RIAZENco ANDROSTENEDIONE

Transcript

1 RIAZENco AROSTENEDIONE DEUTSCH ENGLISH ΕΛΛHNIKA ESPAÑOL FRANÇAIS ITALIANO (de) (en) (el) (es) (fr) (it) ZenTech s.a. Liège Science Park, Avenue du Pré-Aily 10, 4031 ANGLEUR, Belgium Tel. : + 32-(0) Fax : + 32-(0) info@zentech.be RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

2 ISO15223 SYMBOLE FÜR MEDIZINPRODUKTE LIMITIERUNG DER LAGERTEMPERATUR MEDICAL DEVICES SYMBOL STORAGE TEMPERATURE LIMITATION ΣΥΜΒΟΛΟ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΣΥΣΚΕΥΩΝ ΚΑΤΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ ΦΥΛΑΞΗΣ SÍMBOLOS PARA APARATOS DE USO EN MEDICINA Limitación de temperatura de almacenamiento SYMBOLES APPLIQUES AUX DISPOSITIFS MEDICAUX LIMITES DE TEMPERATURES SIMBOLI DISPOSITIVI MEDICI Conservare a CHARGENCODE BATCH CODE ΚΩ ΙΚΟΣ ΠΑΡΤΙ ΑΣ Código de lote NUMERO DE LOT Lotto VERWEBAR BIS USE BY ΗΜΕΡΟΜ. ΛΗΞΗΣ Consumir antes de DATE D EXPIRATION Data di scadenza DAS HABUCH ZU RATE ZIEHEN FÜR IN-VITRO- DIAGNOSTISCHE ANWEUNG HERGESTELLT VON CONSULT OPERATING INSTRUCTIONS IN VITRO DIAGNOSTIC DEVICE MANUFACTURED BY ΑΝΑΤΡΕΞΤΕ ΣΤΙΣ Ο ΗΓΙΕΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΣΥΣΚΕΥΗ IN VITRO ΚΑΤΑΣΚΕΥΑΖΕΤΑΙ ΑΠΟ ΤΗΝ Consultar las instrucciones de manejo o funcionamiento Dispositivo de diagnóstico in vitro LIRE LES INSTRUCTIONS IN VITRO DIAGNOSTIC Consulti l istruzione per l uso Dispositivo medicodiagnositico in vitro Fabricado por FABRIQUE PAR Prodotto da KATALOG NR. CATALOGUE NUMBER ΑΡΙΘΜΟΣ ΚΑΤΑΛΟΓΟΥ Número de catálogo RÉFÉRENCE Numero di catalogo SYMBOLE (EMPFOHLEN VON DER EDMA) Anzahl der Bestimmungen beschichtete Röhrchen SYMBOLS (EDMA RECOMMEATIONS) number of determinations Coated tubes ΣΥΜΒΟΛΑ (Συστάσεις EDMA) Αριθµός προσδιορισµών Επιστρωµένα σωληνάρια Símbolos (recomendaciones de la EDMA) Número de determinaciones SYMBOLES (recommandations EDMA) Nombre de déterminations (Σ) SIMBOLI (RACCOMAAZIONI EDMA) Numero di determinazioni Tubos recubiertos Tubes coatés Tubi cotati Radioaktiver Tracer Radioactive tracer Ραδιενεργός ιχνηθέτης Trazador radiactivo Traceur radioactif Tracciante radioattivo Kalibrator Calibrator Βαθµονοµητής Calibrador Calibrateurs Calibratore Kontrolle Control Ορός ελέγχου Control Contrôle Controllo Waschlösung zum x- maligen verdünnen Wash solution to be diluted n fold ιάλυµα πλύσης που πρέπει να αραιωθεί n φορές Solución de lavado que debe diluirse n veces Solution de lavage diluée en n fois Soluzione di lavaggio da diluire in n volte RADIOAKTIVES MATERIAL RADIOACTIVE MATERIAL ΡΑ ΙΕΝΕΡΓΟ ΥΛΙΚΟ MATERIAL RADIACTIVO MATERIEL RADIOACTIF MATERIALE RADIOATTIVO BIOGEFÄHRDUNG BIOLOGICAL RISKS Βιολοικοι Κιυδυνοι RIESGO BIOLOGICO RISQUES BIOLOGIQUES RISCHIO BIOLOGICO RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

3 DEUTSCH RADIOIMMUNOASSAY ZUR QUANTITATIVEN BESTIMMUNG DES AROSTEION IN HUMANEM SERUM R-GM Bestimmungen DIESER KIT IST NUR FÜR DIE IN - VITRO DIAGNOSTIK BESTIMMT 1. KLINISCHE ANWEUNGEN Androstendion (4-Androstene-3, 17-dione), ein C 19 Steroid, wird in der Nebenniere und in den Gonaden produziert. Androstendion ist ein direkter Vorläufer sowohl von Testosteron als auch von Östron. Beide werden danach in Östradiol umgewandelt. Die Messung des Serum Androstendion liefert einen wertvollen Marker der Androgenbiosynthese. Erhöhte Androstendionwerte wurden bei der virilisierenden, congenitalen, adrenalen Hyperplasie festgestellt. Androstendion Serumwerte sind ebenfalls beim polyzystischen Ovarialsyndrom, bei der ovarialen, stromalen Hyperthekose, bei dem 3ß-hHydroxisteroid-Dehydrogenase-Defekt und anderen Ursachen von Hirsutismus bei Frauen erhöht [3,5,6]. Erhöhte Androstendion Serumwerte können ebenso bei adrenalen und ovarialen, virilisierenden Tumoren auftreten [3]. 2. TESTPRINZIP Die Durchführung erfolgt nach dem Basisprinzip des Radioimmunoassays: ein radioaktives und ein nicht-radioaktives Antigen konkurrieren um eine festgelegte Anzahl von Antikörper- Bindungsstellen [9]. Die Menge des mit [I-125]-gekennzeichneten Androstendion, gebunden an den Antikörpe,r ist umgekehrt proportional zur Konzentration des vorhandenen Androstendion. Die Trennung des freien und gebundenen Antigens erfolgt durch Abgießen oder Absaugen der mit Antikörpern beschichteten Röhrchen. 3. MITGELIEFERTES MATERIAL - Die Reagenzien sind ausreichend für 100 Bestimmungen. - Lagern Sie den Kit und die Reagenzien bei 2 8 C. - Das Verfallsdatum jedes Reagenz ist auf dem Etikett angegeben. 1. Radioactiver Tracer: 1 Fläschchen (27 ml) 125 l gekennzeichnetes Androstendion in einem auf Protein basierenden Puffer. Radioaktivität: ±115 KBq. Konservierungsmittel: NaN 3 (<0,1%). 2. Kalibratoren: Nullkalibrator: 1 Fläschchen enthält: 0 ng/ml Androstendion in humanem Serum. Lyophilisiert. Wiederherstellung mit 1,0 ml destilliertem Wasser. Kalibratoren 1 bis 5: 5 Fläschchen mit Androstendion in humanem Serum. Lyophilisiert. Wiederherstellung mit 0,5 ml destilliertem Wasser. Nach Wiederherstellung können die Kalibratoren einen Monat lang bei 2-8 C gelagert werden. Die exakten Werte entnehmen sie bitte dem Qualitätskontroll-Datenblatt. Konservierungsmittel : NaN 3 (< 0,1%). 3. Kontrollen : 2 Fläschchen enthalten niedrige und hohe Konzentrationen von Androstendion in humanem Serum. Lyophilisiert. Wiederherstellung mit 0,5ml destilliertem Wasser. Nach der Wiederherstellung können die Kontrollsera einen Monat lang bei 2-8 C gelagert werden. Die genauen Werte entnehmen Sie dem Qualitätskontroll-Datenblatt. Konservierungsmittel: NaN 3 (<0,1%). 4. Beschichtete Röhrchen: 100 mit Kaninchen-Anti-Androstendion Immunoglobulin beschichtete Röhrchen. Unbenutzte Röhrchen müssen bei 2-8 C, geschützt vor Feuchtigkeit, gelagert werden. 5. Waschlösung (50fach konzentriert): 1 Fläschchen mit 20 ml Tris-HCl Puffer mit Detergent und Konservierungsmittel NaN 3 (<0,1 %). Auf 1000 ml mit destilliertem Wasser auffüllen. Die verdünnte Waschlösung ist 2 Monate lang bei 2-8 C stabil. 4. ERFORDERLICHES, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTES, MATERIAL - Teströhrchen aus Plastik - Racks für die Teströhrchen - Einstellbare, automatische Mikropipetten mit Einmalspitzen - Vortexmixer - Graduierter Zylinder - Absaugpumpe oder automatische Waschanlage - Szintillations-Gamma-Counter - Destilliertes Wasser - Wasserbad 5. WARNHINWEISE U VORSICHTSMAßNAHMEN FÜR ANWEER Nur bestimmt zum in vitro Gebrauch. Dieser Test sollte nur von erfahrenem Laborpersonal, in Übereinstimmung mit den Richtlinien der GLP, benutzt werden. Radioaktives Material - Nicht zur innerlichen oder äußerlichen Anwendung bei Menschen und Tieren bestimmt. Dieses radioaktive Material darf nur von Ärzten, klinischen Laboratorien oder Krankenhäusern in Empfang genommen, erworben, besessen oder benutzt werden. Der Gebrauch ist ausschließlich für klinische oder Labor in vitro Tests vorgesehen. Er schließt nicht die interne oder externe Verabreichung des Materials oder die Bestrahlung von Menschen oder Tieren ein. Der Erhalt, Erwerb, Besitz, Gebrauch und Transport unterliegt den gesetzlichen Regelungen jedes einzelnen Staates. Die physikalischen Charakteristika von 125 I befinden sich am Ende der Gebrauchsanleitung 1. Sicherheitsmaßnahmen: die folgenden Vorsichtsmaßnahmen sollten beim Umgang mit radioaktivem Material beachtet werden: - Lagern Sie radioaktives Material nur in den dafür vorgesehenen Bereichen. - Vermeiden Sie Essen, Trinken, Rauchen oder Schminken an Orten, wo mit radioaktiven Materialien gearbeitet wird. - Pipettieren Sie nicht mit dem Mund. - Tragen Sie Handschuhe beim Umgang mit radioaktivem Material und waschen Sie anschließend Ihre Hände sorgfältig. - Bedecken Sie die Arbeitsfläche mit saugfähigem Papier und entsorgen Sie es nach dem Test. - Wischen Sie Verschüttetes sofort und sorgfältig auf und entsorgen Sie das kontaminierte Material als radioaktiven Abfall. - Die Entsorgung von radioaktivem Abfall über das sanitäre Abwassersystem ist per Gesetz verboten. 2. Chemisches Risiko Natriumazid (NaN3) Warnung: einige Reagenzien dieses Kits enthalten Natriumazid als Konservierungsstoff. Für alle diese Reagenzien beträgt die Konzentration von Natriumazid <0,1 Gewichtsprozent. Natriumazid kann mit Blei- und Kupferrohren explosive Metallazidverbindungen bilden. Spülen Sie bei der Entsorgung aller nichtradioaktiven Reagenzien über das Leitungssystem mit großen Wassermengen nach. Risikosatzes R21/22 Gesundheitsschädlich bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Sicherheitssatzes S-26 Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. S-28.1 Bei Berührung mit der Haut sofort abwaschen mit viel Wasser S-46 Bei Verschlucken sofort ärztlichen Rat einholen und Verpackung oder Etikett vorzeigen. 3. Warnung vor potentiellem biologischen Risikomaterial: Dieser Kit kann einige Reagenzien enthalten, die mit menschlichem Serum oder Plasma gewonnen wurden. Das verwendete Serum oder Plasma wurde mit einer FDAzugelassenen Methode als nichtreaktiv gegen HIV-1/2 Antikörper, HCV und HbsAg getestet. RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

4 Da keine Methode eine vollständige Sicherheit für die Abwesenheit von HIV -1/2, HCV, HbsAg oder anderen infektiösen Wirkstoffen garantieren kann, sollten die Reagenzien als biologisches Risikomaterial der Stufe 2 behandelt werden, wie es für alle potentiell infektiösen menschlichen Serum- oder Blutproben in dem Handbuch der nationalen Gesundheitsbehörden Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 3.Edition 1993 vorgeschrieben ist. 6. SAMMLUNG VON EINZELPROBEN Es ist erforderlich Serum zu benutzen. Hoch lipämische oder hämolytische Proben müssen verworfen werden. Die Proben können bei 2-8 C für 1Tage aufbewahrt werden; bei längeren Zeiträumen ist es ratsam die Proben bei 20 C einzufrieren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben kann die Androstendionwerte verringern. 7. TESTVERLAUF - Vor Gebrauch müssen alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur gebracht werden. - Mischen sie die Proben vor Gebrauch durch sanftes Schütteln. - Für alle Kalibratoren wird eine doppelte Messung empfohlen. 1. Bereiten sie leere Röhrchen für Total-Aktivität und beschichtete Röhrchen für Kalibratoren, Proben und Kontrolle vor. 2. Pipettieren Sie 25 µl jedes Kalibrators, Kontrolle und Probe in das adäquate Röhrchen. Pipettieren sie direkt auf den Boden der Röhrchen. 3. Geben Sie 250 µl des radioaktiven Tracers in alle Röhrchen. Vorsichtig mischen. 4. Inkubieren sie alle Röhrchen in einem Wasserbad bei 37 C 60 Minuten lang. 5. Saugen sie den Inhalt jedes Röhrchens, außer denen für die Total- Aktivität, ab. 6. Geben sie 2 ml der verdünnten Waschlotion in jedes Röhrchen, außer in die für die Total-Aktivität und saugen sie gründlich ab oder gießen sie den Inhalt aller Röhrchen auf absorbierendes Papier ab. 7. Zählen Sie die an die Röhrchen gebundene Radioaktivität 1 Minute lang in einem Gamma- Zähler. Wir schlagen vor, den Hintergrund des Instruments vor dem Zählen zu messen. Um Abweichungen in der Sensitivität des Systems zu vermeiden, muß der Hintergrund auf ein Minimum reduziert oder angepasst werden. VERSUCHSSCHEMA Röhrchen Total Aktivität Kalibratoren Kontrolle Proben Reagenz Kalibratoren µl Kontrollserum µl ---- Proben µl Tracer 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl - Mischen und im Wasserbad bei 37 C 60 Minuten lang inkubieren - absaugen oder dekantieren und mit 1 x 2ml waschen (außer dem Röhrchen für die Totalaktivität). - Zählen 8. KALKULATION DER RESULTATE Die Resultate der Packungsbeilage sind mittels einer logarithmischlinearen Kurvendarstellung kalkuliert. Andere Methoden der Datenreduktion können zu leicht unterschiedlichen Resultaten führen. Kalkulieren sie den Prozentwert der Bindungskapazität (Bo/T%) und die Prozentzahl der Bindung für Kalibratoren, Kontrollen und Proben (B/Bo%). Zeichnen sie die Kalibrationskurve auf logit-log oder semilog Papier nach der spline fitting Methode mit den Kalibrationsdosen auf der Abzisse und den respektiven B/Bo % auf der Ordinate. Kalkulieren sie den Wert von B/Bo für jede Probe und lesen sie die Konzentration durch Interpolation an der Eichkurve ab, um die Androstendionkonzentation in den getesteten Proben, ausgedückt in ng/ml, zu erhalten. KALKULATIONSBEISPIEL Die unten aufgeführten Werte müssen als Beispiel gesehen werden und sollten nicht an Stelle experimentell gewonnener Daten verwendet werden. Beschreibung Mittelwert B/B0 (%) ng/ml cpm. Totalaktivität (T) CAL CAL CAL CAL CAL CAL CONTROL CONTROL P P P INTERNE QUALITÄTSKONTROLLE - Entsprechen die Ist-Werte nicht den auf den Q.K. Blatt angegebenen Soll-Werten, können die Werte, ohne treffende Erklärung der Abweichungen, nicht weiterverarbeitet werden. - Falls Extra-Kontrollen erwünscht sind, kann jedes Labor seinen eigenen Pool herstellen, der in Aliquots eingefroren werden sollte. - Akzeptanzkriterien für die Differenz zwischen den Resultaten der Wiederholungstests anhand der Proben müssen auf Guter Laborpraxis beruhen. 9. REFERENZWERTE Es wird empfohlen, dass jedes Labor seine eigenen Referenzintervalle bestimmt. Die unten aufgeführten Werte sind lediglich indikativ. POPULATION N durchschnittliche durchschnittliche + 3 S.D. Männer Frauen Alle VERSUCHSDURCHFÜHRUNG Alle Charakteristika der Durchführung werden in ng/ml ausgedrückt. Zur Umrechnung in nmol/l: ng/ml x 3.45 = nmol/l A. Sensitivität: Die theoretische Sensivität oder die unterste Nachweisgrenze, kalkuliert durch Interpolation des Mittelwerts minus 2facher Standardabweichung von 20 Replikaten des 0 ng/ml Androstendionkalibrators, ist 0.05 ng/ml. B. Präzision: Intra-assay PROBE Durchschnittliche ± S.D V.K. (%) ± ± ± Inter-assay PROBE Durchschnittliche ± S.D V.K. (%) ± ± ± N N RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

5 C. Genauigkeit Die Genauigkeit der Methode wurde durch Wiederfindungs- und Paralleltests evaluiert: Wiederfindungs Test: Zwei Serumproben enthalten unterschiedliche Werte endogenen Androstendions, die mit bekannten Mengen Androstendions gespiked und untersucht werden. Verdünnung erwartete Werte gemessene Werte wiedergefundene Werte (%) S S1 + Kal S1 + Kal S1 + Kal S1 + Kal S1 + Kal S1 + Kal S S2 + Kal S2 + Kal S2 + Kal S2 + Kal S2 + Kal S2 + Kal Parallel Test: Zwei Serumproben werden mit 0 ng/ml Androstendionkalibrator verdünnt und untersucht. Verdünnung erwartete Werte gemessene Werte wiedergefundene Werte (%) S1 unverdünnt / / / / S2 unverdünnt / / / / Spezifität : Eine Kreuzreaktion des Androstendion-Antiserums wurde gegen folgende Verbindungen gemessen. Die prozentuale Kreuzreaktion wird ausgedrückt durch den Anteil der Androstendionkonzentration zur Konzentration der reagierenden Verbindung bei 50% Bindung des 0 ng/ml Kalibrator. Verbindung % Kreuzreaktion Androstenedione 100 Androsterone α-Hydroxyprogesterone Cortisone Isoandrosterone Deoxycortisone Etiocholanolone α - Dihydrotestosterone Dehydroepiandrosterone (DHEA) Progesterone Corticosterone Cortisol Estrone Pregnenolone Cholesterol - DHEA-Sulfate Estradiol 17β Estriol 17α -Hydroxypregnenolone ENGLISH RADIOIMMUNOASSAY FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF AROSTENEDIONE IN HUMAN SERUM R-GM Determinations FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE ONLY 1. CLINICAL APPLICATIONS Androstenedione (4-Androstene-3, 17-dione), a C 19 steroid, is produced in the adrenal gland and gonads. Androstenedione is an immediate precursor to both testosterone and estrone, both of which may be subsequently converted to estradiol. Measurement of serum androstenedione provides a useful marker of androgen biosynthesis. Elevated androstenedione levels have been demonstrated in virilizing congenital adrenal hyperplasia. Androstenedione serum levels are also increased in polycystic ovary syndrome, ovarian stromal hyperthecosis, 3ß-hydroxysteroid dehydrogenase deficiency, and other causes of hirsutism in women [3,5,6]. Elevated androstenedione serum levels may also occur in adrenal and ovarian virilizing tumors [3]. 2. PRINCIPLE OF THE ASSAY The procedure follows the basic principle of radioimmunoassay where there is competition between a radioactive and a non-radioactive antigen for a fixed number of antibody binding sites [9]. The amount of [I-125]-labelled androstenedione bound to the antibody is inversely proportional to the concentration of androstenedione present. The separation of free and bound antigen is achieved by decanting or aspirating the antibody-coated tubes. 3. REAGENTS PROVIDED WITH THE KIT - The reagents are sufficient for 100 determinations. - Store the kit and reagents at 2-8 C. - The expiration date of each reagent is shown on the label. 1. Radioactive Tracer : 1 vial (27 ml) of 125 l labelled androstenedione in a protein-based buffer. Radioactivity contents: ±115 kbq. Preservative : NaN 3 (< 0.1%). 2. Calibrators: Zero calibrator: 1 vial containing 0 ng/ml androstenedione in human serum. Lyophilized. Reconstitute with 1.0 ml of distilled water Calibrators 1 to 5: 5 vials of androstenedione in human serum Lyophilized. Reconstitute with 0.5 ml of distilled water. After reconstitution, the calibrators can be stored at 2-8 C for one month. For the exact value, refer to the value indicated on the Quality Control data sheet. Preservative : NaN 3 (< 0.1%). 3. Controls: 2 vials containing low and high concentrations of androstenedione in human serum. Lyophilized. Reconstitute with 0.5 ml of distilled water. After reconstitution, the controls serum can be stored at 2-8 C for one month. For the exact value, refer to the value indicated on the Quality Control data sheet. Preservative : NaN 3 (< 0.1%). 4. Coated Tubes: 100 tubes coated with rabbit anti-androstenedione immunoglobulin. Unused tubes must be stored at 2-8 C, protected from moisture. 5. Washing solution (50x concentrated): 1 vial of 20 ml Tris-HCl buffer with detergent and preservative NaN 3 (<0.1 %). Bring to 1000 ml with distilled water. The diluted washing solution is stable for 2 months at 2-8 C. RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

6 4. MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED - Plastic test tubes. - Test tube racks. - Adjustable, automatic micropipettes with disposable tips. - Vortex mixer. - Graduated cylinder. - Aspiration pump or automated washing device. - Scintillation gamma counter. - Distilled water. - Waterbath. 5. WARNING A PRECAUTIONS FOR USERS For in vitro diagnostic use. Only experienced laboratory personnel should use this test and handling should be in agreement with GLP. Radioactive Material - Not for Internal or External Use in Humans or Animals. This radioactive material may be received, acquired, possessed, and used only by physicians, clinical laboratories or hospitals and only for in vitro clinical or laboratory tests not involving internal or external administration of the material, or the radiation there from to human beings or animals. Its receipt, acquisition, possession, use and transfer are subject to the regulations of each country. Physical characteristics of 125 I: see end of instructions 1. Safety Precautions: The following precautions should be observed in handling radioactive material: o Store radioactive materials in a designated area. o Do not eat, drink, smoke or apply cosmetics where radioactive materials are being handled. o Do not pipette by mouth. o Wear gloves when handling radioactive materials and wash hands thoroughly afterwards. o Cover working area with disposable absorbent paper. o Wipe up all spills immediately and thoroughly and dispose of the contaminated materials as radioactive waste. o Dispose of the liquid radioactive waste into the sanitary sewage system if permitted by the local regulations. 2. CHEMICAL HAZARD Sodium Azide (NaN 3) Warning: Some of the reagents in this kit contain sodium azide as a preservative. For all such reagents, the concentration of sodium azide is <0.1% w/w. Sodium azide may react with lead and copper plumbing to form explosive metal azides. Dispose of all non radioactive reagents by flushing with large amounts of water through the plumbing system. Risk Phrases R 21/22 Harmful in contact with skin and if swallowed. Safety Phrases S-26 In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. S-28.1 After contact with skin, wash immediately with plenty of water. S-46 If swallowed seek medical advice immediately and show the container or label. 3. POTENTIAL BIOHAZARDOUS MATERIAL Warning: This kit may contain some reagents made with human serum or plasma. The serum or plasma used has been tested by an FDA-approved method and found to be non-reactive for HIV-1/2 Antibodies, HCV and HBsAg. Because no method can offer complete assurance that HIV-1/2, HCV, HBsAg or other infectious agents are absent, these reagents should be handled at the Biosafety Level 2 as recommended for any potentially infectious human serum or blood specimen in the Centers for Disease Control/National Institutes of Health manual Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 3 rd Edition SPECIMEN COLLECTION It is recommended to use serum. Highly lipemic or hemolyzed samples must be discarded. Keep samples at 2-8 C for 1 day; for longer periods it is advisable to freeze samples in aliquots at -20 C. Repeated freezing and thawing of samples may decrease androstendione levels. 7. ASSAY PROCEDURE - Bring all reagents and samples to warm up at room temperature. - Mix samples by gentle agitation before use. - For all calibrators, a duplicate measure is recommended 1. Prepare plain tubes for Total Counts, and coated tubes for Calibrators, Samples and Controls. 2. Pipette 25 µl of each Calibrator, Controls and Sample into the appropriated tubes. Pipette directly to the bottom of the tubes. 3. Add 250 µl of Radioactive Tracer to every tube. Mix gently 4. Incubate all tubes in a waterbath at 37 C for 60 minutes. 5. Aspirate the contents of each tube, except the tubes for Total Counts. 6. Add 2 ml of diluted washing solution to every tube, except tubes for Total Counts and aspirate thoroughly or decant the contents of all tubes on absorbent paper. 7. Count the radioactivity bound to the tubes for 1 minute in a gamma counter. We suggest to control the background of the instrument before counting the assay. In order to avoid variations in the sensitivity of the system, the background must be reduced to a minimum or adjusted properly. ASSAY SCHEME Tubes Total Calibrators Controls Samples activity Reagents Calibrators µl Control serums µl ---- Samples µl Tracer 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl - Mix and incubate in a water bath at 37 C for 60 minutes - Aspirate or decant and wash : 1 x 2 ml, excepted total activity tubes - Count 8. CALCULATION OF RESULTS The results in this package insert were calculated using log-linear curve fit. Other data reduction methods may give slightly different results. Calculate the binding capacity percentage (B o/t%), and the binding percentage for Calibrators, Controls and Samples (B/B o%). Draw the calibration curve on a logit-log or semilog paper, using the spline fitting method, with the calibration doses on the abcissa and the respective B/B o % on the ordinate. Calculate the B/B o % for each sample and read the concentration by interpolation on the calibration curve to obtain androstenedione concentration present in the assayed samples, expressed in ng/ml. EXAMPLE OF CALCULATION The values reported below must be considered as an example and may not be used in place of experimental data. Description Average cpm. B/B 0 (%) ng/ml Total Activity (T) CAL CAL CAL CAL CAL CAL CONTROL CONTROL P P P RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

7 INTERNAL QUALITY CONTROL - If the results obtained for Control 1 and/or Control 2 are not within the range specified on Q.C. sheet, the results cannot be used unless a satisfactory explanation for the discrepancy has been given. - If desirable, each laboratory can make its own pools of control samples, which should be kept frozen in aliquots. - Acceptance criteria for the difference between the duplicate results of the samples should rely on Good Laboratory Practises. 9. REFERENCE VALUES It is recommended that each laboratory determines its own reference interval. Values reported below are only indicative. POPULATION N MEAN Mean +3 SD Males Females All Subjects PERFORMANCES OF THE ASSAY All performance characteristics are expressed in ng/ml. To convert to nmol/l: ng/ml x 3.45 = nmol/l A. Sensitivity: The theoretical sensitivity, or minimum detection limit, calculated by the interpolation of the mean minus two standard deviations of 20 replicates of the 0 ng/ml Androstenedione calibrator, is 0.05 ng/ml. B. Precision: Intra-assay Serum Mean ± SD CV N (%) ± ± ± Inter-assay Serum Mean ± SD CV N (%) ± ± ± Parallelism test : Two serum samples were diluted with 0 ng/ml Androstenedione calibrator and assayed. Dilution Expected Measured Recovery (%) S1 undiluted / / / / S2 undiluted / / / / Specificity : The cross-reactivity of the androstenedione antiserum has been measured against various compounds. The percent cross-reactivity is expressed as the ratio of the androstenedione concentration to the concentration of the reacting compound at 50% binding of the 0 ng/ml calibrator. Compound % Cross-Reactivity Androstenedione 100 Androsterone α-Hydroxyprogesterone Cortisone Isoandrosterone Deoxycortisone Etiocholanolone α - Dihydrotestosterone Dehydroepiandrosterone (DHEA) Progesterone Corticosterone Cortisol Estrone Pregnenolone Cholesterol - DHEA-Sulfate Estradiol 17β Estriol 17α -Hydroxypregnenolone C. Accuracy Accuracy of the method has been checked by the recovery and parallelism tests: Recovery test : Two serum samples containing different levels of endogenous androstenedione were spiked with known amounts of androstenedione and assayed. Added Expected Measured Recovery (%) S S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

8 ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΡΑ ΙΟΑΝΟΣΟΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΣ ΓΙΑ ΤΟΝ ΠΟΣΟΤΙΚΟ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΑΝ ΡΟΣΤΕΝΕ ΙΟΝΗΣ ΣΕ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΟΡΟ R-GM προσδιορισµοί ΜΟΝΟ ΓΙΑ ΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ IN VITRO 1. ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ Η ανδροστενεδιόνη (4-ανδροστένιο-3, 17-διόνη), ένα στεροειδές C 19, παράγεται στα επινεφρίδια και τις γονάδες. Η ανδροστενεδιόνη είναι άµεσος πρόδροµος τόσο για την τεστοστερόνη όσο και για οιστρόνη, που µπορούν να µετατραπούν αµφότερες στη συνέχεια σε οιστραδιόλη. Η µέτρηση της ανδροστενεδιόνης στον ορό παρέχει ένα χρήσιµο δείκτη της βιοσύνθεσης ανδρογόνων: Αυξηµένα επίπεδα ανδροστενεδιόνης έχουν εµφανιστεί σε αρρενοποιητική συγγενή υπερπλασία των επινεφριδίων. Τα επίπεδα της ανδροστενεδιόνης στον ορό αυξάνονται επίσης στο σύνδροµο των πολυκυστικών ωοθηκών, στην υπερθήκωση των στρωµατικών κυττάρων των ωοθηκών, στην ανεπάρκεια της 3β3- υδροξυστεροειδικής δεϋδρογονάσης και σε άλλες αιτίες δασυτριχισµού στις γυναίκες (3, 5, 6). Αυξηµένα επίπεδα ανδροστενεδιόνης στον ορό ενδέχεται να εµφανιστούν επίσης σε περίπτωση αρρενοποιητικών όγκων των επινεφριδίων και των ωοθηκών [3]. 2. ΒΑΣΙΚΗ ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ Η διαδικασία ακολουθεί τη βασική αρχή του ανοσοπροσδιορισµού όπου υπάρχει ανταγωνισµός ανάµεσα σε ένα ραδιενεργό και ένα µη ραδιενεργό αντιγόνο για ένα καθορισµένο αριθµό σηµείων δέσµευσης αντισωµάτων [9]. Η ποσότητα της σηµασµένης µε [I-125] ανδροστενεδιόνης, που είναι δεσµευµένη στο αντίσωµα, είναι αντιστρόφως ανάλογη προς τη συγκέντρωση της ανδροστενεδιόνης που υπάρχει στο δείγµα. Ο διαχωρισµός του ελεύθερου και του δεσµευµένου αντιγόνου επιτυγχάνεται µε τη µετάγγιση ή την αναρρόφηση των σωληναρίων που είναι επιστρωµένα µε αντίσωµα. 3. ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ - Τα αντιδραστήρια επαρκούν για 100 προσδιορισµούς. - Φυλάσσετε το κιτ και τα αντιδραστήρια στους 2-8 C. - Η ηµεροµηνία λήξης κάθε αντιδραστηρίου αναγράφεται στην ετικέτα. 1. Ραδιενεργός ιχνηθέτης : 1 φιαλίδιο (27 ml) µε ανδροστενεδιόνη σηµασµένη µε 125 l σε ρυθµιστικό διάλυµα που έχει ως βάση την πρωτεΐνη. Περιεχόµενα ραδιενέργειας: ± 115 kbq. Συντηρητικό: NaN 3 (< 0,1%). 2. Βαθµονοµητές: Μηδενικός βαθµονοµητής: 1 φιαλίδιο που περιέχει 0 ng/ml ανδροστενεδιόνης σε ανθρώπινο ορό. Λυοφιλοποιηµένο. Ανασυστήστε µε 1,0 ml απεσταγµένου νερού Βαθµονοµητές 1 έως 5: 5 φιαλίδια ανδροστενεδιόνης σε ανθρώπινο ορό. Λυοφιλοποιηµένο. Ανασυστήστε µε 0,5 ml απεσταγµένου νερού. Μετά την ανασύσταση, οι βαθµονοµητές µπορούν να φυλαχτούν σε θερµοκρασία 2-8 C για ένα µήνα. Για την ακριβή τιµή, ανατρέξτε στην τιµή που αναφέρεται στο φύλλο δεδοµένων Ποιοτικού Ελέγχου. Συντηρητικό: NaN 3 (< 0,1%). 3. Ορός ελέγχου: 2 φιαλίδια που περιέχουν χαµηλές και υψηλές συγκεντρώσεις ανδροστενεδιόνης σε ανθρώπινο ορό. Λυοφιλοποιηµένο. Ανασυστήστε µε 0,5 ml απεσταγµένου νερού Μετά την ανασύσταση, οι οροί ελέγχου µπορούν να φυλαχτούν σε θερµοκρασία 2-8 C για ένα µήνα. Για την ακριβή τιµή, ανατρέξτε στην τιµή που αναφέρεται στο φύλλο δεδοµένων Ποιοτικού Ελέγχου. Συντηρητικό: NaN 3 (< 0,1%). 4. Επιστρωµένα σωληνάρια: 100 σωληνάρια επιστρωµένα µε ανοσοσφαιρίνη αντι-ανδροστενεδιόνης από κουνέλι. Τα µη χρησιµοποιηµένα σωληνάρια πρέπει να φυλάσσονται σε θερµοκρασία 2-8 C, προστατευµένα από την υγρασία. 5. ιάλυµα πλύσης (συµπυκνωµένο 50x): 1 φιαλίδιο µε 20 ml ρυθµιστικού διαλύµατος Tris-HCl µε απορρυπαντικό και συντηρητικό NaN 3 (<0,1 %). Φέρτε το στα 1000 ml µε απεσταγµένο νερό. Το αραιωµένο διάλυµα πλύσης παραµένει σταθερό επί 2 µήνες στους 2-8 C. 4. YΛΙΚΑ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΟΥΝΤΑΙ ΑΛΛΑ ΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ - Πλαστικά δοκιµαστικά σωληνάρια - Βάσεις δοκιµαστικών σωληναρίων. - Ρυθµιζόµενες, αυτόµατες µικροπιπέτες µε αναλώσιµα ρύγχη. - Αναµείκτης στροβιλισµού (τύπου vortex). - ιαβαθµισµένος κύλινδρος - Αντλία αναρρόφησης ή αυτοµατοποιηµένη συσκευή πλύσης. - Μετρητής σπινθηρισµών γ ακτινοβολίας. - Απεσταγµένο νερό. - Υδατόλουτρο 5. ΠΡΟΕΙ ΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ ΓΙΑ ΤΟΥΣ ΧΡΗΣΤΕΣ Για διαγνωστική χρήση in vitro. Μόνον έµπειρο προσωπικό εργαστηρίων θα πρέπει να χρησιµοποιεί αυτήν την εξέταση και ο χειρισµός θα πρέπει να είναι σε συµφωνία µε την Ορθή Εργαστηριακή Πρακτική (GLP). Ραδιενεργό υλικό Όχι για εσωτερική ή εξωτερική χρήση σε ανθρώπους ή ζώα. Αυτό το ραδιενεργό υλικό µπορεί να παραλαµβάνεται, να αποκτάται, να κατέχεται και να χρησιµοποιείται µόνον από ιατρούς, κλινικά εργαστήρια ή νοσοκοµεία και µόνο για in vitro κλινικές ή εργαστηριακές εξετάσεις, οι οποίες δεν περιλαµβάνουν εσωτερική ή εξωτερική χορήγηση του υλικού ή της ακτινοβολίας του σε ανθρώπους ή ζώα. Η παραλαβή, λήψη, κατοχή, χρήση και µεταβίβασή του υπόκεινται στους κανονισµούς κάθε χώρας. Φυσικά χαρακτηριστικά του 125 I: βλ. τέλος των οδηγιών 1. Προφυλάξεις για την ασφάλεια: Οι ακόλουθες προφυλάξεις θα πρέπει να τηρούνται κατά το χειρισµό ραδιενεργού υλικού: o Να φυλάσσετε τα ραδιενεργά υλικά σε καθορισµένο χώρο. o Μην τρώτε, µην πίνετε, µην καπνίζετε και µη χρησιµοποιείτε καλλυντικά στο χώρο όπου γίνεται χειρισµός ραδιενεργών υλικών. o Μη διανέµετε µε πιπέτα χρησιµοποιώντας το στόµα σας. o Να φοράτε γάντια όταν χειρίζεστε ραδιενεργά υλικά και να πλένετε καλά τα χέρια σας στη συνέχεια. o Να καλύπτετε την περιοχή εργασίας µε απορροφητικό χαρτί µίας χρήσης. o Να σκουπίζετε αµέσως και καλά όλα τα χυµένα υλικά και να απορρίπτετε τα µολυσµένα υλικά ως ραδιενεργά απόβλητα. o Να απορρίπτετε τα υγρά ραδιενεργά απόβλητα στο υγειονοµικό σύστηµα αποχέτευσης, αν αυτό επιτρέπεται από τους τοπικούς κανονισµούς. 2. ΧΗΜΙΚΟΣ ΚΙΝ ΥΝΟΣ Αζίδιο του νατρίου (NaN 3) Προειδοποίηση: Μερικά από τα αντιδραστήρια που περιλαµβάνονται στο κιτ αυτό περιέχουν αζίδιο του νατρίου ως συντηρητικό. Για όλα τα εν λόγω αντιδραστήρια, η συγκέντρωση του αζιδίου του νατρίου είναι <0,1% w/w. Το αζίδιο του νατρίου ενδέχεται να αντιδράσει µε το µόλυβδο και το χαλκό των υδραυλικών σωληνώσεων µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό αζιδίων µετάλλων. Απορρίψτε όλα τα µη ραδιενεργά αντιδραστήρια ξεπλένοντας µε άφθονο νερό µέσω του συστήµατος της αποχέτευσης. Φράσεις που αφορούν κινδύνους R 21/22 Επιβλαβές σε επαφή µε το δέρµα και σε περίπτωση καταπόσεως. Φράσεις που αφορούν την ασφάλεια S-26 Σε περίπτωση επαφής µε τα µάτια, πλύνετέ τα αµέσως µε άφθονο νερό και ζητήστε ιατρική συµβουλή. S-28.1 Σε περίπτωση επαφής µε το δέρµα, πλυθείτε αµέσως µε άφθονο νερό. RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

9 S-46 Σε περίπτωση κατάποσης ζητήστε αµέσως ιατρική συµβουλή και δείξτε αυτό το δοχείο ή την ετικέτα. 3. ΠΙΘΑΝΩΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΕΠΙΚΙΝ ΥΝΟ ΥΛΙΚΟ Προειδοποίηση: Το κιτ αυτό µπορεί να περιέχει µερικά αντιδραστήρια παρασκευασµένα µε ανθρώπινο ορό ή πλάσµα. Ο ορός ή το πλάσµα που χρησιµοποιήθηκε έχει ελεγχθεί µε µέθοδο εγκεκριµένη από τον FDA και έχει βρεθεί ότι δεν είναι δραστικός για αντισώµατα έναντι HIV-1/2, HCV και HBsAg. Επειδή καµία µέθοδος δεν µπορεί να προσφέρει πλήρη διασφάλιση ότι δεν υπάρχουν οι ιοί HIV-1/2, HCV, HBsAg ή άλλοι µολυσµατικοί παράγοντες, ο χειρισµός αυτών των αντιδραστηρίων θα πρέπει να γίνεται σύµφωνα µε το Επίπεδο Βιολογικής Ασφάλειας 2 όπως συνιστάται για οποιοδήποτε ενδεχοµένως µολυσµατικό ανθρώπινο ορό ή δείγµα αίµατος στο εγχειρίδιο των Κέντρων Ελέγχου Νόσων/Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας µε τίτλο Βιολογική ασφάλεια σε µικροβιολογικά και βιοχηµικά εργαστήρια" (Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories), 3 η έκδοση ΣΥΛΛΟΓΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ Συνιστάται η χρήση ορού. Ιδιαίτερα λιπαιµικά ή αιµολυµένα δείγµατα θα πρέπει να απορρίπτονται. Κρατήστε τα δείγµατα στους 2-8 C επί 1 ηµέρα. Για µεγαλύτερες περιόδους θα σας συνιστούσαµε να καταψύξετε τα δείγµατα σε κλάσµατα (δόσεις) στους -20 C. Επανειληµµένη κατάψυξη και απόψυξη των δειγµάτων ενδέχεται να αυξήσει τα επίπεδα της ανδροστενεδιόνης. 7. ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ ΜΕΘΟ ΟΥ - Φέρετε όλα τα αντιδραστήρια και τα δείγµατα σε θερµοκρασία δωµατίου πριν από τη χρήση. - Πριν από τη χρήση, αναµείξτε τα δείγµατα µε απαλή ανακίνηση. - Για όλους τους βαθµονοµητές, συνιστάται διπλή µέτρηση 1. Προετοιµάστε απλά σωληνάρια για τις µετρήσεις «Total» (µετρήσεις του ιχνηθέτη) και επιστρωµένα σωληνάρια για τους βαθµονοµητές, τα δείγµατα και τον ορό ελέγχου. 2. ιανείµετε µε πιπέτα 25 µl από κάθε βαθµονοµητή, ορό ελέγχου και δείγµα στα κατάλληλα σωληνάρια. ιανείµετε κατευθείαν στον πυθµένα των σωληναρίων. 3. Προσθέστε 250 µl ραδιενεργού ιχνηθέτη σε όλα τα σωληνάρια. Αναµείξτε µε ήπια κίνηση. 4. Επωάστε όλα τα σωληνάρια σε υδατόλουτρο στους 37 C για 60 λεπτά. 5. Αναρροφήστε το περιεχόµενο κάθε σωληναρίου (µε εξαίρεση εκείνα που αφορούν τις µετρήσεις του ιχνηθέτη 125 I ["total"]). 6. Προσθέστε 2 ml αραιωµένου διαλύµατος πλύσης σε κάθε σωληνάριο, εκτός από τα σωληνάρια που αφορούν τις µετρήσεις του ιχνηθέτη ("τotal") και αναρροφήστε καλά ή µεταγγίστε το περιεχόµενο των σωληναρίων σε απορροφητικό χαρτί. 7. Μετρήστε τη ραδιενέργεια στα σωληνάρια επί 1 λεπτό σε µετρητή γ ακτινοβολίας. Προτείνουµε να ελέγξετε το υπόβαθρο του οργάνου πριν µετρήσετε τον προσδιορισµό. Προκειµένου να αποφύγετε αποκλίσεις στην ευαισθησία του συστήµατος, το υπόβαθρο πρέπει να µειωθεί στο ελάχιστο ή να ρυθµιστεί κατάλληλα. ΣΧΗΜΑ ΜΕΘΟ ΟΥ Σωληνάρια Μέτρηση ιχνηθέτη 125 Ι (total) Βαθµονο- µητές Ορός ελέγχου είγµατα Αντιδραστήριο Βαθµονοµητές µl Ορός ελέγχου µl ---- είγµατα µl Ιχνηθέτης 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl - Αναµείξτε και επωάστε σε υδατόλουτρο στους 37 για 60 λεπτά. - Αναρροφήστε ή µεταγγίστε και πλύνετε: 1 x 2 ml, εξαιρεµένοι συνολικοί σωλήνες δραστηριότητας - Μετρήστε 8. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Τα αποτελέσµατα σ' αυτό το φύλλο οδηγιών υπολογίστηκαν χρησιµοποιώντας προσαρµογή λογαριθµικής-γραµµικής καµπύλης. Άλλες µέθοδοι αναγωγής δεδοµένων ενδέχεται να δώσουν ελαφρώς διαφορετικά αποτελέσµατα. Υπολογίστε το ποσοστό ικανότητας δέσµευσης (Bo/T%) και το ποσοστό δέσµευσης για τους βαθµονοµητές, τους ορούς ελέγχου και τα δείγµατα (B/Bo%). Σχεδιάστε την καµπύλη βαθµονόµησης πάνω σε ένα χαρτί γραφήµατος logit-log ή ηµιλογαριθµικό χαρτί γραφήµατος, χρησιµοποιώντας τη µέθοδο προσαρµογής καµπύλης spline, µε τις δόσεις βαθµονόµησης πάνω στην τετµηµένη και το αντίστοιχο B/Bo % πάνω στην τεταγµένη. Υπολογίστε το B/Bo % για κάθε δείγµα και διαβάστε τη συγκέντρωση µε αναγωγή στην καµπύλη βαθµονόµησης για να λάβετε τη συγκέντρωση της ανδροστενεδιόνης που υπάρχει στα δείγµατα, τα οποία υποβάλλονται σε προσδιορισµό, εκφρασµένη σε ng/ml. ΠΑΡΑ ΕΙΓΜΑ ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΥ Οι τιµές που αναφέρονται πιο κάτω πρέπει να θεωρηθούν ως παράδειγµα και δεν µπορούν να χρησιµοποιηθούν αντί πειραµατικών δεδοµένων. Περιγραφή Μέση τιµή B/B 0 (%) ng/ml cpm Μέτρηση ιχνηθέτη 125 Ι (T) CAL CAL CAL CAL CAL CAL ΟΡΟΣ ΕΛΕΓΧΟΥ ΟΡΟΣ ΕΛΕΓΧΟΥ P P P ΕΣΩΤΕΡΙΚΟΣ ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ - Εάν τα αποτελέσµατα που λαµβάνονται για τον ορό ελέγχου 1 ή/και τον ορό ελέγχου 2 δε βρίσκονται εντός του πεδίου τιµών που καθορίζεται στην ετικέτα του φιαλιδίου, τα αποτελέσµατα δεν είναι δυνατό να χρησιµοποιηθούν, εκτός εάν έχει δοθεί ικανοποιητική εξήγηση για την ασυµφωνία. - Εάν είναι επιθυµητό, κάθε εργαστήριο µπορεί να δηµιουργήσει τα δικά του µείγµατα δειγµάτων ελέγχου (pools), τα οποία πρέπει να διατηρούνται κατεψυγµένα σε κλάσµατα/δόσεις µιας χρήσης. - Τα κριτήρια αποδοχής για τη διαφορά µεταξύ των διπλών αποτελεσµάτων των δειγµάτων θα πρέπει να βασίζονται σε ορθές εργαστηριακές πρακτικές. 9. ΤΙΜΕΣ ΑΝΑΦΟΡΑΣ Συνιστάται κάθε εργαστήριο να προσδιορίσει το δικό του πεδίο τιµών αναφοράς. Οι τιµές που αναφέρονται πιο κάτω είναι απλώς ενδεικτικές. ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ N ΜΕΣΗ ΜΕΣΗ 3ΤΑ Άνδρες Γυναίκες Όλα τα υποκείµενα ΑΠΟ ΟΣΕΙΣ ΤΗΣ ΜΕΘΟ ΟΥ Όλα τα χαρακτηριστικά απόδοσης εκφράζονται σε ng/ml. Για µετατροπή σε nmol/l: ng/ml x 3,45 = nmol/l A. ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ: Η θεωρητική ευαισθησία ή το ελάχιστο όριο ανίχνευσης, που υπολογίζεται µέσω αναγωγής της µέσης τιµής µείον δύο τυπικές αποκλίσεις 20 επαναλήψεων του βαθµονοµητή ανδροστενεδιόνης 0 ng/ml, είναι 0.05 ng/ml. RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

10 B. Ακρίβεια: Για τον ίδιο προσδιορισµό Ορός Μέση τιµή ± Τυπ. Σ.. N απόκλιση % A 0.51 ± B 1.50 ± C 4.70 ± Μεταξύ διαφορετικών προσδιορισµών Ορός Μέση τιµή ± Τυπ. Σ.. N απόκλιση % A 0.63 ± B 2.17 ± C 5.47 ± Γ. ΟΡΘΟΤΗΤΑ Η ορθότητα της µεθόδου έχει ελεγχθεί µε δοκιµασίες ανάκτησης και παραλληλισµού: Ένωση % ιασταυρούµενη αντιδραστικότητα Ανδροστενεδιόνη 100 Ανδροστερόνη υδροξυπρογεστερόνη Κορτιζόνη Ισοανδροστερόνη εοξυκορτιζόνη Αιτιοχολανολόνη α-διυδροτεστοστερόνη εϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA) Προγεστερόνη Κορτικοστερόνη Κορτιζόλη Οιστρόνη Πρεγνενολόνη µην καθορισµένος Χοληστερόλη - DHEA-Θειική Οιστραδιόλη µην καθορισµένος Οιστριόλη µην καθορισµένος 17-υδροξυπρογεστερόνη µην καθορισµένος οκιµασία ανάκτησης: ύο δείγµατα ορού που περιέχουν διαφορετικά επίπεδα ενδογενούς ανδροστενεδιόνης εµβολιάστηκαν µε γνωστές ποσότητες ανδροστενεδιόνης και υποβλήθηκαν σε προσδιορισµό. Αναµενόµενη Μετρηθείσα Ανάκτηση συγκέντρωση συγκέντρωση (%) S S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL οκιµασία παραλληλισµού: ύο δείγµατα ορού αραιώθηκαν µε βαθµονοµητή ανδροστενεδιόνης 0 ng/ml και υποβλήθηκαν σε προσδιορισµό. Αραίωση Αναµενόµενη τιµή Μετρηθείσα τιµή Ανάκτηση (%) S1 µη αραιωµένο / / / / S2 µη αραιωµένο / / / / ΕΙ ΙΚΟΤΗΤΑ: Η διασταυρούµενη αντιδραστικότητα του αντιορού ανδροστενεδιόνης µετρήθηκε έναντι διαφόρων ενώσεων. Το ποσοστό επί τοις εκατό της διασταυρούµενης αντιδραστικότητας εκφράστηκε ως ο λόγος της συγκέντρωσης ανδροστενεδιόνης προς τη συγκέντρωση της αντιδρώσας ένωσης σε δέσµευση 50% του Προτύπου Α 0 ng/ml. RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

11 ESPAGÑOL RADIOINMUNO ENSAYO PARA LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE AROSTENEDIONA EN SUERO HUMANO R-GM determinaciones SÓLO PARA EL USO EN DIAGNÓSTICOS IN VITRO 1. APLICACIONES CLÍNICAS La Androstenediona (4-Androstena-3, 17-diona), un esteroide C 19, se produce en las glándulas suprarrenales y las gónadas. La Androstenediona es un precursor inmediato tanto de la testosterona como de la estrona, las cuales pueden posteriormente convertirse en estradiol. La medición de androstenediona sérica, provee de un marcador útil de la biosíntesis de andrógenos. Se han encontrado niveles elevados Androstenediona en la hiperplasia suprarrenal congénita virilizarte. Los niveles séricos de Androstenediona también se encuentran elevados en el síndrome de ovario poliquístico, hipertecosis del estroma ovárico, deficiencia de deshidrogenasa 3ß-hidroxiesteroide y otras causas de hirsutismo e la mujer. [3, 5,6]. También pueden ocurrir niveles séricos elevados de androstenediona cuando hay tumores suprarrenales y ováricos virilizantes [3]. 2. PRINCIPIO DEL ANÁLISIS El procedimiento sigue el principio básico del radioinmuno ensayo donde un antígeno radiactivo compite contra uno no radiactivo por un número fijo de sitios de unión de anticuerpos [9]. La cantidad de [I- 125]- androstenediona marcada unida al anticuerpo es inversamente proporcional a la concentración de androstenediona presente. La separación del antígeno libre del unido, se obtiene decantando o aspirando los tubos recubiertos con anticuerpos. 3. MATERIAL SUMINISTRADO - Los reactivos bastan para 100 determinaciones. - Almacene el kit y los reactivos a 2-8 C. - La fecha de caducidad de cada reactivo se muestra en la etiqueta 1. Trazador radiactivo: 1 vial (27 ml) de androstenediona marcada con 125 l, en un tampón protéico. Contenido de radiactividad: ±115 kbq. Conservante: NaN 3 (< 0,1%). 2. Calibradores: Calibrador cero: 1 vial con andostenediona en suero humano que contiene 0 ng/ml. Reconstituya con 1,0 ml de agua destilada. Calibradores 1 a 5: 5 viales de androstenediona en suero humano liofilizado. Reconstituya con 0,5 ml de agua destilada. Después de reconstituidos, los calibradores pueden ser almacenados entre 2-8 C por un mes. Para el valor exacto, refiérase al valor indicado en la hoja de datos de Control de Calidad. Conservante : NaN 3 (< 0,1%). 3. Controles: 2 viales conteniendo concentraciones altas y bajas de androstenediona en suero humano liofilizado. Reconstituya en 0,5 ml de agua destilada. Después de reconstituidos, los sueros de control pueden almacenarse por un mes entre 2-8 C. Para el valor exacto, refiérase al valor indicado en la hoja de datos de Control de Calidad. Conservante : NaN 3 (< 0,1%). 4. Tubos recubiertos: 100 tubos recubiertos con inmunoglobulina de conejo anti-androstenediona. Los tubos que no se usen deberán almacenarse a 2-8 C y quedar protegidos de la humedad. 5. Solución de lavado (concentración x 50): 1 vial de 20 ml de tampón TRIS-HCl con detergente Conservante: NaN 3 < 0,1%. Mezclar con agua destilada hasta obtener un volumen de 1000 ml. La solución de lavado diluida se mantiene estable durante 2 meses a 2-8 C. 4. MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO - Tubos de ensayo de plástico - Gradillas de tubos de ensayo. - Micropipetas automáticas ajustables con puntas desechables. - Mezclador vórtex. - Cilindro graduado. - Bomba de aspiración o aparato de lavado automático. - Contador de centelleo gamma. - Agua destilada. - Baño maría. 5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES PARA LOS USUARIOS Para uso de diagnóstico in vitro. Este ensayo sólo debe ser usado por personal de laboratorio con experiencia y su manejo debe estar en línea con GLP (Buena Práctica en el Laboratorio). Material Radiactivo No Usar Interna o Externamente en Humanos o Animales. Este material radiactivo puede ser recibido, adquirido, poseído y usado sólo por médicos, laboratorios clínicos y hospitales y sólo para exámenes clínicos o de laboratorio in vitro sin incluir administración interna o externa del material, o la radiación a seres humanos o animales. Su recepción adquisición, posesión, uso y trasporte están reguladas por las normas de cada país. Características Físicas de 125 I: vea el final de las instrucciones. 1. Precauciones de Seguridad: Las siguientes precauciones deben ser observadas al manipular material radiactivo: o Almacenar materiales radiactivos en un área designada. o No coma, beba, fume o se aplique cosméticos en lugares donde se manipulan materiales radiactivos. o No pipetee con la boca. o Use guantes cuando manipule materiales radiactivos y posteriormente lávese las manos escrupulosamente. o Cubra el área de trabajo con papel absorbente desechable. o Limpie los derrames inmediatamente y de forma rigurosa y elimine el material contaminado como desecho radiactivo. o Elimine el líquido radiactivo en el sistema de alcantarillado si está permitido por las normas locales. 2. PELIGROS QUÍMICOS Azida de Sodio (NaN 3) Precaución: Algunos de los reactivos en este kit, contienen azida de sodio como preservativo. Para todos esos reactivos, la concentración de azida de sodio es <0,1% p/p. La azida de sodio puede reaccionar con las cañerías de cobre y plomo para formar azidas metálicas explosivas. Elimine todos los reactivos no radiactivos, por el sistema de alcantarillado, con abundante cantidad de agua. Afirmaciones de Riesgo R 21/22 Dañino en contacto con la piel y si es ingerido. Afirmaciones de Seguridad S-26 En caso de contacto con los ojos, enjuague inmediatamente con bastante agua y pida asistencia médica. S-28.1 Después haber contacto con la piel, lavar inmediatamente con bastante agua. S-46 Si es ingerido acuda por asistencia médica de inmediato llevando el envase o la etiqueta 3. MATERIAL DE POTENCIAL RIESGO BIOLÓGICO Precaución: Este kit puede contener algunos reactivos hechos con suero o plasma humano. El suero o plasma usados han sido examinados con métodos aprobados por la FDA y se ha determinado que no son reactivos con anticuerpos HIV-1/2, anticuerpos HCV y HBsAg. Debido a que ningún método puede ofrecer seguridad total de que HIV-1/2, HCV, HBsAg u otros agentes infecciosos no estén presentes, estos reactivos debe manipularse al Nivel 2 de Bioseguridad tal como se recomienda en el manual Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 3 rd Edition 1993.de los Centers for Disease Control/National Institutes of Health. 6. RECOGIDA DE MUESTRAS Sólo se pueden utilizar muestras de suero. Deberán descartarse las muestras demasiado lipémicas o hemolizadas. Mantenga las muestras a 2-8 C durante 1 día; para períodos más largos se recomienda RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

12 congelar las muestras en porciones alícuotas a -20 C. Congelar y descongelar las muestras en forma repetida puede disminuir los niveles de androstendiona. 7. PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS - Asegúrese de que todas las muestras y los reactivos se encuentran a temperatura ambiente antes de utilizarlos. - Antes de su uso, mezcle las muestras por inversión. - Se recomienda una medida duplicada para todos los calibradores. 1. Prepare tubos normales para los recuentos totales y tubos con recubrimiento para los calibradores, las muestras y los controles. 2. Pipetee 25 µl de Calibrador, Controles y Muestra dentro de los tubos adecuados. Pipetee directamente al fondo de los tubos. 3. Agregue 250 µl de Marcador Radiactivo a cada tubo. Mezcle suavemente. 4. Incube todos los tubos en el baño maria a 37 C por 60 minutos. 5. Aspire el contenido de los tubos, excepto el de los de recuentos totales. 6. Añada 2 ml de solución de lavado diluida en todos los tubos, excepto los de recuentos totales, y aspire totalmente o decante el contenido de los tubos con ayuda de papel absorbente. 7. Mida la radiactividad de los tubos durante 1 minuto con un contador gamma. Es recomendable controlar el fondo del instrumento antes de realizar la medición en el análisis. Para evitar variaciones en la sensibilidad del sistema, el fondo debe reducirse al mínimo o ajustarse debidamente ESQUEMA DEL ANÁLISIS Tubos Actividad Reactivo total Calibradores Controles Muestras Calibradores µl Sueros de control µl ---- Muestras µl Trazador 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl - Mezcle e incube en baño maría a 37 C por 60 minutos - Aspire o decante y lave: 1 x 2 ml, excepto tubos de recuento total - Recuento 8. CÁLCULO DE RESULTADOS Los resultados en este inserto fueron calculados usando curva de ajuste linear-logaítmica. Otros métodos de reducción de datos pueden dar resultados ligeramente distintos. Calcule el porcentaje de capacidad de unión (B o/t%) y el porcentaje de unión para Calibradores, Controles y Muestras (B/B o%). Tace la curva de calibración en una gráfico logit-log o semi-log, usando el método spline fitting, con las dosis de calibración en la abcisa y las B/B o % correspondientes en la ordenada. Calcule el B/B o % para cada muestra y lea la concentración interpolando en la curva de calibración para obtener la concentración expresada en ng/ml de androstenediona presente en las muestras analizadas. EJEMPLO DE CÁLCULO Los valores que se indican a continuación son simplemente ilustrativos y no deben emplearse en lugar de los datos experimentales. CONTROL DE CALIDAD INTERNO - Si los resultados obtenidos para el Control 1 y/o Control 2 no caen dentro del rango especificado en la hoja de control de calidad, los resultados no puede ser usados a menos que se encuentre una explicación satisfactoria a la discrepancia dada. - Si se desea, cada laboratorio puede hacer su propio grupo de muestras de control que debe ser almacenadas en alícuotas congeladas. - El criterio de aceptación para las diferencias entre los resultados de los duplicados debe depender de una Buena Práctica en el Laboratorio (GLP). 9. VALORES DE REFERENCIA Es recomendable que cada laboratorio determine su propio intervalo de referencia. Los valores que se indican a continuación son meramente indicativos. POBLACIÓN N MEDIA MEDIA +3 D.E. Hombres 100 1,30 2,86 Mujeres 100 1,14 2,83 Todos 200 1,22 2, REIMIENTO DEL ANÁLISIS Todas las características de rendimiento están expresadas en ng/ml. Para convertir a nmol/l: ng/ml x 3,45 = nmol/l A. Sensibilidad: La sensibilidad teórica o límite de detección mínimo, calculado interpolando el promedio de 20 muestras repetidas de calibrador 0 ng/ml Androstenediona menos dos desviaciones estándar, es 0,05 ng/ml. B. Precisión: Intraensayo Suero Media ± D.E. C.V. N (%) 1 0,51 ± 0,03 5, ,50 ± 0,12 8, ,70 ± 0,41 8,7 17 Entre análisis Suero Media ± D.E. C.V. N (%) 1 0,63 ± 0,06 9, ,17 ± 0,17 7, ,47 ± 0,20 3,7 6 C. EXACTITUD La exactitud del método ha sido evaluada mediante pruebas de recuperación y paralelismo. Prueba de recuperación A dos muestras de suero con distintos niveles de androstenediona endógena se les agregaron cantidades conocidas de androstenediona y luego se analizan. Descripción Promedio B/B 0 ng/ml cpm (%) Actividad total(t) CAL CAL ,5 0,10 CAL ,1 0,30 CAL ,1 1,0 CAL ,0 3,0 CAL ,9 10,0 CONTROL ,3 0,68 CONTROL ,2 2,82 P ,6 0,65 P ,8 1,25 P ,3 6,99 RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / Agregado Previsto Medido Recuperación (%) S1-0,67 - S1 + CAL 0 0,34 0,41 120,6 S1 + CAL 1 0,39 0,40 102,6 S1 + CAL 2 0,49 0,54 110,2 S1 + CAL 3 0,84 1,01 120,2 S1 + CAL 4 1,84 1,80 97,8 S1 + CAL 5 5,34 4,22 79,0

13 Agregado Previsto Medido Recuperación (%) S2-1,89 - S2 + CAL 0 0,95 0,94 98,9 S2 + CAL 1 1,00 1,06 106,0 S2 + CAL 2 1,10 1, S2 + CAL 3 1,45 1,51 104,1 S2 + CAL 4 2,45 2,56 104,5 S2 + CAL Prueba de paralelismo: Dos muestras de suero se diluyeron con calibrador con 0 ng/ml Androstenediona y luego se analizaron. Dilución Previsto Medido Recuperación (%) S1 sin diluir - 2,71-1/2 1,35 1,38 102,2 1/4 0,68 0,67 98,5 1/8 0,34 0,35 102,9 1/16 0,17 0,23 135,2 S2 sin diluir - 5,01-1/2 2,50 2,27 90,8 1/4 1,25 1,29 103,2 1/8 0,63 0,73 115,9 1/16 0,31 0,39 125,8 Especificidad: La reacción cruzada del antisuero androstenediona ha sido medida contra varios compuestos. El porcentaje de reacción cruzada se expresa como la relación de la concentración de androstenediona a la concentración del compuesto reactivo cuando 50% del calibrador con 0 ng/ml se ha unido. Compuesto % Reacción cruzada Androstenediona 100 Androsterona 0, α-Hidroxiprogesterona 0,084 Cortisona 0,0099 Isoandrosterona 0, Deoxicortisona 0,0006 Etiocholanolona 0,0422 5α - Dihidrotestosterona 0,0105 Dehydroepiandrosterona (DHEA) 0,0155 Progesterona 0,0168 Corticosterona 0,0047 Cortisol 0,0148 Estrona 0,0270 Pregnenolona Colesterol - DHEA-Sulfato 0,0009 Estradiol 17β Estriol 17α -Hidroxipregnenolona FRANÇAIS DOSAGE RADIO-IMMUNOLOGIQUE POUR LA DETERMINATION QUANTITATIVE DE L'AROSTENEDIONE DANS LE SERUM HUMAIN R-GM Déterminations UNIQUEMENT À USAGE DE DIAGNOSTIC IN VITRO 1. APPLICATIONS CLINIQUES L'androstènedione (4-Androstène-3, 17-dione), un stéroïde en C 19, est produit par les glandes surrénales et les gonades. L'androstènedione est un précurseur immédiat à la fois de la testostérone et de l'oestrone, pouvant être ensuite toutes les deux converties en oestradiol. Le dosage de l'androstènedione sérique fournit un marqueur utile de la biosynthèse des androgènes. Des taux élevés d'androstènedione ont été démontrés dans l'hyperplasie surrénale congénitale virilisante. Les taux sériques d'androstènedione sont également augmentés dans le syndrome des ovaires polykystiques, l'hyperthécose du stroma ovarien, la déficience en 3ß-hydroxystéroïde déshydrogénase et d'autres causes d'hirsutisme chez la femme [3,5,6]. Des taux sériques élevés d'androstènedione peuvent également se rencontrer dans les tumeurs surrénaliennes et ovariennes virilisantes [3]. 2. PRINCIPES DE L'ANALYSE La procédure est basée sur le principe du dosage radio-immunologique dans lequel il y a compétition entre un antigène radioactif et un antigène non radioactif pour un nombre fixe de sites de liaison de l'anticorps [9]. La quantité d'androstènedione marquée à l'[i- 125 ] liée à l'anticorps est inversement proportionnelle à la concentration en androstènedione présente. La séparation entre les antigènes libres et les antigènes liés est réalisée par décantation ou aspiration des tubes coatés avec les anticorps. 3. REACTIFS FOURNIS AVEC LA TROUSSE - Les réactifs sont suffisants pour 100 déterminations. - Conserver la trousse et les réactifs entre 2 et 8 C. - La date d'expiration de chacun des réactifs est inscrite sur son étiquette. 1. Traceur radioactif: 1 flacon (27 ml) d'androstènedione marquée à l' 125 l dans un tampon protéiné. Radioactivité du contenu: ±115 kbq. Agent conservateur: NaN 3 (< 0,1%). 2. Calibrateurs: calibrateur zéro: 1 flacon contenant 0 ng/ml d'androstènedione dans du sérum humain. Lyophilisé. Reconstituer avec 1,0 ml d eau distillée. Calibrateurs 1 à 5: 5 flacons d'androstènedione dans du sérum humain. Lyophilisé. Reconstituer avec 0.5 ml d'eau distillée. Après reconstitution, les calibrateurs peuvent être conservés un mois entre 2 et 8 C. Pour la valeur exacte, se référer à la valeur indiquée sur la feuille des données du contrôle de qualité. Agent conservateur: NaN 3 (< 0,1%). 3. Contrôles: 2 flacons contenant des concentrations basses et élevées d'androstènedione dans du sérum humain. Lyophilisé. Reconstituer avec 0,5 ml d'eau distillée. Après reconstitution, les calibrateurs peuvent être conservés un mois entre 2 et 8 C. Pour la valeur exacte, se référer à la valeur indiquée sur la feuille des données du contrôle de qualité. Agent conservateur: NaN 3 (< 0,1%). 4. Tubes coatés: 100 tubes coatés avec une immunoglobuline de lapin anti-androstènedione. Les tubes inutilisés doivent être conservés entre 2 et 8 C, à l'abri de l'humidité. 5. Solution de lavage (concentrée 50x): 1 flacon de 20 ml d'un tampon Tris-HCl avec du détergent et un agent conservateur NaN 3 (<0,1 %). Amener à 1000 ml avec de l'eau distillée. La solution diluée est stable pendant 2 mois entre 2 et 8 C. RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

14 4. MATERIEL REQUIS MAIS NON FOURNI - Tubes d'analyse en plastique. - Portes tubes d'analyse. - Micropipettes automatiques réglables avec embouts jetables. - Agitateur Vortex. - Cylindre gradué. - Pompe d'aspiration ou appareil de lavage automatisé. - Compteur de scintillation gamma. - Eau distillée. - Bain-marie. 5. AVERTISSEMENTS ET PRECAUTIONS D EMPLOI Ce matériel est conçu uniquement pour une utilisation diagnostique in vitro. Le kit est destiné à l utilisation professionnel et uniquement utilisé par le personnel du laboratoire, en conformité aux normes GLP. Caractéristiques physique de 125 I: voir fin de la notice 1. Précautions: Matériel radioactif - Ne pas administrer par voie interne ou externe à des êtres humains ou à des animaux. Le matériel radioactif ne peut être acheté, commandé et détenu que par du personnel médical, des laboratoires d analyse, des hôpitaux et uniquement à des fins de diagnostic IN VITRO. Il ne doit en aucun cas être administré par voie interne ou externe à des êtres humains ou des animaux. La réception, l achat, la possession, l utilisation et le transfert de ce matériel est soumis à des réglementations qui peuvent être différentes dans chaque pays. Mesures de précaution pour l utilisation de matériel radioactif: o Conserver le matériel radioactif dans un endroit prévu à cet effet. o Ne pas manger, boire, fumer ou appliquer de cosmétiques dans les zones destinées à l utilisation de matériaux radioactifs. o Ne pas pipeter la solution radioactive avec la bouche. o Porter des gants pour manipuler du matériel radioactif et soigneusement se laver les mains après son utilisation. o Couvrir la zone de travail à l aide de papier absorbant jetable. o Toute perte accidentelle de produit radioactif doit être traitée selon les procédures établies. o Tous les matériaux radioactifs doivent être éliminés selon des systèmes d élimination conformes aux dispositions prévues par les organismes de contrôles ayant juridiction sur le laboratoire. 2. Risque chimique- Nitrure de sodium (NaN 3): Le nitrure de sodium est utilisé dans les réactifs du kit à une concentration finale ne dépassant pas 0,1% p/p. Le nitrure de sodium peut avoir des effets sur les tuyaux d évacuation en plomb et cuivre en formant des azides métalliques hautement explosifs. Lors de l élimination du produit, rincer abondamment à l eau pour éviter l accumulation d azides. Le nitrure de sodium est un poison. Il peut être létal s il est ingéré. Ne pas pipeter avec la bouche le matériel contenant du nitrure de sodium. Manipuler avec précaution et éviter le contact avec la peau. Se laver les mains après avoir travaillé avec du matériel contenant du nitrure de sodium. Phrases de risque R-21/22 Dangereux si le produit entre en contact avec la peau ou s il est ingéré Phrases de sécurité S-26 En cas de contact avec les yeux, rincer immédiatement avec une grande quantité d eau et consulter un médecin. S-28.1 Après le contact avec les yeux, rincer immédiatement avec une grande quantité d eau. S-46 En cas d ingestion, consulter immédiatement un médecin et lui montrer le récipient ou l étiquette. 3. Risque biologique - Sérum humain: Le kit contient des réactifs préparés à l aide de sérum ou de plasma humain. Le sérum et le plasma employés ont été testés selon une méthode approuvée par la FDA. Ils sont négatifs à la présence d anticorps HIV-1/2, HCV et HbsAg. Toutefois, aucune méthode ne permet d établir avec certitude que le HIV-1/2, HCV, HbsAg ou d autres agents infectieux sont absents. Ces réactifs devraient donc être considérés comme potentiellement infectieux et manipulés avec les précautions appliquées pour les échantillons de sérum ou de plasma au Biosafety Level 2 et selon les dispositions du manuel sanitaire CDC (Centers for Disease Control/National Institutes of Health), Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 3 rd Edition, ECHANTILLONS A TESTER Il est recommandé d'utiliser du sérum. Les échantillons fortement lipémiques ou hémolysés doivent être écartés. Conserver les échantillons entre 2 et 8 C pendant 1 jour. Pour de plus longues périodes, il est conseillé d'aliquoter les sérums et de les congeler à - 20 C. Des décongélations-recongélations successives peuvent faire baisser les taux d'androstènedione. 7. REALISATION DU DOSAGE - Amener tous les réactifs et les échantillons à température ambiante. - Mélanger les échantillons en les agitant doucement avant utilisation. - Pour tous les calibrateurs, il est recommandé de faire une mesure en double. 1. Préparer des tubes ordinaires pour le comptage total et des tubes coatés pour les calibrateurs, les échantillons et les contrôles. 2. Pipeter 25 µl de chaque calibrateur, contrôle et échantillon dans les tubes appropriés. Pipeter directement dans le fond des tubes. 3. Ajouter 250 µl de traceur radioactif à chacun des tubes. Mélanger doucement. 4. Incuber tous les tubes au bain-marie à 37 C pendant 60 minutes. 5. Aspirer le contenu de chaque tube sauf celui des tubes pour le comptage total. 6. Ajouter 2 ml de solution de lavage diluée à chacun des tubes, excepté aux tubes pour le comptage total et aspirer complètement ou décanter le contenu de tous les tubes sur du papier absorbant. 7. Compter la radioactivité liée aux tubes pendant 1 minute au compteur gamma. Nous suggérons de contrôler le bruit de fond de l'instrument avant de compter l'analyse. Afin d'éviter des variations dans la sensibilité du système, le bruit de fond doit être réduit au minimum ou ajusté correctement. SCHÉMA DU DOSAGE Tubes Activité totale Calibrateurs Contrôle Échantillons Réactifs Calibrateurs µl Contrôles µl ---- Échantillons µl Traceur 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl - Mélanger et incuber au bain-marie à 37 C pendant 60 minutes - Aspirer ou décanter et laver : 1 x 2 ml, excepté pour les tubes d activité totale - Compter 8. CALCUL DES RESULTATS Les résultats repris dans le mode d'emploi de cette trousse ont été calculés en utilisant une courbe log-linéaire. D'autres méthodes de réduction des données peuvent donner des résultats légèrement différents. Calculer le pourcentage de capacité de liaison (Bo/T%), et le pourcentage de liaison des calibrateurs, contrôles et échantillons (B/Bo%). Reporter la courbe de calibration sur un papier logit-log ou semilogarithmique en utilisant la méthode de lissage des points par fonction "spline" avec les taux des calibrateurs sur l'abscisse et les B/Bo % correspondant sur l'ordonnée. Calculer le B/Bo % pour chacun des échantillons et lire la concentration par interpolation sur la courbe de calibration pour obtenir la concentration en androstènedione présente dans les sérums analysés, concentration exprimée en ng/ml. RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

15 EXAMPLE DE CALCUL Les valeurs mentionnées ci-dessous doivent être considérées comme un exemple et ne peuvent pas être utilisées en lieu et place de données expérimentales. Description Moyenne cpm. B/B0 (%) ng/ml Activité totale (T) CAL CAL CAL CAL CAL CAL CONTRÔLE CONTRÔLE P P P CONTROLE QUALITE INTERNE - Si les résultats obtenus pour le(s) contrôle(s) 1 et/ou 2 ne sont pas dans l intervalle spécifié sur la feuille de contrôle de qualité, les résultats ne peuvent pas être utilisés à moins que l'on ait donné une explication satisfaisante de la non-conformité. - Chaque laboratoire est libre de faire ses propres stocks d échantillons contrôles, lesquels doivent être congelés aliquotés. - Les critères d acceptation pour les écarts des valeurs en double des échantillons doivent être basés sur les pratiques de laboratoire courantes. 9. VALEURS DE REFERENCE Il est recommandé que chaque laboratoire détermine son propre intervalle de référence. Les valeurs mentionnées ci-dessous ne le sont qu'à titre indicatif. POPULATION N MOYENNE MOYENNE + 3 DS Hommes Femmes Tous les sujets PERFORMANCES DE L'ANALYSE Toutes les caractéristiques des performances sont exprimées en ng/ml. Pour convertir en nmol/l: ng/ml x 3,45 = nmol/l A. Sensibilité: La sensibilité théorique, ou limite de détection minimale, calculé par interpolation de la moyenne moins deux déviations standards de 20 dosages du calibrateur androstènedione 0 ng/ml est 0.05 ng/ml. B. Précision: Intra-essai Echantillon Moyenne ± DS CV N (%) ± ± ± Inter-essai Echantillon Moyenne ± DS CV N (%) ± ± ± C. Exactitude L'exactitude de la méthode a été contrôlée par des tests de recouvrement et des tests de parallélisme: Test de récupération: Deux échantillons de sérum contenant différents taux d'androstènedione endogène ont été enrichis avec des quantités connues d'androstènedione. Ils ont ensuite été analysés. Ajouté Attendu Observé Récupération (%) S S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL Test de parallélisme: Deux échantillons de sérum ont été dilués avec le calibrateur androstènedione 0 ng/ml. Ils ont ensuite été analysés. Facteur de Attendu Observé Récupération dilution (%) S1 non dilué / / / / S2 non dilué / / / / Spécificité: La réactivité croisée de l'antisérum androstènedione a été mesurée visà-vis de différents composants. Le pourcentage de réactivité croisée a été exprimé comme le rapport de la concentration en androstènedione et la concentration du composant réagissant à 50% de liaison du calibrateur 0 ng/ml. Composé % Réactivité croisée Androstenedione 100 Androsterone α-Hydroxyprogesterone Cortisone Isoandrosterone Deoxycortisone Etiocholanolone α - Dihydrotestosterone Dehydroepiandrosterone (DHEA) Progesterone Corticosterone Cortisol Estrone Pregnenolone Cholesterol - DHEA-Sulfate Estradiol 17β Estriol 17α -Hydroxypregnenolone RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

16 ITALIANO DOSAGGIO RADIOIMMUNOLOGICO PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DELL AROSTENEDIONE IN SIERO UMANO R-GM Determinazioni SOLO PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO 1. APPLICAZIONI CLINICHE L androstenedione (4-Androstene-3, 17-Dione) è uno steroide C 19, prodotto dalla ghiandola surrenale e dalle gonadi. L androstenedione è un precursore immediato del testosterone e dell estrone successivamente convertibili in estradiolo. La misurazione dei livelli di androstenedione nel siero rappresenta un utile marker della biosintesi androgenica. E stato osservato un aumento dei livelli di androstenedione in associazione ad iperplasia surrenale congenita virilizzante. Innalzamenti dei livelli sierici di androstenedione sono risultati associati anche a sindrome dell ovaio policistico, ipertecosi stromale, deficienza di 3ß-idrossisteroide idrogenasi ed ad altre cause di irsutismo nella donna (3,5,6). Un innalzamento dei livelli di androstenedione nel siero può verificarsi anche in soggetti con tumori surrenalici e ovarici virilizzanti (3). 2. PRINCIPIO DEL DOSAGGIO La procedura sfrutta il principio del dosaggio radioimmunologico, vale a dire la competizione tra antigene radioattivo e antigene non-radioattivo per un numero prestabilito di siti anticorpali leganti (9). La quantità di androstenedione marcato con I 125 legato agli anticorpi risulterà inversamente proporzionale alla concentrazione di androstenedione presente nel campione. La separazione tra antigene libero e legato avviene mediante decantazione o aspirazione del contenuto dei tubi rivestiti con anticorpi. 3. REAGENTI FORNITI NEL KIT - I reagenti sono sufficienti per 100 determinazioni. - Il kit deve essere conservato a 2-8 C. - La data di scadenza di ciascun reagente è indicata sulla rispettiva etichetta. 1. Tracciante Radioattivo: 1 flacone (27ml) di androstenedione marcato con I 125 in soluzione tampone a base proteica. Contenuto di radioattività: +/- 115 kbq. Conservante : NaN 3 (< 0,1%). 2. Calibratori: Calibratore Zero. 1 flacone contenente 0 ng/ml di androstenedione in siero umano. Liofilizzato. Ricostituire con 1,0 ml di acqua distillata. Calibratori da 1 a 5: 5 flaconi di androstenedione in siero umano. Liofilizzato. Ricostituire con 0,5 ml di acqua distillata. Dopo ricostituzione, i calibratori potranno essere conservati a 2-8 C per un mese. l valori esatti sono riportati sul Foglio Dati di Controllo Qualità. Conservante : NaN 3 (< 0,1%). 3. Controlli: 2 flaconi contenenti rispettivamente un livello basso e un livello alto di androstenedione in siero umano. Liofilizzato. Ricostituire con 0,5 ml di acqua distillata. Dopo ricostituzione, i sieri di controllo potranno essere conservati a 2-8 C per un mese. I valori esatti sono riportati sul Foglio Dati di Controllo Qualità. Conservante : NaN 3 (< 0,1%). 4. Tubi Rivestiti: 100 tubi rivestiti con immunoglobulina di conglio anti-androstenedione. I tubi non utilizzati potranno essere conservati a 2-8 C, protetti dall umidità.. 5. Soluzione di Lavaggio (concentrata 50x): 1 flacone contenente 20 ml di tampone Tris-HCL con detergente e conservante NaN 3 (<0,1 %). Portare al livello di 1000 ml aggiungendo acqua distillata. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 2 mesi a 2-8 C. 4. MATERIALE NECESSARIO MA NON FORNITO - Provette in plastica - Porta provette. - Micropipette automatiche a punte intercambiabili a volume variabile. - Miscelatore vortex - Cilindro graduato - Pompa aspirante oppure apparecchiatura automatica per il lavaggio delle micropiastre. - Gamma counter per scintillazione - Acqua distillata. - Bagnomaria 5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI D USO Questo materiale è solo per uso diagnostico In Vitro. Il kit è per solo uso professionale, deve quindi essere esclusivamente utilizzato da personale esperto di laboratorio, in conformità alle norme GLP. Caratteristica fisica 125 I: vedere alla fine della metodica 1. Precauzioni: Materiale Radioattivo- Non per somministrazione interna od esterna ad esseri umani o animali: Il materiale radioattivo può essere acquistato, ordinato e detenuto solo da personale medico, laboratori di analisi, ospedali ed unicamente per uso diagnostico IN VITRO, non per somministrazione interna od esterna in esseri umani o animali. Il ricevimento, l acquisto, il possesso, l uso e il trasferimento di tale materiale è soggetto a regolamentazioni che possono differire da Nazione a Nazione. Misure precauzionali nell utilizzo di materiale radioattivo: o Conservare il materiale radioattivo in apposite aree. o Non mangiare, bere, fumare o applicare cosmetici nelle aree destinate all uso di materiali radioattivi. o o o o o Non pipettare la soluzione radioattiva con la bocca. Indossare guanti durante l utilizzo di materiale radioattivo e lavare accuratamente le mani dopo l impiego di tale materiale. Coprire l area di lavoro con carta assorbente a perdere. Ogni perdita accidentale di radioattivo deve essere trattata in accordo con le procedure stabilite. Tutti i materiali radioattivi vanno eliminati in appositi sistemi di smaltimento secondo le disposizioni emesse dagli organi di controllo con giurisdizione sul laboratorio. 2. Rischio Chimico - Sodio Azide (NaN 3): La Sodio Azide è impiegata nei reagenti del kit ad una concentrazione finale non superiore a 0.1% p/p. La Sodio azide può reagire con tubature di scarico in piombo e rame formando azidi metalliche altamente esplosive. Quando si procede all eliminazione del prodotto sciacquare abbondantemente con acqua per evitare l accumulo di azidi. La Sodio azide è un veleno che può essere fatale se ingerito. Non pipettare il materiale contenente Sodio azide con la bocca. Maneggiare con cura evitando il contatto con la pelle e lavare le mani dopo aver lavorato con materiale contenente Sodio azide. Frasi di rischio R-21/22 Dannoso a contatto con la pelle e se ingerito Frasi di sicurezza S-26 In caso di contatto con gli occhi, sciacquare immediatamente con tanta acqua e consultare un medico. S-28.1 Dopo il contatto con gli occhi, sciacquare immediatamente con tanta acqua. S-46 Se ingerito consultare subito un medico, mostrandogli il contenitore o l etichetta. 3. Rischio Biologico - Siero Umano: Il kit contiene alcuni reagenti preparati con siero o plasma umano. Il siero e il plasma impiegati sono stati testati con un metodo approvato dalla FDA e sono risultati negativi per la presenza di anticorpi HIV-1/2, HCV e HBsAg. In ogni caso, poiché nessun metodo offre completa assicurazione che HIV-1/2, HCV, HBsAg o altri agenti infettivi siano assenti, questi reagenti dovrebbero essere considerati potenzialmente infettivi e maneggiati con le stesse precauzioni adottate per altri campioni di siero o di plasma al Biosafety Level 2 e secondo le disposizioni del manuale sanitario CDC (Centers for Disease Control/National Institutes of Health), Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 3 rd Edizione, RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

17 6. RACCOLTA DEI CAMPIONI Si raccomanda di utilizzare siero. I campioni fortemente lipemici o emolizzati devono essere scartati. I campioni possono essere conservati a 2-8 C per 1 giorno; per periodi più lunghi aliquotare e congelare a -20 C. Ripetuti congelamenti e scongelamenti dei campioni possono provocare una diminuzione dei livelli di androstenedione. 7. PROCEDIMENTO OPERATIVO - Attendere che i reagenti ed i campioni raggiungano la temperatura ambiente. - Agitare delicatamente i campioni prima dell uso. - Per quanto riguarda i calibratori, si consiglia di effettuare il dosaggio in duplicato. 1. Preparare tubi vuoti per la Total Count, e i tubi rivestiti per i Calibratori, i Campioni e i Controlli. 2. Dispensare 25 µl di standard, campioni e controlli nelle rispettive provette. Dispensare direttamente nel fondo dei provetti. 3. Dispensare 250 µl di Tracciante Radioattivo in ogni tubo. Miscelare delicatamente. 4. Incubare tutti i tubi a bagnomaria a 37 C per 60 minuti. 5. Aspirare il contenuto di tutti i tubi fuoché di quelli destinati alla Total Count. 6. Dispensare 2 ml di soluzione di lavaggio diluita, in ciascun tubo fuorché in quelli destinati alla Total Count ed aspirare accuratamente o decantare il contenuto di tutti i tubi su carta assorbente. 7. Leggere la radioattività legata ai tubi, per 1 minuto, in gamma counter. Si consiglia di controllare il background dello strumento prima di effettuare la lettura. Al fine di evitare variazioni nella sensibilità del sistema, il background dovrà essere ridotto al minimo o accuratamente regolato. SCHEMA DEL DOSAGGIO Tubi Attività Calibratori Controlli Campioni Totale Reagenti Calibratori µl Serum controlli µl ---- Campioni µl Tracciante 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl - Miscelare e incubare a bagnomaria a 37 C per 60 minuti - Aspirare, o decantare, e lavare: 1x2ml eccetto i tubi attività totale - Lettura 8. CALCOLO DEI RISULTATI I risultati riportati nell inserto del prodotto sono stati calcolati utilizzando una curva log-lineare. Sistemi di calcolo differenti potrebbero fornire risultati leggermente diversi. Calcolare la percentuale di Binding Capacity (Bo/T%), e la percentuale di Binding (B/Bo%) per Calibratori, Controlli e Campioni. Tracciare la curva di calibrazione su carta logit-log o semilog utilizzando il metodo spline fitting, con le concentrazioni dei calibratori in ascissa e i rispettivi valori di B/Bo % in ordinata. Calcolare quindi la B/Bo % per ciascun campione e leggere, per interpolazione sulla curva di calibrazione, la concentrazione di androstenedione presente nel campione esaminato, espressa in ng/ml. ESEMPIO DI CALCOLO I valori sotto riportati devono essere considerati unicamente un esempio e non devono essere utilizzati in luogo dei dati sperimentali. Descrizione Media cpm. B/B0 (%) ng/ml Attività Totale (T) CAL CAL CAL CAL CAL CAL CONTRÔLLO CONTRÔLLO CAMPIONE CAMPIONE CAMPIONE CONTROLLO DI QUALITA INTERNO - Se i risultati ottenuti dosando il Controllo 1 e il Controllo 2 non sono all interno dei limiti riportati sul controllo di qualità, non è opportuno utilizzare i risultati ottenuti per i campioni, a meno che non si trovi una giustificazione soddisfacente. - Ogni laboratorio può preparare un proprio pool di sieri da utilizzare come controllo, da conservare congelato in aliquote. Non congelare e scongelare un aliquota più di due volte. - I criteri di accettazione delle differenze tra i risultati in duplicato dei campioni devono basarsi sulla buona prassi di laboratorio. 9. VALORI DI RIFERIMENTO Si raccomanda a ciascun laboratorio di determinare il proprio intervallo di riferimento. I valori qui di seguito riportati sono solo indicativi. POPOLAZIONE N MEDIA MEDIA + 3 SD Maschi Femmine Insieme CARATTERISTICHE METODOLOGICHE Tutte le caratteristiche di performance sono espresse in ng/ml. Conversione in nmol/l: ng/ml x 3,45 = nmol/l. A. Sensibilita : La sensibilità teorica, o limite minimo di rilevazione, calcolata per interpolazione della media meno due deviazioni standard di 20 replicati del Calibratore 0 ng/ml di Androstenedione, è pari a 0.05 ng/ml. B. Precisione: Intra-saggio Campione Media ± DS CV N (%) ± ± ± Inter-saggio Campione Media ± DS CV N (%) ± ± ± C. Accuratezza L'accuratezza del metodo è stata valutata mediante il test di recupero ed il test di parallelismo: Test di Recupero: Sono stati sottoposti al test tre campioni di siero contenenti livelli diversi di androstenedione endogeno ai quali sono state aggiunte quantità note di androstenedione. RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07

18 Aggiunto Atteso Misurato Recupero (%) S S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S1 + CAL S S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL S2 + CAL Test di Parallelismo: Sono stati sottoposti a test tre campioni di siero diluiti con calibratore 0 ng/ml di Androstenedione Fattore di Atteso Misurato Recupero diluzione (%) S1 indiluito / / / / S2 indiluito / / / / Specificiata : E stata valutata la reattività crociata dell antisiero dell androstenedione contro diversi composti. La percentuale di reattività crociata è stata espressa come rapporto tra concentrazione di androstenedione e concentrazione dell altro composto, con un legame del 50% dello calibratore 0 ng/ml. Composto % Reattività Crociata Androstenedione 100 Androsterone α-Hydroxyprogesterone Cortisone Isoandrosterone Deoxycortisone Etiocholanolone α - Dihydrotestosterone Dehydroepiandrosterone (DHEA) Progesterone Corticosterone Cortisol Estrone Pregnenolone Cholesterol - DHEA-Sulfate Estradiol 17β Estriol 17α -Hydroxypregnenolone 11. BIBLIOGRAPHIE BIBLIOGRAPHY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ BIBLIOGRAPHIE BIBLIOGRAFÍA 1. Dorfmon RI, Shipley RA. Androgens. John Wiley and Sons, New York, 1956, Horton R, Tait J. Androstenedione production and interconversion rates measured in peripheral blood and studies on the possible site of its conversion to testosterone. J Endocrinol lnvest,1966, 45, Pang S, Riddick l. Hirsutism. In : Lifshitz F (ed) Pediatric Endocrinology, A Clinical Guide, second edition. Marcel Dekker, Inc., New York, 1990, Cavallo A, Corn C, Bryan GT, Meyer WJ III. The use of plasma androstenedione in monitoring therapy of patients with congenital adrenal hyperplasia. J Pediatr. 1979, 95, Bull NY Acad Med 1977, 53, Barrett-Connor E, Garland C, McPhillips JB, Khaw K-T, Wingard DL. A prospective, population-based study of androstenedione, estrogens, and prostate cancer. Canc Res 1990, 50, Rittmaster RS, Thompson DL. Effects of leuprolide and dexamethasone on hair growth and hormone levels in hirsute women. The relative importance of the ovary and adrenal in the pathogenesis of hirsutism. J Clin Endocrinol Metob. 1990, 70, Zwicker H, Rittmaster RS. Androsterone sulfate: Physiology and significance in hirsute women. J Clin Endocrinol Metab 1993, 76, Rosen M. Nouri N, Alexander l. Evaluation of a direct assay for the measurement of androstenedione. Clin Chem 1987, 33, 891 (abstract 054). 9. Yalow R, Berson S: Introduction and general considerations. In: Odell WD and Daughaday WH, eds. Principles of Competitives Protein Binding Assays. J.B. Lippincott Co., Philadelphia, 1971, Physikalisches Daten of 125 I Physical characteristics of 125 I Caractéristiques physiques φυσικά χαρακτηριστικά του 125 Ι Caratteristica fisica 125 I t 1/2 = 59.9 Tagen, days, dias, ηµέρες, giorni, dagen, dni, días Wichtigste Emissionnen Main emissions Emissions principales κύριες εκποµπές Emissione principale E (MeV) % γ X RIAZENco AROSTENEDIONE / R-GM-MZ-003 / 05-07