθε βλαστική στοιβάδα είναι πολυδύναμα (multipotent), καθώς μπορούν να διαφοροποιηθούν μόνο προς συγκεκριμένους ιστούς, συγγενικούς μεταξύ τους. Από τα κύτταρα αυτά θα προκύψουν τέλος τα μονοδύναμα (mopotent) κύτταρα, τα οποία είναι δεσμευμένα μόνο προς ένα ιστό, μπορούν να αυτοανανεώνονται, αλλά έχουν χάσει την ικανότητα προς περαιτέρω διαφοροποίηση. Παραδείγματα αποτελούν τα δορυφόρα μυϊκά κύτταρα που βρίσκονται δίπλα στις μυϊκές ίνες και συμβάλλουν στην ανανέωση των μυϊκών κυττάρων, κύτταρα της επιδερμίδας, του ήπατος, του γαστρεντερικού βλεννογόνου κ.ά., που σκοπό έχουν την αντικατάσταση των κυττάρων που νεκρώνονται ή αποπίπτουν (εικόνα 1).

19 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 19 Εικόνα 1: Διαφοροποίηση των αρχέγονων προγονικών κυττάρων 20(τροποποίηση) VSELs: Very Small Embryonic like Stem Cells (βλ. παράγραφο 1.3) Κατά την πορεία προς τη διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων, συμβαίνουν επιγενετικές τροποποιήσεις μέσω μεθυλίωσης των σωματικών γονιδίων αποτύπωσης (somatic imprinted genes), με αποτέλεσμα τα κύτταρα να παύουν νωρίς να είναι «αθανατοποιημένα» (δηλαδή να αυτοανανεώνονται θεωρητικά επ άπειρο) και σταδιακά αποκτούν χαρακτήρες διαφοροποιημένων σωματικών κυττάρων. Αυτός είναι ένας μηχανισμός του οργανισμού για να αποτρέπεται ο ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός των κυττάρων και η δυνητική δημιουργία παθολογικών σχηματισμών, όπως το τεράτωμα. Ωστόσο η οδός της διαφοροποίησης (αρχέγονο πολυδύναμο κύτταρο > δεσμευμένο προγονικό κύτταρο > ώριμο διαφοροποιημένο κύτταρο) δε θεωρείται πλέον ότι είναι μιας κατεύθυνσης. In vitro έχει καταδειχθεί πως πολυδύναμα κύτταρα παρουσία συγκεκριμένων αυξητικών παραγόντων (όπως οι LIF leukemia inhibitory factor, bfgf basic fibroblast growth factor και kit ligand) μπορούν να υποστούν εκ νέου επιγενετικές τροποποιήσεις και να δώσουν γένεση σε πληθυσμό που έχει επανακτήσει τις αρχικές «αθανατοποιημένες» ιδιότητες 21. Αλλά και σε πειραματόζωα φάνηκε η ικανότητα διαφοροποίησης των προγονικών κυττάρων προς κύτταρα διαφορετικών κυτταρικών σειρών. Η αρχή έγινε από τους Gussoni και συν., οι οποίοι μετά από μεταμόσχευση αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων (HSCs) σε μύες που έπασχαν από Χ φυλοσύνδετη μυϊκή δυστροφία βρήκαν νέες μυϊκές ίνες θετικές στη δυστροφίνη, οι οποίες προέρχονταν από τα κύτταρα του δότη 22. Στις επόμενες παραγράφους θα περιγραφούν οι κυριότεροι προγονικοί κυτταρικοί πληθυσμοί που κυκλοφορούν στο περιφερικό αίμα και στους οποίους εστίασε η παρούσα μελέτη.

20 20 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.2. Αιμοποιητικά Προγονικά Κύτταρα (HSCs, Haematopoietic stem cells) Τα Αιμοποιητικά Προγονικά Κύτταρα είναι κύτταρα κατεξοχήν του μυελού των οστών. Αποτελούν περίπου το 0,01% των εμπύρηνων κυττάρων αυτού και συμμετέχουν στο μηχανισμό της αιμοποίησης 23 (εικόνα 2). Επίσης όμως συμμετέχουν με παρακρινή δράση στην προσπάθεια αναγέννησης μετά από ιστική βλάβη 24. Αρχικά είχε περιγραφεί πως τα κύτταρα αυτά του μυελού των οστών μπορούν να διαφοροποιηθούν προς όλες τις κυτταρικές σειρές, αργότερα όμως ανακαλύφθηκε η ύπαρξη και άλλων μη αιμοποιητικών πληθυσμών στο μυελό των οστών που εξηγούν αυτή τη πολυδυναμικότητα 25,26. Ωστόσο, φαίνεται πως τα HSCs παίζουν ρόλο και σε οποιαδήποτε ιστική βλάβη, καθώς προάγουν τη χημειοταξία, την επιβίωση και ανάπτυξη τόσο των τοπικών κυττάρων όσο και άλλων προγονικών σειρών 27. Επίσης φαίνεται πως και στην αγγειογένεση εκτός από τα προγονικά ενδοθηλιακά κύτταρα συμμετέχουν και κύτταρα που έχουν αιμοποιητικούς χαρακτήρες 28,29. Όσον αφορά τις μη αιμοποιητικές δυνατότητες των HSCs, αξιοσημείωτη είναι και η θεραπευτική χρησιμότητα της μεταμόσχευσης των κυττάρων αυτών σε μεταβολικά νοσήματα 30. Εικόνα 2: Διαφοροποίηση των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων (HSCs) προς ώριμα κύτταρα της αιμοποιητικής σειράς 23(τροποποίηση) Long term HSCs: μακράς δράσης HSCs, Short term HSCs: βραχείας δράσης HSCs

21 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 21 Κυτταρομετρία ροής Οι Machalinska και συν μελετώντας τα κύτταρα αυτά σε νεογνά βρήκαν διάμετρο περίπου διπλάσιο από τα Very Small Embryonic like Stem Cells (VSELs, βλ. παράγραφο 1.3) (περίπου μm), ενώ εξέφραζαν σε σημαντικό βαθμό ταυτόχρονα τους δείκτες CXCR4/CD184 και CD Τα κύτταρα αυτά είναι επίσης CD34 +, c Kit +, Sca 1 +, Lineage, CD41 +, Tie 2 +, CD48 +, CD150 + και CD Ρόλος Πειραματικές μελέτες Τα HSCs υπό φυσιολογικές συνθήκες ομοιόστασης βρίσκονται σε ελαττωμένους αριθμούς στο περιφερικό αίμα, ενώ έπειτα από βλάβη ανταποκρίνονται γρήγορα, αυξάνονται σε αριθμό και κινητοποιούνται από το μυελό προς τη συστηματική κυκλοφορία. Βασικό ρόλο για την αγκυροβόλησή τους στο μυελό αλλά και για την κινητοποίησή τους παίζει η κυτταροκίνη SDF 1, η οποία δρα μέσω του υποδοχέα της CD184 που βρίσκεται στην επιφάνεια των HSCs, αλλά και άλλων προγονικών κυττάρων Χορήγηση CD34 + κυττάρων ανθρώπειου ομφαλίου αίματος σε πειραματικά μοντέλα εγκεφαλικού εμφράκτου 48 ώρες μετά το συμβάν, έδειξε αύξηση στη νέο αγγειογένεση, δημιουργώντας με αυτό τον τρόπο ένα περιβάλλον ευνοϊκό για τα τοπικά εναπομείναντα κύτταρα (penumbra) αλλά και για τα προγονικά κύτταρα που θα μεταναστεύσουν εκεί είτε από γειτονικές είτε από απομακρυσμένες περιοχές 36. Επίσης, μελέτη παρατήρησης σε ποντίκια έδειξε μειωμένα επίπεδα των κυκλοφορούντων CD34 + κυττάρων σε πειραματικό μοντέλο βρογχοπνευμονικής δυσπλασίας 37, υποδηλώνοντας τον προστατευτικό ρόλο των κυττάρων αυτών στη νεογνική πνευμονική βλάβη. Κλινικές μελέτες Κλινικές μελέτες σε ενήλικες μετά από εγκεφαλικό επεισόδιο έχουν δείξει ταχεία και μεγάλη κινητοποίηση στο περιφερικό αίμα των CD34 + προγονικών κυττάρων την 7 η μέρα μετά το επεισόδιο (συγκριτικά με την 1 η μέρα) 38. Ομοίως και οι Taguchi και συν. βρήκαν αύξηση των CD34 + κυκλοφορούντων κυττάρων μετά το συμβάν, με κορύφωση την 7 η μέρα και επιστροφή στα αρχικά επίπεδα την 30 η ημέρα 39. Σε ανάλογα συμπεράσματα κατέληξαν και οι Dunac και συν., παρατηρώντας ότι το μέγεθος της κινητοποίησης συσχετιζόταν άμεσα με τη νευρολογική και λειτουργική βελτίωση των ασθενών 40. Άλλες μελέτες έχουν συσχετίσει τα μειωμένα επίπεδα CD34 + κυττάρων με την παθοφυσιολογία της χρόνιας αποφρακτικής πνευμονοπάθειας 41,42. Ανάλογα αποτελέσματα περιγράφονται και στην αθηροσκληρητική νόσο για υποπληθυσμούς των CD34 +, συμπεριλαμβανομένων των HSCs 43.

22 22 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ο κοινός παρανομαστής σε αυτές τις μελέτες είναι ότι σε οξεία νόσο οι προγονικοί πληθυσμοί αυξάνονται σε άμεση χρονική συσχέτιση ως προς τη βλάβη, ίσως σε μια προσπάθεια άμεσης ανταπόκρισης για μείωση της βλάβης και ανάπλαση. Αντίθετα, σε χρόνια νόσο τα επίπεδα των κυττάρων αυτών είναι σταθερά χαμηλά, υποδηλώνοντας τη γενικότερη αδυναμία να αναπλαστεί η ιστική βλάβη και να αποτραπεί η χρόνια νόσος. Μελέτη σε νεογνά με σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας (ΣΑΔ) έδειξε πως τα CD34 + κυκλοφορούντα προγονικά κύτταρα την πρώτη ημέρα ζωής ήταν σημαντικά περισσότερα σε αυτή την κατηγορία των νεογνών σε σχέση με τα πρόωρα χωρίς ΣΑΔ 44. Επίσης περισσότερα ήταν και στην ομάδα εκείνη των νεογνών με ΣΑΔ που εν τέλει επέζησε, ενώ μειωμένος αριθμός κυττάρων συνδυάστηκε με παρατεταμένη διάρκεια παραμονής σε τεχνητό αερισμό. Η μελέτη καταλήγει στην υπόθεση πως τα CD34 + κύτταρα πιθανώς εμπλέκονται στην ανάπλαση της πνευμονικής βλάβης στα νεογνά. Άλλη μελέτη των CD34 + κυττάρων σε πολύ πρόωρα νεογνά (μετρημένα κατά το πρώτο 48ωρο, την 7 η, 14 η και 21 η ημέρα ζωής) δεν έδειξε καμία συσχέτιση με την πνευμονική λειτουργία και την έκβαση σε ΒΠΔ 45. Επίσης η πρώτη μέτρηση κατά το πρώτο 48ωρο δε συσχετιζόταν με την ύπαρξη χοριοαμνιονίτιδας, ΠΡΕΥ, με άλλες επιπλοκές της προωρότητας ή τη θνητότητα. Άλλοι ερευνητές βρήκαν τους υποπληθυσμούς CD34 + CD133 + και CD34 + CD133 αυξημένους στα πρόωρα που εμφάνισαν επιπλοκές, όπως ΣΑΔ, ΒΠΔ, νεκρωτική εντεροκολίτιδα (ΝΕΚ) και αναιμία, αλλά αυτό το αποτέλεσμα δεν ίσχυε όταν τα δεδομένα σταθμίστηκαν για την ηλικία κύησης 46. Ομοίως, καμία συσχέτιση των υποπληθυσμών των CD34 + κυττάρων στη γέννηση με την ΒΠΔ δεν βρήκαν και οι Borghesi και συν. όταν τα αποτελέσματα σταθμίστηκαν για την ηλικία κύησης 47. Υπενθυμίζεται πως ο επιφανειακός δείκτης CD34 δεν είναι ειδικός δείκτης και απαντάται τόσο στα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα, όσο και σε άλλους πληθυσμούς (πχ VSELs, ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα). Συνεπώς οι συγκρίσεις των παραπάνω μελετών με άλλες που στοχεύουν σε πιο ειδικούς πληθυσμούς είναι μόνο έμμεσες και εκ φύσεως ασαφείς. Τελευταία υπάρχει η τάση οι κυτταρικοί πληθυσμοί να χαρακτηρίζονται με πιο ειδικό τρόπο (με συνδυασμούς περισσοτέρων επιφανειακών δεικτών και όχι μόνο με ένα δείκτη επιφανείας). Οι Kotowski και συν. βρήκαν μειωμένα επίπεδα των HSCs (CD184 + /lin /CD45 + ) στο αίμα του ομφαλίου λώρου πρόωρων νεογνών που στην πορεία εμφάνισαν ενδοκοιλιακή αιμορραγία (intraventricular haemorrhage, IVH) 46. Τα (μειωμένα) αυτά επίπεδα έμεναν σταθερά για 6 εβδομάδες, δικαιολογώντας κατά τους συγγραφείς την αδυναμία προστατευτικής δράσης των κυττάρων αυτών και την εμφάνιση επιπλοκών της προωρότητας. Οι Borghesi και συν. αναφέρουν συσχέτιση των CD34 + CD45 + προγονικών κυττάρων (που εμπεριέχουν και τον υποπληθυσμό των HSCs) στη γέννηση με την περικοιλιακή λευκομαλακία (periventricular leukomalacia, PVL), αλλά όχι με την ενδοκοιλιακή αιμορραγία 48. Ομοίως αδυναμία συσχέτισης με την IVH έδειξαν οι Paviotti και συν., μετρώντας τα CD34 + προγονικά κύτταρα την 1 η ημέρα της ζωής 49.

23 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 23 Η αδυναμία σύγκρισης των μελετών είναι προφανής, τόσο λόγω του διαφορετικού χαρακτηρισμού του πληθυσμού που μελετάται όσο και των διαφορετικών χρονικών στιγμιοτύπων που χρησιμοποιούνται. Εκτός της IVH, μειωμένα ποσοστά HSCs στο ομφάλιο αίμα συνδυάστηκαν επίσης και με την εμφάνιση ΣΑΔ και λοίμωξης, θέτοντας σύμφωνα με τους συγγραφείς τα επίπεδα HSCs ως ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα εμφάνισης των νόσων αυτών 46. Μελέτη νεογνών με αμφιβληστροειδοπάθεια της προωρότητας (retinopathy of prematurity, ROP) βρήκε αυξημένο πληθυσμό CD34 + CD45 + στη γέννηση 47, ενώ άλλη μελέτη δε βρήκε διαφορές τη 10 η εβδομάδα ζωής όσον αφορά τον lin CD184 + CD45 + πληθυσμό 31. Σχέση με τη Διάρκεια Κύησης (ΔΚ) Μελέτες σε νεογνά αναφέρουν πως μικρότερα πρόωρα εμφάνισαν περισσότερα CD34 + κύτταρα στο αίμα τους 44,45. Στη μελέτη των Bui και συν. τα CD34 + κύτταρα και οι υποκατηγορίες αυτών ήταν αυξημένα σε πρόωρα νεογνά σε σχέση με τα τελειόμηνα, μεταξύ δε των προώρων τα επίπεδά τους είχαν αντιστρόφως ανάλογη σχέση με τη διάρκεια κύησης 50. Σε ανάλογο συμπέρασμα για τα CD ,52 και τους υποπληθυσμούς αυτών (CD34 + CD133 + και CD34 + CD133 ) 46 καταλήγουν και άλλοι ερευνητές. Αντικρουόμενη αναφορά ειδικά για τον υποπληθυσμό CD34 + CD133 αναφέρουν οι Opie και συν., καθώς βρήκαν μειωμένο αριθμό κυττάρων στο εμβρυικό αίμα των προώρων νεογνών 52. Κινητική κατά την εξωμήτριο ζωή Μελέτη της κινητικής των CD34 + κυττάρων την πρώτη ημέρα ζωής έδειξε ταχεία πτώση των επιπέδων στα τελειόμηνα, ιδίως μεταξύ των 2 και 6 πρώτων ωρών ζωής, ενώ στα πρόωρα παρατηρήθηκε μια παροδική αύξηση κατά τις πρώτες 8 ώρες, προτού αρχίσει να μειώνεται ο αριθμός τους 53,54. Πιο πρόσφατη μελέτη του CD34 + πληθυσμού και υποκατηγοριών αυτού στα πρόωρα (μετρημένα την 1 η ημέρα ζωής και την 1 η, 2 η και 3 η εβδομάδα) έδειξε πτώση των επιπέδων τους κατά την εξωμήτριο ζωή 50, σε συμφωνία με προηγούμενη παρατήρηση των Paviotti και συν. για πτώση των επιπέδων στην ηλικία των 36 εβδομάδων από τη σύλληψη 49. Οι Kotowski και συν. αναφέρουν σταθερά επίπεδα των HSC (CD184 + lin CD45 + ) στις 2 και 6 εβδομάδες σε σχέση με τα επίπεδα του ομφαλίου λώρου 46. Πτώση των επιπέδων των CD34 +, CD34 + CD45 + και CD34 + CD45 υποπληθυσμών στις 48 ώρες ζωής σε σχέση με τη γέννηση και σταθερή πορεία έως τις 7 ημέρες, αναφέρουν άλλοι ερευνητές 47, ενώ οι Bizzarro και συν. αναφέρουν ταχεία μείωση των CD34 + στα πρόωρα την 1 η βδομάδα της ζωής και σταδιακότερη περαιτέρω μείωση έως την 21 η μέρα ζωής 45. Αναλυτικά οι μελέτες των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων και όλων των κυκλοφορούντων προγονικών κυττάρων στο ομφάλιο αίμα και στα νεογνά παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Τα ανωτέρω πειραματικά και κλινικά δεδομένα υποδεικνύουν πως τα HSCs παίζουν ρυθμιστικό ρόλο τόσο στην ομοιόσταση όσο και στη διαδικασία ανάπλασης μετά από ιστική βλάβη, και τα καθιστούν πολλά υποσχόμενο μέσο στη φαρέτρα της αναγεννητικής ιατρικής.

24 24 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.3. Very Small Embryonic like Stem Cells (VSELs) Τα Very Small Embryonic like Stem Cells αποτελούν πολλά υποσχόμενα πολυδύναμα κύτταρα μη αιμοποιητικής προέλευσης, που ανακαλύφθηκαν πρόσφατα στο αίμα του ομφαλίου λώρου, στο μυελό των οστών και άλλου, συμμετέχουν δε και στην οργανογένεση κατά την εμβρυϊκή ζωή 20. Ο μυελός των οστών θεωρούνταν για πολλά χρόνια ότι αποτελεί την εστία αποκλειστικά των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων. Αρχικά μελέτες θεώρησαν πως η μεγάλη δυνατότητα διαφοροποίησης των κυττάρων του μυελού προς κάθε κυτταρική σειρά, οφείλεται στην αυξημένη πολυδυναμικότητα των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων. Πρόσφατες όμως έρευνες κατέδειξαν την ύπαρξη στο μυελό και άλλων πληθυσμών προγονικών κυττάρων που δεν ανήκουν στην αιμοποιητική σειρά, τα οποία ευθύνονται εν μέρει για την «πολυδυναμικότητα» που αρχικά περιγράφηκε 25,26,55. Ερευνητές, με κυριότερους τον Ratajczak και την ομάδα του, απομόνωσαν από το μυελό αλλά και από άλλους ιστούς, όπως εγκέφαλο, νεφρούς, πάγκρεας, ήπαρ, μύες ένα σπάνιο ομοιογενή πληθυσμό κυττάρων (~0,01% των μονοπήρηνων κυττάρων του μυελού) που ονόμασαν Very Small Embryonic Like Stem Cells Τα κύτταρα αυτά εκφράζουν αρκετούς δείκτες πολυδύναμων κυττάρων (SSEA 1, Oct 4, Nanog, Rex 1 και Rif 1 telomerase protein) που χαρακτηρίζουν τα βλαστικά κύτταρα που προέρχονται από την επιβλάστη 59. Υπάρχουν σε μεγαλύτερο αριθμό σε νεαρότερα άτομα, ενώ μειώνονται με την αύξηση των επιπέδων της ινσουλίνης και των ινσουλινόμορφων αυξητικών παραγόντων 60. Υπέθεσαν ότι τα κύτταρα αυτά προέρχονται από την επιβλάστη (βλ. και εικόνα 1) και αποθέτονται κατά την πρώιμη φάση της γαστριδίωσης (gastrulation) στους αναπτυσσόμενους ιστούς, παραμένουν έως την ενήλικη ζωή στους ιστούς αυτούς και παίζουν ρόλο στη διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων που είναι δεσμευμένα προς μία κυτταρική σειρά 59. Τα VSELs λοιπόν είναι πολυδύναμα αρχέγονα προγονικά κύτταρα που βρίσκονται σε κατάσταση ηρεμίας σε διάφορους ιστούς, υπό δε την επίδραση εξωγενών ερεθισμάτων στο μικροπεριβάλλον υφίστανται επιγενετικές αλλαγές και οδηγούνται προς διαφοροποίηση σε κάποια ειδική κυτταρική σειρά 61. Η πολυδυναμικότητά τους έχει δειχθεί in vitro, καθώς μπορούν να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα και των τριών βλαστικών στοιβάδων 62,63. In vivo όμως αυτή η δυναμικότητα δεν έχει αποδειχθεί από πειράματα στα οποία τα κύτταρα αυτά εγχήθηκαν σε αναπτυσσόμενη βλαστοκύστη 20. Ωστόσο, όπως έχει φανεί και με άλλα πολυδύναμα κύτταρα προερχόμενα από την επιβλάστη, θα μπορούσαν θεωρητικά και τα VSELs κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες (επιγενετικές αλλαγές σε ιστική βλάβη) να επανακτήσουν την πρότερη δυναμικότητά τους 59,64.

25 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 25 Μορφολογία και Κυτταρομετρία ροής Καθώς αποτελούν πληθυσμό που ανακαλύφθηκε πρόσφατα, κρίνεται σκόπιμο να περιγραφούν εν συντομία τα μορφολογικά χαρακτηριστικά των VSELs. Διαθέτουν αρκετά χαρακτηριστικά των εμβρυονικών κυττάρων. Έχουν μικρό μέγεθος (διάμετρο 3 5 μm στα ποντίκια και 5 7 μm στους ανθρώπους), είναι δηλαδή μικρότερα από τα ερυθρά αλλά μεγαλύτερα από τα αιμοπετάλια 20,31,56,65. Έχουν μεγάλο πυρήνα που περιβάλλεται από λίγο κυτταρόπλασμα (υψηλό δείκτη πυρήνα προς κυττταρόπλασμα, ενδεικτικό αρχέγονης κατάστασης) και ευχρωματίνη 20. Έχουν διπλοειδικό DNA, πολλά μιτοχόνδρια και υψηλή δραστηριότητα τελομεράσης. Ξεχωρίζουν από τα μεγάλα αιμοπετάλια από την παρουσία πυρήνα και τους διαφορετικούς δείκτες επιφανείας. Τα VSELs δεν εκφράζουν τα MHC 1 και HLA DR αντιγόνα και είναι επίσης CD90, CD45, CD109 CD Αντίθετα εκφράζουν τους υποδοχείς CXCR4 (CD184), c met, CD34 και CD Ρόλος Τα VSELs έχει βρεθεί πως αποδεσμεύονται από το μυελό και κυκλοφορούν στο αίμα μετά από βλάβη ιστού ή οργάνου (πχ εγκεφαλικό έμφρακτο) 20,66. Οι παράγοντες Stromal cell derived factor 1 (SDF 1) και Hepatocyte Growth Factor (HGF) αυξάνονται στην περιοχή της βλάβης και δρουν χημειοτακτικά για τα VSELs, συνδεόμενοι στους υποδοχείς επιφανείας των κυττάρων αυτών (CXCR4 και c met(υποδοχέας κινάσης της τυροσίνης) αντίστοιχα). Τα VSELs είναι πολύ ευκίνητα και ανταποκρίνονται ταχέως στη βαθμίδωση συγκέντρωσης του SDF 1. Οι ουσίες αυτές εκκρίνονται επίσης και από τους ινοβλάστες του μυελό των οστών, επανοδηγώντας τα VSELs «πίσω» στο μυελό των οστών, όπου και παραμένουν σε κατάσταση «ηρεμίας». Κινητοποίηση των VSELs συμβαίνει επίσης και μετά από καταστάσεις stress ή με τη δράση φαρμακευτικών παραγόντων (πχ granulocyte colony stimulating factor GCSF) 66,67. Νεότερα δεδομένα καταδεικνύουν το ρόλο των κυττάρων αυτών στην προσπάθεια αναγέννησης των βεβλαμένων ιστών 68. Έτσι φαίνεται πως τα VSELs αποτελούν μια πηγή κυκλοφορούντων πολυδύναμων κυττάρων που παίζουν ρόλο στη διαφοροποίηση προς ιστικά δεσμευμένα προγονικά κύτταρα τόσο σε καταστάσεις ηρεμίας όσο και σε καταστάσεις stress ή ιστικής βλάβης. Ειδικότερα η ικανότητά τους να διαφοροποιηθούν σε κύτταρα της νευρικής σειράς δίνει ελπίδες για τη δυνατότητα τους να χρησιμοποιηθούν για ανάπλαση μετά από βλάβη στο ΚΝΣ. Η δραστηριότητα των VSELs φαίνεται πως μειώνεται με την ηλικία, γεγονός που ίσως εξηγεί την αυξημένη αναγεννητική ικανότητα στα νεαρά άτομα (τίθεται ακόμα θέμα συσχέτισής τους με τη διάρκεια ζωής των οργανισμών) 20,69.

26 26 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Πειραματικές μελέτες Τα κυκλοφορούντα VSELs βρέθηκαν αυξημένα σε πειραματικά μοντέλα εγκεφαλικού επεισοδίου σε ποντίκια 66, υποδηλώνοντας την ύπαρξη ενός ενδογενούς μηχανισμού ανάπλασης. Η έκφραση στην επιφάνεια αυτών των κυττάρων αντιγόνων που εκφράζονται στην νευρική σειρά αποτελεί ένδειξη της ύπαρξης μιας σχέσης ανάμεσα στα VSELs και τα προγονικά κύτταρα που είναι δεσμευμένα ως προς τη νευρική σειρά 60,70. Κλινικές μελέτες Τα κυκλοφορούντα VSELs βρέθηκαν αυξημένα σε ενήλικες μετά από εγκεφαλικό επεισόδιο 70,71 υποδηλώνοντας την κινητοποίησή τους από το μυελό προς το βεβλαμένο εγκέφαλο. Η κινητοποίηση είχε κοινά χαρακτηριστικά με αυτή που είχε περιγραφεί για το αντίστοιχο πειραματικό πρότυπο στα ποντίκια 66, αλλά διέφερε ως προς το χρονοδιάγραμμα αυτής: τα κύτταρα εμφάνισαν μέγιστη κινητοποίηση την 1 η ημέρα μετά το συμβάν στα ποντίκια, ενώ στους ανθρώπους την 3 η ημέρα. Τα VSELs, εκτός από το εγκεφαλικό επεισόδιο, βρέθηκαν να αυξάνονται επίσης μετά από έμφραγμα του μυοκαρδίου και σοβαρά εγκαύματα, ίσως σε μια προσπάθεια ανάπλασης της βλάβης 72,73. Μελετώντας τα κύτταρα αυτά σε νεογνά, οι Kotowski και συν. δε βρήκαν συσχέτιση των επιπέδων του ομφαλίου λώρου με οποιαδήποτε επιπλοκή της προωρότητας 46. Ομοίως και οι Machalinska και συν. δε βρήκαν συσχέτιση με την ROP τη 10 η εβδομάδα ζωής, όμως η υποομάδα των παιδιών με σοβαρή μορφή της αμφιβληστροειδοπάθειας της προωρότητας (ROP plus disease) εμφανιζε τάση για χαμηλότερα επίπεδα σε σχέση με τα υπόλοιπα νεογνά που είχαν ROP 31. Σχέση με τη διάρκεια κύησης Οι Kotowski και συν. περιγράφουν αυξημένα επίπεδα στα πρόωρα τη 2 η εβδομάδα ζωής, αλλά όχι στη γέννηση ή στις 6 εβδομάδες 46. Άλλη μελέτη βρήκε αυξημένα τα VSELs τη 10 η εβδομάδα στα πρόωρα σε σχέση με τα τελειόμηνα 31. Κινητική κατά την εξωμήτριο ζωή Οι Kotowski και συν. αναφέρουν σταθερά επίπεδα στις 2 και 6 εβδομάδες σε σχέση με τα επίπεδα του ομφαλίου λώρου 46. Στον πίνακα 1 συνοψίζονται οι μελέτες των VSELs σε νεογνά.

27 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα (EPCs, endothelial progenitor cells) Τα Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα πρωτο χαρακτηρίστηκαν το 1997 από τον Asahara ως κύτταρα ενδοθηλιακής σειράς που βρίσκονται στο μυελό και μπορούν να μεταναστεύουν σε ισχαιμικές περιοχές και να συντελούν στην νέο αγγειογένεση 74. Βρίσκονται στο περιφερικό αίμα, στο μυελό των οστών και στο αίμα του ομφαλίου λώρου και συντελούν στην αποκατάσταση της βλάβης στο αγγειακό ενδοθήλιο και στη νεοαγγείωση Η κινητοποίηση των EPCs γίνεται μέσω κυτταροκινών, ανάμεσα στις οποίες ιδιαίτερα έχει μελετηθεί η συσχέτιση με την ερυθροποιητίνη και τον VEGF 37,50. Μελέτες που συνεχώς αυξάνονται σε αριθμό δείχνουν πως τα κυκλοφορούντα EPCs πέρα από τη συμβολή τους στην ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος στο έμβρυοενδεχόμενα αποτελούν ένα καλό δείκτη της αναγεννητικής ικανότητας του αγγειακού συστήματος στην εξωμήτριο ζωή. Έτσι, σε καταστάσεις οξείας ιστικής βλάβης τα κύτταρα αυτά αυξάνονται σε αριθμό. Ας μην ξεχνάμε πως σε οποιαδήποτε ιστική βλάβη συνήθως ταυτόχρονα υφίσταται βλάβη και το αντίστοιχο τοπικό αγγειακό δίκτυο που τροφοδοτεί τους ιστούς. Αντίθετα, σε χρόνια αγγειακά νοσήματα τα κύτταρα αυτά είναι σαφώς μειωμένα, υποδηλώνοντας την αδυναμία ανάπλασης των βλαβών (τα στοιχεία αυτά περιγράφονται αναλυτικότερα παρακάτω σε αυτή την παράγραφο). Κυτταρομετρία ροής Από την πρώτη περιγραφή των EPCs το 1997 από τον Asahara 74, η ταυτότητά τους δεν έχει προσδιοριστεί επακριβώς έως και σήμερα. Η επιστημονική ερεύνα στο πεδίο αυτό είναι σε έξαρση, όπως και η ασυμφωνία των ερευνητών 75, Έτσι, υπάρχει μεγάλη δυσχέρεια στη σύγκριση των διαφόρων μελετών μεταξύ τους. Έχουν περιγραφεί οι εξής δείκτες επιφανείας στα κύτταρα αυτά: CD34, CD133 (AC133), CD31 και VEGFR2/KDR. Εν μέρει ο μεγάλος βαθμός δυσκολίας της ταυτοποίησης του προγονικού πολυδύναμου κυτταρικού πληθυσμού που ευθύνεται για την αγγειογένεση οφείλεται στο γεγονός ότι στο περιφερικό αίμα κυκλοφορούν προγονικά ενδοθηλιακά κύτταρα που βρίσκονται σε διαφορετικό στάδιο διαφοροποίησης, αλλά επίσης και ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα (που αποπίπτουν από το ενδοθήλιο των αγγείων), καθώς και ενδοθηλιακά μικροκυστίδια (κυστίδια που προέρχονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα μέσω εξωκυττάρωσης και περιέχουν δραστικές ουσίες/κυτταροκίνες). Όλα αυτά τα κύτταρα και οι σχηματισμοί μοιράζονται κοινούς επιφανειακούς δείκτες αλλά και λειτουργικές ιδιότητες. Προγονικά κύτταρα που βοηθούν στη νεοαγγειογένεση παρουσιάζονται επίσης τόσο από την αιμοποιητική (πχ τα HSCs) όσο και από την μη αιμοποιητική σειρά (όπως πχ και τα MSCs), στοιχείο που αποτελεί ένα επιπλέον αγκάθι στην προσπάθεια για ομοφωνία στο χαρακτηρισμό και την ταυτοποίηση των υπεύθυνων για την νεοαγγειογένεση κυττάρων. Παλαιότερα οι περισσότεροι ερευνητές χαρακτήριζαν ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα τα κύτταρα με τους επιφανειακούς δείκτες CD34, CD133 και KDR, σε συνδυασμούς

28 28 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ αυτών 74,81. Ωστόσο τα τελευταία χρόνια ερευνητές έχουν δείξει πως αυτά τα κύτταρα είναι μάλλον αιμοποιητικής προέλευσης αγγειογενετικά κύτταρα και τα πραγματικά EPCs βρίσκονται στην υποομάδα των CD34 + που δε φέρουν το δείκτη CD45 76,78, Έτσι, σήμερα η τάση είναι τα EPCs να θεωρούνται πως είναι CD34 +, VEGFR2 + και CD45 (ή CD45 dim/ ) 49,50,75,85,86, ενώ ο δείκτης CD133 + εκφράζει τα περισσότερο πρώιμα προγονικά κύτταρα 50,87,88. Καλλιέργειες προγονικών επιθηλιακών κυττάρων Παρόμοια δυσκολίες παρουσιάζει και ο χαρακτηρισμός των προγονικών επιθηλιακών κυττάρων μέσω καλλιεργητικών μεθόδων, καθώς τα κύτταρα όσο ωριμάζουν στις καλλιέργειες και διαφοροποιούνται προς ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα σταδιακά αλλάζουν ορισμένα αντιγόνα επιφανείας και (ετεροχρονισμένα) βιολογική συμπεριφορά. Επιπλέον καλλιεργούνται σε περιβάλλον που απέχει παρασάγγας από το περιβάλλον in vivo. Συνήθως περιγράφονται δύο ξεχωριστοί πληθυσμοί στις καλλιέργειες, τα early outgrowth EPCs (ή colony forming unit endothelial cells (CFU ECs)) και τα late outgrowth EPCs (ή endothelial colony forming cells (ECFCs)). Τα πρώτα δεν πολλαπλασιάζονται γρήγορα και θεωρείται ότι παρουσιάζουν μορφολογία και ιδιότητες αγγειογενετικών μακροφάγων/αιμοποιητικών κυττάρων, ενώ τα τελευταία πολλαπλασιάζονται ταχύτατα και παρουσιάζουν μορφολογικές και ιστολογικές ιδιότητες που χαρακτηρίζουν περισσότερο την ενδοθηλιακή σειρά. Ωστόσο και οι δυο πληθυσμοί ενδεχόμενα να σχετίζονται με τη διαδικασία της νέο αγγειογένεσης 28,29. Ο αριθμός και η ταχύτητα πολλαπλασιασμού των ECFCs είναι μεγαλύτερη όταν τα κύτταρα αυτά απομονωθούν από πρόωρα νεογνά, λιγότερο από τελειόμηνα και ακόμα λιγότερο από ενήλικες. Επίσης τα κύτταρα των προώρων νεογνών είναι περισσότερο ευάλωτα στην υπεροξία, ενώ προστατεύονται κατόπιν θεραπείας με αντι οξειδωτικούς παράγοντες 89. Τέλος, είναι αξιοσημείωτο ότι δεν έχει δειχθεί άμεση συσχέτιση των ενδοθηλιακών προγονικών κυτταρικών πληθυσμών που καλλιεργούνται με αυτούς που μετρώνται στην κυτταρομετρία ροής. Τα ECFC (Endothelial colony forming cells) κύτταρα των καλλιεργειών ανήκουν μάλλον στον CD34 + CD45 πληθυσμό 47,89. Ρόλος Πειραματικές μελέτες Πειραματικά μοντέλα έχουν δείξει πως μετά από εγκεφαλική αιμορραγία η ακεραιότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (ΑΕΦ) διασπάται 90. Ως εκ τούτου, η μετανάστευση λευκοκυττάρων και άλλων κυττάρων φλεγμονής προς τον εγκέφαλο αυξάνεται. Η ικανότητα των EPCs να αποκαθιστούν τη διαταραχή στην ακεραιτότητα του ΑΕΦ επηρεάζει άμεσα την πορεία των παθοφυσιολογικών γεγονότων μετά από εγκεφαλική βλάβη. Ωστόσο το πεδίο αυτό δεν έχει μελετηθεί εκτενώς. Μειωμένα επίπεδα EPCs έχουν παρατηρηθεί σε πειραματικά μοντέλα ΒΠΔ, υποδηλώνοντας συσχετισμό των κυττάρων αυτών με την φυσιολογική ανάπτυξη των

29 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 29 πνευμόνων στο έμβρυο και νεογνό, αλλά και την αρνητική επίπτωση της υπεροξίας στα κύτταρα αυτά με αποτέλεσμα την εμφάνιση της νόσου 37,91. Η χορήγηση ερυθροποιητίνης, που προάγει την κινητοποίηση των EPCs, σε αυτό το πειραματικό μοντέλο οδήγησε σε μείωση της πνευμονικής βλάβης, ενισχύοντας την υπόθεση για το ρόλο των κυττάρων αυτών στη διαδικασία ανάπλασης 92,93. Αλλά και σε πειραματικά μοντέλα που προσομοιώνουν αγγειακή βλάβη τύπου ενήλικα, έχει φανεί αύξηση των EPCs που σχετίζεται με τη νεοαγγειογένεση στην καρδιά 94 96, στον αμφιβληστροειδή 97, και τον εγκέφαλο 98. Κλινικές μελέτες Τα EPCs βρίσκονται σε πολύ μικρούς αριθμούς στο περιφερικό αίμα υγιών ενηλίκων, ενώ βρίσκονται σε ακόμα μικρότερα ποσοστά σε καταστάσεις με χρόνιες ενδοθηλιακές βλάβες, όπως στεφανιαία νόσο, υπέρταση, σακχαρώδη διαβήτη, γήρανση, κάπνισμα και υπερχοληστερολαιμία Στις μελέτες αυτές ο μειωμένος αριθμός των κυκλοφορούντων EPCs περιγράφεται ως δείκτης κινδύνου για τις περιγραφόμενες ασθένειες. Αντίθετα σε οξείες καταστάσεις, όπως το οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου 105,106, η σοβαρή σήψη 107 και η πνευμονία, παρατηρούνταν αύξηση αυτών των κυττάρων και ο αριθμός τους συσχετίζονταν με τη θετική έκβαση 106, Ειδικότερα, στο οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου παρατηρούνταν βελτίωση ανατομική και λειτουργική όταν τα κυκλοφορούντα ενδοθηλιακά κύτταρα ήταν αυξημένα ή με μεγαλύτερη ικανότητα για διαφοροποίηση 111,112. Ανάλογες ήταν και οι παρατηρήσεις μετά από εγκεφαλικό έμφρακτο 39. Μελετώντας νεογνά που εμφάνισαν IVH, οι Safronow και συν. βρήκαν οριακά αυξημένα επίπεδα των EPCs στο ομφάλιο αίμα 87. Επίσης, οι Strauss και συν. περιγράφουν αυξημένα επίπεδα RNA ενδοθηλιακών δεικτών σε νεογνά με αυξημένη ηχογένεια στο υπερηχογράφημα εγκεφάλου και σε IVH 113, ενώ άλλοι ερευνητές δεν εντόπισαν παρόμοια σχέση 47,49. Μειωμένα επίπεδα ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων βρέθηκαν τόσο στον ομφάλιο λώρο 47,85 όσο και στο περιφερικό αίμα κατά τη διάρκεια των 3 πρώτων εβδομάδων ζωής 50 σε πρόωρα νεογνά που στην πορεία ανέπτυξαν ΒΠΔ, ενώ τέτοια συσχέτιση δε βρήκαν οι Pavioti και συν 49. Οι τελευταίοι ερευνητές δε βρήκαν συσχέτιση με την πνευμονική λειτουργία εν γένει (ΒΠΔ, διάρκεια μηχανικού αερισμού ή εξάρτησης από το Ο 2, χορήγηση επιφανειοδραστικού παράγοντα) ούτε στη γέννηση ούτε και την 36 η εβδομάδα από τη σύλληψη. Αντίθετα οι Borghesi και συν. περιγράφουν την «προστατευτική» δράση των υψηλότερων επιπέδων των ECFC (Endothelial colony forming cells) στη γέννηση όσον αφορά τη διάρκεια του μηχανικού αερισμού και των αναγκών σε Ο Από τις μελέτες αυτές διαφαίνεται η προστατευτική (αλλά και προγνωστική) αξία των κυττάρων αυτών ήδη από την 1 η ημέρα ζωής όσον αφορά την εξέλιξη της πνευμονικής βλάβης σε ΒΠΔ. Σε αρκετές μελέτες τα επίπεδα στον ομφάλιο λώρο βρέθηκαν μειωμένα σε παθολογικές καταστάσεις κατά την κύηση, όπως διαβήτης και προεκλαμψία 85, Σε καταστάσεις που

30 30 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ το κοινό τους υπόβαθρο είναι το αυξημένο stress, όπως η χοριοαμνιονίτιδα, η σήψη, η νεκρωτική εντεροκολίτιδα (ΝΕΚ), η ROP, το χαμηλό Apgar score και ο κολπικός τοκετός, τα επίπεδα των EPCs είναι αυξημένα, ενώ ελαττωμένα περιγράφονται σε αιμοδυναμικά σημαντικό ανοιχτό βοτάλλειο πόρο (patent ductus arteriosus, PDA) και μετά από διασωλήνωση 31,49,50,85,87. Αντίθετα, οι Borghesi και συν. δε βρήκαν καμία συσχέτιση των κυττάρων αυτών στο ομφάλιο αίμα με μαιευτικά ή περιγεννητικά χαρακτηριστικά (προγεννητική χορήγηση στεροειδών, φύλο, υπέρταση, καισαρική τομή, πολλαπλή κύηση, SGA, χοριοαμνιονίτιδα, αριθμός λευκών αιμοσφαιρίων στη γέννηση) 47. Άλλοι ερευνητές μελετώντας από άλλη οπτική γωνία, διερεύνησαν την 1 η ημέρα ζωής την «προγνωστική» δυνατότητα των κυττάρων αυτών ως προς την ανάπτυξη επιπλοκών της προωρότητας, όμως δε βρήκαν σημαντική συσχέτιση όσον αφορά την IVH, ΝΕΚ, PDA, ROP ή σήψη 47,49. Σχέση με τη διάρκεια κύησης Μελέτες των ενδοθηλιακών προγονικών σειρών στο ομφάλιο αίμα πρόωρων νεογνών έδειξαν παρόμοια 117 ή αυξημένα επίπεδα 87,89 σε σχέση με το ομφάλιο αίμα τελειομήνων νεογνών. Ωστόσο άλλη μελέτη δε βρήκε διαφορά στα επίπεδα την πρώτη ημέρα ζωής μεταξύ προώρων και τελειομήνων, καθώς και απουσία συσχέτισης με την διάρκεια κύησης εν γένει 50. Όσον αφορά τα ECFC (Endothelial colony forming cells), μελέτες αναφέρουν μικρότερα ποσοστά σε μικρότερες ηλικίες κύησης(θετική συσχέτιση) 47,117, ενώ αντίθετα αρνητική (μελετώντας βέβαια λίγο μεγαλύτερα πρόωρα νεογνά) ή καμία συσχέτιση βρήκαν οι Baker και συν 85,89. Κινητική κατά την εξωμήτριο ζωή Οι Bui και συν. δε βρήκαν διαφορές στα επίπεδα των EPCs στα πρόωρα κατά τη διάρκεια των τριών πρώτων εβδομάδων ζωής 50. Παρομοίως, οι Paviotti και συν. βρήκαν σταθερά (ή και ελαφρώς αυξημένα) επίπεδα των EPCs σε πρόωρα όταν έφταναν σε ηλικία 36 εβδομάδων από τη σύλληψη σε σχέση με την 1 η ημέρα ζωής 49. Κρίνεται αναγκαίο να τονιστεί ότι δεδομένου πως α) σε όλες αυτές τις μελέτες τα εν δυνάμει «EPCs» χαρακτηρίζονται με πολύ διαφορετικούς δείκτες, και β) δεν υπάρχει σταθερή συσχέτιση των ECFCs που αναπτύσσονται σε κυτταρικές καλλιέργειες με τα κύτταρα που μελετώνται με κυτταρομετρία ροής 87, η ουσιαστική σύγκριση των μελετών δεν είναι δυνατή. Ο πίνακας 1 συνοψίζει τα αποτελέσματα των μελετών των EPCS και όλων των κυκλοφορούντων προγονικών κυτταρικών σειρών που έχουν μελετηθεί σε νεογνά.

31 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 31 Προγονική Κυτταρική Σειρά CD34+ KDR+ (VEGFR2+) CD34+ CD133+ VEGFR KDR+ Πίνακας 1: Σύνοψη των μελετών των κυκλοφορούντων προγονικών κυτταρικών που διενεργήθηκαν σε νεογνά, ταξινομημένες με βάση τον μελετώμενο κυτταρικό υποπληθυσμό Μελέτη Πληθυσμός Σχέση Άλλο μελέτης με ΔΚ Paviotti 36 πρόωρα (2011) 49 (<28w) Bui 45 πρόωρα (2013) 50 (<37w) Baker 26 πρόωρα (2009) 89 (28 35w) 24 τελειόμηνα Borghesi (2013) πρόωρα (<32w) Paviotti 36 πρόωρα (2011) 49 (<28w) Borghesi 98 πρόωρα (2009) 47 (<32w) Borghesi (2013) πρόωρα (<32w) Baker 26 πρόωρα (2009) 89 (28 35w) 24 τελειόμηνα Paviotti 36 πρόωρα (2011) 49 (<28w) Ηλικία κατά τη δειγματοληψία 1d 36w PMA 1d 1w 2w 3w ΟΑ 1d 7d 28d 1d 36w PMA Πρώτες 3h 48h 7d 1d 7d 28d Αυξημένα επίπεδα στα πρόωρα (vs τελειόμηνα) Σχέση με εξωμήτ ριο ηλικία Ναι ( 1d) Όχι Σταθερά επίπεδα Ναι ( 1d) Όχι Αρνητι κή συσχέτ ιση (1d) Θετική συσχέτ ιση την 21d (σε σχέση με 1d) Οριακά την 1w & 2w Σταθερά επίπεδα (ή λίγο ) Σχέση με ΒΓ Όχι Θετική συσχέτ ιση Σχέση με ΒΠΔ Όχι (1d, 36w PMA) ΟΑ Όχι Όχι 1d 36w PMA Baker 26 πρόωρα ΟΑ Όχι Θετική συσχέτ ιση Σταθερά επίπεδα Θετική συσχέτ ιση Όχι Σχέση με IVH Όχι (1d) Καμία συσχέτιση την 1d με: o ΝΕΚ o ROP o σήψη o Θάνατο o Δείκτες πνευμονικής λειτουργίας (διάρκεια μηχανικού αερισμού/εξάρτησης στο Ο 2, ΕΔΠ) την 1d σε αιμοδυναμικά σημαντικό PDA Όχι Όχι Καμία συσχέτιση την 1d με: (1d, 36w (1d) o ΝΕΚ PMA) o ROP o σήψη o Θάνατο o Δείκτες πνευμονικής λειτουργίας (διάρκεια μηχανικού αερισμού/εξάρτησης στο Ο 2, ΕΔΠ) την 1d σε αιμοδυναμικά σημαντικό PDA Όχι Όχι Καμία συσχέτιση με ΝΕΚ Όχι Όχι (1d, 36w PMA) Όχι (1d) Καμία συσχέτιση την 1d με: o ΝΕΚ o ROP o σήψη o Θάνατο o Δείκτες πνευμονικής λειτουργίας o (διάρκεια μηχανικού αερισμού/εξάρτησης στο Ο2, ΕΔΠ) την 1d σε αιμοδυναμικά σημαντικό PDA

32 32 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ CD34+ CD45 VEGFR2+ CD34+ CD45 CD133+ VEGFR2+ CD34+ CD117+ VEGFR2+ CD34+ CD117 VEGFR2+ VEGFR2+ CD34+ CD45 /dim CD31+ Λόγος: [CD /dim 133+] / [ /dim 133 ] CD34+ CD133+ CD144+ (early EPCs) CD34+ CD133 CD144 + (late EPCs) (2009) 89 (28 35w) 24 τελειόμηνα Bui 45 πρόωρα (2013) 50 (<37w) Borghesi (2013) πρόωρα (<32w) Borghesi 98 πρόωρα (2009) 47 (<32w) Borghesi 98 πρόωρα (2009) 47 (<32w) Baker 26 πρόωρα (2009) 89 (28 35w) 24 τελειόμηνα Baker 62 πρόωρα (2012) 85 (24 36w) Baker 62 πρόωρα (2012) 85 (24 36w) Safranow 90 πρόωρα (2012) 87 (23 36w) 52 τελειόμηνα Machalin ska (2010) πρόωρα (<33w) 30 τελειόμηνα Safranow 90 πρόωρα (2012) 87 (23 36w) 52 τελειόμηνα 1d 1w 2w 3w 1d 7d 28d Πρώτες 3h 48h 7d Πρώτες 3h 48h 7d ΟΑ Όχι (1d) Όχι Όχι (σχεδόν μη ανιχνεύσιμ α για 3w) στα τελειόμη να (>πρόωρα) Θετική συσχέτ ιση ΟΑ Όχι ΟΑ Όχι Όχι ΟΑ 2w 6w Ναι (ΟΑ) Αρνητική συσχέ τιση σε πρόωρ α <30w πρόωρα: την 2w & 6w (έως να φτάσουν στα επίπεδα των τελειομή νων) τελειόμη να: σταθερά επίπεδα Όχι Τάση για σε: o Χοριοαμνιονίτιδα o Λοιμώξεις (χωρίς στατιστική σημαντικότητα): o μετά την αποδέσμευση από τον αναπνευστήρα o ΝΕΚ o σε τελειόμηνα με αναπνευστική δυσχέρεια Όχι Όχι Καμία συσχέτιση με ΝΕΚ Όχι * Όχι Καμία συσχέτιση με ΝΕΚ [* στις 3h, αλλά καμία συσχέτιση μετά από στάθμιση για ΔΚ] Όχι την 6w σε: o Λοιμώξεις (τάση) o ΣΑΔ o Μεταγγίσεις Αρνητική συσχέτιση με Apgar score (στα πρόωρα) στα αγόρια Καμία συσχέτιση (ΟΑ) με ΣΑΔ, ROP, ΒΠΔ & λοιμώξεις [θετική συσχέτιση που χάνεται μετά από στάθμιση για ΔΚ] 10w Ναι σε ROP ΟΑ 2w 6w Ναι (ΟΑ) Αρνητική συσχέ τιση σε πρόωρ α πρόωρα: στις 2w & 6w (έως να φτάσουν τα επίπεδα των τελειομή Όχι (τάσ η) Αρνητική συσχέτιση με Apgar score (στα πρόωρα) σε: o Καισαρική τομή o ΣΑΔ

33 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 33 CD VEGFR2+ ECFCs RNA γονιδίων που εκφράζονται σε αιμοενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (AC133, Tie 2, Flk 1 (VEGFR2), Scl/Tal1) CD34+ Borghesi 98 πρόωρα (2009) 47 (<32w) Baker 62 πρόωρα (2012) 85 (24 36w) Baker 26 πρόωρα (2009) 89 (28 35w) 24 τελειόμην α Borghesi 98 πρόωρα (2009) 47 (<32w) Ligi (2011) πρόωρα 25 τελειόμηνα Javed 39 πρόωρα (2008) 117 (24 37w) και τελειόμηνα Strauss (2009) πρόωρα (<34w) Borghesi 98 πρόωρα (2009) 47 (<32w) Πρώτες 3h 48h 7d <30w νων) τελειόμη να: σταθερά επίπεδα Θετική συσχέτ ιση Όχι * ΟΑ Όχι Όχι (ΟΑ) λόγος 133+/ 133 Καμία συσχέτιση στον απόλυτο αριθμό Όχι [* στις 3h, αλλά καμία συσχέτιση μετά από στάθμιση για ΔΚ] σε: o Χοριοαμνιονίτιδα o Κολπικό τοκετό Καμία συσχέτιση σε: o μεταξύ προγραμματισμένης & επείγουσας ΚΤ o προγεν χορήγηση κορτικ/ειδών o Προεκλαμψία (, αλλά όχι στατιστικά σημαντικό) ΟΑ Ναι Καμία συσχέτιση με: o CD45 CD34+CD133+VEGFR2+ o CD34 + CD45 ΟΑ ΟΑ OA d3 5 d10 15 d30 Πρώτες 3h 48h Θετική συσχέτ ιση Θετική συσχέτιση Μειωμένα στις 48h Θετική συσχέτ ιση και στην υποομάδα με ΔΚ <28w Όχι (τάση) Καμία συσχέτιση σε: o προγεν χορήγηση κορτικ/ειδών o Σήψη o Φύλο o PDA o Προεκλαμψία o Τρόπος τοκετού o Πολλαπλή κύηση o SGA o Χοριοαμνιονίτιδα o WBC (την 1d) o Άλλα μαιευτικά /περιγεννητικά χαρακτηριστικά o CD34+ υποομάδες Αρνητική συσχέτιση με: o διάρκεια χορήγησης o σε: o o Ο 2 διάρκεια μηχανικού αερισμού υπερηχογένεια εγκεφάλου Χοριοαμνιονίτιδα (τάση) σε: o BPD o ROP o Αιμαγγειώματα δέρματος

34 34 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Bui 45 πρόωρα (2013) 50 (<37w) Paviotti 36 πρόωρα (2011) 49 (<28w) Qi 41 πρόωρα (2010) 44 με ΣΑΔ 20 πρόωρα μάρτυρες 14 τελειόμηνα μάρτυρες 7d 1d 1w 2w 3w 1d 36w PMA 1d ΟΑ (1d) Αρνητική συσχέτιση (1d) Σταθερά στις 7d (ίδια επίπεδα με 48h) Ναι (1d) Όχι Όχι Όχι (1d, 36w PMA) στα τελειόμη να (>πρόωρα) Αρνητική συσχέτιση Όχι (1d) Όχι σε: o o Καμία συσχέτιση την 1d με: o ΝΕΚ o ROP o σήψη o Θάνατο o Δείκτες πνευμονικής λειτουργίας (διάρκεια μηχανικού αερισμού/ εξάρτησης στο Ο 2, ΕΔΠ) ΣΑΔ Επιζήσαντες με ΣΑΔ Αρνητική συσχέτιση με: o διάρκεια μηχανικού αερισμού o ηλικία αιμοληψίας (σε ώρες) Καμία συσχέτιση με WBC Bizzaro 30 πρόωρα (2007) 45 (24 32w) Li (2001) 54 (CD34+ και υποπλη θυσμοί τους: CD33+, CD71+, CD62L+, CD49d+) Πρώτες 48h 7d 14d 21d 9 πρόωρα 2h (<37w) 4h 11 τελειό μηνα 8h 6h 24h 48h Αρνητι κή συσχέτ ιση Baker 26 πρόωρα (2009) 89 (28 35w) 24 τελειόμηνα Αρνητική συσχέτιση Μειώνονται γρήγορα τις πρώτες 7d, και αργά έως την 21d Τελειόμη να: ταχεία πτώση, ιδίως τις πρώτες 2 6h Πρόωρα: αυξήθηκ αν τις πρώτες 8 ώρες και εν συνεχεία μειώθηκ αν Όχι Καμία συσχέτιση (σε όλα τα χρονικά στιγμιότυπα) με: o Θάνατο o Δείκτες πνευμονικής λειτουργίας (διάρκεια μηχανικού αερισμού/ εξάρτησης στο Ο 2, ΒΠΔ) Καμία συσχέτιση (48h) με: o Χοριοαμνιονίτιδα o ΠΡΕΥ o CRIBscore o Άλλη νοσηρότητα Συσχέτιση με WBC (48h)

35 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 35 CD34+ CD45+ CD34+ CD45 CD184+ lin CD45+ (HSCs) CD133+ CD34+ CD133+ Li (1999) τελειόμηνα Opie Εμβρυικό (1998) 52 αίμα από 10 έμβρυα 21w και 12 έμβρυα 39 εβδομάδων Borghesi 98 πρόωρα (2009) 47 (<32w) Bui 45 πρόωρα (2013) 50 (<37w) Borghesi 98 πρόωρα (2009) 47 (<32w) Kotowski 90 πρόωρα (2012) 46 (33w±3) 52 τελειόμηνα Machalin ska (2010) πρόωρα (<33w) 30 τελειόμηνα Paviotti 36 πρόωρα (2011) 49 (<28w) Baker 26 πρόωρα (2009) 89 (28 35w) 24 τελειόμηνα Kotowski 90 πρόωρα (2012) 46 (33w±3) 52 τελειόμηνα 2h 4h 6h 8h 24h 48h Πρώτες 3h 48h 7d 1d 1w 2w 3w Πρώτες 3h 48h 7d Αρνητι κή συσχέτ ιση Αρνητι κή συσχέτ ιση Ναι (1d) Όχι Όχι ταχεία πτώση (70% πτώση στις 48h σε σχέση με τις 2h), ιδίως τις πρώτες 4h Μειωμέν α στις 48h Σταθερά στις 7d (ίδια επίπεδα με 48h) Αρνητι Μειωμέν κή α στις συσχέτ 48h ιση Σταθερά στις 7d (ίδια επίπεδα με 48h) Όχι (ΟΑ) Όχι Σταθερά επίπεδα Όχι * Όχι (3h)σε: o ROP o PVL Καμία συσχέτιση με ΝΕΚ [* στις 3h, αλλά καμία συσχέτιση μετά από στάθμιση για ΔΚ] Όχι Όχι Καμία συσχέτιση με ΝΕΚ ΟΑ Όχι (ΟΑ) σε: 2w 6w (ΟΑ) ΣΑΔ Λοίμωξη Οποιαδήποτε νοσηρότητα (ως σύνολο) Αναιμία (αλλά καμία συσχέτιση μετά από στάθμιση για ΔΚ) 10w Καμία συσχέτιση με ROP 1d 36w PMA ΟΑ ΟΑ 2w 6w Όχι Ναι (OA) Όχι όχι Όχι (d1, 36 w PMA) Αρνητι κή συσχέτ ιση πρόωρα: στις 2w & 6w (έως να φτάσουν Όχι Όχι * όχι Καμία συσχέτιση την 1d με: o ΝΕΚ o ROP o σήψη o Θάνατο o Δείκτες πνευμονικής λειτουργίας (διάρκεια μηχανικού αερισμού/ εξάρτησης στο Ο 2, ΕΔΠ) [*Καμία συσχέτιση με ΣΑΔ, ΒΠΔ & ΝΕΚ μετά από στάθμιση για την ΔΚ]

36 36 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ CD34+ CD133 CD184+ lin CD45 (VSELs) CD34+ lin Paviotti 36 πρόωρα (2011) 49 (<28w) Baker 26 πρόωρα (2009) 89 (28 35w) 24 τελειόμηνα Kotowski 90 πρόωρα (2012) 46 (33w±3) 52 τελειόμην α 1d 36w PMA ΟΑ ΟΑ 2w 6w Opie Εμβρυικό (1998) 52 αίμα από 10 έμβρυα 21w και 12 έμβρυα 39 εβδομάδων Kotowski 90 πρόωρα ΟΑ (2012) 46 (33w±3) 2w 52 τελειόμηνα 6w Machalin ska (2010) πρόωρα (<33w) 30 τελειόμηνα Opie Εμβρυικό (1998) 52 αίμα από 10 έμβρυα 21w και 12 έμβρυα 39 εβδομάδων στα τελειόμη να (>πρόωρα) Ναι (ΟΑ) τα επίπεδα των τελειομή νων) τελειόμη να: σταθερά επίπεδα Όχι Όχι Όχι (1d, 36w PMA) Αρνητι κή συσχέ τιση σε πρόωρ α <30w Θετική συσχέτ ιση πρόωρα: στις 2w & 6w (έως να φτάσουν τα επίπεδα των τελειομή νων) τελειόμη να: σταθερά επίπεδα Όχι Όχι * Όχι Καμία συσχέτιση την 1d με: o ΝΕΚ o ROP o σήψη o Θάνατο o Δείκτες πνευμονικής λειτουργίας (διάρκεια μηχανικού αερισμού/ εξάρτησης στο Ο 2, ΕΔΠ) [*Καμία συσχέτιση με ΣΑΔ, ΒΠΔ & ΝΕΚ μετά από στάθμιση για την ΔΚ] (OA) Όχι σταθερά Όχι Καμία συσχέτιση (ΟΑ) με: (τάση) επίπεδα ρόωρα o ΣΑΔ : o Λοίμωξη (2w) Αρνητι o Αναιμία κή o Οποιαδήποτε νοσηρότητα συσχέτ (ως σύνολο, ιση συμπεριλαμβανομένης της ΒΠΔ, ΝΕΚ & ROP) 10w Ναι Καμία συσχέτιση με ROP στη ROP(+) (σε σχέση με ROP) (τάση) Θετική συσχέτ ιση

37 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα (MSCs, Mesenchymal Stem Cells) Τα μεσεγχυματικά κύτταρα πρωτο περιγράφηκαν από τον Friedenstein και συν. το Έχουν απομονωθεί από το μυελό των οστών, το λιπώδη ιστό, τον ομφάλιο λώρο, το περιφερικό αίμα, τον οδοντικό πολφό, τον περιαγγειακό χώρο (ακόμα και στον εγκέφαλο) και σε άλλους ιστούς του μεσοδέρματος 121. Ποικίλες μελέτες έχουν δείξει την ικανότητα διαφοροποίησης των MSCs σε οστεοβλάστες, ινοβλάστες, χοδροβλάστες, μυοβλάστες και λιπώδη κύτταρα, αλλά και νευροαγγειακούς ιστούς 121. Κυτταρομετρία ροής Τα ανθρώπεια MSCs εκφράζουν «εξ ορισμού» στην επιφάνειά τους τα αντιγόνα CD105, CD73 και CD90, ενώ είναι αρνητικά για τους δείκτες επιφανείας CD34 και CD45 (που αποτελούν δείκτες επιφανείας της αιμοποιητικής σειράς) καθώς και αρνητικά για τους CD14, CD11b, CD79a, CD19 και HLA DR. Επιπρόσθετα είναι θετικά για τα CD13, CD29, CD44, CD166, CD271, CD146, CXCR4 και Stro 1 και αρνητικά για το CD31. Οι διαφορές μεταξύ των διαφορετικών ερευνητών είναι συχνά η αιτία των διαφορετικών αποτελεσμάτων Ρόλος Πειραματικές μελέτες μεταμόσχευσης MSCs Ποικίλες μελέτες σε πειραματικά μοντέλα εγκεφαλικής βλάβης μετά από ισχαιμία έδειξαν λειτουργική βελτίωση μετά τη χορήγηση μεσεγχυματικών κυττάρων 2, Οι μελέτες αυτές είναι κυρίως σε πειραματικά πρότυπα εγκεφαλικού εμφράκτου και υποξικήςισχαιμικής εγκεφαλοπάθειας, ενώ ανάλογες μελέτες για PVL λείπουν. Ωστόσο, ανεξάρτητα από την οδό χορήγησης των κυττάρων αυτών, τα MSCs σε μικρό βαθμό μόνο επιβίωναν στο εγκεφαλικό παρέγχυμα γύρω από τη βλάβη 123. Προφανώς η λειτουργική βελτίωση στις περιπτώσεις αυτές λάμβανε χώρα μέσω άλλων μηχανισμών, όπως η έκκριση νευροτροφικών ουσιών. Έχει βρεθεί ότι τα μεσυγχυματικά κύτταρα εκκρίνουν μια πλειάδα νευροτροφικών ουσιών, όπως Hepatocyte Growth Factor (HGF), Nerve Growth Factor (NGF), basic Fibroblast Growth Factor (bfgf), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) και Insulin like Growth Factor 1 (IGF 1), και ενεργοποιούν τον ενδογενή μηχανισμό ανάπλασης μετά από βλάβη μέσω ευόδωσης της διαδικασίας της αγγειογένεσης, νευρογένεσης και συναπτογένεσης Όντως, μελέτες έχουν δείξει πως τα MSCs προάγουν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση ενδογενών νευρικών προγονικών κυττάρων από τις συνήθεις θέσεις τους στον εγκέφαλο (υποκοιλιακή ζώνη και υποκοκκιώδη ζώνη του ιπποκάμπου) προς την εστία της εγκεφαλικής βλάβης 129,131,133. Επίσης προάγουν την επαναμυελινοποίηση, τη συναπτογένεση και τον πολλαπλασιασμό των αστροκυττάρων, ενώ προστατεύουν από την απόπτωση μετά από ισχαιμία και μειώνουν το μέγεθος της ουλής 123, Ωστόσο, παρόλο που οι κύριες δράσεις των κυττάρων αυτών συντελούνται με έμμεσους τρόπους (έκκριση νευροτροφικών ουσιών), φαίνεται πως η διαφοροποίηση προς ένα νευρωνικό φαινότυπο επιτυγχάνει

38 38 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ακόμα καλύτερα λειτουργικά αποτελέσματα 137. Επιπλέον η δυνατότητα των μεσεγχυματικών προγονικών κυττάρων του μυελού να περνάνε τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό είναι μεγάλη. Η παρουσία τους όμως στην περιοχή της νέκρωσης από μόνη της δεν σημαίνει τίποτα. Αν δεν σχηματίσουν συνδέσεις με τα γειτονικά κύτταρα θα αποπέσουν 138. Αλλά και σε άλλα πειραματικά πρότυπα τα MSCs έχει φανεί ότι συντελούν στη μείωση της ιστικής βλάβης και στην ανάπλαση. Σε πειραματικά πρότυπα ΒΠΔ φάνηκε πως η ενδοτραχειακή ή συστηματική χορήγηση MSCs ή εκχυλίσματος από καλλιέργεια MSCs οδηγεί σε βελτιωμένη αρχιτεκτονική στη διάπλαση των πνευμόνων 139,140. Κλινικές μελέτες Μελέτη παρατήρησης σε νεογέννητα έδειξε αντιστρόφως ανάλογη σχέση των MSCs του ομφαλίου αίματος με την ηλικία κύησης 117. Μελέτες θεραπευτικής χορήγησης ενδοαγγειακά μεσεγχυματικών κυττάρων σε ενήλικες ασθενείς με εγκεφαλικό επεισόδιο ή με οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου έχουν δείξει την ασφάλεια αλλά και την πιθανή λειτουργική βελτίωση των ασθενών

39 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Νευροτροφικοί και χημειοτακτικοί παράγοντες Μία διαφορετική στρατηγική νευροαναγέννησης είναι ο εμπλουτισμός του μικροπεριβάλλοντος της βλάβης με τροφικούς παράγοντες, απαραίτητους για τη διάσωση των νευρώνων και την ανάπτυξή τους. Οι τροφικοί αυτοί παράγοντες εκκρίνονται και από τα προγονικά κύτταρα, τόσο τα ενδογενή όσο και τα εξωγενώς χορηγούμενα, κατά ένα παρακρινή ή και ενδοκρινικό τρόπο. Επιπρόσθετα, έχει βρεθεί πως εξωγενή χορήγηση απευθείας αυτών των ουσιών ενισχύει τη δράση των μεταμοσχευθέντων προγονικών κυττάρων 145. Ποικίλοι τροφικοί παράγοντες έχουν αναφερθεί πως αυξάνονται ενδογενώς μετά από ισχαιμικό συμβάν 146 και η παρουσία τους δρα ευεργετικά στην πρόληψη της νευρικής βλάβης και στην αναγέννηση. Τέτοιοι παράγοντες είναι οι εξής 1, : Νευρωνικός αυξητικός παράγων (nerve growth factor, NGF), Νευροτροφικός παράγων προερχόμενος από τον εγκέφαλο (brain derived neurotrophic factor, BDNF), Νευροτροφικός παράγων προερχόμενος από κύτταρα γλοίας (glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF), Ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγων 1 (insulin like growth factor, IGF 1), Βασικός ινοβλαστικός αυξητικός παράγων (basic fibroblast growth factor, bfgf), Επαγόμενος από την Υποξία Παράγοντας 1α (hypoxia inducible factor 1a, HIF1a), Αυξητικός παράγοντας του ενδοθηλίου των αγγείων (vascular endothelial growth factor, VEGF), Ερυθροποιητίνη (Erythropoietin, ΕΡΟ), Αυξητικός παράγων μεταμόρφωσης (transforming growth factor (TGF) beta3), Νευροτροφίνες 3, 4, 5 & 6 (Neurotrophin, NT 3, NT 4, NT 5, NT 6). Ειδικότερα, κλινικές μελέτες σε νεογνά με περιγεννητική ασφυξία έδειξαν αυξημένους τους εξής εγκεφαλικούς δείκτες και τροφικούς παράγοντες 1 : 1) στο ΕΝΥ την Ειδική νευρωνική ενολάση (neuron specific enolase, NSE), Πρωτεΐνη νευρονηματίου (neurofilament protein, NFP), S 100b, Νευρογλοιακή ινιδιακή όξινη πρωτεΐνη (glial fibrillary acidic protein, GFAP), Κρεατινική κινάση ΒΒ (creatine kinase BB, CK BB), Νευρωνικός αυξητικός παράγοντας (neural growth factor, NGF) και Ερυθροποιητίνη, 2) στο αίμα την NSE, S 100b, GFAP, CK BB, EPO και IGF 1, ενώ 3) στα ούρα την S 100b. Στη συνέχεια θα περιγραφούν οι νευροτροφικοί και χημειοτακτικοί παράγοντες που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή:

40 40 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1. Ερυθροποιητίνη (Erythropoietin, EPO) Η ερυθροποιητίνη είναι χημειοτακτικός, πλειοτροπικός, αυξητικός παράγοντας με νευροπροστατευτική δράση Αποτελεί γλυκοπρωτεΐνη που αρχικά έγινε γνωστή για το ρόλο της στην ερυθροποίηση, αλλά έκτοτε αναγνωρίστηκε μια ποικιλία δράσεων, όπως ρύθμιση της φλεγμονής και της ανοσοαπόκρισης, αγγειογένεση (μέσω αλληλεπίδρασης με τον VEGF και άλλες κυτταροκίνες), νευρογένεση τόσο κατά την εμβρυογένεση όσο και in vitro 155. Η χαμηλή μερική τάση οξυγόνου επάγει τη σύνθεση του παράγοντα HIF 1a, ο οποίος με τη σειρά του επάγει τη σύνθεση της ερυθροποιητίνης 155. Τα επίπεδα της ΕΡΟ στο αίμα των προώρων νεογνών έχουν περιγραφεί σε μελέτες: στον ομφάλιο λώρο (25 72 mu/ml) 156, την 1 η εβδομάδα ζωής (11,3±6,1 mu/ml) και την 4 η εβδομάδα (15,9±13,4 mu/ml) 157, ενώ μέσο όρο τον πρώτο μήνα της ζωής αναφέρονται επίπεδα 9,7 mu/ml 158. Άλλη μελέτη αναφέρει <20 mu/ml μεταξύ 7 ης και 50 ης ημέρας ζωής, με επακόλουθη άνοδο κατά τη διάρκεια της φυσιολογικής πτώσης της αιμοσφαιρίνης τις επόμενες μέρες (φυσιολογική αναιμία των βρεφών) 159,160. Πειραματικές μελέτες Σε πειραματικά μοντέλα ΥΙΕ η χορήγησή της ΕΡΟ βρέθηκε να αυξάνει την νεοαγγειογένεση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των NSC (νευρικών βλαστικών κυττάρων) στην ισχαιμική περιοχή 154, αλλά και πιθανώς τη διαφοροποίησή τους σε νευρικά κύτταρα. Εν γένει έχει νευροπροστατευτική δράση με ευνοϊκά βραχυπρόθεσμα και μακροπρόθεσμα λειτουργικά αποτελέσματα. Η χορήγηση ερυθροποιητίνης σε πειραματικό μοντέλο ΒΠΔ οδήγησε σε μείωση της πνευμονικής βλάβης, υποδηλώνοντας πιθανή εμπλοκή της ΕΡΟ (και των ΚΠΚ που αυτή κινητοποιεί) στη διαδικασία της ανάπλασης 92,93. Κλινικές μελέτες Στα πρόωρα νεογνά η ερυθροποιητίνη χρησιμοποιείται για την πρόληψη και θεραπεία της αναιμίας. Οι δόσεις όμως που θεωρούνται νευροπροστατευτικές στα πειραματόζωα είναι πολύ υψηλότερες ( U/kg/δόση) ώστε να επιτυγχάνεται δίοδος της ουσίας από τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό. Στη βιβλιογραφία υπάρχουν δύο πρόσφατες μελέτες ασφάλειας σε εξαιρετικά χαμηλού βάρους πρόωρα που έδειξαν καλή ανοχή και ασφάλεια των υψηλών δόσεων ( U/kg/δόση) της ΕΡΟ 164,165, αλλά και ενδείξεις νευροπροστασίας. Ενδείξεις νευροπροστασίας φάνηκαν με περισσότερη σαφήνεια και σε τρεις μελέτες αποτελεσματικότητας της χορήγησης ακόμα και χαμηλών δόσεων ( U/kg/δόση) ερυθροποιητίνης, τόσο στα πρόωρα 166,167 όσο και στα τελειόμηνα νεογνά με μέτρια ΥΙΕ 168 (όσον αφορά τη μακροχρόνια τουλάχιστον έκβαση, καθώς οι βραχυπρόθεσμες εκβάσεις δεν είχαν σημαντική διαφορά). Σε μια σημαντική μελέτη, οι Juul και συν. βρήκαν αύξηση ενδογενώς της ΕΡΟ στο ΕΝΥ σε ασφυκτικά νεογνά και σε ενδοκοιλιακή αιμορραγία. Καθώς τα επίπεδα στο αίμα δε συσχετίζονταν με αυτά στο ΕΝΥ στη μελέτη αυτή, οι συγγραφείς καταλήγουν στο

41 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 41 συμπέρασμα πως σε υποξία εγκεφάλου και σε IVH η ερυθροποιητίνη παράγεται ενδογενώς στον εγκέφαλο 169. Ακόμη, τα επίπεδα στο ΕΝΥ σχετίζονταν θετικά με την έκβαση. Τέλος, οι συγγραφείς παρατήρησαν πως μετά από εξωγενή χορήγηση ανασυνδυασμένης ερυθροποιητίνης (repo), τα επίπεδα στο ΕΝΥ δεν αυξήθηκαν. Συνεπώς οι ενδείξεις για νευροπροστασία μετά από χορήγηση repo πιθανώς να οφείλονται σε έμμεση δράση, ενδεχόμενα μέσω κινητοποίησης προγονικών κυττάρων. Και αυτό δεδομένου ότι η ΕΡΟ έχει τέτοια ικανότητα κινητοποίησης πολυδύναμων προγονικών κυττάρων της κυκλοφορίας, τα οποία με τη σειρά τους ασκούν τις νευροπροστατευτικές δράσεις. Επίσης, η χορήγηση σε ενήλικες της ΕΡΟ κατόπιν εγκεφαλικού εμφράκτου (450 U/kg) φάνηκε επωφελής και ασφαλής 170. Αναφορικά με τη ΒΔΠ, οι Rayjada και συν. βρήκαν πως η χορήγηση ΕΡΟ για την πρόληψη της αναιμίας της προωρότητας οδήγησε σε μειωμένα ποσοστά ΒΠΔ σε πολύ χαμηλού βάρους γέννησης πρόωρα νεογνά 152, ενώ αντίθετα οι Juul και συν. δε βρήκαν κάτι τέτοιο. Σχέση της EPO με τα προγονικά κύτταρα Από παλαιότερα είναι γνωστή η δράση της ΕΡΟ στον ενήλικα όσον αφορά την κινητοποίηση των CD34 + CD45 + προγονικών κυττάρων και των EPCs στο περιφερικό αίμα κατά ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο 171. Τα EPC με τη σειρά τους προάγουν την νεοαγγειογένεση. Σε μελέτη σε σηπτικούς ασθενείς, παρατηρήθηκε αύξηση της EPO, των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων καθώς και σημαντική συσχέτιση μεταξύ τους 107. Σε εγκεφαλικό έμφρακτο όταν χορηγήθηκε EPO, βρέθηκε αύξηση των EPCs 19 ημέρες μετά τη χορήγηση, ενώ η πιθανότητα ενός 2 ου εγκεφαλικού επεισοδίου (στις 90 ημέρες παρακολούθησης) αλλά και τα μείζονα νευρολογικά υπολείμματα ήταν μειωμένα 106. Όσον αφορά τα νεογνά, οι Bui και συν. δεν αναφέρουν διαφορά στα επίπεδα της ΕΡΟ την 1 η ημέρα ζωής μεταξύ τελειομήνων και προώρων, και απουσία συσχέτισης με τα κυκλοφορούντα CD34 + και τα EPCs (κάτι που ήταν κατά τους συγγραφείς αναμενόμενο, καθώς δεν βρήκαν γενικώς αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ στις μετρήσεις τους). Μειωμένα επίπεδα όμως παρατηρήθηκαν στα νεογνά που ανέπτυξαν ΒΠΔ, ενώ ενδείξεις για αύξηση υπήρχαν σε μεταβολική οξέωση και σήψη 50. Οι Meister και συν. μελέτησαν τυχαιοποιημένα τα CD34 + κύτταρα σε πρόωρα νεογνά χορηγώντας repo 300 IU/kg, 3 φορές την εβδομάδα για 1 μήνα, χωρίς ωστόσο να βρουν διαφορές Iνσουλινόμορφος αυξητικός παράγων 1 (Insulinlike Growth Factor 1, IGF 1) Ο ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγων 1 είναι απαραίτητος για την εμβρυική αύξηση, για την αύξηση και ωρίμανση του εμβρυικού εγκεφάλου, καθώς και για τη διαφοροποίηση και προστασία των προ ολιγοδενδροκυττάρων (pre oligodendrocytes, preol) 173. Φαίνεται

42 42 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ πως έχει αντιαποπτωτική δράση (μέσω μείωσης της δράσης της κασπάσης 3) 174 και ευνοεί την επιβίωση των νευρικών κυττάρων (μέσω ενεργοποίησης της κινάσης σερίνης/θρεονίνης AKt). Με αυτό τον τρόπο ανακόπτει το βιοχημικό καταρράκτη που οδηγεί σε απόπτωση μετά από ΥΙΕ 1. Η χαμηλή μερική συγκέντρωση Ο 2 επάγει τον Επαγώμενο από την Υποξία Παράγοντα 1α (HIF1a), ο οποίος προάγει την αύξηση των ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα 155. Πειραματικές μελέτες Σε πρόσφατη μελέτη η πρώιμη (την 1 η ώρα) ενδορινική χορήγηση ανασυνδυασμένης ανθρώπινης IGF 1 (rhigf 1) οδήγησε σε είσοδο της ουσίας στον εγκέφαλο, αντιαποπτωτική δράση, αυξημένο πολλαπλασιασμό των προγονικών νευρικών κυττάρων και των προολιγοδενδροκυττάρων (preol), μείωση της βλάβης και λειτουργικά θετικά αποτελέσματα 175. Αποκλεισμός τεχνητά του IGF 1 αναχαιτίζει μερικώς τη νευροπροστατευτική του δράση 176. Επίσης ποντίκια που δεν εξέφραζαν το γονίδιο του IGF 1 είχαν μειωμένο όγκο εγκεφάλου και υπομυελίνωση 177. Αλλά και η έγχυση ενδοκοιλιακά του παράγοντα αυτού φάνηκε να προστατεύει μερικώς τη λευκή ουσία από ισχαιμία 178. Κλινικές μελέτες Ο IGF 1 αυξάνει κατά τη διάρκεια της εμβρυικής ζωής 179. Ως εκ τούτου, η πρώιμη διακοπή της κύησης έχει ως αποτέλεσμα μειωμένα επίπεδα στα πρόωρα νεογνά 180, κάτι που μπορεί να σχετίζεται με μειωμένη σωματική ανάπτυξη 181 αλλά και να επιδρά αρνητικά στην ωρίμανση και προστασία του εγκεφάλου στα πρόωρα. Τόσο το μέγεθος των εγκεφαλικών δομών όσο και η νευροαναπτυξιακή εξέλιξη στα 2 χρόνια ζωής συσχετίστηκαν με αυξημένο IGF 1 στις πρώτες εβδομάδες μετά τη γέννηση 182,183. Μελέτη φάσης ΙΙ χορήγησης ανασυνδυασμένου IGF 1 (μαζί με τη δεσμευτική του πρωτεΐνη, IGFBP 3) που είχε στόχο να επιτύχει σε πρόωρα νεογνά κυκλοφορούντα εξωμήτρια επίπεδα όμοια με τα εμβρυικά, αναφέρει ασφάλεια στη χορήγηση 184. Όσον αφορά τα ασφυκτικά τελειόμηνα νεογνά, τα επίπεδά του IGF 1 στο πλάσμα τις πρώτες ώρες της ζωής βρέθηκαν ελαττωμένα Stromal cell derived factor 1 (SDF 1 ή CXCL12) Ο SDF 1 αποτελεί χημειοτακτικό παράγοντα που συνδέεται με τα κύτταρα που φέρουν τον υποδοχέα CXCR4(CD184) στην επιφάνειά τους. Τον υποδοχέα αυτόν φέρουν στην επιφάνειά τους τα νευρικά προγονικά κύτταρα και κατεξοχήν τα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα 188. Ο SDF 1 παίζει σημαντικό ρόλο κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του εγκεφάλου καθοδηγώντας την μετανάστευση των νευροβλαστών και την αγγειογένεση. Στην μεταεμβρυϊκή ζωή ο βασικός του ρόλος είναι διττός: τόσο η αγκυροβόληση των ΚΠΚ στο μυελό των οστών όσο και η κινητοποίησή και μετανάστευσή των κυττάρων αυτών σε ιστούς που υφίστανται ισχαιμική βλάβη. Στο μυελό των οστών ο SDF 1 εκκρίνεται κυρίως από τους οστεοβλάστες και τα κύτταρα στρώματος. Συνδεόμενος με τον υποδοχέα CXCR4, έχει ως

43 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 43 αποτέλεσμα την αγκυροβόληση των προγονικών κυττάρων στο μυελό και τη διατήρησή τους σε αρχέγονη κατάσταση. Για να επέλθει εν συνεχεία κινητοποίηση από το μυελό, προϋπόθεση είναι η μείωση της παραγωγής SDF 1 στο μυελό και η αναστολή της σύνδεσης SDF 1/CXCR Εκτός από τους οστεοβλάστες και τα κύτταρα στρώματος του μυελού των οστών, ο SDF 1 έχει βρεθεί και σε άλλα σημεία όπου αγκυροβολούν τα προγονικά κύτταρα, όπως στο δέρμα και στο ενδοθήλιο του εγκεφάλου 32,35, Όσον αφορά τη μετανάστευση των ΚΠΚ στην περιφέρεια, ο SDF 1 εκκρίνεται από τα κύτταρα του μικροπεριβάλλοντος της ιστικής βλάβης. Ειδικότερα, μετά από ισχαιμική βλάβη ο Επαγώμενος από την Υποξία Παράγοντας 1α (HIF 1a) αυξάνει την παραγωγή του SDF 1 στο ενδοθήλιο πλησίον της βλάβης 32,188. Ταυτόχρονα ο ίδιος παράγοντας αυξάνει την έκφραση του υποδοχέα του SDF 1 (CXCR4/CD184) στα ΚΠΚ. Με αυτό τον τρόπο η ισχαιμική βλάβη (μέσω των HIF 1a και SDF 1 ) οδηγεί στη στρατολόγηση προγονικών κυττάρων από την περιφέρεια προς την περιοχή της βλάβης. Συμπερασματικά, ο άξονας SDF 1/CXCR4 παίζει τον καθοριστικότερο ρόλο τόσο στη μετανάστευση και διαφοροποίηση, όσο και στην επιβίωση, «αγκυροβόληση» και κατάσταση «ηρεμίας» των βλαστικών κυττάρων του μυελού των οστών 194. Πειραματικές μελέτες Η μετανάστευση μέσω του άξονα SDF 1/CXCR4 έχει παρατηρηθεί σε πειραματικές μελέτες για διάφορες κυτταρικές σειρές 195. Ειδικότερα, τα HSCs από το μυελό των οστών προσκολλώνται στο ενδοθήλιο των αγγείων, μετακινούνται στη συστηματική κυκλοφορία, ενώ υπό ορισμένες συνθήκες (πχ ιστική βλάβη) κυτταροκίνες από τον εγκέφαλο τα καθοδηγούν προς τον τελικό προορισμό 196. Τον υποδοχέα του SDF 1, CXCR4, εκφράζουν στην επιφάνειά τους και τα μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα (MSC), και με ανάλογο τρόπο κατευθύνονται κατά ένα χημειοτακτικό τρόπο προς την περιοχή της βλάβης 123. Σε μοντέλα εγκεφαλικού εμφράκτου, στην περιοχή περιφερειακά της ισχαιμικής βλάβης (penumbra) τα επίπεδα του SDF 1 φαίνεται πως φτάνουν στα υψηλότερα επίπεδα την 7 η μέρα μετά την ισχαιμία, διατηρούνται σε υψηλά επίπεδα έως και 30 ημέρες (έως και 4 μήνες κατά άλλους ερευνητές), ενώ αποτέλεσμα της υπερέκφρασης αυτής είναι και η αυξημένη νέο αγγειογένεση 123,193. Σε μοντέλο όμως ΥΙΕ σε νεογέννητα πειραματόζωα, η τοπική αύξηση του SDF 1 ανιχνεύτηκε μόνο ως την 7 η μέρα μετά το συμβάν, υποδηλώνοντας πιο στενό θεραπευτικό «παράθυρο» στα νεογνά 4. Σε μοντέλο μυοκαρδιακής ισχαιμίας φάνηκε πως ο άξονας αυτός είναι απαραίτητος για την προσέλκυση των προγονικών κυττάρων του μυελού στο βεβλαμένο μυοκάρδιο, αλλά ο άξονας αυτός δεν ήταν λειτουργικός απουσία ιστικής βλάβης 197. Η σημαντικότητα αυτού του χημειοτακτικού άξονα φαίνεται από πειράματα σε έμβρυα ποντίκια στα οποία λείπει τελείως ο υποδοχέας CXCR4 (knockout ποντίκια), τα οποία εμφανίζουν πολλαπλές διαμαρτίες, έχουν διαταραγμένη αιμοποίηση στο μυελό και δεν καταφέρνουν να επιζήσουν 198.

44 44 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κλινικές μελέτες Μελέτες σε ενήλικες έχουν δείξει αυξημένα επίπεδα του SDF 1 στον ορό και στην ισχαιμική περιοχή παράλληλα με αυξημένα προγονικά κύτταρα. Ειδικότερα, οι αυξήσεις που παρατηρήθηκαν στα VSELs μετά από εγκεφαλικό έμφρακτο, έμφραγμα του μυοκαρδίου ή σοβαρό έγκαυμα συσχετίστηκαν με αυξημένα επίπεδα του SDF 1 70,72,73. Μελέτη σε νεογνά με ΣΑΔ βρήκε αυξημένα επίπεδα του SDF 1 στο περιφερικό αίμα σε σχέση με πρόωρα χωρίς ΣΑΔ. Επίσης η συγκέντρωση του SDF 1 συσχετιζόταν σημαντικά με τα επίπεδα των κυκλοφορούντων CD34 + κυττάρων, δηλώνοντας συμμετοχή του SDF 1 στην κινητοποίηση αυτών των κυττάρων 199. Η ομάδα των Kotowski και Safranow δεν βρήκε συσχετισμό του παράγοντα αυτού με κάποια από τις επιπλοκές της προωρότητας 46,87, ενώ οι Machalinska και συν. βρήκαν αυξημένο τον SDF 1 τη 10 η εβδομάδα ζωής στα πρόωρα που εμφάνισαν αμφιβληστροειδοπάθεια της προωρότητας καθώς και στους τελειόμηνους μάρτυρες (συγκριτικά με τα πρόωρα χωρίς ROP) 31. Επιπλέον, η ομάδα των Kotowski και Safranow δε βρήκε διαφορά μεταξύ προώρων και τελειομήνων στα επίπεδα του παράγοντα αυτού στο ομφάλιο αίμα, ούτε και συσχέτιση με το φύλο, τον τύπο του τοκετού καθώς και με τα HSCs, VSELs ή EPCs του ομφαλίου αίματος 46,87. Ωστόσο στα πρόωρα, τα επίπεδα του SDF 1 στο ομφάλιο αίμα συσχετιζόταν σε μεγάλο βαθμό με τα VSELs της 2 ης εβδομάδας ζωής. Στο ίδιο διάστημα (γέννηση έως τη 2 η βδομάδα ζωής) και τα επίπεδα του SDF 1 αυξήθηκαν σημαντικά. Την 2 η εβδομάδα ζωής τα πρόωρα είχαν επίσης αυξημένα VSELs σε σχέση με τα τελειόμηνα. Οι συσχετίσεις αυτές του SDF 1 με τα VSELs δεν εμφάνισαν ένα καθαρό μοντέλο συσχέτισης, όπως οι ανάλογες μελέτες των ενηλίκων που αναφέρθηκαν παραπάνω, σκιαγραφούν ωστόσο πως και στα νεογνά ενδεχόμενα να υπάρχει αντίστοιχο φαινόμενο, με τον παράγοντα SDF 1 να αυξάνει την κινητοποίηση των VSELs. Αξιοσημείωτη είναι και η μελέτη των Bowie και συν. που αναφέρουν πως τα HSCs των νεογνών τις 4 πρώτες εβδομάδες ζωής παράγουν μεγαλύτερες ποσότητες SDF 1 και διεγείρουν την αύξηση τους κατά ένα αυτοκρινή τρόπο, σε μια περίοδο ταχείας αύξησης του σώματος, κάτι που δεν παρατηρείται στους ενήλικες 27. Ίσως τα αυξημένα κατά αυτόν τον τρόπο επίπεδα SDF 1 να συγχέονται κατά την μέτρηση στο περιφερικό αίμα με τα ποσοστά του παράγοντα που εκκρίνονται από ιστούς που υφίστανται βλάβη. Το γεγονός αυτό είναι ικανό να ερμηνεύσει την δυσαναλογία των ευρημάτων μεταξύ μελετών ενηλίκων και νεογνών όσον αφορά τον SDF 1, αλλά σαφώς το θέμα χρήζει περαιτέρω έρευνας Άλλοι νευροτροφικοί παράγοντες Ο νευροτροφικός παράγων προερχόμενος από τον εγκέφαλο (brain derived neurotrophic factor, BDNF) είναι μια νευροτροφίνη που επίσης προστατεύει μετά από

45 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 45 ασφυκτικό συμβάν, αλλά η αποτελεσματικότητά του εξαρτάται από το χρόνο της χορήγησης. Έχει θετικά αποτελέσματα αν χορηγηθεί την 5 η μέρα, καμία δράση αν χορηγηθεί αργότερα και επιδεινώνει τη βλάβη αν χορηγηθεί την 1 η μέρα της ζωής 200. Αποκλεισμός τεχνητά της δράσης του BDNF αναχαιτίζει μερικώς τη νευροπροστατευτική του δράση 176. Σημαντικοί παράγοντες φαίνονται επίσης να είναι ο Βασικός Ινοβλαστικός Αυξητικός Παράγων (bfgf) (οδήγησε σε αυξημένο πολλαπλασιασμό, μετανάστευση αλλά και επιτυχή διαφοροποίηση και νευρωνικές διασυνδέσεις σε μοντέλο τραύματος) και η Νευροτροφίνη 3 (NT 3) 204 (προάγει σημαντικά την αύξηση της νευρωνικής διαφοροποίησης των προγονικών κυττάρων με θετικά λειτουργικά αποτελέσματα). Ο αυξητικός παράγοντας του ενδοθηλίου των αγγείων (vascular endothelial growth factor, VEGF) είναι ρυθμιστής της αγγειογένεσης και εμπλέκεται στο νευρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση 205. Το ενδοθηλιακό μικροπεριβάλλον δημιουργεί τις προϋποθέσεις για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των προγονικών κυττάρων, γεγονότα άρρηκτα συνδεδεμένα με την αγγειογένεση. Ο VEGF A είναι το πιο σημαντικό μέλος αυτής της οικογένειας. Εκφράζεται στα κύτταρα του φλοιού νωρίς στην εμβρυογένεση, τα οποία στη συνέχεια διαμορφώνονται σε ώριμα γλοιικά γύρω από τα αγγεία. Έπειτα από υποξία (με τη μεσολάβηση και του παράγοντα HIF 1a 155 ) παρατηρείται αυξημένη έκφρασή του στα νευρικά και γλοιικά κύτταρα 206, κατευθύνοντας την αγγειογένεση και ωθώντας τον πολλαπλασιασμό νευρικών και μη νευρικών κυτταρικών σειρών 207. Επίσης δρα χημειοτακτικά στα NSCs αυξάνοντας τη μετανάστευση κατά την ανοξία 208. Πειραματόζωα με τεχνητή έλλειψη του VEGF A (knockout ποντίκια) εμφάνισαν σοβαρά προβλήματα στην αγγειογένεση, στη νευρωνική μετανάστευση και επιβίωση 209. Σε πειραματικά μοντέλα ενηλίκων, πρόωρη ενδοφλέβια χορήγηση του παράγοντα αυτού (1 ώρα μετά το συμβάν) οδήγησε σε αυξημένη διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και αύξηση της βλάβης, αλλά καθυστερημένη χορήγηση μετά από 48 ώρες αύξησε την αγγειογένεση με θετικά λειτουργικά αποτελέσματα 210. Τοπική και ενδοκοιλιακή χορήγηση είχαν επίσης θετικά αποτελέσματα 211. Αλλά και σε πειραματόζωα που υπερέκκριναν τεχνητά VEGF καταδείχθηκε η νευροπροστατευτική και αντιαποπτωτική δράση 205. Σε μελέτη σε σηπτικούς ασθενείς βρέθηκαν αυξημένα επίπεδα του VEGF, καθώς και θετική συσχέτιση μεταξύ αυτών και των κυκλοφορούντων EPCs 107. Μελέτη προώρων έδειξε αύξηση του VEGF και του HGF (hepatocyte growth factor) σε πρόωρα με ROP τη 10 η εβδομάδα ζωής και οριακή αύξηση στα πρόωρα σε σχέση με τα τελειόμηνα, ενώ δεν έδειξε συσχέτιση του παράγοντα bfgf 31. Σε άλλη μελέτη δε βρέθηκε συσχέτιση των VEGF και GM CSF με το σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας 44.

46 46 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3. Δείκτες εγκεφαλικής βλάβης Από τους εγκεφαλικούς δείκτες, οι ΝSΕ, NFP και CK BB θεωρούνται νευρωνικοί δείκτες και οι S 100b, GFAP και CK BB αστροκυτταρικοί δείκτες, αν και η ΝSΕ και S100b ανιχνεύθηκαν και στον πλακούντα. Γενικώς, οι δείκτες αυτοί συσχετίζονται με το βαθμό της εγκεφαλικής βλάβης κλινικά και απεικονιστικά. Ο CK BB στο πλάσμα θεωρείται δείκτης με μεγάλη ευαισθησία και μικρή ειδικότητα, ενώ μετρημένος στο ΕΝΥ έχει επιπλέον και καλή ειδικότητα 1. Θα αναφερθούμε εκτενέστερα στους δείκτες S100b και NSE, οι οποίοι και χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη S100b Η S100b αποτελεί πρωτεΐνη συνδεδεμένη με το ασβέστιο σε μορφή ομοδιμερούς (τύπου ββ). Εκκρίνεται κυρίως από τα αστροκύτταρα (μέσω ερεθισμάτων στον υποδοχέα 5 ΗΤ 1Α της αδενοσίνης, του γλουταμινικού και του λυσοφωσφορικού οξέος) και παίζει σημαντικό ρόλο στη νευρωνική ανάπτυξη αλλά και ανάπλαση όταν βρίσκεται σε χαμηλές ιστικές συγκεντρώσεις. Αντίθετα, μετά από κυτταρική βλάβη η πρωτεΐνη αυτή αθροίζεται εξωκυττάρια σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις και συμμετέχει συνεργατικά στη διαδικασία της απόπτωσης 212,213. Ιστική βλάβη οδηγεί σε απελευθέρωση και ανίχνευση στο ΕΝΥ και στην κυκλοφορία. Είναι δείκτης κυρίως διαγνωστικός αλλά και προγνωστικός 212, Λόγω του πολύ μικρού χρόνου ημίσειας ζωής (20 λεπτά έως 2 ώρες) θεωρείται πως αντανακλά κατεξοχήν οξέα συμβάντα 217,218. Πειραματικές μελέτες Μελέτες σε πειραματικά μοντέλα νεογνικής ΥΙΕ βρήκαν υψηλότερα επίπεδα της S100b στην εγκεφαλική βλάβη και συσχέτιση τόσο χρονικά όσο και με την παθολογοανατομική εικόνα και την έκταση της βλάβης 219,220. Κλινικές μελέτες Μελέτες σε ενήλικες με τραύμα εγκεφάλου, ισχαιμική βλάβη και υπαραχνοειδή αιμορραγία βρήκαν σταθερά αυξημένα ποσοστά της S100b στο αίμα Αλλά και σε άλλες μορφές εγκεφαλικής βλάβης έχουν αναφερθεί αυξημένες τιμές της S100b, όπως όγκοι, σχιζοφρένεια, γήρανση και νόσο Alzheimer 213, Επίσης αυξημένα επίπεδα S100b βρέθηκαν σε τραυματική βλάβη εγκεφάλου σε βρέφη και παιδιά στο τέλος του πρώτου 24ώρου μετά τη βλάβη 229. Αυξημένα επίπεδα της S100b την πρώτη ημέρα ζωής σε τελειόμηνα νεογνά με Υποξική Ισχαιμική Εγκεφαλοπάθεια αναφέρουν αρκετές μελέτες 212,217, Πιο συγκεκριμένα, η

47 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 47 S100b βρέθηκε αυξημένη σε ΥΙΕ το πρώτο 24ωρο της ζωής, με τα επίπεδα να μειώνονται τις επόμενες 3 ημέρες 217. Οι Martins και συν. βρήκαν αυξημένα επίπεδα της S100b και του γαλακτικού την 1 η και 4 η ημέρα ζωής σε νεογνά με ΥΙΕ 231. Οι Maschmann και συν. αναφέρουν σταθερά επίπεδα της S100b την πρώτη εβδομάδα ζωής στα τελειόμηνα νεογνά ( μg/l), επίπεδα αυξημένα σε σχέση με τους ενήλικες. Οι συγγραφείς αποδίδουν αυτή τη διαφορά στην ανωριμότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού. Ομοίως, αυξημένη βρήκαν την S100b στην ομάδα των νεογνών με YIE 232. Άλλοι ερευνητές αποδίδουν τα αυξημένα επίπεδα στα νεογνά (σε σχέση με τους ενήλικες) σε αυξημένο μεταβολισμό των νευρογλοιακών κυττάρων στη περίοδο αυτή της ζωής 235. Οι Wijnberger και συν. έθεσαν εν αμφιβολία το δείκτη S100b, υποστηρίζοντας πως δεν είναι ειδικός, καθώς βρίσκεται και στον ομφάλιο λώρο και τον πλακούντα 218. Το επιχείρημα αυτό αντικρούουν άλλοι ερευνητές 217,236, καθώς δεν επιβεβαίωσαν το εύρημα αυτό. Επιπρόσθετα θεωρούν ότι λόγω του πολύ μικρού χρόνου ημίσειας ζωής (30min 2h) του δείκτη S100b, τα επίπεδά του ταχύτατα όφειλαν να μειωθούν μετά τη γέννηση. Αυτό όμως δεν συμβαίνει στα νεογνά με εγκεφαλική βλάβη, στα οποία οι τιμές σχεδόν σε όλες τις μελέτες είναι αυξημένες 212, ,231,232. Οι Murabayashi και συν. 212 μέτρησαν την S100b την 1 η, 2 η και 6 η ημέρα ζωής σε 40 τελειόμηνα νεογνά με περιγεννητικό stress/ασφυξία, ενδοκράνια αιμορραγία ή δυσπλασία εγκεφάλου. Τα επίπεδα στην ομάδα ελέγχου ήταν σταθερά την 1 η και 6 η ημέρα ζωής (2,1±0,12 μg/l και 2,28±0,11 μg/l αντίστοιχα), ενώ σημαντικά αυξημένα βρέθηκαν στην υποομάδα που είχε κεχρωσμένο ενάμνιο (3.53 ± 0.36 μg/l και 3.17 ± 0.37 μg/l αντίστοιχα), αντικατοπτρίζοντας το πιθανό εμβρυικό στρες. Έτσι η μέτρηση της S100b αμέσως μετά τη γέννηση ίσως αποτελεί ικανό δείκτη του ενδομήτριου στρες. Στη μελέτη αυτή δε βρέθηκε συσχέτιση με τη ΔΚ, ΒΓ και τον τρόπο τοκετού. Στα νεογνά με περιγεννητικό στρες τα επίπεδα τις ημέρες 1,2 και 6 ήταν αντίστοιχα 3.47 ± 2.19 μg/l, 2.26 ± 1.25 μg/l, και 2.18 ± 0.97 μg/l, ενώ σημαντικά υψηλότερα ήταν στα νεογνά με βαριά ασφυξία τις ημέρες 1, 2 και 6 (21.30 ± 9.52 μg/l, 9.39 ± 2.86 μg/l, και 2.83 ± 0.55 μg/l αντίστοιχα). Τα επίπεδα συσχετίζονταν αντιστρόφως ανάλογα με το Apgar Score. Τα νεογνά με υπαραχνοειδή/υποσκληρίδια αιμορραγία, υδροκέφαλο ή σύνδρομο Dandy Walker δεν εμφάνισαν ιδιαίτερα αυξημένες τιμές. Πολλές μελέτες εντοπίζουν όμως και προγνωστική αξία στο δείκτη αυτό. Oι Thorngren Jerneck και συν. βρήκαν συσχέτιση της S100b σε επίπεδα 12 μg/l την 1 η ημέρα ζωής με την έκβαση σε εγκεφαλική παράλυση ή θάνατο 217. Ανάλογο προγνωστικό αποτέλεσμα βρίσκουν και άλλοι ερευνητές. Όλα τα νεογνά με ΥΙΕ είχαν επίπεδα 10 μg/l τις πρώτες 2 μέρες 212. Ομοίως, οι Qian και συν. προσδιόρισαν ένα προγνωστικό όριο 2,02 μg/l για την έκβαση σε μέτρια ή σοβαρή ΥΙΕ, με ευαισθησία 86,7% και ειδικότητα 88% 234. Οι Massaro και συν. σε μετρήσεις αμέσως μετά τη γέννηση βρήκαν προγνωστικό όριο 0,7 μg/l (64% ευαισθησία και 84% ειδικότητα) και 1,6 μg/l (40% ευαισθησία και 91% ειδικότητα) όσον αφορά την σοβαρή εγκεφαλική βλάβη που εντοπίζεται με MRI ή την έκβαση του θανάτου. Όσον αφορά το θάνατο ή τα βραχυπρόθεσμα νευρολογικά ελλείμματα, ένα όριο 0,2 μg/l την 3 η ημέρα ζωής

48 48 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ παρείχε 71% ευαισθησία και 82% ειδικότητα 230. Αντίθετα, οι Nagdyman και συν. δεν εντόπισαν προγνωστική αξία στο δείκτη αυτό όταν εκτίμησαν τη νευροαναπτυξιακή εξέλιξη στους 20 μήνες ζωή 216. Μεγαλύτερη προγνωστική αξία φαίνεται να έχουν οι συγκεντρώσεις της S100b στα ούρα. Οι Gazzolo και συν. μετρώντας την S100b στα ούρα τελειομήνων νεογνών βρήκαν αυξημένες τιμές στα νεογνά με περιγεννητική ασφυξία (με ή χωρίς εγκεφαλοπάθεια), με περισσότερο όπως ήταν αναμενόμενο τις τιμές στην υποομάδα με τη βαριά εγκεφαλοπάθεια. Επιπλέον προσδιόρισαν προγνωστικό ρόλο ως προς την εξέλιξη σε ΥΙΕ και ως προς τα νευρολογικά υπολείμματα από την πρώτη κιόλας ούρηση, με ποσοστό ευαισθησίας 91,3% και ειδικότητα 94,6%, Οι τιμές αυτές αυξανόταν στο 100% και 98,8% αντίστοιχα από τις μετρήσεις στα ούρα τις επόμενες 3 ημέρες 237,238. Όσον αφορά την έκβαση του θανάτου, οι Risso και συν. βρήκαν ευαισθησία και ειδικότητα 100% στα ούρα 239. Οι Distefano και συν. μετρώντας την S100b σε πρόωρα νεογνά βρήκαν αυξημένα επίπεδα τις πρώτες 24 ώρες σε νεογνά με PVL, ενώ τα επίπεδα μειώνονταν την 7 η και 21 η ημέρα 240. Σε άλλη μελέτη προώρων, η S100b ήταν 4 φορές περισσότερο αυξημένη στα νεογνά με μεθαιμορραγική κοιλιακή διάταση 241. Τέλος, οι Giuseppe και συν αναφέρουν σταδιακή αύξηση της S100b από την 1 η έως την 7 η ημέρα ζωής στα πρόωρα με βαριά ασφυξία, σε αντίθεση με την πτωτική πορεία κατά τη διάρκεια της 1 ης εβδομάδας στη μέτρια ασφυξία 214. Αυξημένα επίπεδα S100b αναφέρονται και σε έμβρυα με ενδομήτρια καθυστέρηση της ανάπτυξης (IUGR) 236. Ομοίως τα επίπεδα της S100b και της ερυθροποιητίνης στο αμνιακό υγρό συσχετίζονταν θετικά, ως αποτέλεσμα της χρόνιας εμβρυικής υποξίας σε κυήσεις υψηλού κινδύνου 242. Αυξημένα επίπεδα και σε νεογέννητα με IUGR βρήκαν και οι Florio και συν Ειδική νευρωνική ενολάση (NSE neuron specific enolase) Η NSE αποτελεί ισοένζυμο που συμμετέχει στο μεταβολισμό της γλυκόζης (γλυκόλυση) και βρίσκεται κατ εξοχήν στο κυτταρόπλασμα των νευρικών και νευροενδοκρινικών κυττάρων, βλάβη των οποίων οδηγεί σε απελευθέρωση στο ΕΝΥ και στην κυκλοφορία σε μεγαλύτερες ποσότητες 229,244. Πειραματικές μελέτες Μελέτες σε πειραματικά πρότυπα νεογνικής εγκεφαλικής βλάβης σε χοίρους και πρόβατα έδειξαν συσχέτιση του βαθμού και της έκτασης της εγκεφαλικής βλάβης με την NSE 219,220.

49 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 49 Κλινικές μελέτες Από παλιά είναι γνωστό πως και η NSE είναι αυξημένη σε ενήλικες μετά από εγκεφαλική βλάβη 225. Αλλά και σε βρέφη και παιδιά με τραυματική βλάβη εγκεφάλου αυξάνονται τα επίπεδα σε δύο χρονικές στιγμές, την 1 η ημέρα (διάμεσος: 11 ώρες) μετά τη βλάβη και την 3 η ημέρα (διάμεσος: 63 ώρες), υποδηλώνοντας 2 αιχμές νευρωνικού θανάτου, η δεύτερη ενδεχόμενα λόγω απόπτωσης 229. Σε μελέτη νεογνών που υπέστησαν καρδιοχειρουργική επέμβαση, τα αυξημένα επίπεδα της NSE συσχετίστηκαν με τη πτωχή έκβαση 245. Αρκετές μελέτες αναφέρουν αυξημένα επίπεδα της NSE στο ΕΝΥ, που συσχετίζονται με την μακροχρόνια έκβαση Ειδικότερα, οι Tekgul και συν. αναφέρουν καλή συσχέτιση της NSE μετρημένης στο ΕΝΥ τις πρώτες 72 ώρες ζωής με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας αλλά και τη νευροαναπτυξιακή εικόνα στα 2 χρόνια ζωής 247. Στα ίδια συμπεράσματα καταλήγουν και άλλοι ερευνητές όσον αφορά τη δυσμενή πρόγνωση (εγκεφαλική παράλυση ή θάνατος) στον 1 ο χρόνο ζωής 248,249. Οι τιμές της NSE συσχετίζονταν επίσης με τα ευρήματα στην MRI και το ηλεκτροεγκεφαλογράφημα 246. Στα αίμα, τα επίπεδα της NSE βρέθηκαν αυξημένα από τους Celtik και συν. το πρώτο 48ωρο στα νεογνά με ΥΙΕ (ιδιαίτερα 3 ου βαθμού), παρουσίασαν δε πτώση την 5 η 7 η ημέρα. Επίσης υπολογίστηκε πως όριο τιμής 40 μg/l είχε 79% ευαισθησία και 70% ειδικότητα όσον αφορά την πρόγνωση της μέτριας και σοβαρής εγκεφαλοπάθειας, και όριο 45,4 μg/l είχε 84% ευαισθησία και 70% ειδικότητα όσον αφορά την πρόγνωση κακής έκβασης στον πρώτο χρόνο ζωής 244. Οι Massaro και συν. αναφέρουν 71% ευαισθησία και 83% ειδικότητα όσον αφορά το θάνατο ή την εγκεφαλική βλάβη που προσδιορίστηκε με MRI, όταν τέθηκε όριο 81 μg/l αμέσως μετά τη γέννηση, ή 33% ευαισθησία και 93% ειδικότητα σε όριο 110 μg/l. Επιπλέον, όριο 67 μg/l την 3 η ημέρα ζωής προέβλεπε την έκβαση του θανάτου ή τα βραχυπρόθεσμα νευρολογικά ελλείμματα με 70% ευαισθησία και 88% ειδικότητα. Αντίθετα, οι Nagdyman και συν. δε βρήκαν συσχέτιση της NSE τις πρώτες 6 ώρες ζωής με την εγκεφαλοπάθεια σε τελειόμηνα 233, αλλά ούτε και συσχέτιση με τη νευροαναπτυξιακή εικόνα στους 20 μήνες ζωής 216. Επίσης δυσκολία στον προσδιορισμό προγνωστικού ρόλου για την NSE μετρημένη στο ΕΝΥ αναφέρει και συστηματική ανασκόπηση του Όσον αφορά τα πρόωρα, οι Giuseppe και συν αναφέρουν αυξημένες τιμές την πρώτη ημέρα ζωής στη μέτρια και βαριά ασφυξία, και σταδιακή πτώση των επιπέδων έως την 7 η ημέρα ζωής 214.

50 50 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 4. Ενδογενής κυτταρική απάντηση μετά από εγκεφαλική βλάβη Μετά από ένα υποξικό ισχαιμικό γεγονός η εγκεφαλική βλάβη περιλαμβάνει πολλαπλούς κυτταρικούς πληθυσμούς (νευρώνες, ολιγοδενδροκύτταρα, αστροκύτταρα, αγγεία) και λαμβάνει χώρα με ποικίλους τρόπους και σε διαφορετικό χρόνο (βλέπε και παρακάτω παράγραφο 9 παθοφυσιολογία εγκεφαλικής βλάβης). Πειραματικές μελέτες κυρίως με το μοντέλο Vannucci 250 (ποντίκια με ετερόπλευρη απολίνωση καρωτίδας σε συνδυασμό με υποξία) έχουν σκιαγραφήσει την αλληλουχία των γεγονότων. Μετά το οξύ ασφυκτικό συμβάν λαμβάνει χώρα κυτταρική νέκρωση που ακολουθείται από παρατεταμένη κυτταρική απόπτωση (για μέρες ή βδομάδες). Από τη δεύτερη μέρα αρχίζει μια ενδογενής προσπάθεια ανάπλασης της βλάβης (πολλαπλασιασμός ενδογενών προγονικών νευρικών κυττάρων και μετανάστευση), που κορυφώνεται την 3 η μέρα και συνεχίζεται τουλάχιστον ως την 10 η μέρα 2 (ή την 21 η κατά άλλους ερευνητές 14,16 ). Η νευρογένεση στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο περιλαμβάνει τρία στάδια: 1) τον πολλαπλασιασμό των προγονικών κυττάρων, 2) τη μετανάστευση και 3) τη διαφοροποίησή τους σε ώριμα κύτταρα της νευρικής σειράς. Το ασφυκτικό συμβάν παραβλάπτει τη διαδικασία της νευρογένεσης και στα τρία παραπάνω στάδια. Όμως και η επακόλουθη ενδογενής προσπάθεια για ανάπλαση έχει πολλαπλώς καταδειχθεί πως κατευθύνεται και στους τρεις αυτούς τομείς: 4.1. Πολλαπλασιασμός προγονικών κυττάρων Έντονος πολλαπλασιασμός των νευρικών βλαστικών κυττάρων (Neural Stem Cells, NSC) υφίσταται στην υποκοιλιακή ζώνη της πλάγιας κοιλίας (subventricular zone, SVZ), κυρίως ομόπλευρα με τη βλάβη αλλά και ετερόπλευρα. Η διαδικασία ξεκινά τη 2 η ημέρα, κορυφώνεται την 3 η (κατά άλλους την 5 η 7 η ), ενώ την 21 η ημέρα δεν ανιχνεύεται ιδιαίτερη διαφορά 15. Οι αυξημένες κυτταρικές διαιρέσεις στο ετερόπλευρο ημισφαίριο υποδηλώνουν την δράση χυμικών αυξητικών παραγόντων. Στο ίδιο συμπέρασμα συνηγορεί και η in vitro μιτωτική δράση κυτταρικών κλασμάτων (εκχυλισμάτων) εγκεφάλου ο οποίος έχει υποστεί ισχαιμική βλάβη 3. Επίσης, ο νευροτροφικός παράγοντας LIF (Leukemia inhibitory factor) αυξάνεται στην SVZ τις πρώτες δύο μέρες μετά το συμβάν Μετανάστευση προγονικών κυττάρων Μετανάστευση νευρικών προγονικών κυττάρων Η μετανάστευση είναι μια διαδικασία που υφίσταται κατά κύριο λόγο στο νεογνικό εγκέφαλο σε σχέση με του ενηλίκου. Η μετανάστευση των NSCs προς την περιοχή της

51 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 51 βλάβης από την SVZ (κυρίως την ομόπλευρη, αλλά και την ετερόπλευρη) φαίνεται να συμβαίνει κυρίως την 7 η μέρα στα πειραματόζωα. Στην περιοχή της βλάβης ανιχνεύεται υπερτετραπλάσια ποσότητα νεοσχηματισθέντων κυττάρων, τα οποία κατ εξοχήν έχουν μεταναστεύσει εκεί από άλλη περιοχή 3. Ακόμη, οι Yang και συν. αναφέρουν αυξημένη και παρατεταμένη νεο νευρογένεση στο νεοφλοιό (προερχόμενη από τα NSCs της SVZ), που διαρκούσε για τουλάχιστον 5 μήνες μετά το υποξικό συμβάν. Ωστόσο, το 85% των νευρώνων δεν κατάφερναν να φτάσουν στην ώριμη μορφή και δεν επιβίωναν 146. Πολλοί υποψήφιοι χημειοτακτικοί παράγοντες των νευρωνικών προγονικών κυττάρων έχουν προταθεί. Μεταξύ αυτών, έχει ανιχνευτεί αύξηση της χημειοτακτικής πρωτεΐνης των μονοκυττάρων (monocyte chemoattractant protein 1, MCP 1, ή monocyte chemoattractant factor 1/ MCF 1) καθώς και του υποδοχέα του CCR 2 στην υποκοιλιακή ζώνη και το φλοιό την 3 η και 14 η μέρα μετά το ισχαιμικό συμβάν, ενώ ο IGF 1 βρέθηκε να αυξάνεται στο νεοφλοιό 146. Μετανάστευση προγονικών κυττάρων της περιφέρειας προς τον εγκέφαλο Μετανάστευση προγονικών κυττάρων έχει βρεθεί πως λαμβάνει χώρα και από την περιφέρεια προς τον ισχαιμικό εγκέφαλο. Συγκεκριμένα, στο μυελό των οστών έχουν βρεθεί ετερογενείς κυτταρικοί πληθυσμοί προγονικών κυττάρων, μεταξύ των οποίων τα Αιμοποιητικά Προγονικά Κύτταρα, τα Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα, τα Μεσεγχυματικά Προγονικά Κύτταρα και τα Very Small Embryonic like Stem Cells 252. Τα κύτταρα αυτά βρίσκονται σε δυναμική κατάσταση μεταξύ αγκυροβολήσεως στο μυελό και κινητοποίησης προς τη συστηματική κυκλοφορία. Από τη συστηματική κυκλοφορία μπορούν με τη δράση χημειοτακτικών παραγόντων να κατευθυνθούν προς τον εγκέφαλο που έχει υποστεί βλάβη (ας σημειωθεί και πως ο αιματοεγκεφαλικός φραγμός είναι περισσότερο «διαπερατός» σε συνθήκες ενδοεγκεφαλικής βλάβης). Έχει δειχθεί πειραματικά πως αυτά τα κύτταρα έχουν την ικανότητα διαφοροποίησης σε νευρικά κύτταρα 253. Εκκρίνουν όμως και νευροτροφικούς αυξητικούς παράγοντες που παίζουν ίσως περισσότερο καθοριστικό ρόλο στην επιβίωση των νευρώνων αλλά και συνεπικουρούν στη δράση των τοπικών νευρικών προγονικών κυττάρων Η μετανάστευση των ΚΠΚ συντελείται με τη συμβολή χημειοτακτικών παραγόντων, ανάμεσα στους οποίους βασικός θεωρείται ο Stromal cellderived factor 1 (SDF 1) 4,194. Ο τελευταίος είναι χημειοτακτικός παράγοντας για τα φέροντα τον υποδοχέα CXCR4 κύτταρα του μυελού (βλ. παράγραφο 2.3). Έτσι ο άξονας SDF 1/ CXCR4 ενορχηστρώνει τη διαδικασία της μετανάστευσης προς το μέρος του οργανισμού που έχει υποστεί βλάβη. Συγκεκριμένα για τον εγκέφαλο, η έκκριση του SDF 1 βρέθηκε κυρίως πως γινόταν από τα ενεργά περιαγγειακά αστροκύτταρα και τα επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία δρουν ως διαμεσολαβητές στη διαδικασία χημειοταξίας και επιστράτευσης αναγεννητικών κυττάρων. Μέσω αυτών γίνεται η σύνδεση των κυκλοφορούντων προγονικών κυττάρων (με τον υποδοχέα CXCR4) και η εξαγγείωση των τελευταίων στην περιοχή της βλάβης. Μελέτες σε πειραματόζωα με ισχαιμία του μυοκαρδίου έδειξαν λειτουργικότητα του άξονα SDF 1/CXCR4 μόνο παρουσία ιστικής βλάβης 197. Προφανώς υπάρχουν παράγοντες που

52 52 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ρυθμίζουν τη λειτουργικότητα και το χρονικό παράθυρο της χημειοταξίας που πρέπει να διευκρινισθούν. Σε κλινικό επίπεδο, οι χημειοτακτικοί παράγοντες GCSF και GM CSF έχουν χρησιμοποιηθεί στην προσπάθεια θεραπείας της εγκεφαλικής βλάβης, σε μια προσπάθεια μίμησης του ενδογενούς προστατευτικού μηχανισμού κινητοποίησης των προγονικών κυττάρων από το μυελό 33,34, επιβεβαιώνοντας τη θεραπευτική ικανότητα του μοντέλου αυτού. Επίσης, κλινικές μελέτες παρατήρησης σε νεογνά έδειξαν πως το παρατεταμένο δεύτερο στάδιο του τοκετού και η δυστοκία έχουν συσχετισθεί με αυξημένα επίπεδα προγονικών κυττάρων του ομφαλίου λώρου 257,258. Το γεγονός αυτό από μόνο του αποτελεί μία άμεση ένδειξη της σχέσης του περιγεννητικού στρες με τα προγονικά κύτταρα της περιφέρειας στο νεογνό και υποδηλώνει την ύπαρξη κάποιου ενδογενούς αμυντικού μηχανισμού. Ο ρόλος του νευρικού συστήματος στη μετανάστευση των προγονικών κυττάρων Τελευταία ο συνεργικός ρόλος του συμπαθητικού νευρικού συστήματος με το ανοσοποιητικό έχει δειχθεί και στη διαδικασία ενδογενούς κινητοποίησης των προγονικών κυττάρων του μυελού. Κατεχολαμίνες, που εκκρίνονται ιδιαίτερα σε συνθήκες stress, απελευθερώνονται στη συστηματική κυκλοφορία αλλά και απευθείας στις νευρικές απολήξεις στο μυελό των οστών, και υποβοηθούν την κινητοποίηση/μετανάστευση των προγονικών κυττάρων. Αυτή η συσχέτιση υποβοηθείται από την παρατήρηση ότι στην επιφάνεια των κυκλοφορούντων προγονικών κυττάρων υπάρχουν λιγότεροι κατεχολαμινεργικοί υποδοχείς όταν αυτά βρίσκονται σε κατάσταση ηρεμίας στο μυελό. Η έκφραση των υποδοχέων αυτών αυξάνεται περαιτέρω μετά από διέγερση με G CSF και GM CSF 189,196. Επίσης, η επαγωγή της αύξησης των βλαστικών κυττάρων ως συνέπεια του σωματικού ή ψυχικού στρες έχει επανειλημμένως περιγραφεί. Μελέτες δείχνουν πως οι β διεγέρτες προάγουν με άμεση δράση την αύξηση αυτή, ενώ το λίθιο την αναχαιτίζει 194. Την κινητοποίηση από το μυελό ευνοούν η καταστροφή του DNA (χημειοθεραπεία, ακτινοβολία), κυτταροκίνες, χυμοκίνες, ανταγωνιστές του CXCR4 και οι τοπικοί οστεοκλάστες (μέσω δράσης του receptor activator of nuclear factor kb ligand (RANKL), του G CSF, του SDF 1 και του παράγοντα osteopontin). Φαίνεται πως ο G CSF μέσω περιφερικών αδρενεργικών νευρώνων κινητοποιεί τα προγονικά κύτταρα (μέσω καταστολής των οστεοβλαστών του ενδοστέου και του SDF 1) 32,194. Επίσης, ο G CSF επάγει την έκφραση των νευρωνικών υποδοχέων στα ανώριμα CD34 +, υποδηλώνοντας πιθανή συμμετοχή των νευροδιαβιβαστών στον πολλαπλασιασμό, μετανάστευση και διαφοροποίησή των προγονικών κυττάρων. Η ντοπαμίνη, αδρεναλίνη και νοραδρεναλίνη δρουν και χημειοτακτικά και προάγουν την κινητικότητά των κυττάρων (μέσω επαγωγής και ενεργοποίησης μεταλλοπρωτεϊνασών) 259. Έχει παρατηρηθεί κιρκάδια (με αύξηση τις βραδινές ώρες) και εποχιακή διακύμανση των κατεχολαμινικών επιπέδων στο μυελό και της

53 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 53 συγκέντρωσης των εκεί κυττάρων. Το κύκλωμα φαίνεται να ξεκινά από τον υπερχιασματικό πυρήνα του εγκεφάλου και μέσω του συμπαθητικού να επενεργεί στον άξονα SDF 1/CXCR4. Εν τέλει, σήμερα διαφαίνεται η ύπαρξη ενός εγκεφαλο οστικού άξονα και ένα μοντέλο εγκεφαλο οστο αιματικής τριάδας με παρακρινή δράση στα προγονικά κύτταρα του μυελού Διαφοροποίηση προγονικών κυττάρων Για να ολοκληρωθεί η διαδικασία της νευρογένεσης από τα προγονικά κύτταρα, μετά τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των τελευταίων στην περιοχή της εγκεφαλικής βλάβης, το τελευταίο βήμα είναι η διαφοροποίηση προς ένα νευρωνικό φαινότυπο και η λειτουργική διασύνδεση με τα γειτονικά κύτταρα. Η διαφοροποίηση φαίνεται να είναι ο πιο αδύνατος κρίκος της ενδογενούς προσπάθειας αναγέννησης. Η ισχαιμική υποξική βλάβη έλκει τα νευρικά προγονικά κύτταρα (NSCs) του εγκεφάλου (που βρίσκονται στην υποκοιλιακή ζώνη των πλαγίων κοιλιών και στην υποκοκκιώδη ζώνη της οδοντωτής έλικας) και προάγει τη διαφοροποίησή τους, αλλά ο αριθμός εν τέλει των νευρώνων που σχηματίζονται είναι πολύ μικρός (φαίνεται πως οι περισσότεροι νεοσχηματιζόμενοι νευρώνες τελικά αποπίπτουν, ίσως εξαιτίας του «αφιλόξενου» μικροπεριβάλλοντος της περιοχής της βλάβης) 260. Το 85% των μεταναστευσάντων νευρώνων δεν ωρίμαζαν και πέθαιναν, κατά τους Yang και συν 146. Σε άλλη μελέτη, μόνο 1% των νεοσχηματισθέντων κυττάρων εμφάνισαν δείκτες νευρικών κυττάρων και μόνο πριν την 28 η μέρα 261. Τα νευρικά αυτά κύτταρα ήταν μάλλον διάμεσοι νευρώνες και όχι πυραμιδικά κύτταρα, και συνεπώς ακατάλληλα για διασύνδεση με το περιβάλλον τους, σχηματισμό δικτύου και λειτουργική αναγέννηση. Το εύρημα αυτό έρχεται σε αντίθεση με την επιτυχή διαφοροποίηση μεταμοσχευθέντων βλαστικών κυττάρων σε υγιή αναπτυσσόμενο εγκέφαλο 262, υποδεικνύοντας ως αίτιο της «αποτυχίας» την τοπική έλλειψη νευρώνων προς διασύνδεση ή το πτωχό τροφικό περιβάλλον μετά από ισχαιμία υποξία. Αυτό το συμπέρασμα ενισχύει και το επιτυχές πείραμα αναγέννησης σε λιγότερο βεβλαμένο εγκεφαλικό ιστό από τους Daval και συν 14. Από την άλλη πλευρά, η νευρογένεση μετά από ΥΙΕ πειραματικά έχει ενισχυθεί πολύ με τη χρήση της νευροτροφίνης 3(ΝΤ 3) 204. Αλλά και τα κύτταρα του μυελού που μετανάστευσαν στην περιοχή της βλάβης φάνηκαν πως έμοιαζαν περισσότερο με περικύτταρα ή ενεργά μικρογλοιακά κύτταρα. Η διαφοροποίηση λοιπόν φαίνεται να είναι μια διαδικασία που σχετίζεται άμεσα με τον ιστό και το μικροπεριβάλλον στα οποία θα εμφυτευθεί το προγονικό κύτταρο. Συνεπώς, η ύπαρξη βαριάς βλάβης αποτρέπει την επιτυχή διαφοροποίηση. Κατά συνέπεια λειτουργική βελτίωση με απλή μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων δεν αναμένεται να έχει τα μέγιστα αποτελέσματα στη βαριά νευρωνική βλάβη, αλλά και η πρώιμη θεραπευτική χορήγηση μπορεί να οδηγήσει σε καταστροφή των μεταμοσχευθέντων κυττάρων. Οι συνδυασμένες θεραπευτικές προσεγγίσεις είναι πιθανότατα το μέλλον της αναγεννητικής προσέγγισης.

54 54 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η έκβαση εν τέλει σχετίζεται τόσο με τη βαρύτητα και την περιοχή της βλάβης όσο και την αναπτυξιακή ηλικία. Με τη δράση των προγονικών κυττάρων προάγεται η νευρογένεση, η συναπτογένεση, αλλά και η αγγειογένεση και μειώνεται η απόπτωση και ο σχηματισμός «ουλής» από γλοία στο σημείο της νέκρωσης. Οι τελευταίες «έμμεσες» δράσεις φαίνεται να είναι και οι σημαντικότεροι τρόποι δράσης, κάτι που φάνηκε στα θετικά αποτελέσματα μετά από μεταμόσχευση προγονικών κυττάρων σε πειραματικά μοντέλα ΥΙΕ Μηχανισμοί δράσης των βλαστικών κυττάρων στην εγκεφαλική βλάβη Αν και η πλειοψηφία των ερευνών κατέδειξε θετικά λειτουργικά ή/και νευροπαθολογοανατομικά αποτελέσματα από τη δράση διαφόρων σειρών προγονικών κυττάρων σε πειραματικά μοντέλα ΥΙΕ, ωστόσο ο ακριβής μηχανισμός δράσης τους είναι ακόμη άγνωστος. Οι ποικίλες υποθέσεις 10 που διατυπώνονται δεν είναι αλληλοαποκλειόμενες και περισσότερος του ενός μηχανισμοί είναι δυνατό να λαμβάνουν χώρα με ευεργετικά αποτελέσματα: Μία υπόθεση είναι η διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων σε νευρικά 193. Αυτή η δυνατότητα έχει καταδειχθεί κυρίως σε πειράματα σε υγιείς αναπτυσσόμενους εγκεφάλους, αλλά και σε ελάσσονες εγκεφαλικές βλάβες, όπως αναφέρθηκε παραπάνω 14,262. Σε σοβαρές βλάβες από ΥΙΕ το ποσοστό των προγονικών κυττάρων που διαφοροποιούνται σε νευρικά είναι πολύ μικρό (και η ανάπτυξη νευρικών αποφυάδων ακόμα μικρότερη) 146,260,261, και ως εκ τούτου ο βαθμός της θετικής λειτουργικής ανταπόκρισης στη μεταμόσχευση δεν μπορεί να συσχετισθεί με το μικρό βαθμό διαφοροποίησης. Ομολογουμένως, η κυτταρική συμπεριφορά και η κλινική σημαντικότητα των νεοεμφανισθέντων νευρώνων δεν έχει αποσαφηνιστεί. Μία δεύτερη υπόθεση είναι πως η ευνοϊκή δράση επιτελείται μέσω της διαφοροποίησης των προγονικών κυττάρων σε άλλα κύτταρα του νευροεξωδέρματος, όπως αστροκύτταρα, και μικρογλοία (από την αιματοποιητική προγονική σειρά). Εξ άλλου μετά από ένα σοβαρό ΥΙΕ οι βλάβες αφορούν όλες τις τοπικές κυτταρικές σειρές και όχι μόνο τους νευρώνες, με συνέπεια τη σημαντική διαταραχή του τοπικού τροφικού μικροπεριβάλλοντος, δυσχεραίνοντας σημαντικά την προσπάθεια αναγέννησης 24, Μία τρίτη υπόθεση είναι η ευόδωση της νεοαγγειογένεσης, η βελτίωση της τοπικής αιμάτωσης μετά το ισχαιμικό συμβάν και εμμέσως της τοπικής ανάπλασης. Σε αυτή τη διαδικασία βρέθηκε πως συμμετέχουν τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (μέσω χημειοταξίας από τον SDF 1), τα HSCs, τα multipotent adult progenitor cells (MAPC) και τα MSC 24, Τέλος, μια τέταρτη υπόθεση είναι πως τα βλαστικά κύτταρα παράγουν τροφικούς παράγοντες που βοηθούν στη «διάσωση» των κυττάρων στον τραυματισμένο ισχαιμικό ιστό 193. Για παράδειγμα, βρέθηκε πως τα MSC εγχεόμενα ενδοφλέβια αυξάνουν την

55 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 55 έκκριση NGF, BDNF, HGF, IGF 1 και VEGF μετά από εγκεφαλική βλάβη 10,12. Με αυτόν τον τρόπο μειώνεται η απόπτωση, η τοπική ανοσολογική απάντηση και ο σχηματισμός μικρογλοιακής ουλής, ενώ επιτείνεται η αγγειογένεση, η μιτωτική δραστηριότητα και η διαφοροποίηση των τοπικών προγονικών κυττάρων 24, Συχνά στα πειράματα, τα πιο αξιοπρόσεχτα αποτελέσματα είναι η αυξημένη επιβίωση των τοπικών κυττάρων. Τη δράση μέσω έκκρισης τροφικών παραγόντων ενισχύουν και τα εξίσου ενθαρρυντικά αποτελέσματα μετά από ενδοφλέβια έγχυση προγονικών κυττάρων (εμφανίζουν παρόμοια αποτελέσματα με την απευθείας ενδοκρανιακή μεταμόσχευση 267 ). Αλλά και εκχυλίσματα εγκεφάλου που έχει υποστεί βλάβη φάνηκαν να έχουν αυξητικές ιδιότητες 3. Παρομοίως, άλλες μελέτες σε πειραματικά μοντέλα δείχνουν λειτουργική βελτίωση μετά τη χορήγηση προγονικών κυττάρων, παρ όλο που στην περιοχή της βλάβης δεν ανιχνεύονται νέοι νευρώνες. Προφανώς το αποτέλεσμα οφείλεται σε έμμεση δράση των προγονικών κυττάρων 128, Εξωγενής χορήγηση προγονικών κυττάρων Από όσα αναφέρθηκαν ανωτέρω για το ρόλο των προγονικών κυττάρων αλλά και των νευροτροφικών ουσιών, γίνεται σαφές πως κάθε εξωγενής αναγεννητική παρέμβαση πρέπει να εφαρμόζεται σε ορισμένο χρόνο και να στοχεύει σε συγκεκριμένο κυτταρικό πληθυσμό/ ούς. Πιθανότερα, για το επιθυμητό αποτέλεσμα να είναι απαραίτητος ένας συνδυασμός θεραπευτικών παρεμβάσεων σε διαφορετικούς χρόνους, παρά η μονοθεραπεία Γενικές αρχές Μέθοδοι έγχυσης Έχουν περιγραφεί οι εξής μέθοδοι έγχυσης: απευθείας στο παρέγχυμα ή στις κοιλίες, ενδοαγγειακά (ενδοαρτηριακά (καρωτίδα) ή ενδοφλέβια), ενδοπεριτοναϊκά και ενδοκαρδιακά 269,270. Η περιφερική χορήγηση έχει σαφή πρακτικά πλεονεκτήματα όσον αφορά μελλοντική κλινική χορήγηση. Ωστόσο απαραίτητη προϋπόθεση είναι τα κύτταρα αυτά καθώς και οι νευροπροστατευτικοί παράγοντες που εκκρίνουν να μπορούν να φθάνουν έως το σημείο της ιστικής βλάβης, ενώ η λεπτομερέστατη γνώση της σχετικής παθοφυσιολογίας θα βοηθούσε ιδιαίτερα τη βελτιστοποίηση της θεραπευτικής προσπάθειας. Όσον αφορά τον εγκέφαλο και την περιφερική χορήγηση προγονικών κυττάρων, η ακριβής λειτουργία και η διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού σε υγιή άτομα αλλά και υπό συνθήκες νόσου είναι σημαντικές παράμετροι. Η διαπερατότητά του αλλάζει σημαντικά στην οξεία και υποξεία φάση της φλεγμονής μετά την εγκεφαλική βλάβη.

56 56 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Περισσότερο «διαπερατός» αιματοεγκεφαλικός φραγμός κατά την οξεία φάση σημαίνει θεωρητικώς ευκολότερη είσοδο στον εγκέφαλο τόσο των ΚΠΚ (τα οποία όμως διέρχονται ούτως ή άλλως σχετικά εύκολα μέσω των υποδοχέων τους) και των νευροτροφικών ουσιών, όσο βέβαια και ουσιών βλαπτικών για τον εγκέφαλο που δημιουργούνται κατά τη διάρκεια της φλεγμονής και της ισχαιμίας, όπως τα προϊόντα του οξειδωτικού stress και τα κύτταρα φλεγμονής 90. Ρόλο στη διαβατότητα του ΑΕΦ φαίνεται πως έχουν και τα EPCs. Σαφώς υπάρχει ανάγκη να μελετηθεί αυτό το πεδίο εκτενέστερα. Είναι πιθανό πως αν τα ενδογενή προγονικά κύτταρα της περιφέρειας (πχ του μυελού των οστών) μπορούν να κινητοποιούνται στην περιφέρεια και εισέρχονται στον εγκέφαλο που έχει υποστεί βλάβη, παρόμοιο μονοπάτι θα μπορούσαν να ακολουθήσουν και τα εξωγενώς χορηγηθέντα προγονικά κύτταρα. Πράγματι, βρέθηκε πως η αύξηση της περιφερικής συγκέντρωσης προγονικών κυττάρων ύστερα από ενδοφλέβια χορήγηση έχει εξίσου θετικά αποτελέσματα με την ενδοκράνια έγχυση 267. Τα προγονικά κύτταρα του μυελού (αιματοποιητικά και μεσεγχυματικά προγονικά κύτταρα) μετά από ενδοφλέβια έγχυση είναι σε θέση να μεταναστεύσουν στον εγκέφαλο και να διαφοροποιηθούν σε νευρώνες, αστρογλοία και ολιγοδενδροκύτταρα 271,272. Η χημειοταξία φαίνεται πάλι να σχετίζεται με τον SDF 1 και τον υποδοχέα του CXCR4, η δε έλλειψη ή μειωμένη λειτουργικότητα του τελευταίου οδηγεί σε αποτυχία της μετανάστευσης 6,197. Χρόνος έγχυσης Το θέμα του βέλτιστου χρόνου έγχυσης χρήζει ιδιαίτερης προσοχής, καθώς η πρώιμη παρέμβαση πριν την εγκατάσταση της ιστικής βλάβης (κατά την πρωτογενή, δευτερογενή και τριτογενή φάση) στην ΥΙΕ 1 είναι σαφώς σοφότερη επιλογή από την προσπάθεια αποκατάστασης μιας ήδη εγκατεστημένης βλάβης αργότερα. Πειραματικές μελέτες έδειξαν πως η ενσωμάτωση των βλαστικών κυττάρων δοτών ήταν βέλτιστη όταν λάμβανε χώρα 3 7 ημέρες μετά από το έμφραγμα, ενώ δεν παρατηρούνταν μετά από 5 εβδομάδες, υποδεικνύοντας την ύπαρξη «παραθύρου» στο φαινόμενο 273,274. Ακόμη, η αύξηση της χημειοτακτικής δράσης του SDF 1 μόνο την πρώτη βδομάδα σε πειραματικό μοντέλο νεογνικής ΥΙΕ υποδηλώνει στενότερο «παράθυρο» από αυτό του μοντέλου του εγκεφαλικού εμφράκτου του ενηλίκου 4. Επίσης, η λειτουργικότητα του χημειοτακτικού άξονα του SDF 1 σχετίζεται άμεσα με την παρουσία και το χρόνο της ιστικής βλάβης 197. Τουλάχιστον όσον αφορά την κινητοποίηση των προγονικών κυττάρων της περιφέρειας και του μικροπεριβάλλοντος της περιοχής της βλάβης, το χρονικό αυτό παράθυρο μάλλον αρμόζει αξιόλογης προσοχής. Ομολογουμένως πάντως η κυτταρική θεραπεία στα νεογέννητα ζώα είναι περισσότερο αποτελεσματική σε σχέση με τα ενήλικα. Επιπρόσθετα, η περιφερική χορήγηση απαιτεί διάβαση μέσω του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (ΑΕΦ). Ο χρόνος που ο φραγμός αυτός έχει διαταραχθεί λόγω της εγκεφαλικής βλάβης είναι καθορισμένος, κάτι που ίσως επιβάλλει ένα ακόμα διαφορετικό χρονικό παράθυρο στη θεραπευτική προσέγγιση περιφερικής χορήγησης. Η ικανότητα διάβασης των κυττάρων αυτών διαμέσω του ΑΕΦ σε συνάρτηση με το χρόνο τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες όσο και σε συνθήκες εγκεφαλικής βλάβης αναμένεται να μελετηθεί περαιτέρω. Περαιτέρω θα

57 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 57 μελετηθεί όμως και η κλινική σημαντικότητα μιας τέτοιας παρατήρησης, καθώς είναι πλέον σαφές πως για την ανατομική και κλινική βελτίωση δεν είναι απαραίτητη η παρουσία των κυττάρων αυτών στην περιοχή της βλάβης, αλλά αρκεί η δράση των νευροτροφικών και αυξητικών παραγόντων που αυτά εκκρίνουν (ενδεχόμενα με τη μορφή μικροσωματιδίων) 128. Ιδιαιτέρως οφείλουν να μελετηθούν οι κινητικές των Κυκλοφορούντων Προγονικών Κυττάρων μετά το βλαπτικό επεισόδιο. Ως σήμερα οι σχετικές μελέτες είναι λίγες ακόμα λιγότερες για τα νεογνά (βλ παραπάνω στην παράγραφο 1 για εκτενή αναφορά) και λίγα τα χρονικά στιγμιότυπα που ερευνώνται. Η έλλειψη δε ενιαίας μεθοδολογίας όσον αφορά το χαρακτηρισμό των προγονικών κυττάρων αποτελεί τη μεγαλύτερη τροχοπέδη στην εξαγωγή σαφών συμπερασμάτων. Είναι σαφές πως τα συμπεράσματα από πειραματικές μελέτες παρέμβασης δεν μπορούν να μεταφερθούν και να εφαρμοστούν σε αντίστοιχες κλινικές μελέτες παρέμβασης, αν πρώτα δεν επιβεβαιωθούν με μελέτες παρατήρησης στους ανθρώπους. Οι διαφορές στην κινητική των κυττάρων ανάμεσα σε ζώα και ανθρώπους αντιστοιχούν σε εντελώς διαφορετικό χρονικό στάδιο στην παθοφυσιολογία της βλάβης. Έτσι παρατηρούμε, για παράδειγμα διαφορετικό χρονοδιάγραμμα κινητοποίησης των προγονικών κυττάρων στους ανθρώπους με εγκεφαλικό επεισόδιο σε σχέση με το αντίστοιχο πειραματικό μοντέλο στα ποντίκια (μέγιστη κινητοποίηση την 1 η ημέρα μετά το συμβάν στα ποντίκια, ενώ στους ανθρώπους παρατηρήθηκε την 3 η ημέρα) 66,71 κ.ο.κ.. Μια άλλη πειραματική παρατήρηση που χρήζει προσοχής είναι οι αναφορές πως άκαιρη δράση των τροφικών παραγόντων ενδέχεται να φέρει δυσμενή αποτελέσματα, ακριβώς λόγω της πολύπλευρης δράσης που επιτελεί ο κάθε παράγοντας. Οι Zhang και συν. αναφέρουν πως χορήγηση του ανασυνδυασμένου ανθρώπειου VEGF 48 ώρες μετά από πρόκληση εστιακής εγκεφαλικής ισχαιμίας σε ποντίκια επέφερε αύξηση της αγγειογένεσης στην περιοχή της penumbra και λειτουργική βελτίωση, ενώ η πρώιμη χορήγηση (1 ώρα μετά την ισχαιμία) οδήγησε σε αύξηση της διαβατότητας του αιματοεγκεφαλικού φραγμού και επιδείνωση της βλάβης με αιμορραγία 210. Αν λάβουμε υπόψη πως ο τροφικός παράγοντας VEGF εκκρίνεται κατ εξοχήν από τα ενδογενή αλλά και εξωγενώς χορηγούμενα προγονικά κύτταρα 129,132, τότε η άκαιρη κλινική χορήγηση αυτών των κυττάρων μπορεί εν δυνάμει να οδηγήσει σε αντίθετα από τα προσδοκώμενα αποτελέσματα, με ολέθρια αποτελέσματα για τον ασθενή. Το ίδιο έχει παρατηρηθεί και για τη χορήγηση της νευροτροφίνης BDNF. Έχει θετικά αποτελέσματα αν χορηγηθεί την 5 η μέρα, καμία δράση αν χορηγηθεί αργότερα και επιδεινώνει τη βλάβη αν χορηγηθεί την 1 η μέρα της ζωής 200. Ως εκ τούτου ο παράγοντας «παράθυρο χορήγησης» χρήζει περαιτέρω μελέτης σε προκλινικό επίπεδο. Στάδιο διαφοροποίησης Από την άλλη πλευρά, το καταλληλότερο για μεταμόσχευση στάδιο διαφοροποίησης των προγονικών κυττάρων αποτελεί ακόμα αναπάντητο ερώτημα. Προκύπτουν θέματα (αυτο)αναγέννησης των κυττάρων, σωστής διαφοροποίησής τους, πιθανότητας

58 58 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ διαφοροποίησης προς άλλη κυτταρική σειρά και πιθανότητας καρκινογένεσης ή δημιουργίας τερατώματος. Λειτουργικότητα Το επόμενο ζητούμενο είναι τα μεταμοσχευθέντα κύτταρα να ενσωματωθούν ομοιόμορφα 273,274 και λειτουργικά. Το αποτέλεσμα στη λειτουργικότητα αποτελεί ένα τεράστιο κεφάλαιο που πρέπει να μελετηθεί εκτενέστερα. Οι πρώτες ενδείξεις είναι ενθαρρυντικές. Η ικανότητα της λειτουργικής αναγέννησης εξαρτάται εν τέλει από τη σοβαρότητα της βλάβης, από την κατάσταση του μικροπεριβάλλοντος και την ικανότητα των μεταμοσχευθέντων κυττάρων να πολλαπλασιάζονται, να μεταναστεύουν, να διαφοροποιούνται και να σχηματίζουν διασυνδέσεις επιτυχώς με τα γειτονικά κύτταρα. Μετά τη μεταμόσχευση και ως τη λειτουργική διαφοροποίηση απαιτείται χρόνος, κατά και μετά τον οποίο είναι αναγκαία η τροφική υποστήριξη του περιβάλλοντος και η προσπάθεια καταστολής της φλεγμονής και της νευρογλοιακής ουλής, καθώς επίσης και κατάλληλη θεραπεία αποκατάστασης για τη διαμόρφωση και σταθεροποίηση των νέων νευρωνικών συνδέσεων. Ασφάλεια Τέλος, η ασφάλεια των μεταμοσχεύσεων έχει καταδειχθεί επανειλημμένως για τα αυτόλογα κύτταρα 18,19,24,132,143,265,266,275. Τα παντοδύναμα εμβρυονικά κύτταρα ίσως ενέχουν τον κίνδυνο τερατώματος. Πάντως ο κίνδυνος ογκογένεσης «βάζοντας κάτι εκεί όπου δεν ανήκει» είναι υπαρκτός, όπως έχει περιγραφεί μετά από χορήγηση των MSCs στον εγκέφαλο Πειραματικές μελέτες μεταμόσχευσης προγονικών κυττάρων Μεταμόσχευση νευρικών προγονικών κυττάρων Μεταμόσχευση νευρικών προγονικών κυττάρων έχει πραγματοποιηθεί σε πειραματόζωα με επιτυχή διαφοροποίησή τους και θετικά λειτουργικά αποτελέσματα. Ανθρώπινα NSCs έχουν πολλαπλασιαστεί και διατηρηθεί επί ένα χρόνο υπό τη δράση του Επιδερμικού Αυξητικού Παράγοντα (Epidermal Growth Factor, EGF), του bfgf και του Ανασταλτικού παράγοντα της λευχαιμίας (LIF), επιδεικνύοντας στη συνέχεια σε πειραματόζωα επιτυχή μετανάστευση και διασύνδεση 260. Στην οξεία φάση πάντως η μεταμόσχευση NSCs προλαμβάνει το νευρωνικό θάνατο και το εγκεφαλικό οίδημα μετά από ισχαιμική βλάβη, ενώ οι αντι φλεγμονώδεις δράσεις επεκτείνονται και στην περιφέρεια 277. Μεταμόσχευση άλλων προγονικών κυττάρων Προγονικά κύτταρα από την ουσία του Wharton μεταναστεύουν, επιβιώνουν για τουλάχιστον 6 βδομάδες και διαφοροποιούνται σε νευρικά επιτυχώς. Ωστόσο λειτουργικά και νευροφυσιολογικά αποτελέσματα δεν έχουν ακόμα περιγραφεί 10,260.

59 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 59 Από τα κύτταρα του μυελού, τα μεσεγχυματικά, τα αιμοποιητικά και η υποομάδα των multipotent adult progenitor cell (MAPC) μπορούν να μεταναστεύσουν και να διαφοροποιηθούν επιτυχώς 260, ενώ παράλληλα αυξάνουν την έκφραση των νευροτροφικών παραγόντων στον βεβλαμένο εγκέφαλο 268. Τα CD34 + (του μυελού, του αίματος του ομφαλίου λώρου ή του περιφερικού αίματος) εισέρχονται στο ΚΝΣ και διαφοροποιούνται σε μακροφάγα και μικρογλοία, ενώ επιτείνουν την αγγειογένεση 38,171,278. Μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος του ομφαλίου λώρου μετά από ενδοφλέβια ή ενδοπεριτοναϊκή 266,269 έγχυση σε πειραματικό μοντέλο μεταναστεύουν στο σημείο της βλάβης, διαφοροποιούνται, ελαττώνουν την φλεγμονή και την απόπτωση και εμφανίζουν θετικά λειτουργικά αποτελέσματα. Η επίδραση αναφέρεται πως είναι δοσοεξαρτώμενη. Η επίδραση ουσιών στη διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού, όπως η μαννιτόλη, φαίνεται πως ενώ δεν αυξάνει τον αριθμό των κυττάρων που μεταναστεύουν προς τον εγκέφαλο, βελτιώνει τη λειτουργικότητα μέσω αύξησης στον εγκέφαλο των νευροτροφικών παραγόντων 11. Τέλος, μεταμόσχευση EPCs σε πειραματικά μοντέλα μυοκαρδιακής ισχαιμίας και ισχαιμίας άκρου οδήγησε στην παρατήρηση αυξημένης αγγειογένεσης και μειωμένης απόπτωσης Κλινικές μελέτες Πληθώρα ανέκδοτων ενθαρρυντικών αποτελεσμάτων αναφέρονται από διάφορα κέντρα σε όλο τον κόσμο, υποσχόμενα «θαύματα» μετά από μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων στις οικογένειες των πασχόντων (stem cell tourism). Ωστόσο πλέον αρκετές οργανωμένες κλινικές μελέτες έχουν δημοσιευτεί, περισσότερο σε ενήλικες και λιγότερο σε νεογνά. Σε ενήλικες Αρκετές κλινικές μελέτες χορήγησης αυτόλογων προγονικών κυττάρων (συνήθως από το μυελό των οστών) σε ασθενείς με ισχαιμία του μυοκαρδίου (σημειωτέον, κάποιες από τις μελέτες έχουν γίνει στην Ά Καρδιοχειρουργική κλινική του νοσοκομείου ΑΧΕΠΑ Θεσσαλονίκης) έχουν δείξει ασφάλεια στη χορήγηση αλλά και σημαντικές ενδείξεις remodeling μετά τη βλάβη 142, Γενικώς στις μελέτες αυτές τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα ήταν μέτρια ή προσωρινά. Ομοίως θετικά αλλά λιγότερο ενθαρρυντικά σε σχέση με τα πειραματικά πρότυπα ήταν και οι μελέτες σε περιφερική αγγειακή νόσο 290 ή σε εγκεφαλικό έμφρακτο 143,255,264. Σε νεογνά Οι δύο πρώτες οργανωμένες κλινικές μελέτες φάσης Ι σε νεογνά έχουν ήδη ολοκληρωθεί και έχουν δείξει ασφάλεια μετά από χορήγηση προγονικών κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, σε νεογνά με ΥΙΕ στο πανεπιστήμιο του Dukes χορηγήθηκαν αυτόλογα προγονικά κύτταρα από

60 60 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ το ομφάλιο αίμα σε 4 δόσεις τις πρώτες 72 ώρες της ζωής. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές ανεπιθύμητες ενέργειες, ενώ υπήρχαν ενδείξεις για βελτιωμένες επιδόσεις στο γνωστικό, λεκτικό και κινητικό τομέα στον πρώτο χρόνο της ζωής 19. Άλλη μελέτη στην Κορέα χορήγησε ενδοτραχειακά αλλογενή μεσεγχυματικά κύτταρα του ομφαλίου αίματος σε πρόωρα νεογνά. Πέρα από την ασφάλεια, υπήρχαν και σε αυτή τη μελέτη ενδείξεις μείωσης της σοβαρότητας της βρογχοπνευμονική δυσπλασίας 18. Μελέτη χορήγησης σε μεγαλύτερα παιδιά με εγκεφαλική παράλυση από το πανεπιστήμιο του Dukes είναι σε εξέλιξη Προγονικά κύτταρα και άλλες νευρολογικές νόσοι Εκτεταμένο ενδιαφέρον υπάρχει για τη χρήση των προγονικών κυττάρων σε ποικίλες νευρολογικές νόσους. Ειδικότερα τα προερχόμενα από το μυελό των οστών προγονικά κύτταρα έχουν μελετηθεί ως υποσχόμενα στη θεραπευτική στρατηγική της νόσου Parkinson 292, της νόσου Alzheimer 293, της γήρανσης του εγκεφάλου 294, της επιληψίας 295 και του τραύματος της νωτιαίου μυελού 296,297. Αξιοσημείωτο είναι επίσης πως αυξημένοι αριθμοί αιμοποιητικών CD34 + /CD38 κυττάρων στο μυελό βρέθηκαν σε ασθενείς με τραύμα του νωτιαίου μυελού 298. Τέλος, τα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα του μυελού των οστών επί πολλά χρόνια αποτελούν μέθοδο εκλογής στη θεραπεία πολλών μεταβολικών νοσημάτων Περιορισμοί στη χορήγηση προγονικών κυττάρων Ωστόσο στη χρήση αυτών των κυττάρων υπάρχουν και πολλές εγγενείς δυσκολίες. Είναι αρκετά δύσκολη η συλλογή τους από το περιφερικό αίμα για αυτόλογη χρήση, καθώς ο αριθμός τους που κυκλοφορεί είναι πολύ μικρός, μειώνεται δε με την πάροδο της ηλικίας 69. Ανάλογο πρόβλημα αποτελεί και ο μικρός (απόλυτος) αριθμός που συλλέγεται από το ομφάλιο αίμα των προώρων νεογνών, στοιχείο που εν μέρει αντιρροπείται από την αυξημένη δυναμικότητα των κυττάρων αυτών σε νεογνά μικρής διάρκειας κύησης 17,24,132,266,278. Άλλο σημαντικό ζήτημα αποτελεί η χρονική στιγμή της έγχυσης. Γενικώς ως βέλτιστος χρόνος χορήγησης των προγονικών κυττάρων έχει περιγραφεί η οξεία και υποξεία φάση μετά από την ιστική βλάβη. Σε αυτό το σύντομο χρονικό διάστημα προκειμένου για αυτόλογη χορήγηση τα κύτταρα πρέπει να συλλεχτούν από το μυελό των οστών, το ομφάλιο αίμα, το περιφερικό αίμα ή άλλους ιστούς, να επεξεργαστούν, να διαχωριστούν ενδεχόμενα από τα υπόλοιπα κύτταρα και να χορηγηθούν εγκαίρως (προτού μειωθεί η βιωσιμότητα τους ή χρησιμοποιηθούν παράγοντες, απαραίτητοι μεν για τη βιωσιμότητα ή τη διαφοροποίηση, οι οποίοι όμως εγείρουν ζητήματα ασφάλειας). Τεχνικά σήμερα αυτό είναι ακόμα αρκετά δύσκολο. Εναλλακτική μέθοδος είναι η χορήγηση αλλογενών κυττάρων ομφαλίου αίματος, στα οποία η πιθανότητα απόρριψης είναι σχετικά μικρή 18.

61 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 61 Τέλος, θεωρητικό εμπόδιο στην προσπάθεια εύρεσης κυττάρων με πολυδύναμες ιδιότητες είναι ο κίνδυνος ογκογένεσης, όπως ήδη περιγράφηκε (παράγραφος 5.1). Η μακροχρόνια παρακολούθηση των κλινικών μελετών που πρόσφατα έλαβαν χώρα, θα διαφωτίσει περισσότερο αυτό το πεδίο. 8. Προβληματισμοί αποτελεσματικότητα και μέλλον των κυκλοφορούντων προγονικών κυττάρων Το γεγονός ότι μετά από ισχαιμικό εγκεφαλικό συμβάν ένα μέρος της περιοχής οριακής αιμάτωσης (penumbra) δεν επιβιώνει, όπως και το γεγονός ότι ένα μεγάλο μέρος της ανατομικής βλάβης συντελείται όχι οξέως αλλά στη δευτερογενή και τριτογενή φάση μετά την ισχαιμία 1, οδηγεί σε προβληματισμό σχετικά με την ενδογενή δυνατότητα των κυκλοφορούντων προγονικών κυττάρων να βοηθήσουν αποτελεσματικά στον περιορισμό της βλάβης. Έτσι, παρόλο που τα κύτταρα αυτά αποδεδειγμένα σε προκλινικό επίπεδο έχουν τη δυνατότητα να μειώσουν την έκταση της βλάβης με τις αντιφλεγμονώδεις, ανοσοτροποποιητικές, νεο αγγειογενετικές και αναπλαστικές ιδιότητές τους, σε κλινικό επίπεδο τα αποτελέσματα μετριάζονται σημαντικά. Το γεγονός αυτό ενδεχόμενα να οφείλεται στη σημαντική βλάβη που υφίσταται το μικροπεριβάλλον της βλάβης (που σημειωτέον είναι αυτό που εκκρίνει και τις χημειοτακτικές και νευροτροφικές ουσίες), με αποτέλεσμα την ανεπαρκή κινητοποίηση των αναπλαστικών/προγονικών κυττάρων. Η παρατηρούμενη (και στην παρούσα μελέτη) ενδογενής κινητοποίηση των ΚΠΚ μετά από ιστική βλάβη είναι η καλύτερη απόδειξη ότι τα κύτταρα αυτά έχουν τις ιδιότητες και την ικανότητα για περιορισμό της βλάβης και ανάπλαση, καθώς οι ενδογενείς αυτοί μηχανισμοί επιλέχθηκαν ανάμεσα σε πολλούς και βελτιστοποιήθηκαν μέσα από τη διαδικασία της επιλογής κατά την εξέλιξη των ειδών (απόρριψη ανεπαρκών μηχανισμών και επικράτηση των πλέον αποτελεσματικών).με άλλα λόγια η φύση επέλεξε τους πιο αποτελεσματικούς μηχανισμούς μέσα από συνεχείς δοκιμές και απορρίψεις. Θα μπορούσε να ειπωθεί πως συνέβη επί χιλιάδες χρόνια κάτι ανάλογο με τις σύγχρονες κλινικές δοκιμές, μόνο που το θετικό συμπέρασμα δεν το προσδιόριζε η στατιστική επιστήμη αλλά η κλινική αποτελεσματικότητα και η φυσική επιλογή. Η προσεκτική λοιπόν παρατήρηση του τύπου της κινητοποίησης (κυτταρικοί υποπληθυσμοί που εμπλέκονται και χρονοδιάγραμμα αυτής) ίσως αποτελεί ιδανική επιλογή για μίμηση και ενίσχυση εξωγενώς, ενδεχομένως ορθότερα από την επιλογή των καταλληλότερων προς μεταμόσχευση κυττάρων μέσα από ολιγάριθμες (αναγκαστικά) κλινικές μελέτες που θα δρομολογηθούν. Γιατί είναι μάλλον απίθανο ένας μηχανισμός να λειτουργήσει αποτελεσματικά όταν επιβληθεί εξωγενώς (ιατρογενώς), όταν ο μηχανισμός αυτός δεν υφίσταται ενδογενώς, παρ όλο που τα «γρανάζια» αυτού του μηχανισμού είναι παρόντα στον οργανισμό. Με άλλα λόγια, αν οι υπό μελέτη κυτταρικοί πληθυσμοί ενδογενώς δεν επιτελούν (αποτελεσματικά ή ακόμα και λιγότερο αποτελεσματικά αυτό είναι εντελώς άλλη παράμετρος για μελέτη ) τουλάχιστον

62 62 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ μια προσπάθεια κινητοποίησης και περιορισμού της βλάβης, τότε οι συγκεκριμένοι πληθυσμοί είναι μάλλον απίθανο να βοηθήσουν εάν τους χορηγήσουμε εξωγενώς. Το δε άλλο μεγάλο θέμα του βέλτιστου χρόνου χορήγησης των κυττάρων αυτών θα μπορούσε ίσως να απαντηθεί πάλι μέσα από κλινικές μελέτες (ενδεχόμενα και με αποτελέσματα που να είναι κλινικά επιζήμια για τον ασθενή βλ. παραπάνω παράγραφο 5.1) ή (ενδεχόμενα πιο συνετά) ενισχύοντας ένα ήδη υπάρχοντα μηχανισμό που ίσως υπολειτουργεί. Ο μηχανισμός αυτός λειτουργεί με συγκεκριμένο χρονοδιάγραμμα και διαμεσολαβητές, έτοιμος προς μελέτη, μίμηση ή ενίσχυση. Ας μη ξεχνούμε ακόμα πως στον οργανισμό σχεδόν ποτέ ένας μηχανισμός δράσης δεν είναι αυτοτελής και αποκομμένος από το σύνολο, αλλά συνήθως διασυνδέεται με πολύπλοκο τρόπο με άλλους λιγότερο ή περισσότερο (φαινομενικά) σχετικούς μηχανισμούς (πχ νευρικό σύστημα, ανοσολογικό, ενδοκρινολογικό κτλ), ώστε όλοι μαζί να συντελέσουν σε ένα επιθυμητό αποτέλεσμα. Ως εκ τούτου, η εξωγενής επιβολή νέων μηχανισμών και ιδιαίτερα σε άκαιρο χρόνο μπορεί να έχει μη αναμενόμενα αποτελέσματα. Τέλος, υπενθυμίζουμε πως πολλές από τις περισσότερο αποτελεσματικές θεραπευτικές στρατηγικές είχαν τη βάση τους στη μελέτη της ενδογενούς απάντησης του οργανισμού. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν η χρήση της κορτιζόνης σε καταστάσεις στρες ή νόσου (η ενδογενής αύξηση των επιπέδων της κορτιζόλης δεν επαρκεί πάντα για την αντιμετώπιση πλειάδας νόσων και απαιτείται εξωγενής υποβοήθηση με χορήγηση κορτιζόνης). Επίσης, άλλο παράδειγμα αποτελεί η μόνη ως σήμερα αποτελεσματική θεραπευτική αντιμετώπιση της εγκεφαλικής βλάβης, η θεραπευτική υποθερμία. Η υποθερμία είναι γνωστό ότι αποτελεί μηχανισμό ενδογενούς αντιμετώπισης της εγκεφαλικής βλάβης σε ζώα, ενήλικες και νεογνά, ονομάζεται δε διεθνώς αυτός ο μηχανισμός με το ελληνικό όνομα αναπυρεξία (anapyrexia) Αλλά και άλλες υπό μελέτη θεραπευτικές στρατηγικές στη νεογνική εγκεφαλοπάθεια έχουν ως βάση τους ενδογενείς μηχανισμούς, όπως η χρήση μελατονίνης, ερυθροποιητίνης και τα ενδοκανναβοειδή 302. Από την άλλη μεριά, η κλινική παρατήρηση της μειωμένης αποτελεσματικότητας της ενδογενούς απάντησης ίσως οδηγήσει την έρευνα προς τη σωστή κατεύθυνση: γιατί ένας σοφά δομημένος πολύπλοκος μηχανισμός (που προφανώς λειτουργεί άψογα σε όλη τη διάρκεια της ζωής και μας προστατεύει) κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες ανεπαρκεί; Γιατί ακόμα και τα εξωγενώς χορηγούμενα προγονικά κύτταρα σε κλινικές μελέτες δεν έχουν στον ίδιο βαθμό τα θετικά αποτελέσματα που παρατηρούνται σε προκλινικό επίπεδο 143, ,287,288 ; Οι απαντήσεις στα ανωτέρω ερωτήματα θα χαράξουν και τις στρατηγικές που θα ακολουθηθούν στην έρευνα: ενίσχυση των κυκλοφορούντων προγονικών κυττάρων με εξωγενή χορήγηση κυττάρων, με χορήγηση παραγόντων που τα κινητοποιούν (πχ G CSF, ανταγωνιστές CXCR4/AMD3100) 71, με νευροτροφίνες 204 ή με ενδεχόμενα με τροποποιητές της διαπερατότητας του ΑΕΦ 138,303. Οι απαραίτητες απαντήσεις μπορούν να εικαστούν από τις μελέτες σε πειραματικά πρότυπα, αλλά διαφέρουν τουλάχιστον ως προς την παράμετρο του χρόνου όσον αφορά την εφαρμογή τους σε κλινικές δοκιμές. Συνεπώς η παρατήρηση των παθοφυσιολογικών μηχανισμών στους οποίους εμπλέκονται τα προγονικά κύτταρα μέσα από αντίστοιχες κλινικές μελέτες σε ανθρώπους αποτελεί μια καλή στρατηγική προσέγγιση, προκειμένου οι

63 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 63 μηχανισμοί αυτοί να «αντιγραφούν» και να ενισχυθούν με τον τρόπο (βέλτιστος κυτταρικός πληθυσμός, δόση, οδός χορήγησης) και στο χρόνο που αρμόζει. Η συνδυασμένη και εξατομικευμένη θεραπευτική προσέγγιση αποτελούν το μέλλον στην αντιμετώπιση της νεογνικής εγκεφαλικής βλάβης. 9. Παθοφυσιολογία της εγκεφαλικής βλάβης 9.1. Υποξική Ισχαιμική Εγκεφαλοπάθεια των τελειομήνων Η κύρια διαταραχή του νευρικού ιστού στο πλαίσιο της Υποξικής Ισχαιμικής Εγκεφαλοπάθειας είναι η έλλειψη οξυγόνου. Υποξαιμία ορίζεται η μειωμένη συγκέντρωση Ο 2 στο αίμα που αρδεύει τους ιστούς, υποξία είναι η μειωμένη ιστική συγκέντρωση Ο 2, ενώ ισχαιμία είναι η μειωμένη άρδευση καθ εαυτή. Συχνά, στη νεογνική περίοδο η υποξαιμία και η ισχαιμία μπορεί να αποτελέσουν αποτέλεσμα της ασφυξίας, της διαταραχής δηλαδή της διακίνησης των αναπνευστικών αερίων 1. Παθοφυσιολογία σε επίπεδο κυττάρου Σε υποξία, η έλλειψη του οξυγόνου, του τελικού αποδέκτη ηλεκτρονίων στην αναπνευστική αλυσίδα, έχει ως αποτέλεσμα την «κατάρρευση» του κύκλου του κιτρικού οξέος και της αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων, και την εκτροπή προς την αναερόβια οδό. Τα ηλεκτρόνια μεταφέρονται (αντί του οξυγόνου) στην εξωτερική στοιβάδα άλλων ενώσεων, σχηματίζοντας ελεύθερες ρίζες, οι οποίες εν συνεχεία οξειδώνουν τα ακόρεστα λιπαρά οξέα της κυτταρικής μεμβράνης, οδηγώντας σε κυτταρική νέκρωση ή απόπτωση 304. Η επίδραση του οξειδωτικού στρες είναι εντονότερη στα νεογνά, λόγω της ανωριμότητας των αντιοξειδωτικών μηχανισμών. Από την άλλη μεριά, εκτροπή προς την αναερόβια οδό έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της παραγωγής του γαλακτικού οξέος (και τη δημιουργία ιστικής οξέωσης) και τη δραματική μείωση παραγωγής ATP. Σε συνύπαρξη ισχαιμίας, όχι μόνο δεν προσφέρεται γλυκόζη λόγω της διαταραχής της αιμάτωσης, αλλά δεν αποβάλλονται και τα τοξικά προϊόντα του μεταβολισμού (CO 2, γαλακτικό) 1. Επιπρόσθετα, το συνηθέστερο περιγεννητικό συμβάν που οδηγεί σε εγκεφαλική βλάβη είναι η ασφυξία, δηλαδή η διαταραχή κατ εξοχήν των αερίων αίματος και της οξεοβασικής ισορροπίας. Συνέπειες αυτών είναι η βραδυκαρδία, η πτώση της αρτηριακής πίεσης και ταυτόχρονα της εγκεφαλικής αρτηριακής άρδευσης. Συμπερασματικά, η πρώιμη μεγάλη ενεργειακή κατάρρευση, το οξειδωτικό stress, η οξέωση, η συσσώρευση τοξικών προϊόντων του μεταβολισμού στους αυξημένου μεταβολισμού νευρώνες του νεογνικού εγκεφάλου συντελούν στη δημιουργία της πρωτογενούς νευρωνικής βλάβης. Εντός 2 3 ωρών από το ισχαιμικό συμβάν, η παροχή ενέργειας επανέρχεται σε φυσιολογικά επίπεδα. Όμως μια «δεύτερη ή καθυστερημένη ενεργειακή κατάρρευση»

64 64 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ επέρχεται μετά από 8 16 ώρες και κορυφώνεται το 2 ο 3 ο 24ωρο ζωής, που οφείλεται στην ιστική βλάβη που επήλθε και ειδικότερα στη μιτοχονδριακή βλάβη 305. Στο σημείο αυτό στοχεύει και η μόνη αποδεδειγμένη ως σήμερα θεραπευτική στρατηγική στην ΥΙΕ, η ήπια υποθερμία. Συγκεκριμένα μειώνεται η θερμοκρασία του σώματος κατά 3 4 ο C, και η εφαρμογή της γίνεται πριν να εμφανιστεί η δεύτερη ενεργειακή κατάρρευση και η έλευση νευρωνικής υπερδιεγερσιμότητας (σπασμών) (πριν δηλαδή τις 6 ώρες περίπου της ζωής) και για περίπου 72 ώρες. Ανάλογα με το βαθμό της υποξίας και την ευπάθεια των κυττάρων, μπορεί να επέλθει νέκρωση ή απόπτωση. Περισσότερο έντονα και σύντομα συμβάντα οδηγούν συνήθως σε νέκρωση, ενώ λιγότερο έντονα και παρατεταμένα σε απόπτωση. Επίσης τα προγονικά κύτταρα είναι περισσότερο επιρρεπή στην απόπτωση. Είναι δυνατό φυσικά σε κάποιον κυτταρικό πληθυσμό να παρατηρούνται στοιχεία νέκρωσης και σε άλλον στοιχεία απόπτωσης. Αρχικά συνήθως παρατηρείται νέκρωση και αργότερα κυριαρχεί η απόπτωση 306. Τέλος, πρόσφατα ερευνητές θεωρούν πως υπάρχει και τριτογενής φάση νευρωνικής βλάβης, που διαρκεί για μήνες ή και χρόνια, και οφείλεται σε παρατεταμένη φλεγμονή και επιγενετικές αλλαγές οι οποίες θα ανακόψουν τη διαδικασία της ανάπλασης (ωρίμανση ολιγοδενδροκυττάρων, νευρογένεση, συναπτογένεση) 307. Παθοφυσιολογία σε επίπεδο ιστών Η εγκεφαλική αιματική ροή φυσιολογικά έχει την ικανότητα να αυτορρυθμίζεται, ώστε να διατηρείται σχετικά σταθερή ανεξάρτητα από τις αυξομειώσεις της συστηματικής αρτηριακής πίεσης. Σε ισχαιμία, υπερκαπνία ή οξέωση (όπως συμβαίνει σε Υποξική Ισχαιμική Εγκεφαλοπάθεια) η αυτορρύθμιση διαταράσσεται και εγκαθιδρύεται μια «παθητική» εγκεφαλική ροή που ακολουθεί τις αυξομειώσεις της συστηματικής πίεσης («αγγειοπαράλυση»). Οι περισσότερο ευάλωτες περιοχές στη διαταραχή της αυτορρύθμισης είναι κατά σειρά η λευκή ουσία, ο φλοιός και λιγότερο το στέλεχος. Τα όρια της ικανότητας αυτορρύθμισης είναι σαφώς στενότερα στα πρόωρα νεογνά. Το κρίσιμο όμως σημείο είναι πως στο νεογνό η φυσιολογική αρτηριακή πίεση είναι πολύ κοντά στο κατώτερο όριο της δυνατότητας αυτορρύθμισης 1. Εν τέλει, μια εγκεφαλική κυκλοφορία με απώλεια της αυτορρύθμισης (που παθητικά ακολουθεί τις αυξομειώσεις της συστηματικής αρτηριακής πίεσης) εκθέτει τον εγκέφαλο σε σοβαρή ισχαιμία ακόμα και σε μικρή μόνο πτώσης της συστηματικής πίεσης. Επιπρόσθετα, υπάρχουν περιοχές στον εγκέφαλο που υποαρδεύονται λόγω ιδιαιτερότητας της ανατομικής κατανομής των κλάδων των αγγείων, όπως τα όρια των περιοχών που αιματώνουν οι τελικοί κλάδοι των αγγείων ή δύο γειτονικοί αρτηριακοί κλάδοι, πχ μεταξύ πρόσθιας και μέσης ή μεταξύ μέσης και οπίσθιας εγκεφαλικής αρτηρίας. Τέτοιες περιοχές είναι τα βάθη της αύλακας και οι παραοβελιαίες περιοχές του φλοιού 1. Οι περιοχές αυτές είναι ακόμα πιο ευάλωτες σε περίπτωση που χαθεί η εγκεφαλική

65 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 65 αυτορρύθμιση. Η συσχέτιση των παραπάνω παρατηρήσεων με περιοχές που πλήττονται από ισχαιμικό συμβάν είναι εμφανής. Μακροσκοπικές βλάβες στον εγκέφαλο Η ασφυξία αποτελεί μείζον πρόβλημα της περιγεννητικής περιόδου, καθώς συχνά καταλήγει σε εγκεφαλικές βλάβες, συχνότερες των οποίων είναι: το εγκεφαλικό οίδημα, η εκλεκτική νευρωνική νέκρωση και η παραοβελιαία βλάβη. Η κατάταξη αυτή δεν είναι πάντα τόσο ευδιάκριτη, καθώς οι αλληλοεπικαλύψεις αποτελούν μάλλον τον κανόνα παρά την εξαίρεση. Α) Το εγκεφαλικό οίδημα στα νεογνά θεωρείται πως είναι απότοκο της εγκεφαλικής νέκρωσης παρά η αιτία της. Πράγματι, σε νεότερες μελέτες δεν καταδεικνύεται η ύπαρξη εγκεφαλικού οιδήματος μετά από ασφυξία και χωρίς την παρουσία ιστικής νέκρωσης 308. Β) Η εκλεκτική νευρωνική νέκρωση αποτελεί την κατ εξοχήν μορφή εγκεφαλικής βλάβης που παρατηρείται στην ΥΙΕ. Οι κύριοι υποτύποι είναι: η διάχυτη νευρωνική βλάβη, η βλάβη φλοιού και εν τω βάθει πυρήνων, και η βλάβη εν τω βάθει πυρήνων και εγκεφαλικού στελέχους 1, Διάχυτη νευρωνική βλάβη λαμβάνει χώρα συνήθως μετά από πολύ έντονο και παρατεταμένο περιγεννητικό συμβάν. Περιλαμβάνει βλάβη όλου του νευράξονα και πρακτικώς μπορεί να προσβάλλει οποιαδήποτε περιοχή. Στα τελειόμηνα νεογνά περισσότερο ευάλωτες περιοχές σε ισχαιμία είναι με τη σειρά ο ιππόκαμπος, ο οπτικός φλοιός, η περιρολάνδειος περιοχή και τέλος ο υπόλοιπος φλοιός. Ο θάλαμος είναι ιδιαίτερα ευπρόσβλητος και συχνά συνδυάζεται με βλάβες των βασικών γαγγλίων και του στελέχους, αφήνοντας συχνά απρόσβλητο το φλοιό. Διαταραχές της ανάπτυξης της παρεγκεφαλίδας είναι είτε πρωτοπαθείς είτε δευτεροπαθείς λόγω ταυτόχρονης βλάβης του θαλάμου και των βασικών γαγγλίων (λόγω της διασυναπτικής αλληλεπίδρασης μεταξύ τους). Η βλάβη του φλοιού και εν τω βάθει πυρήνων συνήθως συμβαίνει σε μέτριο ως σοβαρό περιγεννητικό συμβάν παρατεταμένης διάρκειας και προσβάλλονται κυρίως οι παραοβελιαίες περιοχές, ο ιππόκαμπος, το κέλυφος του φακοειδούς πυρήνα και ο θάλαμος. Η βλάβη των εν τω βάθει πυρήνων και του εγκεφαλικού στελέχους προκαλείται από σοβαρό και αιφνίδιο περιγεννητικό συμβάν («ολική ασφυξία»). Συχνά η νευρολογική κατάσταση μπορεί σταδιακά να εμφανίσει σχετική βελτίωση, στοιχείο που αποδίδεται μάλλον στους ενδογενείς μηχανισμούς ανάπλασης και στην πλαστικότητα του νεογνικού εγκεφάλου. Οι βλάβες του φλοιού δεν απεικονίζονται καλά με το υπερηχογράφημα εγκεφάλου. Στην αξονική τομογραφία (CT) τις πρώτες μέρες εμφανίζονται έντονες, διάχυτες, αμφοτερόπλευρες υποπυκνωτικές περιοχές με απώλεια της διάκρισης λευκής φαιάς ουσίας, σε συνδυασμό με υπερπυκνωτικούς εν τω βάθει πυρήνες. Η ατροφία φλοιού και οι αυξημένοι υπαραχνοειδείς χώροι φαίνονται καλύτερα μετά από μερικές βδομάδες. Στην Μαγνητική Τομογραφία (MRI) εμφανίζεται επίσης απώλεια της διάκρισης λευκής φαιάς ουσίας και αυξημένο σήμα στην T1 (εικόνα 7) και (ιδίως μετά τις 32 ώρες) αυξημένο και στην DWI (Diffusion weighted MRI) (μειωμένη διάχυση). Η βλάβη των βασικών γαγγλίων και

66 66 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ του θαλάμου απεικονίζονται ικανοποιητικά στο υπερηχογράφημα, ιδιαίτερα αν συνυπάρχει και αιμορραγία. Το ίδιο ισχύει και για τη CT, με υποπυκνωτική απεικόνιση και απώλεια της διάκρισης αυτών των ανατομικών στοιχείων, ενώ υπερπυκνωτική απεικόνιση παρατηρείται σε αιμορραγία ή ασβεστοποίηση. Σε απώλεια θαλαμικού ιστού η τρίτη κοιλία διατείνεται. Στην MRI παρομοίως έχουμε αυξημένο σήμα στην T1 και FLAIR ακολουθία και από την 6 η ώρα περίπου αυξημένο και στην DWI (εικόνα 3). Η DWI είναι πιο ευαίσθητη στην ανίχνευση βλαβών του φλοιού και των εν τω βάθει πυρήνων, ενώ με την ποσοτική ογκομετρική MRI καταδεικνύεται σαφέστερα η απώλεια όγκου των βασικών γαγγλίων και η λέπτυνση του φλοιού. Το εγκεφαλικό στέλεχος είναι αρκετά «εν τω βάθει» για να απεικονιστεί ικανοποιητικά από το υπερηχογράφημα, αλλά στην MRI εμφανίζεται αυξημένο σήμα (ιδίως στην καλύπτρα) 1,310,313,314. Εικόνα 3: Βλάβη των βασικών γαγγλίων : a) ήπια, b) μέτρια και c) σοβαρή ( ως παθολογικό χαμηλής έντασης σήμα φαίνεται το οπίσθιο σκέλος της έσω κάψας) d) αυξημένο σήμα στην DWI (μειωμένη διάχυση) Γ) Παραοβελιαία βλάβη. Αποτελεί την κύρια διαταραχή στα τελειόμηνα νεογνά με περιγεννητική ασφυξία. Παθογενετικά, είναι περιοχή που είναι στα όρια των τελικών αρτηριακών κλάδων, οπότε είναι πολύ ευάλωτη στην υπόταση (εικόνα 4α). Η βλάβη είναι συνήθως αμφοτερόπλευρη (αν και το ένα ημισφαίριο μπορεί να πληγεί εντονότερα), περιλαμβάνει το φλοιό και την υποκείμενη λευκή ουσία. Είναι εμφανέστερη στις βρεγματοινιακές περιοχές, που αποτελούν τα όρια της πρόσθιας, μέσης και οπίσθιας εγκεφαλικής αρτηρίας. Στη μορφή αυτή της βλάβης τα εγγύς τμήματα των άνω άκρων επηρεάζονται περισσότερο από των κάτω άκρων (εικόνα 4β). Σε μεγαλύτερες ηλικίες εμφανίζονται διαταραχές της κινητικής λειτουργίας (σπαστική τετραπάρεση) και της διανοητικής κατάστασης. Εξέταση εκλογής αποτελεί η MRI που εμφανίζει αυξημένο σήμα στις Τ1 και FLAIR ακολουθίες (εικόνα 5), ενώ το υπερηχογράφημα εγκεφάλου και η CT δεν έχουν καλή απεικονιστική ευαισθησία 1,310,313,314.

67 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 67 α) β) Εικόνα 4 : α) Παθογενετικός μηχανισμός παραοβελιαίας βλάβης β) Τοπογραφική εξήγηση κλινικών συμπτωμάτων της παραοβελιαίας βλάβης (ανθρωπάριο του κινητικού φλοιού) 1(τροποποίηση) α) β) γ) Εικόνα 5: Παραοβελιαία βλάβη της λευκής ουσίας α) στην Τ1, β) Τ2 ακολουθία και γ) στηνdwi. Για τη σύνδεση του περιγεννητικού συμβάντος με μεταγενέστερα νευρολογικά ελλείμματα, όπως η εγκεφαλική παράλυση, είναι απαραίτητο να μεσολαβήσει η σαφής παρουσία νεογνικής εγκεφαλοπάθειας. Η παρουσία ασφυξίας και εν συνεχεία η πρώιμη παρουσία εγκεφαλοπάθειας αποτελούν τον καλύτερο δείκτη εγκεφαλικής βλάβης. Αυτά τα δύο στοιχεία εξάλλου είναι τα δύο σύγχρονα βασικά κριτήρια που χρησιμοποιούν σήμερα οι περισσότεροι διεθνείς φορείς για να ταυτοποιήσουν την υποξική εγκεφαλική βλάβη 315.

68 68 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Υπάρχουν διάφορες ταξινομήσεις των βαθμών της εγκεφαλοπάθειας, αλλά η ευρύτερα χρησιμοποιούμενη είναι η κλασική ταξινόμηση των Sarnat και Sarnat 316 : Βαθμός 1 Βαθμός 2 Βαθμός 3 Διάρκεια <24h 2 14 μέρες Ώρες ως βδομάδες Επίπεδο συνείδησης Εγρήγορση Λήθαργος Κώμα Σπασμοί Απουσία Συχνοί Συχνοί ΗΕΓ Φυσιολογικό Περιοδικό ή παροξυσμοί, χαμηλό δυναμικό, σπασμοί Περιοδικό, καταστολή των παροξυσμών ή ισοηλεκτρικό Μυϊκός τόνος Φυσιολογικός ή Υποτονία Απουσία υπερτονία Τενόντια αντανακλαστικά Αυξημένα Αυξημένα Μειωμένα ή απόντα Μυϊκός κλώνος Παρών Παρών Απών Ανταν. απομύζησης Αδύναμο Αδύναμο ή απόν Απόν Moro Υπερεκφράζεται Όχι πλήρες Απόν Οφθαλμοαιθουσιαίο Φυσιολογικό Υπεραντιδρών Αδύναμο ή απόν Κόρες Μυδρίαση, Μύση, αντιδρώσες Ποικίλει αντιδρώσες Καρδιακός ρυθμός Αυξημένος Μειωμένος Ποικίλει Κινητικότητα Γαστρεντερικού Φυσιολογική ή Αυξημένη Ποικίλει μειωμένη ΠΡΟΓΝΩΣΗ Γενικώς καλή Ποικίλει Γενικώς δυσοίωνη Γενικώς, ο βαθμός 1 κατά Sarnat και Sarnat (ήπια εγκεφαλοπάθεια) έχει καλή πρόγνωση, ενώ ο βαθμός 3 (σοβαρή εγκεφαλοπάθεια) άσχημη πρόγνωση (θάνατος ή βαριά αναπηρία). Ο βαθμός 2 (μέτρια εγκεφαλοπάθεια) παρουσιάζει πιο ετερογενές φάσμα νευρολογικών εκδηλώσεων, καθώς και «εκλεπτυσμένες» μαθησιακές ή συμπεριφορικές διαταραχές στην όψιμη παιδική και εφηβική περίοδο 317 : συχνά το νοητικό πηλίκο είναι χαμηλότερο από εκείνο των παιδιών με ήπια εγκεφαλοπάθεια ή της ομάδας ελέγχου (υγιή παιδιά), ωστόσο παραμένει σε φυσιολογικά όρια και οι γενικές γνωστικές τους ικανότητες δεν υστερούν. Οι βιβλιογραφικές αναφορές δεν ταυτίζονται πάντα, αλλά αρκετές μελέτες καταδεικνύουν ελλείμματα στη γλώσσα, το λεξιλόγιο, ελλείμματα οπτικοκινητικής συνέργιας, ελλείμματα στην ανάγνωση, γραφή, ορθογραφία και μαθηματικά, ενώ μόνο τα παιδιά με βαριά εγκεφαλοπάθεια υστερούν ολόκληρη τάξη ή τάξεις από την ομάδα ελέγχου. Η αφηγηματική, η ακουστική, η βραχυπρόθεσμη και μεσοπρόθεσμη μνήμη φαίνεται να επηρεάζονται ιδιαίτερα σε κάποιες μελέτες, σε αντίθεση με την άθικτη μνήμη προσώπων, ονομάτων, καθημερινότητας και τον προσανατολισμό. Συμπεριφορικά, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου, αναφέρονται υποκειμενικά προβλήματα υπερκινητικότητας, επιθετικότητας, παθητικότητας, άγχους και υπακοής στους γονείς, ενώ δεν παρατηρείται διαφορά στην παρορμητικότητα και τον εθισμό

69 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ιδιαιτερότητες της εγκεφαλικής βλάβης στα πρόωρα Με τον όρο εγκεφαλοπάθεια της προωρότητας περιγράφεται η μορφή της εγκεφαλικής βλάβης που συνήθως συμβαίνει στα πολύ χαμηλού βάρους γέννησης πρόωρα νεογνά (VLBW, <1500g 1,5% των ζώντων γεννήσεων). Η ενδοκοιλιακή αιμορραγία και η περικοιλιακή λευκομαλακία (periventricular leukomalacia, PVL) αποτελούν τον κλασικό τύπο εγκεφαλικής βλάβης σε αυτά τα παιδιά και συχνά συνοδεύεται από νευρωνική/αξονική βλάβη της λευκής ουσίας, του φλοιού, των βασικών γαγγλίων, του στελέχους και/ή της παραγκεφαλίδας 1,321. Τόσο οι μηχανισμοί της ισχαιμίας/επαναιμάτωσης όσο και της φλεγμονής/λοίμωξης οδηγούν στη δημιουργία οξειδωτικού στρες και στην εγκατάσταση εστιακής βλάβης/νέκρωσης και εν συνεχεία σχηματισμού «ουλής»/γλοίωσης, ενώ βλάπτονται και τα όψιμα προγονικά ολιγοδενδροκύτταρα που υπό φυσιολογικές συνθήκες οδηγούν σε επαρκή μυελίνωση 322. Η περικοιλιακή λευκομαλακία αναφέρεται σε βλάβη που υφίσταται η λευκή ουσία ραχιαία και πλάγια των εξωτερικών γωνιών των πλαγίων κοιλιών (εικόνα 6). Αφορά νέκρωση μακροσκοπική, με σχηματισμό κυστών (κυστική/εστιακή PVL) ή μικροσκοπική, χωρίς κύστες και με διάχυτη γλοίωση (μη κυστική/διάχυτη PVL). Συναντάται κυρίως σε περιγεννητική ασφυξία προώρων νεογνών, αλλά και σε τελειόμηνα (ως και στο 30 50%). Στα τελευταία εικάζεται ότι μπορεί να προέρχεται από συμβάν του τρίτου τριμήνου της κύησης. Εικόνα 6: Περικοιλιακή λευκομαλακία, τοπογραφία και παθογένεση 1(τροποποίηση)

70 70 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Το τρίγωνο των πλαγίων κοιλιών και η περιοχή γύρω από το τρήμα του Monro είναι οι συνηθέστερες περιοχές νέκρωσης, καθώς είναι τα όρια των μακρών διατιτραινουσών αρτηριών και περιοχές οριακής αιμάτωσης (εικόνα 6). Σε διάχυτη γλοίωση προσβάλλονται κυρίως τα προγονικά ολιγοδενδροκύτταρα (pre OL), με αποτέλεσμα την υπομυελίνωση, το μειωμένο όγκο λευκής ουσίας και την αντιδραστική διάταση των πλαγίων κοιλιών. Η κυστική μορφή απεικονίζεται εύκολα με το υπερηχογράφημα εγκεφάλου (όταν η κύστη είναι >3mm ). Την 1 η εβδομάδα η αυξημένη τοπικά ηχογένεια αντιπροσωπεύει τη νέκρωση ή και την αιμορραγία, τις επόμενες 15 μέρες στην περιοχή της νέκρωσης εμφανίζονται κύστεις (ηχοδιαφάνεια), οι οποίες εν συνεχεία στους επόμενους 1 2 μήνες υφίστανται συρρίκνωση και μπορεί να εξαφανισθούν και να εμφανισθεί διάταση των κοιλιών. Με τη βελτίωση της μαιευτικής και περιγεννητικής φροντίδας τις τελευταίες δεκαετίες (και ιδιαιτέρως με τη χρήση προγεννητικά στεροειδών, τη χορήγηση επιφανειοδραστικού παράγοντα και την λιγότερο επεμβατική αναπνευστική υποστήριξη στις νεογνολογικές μονάδες) η συχνότητα της κυστικής λευκομαλακίας έχει μειωθεί και τη θέση της πήραν πιο «λεπτές» μορφές βλάβης, η μη κυστική/διάχυτη PVL. Η τελευταία είναι δύσκολο να διαγνωσθεί με το υπερηχογράφημα, ειδικά στα αρχικά στάδια. Έτσι, για τη μη κυστική μορφή ενδείκνυται η μαγνητική τομογραφία, η οποία απεικονίζει και τη διάχυτη γλοίωση. Η αξονική τομογραφία εμφανίζει υποπυκνωτικά στοιχεία περικοιλιακά, αλλά κυρίως μείωση της λευκής ουσίας (μπορεί η αύλακα να φθάνει ως το τοίχωμα των πλαγίων κοιλιών), διάταση των πλαγίων κοιλιών με ανώμαλο περίγραμμα, ασβεστοποίηση και αιμορραγικά στοιχεία ενδοπαρεγχυματικά ή ενδοκοιλιακά. Στην MRI εμφανίζονται με μεγαλύτερη διακριτική ευχέρεια οι ανωτέρω βλάβες (εικόνα 7, a c). Μειωμένο σήμα φαίνεται στην Τ1 και αυξημένο στην Τ2 ακολουθία. Στο 50% των ασφυκτικών τελειομήνων ανιχνεύεται μειωμένο σήμα στο οπίσθιο σκέλος της έσω κάψας (ευαίσθητος αρνητικός προγνωστικός δείκτης). Η ποσοτική ογκομετρική MRI καταδεικνύει σαφέστερα την απώλεια όγκου της λευκής ουσίας (απώλεια μυελίνωσης, νευραξόνων ή και τα δύο), ιδίως στην κινητικοαισθητική και βρεγματοϊνιακή περιοχή. Με την diffusion tensor MRI ανιχνεύονται διαταραχές της ανάπτυξης των αξονικών οδών 1,314,321,323,324. Τα νεογνά με PVL εμφανίζουν συνήθως μυϊκή αδυναμία των κάτω άκρων και παθολογικά οπτικά προκλητά δυναμικά (προσβολή της οπτικής ακτινοβολίας), ενώ σε μεγαλύτερες ηλικίες εμφανίζουν κατά κύριο λόγο το πρότυπο της σπαστικής διπληγίας. Σε ήπιες προσβολές συχνά εμφανίζεται σταδιακά κλινική βελτίωση της σπαστικής διπληγίας. Η τοπογραφία της βλάβης εξηγεί την μεγαλύτερη προσβολή των κάτω άκρων σε μέτρια βλάβη, ενώ σε μεγάλες βλάβες που προσβάλλονται σημαντικά και τα άνω άκρα έχουμε και διανοητικά ελλείμματα 1.

71 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 71 d e f Εικόνα 7: a c: Περικοιλιακή λευκομαλακία. a) Τ2 ακολουθία που καταδεικνύει αιμορραγική βλάβη της λευκής ουσίας, b)&c) στους 16 μήνες φαίνεται η μείωση της λευκής ουσίας (ατροφία), η διάταση των πλαγίων κοιλιών με ανώμαλο περίγραμμα και περικοιλιακά γλοίωση (βέλος). d f: Ενδοκοιλιακή αιμορραγία. d) I βαθμού, e) II βαθμού, f) III βαθμού 325 Η ενδοκοιλιακή αιμορραγία (Intraventricular haemorrhage, IVH) αρχίζει στην υποεπενδυματική βλαστική στοιβάδα της πλάγιας κοιλίας, που αποτελεί πηγή προγονικών κυττάρων της νευρικής σειράς. Ενδοαγγειακοί παράγοντες (απώλεια της αγγειακής αυτορρύθμισης σε συνδυασμό με αιφνίδιες μεταβολές της συστηματικής αρτηριακής πίεσης, αυξημένη εγκεφαλική φλεβική πίεση και διαταραχές της πήξης), αγγειακοί παράγοντες (ανωριμότητα των τριχοειδών στη βλαστική στοιβάδα) και εξωαγγειακοί παράγοντες (αυξημένη ινωδολυτική δραστηριότητα στη βλαστική στοιβάδα και μειωμένη ιστική πίεση περιαγγειακά) αποτελούν τους κυριότερους παθογενετικούς μηχανισμούς. Η ενδοκοιλιακή αιμορραγία ταξινομείται σε 4 βαθμούς με βάση τη βαρύτητα της προσβολής (εικόνα 7, d f): Ι: αιμορραγία της βλαστικής στοιβάδας, ΙΙ: η αιμορραγία επεκτείνεται στις κοιλίες, χωρίς αυτές να διαταθούν, ΙΙΙ: επέρχεται και διάταση των κοιλιών, ΙV: συνυπάρχει και αιμορραγικό φλεβικό έμφρακτο. Κλινικώς, η ενδοκοιλιακή αιμορραγία εκδηλώνεται κυρίως με τη μορφή 3 συνδρόμων: καταστροφικό σύνδρομο (δραματική κλινική εξέλιξη σε λεπτά ως ώρες, κυρίως σε σοβαρού βαθμού ενδοκοιλιακή αιμορραγία), «αναπηδητικό/ασυνεχές» σύνδρομο (ηπιότερη και ασυνεχής κλινική εικόνα, συχνά με ευνοϊκή έκβαση) και κλινικά βουβό σύνδρομο. Η διάγνωση και η παρακολούθηση γίνεται με το υπερηχογράφημα εγκεφάλου, ενώ συχνά επακόλουθα είανι η διαταραχή στη

72 72 Α) ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ νευρογένεση και μυελίνωση, το περικοιλιακό αιμορραγικό έμφρακτο και ο μεθαιμορραγικός υδροκέφαλος 1,321,326,327. Παρ όλη τη βελτίωση της φροντίδας στις νεογνολογικές μονάδες, τα τελευταία 15 χρόνια η συχνότητα της σοβαρής μορφής IVH και της PVL παρέμεινε σχετικά αμετάβλητη 322, ενώ ο αριθμός των VLBW νεογνών που επιβιώνουν αυξάνεται. Η σημαντικότητα της βλάβης καθιστά επιβλητική την αναζήτηση νέων νευροπροστατευτικών μεθόδων. Ειδικότερα, θα πρέπει να μελετηθεί εκτενέστερα η χορήγηση εξωγενώς προγονικών κυττάρων με σκοπό την προστασία των προ ολιγοδενδροκυττάρων, αλλά και να μελετηθεί η δυνατότητα ενδογενούς ανάπλασης/επαναμυελίνωσης. Προγονικά κύτταρα του αίματος του ομφαλίου λώρου έχει δειχθεί πως προστατεύουν τα ώριμα ολιγοδενδροκύτταρα (OL) σε μοντέλο στέρησης οξυγόνου και γλυκόζης, αλλά δεν υπάρχουν δεδομένα για τα όψιμα προγονικά OL (preol), τα οποία και κατεξοχήν βλάπτονται στη μορφή αυτή της εγκεφαλοπάθειας 328. Τα προγονικά OL ενήλικης ή εμβρυϊκής προέλευσης έχουν αποδειχθεί ικανά να μυελινώσουν αμύελους άξονες σε πειραματικό μοντέλο 329. Ωστόσο, τα preol μπορεί να μην είναι από μόνα τους ικανά να αποκαταστήσουν τη λειτουργικότητα στην εγκεφαλοπάθεια των προώρων, καθώς οι βλάβες είναι πιο σύνθετες και περιλαμβάνουν και απώλειες νευρώνων. Και σε αυτό τον τύπο της εγκεφαλικής βλάβης η χρονική αλληλουχία των βασικών γεγονότων παραμένει η ίδια: αρχικά συμβαίνει άμεσος κυτταρικός θάνατος των preol ανεξάρτητος από την κασπάση 3 και στη συνέχεια καθυστερημένος θάνατος εξαρτώμενος από την κασπάση 3. Εν συνεχεία ακολουθεί έντονη αναγεννητική δραστηριότητα με τον πολλαπλασιασμό και τη συσσώρευση των preol, που δεν καταφέρνουν όμως να ωριμάσουν και να ξεκινήσουν τη μυελίνωση 75. Για μια ακόμη φορά οι διαταραχές στο μικροπεριβάλλον από τη βλάβη μπορεί να είναι καθοριστικές. Ενδεχόμενα την ίδια τύχη να έχουν και εξωγενώς χορηγηθέντα προγονικά OL, γι αυτό οι προσπάθειες θα πρέπει να εστιαστούν στο μικροπεριβάλλον και στην υποβοήθηση της διαφοροποίησης.

73 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 73

74 74 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

75 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Μεθοδολογία 1.1. Τύπος μελέτης και Πληθυσμός μελέτης Η μελέτη διεξήχθη στην Ά Νεογνολογική Κλινική και Εντατική Νοσηλεία Νεογνών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (τριτοβάθμιο κέντρο), στο Ιπποκράτειο Γενικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης, από το Δεκέμβριο του 2010 έως το Νοέμβριο του 2013, και είναι προοπτική μελέτη κοόρτης (cohort). Μελετήθηκαν 2 ομάδες ασθενών: i. Τα πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια της προωρότητας (ομάδα ασθενών), τα οποία συγκρίθηκαν με πρόωρα χωρίς εγκεφαλοπάθεια (μάρτυρες). Η διάκριση έγινε με βάση την παρουσία ή όχι εγκεφαλικής βλάβης (ενδοκοιλιακή αιμορραγία (IVH) 3 ου ή 4 ου βαθμού, περικοιλιακή λευκομαλακία (PVL) ή έμφρακτο). ii. Τα τελειόμηνα νεογνά με περιγεννητική ασφυξία και υποξική ισχαιμική εγκεφαλοπάθεια (ΥΙΕ) (ομάδα ασθενών), τα οποία συγκρίθηκαν με φυσιολογικά τελειόμηνα (μάρτυρες). Η ομάδα της ΥΙΕ χωρίστηκε στις ομάδες της μέτριας/βαριάς ΥΙΕ (στην οποία κατ εξοχήν εμφανίζονται μακροχρόνια νευροαναπτυξιακά προβλήματα και η οποία αποτελεί στόχο νέων θεραπευτικών στρατηγικών) και στην ομάδα της ήπιας εγκεφαλοπάθειας. Τα νεογνά μελετήθηκαν από την 1 η ημέρα ζωής έως την 45 η ημέρα σε 5 χρονικά στιγμιότυπα (1 η, 3 η, 9 η, 18 η και 45 η ημέρα ζωής), καθώς και στον 8 ο και 24 ο μήνα ζωής. Κριτήρια εισόδου στη μελέτη ήταν η προωρότητα (διάρκεια κύησης (ΔΚ) <33w) για την ομάδα των προώρων νεογνών και η εμφάνιση περιγεννητικού συμβάντος (ασφυξίας) σύμφωνα με τους διεθνείς ορισμούς 315,316 για τα τελειόμηνα νεογνά (ΔΚ>37w). Κριτήρια αποκλεισμού για όλα τα νεογνά ήταν η ύπαρξη ενδομήτριας καθυστέρησης της αύξησης, μείζονες συγγενείς διαμαρτίες ή μεταβολικές διαταραχές, λοίμωξη του ΚΝΣ, συγγενείς διαταραχές της πήξης και δίδυμη κύηση με μείζονα προβλήματα στο άλλο έμβρυο (διαμαρτίες ή θνησιγενές). Η μελέτη είχε την έγκριση της Επιτροπής Βιοηθικής της Ιατρικής σχολής του Α.Π.Θ., του Επιστημονικού Συμβουλίου του Γ.Ν.Θ. Ιπποκρατείου, καθώς και την έγγραφη συγκατάθεση των γονέων των νεογνών.

76 76 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1.2. Ορισμοί Τα τελειόμηνα νεογνά ανάλογα με την κλινική τους εικόνα, το Apgar Score, τη μέτρηση της οξεοβασικής ισορροπίας στο αίμα του ομφαλίου λώρου ή αμέσως μετά τη γέννηση και κατά περίπτωση την ηλεκτρική δραστηριότητα του εγκεφάλου που καταγράφηκε στο aeeg (Amplitude integrated electroencephalography) (Olympic CFM 6000,Olympic Medical Inc, Seattle, WA), κατατάχθηκαν στις ομάδες της ήπιας, της μέτριας και της βαριάς εγκεφαλοπάθειας, σύμφωνα με τα κριτήρια των Sarnat & Sarnat 316. Όλα τα νεογνά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια πληρούσαν τα κριτήρια της περιγεννητικής ασφυξίας του Αμερικανικού Κολλεγίου Μαιευτήρων/Γυναικολόγων (ACOG) 315. Η επιβεβαίωση της εγκεφαλικής βλάβης έγινε με μαγνητική τομογραφία, άμεσα μόλις η κλινική κατάσταση του νεογνού το επέτρεπε. Η διάγνωση της εγκεφαλικής βλάβης στα πρόωρα νεογνά βασίστηκε σε διαδοχικά υπερηχογραφήματα εγκεφάλου (συχνότερα κατά την 1 η εβδομάδα ζωής) 330 ή/και σε μαγνητική τομογραφία (κοντά στην ηλικία της τελειόμηνης ωριμότητας, ανάλογα με την κλινική κατάσταση του νεογνού). Σε κλινική υποψία σπασμών, η ηλεκτρική δραστηριότητα του εγκεφάλου παρακολουθήθηκε με aeeg. Η διάγνωση της βρογχοπνευμονικής δυσπλασίας (ΒΠΔ) έγινε σύμφωνα με τα διεθνή κριτήρια και με βάση τις ανάγκες σε Ο 2 μετά την 36 η εβδομάδα από τη σύλληψη (ή μετά την 28 η ημέρα ζωής εάν το νεογνό γεννήθηκε με ΔΚ>32w) 331. Η διάγνωση του συνδρόμου αναπνευστικής δυσχέρειας (ΣΑΔ) βασίστηκε στην κλινική εξέταση, τα αέρια αίματος και την ακτινογραφία θώρακος και στον αποκλεισμό λοίμωξης 332,333. Η διάγνωση της νεκρωτικής εντεροκολίτιδας (ΝΕΚ) έγινε με βάση τα τροποποιημένα κριτήρια Bell (>στάδιο ΙΙ βέβαιη ΝΕΚ) 334. H διάγνωση της αμφιβληστροειδοπάθειας της προωρότητας έγινε σύμφωνα με τα διεθνή κριτήρια, με βάση την παρουσία νεοαγγείωσης στον αμφιβληστροειδή (στάδιο >3) 335. Η παρουσία λοίμωξης διαγνώστηκε με βάση την κλινική εικόνα και την παρουσία παθολογικών εργαστηριακών ευρημάτων (αυξημένη CRP 15 mg/l, λευκοκυττάρωση ή λευκοπενία, θετική καλλιέργεια αίματος). Αν η καλλιέργεια αίματος δεν ήταν διαθέσιμη ή ήταν αρνητική παρ όλο που η κλινική εικόνα και οι υπόλοιποι εργαστηριακοί δείκτες ήταν ενδεικτικοί λοίμωξης, η κατάσταση χαρακτηριζόταν ως «πιθανή λοίμωξη» και αντιμετωπιζόταν ανάλογα. Η παρουσία ανοιχτού βοταλλείου πόρου (patent ductus arteriosus, PDA) διαγνώστηκε με τη χρήση υπερηχογραφήματος επί κλίνης από έμπειρο νεογνολόγο και εν συνεχεία από παιδο καρδιολόγο.

77 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 77 Η διάγνωση της χοριοαμνιονίτιδας έγινε με βάση την απομόνωση παθογόνου οργανισμού από το αμνιακό υγρό ή το αίμα της μητέρας και/ή την παρουσία περιγεννητικά εμπυρέτου στη μητέρα σε συνδυασμό με αυξημένους δείκτες φλεγμονής, καθώς και από την παρουσία θολερού και/ή δύσοσμου αμνιακού υγρού. Ως ΠΡΕΥ (πρόωρη ρήξη εμβρυικών υμένων) ορίστηκε η ρήξη των υμένων >18 ώρες πριν τον τοκετό Εργαστηριακός έλεγχος Για τη μέτρηση των κυκλοφορούντων προγονικών κυττάρων καθώς και των βιολογικών δεικτών της μελέτης δειγματοληψία γινόταν την 1 η ημέρα ζωής (εύρος: 12 η 24 η ώρα ζωής), την 3 η ημέρα ζωής (49 η 84 η ώρα ζωής), την 9 η ημέρα ζωής (±24 ώρες), τη 18 η ημέρα ζωής (±48 ώρες), τη 45 η ημέρα ζωής (±72 ώρες), μετά τον 8 ο μήνα ζωής (8 ος 12 ος μήνας διορθωμένης ηλικίας) και μετά το 2 ο έτος ζωής (24 ος 30 ος μήνας διορθωμένης ηλικίας). Την πρώτη ημέρα ζωής αποφεύχθηκε η πολύ πρώιμη δειγματοληψία τις πρώτες ώρες ζωής, ώστε να αποφευχθούν οι πιθανές μεγάλες διακυμάνσεις των CD34 + προγονικών κυττάρων κατά τις πρώτες ώρες που διαπιστώθηκαν σε προηγούμενες μελέτες 53,54. Η κυτταρομετρία ροής έγινε μέσα σε 24 ώρες από τη δειγματοληψία (συνήθως τις πρώτες 4 ώρες), ενώ οροί και πλάσμα συλλέχθηκαν για τη μέτρηση των βιολογικών δεικτών σύμφωνα με τα πρωτόκολλα των κατασκευαστών αυτών και αποθηκεύθηκαν στους 80 ο C έως την ημέρα της μέτρησης. Κυτταρομετρία ροής Περιφερικό αίμα συλλεγόταν σε σωληνάρια με αντιπηκτικό EDTA. Ποσότητα 100 μl αίματος επωαζόταν για 15 λεπτά σε σωληνάρια 15x75 χιλ, μετά από προσθήκη 10μl από καθένα από τα ακόλουθα τέσσερα μονοκλωνικά αντισώματα: anticd184(cxcr4) PE, anticd34 FITCH, anticd45 PECy5 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) και anticd133 APC (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Η επώαση γινόταν σε θερμοκρασία δωματίου και στο σκοτάδι. Ταυτόχρονα και κατά τον ίδιο τρόπο γινόταν επώαση του αίματος με τα αντίστοιχα τέσσερα ισοτυπικά controls: Mouse IgG2a PE, mouse IgG1 FITC, mouse IgG1 PECy5 και mouse IgG1 APC (EXBIO, Prague, Czech Republic), τα οποία χρησιμοποιούνταν ως αρνητικοί μάρτυρες (μάρτυρες του μη ειδικού φθορισμού). Για τη σύγκριση της διαμέτρου των βιολογικών μικροκυστιδίων (microparticles) και των κυττάρων των υπό μελέτη πληθυσμών χρησιμοποιούνταν σφαιρίδια διαμέτρου 0,5μm, 0,9 μm και 3 μm (Megamix beads, Biocytex, Marseille, France). Μετά το πέρας της επώασης γινόταν λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων με πρόσθεση λυτικού διαλύματος (BD PharmLyse Lysing Solution, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), επώαση 15 λεπτά στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου και πλύση με PBS (Phosphate Buffered Saline).

78 78 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Οι μετρήσεις γινόταν σε κυτταρομετρητή ροής τετραπλού φθορισμού FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA) και με χρήση του λογισμικού BD FACSDiva Software (version 6, BD Biosciences). Σε κάθε μέτρηση δείγματος γινόταν παρατηρήσεις κυττάρων (events). Όλες οι μετρήσεις έγιναν εις διπλούν και υπολογίστηκαν οι μέσοι όροι. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων εμφανίζονταν με μορφή σημειακών διαγραμμάτων (dot plots), με τα σημεία να αντιστοιχούν σε κύτταρα και με τους λογαρίθμους των εντάσεων των φθορισμών των φθοριοχρωμάτων τοποθετημένους στους άξονες x και y. Οι ανοσοφαινότυποι των Κυκλοφορούντων Προγονικών Κυττάρων που μελετήθηκαν ήταν: Τα Αιμοποιητικά Προγονικά Κύτταρα (HSCs): CD34 + /CD184 + /CD45 + τα Very Small Embryonic Like Stem Cells (VSELs): CD34 + /CD184 + /CD45 τα πρώιμα Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα (early EPCs): CD34 + /CD45 dim/ /CD184 + /CD133 + τα όψιμα Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα (late EPCs): CD34 + /CD45 dim/ /CD184 + /CD133. Η τακτική διαχωρισμού και προσδιορισμού των κυτταρικών πληθυσμών που χρησιμοποιήθηκε κατά την κυτταρομετρία φαίνεται στις εικόνες 8 9. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων των ΚΠΚ εκφράζονται ως ποσοστά του συνόλου των παρατηρήσεων (events) κατά την κυτταρομετρία. Πρέπει να σημειωθεί ότι ο χαρακτηρισμός ενός κυτταρικού πληθυσμού ως «καθαρού» με κυτταρομετρία προαπαιτεί τη χρησιμοποίηση συνδυασμού αρκετών και ειδικών για το συγκεκριμένο πληθυσμό δεικτών, όπως προκύπτει από τη σχετική βιβλιογραφία. Όσον αφορά την επιβεβαίωση της καθαρότητας, αυτή είναι εφικτή με εφαρμογή μεθόδων ανοσοϊστοχημείας. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε συνδυασμός 3 ή 4 επιφανειακών δεικτών για κάθε πληθυσμό, καθώς και τα δεδομένα μορφολογικά χαρακτηριστικά των κυττάρων (διάμετρος και κοκκίωση), ώστε με βάση αυτά να επιτυγχάνεται η ορθή οριοθέτηση ( gating ) των πληθυσμών και να ελαχιστοποιούνται οι πιθανότητες αλληλοεπικάλυψης αυτών. Παρά ταύτα δεν είναι δυνατό να ισχυριστούμε ότι οι μετρούμενοι κυτταρικοί πληθυσμοί είναι «καθαροί» και ότι δεν εμπεριέχουν κύτταρα και άλλου πληθυσμού. Εξάλλου, στη βιβλιογραφία δεν περιγράφονται δοκιμασμένες και αποδεκτές μέθοδοι και τεχνικές για την απόλυτα ακριβή μέτρηση των πληθυσμών που ενδιαφέρουν την παρούσα μελέτη, ιδιαίτερα όταν αναφερόμαστε σε ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (βλ. Γενικό μέρος/παράγραφο 1.4). Ως εκ τούτου, η έκφραση «κυτταρικού πληθυσμού πλούσιου σε HSCs ή VSELs» είναι σαφώς ορθότερη. Όμως, για λόγους ευκολίας, στο κείμενο θα χρησιμοποιούμε μόνο την ονομασία του κυτταρικού πληθυσμού.

79 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 79 Εικόνα 8 : Τεχνική διαχωρισμού των HCSs και VSELs: Πλαίσιο Α: Εμπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος απεικονίζονται σε διάγραμμα με άξονες SSC/ FSC. Στην πύλη (gate) 1 περικλείονται τα μικρού μεγέθους λεμφοκύτταρα, επεκτεινόμενο προς τα αριστερά για να συμπεριλάβει και άλλα μικρού μεγέθους κύτταρα, όπως τα VSELs. Για το λόγο αυτό το όριο (threshold) τέθηκε πολύ χαμηλά και χρησιμοποιήθηκαν μικρά προκαθορισμένου μεγέθους σφαιρίδια (beads) ώστε να αποκλειστούν τα βιολογικά μικροσωμάτια (microparticles) αλλά όχι και τα VSELs (πλαίσιο Ε). Πλαίσιο Β: Κύτταρα από την πύλη 1 αναλύονται περαιτέρω ως προς την έκφραση του επιφανειακού αντιγόνου CD34, και τα CD34+ κύτταρα ή «συμβάντα» (events) στη συνέχεια αναλύονται ως προς την έκφραση των επιφανειακών αντιγόνων CD184 και CD45 (πλαίσιο C). Πλαίσιο C: Δύο πληθυσμοί CD184(CXCR4)+ κυττάρων διαχωρίζονται ως προς την CD45 έκφραση. Στο άνω αριστερό τεταρτημόριο αντιπροσωπεύονται τα μη αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα CD34+/ CD184+/ CD45 που είναι πλούσια σε VSEL, ενώ στο άνω δεξιό τεταρτημόριο αντιπροσωπεύονται τα CD34+/ CD184+/ CD45+ κύτταρα, πληθυσμός πλούσιος σε HSCs. Πλαίσιο D: Κυτταρικοί πληθυσμοί από το πλαίσιο C απεικονίζονται σε άξονες SSC/ FSC, όπου σαφώς φαίνεται η θέση και το μέγεθος των κυττάρων (βλέπε σε αντιπαραβολή και το πλαίσιο Ε). Η τοποθέτηση των πυλών βασίστηκε στη χρήση ισοτύπων αναφοράς (πλαίσιο F και εικόνα 9/πλαίσιο G), αλλά και στην κατανομή και το διαχωρισμό των κυτταρικών πληθυσμών (πλαίσια G,H,I). (Η εικόνα αντιπροσωπεύει ενδεικτική ανάλυση κυτταρομετρίας από τα δείγματα που μετρήθηκαν)

80 80 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Εικόνα 9: Τεχνική διαχωρισμού των EPCs : Πλαίσιο Α: Εμπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος απεικονίζονται σε διάγραμμα με άξονες SSC/ FSC. Η πύλη 2 περιλαμβάνει την περιοχή των μονοπύρηνων κυττάρων. Πλαίσιο Β: Κύτταρα από την πύλη (gate) 2 ομοίως αναλύονται περαιτέρω ως προς την έκφραση του επιφανειακού αντιγόνου CD34, και τα CD34 + κύτταρα στη συνέχεια διαχωρίζονται ως προς την έκφραση των επιφανειακών αντιγόνων CD184 και CD133 στο πλαίσιο C. Πλαίσιο C: Δύο πληθυσμοί CD184 (CXCR4) + κυττάρων διαχωρίζονται ως προς την έκφραση του επιφανειακού αντιγόνου CD133. Στο άνω δεξιό τεταρτημόριο αντιπροσωπεύονται τα CD34 + / CD184 + / CD133 + κύτταρα, ενώ στο άνω αριστερό τεταρτημόριο αντιπροσωπεύονται τα CD34 + / CD184 + / CD133 κύτταρα. Και οι δυο υποπληθυσμοί αναλύονται περαιτέρω ως προς την έκφραση του επιφανειακού αντιγόνου CD45 στα πλαίσια D1 και D2 αντιστοίχως. Πλαίσια D1 & D2: Mε βάση την έκφραση των επιφανειακών αντιγόνων CD45 και CD133, χαρακτηρίζονται τα EPCs ως «πρώιμα EPCs» (early EPCs CD34 + /CD45 dim/ /CD184 + /CD133 + ) και «όψιμα EPCs» (late EPCs CD34 + /CD45 dim/ /CD184 + /CD133 ). Πλαίσιο Ε: Όλοι οι EPCs υποπληθυσμοί απεικονίζονται σε άξονες CD133/CD45, όπου το εύρος του ανοσοφαινότυπου φαίνεται ευκρινέστερα. Η τοποθέτηση των πυλών βασίστηκε στη χρήση ισοτύπων αναφοράς (πλαίσιο G και εικόνα 8/πλαίσιο F), αλλά και στην κατανομή και το διαχωρισμό των κυτταρικών πληθυσμών (πλαίσια F,H). (Η εικόνα αντιπροσωπεύει ενδεικτική ανάλυση κυτταρομετρίας από τα δείγματα της μελέτης)

81 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 81 Βιολογικοί δείκτες Την 1 η, 3 η, 9 η, 18 η και 45 η ημέρα ζωής και από τις ίδιες αιμοληψίες προσδιορίστηκαν στον ορό τα επίπεδα των βιολογικών δεικτών εγκεφαλικής βλάβης S100b και Ειδικής Νευρωνικής Ενολάσης (Neuron Specific Enolase, NSE), καθώς και των νευροτροφικών/χημειοτακτικών παραγόντων Ερυθροποιητίνης (Erythropoietin, EPO), Ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα 1 (Insulin like Growth Factor 1, IGF 1) και SDF 1 (Stromal cell Derived Factor 1) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών των αντιδραστηρίων. Προσδιορισμός της Ερυθροποιητίνης (EPO) και του Ινσουλινόμορφου αυξητικού παράγοντα 1 (IGF 1) Η συγκέντρωση της EPO και του IGF 1 στα δείγματα ορού προσδιορίστηκε με μη ανταγωνιστική μέθοδο ανοσοχημειοφωταύγειας (ICMA) δύο θέσεων, χρησιμοποιώντας τυποποιημένες συσκευασίες αντιδραστηρίων (kits) της εταιρείας Siemens (Siemens, Llanberis, United Kingdom). Όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στον ανοσολογικό αναλυτή Immulite 2000XPi της ίδιας εταιρείας. Για τη μέτρηση της EPO τα δείγματα επωάζονται αρχικά με αντιδραστήριο που περιέχει μίγμα από βιοτινυλιωμένο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της EPO και μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της EPO συζευγμένο με Αλκαλική Φωσφατάση (ALP) με αποτέλεσμα το σχηματισμό συμπλόκου τύπου sandwich. Το βιοτινυλιωμένο ανοσοσύμπλοκο δεσμεύεται από την στρεπταβιδίνη που είναι ακινητοποιημένη σε αδρανή σφαιρίδια πολυστυρενίου (στερεά φάση) κατόπιν αυθόρμητης αντίδρασης με τη βιοτίνη. Η μέτρηση του IGF 1 περιλαμβάνει την επώαση των δειγμάτων με anti IGF 1 mab που είναι ακινητοποιημένο σε αδρανή σφαιρίδια πολυστυρενίου. Ακολουθεί η προσθήκη πολυκλωνικού anti IGF 1 Ab συζευγμένου με ALP και ο σχηματισμός ανοσοσυμπλόκου τύπου sandwich. Κατόπιν προσθήκης υποστρώματος (adamantyl dioxetane phosphate) στο μείγμα της αντίδρασης απελευθερώνονται χημειοφωταυγή προϊόντα. Προσδιορισμός της πρωτεΐνης S100b και της Ειδικής Νευρωνικής Ενολάσης (Neuron Specific Enolase, NSE) Η συγκέντρωση των παραγόντων S100b και NSE στα δείγματα ορού προσδιορίστηκε με μη ανταγωνιστική μέθοδο ανοσοχημειοφωταύγειας (ICMA) δύο θέσεων χρησιμοποιώντας τυποποιημένες συσκευασίες αντιδραστηρίων της εταιρίας Diasorin, ενώ όλες οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στον ανοσολογικό αναλυτή LIAISON της ίδιας εταιρίας (DiaSorin S.p.A., Saluggia, Italy). Η διαδικασία της μέτρησης περιλαμβάνει τα εξής στάδια: i. Επώαση του δείγματος με mab έναντι της μετρούμενης πρωτεΐνης το οποίο είναι προσκολλημένο πάνω σε αδρανή μαγνητικά σφαιρίδια

82 82 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ii. Έκπλυση και απομάκρυνση των μη δεσμευμένων μορίων της πρωτεΐνης από το μείγμα της αντίδρασης iii. Προσθήκη δεύτερου mab έναντι της ίδιας πρωτεΐνης επισημασμένο με ισολουμινόλη και σχηματισμός συμπλόκου τύπου sandwich. iv. Προσθήκη αντιδραστηρίων σήμανσης και μέτρηση της εκλυόμενης χημειοφωταύγειας. Η συγκέντρωση της EPO, IGF 1, S100b και NSE στα εξεταστέα δείγματα υπολογίζεται από την ένταση της χημειοφωταύγειας (RLU) βάσει καμπύλης αναφοράς (Master Curve) που είναι ενσωματωμένη στο λογισμικό του αναλυτή και προσαρμόζεται κάθε φορά με τη χρήση των κατάλληλων βαθμονομητών (Low και High Adjustors). Στους πίνακες 2 έως 4 αναφέρονται τα τεχνικά χαρακτηριστικά των μεθόδων. Πίνακας 2: Αναλυτική ευαισθησία και εύρος ανίχνευσης της μεθόδου ICMA Αναλυτής Immulite 2000XPi Liaison Μετρούμενη ουσία Εύρος ανίχνευσης Αναλυτική ευαισθησία EPO miu/ml 0,5mIU/ml IGF ng/ml 0,1 ng/ml S100b 0 30 ng/ml 0,02 ng/ml NSE ng/ml 0,04 ng/ml Πίνακας 3: Συντελεστής μεταβλητότητας για εντός σειράς και μεταξύ σειράς μετρήσεις Μετρούμενη ουσία Within Run CV Between Run CV EPO 4,28 % 8,20 % IGF 1 3,05 % 6,16 % S100b 3,76 % 7,23 % NSE 1,82 % 4,6 % Πίνακας 4: Εύρος τιμών αναφοράς Μετρούμενη ουσία Τιμές αναφοράς EPO 4,3 29,0 miu/ml Διάμεσος: <25 ng/ml, 95ηΕΘ: 26 ng/ml (νεογνά 1 7 ημερών ) IGF 1 Διάμεσος: <25 ng/ml, 95ηΕΘ: 41 ng/ml (νεογνά 8 15 ημερών ) Διάμεσος: 134 ng/ml, εύρος: ng/ml (παιδιά 1 έτους) S100b 0 0,15 ng/ml NSE 0 12,5 ng/ml

83 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 83 Προσδιορισμός της χημειοκίνης SDF 1 (Stromal cell Derived Factor 1) Για τον προσδιορισμό της ανωτέρω χημειοκίνης χρησιμοποιήθηκε ανοσοενζυμική μέθοδος (ELISA) τύπου sandwich. Τα αντιδραστήρια και η πλάκες ELISA της μεθόδου ήταν της εταιρίας R&D Systems (Quantikine ELISA, R&D Systems, Minneapolis, USA). Οι πλάκες ELISA περιείχαν στα βαθύσματα προσροφημένο μονοκλωνικό αντίσωμα της SDF 1a. Κατά την πρόσθεση των δειγμάτων και των standards στα βαθύσματα, η SDF 1a συνδεόταν στο ακινητοποιημένο αντίσωμα. Γινόταν επώαση με τα δείγματα και εν συνεχεία έκπλυση των βαθυσμάτων προς απομάκρυνση όλων των μη συνδεθεισών ουσιών. Στη συνέχεια, γινόταν πρόσθεση πολυκλονικού αντισώματος ειδικού της SDF 1a, το οποίο ήταν συνδεδεμένο με ένζυμο (conjugated, horseradish peroxidase). Μετά την επώαση επακολουθούσε μια δεύτερη έκπλυση για την απομάκρυνση των ουσιών που δεν συνδέθηκαν και στη συνέχεια γινόταν πρόσθεση υποστρώματος (TMB + H 2 O 2 ), το οποίο δημιουργούσε χρώμα, του οποίου η ένταση ήταν σχετική με την ποσότητα της SDF 1a του δείγματος ή του standard. Η παραγωγή του χρώματος σταματούσε με την πρόσθεση ειδικού διαλύματος (stop solution, 2N H 2 SO 4 ). Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης της SDF 1a στα δείγματα, στα standards και στα controls γινόταν βάση διπλής λογαριθμικής καμπύλης βαθμονόμησης. Η καμπύλη αυτή σχεδιαζόταν σε διπλό λογαριθμικό σύστημα συντεταγμένων, με τοποθέτηση των λογαρίθμων των τιμών οπτικής απορρόφησης των standards στον άξονα ψ και στον άξονα των χ των αντίστοιχων λογαρίθμων των τιμών συγκέντρωσης της SDF 1a. Η καμπύλη ήταν γραμμική και προσδιοριζόταν με ανάλυση συσχέτισης των ζευγών των τιμών. Η ευαισθησία της μεθόδου όσον αφορά την ελάχιστη ανιχνευόμενη συγκέντρωση SDF 1a ήταν 18 pg/ml και ο συντελεστής διακύμανσης των τιμών ήταν 3,4% στις εντός σειράς μετρήσεις (intra assay) και 9,4% στις μεταξύ σειράς μετρήσεις (inter assay). Σε υγιείς ενήλικες αιμοδότες η μέση τιμή της SDF 1a στο EDTA πλάσμα ήταν 2000pg/ml (εύρος ) Παρακολούθηση των νεογνών: κλινική, νευροαναπτυξιακή και απεικονιστική Για όλα τα νεογνά της μελέτης καταγράφηκαν κατά τη διάρκεια της νοσηλείας τα δημογραφικά, μαιευτικά και περιγεννητικά χαρακτηριστικά (Διάρκεια Κύησης (ΔΚ), Βάρος Γέννησης (ΒΓ), φύλο, ηλικία μητέρας, τόκος, τρόπος τοκετού, τρόπος σύλληψης, πολύδυμη κύηση, Apgar score, η παρουσία εργώδους τοκετού, η προγεννητική χορήγηση στεροειδών, η ρήξη των εμβρυϊκών υμένων για διάστημα μεγαλύτερο των 18 ωρών, η ύπαρξη χοριοαμνιονίτιδας, συνδρόμου αναπνευστικής δυσχέρειας, βρογχοπνευμονικής δυσπλασίας, ενδοκοιλιακής αιμορραγίας, περικοιλιακής λευκομαλακίας, αμφιβληστροειδοπάθειας της προωρότητας,

84 84 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ νεκρωτικής εντεροκολίτιδας, σηψαιμίας, ανοικτού βοταλλείου πόρου, διάρκεια νοσηλείας, παρουσία σπασμών, νευρολογική εικόνα, επιβίωση). Η νευροαναπτυξιακή εκτίμηση κλινικά έγινε από ειδικό νεογνολόγο με ιδιαίτερη ενασχόληση στη νευρολογική παρακολούθηση των νεογνών και βρεφών την 1 η μέρα της ζωής, την πρώτη εβδομάδα και στην έξοδο από την κλινική, καθώς και τον 8 ο και 24 ο μήνα της ζωής (διορθωμένη ηλικία). Η αναπτυξιακή δοκιμασία Bayley ΙΙΙ μετά το 2 ο χρόνο ζωής (διορθωμένη ηλικία) έγινε από παιδίατρο με ιδιαίτερη ενασχόληση στο αντικείμενο και εργοθεραπεύτρια με ειδίκευση στη συγκεκριμένη δοκιμασία. Οι παραπάνω ερευνήτριες δεν γνώριζαν στοιχεία του ιστορικού του παιδιού (τυφλή μελέτη). Η κλίμακες της αναπτυξιακής δοκιμασίας Bayley III που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη περιλαμβάνουν εκτίμηση της νοητικής ανάπτυξης, της γλωσσικής ικανότητας (αντιληπτικής και εκφραστικής) και της κινητικής ανάπτυξης (αδρής και λεπτής κινητικότητας) 336. Η νοητική κλίμακα εκτιμά την αισθητηριο κινητική ανάπτυξη, τη μνήμη, την ικανότητα επίλυσης προβλημάτων, την ικανότητα σκέψης, χειρισμού, εξερεύνησης και αναγνώρισης σχετικών αντικειμένων. Η αντιληπτική γλωσσική υποκλίμακα εκτιμά την ικανότητα κατανόησης του λόγου και ανταπόκρισης σε εντολές, ενώ η εκφραστική γλωσσική υποκλίμακα εκτιμά το λεξιλόγιο και τη σύνταξη. Η υποκλίμακα της αδρής κινητικότητας εκτιμά την ισορροπία, τη στάση και κίνηση του σώματος, ενώ η υποκλίμακα της λεπτής κινητικότητας την ικανότητα λαβής με το χέρι, ταχύτητας, αισθητηριο κινητικής συνεργασίας και ικανότητας σχεδιασμού μιας κινητικής δεξιότητας. Οι σύνθετες κλίμακες της νοητικής, γλωσσικής και κινητικής ανάπτυξης έχουν μέσο όρο 100 και τυπική απόκλιση (SD) 15. Ήπια καθυστέρηση θεωρήθηκε βαθμολογία κάτω από 85 ( 1 SD) και μέτρια/σοβαρή κάτω από 70 ( 2 SD). Οι υποκλίμακες της νοητικής ανάπτυξης, του αντιληπτικού και εκφραστικού λόγου, της λεπτής και της αδρής κινητικότητας έχουν μέσο όρο 10 και τυπική απόκλιση 3. Ήπια καθυστέρηση θεωρήθηκε βαθμολογία κάτω από 7 ( 1 SD) και μέτρια/σοβαρή κάτω από 4 ( 2 SD) 337. Αξιολόγηση και βαθμονόμηση των μαγνητικών τομογραφιών εγκεφάλου έγινε από ειδική παιδοακτινολόγο με ενασχόληση στο αντικείμενο αυτό. Η ερευνήτρια δεν γνώριζε στοιχεία του ιστορικού του παιδιού (τυφλή μελέτη). H βαθμολόγηση των βλαβών έγινε σύμφωνα με πρωτόκολλο που έχει περιγραφεί από τους Kidokoro και συν. για την εγκεφαλοπάθεια των προώρων 338 και από τους Barkovich και συν. για την εγκεφαλική βλάβη σε τελειόμηνα 339,340. Ειδικότερα, στα τελειόμηνα βαθμολογήθηκε το μέγεθος της βλάβης στα βασικά γάγγλια (βαθμολογία 0 έως 4) και στην παραοβελιαία περιοχή (βαθμολογία 0 έως 5). Στα πρόωρα βαθμολογήθηκε το μέγεθος των βλαβών (μεταξύ 0 και 4) της λευκής ουσίας (ειδικότερα ξεχωριστά βαθμολογήθηκαν οι κυστικές αλλοιώσεις, το εστιακό παθολογικό σήμα της λευκής ουσίας, η λέπτυνση του μεσολοβίου, οι διάταση των πλαγίων κοιλιών, η μυελίνωση

85 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 85 και η μείωση του όγκου της λευκής ουσίας), οι βλάβες στην παρεγκεφαλίδα και η διεύρυνση του υπαραχνοειδούς χώρου. Σύμφωνα με το άθροισμα της βαθμολογίας που εκφράζει το σύνολο των βλαβών του εγκεφάλου στη μαγνητική τομογραφία για τα πρόωρα, οι βλάβες χαρακτηρίστηκαν ως μη παθολογικές (βαθμολογία 0 3), ήπιες (4 7), μέτριες (8 11) και σοβαρές ( 12) Στατιστική ανάλυση Τα δεδομένα παρουσιάζονται για τις συνεχείς μεταβλητές ανάλογα με την κατανομή ως μέσος όρος(/τυπική απόκλιση) ή ως διάμεσος (/εύρος διακύμανσης), ενώ για τις διχοτόμους περιγράφονται οι απόλυτοι αριθμοί και οι εκατοστιαίες αναλογίες. Η κατανομή των συνεχών μεταβλητών ελέγχθηκε με τη δοκιμασία Kolmogorov Smirnov. Οι διαφορές μεταξύ των ποσοτικών παραμέτρων ανάμεσα στις δυο ομάδες εκτιμήθηκαν με το t test (independent or paired) όταν υπήρχε κανονική κατανομή, ενώ διαφορετικά χρησιμοποιήθηκε το Mann Whitney test ή το Wilcoxon Signed Rank. Συσχετίσεις μεταξύ ποσοτικών παραμέτρων έγιναν με τη χρήση του Pearson s correlation or Spearman s rank correlation, ανάλογα την κατανομή. Για τη σύγκριση μεταξύ χρονικών στιγμών χρησιμοποιήθηκε η δοκιμασία Friedman. Η σύγκριση μεταξύ των ομάδων για τις διχότομες μεταβλητές έγινε με τη δοκιμασία Fisher s exact. Για τον υπολογισμό της προγνωστικής αξίας των μεταβλητών χρησιμοποιήθηκαν καμπύλες ROC (Receiver operating characteristics) και εκτιμήθηκε το εμβαδό κάτω από την καμπύλη. Όλες οι ομάδες ασθενών συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες ομάδες ελέγχου. Όταν γίνεται σύγκριση μεταξύ περισσότερων των 2 ομάδων, γίνεται αναφορά στο αποτέλεσμα πριν και μετά τη διόρθωση κατά Bonferroni. Τιμή p<0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικώς σημαντική. Τιμές του p μεταξύ 0,050 και 0,099 θεωρήθηκαν ως παρουσία τάσης στη διακύμανση των δεδομένων και αναφέρονται. Λόγω του γεγονότος ότι τα περισσότερα θέματα που διαπραγματεύεται η παρούσα μελέτη δεν έχουν περιγραφεί ξανά στη βιβλιογραφία (και συνεπώς ένας από τους πρωτεύοντες σκοπούς είναι η διερεύνηση άγνωστων συσχετισμών) καθώς και λόγω του γεγονότος ότι τα μελετώμενα κύτταρα αποτελούν σπάνιους πληθυσμούς, η αναφορά ακόμα και των στατιστικώς οριακών αποτελεσμάτων (τάσεων) θεωρήθηκε σκόπιμη. Η στατιστική ανάλυση έγινε με το στατιστικό πακέτο SPSS for Windows (SPSS, IBM Corp., Chicago, IL, USA) (v.20).

86 86 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2. Αποτελέσματα Μεταξύ Δεκεμβρίου 2010 και Νοεμβρίου 2013 ογδόντα επτά παιδιά εισήχθησαν στη μελέτη. Από αυτά τέθηκαν εκτός μελέτης ένα νεογνό με συγγενή καρδιοπάθεια (στένωση ισθμού αορτής και μεσοκοιλιακή επικοινωνία), ένα νεογνό που γεννήθηκε χωρίς περιγεννητικό συμβάν και από τις πρώτες μέρες ζωής εμφάνισε πολλαπλούς υποτροπιάζοντες ανθεκτικούς σπασμούς (πιθανό μεταβολικό νόσημα), καθώς και 2 νεογνά για τα οποία χάθηκε η δυνατότητα παρακολούθησής τους μετά την πρώτη βδομάδα ζωής. Εν τέλει, 83 νεογνά μελετήθηκαν, 47 πρόωρα και 36 τελειόμηνα. Από τα πρόωρα νεογνά, 31 δεν εμφάνισαν καθόλου (n=28) ή μόνο ήπια νευρολογική βλάβη (IVH 1 ου βαθμού, n=3), με φυσιολογική νευρολογική εξέταση και πορεία, και θεωρήθηκαν ως πρόωρα μάρτυρες (ομάδα 1). Τα υπόλοιπα 16 πρόωρα νεογνά εμφάνισαν ενδοκοιλιακή αιμορραγία 3 ου ή 4 ου βαθμού, περικοιλιακή λευκομαλακία ή έμφρακτο, και αποτέλεσαν την ομάδα των προώρων με εγκεφαλική βλάβη (ομάδα 2). Από τα τελειόμηνα νεογνά, 12 φυσιολογικά νεογνά χωρίς περιγεννητικό συμβάν θεωρήθηκαν ως τελειόμηνα μάρτυρες (ομάδα 3), ενώ 11 εμφάνισαν περιγεννητικό stress/ασφυξία και ελάσσονα νευρολογική σημειολογία μόνο το πρώτο 24ωρο της ζωής, ενώ εν συνεχεία είχαν φυσιολογική νευρολογική εικόνα και πορεία (ομάδα ήπιας εγκεφαλοπάθειας Sarnat 1) (ομάδα 4). Τέλος, 13 τελειόμηνα εμφάνισαν περιγεννητική ασφυξία και μέτρια ή βαριά εγκεφαλοπάθεια (Sarnat 2 ή 3) (ομάδα 5). Τα μαιευτικά και περιγεννητικά χαρακτηριστικά των παιδιών, καθώς και οι κλινικές παράμετροι και επιπλοκές φαίνονται στον πίνακα 5. Από τα 13 τελειόμηνα νεογνά με μέτρια/βαριά ΥΙΕ, 9 υποβλήθηκαν σύμφωνα με το κλινικό θεραπευτικό πρωτόκολλο σε υποθερμία, ενώ τα υπόλοιπα 4 νεογνά (2 με μέτρια και 2 με βαριά ΥΙΕ) δεν υποβλήθηκαν σε θεραπευτική υποθερμία λόγω μη πλήρωσης των κριτηρίων την 6 η ώρα ζωής ή λόγω καθυστερημένης προσέλευσης στο τριτοβάθμιο κέντρο όπου έγινε η μελέτη. 14 νεογνά κατέληξαν πριν να πάρουν εξιτήριο. Από αυτά, τα 11 ήταν πρόωρα νεογνά (9 εκ των οποίων με εγκεφαλική βλάβη) και 3 ήταν τελειόμηνα με βαριά περιγεννητική ασφυξία (πίν. 5). Από τα 83 παιδιά της μελέτης συνολικά λήφθηκαν 400 δείγματα περιφερικού αίματος για προσδιορισμό των κυκλοφορούντων προγονικών κυττάρων και των προς μελέτη βιολογικών δεικτών. Αναλυτικά ο αριθμός των δειγμάτων ανά εξέταση σε κάθε χρονική στιγμή φαίνεται στους πίνακες των αποτελεσμάτων της αντίστοιχης εξέτασης. Μικρότερος αριθμός δειγμάτων από τον αναμενόμενο οφείλεται σε δυσκολίες στην παρακολούθηση των παιδιών κυρίως μακροχρόνια μετά την έξοδό τους από το νοσοκομείο, σε δυσχέρεια

87 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 87 λήψης δείγματος αίματος στην προβλεπόμενη ηλικία καθώς και σε αστοχίες της ποιότητας δείγματος που φάνηκαν κατά την εκτέλεση ευαίσθητων τεχνικών μετρήσεων. Παράμετρος Πίνακας 5: Μαιευτικά και περιγεννητικά χαρακτηριστικά των νεογνών της μελέτης Πρόωρα νεογνά μάρτυρες (ομάδα 1, n= 31) Πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια (ομάδα 2, n=16) Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες (ομάδα 3, n=12) Τελειόμηνα νεογνά με ήπια εγκεφαλοπάθεια (ομάδα 4, n=11) Τελειόμηνα Σύγκριση νεογνά με Ομάδων μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια (ομάδα 5, n=13) Χοριοαμνιονίτιδα [n (%)] 4 (12,9%) 3 (18,8%) Προγεννητική Χορήγηση Στεροειδών [n (%)] 30 (96,8%) 7 (46,6%) 1 2 <0,0005 ΠΡΕΥ [n (%)] 9 (29%) 3 (20%) Καισαρική τομή [n (%)] 23 (82,1%) 9 (60%) 6 (66,7%) 5 (50%) 6 (46,1%) Πολύδυμη κύηση [n (%)] 15 (48,3%) 4 (26,6%) 2 (16,7%) 0 0 Διάρκεια κύησης (εβδομάδες) (ΜΟ/SD) Βάρος Γέννησης (gr) (ΜΟ/SD) 29,8 (2,1) 27,3 (2,9) 37,9 (1,2) 38,7 (1,3) 38,2 (1,6) (396) 1182 (495) 2962 (333) 3341 (445) 3098 (680) Άρρεν φύλο [n (%)] 16 (51,6%) 7 (43,8%) 5 (41,6%) 9 (81,8%) 8 (61,5%) 3 4 0,089 Apgar Score 1 (διάμεσος, εύρος) Apgar Score 5 (διάμεσος, εύρος) SBE (κατά την εισαγωγή mmol/l) (ΜΟ/SD) 8 (7) 3 (7) 8(1) 5 (7) 1 (3) (5) 5 (9) 9 (1) 8 (5) 5 (3) ,46 (3,52) 12,30 (8,65) 6,82 (3,14) 8,47 (4,58) 17,81 (4,96) IVH (I βαθμού) [n (%)] 3 (9,6%) IVH (II βαθμού) [n (%)] 2 (12,5%) IVH (III/IV βαθμού) [n(%)] 0 10 (62,5%) (7,7%) PVL [n (%)] 0 6 (37,5%) (7,7%) Έμφρακτο [n(%)] 0 1 (6,2%) ΣΑΔ [n (%)] 15 (48,4%) 7 (46,7%) 2 (16,7%) 0 2 (15,4%) ΒΠΔ [n (%)] 5 (16,1%) 5 (33,3%) ΝΕΚ [n (%)] 9 (29%) 2 (12,5%) ROP (>3 ου βαθμού) [n (%)] 1 (3,2%) 2 (13,3%) Όψιμη σηψαιμία [n(%)] 2 (6,5%) 2 (12,5%) 0 1 (9,1%) 1 (7,7%) Διάρκεια νοσηλείας (ημέρες, ΜΟ/SD) Θάνατος (n) [ημέρα θανάτου: διάμεσος (εύρος)] 45,1 (25,6) 66,5 (29,6) 4 (1) 11,1 (4,1) 45,1 (28) [31,5 (51)] [11 (53)] [5 (7)] p <0,005 0,058 <0,01 <0,05 <0,0005 <0,0005 <0,0005 <0,01 <0,0005 <0,0005 <0,0005 <0,05 <0,01 <0,0005 <0,0005 <0,05 <0,005 <0, <0,0005 IVH: ενδοκοιλιακή αιμορραγία, PVL: περικοιλιακή λευκομαλακία, ΣΑΔ: σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας, ΒΠΔ: βρογχοπνευμονική δυσπλασία, ΝΕΚ: νεκρωτική εντεροκολίτιδα, ROP: (retinopathy of prematurity) αμφιβληστροειδοπάθεια προωρότητας, ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation (τυπική απόκλιση) Τα αποτελέσματα της μελέτης για τα ΚΠΚ και τους υπό μελέτη βιολογικούς δείκτες έχουν ως ακολούθως:

88 88 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.1. Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα (ΚΠΚ) Κινητική Αιμοποιητικά Προγονικά Κύτταρα (HSCs) Τα ποσοστά των Αιμοποιητικών Προγονικών Κυττάρων βρέθηκαν αυξημένα στα πρόωρα με εγκεφαλοπάθεια κυρίως την 3 η και 9 η ημέρα ζωής, σε σχέση με την ομάδα μαρτύρων των προώρων. Στα τελειόμηνα, τα νεογνά με μέτρια/βαριά ΥΙΕ εμφάνιζαν αυξημένα επίπεδα την 45 η ημέρα σε σχέση με τους μάρτυρες. Η κινητική των HSCs των προώρων και των τελειομήνων νεογνών φαίνεται αναλυτικά στον πίνακα 6 και παραστατικά στην εικόνα 10. Όταν όμως η ομάδα των τελειομήνων νεογνών με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια διαχωρίστηκε ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας (ομάδα 5α: μέτρια εγκεφαλοπάθεια (n=5) και ομάδα 5β: βαριά εγκεφαλοπάθεια (n=8)), φάνηκε ευκρινέστερα πως τα HSCs κινητοποιούνται εντόνως μετά από μετρίου βαθμού εγκεφαλοπάθεια αλλά αδυνατούν να αυξηθούν στην βαριά εγκεφαλική βλάβη (πίνακας 7 και εικόνα 11).

89 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 89 Πίνακας 6: Ποσοστά των HSCs σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά από τη γέννηση ως το 2 ο χρόνο ζωής Πρόωρα νεογνά μάρτυρες Χρόνος (Ομάδα 1) n * ΜΟ (SD) 1 ημ. 29 0, (0, ) 3 ημ. 28 0, (0, ) 9 ημ. 28 0, (0, ) 18 ημ. 28 0, (0, ) 45 ημ. 22 0, (0, ) 8 Μήν. 21 0, (0, ) 24 Μήν. 18 0, (0, ) Πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 2) n * ΜΟ (SD) 15 0, (0, ) 11 0, (0, ) 11 0, (0, ) 10 0,00267 (0, ) 6 0, (0, ) 5 0,00496 (0, ) 3 0,0019 (0, ) Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες (Ομάδα 3) n * ΜΟ (SD) 12 0, (0, ) 11 0, (0,001442) 8 0, (0,003652) 8 0, (0,002816) 7 0, (0,001528) 6 0, (0,001390) 3 0, (0,001594) Τελειόμηνα νεογνά με ήπια εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 4) n * ΜΟ (SD) 9 0, (0, ) 10 0,00162 (0, ) 8 0, (0, ) 6 0, (0, ) 6 0, (0, ) 6 0,0019 (0,001004) 6 0, (0,023544) ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων * ποσοστό επί του συνόλου των παρατηρήσεων (events) στην κυτταρομετρία ροής Τελειόμηνα νεογνά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 5) n * ΜΟ (SD) 12 0, (0, ) 12 0, (0, ) 10 0,0059 (0, ) 9 0, (0, ) 7 0, (0, ) 6 0, (0, ) 5 0,00362 (0, ) Σύγκριση Ομάδων p 1 2 <0, , <0,05 Εικόνα 10: Κινητική των HSCs στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά την 1 η, 3 η, 9 η,18 η και 45 η ημέρα ζωής, καθώς και τον 8 ο και 24 ο μήνα.

90 90 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Πίνακας 7: Ποσοστά των HSCs στα τελειόμηνα νεογνά με ΥΙΕ, όταν διαχωριστούν σε ομάδα με μέτρια ΥΙΕ (ομάδα 5α) και βαριά ΥΙΕ (ομάδα 5β) Χρόνος Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες (Ομάδα 3, n=12 ) n * ΜΟ (SD) Τελειόμηνα νεογνά με Μέτρια Εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 5α, n= 5 ) n * ΜΟ (SD) Τελειόμηνα νεογνά με Βαριά Εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 5β, n=8 ) n * ΜΟ (SD) Σύγκριση Ομάδων 1 ημ. 12 0, (0, ) 4 0, (0, ) 8 0, (0, ) 3 5a 5a 5b 3 ημ. 11 0, (0, ) 4 0,0043 (0, ) 8 0, (0, ) 3 5a 5a 5b p 0,087 <0,05 ** <0,05 <0,01 ** 9 ημ. 8 0, (0, ) 4 0,0085 (0, ) 6 0, (0, ) 18 ημ. 8 0, (0, ) 4 0,00535 (0, ) 5 0,0029 (0, ) 45 ημ. 7 0, (0, ) 2 0,00595 (0, ) 5 0,00568 (0, ) 3 5b 0,093 8 Μήν. 6 0, (0, ) 3 0,0035 (0, ) 3 0, (0, ) 24 Μήν. 3 0, (0, ) 3 0, (0, ) 2 0,00345 (0, ) ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων * ποσοστό επί του συνόλου των παρατηρήσεων (events) στην κυτταρομετρία ροής ** στατιστικώς σημαντικά και μετά τη διόρθωση κατά Bonferroni (p<0,05) Εικόνα 11: Κινητική των HSCs στα τελειόμηνα νεογνά με ΥΙΕ, όταν διαχωριστούν ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας

91 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 91 Συσχετίσεις Πρόωρα νεογνά Προγεννητικoί παράγοντες Στα πρόωρα νεογνά, τα HSCs της 1 ης ημέρας ζωής δεν εμφάνιζαν συσχέτιση με τη διάρκεια κύησης (ΔΚ) και το βάρος γέννησης (ΒΓ). Η χοριοαμνιονίτιδα σχετιζόταν με ελαττωμένα επίπεδα HSCs την 1 η (p<0,05), 9 η (p=0,09) και 18 η ημέρα ζωής (p=0,063), ενώ η πολύδυμη κύηση με ελαττωμένα ποσοστά HSCs την 1 η (p<0,0005) και 3 η ημέρα ζωής (p<0,05). Εξωμήτριοι παράγοντες Χαμηλό Apgar score στο 1 ο και 5 ο λεπτό σχετιζόταν με υψηλότερα επίπεδα HSCs την 3 η ημέρα ζωής (rho= 0,379/p<0,05 και rho= 0,287/p=0,076 αντίστοιχα). Αυτό ίσχυε ιδίως για τα νεογνά με Apgar score στο 1 ο λεπτό <4 (αυξημένα HSCs την 3 η ημέρα (p<0,05) και οριακά την 9 η ημέρα ζωής (p=0,08)). Χαμηλά επίπεδα HSCs εμφάνιζαν τα πρόωρα νεογνά με σηψαιμία σχεδόν σε όλο τον πρώτο ενάμιση μήνα ζωής (1 η ημέρα (p<0,05), 3 η (p=0,071), 9 η (p<0,005), 18 η (p<0,05) και 45 η ημέρα ζωής (p<0,01)) (παράρτημα Α, εικόνα Α.1). Μάλιστα υπολογίστηκε πως ποσοστά HSCs χαμηλότερα των 0,017 (επί του συνόλου των παρατηρήσεων (events) στην κυτταρομετρία ροής) την 1 η ημέρα ζωής προέβλεπαν με 100% ευαισθησία και 66,7% ειδικότητα την εμφάνιση σηψαιμίας στην όψιμη νεογνική περίοδο (Area under the ROC curve (AUC):0,811, 95% CI:0,669 0,953, p<0,05) (παράρτημα Α, εικόνα Α.2). Επίσης χαμηλότερα επίπεδα την 3 η ημέρα ζωής εμφάνιζαν τα πρόωρα που ανέπτυξαν νεκρωτική εντεροκολίτιδα (ΝΕΚ) (p<0,05). Ειδικότερα, ποσοστά HSCs χαμηλότερα από 0,015 την 3 η ημέρα ζωής προέβλεπαν με 66,7% ευαισθησία και 66,7% ειδικότητα την εμφάνιση ΝΕΚ στα πρόωρα (AUC:0,739, 95% CI: 0,576 0,902, p<0,05) (παράρτημα Α, εικόνα Α.3). Αντίθετα, η παρουσία σοβαρής ενδοκοιλιακής αιμορραγίας (IVH) (3 ου ή 4 ου βαθμού) σχετιζόταν με αυξημένα HSCs την 3 η ημέρα ζωής (p<0,05), σε σχέση με τα πρόωρα στα οποία δεν ανιχνεύτηκε κανενός είδους εγκεφαλική βλάβη. Ομοίως και τα νεογνά που εμφάνισαν κυστική περικοιλιακή λευκομαλακία (PVL) είχαν την 3 η ημέρα ζωής αυξημένα HSCs σε σχέση με τα νεογνά στα οποία δεν ανιχνεύτηκε καμία εγκεφαλική βλάβη (p<0,05). Τέλος, τα επίπεδα των HSCs στα πρόωρα νεογνά δε συσχετίστηκαν με το ΣΑΔ ή τη ΒΠΔ. Τελειόμηνα νεογνά Προγεννητικoί παράγοντες Η πολύδυμη κύηση σχετιζόταν με οριακά ελαττωμένα ποσοστά HSCs την 1 η (p=0,059), 3 η (p<0,064) και 18 η ημέρα ζωής (p=0,081), ενώ οριακά αυξημένα ήταν τα επίπεδα των ίδιων ημερών (1 ης, 3 ης και 18 ης ) μετά από κολπικό τοκετό σε σχέση με την καισαρική

92 92 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ τομή(p=0,063, p=0,059 και p=0,064 αντίστοιχα) (Σημειωτέον, δεν υπήρχε συσχέτιση πολύδυμης κύησης και τρόπου τοκετού στα τελειόμηνα). Εξωμήτριοι παράγοντες Παρουσία μέτριας οξέωσης τις πρώτες ώρες της ζωής (ph μεταξύ 7 και 7,2) σχετιζόταν με αυξημένα HSCs την 9 η ημέρα ζωής (p<0,05), ενώ έντονη οξέωση (ph<7) σχετιζόταν οριακά με αυξημένα επίπεδα την 3 η ημέρα ζωής (p=0,07). Επίσης, τα επίπεδα των HSCs της 9 ης ημέρας ζωής σχετίζονταν θετικά με τη διάρκεια της νοσηλείας (rho= 0,552, p<0,05). Ανάμεσα στα νεογνά με ΥΙΕ 2 ου ή 3 ου βαθμού (n=13), αυτά που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπευτική υποθερμία (n=4) είχαν μια τάση για χαμηλότερα ποσοστά HSCs την 18 η ημέρα ζωής (p=0,07) Very Small Embryonic like Stem Cells (VSELs) Κινητική Στη μελέτη αυτή δε φάνηκε σημαντική διαφορά στα ποσοστά του πληθυσμού των VSELs μεταξύ των προώρων με εγκεφαλοπάθεια και αυτών χωρίς εμφανή εγκεφαλική βλάβη. Επίσης τα τελειόμηνα με ήπια εγκεφαλοπάθεια και αυτά με μέτρια/σοβαρή εγκεφαλοπάθεια δε διέφεραν σημαντικά από την ομάδα ελέγχου. Εξαίρεση αποτελούν τα επίπεδα των 24 μηνών στην ομάδα με τη μέτρια/σοβαρή εγκεφαλοπάθεια, που ήταν σημαντικά υψηλότερα σε σχέση με τα υγιή τελειόμηνα (πίν. 8 και εικόνα 12). Εντούτοις, όταν η ομάδα των τελειομήνων νεογνών με μέτρια/σοβαρή εγκεφαλοπάθεια διαχωρίστηκε ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας, φάνηκε ευκρινέστερα πως τα VSELs κινητοποιούνται μετά από μετρίου βαθμού εγκεφαλοπάθεια αλλά όχι και στη βαριά εγκεφαλική βλάβη (πίν. 9 και εικόνα 13). Ωστόσο η παρατήρηση αυτή δεν άγγιζε στατιστική σημαντικότητα. Τέλος, στην ομάδα των προώρων χωρίς εγκεφαλοπάθεια, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαχρονικά μεταβολή των ποσοστών των VSELs (Friedman test, p<0,01) (μείωση έως την 9 η ημέρα ζωής και εν συνεχεία αύξηση έως την 45 η ημέρα ζωής).

93 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 93 Πίνακας 8: Ποσοστά των VSELS στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά στα 7 χρονικά στιγμιότυπα της μελέτης Πρόωρα νεογνά μάρτυρες Χρόνος (Ομάδα 1) n * ΜΟ (SD) 1 ημ. 29 0, (0, ) 3 ημ. 28 0, (0, ) 9 ημ. 28 0, (0, ) 18 ημ. 28 0, (0, ) 45 ημ. 22 0, (0, ) 8 Μήν. 21 0, (0,003294) 24 Μήν. 18 0, (0, ) Πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 2) n * ΜΟ (SD) 15 0,00315 (0, ) 11 0, (0, ) 11 0, (0, ) 10 0, (0, ) 6 0, (0,0047) 5 0,00608 (0,004415) 3 0,0049 (0,0014) Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες (Ομάδα 3) n * ΜΟ (SD) 12 0, (0, ) 11 0,0036 (0, ) 8 0, (0, ) 8 0,0044 (0, ) 7 0, (0, ) 6 0,0042 (0, ) 3 0, (0, ) Τελειόμηνα νεογνά με ήπια εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 4) n * ΜΟ (SD) 9 0, (0, ) 10 0, (0, ) 8 0, (0, ) 6 0, (0, ) 6 0, (0, ) 6 0,00405 (0, ) 6 0, (0,077386) ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων * ποσοστό επί του συνόλου των παρατηρήσεων (events) στην κυτταρομετρία ροής Τελειόμηνα νεογνά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 5) n * ΜΟ (SD) 12 0, (0, ) 12 0, (0, ) 10 0, (0, ) 9 0, (0, ) 7 0, (0, ) 6 0,00605 (0, ) 5 0,00838 (0, ) Σύγκριση Ομάδων p 3 5 <0,05 Εικόνα 12: Κινητική των VSELs στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά

94 94 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Χρόνος Πίνακας 9: Ποσοστά των VSELs στη μέτρια και στη βαριά εγκεφαλοπάθεια Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες (Ομάδα 3) n * ΜΟ (SD) Τελειόμηνα νεογνά με Μέτρια Εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 5α) n * ΜΟ (SD) Τελειόμηνα νεογνά με Βαριά Εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 5β) n * ΜΟ (SD) Σύγκριση Ομάδων 1 ημ. 12 0, (0, ) 4 0,00705 (0, ) 8 0, (0, ) 3 5α 0,089 ** 3 ημ. 11 0,0036 (0, ) 4 0, (0, ) 8 0, (0, ) 9 ημ. 8 0, (0, ) 4 0, (0, ) 6 0, (0, ) 18 ημ. 8 0,0044 (0, ) 4 0, (0, ) 5 0,0028 (0,002217) 45 ημ. 7 0, (0, ) 2 0,0029 (0, ) 5 0,00594 (0, ) 8 Μήν. 6 0,0042 (0, ) 3 0, (0, ) 3 0, (0, ) 24 Μήν 3 0, (0, ) 3 0, (0, ) 2 0,0086 (0, ) ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων * ποσοστό επί του συνόλου των παρατηρήσεων (events) στην κυτταρομετρία ροής **μη στατιστικά σημαντικές διαφορές μετά τη διόρθωση κατά Bonferroni p Εικόνα 13: Κινητική των VSELs στα τελειόμηνα ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας

95 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 95 Συσχετίσεις Πρόωρα νεογνά Προγεννητικοί παράγοντες Τα VSELs της 1 ης ημέρας ζωής δεν εμφάνισαν συσχέτιση με τη διάρκεια κύησης και το βάρος γέννησης. Η χοριοαμνιονίτιδα σχετιζόταν με ελαττωμένα επίπεδα VSELs την 3 η ημέρα ζωής (p<0,05). Εξωμήτριοι παράγοντες Apgar score στο 1 ο λεπτό χαμηλότερο από 4 σχετιζόταν με μειωμένα επίπεδα VSELs την 1 η (p=0,055), 18 η (p<0,05) και 45 η ημέρα ζωής (p=0,055). Τάση για αυξημένα επίπεδα την 3 η ημέρα ζωής εμφάνιζαν τα νεογνά με Apgar score στο 1 ο λεπτό μεταξύ 4 και 6, συγκριτικά με τα νεογνά που είχαν Apgar score μεγαλύτερο του 6 (p=0,09). Τα νεογνά με PVL εμφάνιζαν οριακά αυξημένα επίπεδα VSELs την 9 η ημέρα ζωής (p=0,056) και τα νεογνά με IVH ( 2ου βαθμού) αυξημένα επίπεδα στον 8 ο μήνα ζωής (p<0,05), σε σχέση με τα νεογνά χωρίς καμία ανιχνεύσιμη εγκεφαλική βλάβη. Επίσης, τα νεογνά με σοβαρού βαθμού (3 ου ή 4 ου ) σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας (ΣΑΔ) εμφάνιζαν μειωμένα επίπεδα VSELs τις πρώτες 45 ημέρες ζωής. Στατιστικώς όμως, μόνο τη 18 η ημέρα είχαν οριακά μειωμένα επίπεδα (p=0,062) σε σχέση με τα νεογνά χωρίς ΣΑΔ και σημαντικά μικρότερα ποσοστά (p<0,05) σε σχέση με τα νεογνά με ήπιο ΣΑΔ (1 ου ή 2 ου βαθμού) (παράρτημα Α, εικόνα Α.4). Ομοίως την ίδια ημέρα (18 η ), μειωμένα επίπεδα είχαν και τα παιδιά που εμφάνισαν βρογχοπνευμονική δυσπλασία (ΒΠΔ) (p<0,05). Χαμηλά επίπεδα VSELs εμφάνιζαν τα πρόωρα νεογνά με σηψαιμία σχεδόν σε όλο τον 1 ο 1,5 μήνα ζωής (1 η ημέρα (p<0,01), 3 η (p=0,087), 9 η (p<0,0005), 18 η (p<0,0005) και 45 η ημέρα ζωής (p<0,05)) (παράρτημα Α, εικόνα Α5). Ας σημειωθεί ότι η παρουσία σηψαιμίας δε συσχετίστηκε σημαντικά με τη ΔΚ ή το ΒΓ σε αυτή τη μελέτη. Υπολογίστηκε πως ποσοστά χαμηλότερα των 0,0136 (επί του συνόλου των παρατηρήσεων (events) στην κυτταρομετρία ροής) την 1 η ημέρα ζωής προέβλεπαν με 100% ευαισθησία και 79,5% ειδικότητα την εμφάνιση όψιμης σηψαιμίας στη νεογνική περίοδο (AUC:0,897, 95% CI: 0,795 1, p<0,01) (παράρτημα Α, εικόνα Α.2). Τελειόμηνα νεογνά Προγεννητικοί παράγοντες Τα VSELs της 1 ης ημέρας ζωής δεν εμφάνιζαν συσχέτιση με προγεννητικούς παράγοντες. Εξωμήτριοι παράγοντες Παρομοίως με τα πρόωρα, στα τελειόμηνα η παρουσία σηψαιμίας σχετιζόταν οριακά με μειωμένα επίπεδα VSELs τις ημέρες 9, 18 και 45 (p=0,083, p=0,097 και p=0,099 αντίστοιχα).

96 96 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κινητική Πρώιμα Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα (eepcs) Όσον αφορά τα πρώιμα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα, βρέθηκε σημαντική αύξηση των ποσοστών τους στα πρόωρα με εγκεφαλοπάθεια την 3 η και 9 η ημέρα ζωής σε σχέση με τα πρόωρα της ομάδας ελέγχου. Τα πρόωρα χωρίς εγκεφαλοπάθεια εμφάνιζαν σταδιακή μείωση των επιπέδων τους (Friedman test, p<0,05). Η ομάδα των τελειομήνων με ήπια εγκεφαλοπάθεια και η ομάδα της μέτριας/βαριάς εγκεφαλοπάθειας δεν παρουσίασε ιδιαίτερες διαφορές με τους μάρτυρες (πίν.10, εικόνα 14). Όταν η ομάδα των τελειομήνων νεογνών με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθειας διαχωρίστηκε ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας, φάνηκε οριακά πως τα eepcs κινητοποιούνται περισσότερο μετά από μετρίου βαθμού εγκεφαλοπάθεια (πίν. 11 και εικόνα 15).

97 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 97 Πίνακας 10: Ποσοστά των πρώιμων Ενδοθηλιακών Προγονικών Κυττάρων στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά Χρόνος Πρόωρα νεογνά μάρτυρες (Ομάδα 1) n * ΜΟ (SD) 1 ημ. 29 0, (0,004831) 3 ημ. 28 0, (0, ) 9 ημ. 28 0, (0,001708) 18 ημ. 28 0, (0, ) 45 ημ. 22 0, (0, ) 8 Μήν. 21 0, (0, ) 24 Μήν. 18 0, (0, ) Πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 2) n * ΜΟ (SD) 15 0, (0, ) 11 0, (0, ) 11 0,0062 (0, ) 10 0,00349 (0, ) 6 0, (0, ) 5 0,00076 (0, ) 3 0,0002 (0,0001) Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες (Ομάδα 3) n * ΜΟ (SD) 12 0, (0, ) 11 0, (0,00094) 8 0, (0,002265) 8 0, (0, ) 7 0, (0, ) 6 0, (0, ) 3 0, (0, ) Τελειόμηνα νεογνά με ήπια εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 4) n * ΜΟ (SD) 9 0, (0, ) 10 0, (0, ) 8 0, (0,000787) 6 0, (0,002136) 6 0, (0, ) 6 0, (0, ) 6 0, (0,004412) ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων * ποσοστό επί του συνόλου των παρατηρήσεων (events) στην κυτταρομετρία ροής Τελειόμηνα νεογνά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 5) n * ΜΟ (SD) 12 0, (0, ) 12 0, (0, ) 10 0,00433 (0, ) 9 0, (0, ) 7 0, (0, ) 6 0, (0, ) 5 0,00076 (0, ) Σύγκριση Ομάδων p 1 2 <0, ,098 <0,0005 Εικόνα 14: Κινητική των πρώιμων Ενδοθηλιακών Προγονικών Κυττάρων στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά

98 98 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Πίνακας 11: Ποσοστά των πρώιμων Ενδοθηλιακών Προγονικών Κυττάρων στα τελειόμηνα νεογνά, διαχωρισμένα ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας Χρόνος Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες (Ομάδα 3) Τελειόμηνα νεογνά με Μέτρια Εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 5α) Τελειόμηνα νεογνά με Βαριά Εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 5β) Σύγκριση Ομάδων n * ΜΟ (SD) n * ΜΟ (SD) n * ΜΟ (SD) 1 ημ. 12 0, (0, ) 4 0, (0, ) 8 0, (0, ) 3 ημ. 11 0, (0,00094) 4 0, (0, ) 8 0, (0, ) 3 5a 5a 5b 9 ημ. 8 0, (0,002265) 4 0, (0, ) 6 0, (0, ) 18 ημ. 8 0, (0, ) 4 0, (0,00225) 5 0,00204 (0,001161) 45 ημ. 7 0, (0, ) 2 0,0024 (0, ) 5 0,0027 (0, ) 8 Μήν. 6 0, (0, ) 3 0, (0, ) 3 0,0016 (0, ) 24 Μήν 3 0, (0, ) 3 0, (0, ) 2 0,00105 (0, ) ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων * ποσοστό επί του συνόλου των παρατηρήσεων (events) στην κυτταρομετρία ροής **μη στατιστικά σημαντικές διαφορές μετά τη διόρθωση κατά Bonferroni p 0,057** 0,089** Εικόνα 15: Κινητική των πρώιμων Ενδοθηλιακών Προγονικών Κυττάρων στα τελειόμηνα νεογνά, ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας

99 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 99 Συσχετίσεις Πρόωρα νεογνά Προγεννητικοί παράγοντες Τα eepcs της 1 ης ημέρας ζωής δεν εμφάνισαν συσχέτιση με τη ΔΚ και το ΒΓ. Σε πολύδυμη κύηση τα eepcs της 1 ης (p<0,005), 3 ης (p=0,063) και 9 ης ημέρας (p<0,05) βρέθηκαν ελαττωμένα. Εξωμήτριοι παράγοντες Τα πρόωρα νεογνά με IVH >2 ου βαθμού είχαν αυξημένα eepcs την 3 η (p<0,01) και 9 η ημέρα ζωής (p<0,005) σε σχέση με τα πρόωρα που δεν εμφάνισαν κανενός είδους εγκεφαλική βλάβη. Επίσης, τάση για αυξημένα eepcs παρατηρήθηκαν και για τα νεογνά με PVL την 18 η ημέρα ζωής (p=0,09). Χαμηλό Apgar score στο 1 ο λεπτό σχετιζόταν με αυξημένα επίπεδα eepcs την 3 η (rho= 0,466, p<0,005) και 9 η rho= 0,487, p<0,005) ημέρα ζωής. Ομοίως για το Apgar score στο 5 ο λεπτό και για τις ίδιες ημέρες (rho= 0,363/p<0,05 και rho= 0,46/p<0,005 αντίστοιχα). Χαμηλότερα επίπεδα eepcs την 1 η (p=0,075), 3 η (p=0,095) και 18 η (p<0,05) ημέρα ζωής παρουσίαζαν τα νεογνά που εμφάνισαν όψιμη σηψαιμία (παράρτημα Α, εικόνα Α6). Επίσης, τα νεογνά που εμφάνισαν ΝΕΚ, είχαν χαμηλότερα επίπεδα eepcs την 3 η ημέρα ζωής (p<0,05). Ειδικότερα, ποσοστά χαμηλότερα των 0,0095 (επί του συνόλου των παρατηρήσεων στην κυτταρομετρία ροής) είχαν 66,7% ευαισθησία και 70% ειδικότητα ως προς την έκβαση της ΝΕΚ (AUC:0,724, 95% CI: 0,586 0,882, p<0,05) (παράρτημα Α, εικόνα Α3). Τέλος, τα eepcs σχετίζονταν θετικά με τη διάρκεια της νοσηλείας (45 η ημέρα, rho=0,356, p=0,088) και με την έκβαση του θανάτου κατά τη νεογνική περίοδο (9 η ημέρα, p<0,05). Τελειόμηνα νεογνά Προγεννητικοί παράγοντες Τα eepcs της 1 ης ημέρας ζωής δεν εμφάνιζαν συσχέτιση με προγεννητικούς παράγοντες. Εξωμήτριοι παράγοντες Τα νεογνά που υποβλήθηκαν σε θεραπευτική υποθερμία (n=9) εμφάνιζαν οριακά χαμηλότερα ποσοστά eepcs την 3 η ημέρα ζωής (p=0,085) και σημαντικά αυξημένα την 18 η ημέρα ζωής (p<0,05), σε σχέση με τα νεογνά μετρίας/σοβαρής εγκεφαλοπάθειας που δεν υποβλήθηκαν σε υποθερμία (n=4).

100 100 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κινητική Όψιμα Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα (lepcs) Στη μελέτη αυτή βρέθηκε πως τα lepcs ήταν αυξημένα στα πρόωρα με εγκεφαλοπάθεια σε σχέση με την ομάδα ελέγχου κυρίως την 1 η, 3 η και 9 η ημέρα ζωής. Επίσης τα πρόωρα της ομάδας ελέγχου είχαν οριακά αυξημένα ποσοστά σε σχέση με τα τελειόμηνα υγιή νεογνά την 1 η και 3 η ημέρα ζωής (πίν. 12 και εικόνα 16). Τα τελειόμηνα νεογνά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια εμφάνιζαν αυξημένα επίπεδα lepcs σε σχέση με τους μάρτυρες σε όλα τα χρονικά στιγμιότυπα, στατιστικώς δε σημαντικά την 1 η και 3 η ημέρα (πίν. 12 και εικόνα 16). Όταν η ομάδα αυτή διαχωρίστηκε ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας, φάνηκε πως τα lepcs κινητοποιούνται στον ίδιο βαθμό τόσο στη μέτρια όσο και στη βαριά εγκεφαλοπάθεια (πίν. 13 και εικόνα 17).

101 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 101 Πίνακας 12: Ποσοστά των lepcs στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά Πρόωρα νεογνά μάρτυρες Χρόνος (Ομάδα 1) n * ΜΟ (SD) 1 ημ. 29 0, (0, ) 3 ημ. 28 0, (0, ) 9 ημ. 28 0, (0, ) 18 ημ. 28 0, (0, ) 45 ημ. 22 0, (0, ) 8 Μήν. 21 0, (0, ) 24 Μήν 18 0, (0, ) Πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 2) n * ΜΟ (SD) 15 0, (0, ) 11 0, (0, ) 11 0, (0, ) 10 0,00096 (0, ) 6 0, (0, ) 5 0, (0, ) 3 0, (0, ) Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες (Ομάδα 3) n * ΜΟ (SD) 12 0, (0, ) 11 0, (0, ) 8 0, (0, ) 8 0, (0, ) 7 0, (0, ) 6 0, (0, ) 3 0, (0, ) Τελειόμηνα νεογνά με ήπια εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 4) n * ΜΟ (SD) 9 0, (0, ) 10 0,00038 (0, ) 8 0, (0, ) 6 0, (0, ) 6 0, (0, ) 6 0, (0, ) 6 0, (0,007899) ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων * ποσοστό επί του συνόλου των παρατηρήσεων (events) στην κυτταρομετρία ροής Τελειόμηνα νεογνά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 5) n * ΜΟ (SD) 12 0, (0, ) 12 0, (0, ) 10 0, (0, ) 9 0, (0, ) 7 0, (0, ) 6 0, (0, ) 5 0, (0, ) Σύγκριση Ομάδων p <0,01 <0,05 0,085 0,056 0,056 0, , ,087 Εικόνα 16: Κινητική των lepcs στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά

102 102 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Χρόνος Πίνακας 13: Ποσοστά των lepcs στα τελειόμηνα νεογνά με μέτρια και με βαριά ΥΙΕ Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες (Ομάδα 3) n * ΜΟ (SD) Τελειόμηνα νεογνά με Μέτρια Εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 5α) n * ΜΟ (SD) Τελειόμηνα νεογνά με Βαριά Εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 5β) n * ΜΟ (SD) Σύγκριση Ομάδων 1 ημ. 12 0, (0, ) 4 0, (0, ) 8 0, (0, ) 3 5b <0,05 ** 3 ημ. 11 0, (0, ) 4 0,00085 (0, ) 8 0, (0, ) 3 5a 0,066 9 ημ. 8 0, (0, ) 4 0, (0, ) 6 0, (0, ) 18 ημ. 8 0, (0, ) 4 0, (0, ) 5 0,00082 (0, ) 3 5a 0, ημ. 7 0, (0, ) 2 0,00060 (0, ) 5 0,00184 (0, ) 8 Μήν. 6 0, (0, ) 3 0, (0, ) 3 0, (0, ) 24 Μήν. 3 0, (0, ) 3 0, (0, ) 2 0, (0, ) ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων * ποσοστό επί του συνόλου των παρατηρήσεων (events) στην κυτταρομετρία ροής ** στατιστικώς σημαντικά και μετά τη διόρθωση κατά Bonferroni (p<0,05) p Εικόνα 17: Κινητική των lepcs στα τελειόμηνα νεογνά ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας

103 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 103 Συσχετίσεις Πρόωρα νεογνά Προγεννητικοί παράγοντες Στα πρόωρα νεογνά, τα lepcs δεν εμφάνισαν στατιστικά σημαντική συσχέτιση με τη ΔΚ ή το ΒΓ. Επίσης, η παρουσία χοριοαμνιονίτιδας σχετιζόταν με μειωμένα επίπεδα lepcs την 3 η (p<0,05), 18 η (p<0,05) και 45 η ημέρα ζωής (p=0,086), ενώ και η πολύδυμη κύηση σχετιζόταν με μειωμένα επίπεδα lepcs την 1 η ημέρα ζωής (p<0,005). Εξωμήτριοι παράγοντες Χαμηλό Apgar score στο 1 ο και 5 ο λεπτό σχετίζονταν με αυξημένα επίπεδα lepcs την 1 η ημέρα ζωής (rho= 0,289/p=0,06 και rho= 0,323/p<0,05 αντίστοιχα). Τα νεογνά με IVH >2 ου βαθμού εμφάνιζαν οριακά αυξημένα επίπεδα lepcs την 1 η (p<0,05) και 3 η ημέρα ζωής (p=0,068) σε σχέση με τα νεογνά στα οποία δεν ανιχνεύτηκε κανενός είδους εγκεφαλική βλάβη. Ομοίως αυξημένα επίπεδα εμφάνιζαν και τα νεογνά με PVL την 1 η ημέρα ζωής (p<0,05). Τα πρόωρα νεογνά με ΒΠΔ παρουσίαζαν αυξημένα lepcs σε σχέση με τους μάρτυρες την 45 η ημέρα ζωής (p<0,05). Επίσης υψηλότερα ήταν τα ποσοστά την 3 η ημέρα ζωής (p<0,05) στα νεογνά που εμφάνισαν αμφιβληστροειδοπάθεια της προωρότητας. Χαμηλότερα επίπεδα lepcs την 1 η (p=0,094), 18 η (p<0,05) και 45 η (p<0,05) ημέρα ζωής σχετίζονταν με την εμφάνιση όψιμης σηψαιμίας στη νεογνική περίοδο (παράρτημα Α, εικόνα Α7). Tελειόμηνα νεογνά Προγεννητικοί παράγοντες Τα lepcs δε συσχετίζονταν στα τελειόμηνα νεογνά με προγεννητικούς παράγοντες. Εξωμήτριοι παράγοντες Το ph αμέσως μετά τη γέννηση σχετίζονταν οριακά αρνητικά με τα επίπεδα των lepcs την 1 η (rho= 0,382, p=0,052) και 9 η (rho= 0,406, p=0,086) ημέρα ζωής. Το ίδιο ίσχυε και για το Apgar score στο 1 ο λεπτό (rho= 0,331, p=0,06). Χαμηλότερα επίπεδα lepcs την 3 η (p<0,05) και 9 η (p=0,06) ημέρα ζωής σχετίζονταν με την εμφάνιση όψιμης σηψαιμίας στη νεογνική περίοδο. Ειδικότερα, υπολογίστηκε πως επίπεδα την 3 η ημέρα χαμηλότερα από 0,0005 (επί του συνόλου των παρατηρήσεων (events) στην κυτταρομετρία ροής) είχαν 100% ευαισθησία και 87,1% ειδικότητα ως προς την έκβαση της σηψαιμίας (AUC:0,935, 95% CI: 0,842 1, p<0,05) (παράρτημα Α, εικόνα Α8). Τα lepcs ήταν αυξημένα την 1 η και 9 η ημέρα ζωής στα νεογνά με αυξημένη διάρκεια νοσηλείας (rho=0,42/p<0,05 και rho=0,488/p<0,05 αντίστοιχα) και σε αυτά που απεβίωσαν (p<0,05 και p=0,095 αντίστοιχα).

104 104 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.2. Βιολογικοί δείκτες Εγκεφαλικής Βλάβης Κινητική S100b Τα επίπεδα της S100b τις πρώτες 45 ημέρες ζωής για όλες τις ομάδες φαίνονται στον πίν. 14 και στο εικόνα 18. Η σύγκριση των ομάδων ασθενών έγινε με τις αντίστοιχες ομάδες ελέγχου. Τα τελειόμηνα νεογνά με μέτρια/βαριά ΥΙΕ (ομάδα 5) παρουσίαζαν αυξημένα επίπεδα την 1 η ημέρα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (ομάδα 3), με σταδιακή μείωση τις επόμενες ημέρες (Friedman test, p<0,05). Επίσης τα πρόωρα με εγκεφαλοπάθεια (ομάδα 2) είχαν οριακά υψηλότερα επίπεδα την ίδια ημέρα σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου των προώρων (ομάδα 1). Επίσης στην τελευταία αυτή ομάδα (ομάδα 1) η S100b ήταν υψηλότερη σε σχέση με την αντίστοιχη των τελειομήνων (ομάδα 3) τις ημέρες 1 και 9. Όταν η ομάδα των τελειομήνων με μέτρια/βαριά ΥΙΕ (ομάδα 5) διαχωρίστηκε σε ομάδες με μέτρια (ομάδα 5α) και βαριά εγκεφαλοπάθεια (ομάδα 5β), έγινε φανερό ότι η S100b αυξήθηκε βασικά μόνο στην ομάδα της βαριάς εγκεφαλοπάθειας (πίν. 15 και εικόνα 19).

105 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 105 Χρόνος Πίνακας 14: Επίπεδα της S100b (μg/l) την 1 η, 3 η, 9 η,18 η και 45 η ημέρα ζωής στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά Πρόωρα νεογνά Τελειόμηνα Σύγκριση μάρτυρες νεογνά μάρτυρες Ομάδων Πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 2) Τελειόμηνα νεογνά με ήπια εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 4) Τελειόμηνα νεογνά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 5) (Ομάδα 1) (Ομάδα 3) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) 1 ημ. 27 1,41 (0,80) 11 5,51 (6,43) 11 1,03 (0,28) 10 1,24 (0,62) 13 8,23 (10,48) ημ. 27 1,11 (0,59) 10 1,69 (1,48) 11 1,06 (0,22) 9 1,35 (1,17) 12 3,0 (3,51) 9 ημ. 25 1,42 (0,44) 9 1,50 (1,27) 8 0,97 (0,36) 8 1,45 (1,01) 10 1,77 (2,58) 1 3 <0, ημ. 21 1,45 (0,51) 8 1,25 (0,93) 4 1,31 (0,38) 4 1,15 (0,19) 9 0,87 (0,13) 45 ημ. 14 1,23 (0,36) 3 1,39 (0,28) 1 1,54 1 1,18 1 0,65 ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων 1 2 p <0,05 <0,05 0,06 Εικόνα 18: Κινητική της S100b τις πρώτες 45 ημέρες ζωής στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά

106 106 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Πίν.15: Επίπεδα της S100b (μg/l) στα τελειόμηνα νεογνά, ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας Χρόνος Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες (ομάδα 3) n ΜΟ (SD) Τελειόμηνα νεογνά με Μέτρια Εγκεφαλοπάθεια (ομάδα 5α) n ΜΟ (SD) Τελειόμηνα νεογνά με Βαριά Εγκεφαλοπάθεια (ομάδα 5β) n ΜΟ (SD) Σύγκριση Ομάδων 1 ημ. 11 1,03 (0,28) 5 1,13 (0,52) 8 12,66 (11,39) 3 5β 5α 5β 3 ημ. 11 1,06 (0,22) 4 1,04 (0,75) 8 3,98 (3,97) 3 5β 5α 5β 9 ημ. 8 0,97 (0,36) 4 0,92 (0,13) 6 2,34 (3,31) 18 ημ. 4 1,31 (0,38) 4 0,82 (0,05) 5 0,91 (0,17) 45 ημ. 1 1,54 1 0,65 ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων * οριακά σημαντικό μετά τη διόρθωση κατά Bonferroni (p=0,069) p <0,05 * <0,05 * 0,076 0,079 Εικόνα 19: Κινητική της S100b ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας στα τελειόμηνα

107 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 107 Συσχετίσεις Πρόωρα νεογνά Τα επίπεδα της S100b στα πρόωρα νεογνά σχετίζονταν θετικά με τα επίπεδα της ερυθροποιητίνης των επόμενων ημερών. Επίσης, τα επίπεδα της 1 ης ημέρας ζωής σχετίζονταν αρνητικά τόσο με την IGF 1 της 18 ης και 45 ης ημέρας ζωής, όσο και με τα επίπεδα των HSCs, VSELs και όψιμων EPCs καθ όλο σχεδόν τον πρώτο 1,5 μήνα ζωής (σταθερά, με υψηλό βαθμό συσχέτισης) (παράρτημα Β, πίν. Β.1). Η σχέση με τον SDF 1 στα πρόωρα έχει ιδιομορφίες (βλ. παράγραφο για ανάλυση). Επιπρόσθετα, τα επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα ζωής σχετίζονταν με περιγεννητικούς δείκτες στρες: το Apgar score στο 1 ο λεπτό (rho= 0,325/p<0,05), την περίσσεια βάσης (SBE, πρώτη μέτρηση μετά τη γέννηση) (rho= 0,422/p<0,01) και την Οξαλοξική Τρανσαμινάση (SGOT) των πρώτων 48 ωρών (rho=0,502/p<0,05). Η καισαρική τομή σχετίστηκε οριακά με αυξημένα επίπεδα S100b την 9 η ημέρα ζωής (p=0,061). Ακόμη, τα επίπεδα της S100b της 1 ης ημέρας ζωής σχετίζονταν οριακά με την εμφάνιση IVH ( 2 ου βαθμού) (p=0,058) και την έκβαση του θανάτου (p=0,071). Μια μικρή ένδειξη αύξησης παρατηρήθηκε και την 18 η ημέρα και στην υποομάδα των παιδιών που εμφάνισαν PVL (p=0,09). Επίσης, τα επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα ζωής είχαν θετική συσχέτιση με την εμφάνιση όψιμης σηψαιμίας κατά την νεογνική περίοδο (p<0,05). Επίσης οριακή αύξηση της S100b την 1 η ημέρα ζωής εμφάνισαν τα πρόωρα με σοβαρό σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας (ΣΑΔ) (>2 ου βαθμού) σε σχέση με αυτά που είχαν ήπιο ΣΑΔ (1 ου ή 2 ου βαθμού) (p=0,069). Αντίθετα, τα τελευταία νεογνά (με ήπιο ΣΑΔ) εμφάνισαν μικρή τάση για χαμηλότερα επίπεδα S100b τις ημέρες 3 (p=0,078) κα 9 (p=0,09) συγκριτικά με τα νεογνά χωρίς καθόλου αναπνευστική δυσχέρεια. Τέλος, τα επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα ζωής στα πρόωρα δεν παρουσίασαν συσχέτιση με τη ΔΚ, το ΒΓ, το φύλο, την ύπαρξη χοριοαμνιονίτιδας, την πρόωρη ρήξη εμβρυικών υμένων (ΠΡΕΥ) και την προγεννητική χορήγηση στεροειδών. Τελειόμηνα νεογνά Στα τελειόμηνα νεογνά η θετική συσχέτιση της S100b με τα επίπεδα της ερυθροποιητίνης και του SDF 1 ήταν περισσότερο σταθερή. Όσον αφορά τα ΚΠΚ, η ίδια έντονη αρνητική συσχέτιση ίσχυε κυρίως για τα VSELs, και σε μικρότερο βαθμό για τα HSCs και τα όψιμa EPCs. Αναφορικά με την IGF 1, αρνητική συσχέτιση παρατηρήθηκε την 9 η ημέρα ζωής (παράρτημα Β, πίν. Β.2). Όπως και στα πρόωρα νεογνά, τα επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα ζωής σχετίζονταν με περιγεννητικούς δείκτες στρες: Apgar score στο 1 ο λεπτό (rho= 0,466/p<0,01), Apgar score στο 5 ο λεπτό (rho= 0,347/p<0,05), περίσσεια βάσης (SBE, πρώτη μέτρηση μετά τη γέννηση) (rho= 0,469/p<0,05) και την Οξαλοξική Τρανσαμινάση (SGOT) των πρώτων 48 ωρών (rho=0,49/p<0,05). Επίσης, τα επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα ζωής είχαν θετική συσχέτιση

108 108 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ οριακά με την έκβαση του θανάτου (p= 0,064) και με τη διάρκεια της νοσηλείας (rho=0,361, p=0,091). Τέλος, τα επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα ζωής δεν παρουσίαζαν συσχέτιση με τον τρόπο του τοκετού και το φύλο. Προγνωστικός ρόλος Αναζητώντας την πιθανή ύπαρξη ενός πρώιμου προγνωστικού ρόλου για την S100b, προσδιορίστηκε στα τελειόμηνα ένα όριο 1,6 μg/l για την πρώτη ημέρα ζωής που προσδιόριζε με 87,5% ευαισθησία και 88,5% ειδικότητα την εξέλιξη σε βαριά εγκεφαλοπάθεια (AUC:0,937, 95% CI: 0,846 1, p<0,0005) (παράρτημα Α, εικόνα Α.9). Επίσης, όλα τα νεογνά που είχαν επίπεδα S100b >11,4 μg/l την 1 η ημέρα ζωής εμφάνισαν πολύ δυσμενή πρόγνωση: πέθαναν κατά τη νεογνική περίοδο ή εμφάνισαν εγκεφαλική παράλυση στα 2 χρόνια της ζωής (66,7% ευαισθησία και 100% ειδικότητα) (AUC: 0,923, 95% CI: 0,798 1, p<0,001) (παράρτημα Α, εικόνα Α.10). Όσον αφορά τα πρόωρα νεογνά, ένα όριο 2,51 μg/l την 1 η ημέρα ζωής προέβλεπε με 71,4% ευαισθησία και 90,3% ειδικότητα την εξέλιξη σε 3 ου ή 4 ου βαθμού IVH (AUC: 0,756, 95% CI: 0,509 1, p<0,05) (παράρτημα Α, εικόνα Α.11). Κινητική Ειδική νευρωνική ενολάση (Neuron Specific Enolase, NSE) Τα επίπεδα της NSE στα πρόωρα και στα τελειόμηνα νεογνά τον πρώτο 1,5 μήνα ζωής φαίνονται στον πίν. 16 και παραστατικά στην εικόνα 20. Οι συγκρίσεις γίνονται με τις αντίστοιχες ομάδες ελέγχου. Τα τελειόμηνα νεογνά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια εμφανίζουν όπως ήταν αναμενόμενο υψηλότερα επίπεδα NSE την 1 η, 3 η και 9 η ημέρα ζωής. Σε σχέση με τα πρόωρα χωρίς εμφανή εγκεφαλική βλάβη, τα πρόωρα με εγκεφαλοπάθεια εμφάνιζαν υψηλότερα επίπεδα καθ όλο τον 1 ο 1,5 μήνα ζωής, στατιστικώς όμως σημαντικά την 45 η ημέρα (πίν. 16 και εικόνα 20). Επίσης, τα πρόωρα νεογνά της ομάδας ελέγχου είχαν τάση για αυξημένα επίπεδα σε σχέση με τους τελειόμηνους μάρτυρες τις ημέρες 1 και 9 (σημειωτέον, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικώς αυξημένα επιπίδα της NSE στα πρόωρα νεογνά με IVH 1 ου βαθμού σε σχέση με αυτά χωρίς εμφανή εγκεφαλική βλάβη). Σε όλες τις ομάδες των παιδιών τα επίπεδα της NSE μειώνονται συν τω χρόνω (Friedman test, p<0,05). Η διαίρεση της ομάδας της μέτριας/βαριάς ΥΙΕ σε υποομάδες της μέτριας και της βαριάς εγκεφαλοπάθειας δείχνει τη σταδιακή αύξηση των επιπέδων της NSE, αναλογικά με το βαθμό της κλινικά παρατηρούμενης εγκεφαλικής βλάβης (πίν. 17 και εικόνα 21).

109 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 109 Χρόνος Πίνακας. 16: Επίπεδα της NSE (μg/l) την 1 η, 3 η, 9 η, 18 η, και 45 η ημέρα ζωής σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά Πρόωρα νεογνά Πρόωρα νεογνά με Τελειόμηνα μάρτυρες εγκεφαλοπάθεια νεογνά μάρτυρες Τελειόμηνα νεογνά με Ήπια Εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 4) Τελειόμηνα νεογνά με Μέτρια/Σοβαρή Εγκεφαλοπάθεια ( Ομάδα 5) Σύγκριση Ομάδων (Ομάδα 1) ( Ομάδα 2) ( Ομάδα 3) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) 1 ημ ,92 (19,13) 12 72,80 (67,46) 11 23,51 (10,76) 10 30,57 (10,17) 12 81,98 (52,75) p <0,0005 0,068 3 ημ ,45 (26,09) 10 38,12 (30,14) 11 16,91 (8,44) 9 20,65 (6,75) 12 42,15 (25,02) 3 5 <0,005 9 ημ ,84 (20,97) 9 23,30 (22,25) 8 11,96 (9,75) 8 18,24 (6,75) 10 24,58 (14,54) ημ ,64 (9,18) 8 34,91 (26,12) 4 12,91 (1,57) 4 18,74 (5,83) 9 16,25 (6,46) 1 2 0, ημ ,06 (5,68) 3 25,13 (8,62) 1 12, ,1 1 9, <0,05 ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων <0,05 0,097 Εικόνα 20: Κινητική της NSE σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά

110 110 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Πίνακας 17: Επίπεδα της NSE (μg/l) στα τελειόμηνα νεογνά διαχωρισμένα ανάλογα με το βαθμό της ΥΙΕ Τελειόμηνα νεογνά Τελειόμηνα νεογνά με Τελειόμηνα νεογνά με Σύγκριση Χρόνος μάρτυρες Μέτρια Εγκεφαλοπάθεια Βαριά Εγκεφαλοπάθεια Ομάδων (ομάδα 3) (ομάδα 5α) (ομάδα 5β) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) 1 ημ ,51 (10,76) 4 66,09 (15,95) 8 89,93 (63,62) 3 5α 3 5β P <0,0005 * <0,0005 * 3 ημ ,91 (8,44) 4 41,30 (22,11) 8 42,57 (27,81) 3 5β <0,05 9 ημ. 8 11,96 (9,75) 4 20,48 (6,68) 6 27,31 (18,21) 3 5β 0, ημ. 4 12,91 (1,57) 4 16,25 (1,84) 5 16,25 (8,99) 3 5α <0,05 45 ημ. 1 12,64 1 9,07 ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων * στατιστικώς σημαντικό και μετά τη διόρθωση κατά Bonferroni (p<0,005) Εικόνα 21: Κινητική της NSE στα τελειόμηνα ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας

111 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 111 Συσχετίσεις Πρόωρα νεογνά Η μελέτη των συσχετίσεων στα πρόωρα δείχνει πως τα αυξημένα επίπεδα της NSE συνδέονταν με μειωμένα επίπεδα του IGF 1 την 18 η και 45 η ημέρα ζωής. Η σχέση με τον SDF 1 στα πρόωρα έχει ιδιομορφίες (βλ. παράγραφο για ανάλυση). Όσον αφορά τα ΚΠΚ, αυξημένα επίπεδα NSE σχετίζονταν με αύξηση των HSCs και VSELs την 18 η ημέρα ζωής, των πρώιμων EPCs την 3 η ημέρα ζωής και των όψιμων EPCs την 18 η και 45 η ημέρα ζωής (παράρτημα Β, πίν.β.3). Τα νεογνά με σοβαρό ΣΑΔ (>2 ου βαθμού) εμφάνιζαν οριακά υψηλότερες τιμές NSE την 9 η ημέρα ζωής (p=0,077) σε σχέση με τα νεογνά με ήπιο ΣΑΔ (1 ου ή 2 ου βαθμού). Επίσης, τα επίπεδα την 1 η ημέρα σχετίζονταν σημαντικά με τις τιμές των τρανσαμινασών του πρώτου 48ώρου (SGOT: rho=0,66/p<0,001 και SGPT: rho=0,658/p<0,005). H NSE την 1 η ημέρα ζωής δεν παρουσίασε συσχέτιση με τον τρόπο του τοκετού, τη ΔΚ, το ΒΓ, το φύλο, την ύπαρξη χοριοαμνιονίτιδας, την πρόωρη ρήξη εμβρυικών υμένων (ΠΡΕΥ) και τη προγεννητική χορήγηση στεροειδών. Τελειόμηνα νεογνά Στα τελειόμηνα νεογνά, τα αυξημένα επίπεδα της NSE σχετίζονταν με μειωμένα επίπεδα του IGF 1 την 3 η και 9 η ημέρα ζωής, αλλά και με αυξημένα επίπεδα της EPO την 3 η ημέρα ζωής και των ενδοθηλιακών προγονικών σειρών (eepcs, lepcs) της 3 ης και 18 ης ημέρας ζωής (παράρτημα Β, πίν.β.4). Επίσης τα επίπεδα της NSE της 1 ης μέρας σχετίζονταν σημαντικά με τη διάρκεια νοσηλείας (rho=0,729, p<0,0005) καθώς και με περιγεννητικούς δείκτες στρες: Apgar score στο 1 ο λεπτό (rho= 0,65/p<0,0005), Apgar score στο 5 ο λεπτό (rho= 0,623/p<0,0005), περίσσεια βάσης (SBE) αμέσως μετά τη γέννηση (rho= 0,701/p<0,0005), περίσσεια βάσης την 3 η ημέρα ζωής (rho= 0,489/p<0,05), τρανσαμινάσες του πρώτου 48ώρου (SGOT: rho=0,611/p<0,005 και SGPT: rho=0,629/p<0,005). Και στα τελειόμηνα, τα επίπεδα της NSE την 1 η ημέρα ζωής δεν παρουσίασαν συσχέτιση με τον τρόπο του τοκετού και το φύλο. Προγνωστικός ρόλος Στα τελειόμηνα νεογνά, ένα όριο 38,8 μg/l την 1 η ημέρα ζωής είχε ευαισθησία 100% και ειδικότητα 95,2% όσον αφορά την εξέλιξη σε 2 ου ή 3 ου βαθμού ΥΙΕ (AUC: 0,976, 95% CI: 0,927 1, p<0,0005) (παράρτημα Α, εικόνα Α12).

112 112 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.3. Χημειοτακτικοί / νευροτροφικοί παράγοντες Κινητική Ερυθροποιητίνη (Erythropoietin, EPO) Η ΕΡΟ ήταν αυξημένη την 1 η και 3 η ημέρα ζωής στα τελειόμηνα νεογνά με μέτρια/βαριά ΥΙΕ σε σχέση με τους μάρτυρες (πίν. 18 και εικόνα 22). Όταν τα νεογνά διαχωρίστηκαν σε αυτά που εμφάνισαν μέτρια και σε αυτά με βαριά εγκεφαλοπάθεια, η ΕΡΟ παρατηρήθηκε αυξημένη κυρίως στη βαριά ΥΙΕ (πίν. 19 και εικόνα 23). Επίσης οριακά και τα νεογνά με ήπια ΥΙΕ είχαν αυξημένα επίπεδα την 1 η ημέρα ζωής σε σχέση με τα υγιή τελειόμηνα. Αναφορικά με τα πρόωρα, αυτά που εμφάνισαν εγκεφαλοπάθεια είχαν αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ την 1 η, 3 η και 9 η ημέρα ζωής σε σχέση με τα πρόωρα της ομάδας ελέγχου.

113 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 113 Χρόνος Πίνακας 18 : Επίπεδα της ερυθροποιητίνης σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά Πρόωρα νεογνά μάρτυρες Πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια ( Ομάδα 2) n ΜΟ (SD) Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες Τελειόμηνα νεογνά με Ήπια Εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 4) n ΜΟ (SD) Τελειόμηνα νεογνά με Μέτρια/Σοβαρή Εγκεφαλοπάθεια ( Ομάδα 5) n ΜΟ (SD) Σύγκριση Ομάδων (Ομάδα 1) ( Ομάδα 3) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) 1 ημ. 23 9,51 (18,07) 12 99,03 (211,73) 11 17,03 (27,20) 5 133,06 (137,25) ,24 (284,58) ημ ,17 (159,4) ,9 (238,7) 10 3,3 (2,38) 8 3,47 (2,52) ,78 (354,1) ημ. 25 2,95 (2,26) 9 26,04 (58,71) 6 6,23 (4,96) 6 3,66 (2,03) 9 94,51 (248,11) ημ. 27 6,13 (7,81) 9 32,19 (69,97) 7 7,23 (6,6) 7 5,57 (2,49) 9 6,32 (7,89) 45 ημ ,89 (10) 6 11,29 (6,95) 7 13,71 (5,49) 6 10,02 (5,17) 6 13,22 (8,02) 8 Μήν ,17 (3,85) 4 10,78 (3,65) 2 13,35 (4,31) 2 6,7 (3,05) 3 12,14 (3,69) 24Μήν 4 8,9 (1,64) 1 2,11 2 9,11 (0,36) 1 15,6 ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων p 0,062 <0,001 <0,05 <0,005 0,084 <0,05 <0,05 <0,05 Εικόνα 22: Κινητική της ερυθροποιητίνης σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά (βλ παράρτημα Α / εικόνα Α.13, για μεγέθυνση στις κατώτερες τιμές)

114 114 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Πίνακας 19 : Επίπεδα της ερυθροποιητίνης στα τελειόμηνα με μέτρια και με βαριά εγκεφαλοπάθεια Τελειόμηνα νεογνά Τελειόμηνα νεογνά με Τελειόμηνα νεογνά με Σύγκριση p Χρόνος μάρτυρες Μέτρια Εγκεφαλοπάθεια Βαριά Εγκεφαλοπάθεια Ομάδων (ομάδα 3) (ομάδα 5α) (ομάδα 5β) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) 1 ημ ,03 (27,20) 5 33,74 (37,1) 7 230,03 (358,92) 3 5β <0,05 3 ημ. 10 3,3 (2,38) 4 45,26 (65,13) 8 440,54 (368,36) 3 5β <0,005 * 9 ημ. 6 6,23 (4,96) 3 4,68 (5,44) 6 139,42 (302,02) 18 ημ. 7 7,23 (6,6) 4 6,88 (10,9) 5 5,87 (5,87) 45 ημ. 7 13,71 (5,49) 2 18,85 (12,52) 4 10,4 (4,83) 8 Μήν. 2 13,35 (4,31) 3 12,14 (3,69) 0 24 Μήν. 1 2, ,6 ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων * στατιστικώς σημαντικό και μετά τη διόρθωση κατά Bonferroni (p<0,05) Εικόνα 23: Κινητική της ερυθροποιητίνης στα τελειόμηνα, ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας

115 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 115 Συσχετίσεις Πρόωρα νεογνά Όπως περιγράφηκε στην παράγραφο 2.2.1, η S100b συσχετίστηκε θετικά με τα επίπεδα της ΕΡΟ (παράρτημα Β, πίν.β.1). Όσον αφορά τα ΚΠΚ, δε βρέθηκε ανεξάρτητη σταθερή συσχέτιση με την ΕΡΟ. Όταν όμως οι συσχετίσεις μελετήθηκαν χωριστά στα πρόωρα με εγκεφαλοπάθεια (ομάδα 2) και σε αυτά χωρίς εγκεφαλοπάθεια (ομάδα 1), φάνηκαν ευκρινέστερα οι συσχετίσεις στην ομάδα της εγκεφαλοπάθειας: η ΕΡΟ της 1 ης ημέρας σχετιζόταν θετικά με τα lepcs της ίδιας ημέρας (rho=0,589, p<0,05) και με τα eepcs της 18 ης ημέρας (rho=0,771, p=0,072), ενώ τα επίπεδα της ΕΡΟ της 3 ης ημέρας σχετίζονταν θετικά με τα ποσοστά των HSCs (rho=0,757, p<0,05) και eepcs (rho=0,75, p=0,052) της 18 ης ημέρας. Η ΕΡΟ ήταν αυξημένη κυρίως την 1 η ημέρα σε χαμηλό Apgar score στο 1 ο και 5 ο λεπτό (rho= 0,538/p<00,001 και rho= 0,564/p<0,0005), και οριακά την 3 η ημέρα ζωής (p=0,064) σε έντονο περιγεννητικό ασφυκτικό επεισόδιο (Apgar score στο 1 ο λεπτό <4). Ομοίως, τα επίπεδα ΕΡΟ της 1 ης ημέρας σχετίζονταν αρνητικά με το ph της 1 ης ημέρας ζωής (rho= 0,539, p<0,001), ενώ τα επίπεδα της 3 ης ημέρα σχετίζονταν αρνητικά με το ph της 1 ης (rho= 0,408, p<0,05) και 3 ης ημέρας (rho= 0,434, p<0,05). Επίσης αυξημένη ΕΡΟ βρέθηκε την 1 η (p<0,05), 3 η (p<0,05) και 9 η (p<0,005) ημέρα ζωής στα νεογνά με IVH >2 ου βαθμού, σε σχέση με τα πρόωρα χωρίς κανενός είδους ανιχνεύσιμη εγκεφαλική βλάβη. Ομοίως και στα πρόωρα με PVL την 1 η ημέρα ζωής (p=0,065). Μειωμένα επίπεδα ΕΡΟ την 1 η ημέρα ζωής σχετίζονταν οριακά με την ανάπτυξη σοβαρού ΣΑΔ (3 ου /4 ου βαθμού) σε σχέση με την εμφάνιση ΣΑΔ μικρότερου βαθμού (p=0,071). Επίσης αξιοσημείωτο είναι πως υπήρχε τάση αυξημένων επιπέδων ΕΡΟ την 1 η ημέρα ζωής στα νεογνά που πήραν προγεννητικά στεροειδή (p=0,088) (σύγκριση μετά από στάθμιση για τον παράγοντα της εγκεφαλοπάθειας). Η διάρκεια της νοσηλείας σχετιζόταν με αυξημένη ΕΡΟ την 3 η ημέρα ζωής (rho=0,557, p<0,01). Ομοίως θετική συσχέτιση είχε και η ΕΡΟ της 1 ης και 3 ης ημέρας με την έκβαση του θανάτου (p<0,001 και p<0,05 αντίστοιχα). Τέλος, η πολύδυμη κύηση σχετίστηκε με οριακά χαμηλότερα επίπεδα ΕΡΟ την 1 η ημέρα ζωής (p=0,055). Τελειόμηνα νεογνά Ομοίως και στα τελειόμηνα νεογνά, σαφείς συσχετίσεις της ΕΡΟ με τα κυκλοφορούντα προγονικά κύτταρα βρέθηκαν όταν μελετήθηκαν χωριστά τα νεογνά με μέτρια/βαριά ΥΙΕ (ομάδα 3) σε σχέση με τους μάρτυρες. Η ΕΡΟ σχετιζόταν θετικά με τα VSELs και κυρίως με τα EPCs, κυρίως στην ομάδα της μέτριας/βαριάς εγκεφαλοπάθειας (παράρτημα Β, πίνακας Β.5). Επίσης, η ΕΡΟ την 3 η ημέρα ζωής ήταν αυξημένη σε νεογνά με χαμηλό ph (οξέωση) αμέσως μετά τη γέννηση (rho= 0,62, p<0,01). Επίσης, αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ την 3 η και οριακά την 9 η ημέρα είχαν τα νεογνά που απεβίωσαν (p<0,05 και p=0,09 αντίστοιχα).

116 116 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Κινητική Iνσουλινόμορφος αυξητικός παράγων 1 (Insulinlike Growth Factor 1, IGF 1) Τα τελειόμηνα με μέτρια/σοβαρή εγκεφαλοπάθεια είχαν οριακά χαμηλότερα επίπεδα IGF 1 την 3 η και 9 η ημέρα ζωής σε σχέση με τους μάρτυρες, ενώ τα πρόωρα με εγκεφαλοπάθεια δε διέφεραν σημαντικά από την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου. Τα τελειόμηνα της ομάδας ελέγχου είχαν σημαντικά υψηλότερα επίπεδα IGF 1 από την 9 η έως και την 45 η ημέρα από την ομάδα ελέγχου των προώρων (πίν. 20 και εικόνα 24). Μετά το διαχωρισμό των τελειομήνων σε μέτρια και βαριά εγκεφαλοπάθεια δε φάνηκε διαφορά ανάμεσα στο βαθμό της εγκεφαλικής βλάβης (πίν. 21 και εικόνα 25). Όλες οι ομάδες (πλην των προώρων με εγκεφαλοπάθεια) εμφάνιζαν σταδιακά αύξηση των επιπέδων τους κατά τη διάρκεια του πρώτου 1,5 μήνα ζωής.

117 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 117 Χρόνος Πίνακας 20 : Επίπεδα του IGF 1 στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά Πρόωρα νεογνά μάρτυρες Πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες Τελειόμηνα νεογνά με Ήπια Εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 4) n ΜΟ (SD) Τελειόμηνα νεογνά με Μέτρια/Σοβαρή Εγκεφαλοπάθεια ( Ομάδα 5) n ΜΟ (SD) Σύγκριση Ομάδων (Ομάδα 1) (Ομάδα 2) ( Ομάδα 3) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) 1 ημ. 27 <23 * 12 23,67 (2,34) 9 27,82 (9,58) 9 24,37 (2,54) 12 24,02 (3,52) 3 ημ ,74 (2,56) 10 23,7 (2,24) 9 30,04 (8,84) 10 34,26 (13,87) 12 <23 * 3 5 0,072 9 ημ ,92 (6,38) 10 <23 * 5 75,17 (49,45) 8 41,49 (25,74) 10 36,04 (25,53) p 0,085 <0, ημ ,28 (7,12) 9 25,24 (6,73) 8 51,7 (23,99) 7 54,83 (26,8) 9 52,59 (24,88) 1 3 <0,01 45 ημ ,6 (12,45) 5 24,8 (2,68) 7 74,11 (16,09) 6 62,65 (24,33) 7 60,23 (27,46) 1 3 <0, Μήν (8,35) 3 69,27 (28,34) ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων * κατώτερο διαγνωστικό όριο της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκε Εικόνα 24: Κινητική του IGF 1 στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά

118 118 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Πίνακας 21 : Επίπεδα του IGF 1 στα τελειόμηνα νεογνά, ανάλογα του βαθμού της εγκεφαλοπάθειας Χρόνος Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες (ομάδα 3) Τελειόμηνα νεογνά με Μέτρια Εγκεφαλοπάθεια (ομάδα 5α) Τελειόμηνα νεογνά με Βαριά Εγκεφαλοπάθεια (ομάδα 5β) Σύγκριση Group p n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) 1 ημ. 9 27,82 (9,58) 5 25,43 (5,46) 7 <23 * 3 ημ. 9 30,04 (8,84) 5 <23 * 7 <23 * 9 ημ. 5 75,17 (49,45) 4 34,55 (10,14) 6 37,04 (33,3) 18 ημ. 8 51,7 (23,99) 4 40,32 (8,75) 5 62,4 (30,16) 45 ημ. 7 74,11 (16,09) 2 64,95 (30,33) 5 58,34 (29,75) 8 Μήν. 1 73,7 ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων * κατώτερο διαγνωστικό όριο της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκε Εικόνα 25: Κινητική του IGF 1 στα τελειόμηνα νεογνά, ανάλογα του βαθμού της εγκεφαλοπάθειας

119 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 119 Συσχετίσεις Πρόωρα νεογνά Στα πρόωρα νεογνά δε βρέθηκε σταθερή συσχέτιση του παράγοντα IGF 1 με τα ΚΠΚ. Τα νεογνά με IVH (>2 ου βαθμού) εμφάνιζαν τάση για μειωμένα επίπεδα IGF 1 τη 18 η ημέρα ζωής p=0,081). Επίσης, η παρουσία σοβαρού ΣΑΔ (3 ου ή 4 ου βαθμού) σχετιζόταν με χαμηλά επίπεδα IGF 1 την 18 η ημέρα ζωής (p<0,05), ενώ τα νεογνά με ΒΠΔ εμφάνιζαν μειωμένα επίπεδα IGF 1 την 18 η (p=0,079) και 45 η ημέρα ζωής (p<0,05). Τέλος, τα νεογνά με σηψαιμία εμφάνιζαν μειωμένα επίπεδα την 9 η (p<0,05), 18 η (p=0,09) και 45 η ημέρα ζωής (p=0,051). Apgar score στο 1 ο λεπτό χαμηλότερο του 4 σχετιζόταν με μειωμένα επίπεδα IGF 1 τη 18 η και 45 η ημέρα ζωής (p<0,05 και για τις 2 ημέρες). Επίσης, αρνητική συσχέτιση παρατηρήθηκε ανάμεσα στα επίπεδα IGF 1 και τη διάρκεια νοσηλείας (18 η μέρα (rho= 0,436/p<0,05) και 45 η ημέρα ζωής (rho= 0,45/p<0,05)). Χαμηλότερα επίπεδα παρατηρήθηκαν και στα πρόωρα που απεβίωσαν στη νεογνική περίοδο (3 η ημέρα (p<0,05) και 18 η ημέρα (p=0,082)). Τέλος, τα επίπεδα του IGF 1 της 1 ης ημέρας ζωής δεν εμφάνισαν συσχέτιση με τη ΔΚ ή το ΒΓ. Τελειόμηνα νεογνά Τα επίπεδα του IGF 1 σχετίζονταν θετικά στα τελειόμηνα νεογνά με τα επίπεδα των HSCs, των πρώιμων EPCs, των όψιμων EPCs και οριακά με τα VSELs (Παράρτημα Β, Πίνακας Β.6). Χαμηλό Apgar score στο 1 ο λεπτό σχετιζόταν με χαμηλά επίπεδα IGF 1 την 9 η ημέρα ζωής (rho=0,459, p<0,05). Κινητική SDF 1 (Stromal cell derived factor 1) Τα επίπεδα του SDF 1 τον πρώτο 1,5 μήνα ζωής στις ομάδες της μελέτης δεν ανέδειξαν συγκεκριμένο πρότυπο κινητικής (πίνακας 22 και εικόνα 26). Τα επίπεδα τη 18 η ημέρα ήταν υψηλότερα στην ομάδα της ήπιας εγκεφαλοπάθειας σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Όταν τα τελειόμηνα διαχωρίστηκαν ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας, φάνηκε μια τάση για μικρότερα επίπεδα SDF 1 την 1 η (p=0,065) και 45 η (p=0,089) ημέρα ζωής στη μέτρια εγκεφαλοπάθεια, καθώς και τάση για αυξημένο SDF 1 την 9 η ημέρα ζωής στη βαριά εγκεφαλοπάθεια (p=0,064), σε σχέση με τους μάρτυρες (εικόνα 27).

120 120 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Χρόνος Πίνακας 22: Επίπεδα του SDF 1 (pg/ml) στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά Πρόωρα νεογνά μάρτυρες Πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες Τελειόμηνα νεογνά με Ήπια Εγκεφαλοπάθεια (Ομάδα 4) n ΜΟ (SD) Τελειόμηνα νεογνά με Μέτρια/Σοβαρή Εγκεφαλοπάθεια ( Ομάδα 5) n ΜΟ (SD) Σύγκριση Ομάδων (Ομάδα 1) ( Ομάδα 2) ( Ομάδα 3) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) n ΜΟ (SD) 1 ημ ,85 (413,35) ,33 (702,42) ,12 (605,61) 6 865,23 (483,19) 9 794,47 (430,27) 3 ημ ,88 (276,51) ,60 (435,52) ,57 (359,05) ,96 (443,39) ,83 (581,62) 9 ημ ,46 (279,04) ,45 (621,86) ,92 (283,79) ,41 (476,51) ,68 (495,57) 18 ημ ,20 (429,87) ,66 (520,76) ,94 (262,67) ,13 (216,37) ,88 (199,70) 3 4 <0,05 45 ημ ,49 (346,97) ,07 (281,43) ,89 (257,99) ,82 (334,98) ,60 (270,93) 8 Μήν ,37 (203,12) ,97 (847,73) ,50 (230,36) ,15 (265,02) ,71 (216,26) 1 3 0,087 ΜΟ: μέσος όρος, SD: standard deviation, n: αριθμός δειγμάτων p Εικόνα 26: Κινητική του SDF 1 στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά

121 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 121 Εικόνα 27: Κινητική του SDF 1 στα τελειόμηνα, ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας Συσχετίσεις Πρόωρα νεογνά Συσχετίσεις με τα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα Τα επίπεδα του SDF 1 της 3 ης ημέρας ζωής σχετίζονταν θετικά με τα επίπεδα VSELs της ίδιας ημέρας (rho=0,416, p<0,05). Επίσης τα επίπεδα του SDF 1 της 9 ης ημέρας ζωής εμφάνισαν τάση συσχέτισης με τα επίπεδα HSCs της 18 ης ημέρας (rho=0,315, p=0,09), ενώ τα επίπεδα του SDF 1 της 18 ης ημέρας ζωής σχετίζονταν σημαντικά με τα επίπεδα των HSCs και των πρώιμων EPCs της ίδιας ημέρας (rho=0,392/p<0,05 και rho=0,389/p<0,05 αντίστοιχα). Συσχετίσεις με περιγεννητικά χαρακτηριστικά Στα πρόωρα νεογνά με χοριοαμνιονίτιδα και σε αυτά που χορηγήθηκαν προγεννητικά στεροειδή παρατηρήθηκε μια τάση μειωμένων επιπέδων SDF 1 την 1 η ημέρα ζωής (p=0,09 και p=0,053 αντίστοιχα). Δε βρέθηκε συσχέτιση με τη ΔΚ ή το ΒΓ.

122 122 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Χαμηλό Apgar score σχετιζόταν με χαμηλά επίπεδα του SDF 1 τη 45 η ημέρα ζωής (rho=0,438, p<0,05). Τα νεογνά που εμφάνισαν IVH 3 ου ή 4 ου βαθμού είχαν χαμηλότερα επίπεδα SDF 1 την 3 η (p<0,05) και την 45 η ημέρα ζωής (p=0,074), σε σχέση με τα πρόωρα στα οποία δεν ανιχνεύτηκε κανενός είδους εγκεφαλική βλάβη. Επίσης τα νεογνά που εμφάνισαν PVL είχαν οριακά μειωμένα επίπεδα SDF 1 την 1 η ημέρα ζωής σε σχέση με τα πρόωρα στα οποία δεν ανιχνεύτηκε κανενός είδους εγκεφαλική βλάβη (p=0,059). Αυξημένα επίπεδα SDF 1 την 1 η ημέρα ζωής είχαν επίσης τα νεογνά με ΣΑΔ 2 ου βαθμού (p<0,05). Αντίθετα, τα νεογνά με ΒΠΔ εμφάνιζαν οριακά μειωμένα επίπεδα την 45 η ημέρα ζωής (p=0,077). Τελειόμηνα νεογνά Συσχετίσεις με τα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα Παρατηρήθηκε μια τάση θετικής συσχέτισης των επιπέδων του SDF 1 της 18 ης ημέρας ζωής με τα ποσοστά των όψιμων EPCs της 45 ης ημέρας (rho=0,451, p=0,091). Συσχετίσεις με περιγεννητικά χαρακτηριστικά Χαμηλό ph αμέσως μετά τη γέννηση σχετιζόταν με μειωμένο SDF 1 την 45 η ημέρα ζωής (rho=0,689, p<0,05), ενώ μειωμένα επίπεδα SDF 1 την 3 η και 9 η ημέρα παρατηρήθηκαν στα νεογνά που είχαν όψιμη σηψαιμία (p<0,05 και για τις 2 ημέρες). Τέλος, αυξημένος χρόνος νοσηλείας σχετιζόταν οριακά με μειωμένα επίπεδα SDF 1 τη 45 η ημέρα ζωής (rho= 0,547/p=0,082). Έκφραση του υποδοχέα CD184/CXCR4 Ειδικότερα για την πληρέστερη μελέτη του χημειοτακτικού άξονα SDF 1/CD184 +, προσδιορίστηκε και ο λόγος των CD184 + θετικών κυττάρων προς τα CD184 κύτταρα, λόγος ο οποίος αντανακλά την αύξηση ή μείωση της έκφρασης του υποδοχέα CXCR4 στην επιφάνεια των ΚΠΚ. Τα επίπεδα του SDF 1 της 3 ης ημέρας εμφάνιζαν οριακά θετική συσχέτιση με το λόγο αυτό (CD184 + /CD184 ) της 9 ης ημέρας ζωής (rho=0,368/p=0,07), καθώς και τα επίπεδα SDF 1 της 45 ης ημέρα με το λόγο αυτό της ίδιας ημέρας (rho=0,645/p<0,005). Μελετώντας τη διακύμανση της έκφρασης του υποδοχέα αυτού στα τελειόμηνα νεογνά της μελέτης μας, βρέθηκε πως στη μέτρια εγκεφαλοπάθεια η έκφραση του υποδοχέα (λόγος CD184 + /CD184 ) ήταν αυξημένη τις ημέρες 9, 18 και 45 σε σχέση με τους μάρτυρες (χωρίς όμως να επιτυγχάνεται στατιστική σημαντικότητα), ενώ στην ομάδα της βαριάς εγκεφαλοπάθειας η έκφραση του υποδοχέα στα ΚΠΚ ήταν μειωμένη τις ημέρες 3 και 9 σε σχέση με τους μάρτυρες (p<0,05 και για τις 2 ημέρες) (εικόνα 28). Ειδικά την 9 η ημέρα η έκφραση στη βαριά εγκεφαλοπάθεια ήταν πολύ μικρότερη σε σχέση με τη μέτρια εγκεφαλοπάθεια (p<0,001, σημαντικό και μετά τη διόρθωση κατά Bonferroni). Επίσης, ανάμεσα στα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια μέτριου ή σοβαρού βαθμού, αυτά που υποβλήθηκαν σε θεραπευτική υποθερμία εμφάνιζαν οριακά χαμηλότερα ποσοστά CD184 + ΚΠΚ την 3 η (p=0,062) και 45 η ημέρα ζωής (p=0,053).

123 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 123 Εικόνα 28: Έκφραση του υποδοχέα του SDF 1 στα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα (λόγος CD184 + /CD184 ) στα τελειόμηνα νεογνά τις πρώτες 45 ημέρες ζωής, ανάλογα με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας

124 124 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 2.4. Νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley III Σε δοκιμασία Bayley ΙΙΙ υποβλήθηκαν μετά το 2 ο χρόνο ζωής 38 παιδιά, 14 τελειόμηνα και 24 πρόωρα νεογνά. Από τα τελειόμηνα, τα 2 είχαν εμφανίσει σοβαρή εγκεφαλοπάθεια, 3 μέτρια εγκεφαλοπάθεια, 6 ήπια εγκεφαλοπάθεια και 3 ήταν φυσιολογικά τελειόμηνα (μάρτυρες). Από τα πρόωρα νεογνά, τα 20 δεν είχαν εμφανή βλάβη εγκεφάλου (πρόωρα μάρτυρες) και τα 4 ανήκαν στην ομάδα της εγκεφαλοπάθειας της προωρότητας. 4 παιδιά (3 τελειόμηνα με βαριά εγκεφαλοπάθεια και 1 πρόωρο με εγκεφαλοπάθεια) δεν μπόρεσαν λόγω της σοβαρής κλινικής εικόνας (εγκεφαλική παράλυση) να προσέλθουν για αναπτυξιακή εκτιμηση. Κατόπιν τηλεφωνικής επικοινωνίας με τους γονείς των παιδιών αυτών, τα αναπτυξιολογικά τους ελλείμματα εκτιμήθηκαν πως ήταν σοβαρότατου βαθμού και σε όλες τις υποκλίμακες η βαθμολογία τους ήταν <2 σταθερές αποκλίσεις. Οι βαθμολογίες των ομάδων των νεογνών φαίνονται στον πίνακα 23. Κλίμακα: Γνωστική Πίνακας 23: Βαθμολογία των βρεφών της μελέτης κατά την νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley III Πρόωρα νεογνά μάρτυρες (Ομάδα 1, n=20 ) ΜΟ (SD) Πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια Τελειόμηνα νεογνά μάρτυρες Τελειόμηνα νεογνά με Ήπια Εγκεφαλοπάθεια Τελειόμηνα νεογνά με Μέτρια/Σοβαρή Εγκεφαλοπάθεια ( Ομάδα 5, n=8) ΜΟ (SD) Σύγκριση Ομάδων (Ομάδα 2, n=5) ΜΟ (SD) ( Ομάδα 3, n=3) ΜΟ (SD) (Ομάδα 4, n=6) ΜΟ (SD) 99,5 (12,1) 88 (16) 98,3 (5,7) 106,7 (17,2) 79,3 (17,4) Λεκτική 101,8 (16,3) 88,8 (20,7) 96,3 (16,6) 107,33 (24,2) 79,1 (19,1) 4 5 <0,05 Κινητική 99 (13,6) 82,4 (16,4) 98,3 (15,7) 108,7 (15,7) 78 (17,9) p <0,05 <0,05 <0,01 <0,05 Υποκλίμακες: Έκφρασης του λόγου Αντίληψης του λόγου Λεπτής Κινητικότητας Αδρής Κινητικότητας 10,4 (2,9) 8,8 (4,2) 9,3 (5,1) 11,2 (4,2) 5,8 (4,1) 4 5 <0,05 10,1 (3,3) 6,8 (4,2) 9,3 (0,6) 11,2 (4,6) 6,3 (3,7) ,8 (2,3) 5,6 (3,5) 8 (0) 11,8 (4,2) 5,5 (3,2) ,8 (3,5) 8 (3,7) 11,3 (3,5) 11 (1,7) 6,1 (4,1) <0,05 0,073 <0,05 < ,07 0,084 <0,05 Τελειόμηνα νεογνά Αναφορικά με τα αποτελέσματα της νευροαναπτυξιακής δοκιμασίας Bayley III, βρέθηκε πως στο γνωστικό τομέα τα τελειόμηνα με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια είχαν χαμηλότερες επιδόσεις σε σχέση με τα τελειόμηνα με ήπια εγκεφαλοπάθεια ή με τους μάρτυρες. Στατιστικώς σημαντικά όμως μεγαλύτερη βαθμολογία εμφάνιζαν τα παιδιά με

125 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 125 ήπια εγκεφαλοπάθεια σε σχέση με την ομάδα της μέτριας/βαριάς εγκεφαλοπάθειας αλλά και σε σχέση με τους μάρτυρες. Επίσης, στη λεκτική κλίμακα τα παιδιά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια είχαν χαμηλότερη βαθμολογία από τα παιδιά με ήπια εγκεφαλοπάθεια. Ομοίως στις υποκλίμακες της έκφρασης και της αντίληψης του λόγου, χαμηλότερες επιδόσεις εμφάνισαν τα παιδιά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια σε σχέση με την ομάδα της ήπιας εγκεφαλοπάθειας. Στον κινητικό τομέα, τα παιδιά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια είχαν επίσης χαμηλότερες επιδόσεις σε σχέση με τα τελειόμηνα με ήπια εγκεφαλοπάθεια. Στην υποκλίμακα της λεπτής κινητικότητας τα νεογνά με ήπια εγκεφαλοπάθεια εμφάνιζαν μεγαλύτερες επιδόσεις σε σχέση με τους μάρτυρες και σε σχέση με την ομάδα της μέτριας/βαριάς εγκεφαλοπάθειας, ενώ στην υποκλίμακα της αδρής κινητικότητας η ομάδα της μέτριας/βαριάς εγκεφαλοπάθειας εμφάνιζε χαμηλότερη βαθμολογία σε σχέση με τις άλλες δυο ομάδες των τελειομήνων (πίνακας 23). Συσχετίσεις Στα τελειόμηνα, τα ποσοστά των HSCs στον 8 ο μήνα ζωής εμφάνιζαν αρνητική συσχέτιση με την επίδοση στη γνωστική (r= 0,655/p<0,05), λεκτική (r= 0,566/p=0,055) και κινητική κλίμακα (r= 0,76, p<0,005) κατά τη δοκιμασία Bayley στο 2 ο χρόνο ζωής. Ομοίως και στην εκφραστική (r= 0,543, p=0,068), και αντιληπτική υποκλίμακα (r= 0,555, p=0,061) του λόγου, αλλά και στις κινητικές υποκλίμακες της λεπτής (r= 0,848, p<0,0005) και αδρής κινητικότητας (r= 0,563, p=0,057). Επίσης τα πρώιμα EPCs μετρημένα κατά το χρόνο της διενέργειας της δοκιμασίας Bayley (μετά το 2 ο χρόνο ζωής) εμφάνιζαν αρνητική συσχέτιση με τη λεκτική κλίμακα (r= 0,618, p<0,05), αλλά και την εκφραστική (r= 0,593, p<0,05) και την αντιληπτική υποκλίμακα του λόγου (r= 0,48, p=0,082). Ομοίως, αρνητική συσχέτιση φάνηκε με την υποκλίμακα της λεπτής κινητικότητας (r= 0,681, p<0,05). Προγνωστικά, τα επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα ζωής μπορούσαν να προβλέψουν την εμφάνιση σοβαρού ελλείμματος (<2 σταθερές αποκλίσεις) και στις τρεις αναπτυξιακές κλίμακες. Ειδικότερα, επίπεδα πάνω από 2,03 μg/l είχαν 100% ευαισθησία και 84,6% ειδικότητα για τα ελλείμματα της γνωστικής κλίμακας (AUC: 0,949, 95% CI: 0,831 1, p<0,05), ενώ για την κινητική κλίμακα επίπεδα πάνω από 1,5 μg/l είχαν 100% ευαισθησία και 75% ειδικότητα (AUC: 0,896, 95% CI: 0,733 1, p<0,05). Τέλος, στη λεκτική κλίμακα επίπεδα πάνω από 2,03 μg/l είχαν 100% ευαισθησία και 84,6% ειδικότητα (AUC: 0,949, 95% CI: 0,831 1, p<0,05) (παράρτημα Α, εικόνα Α.14). Ομοίως, για ηπιότερα ελλείμματα (< 1 σταθερή απόκλιση), επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα ζωής είχαν καλή προγνωστική αξία για όλες τις αναπτυξιακές κλίμακες και υποκλίμακες. Ειδικότερα, επίπεδα της S100b πάνω από 1,5 μg/l προέβλεπαν τα ελλείμματα στη γνωστική και κινητική κλίμακα (και για τα δύο: 100% ευαισθησία και 75% ειδικότητα

126 126 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ AUC: 0,896, 95% CI: 0,733 1, p<0,05), καθώς και στη λεκτική κλίμακα (85,7% ευαισθησία και 88,9% ειδικότητα AUC: 0,921, 95% CI: 0,781 1, p<0,005). Για την υποκλίμακα της λεπτής κινητικότητας το όριο ήταν 1,45 μg/l (100% ευαισθησία και 72,7% ειδικότητα AUC: 0,886, 95% CI: 0,71 1, p<0,05), για την αδρή κινητικότητα το όριο ήταν 1,5 μg/l (100% ευαισθησία και 75% ειδικότητα AUC: 0,83, 95% CI: 0,733 1, p<0,05), για την υποκλίμακα της έκφρασης του λόγου το όριο ήταν 1,5 μg/l (85,7% ευαισθησία και 88,9% ειδικότητα AUC: 0,921, 95% CI: 0,781 1, p<0,005) και για την υποκλίμακα της αντίληψης του λόγου το όριο ήταν 2,03 μg/l (100% ευαισθησία και 84,6% ειδικότητα AUC: 0,949, 95% CI: 0,831 1, p<0,05) (παράρτημα Α, εικόνα Α.15). Για την προγνωστική αξία της NSE την 3 η ημέρα ζωής, προσδιορίστηκε ένα όριο 29,9 μg/l αναφορικά με την παρουσία σοβαρών ελλειμμάτων (< 2 σταθερές αποκλίσεις) στη γνωστική κλίμακα (100% ευαισθησία και 76,9% ειδικότητα AUC: 0,923, 95% CI: 0,765 1, p<0,05), στην κινητική κλίμακα (75% ευαισθησία και 75% ειδικότητα AUC: 0,833, 95% CI: 0,611 1, p=0,052) και στη λεκτική κλίμακα (100% ευαισθησία και 76,9% ειδικότητα AUC: 0,923, 95% CI: 0,765 1, p<0,05) (παράρτημα Α, εικόνα Α.16). Αναφορικά με την εμφάνιση ήπιων ελλειμμάτων (<1 σταθερή απόκλιση), το ίδιο όριο (29,9 μg/l) στην υποκλίμακα της λεπτής κινητικότητας είχε 75% ευαισθησία και 72,7% ειδικότητα (AUC: 0,841, 95% CI: 0,623 1, p<0,05), ενώ στην υποκλίμακα της αντίληψης του λόγου είχε 100% ευαισθησία και 76,9% ειδικότητα (AUC: 0,923, 95% CI: 0,765 1, p<0,05) (παράρτημα Α, εικόνα Α.17). Πρόωρα νεογνά Στην κινητική κλίμακα και στην υποκλίμακα της λεπτής κινητικότητας τα πρόωρα με εγκεφαλοπάθεια εμφάνιζαν χαμηλότερες επιδόσεις σε σχέση με τα πρόωρα χωρίς εμφανή εγκεφαλική βλάβη (πίνακας 23). Επίσης οριακά χαμηλότερη βαθμολογία εμφάνιζαν στην αντιληπτική υποκλίμακα του λόγου. Συσχετίσεις Τα HSCs μετρημένα κατά το χρόνο της διενέργειας της δοκιμασίας Bayley (μετά το 2 ο χρόνο ζωής, διορθωμένης ηλικίας) εμφάνιζαν θετική συσχέτιση με τη λεκτική κλίμακα (r= 0,421, p=0,057) και την αντιληπτική υποκλίμακα αυτής (r=0,433, p<0,05). Τα HSCs στον 8 ο μήνα ζωής εμφάνιζαν ομοίως θετική συσχέτιση με τις επιδόσεις στην υποκλίμακα της λεπτής κινητικότητας (r=0,4, p=0,065). Αντίθετα, κατά το χρόνο διενέργειας της αναπτυξιακής δοκιμασίας, τα ποσοστά των VSELs και όψιμων EPCs εμφάνιζαν αρνητική συσχέτιση με τις επιδόσεις στη λεπτή κινητικότητα (r= 0,538/p<0,05 και r= 0,498/p<0,05), καθώς και τα πρώιμα EPCs με τις επιδόσεις στην υποκλίμακα της αδρής κινητικότητας (r= 0,461, p<0,05). Προγνωστικά, επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα ζωής πάνω από 1,32 μg/l μπορούσαν να προβλέψουν την εμφάνιση ήπιου ελλείμματος (<1 SD) στην αντιληπτική υποκλίμακα του λόγου με 80% ευαισθησία και 64,7% ειδικότητα, ενώ επίπεδα πάνω από 2,19 μg/l είχαν

127 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ % ευαισθησία και 94,1% ειδικότητα (AUC: 0,835, 95% CI: 0,642 1, p<0,05) (παράρτημα Α, εικόνα Α.18). Επίσης, επίπεδα της NSE την 1 η ημέρα ζωής πάνω από 57,8 μg/l είχαν 75% ευαισθησία και 88,9% ειδικότητα για την πρόγνωση ήπιου ελλείμματος (<1 SD) στη λεκτική κλίμακα (AUC: 0,889, 95% CI: 0,738 1, p<0,05), και 80% ευαισθησία και 100% ειδικότητα για την υποκλίμακα της αντίληψης του λόγου (AUC: 0,953, 95% CI: 0,854 1, p<0,005) (παράρτημα Α, εικόνα Α.19) Αξιολόγηση βλαβών στη Μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου Τελειόμηνα νεογνά Από τα 13 τελειόμηνα νεογνά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια, τα 3 κατέληξαν τις πρώτες ημέρες ζωής. Από τα υπόλοιπα 10, τα 9 είχαν μαγνητικές τομογραφίες ικανοποιητικής ευκρίνειας ώστε να αναλυθούν και να ποσοτικοποιηθούν. Οι μαγνητικές τομογραφίες εγκεφάλου έγιναν κατά μέσο όρο τη 16 η ημέρα ζωής (ΜΟ=16,3, SD=7,14). Στα τελειόμηνα νεογνά βαθμολογήθηκαν οι βλάβες στα βασικά γάγγλια και η μορφή της παραοβελιαίας βλάβης (οριακής αιμάτωση περιοχές), καθώς και η συνολική έκταση της βλάβης, σύμφωνα με τη μεθοδολογία που έχουν υποδείξει οι Barkovich και συν 339. Από τα 9 παιδιά που είχαν αξιολογήσιμη μαγνητική τομογραφία, τα 2 δεν είχαν βλάβες στα βασικά γάγγλια ούτε παραοβελιαία, ενώ μόνο 2 παιδιά εμφάνισαν βλάβες στην παραοβελιαία περιοχή (σοβαρού βαθμού: 5). Τα υπόλοιπα είχαν μέσο όρο 2,57 αναφορικά με το μέγεθος των βλαβών στα βασικά γάγγλια και 4 μέσο όρο στη συνολική βαθμολογία. Συσχετίσεις Δοκιμασία Bayley Στα τελειόμηνα νεογνά, σοβαρότερη εγκεφαλική βλάβη (βλάβη στα βασικά γάγγλια, παραοβελιαία βλάβη, συνολικό βαθμολογία στην MRI) σχετιζόταν σημαντικά με χαμηλότερη βαθμολογία σε όλες τις κλίμακες και υποκλίμακες κατά τη δοκιμασία Bayley (rho μεταξύ 0,528 και 0,624, και p<0,05 για όλες τις συσχετίσεις). Δείκτες εγκεφαλικής βλάβης Το μέγεθος των βλαβών στα βασικά γάγγλια σχετιζόταν με τα επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα ζωής (r=0,487, p<0,01), ενώ στην παραοβελιαία περιοχή με τα επίπεδα της S100b την 1 η και 3 η ημέρα ζωής (r=0,432/p<0,05 και r=0,439/p<0,05 αντίστοιχα). Ομοίως οι βλάβες στα βασικά γάγγλια με τα επίπεδα της NSE την 1 η (r=0,641, p<0,0005) και 3 η ημέρα ζωής(r=0,597, p<0,001), ενώ στην παραοβελιαία περιοχή με τα επίπεδα της 1 ης (r=0,432,

128 128 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ p<0,05) και 3 ης (r=0,439, p<0,05) ημέρας ζωής. Ειδικότερα, επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα >1,6 μg/l προέβλεπαν με 100% ευαισθησία και 84,6% ειδικότητα την εμφάνιση μέτριας ή σοβαρής βλάβης στα βασικά γάγγλια (βαθμολογία 3 ή 4) (AUC: 0,942, 95% CI: 0,853 1, p<0,005), ενώ τα 2 νεογνά που εμφάνισαν σοβαρή παραοβελιαία βλάβη (βαθμολογία: 5) είχαν επίπεδα S100b την 1 η ημέρα >13,9 μg/l (100% ευαισθησία και ειδικότητα (AUC: 1, 95% CI: 1 1, p<0,0005) (παράρτημα Α, εικόνα Α.20). Πρόωρα νεογνά Από τα πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια επέζησαν τα 7, από τα οποία 6 ελέγχθηκαν με Μαγνητική Τομογραφία εγκεφάλου κοντά στην ηλικία της τελειόμηνης ωριμότητας. Ειδικότερα, βαθμολογήθηκαν χωριστά οι βλάβες στη λευκή ουσία (οι κυστικές βλάβες, το εστιακό παθολογικό σήμα, η λέπτυνση του μεσολοβίου, η μυελίνωση και η μείωση όγκου) και στη φαιά ουσία/παρεγκεφαλίδα (διεύρυνση υπαραχνοειδούς χώρου, παρουσία βλαβών στην παρεγκεφαλίδα), αλλά υπολογίστηκε και η συνολική βαθμολογία για τις βλάβες στον εγκέφαλο, σύμφωνα με τη βαθμονόμηση που έχουν υποδείξει οι Kidokoro και συν 338. Από τα 6 αυτά βρέφη, 2 είχαν μη σημαντικές βλάβες (συνολική βαθμολογία <4), 1 είχε ήπιες βλάβες (συνολική βαθμολογία: 5), 1 μέτριες βλάβες (συνολική βαθμολογία: 8) και 2 σοβαρές βλάβες (συνολική βαθμολογία 12). Συσχετίσεις Δοκιμασία Bayley Στα πρόωρα νεογνά, εντονότερο εστιακό παθολογικό σήμα στη λευκή ουσία σχετιζόταν οριακά αρνητικά με τις επιδόσεις στο γνωστικό τομέα (r= 825, p=0,086), με την κινητική κλίμακα (r= 0,392, p=0,058) και την υποκλίμακα της αδρής κινητικότητας (r= 0,86, p=0,061). Επίσης, η λέπτυνση του μεσολοβίου σχετιζόταν αρνητικά με τις επιδόσεις στο κινητικό τομέα (r= 0,349,p=0,095) και στην υποκλίμακα της αδρής κινητικότητας (r= 0,91, p<0,05). Ομοίως, η καθυστερημένη μυελίνωση σχετιζόταν αρνητικά με την κινητική κλίμακα (r= 0,395, p=0,056), ενώ η μείωση του όγκου της λευκής ουσίας με τη λεπτή κινητικότητα (r= 0,357, p=0,087). Με την κινητική κλίμακα και τη λεπτή κινητικότητα σχετιζόταν αρνητικά και η διεύρυνση του υπαραχνοειδούς χώρου (r= 0,404/p<0,05 και r= 347/p=0,097 αντίστοιχα), ενώ και η παρουσία βλαβών στην παρεγκεφαλίδα σχετιζόταν οριακά με τις μειωμένες κινητικές δεξιότητες (r= 0,36, p=0,084). Δείκτες εγκεφαλικής βλάβης Η συνολική βαθμολογία των βλαβών στη Μαγνητική τομογραφία συσχετιζόταν σημαντικά με τα επίπεδα της NSE τη 45 η ημέρα ζωής (r=0,516, p<0,05). Μάλιστα, επίπεδα μεγαλύτερα από 22,6 μg/l προέβλεπαν την ύπαρξη μέτριας ή σοβαρής βλάβης (συνολική βαθμολογία > 8) με ευαισθησία 100% και ειδικότητα 93.3% (AUC: 0,967, 95% CI: 0,877 1, p<0,05) (παράρτημα Α, εικόνα Α.21).

129 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Συζήτηση Πληθώρα πειραματικών εργασιών έχουν καταδείξει τον αναπλαστικό ρόλο των προγονικών κυττάρων σε μοντέλα ιστικής βλάβης. Παρόμοια αποτελέσματα φάνηκαν και σε μελέτες σε ενήλικες, τόσο σχετικά με τα ενδογενή κυκλοφορούντα προγονικά κύτταρα όσο και μετά από εξωγενή χορήγηση αυτών. Όσον αφορά τα νεογνά, μελέτες των ενδογενών προγονικών κυττάρων σε τελειόμηνα δεν υπάρχουν, ενώ οι λιγοστές μελέτες των τελευταίων ετών στα πρόωρα δεν εστιάζουν στο γεγονός της εγκεφαλικής βλάβης. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που περιγράφει την κινητοποίηση των Κυκλοφορούντων Προγονικών Κυττάρων σε τελειόμηνα νεογνά με ΥΙΕ. Αναφορικά με τα πρόωρα νεογνά, η μελέτη επικεντρώνεται στην εγκεφαλική βλάβη. Έτσι, τόσο η επιλογή των χρονικών στιγμών της λήψεως δειγμάτων (πυκνότερες δειγματοληψίες στην οξεία φάση της εγκεφαλικής βλάβης, λιγότερες στην υποξεία φάση καθώς και 2 χρονικά στιγμιότυπα μακροπρόθεσμα στον 8 ο και 24 ο μήνα (συμπλήρωση της μυελίνωσης), όσο και η χρησιμοποίηση βιοχημικών δεικτών εγκεφαλικής βλάβης (S100b και NSE) είχαν σκοπό να καθορίσουν όσο γίνεται με μεγαλύτερη σαφήνεια χρονικά και ποσοτικά το γεγονός της εγκεφαλικής βλάβης. Ακόμη, βαθμολογήθηκαν οι βλάβες στις μαγνητικές τομογραφίες εγκεφάλου και διενεργήθηκε η αναπτυξιακή δοκιμασία Bayley III μετά το 2 ο χρόνο ζωής. Ο καθορισμός με σαφήνεια του γεγονότος της εγκεφαλικής βλάβης αποτέλεσε στέρεα βάση για τις συσχετίσεις με τα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα. Επιπρόσθετα, πέρα από την περιγραφή της κινητικής των ΚΠΚ, έγινε προσπάθεια να ανιχνευθούν πιθανοί μηχανισμοί που εμπλέκονται σε αυτή την κινητοποίηση, μετρώντας τρεις πιθανούς χημειοτακτικούς παράγοντες με βάση τη βιβλιογραφία. Όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη περιγραφής της κινητικής των Κυκλοφορούντων Προγονικών Κυττάρων σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά εστιασμένη στο συμβάν της εγκεφαλικής βλάβης, μελετώντας περισσότερα χρονικά στιγμιότυπα και περισσότερους βιοχημικούς δείκτες ταυτόχρονα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα Αιμοποιητικά Προγονικά Κύτταρα (HSCs) Πρόωρα νεογνά Κινητική Στη μελέτη αυτή βρέθηκε πως τα HSCs ήταν σημαντικά αυξημένα στα πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια, ιδίως τις ημέρες 3 και 9, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Το ίδιο

130 130 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ αποτέλεσμα φάνηκε και όταν συγκρίθηκαν μόνο τα νεογνά με σοβαρή IVH (3 ου ή 4 ου βαθμού) ή μόνο τα νεογνά με PVL σε σχέση με τα νεογνά χωρίς καμία εμφανή εγκεφαλική βλάβη. Αντίθετα, τα επίπεδα της 1 ης ημέρας ζωής δε βρέθηκαν να συσχετίζονται με την IVH, PVL ή ως σύνολο με την εγκεφαλοπάθεια της προωρότητας. Ως εκ τούτου δεν προκύπτει κάποια ένδειξη πως τα επίπεδα των κυττάρων αυτών κατά τη γέννηση παίζουν κάποιο ρόλο (προστατευτικό) στην εμφάνιση αυτών των επιπλοκών της προωρότητας, αλλά μάλλον αυξάνονται δευτερογενώς ως απάντηση στην εμφάνιση της εγκεφαλικής βλάβης. Παρά το γεγονός ότι οι διάφορες δημοσιευμένες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει διαφορετικούς δείκτες για το χαρακτηρισμό των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, θα επιχειρήσουμε μια σύγκριση των αποτελεσμάτων. Σημειωτέον, με όσους λιγότερους δείκτες χαρακτηρίζεται ένας κυτταρικός πληθυσμός, τόσο λιγότερο καθαρός είναι και ενδεχόμενα εμπεριέχει περισσότερους τους ενός υποπληθυσμούς. Σε συμφωνία με την παρούσα μελέτη, οι Borghesi και συν. δεν αναφέρουν συσχέτιση των CD34 + /CD45 + προγονικών κυττάρων (που εμπεριέχουν και τον υποπληθυσμό των HSCs) στη γέννηση με την ενδοκοιλιακή αιμορραγία 47. Ομοίως και οι Paviotti και συν. δε βρήκαν συσχέτιση την 1 η ημέρα ζωής μελετώντας τα CD34 + κύτταρα 49. Οι Borghesi και συν. αναφέρουν όμως αυξημένα επίπεδα την 3 η ώρα ζωής στα νεογνά που εμφάνισαν PVL. Οι Kotowski και συν. μελετώντας τα HSCs (ορίζοντάς τα ως CD184 + /lin /CD45 + ) βρήκαν μειωμένα επίπεδα στον ομφάλιο λώρο σε νεογνά που στη συνέχεια εμφάνισαν IVH ή κάποια επιπλοκή της προωρότητας (οποιασδήποτε επιπλοκής ως σύνολο), υποδηλώνοντας πιθανό προστατευτικό ρόλο των κυττάρων αυτών 46. Βέβαια, σημασία έχει και ο διαφορετικός χρόνος της αιμοληψίας την 1 η ημέρα ζωής. Στη δική μας μελέτη ήταν αρκετά μεταγενέστερος (12 η 24 η ώρα ζωής) συγκριτικά με εκείνο των Kotowski και συν. (ομφάλιο αίμα) και Borghesi και συν.(3 η ώρα ζωής). Όσον αφορά τις μετέπειτα χρονικές στιγμές, παρ ότι οι Borghesi και συν. συμπεριέλαβαν τη 2 η και 7 η ημέρα ζωής, οι Kotowski και συν. τη 2 η και 6 η εβδομάδα ζωής και οι Paviotti και συν. τη 36 η εβδομάδα από τη σύλληψη, κανείς δεν αναφέρει δεδομένα συσχέτισης των τιμών αυτών των ημερών με την εγκεφαλική βλάβη των προώρων. Συσχετίσεις Προγεννητικοί παράγοντες Στην παρούσα μελέτη δε βρέθηκε συσχέτιση των HSCs με τη ΔΚ και το ΒΓ. Σε συμφωνία βρίσκονται τα αποτελέσματα των Paviotti και συν. (CD34 + ) 49 και Kotowski και συν. (CD184 + lin CD45 + ) 46. Αντίθετα, οι περισσότεροι ερευνητές που μελέτησαν μεμονωμένα το γενικό πληθυσμό των CD34 + (Bui και συν. 50, Qi και συν. 44, Bizzaro και συν. 45, Li και συν. 54, Opie και συν. 52 ) βρήκαν αρνητική συσχέτιση με τη ΔΚ. Υπενθυμίζεται ότι ο CD34 + δεν είναι καθόλου ειδικός δείκτης αλλά συναντάται στους περισσότερους πληθυσμούς προγονικών κυττάρων και όχι μόνο στα HSCs (συναντάται επίσης στα VSELs και τα EPCs). Ομοίως αρνητική συσχέτιση βρήκαν και οι Borghesi και συν. (CD34 + CD45 + ) 47. Είναι σαφές πως απόλυτη σύγκριση των αποτελεσμάτων των μελετών δεν είναι δυνατή.

131 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 131 Επίσης, βρέθηκε πως η χοριοαμνιονίτιδα σχετιζόταν με μειωμένα επίπεδα HSCs την 1 η, 9 η και 18 η ημέρα ζωής. Το εύρημα αυτό είναι συμβατό με προηγούμενες αναφορές ότι οι φλεγμονώδεις καταστάσεις (κυρίως χρόνιες) σχετίζονται με μειωμένα επίπεδα προγονικών κυττάρων 41 43, Ίσως η φλεγμονώδης διαδικασία και η ύπαρξη μικροβιακού παράγοντα καταστέλλει την κινητοποίηση των ΚΠΚ, όπως και στη σηψαιμία. Αντίθετα, οι Bizzaro και συν. αναφέρουν ότι δεν βρήκαν τέτοια συσχέτιση με τα επίπεδα CD34 + των πρώτων 48 ωρών της ζωής 45. Όσον αφορά τα μειωμένα HSCs στην πολύδυμη κύηση, αυτό αποτελεί σταθερή παρατήρηση στη μελέτη μας και για άλλους κυτταρικούς πληθυσμούς, τόσο στα πρόωρα όσο και σε τελειόμηνα νεογνά. Δεν έχει περιγραφεί ξανά τέτοια συσχέτιση, και δεν είναι εύκολη η εξήγηση αυτής της παρατήρησης. Αν και στη δική μας μελέτη δεν υπήρχε διαφορά στα αποτελέσματα της αναπτυξιακής δοκιμασίας Bayley III κατά το 2 ο χρόνο ζωής σε σχέση με την πολύδυμη κύηση, μελέτες έχουν δείξει συσχέτιση της μονήρους κύησης με αυξημένη ακαδημαϊκή επίδοση στο 10 ο έτος ζωής 341. Σε «συμφωνία» με αυτή την παρατήρηση είναι και το δικό μας εύρημα πως τα ποσοστά των HSCs (όπως και των EPCs) είναι υψηλότερα στη μονήρη κύηση, καθώς πρόκειται για κύτταρα που θεωρούνται πως συντελούν σε «αναβολικές» κυτταρικές διαδικασίες σε όλους τους ιστούς συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου. Παρ όλα αυτά, το θέμα αυτό οφείλει να διαλευκανθεί στο μέλλον περισσότερο. Σημειωτέον, η πολύδυμος κύηση δεν σχετιζόταν σημαντικά με την εμφάνιση εγκεφαλοπάθειας, και οι δύο αυτές καταστάσεις επηρέαζαν ανεξάρτητα τα ποσοστά των κυττάρων. Εξωμήτριοι παράγοντες Στη μελέτη αυτή βρέθηκαν αυξημένα ποσοστά HSCs την 3 η και (οριακά) την 9 η ημέρα ζωής σε νεογνά με χαμηλό Apgar score, παρατήρηση που συμφωνεί με τη γενικότερη γνώση πως τα προγονικά κύτταρα κινητοποιούνται σε καταστάσεις στρες. Πνευμονική λειτουργία. Στην παρούσα μελέτη δε βρέθηκε κάποια συσχέτιση των HSCs με το σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας ή τη ΒΠΔ. Σε συμφωνία, προηγηθείσες μελέτες των CD34 + δεν βρήκαν συσχέτιση με την πνευμονική λειτουργία, το ΣΑΔ ή την ΒΠΔ 45,49. Αντίθετα, οι Qi και συν. βρήκαν αυξημένα επίπεδα CD34 + κυττάρων την 1 η ημέρα ζωής στα νεογνά με ΣΑΔ καθώς και μειωμένο αριθμό στα νεογνά με ΣΑΔ που δεν είχαν καλή έκβαση (χρειάστηκαν περισσότερες ημέρες τεχνητή υποστήριξη της αναπνοής ή απεβίωσαν), αλλά καμία συσχέτιση με τη ΒΠΔ 44. Αντίθετα οι Kotowski και συν. βρήκαν μειωμένα επίπεδα CD184 + lin CD45 + στο ομφάλιο αίμα σε νεογνά που εμφάνισαν ΣΑΔ 46. Στη μελέτη αυτή βρέθηκαν μειωμένα επίπεδα HSCs από την πρώτη ημέρα ζωής έως και την 45 η στα νεογνά που εμφάνισαν όψιμη σηψαιμία. Λαμβάνοντας υπόψη πως από τα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα προέρχονται τα περισσότερα κύτταρα που συμμετέχουν τόσο στην κυτταρική όσο και στη χυμική ανοσία (ουδετερόφιλα, μονοκύτταρα, ΝΚ κύτταρα, Τ και Β λεμφοκύτταρα βλ. εικόνα 2), θα μπορούσε να υποθέσει κανείς ότι τα μειωμένα ποσοστά τις πρώτες ημέρες ζωής και πριν την εμφάνιση λοίμωξης προδιαθέτουν σε

132 132 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ αυξημένη ευπάθεια σε μικροβιακούς παράγοντες, ενώ τα μειωμένα ποσοστά μετά από την εμφάνιση λοίμωξης (δεδομένου ότι παρατηρήθηκαν μειωμένα ποσοστά έως και την 45 η ημέρα ζωής) είτε αντανακλούν συνέχιση χρονικά αυτής της μειωμένης προστατευτικής ικανότητας είτε είναι αποτέλεσμα της κατασταλτικής δράσης της φλεγμονώδους διαδικασίας. Το αποτέλεσμα είναι το ίδιο: αυξημένη ευπάθεια των προώρων στις λοιμώξεις, κάτι που και κλινικά είναι εμφανές. Ειδικότερα, βρέθηκε ότι όλα τα πρόωρα που εμφάνισαν λοίμωξη είχαν ποσοστά HSCs την 1 η ημέρα ζωής χαμηλότερα από 0,017 (επί του συνόλου των παρατηρήσεων στην κυτταρομετρία ροής) (100% ευαισθησία και 66,7% ειδικότητα). Σε συμφωνία είναι η παρατήρηση των Kotowski και συν. πως τα HSCs (CD184 + lin CD45 + ) του ομφαλίου λώρου είναι μειωμένα στα πρόωρα που εμφάνισαν λοίμωξη 46, ενώ αντίθετα καμία συσχέτιση με τη σήψη δε βρήκαν άλλοι συγγραφείς για τα CD34 + των πρώτων 48 ωρών ζωής 45,49. Ας σημειωθεί ότι στη μελέτη μας η παρουσία σηψαιμίας δε συσχετίστηκε σημαντικά με τη ΔΚ, το ΒΓ, αλλά ούτε και με την ύπαρξη εγκεφαλικής βλάβης ή το Apgar score (τα οποία συσχετίστηκαν με τα επίπεδα των HSCs). Παρόμοια προστατευτική δράση ενδεχόμενα να έχουν τα HSCs και για άλλες καταστάσεις, στις οποίες οι φλεγμονώδεις/λοιμογόνοι παράγοντες εμπλέκονται, όπως η νεκρωτική εντεροκολίτιδα. Ειδικότερα, στη μελέτη μας μειωμένα βρέθηκαν και τα HSCs την 3 η ημέρα ζωής στα νεογνά που εμφάνισαν ΝΕΚ. Ειδικότερα, ποσοστά HSCs χαμηλότερα από 0,015 την 3 η ημέρα ζωής προέβλεπε με 66,7% ευαισθησία και 66,7% ειδικότητα την εμφάνιση ΝΕΚ στα πρόωρα. Παρόμοια συσχέτιση δεν υπήρχε για τα επίπεδα του πρώτου 24ώρου ζωής, σε συμφωνία με άλλους συγγραφείς που δε βρήκαν συσχέτιση της ΝΕΚ με τα CD34 + τις πρώτες 48 ώρες ζωής 45,49 ή με τα CD34 + CD45 + τις πρώτες 3 ώρες ζωής 47. Δεδομένου ότι τα ΚΠΚ είναι μειωμένα τον πρώτο μήνα ζωής σε νεογνά που είχαν χοριοαμνιονίτιδα ή εμφάνισαν σήψη, τότε ενδεχόμενα η λοίμωξη να επιδρά αρνητικά και στην προστασία από τη ΝΕΚ (κλινικά γνώριμος συσχετισμός) αλλά και στην ενδογενή προσπάθεια ανάπλασης της εγκεφαλικής (ή άλλης ιστικής) βλάβης. Το θέμα είναι πολύ ενδιαφέρον και σαφώς χρήζει περαιτέρω έρευνας. Τελειόμηνα νεογνά Κινητική Όσο μπορούμε να γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη μελέτη κινητικής των ενδογενών προγονικών κυττάρων σε τελειόμηνα με ΥΙΕ. Στη μελέτη αυτή βρέθηκε πως στα νεογνά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια τα HSCs ήταν αυξημένα μόνο την 45 η ημέρα ζωής σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Κατά το διαχωρισμό όμως σε ομάδα της μέτριας και σε ομάδα της σοβαρής ΥΙΕ, φάνηκε πως τα HSCs αυξάνονται σημαντικά την 1 η και 3 η ημέρα κατ εξοχήν στα νεογνά με μετρίου βαθμού εγκεφαλοπάθεια, ενώ στη βαριά εγκεφαλοπάθεια μόλις την 45 η ημέρα ζωής υποσημαίνεται μια τάση για αύξηση. Λαμβάνοντας υπόψη τις αναπλαστικές και αναγεννητικές ικανότητες των προγονικών κυττάρων, η παραπάνω παρατήρηση είναι σημαντική: μόνο στη μετρίου βαθμού εγκεφαλική βλάβη υπάρχει η ικανότητα να κινητοποιηθούν κύτταρα από την περιφέρεια προς την περιοχή της βλάβης προς ανάπλαση αυτής, ενώ στη βαριά εγκεφαλική βλάβη η διαδικασία αυτή υστερεί

133 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 133 σημαντικά. Το γεγονός αυτό μπορεί να οφείλεται σε ανεπάρκεια των χημειοτακτικών μηχανισμών. Είναι γνωστό ότι οι χημειοτακτικές ουσίες εκκρίνονται από το μικροπεριβάλλον των νευρώνων και τα ενδοθηλιακά κύτταρα (βλ. Γενικό μέρος/παράγραφο 2.3), τα οποία σε σοβαρού βαθμού εγκεφαλική βλάβη έχουν υποστεί και τα ίδια σημαντική βλάβη. Ακόμα, όμως, και η χημειοταξία να είναι επαρκής, η συμμετοχή του κεντρικού νευρικού συστήματος στην κινητοποίηση των περιφερικών προγονικών κυττάρων (βλ. Γενικό μέρος/παράγραφο 4.2) έχει σαφώς επηρεαστεί, αλλά και η πολυοργανικότητα των βλαβών στη βαριά ΥΙΕ και η εν γένει βαριά γενική κατάσταση μπορεί να εμποδίζει την κινητοποίηση καθ εαυτή. Τέλος, σε συμφωνία με τις παραπάνω εργαστηριακές παρατηρήσεις είναι και η κλινική πραγματικότητα: είναι γνωστή η περισσότερο ευμενής κλινική εξέλιξη των νεογνών με μετρίου βαθμού ΥΙΕ (στα οποία τα προγονικά κύτταρα κινητοποιούνται) σε σχέση με τη βαριά ΥΙΕ (στα οποία δεν παρατηρείται κινητοποίηση των HSCs). Το πρότυπο αυτό κινητοποίησης δεν παρατηρήθηκε μόνο στα HSCs, αλλά το συναντάμε και σε άλλους προγονικούς πληθυσμούς στην παρούσα μελέτη (VSELs και πρώιμα EPCs), ενισχύοντας τη βαρύτητα του ευρήματος αυτού αναφορικά με τη λειτουργία των ενδογενών αμυντικών μηχανισμών, την αιτιοπαθογένεια της έκτασης της εγκεφαλικής βλάβης και την πιθανή μελλοντική στοχευμένη θεραπευτική παρέμβαση. Κατά τη μεταγεννητική περίοδο, τα ποσοστά των HSCs στα υγιή τελειόμηνα βρέθηκαν σταθερά τις πρώτες 45 ημέρες ζωής. Σε συμφωνία οι Kotowski και συν. περιγράφουν σταθερά επίπεδα από τη γέννηση έως τις 6 βδομάδες ζωής 46. Οι Li και συν παρατήρησαν ταχεία πτώση των CD34 + τις πρώτες 4 ώρες ζωής και λιγότερο στις 48 ώρες 54. Στη δική μας μελέτη η αιμοληψία της πρώτης ημέρας ήταν μετά τη 12 η ώρα ζωής. Επίσης, αξιόλογη είναι και η παρατήρηση πως τα νεογνά που υποβλήθηκαν σε θεραπευτική υποθερμία εμφάνισαν οριακά υψηλότερα ποσοστά HSCs την 18 η ημέρα ζωής, ένδειξη πιθανώς πως η θεραπευτική υποθερμία ευνοεί τη κινητοποίηση των ΚΠΚ τις ημέρες που έπονται της επαναθέρμανσης και συνεπώς πιθανώς δρα ευεργετικά και στη λειτουργία των ενδογενών μηχανισμών ανάπλασης. Φυσικά αυτή η παρατήρηση αποτελεί μόνο μια ένδειξη που χρήζει περαιτέρω έρευνας, καθώς μόνο 4 νεογνά δεν υποβλήθηκαν σε υποθερμία. Συσχετίσεις Προγεννητικοί παράγοντες Στα τελειόμηνα νεογνά παρατηρήθηκε πως τα HSCs αυξάνονται στον κολπικό τοκετό, πιθανώς λόγω αυξημένου στρες. Εξωμήτριοι παράγοντες Ομοίως με άλλες καταστάσεις στρες που συντελούν στην κινητοποίηση των ΚΠΚ, βρέθηκε πως η παρουσία ασφυκτικού περιγεννητικού συμβάντος (οξέωσης τις πρώτες ώρες της ζωής) σχετιζόταν με αυξημένα HSCs τις επόμενες ημέρες. Επίσης τα ποσοστά των HSCs την 9 η ημέρα σχετιζόταν θετικά με τη διάρκεια της νοσηλείας, παρατήρηση συμβατή με αύξηση των ΚΠΚ σε καταστάσεις νόσου ή στρες.

134 134 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη βρέθηκε πως τα Αιμοποιητικά Προγονικά Κύτταρα κινητοποιούνται μετά από εγκεφαλική βλάβη στα πρόωρα νεογνά. Στα τελειόμηνα νεογνά, αντίστοιχη κινητοποίηση βρέθηκε ότι είναι ιδιαίτερα εμφανής μόνο στη μέτρια εγκεφαλοπάθεια και όχι στη βαριά εγκεφαλοπάθεια, σημείο ενδεικτικό πως οι ενδογενείς αναπλαστικοί μηχανισμοί του νεογνού είναι ανεπαρκείς στη βαριά εγκεφαλική βλάβη (τουλάχιστον όσον αφορά τα ΚΠΚ), με αποτέλεσμα την παρουσία σοβαρών νευροαναπτυξιακών προβλημάτων. Επίσης, παρατηρήθηκε μειωμένη κινητοποίηση των HSCs σε χοριοαμνιονίτιδα, σηψαιμία και νεκρωτική εντεροκολίτιδα και ένδειξη πιθανού προστατευτικού ρόλου των HSCs στην εμφάνιση αυτών των φλεγμονωδών καταστάσεων VSELs Πρόωρα νεογνά Κινητική Στη μελέτη αυτή δε βρέθηκε διαφορά μεταξύ των ομάδων των προώρων με εγκεφαλοπάθεια (ως σύνολο) και της ομάδας ελέγχου. Ωστόσο, η ανάλυση υπο ομάδων έδειξε ότι τα νεογνά με κυστική PVL εμφάνισαν αυξημένα επίπεδα VSELs την 9 η ημέρα ζωής (σε σχέση με πρόωρα χωρίς καμία εμφανή βλάβη στον εγκέφαλο), ενώ τα νεογνά με IVH εμφάνισαν αυξημένα επίπεδα τον 8 ο μήνα ζωής. Λαμβάνοντας υπόψη τις αναγεννητικές ιδιότητες των VSELs, διαφαίνεται μια μικρή κινητοποίηση των κυττάρων αυτών στα νεογνά με κυστική PVL, ενώ τα νεογνά με IVH εμφανίζουν ενδεχόμενα μια ενδογενή προσπάθεια ανάπλασης που διαρκεί για μήνες. Τα πρόωρα της ομάδας ελέγχου στη μελέτη αυτή εμφάνισαν σταδιακή αύξηση των επιπέδων έως την 45 η ημέρα ζωής. Επίσης, δεν παρατηρήθηκαν διαφορές σε σχέση με τα υγιή τελειόμηνα. Οι Kotowski και συν. στη δική τους μελέτη παρατήρησαν σταθερά επίπεδα στα υγιή πρόωρα έως την 6 η εβδομάδα ζωής (μελετώντας τα CD184 + lin CD45 κύτταρα), καθώς και υψηλότερα επίπεδα σε σχέση με τα τελειόμηνα τη 2 η εβδομάδα ζωής και οριακά στο αίμα του ομφαλίου λώρου 46. Οι Machalinska και συν. αναφέρουν αυξημένα επίπεδα VSELs στα πρόωρα τη 10 η εβδομάδα σε σχέση με τα τελειόμηνα 31. Συσχετίσεις Προγεννητικοί παράγοντες Τα VSELs της 1 ης ημέρας ζωής δεν εμφάνισαν συσχέτιση με τη ΔΚ και το ΒΓ στη δική μας μελέτη. Οι Kotowski και συν. περιγράφουν υψηλότερα ποσοστά σε χαμηλού βάρους γέννησης πρόωρα. Επίσης, βρέθηκε πως η χοριοαμνιονίτιδα μειώνει τα ποσοστά των VSELs την 3 η ημέρα ζωής, ενδεχόμενα ως φλεγμονώδης διαδικασία, ακριβώς όπως παρατηρήθηκε και για τα HSCs. Δεν υπάρχουν άλλες σχετικές αναφορές στη βιβλιογραφία.

135 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 135 Εξωμήτριοι παράγοντες Στη μελέτη αυτή παρατηρήθηκαν χαμηλότερα ποσοστά VSELs την 1 η, 18 η και 45 η ημέρα στα πρόωρα νεογνά με έντονο περιγεννητικό stress (Apgar Score στο 1 ο λεπτό<4) σε σχέση με τα νεογνά που είχαν Apgar score στο 1 ο λεπτό >6. Ωστόσο τα νεογνά με ενδιάμεσο Apgar Score (4 6) εμφάνισαν μια τάση για υψηλότερα ποσοστά VSELs σε σχέση με αυτά που είχαν Apgar score στο 1 ο λεπτό >6. Φαίνεται πως το έντονο στρες αναστέλλει την κινητοποίηση των VSELs, ενώ αντίθετα το ήπιο στρες την ευνοεί. Αυτή η παρατήρηση είναι σε πλήρη συμφωνία με το γενικευμένο πρότυπο κινητοποίησης των ΚΠΚ που παρατηρήθηκε σε αυτή τη μελέτη, όπου τα προγονικά κύτταρα κινητοποιούνται σε ήπιες καταστάσεις στρες ή νόσου, ενώ σε βαριά προσβολή αναστέλλεται η κινητοποίησή τους. Η παρατήρηση αυτή συνάδει επίσης με την κλινική εμπειρία για ευνοϊκή έκβαση σε ήπιες καταστάσεις στρες ή νόσου και τη δυσμενή έκβαση σε έντονα συμβάντα. Είναι πιθανό η μειωμένη λειτουργικότητα των μηχανισμών της ενδογενούς άμυνας και ανάπλασης να συμβάλλει στην εμφάνιση μεγαλύτερων ιστικών βλαβών. Το ίδιο πρότυπο παρατηρείται και στη σχέση VSELs και ΣΑΔ. Τα νεογνά με σοβαρό ΣΑΔ (3 ου ή 4 ου ) βαθμού είχαν γενικώς μειωμένα επίπεδα VSELs, στατιστικώς δε οριακά μειωμένα επίπεδα VSELs την 18 η ημέρα ζωής σε σχέση με τα νεογνά χωρίς ΣΑΔ και σημαντικώς μειωμένα ποσοστά σε σχέση με τα νεογνά με ήπιο ΣΑΔ (1 ου ή 2 ου βαθμού). Δηλαδή τα VSELs ήταν λίγο υψηλότερα στα νεογνά με μετρίου βαθμού ΣΑΔ σε σχέση με τα νεογνά χωρίς καθόλου ΣΑΔ. Οι Kotowski και συν. δε βρήκαν συσχέτιση των επιπέδων του ομφαλίου λώρου με το ΣΑΔ, όπως και με οποιαδήποτε νοσηρότητα 46. Επίσης, παρατηρήθηκε πως τα νεογνά με ΒΠΔ εμφάνισαν μειωμένα επίπεδα των VSELs τη 18 η ημέρα ζωής, παρατήρηση που μπορεί να υποδηλώνει συμμετοχή του προγονικού αυτού υποπληθυσμού στη φυσιολογική διαδικασία οργανογένεσης των πνευμόνων και του αγγειακού του δικτύου και ενδεχόμενη εμπλοκή της ανεπαρκούς κινητοποίησής τους στην παθοφυσιολογία της ΒΠΔ 20. Τέλος, χαμηλά επίπεδα VSELs εμφάνισαν τα πρόωρα νεογνά με σηψαιμία σχεδόν σε όλο τον 1 ο 1,5 μήνα ζωής (ας σημειωθεί ότι η παρουσία σηψαιμίας δε συσχετίστηκε σημαντικά με τη ΔΚ ή το ΒΓ σε αυτή τη μελέτη). Ανάλογη επίδραση της σηψαιμίας παρατηρήθηκε και στα HSCs, όπως ήδη περιγράφηκε. Φαίνεται πως (παρομοίως με τα HSCs) τα VSELs παίζουν επίσης κάποιο προστατευτικό ρόλο στην ευπάθεια στη λοίμωξη, και τα μειωμένα επίπεδα από την 1 η ημέρα ζωής σχετίζονται με αυξημένη πιθανότητα όψιμης σηψαιμίας. Ειδικότερα, υπολογίστηκε πως όλα τα νεογνά με σηψαιμία είχαν ποσοστά VSELs την 1 η ημέρα ζωής χαμηλότερα των 0,0136 (επί του συνόλου των παρατηρήσεων στην κυτταρομετρία ροής). Η προγνωστική αξία ήταν λίγο καλύτερη από αυτήν των HSCs ως προς τη σηψαιμία. Τα HSCs όπως περιγράφηκε παραπάνω αποτελούν προγονική σειρά των περισσοτέρων κυττάρων της κυτταρικής και χημικής ανοσίας, και ως εκ τούτου τα αυξημένα επίπεδα είναι λογικό να προστατεύουν από μικροβιακούς παράγοντες. Όσον αφορά τα VSELs, η εξήγηση είναι λίγο δυσκολότερη, αλλά οι ερευνητές που ανακάλυψαν την ύπαρξή τους θεωρούν πως τα VSELs είναι από τους πιο αρχέγονους πληθυσμούς του μυελού των

136 136 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ οστών, και μάλιστα μπορούν να διαφοροποιηθούν και προς αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα 20. Υπό αυτό το πρίσμα, υπάρχει άμεση συσχέτιση και με τα κύτταρα της ανοσίας. Είναι βέβαια σαφές ότι τα VSELs αποτελούν έναν από τους πιο πρόσφατα χαρακτηρισμένους πληθυσμούς και η γνώση μας για αυτά τα κύτταρα δεν είναι επαρκής. Ίσως όμως και ένας άλλος μηχανισμός ενδεχόμενα να συνυπάρχει: είναι πιθανόν και η ίδια η σηψαιμία, ως εντονότατος στρεσσογόνος παράγοντας αλλά και ως φλεγμονώδης διαδικασία, να διαταράσσει τη διαδικασία της κινητοποίησης των κυττάρων αυτών, κάτι που ισχύει όμως μόνο κατά τις ημέρες που ακολουθούν τη μικροβιακή επιμόλυνση. Υπενθυμίζεται πως και η χοριοαμνιονίτιδα συσχετίστηκε με μειωμένους κυτταρικούς πληθυσμούς (HSCs, VSELs και όψιμα EPCs). Οι Machalinska και συν. αναφέρουν πως δεν υπήρχε συσχέτιση των επιπέδων των VSELS (CD184 + lin CD45 ) τη 10 η εβδομάδα ζωής με την αμφιβληστροειδοπάθεια της προωρότητας, αλλά η βαρύτερη μορφή της νόσου (ROP plus) σχετίστηκε οριακά με μειωμένα επίπεδα 31. Στη δική μας μελέτη ομοίως δε βρέθηκε συσχέτιση των VSELs με αυτή την επιπλοκή της προωρότητας. Τελειόμηνα νεογνά Κινητική Στη μελέτη αυτή, δε φάνηκε βραχυπρόθεσμα διαφορά μεταξύ των υγιών τελειομήνων, των νεογνών με ήπια εγκεφαλοπάθεια και των νεογνών με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια, πλην των επιπέδων στους 24 μήνες ζωής, όπου τα επίπεδα είναι σαφώς αυξημένα στην τελευταία ομάδα. Όπως και στα πρόωρα νεογνά με IVH, αυτό πιθανώς δηλώνει μακροχρόνια προσπάθεια ανάπλασης της εγκεφαλικής βλάβης. Όταν βέβαια η ομάδα της περιγεννητικής ασφυξίας διαχωρίστηκε στα νεογνά που εμφάνισαν μέτρια και στα νεογνά με βαριά εγκεφαλοπάθεια, έγινε περισσότερο σαφές πως παρατηρείται άμεση κινητοποίηση τις πρώτες 45 ημέρες ζωής μόνο στην ομάδα της μέτριας εγκεφαλοπάθειας. Ωστόσο στατιστικώς παρατηρήθηκε μόνο μια τάση την 1 η ημέρα ζωής. Ενδεχόμενα ο μικρός αριθμός παιδιών στην κάθε ομάδα να ευθύνεται για την έλλειψη στατιστικής δύναμης. Διαφαίνεται πως κυρίως σε μετρίου βαθμού εγκεφαλική βλάβη τα VSELs κινητοποιούνται από την περιφέρεια προς ανάπλαση και αποκατάσταση, ενώ στη βαριά εγκεφαλική βλάβη το φαινόμενο αυτό δεν παρατηρείται, κατά το ίδιο ακριβώς πρότυπο κινητοποίησης που παρατηρήθηκε στα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα με μεγαλύτερη σαφήνεια. Συσχετίσεις Προγεννητικοί παράγοντες Στα τελειόμηνα νεογνά, τα VSELs της 1 ης προγεννητικούς παράγοντες. ημέρας ζωής δεν εμφάνισαν συσχέτιση με

137 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 137 Εξωμήτριοι παράγοντες Η παρουσία όψιμης σηψαιμίας συσχετίστηκε οριακά με μειωμένα επίπεδα VSELs τις ημέρες 9, 18 και 45, θέμα που σχολιάστηκε αναλυτικά παραπάνω στην παράγραφο των προώρων. Συμπερασματικά, τα VSELs στη μελέτη αυτή φάνηκαν πολύ ευάλωτα σε κάθε μορφή σοβαρού στρες ή νόσου, ενώ ηπιότερες καταστάσεις ευνοούσαν την κινητοποίησή τους. Επίσης, διαφάνηκε πως σε εγκεφαλική βλάβη παρατηρούνται μακροπρόθεσμα αυξημένα ποσοστά, πιθανό στο πλαίσιο μιας παρατεταμένης μακροχρόνιας προσπάθειας ανάπλασης Πρώιμα Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα (eepcs) Όπως έχει ήδη αναφερθεί εκτενώς στο Γενικό μέρος, ο χαρακτηρισμός των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων καθώς και η τεχνική προσδιορισμού τους διαφέρουν τόσο πολύ στη βιβλιογραφία, που οι συγκρίσεις είναι κατ ουσίαν μόνο σχετικές. Πρόωρα νεογνά Κινητική Τα eepcs βρέθηκαν σημαντικά αυξημένα στα πρόωρα με εγκεφαλοπάθεια σε σχέση με τα πρόωρα χωρίς εγκεφαλοπάθεια την 3 η και 9 η ημέρα ζωής. Τις ίδιες ημέρες τα επίπεδα των κυττάρων αυτών ήταν αυξημένα στα νεογνά που είχαν χαμηλό Apgar score (σε συμφωνία με τους Safranow και συν. 87 ) και σε αυτά που εμφάνισαν IVH > 2 ου βαθμού. Ως εκ τούτου, δεν είναι σαφές αν η κινητοποίηση αυτή των κυττάρων προέρχεται από το γεγονός του περιγεννητικού στρες/ασφυξίας (που σε μεγάλο βαθμό ευθύνεται για τις εγκεφαλικές βλάβες τα Apgar score σχετίζονται εντονότατα με την IVH) ή από τις εγκεφαλικές βλάβες καθ εαυτές. Πάντως στα νεογνά με PVL παρατηρήθηκε μια τάση για αύξηση τη 18 η ημέρα ζωής και όχι τις άλλες ημέρες. Πιθανώς η κινητοποίηση να σχετίζεται σε μεγάλο βαθμό και από την ίδια την εγκεφαλική βλάβη. Πολυπαραγοντική μελέτη δεν ήταν δυνατή λόγω του μικρού αριθμού των παιδιών με εγκεφαλοπάθεια. Τα δικά μας αποτελέσματα (όσο είναι δυνατή η σύγκριση) είναι σε συμφωνία με τους Safranow και συν. (που βρήκαν αύξηση στο ομφάλιο αίμα) 87 και τους Strauss και συν. 113 αναφορικά με τη συσχέτιση με την IVH, ενώ αντίθετα άλλοι ερευνητές δε βρήκαν παρόμοια συσχέτιση 47,49. Συσχετίσεις Προγεννητικοί παράγοντες Τα eepcs της 1 ης ημέρας ζωής δεν εμφάνισαν συσχέτιση με τη ΔΚ και το ΒΓ, σε αντίθεση με τους Safranow και συν. που βρήκαν αρνητική συσχέτιση 87. Επίσης, χαμηλότερα ποσοστά παρατηρήθηκαν σε πολύδυμη κύηση, παρατήρηση κοινή και σε άλλους κυτταρικούς πληθυσμούς (βλ. και παράγραφο 3.1.1). Η πολύδυμη κύηση και η εμφάνιση

138 138 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ εγκεφαλοπάθειας αποτελούσαν ανεξάρτητους παράγοντες σχετικά με τα επίπεδα των κυττάρων στη μελέτη αυτή. Εξωμήτριοι παράγοντες Όπως σχολιάστηκε και για τα HSCs και VSELs, η όψιμη σηψαιμία συσχετιζόταν με χαμηλά επίπεδα eepcs, οριακά την 1 η και 3 η ημέρα ζωής και σημαντικά τη 18 η ημέρα ζωής. Ομοίως και οι Safranow και συν. βρήκαν οριακά χαμηλή τιμή την 6 η εβδομάδα ζωής 87. Αντίθετα, αντίστοιχη αναφορά στους ενήλικες περιγράφει αύξηση των EPCs 107. Οι διαφορές της λειτουργικής συμπεριφοράς των ΚΠΚ ανάμεσα σε νεογνά και ενήλικες χρήζουν περαιτέρω μελέτης. Επίσης, παρομοίως με τα HSCs, τα επίπεδα των eepcs την 3 η ημέρα ήταν χαμηλότερα στα νεογνά που εμφάνισαν ΝΕΚ, και είχαν μέτρια προγνωστική αξία ως προς την εμφάνιση αυτής της επιπλοκής. Ανάλογη προγνωστική αξία δεν εντόπισαν άλλοι ερευνητές 47,49. Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα εμπλέκονται στη διαδικασία της άμυνας του οργανισμού και στην παθογένεση της ΝΕΚ χρήζει περαιτέρω έρευνας. Επίσης, η θετική συσχέτιση των επιπέδων των eepcs με τη διάρκεια της νοσηλείας και την έκβαση του θανάτου θεωρούμε ότι αντανακλά τη θετική συσχέτιση με τη βαρύτητα της κλινικής εικόνας, όπως φάνηκε επίσης στη συσχέτιση με το Apgar score και την παρουσία εγκεφαλικής βλάβης. Τέλος, στην παρούσα μελέτη δε βρέθηκε συσχέτιση των eepcs με το ΣΑΔ ή τη ΒΠΔ. Παρομοίως, άλλες μελέτες δε βρίσκουν συσχέτιση με την πνευμονική λειτουργία 49, ενώ οι Borghesi και συν. αναφέρουν «προστατευτική» δράση των ECFC (Endothelial colonyforming cells) στη γέννηση όσον αφορά τη διάρκεια του μηχανικού αερισμού και των αναγκών σε Ο Τελειόμηνα νεογνά Κινητική Στην ομάδα των τελειομήνων οι διαφορές στην κινητική δεν ήταν τόσο εμφανείς. Η ομάδα της ήπιας εγκεφαλοπάθειας και της μέτριας/βαριάς εγκεφαλοπάθειας δε διέφεραν στατιστικά από την ομάδα ελέγχου, αν και η ομάδα της μέτριας/βαριάς εγκεφαλοπάθειας είχε υψηλότερα επίπεδα eepcs. Όταν η τελευταία χωρίστηκε σε μέτρια και σοβαρή εγκεφαλοπάθεια, φάνηκε οριακά πως τα eepcs κινητοποιούνται περισσότερο στη μετρίου βαθμού εγκεφαλοπάθεια, όμοιο πρότυπο κινητοποίησης με αυτό που παρατηρήθηκε στα HSCs και VSELs. Συσχετίσεις Προγεννητικοί παράγοντες Στα τελειόμηνα νεογνά, τα eepcs της 1 ης προγεννητικούς παράγοντες. ημέρας ζωής δεν εμφάνισαν συσχέτιση με

139 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 139 Εξωμήτριοι παράγοντες Τα νεογνά που υποβλήθηκαν σε θεραπευτική υποθερμία εμφάνισαν οριακά χαμηλότερα επίπεδα eepcs την 3 η ημέρα ζωής, την τελευταία ημέρα της υποθερμίας, σε σχέση με τα 4 νεογνά που δεν υποβλήθηκαν σε υποθερμία. Ως γνωστόν η υποθερμία χαμηλώνει το μεταβολικό ρυθμό στο νεογνό και επιβραδύνει τη λειτουργία των ζωτικών οργάνων 342. Στο πλαίσιο αυτό πολύ πιθανό να μειώνεται και η χημειοταξία ή η ικανότητα προς κινητοποίηση των eepcs την 3 η ημέρα ζωής. Επίσης παρατηρήθηκε πως τη 18 η ημέρα τα κύτταρα αυτά βρέθηκαν σημαντικά αυξημένα στα παιδιά με υποθερμία σε σχέση με αυτά που δεν υποβλήθηκαν σε υποθερμία (όπως ακριβώς περιγράφηκε και για τα HSCs παράγραφος 3.1.1). Μία πιθανή εξήγηση είναι πως στην υποθερμία η βαρύτητα της κλινικής κατάστασης και της εγκεφαλικής βλάβης έχει περιοριστεί και η κινητοποίηση των κυττάρων είναι αυξημένη, κατ ανάλογο τρόπο με αυτόν που τα eepcs είναι περισσότερο αυξημένα στη μέτρια εγκεφαλοπάθεια σε σχέση με τη βαριά. Ενδεχόμενα βέβαια και η θεραπευτική υποθερμία να ευνοεί με άλλους μηχανισμούς την ενδογενή ανάπλαση. Συμπερασματικά, τα πρώιμα Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα βρέθηκαν να κινητοποιούνται μετά από εγκεφαλική βλάβη σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά (κυρίως σε μέτρια εγκεφαλοπάθεια), πιθανώς σε μια προσπάθεια νεοαγγειογένεσης και αύξησης της αιμάτωσης στις περιοχές που υπέστησαν ιστική βλάβη. Μειωμένα ποσοστά βρέθηκαν σε σηψαιμία και ΝΕΚ, ενώ φαίνεται ότι η θεραπευτική υποθερμία μπορεί να αυξάνει την κινητοποίησή τους μετά το πέρας αυτής Όψιμα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (lepcs) Πρόωρα νεογνά Κινητική Τα όψιμα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα στη μελέτη αυτή ήταν αυξημένα στα πρόωρα με εγκεφαλοπάθεια την 1 η, 3 η και 9 η ημέρα ζωής σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Τα αυξημένα επίπεδα την 1 η ημέρα σχετίστηκαν επίσης με το χαμηλό Apgar score (σε συμφωνία με τους Safranow και συν 87 ). Φαίνεται ότι η παρουσία περιγεννητικού ασφυκτικού συμβάντος και η εμφάνιση εγκεφαλικών βλαβών συντελούν στην κινητοποίηση των lepcs, ως πολυδύναμων προγονικών κυττάρων που θα βοηθήσουν στην νεοαγγειογένεση και την ανάπλαση του βεβλαμένου ιστού. Τα ποσοστά των όψιμων EPCs στα πρόωρα της ομάδας ελέγχου ήταν αυξημένα την 1 η και 3 η ημέρα ζωής σε σχέση με τα τελειόμηνα της ομάδας ελέγχου. Είναι πιθανό πως τα επίπεδα στο αίμα (στην κυκλοφορία του εμβρύου και κατά συνέπεια τις πρώτες ημέρες μετά τη γέννηση) εκφράζουν τις ανάγκες του οργανισμού όσον αφορά τη διαδικασία της αγγείωσης κατά την οργανογένεση. Δηλαδή, όσο πιο μικρή είναι η ηλικία κύησης, τόσο πιο

140 140 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ανώριμη είναι η διάπλαση των οργάνων και του αντίστοιχου αγγειακού δικτύου, και συνεπώς μεγαλύτερη η ανάγκη για αυξημένα EPCs στην κυκλοφορία. Σε συμφωνία για τη συσχέτιση με τη ΔΚ βρίσκονται και οι παρατηρήσεις των Safranow και συν 87. Συσχετίσεις Προγεννητικοί παράγοντες Η παρουσία χοριοαμνιονίτιδας συσχετιζόταν αρνητικά με τα lepcs την 3 η, 9 η και 45 η ημέρα ζωής, υποδηλώνοντας την παρατεταμένη αρνητική επίδραση της φλεγμονώδους κατάστασης στην κινητοποίηση των κυττάρων. Οι ακριβείς μηχανισμοί δεν είναι γνωστοί, και παρόμοια παρατήρηση δεν έχει περιγραφεί για τα νεογνά. Επίσης, η πολύδυμη κύηση σχετιζόταν για άλλη μια φορά με μειωμένα επίπεδα την 1 η ημέρα ζωής (βλ και παράγραφο 3.1.1). Εξωμήτριοι παράγοντες Αυξημένα lepcs παρατηρήθηκαν την 45 η ημέρα ζωής στα νεογνά με ΒΠΔ. Δεδομένου ότι στην παθογένεια της ΒΠΔ εκτός από τις δομικές αλλαγές των βρογχιολίων συμμετέχει και η ανωριμότητα του πνευμονικού αγγειακού δικτύου 47, τα αυξημένα lepcs ενδεχόμενα να εκφράζουν ακριβώς αυτή την προσπάθεια νεοαγγείωσης του οργανισμού. Παρομοίως, οι Safranow και συν. βρήκαν αυξημένα επίπεδα σε ΣΑΔ 87. Μελέτες αναφέρουν μειωμένα επίπεδα στο ομφάλιο αίμα και τις 3 πρώτες εβδομάδες ζωής στη ΒΠΔ 50,85, ενώ άλλοι ερευνητές δε βρήκαν συσχέτιση 49. Υπενθυμίζεται πάντα η διαφορετικότητα των μελετών όσον αφορά τους πληθυσμούς των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων και η σχετικότητα των συγκρίσεων. Η σηψαιμία ομοίως με άλλες κυτταρικές σειρές συσχετίστηκε με χαμηλότερα επίπεδα lepcs (βλ και παράγραφο 3.1.1). Τελειόμηνα νεογνά Κινητική Στην ίδια «λογική» με τα πρόωρα, τα lepcs ήταν αυξημένα στα τελειόμηνα νεογνά τόσο σε παρουσία ασφυξίας (οξέωσης) αμέσως μετά τη γέννηση και χαμηλού Apgar score, όσο και σχεδόν σε όλο τον πρώτο 1,5 μήνα ζωής στην ομάδα της μέτριας/σοβαρής εγκεφαλοπάθειας. Σε αντίθεση με τους άλλους κυτταρικούς υποπληθυσμούς, τα lepcs παρουσίαζαν παρόμοια αύξηση τόσο στη μέτρια όσο και στη βαριά εγκεφαλοπάθεια. Αυτό ενδεχόμενα να υποδηλώνει διαφορετικό μηχανισμό χημειοταξίας και κινητοποίησης, που δεν επηρεάζεται ακόμα και σε μεγάλου βαθμού ιστική βλάβη ή σοβαρή κλινική κατάσταση. Άκρως ενδιαφέρουσα είναι και η παρατήρηση ότι τα lepcs ήταν αυξημένα σε αυτά τα παιδιά για μεγάλο χρονικό διάστημα, μέχρι τον 8 ο και 24 ο μήνα ζωής, υποδηλώνοντας ένα πιο ευρύ χρονικό παράθυρο ανάπλασης. Συσχετίσεις Προγεννητικοί παράγοντες Δε βρέθηκε συσχέτιση των προγεννητικών παραγόντων με τα ποσοστά των lepcs στα τελειόμηνα νεογνά.

141 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 141 Εξωμήτριοι παράγοντες Όπως και στα πρόωρα νεογνά, στα τελειόμηνα η σηψαιμία συσχετίστηκε με χαμηλά επίπεδα lepcs την 3 η και 9 η ημέρα ζωής (βλ και παράγραφο 3.1.1). Ειδικά για την 3 η ημέρα, καλή προγνωστική αξία εμφάνισαν επίπεδα χαμηλότερα των 0,0005. Τα αυξημένα επίπεδα lepcs που βρέθηκαν στα νεογνά με μεγαλύτερη διάρκεια νοσηλείας και σε αυτά που απεβίωσαν αντανακλούν πιθανώς την παρατήρηση των αυξημένων επιπέδων των κυττάρων αυτών σε βαρύτερη κλινική κατάσταση. Συμπερασματικά, τα όψιμα Ενδοθηλιακά Προγονικά Κύτταρα βρέθηκε να κινητοποιούνται έντονα μετά από εγκεφαλική βλάβη σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά, πιθανώς σε μια προσπάθεια αύξησης της νεοαγγείωσης μετά από ιστική βλάβη. Τα ποσοστά τους ήταν αυξημένα μέχρι και τον 8 ο και 24 ο μήνα ζωής, πιθανόν δηλώνοντας ένα ευρύ χρονικό παράθυρο αναφορικά με τη διαδικασία αναγέννησης. Ομοίως με τις άλλες κυτταρικές σειρές, τα ποσοστά των όψιμων EPCs βρέθηκαν μειωμένα σε χοριοαμνιονίτιδα και σηψαιμία.

142 142 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 3.2. Βιολογικοί δείκτες Εγκεφαλικής Βλάβης Η πρώιμη ανίχνευση των νεογνών που βρίσκονται σε κίνδυνο για νευροαναπτυξιακά ελλείμματα αποτελεί μεγάλη κλινική πρόκληση, ειδικά κάτω από το πρίσμα των ευνοϊκών αποτελεσμάτων που έχουν οι πρώιμες στρατηγικές νευροπροστασίας, όπως η θεραπευτική υποθερμία. Η πρόκληση είναι ακόμα μεγαλύτερη αν αναλογιστεί κανείς ότι η κλινική εκτίμηση τις πρώτες ώρες ζωής σε νεογνά οριακής βιωσιμότητας στη μονάδα εντατικής θεραπείας είναι δύσκολη, υποκειμενική και μπορεί να αλλάζει συν τω χρόνω 230. Επιπλέον, παράγοντες που επηρεάζουν την κλινική εκτίμηση είναι η χορήγηση κατασταλτικών φαρμάκων και η διασωλήνωση. Στο ίδιο χρονικό διάστημα, η εκτίμηση με μαγνητική τομογραφία είναι δύσκολη για τεχνικούς λόγους και έχει και μειωμένη ευαισθησία 1,340. Ωστόσο, σε αυτές τις λίγες πρώτες ώρες ζωής πρέπει να ληφθούν πολύ σημαντικές θεραπευτικές αποφάσεις. Επίσης, η κλινική εξέταση και η ηλεκτροφυσιολογική εκτίμηση στα νεογνά που βρίσκονται υπό θεραπευτική υποθερμία δεν αποτελούν καλούς προγνωστικούς δείκτες έκβασης Επιπλέον, η εκτίμηση με aeeg απαιτεί εξοπλισμό και εξειδίκευση. Για αυτόν το λόγο, είναι μεγάλη η ανάγκη να βρεθούν άλλοι δείκτες διαγνωστικοί, παρακολούθησης και προγνωστικοί που θα βοηθήσουν τη λήψη κλινικών αποφάσεων. Σε αυτό το πλαίσιο, ποικίλοι δείκτες εγκεφαλικής βλάβης έχουν δοκιμαστεί σε πειραματικό αλλά και κλινικό επίπεδο. Ανάμεσα σε αυτούς, ιδιαίτερη θέση κατέχουν οι S100b και η Ειδική Νευρωνική Ενολάση (NSE), λόγω κυρίως των σταθερών αποτελεσμάτων στις περισσότερες μελέτες. Παρ όλα αυτά, ο κλινικός τους ρόλος δεν έχει καθοριστεί στα νεογνά και ιδιαίτερα στα πρόωρα, τόσο διαγνωστικά όσο και προγνωστικά 215. Στην παρούσα μελέτη, εκτιμήθηκε η κινητική της S100b και της NSE κατά τις πρώτες 45 ημέρες ζωής στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά, και ερευνήθηκαν οι συσχετίσεις με περιγεννητικούς παράγοντες, με χημειοτακτικούς/νευροτροφικούς παράγοντες και με την κινητοποίηση των ΚΠΚ S100b Πρόωρα νεογνά Αναφορικά με τα πρόωρα νεογνά, στην παρούσα μελέτη τα επίπεδα της S100b ήταν αυξημένα την πρώτη ημέρα ζωής στα νεογέννητα που εμφάνισαν εγκεφαλική βλάβη. Επίσης υπολογίστηκε πως επίπεδα άνω των 2,51 μg/l την 1 η ημέρα συσχετιζόταν με την 3 ου και 4 ου βαθμού IVH με 71,4% ευαισθησία και 90,3% ειδικότητα. Ομοίως, και οι Distefano και συν. βρήκαν αύξηση στο αίμα την ίδια ημέρα ζωής στα νεογνά με PVL 240. Τα ανωτέρω δεδομένα οδηγούν στο συμπέρασμα πως στα πρόωρα η εγκεφαλική βλάβη συντελείται σε μεγάλο βαθμό την 1 η ημέρα ζωής, παρόλη την εξελικτική φύση της βλάβης στην IVH και PVL. Επίσης, οι Whitelaw και συν. βρήκαν αυξημένα επίπεδα στο ΕΝΥ σε

143 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 143 μεθαιμορραγική κοιλιακή διάταση 241. Οι Giuseppe και συν. βρήκαν προοδευτικά αυξημένα επίπεδα κατά τη διάρκεια της 1 ης βδομάδας ζωής στα πρόωρα με βαριά ασφυξία, ενώ σε αυτά με μέτρια ασφυξία τα επίπεδα είχαν πτωτική πορεία 214. Επίσης, αυξημένα επίπεδα της S100b βρέθηκαν σε έμβρυα και νεογνά με ενδομήτρια καθυστέρηση της αύξησης (IUGR) 236,242,243. Στη μελέτη μας η παρουσία IUGR ήταν κριτήριο αποκλεισμού. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, τα πρόωρα της ομάδας ελέγχου εμφάνιζαν υψηλότερα επίπεδα της S100b την 1 η και 9 η ημέρα ζωής σε σχέση με τα τελειόμηνα της ομάδας ελέγχου. Άλλοι ερευνητές περιγράφουν υψηλότερα επίπεδα στα νεογνά σε σχέση με τους ενήλικες, και ερμηνεύουν αυτό ως αποτέλεσμα του περισσότερο ανώριμου αιματοεγκεφαλικού φραγμού στα νεογνά 232 ή του αυξημένου μεταβολισμού των νευρογλοιακών κυττάρων στην ηλικία αυτή 235. Και η δική μας παρατήρηση σχετικά με την προωρότητα πιθανώς να έχει παρόμοια εξήγηση (περισσότερο ανώριμος αιματοεγκεφαλικός φραγμός ή αυξημένος μεταβολισμός στα πιο μικρής διάρκειας κύησης νεογνά), αν και η πιθανή εμπλοκή του σχετικά αυξημένου περιγεννητικά οξειδωτικού στρες στα πρόωρα νεογνά (συγκριτικά με τα τελειόμηνα) δεν μπορεί να αγνοηθεί. Δηλαδή, ακόμα και σε απουσία εμφανούς εγκεφαλικής βλάβης στην προωρότητα (πρόωρα μάρτυρες), τα αυξημένα επίπεδα της S100b ενδεχόμενα να μαρτυρούν υποκλινική βλάβη. Σε συμφωνία είναι και η κλινική γνώση πως τα πρόωρα νεογνά εμφανίζουν σε σαφώς μεγαλύτερο βαθμό μακροχρόνια ελάσσονα νευροαναπτυξιακά και μαθησιακά προβλήματα 1. Σημειώνεται πως δεν βρέθηκε συσχέτιση των δεικτών εγκεφαλικής βλάβης με την παρουσία 1 ου βαθμού IVH. Η αύξηση της S100b την 1 η ημέρα ζωής στα πρόωρα με σοβαρή IVH αποτελεί ένδειξη ότι μεγάλο μέρος της εγκεφαλικής βλάβης συντελείται ήδη από την πρώτη ημέρα ζωής, ενώ στα νεογνά με PVL μικρή ένδειξη αύξησης φάνηκε αργότερα, την 18 η ημέρα ζωής. Ωστόσο στατιστικώς το εύρημα αυτό ήταν οριακό. Τελειόμηνα νεογνά Στα τελειόμηνα νεογνά με βαριά ΥΙΕ βρέθηκαν ιδιαίτερα αυξημένα επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα ζωής και σε μικρότερο βαθμό την 3 η ημέρα ζωής. Αξίζει προσοχής, πως τα επίπεδα στη μέτρια εγκεφαλοπάθεια δεν αυξήθηκαν σχεδόν καθόλου. Αυτές οι παρατηρήσεις είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες 212,217, Επιπλέον υπολογίστηκε πως επίπεδα >1,6 μg/l την 1 η ημέρα ζωής προβλέπουν την εξέλιξη σε βαριά ΥΙΕ με βαθμό ευαισθησίας 87,5% και ειδικότητα 88,5%. Κοντά στα δικά μας όρια, και οι Qian και συν. βρήκαν πως επίπεδα άνω των 2,02 μg/l είχαν ευαισθησία 86,7% και ειδικότητα 88% για την ίδια έκβαση 234. Αρκετά υψηλότερα όρια βρήκαν οι Murabayashi και συν. (10μg/l) 212, αλλά οι τιμές στην ομάδα ελέγχου ήταν σχεδόν διπλάσιες από ότι στην δική μας μελέτη. Παρομοίως, οι Thorngren Jerneck και συν. υπολόγισαν όριο στα επίπεδα των 12 μg/l όσον αφορά την έκβαση του θανάτου ή της εγκεφαλικής παράλυσης 217, αλλά η δική τους μελέτη δεν συμπεριέλαβε ομάδα υγιών παιδιών ως μάρτυρες. Οι Massaro και συν. αναφέρουν πως μέτρηση αμέσως μετά τη γέννηση >0,7μg/l προσφέρει προγνωστική αξία αναφορικά με την έκβαση του θανάτου ή την παρατήρηση σοβαρής εγκεφαλικής βλάβης

144 144 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ στη μαγνητική τομογραφία με 64% ευαισθησία και 84% ειδικότητα, ενώ όριο 1,6 μg/l έχει 40% ευαισθησία και 91% ειδικότητα 230. Στη βιβλιογραφία αναφέρεται πως μεγαλύτερη προγνωστική αξία έχουν μετρήσεις στα ούρα από την πρώτη κιόλας ούρηση (91,3% ευαισθησία και 94,6% ειδικότητα) αναφορικά στην έκβαση της ΥΙΕ 237,238. Ομοίως, και οι Risso και συν. βρήκαν στα ούρα ευαισθησία και ειδικότητα 100% όσον αφορά το νεογνικό θάνατο 239. Αντιθέτως, οι Nagdyman και συν. δεν μπόρεσαν να βρουν συσχέτιση με την νευροαναπτυξιακή έκβαση στους 20 μήνες ζωής 216. Στην παρούσα μελέτη βρέθηκε επίσης πως όλα τα τελειόμηνα που πέθαναν στην νεογνική περίοδο ή ανέπτυξαν εγκεφαλική παράλυση στα 2 χρόνια ζωής είχαν επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα ζωής μεγαλύτερα από 11,4 μg/l. Τέλος, οι Massaro και συν. βρήκαν πως όριο 0,2 μg/l την 3 η ημέρα ζωής παρείχε ευαισθησία 71% και ειδικότητα 82% για την έκβαση του θανάτου ή τη δυσμενή βραχυπρόθεσμη νευρολογική έκβαση Ειδική νευρωνική ενολάση (NSE ) Πρόωρα νεογνά Η παρούσα μελέτη βρήκε πως στα πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια τα επίπεδα της NSE ήταν αυξημένα σχεδόν σε όλα τα χρονικά στιγμιότυπα, στατιστικώς δε σημαντικά μόνο την 45 η ημέρα ζωής. Αυτό το εύρημα μπορεί να αντανακλά τις ιδιαιτερότητες της εγκεφαλοπάθειας της προωρότητας (όπου η εγκεφαλική βλάβη σε σημαντικό βαθμό έχει προϊούσα πορεία υποξεία και παρατεταμένη), αλλά επίσης και την ομοίως παρατεταμένη διαδικασία της απόπτωσης. Οι Giuseppe και συν. αναφέρουν αυξημένα επίπεδα την 1 η ημέρα ζωής στα πρόωρα με περιγεννητική ασφυξία και σταδιακή πτώση 214. Στη μελέτη μας ακόμη, τα πρόωρα της ομάδας ελέγχου εμφάνιζαν υψηλότερα επίπεδα της NSE την 1 η και 9 η ημέρα ζωής σε σχέση με τα τελειόμηνα της ομάδας ελέγχου. Να σημειωθεί πως δεν βρέθηκε συσχέτιση της NSE με την παρουσία IVH 1 ου βαθμού. Τις ίδιες ημέρες ήταν αυξημένα και τα επίπεδα της S100b. Η ερμηνεία πιθανώς να είναι παρόμοια σαν αυτή που περιγράφηκε ανωτέρω για την αντίστοιχη αύξηση της S100b. Συγκριτικά με την S100b, η NSE εμφάνισε ένα πρότυπο κινητικής με περισσότερο σταδιακή πτώση των επιπέδων της στην πορεία του χρόνου, στην ουσία σε όλες τις ομάδες των παιδιών, πλην των προώρων με εγκεφαλοπάθεια. Αυτό αντανακλά το γεγονός του μεγαλύτερου χρόνου ημίσειας ζωής της NSE (Τ 1/2 24 ώρες) σε σχέση με την S100b, αλλά στην περίπτωση των νεογνών με σοβαρή εγκεφαλοπάθεια δεν πρέπει να αγνοηθεί και η συμμετοχή της παρατεταμένης απόπτωσης στην ερμηνεία της κινητικής της NSE. Τελειόμηνα νεογνά Στην παρούσα μελέτη βρέθηκαν σε τελειόμηνα νεογνά με ΥΙΕ σημαντικά αυξημένα τα επίπεδα της NSE την 1 η, 3 η και 9 η ημέρα ζωής, σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Σε συμφωνία, ο Celtik και συν. βρήκαν αυξημένα επίπεδα τις πρώτες 48 ώρες 244. Επίσης, άλλες

145 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 145 μελέτες αναφέρουν αυξημένα επίπεδα στο ΕΝΥ και καλή συσχέτιση με την έκβαση Στη μελέτη αυτή, προσδιορίστηκε επίσης ένα προγνωστικό όριο της τάξης των 38,8μg/l την 1 η ημέρα της ζωής που προσδιόριζε την έκβαση σε 2 ο ή 3 ο βαθμό ΥΙΕ με εξαιρετική ευαισθησία και ειδικότητα (100% και 95,2% αντίστοιχα). Πολύ κοντά στο όριο αυτό, οι Celtik και συν. υπολόγισαν για την ίδια έκβαση το όριο των 40 μg/l (με 79% ευαισθησία και 70% ειδικότητα), και το όριο των 45,4 μg/l (με 84% ευαισθησία και 70% ειδικότητα) όσον αφορά τη δυσοίωνη έκβαση στον 1 ο χρόνο ζωής 244. Οι Massaro και συν. όσον αφορά την έκβαση του θανάτου ή της εγκεφαλικής βλάβης που φαίνεται στην MRI αναφέρουν όριο 81 μg/l αμέσως μετά τη γέννηση (71% ευαισθησία και 83% ειδικότητα) ή όριο 110 μg/l για μεγαλύτερη ειδικότητα (33% ευαισθησία και 93% ειδικότητα). Επίσης οι ίδιοι συγγραφείς αναφέρουν όριο 67 μg/l την 3 η ημέρα ζωής που προβλέπουν με 70% ευαισθησία και 88% ειδικότητα την έκβαση του θανάτου ή της πρώιμης νευρολογικής διαταραχής. Αντίθετα, οι Nagdyman και συν. δε βρήκαν συσχέτιση της NSE (μετρημένη τις πρώτες 6 ώρες ζωής) με την ΥΙΕ, ούτε και καμία προγνωστική αξία 216,233. Ενδεχόμενα η μέτρηση της NSE τις πρώτες λίγες ώρες μετά τη γέννηση να μην έχει ικανοποιητική προγνωστική αξία. Ακόμη, από τη μελέτη μας η NSE φαίνεται να είναι πιο ευαίσθητος δείκτης από την S100b, καθώς αυξάνεται αναλογικά με το βαθμό της εγκεφαλοπάθειας, και όχι μόνο στη σοβαρή εγκεφαλική βλάβη (όπως η S100b). Έχοντας υπόψη πως οι νευρώνες είναι πιο ευάλωτοι από τα αστροκύτταρα στην υποξία (κατά σειρά: νευρώνες > ολιγοδενδροκύτταρα > αστροκύτταρα > μικρογλοία) 1, η παρατήρηση αυτή αντικατοπτρίζει πιθανότατα την υποκείμενη παθοφυσιολογία: σε μέτριο βαθμό ισχαιμίας επηρεάζονται κυρίως οι νευρώνες (αυξάνοντας τη NSE), ενώ σε μεγαλύτερο βαθμό ισχαιμίας βλάπτονται και άλλες κυτταρικές σειρές (βλάβη αστροκυττάρων, που συνεπάγεται αύξηση της S100b) Συσχετίσεις των δεικτών εγκεφαλικής βλάβης (S100b και NSE) με άλλες παραμέτρους Η συσχέτιση των επιπέδων της ερυθροποιητίνης με την S100b και τη NSE μπορεί να οφείλεται στον κοινό τους παρανομαστή, το υποξαιμικό γεγονός, το οποίο οδηγεί τόσο στην αύξηση της ΕΡΟ όσο και στην εγκεφαλική βλάβη. Ωστόσο, ενδέχεται η σταθερή συσχέτιση της ΕΡΟ με τα επίπεδα των δεικτών εγκεφαλικής βλάβης να αντανακλά μια πιο άμεση σχέση μεταξύ τους. Η νευροπροστατευτική δράση της ΕΡΟ είναι γνωστή, ενώ έχει επίσης παρατηρηθεί πως παράγεται ενδογενώς στο ΚΝΣ μετά από εγκεφαλική βλάβη σε πρόωρα νεογνά 169. Συνεπώς, είναι πιθανό η παρατηρούμενη αύξηση της νευροπροστατευτικής ΕΡΟ να αποτελεί απάντηση στην ίδια την εγκεφαλική βλάβη στα πλαίσια ενός ενδογενούς αμυντικού μηχανισμού. Επίσης, παρατηρήθηκε σταθερά η αρνητική συσχέτιση και των δύο δεικτών εγκεφαλικής βλάβης με τα επίπεδα του IGF 1 της ίδιας ημέρας ή των επομένων ημερών, υποδηλώνοντας την κατασταλτική επίδραση της εγκεφαλικής βλάβης στη δράση αυτού του αυξητικού παράγοντα.

146 146 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Μεγάλο ενδιαφέρον και ιδιαίτερα δύσκολοι στην ερμηνεία είναι οι συσχετίσεις που παρατηρήθηκαν με τα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα. Τα αυξημένα επίπεδα της S100b συσχετίστηκαν σταθερά αρνητικά με τα ποσοστά των ΚΠΚ (της ίδιας και κυρίως των επομένων ημερών) τόσο στα πρόωρα όσο και στα τελειόμηνα νεογνά, υποδεικνύοντας κατασταλτική επίδραση του μεγέθους της αστροκυτταρικής βλάβης στη διαδικασία της κινητοποίησης των προγονικών κυττάρων της περιφέρειας 213. Αντιθέτως, τα επίπεδα της NSE συσχετίστηκαν σταθερά θετικά με τα ΚΠΚ στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά, υποδεικνύοντας ένα αντίθετο πρότυπο κινητοποίησης: αυξημένη κινητοποίηση των ΚΠΚ σε νευρωνική βλάβη. Όσο γνωρίζουμε, δεν υπάρχουν αναφορές στη βιβλιογραφία για τη σχέση των δεικτών αυτών με τα ΚΠΚ σε εγκεφαλική βλάβη, οπότε μόνο εικασίες με βάση την παθοφυσιολογία μπορούμε να κάνουμε για να εξηγήσουμε τα ευρήματα αυτά. Κατ αρχήν, πρέπει να εστιάσουμε στην αλυσίδα της χημειοταξίας και κινητοποίησης των προγονικών κυττάρων. Οι χημειοτακτικές ουσίες εκκρίνονται από το μικροπεριβάλλον της βλάβης και το τοπικό ενδοθήλιο 32,188. Σε ένα ιδεατό μοντέλο, σε καθαρά νευρωνική βλάβη (στην οποία παρατηρείται αύξηση της NSE 244 ) το μικροπεριβάλλον των νευρώνων (τα αστροκύτταρα δηλαδή και το ενδοθήλιο) θα λάβει τα σήματα της κυτταρικής βλάβης και θα εκκρίνει χημειοτακτικούς παράγοντες για τη στρατολόγηση νευροπροστατευτικών παραγόντων, μεταξύ των οποίων και τα προγονικά κύτταρα της περιφέρειας. Όταν όμως η βλάβη συμπεριλάβει και το μικροπεριβάλλον (δηλαδή τα αστροκύτταρα που οδηγεί σε αύξηση της S100b και το τοπικό ενδοθήλιο), τότε η διαδικασία μεταφοράς του σήματος για έκκριση χημειοτακτικών παραγόντων διακόπτεται, με αποτέλεσμα την ανεπαρκή κινητοποίηση των ΚΠΚ (παράρτημα Α, εικόνα Α.22). Θα μπορούσε να δοθεί όμως και άλλη (παράλληλη) ερμηνεία: όπως αναλύθηκε ανωτέρω, η NSE είναι πιο «ευαίσθητος» δείκτης, καθώς παρατηρείται αυξημένος και σε μικρότερο βαθμό εγκεφαλοπάθειας, αντικατοπτρίζοντας ενδεχόμενα την παρουσία νευρωνικής βλάβης σε μικρότερο βαθμό ισχαιμικής προσβολής, σε σχέση με την αστροκυτταρική βλάβη. Με άλλα λόγια, η αύξηση της S100b προϋποθέτει την ύπαρξη ισχυρότερου ισχαιμικού συμβάντος (βλ. και εικόνα 19). Συνεπώς, αυξημένη S100b συνδέεται με σοβαρότερη εγκεφαλική βλάβη (δηλαδή συνδυασμένη βλάβη νευρώνων και μικροπεριβάλλοντος) αλλά και κατ επέκταση βαρύτερη γενική κλινική κατάσταση. Έτσι, η γενικευμένη βλάβη στον εγκεφαλικό ιστό ενδεχόμενα διακόπτει την αλληλουχία της χημειοταξίας αλλά και η βαρύτερη γενική κλινική κατάσταση του νεογνού δρα κατασταλτικά στην κινητοποίηση των ΚΠΚ. Φαίνεται λοιπόν ότι ούτε το «σήμα» μπορεί να σταλεί σωστά, αλλά και ο «παραλήπτης του σήματος» (τα ΚΠΚ) δυσκολεύεται να ανταποκριθεί. Στη μελέτη αυτή βρέθηκαν σταθερές συσχετίσεις των δεικτών εγκεφαλικής βλάβης της 1 ης ημέρας ζωής με άλλους δείκτες περιγεννητικού στρες (όπως το Apgar score, η μεταβολική οξέωση και οι τρανσαμινάσες), παρατήρηση που δεν προκαλεί έκπληξη. Ομοίως, οι συσχετίσεις με την έκβαση του θανάτου και τη διάρκεια της νοσηλείας είναι

147 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 147 αναμενόμενη, καθώς η έκταση της εγκεφαλικής βλάβης καθορίζει κυρίως αυτές τις παραμέτρους. Η συσχέτιση της αυξημένης S100b την 1 η ημέρα ζωής με την εμφάνιση όψιμης σηψαιμίας στα πρόωρα θα μπορούσε να εξηγηθεί από το γεγονός ότι σε σοβαρή εγκεφαλική βλάβη συνήθως συνυπάρχει πολυσυστηματική προσβολή και κατά συνέπεια αυξημένη ευπάθεια σε λοιμώξεις. Ενδεχόμενα όμως η ίδια η εγκεφαλική βλάβη να καθιστά τα νεογνά πιο ευάλωτα στις λοιμώξεις, καθώς το ΚΝΣ παίζει κυρίαρχο ρόλο στη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος. Να σημειωθεί ότι στη μελέτη αυτή δεν υπήρξε συσχέτιση της σήψης με τη διάρκεια νοσηλείας των προώρων ή τη διάρκεια κύησης. Επίσης έχει ενδιαφέρον πως δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση των δύο αυτών βιολογικών δεικτών εγκεφαλικής βλάβης με το βάρος γέννησης, τη διάρκεια κύησης ή άλλους προγεννητικούς δείκτες. Η αύξηση της S100b στα πρόωρα που γεννήθηκαν με καισαρική τομή ενδέχεται να αποτελεί αντανάκλαση μιας πιο επείγουσας διαδικασίας στα πλαίσια εντονότερου περιγεννητικού συμβάντος. Η βιβλιογραφία όμως υποδεικνύει ότι ο τοκετός διά της κολπικής οδού μπορεί να παίζει προστατευτικό ρόλο, καθώς επάγει την έκφραση γονιδίων, όπως τον μεταγραφικό παράγοντα του HIF1 και των γονιδίων στόχων του, με αποτέλεσμα την αύξηση της αγγειοδιαστολής, της μεταφοράς γλυκόζης, της γλυκόλυσης, καθώς και την αντιοξειδωτική και αντιαποπτωτική δράση 348. Με άλλα λόγια, η όλη νευροορμονική προετοιμασία του εμβρύου να ανταπεξέλθει στο στρες του κολπικού τοκετού αποτελεί είδος προστασίας ( preconditioning ) έναντι ενός ήπιου ασφυκτικού συμβάντος. Τέλος, μια μικρή τάση αλλά με σταθερό πρότυπο κινητικής παρατηρήθηκε όσον αφορά το σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας (ΣΑΔ): τα επίπεδα των δεικτών εγκεφαλικής βλάβης ήταν κατά σειρά αυξημένα στο σοβαρό ΣΑΔ (3 ου ή 4 ου βαθμού), εν συνεχεία λιγότερο αυξημένα στα νεογνά χωρίς ΣΑΔ και ακόμα πιο χαμηλά στα νεογνά με ήπιο ΣΑΔ (1 ου ή 2 ου βαθμού). Αρχικά κάνει εντύπωση πως το σοβαρό ΣΑΔ σχετίζεται (οριακά) με αυξημένους δείκτες εγκεφαλικής βλάβης, αντανακλώντας πιθανώς το πόσο ευάλωτο είναι το ΚΝΣ σε σοβαρή χρόνια υποξαιμία (ακόμα και όταν δεν υπάρχει έντονο και οξύ γεγονός sentinel (signal) hypoxic event όπως στην περιγεννητική ασφυξία των τελειομήνων). Ακόμη όμως περισσότερο προκαλεί εντύπωση πως η παρουσία ήπιας αναπνευστικής δυσχέρειας εμφάνιζε χαμηλότερους δείκτες εγκεφαλικής βλάβης συγκριτικά με την απουσία αναπνευστικής δυσχέρειας, αντανακλώντας πιθανώς τις νευροπροστατευτικές ιδιότητες της ήπιας υποξίας (πρότυπο preconditioning ). Η παρατήρηση αυτή βέβαια έχει εξήγηση παθοφυσιολογική 1 : η ήπια αναπνευστική δυσχέρεια και κατά συνέπεια η ήπια υπερκαπνία έχει επωφελή δράση. Προκαλείται αγγειοδιαστολή, διατηρείται ή αυξάνεται η εγκεφαλική αιματική ροή, μειώνεται ο μεταβολικός ρυθμός και μετατοπίζεται η καμπύλη δέσμευσης του Ο 2 προς τα δεξιά (λόγω της οξέωσης), βοηθώντας την αποδέσμευση του Ο 2 στους ιστούς (φαινόμενο Bohr). Πράγματι, σε πειραματόζωα που υποβλήθηκαν σε υποξίαισχαιμία παρατηρήθηκε νευροπροστατευτική δράση σε μέτρια υπερκαπνία 349. Όταν όμως η

148 148 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ υποξία είναι σοβαρότερη, η επακόλουθη συσσώρευση γαλακτικού και CO 2 προκαλεί σοβαρή οξέωση και ιστική βλάβη. Συμπερασματικά, οι δείκτες εγκεφαλικής βλάβης S100b και NSE αποδείχθηκαν αξιόπιστοι τόσο διαγνωστικά όσο και προγνωστικά, με το δείκτη NSE να έχει μεγαλύτερη ευαισθησία στην ανίχνευση ηπιότερης βλάβης. Είναι άξιο προσοχής πως τα πρόωρα χωρίς εμφανή εγκεφαλική βλάβη εμφάνισαν περισσότερο αυξημένους δείκτες συγκριτικά με τελειόμηνους μάρτυρες. Αλλά και τα πρόωρα με εγκεφαλοπάθεια εμφάνισαν παρατεταμένα αυξημένο το δείκτη νευρωνικής βλάβης NSE, υποδηλώνοντας τις ιδιαιτερότητες της παθοφυσιολογίας στην εγκεφαλοπάθεια της προωρότητας. Αξιόλογη επίσης είναι η παρατήρηση της ευπάθειας σε βλάβη του ΚΝΣ σε χρόνια υποξαιμία (χωρίς εμφανές οξύ υποξαιμικό συμβάν) αλλά και τα πρότυπα preconditioning σε ήπιο ΣΑΔ και κολπικό τοκετό. Τέλος, εξαιρετικά ενδιαφέρουσα είναι η συσχέτιση της S100b και της NSE με τα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα, και οι πιθανές προεκτάσεις των συμπερασμάτων μελλοντικά σε θεραπευτική εφαρμογή εξωγενούς χορήγησης βλαστικών κυττάρων. Πιστεύουμε πως οι παραπάνω παρατηρήσεις μπορεί να οδηγήσουν σε καλύτερη γνώση της παθοφυσιολογίας και ως εκ τούτου στο σχεδιασμό περισσότερο εξατομικευμένων θεραπευτικών προσεγγίσεων στο μέλλον. Πριν φτάσουμε σε αυτό το σημείο όμως, ο προσδιορισμός προγνωστικών ορίων πολύ νωρίς από την 1 η ημέρα της ζωής (που βρέθηκαν και σε αυτή τη μελέτη) θα μπορέσει να ανιχνεύσει εγκαίρως τα νεογνά υψηλού κινδύνου, γεγονός που έχει αναμφισβήτητα μεγάλη σημασία για τον κλινικό ιατρό και για τη λήψη αποφάσεων.

149 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Χημειοτακτικοί / νευροτροφικοί παράγοντες Ερυθροποιητίνη (EPO) Πρόωρα νεογνά Στη μελέτη μας, στα πρόωρα νεογνά χωρίς εγκεφαλική βλάβη δε βρέθηκε συσχέτιση της ΕΡΟ με τη ΔΚ ή το ΒΓ. Η ΕΡΟ ήταν αυξημένη στην ομάδα της εγκεφαλοπάθειας των προώρων σε σχέση με την ομάδα ελέγχου τις πρώτες ημέρες ζωής. Επίσης ήταν αυξημένη στα πρόωρα με χαμηλό Apgar score κυρίως την 1 η ημέρα ζωής, καθώς και στα νεογνά με οξέωση την 1 η και 3 η ημέρα ζωής, σε συμφωνία με την παρατήρηση των Bui και συν 50. Οι θετικές συσχετίσεις μεταξύ ΕΡΟ και S100b (βλ. παράγραφο 3.2.3), καθώς και η περισσότερο παρατεταμένη αύξηση της ΕΡΟ (1 η έως 9 η ημέρα ζωής) στα νεογνά που εμφάνισαν εγκεφαλική βλάβη, αποτελούν ενδείξεις πως η αύξηση αυτή δεν σχετίζεται μόνο με το γεγονός του περιγεννητικού ασφυκτικού συμβάντος και της οξέωσης, αλλά και με την παρουσία της εγκεφαλικής βλάβης αυτής καθ εαυτής. Παρόμοια ήταν τα ευρήματα των Juul και συν., οι οποίοι παρατήρησαν σε νεογνά με IVH και εγκεφαλική υποξία αύξηση της παραγωγής ΕΡΟ που παραγόταν στο ΚΝΣ 169. Είναι γνωστό ότι η ΕΡΟ έχει νευροπροστατευτική δράση 163, ενώ η χορήγηση repo στα πρόωρα έδειξε τάσεις μειωμένης επίπτωσης IVH και PVL 164. Η αύξησή της στα νεογνά με εγκεφαλική βλάβη πιθανώς αντανακλά ενδογενή μηχανισμό νευροπροστασίας. Στη μελέτη μας βρήκαμε χαμηλά επίπεδα ΕΡΟ σε ΣΑΔ. Είναι αξιοσημείωτο πως παρατηρήθηκε μια τάση αυξημένων επιπέδων ΕΡΟ την 1 η ημέρα ζωής στα νεογνά που πήραν προγεννητικά στεροειδή, τα δε αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ της ημέρα αυτής συσχετίστηκαν επίσης οριακά με την εμφάνιση μικρότερου βαθμού ΣΑΔ στα πρόωρα. Ενδεχόμενα στο μηχανισμό δράσης της προγεννητικής χορήγησης στεροειδών στην προφύλαξη από αναπνευστική δυσχέρεια εμπλέκεται και η ΕΡΟ, της οποίας ο ρόλος στην προφύλαξη από ΒΠΔ έχει επίσης περιγραφεί πειραματικά και κλινικά 92,93. Στην παρούσα μελέτη δε βρέθηκε συσχέτιση με τη ΒΠΔ, όπως περιγράφουν οι Bui και συν 50. Πάντως η εξωγενής χορήγηση repo έχει δείξει αντικρουόμενα αποτελέσματα όσον αφορά την εξέλιξη σε ΒΠΔ 152,164. Αναφορικά με τη σχέση της ΕΡΟ με τα προγονικά κύτταρα, οι Meister και συν. δε βρήκαν διαφορές στα CD34 + κύτταρα μετά από χορήγηση repo σε πρόωρα νεογνά 172. Επίσης οι Bui και συν. δε βρήκαν συσχέτιση της ΕΡΟ με τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (CD VEGFR2 + ) ή το γενικό πληθυσμό CD34 + στα πρόωρα, αλλά όπως αναφέρουν και οι ίδιοι, κάτι τέτοιο ήταν αναμενόμενο καθώς τα επίπεδα της ΕΡΟ ήταν γενικώς χαμηλά 50. Ομοίως και στην παρούσα μελέτη δε βρέθηκαν ιδιαίτερες συσχετίσεις με τα ΚΠΚ, παρά μόνο όταν μελετήθηκε ξεχωριστά η ομάδα των προώρων με εγκεφαλοπάθεια, στην οποία και τα επίπεδα ΕΡΟ ήταν περισσότερο αυξημένα. Βρέθηκε θετική συσχέτιση της ΕΡΟ με τα αιμοποιητικά προγονικά κύτταρα, κάτι που σαφώς αντανακλά την αιμοποιητική της

150 150 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ δράση. Εντονότερες συσχετίσεις ωστόσο παρατηρήθηκαν με τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα, παρατήρηση που έχει περιγραφεί σε ενήλικες και έχει σχέση με την εξής θεωρητική παθοφυσιολογική αλληλουχία 106,171 : η ιστική βλάβη/ισχαιμία συνήθως συνοδεύεται και από βλάβη του τοπικού αγγειακού δικτύου και από δημιουργία μιας περιοχής πέριξ της νέκρωσης, η οποία έχει μειωμένη αιμάτωση και τα κύτταρα αυτής οριακά επιβιώνουν (penumbra). Η ιστική βλάβη οδηγεί σε έκκριση της ΕΡΟ και επακόλουθη χημειοταξία και κινητοποίηση των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων, με αποτέλεσμα τη νεοαγγειογένεση και τη βελτίωση της αιμάτωσης και της επιβίωσης των κυττάρων στην penumbra. Τέλος, η παρουσία συσχετίσεων της ΕΡΟ με τα ΚΠΚ βασικά μόνο στην ομάδα της εγκεφαλοπάθειας αποτελεί άλλη μια ένδειξη πως η αύξηση της ΕΡΟ σε εγκεφαλική βλάβη πιθανώς συνδέεται με την κινητοποίηση των ΚΠΚ. Τελειόμηνα νεογνά Η ΕΡΟ ήταν αυξημένη την 1 η ημέρα οριακά στα νεογνά με ήπια εγκεφαλοπάθεια, καθώς και την 1 η και 3 η ημέρα στα νεογνά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια. Ανάμεσα στα τελευταία, η αύξηση ήταν μεγαλύτερη στα νεογνά που εμφάνισαν βαριά εγκεφαλοπάθεια, σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες 169. Ομοίως, τα επίπεδα της 3 η ημέρας ήταν αυξημένα στα νεογνά με οξέωση μετά τη γέννηση. Είναι γνωστό ότι η ΕΡΟ αυξάνεται σε συνθήκες υποξίας, αλλά η συσχέτιση μεταξύ S100b και ΕΡΟ (παράγραφος 2.2.1) καθώς και μεταξύ NSE και ΕΡΟ (παράγραφος 2.2.2) υποδηλώνει πως και η ίδια η εγκεφαλική βλάβη πιθανώς να αποτελεί ερέθισμα για την αύξηση της ΕΡΟ. Στο τελευταίο αυτό συμπέρασμα καταλήγουν και οι Juul και συν Ομοίως με τα πρόωρα, οι συσχετίσεις με τα ΚΠΚ ήταν πιο σημαντικές στην ομάδα της μέτριας/βαριάς εγκεφαλοπάθειας, ένδειξη (όπως φάνηκε και στα πρόωρα) πως σε παρουσία εγκεφαλικής βλάβης η ΕΡΟ συντελεί στην κινητοποίηση των ΚΠΚ. Τα επίπεδα της ΕΡΟ συχετίζονταν κυρίως τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (βλ. και ανωτέρω για τα πρόωρα). Όσο γνωρίζουμε, είναι η πρώτη μελέτη που μελετά ταυτόχρονα ΕΡΟ και προγονικά κύτταρα σε τελειόμηνα νεογνά. Τέλος, τα αυξημένα επίπεδα ΕΡΟ την 3 η ημέρα ζωής στα νεογνά τα οποία απεβίωσαν αντανακλούν πιθανώς τη βαρύτητα της εγκεφαλικής βλάβης και της γενικής κλινικής εικόνας. Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη παρατηρήθηκε αύξηση της ΕΡΟ σε νεογνά με εγκεφαλική βλάβη. Η αύξηση της ΕΡΟ πιθανώς να συνδέεται με την κινητοποίηση των αιμοποιητικών και ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων, συντελώντας στην ανάπλαση και νεοαγγειογένεση, και αναδεικνύοντας το νευροπροστατευτικό της ρόλο. Η δράση της αυτή πιθανότατα σχετίζεται με τη σοβαρότητα της εγκεφαλικής βλάβης.

151 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ IGF 1 Πρόωρα νεογνά Στη μελέτη αυτή δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές ανάμεσα στα πρόωρα με εγκεφαλοπάθεια και στους μάρτυρες. Ωστόσο, ενώ οι μάρτυρες παρουσίαζαν σταδιακή αύξηση στα επίπεδα IGF 1, η ομάδα με την εγκεφαλοπάθεια παρέμεινε σε σταθερά χαμηλά επίπεδα στις πρώτες 45 ημέρες ζωής. Τα χαμηλά επίπεδα του IGF 1 σε νεογνά με χαμηλό Apgar score και σε IVH υπογραμμίζουν αυτή τη διαφορά. Παραπάνω περιγράφηκε πως η σοβαρότητα της εγκεφαλικής βλάβης, όπως αυτή αντανακλάται στα επίπεδα της S100b και την NSE, συσχετιζόταν με μειωμένα επίπεδα του IGF 1. Παρόμοια μείωση του IGF 1 σε τελειόμηνα με εγκεφαλοπάθεια αναφέρουν αρκετοί ερευνητές Όπως περιγράφηκε, ποικίλες πειραματικές 173 και κλινικές μελέτες 182 έχουν δείξει το νευροπροστατευτικό ρόλο του IGF 1. Συνεπώς, μείωσή του συνδέεται με επιδείνωση της εγκεφαλικής βλάβης. Μετά από εμφάνιση καταστάσεων στρες, όπως το περιγεννητικό ασφυκτικό γεγονός και το σοβαρό ΣΑΔ, βρέθηκαν μειωμένα τα επίπεδα του IGF 1. Φαίνεται πως ο IGF 1 είναι αυξητικός παράγοντας που «προσβάλλεται» εύκολα σε εμφάνιση στρες. Αλλά και η εμφάνιση νόσου, όπως η σηψαιμία, η IVH και η ΒΠΔ, συσχετίστηκε με χαμηλά επίπεδα του αυξητικού αυτού παράγοντα. Παρομοίως, χαμηλά επίπεδα IGF 1 παρατηρήθηκαν σε νοσηλεία μεγάλης διάρκειας, και αντανακλούν πιθανότατα τη βαρύτερη κλινική εικόνα. Ομοίως και για τα νεογνά που απεβίωσαν. Η αιτιοπαθογενετική σχέση μεταξύ επιπέδων IGF 1 και νοσηρότητας δεν είναι γνωστή: η σοβαρότητα της νοσηρότητας ευθύνεται για τα χαμηλά επίπεδα του IGF 1, ή τα χαμηλά επίπεδα του αυξητικού αυτού παράγοντα δεν ήταν επαρκή για την προστασία από την εκδήλωση της νόσου; Ερώτημα με σοβαρές κλινικές προεκτάσεις που οφείλει να απαντηθεί στο μέλλον. Τέλος, η παρουσία μειωμένων επιπέδων του αυξητικού αυτού παράγοντα ίσως να συνευθύνεται για την αναστολή της σωματικής και νευρωνικής ανάπτυξης σε χρόνια βαριά νοσηρότητα. Ο IGF 1 βρέθηκε να αυξάνεται σταδιακά στα πρόωρα χωρίς εγκεφαλική βλάβη, σε συμφωνία με άλλη μελέτη όπου διαπιστώθη αύξηση από τη σύλληψη έως την 30 η εβδομάδα 181. Η αιτιολογία της αδυναμίας να παρατηρηθεί παρόμοια αύξηση στην ομάδα των πρόωρων με εγκεφαλική βλάβη περιγράφηκε σαφώς ανωτέρω και αποδίδεται στην αυξημένη νοσηρότητα. Τα σταθερά χαμηλότερα επίπεδα στα πρόωρα σε σχέση με τα τελειόμηνα είναι κοινό εύρημα σε μελέτες και αντικατοπτρίζει τη σταδιακή αύξηση ενδομήτρια, η οποία ανακόπτεται στον πρόωρο τοκετό 180. Όταν στην ανάλυση συμπεριλήφθηκαν μαζί οι μάρτυρες των ομάδων των προώρων και τελειομήνων, τότε ο IGF 1 είχε θετική συσχέτιση τόσο με τη ΔΚ όσο και το ΒΓ. Οι ομάδες των προώρων και τελειομήνων μαρτύρων εμφάνισαν τις μεγαλύτερες διαφορές μεταξύ τους την 9 η, 18 η και 45 η ημέρα ζωής.

152 152 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Τελειόμηνα νεογνά Στη μελέτη αυτή βρέθηκαν οριακά μειωμένα τα επίπεδα του IGF 1 στην ομάδα της μέτριας/βαριάς εγκεφαλοπάθειας, χωρίς ιδιαίτερη διαφορά μεταξύ μέτριας και βαριάς εγκεφαλοπάθειας. Παρόμοια ήταν τα ευρήματα προγενέστερων μελετών που ανέφεραν χαμηλότερα επίπεδα στα ασφυκτικά νεογνά: στο ομφάλιο αίμα 185, την 1 η και 10 η ημέρα ζωής 186, τις πρώτες 3 ημέρες και την 4 η εβδομάδα ζωής 187. Όπως περιγράφηκε παραπάνω, η σοβαρότητα της εγκεφαλικής βλάβης, όπως αντανακλάται στα επίπεδα των S100b και NSE, συσχετιζόταν ισχυρά με μειωμένα επίπεδα του IGF 1. Φαίνεται πιθανό πως τα μειωμένα επίπεδα του αυξητικού αυτού παράγοντα είναι αποτέλεσμα της περιγεννητικής ασφυξίας και συντελούν στην ανεπαρκή προστασία του εγκεφάλου, δεδομένων των νευροπροστατευτικών ιδιοτήτων που κατέχει. Επίσης, στη μελέτη αυτή τα επίπεδα του IGF 1 συσχετιζόταν θετικά με τα επίπεδα και των τεσσάρων προγονικών κυτταρικών πληθυσμών στα τελειόμηνα (HSCs, VSELs, eepcs και lepcs). Ενδεχόμενα, ένας μηχανισμός δράσης των αναβολικών και νευροπροστατευτικών ιδιοτήτων του παράγοντα IGF 1 να έχει σχέση με την κινητοποίηση των προγονικών κυττάρων. Συμπερασματικά, τα ευρήματα της μελέτης αυτής είναι ενδεικτικά της χημειοτακτικής δράσης του IGF 1 και στις τέσσερεις κυτταρικές σειρές προγονικών κυττάρων που μελετήθηκαν. Ωστόσο, φάνηκε ότι ο IGF 1 είναι πολύ «ευάλωτος» σε ποικίλες καταστάσεις στρες, όπως το περιγεννητικό ασφυκτικό γεγονός και το σοβαρό ΣΑΔ. Επίσης, τα μειωμένα επίπεδα του IGF 1 σε νόσους, όπως η σηψαιμία, η ΒΠΔ, η IVH και η εγκεφαλοπάθεια, ενδεχόμενα να αντανακλά το ίδιο φαινόμενο (η σοβαρότητα της νοσηρότητας να ευθύνεται για τα χαμηλά επίπεδα του IGF 1). Ενδεχόμενα όμως η αιτιοπαθογενετική σχέση να είναι αντίθετη: τα χαμηλά επίπεδα του αυξητικού και νευροτροφικού αυτού παράγοντα να μην ήταν επαρκή για την προστασία από την εκδήλωση της νόσου. Τέλος, ίσως ο μειωμένος IGF 1 να συνευθύνεται για την αναστολή της σωματικής και νευρωνικής ανάπτυξης σε χρόνια βαριά νοσηρότητα SDF 1 Πρόωρα νεογνά Κινητική Η κινητική του SDF 1 δεν εμφάνισε κάποιο συγκεκριμένο πρότυπο στις ομάδες της μελέτης. Τα πρόωρα της ομάδας μαρτύρων δε διέφεραν από τα τελειόμηνα υγιή, σε συμφωνία με άλλους ερευνητές 46,87. Αντίθετα οι Machalinska και συν. μελετώντας τα επίπεδα τη 10 η εβδομάδα ζωής βρήκαν αυξημένα επίπεδα στα τελειόμηνα σε σχέση με τα πρόωρα 31.

153 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 153 Όπως θα δούμε παρακάτω, η μελέτη του SDF 1 ήταν δυσχερής, κάτι που και η βιβλιογραφία αναφέρει, ιδιαίτερα στα νεογνά. Οι Bowie και συν. 27 εξέφρασαν επιφυλάξεις όσον αφορά την παρακρινή έκκριση SDF 1 από τα HSCs στη νεογνική ηλικία, κάτι που δυσχεραίνει την εκτίμηση της προέλευσης των επιπέδων του SDF 1 που εκτιμούνται στο περιφερικό αίμα. Επίσης ο SDF 1 εκκρίνεται τόσο από το μυελό των οστών με στόχο τον «επαναπατρισμό» (homing) των προγονικών κυττάρων της κυκλοφορίας όσο και από τις περιοχές της ιστικής βλάβης 188,189. Αποτελεί θέμα προβληματισμού ποιας προέλευσης SDF 1 επίπεδα προσδιορίζονται σε δείγματα περιφερικού αίματος. Σε μελέτες σε ποντίκια, για παράδειγμα, βρέθηκε αυξημένος ο SDF 1 στην περιοχή γύρω από την ισχαιμική βλάβη του μυοκαρδίου, ενώ τα επίπεδα στον ορό ήταν μειωμένα 197. Ιδιαίτερα στα πολύ πρόωρα νεογνά, λόγω της κλινικής κατάστασης, απαιτείται πολύ συχνά η χορήγηση παραγώγων αίματος, τα οποία περιέχουν πλάσμα από τους αιμοδότες. Όπως φάνηκε από μετρήσεις που έγιναν σε αυτά τα δείγματα, οι μονάδες συμπυκνωμένων ερυθρών περιείχαν μικρές ποσότητες πλάσματος και χαμηλής συγκέντρωσης σε SDF 1 (μέσος όρος: 755,4 pg/ml χαμηλότερες από τις τιμές πλάσματος προώρων νεογνών βλ πίν.22), ενώ οι μονάδες πλάσματος (FFP Fresh Frozen Plasma) είχαν πολύ μεγαλύτερες συγκεντρώσεις (μέσος όρος: 2867 pg/ml εντός του εύρους φυσιολογικών τιμών πλάσματος των ενηλίκων αιμοδοτών, αλλά πολύ υψηλότερες από τις τιμές των νεογνών). Ωστόσο ο μικρός χρόνος ημίσειας ζωής του SDF 1 (~30 λεπτά) καθώς και το γεγονός ότι στη μελέτη μας οι δειγματοληψίες απείχαν χρονικά από τις μεταγγίσεις, αποκλείουν το ενδεχόμενο να επηρεάστηκαν τα αποτελέσματα προσδιορισμού του SDF 1 από τις μεταγγίσεις. Οι μελέτες σε ενήλικες που αναφέρθηκαν ανέφεραν αυξημένα επίπεδα του SDF 1 στον ορό σε ιστική βλάβη 70,72,73. Αντίθετα, οι μελέτες σε νεογνά δεν αναφέρουν σταθερά αποτελέσματα 31,46,87. Συσχετίσεις με τους δείκτες εγκεφαλικής βλάβης Στην εξωμήτρια ζωή ο ρόλος του SDF 1 σε καταστάσεις ιστικής βλάβης είναι η χημειοταξία των ΚΠΚ. Η αύξηση του SDF 1 μετά από ιστική βλάβη αποτελεί σταθερό εύρημα μελετών στους ενήλικες 70,72,73, όπως και στη μελέτη μας στα τελειόμηνα νεογνά με εγκεφαλική βλάβη. Στα πρόωρα νεογνά, η σταθερή αυτή συσχέτιση εμφανίζεται από την 9 η ημέρα ζωής και μετά. Ειδικότερα, την 1 η ημέρα ζωής παρατηρήσαμε το αντίθετο μοντέλο. Τα επίπεδα S100b και NSE της 1 ης ημέρας ζωής συσχετίζονταν αρνητικά με τα επίπεδα του SDF 1 της 9 ης ημέρας. Αυτό το «αντιφατικό» μοντέλο κινητικής παρατηρήθηκε μόνο στα πρόωρα. Παρόμοια, στα πρόωρα το χαμηλό Apgar score συσχετίστηκε με χαμηλά επίπεδα την 45 η ημέρα ζωής. Το μοντέλο αυτό κινητικής δεν είναι εύκολο να ερμηνευτεί, ούτε στη βιβλιογραφία έχει γίνει παρόμοια συσχέτιση σε νεογνά. Όπως περιγράφηκε, ο SDF 1 παίζει βασικό ρόλο στην εμβρυική ζωή για την ανάπτυξη του εγκεφάλου και την καθοδήγηση των νευροβλαστών κατά την οργανογένεση 188, διαδικασία που αιφνίδια ανακόπτεται από τον πρόωρο τοκετό. Είναι πιθανό ότι το περιγεννητικό στρες και η ιστική βλάβη την πρώτη ημέρα ζωής να συσχετίζονται με το μειωμένο SDF 1, αντανακλώντας ακριβώς αυτή την αιφνίδια πρόωρη μετάβαση από την ομαλή διαδικασία της εμβρυικής ανάπτυξης του

154 154 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ εγκεφάλου στο μη ευνοϊκό εξωμήτριο περιβάλλον. Επίσης, τα νεογνά με χαμηλό Apgar score και αυξημένους δείκτες εγκεφαλικής βλάβης είναι αυτά που θα εμφανίσουν IVH ή PVL, εξ ου και η αρνητική συσχέτιση με τον SDF 1 που παρατηρήθηκε στην παρούσα μελέτη. Αν επιπρόσθετα υποδηλώνεται και νευροπροστατευτική δράση του SDF 1 που είναι μειωμένη στα νεογνά αυτά, αυτό είναι θέμα που χρήζει περαιτέρω προσοχής. Από την 9 η έως την 45 η ημέρα ζωής, τα επίπεδα των δεικτών εγκεφαλικής βλάβης συσχετίζονται θετικά πλέον με τον SDF 1, υιοθετώντας το σταθερό πρότυπο κινητικής των τελειομήνων (και ενηλίκων). Βέβαια οι ανωτέρω παρατηρήσεις στα πρόωρα οφείλουν να μελετηθούν εκτενέστερα. Συσχετίσεις με ΚΠΚ Τα αυξημένα επίπεδα του SDF 1 συσχετίστηκαν σποραδικά με αυξημένα ποσοστά των κυκλοφορούντων προγονικών κυττάρων της ίδιας ή των επομένων ημερών, και συγκεκριμένα των VSELs, των HSCs και των πρώιμων EPCs. Πιθανώς ο περιορισμένος αριθμός των νεογνών στην κάθε ομάδα της μελέτης δεν επέτρεψε την εξαγωγή πιο σαφών συσχετίσεων. Από τις θετικές συσχετίσεις όμως διαφαίνεται πως ο SDF 1 δρα αυξητικά για τα ΚΠΚ. Αντίθετα, οι Safranow και συν. δεν εντόπισαν σχέση με τα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα 87, ενώ οι Kotowski και συν. βρήκαν μόνο μια συσχέτιση με τα VSELs 46. Επίσης οι Qi και συν. βρήκαν συσχέτιση με τα CD , ενώ μελέτες σε ενήλικες έδειξαν πιο εμφανείς συσχετίσεις 70,72. Η δυσχέρεια εκτίμησης της κινητικής του SDF 1 στα νεογνά που περιγράφηκε παραπάνω επηρεάζει σαφώς και την προσπάθεια εντοπισμού σαφών συσχετίσεων. Είναι επίσης σαφές ότι αν και σε πειραματικό επίπεδο είναι αποδεδειγμένη η χημειοτακτική δράση του SDF 1 για τα ΚΠΚ, η εύρεση αντίστοιχων ενδείξεων σε κλινικό επίπεδο είναι πολύ δυσκολότερη, και οι όποιες συσχετίσεις εμφανίζονται είναι αξιοσημείωτες. Η δυσκολία έγκειται κυρίως ότι ένας χημειοτακτικός άξονας που λειτουργεί θαυμάσια σε πειραματικό «αποστειρωμένο» από απρόβλεπτους παράγοντες περιβάλλον, όταν γίνεται προσπάθεια να μελετηθεί σε πραγματικό ασθενή παρεμβάλλονται πολυάριθμοι παράμετροι, που στην πλειονότητά τους δεν μπορούν να προβλεφθούν ούτε ίσως να διαπιστωθούν. Ιδιαίτερα αυτό ισχύει σε βαριές κλινικές καταστάσεις, όπου οι χυμικοί και κυτταρικοί συσχετισμοί αλλάζουν άρδην. Ως εκ τούτου οι όποιες ενδείξεις βρεθούν μπορούν να αποτελέσουν αφετηρία περαιτέρω μελετών. Συσχετίσεις με περιγεννητικά χαρακτηριστικά Ο SDF 1 διαφαίνεται πως είναι ένας αυξητικός παράγοντας ευάλωτος σε φλεγμονώδεις και έντονα στρεσσογόνες καταστάσεις στα πρόωρα. Ειδικότερα, τα επίπεδά του μειώνονται σε χοριοαμνιονίτιδα και σε χαμηλό Apgar score. Τα μειωμένα επίπεδα της 1 ης ημέρας σε προγεννητική χορήγηση στεροειδών είναι σε συμφωνία με την πειραματική γνώση πως τα στεροειδή μειώνουν τα επίπεδα του SDF Τα χαμηλά επίπεδα του SDF 1 σε IVH και σε ΒΠΔ μπορεί να σχετίζονται αιτιοπαθογενετικά με τις νόσους (μειωμένα προστατευτικά επίπεδα), να είναι αποτέλεσμα

155 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 155 της νοσηρότητας, ή απλώς να συνυπάρχουν προκαλούμενοι από τους ίδιους παράγοντες. Αυτό το θέμα χρήζει περαιτέρω μελέτης. Αντίθετα, η παρουσία ΣΑΔ τις πρώτες ώρες της ζωής σχετιζόταν με αυξημένα επίπεδα SDF 1, όπως ανέφεραν και οι Qi και συν 44. Είναι γνωστό ότι η ιστική υποξία αυξάνει την έκκριση του SDF 1 μέσω του HIF 1a 32,188. Οι Machalinska και συν. αναφέρουν αυξημένα επίπεδα SDF 1 τη 10 η βδομάδα ζωής στα νεογνά με αμφιβληστροειδοπάθεια της προωρότητας. Στη δική μας μελέτη δε βρέθηκε ανάλογη συσχέτιση την 5 η εβδομάδα ζωής. Τέλος, άλλοι ερευνητές δε βρήκαν συσχέτιση με οποιαδήποτε επιπλοκή της προωρότητας 46,87. Η δυσχέρειες στην εκτίμηση του SDF 1 στα νεογνά είναι εμφανείς στα υπάρχοντα, περιορισμένα διεθνή δεδομένα. Τελειόμηνα νεογνά Κινητική Η εικόνα της κινητικής στα τελειόμηνα ήταν λίγο μόνο σαφέστερη. Παρατηρήθηκαν λίγες διαφορές μεταξύ των παιδιών με διαφορετικό βαθμό εγκεφαλοπάθειας, αλλά δεν εμφανιζόταν ένα σαφές πρότυπο κινητικής που θα μπορούσε να οδηγήσει σε πιθανές παθοφυσιολογικές ερμηνείες. Ειδικότερα, βρέθηκε τάση για μειωμένα επίπεδα στη μέτρια εγκεφαλοπάθεια και αυξημένα στη βαριά, σε αντίθεση τόσο με την έκφραση του υποδοχέα CD184 όσο και με την κινητοποίηση των ΚΠΚ. Σε συμφωνία με το «παράδοξο» αυτό, πειραματική μελέτη αναφέρει αυξημένα τοπικά επίπεδα SDF 1 μετά από ιστική βλάβη αλλά μειωμένα στον ορό 197. Οι δυσχέρειες στην εκτίμηση του SDF 1 στα πρόωρα νεογνά που αναφέρθηκαν παραπάνω ισχύουν και στα τελειόμηνα. Για το λόγο αυτό, προκειμένου να σκιαγραφηθεί ο ρόλος του χημειοτακτικού άξονα SDF 1/CXCR4, μελετήσαμε το «αρνητικό είδωλο» του SDF 1, την έκφραση του υποδοχέα του. Και αυτό δεδομένου ότι οι ίδιοι παράγοντες που κινητοποιούν τα κύτταρα, αυξάνουν και την έκφραση των υποδοχέων χημειοταξίας σε αυτά. Με το λόγο CD184 + /CD184, μελετήθηκε η διαχρονική μεταβολή της έκφρασης του υποδοχέα CXCR4 (CD184) στην επιφάνεια των κυκλοφορούντων προγονικών κυττάρων ως σύνολο. Βρέθηκε αύξηση της έκφρασης του CD184 στη μέτρια εγκεφαλοπάθεια τις ημέρες 9 έως 45 και σημαντική μείωση στη βαριά εγκεφαλοπάθεια την 3 η και 9 η ημέρα ζωής. Παρατηρήθηκε, δηλαδή, το πρότυπο κινητοποίησης που περιγράφηκε και στην κινητική των HSCs, των VSELs και των eepcs: κινητοποίηση στη μέτριας βαρύτητας εγκεφαλική βλάβη και αδυναμία κινητοποίησης στη βαριά βλάβη. Ειδικότερα, παρατηρήθηκε πως στη μέτρια εγκεφαλοπάθεια τα κύτταρα που φέρουν τον υποδοχέα CD184 στην επιφάνειά τους αυξάνονται (8πλασιάζονται) μετά την 9 η ημέρα ζωής, σε σχέση με τα επίπεδά τους στη γέννηση. Αντίθετα στη βαριά εγκεφαλοπάθεια, τα κύτταρα που φέρουν τον υποδοχέα CD184 είναι πολύ λιγότερα σε όλα σχεδόν τα χρονικά στιγμιότυπα σε σχέση με τους μάρτυρες και πολύ περισσότερο σε σχέση με την ομάδα της μέτριας εγκεφαλοπάθειας. Επίσης, βρέθηκαν ενδείξεις μικρότερης έκφρασης στα ΚΠΚ του δείκτη CD184 σε νεογνά που υποβλήθηκαν σε υποθερμία την 3 η και 45 η ημέρα ζωής. Με την επιφύλαξη ότι μόλις 4

156 156 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ νεογνά δεν εντάχθηκαν στο θεραπευτικό πρωτόκολλο της υποθερμίας, η ελαττωμένη κινητοποίηση την 3 η ημέρα ζωής στην υποθερμία σχετίζεται πιθανότατα με το μειωμένο μεταβολισμό κατά την υποθερμία. Η παρατήρηση για την 45 η ημέρα είναι δυσκολότερο να ερμηνευτεί, και ενδεχόμενα να σχετίζεται με περιορισμό της βλάβης λόγω της υποθερμίας. Περαιτέρω έρευνα απαιτείται για να διασαφηνιστεί το θέμα. Συσχετίσεις με τους δείκτες εγκεφαλικής βλάβης Στα τελειόμηνα νεογνά ο χημειοτακτικός παράγοντας SDF 1 βρέθηκε να αυξάνεται αναλογικά με τη σοβαρότητα της εγκεφαλικής βλάβης, όπως αυτή εκφράζεται από τους δείκτες S100b και NSE, υποδηλώνοντας πρότυπο κινητικής ανάλογο με αυτό που παρατηρείται στους ενήλικες με ιστική βλάβη. Βέβαια, όπως περιγράφηκε πολλές φορές παραπάνω, η δυσχέρεια στην εκτίμηση του SDF 1 στα νεογνά οδηγεί εν τέλει σε κινητική που δεν είναι εύκολα ερμηνεύσιμη. Συσχετίσεις με ΚΠΚ Στα τελειόμηνα νεογνά παρατηρήθηκε μόνο μια συσχέτιση του SDF 1 με τα όψιμα EPCs. Στην προσιτή βιβλιογραφία δε βρέθηκαν μελέτες τελειομήνων σχετικές με τα ΚΠΚ και τον παράγοντα SDF 1. Όπως συζητήθηκε παραπάνω, η ανεύρεση συσχετίσεων σε κλινικό επίπεδο απαιτεί περισσότερες μελέτες προς επιβεβαίωση. Συσχετίσεις με περιγεννητικά χαρακτηριστικά Η πολύδυμη κύηση συσχετίστηκε σταθερά με μειωμένα επίπεδα SDF 1. Αυτό είναι σε αρμονία με τα επίσης μειωμένα επίπεδα της νευροτροφικής ΕΡΟ, καθώς και των HSCs, eepcs και lepcs στην πολύδυμη κύηση. Επίσης το περιγεννητικό ασφυκτικό συμβάν (οξέωση μετά τη γέννηση), η σηψαιμία, η αυξημένη διάρκεια νοσηλείας σχετίστηκαν με μειωμένα επίπεδα του SDF 1. Όπως και στα πρόωρα νεογνά, φαίνεται πως έντονα στρεσσογόνες καταστάσεις και βαριά κλινική εικόνα συσχετίζεται με χαμηλά επίπεδα του SDF 1. Η σχέση αιτίου αιτιατού δεν είναι πάντα ξεκάθαρη και χρήζει περαιτέρω μελέτης. Έτσι, η αυξημένη διάρκεια νοσηλείας μπορεί να εκφράζει τη βαρύτητα της κλινικής κατάστασης, η οποία καταστέλλει τον ενδογενή μηχανισμό ανάπλασης, ενδέχεται όμως να αποτελεί και αποτέλεσμα της ανεπάρκειας του ενδογενούς μηχανισμού ανάπλασης. Στη δεύτερη αυτή περίπτωση, θεωρείται αναγκαίο να επιβεβαιωθεί ποιο βήμα του ενδογενούς μηχανισμού ανεπαρκεί και να σχεδιαστούν ανάλογες θεραπευτικές στρατηγικές. Συμπερασματικά, η έκκριση του χημειοτακτικού παράγοντα SDF 1 τόσο από την περιοχή της ιστικής βλάβης (μετανάστευση των ΚΠΚ) όσο και από το μυελό των οστών («επαναπατρισμός» των ΚΠΚ) (αλλά ενδεχόμενα και από άλλες πηγές) καθιστά δύσκολη την ερμηνεία των μεταβολών των επιπέδων του στο περιφερικό αίμα. Ωστόσο, η μελέτη του «αρνητικού ειδώλου» του φαινομένου, δηλαδή του βαθμού έκφρασης του υποδοχέα του (CD184) στην επιφάνεια των ΚΠΚ, βοήθησε να υπερκεραστεί το εμπόδιο αυτό και να μελετηθεί ο άξονας χημειοταξίας SDF 1/CXCR4. Με τον τρόπο αυτό επιβεβαιώθηκε το σταθερό πρότυπο κινητικής που επανειλημμένα παρατηρήθηκε σε αυτή τη μελέτη: έντονη κινητοποίηση στη μέτρια εγκεφαλοπάθεια και καταστολή στη βαριά εγκεφαλοπάθεια. Η

157 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 157 σημασία αυτής της παρατήρησης για τη μελλοντική εφαρμογή εξωγενούς θεραπευτικής χορήγησης βλαστικών κυττάρων είναι προφανής: προτού γίνει χορήγηση, πρέπει να διαφοροποιηθεί το «περιβάλλον υποδοχής» κατάλληλα (ενδεχόμενα με τη χρήση νευροτροφικών παραγόντων), ώστε τα προγονικά κύτταρα να έχουν τη δυνατότητα να δράσουν όπως έχουν προγραμματιστεί. Ίσως για αυτό το λόγο τα περισσότερα πειραματικά μοντέλα εμφάνισαν μόνο μετρίου βαθμού ενθαρρυντικά αποτελέσματα μετά από απλή μεταμόσχευση προγονικών κυττάρων, τα οποία βελτιώθηκαν όταν προηγήθηκε παρέμβαση νευροτροφική 204. Θεωρούμε πως η παρούσα μελέτη με τη συνδυαστική εκτίμηση βιοδεικτών και ΚΠΚ σε διαδοχικά χρονικά στιγμιότυπα παρέχει αρκετά βασικά στοιχεία παθοφυσιολογίας για την εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων σε αυτήν την κατεύθυνση Νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley III και Αξιολόγηση βλαβών στη Μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου Τελειόμηνα νεογνά Τα τελειόμηνα νεογνά με μέτρια/βαριά εγκεφαλοπάθεια εμφάνισαν σταθερά χαμηλότερη βαθμολογία σε σχέση με τα νεογνά με ήπια ή καθόλου εγκεφαλοπάθεια στη νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley III που διενεργήθηκε μετά το 2 ο χρόνο της ζωής. Η παρατήρηση αυτή ισχύει για όλες τις κλίμακες που ελέγχθηκαν στη δοκιμασία, δηλαδή για το γνωστικό τομέα, το λεκτικό τομέα, την αντιληπτική και εκφραστική ικανότητα, τον κινητικό τομέα, την αδρή και λεπτή κινητικότητα. Τα ευρήματα αυτά είναι συμβατά με την εντόπιση της βλάβης στην εγκεφαλοπάθεια των τελειομήνων, κατά την οποία βλάπτεται κυρίως ο φλοιός και τα βασικά γάγγλια 1. Παρόμοια, από τη βαθμολόγηση του μεγέθους των βλαβών στη μαγνητική τομογραφία στη μελέτη αυτή, διαπιστώθηκε ότι η παρουσία σοβαρών βλαβών συσχετίζεται γενικευμένα με μειωμένη βαθμολογία σε όλες τις κλίμακες. Αυτή η παρατήρηση ήταν αναμενόμενη, καθώς τα νεογνά με τις μεγαλύτερες βλάβες στη μαγνητική τομογραφία ήταν αυτά που εμφάνισαν σοβαρότερα νευρολογικά προβλήματα και εγκεφαλική παράλυση. Επίσης, σε συμφωνία με τα υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα, τα νεογνά με ήπια εγκεφαλοπάθεια δεν εμφάνισαν ελλείμματα κατά τη διενέργεια της αναπτυξιακής δοκιμασίας 1. Αντίθετα, σε όλες τις κλίμακες είχαν επιδόσεις υψηλότερες από το μέσο όρο (που ορίζει η δοκιμασία Bayley), και στατιστικά υψηλότερες από τους μάρτυρες στη γνωστική κλίμακα και στην υποκλίμακα της λεπτής κινητικότητας. Η παρατήρηση αυτή ίσως οφείλεται στη μεγαλύτερη ευαισθητοποίηση των γονέων αυτών των παιδιών μετά το περιγεννητικό συμβάν που βίωσαν στο παιδί τους, γεγονός που οδηγεί σε εντονότερο ενδιαφέρον για την ψυχοκινητική του ανάπτυξη. Είναι, όμως, πιθανό σε ήπια περιγεννητική προσβολή να κινητοποιούνται οι αμυντικοί και αναπλαστικοί μηχανισμοί του οργανισμού, χωρίς ωστόσο να έχει επέλθει επί της ουσίας σοβαρή βλάβη.

158 158 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Το αποτέλεσμα είναι αυξημένη παραγωγή νευροτροφινών (όπως είναι η ΕΡΟ, η οποία στην παρούσα μελέτη βρέθηκε αυξημένη στα νεογνά με ήπια εγκεφαλοπάθεια). Αναφορικά με τη σχέση των νευροαναπτυξιακών ευρημάτων με τα ΚΠΚ, παρατηρήθηκαν σταθερά υψηλά ποσοστά των HSCs τον 8 ο μήνα ζωής και των πρώιμων EPCs μετά το 2 ο χρόνο ζωής στα παιδιά που είχαν χαμηλές επιδόσεις σχεδόν σε όλες τις κλίμακες στη δοκιμασία Bayley. Παρομοίως, παραπάνω περιγράφηκαν υψηλά ποσοστά των ΚΠΚ στα παιδιά με βαριά εγκεφαλοπάθεια τον 8 ο και 24 ο μήνα ζωής. Η μακροπρόθεσμη αύξηση των ΚΠΚ εκφράζει ακριβώς την καθυστερημένη κινητοποίησή τους και τη μακροχρόνια προσπάθεια ανάπλασης μετά από εγκεφαλική βλάβη. Σε αντίθεση με προγενέστερους ερευνητές 216, στην παρούσα μελέτη η S100b και η NSE αποδείχθηκαν δείκτες με πολύ καλή προγνωστική αξία όσον αφορά τη μακροπρόθεσμη νευροαναπτυξιακή έκβαση και την παρουσία βλαβών στη μαγνητική τομογραφία. Ειδικότερα, τα επίπεδα της S100b την 1 η ημέρα ζωής προέβλεπαν με καλή προγνωστική ακρίβεια την έκβαση σε όλες τις υποκλίμακες της νευροαναπτυξιακής δοκιμασίας Bayley III, τόσο για σοβαρά (<2 SD) όσο και για ήπια ελλείμματα (<1 SD). Μικρότερου εύρους αλλά αντίστοιχης ευαισθησίας ήταν και τα επίπεδα της NSE την 3 η ημέρα ζωής. Επίσης, τα επίπεδα των δυο αυτών δεικτών την 1 η και 3 η ημέρα ζωής εμφάνισαν σημαντική συσχέτιση αλλά και αξιόλογη προγνωστική αξία αναφορικά με τη σοβαρότητα της βλάβης που παρατηρήθηκε στη μαγνητική τομογραφία στα βασικά γάγγλια και στην παραοβελιαία περιοχή. Πρόωρα νεογνά Τα πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια είχαν σημαντικά χαμηλότερη βαθμολογία στην νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley στον κινητικό τομέα και οριακά χαμηλότερη στη λεπτή κινητικότητα και στην αντιληπτική ικανότητα, σε σχέση με τα πρόωρα χωρίς εμφανή εγκεφαλική βλάβη. Επιπλέον διαπιστώσαμε σαφή συσχέτιση των βλαβών στη μαγνητική τομογραφία με τη μειωμένη βαθμολογία στη νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley, η οποία βρίσκεται σε πλήρη συμφωνία με την υποκείμενη παθοφυσιολογία 1. Έτσι, κινητικά προβλήματα σχετίζονταν ευρέως με παθολογικό σήμα στη λευκή ουσία, λέπτυνση του μεσολοβίου, καθυστερημένη μυελίνωση, μείωση του όγκου της λευκής ουσίας, διεύρυνση του υπαραχνοειδούς χώρου και με βλάβες στην παρεγκεφαλίδα. Όπως και στα τελειόμηνα νεογνά, έτσι και στα πρόωρα τα επίπεδα της S100b και της NSE την 1 η ημέρα ζωής είχαν σημαντική προγνωστική αξία ως προς την εμφάνιση ήπιων (< 1 SD) ελλειμμάτων στην κλίμακα του λόγου και της αντίληψής του κατά τη δοκιμασία Bayley. Αναφορικά με τη σοβαρότητα των βλαβών στη μαγνητική τομογραφία (συνολική βαθμολογία), σημαντική συσχέτιση και προγνωστική αξία είχαν τα επίπεδα της NSE την 45 η ημέρα ζωής. Συγκεκριμένα, η ομάδα των προώρων με εγκεφαλοπάθεια και παθολογικά ευρήματα στην MRI εμφάνισε σημαντικά αυξημένα επίπεδα της NSE την 45 η ημέρα ζωής σε σύγκριση με τα πρόωρα μάρτυρες (πίν. 16).

159 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Επιφυλάξεις Η διεξαγωγή της μελέτης σε ένα μόνο κέντρο σε συνδυασμό με την απαίτηση του σχεδιασμού για 2 έτη παρακολούθησης είχε ως μειονέκτημα το μικρό σχετικά αριθμό των νεογνών που εντάχθηκαν σε κάθε υποομάδα της μελέτης. Το γεγονός αυτό ενδεχόμενα να οδηγεί σε στατιστικό σφάλμα τύπου ΙΙ (να γίνει αποδεκτή δηλαδή η υπόθεση που ελέγχουμε, ενώ δεν ισχύει), ενώ ταυτόχρονα δεν επιτρέπει τη διενέργεια πολυπαραγοντικής ανάλυσης. Στη μελέτη αυτή, όπου δεν ήταν δυνατή η πολυπαραγοντική ανάλυση και η στατιστική κατεδείκνυε την ύπαρξη σοβαρού συγχυτικού παράγοντα, γινότανε όπου ήταν δυνατόν μελέτη σε υποομάδες με παρουσία ή απουσία του παράγοντα, ώστε να επιβεβαιωθεί ή απορριφθεί το μέγεθος της επίδρασης. Βέβαια, σε μια κλινική έρευνα με ασθενείς σε σοβαρή κλινική κατάσταση στη μονάδα εντατικής θεραπείας, οι παράγοντες που ενδεχόμενα να επιδρούν στα βιοχημικά μονοπάτια είναι πολλαπλοί και αδύνατο να ελεγχθούν στο σύνολό τους, όπως και το πλήθος των επιπλοκών και των χορηγούμενων φαρμακευτικών σκευασμάτων. Ιδανικές «αποστειρωμένες» συνθήκες μπορούν να δημιουργηθούν μόνο σε επίπεδο εργαστηρίου. Στην κλινική έρευνα, μόνο μεγάλου εύρους πολυκεντρική μελέτη θα είχε τη στατιστική δύναμη να διερευνήσει όλες τις παραμέτρους. Ωστόσο όμως, βασικός στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να ανιχνεύσει άγνωστες συσχετίσεις και να υποβάλλει ερωτήματα για περαιτέρω έρευνα, και όχι να καταλήξει σε οριστικά συμπεράσματα. Πόσο μάλλον όταν τα κυκλοφορούντα προγονικά κύτταρα που μελετήθηκαν αποτελούν σπάνιους πληθυσμούς στο αίμα. Για αυτό το λόγο, θεωρήθηκε ότι αποτελούν αξιόλογα προς αναφορά ακόμα και ευρήματα στα όρια της στατιστικής σημαντικότητας, όπως πρότυπα κινητικής και συσχετίσεις σπάνιων κυτταρικών πληθυσμών σε ένα υπόβαθρο κριτικής κλινικής κατάστασης στη μονάδα εντατικής θεραπείας, με πολυάριθμους συγχυτικούς παράγοντες, δεδομένου μάλιστα ότι η πλειονότητα των αναφορών αυτής της μελέτης δεν έχει βιβλιογραφικά προηγούμενα. Επίσης, όσον αφορά τα ΚΠΚ, η βιβλιογραφία άλλοτε περιγράφει ρόλο προστατευτικό των κυττάρων αυτών (μειωμένα επίπεδα που συσχετίζονται με τη μεταγενέστερη εμφάνιση νόσου), άλλοτε δευτερογενή αύξηση στα πλαίσια περιορισμού της ιστικής βλάβης και ανάπλασης και άλλοτε μείωση των επιπέδων τους στο αίμα στα πλαίσια χρόνιας φλεγμονώδους (συνήθως) κατάστασης (γενικό μέρος/παράγραφοι ). Όλα τα παραπάνω πρότυπα εκφράστηκαν και στην παρούσα μελέτη. Είναι μεγάλη πρόκληση να εδραιωθούν συμπεράσματα αναφορικά με το ποιοι κυτταρικοί υποπληθυσμοί ακολουθούν συγκεκριμένα πρότυπα κινητικής και υπό ποιες συνθήκες. Πολύ δε περισσότερο είναι σημαντικό να διευκρινιστούν οι διαμεσολαβητές και τα σήματα που καθορίζουν την κινητικότητα των κυττάρων αυτών. Θεωρούμε πως η παρούσα μελέτη μπορεί να αποτελέσει την αφετηρία για περαιτέρω έρευνα. Τα μοντέλα κινητικής των κυττάρων και διαδοχικών μεταβολών των βιολογικών δεικτών που καταγράφηκαν στη μελέτη αυτή είναι πολύπλοκα. Θα ήταν αναντίρρητα πολύ βολική η ύπαρξη γραμμικών συσχετίσεων, τύπου

160 160 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Α>> Β >> Γ. Στη φύση, όμως, οι βιοχημικοί δρόμοι πολύ συχνά διασταυρώνονται, ενώ άλλοτε η ίδια ουσία επιτελεί εντελώς διαφορετικούς ρόλους όταν βρίσκεται σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (π.χ. η S100b 213 ) ή κάτω υπό διαφορετικές συνθήκες (π.χ. τα ΚΠΚ). ΤΕΛΙΚΟ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ Η μελέτη αυτή έδειξε καθαρά πως τα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα κινητοποιούνται στα πρόωρα νεογνά με εγκεφαλική βλάβη αλλά και στα τελειόμηνα με μετρίου βαθμού εγκεφαλοπάθεια σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες. Η κινητοποίηση αυτή ενδεχόμενα εντάσσεται σε μια προσπάθεια ενδογενούς άμυνας και ανάπλασης, εάν λάβουμε υπόψη τα χαρακτηριστικά και τις ιδιότητες των προγονικών κυττάρων καθώς και τα ανάλογα αποτελέσματα από τα πειραματικά πρότυπα. Για πρώτη φορά στα νεογνά βρέθηκαν σαφείς ενδείξεις πως οι ενδογενείς μηχανισμοί άμυνας και ανάπλασης μετά από εγκεφαλική βλάβη περιλαμβάνουν κινητοποίηση προγονικών κυττάρων από την περιφέρεια. Επιπλέον, σημαντικό εύρημα της μελέτης αυτής είναι η αδυναμία κινητοποίησης των ΚΠΚ στη βαριά εγκεφαλοπάθεια των τελειομήνων. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ανεπάρκεια του ενδογενούς συστήματος άμυνας και αναγέννησης σε σοβαρή εγκεφαλική βλάβη και σχέση της με τα παρατηρούμενα σοβαρά νευροαναπτυξιακά προβλήματα στις περιπτώσεις αυτές. Ενδεχόμενα στο μέλλον η εξωγενής χορήγηση προγονικών κυττάρων (ιδιαίτερα) στη βαριά εγκεφαλοπάθεια να αναπληρώσει την ενδογενή αδυναμία και να περιορίσει το βαθμό της εγκεφαλικής βλάβης. Θεωρούμε πως η μίμηση του ενδογενούς προτύπου και η ενίσχυση αυτού μπορεί να αποδώσει τα καλύτερα αποτελέσματα στην προσπάθεια αυτή. Η παρούσα εργασία με τη συνδυαστική μελέτη βιοδεικτών και Κυκλοφορούντων Προγονικών Κυττάρων σε πολλαπλά χρονικά στιγμιότυπα παρέχει βασικά στοιχεία παθοφυσιολογίας για την εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων σε αυτή την κατεύθυνση.

161 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Περίληψη Η περιγεννητική ασφυξία και η προκαλούμενη από αυτήν εγκεφαλοπάθεια αποτελεί μια από τις πιο συνήθεις αιτίες θανάτου και μακροχρόνιων νευρολογικών ελλειμμάτων (μαθησιακές δυσκολίες, νοητική υστέρηση, επιληψία και εγκεφαλική παράλυση) στα πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά. Ως σήμερα η νεογνική εγκεφαλοπάθεια επιδέχεται μόνο υποστηρικτικής θεραπείας (με εξαίρεση τη θεραπευτική υποθερμία για τα τελειόμηνα τις πρώτες 6 ώρες της ζωής) και ως εκ τούτου αποτελεί στόχο της αναγεννητικής ιατρικής. Πράγματι, πολυάριθμες μελέτες σε πειραματικά πρότυπα νεογνικής εγκεφαλοπάθειας αλλά και κλινικές μελέτες σε ενήλικες με νευρωνική βλάβη έχουν δείξει ευνοϊκά αποτελέσματα μετά από εξωγενή χορήγηση προγονικών κυττάρων. Αντίστοιχες μελέτες σε νεογνά βρίσκονται σε εξέλιξη. Όμως τα προγονικά κύτταρα υπάρχουν ενδογενώς και ιδιαίτερα στο νεογέννητο. Άμεσα λοιπόν προκύπτει το εξής ερώτημα: ποιος είναι ο ρόλος των ενδογενών προγονικών κυττάρων στα νεογνά μετά από εγκεφαλική βλάβη; Συμμετέχουν στον ενδογενή μηχανισμό άμυνας και ανάπλασης; Ποια η διαφορά των κυττάρων αυτών σε νεογνά στα οποία εμφανίζεται ανατομική βλάβη και νευρολογική σημειολογία σε σχέση με αυτά που έχουν καλύτερη έκβαση; Για να απαντηθούν τα ερωτήματα αυτά σχεδιάστηκε μια προοπτική μελέτη κοόρτης σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά, που έλαβε χώρα στην Α Νεογνολογική Κλινική και Εντατική Νοσηλεία Νεογνών του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης στο Ιπποκράτειο Γενικό Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης. Από το Δεκέμβριο του 2010 έως το Νοέμβριο του 2013 μελετήθηκαν 83 νεογνά, 47 πρόωρα και 36 τελειόμηνα, από την 1 η ημέρα ζωής έως το 2 ο έτος ζωής (διορθωμένη ηλικία). Από τα πρόωρα, 16 εμφάνισαν εγκεφαλική βλάβη (IVH 3 ου ή 4 ου βαθμού, κυστική PVL ή έμφρακτο), ενώ 31 δεν παρουσίασαν εμφανή εγκεφαλική βλάβη και θεωρήθηκαν ως πρόωρα μάρτυρες. Από τα τελειόμηνα, 13 εμφάνισαν μέτρια ή σοβαρή εγκεφαλοπάθεια, 11 ήπια εγκεφαλοπάθεια, ενώ 12 φυσιολογικά νεογνά χωρίς περιγεννητικό συμβάν θεωρήθηκαν ως τελειόμηνα μάρτυρες. Συλλέχτηκε περιφερικό αίμα τις ημέρες ζωής 1, 3, 9, 18 και 45, καθώς και τον 8 ο και 24 ο μήνα ζωής, και προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής τα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα (ΚΠΚ), καθώς και με τη μέθοδο της ανοσοχημειοφωταύγειας μετρήθηκαν οι δείκτες εγκεφαλικής βλάβης S100b και Ειδική Νευρωνική Ενολάση (NSE), και οι χημειοτακτικοί/νευροτροφικοί παράγοντες ερυθροποιητίνη (ΕΡΟ) και ινσουλινόμορφος αυξητικός παράγων (IGF 1). Επίσης, ταυτόχρονα με ELISA προσδιορίστηκαν και τα επίπεδα του χημειοτακτικού δείκτη Stromal cell Derived Factor 1 (SDF 1). Αναφορικά με τα ΚΠΚ, οι πληθυσμοί που μελετήθηκαν ήταν τα Αιμοποιητικά Προγονικά Κύτταρα (HSCs, CD34 + /CD184 + /CD45 + ), τα Very Small Embryonic like Stem Cells (VSELs, CD34 + /CD184 + /CD45 ), τα πρώιμα Ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (early EPCs, CD34 + /CD45 dim/ /CD184 + /CD133 + ) και τα όψιμα Ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα (late EPCs, CD34 + /CD45 dim/ /CD184 + /CD133 ). Επιπλέον, έγινε λεπτομερής καταγραφή των περιγεννητικών χαρακτηριστικών και των επιπλοκών κατά τη νεογνική περίοδο, ενώ καταγράφηκε λεπτομερώς η νευρολογική εξέλιξη κλινικά και

162 162 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ απεικονιστικά (με διαδοχικά υπερηχογραφήματα στα πρόωρα νεογνά και με μαγνητική τομογραφία σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά με εγκεφαλική βλάβη). Επιπρόσθετα, έγινε βαθμολόγηση του μεγέθους των βλαβών που φάνηκαν στη μαγνητική τομογραφία εγκεφάλου αλλά και νευροαναπτυξιακός έλεγχος μετά το 2 ο χρόνο διορθωμένης ηλικίας με τη δοκιμασία Bayley III. Όσο γνωρίζουμε, αυτή αποτελεί την πρώτη μελέτη της κινητικής των ενδογενών ΚΠΚ σε τελειόμηνα νεογνά, ενώ ανάμεσα στις λίγες σχετικές μελέτες των ΚΠΚ σε πρόωρα νεογνά, η μελέτη αυτή διαφοροποιείται γιατί επικεντρώνεται ειδικά στην εγκεφαλική βλάβη. Ειδικότερα, έχει περισσότερα χρονικά στιγμιότυπα μελέτης (επτά για κάθε παιδί), μελετά ταυτόχρονα δείκτες εγκεφαλικής βλάβης και χημειοτακτικούς/νευροτροφικούς παράγοντες, ενώ και οι προγονικοί κυτταρικοί υποπληθυσμοί προσδιορίζονται με μεγαλύτερη ακρίβεια χρησιμοποιώντας συνδυασμούς επιφανειακών δεικτών. Παράλληλα, τα παιδιά ελέχθησαν στοχευμένα νευροαναπτυξιακά και απεικονιστικά. Τα κυριότερα αποτελέσματα που προκύπτουν από τη μελέτη των Κυκλοφορούντων Προγονικών Κυττάρων, των χημειοτακτικών/νευροτροφικών παραγόντων και των βιολογικών δεικτών εγκεφαλικής βλάβης σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια είναι τα εξής: Τα ποσοστά των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων, καθώς και των πρώιμων και των όψιμων ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων ήταν αυξημένα στα πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια σε σχέση με τα πρόωρα χωρίς εμφανή εγκεφαλική βλάβη κυρίως τις πρώτες 9 ημέρες της ζωής. Στα τελειόμηνα νεογνά με μετρίου βαθμού εγκεφαλοπάθεια, όλοι οι προγονικοί υποπληθυσμοί που μελετήθηκαν ήταν αυξημένοι σε σχέση με τους μάρτυρες, ουσιαστικά σε όλο τον πρώτο ενάμιση μήνα ζωής, σημαντικά δε κυρίως την 1 η και 3 η ημέρα ζωής. Με την εξαίρεση των όψιμων EPCs, τα Κυκλοφορούντα Προγονικά Κύτταρα που μελετήθηκαν δεν εμφάνιζαν αύξηση στα τελειόμηνα με βαριά εγκεφαλοπάθεια σε σχέση με τους μάρτυρες κατά τη νεογνική περίοδο (σε αντίθεση με τα τελειόμηνα που είχαν μέτρια εγκεφαλοπάθεια), αλλά αντίθετα εμφάνιζαν πολύ χαμηλότερα ποσοστά σε σχέση με τα νεογνά με τη μέτρια εγκεφαλοπάθεια, συχνά δε ποσοστά χαμηλότερα ακόμα και από τους μάρτυρες. Στα τελειόμηνα νεογνά με βαριά εγκεφαλοπάθεια παρατηρήθηκαν σε δεύτερο χρόνο (όψιμα) σταθερά αυξημένα ποσοστά (σε σχέση με τους μάρτυρες) των HSCs (την 45 η ημέρα και τον 8 ο μήνα ζωής), των VSELs (τον 24 ο μήνα ζωής), των πρώιμων και όψιμων EPCs (την 45 η ημέρα, τον 8 ο και 24 ο μήνα ζωής). Το πρότυπο αυτό, αν και εμφάνιζε σταθερότητα και επαναληψιμότητα, δεν ήταν πάντα στατιστικά σημαντικό.

163 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 163 Τα πρόωρα νεογνά με σοβαρή ενδοκοιλιακή αιμορραγία εμφάνιζαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα των VSELs τον 8 ο μήνα ζωής σε σχέση με τους αντίστοιχους μάρτυρες. Τα νεογνά με μέτρια ή βαριά εγκεφαλοπάθεια που υποβλήθηκαν σε θεραπευτική υποθερμία εμφάνιζαν τάση για υψηλότερα ποσοστά HSCs και πρώιμων EPCs τη 18 η ημέρα ζωής. Τα πρόωρα νεογνά που εμφάνισαν όψιμη σηψαιμία είχαν σταθερά σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα HSCs και VSELs (1 η, 3 η, 9 η, 18 η και 45 η ημέρα ζωής), πρώιμων EPCs (1 η,3 η και 18 η ημέρα) και όψιμων EPCs (1 η, 18 η και 45 η ημέρα ζωής). Ομοίως, τα τελειόμηνα με σηψαιμία εμφάνιζαν οριακά χαμηλότερα ποσοστά των VSELs (9 η, 18 η και 45 η ημέρα) και όψιμων EPCs (3 η και 9 η ημέρα ζωής). Η αξιολόγηση προγονικών κυττάρων ως προγνωστικών δεικτών έδειξε ότι ποσοστά των HSCs χαμηλότερα των 0,017 (επί του συνόλου των παρατηρήσεων στην κυτταρομετρία ροής) την 1 η ημέρα ζωής είχαν 100% ευαισθησία και 66,7% ειδικότητα για την εμφάνιση σηψαιμίας στα πρόωρα, ενώ ποσοστά VSELs χαμηλότερα από 0,0136 την ίδια ημέρα εμφάνιζαν 100% ευαισθησία και 79,5% ειδικότητα. Στα τελειόμηνα, ποσοστιαία αναλογία όψιμων EPCs την 3 η ημέρα ζωής κάτω από 0,0005 είχε 100% ευαισθησία και 87,1% ειδικότητα ως προς την εμφάνιση της σηψαιμίας. Τα πρόωρα με νεκρωτική εντεροκολίτιδα εμφάνισαν σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά HSCs και πρώιμων EPCs την 3 η ημέρα ζωής. Η αξιολόγησή τους ως προγνωστικών δεικτών έδειξε ότι ποσοστά HSCs χαμηλότερα από 0,015 την 3 η ημέρα ζωής είχαν 66,7% ευαισθησία και 66,7% ειδικότητα για την εμφάνιση ΝΕΚ στα πρόωρα, ενώ ποσοστά των πρώιμων EPCs χαμηλότερα από 0,0095 την ίδια ημέρα εμφάνιζαν 66,7% ευαισθησία και 70% ειδικότητα. Η παρουσία χοριοαμνιονίτιδας σχετοζόταν σταθερά στα πρόωρα νεογνά με χαμηλότερα επίπεδα των HSCs (1 η, 9 η, 18 η ημέρα), των VSELs (3 η ημέρα) και των όψιμων EPCs (3 η, 18 η και 45 η ημέρα ζωής). Αναφορικά με τους βιολογικούς δείκτες εγκεφαλικής βλάβης, η S100b ήταν αυξημένη στα τελειόμηνα νεογνά με βαριά εγκεφαλοπάθεια την 1 η και 3 η ημέρα ζωής, ενώ στα πρόωρα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια ήταν αυξημένη την 1 η ημέρα ζωής, σε σύγκριση με τους αντίστοιχους μάρτυρες. Ομοίως, η NSE ήταν αυξημένη στα τελειόμηνα με μέτρια και βαριά εγκεφαλοπάθεια τις πρώτες 18 ημέρες ζωής, ενώ στα πρόωρα νεογνά με εγκεφαλική βλάβη κυρίως την 18 η και 45 η ημέρα ζωής. Προγνωστικά, βρέθηκε πως επίπεδα της NSE στα τελειόμηνα νεογνά την 1 η ημέρα ζωής μεγαλύτερα του 38,8 μg/l είχαν υψηλή ευαισθησία (100%) και ειδικότητα (95,2%) όσον αφορά την εξέλιξη σε 2 ου ή 3 ου βαθμού ΥΙΕ. Το αντίστοιχο όριο για τη S100b την ίδια ημέρα ήταν 1,6 μg/l, με 87,5% ευαισθησία

164 164 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ και 88,5% ειδικότητα αναφορικά με την εξέλιξη σε βαριά εγκεφαλοπάθεια, ενώ όλα τα τελειόμηνα που εμφάνισαν δυσμενέστατη πρόγνωση (θάνατο ή εγκεφαλική παράλυση) είχαν επίπεδα πάνω από 11,4 μg/l. Στα πρόωρα νεογνά, επίπεδα S100b υψηλότερα από 2,51 μg/l την 1 η ημέρα προέβλεπαν με 71,4% ευαισθησία και 90,3% ειδικότητα την εξέλιξη σε 3 ου ή 4 ου βαθμού IVH. Η συσχέτιση των τα Κυκλοφορούντων Προγονικών Κυττάρων με τους βιολογικούς δείκτες εγκεφαλικής βλάβης εμφανίζει ιδιαίτερου παθοφυσιολογικού ενδιαφέροντος πρότυπο: θετική συσχέτιση με την NSE και αρνητική συσχέτιση με την S100b. Οι βιολογικοί δείκτες εγκεφαλικής βλάβης παρουσιάζαν μεγαλύτερη αύξηση σε σοβαρό ΣΑΔ (3 ου /4 ου βαθμού) συγκριτικά με εκείνα χωρίς ΣΑΔ, ενώ τα νεογνά με ήπιο ΣΑΔ (1 ου /2 ου βαθμού) παρουσίαζαν τα χαμηλότερα επίπεδα. Η ερυθροποιητίνη στα πρόωρα με εγκεφαλοπάθεια σχετιζόταν θετικά με τα αιμοποιητικά καθώς και τα πρώιμα και όψιμα ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα, κυρίως των επόμενων ημερών. Ομοίως, θετική συσχέτιση βρέθηκε κυρίως στα τελειόμηνα με μέτρια/σοβαρή εγκεφαλοπάθεια ανάμεσα στην ΕΡΟ και τα VSELs, τα πρώιμα και όψιμα EPCs των επόμενων ημερών. Στα τελειόμηνα νεογνά, ο IGF 1 σχετιζόταν θετικά με το σύνολο των Κυκλοφορούντων Προγονικών Κυττάρων. Μειωμένα επίπεδα IGF 1 παρατηρήθηκαν σε χαμηλό Apgar score, μέτρια/σοβαρή εγκεφαλοπάθεια, σοβαρή IVH, σηψαιμία, σοβαρό ΣΑΔ, ΒΠΔ, αυξημένη διάρκεια νοσηλείας καθώς και στα νεογνά που απεβίωσαν. Ο χημειοτακτικός παράγοντας SDF 1 σχετιζόταν θετικά στα πρόωρα νεογνά με τα ποσοστά των HSCs, VSELs και πρώιμων EPCs, ενώ στα τελειόμηνα νεογνά οριακά με τα όψιμα EPCs. Η έκφραση του υποδοχέα του SDF 1 (CD184/CXCR4) στην επιφάνεια των ΚΠΚ ήταν αυξημένη στα τελειόμηνα νεογνά σε μετρίου βαθμού εγκεφαλοπάθεια την 9 η, 18 η και 45 η ημέρα ζωής σε σχέση με τους μάρτυρες, ενώ σημαντική μείωση εμφάνιζε η έκφραση στη βαριά εγκεφαλοπάθεια την 3 η και 9 η ημέρα. Τα παραπάνω ευρήματα οδηγούν στα βασικά συμπεράσματα της παρούσης μελέτης: Μετά από εγκεφαλική βλάβη παρατηρείται ένα σταθερό πρότυπο ενδογενούς απάντησης με κινητοποίηση ουσιαστικά και των τεσσάρων ενδογενών προγονικών κυτταρικών πληθυσμών που μελετήθηκαν, τόσο στα πρόωρα νεογνά με εγκεφαλική βλάβη όσο και στα τελειόμηνα με μετρίου βαθμού εγκεφαλοπάθεια. Τα ευρήματα αυτά συνηγορούν για την ύπαρξη στα νεογνά ανάλογου ενδογενούς αμυντικού και αναπλαστικού μηχανισμού, όπως έχει

165 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 165 εκτεταμένα αναφερθεί σε πειραματικά πρότυπα και σε κλινικές μελέτες σε ενήλικες. Η ενδογενής αύξηση των Ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων μετά από ιστική βλάβη αντανακλά την προσπάθεια νεο αγγείωσης και βελτίωσης της αιμάτωσης στην περιοχή γύρω από τη βλάβη (penumbra). Στα τελειόμηνα νεογνά με βαριά εγκεφαλοπάθεια, η παρατηρούμενη αδυναμία κινητοποίησης των περισσότερων πληθυσμών των Κυκλοφορούντων Προγονικών Κυττάρων στη νεογνική περίοδο αποτελεί ένδειξη ανεπάρκειας του ενδογενούς αμυντικού και αναπλαστικού μηχανισμού σε εκτεταμένη ιστική βλάβη. Δεδομένου ότι τα νεογνά με βαριά εγκεφαλοπάθεια εμφανίζουν τα σοβαρότερα νευροαναπτυξιακά προβλήματα, εικάζουμε πως η αναπλήρωση της ενδογενούς ανεπάρκειας με εξωγενή χορήγηση προγονικών κυττάρων σε αυτά τα νεογνά μπορεί να έχει ευεργετική επίδραση στον περιορισμό του μεγέθους της εγκεφαλικής βλάβης και των νευρολογικών υπολειμμάτων, κατ ανάλογο τρόπο με τα ευεργετικά αποτελέσματα που αναφέρονται σε χορήγηση προγονικών κυττάρων στα αντίστοιχα πειραματικά πρότυπα. Στα τελειόμηνα νεογνά με βαριά εγκεφαλοπάθεια παρατηρήθηκε όψιμη κινητοποίηση των ΚΠΚ την 45 η ημέρα ζωής αλλά κυρίως τον 8 ο και 24 ο μήνα ζωής. Δηλαδή η ενδογενής διαδικασία ανάπλασης που τον πρώτο μήνα ζωής υστερεί σε αυτά τα νεογνά, φαίνεται πως ξεκινά καθυστερημένα και διαρκεί αρκετούς μήνες στην προσπάθεια να μειώσει τις συνέπειες της εκτεταμένης ιστικής βλάβης. Παρόμοια όψιμη κινητοποίηση των VSELs παρατηρούμε και σε πρόωρα νεογνά με σοβαρή ενδοκοιλιακή αιμορραγία, υποδηλώνοντας μια παρατεταμένη διαδικασία ανάπλασης μετά από σοβαρή ιστική βλάβη. Εικάζουμε πως η παρουσία μακροχρόνια ενεργού ενδογενούς μηχανισμού ανάπλασης σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά σκιαγραφεί όρια θεραπευτικού παραθύρου για εξωγενή χορήγηση προγονικών κυττάρων που εκτείνονται για αρκετούς μήνες. Παρ όλο το μικρό αριθμό των νεογνών που δεν υποβλήθηκαν σε θεραπευτική υποθερμία, βρέθηκαν ενδείξεις πως η θεραπευτική υποθερμία ενδεχόμενα δρα ευοδωτικά στον ενδογενή μηχανισμό ανάπλασης, καθώς παρατηρήθηκε εντονότερη κινητοποίηση των HSCs και VSELs μετά την επαναθέρμανση. Στην παρούσα μελέτη φάνηκε πως τα ΚΠΚ ενδεχόμενα να έχουν κάποιο προστατευτικό ρόλο ως προς την εμφάνιση φλεγμονωδών καταστάσεων και λοίμωξης. Η σταθερή συσχέτιση σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά των χαμηλών ποσοστών των ΚΠΚ (ήδη από την 1 η ημέρα ζωής και καθ όλο τον πρώτο ενάμιση μήνα) με την παρουσία όψιμης σηψαιμίας υποδεικνύει πιθανό προστατευτικό ρόλο των υψηλών επιπέδων των ΚΠΚ. Τα HSCs και VSELs εμφάνισαν επιπρόσθετα αξιόλογη προγνωστική αξία. Παρομοίως, η παρουσία χοριοαμνιονίτιδας

166 166 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ συσχετίστηκε σταθερά με μειωμένα επίπεδα των περισσοτέρων ΚΠΚ τον 1 ο μήνα ζωής. Επιπρόσθετα, φάνηκε πως και στη Νεκρωτική εντεροκολίτιδα τα υψηλά ποσοστά των HSCs και των πρώιμων EPCs ενδεχόμενα έχουν κάποιο προστατευτικό ρόλο, ενώ η προγνωστική τους αξία ήταν μετρίου βαθμού. Οι S100b και NSE φαίνεται να αποτελούν αξιόπιστους δείκτες εγκεφαλικής βλάβης σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά, τόσο διαγνωστικά όσο και προγνωστικά. Ειδικότερα, η NSE αποδείχθηκε πιο ευαίσθητος δείκτης, καθώς αυξήθηκε αναλογικά στη μέτρια και βαριά εγκεφαλοπάθεια των τελειομήνων, ενώ η S100b αυξήθηκε μόνο στη βαριά εγκεφαλοπάθεια. Η θετική συσχέτιση της ερυθροποιητίνης με τα ΚΠΚ, κυρίως στα νεογνά με εγκεφαλοπάθεια, αντανακλά τη χημειοτακτική, αιμοποιητική και νεοαγγειογενετική της δράση, αναδεικνύοντας το νευροπροστατευτικό της ρόλο. Η θετική συσχέτιση του IGF 1 στα τελειόμηνα νεογνά με τα ΚΠΚ αποτελεί ένδειξη του χημειοτακτικού του ρόλου. Τα μειωμένα επίπεδά του σε παθολογικές καταστάσεις ενδεχόμενα αντανακλούν την ανεπάρκεια της αναβολικής και προστατευτικής του δράσης. Στη μελέτη αυτή διαφάνηκε πως ο SDF 1 λειτουργεί ευοδωτικά για τους προγονικούς κυτταρικούς πληθυσμούς. Οι μεταβολές του ποσοστού έκφρασης του υποδοχέα του SDF 1 (CD184/CXCR4) επιβεβαιώνουν το πρότυπο κινητοποίησης που παρατηρήθηκε στα ΚΠΚ σε σχέση με τη βαρύτητα της εγκεφαλικής βλάβης: αύξηση στη μέτρια εγκεφαλοπάθεια και μείωση στη βαριά. Συμπερασματικά, μετά από εγκεφαλική βλάβη σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά παρατηρείται κινητοποίηση των προγονικών κυττάρων της περιφέρειας κατά ένα χημειοτακτικό τρόπο, με σκοπό την ενδογενή άμυνα έναντι του ισχαιμικού γεγονότος και την ανάπλαση μετά από την εγκατάσταση της ιστικής βλάβης. Όταν όμως η βλάβη είναι σοβαρή, ο μηχανισμός αυτός φαίνεται ότι ανεπαρκεί σε μεγάλο βαθμό τον πρώτο μήνα της ζωής, παρατήρηση που συνάδει με την εμφάνιση σοβαρότερων νευροαναπτυξιακών προβλημάτων σε αυτά τα παιδιά. Η εξωγενής χορήγηση προγονικών κυττάρων (ιδιαιτέρως) στη βαριά εγκεφαλοπάθεια ενδεχόμενα να αναπληρώσει την ενδογενή αδυναμία και να περιορίσει το βαθμό της εγκεφαλικής βλάβης. Σοβαροί παράμετροι που πρέπει να απαντηθούν πριν την κλινική εφαρμογή της μεταμόσχευσης προγονικών κυττάρων είναι ο βέλτιστος κυτταρικός υποπληθυσμός, η δόση, η οδός χορήγησης, ο χρόνος χορήγησης και η χρήση νευροτροφικών ουσιών. Η παρούσα εργασία με τη συνδυαστική μελέτη βιοδεικτών και Κυκλοφορούντων Προγονικών Κυττάρων σε πολλαπλά χρονικά στιγμιότυπα παρέχει βασικά στοιχεία παθοφυσιολογίας για την εξαγωγή χρήσιμων συμπερασμάτων σε αυτή την κατεύθυνση. Η εξατομικευμένη αναγεννητική ιατρική αποτελεί το μέλλον στη θεραπευτική αντιμετώπιση της νεογνικής εγκεφαλικής βλάβης.

167 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Summary Perinatal asphyxia and related neonatal encephalopathy are among the most common causes of neonatal death and long term neurological deficits (learning difficulties, mental retardation, epilepsy and cerebral palsy), both in preterm and fullterm neonates. Modern therapeutic strategies in newborns with brain injury involve only supportive care (with the exception of therapeutic hypothermia in fullterm neonates who are admitted in Neonatal Intensive Care Unit within the first 6 hours if life), and therefore neonatal encephalopathy remains a basic target for regenerative medicine. Indeed, numerous preclinical data in animal models and clinical studies in adults with brain injury have shown favorable results after exogenous administration of progenitor cells. Relevant clinical trials in neonates are underway. On the other hand, progenitor cells do exist endogenously as well, especially referring to newborns. Therefore, a critical question is raised: what is the role of endogenous progenitor cells in neonates after brain injury? Do they participate in the endogenous regeneration process? Do they alter their behavior in neonates with adverse neurological outcome? To answer these critical questions, a prospective cohort study in preterm and fullterm neonates was designed, which took place in the 1 st Neonatal Department of Aristotle University of Thessaloniki. 83 newborns were included in the present study (47 preterms and 36 fullterms) from December 2010 to November Neonates were observed from the first day of their life until they completed their second year of life (corrected age). Among preterms, 16 developed brain damage (II/III degree IVH, cystic PVL or infract), while 31 showed no apparent brain injury and served as preterm controls. Among fullterms, 13 developed moderate or severe encephalopathy, 11 developed mild encephalopathy, whereas 12 healthy neonates without any perinatal event comprised the group of fullterm controls. Peripheral blood was collected on days 1, 3, 9, 18 and 45 of life, as well as in the 8 th and 24 th month of life (corrected age). From these samples, Circulating Progenitor Cells (CPCs) were determined using Flow Cytometry, whereas brain injury markers (S100b and Neuronal Specific Enolase (NSE)) and chemoattractants/neurotrophic factors (erythropoietin (EPO) and Insulin like growth factor 1 (IGF 1)) were measured using Immunochemiluminometric Assay (ICMA). Additionally, on the same days chemoattractant Stromal cell Derived Factor 1 (SDF 1) was determined using ELISA. Regarding CPCs, cell populations of interest included Haematopoietic Stem Cells (HSCs, CD34 + /CD184 + /CD45 + ), Very Small Embryonic like Stem Cells (VSELs, CD34 + /CD184 + /CD45 ), early Endothelial Progenitor Cells (early EPCs, CD34 + /CD45 dim/ /CD184 + /CD133 + ) and late Endothelial Progenitor Cells (late EPCs, CD34 + /CD45 dim/ /CD184 + /CD133 + ). Perinatal characteristics and complications during the neonatal period were recorded, especially regarding neurological outcome. Preterms were assessed frequently using cranial ultrasound and all suspected brain injuries in preterms and fullterms were further elucidated using Magnetic Resonance Imaging (MRI) as appropriate. Quantification of lesions from MRI images was also

168 168 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ performed. Moreover, all available children when they completed their second year of life (corrected age) underwent neurodevelopmental examination using Bayley III test. To the best of our knowledge, this is the first study regarding kinetics of CPCs in fullterms. Additionally, compared to the few previous studies of CPCs kinetics in preterms, the present study differs because it was designed to investigate specifically the brain injury event. In particular, more time points were studied (seven for each child) and simultaneously levels of brain injury markers and chemoattractants/neurotrophic factors were assessed. Moreover, progenitor cells were more accurately identified using a constellation of surface markers, and a detailed neurodevelopmental and neuroimaging assessment was performed. The main results of the current study based on kinetics of Circulating Progenitor Cells, brain injury biomarkers and chemoattractants, are the following: Levels (percentages) of Haematopoietic Stem Cells, early and late Endothelial Progenitor Cells were found increased in preterm neonates with encephalopathy mainly in the first 9 days of life, compared to preterm controls. Regarding fullterms with moderate encephalopathy, all cell populations studied were increased compared to controls in the first 45 days of life, with the differences being more significant on days 1 and 3 of life. With the exception of late EPCs, CPCs proportions in fullterms with severe encephalopathy did not increase compared to controls, a pattern similar to that observed in moderate encephalopathy. On the contrary, they were often lower than the levels in controls. Levels of HSCs on day 45 and at the age of 8 months, VSELs at the age of 24 months, early and late EPCs on day 45 and at the age of 8 and 24 months were constantly increased in neonates with severe encephalopathy compared to controls. The differences though did not always reach statistical significance. Preterms with severe IVH had significantly increased VSELs at the age of 8 months, compared to controls. Among fullterm neonates with moderate/severe encephalopathy, those that underwent therapeutic hypothermia presented higher levels of HSCs and early EPCs on day 18. Preterms with late sepsis constantly had lower levels of HSCs and VSELs on days 1, 3, 9, 18 and 45, early EPCs on days 1, 3, and 18 and late EPCs on days 1, 18 and 45. Similarly in fullterms with late sepsis, borderline lower levels of VSELs on days 9,18 and 45 and late EPCs on days 3 and 9 were observed compared to neonates without sepsis. Prognostically, levels of HSCs lower than (of the total events in flow cytometry) on day 1 of life provided sensitivity of 100% and

169 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 169 specificity of 66.7% regarding the presence of late sepsis in preterms, whereas levels lower than on the same day provided sensitivity of 100% and specificity of 79.5%. Similarly in fullterms, the cut off levels for late EPCs on day 3 was and provided sensitivity of 100% and specificity of 87.1%. Preterms with necrotizing enterocolitis (NEC) had significantly lower levels of HSCs and early EPCs on day 3. Prognostically, levels of HSCs lower than on day 3 provided sensitivity of 66.7% and specificity of 66.7% regarding the occurrence of NEC in preterms, whereas levels of early EPCs lower than on the same day provided sensitivity of 66.7% and specificity of 70%. Chorioamnionitis was constantly correlated with lower levels of HSCs (on days 1, 9 and 18), VSELs (on day 3) and late EPCs (on days 3, 18 and 45) in preterms. Regarding brain injury biomarkers, S100b levels were increased in fullterms with severe encephalopathy on days 1 and 3, whereas in preterms with encephalopathy these levels were increased on day 1, compared to controls. Similarly, NSE levels were increased in fullterms with both moderate and severe brain injury in the first 18 days of life, whereas preterms with encephalopathy presented increased levels of NSE mainly on days 18 and 45. Prognostically, a cutoff for NSE of 38.8 μg/l on day 1 had high sensitivity and specificity (100% and 95.2% respectively) regarding the development of 2 nd or 3 rd degree encephalopathy in fullterms. The cut off level of 1.6 μg/l for S100b on the same day provided a sensitivity of 87.6% and specificity of 88.5% regarding the development of severe encephalopathy. All fullterms with adverse outcome (death or cerebral palsy) had levels of S100b higher than 11.4 μg/l on day 1. In preterms, a cut off level of 2.51 μg/l for S100b on day 1 could predict the development of severe IVH (III/IV degree). A pattern of special pathophysiological interest was observed regarding the correlation of biomarkers of brain injury with CPCs: positive correlations were found between NSE levels and CPCs and negative correlations between S100b levels and CPCs. Levels of brain injury markers were more increased in preterms with severe Respiratory distress syndrome (RDS) (3 rd /4 th degree), less in preterms without RDS and were even lower in preterms with mild RDS (1 st /2 nd degree). In preterms with encephalopathy, erythropoietin correlated positively with HSCs and late EPCs levels mainly measured on the following days. Similarly, positive correlations were also found between EPO and VSELs, early and late EPCs measured on the days following, especially in fullterm neonates with moderate/severe encephalopathy.

170 170 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ In fullterm neonates, IGF 1 correlated positively with all CPCs subtypes. Lower levels of IGF 1 were observed in perinatal stress, moderate/severe encephalopathy, severe IVH, sepsis, severe RDS, BPD, prolonged hospitalization and neonatal death. Chemoattractant SDF 1 correlated positively with HSCs, VSELs and early EPCs in preterms. A borderline correlation was also observed between SDF 1 and late EPCs in fullterm neonates. SDF 1 receptor (CD184/CXCR4) expression on CPCs surface was increased in fullterms with moderate encephalopathy on days 9, 18 and 45 compared to controls, whereas it was significantly reduced in cases of severe encephalopathy on days 3 and 9. The main conclusions of the current study, based on the abovementioned observations, are the following: There is a constant pattern of endogenous response following brain injury, involving basically all four progenitor cell types studied, both in preterms with brain injury and in fullterms with moderate encephalopathy. These findings suggest the existence of an endogenous defence and regeneration mechanism in neonates, in line with observations in preclinical models and in adult studies. Endogenous increase of Endothelial progenitor cells after tissue damage possibly reflects the neo angiogenesis process in the penumbra. The observed lack of mobilization of most types of CPCs in neonates with severe encephalopathy indicate a defficiency of the endogenous defence and regeneration mechanism after extensive tissue damage. Considering that severe encephalopathy is associated with most severe neurodevelopmental problems, we suggest that exogenous stem cell administration could counterbalance the endogenous insufficiency in neonates with 3 rd degree encephalopathy and would have favorable effects regarding reduction of tissue damage and neurological sequelae as observed in preclinical models. A late mobilization of CPCs was observed in fullterms with severe encephalopathy on day 45 and at the age of 8 and 24 months of life. Therefore, it seems that, despite the insufficient endogenous defence and regeneration mechanism in these neonates in the first month of life, a delayed relative process takes place and persists for several months, possibly in an effort to counterbalance the consequences of the extensive tissue damage. A similar late mobilization of VSELs was observed in preterms with severe IVH, indicating a prolonged regeneration process after severe tissue damage. We speculate that the presence of an active prolonged endogenous regeneration mechanism, both

171 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 171 in preterms and fullterms, outlines a possible therapeutic window that extends for several months after birth. Although the number of neonates that did not undergo therapeutic hypothermia is too small, our results indicate a more vivid mobilization after rewarming were observed in fullterms undergoing hypothermia and suggest that hypothermia possibly promotes endogenous regeneration mechanisms. The low levels of CPCs that were constantly observed in preterms and fullterms with sepsis as early as the first day of life and throughout the first 45 days, indicate that higher levels of CPCs could have a possible protective role. Also, HSCs and VSELs were proved to have good prognostic value. Similarly, chorioamnionitis was constantly correlated with lower levels of most progenitor cell subtypes studied during the first month of age. Moreover, higher levels of HSCs and early EPCs could possibly have a protective role regarding the occurrence of NEC, although their prognostic value was moderate. In the present study, S100b and NSE proved to be reliable biomarkers of brain injury in preterm and fullterm neonates, both diagnostically and prognostically. NSE proved to be a biomarker of brain injury with greater sensitivity than S100b, as it was increased proportionally in moderate and severe encephalopathy, whereas S100b increased only in severe brain damage. The positive correlations of erythropoietin with CPCs, mainly in neonates with encephalopathy, reflect the chemotactic, haematopoietic and neoangiogenetic properties of EPO underlining its neuroprotective role. In fullterm neonates, IGF 1 correlated positively with all CPCs subtypes, confirming its chemotactic role. The low levels of IGF 1 observed in neonates with various morbidities possibly reflect the inefficient protective role of this growth factor. In the present study SDF 1 was found to promote basically all CPCs subtypes. The changes of the expression of the surface receptor of SDF 1 (CD184/CXCR4) confirmed the mobilization pattern of CPCs in relation to the severity of encephalopathy: CPCs were robustly mobilized after moderate brain damage but not in severe encephalopathy. In conclusion, CPCs were mobilized in preterm and fullterm infants following brain injury in a chemotactic way, as part of an endogenous defence and regeneration mechanism against the hypoxic event and the related tissue damage. However, when the injury was severe, this mechanism was found to be insufficient in the first month of life, observation that is consistent with the occurrence of more severe neurodevelopmental deficits in these

172 172 Β) ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ children. It is possible that exogenous administration of progenitor cells in the future, especially in cases of severe encephalopathy, might reinforce this endogenous insufficiency, reduce the extent of brain injury and improve the clinical outcome. Before exogenous administration of progenitor cells will be applied in clinical practice, critical issues must be elucidated, including the ultimate cell subtype, dose, route of administration, the appropriate time of administration, as well as the use of neurotrophic factors. The present study offers important data in pathophysiology regarding the role of biomarkers and endogenous CPCs in consecutive time points. Personalized regeneration medicine could be the therapeutic strategy of choice in neonatal brain injury in the near future.

173 173 Παράρτημα Α Εικόνες * ποσοστό επί του συνόλου των παρατηρήσεων στην κυτταρομετρία ροής Εικόνα Α.1: Ποσοστά των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων στα πρόωρα νεογνά, διαχωρισμένα ανάλογα με την παρουσία σηψαιμίας

174 174 Παράρτημα Α Εικόνα Α.2: Καμπύλη ROC για τα επίπεδα HSCs και VSELs την 1 η ημέρα ζωής ως προς την εμφάνιση σηψαιμίας στη νεογνική περίοδο στα πρόωρα νεογνά Εικόνα Α.3: Καμπύλη ROC όσον αφορά την προγνωστική αξία των HSCs και eepcs της 3ης ημέρας ζωής σε σχέση με την έκβαση της νεκρωτικής εντεροκολίτιδας στα πρόωρα νεογνά

175 Παράρτημα Α 175 * ποσοστό επί του συνόλου των παρατηρήσεων στην κυτταρομετρία ροής Εικόνα Α.4: Ποσοστά των VSELs στα πρόωρα νεογνά σε σχέση με τη σοβαρότητα του Συνδρόμου Αναπνευστικής Δυσχέρειας (ΣΑΔ)

176 176 Παράρτημα Α * ποσοστό επί του συνόλου των παρατηρήσεων στην κυτταρομετρία ροής Εικόνα Α.5: Ποσοστά των VSELs στα πρόωρα νεογνά, διαχωρισμένα ανάλογα με την παρουσία σηψαιμίας

177 Παράρτημα Α 177 * ποσοστό επί του συνόλου των παρατηρήσεων στην κυτταρομετρία ροής Εικόνα Α.6: Κινητική των πρώιμων ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων στα πρόωρα, ανάλογα με την παρουσία όψιμης σηψαιμίας * ποσοστό επί του συνόλου των παρατηρήσεων στην κυτταρομετρία ροής Εικόνα Α.7: Κινητική των όψιμων ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων στα πρόωρα, ανάλογα με την παρουσία όψιμης σηψαιμίας

178 178 Παράρτημα Α Εικόνα Α.8: Καμπύλη ROC αναφορικά με την προγνωστική αξία των lepcs της 3 ης ημέρα ζωής σε σχέση με την έκβαση της σηψαιμίας στα τελειόμηνα νεογνά. Εικόνα Α.9: Καμπύλη ROC της S100b την 1 η εγκεφαλοπάθεια (ΥΙΕ) των τελειομήνων νεογνών ημέρα ζωής, ως προγνωστικό εργαλείο για τη σοβαρή

179 Παράρτημα Α 179 Εικόνα Α.10: Καμπύλη ROC της S100b την 1 η ημέρα ζωής στα τελειόμηνα, ως προγνωστικό εργαλείο για την εγκεφαλική παράλυση ή το θάνατο των τελειομήνων νεογνών Εικόνα Α.11: Καμπύλη ROC της S100b την 1 η ημέρα ζωής, ως προγνωστικό εργαλείο για την 3 ου και 4 ου βαθμού IVH στα πρόωρα νεογνά

180 180 Παράρτημα Α Εικόνα Α.12: Καμπύλη ROC της NSE την 1 η ημέρα ζωής, ως προγνωστικό εργαλείο για τη μέτρια ή σοβαρή εγκεφαλοπάθεια (ΥΙΕ) Εικόνα Α.13: Κινητική της ερυθροποιητίνης σε πρόωρα και τελειόμηνα νεογνά (μεγέθυνση στις κατώτερες τιμές της εικόνας 22)

181 Παράρτημα Α 181 α) β) γ) Εικόνα Α.14: Καμπύλες ROC της S100b την 1 η ημέρα ζωής στα τελειόμηνα νεογνά, ως προγνωστικό εργαλείο για την εμφάνιση σοβαρού ελλείμματος (<2 SD) κατά τη νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley III, α) στη γνωστική κλίμακα, β) στη κινητική κλίμακα και γ) στη λεκτική κλίμακα

182 182 Παράρτημα Α α) β) γ) δ) ε) στ) ζ) Εικόνα Α.15: Καμπύλες ROC της S100b την 1 η ημέρα ζωής στα τελειόμηνα νεογνά, ως προγνωστικό εργαλείο για την εμφάνιση ήπιου ελλείμματος (<1 SD) κατά τη νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley III, α) στη γνωστική κλίμακα, β) στη κινητική κλίμακα, γ) στη λεκτική κλίμακα, δ) στην υποκλίμακα της λεπτής κινητικότητας, ε) της αδρής κινητικότητας, στ) της έκφρασης του λόγου και ζ) της αντίληψης του λόγου.

183 Παράρτημα Α 183 α) β) γ) Εικόνα Α.16: Καμπύλες ROC της NSE την 3 η ημέρα ζωής στα τελειόμηνα νεογνά, ως προγνωστικό εργαλείο για την εμφάνιση σοβαρού ελλείμματος (<2 SD) κατά τη νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley III, α) στη γνωστική κλίμακα, β) στη κινητική κλίμακα και γ) στη λεκτική κλίμακα, α) β) Εικόνα Α.17: Καμπύλες ROC της NSE την 3 η ημέρα ζωής στα τελειόμηνα νεογνά, ως προγνωστικό εργαλείο για την εμφάνιση ήπιου ελλείμματος (<1 SD) κατά τη νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley III α) στην υποκλίμακα της λεπτής κινητικότητας και β) στην υποκλίμακα της αντίληψης του λόγου.

184 184 Παράρτημα Α Εικόνα Α.18: Καμπύλη ROC της S100b την 1 η ημέρα ζωής στα πρόωρα νεογνά, ως προγνωστικό εργαλείο για την εμφάνιση ήπιου ελλείμματος (<1 SD) κατά τη νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley III στην υποκλίμακα της αντίληψης του λόγου. α) β) Εικόνα Α.19: Καμπύλες ROC της NSE την 1 η ημέρα ζωής στα πρόωρα νεογνά, ως προγνωστικό εργαλείο για την εμφάνιση ήπιου ελλείμματος (<1 SD) κατά τη νευροαναπτυξιακή δοκιμασία Bayley III, α) στην κλίμακα του λόγου και β) στην υποκλίμακα της αντίληψης του λόγου.

185 Παράρτημα Α 185 α) β) Εικόνα Α.20: Καμπύλες ROC της S100b την 1 η ημέρα ζωής στα τελειόμηνα νεογνά, ως προγνωστικό εργαλείο για την εμφάνιση α) μέτριας ή σοβαρής βλάβης στα βασικά γάγγλια και β) σοβαρής παραοβελιαίας βλάβης. Εικόνα Α.21: Καμπύλη ROC της NSE την 45 η ημέρα ζωής στα πρόωρα νεογνά, ως προγνωστικό εργαλείο για την εμφάνιση μέτριας ή σοβαρής βλάβης στη μαγνητική τομογραφία.

186 186 Παράρτημα Α α) β) Εικόνα Α.22: α) Παραστατική απεικόνιση της αλυσίδας των παθοφυσιολογικών γεγονότων μετά από νευρωνική βλάβη: την πληροφορία της βλάβης λαμβάνουν τα κύτταρα του μικροπεριβάλλοντος των νευρώνων, δηλαδή τα αστροκύτταρα και το τοπικό ενδοθήλιο. Αυτά με τη σειρά τους εκκρίνουν χημειοτακτικές ουσίες (π.χ. τον SDF 1) στην κυκλοφορία με σκοπό την κινητοποίηση των προγονικών κυτταρικών σειρών που βρίσκονται σε κατάσταση ηρεμίας στο μυελό των οστών προς στη συστηματική κυκλοφορία, και την τελική τους χημειοτακτική προσέλκυση προς την ιστική βλάβη πίσω στον εγκέφαλο. β) Αδυναμία έκκρισης του χημειοτακτικού ερεθίσματος έπειτα από εκτεταμένη βλάβη και στο μικροπεριβάλλον των νευρώνων (αστροκύτταρα και ενδοθήλιο), και διακοπή της αλυσίδας χημειοταξίας.