In vitro και ex vivo αξιολόγηση σιδηρο/υπερπαρα-μαγνητικών νανοσωματιδίων επισημασμένων με γάλλιο-68 για ανάπτυξη απεικονιστικών παραγόντων PET/MRI

Transcript

1 Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών Δημόκριτος In vitro και ex vivo αξιολόγηση σιδηρο/υπερπαρα-μαγνητικών νανοσωματιδίων επισημασμένων με γάλλιο- για ανάπτυξη απεικονιστικών παραγόντων PET/MRI Μ. Καραγεώργου Επιβλέποντες: Π. Μπουζιώτη, Δ. Σταμόπουλος Τριμελής Επιτροπή: Μ. Καλαμιώτου, Π. Μπουζιώτη, O. Tillement

2 Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών ΠΡΟΛΟΓΟΣ Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών Δημόκριτος Στόχος της παρούσας μελέτης αποτελεί η αξιολόγηση των επισημασμένων με το ραδιοϊσότοπο γάλλιο- ( Ga) σιδηρο/υπερπαρα-μαγνητικών νανοσωματιδίων οξειδίων του σιδήρου (Fe 3 O 4 NPs), τα οποία φέρουν στην επιφάνειά τους επικάλυψη με βιοσυμβατή φωσφονική ένωση (DPD), ως πιθανοί απεικονιστικοί παράγοντες PET/MRI. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν: Ραδιοεπισήμανση με γάλλιο-: Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs In vitro μελέτη σταθερότητας της ραδιοεπισήμανσης σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα φυσιολογικού ορού και σε ανθρώπινο πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια Μέτρηση υδροδυναμικής ακτίνας Fe 3 O 4 -DPD και Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs Μέτρηση μεγέθους των Fe 3 O 4 -DPD και Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs με μικροσκοπία ατομικής δύναμης (ΜΑΔ) και οπτική μικροσκοπία (ΟΜ) In vitro μελέτη κυτταροτοξικότητας σε υγιή και καρκινική κυτταρική σειρά Ex vivo μελέτη βιοκατανομής σε πειραματόζωα

3 Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών Δημόκριτος ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Η παρουσίαση αποτελείται από τις πιο κάτω ενότητες: Πειραματικές τεχνικές Αποτελέσματα και συζήτηση Συμπεράσματα Μελλοντικοί Στόχοι

4 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Το πρωτόκολλο για την πραγματοποίηση της συγκεκριμένης μελέτης, καθώς και οι πειραματικές διατάξεις που χρησιμοποιήθηκαν παρουσιάζονται στη συνέχεια: Έκλουση γεννήτριας Ge/ Ga για την παραλαβή του ραδιοϊσοτόπου Ga Έκλουση γεννήτριας με διάλυμα 0,1Μ HCl Διάλυμα Ν1: 80% Ακετόνη, 0.15Μ HCl Διάλυμα Ν2: 97.56% Ακετόνη, 0.1Μ HCl Τρείς εκλούσεις την ημέρα Ge t 1/2 = 271 ημέρες p + β - n+ν e Ga t 1/2 = λεπτά p n+β + +ν e Zn Έκλουση γεννήτριας Διάλυμα Ν1 Απομάκρυνση Ge Έκλουση Ga Διάλυμα Ν2 Στήλη Ανταλλαγής κατιόντων Καθαρό Ga

5 Επισήμανση των Fe 3 O 4 -DPD NPs με το ραδιοϊσότοπο Ga Fe 3 O 4 -DPD Nps Ρυθμιστικό διάλυμα οξικού νατρίου (0,2Μ) ph 4 GaCl 3 (Έκλουσμα από γεννήτρια Ge/ Ga) T= 90 o C 40min Σύμπλοκο Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs Πλύση του συμπλόκου μέσω φυγοκέντρησης (1490 g, 10 min) για την απομάκρυνση του ελεύθερου ραδιοϊσοτόπου Ga και ανασύστασή του σε υπερκάθαρο νερό PET Imaging PET/MRI Imaging agent MRI Imaging Rosales et al., Bioconjugate Chemistry, 2011, 22,

6 Έλεγχος της ραδιοχημικής καθαρότητας του συμπλόκου Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs Ο έλεγχος της ραδιοχημικής καθαρότητας του συμπλόκου πραγματοποιείται με υγρή χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας: a. Εναπόθεση δείγματος Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs σε χαρτί TLC-silica gel (1x10 cm) 1 cm πάνω από τη βάση του c. Το χαρτί τοποθετείται σε ανιχνευτή σάρωσης ραδιενέργειας τύπου: Radio-TLC Detector b. Εναπόθεση του χαρτιού σε διαλύτη, έως ότου το χαρτί διαβραχεί μέχρι 1 cm κάτω από τη κορυφή του. Ο διαλύτης συμπαρασύρει ελεύθερα ιόντα Ga +3 d. Υπολογισμός της ραδιοχημικής καθαρότητας:

7 In vitro μελέτη σταθερότητας της ραδιοεπισήμανσης σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα φυσιολογικού ορού (PBS) και σε ανθρώπινο πλάσμα Δείγμα Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs αναμείχθηκε και επωάστηκε με: α) PBS σε αναδευτήρα σε θερμοκρασία δωματίου, β) πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια ανθρώπινου αίματος στους Τ=37 0 C, το οποίο απομονώθηκε ύστερα από φυγοκέντρηση (672 g, 15 min) ολικού αίματος (συγκέντρωση ΝPs στο πλάσμα C NPs = 30μg/ml, αιμοληψία 1 ml x 3 δότες). Ο έλεγχος σταθερότητας πραγματοποιήθηκε 30, 60, 120 λεπτά μετά την επώαση με υγρή χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας. Μέτρηση υδροδυναμικής ακτίνας Fe 3 O 4 -DPD NPs και Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs με Δυναμική Σκέδαση Φωτός (DLS) R h = k B T 6πηD Γ=D*q 2 4πnsin(45 0 ) q= λ Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο Νανο-υλικών Οργανωμένης Υπερμοριακής Δομής σε συνεργασία με την Δρ. Ω. Σιδεράτου Lim et al., Nanoscale Research Letters, 2013, 8:381

8 Μέτρηση μεγέθους των Fe 3 O 4 -DPD NPs και Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs με Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης (ΜΑΔ) Chip πυριτίου στο οποίο είναι προσαρτημένος βραχίονας με μια υπεραιχμηρή ακίδα 5-15 nm στο κάτω μέρος του μm μm Δημιουργία των δειγμάτων σε μονοστρωματικά υμένια για μέτρηση στο ΜΑΔ με χρήση cytospinner (2000 στροφές/min, διάρκεια περιστροφής 10 sec) Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στο Ινστιτούτο Νανοεπιστήμης και Νανοτεχνολογίας, ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος

9 Μέτρηση μεγέθους των Fe 3 O 4 -DPD NPs και Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs με Οπτική Μικροσκοπία Η δημιουργία των δειγμάτων σε μονοστρωματικά υμένια, πριν τη μέτρησή τους στο ΜΑΔ, παρατηρήθηκε σε Οπτικό Μικροσκόπιο, με σκοπό: υμένια κατάλληλης επιφανειακής κάλυψης (μέγιστο frame σάρωσης ΜΑΔ 150x150 μm) και μονοστρωματικής διάταξης χωρίς μεγάλες υψομετρικές διακυμάνσεις. Η παρατήρηση και λήψη εικόνων των δειγμάτων (Fe 3 O 4 -DPD NPs και Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs) έγινε με διαφορετικές μεγεθύνσεις μεταβάλλοντας σε κάθε μια την εστίαση. Πραγματοποιήθηκε εκτίμηση του μεγέθους των νανοσωματιδίων με βάση πρότυπο δείγμα. Διακριτική ικανότητα d=0.61λ/nsinθ (>0.2μm) Μεγέθυνση Μ=m 1 x m 2 Οπτικό μικροσκόπιο Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στο Ινστιτούτο Νανοεπιστήμης και Νανοτεχνολογίας, ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος

10 In vitro μελέτη κυτταροτοξικότητας των Fe 3 O 4 -DPD NPs σε υγιή κυτταρική σειρά νεφρού (ΗEK293T) και καρκινική κυτταρική σειρά μαστού (4T1) Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο προσδιορισμού κυτταρικής βιωσιμότητας ΜΤΤ (3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide): Τοποθέτηση κυττάρων σε πλακίδια κυτταροκαλλιεργειών με 96 μικροφρεάτια (5000 κύτταρα/μικροφρεάτιο), 24 ώρες επώαση στους Τ=37 0 C σε θρεπτικό υλικό Προσθήκη διαφορετικών συγκεντρώσεων Fe 3 O 4 -DPD NPs (3-50 μg/ml) στα κύτταρα, 24 ώρες επώαση Προσθήκη 100μL διαλύματος ΜΤΤ στα κύτταρα, 2 ώρες επώαση στους Τ=37 0 C (σχηματισμός μπλέ/μώβ κρυστάλλων φορμαζάνης) Διαλυτοποίηση των κρυστάλλων και μέτρηση απορρόφησης σε φωτόμετρο SPECTROstar Nano, BMG LABTECH, ΙΙΒΕΑΑ Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν από συνεργάτες στο εργαστήριο βιολογίας (Δρ Μ. Γαζούλη), τμήμα Ιατρικής, ΕΚΠΑ

11 Ex vivo μελέτη βιοκατανομής των Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs σε ανοσοκατεσταλμένα πειραματόζωα (τύπου: severe combined immunodeficiency SCID) Ενδοφλέβια χορήγηση εναιωρήματος Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs σε SCID ποντίκια, που φέρουν καρκινικό όγκο (4Τ1), μέσω ουραίας φλέβας. Τρείς ομάδες, 3 ποντικιών η καθεμιά, θυσιάστηκαν 30, 60, 120 min μετά τη χορήγηση και πραγματοποιήθηκε δειγματοληψία αίματος και ιστών. Υπολογίστηκε το ποσοστό κατακράτησης σε κάθε ιστό ώς % χορηγούμενη δόση/gr (%ID/gr). Καρτέλα τοποθέτησης δειγμάτων ιστών Χορήγηση δείγματος σε πειραματόζωο τοποθετημένο σε κατάλληλη βάση. Μετρητής ακτινοβολίας γ πολλαπλών δειγμάτων

12 (111) (400) (220) (311) ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μαγνητικός και κρυσταλλογραφικός χαρακτηρισμός των Fe 3 O 4 -DPD NPs Η σύνθεση, ο κρυσταλλογραφικός χαρακτηρισμός και οι μαγνητικές μετρήσεις των Fe 3 O 4 -DPD NPs πραγματοποιήθηκαν από συνεργάτες στο Ινστιτούτο Πυρηνικών Επιστημών Vinča, Βελιγράδι, Σερβία Περιθλασίγραμμα ακτίνων-χ Fe 3 O 4 -DPD NPs Σε Τ=300 K η καμπύλη M(H) εμφανίζει μηδενικό συνεκτικό πεδίο, υποδεικνύοντας υπερπαραμαγνητικά Fe 3 O 4 -DPD NPs Mαγνήτιση κόρου Ms=40 emu/g (Τ=300Κ)

13 Ραδιοχημική καθαρότητα των Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs Πλύση με υπερκάθαρο νερό (1490 g, 10 min) Η απόδοση της ραδιοεπισήμανσης του συμπλόκου υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια ραδιοϊσότοπο Ga ισούται με 69,5% Η ραδιοχημική καθαρότητα του συμπλόκου υπερπαραμαγνητικά νανοσωματίδια ραδιοϊσότοπο Ga μετά την απομάκρυνση των ελεύθερων ιόντων Ga +3 βρέθηκε ίση με 91,5% Προσδιορισμός κορυφής ελεύθερου ραδιοϊσοτόπου Ga

14 % Stability % Stability a In vitro έλεγχος σταθερότητας της ραδιο-επισήμανσης PBS Time (min) Υδροδυναμική ακτίνα Fe 3 O 4 -DPD NPs και Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs (DLS) b Human platelet-rich plasma Time (min) Τα αποτελέσματα υπέδειξαν ικανοποιητική σταθερότητα της ραδιοεπισήμανσης 30, 60, 120 λεπτά μετά την επώαση των Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs σε α) PΒS και β) πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια (3 δότες). (a) Fe 3 O 4 -DPD NPs 48nm (b) Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs Υδροδυναμική ακτίνα Fe 3 O 4 -DPD NPs : a. Πρίν την επισήμανση b. Μετά την επισήμανση με το ραδιοϊσότοπο Ga 235nm 10nm R h (nm) nm R h (nm)

15 Μέτρηση μεγέθους των Fe 3 O 4 -DPD NPs με Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης (ΜΑΔ) Μέτρηση μεγέθους: x (154±44) nm, y (329±104) nm, z (διάμετρος) (17±4) nm

16 Μέτρηση μεγέθους των Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs με Μικροσκοπία Ατομικής Δύναμης (ΜΑΔ) Μέτρηση μεγέθους: x (556±264) nm, y (714±349) nm, z (διάμετρος) (83±66) nm

17 Μελέτη της διαφοράς του μεγέθους των Fe 3 O 4 -DPD και Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs μεταξύ των μεθόδων ΜΑΔ και DLS Το μέγεθος των Fe 3 O 4 -DPD NPs βρέθηκε ίσο με 17±4 nm (ΜΑΔ) (Ν=40 NPs) και η υδροδυναμική τους διάμετρος D h =96 nm (DLS), ενώ το μέγεθος των Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs βρέθηκε ίσο με 83±66 nm (ΜΑΔ) (Ν=40 NPs) και D h =470 nm (DLS). Οι διαφορές αυτές οφείλονται: Κατά τη μέτρηση των NPs με ΜΑΔ γίνεται υπερεκτίμηση του μεγέθους στη σάρωση του επιπέδου X, Y, που προέρχεται από την καμπυλότητα της ακίδας στην αλληλεπίδρασή της με το δείγμα. Ως πραγματικό μέγεθος των ΝPs λαμβάνεται η συνιστώσα Ζ Με ΜΑΔ μετράται το πραγματικό μέγεθος των NPs (δείγμα επιστρωμένο σε γυαλάκι μικροσκοπίου), ενώ με DLS η υδροδυναμική ακτίνα των ΝPs σε εναιώρημα Με ΜΑΔ μετρούνται μεμονωμένα NPs, με DLS μετρούνται συσσωματώματα NPs 10x Method development for DLS 3μm Application of AFM on Particle Characterization Εικόνα οπτικού μικροσκοπίου: συσσωματώματα στο δείγμα νανοσωματιδίων

18 Εκτίμηση μεγέθους των Fe 3 O 4 -DPD και Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs με Οπτική Μικροσκοπία (ΟΜ) a) Fe 3 O 4 -DPD NPs b) Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs c) Reference sample 20x 3μm 3μm 3μm 40x 3μm 3μm 3μm Εκτίμηση μεγέθους: a. 40x: (541±76)nm b. 40x: (605±60)nm

19 % Βιωσιμότητα % Βιωσιμότητα Αποτελέσματα in vitro κυτταροτοξικότητας των Fe 3 O 4 -DPD NPs σε υγιή και καρκινική κυτταρική σειρά Βιωσιμότητα φυσιολογικών κυττάρων control Συγκέντρωση νανοσωματιδίων (μg/ml) Βιωσιμότητα καρκινικών κυττάρων control Συγκέντρωση νανοσωματιδίων (μg/ml) Τα αποτελέσματα της βιωσιμότητας των κυτταρικών σειρών υπέδειξαν: Η τοξικότητα εξαρτάται από την συγκέντρωση των Fe 3 O 4 -DPD NPs στα κύτταρα Η % βιωσιμότητα των δύο κυτταρικών σειρών για μικρές συγκεντρώσεις (3-10μg/mL) είναι ικανοποιητική (> 50%) Η % βιωσιμότητα των φυσιολογικών κυττάρων σε μεγάλες συγκεντρώσεις (>20μg/mL) είναι > 50%, ενώ των καρκινικών κυττάρων είναι < 50% Μεγαλύτερη τοξικότητα στα καρκινικά κύτταρα συγκριτικά με τα φυσιολογικά για μεγάλες συγκεντρώσεις ΝPs, κάτι που είναι θετικό μιας και, εκτός της απεικονιστικής/διαγνωστικής αξίας των Fe 3 O 4 -DPD NPs, μπορεί να συσχετιστεί με πιθανό θεραπευτικό αποτέλεσμα.

20 % ID/gr Αποτελέσματα ex vivo βιοκατανομής των Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs σε πειραματόζωα (SCID mice): ,0 5,5 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 blood heart liver spleen lung kidney stomach intestine pancreas muscle bone 30min 60min 120min Tumor:Blood Tumor:Muscles tumor brain Τα αποτελέσματα της βιοκατανομής των Ga-Fe 3 O 4 Nps σε πειραματόζωα (Ν=3 σε κάθε χρονική στιγμή) παρουσίασαν: Υψηλό ποσοστό κατακράτησης σε ήπαρ και σπλήνα Ικανοποιητική παραμονή των Ga-Fe 3 O 4 NPs στη κυκλοφορία του αίματος Η συσσώρευση των Ga-Fe 3 O 4 Nps στο καρκινικό όγκο (4Τ1) αυξάνει με το χρόνο Τα Ga-Fe 3 O 4 NPs στοχεύουν τον όγκο παθητικά, εκμεταλλευόμενα το διερρηγμένο καρκινικό ενδοθήλιο

21 Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: 1. Υψηλής καθαρότητας ραδιοεπισημασμένα με Ga σιδηρο/υπερπαρα-μαγνητικά νανοσωματίδια οξειδίων του σιδήρου 2. Ικανοποιητική in vitro σταθερότητα της ραδιοεπισήμανσης σε α) PBS (διαλύτης χορήγησης των νανοσωματιδίων στα πειραματόζωα και σε β) ανθρώπινο πλάσμα (καθορίζει πώς θα συμπεριφερθούν τα νανοσωματίδια in vivo λαμβάνοντας υπόψη τις πρωτεΐνες του πλάσματος, ph και Τ=37 0 C) 3. Το μέγεθος των Fe 3 O 4 -DPD NPs μετρήθηκε ίσο με 17±4 nm (ΜΑΔ) (Ν=40 NPs) και η υδροδυναμική τους διάμετρος D h =96 nm (DLS), ενώ το μέγεθος των Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs βρέθηκε ίσο με 83±66 nm (ΜΑΔ) (Ν=40 NPs) και D h =470 nm (DLS): ικανοποιητική βιοκινητική 4. H μελέτη κυτταροτοξικότητας υποδεικνύει πως η χορηγούμενη δόση των Ga-Fe 3 O 4 -DPD Nps που πραγματοποιείται στα πειραματόζωα κατά την βιοκατανομή (11μg/100μL/mouse) δεν προκαλεί τοξικότητα στα φυσιολογικά κύτταρα, ενώ η βιωσιμότητα των καρκινικών κύτταρων παραμένει > 50% 5. Η ex vivo μελέτη της βιοκατανομής των Ga-Fe 3 O 4 Nps εμφανίζει τη συσσώρευσή τους στο καρκινικό όγκο (4Τ1), η οποία αυξάνει με το χρόνο ΜΕΛΛΟΝΤΙΚΟΙ ΣΤΟΧΟΙ: Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών Δημόκριτος 1. Πλήρης μελέτη της κρυσταλλικής δομής και των μαγνητικών ιδιοτήτων των συγκεκριμένων Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs 2. Μελέτη της βιοσυμβατότητας των συγκεκριμένων Ga-Fe 3 O 4 -DPD NPs με τα έμμορφα στοιχεία ανθρώπινου περιφερικού αίματος (ερυθροκύτταρα, λευκοκύτταρα, αιμοπετάλια)

22 Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Εθνικό Κέντρο Έρευνας Φυσικών Επιστημών Δημόκριτος Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας