2

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΝΕΥΡΟΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Α ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ Η ΚΥΤΤΑΡΟΑΡΧΙΤΕΚΤΟΝΙΚΗ ΚΑΙ ΟΙ ΣΥΝ ΕΣΕΙΣ ΤΟΥ ΚΕΡΚΟΦΟΡΟΥ ΠΥΡΗΝΑ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΚΑΙ ΟΙ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ ΤΟΥΣ ΣΤΗ ΝΟΣΟ ΤΟΥ ALZHEIMER ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ Ι. ΤΣΑΜΗΣ ΙΑΤΡΟΣ ΥΠΟΤΡΟΦΟΣ Ι.Κ.Υ. Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ Αριθµός ιατριβής 3010 ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2011

2 2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΝΕΥΡΟΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Α ΝΕΥΡΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ Η ΚΥΤΤΑΡΟΑΡΧΙΤΕΚΤΟΝΙΚΗ ΚΑΙ ΟΙ ΣΥΝ ΕΣΕΙΣ ΤΟΥ ΚΕΡΚΟΦΟΡΟΥ ΠΥΡΗΝΑ ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΚΑΙ ΟΙ ΑΛΛΟΙΩΣΕΙΣ ΤΟΥΣ ΣΤΗ ΝΟΣΟ ΤΟΥ ALZHEIMER ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ Ι. ΤΣΑΜΗΣ ΙΑΤΡΟΣ ΥΠΟΤΡΟΦΟΣ Ι.Κ.Υ. Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ

4 4

5 Τριµελής Συµβουλευτική Επιτροπή: 1. Καθηγητής ΣΤΑΥΡΟΣ Ι. ΜΠΑΛΟΓΙΑΝΝΗΣ (Επιβλέπων Καθηγητής) 2. Καθηγητής ΑΡΙΣΤΕΙ ΗΣ ΖΑΦΕΙΡΟΠΟΥΛΟΣ 3. Αναπλ. Καθηγήτρια ΠΕΡΣΕΦΟΝΗ ΠΑΠΠΑ-ΟΙΚΟΝΟΜΙ ΟΥ Επταµελής Εξεταστική Επιτροπή: 1. Καθηγητής ΣΤΑΥΡΟΣ Ι. ΜΠΑΛΟΓΙΑΝΝΗΣ 2. Καθηγητής ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΤΑΣΚΟΣ 3. Καθηγήτρια ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΚΩΣΤΑ 4. Καθηγητής ΑΡΙΣΤΕΙ ΗΣ ΖΑΦΕΙΡΟΠΟΥΛΟΣ 5. Καθηγήτρια ΣΕΒΑΣΤΗ ΜΠΟΣΤΑΤΖΟΠΟΥΛΟΥ 6. Αναπλ. Καθηγήτρια ΠΕΡΣΕΦΟΝΗ ΠΑΠΠΑ-ΟΙΚΟΝΟΜΙ ΟΥ 7. Επικ. Καθηγήτρια ΕΥΦΡΟΣΥΝΗ ΚΟΥΤΣΟΥΡΑΚΗ 5

6 6

7 Πρόλογος Η παρούσα µελέτη εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Νευροπαθολογίας της Α Νευρολογικής Κλινικής της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης κάτω από την άµεση καθοδήγηση και επίβλεψη του Καθ. κ. Σταύρου Μπαλογιάννη. Πρόκειται για παθολογοανατοµική µελέτη του κερκοφόρου πυρήνα στον ανθρώπινο εγκέφαλο, επικεντρωµένη στις συνάψεις των νευρώνων και στις συναπτικές αλλοιώσεις της νόσου του Alzheimer. Θεωρώ χρέος µου να ευχαριστήσω όλους όσους βοήθησαν στην πραγµατοποίηση της µελέτης αυτής. Πρωτίστως, τον Καθ. κ. Σταύρο Μπαλογιάννη ο οποίος µε ενέπνευσε και µε καθοδήγησε όχι µόνο κατά την εκπόνηση της διδακτορικής διατριβής, αλλά και πολύ πριν από αυτή, όταν από φοιτητή ακόµα µε µύησε στις αρχές της Νευρολογίας, της Νευροπαθολογίας και της έρευνας. Ευχαριστώ επίσης τα µέλη της Τριµελούς Συµβουλευτικής Επιτροπής καθώς και τα µέλη της Επταµελούς Εξεταστικής Επιτροπής για τις χρήσιµες παρατηρήσεις τους. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την Καθ. κ. Κώστα Βασιλική που ως επικεφαλής του Εργαστηρίου Νευροπαθολογίας συνέβαλε αποτελεσµατικά στην επίλυση κάθε πρακτικού και θεωρητικού προβλήµατος που ανέκυπτε στην πειραµατική διαδικασία. Ακόµα ευχαριστώ τους συνεργάτες στο Εργαστήριο Νευροπαθολογίας, Luc Flavien Bekale Adipepe, Ιωάννη Μαυρουδή και ηµήτριο Φωτίου για τις εποικοδοµητικές και ευχάριστες συζητήσεις πάνω σε θέµατα σχετικά µε την έρευνα και ιδιαίτερα το ηµήτριο Μυτιληναίο µε τον οποίο συµπορευτήκαµε τα τελευταία οκτώ χρόνια στο χώρο της Νευροπαθολογίας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους συνεργάτες από άλλα εργαστήρια, χωρίς τη συνδροµή των οποίων η ολοκλήρωση της παρούσας 7

8 διατριβής δεν θα ήταν δυνατή. Συγκεκριµένα ευχαριστώ τον Αναπλ. Καθ. κ. Τζάου Ντούγκου Σαµουήλ και τον Καθ. κ. Ψαρούλη ηµήτριο (Εργαστήριο Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας της Ιατρικής Σχολής του ΑΠΘ) που προσέφεραν µέρος του υλικού της µελέτης. Την κ. Χιωτέλη Μαρία και τον Καθ. κ. Ντινόπουλο Αθανάσιο, καθώς µέρος της προετοιµασίας των παρασκευασµάτων για το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο έγινε στο Εργαστήριο Ανατοµίας, Ιστολογίας και Εµβρυολογίας της Κτηνιατρική Σχολής του ΑΠΘ. Τον κ. Μυγδαλιά Γεώργιο και την Καθ. κ. Οικονόµου Λουίζα για τη µορφοµετρική µελέτη των συνάψεων στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο του Εργαστηρίου Ιστολογίας και Εµβρυολογίας της Ιατρική Σχολής του ΑΠΘ. Την κ. Χρυσάνθου Μαργαρίτα και την τ. Καθ. κ. Ισιδωρίδου Μαριέττα (Α Ψυχιατρική Κλινική της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστηµίου Αθηνών, Αιγινήτειο Νοσοκοµείο) για τη βοήθειά τους στον καθορισµό του πρωτοκόλλου προετοιµασίας κατεψυγµένων ιστών για ηλεκτρονική µικροσκόπηση. Την Επικ. Καθ. κ. Νικολακάκη Ελένη και τον Αναπλ. Καθ. κ. Γιαννακούρο Θωµά (Εργαστήριο Βιοχηµείας του Τµήµατος Χηµείας της Σχολής Θετικών Επιστηµών του ΑΠΘ) για τη χρήσιµη και εποικοδοµητική συζήτηση σχετικά µε το εναλλακτικό µάτισµα των γλουταµατεργικών υποδοχέων. Την κ. Κεµερλή Μαρία και την κ. Σκεµπάρη Κάρµεν (Εργαστήριο Παθολογικής Ανατοµίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστηµίου Αθηνών) για τη συµβολή τους στην προετοιµασία των παρασκευασµάτων ανοσοϊστοχηµείας. εν παραλείπω να ευχαριστήσω τις τράπεζες εγκεφάλων Netherlands Brain Bank και Brain Bank Münich που προσέφεραν το µεγαλύτερο µέρος από το υλικό της µελέτης. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά µου, τη σύζυγο, τα παιδιά και τους γονείς µου, χωρίς την υλική και ηθική συµπαράσταση των οποίων δε θα ήταν ποτέ δυνατή η πραγµατοποίηση της µελέτης αυτής. 8

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 Κερκοφόρος Πυρήνας Μακροσκοπική Ανατοµία Ιστολογία Κυτταροαρχιτεκτονική Νευροδιαβιβαστές και Υποδοχείς Συνδέσεις Λειτουργία - Παθολογία 1.2 Νόσος του Alzheimer Κλινική Εικόνα ιάγνωση Πρόληψη Αντιµετώπιση Αιτιοπαθογένεια Νευροπαθολογικές Αλλοιώσεις 1.3 Σκοπός της µελέτης ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.1 Ασθενείς και Μάρτυρες 2.2 Μέθοδοι Ταχεία µέθοδος Golgi Ανοσοϊστοχηµεία Ηλεκτρονική Μικροσκόπηση Μέθοδοι Nissl Nauta Gallyas Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Ταχεία µέθοδος Golgi 3.2 Ανοσοϊστοχηµεία 3.3 Ηλεκτρονική Μικροσκόπηση

10 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1 Συνοπτική παρουσίαση των αποτελεσµάτων της µελέτης 4.2 Συζήτηση επί των κυριότερων σηµείων που προκύπτουν από τη µελέτη 4.3 Συµπεράσµατα ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΑΝΑΦΟΡΕΣ

11 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 11

12 1.1 Κερκοφόρος Πυρήνας Μακροσκοπική Ανατοµία Ο κερκοφόρος πυρήνας είναι υποφλοιώδης σχηµατισµός των ηµισφαιρίων του εγκεφάλου. Ανήκει στα βασικά γάγγλια και µαζί µε το κέλυφος του φακοειδούς πυρήνα αποτελούν το ραβδωτό σώµα (Εικόνα 1). Στα βασικά γάγγλια εκτός από το ραβδωτό σώµα ανήκει η ωχρά σφαίρα (έσω και έξω µοίρα), η µέλαινα ουσία (συµπαγής και δικτυωτή µοίρα) και ο υποθαλαµικός πυρήνας ή υποθαλάµιο σωµάτιο του Luys. Το ραχιαίο τµήµα του ραβδωτού σώµατος, όπου ο κερκοφόρος πυρήνας µε το κέλυφος φακοειδούς διαχωρίζονται από το πρόσθιο σκέλος της έσω κάψας, αποκαλείται νεοραβδωτό σώµα (neostriatum) ή ραχιαίο ραβδωτό σώµα (dorsal striatum). Κοιλιακώς οι δύο πυρήνες ενώνονται στο κοιλιακό ραβδωτό σώµα (ventral striatum), στο οποίο περιλαµβάνεται και ο επικλινής πυρήνας (nucleus accumbens) και µέρος του οσφρητικού συστήµατος (οσφρητικό φύµα, olfactory tubercle). Χωρίζεται σε τρία µέρη ο κερκοφόρος πυρήνας, την κεφαλή, το σώµα και την ουρά. Η κεφαλή είναι πιο διευρυµένη και ο όγκος του πυρήνα προοδευτικά µειώνεται στο σώµα και την ουρά (Εικόνα 2). Βρίσκεται ο κερκοφόρος πυρήνας σε κάθε ηµισφαίριο στο έξω πλάγιο τοίχωµα της πλάγιας κοιλίας. Η κεφαλή του εντοπίζεται στο τοίχωµα του µετωπιαίου κέρατος της πλάγιας κοιλίας, το σώµα του κερκοφόρου πυρήνα στο τοίχωµα του σώµατος της πλάγια κοιλίας και η ουρά του φέρεται προς τα πίσω, κάτω και έξω ακολουθώντας τη στροφή της κοιλίας µέχρι την οροφή του κροταφικού κέρατος αυτής (1, 2). 12

13 Κεφαλή κερκοφόρου πυρήνα Κέλυφος φακοειδούς πυρήνα Θάλαµος Ουρά κερκοφόρου πυρήνα Εικόνα 1. Νεκροτοµικό παρασκεύασµα αριστερού ηµισφαιρίου εγκεφάλου ανθρώπου σε στεφανιαία τοµή. 13

14 Σώµα κερκοφόρου πυρήνα Ουρά κερκοφόρου πυρήνα Κεφαλή κερκοφόρου πυρήνα Εικόνα 2. Νεκροτοµικό παρασκεύασµα κερκοφόρου πυρήνα από το αριστερό ηµισφαίριο ανθρώπινου εγκεφάλου αποµονωµένο από γειτονικές δοµές. Έσω όψη Ιστολογία Κυτταροαρχιτεκτονική Από ιστολογικής απόψεως, µελέτες µε τη µέθοδο Nissl από την αρχή του προηγούµενου αιώνα, κατέτασσαν τους νευρώνες του κερκοφόρου πυρήνα µε βάση το µέγεθος και την αδρή µορφολογία του κυτταρικού σώµατος σε δύο 14

15 (3, 4, υποπληθυσµούς, σε µικρούς και µεγάλους νευρώνες 5). Μελέτες εµποτισµού των κυττάρων µε άλατα του αργύρου (µέθοδος Golgi) χρησιµοποίησαν χαρακτηριστικά του δενδριτικού πεδίου, των ακανθών και του κυτταρικού σώµατος για τη λεπτοµερή περιγραφή των µορφολογικών χαρακτηριστικών των νευρώνων και την ταξινόµησή τους. Αντίστοιχες µελέτες πραγµατοποιήθηκαν σε διάφορα είδη και στον άνθρωπο (6 10). Παρόλο που παρουσιάζουν πολλά κοινά στοιχεία δεν υπάρχει οµοφωνία στην µορφολογική ταξινόµηση των κυττάρων ούτε στο ίδιο είδος ούτε και πολύ περισσότερο σε διαφορετικά είδη (11). Ο κυρίαρχος τύπος κυττάρων που απαντάται στον κερκοφόρο πυρήνα στον άνθρωπο, σε ποσοστό έως και 95% του συνολικού κυτταρικού πληθυσµού, είναι οι µέσου µεγέθους ακανθώδεις νευρώνες (medium size spiny neurons) (8, 10, 12, 13). Το κυτταρικό τους σώµα έχει διάµετρο µm και από αυτό εκτείνονται τρεις έως δέκα πρωτογενείς δενδρίτες. Το αρχικό τµήµα των δενδριτών είναι διευρυµένο και ελεύθερο από άκανθες, αλλά γρήγορα διακλαδίζονται δίνοντας δευτερογενείς και τριτογενείς δενδρίτες, οι οποίοι είναι καλυµµένοι από πολυάριθµες δενδριτικές άκανθες. Περιγράφεται επίσης υποπληθυσµός των ακανθωδών κυττάρων, σε ποσοστό 1 3% του συνολικού κυτταρικού πληθυσµού, µε µεγαλύτερο κυτταρικό σώµα (διαµέτρου έως 30µm), µικρότερη συγκέντρωση ακανθών στους δενδρίτες και περιστασιακά παρατηρούµενες σωµατικές άκανθες. Οι νευρώνες αυτοί ταξινοµήθηκαν από τους Braak και Braak (8) σε δύο διαφορετικούς τύπους, µέσου έως µεγάλου µεγέθους ακανθώδεις νευρώνες και µεγάλοι νευρώνες µε ελάχιστες άκανθες. Για την ταξινόµησή τους αυτή, οι συγγραφείς χρησιµοποίησαν και χαρακτηριστικά του κυτταρικού σώµατος, από την εντόπιση κοκκίων χρωστικής και λιποφουσκίνης. Οι Graveland και συν. (10) ενέταξαν τους νευρώνες αυτούς σε ένα µόνο πληθυσµό χαρακτηρίζοντας τους ως µέσου και µεγάλου µεγέθους ακανθώδη κύτταρα. Οι Yelnik και συν. (13) περιέγραψαν 15

16 νευρώνες µε µεγάλο κυτταρικό σώµα, µικρό αριθµό δενδριτών µε µεγάλο µήκος και ελάχιστες άκανθες ως ένα ξεχωριστό κυτταρικό τύπο (Εικόνα 3). Ανέφεραν, όµως, ότι υπήρχαν στα παρασκευάσµατά τους νευρώνες µε χαρακτηριστικά ενδιάµεσα από τα κύτταρα αυτά και τα τυπικά µέσου µεγέθους ακανθώδη κύτταρα. Σε µικρή συγκέντρωση απαντώνται στον κερκοφόρο πυρήνα νευρώνες των οποίων οι δενδρίτες έχουν ελάχιστες ή καθόλου άκανθες (aspiny neurons). Οι νευρώνες αυτοί διακρίνονται σε µικρού µεγέθους (1 2%) και µεγάλου µεγέθους (1 2%), µε κυτταρικό σώµα διαµέτρου 10 15µm και 30 50µm, αντίστοιχα (8, 13). Στην πρώτη οµάδα νευρώνων οι δενδρίτες παρουσιάζουν κοµβολογιοειδείς διευρύνσεις και µε τις διακλαδώσεις τους και τη συνεστραµµένη πορεία τους δηµιουργούν ένα πυκνό δίκτυο σε µικρή απόσταση από το κυτταρικό σώµα. Τους νευρώνες αυτούς οι Graveland και συν. (10) διέκριναν περαιτέρω σε δύο υποοµάδες, µικρού και µέσου µεγέθους, µε διάµετρο κυτταρικού σώµατος 10µm και 15µm, αντίστοιχα. Οι µεγάλοι νευρώνες έχουν 3 µέχρι 14 πρωτογενείς δενδρίτες οι οποίοι µε τις πολλαπλές διακλαδώσεις τους δηµιουργούν επίσης πυκνό δίκτυο µε ακτίνα περίπου 300 µm. Μελέτες που έχουν γίνει στο ραβδωτό σώµα σε διάφορα είδη θηλαστικών, κυρίως σε τρωκτικά και πρωτεύοντα, παρουσιάζουν αντιστοιχίες στα µορφολογικά χαρακτηριστικά των νευρώνων και στην ταξινόµησή τους µε αυτές στον άνθρωπο. Οι µέσου µεγέθους ακανθώδεις νευρώνες περιγράφονται σταθερά από όλους τους συγγραφείς σε όλα τα είδη που µελετήθηκαν ως οι 16

17 Εικόνα 3. Κύριοι τύποι νευρώνων του ραβδωτού σώµατος των πρωτευόντων όπως περιγράφονται από τους Yelnik και συν., σε απεικόνιση µε camera lucida. Α. Μέσου µεγέθους ακανθώδεις νευρώνες (Spiny neurons). B. Μέσου - µεγάλου µεγέθους νευρώνες µε µικρό αριθµό δενδριτών, οι οποίοι έχουν µεγάλο µήκος και ελάχιστες άκανθες (Leptodendritic neurons). C. Μεγάλου µεγέθους νευρώνες µε 17

18 κυρίαρχοι νευρώνες του ραβδωτού σώµατος. Για τους υπόλοιπους νευρώνες ωστόσο η ακριβής ταξινόµηση σε οµάδες µε βάση αυστηρά µορφολογικά κριτήρια είναι πολύ δύσκολη. Αυτό οφείλεται στη µικρή συγκέντρωση των κυττάρων αυτών και στην πολυµορφία τους, καθώς και στη χρησιµοποίηση από τους ερευνητές διαφορετικών µεθόδων. Στον Πίνακα 1 φαίνονται αντιστοιχίες ανάµεσα στους κυτταρικούς πληθυσµούς που έχουν περιγραφεί σε διαφορετικές µελέτες (6 8, 10, 13 15). Σχετικά µε τους νευράξονες των παραπάνω κυτταρικών πληθυσµών στον ανθρώπινο εγκέφαλο, τα δεδοµένα που υπάρχουν µέχρι σήµερα προέρχονται είτε από µελέτες εµποτισµού µε τη µέθοδο Golgi σε ανθρώπινα παρασκευάσµατα είτε έµµεσα από πειραµατικά δεδοµένα σε αντίστοιχους κυτταρικούς πληθυσµούς άλλων ειδών. Έτσι, είναι γνωστό ήδη από το 1980 περίπου ότι τα µέσου µεγέθους ακανθώδη κύτταρα είναι προβολικοί νευρώνες και έχουν νευράξονες που αποτελούν το κύριο απαγωγό σύστηµα του κερκοφόρου πυρήνα καταλήγοντας στην ωχρά σφαίρα και στην µέλαινα ουσία (16 18). Οι άξονες αυτοί πριν οδηγηθούν εκτός του ραβδωτού σώµατος χορηγούν παράπλευρους τοπικούς κλάδους που καταλήγουν σε άλλα ακανθώδη κύτταρα (19, 20). Για τους νευρώνες χωρίς λείους δενδρίτες που δηµιουργούν ένα πυκνό πεδίο µε τις πολυάριθµες διακλαδώσεις και τη συνεστραµµένη τους πορεία (Spidery neurons). D. Μικρού - µέσου µεγέθους νευρώνες µε λείους δενδρίτες που έχουν πυκνό δενδριτικό πεδίο σε µικρή απόσταση από το κυτταρικό σώµα (Microneurons). (13). 18

19 δενδριτικές άκανθες (aspiny neurons) έχει επικρατήσει η άποψη ότι οι νευράξονές τους εξαντλούνται εντός των ορίων του ραβδωτού σώµατος εξυπηρετώντας στη δηµιουργία τοπικών ανασταλτικών κυκλωµάτων µε τα ακανθώδη κύτταρα (14, 21, 22). Για τους µεγαλύτερους, όµως, από τους νευρώνες χωρίς άκανθες έχει υποστηριχθεί η ύπαρξη συνδέσεων τόσο εντός όσο και εκτός του ραβδωτού σώµατος, κυρίως στο φλοιό των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων (23 28). Παρόλα αυτά, στη διεθνή βιβλιογραφία φαίνεται να έχει επικρατήσει η άποψη ότι οι νευρώνες αυτοί είναι ενδιάµεσοι (20, 22, 29 31). Αυτό µπορεί να οφείλεται είτε στους πολυάριθµους παράπλευρους κλάδους των νευραξόνων τους εντός του ραβδωτού σώµατος είτε στην ύπαρξη δύο ή περισσότερων υποπληθυσµών µε διαφορετικές ιδιότητες και συνδέσεις. Για τις οµάδες νευρώνων µε ενδιάµεσα χαρακτηριστικά στο µέγεθος κυτταρικού σώµατος και στη πυκνότητα των δενδριτικών ακανθών, οι οποίοι έχουν περιγραφεί στις µορφολογικές µελέτες, δεν υπάρχουν επαρκή δεδοµένα για το αν οι νευράξονές τους συµµετέχουν στα τοπικά κυκλώµατα ή εκτείνονται εκτός του ραβδωτού σώµατος (31). Οι παραπάνω νευρώνες του κερκοφόρου πυρήνα δεν είναι οµοιόµορφα κατανεµηµένοι αλλά είναι οργανωµένοι σε νησίδια και ενδιάµεση ουσία (striosomes matrix). Αυτή η διαµερισµατοποίηση αρχικά παρατηρήθηκε µε ανοσοϊστοχηµικές µελέτες της κατανοµής της ακετυλοχολινεστεράσης στον άνθρωπο, τον πίθηκο και τη γάτα (32). Μεταγενέστερες µελέτες επιβεβαίωσαν την ύπαρξη διαµερισµατοποίησης και σε άλλα είδη στην κατανοµή νευροδιαβιβαστών, υποδοχέων νευροδιαβιβαστών και νευροπεπτιδίων εγκεφαλίνη, σωµατοστατίνη, νευροτενσίνη, καλβιδίνη, τυροσίνη-υδροξυλάση, ουσία P, παρβαλβουµίνη, υποδοχείς οπιοειδών, διεγειρόντων αµινοξέων και ντοπαµίνης (33 50). Επιπροσθέτως παρατηρήθηκε 19

20 Πίνακας 1. Συσχέτιση των νευρωνικών πληθυσµών του κερκοφόρου πυρήνα που περιγράφονται στα αποτελέσµατα της παρούσας µελέτης µε αυτούς που έχουν περιγραφεί σε προγενέστερες µελέτες Graveland και συν Rafols και συν Kemp και Powell 1971 DiFiglia και συν Braak και Braak 1982 Takagi και συν Yelnik και συν Παρούσα µελέτη Είδος Άνθρωπος Πρωτεύοντα Επίµυς Άνθρωπος Πίθηκος Γάτα Επίµυς Άνθρωπος Spiny type I Medium spiny neurons Medium size spiny cells Spiny type I Type I - Spiny neurons Μέσου µεγέθους µε υψηλή πυκνότητα δενδριτικών ακανθών Spiny type IΙ Medium neurons with fewer dendritic spines Spiny type IΙ Type II - Intermediate neurons Μέσου - µεγάλου µεγέθους µε χαµηλή πυκνότητα δενδριτικών ακανθών Ακανθώδεις νευρώνες (spiny neurons) Spindleshaped, medium-size aspiny 20 Aspiny type Ι Small aspiny neurons Medium size aspiny cells Aspiny type Ι and III Type V Roundshaped, medium-size aspiny Microneurons Μικρού - µέσου µεγέθους Νευρωνικοί Πληθυσµοί Κερκοφόρου Πυρήνα Aspiny type II Large neurons with many dendrites Giant cells Aspiny type II Type III Spidery neurons Πυκνό δενδριτικό πεδίο µικρής έκτασης Νευρώνες µε ελάχιστες ή καθόλου δενδριτικές άκανθες (aspiny neurons) Giant aspiny Μεγάλου µεγέθους Large neurons with fewer dendrites Spiny type IΙ Type IV Leptodendriti c neurons Αραιό δενδριτικό πεδίο µεγάλης έκτασης

21 ότι οι νευρώνες των δύο διαφορετικών διαµερισµάτων εγκαθιστούν συνδέσεις µε διαφορετικές δοµές του εγκεφάλου (51 62) Νευροδιαβιβαστές και Υποδοχείς Οι µέσου µεγέθους ακανθώδεις νευρώνες του ραβδωτού σώµατος χρησιµοποιούν γ-άµινο-βουτυρικό οξύ ως κύριο νευροδιαβιβαστή (GABAεργικοί νευρώνες) (63). Ανοσοϊστοχηµικές µελέτες χωρίζουν τα µέσου µεγέθους ακανθώδη κύτταρα σε δύο υποπληθυσµούς, ανάλογα µε τα νευροπεπτίδια που χρησιµοποιούν ουσία P και δυνορφίνη ή εγκεφαλίνη (36, 43). Ο κύριος νευροδιαβιβαστής που χρησιµοποιούν οι µικρού µέσου µεγέθους ενδιάµεσοι νευρώνες µε λείους δενδρίτες είναι επίσης το γ-άµινο-βουτυρικό οξύ (GABA). ιακρίνονται περαιτέρω σε τρεις τουλάχιστον υπότυπους που περιέχουν παρβαλβουµίνη, καλρετινίνη και σωµατοστατίνη, αντίστοιχα (30, 37, 54, 64 67). Οι νευρώνες αυτοί δηµιουργούν ένα πυκνό τοπικό δίκτυο (local circuit neurons) µε τις συνδέσεις τους στους ακανθώδεις νευρώνες (10, 14, 29, 31, 68). Οι µεγάλου µεγέθους νευρώνες του κερκοφόρου πυρήνα µε ελάχιστες ή και καθόλου δενδριτικές άκανθες έχουν αναγνωριστεί ως χολινεργικοί νευρώνες από ανοσοϊστοχηµικές µελέτες µε χολίνη-ακέτυλο-τρανσφεράση (ChAT) και ακέτυλο-χολίνεστεράση (AChE) (30, 69, 70). Όσον αφορά τους υποδοχείς νευροδιαβιβαστών, στους νευρώνες του ραβδωτού σώµατος έχουν εντοπισθεί υποδοχείς των διεγειρόντων αµινοξέων, ντοπαµίνης, σεροτονίνης, γ-αµινο-βουτυρικού οξέος, ακετυλοχολίνης και οπιοειδών. Οι υποδοχείς των διεγειρόντων αµινοξέων διακρίνονται σε ιονοτροπικούς και µεταβοτροπικούς (ionotropic metabotropic). Οι ιονοτροπικοί διακρίνονται περαιτέρω στους NMDA και µη-nmda υποδοχείς, στους οποίους ανήκουν οι AMPA και οι Kainate υποδοχείς. Για τους NMDA 21

22 υποδοχείς υπάρχουν επτά διαφορετικές υποµονάδες που κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια (NR1, NR2A NR2D and NR3A NR3B), οι οποίες συνδυαζόµενες διαµορφώνουν τετραµερή. Οι λειτουργικοί NMDA υποδοχείς είναι τετραµερή των παραπάνω υποµονάδων που περιέχουν τουλάχιστον µια υποµονάδα NR1. Το γονίδιο της NR1 υφίσταται εκτεταµένο εναλλακτικό µάτισµα µε αποτέλεσµα τη δηµιουργία οκτώ διαφορετικών υπότυπων (NR1-1a,1b to NR1-4a,4b) (71). NMDA υποδοχείς εντοπίζονται στην πλειονότητα των νευρώνων του ραβδωτού σώµατος (Εικόνα 4), όπως περιγράφεται από ανοσοϊστοχηµικές µελέτες στον άνθρωπο και σε άλλα είδη θηλαστικών (72 77). Οι AMPA υποδοχείς είναι τετραµερή που δηµιουργούνται από συνδυασµούς των υποµονάδων GluR1, GluR2, GluR3 και GluR4. Κάθε µια από τις υποµονάδες αυτές εντοπίζεται σε δύο διαφορετικές µορφές (flip flop) που προκύπτουν από εναλλακτικό µάτισµα των γονιδίων που τις κωδικοποιούν (78, 79). Ανοσοϊστοχηµικές µελέτες περιγράφουν την εντόπιση των υποµονάδων GluR1 4 σε διαφορετικά ποσοστά στους νευρωνικούς πληθυσµούς του κερκοφόρου πυρήνα (Εικόνα 4) (77, 80 83). Επίσης, έχει περιγραφεί και η εντόπιση ιονοτροπικών υποδοχέων Kainate στο ραβδωτό σώµα (84, 85). Για τους µεταβοτροπικούς υποδοχείς έχουν βρεθεί οκτώ διαφορετικοί υπότυποι (mglur1 8) που κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια και ταξινοµούνται σε τρεις κατηγορίες Group I (mglur1 και 5), Group II (mglur2 και 3) και Group IIΙ (mglur4,6,7 και 8) (86, 87). Οι Group II και III υποδοχείς στον κερκοφόρο πυρήνα εντοπίζονται κυρίως στις προσυναπτικές µεµβράνες των τελικών κοµβίων (88, 89). Οι Group I υποδοχείς εντοπίζονται τόσο στους προβολικούς όσο και στους ενδιάµεσους νευρώνες του ραβδωτού σώµατος, σύµφωνα µε ανοσοϊστοχηµικές µελέτες σε επίµυες (90 93). Οι υποδοχείς ντοπαµίνης είναι υποδοχείς συνδεδεµένοι µε G πρωτεΐνη και διακρίνονται σε πέντε τύπους (D1 D5), οι οποίοι οµαδοποιούνται σε δύο κατηγορίες την D1, όπου ανήκουν οι D1 και D5, και την D2, όπου ανήκουν 22

23 οι D2, D3 και D4 (94, 95). Οι νευρώνες του ραβδωτού σώµατος εκφράζουν υποδοχείς ντοπαµίνης. Οι υποδοχείς της οµάδας D1 εντοπίζονται κυρίως στους νευρώνες των νησιδίων ενώ της οµάδας D2 στην ενδιάµεση ουσία (43, 54). Οι δενδριτικές άκανθες των µέσου µεγέθους ακανθωδών κυττάρων δηµιουργούν συνάψεις µε ντοπαµινεργικούς νευράξονες όπως και µε νευράξονες που απελευθερώνουν γλουταµινικό οξύ. Μελέτες σε υποκυτταρικό επίπεδο υποστηρίζουν την αλληλεπίδραση ντοπαµίνης και διεγειρόντων αµινοξέων στις άκανθες των νευρώνων του ραβδωτού σώµατος, καθώς έχει παρατηρηθεί εντόπιση και των δύο υποδοχέων σε συνάψεις στις ίδιες άκανθες (96 98). Εικόνα 4. Ανοσοϊστοχηµική εντόπιση ιονοτροπικών υποδοχέων του γλουταµινικού οξέος στους νευρώνες του ραβδωτού σώµατος στον αρουραίο. Η πλειονότητα των νευρώνων είναι ανοσοθετικοί τόσο για την υποµονάδα NMDAR1 των NMDA υποδοχέων (Α) όσο και για τις υποµονάδες GluR 2 και 3 των AMPA υποδοχέων (Β). Σε ορισµένους νευρώνες το αρχικό τµήµα των δενδριτών είναι επίσης ανοσοσεσηµασµένο (βέλη). NS: Νεοραβδωτό σώµα (Neostriatum), mnr1: αντίσωµα για την υποµονάδα NMDAR1 των NMDA υποδοχέων από ποντικούς (mouse), GluR2/3: αντίσωµα για τις υποµονάδες GluR 2 και 3 των AMPA υποδοχέων. Κλίµακα: 10 µm. (77). 23

24 Οι υποδοχείς του GABA διακρίνονται σε δύο τύπους, GABA-A (ιονοτροπικοί) και GABA-B (µεταβοτροπικοί). Για τους GABA-A υποδοχείς έχουν βρεθεί 15 υποµονάδες που κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια και δηµιουργούν λειτουργικούς υποδοχείς µε συνδυασµούς ως πενταµερή (71). Στον κερκοφόρο πυρήνα απαντώνται κυρίως στις µετασυναπτικές µεµβράνες και οι νευρωνική πληθυσµοί εκφράζουν µια πληθώρα υποµονάδων των GABA-A υποδοχέων σύµφωνα µε ανοσοϊστοχηµικές µελέτες σε επίµυες (99 102). Οι GABA-B υποδοχείς είναι διµερή που δηµιουργούνται από τις υποµονάδες GABA-B1 και GABA-B2 ( ). Ανοσοϊστοχηµικές µελέτες στο ραβδωτό σώµα στον άνθρωπο, σε τρωκτικά και σε πρωτεύοντα καταδεικνύουν την ύπαρξη και των δύο υποµονάδων στους µέσου µεγέθους ακανθώδεις νευρώνες ( ). Ωστόσο, µελέτες µε in situ υβριδισµό δείχνουν ένδεια των νευρώνων του ραβδωτού σώµατος σε mrna για την GABA-B2 υποµονάδα. (108, 109). Περαιτέρω µελέτες µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο εντοπίζουν τους λειτουργικούς GABA-B υποδοχείς σε προσυναπτικές µεµβράνες γλουταµατεργικών νευραξόνων (110), υπογραµµίζοντας τη σηµασία τους για τη ρύθµιση των διεγερτικών συνάψεων. Για την σεροτονίνη (5-HT) έχουν περιγραφεί 14 διαφορετικοί υποδοχείς οι οποίοι ταξινοµούνται σε επτά οµάδες (5-ΗΤ[1] έως 5-ΗΤ[7]) µε βάση τα δοµικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά τους (111). Στο ραβδωτό σώµα έχει περιγραφεί η εντόπιση διαφόρων τύπων υποδοχέων σεροτονίνης, κυρίως στα κυτταρικά σώµατα και στους δενδρίτες και σπανιότερα στις άκανθες των νευρώνων (112, 113). Οι υποδοχείς ακετυλοχολίνης διακρίνονται σε µουσκαρινικούς και νικοτινικούς, οι οποίοι απαντώνται στις νευροµυϊκές συνάψεις των λείων και των γραµµωτών µυϊκών ινών, αντίστοιχα. Και οι δύο τύποι υποδοχέων εντοπίζονται επίσης στο κεντρικό νευρικό σύστηµα (114, 115). Οι µουσκαρινικοί 24

25 είναι υποδοχείς που συνδέονται µε G-πρωτεΐνες και διακρίνονται σε πέντε υπότυπους, που κατηγοριοποιούνται σε δύο οµάδες, την Μ1 (στην οποία ανήκουν οι Μ1, Μ3 και Μ5) και την Μ2 (στην οποία ανήκουν οι Μ2 και Μ4) (116). Στο ραβδωτό σώµα εντοπίζονται κυρίως οι Μ1 και Μ4 υποδοχείς και σε µικρότερα ποσοστά οι Μ2, Μ3 και Μ5. Οι Μ4 υποδοχείς βρίσκονται κυρίως στην προσυναπτική µεµβράνη των χολινεργικών νευραξόνων συµµετέχοντας στην αυτορύθµιση της έκκρισης ακετυλοχολίνης από τους τοπικούς κλάδους των χολινεργικών νευρώνων ( ). Για τους νικοτινικούς υποδοχείς έχουν χαρακτηριστεί δώδεκα υποµονάδες που συνδυαζόµενες δηµιουργούν τα πενταµερή των λειτουργικών υποδοχέων. Οι υποµονάδες αυτές κατηγοριοποιούνται σε δύο κλάσεις, α (α2 έως α10) και β (β2, β3 και β4) (114, 120). Οι νικοτινικοί υποδοχείς στο ραβδωτό σώµα εντοπίζονται κυρίως στη µεµβράνη των ντοπαµινεργικών νευραξόνων, ρυθµίζοντας την έκκριση ντοπαµίνης (114, ). Στο ραβδωτό σώµα εκφράζονται, επίσης, ευρέως υποδοχείς οπιοειδών και η κατανοµή τους ακολουθεί τη διαµερισµατοποίηση σε νησίδια και ενδιάµεση ουσία (36, 38). Οι υποδοχείς οπιοειδών διακρίνονται στους δ, τους µ και τους κ, από τους οποίους όλοι εκφράζονται στον κερκοφόρο πυρήνα, σε µεγαλύτερα όµως ποσοστά οι δύο πρώτοι (124, 125). Η ενεργοποίηση των υποδοχέων αυτών γίνεται κυρίως από τις ενδορφίνες και τις εγκεφαλίνες και συµβάλει στη ρύθµιση της λειτουργίας των χολινεργικών νευρώνων και της απελευθέρωσης ντοπαµίνης στο ραβδωτό σώµα (33, 125). Επίσης, υποπληθυσµοί νευρώνων του ραβδωτού σώµατος εκφράζουν υποδοχείς για τη ουσία P καθώς και υποδοχείς σωµατοστατίνης (128). (126, 127) 25

26 1.1.4 Συνδέσεις Το νεοραβδωτό σώµα δέχεται διεγερτικές συνδέσεις που προέρχονται από το νεόφλοιο και χρησιµοποιούν ως νευροδιαβιβαστή το γλουταµινικό οξύ. Αυτές οι ίνες προέρχονται κατά κύριο λόγο από τα πυραµιδικά κύτταρα της πέµπτης στιβάδας του φλοιού και καταλήγουν στα µέσου µεγέθους ακανθώδη κύτταρα του κερκοφόρου πυρήνα και συγκεκριµένα στην κεφαλή των δενδριτικών τους ακανθών ( ). Τελικά κοµβία των φλοιικών ινών δηµιουργούν επίσης συνάψεις µε τους GABAεργικούς ενδιάµεσους νευρώνες και τους χολινεργικούς νευρώνες (134). Η µεταβίβαση των πληροφοριών στις συνάψεις που εγκαθιστούν οι φλοιικές ίνες µεσολαβείται από NMDA και AMPA υποδοχείς (ιονοτροπικοί υποδοχείς) καθώς και από µεταβοτροπικούς υποδοχείς των διεγειρόντων αµινοξέων (56, 77, 88). Οι υποδοχείς αυτοί έχει αποδειχθεί ότι έχουν κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη παρατεταµένης ενίσχυσης (long term potentiation, LTP) και παρατεταµένης καταστολής (long term depression, LTD), που είναι οι διαδικασίες που ενέχονται στη συναπτική πλαστικότητα, στη µάθηση και τη µνήµη του ραβδωτού σώµατος ( ). Η δεύτερη µεγαλύτερη πηγή προέλευσης κεντροµόλων ινών για τον κερκοφόρο πυρήνα είναι η συµπαγής µοίρα της µέλαινας ουσίας. Οι ίνες αυτές είναι ντοπαµινεργικές και απολήγουν κυρίως στο «λαιµό» των δενδριτικών ακανθών, δίπλα και κεντρικότερα από τις φλοιικές διεγερτικές συνάψεις, στα 26

27 Φλοιός (Μετωπιαίος Λοβός) Κερκοφόρος Πυρήνας (Κεφαλή) Θάλαµος (Pf CM PV VA VL MD) Ωχρά Σφαίρα Έσω Έξω Μοίρα Μοίρα Μέλαινα Ουσία ικτυωτή Συµπαγής Μοίρα Μοίρα Υποθαλαµικός Πυρήνας Φυγόκεντρες συνδέσεις άµεσου κυκλώµατος Φυγόκεντρες συνδέσεις έµµεσου κυκλώµατος Εικόνα 5. Σχεδιάγραµµα των σηµαντικότερων προσαγωγών και απαγωγών συνδέσεων του κερκοφόρου πυρήνα. µέσου µεγέθους ακανθώδη κύτταρα, όπου υπάρχουν υποδοχείς ντοπαµίνης των οµάδων D1 και D2 (137, 138). Οι χολινεργικοί νευρώνες επίσης δέχονται ντοπαµινεργικές συνάψεις (139). Ο ρόλος της ντοπαµίνης στον κερκοφόρο 27

28 πυρήνα είναι ρυθµιστικός, γεγονός που φαίνεται και από τη θέση των ντοπαµινεργικών συνάψεων δίπλα και κεντρικότερα από τις γλουταµινεργικές συνάψεις (140). Ο κερκοφόρος πυρήνας δέχεται ακόµα διεγερτικές ίνες από το θάλαµο και τον υποθαλαµικό πυρήνα, που είναι επίσης γλουταµατεργικές (139, ). Οι κεντροµόλες συνδέσεις από το θάλαµο προέρχονται κυρίως από τον κεντρικό πυρήνα (CM) και τον παραδεσµικό (Pf) αλλά και από άλλους πυρήνες του θαλάµου, όπως τον πρόσθιο κοιλιακό (VA), τον έξω κοιλιακό (VL), τον έσω ραχιαίο (MD) και τον παρακοιλιακό (PV) (141, 145). Ο κερκοφόρος πυρήνας στα πρωτεύοντα συνδέεται κυρίως µε τον παραδεσµικό (Pf) (142). Τα τελικά κοµβία των ινών που προέρχονται από τον κεντρικό (CM) και τον παραδεσµικό πυρήνα (Pf) δηµιουργούν συνάψεις κυρίως µε τους δενδρίτες των προβολικών και ενδιάµεσων νευρώνων του ραβδωτού σώµατος ενώ από τους υπόλοιπους θαλαµικούς πυρήνες οι νευρικές ίνες απολήγουν στις κεφαλές των δενδριτικών ακανθών, όπως και οι φλοιικές ίνες ( ). Έτσι, φαίνεται ότι οι ντοπαµινεργικές συνδέσεις είναι σε θέση να ασκούν ρυθµιστικό ρόλο στην πλειονότητα των διεγερτικών συνδέσεων του ραβδωτού σώµατος που προέρχονται τόσο από το φλοιό όσο και από το θάλαµο, έκτος από τις συνδέσεις µε τον κεντρικό και τον παραδεσµικό πυρήνα (142). Οι ενδιάµεσοι νευρώνες του ραβδωτού σώµατος έχει βρεθεί ότι δέχονται ανασταλτικές GABAεργικές συνδέσεις από υποπληθυσµό νευρώνων της έξω µοίρας της ωχράς σφαίρας (149). Οι συνδέσεις αυτές είναι σε θέση να επηρεάζουν σε µεγάλο βαθµό τη λειτουργία των προβολικών νευρώνων, µέσω των εκτεταµένων τοπικών συνδέσεων των ενδιάµεσων GABAεργικών κυττάρων (22, 150). Οι φυγόκεντρες συνδέσεις του κερκοφόρου πυρήνα είναι GABAεργικές, προέρχονται από τα µέσου µεγέθους ακανθώδη κύτταρα και κατευθύνονται κυρίως στη δικτυωτή µοίρα της µέλαινας ουσίας και στην έσω και έξω µοίρα 28

29 της ωχράς σφαίρας. Η έξω µοίρα της ωχράς σφαίρας επιπλέον συνδέεται µε την έσω µοίρα της ωχράς σφαίρας και µε τη δικτυωτή µοίρα της µέλαινας ουσίας απευθείας ή µέσω του υποθαλαµικού πυρήνα. Με τον τρόπο αυτό οι απαγωγές συνδέσεις του κερκοφόρου και του φακοειδούς πυρήνα θεωρείται ότι συµµετέχουν στη δηµιουργία δύο κυκλωµάτων, ενός άµεσου και ενός έµµεσου (134, 151). Οι µέσου µεγέθους ακανθώδεις νευρώνες από όπου ξεκινά το άµεσο κύκλωµα εντοπίζονται κυρίως στο νησίδια του ραβδωτού σώµατος, φέρουν υποδοχείς ντοπαµίνης της οµάδας D1 και εκφράζουν ουσία P και δυνορφίνη. Οι νευρώνες του έµµεσου κυκλώµατος εντοπίζονται κυρίως στην ενδιάµεση ουσία του ραβδωτού σώµατος, έχουν υποδοχείς ντοπαµίνης της οµάδας D2 και εκφράζουν εγκεφαλίνη. Η διάκριση αυτή παρότι δεν είναι απόλυτη χαρακτηρίζει την πλειονότητα των προβολικών GABAεργικών νευρώνων του ραβδωτού σώµατος (59, 139). Στην Εικόνα 5 φαίνονται οι κύριες συνδέσεις του κερκοφόρου πυρήνα. Εκτός από το βασικό αυτό σχήµα πορείας των πληροφοριών στα βασικά γάγγλια υπάρχουν παράπλευρες συνδέσεις τόσο µεταξύ των δύο κυκλωµάτων όσο και µε άλλους σχηµατισµούς. Έτσι, οι νευρώνες του ραβδωτού σώµατος που συµµετέχουν στο άµεσο κύκλωµα δίνουν παράπλευρους κλάδους στην έξω µοίρα της ωχράς σφαίρας (152). Επίσης, απαγωγές συνδέσεις των νευρώνων του ραβδωτού σώµατος καταλήγουν εκτός από τη δικτυωτή µοίρα της µέλαινας ουσίας και στη συµπαγή µοίρα (54, 59). Επιπλέον, εκτός από τα µέσου µεγέθους ακανθώδη κύτταρα που έχουν χαρακτηριστεί προβολικοί νευρώνες, συνδέσεις εκτός του ραβδωτού σώµατος έχει περιγραφεί ότι εγκαθιστούν και χολινεργικοί νευρώνες µε µεγάλο κυτταρικό σώµα και λείους δενδρίτες. Σύµφωνα µε µελέτες που έγιναν κατά κύριο λόγο σε γάτες, αλλά και σε τρωκτικά και πρωτεύονται, οι νευράξονές τους καταλήγουν στο φλοιό των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων (23 28). Ο υποφλοιώδης σχηµατισµός που δέχεται τις πληροφορίες από τα δύο βασικά κυκλώµατα των βασικών γαγγλίων, άµεσο και 29

30 έµµεσο, µετά τη µέλαινα ουσία και την ωχρά σφαίρα, είναι ο θάλαµος (κυρίως οι πυρήνες πρόσθιος κοιλιακός (VA), έξω κοιλιακός (VL) και έσω ραχιαίος (MD)) (1, 153, 154). Οι παραπάνω συνδέσεις έχει αποδειχθεί ότι είναι χωρισµένες σε πέντε «µερικώς κλειστά» κυκλώµατα µεταξύ βασικών γαγγλίων, θαλάµου και φλοιού, που ονοµάζονται «basal ganglia thalamo cortical loops». Κάθε κύκλωµα αγκύλη ξεκινά από φλοιικές περιοχές που συνδέονται αµφίδροµα µεταξύ τους. Μέσω του ραβδωτού σώµατος, της ωχράς σφαίρας και της µέλαινας ουσίας και τελικά του θαλάµου καταλήγουν πίσω σε µια από τις περιοχές του νεόφλοιου από όπου ξεκίνησαν. Σε όλη την πορεία τους µέσα από τις παραπάνω δοµές κάθε αγκύλη παραµένει διαχωρισµένη από τις υπόλοιπες. Αυτή η θεώρηση προτάθηκε το 1986 από τους Alexander και συνεργάτες και ισχύει µέχρι και σήµερα στις βασικές τις αρχές (155). Τα πέντε κυκλώµατα που περιγράφηκαν αρχικώς είναι το κινητικό κύκλωµα, το οφθαλµοκινητικό, το κύκλωµα του πρόσθιου τµήµατος της έλικας του προσαγωγίου και δύο προµετωπιαία κυκλώµατα. Τα δύο πρώτα κυκλώµατα είναι καλύτερα χαρακτηρισµένα και περιγεγραµµένα, αλλά κάτω από το φως των πιο πρόσφατων φυσιολογικών, ανατοµικών και παθολογικών δεδοµένων για τη συµµετοχή του ραβδωτού σώµατος σε ανώτερες νοητικές λειτουργίες, τα προµετωπιαία κυκλώµατα έχουν τραβήξει νέο ερευνητικό ενδιαφέρον (156, 157). 30

31 Εικόνα 6. Σχεδιάγραµµα της πορείας των πληροφοριών από το φλοιό των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων µέσω των βασικών γαγγλίων. Οι συνειρµικές περιοχές του φλοιού (AS) συνδέονται κατά κύριο λόγο µε τον κερκοφόρο πυρήνα (CD) ενώ οι αισθητικο-κινητικές περιοχές του φλοιού (SM) µε το κέλυφος του φακοειδούς πυρήνα (PUT). Από τον κερκοφόρο πυρήνα οι πληροφορίες µεταφέρονται κυρίως στη δικτυωτή µοίρα της µέλαινας ουσίας (SNr), ενώ από το κέλυφος κυρίως στην έσω µοίρα της ωχράς σφαίρας (GPi) και λιγότερο στην έξω µοίρα αυτής (GPe) και στην µέλαινα ουσία (158). Ανάµεσα στις φλοιικές περιοχές που συνδέονται µε τον κερκοφόρο πυρήνα ο µετωπιαίος λοβός έχει κεντρική θέση και αυτό είχε αρχικώς αποδοθεί 31

32 αποκλειστικά στον έλεγχο των κινητικών λειτουργιών (συνδέσεις µε τον κινητικό και τον προκινητικό φλοιό). Λεπτοµερέστερες µελέτες σε πειραµατόζωα, κυρίως πρωτεύοντα, αποκάλυψαν ότι φλοιικές περιοχές που σχετίζονται µε κινητικές και αισθητικές λειτουργίες εγκαθιστούν συνδέσεις κατά κύριο λόγο µε το κέλυφος του φακοειδή πυρήνα (159, 160). Παράλληλα όµως υπάρχουν άφθονες συνδέσεις µεταξύ του προµετωπιαίου φλοιού και του ραβδωτού σώµατος, οι οποίες εντοπίζονται να καταλήγουν στην κεφαλή του κερκοφόρου πυρήνα (Εικόνα 6) (158, ). Έχει διατυπωθεί η υπόθεση ότι όπως οι συνδέσεις του ραβδωτού σώµατος µε τον κινητικό και προκινητικό φλοιό συµβάλλουν στον έλεγχο των κινήσεων, έτσι και οι συνδέσεις του κερκοφόρου πυρήνα µε τον προµετωπιαίο φλοιό συµβάλλουν στον έλεγχο της συµπεριφοράς και στη ρύθµιση ανώτερων νοητικών λειτουργιών. Είναι γνωστό ότι ο προµετωπιαίος φλοιός έχει κεντρικό ρόλο στη διαµόρφωση του χαρακτήρα, την ευθυγράµµιση της συµπεριφοράς µε τις κοινωνικές συνθήκες, τη µνήµη και τη µάθηση ( ). Η λειτουργία του προµετωπιαίου λοβού ως σύνολο σχετίζεται µε την εναρµόνιση της βούλησης, της σκέψης και της δράσης µε τις εσωτερικές επιθυµίες και τις εξωτερικές συνθήκες. Συµβάλει στην ικανότητα διαφοροποίησης και επιλογής ανάµεσα σε αντικρουόµενες απόψεις και θέσεις, στην πρόβλεψη µελλοντικών συνεπειών από παροντικές ενέργειες, στο σχεδιασµό για το µέλλον, στη ρύθµιση της συµπεριφοράς, στην αντίληψη του χώρου, στην προσοχή, στον καθορισµό των σχέσεων µε τους άλλους και ακόµα στην αυτοεκτίµηση. Οι λειτουργίες αυτές έχουν βαρύνουσα σηµασία για τη διαµόρφωση του χαρακτήρα ( ). Έτσι, είναι σηµαντικό να υπογραµµίσουµε ότι οι τελικές συνδέσεις του κερκοφόρου πυρήνα µε τον φλοιό δεν είναι µονόδροµες αλλά αµφίδροµες. Το ραβδωτό σώµα, µε τα κυκλώµατα που περνούν από τα βασικά γάγγλια και το θάλαµο, καταλήγοντας πίσω στο φλοιό των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων, συµµετέχει στη ρύθµιση των 32

33 παραπάνω λειτουργιών. Αυτό έχει αποδειχθεί ότι ισχύει για το κινητικό και το οφθαλµοκινητικό κύκλωµα και, λόγω της αντιστοιχίας των συνδέσεων για τη ροή πληροφοριών µε τα προµετωπιαία κυκλώµατα, είναι η πιο πιθανή εξήγηση του ρυθµιστικού ρόλου του ραβδωτού σώµατος στη συµπεριφορά (155, 172, 173). H ακριβής εντόπιση των συνδέσεων του προµετωπιαίου λοβού µε τον κερκοφόρο πυρήνα δεν έχει µέχρι σήµερα περιγραφεί στον ανθρώπινο εγκέφαλο. Φυσιολογικές και ανατοµικές µελέτες σε πρωτεύοντα έχουν αποκαλύψει συνδέσεις από κάποιες περιοχές του προµετωπιαίου λοβού µε συγκεκριµένες περιοχές του κερκοφόρου πυρήνα ( ). Επιπροσθέτως, συµπεριφορικές µελέτες σε πρωτεύοντα αποδεικνύουν ότι ο προµετωπιαίος λοβός δεν έχει ενιαία λειτουργία, αλλά κάθε περιοχή εξυπηρετεί διαφορετικές λειτουργίες (177, 178). Έτσι, έχουν αποδοθεί συγκεκριµένες λειτουργίες στις συνδέσεις του προµετωπιαίου φλοιού µε τον κερκοφόρο πυρήνα, ως τµήµα των κυκλωµάτων βασικών γαγγλίων θαλάµου φλοιού. Οι συνδέσεις από την έξω ραχιαία περιοχή του µετωπιαίου λοβού (πεδία 9 και 10 κατά Brodmann) µε το έξω ραχιαίο τµήµα της κεφαλής του κερκοφόρου πυρήνα έχουν συσχετιστεί µε το σχεδιασµό µελλοντικών ενεργειών και µε µνηµονικές εγχαράξεις σχετιζόµενες κυρίως µε το χώρο (179, 180). Στο ίδιο τµήµα του κερκοφόρου πυρήνα καταλήγουν νευράξονες από τον κροταφικό λοβό (πεδία 21 και 22 κατά Brodmann). Στις συνδέσεις της κογχικής επιφάνειας του µετωπιαίου φλοιού (πεδία 10 και 11 κατά Brodmann) µε το µέσο-κοιλιακό τµήµα της κεφαλής του κερκοφόρου πυρήνα έχει αποδοθεί η ικανότητα για τις απαραίτητες µεταβολές της συµπεριφοράς ανάλογα µε τις εσωτερικές επιθυµίες, τους στόχους και τις κοινωνικές συνθήκες, καθώς και η µάθηση µε την επιβράβευση (181). Οι συνδέσεις της έσω επιφάνειας του προµετωπιαίου φλοιού και κυρίως του προσθίου τµήµατος της έλικας του προσαγωγίου (πεδίο 24 κατά Brodmann) µε το κοιλιακό τµήµα της κεφαλής του κερκοφόρου πυρήνα και γενικότερα το κοιλιακό ραβδωτό σώµα έχουν ρυθµιστικό ρόλο για 33

34 τη συµπεριφορά µέσω των κινήτρων και για την εκφορά των συναισθηµάτων (182). Οι παραπάνω λειτουργίες που έχουν αποδοθεί στις συνδέσεις µεταξύ προµετωπιαίου φλοιού και κερκοφόρου πυρήνα, έχουν αποκαλυφθεί µετά από µελέτες σε πρωτεύοντα κατά κύριο λόγο (183). Ωστόσο, ο προµετωπιαίος φλοιό του ανθρώπινου εγκεφάλου δεν έχει ούτε τις ίδιες διαστάσεις ούτε πλήρη αντιστοιχία στα ανατοµικά διαµερίσµατα µε αυτό τον πιθηκοειδών (184). Για να εξαχθούν ασφαλή συµπεράσµατα για το ρόλο του κερκοφόρου πυρήνα στις ανώτερες νοητικές λειτουργίες και τις συνδέσεις του µε το προµετωπιαίο λοβό είναι απαραίτητο να υπάρχουν ανατοµικά δεδοµένα από µελέτες σε ανθρώπινο εγκέφαλο (185). Μια προσπάθεια προς αυτή την κατεύθυνση έγινε στην εργασία των Leh και συνεργατών, επιβεβαιώνοντας κάποιες από τις συνδέσεις που είχαν προηγουµένως περιγραφεί σε ζώα (186). Οι απαγωγές συνδέσει από τον κερκοφόρο πυρήνα που ενέχονται στη ρύθµιση της συµπεριφοράς και στη µνήµη είναι πιο πολύπλοκες και γι αυτό λιγότερο κατανοητές (187). Η γενική θεώρηση για τις συνδέσεις του νεοραβδωτού σώµατος µέσω της ωχράς σφαίρας, της µέλαινας ουσίας και του θαλάµου που καταλήγουν πίσω στον φλοιό των ηµισφαιρίων ισχύει και σε αυτή την περίπτωση. Σύµφωνα µε µελέτες σε πρωτεύοντα, οι απαγωγές συνδέσεις από τον κερκοφόρο πυρήνα καταλήγουν κατά κύριο λόγο στην µέλαινα ουσία (Εικόνα 6) (158). Ωστόσο, το κατά πόσο τα τρία κυκλώµατα αγκύλες που ξεκινούν από τον προµετωπιαίο φλοιό παραµένουν διαχωρισµένα κάτω από το επίπεδο του κερκοφόρου πυρήνα, δεν έχει αποδειχθεί ακόµα (188, 189). Το πλάγιο-ραχιαίο τµήµα της κεφαλής του κερκοφόρου πυρήνα φέρεται να συνδέεται µε το πλάγιο τµήµα της έσω µοίρας της ωχράς σφαίρας και της µέλαινας ουσίας, από όπου οι ώσεις φέρονται στον πρόσθιο κοιλιακό και στον έσω ραχιαίο πυρήνα του θαλάµου, αντίστοιχα. Παροµοίως, η µέση-κοιλιακή µοίρα της κεφαλής του κερκοφόρου πυρήνα συνδέεται µε το µέσο τµήµα της 34

35 έσω µοίρας της ωχράς σφαίρας και της µέλαινας ουσίας, από όπου όπως και προηγουµένως οι ώσεις φέρονται στον πρόσθιο κοιλιακό και τον έσω ραχιαίο πυρήνα του θαλάµου (155). Ο ρυθµιστικός ρόλος του κερκοφόρου πυρήνα σε ανώτερες νοητικές λειτουργίες πραγµατοποιείται και µε τη βοήθεια άλλων συνδέσεων. Ο θάλαµος προβάλει συνδέσεις προς τον κερκοφόρο πυρήνα και το κέλυφος του φακοειδούς πυρήνα µεταφέροντας αισθητικές πληροφορίες προς το ραβδωτό σώµα χωρίς τη µεσολάβηση του φλοιού των ηµισφαιρίων (141, 143). Με τον τρόπο αυτό, το ραβδωτό σώµα παίζει ενεργό ρόλο στην αντίληψη των αισθήσεων και στη δηµιουργία αισθητικο-κινητικών συσχετίσεων (190, 191). Επιπλέον, αυτό το σκέλος εισόδου αισθητικών πληροφοριών προς το νεοραβδωτό σώµα αποτελεί την πηγή για τη δηµιουργία µνηµονικών εγχαράξεων. Το σύστηµα µνήµης και µάθησης που εδράζει στο νεοραβδωτό σώµα είχε θεωρηθεί αρχικά αυστηρά διαχωρισµένο από αυτό του ιπποκάµπου. Σήµερα υπάρχουν ενδείξεις προερχόµενες από φυσιολογικές µελέτες που υποστηρίζουν ότι τα δύο αυτά συστήµατα συνδέονται (192, 193). Παρόλα αυτά, ανατοµικές αποδείξεις τέτοιων συνδέσεων (άµεσων ή έµµεσων) έχουν βρεθεί µόνο για το κοιλιακό ραβδωτό σώµα. Ακόµα, την τελευταία δεκαετία αναφέρθηκε η ύπαρξη άµεσων συνδέσεων µεταξύ του κερκοφόρου πυρήνα και της παρεγκεφαλίδας, οι οποίες ενέχονται στη ρύθµιση των εκουσίων κινήσεων, αλλά η πιθανή τους εµπλοκή και σε άλλες λειτουργίες δεν έχει ακόµα αποσαφηνιστεί (194, 195). Όσον αφορά το κοιλιακό τµήµα του ραβδωτού σώµατος, οι προσαγωγές του συνδέσεις προέρχονται εκτός από τον προµετωπιαίο και τον κροταφικό λοβό και από τον αµυγδαλοειδή πυρήνα, τον ιπποκάµπειο σχηµατισµό, το θάλαµο και το µέσο εγκέφαλο (196, 197). Οι απαγωγές συνδέσεις φέρονται στο κοιλιακό τµήµα της ωχράς σφαίρας και µέσω του έσω ραχιαίου πυρήνα του θαλάµου καταλήγουν πίσω στο φλοιό του προµετωπιαίου λοβού. Ένα άλλο σκέλος των 35

36 απαγωγών ινών κατευθύνεται από το κοιλιακό ραβδωτό σώµα προς τους πλάγιους πυρήνες του υποθαλάµου και τους κινητικούς πυρήνες του στελέχους του εγκεφάλου (155, 198). Σύµφωνα µε τον Gordon Mogenson, που είναι από τους πρώτους ερευνητές που επικέντρωσε την προσοχή του στις λειτουργίες που εξυπηρετούνται από τις συνδέσεις του κοιλιακού τµήµατος του ραβδωτού σώµατος, ο σχηµατισµός αυτός έχει κεντρική θέση στην επεξεργασία των κινήτρων πριν την τελική απόφαση για ενέργεια (199). Επίσης, συµµετέχει το κοιλιακό ραβδωτό σώµα σε διεργασίες σχετικές µε το συναίσθηµα, την ευχαρίστηση και την ανταπόδοση (138, 200) Λειτουργία Παθολογία Όσον αφορά τη λειτουργία, ήταν γνωστό ήδη από την αρχή του περασµένου αιώνα ότι ο κερκοφόρος πυρήνας και το κέλυφος του φακοειδούς πυρήνα έχουν κεντρικό ρόλο στην οργάνωση και τον έλεγχο των κινήσεων. Παρόλα αυτά, µελέτες που εκπονήθηκαν τις τελευταίες δεκαετίες δίνουν ολοένα και περισσότερο έµφαση στη συµµετοχή του κερκοφόρου πυρήνα και κυρίως της κεφαλής σε ανώτερες νοητικές λειτουργίες και στη συµπεριφορά (βλέπε προηγούµενο κεφάλαιο). Το ενδιαφέρον γι αυτές τις λειτουργίες άρχισε να αναπτύσσεται από µελέτες σε ζώα (τρωκτικά και πρωτεύοντα) µε πειραµατικές βλάβες στο νεοραβδωτό σώµα και από παρατηρήσεις σε ανθρώπους που έπασχαν από παθήσεις που πρωταρχικά επηρεάζουν το ραβδωτό σώµα. Επιπλέον, πιο πρόσφατες µελέτες πάνω σε ψυχιατρικές παθήσεις υπογραµµίζουν τον κεντρικό ρόλο της παθολογίας του ραβδωτού σώµατος στην παθογένεια των διαταραχών συµπεριφοράς και συναισθήµατος καθώς και από τη χρήση ναρκωτικών ουσιών (156, 197, 201, 202). 36

37 Από το δεύτερο µισό του προηγούµενου αιώνα µελέτες σε πειραµατόζωα αποκάλυψαν διαταραχές στη συµπεριφορά µετά από διάφορους πειραµατικούς χειρισµούς στο νεοραβδωτό σώµα. Το γεγονός ότι παρόµοια δυσλειτουργία εµφανιζόταν και µετά από βλάβες στον φλοιό του προµετωπιαίου λοβού ήταν η πρώτη ένδειξη λειτουργικής σύνδεσης µεταξύ των δοµών αυτών. Μεταγενέστερες µελέτες σε πρωτεύοντα, όπως αναφέρεται στο προηγούµενο κεφάλαιο, χαρακτήρισαν καλύτερα τις λειτουργίες στις οποίες συµµετέχει ο κερκοφόρος πυρήνας, σε συνεργασία µε το µετωπιαίο λοβό, και τις συσχέτισαν µε τη µνήµη, τη µάθηση, την ανταπόκριση στην επιβράβευση, την ανάλυση πληροφοριών σχετικών µε το χώρο και την ικανότητα για εναλλαγή στη στρατηγική συµπεριφοράς ανάλογα µε τις µεταβαλλόµενες περιβαλλοντικές και κοινωνικές συνθήκες. Αρχικά, η συµµετοχή του νεοραβδωτού σώµατος στις διεργασίες της µνήµης αποδόθηκε αποκλειστικά στην οργάνωση τυποποιηµένων σχηµάτων συµπεριφοράς. Ωστόσο, πιο πρόσφατα ερευνητικά δεδοµένα υποστηρίζουν την ιδέα ενός γενικότερου ρόλου του κερκοφόρου πυρήνα στην εγχάραξη της µνήµης και την επεξεργασία αισθητικών-κινητικών πληροφοριών για τη δηµιουργία συσχετίσεων. Επιπλέον, η ανταπόκριση στην επιβράβευση η οποία είναι βασικός παράγοντας της διαµόρφωσης και τροποποίησης της συµπεριφοράς µέσω των κινήτρων είναι µια λειτουργία που επιτελείται κυρίως από την κοιλιακή µοίρα του ραβδωτού σώµατος σε συνδυασµό µε το νεοραβδωτό σώµα (1, 200). Οι λειτουργικές συνέπειες των αλλοιώσεων του κερκοφόρου πυρήνα στον άνθρωπο παρατηρούνται κατά κύριο λόγο σε ασθενείς που πάσχουν από νόσο του Huntington και νόσο του Parkinson. Στην πρώτη νόσο είναι χαρακτηριστικό ότι διαταραχές του συναισθήµατος (κατάθλιψη), αντικοινωνική συµπεριφορά καθώς και διαταραχές ανώτερων νοητικών λειτουργιών, της µνήµης, της κριτικής ικανότητας, της προσοχής, παρατηρούνται ακόµα και στα αρχικά στάδια, όταν δεν υπάρχουν παθολογικές 37

38 αλλοιώσεις σε φλοιικές περιοχές ή στον ιππόκαµπο (203). Παροµοίως και στη νόσο του Parkinson οι ασθενείς υποφέρουν από διαταραχές συναισθήµατος, επιβράδυνση της σκέψης, µειωµένη δυνατότητα συγκέντρωσης της προσοχής και δυσκολίες στη µάθηση (203, 204). Ακόµα και αν κάποιες από αυτές τις διαταραχές µπορούν να αποδοθούν σε δυσλειτουργία του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων, η συµµετοχή του κερκοφόρου πυρήνα ως η πρωταρχικός εµπλεκόµενη στη νόσο περιοχή δεν µπορεί να αποκλεισθεί. Σε ψυχιατρικές παθήσεις, όπως η σχιζοφρένια και η κατάθλιψη, ο κεντρικός ρόλος των αλλοιώσεων του νεοραβδωτού σώµατος και των κυκλωµάτων µε τον προµετωπιαίο φλοιό στην παθογένειά τους είναι επαρκώς αποδεδειγµένος (156, 197, 201, 202). Το ανατοµικό υπόστρωµα των νοητικών λειτουργιών του κερκοφόρου πυρήνα δεν έχει αποσαφηνιστεί ακόµα πλήρως στον ανθρώπινο εγκέφαλο, παρόλο που οι συνδέσεις του έχουν µελετηθεί εκτενώς, σε διάφορα είδη θηλαστικών και πρωτευόντων. Οι συνδέσεις που είναι καλύτερα χαρακτηρισµένες είναι αυτές που εγκαθίστανται µε τον κινητικό και προκινητικό φλοιό και ενέχονται κυρίως στη διαµόρφωση κινητικών λειτουργιών και έχουν πολλά κοινά στοιχεία µεταξύ των διαφόρων ειδών και του ανθρώπου (134). 1.2 Νόσος του Alzheimer Η νόσος του Alzheimer είναι η πιο συχνή αιτία γεροντικής προγεροντικής άνοιας. ιακρίνεται σε δύο µορφές, τη σποραδική που είναι η πιο συχνή και έχει έναρξη συνήθως µετά το 65ο έτος ηλικίας και την οικογενή που κληρονοµείται µε αυτοσωµικό επικρατές τρόπο και έχει έναρξη πριν το 65ο 38

39 έτος ηλικίας. Χαρακτηρίζεται η νόσος από σταδιακή έκπτωση των νοητικών λειτουργιών και εγκατάσταση διαταραχών της προσοχής, του προσανατολισµού, της κριτικής ικανότητας, της µνήµης, της µάθησης, του συναισθήµατος και της κοινωνικής συµπεριφοράς (205). Είναι νευροεκφυλιστική πάθηση και περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Γερµανό ψυχίατρο και νευροπαθολόγο Alois Alzheimer το Η ασθενής του Alzheimer ονοµαζόταν Augusta D. και ήταν πενήντα ετών. Την παρακολούθησε από το 1901 έως το 1906, οπότε απεβίωσε, εξέτασε τον εγκέφαλό της και περιέγραψε τις χαρακτηριστικές νευροπαθολογικές αλλοιώσεις της νόσου (Εικόνα 7). Τα επόµενα πέντε χρόνια περιγράφηκαν περισσότερα από δέκα παρόµοια περιστατικά και ο όρος νόσος του Alzheimer άρχισε ήδη να χρησιµοποιείται. Για αρκετά χρόνια η άνοια χαρακτηριζόταν ως νόσος του Alzheimer µόνο σε ασθενείς µε ηλικία µικρότερη των 65 ετών. Από τη δεκαετία του 70 και µετά, όµως, η διάγνωση της νόσου του Alzheimer άρχισε να τίθεται ανεξάρτητα από την ηλικία (206, 207). Η άνοια και ιδιαίτερα η νόσος του Alzheimer εκτός από τις δραµατικές συνέπειες που έχει κατά την εξέλιξή της για τους ασθενής, αποτελεί ένα δυσβάσταχτο πολλές φορές φορτίο για τους φροντιστές και για ολόκληρη την κοινωνία. Καθώς η πορεία της νόσου είναι προϊούσα, µε διάρκεια που µπορεί να ξεπεράσει τα 20 χρόνια και σηµαντικό ποσοστό των ασθενών δεν χρειάζεται νοσοκοµειακή φροντίδα, τουλάχιστον στα αρχικά στάδια, µεγάλο βάρος για τη φροντίδα των ασθενών παίρνουν τα µέλη των οικογενειών τους. Οι ασθενείς χρειάζονται σταδιακά όλο και περισσότερη βοήθεια για την εξυπηρέτηση ακόµα και βασικών αναγκών τους και αυτό µπορεί να διαρκέσει αρκετά χρόνια, εξαντλώντας τα σωµατικά και ψυχικά αποθέµατα των φροντιστών ( ). Επίσης, µε την αύξηση του µέσου όρου ζωής τις τελευταίες δεκαετίες και 39

40 Εικόνα 7. Ενδοκυττάριες νευροϊνιδιακές αλλοιώσεις όπως περιγράφηκαν για πρώτη φορά το 1906 από τον Alois Alzheimer. την παράλληλη αύξηση της επίπτωσης της νόσου του Alzheimer το κόστος για την κοινωνία είναι µεγάλο, λόγω της νοσοκοµειακής περίθαλψης, της περίθαλψης στο σπίτι και της απώλειας παραγωγικού ανθρώπινου δυναµικού τόσο από τους ασθενείς όσο και από τους φροντιστές (211) Κλινική εικόνα - ιάγνωση Η κλινική εικόνα των ασθενών παρουσιάζει σταδιακή επιδείνωση. Τα αρχικά συµπτώµατα είναι ήπια και αφορούν κυρίως διαταραχές στην προσοχή, τον σχεδιασµό για το µέλλον, την ευελιξία της σκέψης και λιγότερο τη µνήµη (212). Από την ψυχική σφαίρα ένα από τα πρώτα συµπτώµατα είναι η απάθεια, η 40

41 συναισθηµατική επιπέδωση (213). Τα αρχικά αυτά συµπτώµατα συγκροτούν την ήπια γνωσιακή διαταραχή (mild cognitive impairment), για την οποία δεν είναι ακόµα γνωστό αν εξελίσσεται πάντα στην τυπική νόσο του Alzheimer (214, 215). Στο πρώτο αυτό στάδιο τα συµπτώµατα µπορεί να ξεφεύγουν της προσοχής των συγγενών και των ιατρών ή ακόµα να θεωρούνται απότοκα της ηλικίας. Στο επόµενο στάδιο η έκπτωση της µνήµης και της µάθησης είναι χαρακτηριστική και συνοδεύεται από διαταραχές στη γλώσσα, την αντίληψη και την εκτέλεση λεπτών κινητικών σχηµάτων. Με την εξέλιξη της νόσου οι ασθενείς σταδιακά αδυνατούν να εκτελούν απλές καθηµερινές πράξεις γεγονός που τους καθιστά εξαρτηµένους από τους φροντιστές τους. Οι δυσκολίες στο λόγο επιδεινώνονται, ο συντονισµός των κινήσεων χάνεται και οι διαταραχές στη µνήµη γίνονται εκτεταµένες, περιλαµβάνοντας εκτός από την αρχικά προσβαλλόµενη βραχυπρόθεσµη και άµεση µνήµη και την µακροπρόθεσµη, τόσο την επεισοδιακή όσο και την σηµασιολογική. Παράλληλα, παρατηρούνται συνήθως έντονα συµπτώµατα από την ψυχική σφαίρα, όπως ευερεθιστότητα και επιθετικότητα, συναισθηµατική ρηχότητα και επιπέδωση, κατάθλιψη και άγχος, αποπροσανατολισµός, ψευδαισθήσεις, παραλήρηµα, καθώς και νοσοαγνωσία. Στο τελικό στάδιο οι ασθενείς καθηλώνονται στο κρεβάτι µε δυσκολία ακόµα και σε απλές κινήσεις, όπως αυτές για την πρόσληψη της τροφής, και αδυναµία λεκτικής επικοινωνίας πέρα από λίγες λέξεις (205, ). Για να τεθεί η διάγνωση της νόσου, εκτός από την νευρολογική εξέταση που αποκαλύπτει την παραπάνω κλινική εικόνα, απαραίτητα είναι τα νεύροψυχολογικά τεστ, για την εξέταση των νοητικών και ψυχικών λειτουργιών, και οι απεικονιστικές εξετάσεις του εγκεφάλου, για την εκτίµηση της ατροφίας και τον αποκλεισµό άλλων πιθανών παθολογικών διεργασιών (219, 220). Από τα διάφορα κριτήρια που έχουν θεσπιστεί για τη διάγνωση της νόσου ευρύτερη αποδοχή έχουν αυτά της αµερικάνικης νευρολογικής εταιρίας σε συνεργασία 41

42 µε τον αµερικάνικο οργανισµό της νόσου Alzheimer (221) και του αµερικάνικου οργανισµού ψυχιατρικής (222). Η επιβεβαίωση της διάγνωσης ωστόσο γίνεται µόνο µε την ιστολογική εξέταση του εγκεφάλου µετά το θάνατο για την εντόπιση των χαρακτηριστικών νευροπαθολογικών αλλοιώσεων που περιγράφονται παρακάτω (221) Πρόληψη Αντιµετώπιση Μέχρι σήµερα δεν υπάρχει αποτελεσµατική µέθοδος για την πρόληψη ή τη θεραπεία της νόσου. ιάφοροι διαιτητικοί και φαρµακευτικοί παράγοντες έχουν συσχετισθεί µε την πρόληψη, χωρίς όµως να υπάρχουν επαρκείς αποδείξεις (223, 224). Επίσης, η συνεχής πνευµατική εξάσκηση έχει συσχετισθεί µε εµφάνιση άνοιας σε µεγαλύτερη ηλικία (225). Οι φαρµακευτικοί παράγοντες που χρησιµοποιούνται στην αντιµετώπιση της νόσου ανήκουν σε δύο κατηγορίες, αναστολείς χολινεστεράσης και ανταγωνιστές των NMDA υποδοχέων, χωρίς όµως θεαµατικά αποτελέσµατα στην πορεία της νόσου (226). Επίσης, αντιψυχωσικοί, αγχολυτικοί και αντικαταθλιπτικοί παράγοντες χρησιµοποιούνται για τον έλεγχο διαταραχών συµπεριφοράς και συναισθήµατος (227) Αιτιοπαθογένεια Σχετικά µε την αιτιολογία της νόσου του Alzheimer, µέχρι σήµερα δεν υπάρχουν επαρκή δεδοµένα και οµοφωνία για τον ακριβή παθογενετικό µηχανισµό. Το 1991 ανακοινώθηκε η παρατήρηση εναποθέσεων β- αµυλοειδούς σε πλάκες στον εγκέφαλο των ασθενών και αυτό θεωρήθηκε η κεντρική αιτία ανάπτυξης της νόσου (228). Το β-αµυλοειδές είναι ένα πεπτίδιο 42

43 µε 38 έως 42 αµινοξέα, που προέρχεται από τη διαµεµβρανική προαµυλοειδή πρωτεΐνης, µε ενζυµατική διάσπαση διαδοχικά από τη β- και γ- σεκρετάση (229). Το γονίδιο που κωδικοποιεί την προαµυλοειδή πρωτεΐνης βρίσκεται στο χρωµόσωµα 21. Στους ασθενείς µε σύνδροµο Down (τρισωµία 21), οι οποίοι έχουν ένα αντίγραφο του γονιδίου παραπάνω, από την ηλικία των 40 ετών αναπτύσσονται στον εγκέφαλο αλλοιώσεις αντίστοιχες µε αυτές που παρατηρούνται στη νόσο του Alzheimer (230, 231). Ακόµα, µεταλλάξεις του γονιδίου της προαµυλοειδούς πρωτεΐνης που κληρονοµούνται µε αυτοσωµατικό επικρατές τρόπο έχουν βρεθεί στην οικογενή µορφή της νόσου. Σε πειραµατόζωα που φέρουν µεταλλαγµένη µορφή του γονιδίου της προαµυλοειδούς πρωτεΐνης παρατηρούνται διαταραχές στις δοκιµασίες της µνήµης και ιστολογικές αλλοιώσεις τύπου Alzheimer ( ). Τα τελευταία χρόνια προτάθηκε ότι στους παθογενετικούς µηχανισµούς της νόσου δε συµµετέχουν απαραίτητα τα ινιδώδη συσσωµατώµατα β-αµυλοειδούς, αλλά και διαλυτά ολιγοµερή τα οποία συµβάλλουν στην εµφάνιση των συναπτικών αλλοιώσεων (235). Ακόµα, προσφάτως, ανακοινώθηκε η ύπαρξη και άλλου προϊόντος της διάσπασης της προαµυλοειδούς πρωτεΐνης που έχει τοξική δράση για τα νευρικά κύτταρα και τις συνάψεις (236). Παράλληλα µε τη θεωρία του αµυλοειδούς έχει διατυπωθεί και η άποψη της εµπλοκής της τ πρωτεΐνης στην παθογένεια της νόσου (237). Η τ πρωτεΐνης υπάρχει σε αφθονία στα νευρικά κύτταρα και χρησιµεύει για τη σταθεροποίηση των µικροσωλινίσκων του κυτταροσκελετού. Η υπερφωσφορυλίωση της τ πρωτεΐνης διαταράσσει τον κυτταροσκελετό των νευρώνων µε τη δηµιουργία των κατά ζεύγη περιελιγµένων ινιδίων που οδηγούν στο σχηµατισµό των χαρακτηριστικών νευροϊνιδιακών δεµατίων της νόσου του Alzheimer. Έτσι, αρχικά διαταράσσεται η επικοινωνία των νευρώνων µέσω των συνάψεων και οι νευρώνες σταδιακά οδηγούνται στον κυτταρικό θάνατο (238, 239). Παρόλα αυτά, δεν υπάρχει συµφωνία για το αν οι 43

44 µηχανισµοί που σχετίζονται µε το β-αµυλοειδές προηγούνται αυτών της τ πρωτεΐνης ή το αντίστροφο ή ακόµα αν έχουν κάποιο κοινό αιτιολογικό παράγοντα και εξελίσσονται παράλληλα ( ). Για τη σποραδική µορφή της νόσου του Alzheimer έχει προταθεί η συσχέτιση µε διάφορα γονίδια, από τα οποία πιο ισχυρό παράγοντα κινδύνου αποτελεί το αλληλόµορφο Ε4 της απολιποπρωτεΐνης Ε, που συσχετίζεται µε εκσεσηµασµένη συσσώρευση αµυλοειδούς στον εγκεφαλικό ιστό (243, 244). Στην οικογενή µορφή της νόσου εκτός από µεταλλάξεις στο γονίδιο της προαµυλοειδούς πρωτεΐνης (όπως αναφέρεται παραπάνω) έχουν περιγραφεί µεταλλάξεις στα γονίδια που κωδικοποιούν την πρεσενιλίνη 1 και 2, που αποτελούν τµήµα της γ-σεκρετάσης, και συµµετέχουν στη συσσώρευση αµυλοειδούς (245). Άλλοι παράγοντες που συµµετέχουν στους παθογενετικούς µηχανισµούς της νόσου σχετιζόµενοι µεταξύ τους και µε τους προαναφερθέντες είναι: η οξειδωτική καταπόνηση (246), οι µιτοχονδριακές αλλοιώσεις (247), η διαταραχή νευροδιαβιβαστών και υποδοχέων (248, 249), η διαταραχή του χολινεργικού συστήµατος (250), η ένδεια νορεπινεφρίνης (251), η συγκέντρωση συνουκλεΐνης (252), η διαταραχή της ουµπικουιτίνης (253), η (254, ενεργοποίηση των νευρογλοιακών κυττάρων 255), η ενεργοποίηση φλεγµονωδών διεργασιών µέσω των κυτταροκινών (256), η διαταραχή της οµοιόστασης ασβεστίου (257) και η διαταραχή στη έκφραση και εντόπιση των νευροτρόφων παραγόντων (258). Τελικό αποτέλεσµα των διεργασιών αυτών είναι η εµφάνιση εκτεταµένων συναπτικών αλλοιώσεων που εµποδίζουν την επικοινωνία µεταξύ των νευρώνων (205). 44

45 1.2.4 Νευροπαθολογικές Αλλοιώσεις Οι χαρακτηριστικές νευροπαθολογικές αλλοιώσεις της νόσου του Alzheimer είναι οι γεροντικές πλάκες, τα ενδοκυττάρια νευροϊνιδιακά δεµάτια, η ελάττωση του αριθµού των νευρώνων, η συγκέντρωση β-αµυλοειδούς στον εξωκυττάριο και ενδοκυττάριο χώρο και η µείωση του αριθµού των συνάψεων (259). Η εντόπιση των παραπάνω αλλοιώσεων (σε συνδυασµό) στις διάφορες περιοχές του εγκεφάλου έχει σηµασία για την επιβεβαίωση της διάγνωσης της νόσου (221, 260). Ωστόσο, υπάρχουν διαφωνίες σχετικά µε τη συµµετοχή τους στην παθογένεια και τη συσχέτισή τους µε τη βαρύτητα της νόσου (261). Σύµφωνα µε τη σταδιοποίηση των Braak και Braak, η οποία έγινε το 1991 και ισχύει µέχρι σήµερα, οι νευροϊνιδιακές αλλοιώσεις παρουσιάζουν χαρακτηριστική εντόπιση στον εγκέφαλο των πασχόντων και επιτρέπουν τη διάκριση έξι σταδίων. Στα δύο πρώτα στάδια οι αλλοιώσεις περιορίζονται στον τρανσ-ενδορινικό φλοιό (transentorhinal cortex), στα δύο επόµενα εντοπίζονται και στον ενδορινικό φλοιό και τον ιππόκαµπο και στα δύο τελευταία επεκτείνονται σε ολόκληρο το φλοιό των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων. Οι γεροντικές ή νευριτικές πλάκες (senile neuritic plaques) έχουν µία κεντρική συµπαγή περιοχή, που παρουσιάζει έντονη αργυροφιλία και εκεί εντοπίζονται εναποθέσεις β-αµυλοειδές, και µια περιφερική µε ινιδώδες υλικό, όπου παρατηρούνται διατεταµένοι και δυστροφικοί νευράξονες καθώς και συγκέντρωση αστροκυττάρων (262). Τα νευροϊνιδιακά δεµάτια ή τολύπια (neurofibrillary tangles) εντοπίζονται στο κυτταρόπλασµα των νευρώνων και δηµιουργούνται από ινίδια του κυτταροσκελετού περιελιγµένα κατά ζεύγη. Στα νευροϊνιδιακά δεµάτια παρατηρείται ανοσοϊστοχηµικά η συσσώρευση τ πρωτεΐνης (263). Γεροντικές πλάκες και νευροϊνιδιακά δεµάτια παρατηρούνται και στον εγκέφαλο ηλικιωµένων ατόµων που δεν πάσχουν από άνοια, αλλά η 45

46 εντόπισή τους είναι διαφορετική από αυτή που περιγράφεται στη νόσο του Alzheimer (264). Μεταξύ των νευροπαθολογικών αλλοιώσεων που περιγράφονται στη νόσο του Alzheimer η συναπτική εκφύλιση έχει κεντρική θέση (205, 265). Η εντόπιση και το εύρος των συναπτικών αλλοιώσεων συσχετίζεται καλύτερα µε την πορεία και τη βαρύτητα των κλινικών εκδηλώσεων, σε σχέση µε τις υπόλοιπες νευροπαθολογικές αλλοιώσεις (266, 267). Ακόµα, η εκφύλιση των συνάψεων φέρεται να έχει ενεργό ρόλο στην παθογένεια της νόσου ( ). Μελέτες των συνάψεων στη νόσο του Alzheimer µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο καταδεικνύουν µείωση της πυκνότητας των συνάψεων και αντίστοιχη αύξηση του µεγέθους τους κυρίως στον ιπποκάµπειο σχηµατισµό και στις συνειρµικές περιοχές του νεόφλοιου (271, 272). Παρακάτω θα αναφερθούµε πιο συγκεκριµένα σε φλοιικές περιοχές που εγκαθιστούν συνδέσεις µε την κεφαλή του κερκοφόρου πυρήνα (βλέπε Συνδέσεις του Κερκοφόρου Πυρήνα). Για την έξω ραχιαία περιοχή του µετωπιαίου λοβού (πεδίο 9 κατά Brodmann) περιγράφηκε µείωση της πυκνότητας των συνάψεων 42% στην στιβάδα ΙΙΙ και 29% στη στιβάδα V (273). Στον συνειρµικό φλοιό του κροταφικού λοβού (πεδία 21 και 22 κατά Brodmann) αναφέρθηκε µείωση 23 33% της συναπτικής πυκνότητας στις ίδιες στιβάδες (274). Επίσης, µείωση της πυκνότητας των συνάψεων παρατηρήθηκε και στην έλικα του προσαγωγίου (πεδία 23 και 24 κατά Brodmann), κυρίως στο οπίσθιο τµήµα της (24 33%) αλλά και στο πρόσθιο (20% µόνο στη στιβάδα ΙΙΙ και όχι στην V) (275). Αντίστοιχες µεταβολές στη συναπτική πυκνότητα έχουν επισηµανθεί και µε ανοσοϊστοχηµικές µελέτες έναντι πρωτεϊνών που σχετίζονται µε τη σύναψη τόσο στο προσυναπτικό πέρας όσο και στις δενδριτικές άκανθες, παρόλο που στις µελέτες αυτές παρατηρούνται ευρείες διακυµάνσεις στα αποτελέσµατα και διαφορές ανάλογα µε την πρωτεΐνη που χρησιµοποιείται (synaptophysin, synaptotagmin, synaptobrevin, synapsin, syntaxin, drebrin) ( ). 46

47 Η συναπτική εκφύλιση της νόσου του Alzheimer αφορά κυρίως τις χολινεργικές και τις γλουταµατεργικές συνάψεις (282). Από τις αρχές της δεκαετίας του 80 παρατηρήθηκε η δυσλειτουργία του χολινεργικού συστήµατος ( ) και µεταγενέστερες µελέτες επιβεβαίωσαν διαταραχές στους δείκτες που χρησιµοποιούνται για την σύνθεση και απελευθέρωση ακετυλοχολίνης καθώς στους υποδοχείς ακετυλοχολίνης ( ). Για τις γλουταµατεργικές συνάψεις παρατηρήθηκαν διαφορές στη συγκέντρωση και εντόπιση τόσο των NMDA και AMPA ιονοτροπικών υποδοχέων όσο και των µεταβοτροπικών υποδοχέων, µεταξύ των ασθενών και των ηλικιωµένων µαρτύρων ( ). Νευροπαθολογικές µελέτες σε ασθενείς που έπασχαν από νόσο του Alzheimer επεσήµαναν την ύπαρξη στον κερκοφόρο πυρήνα γεροντικών πλακών, νευροϊνιδιακών αλλοιώσεων και β-αµυλοειδούς (292, 293). Ακόµα, µορφολογικές µελέτες σε κυτταρικό και υποκυτταρικό επίπεδο επισηµαίνουν εκτεταµένες αλλοιώσεις στους µεγάλους χολινεργικούς νευρώνες του ραβδωτού σώµατος (294). Παρόλα αυτά και παρά τις συνδέσεις του κερκοφόρου πυρήνα µε τον προµετωπιαίο φλοιό, ο οποίο εµφανίζει εκτεταµένες αλλοιώσεις στην νόσου του Alzheimer, δεν έχουν διαπιστωθεί συναπτικές αλλοιώσεις στον πυρήνα, τουλάχιστον στην ανοσοϊστοχηµική εντόπιση προσυναπτικών πρωτεϊνών (279). 1.3 Σκοπός της µελέτης Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η µελέτη των ποιοτικών και ποσοτικών χαρακτηριστικών των νευρώνων και των συνάψεων του κερκοφόρου πυρήνα στον ανθρώπινο εγκέφαλο και η σύγκριση µε τα 47

48 αντίστοιχα χαρακτηριστικά σε ασθενείς που έπασχαν από τη νόσο του Alzheimer. Ο κερκοφόρος πυρήνας έχει εκτεταµένες συνδέσεις µε τον προµετωπιαίο φλοιό (263) και µέσω αυτών διαδραµατίζει κεντρικό ρόλο στη διαµόρφωση της συµπεριφοράς, στη µνήµη και τη µάθηση (164). Οι λειτουργίες αυτές παραβλάπτονται σηµαντικά στη νόσο του Alzheimer (205) και θα ήταν εύλογο να υποθέσει κανείς ότι ο κερκοφόρος πυρήνας είναι δυνατό να παρουσιάζει σηµαντικές αλλοιώσεις στους ασθενείς (295). Ωστόσο, νευροπαθολογικές µελέτες στον πυρήνα έχουν επισηµάνει µόνο ήπιες νευροϊνιδιακές αλλοιώσεις και µείωση της συγκέντρωσης των χολινεργικών νευρώνων (292, 296), χωρίς όµως αυτά να συνοδεύονται από συναπτικές αλλοιώσεις, που είναι δείκτης της λειτουργικής έκπτωσης που παρατηρείται στη νόσο (279). Αντίθετα, απεικονιστικές µελέτες της τελευταίας δεκαετίας σε ασθενείς µε νόσο του Alzheimer επισηµαίνουν ατροφικές αλλοιώσεις του κερκοφόρου πυρήνα, κυρίως της κεφαλής του στο αριστερό ηµισφαίριο ( ). Με σκοπό να διερευνηθεί το υπόστρωµα των αλλοιώσεων αυτών στην παρούσα διατριβή πραγµατοποιήθηκε µορφολογική και µορφοµετρική µελέτη των κυτταρικών και συναπτικών χαρακτηριστικών του πυρήνα. Για τη µελέτη των κυτταρικών χαρακτηριστικών χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος rapid-golgi, µία µέθοδος ευρέως γνωστή για τη λεπτοµερή απεικόνιση των νευρώνων µε τις αποφυάδες τους. Για τη µελέτη των συναπτικών χαρακτηριστικών αρχικά χρησιµοποιήθηκε ανοσοϊστοχηµεία για υποδοχείς του γλουταµινικού οξέος, καθώς όπως προαναφέρθηκε οι γλουταµατεργικές συνδέσεις του νεόφλοιου µε τον κερκοφόρο πυρήνα έχουν σηµαντικό ρόλο για την συµµετοχή του πυρήνα στις ανώτερες νοητικές λειτουργίες. Συγκεκριµένα χρησιµοποιήθηκε για τους NMDA υποδοχείς η υποµονάδα NMDAR1, η οποία είναι η απαραίτητη υποµονάδα για τη δηµιουργία λειτουργικών NMDA υποδοχέων. Για τους AMPA υποδοχείς µελετήθηκε η υποµονάδα GluR2, καθώς προηγούµενες 48

49 µελέτες έχουν επισηµάνει σηµαντικές µεταβολές αυτής της υποµονάδας AMPA υποδοχέων σε ασθενείς µε νόσο του Alzheimer (301). Για τους µεταβοτροπικούς υποδοχείς γλουταµινικού οξέος, καθώς ο ρόλος τους στη νόσο Alzheimer δεν είναι ακόµα σαφώς περιγεγραµµένος (302), µελετήθηκε η εντόπιση του τύπου mglur5, για τον οποίο έχουν περιγραφεί αλλοιώσεις στο σύνδροµο Down και σε µικρό δείγµα από ασθενείς µε νόσο του Alzheimer (303). Τέλος, τα συναπτικά χαρακτηριστικά µελετήθηκαν µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο, για τον ακριβή προσδιορισµό της πυκνότητας και του µεγέθους των συνάψεων στη νόσο του Alzheimer, κυρίως στην κεφαλή του αριστερού κερκοφόρου πυρήνα, που παρουσιάζει πιο εκτεταµένες ατροφικές αλλοιώσεις στους ασθενείς ( ). 49

50 ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 50

51 2.1 Ασθενείς και Μάρτυρες Για την παρούσα διατριβή συγκεντρώθηκαν νεκροτοµικά παρασκευάσµατα κερκοφόρου πυρήνα από 20 ασθενείς που έπασχαν από τη νόσο του Alzheimer και από 22 υγιείς µάρτυρες και των δύο φύλλων, διαφόρων ηλικιών, που δεν έπασχαν από κάποια νευρολογική ή ψυχιατρική πάθηση και απεβίωσαν µε αιφνίδιο θάνατο. Μελετήθηκε η κεφαλή του κερκοφόρου πυρήνα και στα δύο ηµισφαίρια. Τα παρασκευάσµατα παραχωρήθηκαν από τις τράπεζες εγκεφάλων Brain Bank Munich και Netherlands Brain Bank, µέλη του ευρωπαϊκού δικτύου τραπεζών εγκεφάλων BrainNet Europe, καθώς και από το Εργαστήριο Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτέλειου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης και από το Εργαστήριο Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστηµίου Αθηνών. Στον Πίνακα 2 φαίνονται τα περιστατικά τα οποία συµπεριλήφθηκαν στη µορφοµετρική µελέτη. Η εκπόνηση της µελέτης εγκρίθηκε από την Ιατρική Σχολή του Α.Π.Θ. (Γ.Σ.Ε.Σ. αριθµ.51/ ). Οι ασθενείς είχαν κλινική διάγνωση πιθανής νόσου του Alzheimer προχωρηµένου σταδίου και νευροπαθολογική επιβεβαίωση της διάγνωσης σταδίου V και VI κατά Braak και Braak (260). εν χρησιµοποιήθηκαν στη µορφοµετρική µελέτη ανοϊκοί ασθενείς µε εκσεσηµασµένες αγγειακές αλλοιώσεις ή µε σωµάτια Lewy κατά τη νευροπαθολογική εξέταση του εγκεφάλου. Επίσης, δεν συµπεριλήφθηκαν στη µελέτη περιστατικά µε οικογενή µορφή της νόσου, αλλά µόνο µε σποραδική. Η ηλικία των ασθενών που συµπεριλήφθηκαν στη µορφοµετρική µελέτη ήταν από 66 έως 87 έτη (µέση τιµή ± τυπική απόκλιση: 79±5,1 έτη). Οι φυσιολογικοί µάρτυρες που συµπεριλήφθηκαν στη µελέτη δεν έπασχαν από κάποια νευρολογική ή ψυχιατρική πάθηση και απεβίωσαν αιφνιδίως 51

52 (συχνότερες αιτίες θανάτου τροχαίο ατύχηµα και οξύ έµφραγµα του µυοκαρδίου). Η ηλικία τους ήταν από 7 έως 88 ετών. Από τους υγιείς µάρτυρες όσοι είχαν ηλικία από 66 έως 88 έτη (µέση τιµή ± τυπική απόκλιση: 78,4±6,6 έτη) αποτέλεσαν την οµάδα ελέγχου παρόµοιας ηλικίας για σύγκριση µε τους ασθενείς. Όσοι είχαν ηλικία από 17 έως 51 έτη (µέση τιµή ± τυπική απόκλιση: 28,7±12,3 έτη) αποτέλεσαν την οµάδα ελέγχου νεότερης ηλικία. 2.2 Μέθοδοι Οι κύριες µέθοδοι που χρησιµοποιήθηκαν στη µελέτη των παραπάνω παρασκευασµάτων είναι οι εξής: εµποτισµός των νευρώνων µε άλατα του αργύρου µε την ταχεία τεχνική Golgi, ανοσοϊστοχηµική εντόπιση υποδοχέων του γλουταµινικού οξέος και µελέτη της υποκυτταρικής µορφολογίας και των συνάψεων µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Επικουρικά χρησιµοποιήθηκαν επίσης οι µέθοδοι Nissl, Nauta και Gallyas Ταχεία µέθοδος Golgi Για τη µέθοδο Golgi χρησιµοποιήθηκε τροποποίηση που περιγράφεται σε προηγούµενη µελέτη (304). Τα ιστοτεµάχια µονιµοποιούνται σε διάλυµα φορµόλης 10% σε νερό για τουλάχιστον 2 εβδοµάδες και ακολουθούν: 1. Χρώση µε διχρωµικό κάλλιο: Τα ιστοτεµάχια τοποθετούνται (αφού προηγηθεί έκπλυση σε νερό) σε διάλυµα Κ 2 Cr 2 O 7 σε Η 2 Ο (7gr σε 300ml) για 7 ηµέρες σε φωτοστεγές περιβάλλον σε θερµοκρασία δωµατίου (18-23 ο C). 52

53 Πίνακας 2. Περιστατικά µορφοµετρικής µελέτης Κωδικός Περιστατικού E18 Ηλικία 84 ετών Φύλο ιάγνωση Νόσος Alzheimer Σταδιοποίηση κατά Braak και Braak V VI E19 80 ετών Νόσος Alzheimer V VI E08 80 ετών Μάρτυρας I II E10 66 ετών Μάρτυρας Ι - ΙΙ E23 29 ετών Μάρτυρας 0 E24 32 ετών Μάρτυρας 0 E25 86 ετών Μάρτυρας ΙΙ Ε17 74 ετών Μάρτυρας Ι - II Ε43 72 ετών Μάρτυρας Ι Ε20 20 ετών Μάρτυρας 0 Ε75 78 ετών Μάρτυρας Ι Ε76 81 ετών Νόσος Alzheimer V VI Ε60 80 ετών Μάρτυρας Ι - ΙΙ Οµάδα στην οποία κατατάχθηκε Ασθενείς Ασθενείς Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Νέοι Μάρτυρες Νέοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Νέοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Προέλευση EITΘ EITΘ EITΘ EITΘ EITΘ EITΘ EITΘ EITΘ EITΘ EITΘ ΕΙΤΑ ΕΙΤΑ ΕΙΤΑ Ηµισφαίριο Ε ΑΡ Ε ΑΡ Ε Ε Ε ΑΡ Ε ΑΡ Ε ΑΡ ΑΡ Ε ΑΡ Ε ΑΡ Ε ΑΡ Ε Ταχεία µέθοδος Golgi ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ Ανοσοϊστοχηµεία ٧ ٧ ٧ ٧ Ηλεκτρονική Μικροσκόπηση 53

54 54

55 Πίνακας 2. Περιστατικά µορφοµετρικής µελέτης (Συνέχεια) Κωδικός Περιστατικού Ηλικία Φύλο ιάγνωση Σταδιοποίηση κατά Braak και Braak Ε77 17 ετών Μάρτυρας 0 Ε79 51 ετών Μάρτυρας 0 Ε80 69 ετών Μάρτυρας I Ε82 86 ετών Μάρτυρας Ι - ΙΙ Ε74 23 ετών Μάρτυρας 0 RZ ετών Μάρτυρας I RZ ετών Μάρτυρας I RZ ετών Νόσος Alzheimer VI RZ ετών Νόσος Alzheimer V RZ ετών Νόσος Alzheimer V RZ ετών Νόσος Alzheimer V RZ ετών Νόσος Alzheimer VI Οµάδα στην οποία κατατάχθηκε Νέοι Μάρτυρες Νέοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Νέοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς Ασθενείς Ασθενείς Ασθενείς Ασθενείς Προέλευση ΕΙΤΑ ΕΙΤΑ ΕΙΤΑ ΕΙΤΑ ΕΙΤΑ BBM BBM BBM BBM BBM BBM BBM Ηµισφαίριο Ε ΑΡ Ε ΑΡ Ε ΑΡ Ε ΑΡ Ε ΑΡ ΑΡ ΑΡ ΑΡ Ε ΑΡ ΑΡ Ε Ταχεία µέθοδος Golgi Ανοσοϊστοχηµεία ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ ٧ Ηλεκτρονική Μικροσκόπηση 55

56 56

57 Πίνακας 2. Περιστατικά µορφοµετρικής µελέτης (Συνέχεια) Κωδικός Περιστατικού Ηλικία Φύλο ιάγνωση Σταδιοποίηση κατά Braak και Braak Οµάδα στην οποία κατατάχθηκε Ηµισφαίριο Προέλευση Ανοσοϊστοχηµεία Ταχεία µέθοδος Golgi Ηλεκτρονική Μικροσκόπηση 97/ ετών Μάρτυρας I Ηλικιωµένοι Μάρτυρες NBB ΑΡ ٧ 98/ ετών Μάρτυρας II Ηλικιωµένοι Μάρτυρες NBB ΑΡ ٧ 97/ ετών Μάρτυρας I Ηλικιωµένοι Μάρτυρες NBB ΑΡ ٧ 02/ ετών Νόσος Alzheimer V Ασθενείς NBB ΑΡ ٧ 97/ ετών Νόσος Alzheimer V Ασθενείς NBB ΑΡ ٧ ٧ 97/ ετών Νόσος Alzheimer VI Ασθενείς NBB ΑΡ ٧ ٧ 09/ ετών Νόσος Alzheimer V Ασθενείς NBB Ε ٧ ΕΙΤΘ: Εργαστήριο Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας Θεσσαλονίκης, ΕΙΤΑ: Εργαστήριο Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας Αθηνών, NBB: Netherlands Brain Bank, BBM: Brain Bank of Munich, ΑΡ: Αριστερό Ηµισφαίριο, Ε: εξί Ηµισφαίριο. 57

58 2. Εµποτισµός µε νιτρικό άργυρο: Τα ιστοτεµάχια τοποθετούνται σε διάλυµα AgNO 3 σε Η 2 Ο (1%) για 7 ηµέρες σε φωτοστεγές περιβάλλον σε θερµοκρασία δωµατίου (18-23 ο C). Προηγείται έκπλυση στο ίδιο διάλυµα µέχρι να διαυγάσει. 3. Αφυδάτωση: Τα τµήµατα του εγκεφάλου µετά τη χρώση ξεπλένονται µε απεσταγµένο νερό και τοποθετούνται σε διαδοχικά διαλύµατα αλκοόλης αυξανόµενης συγκέντρωσης (50% - 75% - 90%) για 10 λεπτά στο καθένα και τελικά σε καθαρή αλκοόλη (100%) για 15 λεπτά. Έπειτα τοποθετούνται σε καθαρή ξυλόλη για 10 λεπτά. 4. Σκήνωση σε παραφίνη: Τα ιστοτεµάχια παραµένουν σε λιωµένη παραφίνη στους 60 ο C για 24 ώρες. Ακολουθεί η σκήνωση σε κύβους παραφίνη, όπου παραµένουν για τουλάχιστον 12 ώρες έως ότου στερεοποιηθεί πλήρως η παραφίνη. 5. Τοµές σε µικροτόµο: Οι κύβοι παραφίνης που περιέχουν τα ιστοτεµάχια τέµνονται σε κυλιόµενο µικροτόµο Reinhart σε τοµές από 100µm έως 300µm. Οι τοµές στη συνέχεια τοποθετούνται σε καθαρή ξυλόλη (100%) και έπειτα σε διάλυµα αλκοόλης σε Η 2 Ο (90%), σε καθαρή αλκοόλη (100%) και τελικά πάλι σε καθαρή ξυλόλη (100%) από 10 λεπτά στο καθένα. 6. Αποπαραφίνωση των τοµών µε εµβάπτιση σε ξυλόλη για 10 λεπτά. 7. Αφυδάτωση των τοµών σε διαδοχικά υδατικά διαλύµατα αιθυλικής αλκοόλης (70%, 90%) για 5 λεπτά στο καθένα και τελικά σε απόλυτη αιθυλική αλκοόλη για 10 λεπτά. 8. ιαφανοποίηση των τοµών µε εµβάπτιση σε ξυλόλη για 10 λεπτά. 9. Επικόλληση καλυπτρίδων µε χρήση διαλυτού στην ξυλόλη µέσου (Entellan). Στην παρούσα µελέτη εφαρµόσθηκε η µέθοδος Golgi σε 31 παρασκευάσµατα κεφαλής κερκοφόρου πυρήνα, από τα οποία εµποτισµός ικανοποιητικού αριθµού νευρώνων για τη µορφοµετρική µελέτη επιτεύχθηκε 58

59 σε 21. Από αυτά 8 προήλθαν από ασθενείς (4 από δεξί ηµισφαίριο και 4 από αριστερό ηµισφαίριο, 5 από άρρενες και 3 από θήλεις, µέση ηλικία 79,2±7,3), 8 από ηλικιωµένους µάρτυρες (4 από δεξί ηµισφαίριο και 4 από αριστερό ηµισφαίριο, 5 από άρρενες και 3 από θήλεις, µέση ηλικία 76,6±6,5) και 5 από νέους µάρτυρες (3 από δεξί ηµισφαίριο και 2 από αριστερό ηµισφαίριο, 3 από άρρενες και 2 από θήλεις, µέση ηλικία 27±6,2). Η παρατήρηση των εµποτισµένων µε άργυρο παρασκευασµάτων έγινε σε οπτικό µικροσκόπιο Zeiss Axiostar-Plus. Με τη µέθοδο Golgi χρωµατίζεται µικρός αριθµός νευρικών κυττάρων µε ολόκληρο το δενδριτικό τους πεδίο και τµήµα του νευράξονα. Για να αποφευχθεί παρερµηνεία των αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκαν αυστηρά κριτήρια στη δειγµατοληψία των νευρώνων (305). Μόνο νευρώνες πλήρως εµποτισµένοι, µε ολόκληρο το δενδριτικό τους πεδίο και χωρίς σηµαντική αλληλοεπικάλυψη µε τους δενδρίτες γειτονικών κυττάρων, συµπεριλήφθηκαν στην µορφολογική περιγραφή των κυτταρικών πληθυσµών του κερκοφόρου πυρήνα, τη µορφοµετρική ανάλυση των χαρακτηριστικών τους και τη σύγκριση ανάµεσα στις οµάδες περιστατικών. Οι νευρώνες που επιλέχθηκαν για τη µορφοµετρική µελέτη (3-10 από κάθε παρασκεύασµα ανάλογα µε την ποιότητα της χρώσης) φωτογραφήθηκαν σε µεγέθυνση x400 σε διαδοχικές φωτογραφίες µε διαφορετικό βάθος εστίασης ώστε να απεικονίζεται ολόκληρο το δενδριτικό τους πεδίο. Για κάθε νευρώνα ελήφθησαν φωτογραφίες ανάλογα µε το εύρος του δενδριτικού πεδίου. Ακολούθως, µε τη βοήθεια του προγράµµατος ImageJ ( έγινε προβολή ολόκληρου του δενδριτικού πεδίου σε δύο διαστάσεις (stack). Πάνω σε αυτή την προβολή αποτυπώθηκαν οι δενδρίτες µε ηµιαυτόµατο τρόπο µε τη βοήθεια της επέκτασης NeuronJ του προγράµµατος ImageJ (Εικόνα 8) ( ). 59

60 Εικόνα 8. Μέσου µεγέθους ακανθώδης νευρώνας κερκοφόρου πυρήνα ανθρώπου. Αριστερά φαίνεται το πλήρες δενδριτικό πεδίο του νευρώνα µετά από προβολή του, από διαδοχικές φωτογραφίες σε δύο διαστάσεις (stack) µε το πρόγραµµα ImageJ. εξιά φαίνεται η αποτύπωση των δενδριτών (tracing) µε την επέκταση NeuronJ του ίδιου προγράµµατος. Με διαφορετικό χρώµα απεικονίζονται οι δενδρίτες διαφορετικής κλάσης. Μπλε: πρωτοταγείς δενδρίτες, κίτρινο: δευτεροταγείς, πράσινο: τριτοταγείς, µαύρο: τεταρτοταγείς, κόκκινο: πεµπτοταγείς και θαλασσί: αρχικό τµήµα του νευράξονα. Οι παράµετροι που συµπεριλήφθηκαν στη µορφοµετρική ανάλυση είναι: ο αριθµός των δενδριτών κατά κλάση, το µήκος των δενδριτών κατά κλάση, το συνολικό µήκος των δενδριτών, η πυκνότητα των ακανθών ανά 10µm σε απόσταση 40 και 90µm από το κυτταρικό σώµα και τέλος η πυκνότητα του δενδριτικού πεδίου ανάλογα µε την απόσταση από το κυτταρικό σώµα. Οι παράµετροι αυτοί προκύπτουν µετά από επεξεργασία των δεδοµένων της αποτύπωσης των δενδριτών από το πρόγραµµα NeuronJ, εκτός από την πυκνότητα των ακανθών και την πυκνότητα του δενδριτικού πεδίου. Η πυκνότητα των ακανθών προσδιορίστηκε µε άµεση καταµέτρηση κατά την 60

61 µικροσκόπηση σε µεγέθυνση x1000, µε προσοφθάλµια µικροµετρική κλίµακα και επιβεβαίωση των αποτελεσµάτων στις φωτογραφίες. Για την εκτίµηση της πυκνότητας του δενδριτικού πεδίου σε σχέση µε την απόσταση από το κυτταρικό σώµα χρησιµοποιήθηκε η µέθοδος των οµόκεντρων κύκλων του Sholl ( ). Σύµφωνα µε τη µέθοδο, στη δυσδιάστατη προβολή του δενδριτικού πεδίου κάθε νευρώνα σχεδιάζονται οµόκεντροι κύκλοι µε κέντρο το κυτταρικό σώµα. Οι οµόκεντροι κύκλοι έχουν αυξανόµενη ακτίνα κατά 20µm και καταµετράται ο αριθµός των δενδριτών που τέµνουν κάθε οµόκεντρο κύκλο (Εικόνα 9). Εικόνα 9. Μέθοδος των οµόκεντρων κύκλων του Sholl στον νευρώνα της εικόνας Ανοσοϊστοχηµεία Για την εντόπιση των υποδοχέων των διεγειρόντων αµινοξέων στους νευρώνες του κερκοφόρου πυρήνα χρησιµοποιήθηκαν συνήθη πρωτόκολλα ανοσοϊστοχηµείας για τοµές παραφίνης. Τα παρασκευάσµατα 61

62 µονιµοποιήθηκαν σε διάλυµα φορµόλης 4% σε νερό για 2 έως 15 ηµέρες και µετά από αφυδάτωση, σκηνώθηκαν σε κύβους παραφίνης. Από αυτούς τοµές 8µm χρησιµοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχηµεία, µε αντισώµατα έναντι των υποδοχέων των διεγειρόντων αµινοξέων (NMDAR1, GluR2, mglur5). Η πειραµατική διαδικασία που ακολουθήθηκε έχει ως εξής: 1. Τοποθέτηση των τοµών παραφίνης σε κλίβανο στους 56 ο C για 30 λεπτά, για να λιώσει η παραφίνη από τις τοµές. 2. Αποπαραφίνωση των τοµών µε εµβάπτισή τους διαδοχικά σε δύο διαλύµατα ξυλόλης 100%, για 10 λεπτά στο καθένα, σε θερµοκρασία δωµατίου. 3. Σταδιακή ενυδάτωση των τοµών µε διαδοχική εµβάπτιση σε διαλύµατα αιθυλικής αλκοόλης (100%, 90%, 70%, 50%) για 5 λεπτά σε κάθε διάλυµα και τελικά σε απεσταγµένο νερό για 5 10 λεπτά. 4. Ανάδειξη αντιγονικών επιτόπων : επικάλυψη των τοµών µε κιτρικό νάτριο σε ph 6.0 και τοποθέτηση των τοµών στον φούρνο µικροκυµάτων 5 min στα 700 watt, 5 min στα 500 watt και 5 min στα 300 watt. 5. Παραµονή σε απεσταγµένο νερό για 5 10 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου, προκειµένου να γίνει επαναδίπλωση των πρωτεϊνικών αλυσίδων. 6. Έκπλυση των τοµών σε απεσταγµένο νερό (2 φορές x 5 λεπτά). 7. Έκπλυση των τοµών σε TBS µε ph 7.4 (3 φορές x 5 λεπτά). 8. Αδρανοποίηση της ενδογενούς υπεροξειδάσης του ιστού µε εµβάπτιση των τοµών σε διάλυµα 0,3% Η 2 Ο 2 σε απεσταγµένο νερό επί 3 λεπτά (σε σκοτεινό µέρος). 9. Έκπλυση των τοµών σε TBS µε ph 7.4 (3 φορές x 5 λεπτά). 10. Επώαση µε το πρωτογενές µονοκλωνικό αντίσωµα για 20 ώρες στους 4 ο C. 11. Έκπλυση των τοµών σε TBS µε ph 7.4 (3 φορές x 5 λεπτά). 12. Επώαση µε το διάλυµα En vision της DakoCytomation για 45 λεπτά. 62

63 13. Έκπλυση των τοµών σε TBS µε ph 7.4 (3 φορές x 5 λεπτά). 14. Επώαση σε διάλυµα 0,05% DAB (χρωµογόνο) για 10 min. 15. Έκπλυση µε απεσταγµένο νερό. 16. Έκπλυση µε τρεχούµενο νερό βρύσης. 17. Χρώση αντίθεσης των πυρήνων (counterstaining) µε αιµατοξυλίνη Harris. 18. Έκπλυση µε τρεχούµενο νερό βρύσης. 19. Αφυδάτωση των τοµών σε διαδοχικά υδατικά διαλύµατα αιθυλικής αλκοόλης (50%, 70%, 90%) για 3 λεπτά στο καθένα και τελικά σε απόλυτη αιθυλική αλκοόλη (2 φορές x 5 λεπτά). 20. ιαφανοποίηση των τοµών µε εµβάπτιση σε ξυλόλη (2 φορές x 2 λεπτά). 21. Επικόλληση καλυπτρίδων µε χρήση διαλυτού στην ξυλόλη µέσου (Entellan). Τα πρωτογενή µονοκλωνικά αντισώµατα που χρησιµοποιήθηκαν είναι τα εξής: 1) anti-nmdar1 (Abcam, Αρ. Κατ. ab52177) σε αραίωση 1/100, 2) anti- GluR2 (Abcam, Αρ. Κατ. ab40878) σε αραίωση 1/100 και 3) anti-mglur5 (Abcam, Αρ. Κατ. ab27190) σε αραίωση 1/100. Η παραπάνω πειραµατική διαδικασία εκτελέσθηκε σε θερµοκρασία δωµατίου, εκτός από τα βήµατα στα οποία αναφέρεται διαφορετική θερµοκρασία (βήµατα 1, 4 και 10). Για τον καθορισµό του παραπάνω πρωτοκόλλου, παραλλαγές αυτού εφαρµόστηκαν σε τοµές παραφίνης από τµήµατα του φλοιού των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων, όπου οι υποδοχείς των διεγειρόντων αµινοξέων υπάρχουν σε αφθονία και η εντόπιση τους στον ανθρώπινο εγκέφαλο έχει περιγραφεί εκτενώς ( ). Παράλληλα µε τη χρώση των τοµών του κερκοφόρου πυρήνα χρησιµοποιήθηκαν και τοµές από το φλοιό των ηµισφαιρίων ως θετικοί µάρτυρες. Επίσης, χρησιµοποιήθηκαν και τοµές στις οποίες παραλήφθηκε το 63

64 πρωτογενές αντίσωµα ως αρνητικοί µάρτυρες για την επαλήθευση της ειδικότητας της ανοσοϊστοχηµικής αντίδρασης. Ανοσοϊστοχηµεία εφαρµόστηκε σε 21 παρασκευάσµατα κερκοφόρου πυρήνα. Από αυτά 7 προήλθαν από ασθενείς (3 από δεξί ηµισφαίριο και 4 από αριστερό ηµισφαίριο, 5 από άρρενες και 2 από θήλεις, µέση ηλικία 77,8±2,3), 8 από ηλικιωµένους µάρτυρες (4 από δεξί ηµισφαίριο και 4 από αριστερό ηµισφαίριο, 7 από άρρενες και 1 από θήλεις, µέση ηλικία 78,2±7,0) και 6 από νέους µάρτυρες (3 από δεξί ηµισφαίριο και 3 από αριστερό ηµισφαίριο, 4 από άρρενες και 2 από θήλεις, µέση ηλικία 30,3±18,1). Η παρατήρηση των κεχρωσµένων τοµών έγινε σε οπτικό µικροσκόπιο Zeiss Axiostar-Plus για την περιγραφή της εντόπισης των υποδοχέων στον κερκοφόρο πυρήνα. Ακολούθως, ελήφθησαν 3-10 φωτογραφίες σε µεγέθυνση x1000 από τυχαίες θέσεις κάθε παρασκευάσµατος, από το ραχιαίο, µέσο και κοιλιακό τµήµα του κερκοφόρου πυρήνα. Στις φωτογραφίες προσδιορίστηκαν µε τη βοήθεια του προγράµµατος ImageJ ο συνολικός αριθµός των νευρώνων και το ποσοστό των νευρώνων στους οποίους εντοπίστηκαν ανοσοϊστοχηµικά οι υποδοχείς των διεγειρόντων αµινοξέων, για σύγκριση µεταξύ ασθενών που έπασχαν από νόσο Alzheimer, ηλικιωµένων και νέων µαρτύρων Ηλεκτρονική Μικροσκόπηση Στη µελέτη του κερκοφόρου πυρήνα στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο συµπεριλήφθηκαν αποκλειστικά περιστατικά µε καθυστέρηση µικρότερη από 6 ώρες από το θάνατο µέχρι τη µονιµοποίηση των παρασκευασµάτων. Το κριτήριο αυτό ικανοποιούσαν µόνο περιστατικά από την τράπεζα εγκεφάλων Netherlands Brain Bank. Τα παρασκευάσµατα από τη λήψη τους καταψύχθηκαν σε βαθιά κατάψυξη (-80 ο C) και µεταφέρθηκαν από το 64

65 Άµστερνταµ στη Θεσσαλονίκη κατεψυγµένα. Έπειτα, ακολουθήθηκε η εξής πειραµατική διαδικασία για την προετοιµασία τους για το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο: 1. ιατοµή κύβων µε πλευρά 0,5-1mm από τη περιοχή ενδιαφέροντος των παρασκευασµάτων. Κατά τη διατοµή το παρασκεύασµα ήταν εµβαπτισµένο σε κρύο µονιµοποιητικό (όµοιο µε του βήµατος 2), σε γυάλινο τρυβλίο τοποθετηµένο µέσα σε τριµµένο πάγο. 2. Μονιµοποίηση για 2,5 ώρες σε διάλυµα γλουταραλδεΰδης 2,5% και παραφορµαλδεΰδης 2% σε 0.1M PBS µε ph 7,4 στους 4 ο C. 3. Έκπλυση σε 0.1M PB µε ph 7,4 για 10 λεπτά (3 φορές). 4. Παραµονή σε 0.1M PB µε ph 7,4 για 20 ώρες. 5. Μονιµοποίηση για 30 λεπτά σε διάλυµα OsO 4 1% σε 0.1M PBS µε ph 7,4. 6. Έκπλυση σε υδατικό διάλυµα 0.1M C 2 H 3 NaO 2 για 5 λεπτά (3 φορές). 7. Αφυδάτωση σε διαδοχικά διαλύµατα αλκοόλης για 15 λεπτά στο κάθε ένα (50%-70%-90%-90%-100%-100%). 8. Εµποτισµός µε οξικό προπυλένιο 100% για 15 λεπτά (2 φορές). 9. Εµποτισµός µε µείγµα ίσων όγκων οξικού προπυλενίου και αραλδίτη για 15 λεπτά. 10. Εµποτισµός µε µείγµα οξικού προπυλενίου και αραλδίτη 1:2 για 18 ώρες. 11. Εγκλεισµός σε πλαστική κάψουλα µε µείγµα πολυµερισµού αραλδίτη στους 60 ο C για 24 µε 48 ώρες. 12. Ηµίλεπτες τοµές (0,8 µm) χρησιµοποιήθηκαν για εντοπισµό κατάλληλου σηµείου για λεπτές τοµές, µετά από χρώση µε κυανό της τολουιδίνης 1%. 13. Λεπτές τοµές (90 nm) τοποθετήθηκαν πάνω σε πλέγµατα χαλκού και χρησιµοποιήθηκαν για το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο, µετά από την ακόλουθη χρώση. 65

66 14. Στέγνωµα για 24 ώρες πάνω σε διηθητικό χαρτί. 15. Χρώση µε διάλυµα 3% οξικού ουρανυλίου για 30 λεπτά. 16. Έκπλυση σε απεσταγµένο νερό για 30 δευτερόλεπτα (3 φορές). 17. Στέγνωµα για 24 ώρες. 18. Χρώση µε διάλυµα Reynold s (κιτρικός µόλυβδος) για 30 λεπτά. 19. Έκπλυση σε απεσταγµένο νερό για 30 δευτερόλεπτα (3 φορές). Από το βήµα 2 και µετά όλη η διαδικασία εκτελέσθηκε σε θερµοκρασία δωµατίου, εκτός από το βήµα 10. Η λήψη λεπτών και ηµίλεπτων τοµών έγινε σε µικροτόµο ακριβείας Reinhart Ultratome. Σηµαντικό µέρος της παραπάνω διαδικασίας εκτελέσθηκε στο Εργαστήριο Ιστολογίας και Ανατοµίας της Κτηνιατρικής Σχολής του ΑΠΘ, µε τη βοήθεια και την καθοδήγηση της κ. Χιωτέλη Μαρίας. Στη µορφοµετρική µελέτη των συνάψεων στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο συµπεριλήφθηκαν 6 περιστατικά, 3 ασθενείς που έπασχαν από νόσο του Alzheimer (1 άρρεν και 2 θήλεις, µέση ηλικία 81±5,3) και 3 ηλικιωµένοι µάρτυρες (1 άρρεν και 2 θήλεις, µέση ηλικία 83,3±5,7). Μελετήθηκε ο κερκοφόρος πυρήνας από το αριστερό ηµισφαίριο καθώς µελέτες µε µαγνητική τοµογραφία σε ασθενείς που πάσχουν από τη νόσο του Alzheimer δείχνουν ότι σε αυτό υπάρχουν πιο εκτεταµένες αλλοιώσεις ( ). Η παρατήρηση και φωτογράφηση των παρασκευασµάτων για τη µορφολογική περιγραφή των υποκυτταρικών χαρακτηριστικών του κερκοφόρου πυρήνα στους υγιείς µάρτυρες και στους ασθενείς που έπασχαν από νόσο Alzheimer έγινε στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο Zeiss 9aS της Α Νευρολογικής Κλινικής, µε ασπρόµαυρα µικροκοκκικά φιλµ της AGFA. Η µορφοµετρική ανάλυση της πυκνότητας και του µεγέθους των συνάψεων έγινε στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο JEOL-2000 του Εργαστηρίου Ιστολογίας Εµβρυολογίας της Ιατρικής Σχολής του ΑΠΘ, µε φωτογραφίες σε ασπρόµαυρα µικροκοκκικά φιλµ της Maco. έκα φωτογραφίες σε µεγέθυνση x

67 ελήφθησαν από τυχαίες θέσεις του νευροπηλιµατικού χώρου σε κάθε παρασκεύασµα. Από τη µορφοµετρική ανάλυση αποκλείσθηκαν φωτογραφίες που περιελάµβαναν κυτταρικά σώµατα ή αγγεία, όπως και όσες δεν είχαν καµία σύναψη. Σε κάθε φωτογραφία καταµετρήθηκε ο αριθµό των συνάψεων που εµφανιζόταν ακέραιες, χωρίς να τέµνονται από τα όρια του πεδίου της φωτογραφίας και µε το πρόγραµµα ImageJ προσδιορίσθηκε το µήκος κάθε σύναψης. Για την εντόπιση των συνάψεων απαραίτητη θεωρήθηκε η παρουσία συναπτικών κυστιδίων στο προσυναπτικό πέρας, εκτός από τις πεπαχυσµένες µεµβράνες (προσυναπτική και µετασυναπτική) Μέθοδοι Nissl Nauta Gallyas Οι τρεις αυτές µέθοδοι χρησιµοποιήθηκαν επικουρικά σε µικρό αριθµό παρασκευασµάτων για τη µορφολογική παρατήρηση στον κερκοφόρο πυρήνα των νευρικών ινών (µέθοδος Nauta) (Εικόνα 10Α), των κυτταρικών σωµάτων (µέθοδος Nissl) και των νευροινιδιακών αλλοιώσεων της νόσου του Alzheimer (µέθοδος Gallyas). Με τη µέθοδο Gallyas επίσης έγινε η σταδιοποίηση των νευροϊνιδιακών αλλοιώσεων (260) (Εικόνα 10Β) στα περιστατικά τα προερχόµενα από το Εργαστήριο Ιατροδικαστικής και Τοξικολογίας της Θεσσαλονίκης και της Αθήνας. Για τη µέθοδο Nissl χρησιµοποιήθηκε κυανού του µεθυλενίου σε τοµές παραφίνης 8µm ως εξής: 1. Τοποθέτηση των τοµών παραφίνης σε κλίβανο στους 56 ο C για 30 λεπτά, για να λιώσει η παραφίνη από τις τοµές. 2. Αποπαραφίνωση των τοµών µε εµβάπτισή τους διαδοχικά σε δύο διαλύµατα ξυλόλης 100%, για 10 λεπτά στο καθένα, σε θερµοκρασία δωµατίου. 67

68 3. Σταδιακή ενυδάτωση των τοµών µε διαδοχική εµβάπτιση σε διαλύµατα αιθυλικής αλκοόλης (100%, 90%, 70%, 50%) για 5 λεπτά σε κάθε διάλυµα και τελικά σε νερό βρύσης για 5 10 λεπτά. 4. Χρώση σε υδατικό διάλυµα κυανού του µεθυλενίου 1% για 3 λεπτά. 5. Έκπλυση των τοµών σε τρεχούµενο νερό βρύσης για 3 λεπτά. 6. Αφυδάτωση των τοµών σε διαδοχικά υδατικά διαλύµατα αιθυλικής αλκοόλης (50%, 70%, 90%) για 30 δευτερόλεπτα στο καθένα και τελικά σε απόλυτη αιθυλική αλκοόλη. 7. ιαφανοποίηση των τοµών µε εµβάπτιση σε ξυλόλη (2 φορές x 1 λεπτά). 8. Επικόλληση καλυπτρίδων µε χρήση διαλυτού στην ξυλόλη µέσου (Entellan). Για τη χρώση Nauta χρησιµοποιήθηκαν τοµές 25µm από κρυοστάτη στις οποίες πραγµατοποιήθηκε η εξής διαδικασία: 1. Αποµυελίνωση µε µείγµα ενός µέρους ΝΗ 4 ΟΗ (πυκνού) και 99 µερών 50% αλκοόλης, για 12 ώρες σε 30 ο C. 2. Έκπλυση σε απεσταγµένο Η 2 Ο για 5 λεπτά. 3. Τοποθέτηση των τοµών σε µείγµα µε AgNO 3 1,5gr, H 2 O 100ml και πυριδίνη (καθαρή) 5ml, για 12 µε 24 ώρες. 4. Μεταφορά των τοµών σε διάλυµα που ετοιµάζεται φρέσκο ως ακολούθως: Σε 30ml διαλύµατος AgNO 3 1,5% σε αλκοόλη 32% προσθέτουµε - 2ml πυκνού διαλύµατος ΝΗ 4 ΟΗ και - 2ml διαλύµατος NaOH 2,5% σε Η 2 Ο. Οι τοµές παραµένουν στο διάλυµα για 2 µε 5 λεπτά 5. Τοποθέτηση των τοµών µέχρι να αποκτήσουν χρώµα ανοιχτό καφέ σε µείγµα αποτελούµενο από: 13,5ml φορµόλης 10%, 450ml αλκοόλης 10% και 13,5ml κιτρικού οξέος 1%. 68

69 Α Β Εικόνα 10. Α) Νευρικές ίνες στην κεφαλή του κερκοφόρου πυρήνα υγιούς µάρτυρα µε τη µέθοδο Nauta. Κλίµακα 20µm. B) Νευροϊνιδιακές αλλοιώσεις στη CA1 περιοχή του ιπποκάµπου σε ασθενή που έπασχε από τη νόσο του Alzheimer. Παρασκεύασµα που χρησιµοποιήθηκε για την επιβεβαίωση της διάγνωσης και τη σταδιοποίηση κατά Braak και Braak (260). Κλίµακα 20µm. 6. Μεταφορά σε διάλυµα Na 2 S 2 O 3 (sodium thiosulfate) 2,5% για 10 δευτερόλεπτα. 7. Έκπλυση σε απεσταγµένο νερό. 8. Αφυδάτωση των τοµών σε διαδοχικά υδατικά διαλύµατα αιθυλικής αλκοόλης (50%, 70%, 90%) για 5 λεπτά στο καθένα και τελικά σε απόλυτη αιθυλική αλκοόλη (2 φορές x 5 λεπτά). 9. ιαφανοποίηση των τοµών µε εµβάπτιση σε ξυλόλη (2 φορές x 2 λεπτά). 10. Επικόλληση καλυπτρίδων µε χρήση διαλυτού στην ξυλόλη µέσου (Entellan). Η µέθοδος Gallyas εφαρµόστηκε σε τοµές παραφίνης 8µm. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε είναι η ακόλουθη: 69

70 1. Τοποθέτηση των τοµών παραφίνης σε κλίβανο στους 56 ο C για 30 λεπτά, για να λιώσει η παραφίνη από τις τοµές. 2. Αποπαραφίνωση των τοµών µε εµβάπτισή τους διαδοχικά σε δύο διαλύµατα ξυλόλης 100%, για 10 λεπτά στο καθένα, σε θερµοκρασία δωµατίου. 3. Σταδιακή ενυδάτωση των τοµών µε διαδοχική εµβάπτιση σε διαλύµατα αιθυλικής αλκοόλης (100%, 90%, 70%, 50%) για 5 λεπτά σε κάθε διάλυµα και τελικά σε νερό βρύσης για 5 10 λεπτά. 4. Τοποθέτηση των τοµών σε διάλυµα περιοδικού οξέος 5% για 5 λεπτά 5. Έκπλυση σε απεσταγµένο νερό (2 φορές x 5 λεπτά). 6. Τοποθέτηση των τοµών σε διάλυµα αποτελούµενο από 40gr NaOH, 100gr KI, 500ml απεσταγµένο νερό και 35ml διαλύµατος 1% AgNO 3, για 1 λεπτό. 7. Έκπλυση σε υδατικό διάλυµα 0.5% οξικού οξέος για 10 λεπτά. 8. Τοποθέτηση των τοµών σε διάλυµα αποτελούµενο από 15gr Na 2 CO 3, 3.4gr NH 4 NO 3, 3.4gr AgNO 3, 17gr H 4 [W 12 SiO 40 ] (tungstosilicic acid) και 5ml φορµαλδεΰδη σε 2lt απεσταγµένο νερό, για 5-30 λεπτά. 9. Έκπλυση σε υδατικό διάλυµα 0.5% οξικού οξέος για 3 λεπτά. 10. Έκπλυση σε απεσταγµένο νερό για 5 λεπτά. 11. Τοποθέτηση των τοµών σε υδατικό διάλυµα 0.1% AuCl 3 για 5 λεπτά. 12. Ταχεία έκπλυση σε απεσταγµένο νερό. 13. Τοποθέτηση των τοµών σε υδατικό διάλυµα 1% Na 2 S 2 O 3 για 5 λεπτά. 14. Έκπλυση των τοµών σε νερό βρύσης για 5 10 λεπτά. 15. Αφυδάτωση των τοµών σε διαδοχικά υδατικά διαλύµατα αιθυλικής αλκοόλης (50%, 70%, 90%) για 3 λεπτά στο καθένα και τελικά σε απόλυτη αιθυλική αλκοόλη (2 φορές x 5 λεπτά). 16. ιαφανοποίηση των τοµών µε εµβάπτιση σε ξυλόλη (2 φορές x 2 λεπτά). 70

71 17. Επικόλληση καλυπτρίδων µε χρήση διαλυτού στην ξυλόλη µέσου (Entellan) Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων έγινε µε το λογισµικό Statistical Package for Social Sciences Version 16.0 for Windows (SPSS, Chicago, IL, USA). Τα περιστατικά χωρίστηκαν σε τρεις οµάδες ασθενείς που έπασχαν από νόσο του Alzheimer, ηλικιωµένοι µάρτυρες, νέοι µάρτυρες και η ανάλυση της διακύµανσης της µέσης τιµής (ANOVA) χρησιµοποιήθηκε για τη σύγκριση των µέσων τιµών κάθε παραµέτρου µεταξύ των οµάδων. Ακολούθως, έγινε σύγκριση µεταξύ των οµάδων ανά δύο (ηλικιωµένοι µάρτυρες ασθενείς, νέοι µάρτυρες ηλικιωµένοι µάρτυρες), µε post hoc tests (Least Significant Difference (LSD)). Τα αποτελέσµατα της στατιστικής επεξεργασίας παρουσιάζονται ως µέση τιµή ± τυπική απόκλιση. Στατιστικώς σηµαντικά θεωρήθηκαν τα αποτελέσµατα µε τιµή p < Οι παράµετροι που συµπεριλήφθηκαν στη στατιστική επεξεργασία για κάθε νευρώνα εµποτισµένο µε τη µέθοδο rapid-golgi είναι οι ακόλουθοι: συνολικό µήκος των δενδριτών αριθµός δενδριτών ανά κλάση (πρωτογενείς, δευτερογενείς,...) µήκος δενδριτών ανά κλάση (πρωτογενείς, δευτερογενείς,...) αριθµός δενδριτών που τέµνει κάθε οµόκεντρο κύκλο (µέθοδος Sholl) αριθµός δενδριτικών ακανθών ανά 10µm µήκος δενδρίτη σε απόσταση 40-50µm από το κυτταρικό σώµα 71

72 αριθµός δενδριτικών ακανθών ανά 10µm µήκος δενδρίτη σε απόσταση µm από το κυτταρικό σώµα Από την ανοσοϊστοχηµική εντόπιση των υποδοχέων των διεγειρόντων αµινοξέων, στατιστική ανάλυση έγινε για: τον συνολικό αριθµό των νευρώνων ανά οπτικό πεδίο το ποσοστό των νευρώνων που φέρουν τους υποδοχείς αυτούς το µέγεθος του κυτταρικού σώµατος των νευρώνων που φέρουν τους υποδοχείς την ένταση της ανοσοϊστοχηµικής χρώσης σε κάθε νευρώνα. Από την ηλεκτρονική µικροσκόπηση συµπεριλήφθηκαν στη στατιστική ανάλυση: η πυκνότητα των συνάψεων ανά 22µm 2 το µέγεθος των συνάψεων Για τα δεδοµένα από την ηλεκτρονική µικροσκόπηση η σύγκριση µεταξύ ασθενών και ηλικιωµένων µαρτύρων έγινε µε two-tailed Student s t test. Στατιστικώς σηµαντικά θεωρήθηκαν τα αποτελέσµατα µε τιµή p < Για τις παραπάνω παραµέτρους εκτός από τη σύγκριση µεταξύ των οµάδων των περιστατικών, έγινε συσχέτιση µε το φύλο, την ηλικία, την καθυστέρηση από την ώρα θανάτου µέχρι τη µονιµοποίηση, το ηµισφαίριο και τη θέση των κυττάρων στον κερκοφόρο πυρήνα (ραχιαία µέση κοιλιακή εντόπιση). Οι συσχετίσεις µεταξύ διαφορετικών παραµέτρων ελέγχθηκαν µε το Pearson s test. Στατιστικώς σηµαντικά θεωρήθηκαν τα αποτελέσµατα µε τιµή p < εν διαπιστώθηκε στατιστικά σηµαντική συσχέτιση των παραµέτρων που ελέγχονται µε καµία από τις παραπάνω παραµέτρους. 72

73 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 73

74 3.1 Ταχεία µέθοδος Golgi Η τεχνική εµποτισµού των νευρικών κυττάρων µε τη µέθοδο Golgi αποκαλύπτει πλήρως το δενδριτικό τους πεδίο και για το λόγο αυτό χρησιµοποιείται ευρέως για την περιγραφή των µορφολογικών χαρακτηριστικών των νευρώνων σε διάφορες περιοχές του εγκεφάλου και των αλλοιώσεών τους σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις ( ). Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αρχικά µελετήθηκαν µορφολογικά οι νευρώνες του κερκοφόρου πυρήνα στους υγιείς µάρτυρες. Η πλειοψηφία των νευρώνων που εµποτίστηκαν µε τη µέθοδο rapid-golgi παρουσιάζουν κυτταρικό σώµα ωοειδές ή πολυεδρικό, µε µεγάλη διάµετρο περί τα 25µm και µικρή διάµετρο περί τα 15µm. Από το κυτταρικό τους σώµα ξεκινούν 4 έως 11 πρωτοταγείς δενδρίτες, οι οποίοι συνήθως έχουν ευρύ στέλεχος και µετά από 5-30µm διακλαδίζονται στους δευτεροταγείς. Το δενδριτικό τους πεδίο εκτείνεται ακτινοειδώς µέχρι απόσταση 300µm από το κυτταρικό σώµα και οι διακλαδώσεις µπορεί να φθάνουν µέχρι και πεµπτοταγείς δενδρίτες, χωρίς αυτό να είναι το πιο συχνό. Ενίοτε, πρωτοταγείς δενδρίτες ξεκινούν από το κυτταρικό σώµα έχοντας µικρό πάχος και συνεχίζουν µε ελάχιστες ή καθόλου διακλαδώσεις µέχρι την κατάληξή τους. Κοινό χαρακτηριστικό όλων των δενδριτών ανεξάρτητα από την τάξη διακλάδωσής τους είναι ότι σε µικρή απόσταση από το κυτταρικό σώµα, µέχρι περίπου 30µm, δεν έχουν καθόλου δενδριτικές άκανθες και από εκεί µέχρι το ακρότατο σηµείο τους είναι καλυµµένοι από πολυάριθµες άκανθες. Το χαρακτηριστικό αυτό σε συνδυασµό µε το µέγεθος του κυτταρικού σώµατος έχει προσδώσει στους νευρώνες αυτούς το όνοµα µέσου µεγέθους ακανθώδεις νευρώνες (medium size spiny neurons) (Εικόνα 11). 74

75 Εικόνα 11. Μέσου µεγέθους ακανθώδης νευρώνας κερκοφόρου πυρήνα. Οι δενδρίτες είναι καλυµµένοι από πολυάριθµες άκανθες εκτός από το αρχικό τµήµα κοντά στο κυτταρικό σώµα. Με βέλος σηµειώνεται ο νευράξονας. Κλίµακα 20µm. Εκτός από τους νευρώνες αυτούς παρατηρήθηκε στον κερκοφόρο πυρήνα η ύπαρξη µικρού αριθµού νευρικών κυττάρων µε µικρότερη συγκέντρωση δενδριτικών ακανθών από τα τυπικά µέσου µεγέθους ακανθώδη κύτταρα. Το κυτταρικό σώµα των νευρώνων αυτών είναι µέσου ή µεγάλου µεγέθους, µε διάµετρο 20 έως 40µm. Άλλοι νευρώνες που εµποτίστηκαν µε άλατα του αργύρου είναι οι µέσου προς µικρού µεγέθους νευρώνες χωρίς άκανθες στους δενδρίτες τους. Οι νευρώνες αυτοί έχουν κυτταρικό σώµα ωοειδές, µε µεγάλη διάµετρο περίπου 20µm. Προβάλουν 3 έως 6 πρωτοταγείς δενδρίτες, οι οποίοι διακλαδίζονται σε 75

76 λεπτούς κλάδους που δηµιουργούν ένα πυκνό δενδριτικό δίκτυο σε µικρή απόσταση από το κυτταρικό σώµα ( µm) (Εικόνα 12). Εικόνα 12. Μέσου µεγέθους νευρώνας κερκοφόρου πυρήνα, χωρίς δενδριτικές άκανθες. Κλίµακα 20µm. Στον κερκοφόρο πυρήνα των υγιών µαρτύρων επίσης παρατηρήθηκαν νευρώνες µε µεγάλο κυτταρικό σώµα, διαµέτρου 30 έως και 50 µm, και 3 έως 5 δενδρίτες ελεύθερους από άκανθες. Οι δενδρίτες των νευρώνων αυτών είτε, όπως στους προηγούµενους νευρώνες, έχουν πολλαπλούς λεπτούς κλάδους δηµιουργώντας ένα πυκνό δίκτυο σε µικρή απόσταση από το κυτταρικό σώµα ( µm) είτε έχουν λίγες διακλαδώσεις (µέχρι τριτοταγείς δενδρίτες) και ευθεία πορεία δηµιουργώντας ένα φτωχό δενδριτικό πεδίο που εκτείνεται όµως µέχρι και 500µm από το κυτταρικό σώµα (Εικόνα 13). 76

77 Εικόνα 13. Μεγάλου µεγέθους νευρώνας κερκοφόρου πυρήνα µε λείους δενδρίτες. Οι δενδρίτες εκτείνονται σε µεγάλη απόσταση από το κυτταρικό σώµα, δίνοντας λιγοστούς κλάδους. Στο κάτω τµήµα της εικόνας φαίνεται για σύγκριση ένας µέσου µεγέθους ακανθώδης νευρώνας. Κλίµακα 20µm. 77

78 Οι οµάδες νευρώνων που περιγράφονται εδώ παρατηρήθηκαν σε όλα τα περιστατικά που µελετήθηκαν, τόσο στους µάρτυρες διαφόρων ηλικιών όσο και στους ασθενείς που έπασχαν από νόσο Alzheimer. Η µέθοδος rapid-golgi που χρησιµοποιήθηκε για την περιγραφή των µορφολογικών χαρακτηριστικών των νευρώνων του κερκοφόρου πυρήνα δεν επιτρέπει τον ακριβή προσδιορισµό της συγκέντρωσης κάθε οµάδας νευρώνων, καθώς δεν εµποτίζονται µε άργυρο όλα τα κύτταρα ούτε και σταθερό ποσοστό αυτών. Ωστόσο, από τους νευρώνες που εµποτίστηκαν εκτιµάται ότι περισσότερο από 90% του συνόλου των νευρικών κυττάρων του κερκοφόρου πυρήνα καλύπτουν οι µέσου µεγέθους ακανθώδεις νευρώνες και το υπόλοιπο ποσοστό ανήκει στις άλλες τρεις οµάδες νευρώνων. Σε παρασκευάσµατα που προέρχονται από άτοµα µικρότερης ηλικίας παρατηρήθηκε ελαφρώς µεγαλύτερη συγκέντρωση νευρώνων χωρίς δενδριτικές άκανθες. Το γεγονός αυτό µπορεί να οφείλεται σε διαφορετικό εµποτισµό από τα άλατα του αργύρου, λόγω ιδιαιτεροτήτων του ιστού σε αυτές τις ηλικίες, όπως η φτωχή µυελίνωση. Για τους ασθενείς που έπασχαν από νόσο Alzheimer δεν παρατηρήθηκε κάποια διαφορά στη συγκέντρωση των κυτταρικών πληθυσµών του κερκοφόρου πυρήνα, ούτε κάποια αδρή αλλοίωση των µορφολογικών χαρακτηριστικών τους µε τη µέθοδο rapid-golgi. Όσο αφορά τη µορφοµετρική ανάλυση, αυτή επικεντρώθηκε στα µέσου µεγέθους ακανθώδη κύτταρα, που είναι η κυρίαρχη κυτταρική οµάδα του κερκοφόρου πυρήνα. Η µικρή συγκέντρωση των νευρώνων που εµποτίστηκαν µε άλατα του αργύρου από τις υπόλοιπες οµάδες δεν έκανε εφικτή τη συγκέντρωση επαρκών πληροφοριών για µορφοµετρική και στατιστική επεξεργασία. Η πρώτη παράµετρος που εξετάσθηκε είναι το συνολικό µήκος των δενδριτών. Για τους νέους µάρτυρες αυτό βρέθηκε 1578±456 µm, για τους ηλικιωµένους µάρτυρες 1792 ± 462 µm και για τους ασθενείς που έπασχαν από 78

79 Α Β Γ Ε ΣΤ 79

80 νόσο Alzheimer 1393±304 µm (Πίνακας 4). Οι διαφορές που παρατηρούνται µεταξύ νέων και ηλικιωµένων µαρτύρων είναι 12% και µεταξύ ηλικιωµένων κι ασθενών 22%. Στο σύνολό τους δεν είναι στατιστικώς σηµαντικές (ANOVA, p=0,051), αλλά στις κατά ζεύγη συγκρίσεις (post hoc tests) στατιστικώς σηµαντική βρέθηκε η διαφορά στο συνολικό µήκος των δενδριτών µεταξύ ασθενών και ηλικιωµένων µαρτύρων (LSD, p<0,05) (Εικόνα 14). Ο αριθµός δενδριτών ανά κλάση παρουσιάζεται στον Πίνακα 3. Οι διαφορές που υπάρχουν µεταξύ των οµάδων περιστατικών είναι µικρές και όχι στατιστικώς σηµαντικές, ούτε στο σύνολό τους ούτε στις κατά ζεύγη συγκρίσεις. Εικόνα 14. Μέσου µεγέθους ακανθώδεις νευρώνες από τον κερκοφόρο πυρήνα νέου µάρτυρα (Α, Β), ηλικιωµένου µάρτυρα (Γ, ) και ασθενή που έπασχε από τη νόσο του Alzheimer (Ε, ΣΤ). Στην αριστερή στήλη (Α, Γ, Ε) φαίνονται οι νευρώνες µε το πλήρες δενδριτικό τους πεδίο αποτυπωµένο σε δύο διαστάσεις µε την επέκταση NeuronJ του προγράµµατος ImageJ. Στη δεξιά στήλη (Β,, ΣΤ) στους ίδιους νευρώνες έχουν σχεδιαστεί επίσης µε το πρόγραµµα ImageJ οµόκεντροι κύκλοι για τη µέθοδο του Sholl. Αν και τα χαρακτηριστικά των νευρώνων που απεικονίζονται εδώ δεν ανταποκρίνονται στο µέσο όρο για κάθε οµάδα περιστατικών, είναι εµφανές ότι µεταξύ του νέου και του ηλικιωµένου µάρτυρα δεν υπάρχουν σηµαντικές διαφορές ενώ στον ασθενή το δενδριτικό πεδίο είναι περιορισµένο κοντά στο κυτταρικό σώµα. Με διαφορετικό χρώµα απεικονίζονται οι δενδρίτες διαφορετικής κλάσης. Μπλε: πρωτοταγείς δενδρίτες, κίτρινο: δευτεροταγείς, πράσινο: τριτοταγείς, µαύρο: τεταρτοταγείς, κόκκινο: πεµπτοταγείς, θαλασσί: αρχικό τµήµα του νευράξονα, ροζ: παράπλευρος κλάδος νευράξονα. Κλίµακα 20 µm. 80

81 Πίνακας 3. Αριθµός δενδριτών ανά κλάση (µέση τιµή ± τυπική απόκλιση) Σύγκριση ανά ζεύγη Post Hoc Test (LSD, p) Νέοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) ANOVA p Νέοι vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες Ασθενείς vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες Πρωτοταγείς 5,9±1,7 6,2±2,0 5,8±3,2 0,918 0,771 0,701 ενδρίτες ευτεροταγείς 12,5±4,5 12,1±4,2 10,3±3,2 0,363 0,800 0,239 ενδρίτες Τριτοταγείς 10,4±5,3 12,5±3,7 11,3±3,4 0,411 0,195 0,437 ενδρίτες Τεταρτοταγείς 7,7±5,0 8,0±4,0 7,5±4,0 0,953 0,871 0,759 ενδρίτες Πεµπτοταγείς 2,3±2,4 2,1±2,4 1,9±1,8 0,929 0,859 0,813 ενδρίτες LSD: Least Significant Difference Στον Πίνακα 4 παρουσιάζεται το µήκος των δενδριτών ανά κλάση. Στατιστικά σηµαντικές διαφορές παρατηρούνται µόνο στους τριτοταγείς δενδρίτες (ANOVA, p=0,025), τόσο µεταξύ νέων και ηλικιωµένων µαρτύρων (35%, LSD p=0,015) όσο και µεταξύ ηλικιωµένων µαρτύρων και ασθενών (29%, LSD p=0,034) (Εικόνα 15). Από την ανάλυση του δενδριτικού πεδίου των νευρώνων µε τη µέθοδο του Sholl προέκυψε ο αριθµός δενδριτών που τέµνει κάθε οµόκεντρο κύκλο µε ακτίνα από 20 έως 220 µm. Τα αποτελέσµατα φαίνονται στον Πίνακα 5. Η 81

82 Πίνακας 4. Μήκος σε µm δενδριτών ανά κλάση (µέση τιµή ± τυπική απόκλιση) Σύγκριση ανά ζεύγη Post Hoc Tests (LSD, p) Νέοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) ANOVA p Νέοι vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες Ασθενείς vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες Πρωτοταγείς ενδρίτες 126±78 136±95 97±119 0,569 0,793 0,298 ευτεροταγείς ενδρίτες 524± ± ±208 0,176 0,705 0,128 Τριτοταγείς ενδρίτες 455± ± ±151 0,025 * 0,015 ** 0,034 ** Τεταρτοταγείς ενδρίτες 356± ± ±193 0,964 0,821 0,824 Πεµπτοταγείς ενδρίτες 113±132 94±91 106±108 0,898 0,655 0,777 Συνολικό ενδριτικό Πεδίο 1578,5±456,0 1792,8±462,9 1393,4±304,2 0,051 * 0,195 0,016 ** Με ** σηµειώνεται p<0,05 και µε * σηµειώνεται p<0,1 LSD: Least Significant Difference ανάλυση της διακύµανσης των µέσων τιµών (ANOVA) δεν έδειξε στατιστικά σηµαντικές διαφορές µεταξύ των οµάδων περιστατικών. Ωστόσο, στις κατά ζεύγη συγκρίσεις (post hoc tests) υπάρχει αυξηµένος αριθµός δενδριτών στους ηλικιωµένους σε σχέση µε τους νέους µάρτυρες, σε όλους τους οµόκεντρους κύκλους, εκτός από αυτόν µε ακτίνα 80 µm. Η διαφορά αυτή σε κανέναν από τους οµόκεντρους κύκλους δεν είναι στατιστικά σηµαντική (LSD, p>0,05). Στη 82

83 ** Νέοι Μάρυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) ** ** Πρωτοταγείς ενδρίτες ευτεροταγείς ενδρίτες Τριτοταγείς ενδρίτες Τεταρτοταγείς ενδρίτες Πεµπτοταγείς ενδρίτες Συνολικό ενδριτικό Πεδίο Εικόνα 15. Μήκος σε µm δενδριτών ανά κλάση (µέση τιµή). Με ** σηµειώνεται p<0,05 σύγκριση των ηλικιωµένων µαρτύρων µε τους ασθενείς παρατηρείται µειωµένος αριθµός δενδριτών στους ασθενείς σε όλους τους οµόκεντρους κύκλους, εκτός από τον πρώτο (20 µm). H διαφορά αυτή είναι στατιστικά σηµαντική στα 160 µm (p=0,037), ενώ στα 40, 60, 100 και 140 µm οι διαφορές παρουσιάζουν p<0,1 χωρίς να φτάνουν σε επίπεδο στατιστικής σηµαντικότητας (Εικόνα 16). 83

84 Πίνακας 5. Μέθοδος των οµόκεντρων κύκλων του Sholl. Ο αριθµός των δενδριτών που τέµνει κάθε οµόκεντρο κύκλο παρουσιάζεται ως µέση τιµή ± τυπική απόκλιση. Σύγκριση ανά ζεύγη Post Hoc Test (LSD, p) Νέοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) ANOVA p Νέοι vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες Αριθµός δενδριτών που τέµνει κάθε οµόκεντρο κύκλο µε ακτίνα: Ασθενείς vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες 20µm 10,8±3,3 12,8±4,1 12,8±5,1 0,432 0,245 0,966 40µm 15,0±5,3 17,6±3,9 14,5±3,7 0,122 0,125 0,062 * 60µm 14,1±5,1 15,1±3,5 12,0±3,8 0, ,054 * 80µm 11,1±3,8 10,5±3,5 8,4±2,8 0,130 0,630 0, µm 7,6±2,8 7,7±3,8 5,4±2,0 0,135 0,933 0,063 * 120µm 4,6±2,6 5,6±4,3 3,6±1,4 0,328 0,452 0, µm 2,9±2,2 3,7±3,1 2,0±1,0 0,201 0,429 0,075 * 160µm 2,2±1,9 2,5±2,5 0,9±0,7 0,101 0,652 0,037 ** 180µm 1,2±1,6 1,4±1,8 0,5±0,7 0,302 0,766 0, µm 0,4±0,9 0,8±1,4 0,2±0,4 0,250 0,276 0, µm 0,1±0,3 0,5±1,0 0,1±0,3 0,242 0,169 0,150 Με ** σηµειώνεται p<0,05 και µε * σηµειώνεται p<0,1 LSD: Least Significant Difference Η πυκνότητα των δενδριτικών ακανθών, για κάθε νευρώνα που συµπεριλήφθηκε στη µορφοµετρική µελέτη, υπολογίσθηκε µε καταµέτρηση των ακανθών ανά 10 µm µήκους δενδρίτη σε τυχαίους δενδρίτες, σε απόσταση 40 και 90 µm από το κυτταρικό σώµα (Πίνακας 6). Παρατηρείται µείωση της πυκνότητας των ακανθών στους ηλικιωµένους σε σχέση µε τους νέους µάρτυρες και στους ασθενείς σε σχέση µε τους ηλικιωµένους µάρτυρες, τόσο στα 40 όσο και στα 90 µm απόσταση από το κυτταρικό σώµα. Στα 90 µm οι 84

85 διαφορές αυτές είναι στατιστικά σηµαντικές (LSD, p<0,05) (Εικόνες 17 και 18) * * * Νέοι Μάρυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) 6 * 4 ** µm 40µm 60µm 80µm 100µm 120µm 140µm 160µm 180µm 200µm 220µm Εικόνα 16. Μέθοδος του Sholl. Μέση τιµή του αριθµού δενδριτών που τέµνει κάθε οµόκεντρο κύκλο µε ακτίνα από 20µm έως 220µm. Με ** σηµειώνεται p<0,05 και µε * σηµειώνεται p<0,1. 85

86 Α Β Γ Εικόνα 17. ενδριτικές άκανθες σε τµήµατα δενδριτών από µέσου µεγέθους ακανθώδη κύτταρα κερκοφόρου πυρήνα προερχόµενα από: νέο µάρτυρα (Α), ηλικιωµένο µάρτυρα (Β) και ασθενή που έπασχε από τη νόσο του Alzheimer (Γ). Τα εικονιζόµενα τµήµατα απέχουν από το κυτταρικό σώµα µm. Εµφανής είναι η ελάττωση της πυκνότητας των ακανθών από τον νέο στον ηλικιωµένο µάρτυρα και στον ασθενή. Επίσης, παρατηρείται αύξηση του ύψους και του µεγέθους της κεφαλής στις εναποµείνασες άκανθες στον ηλικιωµένο µάρτυρα και στον ασθενή. Κλίµακα 5µm. 86

87 Πίνακας 6. Αριθµός δενδριτικών ακανθών ανά 10 µm µήκος δενδρίτη (µέση τιµή ± τυπική απόκλιση) Σύγκριση ανά ζεύγη Post Hoc Test (LSD, p) Νέοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) ANOVA p Απόσταση από το κυτταρικό σώµα: Νέοι vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες Ασθενείς vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες µm 8,2±2,3 6,7±1,9 5,9±2,6 0,061 * 0,087 * 0, µm 10,0±2,7 7,8±1,9 5,2±1,6 0,001 ** 0, 008 ** 0,002 ** Με ** σηµειώνεται p<0,05 και µε * σηµειώνεται p<0,1 LSD: Least Significant Difference ** * ** µm µm Νέοι Μάρυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) Εικόνα 18. Μέση τιµή του αριθµού δενδριτικών ακανθών ανά 10 µm µήκος δενδρίτη σε απόσταση 40-50µm και µm από το κυτταρικό σώµα. Με ** σηµειώνεται p<0,05 και µε * σηµειώνεται p<0,1. 87

88 3.2 Ανοσοϊστοχηµεία Η ανοσοϊστοχηµική µελέτη για την υποµονάδα NMDAR1 των NMDA υποδοχέων αποκάλυψε την εντόπισή της στην πλειονότητα των νευρώνων του κερκοφόρου πυρήνα, συσσωρευµένη σε κοκκία ή διάχυτα στο κυτταρόπλασµα και σε ορισµένες περιπτώσεις και στο αρχικό τµήµα των δενδριτών (Εικόνα 19). Α Β Γ Εικόνα 19. Μέσου µεγέθους νευρώνες κερκοφόρου πυρήνα στην πλειονότητά τους ανοσοθετικοί για την υποµονάδα NMDAR1 των NMDA υποδοχέων σε παρασκευάσµατα προερχόµενα από νέο µάρτυρα (Α), ηλικιωµένο µάρτυρα (Β) και ασθενή που έπασχε από τη νόσο του Alzheimer (Γ). Κλίµακα 10µm. Η ένταση της χρώσης είναι χαµηλή και δεν παρουσιάζει ιδιαίτερες διακυµάνσεις µεταξύ διαφορετικών νευρώνων του κερκοφόρου πυρήνα, ανεξαρτήτως του µεγέθους του κυτταρικού σώµατος, και είναι αντίστοιχη της πλειονότητας των κυττάρων στο φλοιό των εγκεφαλικών ηµισφαιρίων. Στο σύνολο των νευρώνων κάθε οπτικού πεδίου που εξετάσθηκε, διακρίθηκαν αυτοί που παρουσίαζαν µέγιστη διάµετρο κυτταρικού σώµατος µεγαλύτερη από 30 µm. Οι νευρώνες αυτοί ήταν πάντα ανοσοθετικοί για NMDAR1 σε όλα 88

89 τα περιστατικά που µελετήθηκαν (Εικόνα 20). Περιστασιακά βρέθηκαν αστροκύτταρα να φέρουν την υποµονάδα NMDAR1 στο κυτταρόπλασµά τους. Εικόνα 20. Μεγάλου µεγέθους νευρώνας από τον κερκοφόρο πυρήνα ασθενούς που έπασχε από τη νόσο του Alzheimer ανοσοθετικός για NMDAR1 µε τη χρώση εντοπισµένη στο κυτταρόπλασµα. Ο νευρώνας περιβάλλεται από αστροκύτταρα των οποίων διακρίνεται ο πυρήνας. Κλίµακα 5µm. Η µορφοµετρική µελέτη για τους νευρώνες ανά οπτικό πεδίο που φέρουν NMDAR1 φαίνεται στον Πίνακα 7. Ο αριθµός των ανοσοθετικών για NMDAR1 νευρώνων του κερκοφόρου πυρήνα είναι µεγαλύτερος στους ηλικιωµένους µάρτυρες σε σχέση µε τους νέους και µεγαλύτερος στους ασθενείς σε σχέση µε τους ηλικιωµένους µάρτυρες (ANOVA, p<0,05). Ωστόσο, αντίστοιχες διαφορές παρατηρούνται και στο συνολικό αριθµό των νευρώνων ανά οπτικό πεδίο (ANOVA, p<0,05), µε αποτέλεσµα το ποσοστό των ανοσοθετικών νευρώνων να µη παρουσιάζει στατιστικά σηµαντικές 89

90 διαφορές µεταξύ των οµάδων των περιστατικών (ANOVA, p>0,05) (Εικόνα 21). Πίνακας 7. Αποτελέσµατα ανοσοϊστοχηµείας για NMDAR1. (µέση τιµή ± τυπική απόκλιση) Σύγκριση ανά ζεύγη Post Hoc Test (LSD, p) Νέοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) ANOVA p Νέοι vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες Ασθενείς vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες Συνολικός αριθµός νευρώνων ανά 10,6±3,2 11,4±2,9 13,8±3,4 0,001 ** 0,260 0,001 ** οπτικό πεδίο Αριθµός ανοσοθετικών για NMDAR1 8,8±3,8 9,8±3,0 12,3±3,5 0,001 ** 0,160 0,001 ** νευρώνων ανά οπτικό πεδίο Ποσοστό % ανοσοθετικών για NMDAR1 νευρώνων ανά οπτικό πεδίο 81,7±16,7 86,5±13,2 88,6±10,7 0,057 * 0,086 * 0,370 Με ** σηµειώνεται p<0,05 και µε * σηµειώνεται p<0,1 LSD: Least Significant Difference Η εντόπιση του υπότυπου AMPA υποδοχέων GluR2 που µελετήθηκε στον κερκοφόρο πυρήνα είναι αντίστοιχη αυτής που περιγράφηκε παραπάνω για την υποµονάδα NMDAR1 των NMDA υποδοχέων. Η ένταση της χρώσης και εδώ δεν παρουσιάζει ιδιαίτερες διακυµάνσεις µεταξύ διαφορετικών νευρώνων και είναι αντίστοιχη της χρώσης των κυττάρων του φλοιού των εγκεφαλικών 90

91 ηµισφαιρίων. Περιστασιακά παρατηρούνται νευρογλοιακά κύτταρα ανοσοθετικά για GluR * Νέοι Μάρυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) Εικόνα 21. Ποσοστό ανοσοθετικών για NMDAR1 νευρώνων του κερκοφόρου πυρήνα επί του συνόλου των νευρώνων του πυρήνα. Με * σηµειώνεται η διαφορά µεταξύ νέων και ηλικιωµένων µαρτύρων όπου p<0,1. Οι διαφορές που παρατηρούνται είναι µικρές και όχι στατιστικά σηµαντικές, παρά το γεγονός ότι σε απόλυτο αριθµό οι ανοσοθετικοί νευρώνες διαφέρουν σηµαντικά µεταξύ των οµάδων. Η µορφοµετρική µελέτη για τους υποδοχείς GluR2, φαίνεται στον Πίνακα 8. Όπως και µε τους NMDAR1 υποδοχείς, έτσι και για τους GluR2 ο αριθµός των ανοσοθετικών νευρώνων του κερκοφόρου πυρήνα είναι µεγαλύτερος στους ηλικιωµένους µάρτυρες σε σχέση µε τους νέους και µεγαλύτερος στους ασθενείς σε σχέση µε τους ηλικιωµένους µάρτυρες (ANOVA, p<0,05). Ωστόσο, αντίστοιχες διαφορές παρατηρούνται και στο συνολικό αριθµό των νευρώνων ανά οπτικό πεδίο (ANOVA, p<0,05), µε αποτέλεσµα το ποσοστό των ανοσοθετικών νευρώνων να µη παρουσιάζει στατιστικά σηµαντικές 91

92 διαφορές µεταξύ των οµάδων των περιστατικών (ANOVA, p>0,05) (Εικόνα 22 και 23). Πίνακας 8. Αποτελέσµατα ανοσοϊστοχηµείας για GluR2. (µέση τιµή ± τυπική απόκλιση) Σύγκριση ανά ζεύγη Post Hoc Test (LSD, p) Νέοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) ANOVA p Νέοι vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες Ασθενείς vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες Συνολικός αριθµός νευρώνων ανά 10,3±2,8 12,4±2,4 13,4±4,0 0,022 ** 0,068 * 0,345 οπτικό πεδίο Αριθµός ανοσοθετικών για GluR2 9,2±2,8 11,4±2,7 12,6±4,2 0,014 ** 0,057 * 0,302 νευρώνων ανά οπτικό πεδίο Ποσοστό % ανοσοθετικών για GluR2 νευρώνων ανά οπτικό πεδίο 89,2±10,0 92,0±7,3 93,4±8,2 0,331 0,343 0,606 Με ** σηµειώνεται p<0,05 και µε * σηµειώνεται p<0,1 LSD: Least Significant Difference Στο σύνολο των νευρώνων κάθε οπτικού πεδίου διακρίθηκαν αυτοί που παρουσίαζαν µέγιστη διάµετρο κυτταρικού σώµατος µεγαλύτερη από 30 µm. Οι νευρώνες αυτοί ήταν πάντα ανοσοθετικοί για GluR2 σε όλα τα περιστατικά που εξετάστηκαν, όπως και για NMDAR1. 92

93 94 Νέοι Μάρυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) Εικόνα 22. Ποσοστό ανοσοθετικών για GluR2 νευρώνων του κερκοφόρου πυρήνα επί του συνόλου των νευρώνων του πυρήνα. Οι διαφορές που παρατηρούνται είναι µικρές και όχι στατιστικά σηµαντικές. Η εντόπιση του υπότυπου των µεταβοτροπικών υποδοχέων mglur5 που µελετήθηκε στον κερκοφόρο πυρήνα παρουσίασε σηµαντικές διαφορές σε σχέση µε την εντόπιση των υποµονάδων ιονοτροπικών υποδοχέων NMDAR1 και GluR2. Στους νέους µάρτυρες παρατηρήθηκε µικρός αριθµός κυττάρων ισχυρά ανοσοθετικών, µικρός αριθµός ασθενώς και µετρίως ανοσοθετικών κυττάρων και µεγάλος αριθµός ανοσοαρνητικών κυττάρων. Οι ισχυρώς ανοσοθετικοί νευρώνες είναι τόσο µεγάλου µεγέθους όσο και µεσαίου µεγέθους, µε πιο συχνούς τους πρώτους. Στους νευρώνες αυτούς, εκτός από το κυτταρικό σώµα ανοσοϊστοχηµική εντόπιση των mglur5 υποδοχέων παρατηρείται και στους δενδρίτες ακόµα και σε µεγάλη απόσταση από το κυτταρικό σώµα (Εικόνα 24). 93

94 Α Β Εικόνα 23. Μέσου µεγέθους νευρώνες κερκοφόρου πυρήνα στην πλειονότητά τους ανοσοθετικοί για την υποµονάδα GluR2 των AMPA υποδοχέων σε παρασκευάσµατα προερχόµενα από νέο µάρτυρα (Α), ηλικιωµένο µάρτυρα (Β) και ασθενή που έπασχε από τη νόσο του Alzheimer (Γ). Κλίµακα 10µm. Γ 94

95 A B Εικόνα 24. Α) Μεγάλου µεγέθους νευρώνας κερκοφόρου πυρήνα έντονα ανοσοθετικός για mglur5 τόσο στο κυτταρικό σώµα όσο και σε τµήµα δενδρίτη. Στην εικόνα φαίνονται ακόµα δύο µέσου µεγέθους νευρώνες ανοσοαρνητικοί. Β) Μέσου µεγέθους νευρώνας έντονα ανοσοθετικός για mglur5 τόσο στο κυτταρικό σώµα όσο και σε τµήµα δενδρίτη. Στην εικόνα φαίνονται δύο ακόµα µέσου µεγέθους νευρώνες, ο ένας ανοσοαρνητικός και ο δεύτερος ασθενώς ανοσοθετικός. Κλίµακα 10µm. Στους ηλικιωµένους µάρτυρες και στους ασθενείς ο αριθµός των ισχυρώς ανοσοθετικών για mglur5 νευρώνων παραµένει ουσιαστικά αµετάβλητος, είναι όµως αυξηµένος ο συνολικός αριθµός των νευρώνων και ο αριθµός των ασθενώς και µετρίως ανοσοθετικών νευρώνων (Πίνακας 9 και Εικόνες 25, 26 και 27). 95

96 Πίνακας 9. Αποτελέσµατα ανοσοϊστοχηµείας για mglur5, Ι. (µέση τιµή ± τυπική απόκλιση) Σύγκριση ανά ζεύγη Post Hoc Test (LSD, p) Νέοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) ANOVA p Νέοι vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες Ασθενείς vs. Ηλικιωµ. Μάρτυρες Συνολικός αριθµός νευρώνων ανά 10,5±2,5 12,8±2,6 14,8±3,0 0,001 ** 0,008 ** 0,015 ** οπτικό πεδίο Αριθµός ανοσοθετικών για mglur5 4,2±2,7 10,3±3,3 13,7±3,2 0,001 ** 0,001 ** 0,001 ** νευρώνων ανά οπτικό πεδίο Ποσοστό % ανοσοθετικών για mglur5 39,6±21,7 80,1±19,0 92,3±10,8 0,001 ** 0,001 ** 0,029 ** νευρώνων ανά οπτικό πεδίο Αριθµός ασθενώς ανοσοθετικών για mglur5 2,5±0,6 8,2±3,7 10,4±4,6 0,001 ** 0,001 ** 0,044 ** νευρώνων ανά οπτικό πεδίο Αριθµός µετρίως ανοσοθετικών για mglur5 0,4±1,1 1,9±2,6 2,6±6,0 0,103 0,200 0,345 νευρώνων ανά οπτικό πεδίο Αριθµός ισχυρά ανοσοθετικών για mglur5 νευρώνων ανά οπτικό πεδίο 0,4±0,6 0,3±0,7 0,3±0,7 0,805 0,514 0,806 Με ** σηµειώνεται p<0,05 και µε * σηµειώνεται p<0,1 LSD: Least Significant Difference 96

97 ** ** Νέοι Μάρυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) Εικόνα 25. Ποσοστό ανοσοθετικών για mglur5 νευρώνων του κερκοφόρου πυρήνα επί του συνόλου των νευρώνων του πυρήνα. Με ** σηµειώνεται p<0,05. Οι διαφορές που παρατηρούνται είναι στατιστικά σηµαντικές τόσο µεταξύ νέων και ηλικιωµένων µαρτύρων όσο και µεταξύ ηλικιωµένων µαρτύρων και ασθενών, σε αντίθεση µε τα αντίστοιχα αποτελέσµατα για τους ιονοτροπικούς υποδοχείς (Εικόνες 21 και 22) ** ** Νέοι Μάρυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) ** ** ** ** Ασθενώς ανοσοθετικοί νευρώνες Μετρίως ανοσοθετικοί νευρώνες Ισχυρώς ανοσοθετικοί νευρώνες Συνολικός αριθµός ανοσοθετικών νευρώνων Συνολικός αριθµός νευρώνων Εικόνα 26. Αποτελέσµατα ανοσοϊστοχηµείας για τον υπότυπο mglur5 των µεταβοτροπικών υποδοχέων. Μέση τιµή του αριθµού ανοσοθετικών νευρώνων σε κάθε οµάδα και του συνολικού αριθµού νευρώνων ανά οπτικό πεδίο. Με ** σηµειώνεται p<0,05. 97

98 Εικόνα 27. Νευρώνες του κερκοφόρου πυρήνα Α ανοσοθετικοί για τον υπότυπο mglur5 των µεταβοτροπικών υποδοχέων σε παρασκευάσµατα προερχόµενα από νέο µάρτυρα (Α), ηλικιωµένο µάρτυρα Β (Β) και ασθενή που έπασχε από τη νόσο του Alzheimer (Γ). Κλίµακα 10µm. Γ 98

99 Οι µεγάλου µεγέθους νευρώνες, µε διάµετρο κυτταρικού σώµατος µεγαλύτερη από 30 µm σε όλα τα περιστατικά που εξετάσθηκαν ήταν πάντα ανοσοθετικοί. ιαφορές παρουσιάστηκαν στην ένταση της χρώσης τους µεταξύ των οµάδων περιστατικών, χωρίς όµως να είναι στατιστικώς σηµαντικές, πιθανώς λόγω της χαµηλής συγκέντρωσης των νευρώνων αυτών (Πίνακας 10 και Εικόνα 28). Πίνακας 10. Αποτελέσµατα ανοσοϊστοχηµείας για mglur5, ΙΙ. (µέση τιµή ± τυπική απόκλιση) Ποσοστό % ασθενώς ανοσοθετικών για mglur5 νευρώνων µεγάλου µεγέθους Ποσοστό % µετρίως ανοσοθετικών για mglur5 νευρώνων µεγάλου µεγέθους Ποσοστό % ισχυρά ανοσοθετικών για mglur5 νευρώνων µεγάλου µεγέθους Νέοι Μάρτυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) ANOVA p 14,3±37,8 12,5±35,4 0,0±0,0 0,675 14,3±37,8 37,5±51,8 66,7±51,6 0,169 71,4±48,8 50,0±53,5 33,3±51,6 0,424 99

100 Νέοι Μάρυρες Ηλικιωµένοι Μάρτυρες Ασθενείς (νόσος του Alzheimer) Ποσοστό ασθενώς ανοσοθετικών νευρώνων µεγάλου µεγέθους Ποσοστό µετρίως ανοσοθετικών νευρώνων µεγάλου µεγέθους Ποσοστό ισχυρώς ανοσοθετικών νευρώνων µεγάλου µεγέθους Εικόνα 28. Ανοσοϊστοχηµική εντόπιση των υποδοχέων mglur5 σε µεγάλου µεγέθους νευρώνες του κερκοφόρου πυρήνα. Στο διάγραµµα φαίνεται η µέση τιµή των ασθενώς, µετρίως και ισχυρώς ανοσοθετικών νευρώνων ανά οµάδα περιστατικών. Οι παρατηρούµενες διαφορές είναι µεγάλες, όχι όµως στατιστικά σηµαντικές, πιθανώς λόγω της χαµηλής συγκέντρωσης των νευρώνων µεγάλου µεγέθους. 3.3 Ηλεκτρονική Μικροσκόπηση Η µορφολογική ανάλυση των παρασκευασµάτων του κερκοφόρου πυρήνα στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο αποκάλυψε αλλοιώσεις στα κυτταρικά οργανύλια, στο έλυτρο µυελίνης των νευρικών ινών και στον αιµατοεγκεφαλικό φραγµό. Αντίστοιχες αλλοιώσεις εντοπίσθηκαν τόσο στους ηλικιωµένους µάρτυρες όσο και στους ασθενείς που έπασχαν από τη νόσο του Alzheimer. Στο κυτταρόπλασµα των νευρώνων του κερκοφόρου πυρήνα παρατηρούνται σε µεγάλη συχνότητα συσσωρεύσεις λυσοσωµάτων µαζί µε 100

101 Α Β Γ Ε ΣΤ Ζ Η 101

102 ευµεγέθη κυστίδια οσµιόφιλου υλικού (Εικόνα 29Α) ή και κρυσταλοειδών σωµατίων (Εικόνα 29Β). Στον κερκοφόρο πυρήνα των ασθενών οι συσσωρεύσεις αυτές είναι πιο εκτεταµένες καταλαµβάνοντας συχνά σηµαντικό τµήµα του κυτταροπλάσµατος των νευρώνων (Εικόνες 29Γ και ). Παρατηρούνται επίσης διαταραχές της λεπτής υφής των µιτοχονδρίων στους ασθενείς και στους ηλικιωµένους µάρτυρες. Οι διαταραχές αυτές συνίστανται σε ποικιλοµορφία του σχήµατος και του µεγέθους τους καθώς και σε άτυπη διάταξη των ακρολοφιών τους (Εικόνες 29Β, Γ, και Εικόνα 30). Ο αιµατοεγκεφαλικός φραγµός µε τις κλειστές συνάψεις των ενδοθηλιακών κυττάρων και τη βασική µεµβράνη στην πλειονότητα των τριχοειδών Εικόνα 29. Λεπτή υφή του κερκοφόρου πυρήνα. Α) Συσσώρευση λυσοσωµάτων και οσµιόφιλου υλικού στο κυτταρόπλασµα νευρώνα σε ηλικιωµένο µάρτυρα. Κλίµακα 2µm. B) Κρυσταλλοειδή σωµάτια στο κυτταρόπλασµα νευρώνα σε ηλικιωµένο µάρτυρα. Με βέλος σηµειώνονται µιτοχόνδρια µε αλλοιώσεις στη διάταξη των ακρολοφιών. Κλίµακα 0,5µm. Γ και ) Εκτεταµένη συσσώρευση λυσοσωµάτων και οσµιόφιλου υλικού στο κυτταρόπλασµα νευρώνων ασθενών. Με βέλος σηµειώνονται µιτοχόνδρια µε αλλοιώσεις στη διάταξη των ακρολοφιών. Κλίµακες 0,5µm. Ε) Τριχοειδές αγγείο στον κερκοφόρο πυρήνα ηλικιωµένου µάρτυρα, χωρίς εµφανείς αδρές αλλοιώσεις στον αιµατοεγκεφαλικό φραγµό. Κλίµακα 1µm. ΣΤ) ισχιδής βασική µεµβράνη στο τοίχωµα του παραπάνω τριχοειδούς αγγείου (Ε). Κλίµακα 0,5µm. Ζ) ισχιδής βασική µεµβράνη στο τοίχωµα τριχοειδούς αγγείου στον κερκοφόρο πυρήνα ασθενούς. Με βέλος σηµειώνεται χαλαρό σηµείο σύνδεσης µεταξύ ενδοθηλιακών κυττάρων. Κλίµακα 0,5µm. Η) Άτυπη µυελίνωση. Στην εικόνα φαίνεται ένα ευρύ έλυτρο µυελίνης που περιβάλλει δύο µικρότερα. Με βέλος σηµειώνεται σηµείο όπου τα πετάλια του ελύτρου έχουν χαλαρώσει. Κλίµακα 0,5µm. 102

103 αγγείων στα παρασκευάσµατα που µελετήθηκαν δεν παρουσίασε αδρές αλλοιώσεις (Εικόνα 29Ε). Ωστόσο, περιστασιακά παρατηρήθηκε η ύπαρξη δισχιδούς βασικής µεµβράνης (Εικόνα 29ΣΤ και Ζ) και η χάλαση των δεσµών µεταξύ ενδοθηλιακών κυττάρων (Εικόνα 29Ζ). Αλλοιώσεις παρατηρήθηκαν επίσης στις διερχόµενες από τον κερκοφόρο πυρήνα εµµύελες νευρικές ίνες. Οι αλλοιώσεις αυτές συνίστανται κυρίως σε χαλάρωση των πεταλίων της µυελίνης και σε άτυπη µυελίνωση (Εικόνα 29Η). Α Β Γ Εικόνα 30. Συνάψεις στο νευροπηλιµατικό χώρο του κερκοφόρου πυρήνα στον εγκέφαλο ηλικιωµένων µαρτύρων (Α, Β) και ασθενών που έπασχαν από νόσο του Alzheimer (Γ, ). Στους µάρτυρες παρατηρείται µικρότερος αριθµός συνάψεων µε µεγαλύτερη επιφάνεια σε σχέση µε τους ασθενείς. Κλίµακα 0,5µm. 103