ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ Διατήρηση της Βιοποικιλότητας και Αειφορική Εκμετάλλευση Αυτοφυών Φυτών (ΒΑΦ) Ακαδημαϊκό έτος , Εαρινό εξάμηνο Αίθουσα 8.20 ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΗ ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ Διδάσκων: Ελευθέριος Π. Ελευθερίου Καθηγητής Βοτανικής Τμήμα Βιολογίας Σχολή Θετικών Επιστημών Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης

2 Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Η διάσπαση των ορίων Διακριτική ικανότητα ΤΕΜ λ e = 0,05 Å, x μικρότερο λ ορατού = 500 nm δ ΤΕΜ = ~2 Å, 1.000x καλύτερη δ ΟΜ = 0,2 μm

3 Ηλεκτρονική μικροσκοπία ΗΜ διέλευσης (ΤΕΜ, transmission electron microscope) ΗΜ σάρωσης (SEM, scanning electron microscope) Bozzola & Ressel 1992

4 Ηλεκτρονική κάννη

5 Ηλεκτρομαγνητικοί φακοί

6 OM & ΤΕΜ Hall et al. 1982

7 ZEISS EM S-2 Εργαστήριο Βοτανικής, Α.Π.Θ. Φωτο: Ελευθερίου Ε.Π.

8 JEOL JEM 1011 Τμήμα Βιολογίας, Α.Π.Θ. Φωτο: Ελευθερίου Ε.Π.

9 Όρια διακριτικής ικανότητας ΤΕΜ

10 Θεμελιώδεις απαιτήσεις ΤΕΜ Υπό κενό Νεκρά, αφυδατωμένα υλικά Τομή: ~60-90 nm Δημιουργία εικόνας: σκέδαση ηλεκτρονίων Ηλεκτρονική αντίθεση

11 Τρόποι προετοιμασίας βιολογικού υλικού για TEM Χημική μονιμοποίηση Φυσική μονιμοποίηση ψυκτοτεμαχισμός Ανοσοκυτταροχημεία κολλοειδούς χρυσού

12 Χημική μονιμοποίηση βιολογικού υλικού για TEM Στερέωση Πλύσιμο σε buffer Μεταστερέωση Πλύσιμο σε buffer Αφυδάτωση Εμπότιση-Έγκλειση Τομή "Χρώση" Παρατήρηση

13 Διαδικασία χημικής μονιμοποίησης Hall & Hawes 1991

14 Στερέωση: αντίδραση γλουταρικής αλδεΰδης

15 Μεταστερέωση: αντίδραση τετροξειδίου του οσμίου (OsO 4 )

16 Αφυδάτωση Ακετόνη ή αιθανόλη σε διαβαθμιζόμενες συγκεντρώσεις 30%, 15 min 50%, 15 min 70%, 30 min 90%, 30 min 100%, 1 ώρα 100%, 2 ώρες 100%, 2 ώρες Οξείδιο προπυλενίου, 15 min Οξείδιο προπυλενίου, 30 min

17 Εμπότιση Έγκλειση Ρητίνες Durcupan ACM, ή Spurr μίγματα 4 συστατικών Οξείδιο προπυλενίου + ρητίνη 3:1, 2 ώρες, περιστροφή Οξείδιο προπυλενίου + ρητίνη 1:1, 2 ώρες, περιστροφή Οξείδιο προπυλενίου + ρητίνη 1:3, 2 ώρες, περιστροφή Καθαρή ρητίνη: όλη νύκτα, περιστροφή Καθαρή ρητίνη: 4 ώρες, περιστροφή Καθαρή ρητίνη: 2 ώρες, περιστροφή Καθαρή ρητίνη: 2 ώρες, περιστροφή Έγκλειση + πολυμερισμός ρητίνης σε θερμοθάλαμο 60 ο ή 70 ο C για 60 ή 8 ώρες, αντίστοιχα

18 Ρητίνες εμπότισης/έγκλεισης υλικού Durcupan ACM Fluka Φωτο: Ελευθερίου Ε.Π.

19 Περιστροφικός αναδευτήρας και θερμοθάλαμος πολυμερισμού ρητινών Φωτο: Ελευθερίου Ε.Π.

20 Μπλοκ πολυμερισμένης ρητίνης και έγκλειση στερεωμένου φυτικού υλικού Τομή σε υπερμικροτόμο Φωτο: Ελευθερίου Ε.Π.

21 Αρχή λειτουργίας υπερμικροτόμου Ελευθερίου Ε.Π.

22 Υπερμικροτόμος Reichert-Jung Ultacut E Εργαστήριο Βοτανικής, Α.Π.Θ. Φωτο: Ελευθερίου Ε.Π.

23 Λεπτομέρειες κεφαλής του υπερμικροτόμου με υλικό και μαχαίρι Prospectus

24 Υάλινα μαχαίρια, χωρίς και με σκάφη Υάλινες ράβδοι LKB Knifemaker 7800 Φωτο: Ελευθερίου Ε.Π.

25 Διαμάντινο μαχαίρι με σκάφη Ακμή διαμαντιού 2,1 mm, 45 o Φωτο: Ελευθερίου Ε.Π.

26 Πλέγματα (grids) χάλκινα, Ø 3,05 mm Grids καλυμμένα με υμένιο formvar για στήριξη των τομών Prospectus Agar Φωτο: Ελευθερίου Ε.Π.

27 Κατασκευή φιλμ επικάλυψης των πλεγμάτων 0,4% Formvar σε χλωροφόρμιο Ελευθερίου Ε.Π.

28 Θήκη φύλαξης και μεταφοράς των grids Φωτο: Ελευθερίου Ε.Π.

29 Λαβίδες ακριβείας για τον χειρισμό των grids Φωτο: Ελευθερίου Ε.Π.

30 "Χρώση" τομών ηλεκτρονική αντίθεση 4% οξικό ουρανύλιο σε νερό ή 50% αιθανόλη 5-50 min, σκοτάδι Πλύσιμο με δις Η 2 Ο Κιτρικός μόλυβδος 1,33 g Pb(NO 3 ) 2 + 1,76 C 6 H 5 N 3 O 7 2H 2 O + 30 ml H 2 O, ανάμιξη 30 min, + 8 ml 1N NaOH 5-50 min Πλύσιμο με δις Η 2 Ο

31 Παρατήρηση στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο και φωτογράφηση σε ειδικό επιστημονικό φιλμ (πλάκες 7Χ7 cm 6.5X9 cm) ή ψηφιακή φωτογράφηση και επεξεργασία σε Η/Υ

32 Σύγκριση εικόνων πυρήνα ΟΜ και ΤΕΜ Kουκιά (ΟΜ) Σιτάρι (ΤΕΜ) Gunning & Steer 1996 Ελευθερίου Ε.Π.

33 Δομή πυρήνα Arabidopsis thaliana (ΤΕΜ) 1. Πυρηνικός φάκελος 2. Χρωματίνη 3. Πυρηνίσκος 4. Πυρηνόπλασμα Ελευθερίου Ε.Π.

34 Ενδοπλασματικό δίκτυο TEM Χ Ελευθερίου Ε.Π.

35 Μιτοχόνδρια TEM Gunning 2004

36 Golgi TEM Χ Ελευθερίου Ε.Π.

37 Λιποπρωτεϊνικοί κρύσταλλοι πυρήνα ελιάς Χ Χ Ελευθερίου Ε.Π.

38 Ψυκτοτεμαχισμός ΤΕΜ Χυμοτοπιακή και κυτοπλασματική όψη τονοπλάστη Gunning & Steer 1996

39 Ψυκτοτεμαχισμός ΤΕΜ Πυρήνας Gunning & Steer 1996

40 Ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM, scanning electron microscope) Bozzola & Ressel 1992

41 Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης SEM Prospectus

42 SEM Αδενώδεις τρίχες νεκταρίου του φυτού Abutilon Gunning 2004