Ευχαριστώ επίσης τον Καθηγητή κ.. Κυριακίδη, µέλος της Επταµελούς επιτροπής και ιευθυντή του Εργαστηρίου Βιοχηµείας, για τις χρήσιµες παρατηρήσεις

Transcript

1 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Το ριβόσωµα, το υποκυτταρικό οργανίδιο το οποίο είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση των πρωτεϊνών, γεννάται στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς µέσω µιας πολύπλοκης διαδικασίας συγκρότησης µακροµορίων, και αναµφισβήτητα, η διαδικασία αυτή είναι µία από τις κυριότερες λειτουργίες του κυττάρου. Οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες, αποτελούν αναπόσπαστο µέρος της βασικής κυτταρικής µηχανής, που εµπλέκεται στη πρωτεϊνική βιοσύνθεση, των οποίων ο ρόλος είχε µεν θεωρηθεί σηµαντικός, αλλά όχι και τόσο σπουδαίος. Παρόλα αυτά όµως, αντικείµενο της επιστηµονικής έρευνας, αποτελεί τις τελευταίες δύο µε τρεις δεκαετίες, η ύπαρξη ριβοσωµικών πρωτεϊνών που είναι πολυλειτουργικές, που σηµαίνει, πως δεν είναι µόνο αναπόσπαστα µέρη του ριβοσώµατος, αλλά διεκπεραιώνουν και άλλες κυτταρικές λειτουργίες, που δεν συνδέονται οπωσδήποτε άµεσα µε τους µηχανισµούς της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Η εργασία αυτή αποτελεί µια συστηµατική προσπάθεια στη διερεύνηση του ρόλου της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5 από ποντίκι, (rps5), σε βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Η συγκεκριµένη διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιοχηµείας, του Τµήµατος Χηµείας, του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, καθώς και στο Εργαστήριο Φαρµακολογίας, του Τοµέα Φαρµακογνωσίας-Φαρµακολογίας, του Τµήµατος Φαρµακευτικής της Σχολής Επιστηµών Υγείας του ίδιου Πανεπιστηµίου, υπό την άµεση επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας κ. Θ. Χολή-Παπαδοπούλου, την οποία ευχαριστώ θερµά για την υπόδειξη του θέµατος, τη συµπαράστασή της σε όλη τη διάρκεια εκπόνησης της διατριβής και τη φιλική της διάθεση, καθώς και υπό την επίβλεψη του Επίκουρου Καθηγητή κ. Ι. Βιζιριανάκη, τον οποίο ευχαριστώ θερµά για το συνεχές ενδιαφέρον του, τις εύστοχες παρατηρήσεις του, το σχεδιασµό µεγάλου µέρους των πειραµάτων και για την κριτική ανάλυση και διόρθωση της συγκεκριµένης διδακτορικής διατριβής. Η συνεργασία µαζί τους, αποτέλεσε µία πηγή γνώσεων και σωστού τρόπου σκέψης. Επίσης, θέλω να ευχαριστήσω και τα άλλα δυο µέλη της Συµβουλευτικής Επιτροπής, την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ Σ. Κουΐδου-Ανδρέου και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Τ. Γιουψάνη, για τον πολύτιµο χρόνο που διέθεσαν για τη διόρθωση της διατριβής και για τις ουσιαστικές υποδείξεις τους. i

2 Ευχαριστώ επίσης τον Καθηγητή κ.. Κυριακίδη, µέλος της Επταµελούς επιτροπής και ιευθυντή του Εργαστηρίου Βιοχηµείας, για τις χρήσιµες παρατηρήσεις του και για τη συνεργασία που είχαµε όλα αυτά τα χρόνια. Επίσης, ευχαριστώ την Καθηγήτρια κ. Ν. Βαβάτση-Χρηστάκη, µέλος της Επταµελούς Επιτροπής, για τις εποικοδοµητικές παρατηρήσεις της. Θέλω να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως το άλλο µέλος της Επταµελούς Επιτροπής, τον Καθηγητή κ. Α. Τσιφτσόγλου, για το µεγάλο ενδιαφέρον του και τις συµβουλές του, καθώς και για τη δυνατότητα που µου έδωσε να πραγµατοποιήσω ένα πολύ µεγάλο µέρος των πειραµάτων στο Εργαστήριο Φαρµακολογίας και έτσι να αγαπήσω ιδιαίτερα τον τοµέα αυτό της έρευνας που έχει να κάνει µε τις κυτταροκαλλιέργειες, όπως επίσης και για την τιµή που µου έκανε να µε ενσωµατώσει στην ερευνητική του οµάδα. Θέλω να ευχαριστήσω πολύ, όλα τα µέλη του Εργαστηρίου Φαρµακολογίας, την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Λ. Παπαδοπούλου, για το συνεχές ενδιαφέρον της, και όλους τους προπτυχιακούς και µεταπτυχιακούς φοιτητές. Ιδιαιτέρως θέλω να ευχαριστήσω την υποψήφια διδάκτωρ κ. Π. Φολτοπούλου για τη συµπαράστασή της, το πραγµατικό ενδιαφέρον της και την πολύ φιλική της διάθεση. Επίσης, ευχαριστώ τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Θ. Γιαννακούρο, και την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Ε. Νικολακάκη για τις πολύτιµες συµβουλές και το ενδιαφέρον τους, καθώς και τα µέλη.ε.π., τους συναδέλφους και γενικά όλα τα µέλη του Εργαστηρίου Βιοχηµείας, για την ευχάριστη συνεργασία που είχαµε αυτά τα χρόνια. Ευχαριστώ επίσης όλους τους συναδέλφους µε τους οποίους δουλέψαµε στον ίδιο χώρο, την κ.κ. Τσαγκάλια και τον κ. Ι. Σανίδα, για το πραγµατικά ευχάριστο και φιλικό κλίµα. Ιδιαίτερα θέλω να ευχαριστήσω την κ. Ε. Παπαχρήστου για την αµέριστη και πολύτιµη συµπαράστασή της, κατά τη διάρκεια της συγγραφής της διατριβής. Επίσης, θερµά θέλω να ευχαριστήσω τον κ. Φ. Κωττάκη, τον κ. Φ. Πεΐδη και κυρίως την κ. Β. ρόσου, για τη µεγάλη συµπαράσταση, κατανόηση, βοήθεια και υποµονή, που έχουν δείξει όλα αυτά τα χρόνια, µιας και ξεκινήσαµε αυτόν τον αγώνα µαζί, ή σχεδόν µαζί. Ευχαριστώ την Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Θ. Παπαµαρκάκη και την Dr. Ζωή Καρέτσου, για την εκτέλεση των πειραµάτων ανοσοφθορισµού, κατά τη διερεύνηση της υποκυτταρικής κατανοµής της rps5 και των µεταλλαγµάτων της. ii

3 Ευχαριστώ θερµά τους λίγους πραγµατικούς φίλους που µου στάθηκαν και µου συµπαραστάθηκαν. Ευχαριστώ τους συγγενείς µου και ιδιαίτερα θέλω να ευχαριστήσω τα αδέλφια µου, Κώστα και Κατερίνα, για την αγάπη και την υποµονή τους. Τέλος, τις πιο θερµές ευχαριστίες µου θέλω να εκφράσω στο Νίκο, για την ατέλειωτη υποµονή, κατανόηση και την ενθάρρυνσή του σε δύσκολες στιγµές κατά την εκπόνηση της διατριβής, καθώς επίσης και στους αγαπηµένους µου γονείς, οι οποίοι από µικρή µε στήριζαν και µε ενθάρρυναν προκειµένου να αγωνίζοµαι για να φέρνω εις πέρας τους στόχους µου. Χωρίς αυτούς τους τρεις ανθρώπους, η συγκεκριµένη διατριβή δεν θα είχε πραγµατοποιηθεί. Χριστίνα Ν. Ματράγκου iii

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΟΡΙΣΜΟΙ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 Α.1. Γενικά για το ριβόσωµα 1 A.2. Βιογένεση των ευκαρυωτικών ριβοσωµάτων 4 Α.2.1. Γενικά για τον πυρηνίσκο 4 Α.2.2. Περιγραφή της βιογένεσης των ριβοσωµάτων 10 Α Στάδια βιογένεσης ευκαρυωτικών ριβοσωµάτων 11 Α.3. Ριβοσωµικές πρωτεΐνες 25 A.3.1. Χαρακτηριστικά των ριβοσωµικών πρωτεϊνών 25 Α.3.2. Μη ριβοσωµικές ιδιότητες των ριβοσωµικών πρωτεϊνών 29 Α.4. Η S7 οικογένεια των ριβοσωµικών πρωτεϊνών 33 Α.4.1. Η S7 ριβοσωµική πρωτεΐνη των βακτηρίων 34 Α.4.2. Η S7 ριβοσωµική πρωτεΐνη των αρχαιοβακτηρίων 37 Α.4.3. Η S5 ριβοσωµική πρωτεΐνη των ευκαρυωτικών 38 Α.5. Το σύστηµα των ερυθρολευχαιµικών κυττάρων ποντικού, MEL: ένα πρότυπο σύστηµα µελέτης, σε µοριακό και κυτταρικό επίπεδο, της ερυθροδιαφοροποίησης των αιµοποιητικών κυττάρων in vitro 41 Α.5.1. ιαφοροποίηση των φυσιολογικών αιµοποιητικών κυττάρων 41 Α.5.2. Λευχαιµικά κύτταρα 42 Α.5.3. Γενικά χαρακτηριστικά των ερυθρολευχαιµικών κυττάρων (MEL) 43 Α ιαφοροποίηση των MEL κυττάρων και επαγωγείς της διαφοροποίησης 43 Α Μορφολογικές και βιοχηµικές αλλαγές κατά τη διαφοροποίηση των MEL κυττάρων in vitro 44 A Χαρακτηριστικά του προγράµµατος διαφοροποίησης των MEL κυττάρων 45 A Η δροµολόγηση των MEL κυττάρων σαν κεντρικό γεγονός της τελικής διαφοροποίησης, οδηγεί σε αµετάκλητη παύση της κυτταρικής ανάπτυξης και σε ασυνεχείς τύπους έκφρασης γονιδίων 47 Α.6. Ο κυτταρικός κύκλος 49 Α.6.1. Γενικά για τον κυτταρικό κύκλο 49 iv

5 Α.6.2. Ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου µέσω των Cdks 50 Α Σηµεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, (checkpoints) 52 Α.7. Το ριβόσωµα συναντά τον κυτταρικό κύκλο 56 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ 57 B. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 59 Β.1. ΥΛΙΚΑ 59 Β.1.1. Βιολογικά υλικά 59 Β.1.2. Χηµικά αντιδραστήρια 59 Β.1.3. Υλικά χρωµατογραφίας 60 B.1.4. Ένζυµα-Αντιδραστήρια Μοριακής Βιολογίας 60 Β.2. ΜΕΘΟ ΟΙ 61 Β.2.1. Καλλιέργειες βακτηρίων 61 Β Καλλιέργεια κυττάρων E. coli 61 Β.2.2. Καλλιέργειες των ερυθρολευχαιµικών κυττάρων ποντικού (MEL) 62 B.2.3. Μέθοδοι προσδιορισµού πρωτεϊνών 62 Β Χρωµατοµετρική µέθοδος κατά Bradford, τροποποιηµένη από τον Bearden 62 Β.2.4. Ηλεκτροφόρηση 63 Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαµιδίου 63 Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-ηλεκτροφόρηση) 64 Β.2.5. Στερέωση και βαφή πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαµιδίου 66 Β Βαφή µε Coomassie Brilliant Blue (CBB) R Β Βαφή µε νιτρικό άργυρο (AgNO 3 ) 67 B.2.6. Παρασκευή πολυκλωνικού αντισώµατος έναντι της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5 68 B.2.7. Ηλεκτροµεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή SDS σε µεµβράνη 69 B.2.8. Ανοσοανίχνευση 70 B.2.9. Αυτοραδιογραφία 71 B Έκφραση και καθαρισµός πρωτεϊνών σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) 72 B Πειράµατα συγκατακρήµνισης (pulldown assays) 74 v

6 Β Ηλεκτροφόρηση τµηµάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης 76 Β Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης (PCR) 77 Β Αντίστροφης Τρανσκριπτάσης Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης (RT-PCR) 81 Β Εισαγωγή σηµειακής µετάλλαξης µε την τεχνική του σχεδιασµού megaprimer 82 B Καθαρισµός τµηµάτων DNA µετά από PCR 84 B Καθαρισµός τµηµάτων DNA από πηκτή αγαρόζης 85 B Κλωνοποίηση τµηµάτων DNA σε πλασµιδιακούς φορείς 85 Β Πέψη µε ενδονουκλεάσες περιορισµού 87 Β Αντίδραση λιγάσης 90 B Προετοιµασία επιδεκτικών για µετασχηµατισµό βακτηρίων (competent cells) 91 B Μέθοδος των δυο διαλυµάτων CaCl 2 91 B Μέθοδος CaCl 2 91 Β Εισαγωγή πλασµιδίου σε κύτταρα E. coli (µετασχηµατισµός) 93 Β Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA 93 Β Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µε αλκαλική λύση και καθαρισµός µε φαινόλη/χλωροφόρµιο / ισοαλυλική αλκοόλη 93 Β Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA χρησιµοποιώντας kit της εταιρείας Qiagen (mini prep) 94 Β Προσδιορισµός του ρυθµού της κυτταρικής ανάπτυξης 95 Β Προσδιορισµός των διαφοροποιηµένων κυττάρων MEL µε τη χρώση βενζιδίνης-h 2 O 2 95 Β Εισαγωγή πλασµιδιακού DNA σε ευκαρυωτικά κύτταρα (Επιµόλυνση) 96 Β Επιµόλυνση (transfection) MEL κυττάρων µε χρήση λιποσωµάτων 96 Β Παροδική επιµόλυνση (transfection) 293Τ κυττάρων µε τη µέθοδο του CaCL 2 97 Β Αποµόνωση κυτταρικών εκχυλισµάτων από καλλιέργεια MEL κυττάρων 99 Β Αποµόνωση µεγαλοµοριακού DNA από ευκαρυωτικά κύτταρα 99 Β Αποµόνωση κυτταροπλασµατικού RNA 100 Β Αποµόνωση κυτταροπλασµατικού RNA 100 vi

7 B Αποµόνωση κυτταροπλασµατικού RNA µε τη µέθοδο της θειοκυανικής γουανιδίνης 101 B Φασµατοφωτοµετρικός ποσοτικός προσδιορισµός του DNA και του RNA 102 B Ηλεκτροφόρηση RNA σε πηκτή αγαρόζης 103 Β Μεταφορά RNA από πηκτή αγαρόζης σε νάιλον µεµβράνη, (υβριδισµός κατά Northern) 104 Β Χρώση της µεµβράνης µε τη µέθοδο κυανού του µεθυλενίου 105 Β Προετοιµασία της µεµβράνης για τον υβριδισµό µε το ραδιοεπισηµασµένο DNA ιχνηλάτη 105 B In vitro [ 32 -P] ραδιοεπισήµανση DNA ιχνηλάτη 106 Β Υβριδισµός της µεµβράνης µε ραδιοεπισηµασµένο ιχνηλάτη (Μέθοδος Church) 106 Β Ξέπλυµα της µεµβράνης και αυτοραδιογραφία 106 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 108 Γ.1. Έκφραση και παραγωγή της ανασυνδυασµένης S5 ριβοσωµικής πρωτεΐνης σε βακτηριακά κύτταρα και µελέτη της λειτουργικότητάς της 108 Γ.1.1. Κλωνοποίηση του γονιδίου της rps5 του ποντικού στον πλασµιδιακό φορέα έκφρασης pet11a 108 Γ.1.2. Μεταµόρφωση των βακτηριακών κυττάρων E.coli BL21(DE3) µε το ανασυνδυασµένο πλασµιδίο pet11a-rps5 για την παραγωγή της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης rps5 110 Γ.1.3. Κλωνοποίηση του γονιδίου της rps5 από ποντίκι στον πλασµιδιακό φορέα pgex-2t για την παραγωγή της ανασυδυασµένης πρωτεΐνης rps5 σαν πρωτεΐνη σύντηξης µε τη GST 112 Γ.1.4. Μετασχηµατισµός µε το ανασυνδυασµένο πλασµιδίο pgex-2t-rps5 των επιδεκτικών κυττάρων E.coli BL21(DE3) και έκφραση της rps5 ως πρωτεΐνης σύντηξης µε τη GST 113 Γ.1.5. Καθαρισµός της πρωτεΐνης σύντηξης GST-rpS5 µε τη χρήση χρωµατογραφίας αγχιστείας (σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης) 114 Γ.1.6. Παραλαβή της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης rps5 µετά από πέψη της πρωτεΐνης σύντηξης GST-rpS5 µε το ένζυµο θροµβίνη 115 Γ.1.7. Έλεγχος αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης GST-rpS5 µε πρωτεΐνες κυτταρικού εκχυλίσµατος ανθρώπινων ερυθρολευχαιµικών κυττάρων 118 vii

8 Γ.1.8. Έλεγχος δοµικών στοιχείων στο µόριο της rps5 και µελέτη του ρόλου τους στη λειτουργία της πρωτεΐνης ενδοκυτταρικά 120 Γ Κλωνοποίηση της περιοχής του γονιδίου της S5 ριβοσωµικής πρωτεΐνης από ποντίκι που κωδικοποιεί τα αµινοξέα , στον πλασµιδιακό φορέα pegfp-c1 προκειµένου να µελετηθεί η υποκυτταρική της εντόπιση 121 Γ Πειράµατα ανοσοφθορισµού 122 Γ.1.9. In vitro φωσφορυλίωση της GST-rpS5 από την κινάση της καζεΐνης II, (CKII) 124 Γ Κλωνοποίηση των περιοχών του γονιδίου της rps5 που κωδικοποιούν τα αµινοξέα 1-37 και , στον πλασµιδιακό φορέα pgex-2t προκειµένου να γίνουν πειράµατα in vitro φωσφορυλίωσης 125 Γ Μετασχηµατισµός µε τα ανασυνδυασµένα πλασµιδία pgex-2t-rps και pgex-2τ-rps των επιδεκτικών κυττάρων E.coli BL21(DE3), έκφραση των πρωτεϊνών σύντηξης GST-rpS GST-rpS και καθαρισµός µε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης 127 Γ Έλεγχος της in vitro φωσφορυλίωσης της GST-rpS και GST-rpS από την κινάση της καζεΐνης II 128 Γ Απάλειψη ή µετάλλαξη των αµινοξέων που εµφανίζονται ως πιθανοί στόχοι φωσφορυλίωσης στο τµήµα της rps5, Γ Σχεδιασµός, παραγωγή και κλωνοποίηση των µεταλλαγµάτων της rps5 στους πλασµιδιακούς φορείς pegfp-c1 για τα πειράµατα υποκυτταρικής εντόπισης και pgex-2t για τα πειράµατα in vitro φωσφορυλίωσης και αποµόνωση των αντίστοιχων πρωτεϊνών σύντηξης µε τη GST 129 Γ In vitro φωσφορυλίωση της GST-rpS5 T(2)del. και T(8)mut. από την κινάση της καζεΐνης II (CKII) 134 Γ.2. Έκφραση της rps5 σε ευκαρυωτικά κύτταρα και µελέτη των ιδιοτήτων της 136 Γ.2.1. Κλωνοποίηση του πλήρους µήκους cdna rps5 του ποντικού στον ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pcdna-3.1(-) Myc/His Β 136 Γ.2.2. Μόνιµη επιµόλυνση των ερυθρολευχαιµικών κυττάρων MEL (stable transfection) 137 viii

9 Γ.2.3. Αποµόνωση, έλεγχος της έκφρασης και τελική επιλογή κλώνων από τα MEL επιµολυσµένα κύτταρα µε τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα MEL-pcDNA-3.1-rpS5 sense 138 Γ.2.4. Έλεγχος των αποµονωµένων κλώνων ως προς την ικανότητα έκφρασης του mrna της εξωγενούς rps5 139 Γ.2.5. Επιβεβαίωση της ύπαρξης του θετικού κλώνου C14 µε την τεχνική της Αντίστροφης Τρανσκριπτάσης PCR (RT-PCR) 142 Γ.2.6. Ανάπτυξη πολυκλωνικού αντισώµατος για την ανίχνευση της rps5 143 Γ.2.7. Ανίχνευση της rps5 πρωτεΐνης στον κλώνο MEL-rpS5 C14, που είναι κύτταρα µόνιµα επιµολυσµένα µε τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα pcdna-3.1-rps5 145 Γ.2.8. Ανίχνευση της rps5 σε κύτταρα 293Τ, παροδικά επιµολυσµένα µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pcdna-3.1-rps5 146 Γ.2.9. Ανίχνευση της rps5 πρωτεΐνης σε κύτταρα MEL, παροδικά επιµολυσµένα µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pcdna-3.1-rps5 147 Γ Μελέτη της συµπεριφοράς των µόνιµα επιµολυσµένων κυττάρων MEL µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pcdna-3.1-rps5, (καλλιέργεια του κλώνου C14), ως προς την κυτταρική ανάπτυξη 149 Γ Έλεγχος της κυτταρικής ανάπτυξης των κυττάρων MEL rps5 C14 παρουσία ή απουσία χηµικών επαγωγέων της διαφοροποίησης 153 Γ Έλεγχος της ικανότητας in vitro διαφοροποίησης των κυττάρων MEL rps5 C14 από διαφορετικούς χηµικούς επαγωγείς 160 Γ Ανάλυση των επιπέδων συσσώρευσης του mrna της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5 και της β- αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, (β major ), σε κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14, καθώς και σε κύτταρα των καλλιεργειών αναφοράς, (control) 163 Γ Μελέτη κατά Western των επιπέδων διαφόρων πρωτεϊνών που εµπλέκονται στο πρόγραµµα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων, σε κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14 και σε κύτταρα των καλλιεργειών αναφοράς 171. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 181 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 196 SUMMARY 198 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 200 ix

10 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΟΡΙΣΜΟΙ 293T : Καρκινικά ηπατικά νεφρικά κύτταρα 30S : Μικρή υποµονάδα 70S ριβοσώµατος 40S : Μικρή υποµονάδα 80S ριβοσώµατος 50S : Μεγάλη υποµονάδα 70S ριβοσώµατος 60S : Μεγάλη υποµονάδα 80S ριβοσώµατος 70S : Ριβόσωµα προκαρυωτικών οργανισµών 80S : Ριβόσωµα ευκακαρυωτικών οργανισµών ADP : Αδενοσιδιφωσφορικό οξύ APS : Υπερθειϊκό αµµώνιο AΤΡ : Αδενοσιτριφωσφορικό οξύ BCIP : 5-βρωµο-4-χλωρο-3-ινδολυλ-φωσφορικό β-msh : β-µερκαπτοαιθανόλη BSA : Αλβουµίνη ορού βοδιού C-τελικό : Καρβόξυ τελικό άκρο µιας πρωτεΐνης CAK : Κινάση ενεργοποιητής της Cdk CBB : Coomassie Brilliant Blue CDKI : Αναστολέας της κινάσης πρωτεϊνών που εξαρτάται από κυκλίνες Cdk : Κινάση πρωτεϊνών που εξαρτάται από κυκλίνες CFA : Πλήρες ανοσοανιχνευτικό Freund CKII : Κινάση καζεΐνης 2 CMV : Κυτταροµεγαλοϊός DEPC : Πυροανθρακικός διαιθυλεστέρας DFC : Πυκνό ινώδες συστατικό DMEM : Θρεπτικό υγρό DMSO : ιµεθυλοσουλφοξείδιο DNA : εοξυριβονουκλεϊνικό οξύ dntp : Τριφωσφορικός εστέρας δεοξυριβονουκλεοζίτη DTT : ιθειοθρεϊτόλη EDTA : Αιθυλενοδιαµινοτετραοξικό οξύ EtBr : Βρωµιούχο αιθίδιο x

11 ETS : Εξωτερικά µεταγραφόµενες περιοχές FC : Ινώδες κέντρο FCS : Ορός εµβρύου µόσχου FLV : Λευχαιµικός ιός Friend G-418 : Νεοµυκίνη αντιβιοτικό GC : Κοκκώδες συστατικό GFP : Πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη GST : Τρανσφεράση της γλουταθειόνης HEPES : Ν-2-υδροξυαιθυλ-πιπεραζιν-Ν -2-αιθανοσουλφονικό οξύ HMBA :Εξαµεθύλενο-δις-ακεταµίδιο HSV : Ιός έρπητα IFA : Μη πλήρες ανοσοανιχνευτικό Freund IPTG : Ισοπροπυλ-1-θειο-β-D-γαλακτοπυρανοζίδιο ITS : Εσωτερικά µεταγραφόµενες περιοχές MAPK : Κινάση πρωτεϊνών που ενεργοποιείται από µιτογόνα MEL : Ερυθρολευχαιµικά κύτταρα µυελού των οστών ποντικού MOPS : 2-(Ν-µορφολινο) προπανοσουλφονικό οξύ mrna : Αγγελιοφόρο RNA N- τελικό : Άµινο τελικό άκρο µιας πρωτεΐνης NBT : Κυανούν του νιτροτετραζολίου NES : Σήµα εξόδου από τον πυρήνα NLS : Σήµα πυρηνικού εντοπισµού NOR : Οργανωτής πυρηνίσκου NoRS : Σήµα κατακράτησης στους πυρηνίσκους NTR : Μη µεταφράσιµη περιοχή Nts : Νουκλεοτίδια OD 260 /OD 280 : Απορρόφηση στα 260, 280 nm αντίστοιχα PAGE : Ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαµιδίου PBS : Ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών PCR : Αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης PEST : Ακολουθία προλίνης, γλουταµινικού οξεός, σερίνης και θρεονίνης xi

12 PMSF : Φαινυλο-µεθυλο-σουλφονυλο-φθορίδιο prb : Πρωτεΐνη Ρετινοβλαστώµατος PrP : Πρωτεΐνη prion PS : Αντιβιοτικό πενικικιλλίνης- στρεπτοµυκίνης PVDF : Πολυ-βινυλο-δι-φθορίδιο rdna : Ριβοσωµικό DNA RNA : Ριβονουκλεϊνικό οξύ rp : Ριβοσωµική πρωτεΐνη rrna : Ριβοσωµικό RNA RT-PCR : Αντίστροφης Τρανσκριπτάσης PCR S6K : Κινάση της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S6 SDS : Άλας µε νάτριο του θειϊκού δωδεκυλίου snornas : Μικρά RNAs του πυρηνίσκου snornps : Μικρά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύµπλοκα του πυρηνίσκου SRP : Σωµατίδιο αναγνώρισης σήµατος Str : Οπερόνιο στρεπτοµυκίνης TAP : ιαδοχικός καθαρισµός αγχιστείας TBE : Τρις-βορικό EDTA TEMED : Ν,Ν,Ν,Ν-τετραµεθυλο-αιθυλενο-διαµίνη Tris : Τρις-υδροξυλµεθυλ-αµινοµεθάνιο trna : Μεταφορικό RNA UBF : Άνωθεν παράγοντας αλληλεπίδρασης UV : Υπεριώδες Ψs : Ψευδοουριδίνες xii

13 Στους γονείς µου Στο Νίκο

14 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το ριβόσωµα, αποτελεί το υποκυτταρικό οργανίδιο το οποίο είναι υπεύθυνο για τη βιοσύνθεση των πρωτεϊνών. Η βιοσύνθεση των ριβοσωµάτων στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, είναι µια πολύπλοκη διαδικασία συγκρότησης µακροµορίων, και χωρίς αµφιβολία, µια από τις κύριες λειτουργίες του κυττάρου. Η διαδικασία αυτή της συγκρότησης των ριβοσωµάτων, αποτελεί αντικείµενο εντατικής µελέτης, περισσότερο από τρεις δεκαετίες. Τα αποτελέσµατα πολλών ερευνητικών οµάδων, έχουν ταυτοποιήσει έναν πολύ µεγάλο αριθµό trans-δραστικών παραγόντων, οι οποίοι απαιτούνται για τη βιοσύνθεση των ριβοσωµάτων. Τα τελευταία όµως τρία µε τέσσερα χρόνια, η ανάπτυξη τεχνικών που αφορούν στην πρωτεϊνική ανάλυση, συνέβαλε στο να µπορέσουν να απαντηθούν πολλά ερωτήµατα, σχετικά µε τον τρόπο που όλοι αυτοί οι παράγοντες συνδέονται και αποσυνδέονται, προκειµένου να πραγµατοποιηθεί η συγκρότηση των ριβοσωµικών υποµονάδων, µε έναν υψηλά δυναµικό και ενορχηστρωµένο τρόπο. Παράλληλα, αντικείµενο της επιστηµονικής έρευνας, αποτελεί τις τελευταίες δύο µε τρεις δεκαετίες, η ύπαρξη ριβοσωµικών πρωτεϊνών που είναι πολυλειτουργικές, που σηµαίνει, πως δεν είναι µόνο αναπόσπαστα µέρη του ριβοσώµατος, αλλά διεκπεραιώνουν και άλλες εργασίες στο κύτταρο, που συχνά δεν συνδέονται µε τους µηχανισµούς της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Στην προκείµενη εργασία γίνεται αναφορά στις τελευταίες απόψεις σχετικά µε τη βιογένεση του ευκαρυωτικού ριβοσώµατος. Επίσης, αναφέρονται γενικές πληροφορίες για τις ριβοσωµικές πρωτεΐνες και παραδείγµατα κάποιων από αυτές που παρουσιάζουν µη ριβοσωµικές ιδιότητες. Επίσης, περιγράφεται το σύστηµα των ερυθρολευχαιµικών κυττάρων MEL, και γίνεται αναφορά στον κυτταρικό κύκλο. Αντικείµενο µελέτης της προκείµενης διδακτορικής διατριβής, αποτελεί η ριβοσωµική πρωτεΐνη της µικρής υποµονάδας S5, από ποντίκι. Α.1. Γενικά για το ριβόσωµα Τα ριβοσώµατα αποτελούν τα καταλυτικά και ρυθµιστικά κέντρα της πρωτεϊνικής σύνθεσης στα κύτταρα. Πρόκειται για κυτταροπλασµατικά κοκκία, τα οποία παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά σε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο, από τον Palade, στις αρχές του 1950, και ονοµάστηκαν µικρά σωµατίδια ή κοκκία. Το σηµερινό τους όνοµα το απέκτησαν το 1958, από τον Roberts. 1

15 Τα ριβοσώµατα βρίσκονται στα κύτταρα όλων των ζωντανών οργανισµών, προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών, καθώς και στους χλωροπλάστες των φυτών και στα µιτοχόνδρια των ευκαρυωτικών, (συνθέτουν 13 από τις πρωτεΐνες που προορίζονται για την εσωτερική µεµβράνη των µιτοχονδρίων), µε εξαίρεση τα ώριµα ερυθροκύτταρα των θηλαστικών. Είναι µικροσκοπικά σωµατίδια, µε διάµετρο ~20nm και εντοπίζονται µε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Αποτελούνται από RNAs και πρωτεΐνες. Το ποσοστό των ριβοσωµικών RNAs, (rrnas), καταλαµβάνει το ~ 65 % του ριβοσώµατος και το υπόλοιπο, αποτελείται από πρωτεΐνες. Ο αριθµός των ριβοσωµάτων σε ένα κύτταρο, εξαρτάται από τον αριθµό των πρωτεϊνών που παράγει το κύτταρο αυτό. Έτσι, στην E.coli, υπάρχουν x10 4 ριβοσώµατα, τα οποία αντιπροσωπεύουν το 25% της συνολικής µάζας του βακτηρίου. Στους προκαρυωτικούς οργανισµούς τα ριβοσώµατα είναι ελεύθερα στο κυτταρόπλασµα. Ο µέσος αριθµός των ριβοσωµάτων σε ένα κύτταρο θηλαστικών είναι ~10 7. Ο µικρότερος αριθµός ριβοσωµάτων παρατηρείται στα σπερµατοκύτταρα, ενώ ο µεγαλύτερος στα εµβρυακά κύτταρα, καθώς και στα κύτταρα που παράγουν πρωτεΐνες που εκκρίνονται στο εξωκυττάριο περιβάλλον (Taylor et al., 1998). Τα ριβοσώµατα των ευκαρυωτικών κυττάρων χωρίζονται σε δυο κατηγορίες: τα ελεύθερα, (µόνα ή σχηµατίζοντας οµάδες που ονοµάζονται πολυριβοσωµάτια ή πολυσωµάτια), τα οποία βρίσκονται στο κυτταρόπλασµα και σχετίζονται µε την παραγωγή κυρίως πρωτεϊνών που προορίζονται για το κυτταρόπλασµα, και αυτά που είναι συνδεδεµένα µε ένα γιγαντιαίο αραχνοειδές οργανίδιο, που αποτελείται από µεµβράνες και ονοµάζεται ενδοπλασµατικό δίκτυο, σχηµατίζοντας έτσι το αδρό ενδοπλασµατικό δίκτυο. Τα ριβοσώµατα της κατηγορίας αυτής, παράγουν κυρίως πρωτεΐνες που προορίζονται για έκκριση, (εξωκύττωση), για τα λυσοσωµάτια και για τη µεµβράνη του πλάσµατος. Ο αριθµός των ριβοσωµάτων των δυο κατηγοριών αλλάζει ανάλογα µε τις µεταβολικές ανάγκες του κυττάρου. Στο σχήµα Α.1, φαίνονται οι δυο κατηγορίες ριβοσωµάτων των ευκαρυωτικών κυττάρων. 2

16 Α. Β.. Σχήµα Α.1. Κατηγορίες ριβοσωµάτων ευκαρυωτικών κυττάρων όπως φαίνονται µέσα στο κύτταρο. Α. Ριβοσώµατα συνδεδεµένα στο ενδοπλασµατικό δίκτυο. Β. Ριβοσώµατα ελεύθερα στο κυτταρόπλασµα, (µόνα και πολυσωµάτια). Τα ριβοσώµατα διαφορετικών ειδών κυττάρων έχουν την ίδια βασική δοµή, αλλά διαφέρουν στο µέγεθος. Έτσι, τα ριβοσώµατα όλων των κυττάρων αποτελούνται από δυο υποµονάδες. Καθεµία από τις υποµονάδες περιλαµβάνει χαρακτηριστικά rrnas και ριβοσωµικές πρωτεΐνες. Στον πίνακα 1, φαίνονται χαρακτηριστικά στοιχεία των ριβοσωµάτων των βακτηρίων, των ευκαρυωτικών κυττάρων, καθώς και των µιτοχονδρίων (Texas A&M University Kingsville, Πίνακας 1. Σύγκριση δοµής ριβοσώµατος σε προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισµούς, καθώς και στα µιτοχόνδρια. Μεγάλη υποµονάδα rrnas (1 από το καθένα) Προκαρυωτικά (70S) Ευκαρυωτικά (80S) Μιτοχόνδρια (55S) 50S 60S 39S 23S (2904 nts) 25/28S (4700 nts) 16S (1560 nts) 5S (120 nts) 5S (120 nts) 5.8S (160 nts) Πρωτεΐνες 33 ~49 48 Μικρή υποµονάδα 30S 40S 28S rrna 16S (1542 nts) 18S (1900 nts) 12S (950 nts) Πρωτεΐνες 21 ~33 29 nts: νουκλεοτίδια 3

17 Όπως προκύπτει από τον πίνακα 1, το ευκαρυωτικό ριβόσωµα περιέχει επιπλέον ένα µόριο rrna και περισσότερες πρωτεΐνες, από ότι το προκαρυωτικό ριβόσωµα. Παρόλα αυτά όµως, οι οµοιότητες µεταξύ των συστατικών του, συνηγορούν υπέρ της άποψης ότι ο ριβοσωµικός πυρήνας είναι συντηρηµένος σε όλους τους οργανισµούς (Dounda et al., 2002). Αρχικά πειράµατα ανασυγκρότησης προκαρυωτικών ριβοσωµάτων in vitro, έδειξαν ότι όλες οι απαραίτητες πληροφορίες περιέχονταν στα rrnas και στις πρωτεΐνες. Όσον αφορά όµως τη βιογένεση των ευκαρυωτικών ριβοσωµάτων, η κατάσταση είναι τελείως διαφορετική. Πρόκειται για µια διαδικασία εξαιρετικά πολύπλοκη και ρυθµισµένη, η οποία πραγµατοποιείται κάτω από στενά όρια χώρου και χρόνου, παρουσία πληθώρας µη ριβοσωµικών παραγόντων (Tschochner και Hurt, 2003). A.2. Βιογένεση των ευκαρυωτικών ριβοσωµάτων Η βιογένεση των ριβοσωµάτων είναι απαραίτητη για την κυτταρική προσαρµογή, ανάπτυξη και πολλαπλασιασµό. Επίσης, κατά τη διαδικασία αυτή, απαιτούνται µεγάλα ποσά ενέργειας. Για το λόγο αυτό, είναι απαραίτητη η ακριβής ρύθµιση, προκειµένου να υπάρξει ισορροπία µεταξύ της γένεσης και της κατανάλωσης. Η διαδικασία της βιοσύνθεσης των ριβοσωµάτων αρχίζει στο υποκυτταρικό οργανίδιο, τον πυρηνίσκο. Α.2.1. Γενικά για τον πυρηνίσκο Ο πυρηνίσκος περιγράφηκε για πρώτη φορά, ως µια υποκυτταρική δοµή, πριν από 150 χρόνια, και του δόθηκε το όνοµα που έχει µέχρι σήµερα. Η πρωταρχική του όµως λειτουργία, σαν µηχανή παρασκευής ριβοσωµάτων, είναι γνωστή τις τελευταίες τέσσερις δεκαετίες, όπου και έχει γίνει συστηµατική δουλειά στην κατανόηση αυτών των µηχανισµών (Olson et al., 2000). Παράλληλα, την τελευταία κυρίως δεκαετία, έχουν βρεθεί και άλλοι ρόλοι αυτού του υποπυρηνικού σωµατιδίου. Έτσι, φαίνεται να αποτελεί το σηµείο ωρίµανσης ή βιογένεσης άλλων ριβονουκλεοπρωτεϊνικών µηχανών, συµπεριλαµβανοµένων του σωµατιδίου αναγνώρισης σήµατος, (Signal Recognition Particle, SRP), του µικρού πυρηνικού ριβονουκλεοπρωτεϊνικού σωµατιδίου µατίσµατος και της τελοµεράσης. Ο πυρηνίσκος, είναι δυνατό να συµµετέχει στην επεξεργασία ή έξοδο κάποιων αγγελιοφόρων και µεταφορέων RNAs, (mrnas και 4

18 trnas), ενώ µπορεί να ελέγχει τη δραστικότητα συγκεκριµένων ρυθµιστικών παραγόντων. Η πιθανότητα ο πυρηνίσκος να σχετίζεται µε επιπρόσθετες λειτουργίες, ενισχύεται από τη σύνδεσή του µε άλλα πυρηνικά σωµατίδια, όπως το περιπυρηνικό διαµέρισµα και το σωµατίδιο Cajal. Όλα αυτά επισηµαίνουν, πως η γνώση του βιολογικού ρόλου του πυρηνίσκου είναι αποσπασµατική, ανεξαρτήτου του γεγονότος πως οι πρώτοι πυρηνίσκοι καθαρίστηκαν πριν από 40 χρόνια (Andersen et al., 2002, Staub et al., 2004, Pederson, 1998). Η πολυλειτουργικότητα του πυρηνίσκου φαίνεται χαρακτηριστικά από τα ευρήµατα της πρωτεϊνικής ανάλυσης του πυρηνίσκου, τόσο του ανθρώπινου, (HeLa κύτταρα), όσο και του φυτικού, (Arabidopsis). υο ερευνητικές οµάδες (Andersen et al., 2002 και Scherl et al,, 2002) βρήκαν ~350 διαφορετικές πρωτεΐνες στον πυρηνίσκο των HeLa κυττάρων, ενώ λαµβάνοντας υπόψη µη δηµοσιευµένα ακόµη αποτελέσµατα των Lamond και Mann, ο αριθµός ανέρχεται περίπου, στις 692. Επίσης, έπειτα από πρωτεϊνική ανάλυση του πυρηνίσκου του Arabidopsis (Pendle et al., 2005) βρέθηκαν 217 πρωτεΐνες. Στο σχήµα Α.2, φαίνονται τα αποτελέσµατα των τριών ερευνών. 5

19 Α Β Γ Σχήµα Α.2. Κατανοµή των ταυτοποιηµένων πρωτεϊνών του πυρηνίσκου. Α. Ανθρώπινος πυρηνίσκος, (HeLa) (Scherl et al., 2002). B. Ανθρώπινος πυρηνίσκος, (HeLa) (Andersen et al., 2002). Γ. Φυτικός πυρηνίσκος, (Arabidopsis) (Pendle et al., 2005). 6

20 Ο πυρηνίσκος αποτελεί το πιο χαρακτηριστικό οργανίδιο του ευκαρυωτικού πυρήνα. Όταν βάφεται µε χρωστικές οι οποίες συζευγνύονται µε το DNA, φαίνεται σα µια σκούρα περιοχή, γεγονός που δηλώνει τη χαµηλή περιεκτικότητά του σε DNA. Επίσης, αν και φαίνεται παράδοξο, αποτελεί την περιοχή όπου γίνεται ένα µεγάλο ποσοστό της µεταγραφής των γονιδίων του κυττάρου, διότι σε αρκετά κύτταρα τα rrnas, αποτελούν περισσότερο από το µισό των παραγόµενων µεταγραφηµάτων. Η εξήγηση αυτών των αντικρουόµενων παρατηρήσεων είναι ότι, τα πιο ενεργά µεταγραφόµενα DNAs, είναι και τα πιο αποσυµπυκνωµένα. (Shaw και Doonan, 2005). Ο πυρηνίσκος αποτελεί µια δυναµική δοµή του πυρήνα χωρίς µεµβράνη, και συγκροτείται γύρω από δέσµες διαδοχικά επαναλαµβανόµενων ριβοσωµικών γονιδίων, (rdna γονιδίων), τα οποία µεταγράφονται από την RNA πολυµεράση Ι. Οι περιοχές αυτές ονοµάζονται οργανωτές πυρηνίσκου, (Nucleolar Organiser Regions, NOR), και αποτελούν τη βάση της δοµικής οργάνωσης του πυρηνίσκου, προκειµένου να στρατολογηθούν όλα τα απαραίτητα συστατικά επεξεργασίας και συγκρότησης, που απαιτούνται για τη βιοσύνθεση των ριβοσωµάτων. Ο πυρηνίσκος, µορφολογικά χωρίζεται σε τρεις διακριτές περιοχές, οι οποίες και µαρτυρούν την ανυσµατική διαδικασία της βιογένεσης των ριβοσωµάτων, (Dundr et al., 2001, Melese και Xue, 1995, Olson et al., 2000, Scheer et al., 1999). α) Ινώδες κέντρο, (Fibrillar Center, FC), το οποίο αποτελεί µια περιοχή ή σωµατίδια, που έπειτα από χρώση µε βαρέα µέταλλα, βάφονται ασθενώς. β) Πυκνό ινώδες συστατικό, (Dense Fibrillar Component, DFC), το οποίο περιβάλλει µερικώς ή ολικώς το ινώδες κέντρο και βάφεται εντονότερα µε συγκεκριµένες χρωστικές. γ) Κοκκώδες συστατικό, (Granular Component, GC), που αποτελεί το εξωτερικό τµήµα του πυρηνίσκου και περιέχει κοκκία, στο µέγεθος των ριβοσωµάτων. Η επικράτηση καθώς και η διευθέτηση των τριών αυτών περιοχών, εξαρτώνται από το είδος, τον τύπο καθώς και από τη φυσιολογική κατάσταση του κυττάρου, (Σχήµατα Α.3, Α.4,και Α.5). Αυτό υποδηλώνει πως η οργάνωση του πυρηνίσκου δεν γίνεται µόνο προκειµένου να λάβει χώρα η βιογένεση των ριβοσωµάτων. Οι διαφορές που περιγράφηκαν είναι δυνατόν να αφορούν σε διαφορετικές λειτουργίες του πυρηνίσκου (Pendle et al., 2005). 7

21 (Shaw et al., 2005) Σχήµα Α.3. ιαγραµµατική αναπαράσταση πυρηνίσκων, όπως φαίνονται µε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Α. Ανθρώπινο κύτταρο καλλιέργειας, (HeLa). Β. Φυτικό κύτταρο, (Pisum sativum root). Γ. Βλαστηµένη ζύµη, (S. cerevisiae). (Olson et al., 2000) Σχήµα Α.4. HeLa κύτταρα µε διαφορετική υποπυρηνική οργάνωση. a). ικτυωτός πυρηνίσκος, που βρίσκεται κυρίως σε κύτταρα που είναι πολύ ενεργά µεταγραφικά. Παρατηρούνται µικρά δικτυωτά κέντρα, (F), που περιβάλλονται από αλυσίδες πυκνού ινώδους συστατικού, (D). Ο ενδιάµεσος χώρος (I), παρουσιάζεται σαν περιοχή µικρής ηλεκτρονικής πυκνότητας, ενώ διακρίνεται και το κοκκώδες συστατικό, (G). b). Περισσότερο κοινή µορφή πυρηνίσκου. Παρατηρούνται κυρίαρχα ινώδη κέντρα, (F), που περιβάλλονται από πυκνό ινώδες συστατικό, (D). Σχετικά µεγάλες περιοχές καλύπτονται από κοκκώδες συστατικό, (G), που διαχωρίζεται περισσότερο ευδιάκριτα από το πυκνό ινώδες συστατικό, από ότι στα δικτυοκύτταρα. 8

22 (Andersen et al., 2002) Σχήµα Α.5. Πυρηνίσκοι από κύτταρα HeLa. i-iv. Αποµονωµένοι πυρηνίσκοι, όπως φαίνονται σε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο, µε αυξανόµενη µεγέθυνση. Είναι ευδιάκριτες οι τρεις περιοχές του πυρηνίσκου. Το ερώτηµα αν ο πυρηνίσκος αποτελεί µια συγκρότηση προϊόντων µεταγραφής γύρω από τα rdna γονίδια και όλα µαζί βρίσκονται σε µια δυναµική ισορροπία και συγκρατούνται µε αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών µε πρωτεΐνες και µε RNA ή αν εµπλέκονται και δοµικά στοιχεία, έχει απασχολήσει τους επιστήµονες τις τελευταίες δεκαετίες (Scheer et al., 1999). Η ταυτοποίηση µορίων που µοιάζουν µε σπεκτρίνες στον πυρηνίσκο αµφίβιων ωοκυττάρων (Carotenuto et al., 1997) ενισχύει την άποψη για συµµετοχή κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών στην οργάνωση και δοµική διατήρηση του πυρηνίσκου. Η πολυπλοκότητα της δοµής του πυρηνίσκου φαίνεται κατά τη µίτωση, όπου ο πυρηνίσκος αποδιατάσσεται και στη συνέχεια σταδιακά ανασυγκροτείται καθώς τα θυγατρικά κύτταρα προχωρούν στη µεσόφαση. Το πιο χαρακτηριστικό γεγονός αυτής της διαδικασίας είναι η καταστολή της σύνθεσης της RNA πολυµεράσης Ι, η οποία αρχίζει στην πρόφαση και συνεχίζεται ως τα τελευταία στάδια της ανάφασης (Dundr et al., 2001). Αρκετοί µηχανισµοί που ελέγχουν τη συγκρότηση και αποδιάταξη του πυρηνίσκου σχετίζονται µε τη δραστικότητα της RNA πολυµεράσης Ι, ενώ άλλοι είναι ανεξάρτητοι (Shaw et al., 2005). Τέλος, το αρχικό δόγµα, ότι η σωστή δοµή και διαµόρφωση του πυρηνίσκου είναι απαραίτητη προκειµένου να διατηρηθεί η σωστή του λειτουργία, φαίνεται να καταρρίπτεται. Έτσι, ούτε η ύπαρξη διαδοχικής οργάνωσης των επαναλαµβανόµενων 9

23 rdna γονιδίων ή η χρωµοσωµική τους εντόπιση, είναι απαραίτητες για τη ζωτικότητα του κυττάρου, αφού µεταλλάγµατα βλαστηµένης ζύµης, στα οποία είχε γίνει απάλειψη των χρωµοσωµικών επαναλαµβανόµενων γονιδίων για τα rrnas, (rdna), αλλά είχαν τα rdna γονίδια σε πλασµίδιο, φαίνεται να περιέχουν µικρούς πυρηνίσκους, (mininucleoli), και εποµένως να πραγµατοποιούνται οι λειτουργίες του πυρηνίσκου, µε µικρότερη όµως αποτελεσµατικότητα. Το ίδιο φαινόµενο παρατηρείται και σε µεταλλάγµατα κυττάρων ζύµης όταν ο προαγωγός της RNA πολυµεράσης Ι, αντικατασταθεί από άλλον προαγωγέα. Στην περίπτωση αυτή, πάλι ο πυρηνίσκος δεν έχει τη σωστή του διαµόρφωση, αλλά η σύνθεση του rrna και η βιογένεση των ριβοσωµάτων εξακολουθούν να πραγµατοποιούνται (Scheer et al., 1999, Nierras et al., 1997, Oakes et al., 1998). Α.2.2. Περιγραφή της βιογένεσης των ριβοσωµάτων Από την προηγούµενη παράγραφο, έγινε κατανοητό πως στον πυρηνίσκο συντελείται µια από τις κυριότερες λειτουργίες του ευκαρυωτικού κυττάρου, η βιογένεση των ριβοσωµάτων. Η διαδικασία αυτή συνεχίζεται στο πυρηνόπλασµα και ολοκληρώνεται στο κυτταρόπλασµα. Το 80% της ενέργειας ενός πολλαπλασιαζόµενου κυττάρου καταναλώνεται προκειµένου να πραγµατοποιηθεί η βιογένεση των ριβοσωµάτων, ενώ καταναλώνεται επίσης και ένας µεγάλος αριθµός θρεπτικών συστατικών. Στους µικροοργανισµούς, η βιοσύνθεση των ριβοσωµάτων σχετίζεται µε τη διαθεσιµότητα σε θρεπτικά συστατικά, καθώς και µε την παρουσία σηµάτων στρες. Στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, συµµετέχουν επίσης ορµονικοί και παράγοντες ανάπτυξης, που ο αριθµός τους ξεπερνάει τους 170 (Powers, 2004, Fromont-Racine et al., 2003). Η δηµιουργία των ριβοσωµάτων είναι µια διαδικασία πολλών ενορχηστρωµένων σταδίων, υψηλής δυναµικής. Το ζητούµενο δεν είναι µόνο η δηµιουργία των συστατικών του ριβοσώµατος, αλλά και η µεταφορά τους, επεξεργασία τους καθώς και η συγκρότησή τους σε ώριµες ριβοσωµικές υποµονάδες (Thomas, 2000). Το µοντέλο που έχει χρησιµοποιηθεί περισσότερο από τους ερευνητές για τη µελέτη του ευκαρυωτικού ριβοσώµατος είναι τα βλαστηµένα κύτταρα ζύµης. 10

24 Α Στάδια βιογένεσης ευκαρυωτικών ριβοσωµάτων Α) Συντονισµένη σύνθεση των ριβοσωµικών RNAs, (rrnas) και των ριβοσωµικών πρωτεϊνών, (rp) Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο Α.1, στα ευκαρυωτικά ριβοσώµατα υπάρχουν τέσσερα είδη ριβοσωµικού RNA, το 5S, 5.8S, 25/28S στη µεγάλη υποµονάδα, 60S και το 18S, στη µικρή υποµονάδα, 40S. Τρία από τα τέσσερα rrnas, (18S, 5.8S και 25/28S), µεταγράφονται σαν ένα πρόδροµο, (pre-rrna), από την RNA πολυµεράση Ι, ενώ το 5S µεταγράφεται από την RNA πολυµεράση ΙΙΙ. Και τα τέσσερα rrnas κωδικοποιούνται από µια µονάδα ριβοσωµικού DNA, (rdna), µοριακού µεγέθους 9.1 kb, η οποία επαναλαµβάνεται φορές, (ανάλογα µε το είδος του κυττάρου), και στη ζύµη βρίσκεται στο χρωµόσωµα XII (Kressler, 1999), σχήµα Α.6. Σχήµα Α.6. οµή της επαναλαµβανόµενης rdna µονάδας στο ζυµοµύκητα. (Kressler D. et al, 1999) Το πρώτο ανιχνεύσιµο ενδιάµεσο προϊόν, (35S στη ζύµη), περιλαµβάνει 5' και 3' εξωτερικά µεταγραφόµενες περιοχές, (External Transcribed Spacers, ETS), τα ώριµα ριβοσωµικά RNAs, 18S, 5.8S και 25S rrna, καθώς και τουλάχιστον δυο µη κωδικοποιούµενες περιοχές, (Internal Transcribed Spacers, ITS). Αυτά τα πρόδροµα rrnas διαφέρουν στη σύσταση και το µέγεθος, κυρίως εξαιτίας των διαφορών στα µεταγραφόµενα µόρια διαχωριστές και στα ποικίλα τµήµατα στα ώριµα ριβοσωµικά rrnas. Το 35S πρόδροµο rrna της ζύµης είναι ένα από τα µικρότερα, ενώ το 45S του ανθρώπου, ένα από τα µεγαλύτερα. Μόνο κύρια τµήµατα της δοµής είναι υψηλά συντηρηµένα ανάµεσα στους διάφορους οργανισµούς. Περίπου το µισό τµήµα του µεταγραφήµατος, χάνεται κατά τη διαδικασία της βιογένεσης των ριβοσωµάτων, κάτι που θέτει το ερώτηµα για την ανάγκη ύπαρξης µεγάλων και ποικίλων διαχωριστικών µορίων (Nazar et al., 2004). Το 35S πρόδροµο rrna διασπάται στο 5' ETS στο σηµείο Α 0, δίνοντας το 33S πρόδροµο rrna, στο σηµείο Α 1, (5' άκρο του ώριµου 18S), δίνοντας το 32S πρόδροµο rrna και στο σηµείο Α 2 στο ITS1, δίνοντας τα 20 και 27SΑ 2 πρόδροµα 11

25 rrnas. Περαιτέρω επεξεργασία του 20S πρόδροµου rrna λαµβάνει χώρα στο κυτταρόπλασµα, όπου µετά από διάσπαση στο σηµείο D, προκύπτει το ώριµο πλέον 18S rrna. Στα ανώτερα θηλαστικά αυτό γίνεται στον πυρήνα. Η επεξεργασία του 27SA 2 συνεχίζεται στον πυρήνα, όπου τελικά προκύπτουν τα ώριµα 5.8 και 25S rrnas από δυο διαφορετικά µονοπάτια. Έτσι, το 85% του 27SA 2 διασπάται στο σηµείο Α 3, στο ITS1, ενώ το 15% διασπάται απευθείας στο σηµείο Β 1L (Fromont- Racine et al., 2003) σχήµα Α.7. (Fromont-Racine et al., 2003) Σχήµα Α.7. Επεξεργασία πρόδροµου rrna στο S. cerevisiae. A. οµή πρόδροµου 35S rrna. B. Σχηµατική αναπαράσταση του µονοπατιού της επεξεργασίας του rrna. Κάτω από συνθήκες µετάλλαξης, πρώιµη διάσπαση του 35S pre-rrna στο σηµείο Α 3, δίνει ένα µη οµαλό ενδιάµεσο, το 23S. Το 22S συσσωρεύεται, όταν πραγµατοποιούνται διασπάσεις στα σηµεία Α 0 και Α 3, απουσία διασπάσεων στα Α 1 και Α 2. Αρχικές ήδη µελέτες έδειξαν πως µεταλλάξεις, οι οποίες παρεµποδίζουν την επεξεργασία στα σηµεία από το Α 0 στο Α 2, δεν έχουν κανένα αποτέλεσµα στη 12

26 σύνθεση των 5.8 και 25S rrnas, ενώ το αντίθετο δεν ισχύει. Σχεδόν κάθε παράγοντας που απαιτείται για τη σύνθεση του 60S, καθυστερεί την πρώιµη διάσπαση από το Α 0 στο Α 2, µε επακόλουθο την παραγωγή του 23S rrna. Απουσία της διάσπασης στο A 2, τα 40S σωµάτια δεν παράγονται πλέον, ενώ τα 60S σχηµατίζονται από εναλλακτικές διασπάσεις, π.χ. στο σηµείο A 3 (Venema et al., 1999). Όσον αφορά τις ριβοσωµικές πρωτεΐνες, αυτές, αφού συντεθούν στο κυτταρόπλασµα από τα ριβοσώµατα, στη συνέχεια κατευθύνονται στον πυρήνα και συγκεκριµένα στον πυρηνίσκο, προκειµένου να στρατολογηθούν στη δηµιουργία του πρόδροµου ριβοσωµικού σωµατιδίου. Κάποιες συγκροτούνται µε τα πρόδροµα rrnas αµέσως µετά την είσοδό τους στον πυρηνίσκο, ενώ άλλες, σε επόµενα στάδια, συµπεριλαµβανοµένων µερικών, οι οποίες, τουλάχιστον στο S.cerevisiae, προστίθενται στο κυτταρόπλασµα. Β) Επεξεργασία των rrnas 1. cis-δραστικά στοιχεία για την επεξεργασία των rrnas Εκτεταµένη χρήση των τεχνολογιών κλωνοποίησης καθώς και νουκλεοτιδικής ανάλυσης, έχει επιτρέψει τη σύγκριση rdna γονιδίων από ένα µεγάλο αριθµό διαφορετικών οργανισµών. Έτσι, περιοχές στα ώριµα rrnas φαίνεται να είναι εξαιρετικά συντηρηµένες, ενώ οι διαχωριστικές ακολουθίες φαίνεται να διαφέρουν τόσο σε σύσταση, όσο και σε µέγεθος (Lalev et al., 1999). Αρχικά λοιπόν, επικρατούσε η άποψη πως οι µηχανισµοί επεξεργασίας του rrna διαφέρουν κατά πολύ φυλογενετικά ή ότι τα διαχωριστικά στοιχεία δεν φαίνεται να παίζουν κάποιο ρόλο στους µηχανισµούς αυτούς. Στη συνέχεια όµως, µε την πρόοδο της επιστήµης και την καθιέρωση πιο λεπτοµερειακών δοµικών και γενετικών αναλύσεων, έγινε πια σαφές, πως δοµικά στοιχεία ή ακολουθίες µέσα στις διαχωριστικές περιοχές, (ITS1, ITS2, 5'ETS, 3'ETS), µπορούν να αλλάξουν δραµατικά την ακρίβεια, την αποτελεσµατικότητα, ακόµη και τη σειρά των σταδίων επεξεργασίας (Cote et al., 2002, Hitchen et al., 1997, Van Nues et al., 1994 και 1995). Τέλος, ενώ δεν είχε δοθεί µεγάλη προσοχή στις ακολουθίες των ώριµων rrnas, έρευνες έδειξαν, πως είναι δυνατόν να περιέχονται σηµαντικοί cis-δραστικοί παράγοντες. Αλλαγές σε ασταθείς ή εκτεταµένες περιοχές στο 18S και 25S, επηρεάζουν την επεξεργασία του rrna (Lalev et al., 2000). 13

27 2. trans-δραστικά στοιχεία για την επεξεργασία των rrnas Η ισοµερείωση των ουριδινών σε ψευδοουριδίνες, (Ψs), καθώς και η µεθυλίωση των 2 -ΟΗ των ριβοζών, αποτελούν τις κυρίαρχες τροποποιήσεις νουκλεοτιδίων των rrnas. Περίπου 100 σηµεία rrna του κάθε τύπου, τροποποιούνται στον άνθρωπο, ενώ ο αριθµός αυτός µειώνεται στα 50 στο S.cerevisiae. Τα ριβοσώµατα της E.coli περιέχουν µόνο 4 µεθυλιωµένα ΟΗ ριβοζών, 10 µεθυλιωµένες βάσεις σε άλλες περιοχές και 10 ψευδοουριδίνες (Maden, 1990, Rozenski et al., 1999). Γενικά, οι τροποποιήσεις των rrnas λειτουργούν σαν ένας µοριακός µηχανισµός, προκειµένου να σταθεροποιηθούν οι απαιτούµενες RNA διαµορφώσεις, ενώ δεν παρατηρούνται στις περιοχές όπου αλληλεπιδρούν οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες. Η απουσία τροποποιηµένων νουκλεοτιδίων στις περιοχές αυτές, υποδεικνύει πως οι περισσότερες αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-rna δεν επηρεάζονται άµεσα από τις τροποποιήσεις (Decatur and Fournier, 2002). Σε αντίθεση µε τα βακτηριακά συστήµατα, όπου ο σχηµατισµός των 2 -Ο- µέθυλ οµάδων και των ψευδοουριδινών απαιτεί συγκεκριµένα ένζυµα, οι αντίστοιχες rrna τροποποιήσεις στα ευκαρυωτικά, κατευθύνονται από τα µικρά RNAs του πυρηνίσκου, ( small nucleolar RNAs, snornas). Στη ζύµη, έχουν βρεθεί πάνω από 100 διαφορετικά snornas που χωρίζονται σε τρεις κατηγορίες: σε αυτά που ανήκουν στο C/D κουτί, στο Η/ACA κουτί και στο RNA της MRP RNAάσης, το οποίο αποτελεί ειδική κατηγορία (Kressler D. et al, 1999). Η ψευδοουριδιλίωση νουκλεοτιδίων των rrnas απαιτεί µικρά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύµπλοκα του πυρηνίσκου, (snornps), της κατηγορίας H/ACA, στα οποία τα snornas του H/ACA κουτιού, λειτουργούν σαν οδηγοί προκειµένου να γίνει ισοµερείωση των ουριδινών στα πρόδροµα rrnas. Αυτό επιτυγχάνεται µε τη δηµιουργία δεσµών βάσεων µεταξύ του snorna και του prerrna και η ψευδοουριδιλίωση λαµβάνει χώρα σε µια συγκεκριµένη απόσταση, περίπου 14 νουκλεοτιδίων, από τη συντηρηµένη ακολουθία του snorna. Ένα snorna, το snr30, φαίνεται να απαιτείται αποκλειστικά για τις αντιδράσεις επεξεργασίας στα σηµεία Α 1 και Α 2, ενώ το snr10, συµµετέχει τόσο σε αντιδράσεις επεξεργασίας του pre-rrna, όσο και σε ψευδοουριδιλιώσεις στο 25S rrna (Samarsky et al., 1999). Έπειτα από πειράµατα συγκατακρήµνισης και καθαρισµού, βρέθηκαν οι κύριες πρωτεΐνες οι οποίες είναι κοινές σε όλα τα snornps σύµπλοκα του H/ACA κουτιού. Έτσι, πρόκειται για ένα σωµάτιο που πιθανώς αποτελείται από δυο αντίγραφα από καθεµία από τις πρωτεΐνες Cbf5p, Gar1p, Nhp2p και Nop10p και 14

28 από ένα snorna H/ACA κουτιού, το οποίο διευθετείται σε µια διδιάστατη δοµή (Kressler et al., 1999, Watkins et al., 1998). Έπειτα από µια σειρά µελετών, φαίνεται πως το ένζυµο το οποίο είναι υπεύθυνο για τη συγκεκριµένη τροποποίηση, είναι η Cbf5p. Απάλειψη του γονιδίου της συγκεκριµένης πρωτεΐνης, έχει σαν αποτέλεσµα τη µη διεξαγωγή της δηµιουργίας των ψευδοουριδινών, εξαιτίας πιθανώς της ενζυµικής δράσης της Cbf5p και της επακόλουθης απάλειψης των snornas του H/ACA κουτιού (Lafontaine et al., 1998). Η µεθυλίωση των νουκλεοτιδίων των rrnas απαιτεί µικρά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύµπλοκα του πυρηνίσκου, (snornps), της κατηγορίας C/D, στα οποία τα snornas του C/D κουτιού, λειτουργούν σαν οδηγοί προκειµένου να γίνει µεθυλίωση στα πρόδροµα rrnas, (στη ζύµη τα rrnas περιέχουν 65 µέθυλοµάδες, από τις οποίες οι 55 συνδέονται µε το 2'-ΟΗ της ριβόζης, ενώ οι υπόλοιπες µε τις βάσεις). Τα snornas έχουν µία ή δυο ακολουθίες καλά συντηρηµένες, οι οποίες ονοµάζονται C ή D κουτί και 10 ή 20 νουκλεοτίδια συµπληρωµατικά του rrna. Το σηµείο της 2'-O- µεθυλίωσης βρίσκεται 5 νουκλεοτίδια άνωθεν του D κουτιού (Kiss- Laszlo et al., 1998). Τα U3 και U14 snornas παίζουν σπουδαίο ρόλο. Έτσι, βρέθηκε πως το U3 απαιτείται σχεδόν αποκλειστικά για την επεξεργασία του pre-rrna στα σηµεία Α 0 και Α 2, ενώ το U14, τόσο για αντιδράσεις επεξεργασίας στα σηµεία Α 1 και Α 2, όσο και για µεθυλίωση σε 2'-Ο ριβόζη, στο 18S rrna (Samarsky et al., 1999). Έχουν βρεθεί τέσσερις πρωτεΐνες οι οποίες είναι κοινές σε όλα τα snornps σύµπλοκα του C/D κουτιού και αυτές είναι οι εξής: Fibrillarin/Nop1p, Nop56p, Nop58p/Nop5p και Snu13p (Kressler et al., 1999, Fromont- Racine et al., 2003, Kiss et al., 2001). Έπειτα από µια σειρά µελετών, φαίνεται πως το ένζυµο το οποίο είναι υπεύθυνο για τη συγκεκριµένη τροποποίηση είναι η fibrillarin/nop1p (Tollervvey et al., 1993). Απάλειψη του γονιδίου της συγκεκριµένης πρωτεΐνης, έχει σαν αποτέλεσµα την απάλειψη του snorna οδηγού της µεθυλίωσης, (του U14 και όχι του U3), (Tollervvey et al., 1991). Το πλεονέκτηµα των snornas είναι ότι οι τροποποιήσεις λαµβάνουν χώρα πριν από την ολοκλήρωση του RNA µεταγραφήµατος, διευκολύνοντας έτσι την αναδίπλωση του πρόδροµου RNA. Το 60% των τροποποιήσεων που γίνονται στη ζύµη, λαµβάνουν χώρα σε λειτουργικές περιοχές του RNA, οι οποίες δεν είναι τελείως αναδιπλωµένες στο µεταγραφηµένο 35S rrna. 15

29 Γ) Συγκρότηση των ριβοσωµάτων Ενώ η επεξεργασία του πρόδροµου rrna, έχει µελετηθεί και κατανοηθεί µε ακρίβεια µέχρι σήµερα, η κατανόηση της συγκρότησης του ριβοσώµατος και της εξόδου στο κυτταρόπλασµα είναι περιορισµένη και µόλις αρχίζει να εξετάζεται µε µεγαλύτερη λεπτοµέρεια (Warner et al., 2001). Η συγκρότηση των ευκαρυωτικών ριβοσωµάτων έχει µελετηθεί καλύτερα στη ζύµη, όπου έχει αποµονωθεί ένας µεγάλος αριθµός πρόδροµων ριβοσωµάτων και έχουν ταυτοποιηθεί τα συστατικά τους. Η διαδικασία αυτή απαιτεί την ύπαρξη ενός µεγάλου αριθµού µη ριβοσωµικών συστατικών, τα οποία δρουν σε διάφορα επίπεδα της ωρίµανσης των ριβοσωµάτων. Τα περισσότερα από αυτά τα συστατικά, ταυτοποιήθηκαν τα τελευταία χρόνια, χάρη στην ανάπτυξη µιας τεχνικής διαδοχικού καθαρισµού αγχιστείας, (Tandem Affinity Purification, TAP), σύµφωνα µε την οποία, οι πρωτεΐνες καθαρίζονται, αφού προσκολληθεί σε αυτές ένα επίτοπο. Η επιτυχία της προσέγγισης αυτής έγκειται στο γεγονός, ότι η πρωτεΐνη σύντηξης παράγεται κοντά στο φυσιολογικό της επίπεδο και συγκροτείται in vivo σε σύµπλοκα που αποµονώνονται σε ήπιες συνθήκες καθαρισµού (Rigaut et al., 1999). i. 90S πρόδροµο ριβόσωµα Στις αρχές του 1970, πρωτοπόρα πειράµατα οδήγησαν στην ταυτοποίηση ενός µικρού αριθµού πρόδροµων ριβοσωµικών σωµατιδίων, του 90S, το οποίο περιέχει το 35S pre-rrna της ζύµης, (45S του ανθρώπου) και έπειτα από επεξεργασία δίνει τα 66S και 43S πρόδροµα µόρια των 60S και 40S υποµονάδων, αντίστοιχα (Udem et al., 1972, Trapman et al., 1975). Προκειµένου να είναι αποτελεσµατική η δηµιουργία των ριβοσωµάτων, είναι απαραίτητο η µηχανή της µεταγραφής, ( η οποία συνθέτει ~7000 νουκλεοτίδια prerrna), να συνδεθεί µε τους παράγοντες, οι οποίοι είναι υπεύθυνοι για την επεξεργασία και τροποποίηση των rrnas, αναδίπλωση και συγκρότηση των πρωτεϊνών. Πριν από τέσσερις δεκαετίες περίπου, αντίθετα µε άλλα σηµεία µεταγραφής, τα rdnas, βρέθηκαν να παρουσιάζουν χαρακτηριστικά Χριστουγεννιάτικα δέντρα, σχηµατίζοντας ακραίους κόµπους, (terminal knobs), στο 5 άκρο των νεοσυντιθέµενων rrnas (Miller και Beatty, 1969). Από την άλλη µεριά, σε µια προσπάθεια αναζήτησης πρωτεϊνών που συνδέονται µε το U3, και χρησιµοποιώντας την τεχνική του καθαρισµού δυο σταδίων, οι Dragon et al., (2002), βρήκαν 17 νέες πρωτεΐνες που συνδέονται µε το U3, (Utp1-17). Οι πρωτεΐνες αυτές, 16

30 µαζί µε τους προηγούµενα ταυτοποιηµένους παράγοντες οι οποίοι αλληλεπιδρούν µε το U3, συγκροτούν ένα σύµπλοκο, το οποίο ονοµάστηκε SSU, (Small SubUnit), processome. Απάλειψη σηµαντικών συστατικών του SSU και µεταλλάξεις στο U3 snorna, προκαλούν απώλεια των ακραίων κόµπων. Έτσι φαίνεται πιθανό αυτοί οι κόµποι να αντιστοιχούν στα πρώτα προ-ριβοσωµικά σύµπλοκα, τα οποία περιέχουν το 35S rrna µαζί µε το U3 snorna. Τα αποτελέσµατα της ανάλυσης της πρωτεϊνικής σύστασης του 90S (Gavin et al., 2002 και Grandi et al., 2002) έδειξαν µεγάλη οµολογία στα σύµπλοκα που αποµονώθηκαν από τα δυο εργαστήρια, και δεδοµένου ότι και τα δυο περιέχουν το 35S pre-rrna και το U3 snorna, τα οποία είναι συστατικά του SSU, προκύπτει πως το SSU processome σχετίζεται µε το 90S πρόδροµο ριβόσωµα (Racine-Fromont et al., 2003). Tschochner και Hurt, 2003 Σχήµα Α.8. ιαγραµµατική αναπαράσταση της δηµιουργίας του 90S πρόδροµου ριβοσώµατος. ii. Από το 90S στο 40 και 60S Ο χαρακτηρισµός διαφορετικών προ-ριβοσωµικών σωµατιδίων έδειξε πως η σύσταση των αρχικών 90S συµπλόκων, διαφέρει σηµαντικά από αυτή των 60 και 40S σωµατιδίων. Ένα πολύ σηµαντικό εύρηµα (Grandi et al., 2002), είναι ότι από το 90S προ-ριβόσωµα απουσιάζουν οι περισσότεροι παράγοντες που απαιτούνται για τη σύνθεση του 60S, όχι όµως και για τη σύνθεση του 40S. Η ίδια παρατήρηση ισχύει και για το SSU processome. Η απλούστερη εξήγηση για το φαινόµενο αυτό είναι ότι το µονοπάτι της συγκρότησης του ριβοσώµατος αντανακλά την 5' 3' σύνθεση του pre-rrna. Η µεταγραφή του 35S pre-rrna γίνεται σε 5 λεπτά περίπου. Αυτό σηµαίνει πως κατά τη διάρκεια της αρχικής µεταγραφής, σηµεία σύνδεσης στο 5'ETS είναι προσιτά, προκειµένου να αρχίσει η συγκρότηση των παραγόντων για τη 17

31 σύνθεση του 40S. Αργότερα, µε καθυστέρηση µερικών λεπτών, και αφού έχει ολοκληρωθεί η σύνθεση και του 3 του 35S pre-rrna, οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες και οι παράγοντες επεξεργασίας και συγκρότησης της µεγάλης υποµονάδες, 60S, αρχίζουν να στρατολογούνται. Μόνο ένας µικρός αριθµός πρωτεϊνών έχει βρεθεί να παίζει ρόλο, τόσο στα αρχικά, όσο και στα τελικά στάδια της ωρίµανσης των ριβοσωµάτων. Μια πρωτεΐνη στην οποία έχει αποδοθεί ο ρόλος της γέφυρας µεταξύ του 90S και 40S, είναι η Enp1p. Το σύµπλοκο που προέκυψε έπειτα από καθαρισµό αγχιστείας µε την Enp1p, περιέχει όχι µόνο το 35S pre-rrna, αλλά και το διµεθυλιωµένο 20S pre-rrna. Επίσης, σε αντίθεση µε άλλες πρωτεΐνες, εµφανίζει δυο κορυφές καθίζησης, µια στα 90S και άλλη µια κοντά στα 40S (Grandi et al., 2002). Από όλα αυτά βγαίνει το συµπέρασµα, πως η συγκεκριµένη πρωτεΐνη συνοδεύει το 40S στο κυτταρόπλασµα, όπου λαµβάνουν χώρα οι τελικές τροποποιήσεις του 20S pre-rrna. Μια άλλη πρωτεΐνη, η οποία πιθανώς έχει αντίστοιχο ρόλο γέφυρας µεταξύ 90S και 60S, είναι η Nsa3p. Το συµπέρασµα αυτό βγαίνει από την παρουσία συνδεδεµένου U3 snorna και όχι 35S pre-rrna, σε σύµπλοκο που προέκυψε από τη Nsa3p χρησιµοποιώντας τη µέθοδο TAP, καθώς και από την παρουσία της συγκεκριµένης πρωτεΐνης σε σωµατίδια µεγαλύτερα του 60S, όπως προέκυψε από υπερφυγοκέντρηση µε βαθµίδωση σουκρόζης (Nissan et al., 2002). iii. Στάδια ωρίµανσης του 40S Το πολύπλοκο σύµπλοκο 90S προ-ριβόσωµα, το οποίο αποτελείται από το 35S pre-rrna, τις ριβοσωµικές πρωτεΐνες της µικρής υποµονάδας και αρκετούς παράγοντες επεξεργασίας και συγκρότησης του 40S, φαίνεται να µετατρέπεται απευθείας στο απλούστερο 40S προ-ριβόσωµα. Χρησιµοποιώντας τη µέθοδο TAP σε συστατικά του 90S, οι Grandi et al., (2002), κατέληξαν στο συµπέρασµα, πως πολλά από τα συστατικά αυτά παραµένουν συνδεδεµένα µε την αποσπώµενη 5'ETS περιοχή, έπειτα από τη διάσπαση στο σηµείο A 0. Αυτό δείχνει, πως αν όχι όλοι, αλλά οι περισσότεροι από τους παράγοντες του 90S, απελευθερώνονται σα σύµπλοκο συνδεδεµένο στην 5'ETS περιοχή. Αυτή η συνολική απόσπαση ~ 30 παραγόντων, αφήνει ένα σχετικά απλό προ-40s σωµατίδιο, το οποίο αποτελείται από λίγους κύριους µη ριβοσωµικούς παράγοντες. Έτσι, το 40S προ-ριβόσωµα αποτελείται περίπου από 9 κύριες µη ριβοσωµικές πρωτεΐνες. Οι περισσότερες από αυτές 18

32 παραµένουν συνδεδεµένες κατά την έξοδο στο κυτταρόπλασµα, όπου είναι πιθανό να συµµετέχουν στα τελευταία στάδια της βιογένεσης της µικρής υποµονάδας. Είναι γνωστό εδώ και αρκετό καιρό πως το µη ώριµο 40S σωµατίδιο, το οποίο περιέχει το 20S πρόδροµο pre-rrna, οδηγείται πολύ γρήγορα στο κυτταρόπλασµα, όπου συµβαίνουν τα τελευταία στάδια της ωρίµανσης του 20S rrna, καθώς και της συγκρότησης του ριβοσώµατος. Η διάσπαση στο σηµείο D και η επακόλουθη µετατροπή του 20S στο 18S, πιθανώς απαιτεί µια συγκεκριµένη ενδονουκλεάση (Venema et al., 1999). Τα τελευταία χρόνια, έχουν βρεθεί κάποιοι trans-δραστικοί παράγοντες, οι οποίοι εξειδικευµένα επηρεάζουν αυτήν την αντίδραση. Ανάµεσα σε αυτούς, αποµονώθηκε και η πρωτεΐνη Rio1 (Vanrobeys et al., 2001). Η πρωτεΐνη Rio2, είναι οµόλογη της Rio1 και οι δυο πρωτεΐνες είναι µέλη µιας καινούριας οικογένειας κινασών σερίνης-θρεονίνης (Angermayr et al., 2002). Η πρωτεΐνη Rio2, θεωρείται µάρτυρας της κυτταροπλασµατικής εντόπισης του 40S σωµατιδίου των τελευταίων σταδίων και φαίνεται ότι δεσµεύεται στο 40S, µετά από τις διασπάσεις στα σηµεία Α 0 -Α 2, ενώ δεν έχει βρεθεί στο 90S πρόδροµο σωµατίδιο (Schafer και Hurt, 2003). Απάλειψη καθεµιάς από τις δυο πρωτεΐνες, έχει σαν αποτέλεσµα τη συσσώρευση του 20S στο κυτταρόπλασµα, γεγονός που δείχνει πως η επεξεργασία του 20S δεν είναι απαραίτητη για την έξοδο του 40S στο κυτταρόπλασµα (Vanrobeys et al., 2001). Μια άλλη πρωτεΐνη, µε παρόµοια κυτταρική εντόπιση µε τη Rio2 πρωτεΐνη, είναι η Nob1, η οποία και αυτή µπορεί να θεωρηθεί µάρτυρας της κυτταροπλασµατικής εντόπισης του 40S, αν και ο ρόλος της στο σωµατίδιο αυτό δεν είναι ακόµη γνωστός (Tschochner και Hurt, 2003). Είναι άξιο προσοχής το γεγονός ότι η πρωτεΐνη αυτή, έχει αναφερθεί να εµπλέκεται στη βιογένεση του 26S πρωτεοσώµατος (Tone et al., 2002). Επίσης, κυρίαρχη παρουσία στο κυτταρόπλασµα, εµφανίζει και η πρωτεΐνη Yor145, η οποία αποµονώθηκε σε πολυσωµάτια µε σταθερά καθίζησης χαµηλότερη από 80S (Schafer και Hurt, 2003). Μια άλλη πρωτεΐνη, η οποία όπως αναφέρθηκε πιο πάνω αποτελεί γέφυρα µεταξύ του 90S και του 40S, είναι η Enp1. Η πρωτεΐνη αυτή, ανιχνεύεται σε σύµπλοκα µε το 90S και εντοπίζεται κυρίως στον πυρηνίσκο, ενώ στο κυτταρόπλασµα παρουσιάζει ασθενές σήµα. Άλλες πρωτεΐνες που ανιχνεύονται και στο πρώιµο 90S σωµατίδιο, είναι οι Dim1 και Rrp12. Η Dim1, είναι µια µεθυλτρανσφεράση, η οποία διµεθυλιώνει το 3' άκρο του 20S και εντοπίζονται µαζί µε την Rrp12 στον πυρηνίσκο, µε ουσιαστική όµως παρουσία και στο κυτταρόπλασµα (Tschochner και Hurt, 2003). 19

33 Η πρωτεΐνη Hrr25, εντοπίζεται σε όλον τον πυρήνα, (πυρηνίσκοςπυρηνόπλασµα), αλλά έχει και σηµαντική παρουσία στο κυτταρόπλασµα. Παρουσιάζει δράση κινάσης, ενώ έχει αναφερθεί πρόσθετος ρόλος της στην ενεργοποίηση της µετάφρασης σε απόκριση βλάβης του DNA. Η πρωτεΐνη αυτή, µαζί µε την Tsr1, εντοπίζονται σε σύµπλοκα µε 40S ενδιάµεσων σταδίων. Η Tsr1, φαίνεται να σχετίζεται µε την GTPάση Bms1 και είναι απαραίτητη για την επεξεργασία του 20S (Gelperin et al., 2001). Εντοπίζεται κυρίως στον πυρηνίσκο, αλλά παρουσιάζει και ουσιαστική κυτταροπλασµατική εντόπιση (Schafer και Hurt, 2003). Τέλος, η πρωτεΐνη Hcr1, φαίνεται να συνδέεται µε το 40S απευθείας στο κυτταρόπλασµα. Η κυτταροπλασµατική αυτή πρωτεΐνη έχει γενετικούς και φυσικούς δεσµούς µε παράγοντες του συµπλόκου έναρξης της νεοσυντιθέµενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας, eif3, και έτσι εµπλέκεται στην έναρξη της µετάφρασης, αλλά φαίνεται να επηρεάζει και την επεξεργασία του 20S pre-rrna (Valasek et al., 2001). iv. Στάδια ωρίµανσης του 60S Όπως περιγράφηκε σε προηγούµενη παράγραφο, η ωρίµανση της pre-40s ριβοσωµικής υποµονάδας, περιλαµβάνει µια µόνο διάσπαση στο 3' άκρο του 18S rrna, (διάσπαση D), και απαιτεί περίπου 10 διαφορετικούς µη ριβοσωµικούς παράγοντες. Η κατάσταση όµως είναι περισσότερο περίπλοκη, όσον αφορά τη νεοσυντιθέµενη 60S ριβοσωµική υποµονάδα, η οποία περιέχει αρκετά πρόδροµα 27S και 7S rrnas, των ώριµων 25S και 5.8S rrnas. Η ωρίµανση εποµένως της 60S, απαιτεί πολλά ένζυµα επεξεργασίας και λαµβάνει χώρα σε διαφορετικά υποκυτταρικά διαµερίσµατα. Έχουν βρεθεί περίπου 70 πρωτεΐνες, οι οποίες συµµετέχουν στα διαφορετικά στάδια ωρίµανσης της 60S υποµονάδας και αρκετές από τις πρωτεΐνες αυτές συνδέονται µε κάποια ή τα περισσότερα από τα pre-60s σύµπλοκα. Τα αποτελέσµατα αρκετών ερευνητικών οµάδων, που προέκυψαν µε τη µέθοδο TAP, οδήγησαν στην καταγραφή των µη ριβοσωµικών παραγόντων, οι οποίοι εµπλέκονται στην ωρίµανση της 60S υποµονάδας (Bassler et al., 2001, Harnpicharnchai et al., 2001, Saveanu et al., 2001, Fatica et al., 2002, Nissan et al., 2002). Έτσι, είναι δυνατό να ταξινοµηθούν τα 60S ριβοσώµατα σε µια σειρά αρχικών, µεσαίων και τελικών ενδιαµέσων συµπλόκων. Μια πρωτεΐνη, η οποία φαίνεται να συνδέεται µόνο µε τα αρχικά pre-60s σωµατίδια, είναι η Ssf1, η οποία αποτελεί µέλος της οικογένειας των σ-70 πρωτεϊνών. Η πρωτεΐνη αυτή βρίσκεται σε σύµπλοκα µε το 27S A 2 και 27SB. Μια άλλη 20

34 πρωτεΐνη, η Rpf1, δείχνει µια πιο περιορισµένη σύνδεση µε τα αρχικά 60S σωµατίδια, από ότι η Ssf1. Η πρωτεΐνη αυτή, ταυτοποιήθηκε στο σύµπλοκο της Ssf1 και συνδέεται αυστηρά µε 27SB ενδιάµεσα σωµατίδια. Οι πρωτεΐνες αυτές, βρίσκονται στον πυρηνίσκο. Στον πυρηνίσκο επίσης εντοπίζονται και οι πρωτεΐνες Nsa3 και Nop7. Η Nsa3, όπως αναφέρθηκε σε προηγούµενη παράγραφο, θεωρείται σαν η πρωτεΐνη γέφυρα µεταξύ του 90S και του 60S. Ακολουθώντας την ωρίµανση των rrnas, τα 60S pre-ριβοσώµατα, µετακινούνται από τον πυρηνίσκο στο πυρηνόπλασµα. Ταυτόχρονα, συµβαίνουν µεγάλες αλλαγές στην πρωτεϊνική σύσταση αυτών των σωµατιδίων. Οι πρωτεΐνες Nog1, Nog2, Nug1 και Nug2 είναι πιθανές GTPάσες, και φαίνεται ότι εµπλέκονται στην επεξεργασία του 27SB και 7S pre-rrna, αφού βρέθηκαν να συνδέονται τόσο µε 27SB και 7S pre-rrna, όσο και µε 25S pre-rrna. Οι πρωτεΐνες αυτές, εντοπίζονται στον πυρηνίσκο, αλλά ακολουθούν το 60S και στο πυρηνόπλασµα, µέχρι τους πυρηνικούς πόρους. υο πρωτεϊνικά σύµπλοκα παίζουν σηµαντικό ρόλο στην ωρίµανση και την ενδοπυρηνική µετακίνηση των pre-ριβοσωµάτων. Αυτά είναι τα Noc1-Noc2 και Νοc2-Noc3 (Milkereit et al., 2001). To πρώτο σύµπλοκο συνδέεται µε το 90S και το pre-60s και εντοπίζεται στον πυρηνίσκο, ενώ το δεύτερο συνδέεται µε το pre-60s, και εντοπίζεται στο πυρηνόπλασµα. Οι πρωτεΐνες Noc εµφανίζουν µια δυναµική ενδοπυρηνική εντόπιση και κινούνται µεταξύ πυρηνίσκου και πυρηνοπλάσµατος. Άλλες πρωτεΐνες, όπως οι Rix1 και Sda1, εντοπίζονται κατά µήκος ολόκληρου του πυρήνα η πρώτη, και στο πυρηνόπλασµα, η δεύτερη. Η πρωτεΐνη Rea1, συνδέεται µε τα pre-60s ριβοσώµατα σε µεταγενέστερο στάδιο στο πυρηνόπλασµα και απελευθερώνεται πριν από την έξοδο στον πυρήνα. Αποτελεί µέλος της οικογένειας των AAA ATPασών και µπορεί να έχει δράση συνοδού πρωτεΐνης, επαναδιατάσσοντας το pre-60s ριβόσωµα, πριν από την έξοδό του στο κυτταρόπλασµα (Brown et al., 2001). Η Arx1, είναι µια πρωτεΐνη η οποία εντοπίζεται τόσο στο πυρηνόπλασµα, όσο και στο κυτταρόπλασµα και ενδεχοµένως να παίζει ρόλο στην έξοδο των pre-60s ριβοσωµάτων από τον πυρήνα. Η ύπαρξη σταδίου ωρίµανσης της 60S υποµονάδας, στο κυτταρόπλασµα, επιβεβαιώνεται από την εµφάνιση νεοσυντιθέµενων 60S υποµονάδων πριν από την είσοδο σε πολυσωµάτια, καθώς και από την καθυστέρηση ενσωµάτωσης 60S υποµονάδων σε ενεργά ριβοσώµατα. Είναι πιθανό, κυτταροπλασµατικοί παράγοντες να συµµετέχουν σε αυτά τα τελικά στάδια ωρίµανσης. Ένα παράδειγµα συνιστά η κυτταροπλασµατική GTPάση, Efl1, η οποία συνδέεται λειτουργικά και γενετικά µε 21

35 την πρωτεΐνη Tif6. Η πρωτεΐνη αυτή της ζύµης, αποτελεί την ορθόλογη πρωτεΐνη των θηλαστικών, eif6, έναν παράγοντα ο οποίος φαίνεται να εµποδίζει τη σύνδεση των ριβοσωµικών υποµονάδων, in vitro. Η Tif6, είναι µια σηµαντική πρωτεΐνη που εµπλέκεται στη βιογένεση της 60S υποµονάδας (Sanvito et al., 1999), µε την οποία συνδέεται στον πυρηνίσκο, και την ακολουθεί στο κυτταρόπλασµα. Η αποσύνδεσή της από αυτήν, εξαρτάται από τη δράση GTPάσης της Efl1 (Senger et al., 2001). Μια άλλη πρωτεΐνη, η οποία έχει παρόµοιο ρόλο µε αυτόν της Efl1, είναι η Lsg1/Kre35. Η πρωτεΐνη αυτή, ανήκει στην κατηγορία των Nog2/Nug1 GTPασών, και φαίνεται να συνδέεται στην 60S, µετά την έξοδό της από τον πυρήνα. Τέλος, µια πρωτεΐνη η οποία εντοπίζεται τόσο στο πυρηνόπλασµα, όσο και στο κυτταρόπλασµα, φαίνεται να είναι η κύρια πρωτεΐνη, η οποία παρέχει το σήµα για την έξοδο της µεγάλης υποµονάδας, 60S, στο κυτταρόπλασµα. Στην πρωτεΐνη αυτή βρέθηκε µια ακολουθία λίγων αµινοξέων, NES, (Nuclear Export Signal), η οποία είναι πλούσια σε λευκίνη. Η Nmd3, συνδέεται µε τη µεγάλη υποµονάδα, µέσω της ριβοσωµικής πρωτεΐνης Rpl10. Στη συνέχεια ο υποδοχέας εξόδου, Xpo1/Crm1, αναγνωρίζει το σήµα NES της Nmd3, και οδηγεί τελικά το όλο σύµπλοκο στο κυτταρόπλασµα. Η έξοδος εξαρτάται από την GTPάση Ran, η οποία είναι συνδεδεµένη µε GTP (Johnson et al., 2002, Ho et al., 2001). Αντίστοιχη πρωτεΐνη για την έξοδο της µικρής υποµονάδας, 40S, στο κυτταρόπλασµα, δεν έχει ακόµη βρεθεί. Στο σχήµα Α.9, φαίνεται µια απλοποιηµένη εκδοχή του µονοπατιού της βιοσύνθεσης των ριβοσωµάτων. Αναφέρονται τα κυριότερα γεγονότα που λαµβάνουν χώρα, καθώς και οι πιο σηµαντικοί παράγοντες που συµµετέχουν προκειµένου να ολοκληρωθούν οι δυο υποµονάδες. Το σχήµα Α.10, παριστάνει τα τελικά στάδια της συγκρότησης των ριβοσωµάτων, τα οποία λαµβάνουν χώρα στο κυτταρόπλασµα. Συνοψίζοντας, φαίνεται καθαρά πως η βιογένεση των ριβοσωµάτων είναι µια διαδικασία αρκετά πιο πολύπλοκη από ότι αρχικά πίστευαν οι επιστήµονες και αρκετές ερωτήσεις παραµένουν ακόµη αναπάντητες. Παρόλα αυτά όµως, η ανάπτυξη τεχνικών, όπως είναι η µέθοδος TAP, η ευαίσθητη φασµατοµετρία µάζας, καθώς και καινούριες τεχνικές υβριδισµού, παρέχουν την υπόσχεση πως θα γίνουν κατανοητές οι πολύπλοκες δυναµικές της διαδικασίας ωρίµανσης, καθώς και η σύνδεσή τους µε άλλες βασικές κυτταρικές λειτουργίες (Fromont Racine et al., 2003, Nazar et al., 2004). 22

36 Fromont Racine et al., 2003 Σχήµα Α.9. ιαγραµµατική αναπαράσταση του µονοπατιού βιοσύνθεσης των ριβοσωµάτων. 23

37 Fromont Racine et al., 2003 Σχήµα Α.10. ιαγραµµατική αναπαράσταση των τελικών σταδίων της συγκρότησης των ριβοσωµάτων στο κυτταρόπλασµα. 24

38 Α.3. Ριβοσωµικές πρωτεΐνες A.3.1. Χαρακτηριστικά των ριβοσωµικών πρωτεϊνών Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο Α.1, τα ευκαρυωτικά ριβοσώµατα αποτελούνται από 4 rrnas, (5S, 5.8S, 18S και 25/28S) και περίπου 82 ριβοσωµικές πρωτεΐνες, (στον επίµυ). Η πλήρης αµινοξική ακολουθία είναι γνωστή για τις 75 από αυτές (Wool et al., 1995). Οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες κατανέµονται στις δυο υποµονάδες του ριβοσώµατος. Έτσι, στη µικρή υποµονάδα έχουν ταυτοποιηθεί περίπου 33 πρωτεΐνες, οι οποίες χαρακτηρίζονται µε το λατινικό γράµµα S, (Small), και έναν αριθµό, ενώ στη µεγάλη υποµονάδα έχουν ταυτοποιηθεί περίπου 49 πρωτεΐνες οι οποίες χαρακτηρίζονται µε το λατινικό γράµµα L, (Large), και έναν αριθµό. Οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες κωδικοποιούνται από mrnas τα οποία συνθέτονται από την RNA πολυµεράση ΙΙ, στον πυρήνα. Στη συνέχεια, τα mrnas τα οποία κωδικοποιούν τις ριβοσωµικές πρωτεΐνες, µεταφέρονται στο κυτταρόπλασµα, όπου γίνεται η µετάφραση και η σύνθεση των πρωτεϊνών. Ακολούθως, οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες διαπερνούν τους πυρηνικούς πόρους, οδηγούνται στον πυρήνα και τελικά στον πυρηνίσκο, όπου συνδέονται µε τα νεοσυντιθέµενα rrnas, προκειµένου να λάβει χώρα η συγκρότηση των ριβοσωµικών υποµονάδων. Οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες, αν και οι περισσότερες είναι µικρές σε µέγεθος και θα ήταν δυνατή η διέλευσή τους από τα σύµπλοκα των πυρηνικών πόρων, προκειµένου να εισέλθουν στον πυρήνα, παρόλα αυτά, µια ειδική κατηγορία πρωτεϊνών, οι καρυοφερίνες, είναι αυτές που οδηγούν τις ριβοσωµικές πρωτεΐνες από το κυτταρόπλασµα στον πυρήνα (Aitchison et al., 2000), και οι οποίες είναι πιθανό να αναγνωρίζουν ακολουθίες αµινοξέων, κυρίως βασικές, στις πρωτεΐνες. Έχει βρεθεί, πως σε ένα κύτταρο ζύµης το οποίο βρίσκεται σε φάση ανάπτυξης, εισέρχονται στον πυρήνα, δια µέσου των πυρηνικών πόρων, περίπου ριβοσωµικές πρωτεΐνες σε ένα λεπτό, ενώ εξέρχονται, στον ίδιο χρόνο, περίπου ριβοσωµικές υποµονάδες (Warner, 1999). Κατά µέσο όρο, οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες των θηλαστικών, έχουν µοριακό µέγεθος Da, το οποίο κυµαίνεται από Da για την L4, έως Da για την L41. Ο αριθµός των αµινοξέων είναι κατά µέσο όρο 164, από 421 έως 25. Οι περισσότερες πρωτεΐνες είναι βασικές, µε µέσο ισοηλεκτρικό σηµείο το 11.05, από 4.07 για την όξινη πρωτεΐνη P1, έως για την πολύ βασική L41 και περιέχουν 25

39 22moles % αργινίνη και λυσίνη και µόνο 9moles % ασπαραγινικό και γλουταµινικό οξύ (Wool et al., 1995). Στις ριβοσωµικές πρωτεΐνες των θηλαστικών, διακρίνονται κάποια δοµικά χαρακτηριστικά. Έτσι, κοντά στο Ν-τελικό και στο C-τελικό άκρο, απαντώνται δέσµες 3 ή 4 βασικών αµινοξέων. Πιο σπάνια εντοπίζονται στο C-τελικό άκρο δέσµες όξινων αµινοξέων. Χαρακτηριστικό των ριβοσωµικών πρωτεϊνών είναι επίσης και οι επαναλαµβανόµενες ακολουθίες 3-8 αµινοξέων, όπως επίσης και οι δοµές δακτύλου ψευδαργύρου και φερµουάρ λευκίνης (Wool et al., 1995). Οι αµινοξικές ακολουθίες των ριβοσωµικών πρωτεϊνών από διάφορα είδη θηλαστικών, παρουσιάζουν πολύ µεγάλη οµολογία. Συγκρίνοντας τις ακολουθίες από άνθρωπο και επίµυ, (τα δυο είδη θηλαστικών για τα οποία υπάρχουν οι περισσότερες πληροφορίες), φαίνεται ότι για 72 συγκρινόµενες ριβοσωµικές πρωτεΐνες, ο µέσος όρος της οµολογίας φτάνει στο 99%, ενώ από αυτές, οι 32 παρουσιάζουν 100% οµολογία (Wool et al., 1995, Kenmochi et al., 1998). εν υπάρχει καµία αµφιβολία, πως οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες όλων των ευκαρυωτικών οργανισµών προέρχονται από µια κοινή οµάδα προγονικών γονιδίων. Η παραδοχή αυτή τεκµηριώνεται µε τη σύγκριση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών του επίµυ και της ζύµης, που αποτελούν δυο ευκαρυωτικά είδη τα οποία απέχουν αρκετά εξελικτικά. Έτσι, από τις 78 ριβοσωµικές πρωτεΐνες του επίµυ, οι 66 µπορούν να συσχετιστούν µε κάποια ριβοσωµική πρωτεΐνη της ζύµης. Η οµολογία της αµινοξικής ακολουθίας φτάνει στο 60%, κυµαινόµενη από 40%-88% (Wool et al., 1995, Kenmochi et al., 1998). Τα ριβοσώµατα των αρχαιοβακτηρίων, αποτελούν µεταβατικά σωµατίδια στην εξέλιξη του σωµατιδίου. Έχει διαπιστωθεί πως οι αµινοξικές ακολουθίες των ριβοσωµικών πρωτεϊνών των αρχαιοβακτηρίων, είναι πιο κοντά στις ακολουθίες των ευκαρυωτικών, παρά των βακτηριακών οµολόγων. Από τις 78 ριβοσωµικές πρωτεΐνες του επίµυ, οι 49 µπορούν να συσχετιστούν µε κάποια ριβοσωµική πρωτεΐνη των αρχαιοβακτηρίων. Η οµολογία της αµινοξικής ακολουθίας φτάνει στο 34%, κυµαινόµενη από 17%-55% (Wool et al., 1995 και Kenmochi N. et al, 1998). Από την αρχή της µελέτης του ριβοσώµατος υπήρχε διαµάχη µεταξύ διαφόρων ερευνητικών οµάδων, για το αν υφίστατατο εξελικτική σχέση ανάµεσα στις πρωτεΐνες του ευκαρυωτικού και προκαρυωτικού ριβοσώµατος. Έτσι, ο Wittmann (1980, 1982), υποστήριζε πως υπάρχει πολύ µικρή οµολογία µεταξύ των ριβοσωµικών πρωτεϊνών των δυο ειδών. Με την πάροδο όµως των ετών και την 26

40 εξέλιξη των τεχνικών, βρέθηκαν σχεδόν ολόκληρες οµάδες αµινοξέων ίδιες σε ριβοσωµικές πρωτεΐνες του επίµυ και της E.coli. Από τις 78 ριβοσωµικές πρωτεΐνες του επίµυ, οι 24 µπορούν να συσχετιστούν µε κάποια ριβοσωµική πρωτεΐνη της E.coli. Είναι πολύ ενδιαφέρον το γεγονός, πως οι περισσότερες ριβοσωµικές πρωτεΐνες της E.coli, που παίζουν πολύ σηµαντικό ρόλο στη συγκρότηση των 30S και 50S ριβοσωµικών υποµονάδων, είναι συντηρηµένες (Wool et al., 1995). Το γεγονός ότι στα θηλαστικά υπάρχουν περίπου 30 ριβοσωµικές πρωτεΐνες περισσότερες από ότι στα βακτήρια, πιθανώς οφείλεται στα περισσότερα και µεγαλύτερα rrnas, ή/και στην πιο πολύπλοκη διαδικασία βιογένεσης των ευκαρυωτικών ριβοσωµάτων ή/και ίσως στη συµµετοχή σε πολυπλοκότερους µηχανισµούς ρύθµισης της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Η βιογένεση των ριβοσωµάτων, εναρµονίζεται µε την κυτταρική ανάγκη για πρωτεϊνική σύνθεση και αυξηµένη βιογένεση ριβοσωµάτων σχετίζεται γενικά µε αυξηµένη πολλαπλασιαστική δραστικότητα. Εξαιτίας του ότι η συγκρότηση και η λειτουργία του ριβοσώµατος εξαρτάται από µια στοιχειοµετρική ισορροπία των ριβοσωµικών πρωτεϊνών, πτώση στα επίπεδα µιας ή περισσοτέρων ριβοσωµικών πρωτεϊνών, µπορεί να µειώσει την ικανότητα ή ακόµα και να καταστήσει τη µεταφραστική µηχανή µη λειτουργική και εποµένως να δοθεί το σήµα στο κύτταρο για αυτοκαταστροφή (Naora και Naora, 1999). Οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες των ευκαρυωτικών κυττάρων είναι δυνατόν να τροποποιηθούν µεταµεταφραστικά. Από τις πιο συνηθισµένες τροποποιήσεις που υφίστανται είναι η ακετυλίωση, η µεθυλίωση και η φωσφορυλίωση. Αρκετές ριβοσωµικές πρωτεΐνες µπορούν να φωσφορυλιωθούν και η φωσφορυλιωµένη τους κατάσταση, καθώς και το επίπεδο έκφρασής τους είναι δυνατόν να αλλάξουν τη λειτουργία τους και εποµένως την κυτταρική τους απόκριση. Η ριβοσωµική πρωτεΐνη S6, είναι η κύρια φωσφοπρωτεΐνη των ευκαρυωτικών ριβοσωµάτων (Gressner και Wool, 1974). Αποτελεί µια από τις πρωτεΐνες της µικρής υποµονάδας που συνδέονται µε το πρόδροµο 45S rrνα και εντοπίζεται στην κεφαλή της κυτταροπλασµατικής 40S υποµονάδας (Nygard και Nilsson, 1990). Η πρωτεΐνη αυτή µπορεί άµεσα να αλληλεπιδράσει µε mrna, trna και παράγοντες έναρξης, οπότε επιβεβαιώνεται η εντόπισή της σε µια περιοχή που συµµετέχει στην έναρξη της µετάφρασης, Πρόκειται για µια πρωτεΐνη µοριακού µεγέθους περίπου 30kDa, η οποία περιλαµβάνει 249 αµινοξέα. Από τα αµινοξέα αυτά, τα 15 είναι σερίνες και 7 από αυτές εντοπίζονται σε µια ακολουθία 15 αµινοξέων στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης 27

41 (Chan και Wool, 1988). Έχει βρεθεί πως φωσφορυλιώνεται διαδοχικά στις πέντε από αυτές, Ser 236, Ser 235, Ser 240, Ser 244, και Ser 247 (Radimerski et al., 2000). Το πιο αξιοσηµείωτο χαρακτηριστικό της S6, είναι ο µεγάλος αριθµός και η ποικιλία των παραγόντων, καθώς και οι αλλαγές στο κυτταρικό περιβάλλον, που επιδρούν στη φωσφορυλίωση της συγκεκριµένης πρωτεΐνης, όπως είναι ορµόνες, παράγοντες ανάπτυξης, τοξικά συστατικά, µόλυνση από ιούς, κυτταρικός µετασχηµατισµός και άλλα (Chan και Wool, 1988). Είναι γνωστό πως η ριβοσωµική πρωτεΐνη S6, φωσφορυλιώνεται από διαφορετικούς τύπους κινασών, την p70/p85s6k, S6K1, και την pp90rsk, S6K2 (Shima et al., 1998). Ο ρόλος της S6K2 στη φωσφορυλίωση της S6, κάτω από φυσιολογικές συνθήκες παραµένει αδιευκρίνιστος. Η S6K1, αποτελείται από δυο κινάσες, την p70s6k και την p85s6k. Οι δυο αυτές κινάσες µεταφράζονται από το ίδιο mrna, χρησιµοποιώντας εναλλακτικά σηµεία έναρξης της µετάφρασης. Η αµινοξική τους ακολουθία είναι η ίδια, µε εξαίρεση µια προέκταση 23 αµινοξέων στην N- τελική περιοχή της p85s6k, η οποία είναι αυτή που οδηγεί την πρωτεΐνη στον πυρηνίσκο, σε αντίθεση µε την p70s6k, που είναι κυτταροπλασµατική (Radimerski et al., 2000). Η φωσφορυλίωση της S6 στον πυρηνίσκο, συµβαίνει κατά τη διάρκεια της ενεργούς βιογένεσης των ριβοσωµάτων, ενώ η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης αυτής στο κυτταρόπλασµα, φαίνεται να ενισχύει την εκλεκτική µετάφραση µιας σειράς µεταγραφηµάτων, κυρίως mrnas ριβοσωµικών πρωτεϊνών και παραγόντων επιµήκυνσης, στα οποία παρατηρείται µια µικρή ακολουθία 5-15 πυριµιδινών, ακριβώς µετά το m 7 GTP κάλυµµα, (5'-TOP). Η ακολουθία αυτή φαίνεται να είναι απαραίτητη για τη ρύθµιση της µετάφρασης αυτών των mrnas, σε απόκριση διαφορετικών ερεθισµάτων ανάπτυξης. Έτσι, η ενορχηστρωµένη ρύθµιση της πρωτεϊνικής σύνθεσης, φαίνεται να εξαρτάται από την παρουσία της ακολουθίας TOP σε αυτά τα mrnas. Η µεταφραστική ρύθµιση των 5 -TOP mrnas, δεν εξαρτάται αποκλειστικά από τη φωσφορυλίωση της S6, αλλά και από άλλα αναπτυξιακά και µιτογόνα ερεθίσµατα, αφού όπως έχει βρεθεί, στα MEL κύτταρα ή σε άλλα αιµοποιητικά κύτταρα, δεν παρατηρείται φωσφορυλιωµένη S6, παρόλα αυτά όµως, πραγµατοποιείται σε κάποιο βαθµό η µετάφραση των 5 -TOP mrnas (Barth-Baus et al., 2002). Η φωσφορυλίωση της S6 απαιτεί την ενεργοποίηση των S6 κινασών. ιάφορα µιτογόνα, ινσουλίνη και αµινοξέα σε περίσσεια, προκαλούν ένα µονοπάτι µεταγωγής σηµάτων, κι έτσι ενεργοποιείται η S6 κινάση µε φωσφορυλιώσεις που αλλάζουν τη 28

42 διαµόρφωση της πρωτεΐνης (Williams et al., 2003). Το µονοπάτι αυτό φαίνεται στο σχήµα Α.11. Hans Trachel, 2002 Σχήµα Α.11. Μονοπάτι µεταγωγής σήµατος που οδηγεί στην ενεργοποίηση της p70/p85s6k. Η ενεργοποίηση της S6 κινάσης απαιτείται για την ολοκλήρωση της G 1 φάσης και τη µετάβαση στην S φάση του κυτταρικού κύκλου και παίζει ρόλο στη ρύθµιση του κυτταρικού µεγέθους στα θηλαστικά και στις µύγες των φρούτων (Dennis et al., 1999). Α.3.2. Μη ριβοσωµικές ιδιότητες των ριβοσωµικών πρωτεϊνών Όπως αναφέρθηκε και στις προηγούµενες παραγράφους, η βιογένεση των ριβοσωµάτων στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, εξαρτάται από την ενορχηστρωµένη παραγωγή και συγκρότηση τεσσάρων µορίων ριβοσωµικών RNAs και περισσοτέρων από 70 ριβοσωµικών πρωτεϊνών, από τις οποίες πολλές είναι εξαιρετικά συντηρηµένες κατά την εξέλιξη. Ο ρόλος που παίζει το ριβόσωµα στη ρύθµιση των διαδικασιών της κυτταρικής ανάπτυξης και του θανάτου δεν προκαλεί εντύπωση, δεδοµένου ότι αυτές οι διαδικασίες ουσιαστικά περιλαµβάνουν δυναµικές αλλαγές στα µοντέλα της γονιδιακής έκφρασης και η βιογένεση των ριβοσωµάτων 29

43 είναι σηµαντική, για µια λειτουργική µηχανή µετάφρασης. Ο ρόλος των ριβοσωµικών πρωτεϊνών στη ρύθµιση της κυτταρικής ανάπτυξης και θανάτου µπορεί να θεωρηθεί απλά, σαν αυτός των ακέραιων αλληλοεξαρτώµενων συστατικών µιας βασικής κυτταρικής µηχανής. Παρόλα αυτά όµως, υπάρχουν στοιχεία, κάποια περιστασιακά και κάποια περισσότερο ουσιώδη, πως κάποιες µεµονωµένες ριβοσωµικές πρωτεΐνες δρουν οι ίδιες σαν διαµορφωτές και εκτελεστές αλλαγών (Naora και Naora, 1999). Από την ανακάλυψη, πριν από 50 χρόνια, ότι τα ριβοσώµατα αποτελούν το σηµείο όπου πραγµατοποιείται η κυτταρική πρωτεϊνική σύνθεση, προέκυψαν πολλές θεωρίες σχετικά µε την προέλευση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών. Αρχικές υποθέσεις απέδιδαν όλα τα σηµαντικά λειτουργικά χαρακτηριστικά του ριβοσώµατος στις ριβοσωµικές πρωτεΐνες, οι οποίες θεωρούνταν ότι συγκρατούνταν και τοποθετούνταν σε συγκεκριµένες θέσεις, από ένα σκελετό που αποτελούνταν από rrnas. Μια αντιστροφή των ρόλων έγινε στις δεκαετίες 1970 και 1980, όταν άρχισαν να αναγνωρίζονται οι πολύ σηµαντικές ιδιότητες των µορίων RNAs, και ειδικά η RNA κατάλυση. Παράλληλα, νέες αποδείξεις απέδωσαν στα rrnas τον κυρίαρχο ρόλο της λειτουργίας του ριβοσώµατος, γεγονός που επιβεβαιώθηκε µε κρυσταλλογραφικές µελέτες, όπου οι σηµαντικότερες λειτουργικές περιοχές του ριβοσώµατος αποτελούνται σχεδόν αποκλειστικά από RNA ( Ban et al., 2000). Το αρχέγονο ριβόσωµα θεωρείται ότι αποτελούνταν αποκλειστικά από rrnas. Η µετάβαση από ένα ριβόσωµα φτιαγµένο από RNA σε µια RNP µηχανή, πιθανώς προέκυψε από την ανάγκη προστασίας των rrnas από διάφορες νουκλεάσες, όπως επίσης και από την ανάγκη διευκόλυνσης της αναδίπλωσης των rrnas και της διατήρησης µιας σωστής διαµόρφωσης, προκειµένου η πρωτεϊνική σύνθεση να πραγµατοποιείται µε ταχύτητα και ακρίβεια. Υπάρχουν δυο πιθανές θεωρίες σχετικά µε την προέλευση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών. Σύµφωνα µε την πρώτη, οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες σχεδιάστηκαν αποκλειστικά για το ριβόσωµα, ενώ η δεύτερη θεωρία υποστηρίζει ότι διαλέχτηκαν ανάµεσα από ήδη υπάρχουσες πρωτεΐνες, οι οποίες είχαν καθορισµένες λειτουργίες. Οι δυο θεωρίες δεν είναι αποκλειστικές, ούτε είναι πιθανό πως όλες οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες προστέθηκαν στο ριβόσωµα την ίδια στιγµή. Αν υιοθετηθεί η θεωρία των προϋπαρχουσών πρωτεϊνών, αυτές που είναι πιο πιθανό να επιλέχθηκαν, είναι αυτές που έχουν την ικανότητα να δεσµεύονται σε νουκλεϊνικά οξέα (Wool et al., 1996). Ποιες είναι εποµένως οι ιδιότητες των ριβοσωµικών πρωτεϊνών; Υπάρχουν απλά για να συνδέονται µε τα rrnas και να τα προστατεύουν από τις νουκλεάσες 30

44 ή/και για να διατηρείται σωστή διαµόρφωση ή µπορεί να έχουν και άλλες ιδιότητες; Τις τελευταίες δυο µε τρεις δεκαετίες µετά τη µελέτη αρκετών ειδών, έχουν αναφερθεί ριβοσωµικές πρωτεΐνες που παρουσιάζουν ιδιότητες εκτός από αυτές που έχουν σαν συστατικά του ριβοσώµατος και της µηχανής σύνθεσης πρωτεϊνών (Zimmermann, 2003). Έτσι, έχουν βρεθεί ριβοσωµικές πρωτεΐνες οι οποίες λειτουργούν κατά τη διάρκεια διαφόρων κυτταρικών λειτουργιών, όπως είναι η αντιγραφή του DNA, η µεταγραφή, η επεξεργασία του RNA, η επιδιόρθωση του DNA, η ρύθµιση της ανάπτυξης, ο κακοήθης µετασχηµατισµός, ακόµα και η φλεγµονή. Στον πίνακα 2, παρουσιάζονται ριβοσωµικές πρωτεΐνες για τις οποίες έχουν βρεθεί µη ριβοσωµικές ιδιότητες. Πίνακας 2. Ριβοσωµικές πρωτεΐνες µε µη ριβοσωµικές ιδιότητες. Ιδιότητα Ριβ. Πρωτεΐνη Replication S1 E. coli L14 Οργανισµός Σχόλια Αναφορά E. coli Transcription S10 E. coli RNA processing S20 S12 Yeast E. coli DNA repair S9 E. coli Autogenous regulation of translation S3 S3 P0 L1, L10, S7, S8, S4 L4 L30 L4 L4 Human Drosophila melanogaster Human E. coli E. coli Yeast Yeast Xenopus laevis Subunit of the replicase of RNA phages Stimulates Rep helicase to unwind DNA Participates in antitermination of transcription Participates in antitermination by RNA polymerase III. Homlogous to rat S20 and E. coli S10. Enhances phage T4 intron splicing in vivo. Participates with UmuC in error prone SOS repaire Identical amino acid sequence to apurinic/apyrimidinic endonuclease III 8-Oxoguanine and apurinic/apyrimidinic lyase Apurinic/apyrimidinic endonuclease. Bind to mrnas in specific ribosomal protein cistrons and inhibit translation Suppresses translation of S10 operon mrna; inhibits transcription of S10 operon Binds to the 5 ' exon-intron junction of L30 pre-mrna and inhibits splicing. Binds to mrna and inhibits translation Binds to L4 mrna and inhibits translation Binds to L4 pre-mrna and inhibits splicing Kamen,1975 Yancey, 1991 Friedman,1981 Hermann-Le Denmat, 1994 Coetzee, 1994 Woodgate, 1989 Kim, 1995 Wilson, 1994 Grabowski, 1991 Nomura, 1984 Zengel, 1991 Vilardell, 1994 Presutti, 1991 Bozzoni,

45 Malignant transformation Regulation of development S14 L7 L5 RPs S4 S2 S6 L19 S18 S19 S15a Human Human Human D. melanogaster Human D. melanogaster D. melanogaster D. melanogaster Arabidopsis thaliana Ascaris lubricoides Strongylocentrotus pupuratus Miscellaneous S8 X. laevis S15a L32 L5 Yeast Mouse Rat Binds to S14 gene and inhibits transcription Inhibits transcription of specific mrna, including its own and of luciferase. Mediated by bzip motif Forms a complex with Mdm2 and p53. The complex can bind 5S RNA Around 50 separate loci are designated minute. Flies with minute fenotype exhibit deffective growth. The 2 minute genes identified encode ribosomal proteins Turner syndrome, female gonadal insufficiency and a variety of anatomic abnormalities Plays a role in oogenesis and is necessary for maturation of the egg follicle Mutations in the S6 gene cause melanotic tumors, and flies display hypertrophied haemopoietic organs Required for normal wing blade development Mutations in PFL, which encodes S18, cause pointed first leaves instead of round ones, reduced fresh weight and prolongation of the life cycle. Required for chromatin condensation mrna for S15a is upregulated during oogenesis The same as p27, an oocyte peripheral membrane protein associated with vesicles formed during mitosis. S8 is phosphorylated in this situation Selective stabilisation of the temperature-sensitive cap-binding subunit of eif-4e Morphogen that can induce the formation of cartilage and endochondrial bone from mesenchymal cells L5-5S rrna complexes stimulate aminoacyl-trna synthase Tasheva, 1995 Neumann, 1995 Kastan, 1993 Lindsley, 1967 Fisher, 1990 Cramton, 1994 Watson, 1992 Hart, 1993 van Lijsebettens, 1994 Etter, 1994 Angerer, 1992 Boman, AL Lavoie, 1994 Ito, 1992 Ogata, 1993 P2 Rat Was isolated from liver as an ironbinding protein that is responsible for distributing iron itracellularly Furukawa, 1992 L22 Human Forms RNP with Epstein-Barrencoded small RNA in B lymphocytes Toczyski, 1994 Wool,

46 Ο πιο πάνω κατάλογος των ριβοσωµικών πρωτεϊνών, ο οποίος δηµοσιεύθηκε από τον Ira Wool, έναν σπουδαίο ερευνητή στον τοµέα του ριβοσώµατος και των ριβοσωµικών πρωτεϊνών, το 1996, έχει κατά πολύ επεκταθεί την τελευταία δεκαετία, αφού συνεχώς ανακαλύπτονται καινούριοι ρόλοι που αποδίδονται στις ριβοσωµικές πρωτεΐνες. Ενδεικτικά αναφέρεται η περίπτωση της L11 ριβοσωµικής πρωτεΐνης από άνθρωπο, η οποία βρέθηκε ότι αλληλεπιδρά απευθείας µε την ογκοπρωτεΐνη HDM2. Η HDM2 είναι µια πρωτεΐνη η οποία παίζει σηµαντικό ρόλο στην αρνητική ρύθµιση της δραστικότητας της p53, µιας από τις σηµαντικότερες ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες. Η L11 λοιπόν, σχηµατίζει ένα τετραµερές σύµπλοκο µε την HDM2 και την p53. Επίσης, βρέθηκε ότι εµποδίζει την προερχόµενη από την HDM2 ουβικιτινιλίωση της p53, και ότι σταθεροποιεί τα πρωτεϊνικά επίπεδά της. Επίσης, είναι δυνατόν η L11 να ενεργοποιήσει την ενδογενή p53. Έτσι, η ριβοσωµική πρωτεΐνη, ανάλογα µε τα ερεθίσµατα, δεσµεύεται µε την HDM2 στο πυρηνόπλασµα, ή βρίσκεται συνδεδεµένη στο ριβόσωµα (Zhang et al., 2003). Ένα άλλο πολύ χαρακτηριστικό παράδειγµα ριβοσωµικής πρωτεΐνης που παρουσιάζει µη ριβοσωµικές ιδιότητες, είναι αυτό της ανθρώπινης L13a. Η προσθήκη ιντερφερόνης-γ, (INF-γ), σε καλλιέργεια ανθρώπινων µονοκυττάρων, έχει σαν αποτέλεσµα την παραγωγή µέσα σε λίγες ώρες της σερουλοπλασµίνης, µιας πρωτεΐνης η οποία συµµετέχει στο µηχανισµό της φλεγµονώδους απόκρισης. Βρέθηκε πως ώρες µετά την προσθήκη της INF-γ, παρατηρείται σιωπή στην έκφραση της πρωτεΐνης, που εξαρτάται από την παρουσία ενός τµήµατος 29 νουκλεοτιδίων στην 3 -UTR περιοχή του mrna της. Η L13 βρέθηκε να αλληλεπιδρά µε την περιοχή αυτή και να εµποδίζει τη µετάφραση. Αυτή η δράση της L13a πραγµατοποιείται µόνο όταν η πρωτεΐνη είναι φωσφορυλιωµένη και έχει απελευθερωθεί από το ριβόσωµα, γεγονός που προκαλεί ιδιαίτερο ενδιαφέρον (Mazumder et al., 2003). Α.4. Η S7 οικογένεια των ριβοσωµικών πρωτεϊνών Στην S7 οικογένεια των ριβοσωµικών πρωτεϊνών, ανήκουν οι εξής κατηγορίες: οι S7 ριβοσωµικές πρωτεΐνες των βακτηρίων, των φυκιών, των χλωροπλαστών, των κυανοβακτηρίων, των αρχαιοβακτηρίων, των µιτοχονδρίων, καθώς και οι S5 ριβοσωµικές πρωτεΐνες των φυτών και των θηλαστικών. Το χαρακτηριστικό της συγκεκριµένης οικογένειας πρωτεϊνών, είναι ένα συντηρηµένο 33

47 τµήµα αµινοξέων στο C- τελικό άκρο, το οποίο έχει την εξής ακολουθία: [DENSK]- x-[livmdet]-x(3)-[livmfta](2)-x(6)-g-k-[kr]-x(5)-[livmf]-[livmfc]-x(2)- [STAC] ( prosite). Α.4.1. Η S7 ριβοσωµική πρωτεΐνη των βακτηρίων Η S7 ριβοσωµική πρωτεΐνη, είναι µια από τις πρωτογενείς πρωτεΐνες που βοηθούν στη σωστή αναδίπλωση του 3 κύριου τµήµατος του 16S rrna, το οποίο τελικά σχηµατίζει την κεφαλή της 30S υποµονάδας του ριβοσώµατος (Nowotny και Nierhaus, 1988). Εντοπίζεται στην κεφαλή της 30S υποµονάδας, προς το µέρος της πλευρικής προεξοχής, πάνω από τη σχισµή και τη θέση αποκωδίκευσης. Στο σχήµα Α.12, φαίνεται η 30S υποµονάδα του βακτηριακού ριβοσώµατος και ο εντοπισµός των ριβοσωµικών πρωτεϊνών. Η προερχόµενη από την rps7 ρύθµιση της διαµόρφωσης του 16S rrna, είναι ένα απαραίτητο βήµα για την επακόλουθη δέσµευση στην κεφαλή της µικρής υποµονάδας, άλλων ριβοσωµικών πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν µε rrna και αυτές είναι οι S3, S9, S10, S13, S14, S19 και λιγότερο η S2. Έχει βρεθεί πως ένα τµήµα του 16S rrna, που αντιστοιχεί στο 3' άκρο του, συγκροτείται µε τις προαναφερθείσες 8 ριβοσωµικές πρωτεΐνες, σχηµατίζοντας ένα συµπαγές, σφαιρικό RNP σωµατίδιο, που οµοιάζει µε την κεφαλή της 30S υποµονάδας (Samaha et al., 1994). Mueller και Brimacombe, 1997 Σχήµα Α.12. Ταυτοποίηση των ριβοσωµικών πρωτεϊνών της 30S υποµονάδας. Με ανοιχτό γαλάζιο, κόκκινο και σκούρο µπλε, παριστάνονται οι πρωτεΐνες που συνδέονται µε το 3' άκρο, το κεντρικό τµήµα και το 5' άκρο του 16S rrna, αντίστοιχα. 34

48 Ανασυγκρότηση in vitro της 30S υποµονάδας, απουσία της S7 ριβοσωµικής πρωτεΐνης, οδηγεί στο σχηµατισµό ενός ετερογενούς µίγµατος σωµατιδίων, το οποίο καθιζάνει, έπειτα από επεξεργασία µε σουκρόζη διαβαθµισµένης συγκέντρωσης, σαν µια ευρεία κορυφή S, και στα σωµατίδια αυτά λείπουν όλες οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες της κεφαλής (Nomura et al., 1970). Η δοµή της rps7 αποτελείται από έξι α- έλικες και µια β-φουρκέτα ανάµεσα στις έλικες 3 και 4. Τα Ν- και C- τελικά άκρα είναι εκτεθειµένα και χωρίς κάποια τάξη. Στο σχήµα Α.13, παριστάνεται η δοµή της rps7. Hosaka et al, 1997 Σχήµα Α.13. Σχηµατική αναπαράσταση της ριβοσωµικής πρωτεΐνης rps7 από τον οργανισµό B. Stearothermophilus. Η rps7 αποτελείται από έξι α-έλικες, (γαλάζιο και κόκκινο), και µια β-φουρκέτα, (πράσινο). Η περιοχή του 16S rrna, µε την οποία αλληλεπιδρά η rps7, έχει χαρακτηριστεί, µε τη χρήση χηµικών και ενζυµικών ιχνηλατών, καθώς και µε τη δηµιουργία µεταλλάξεων, απαλείφοντας κάποιες περιοχές. Έτσι, οι περιοχές σύνδεσης, εντοπίζονται σε δυο εσωτερικές θηλιές της δευτεροταγούς δοµής του 16S rrna, µια ένωση τριπλής και τετραπλής έλικας, και συγκεκριµένα στα , και (Dragon et al., 1993, Powers και Noller, 1995). Όπως και άλλες ριβοσωµικές πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν πρωτογενώς µε το 16S rrna, έτσι και η rps7, παίζει ένα διπλό ρόλο, σαν µεταφραστικός καταστολέας, ο οποίος αυτορυθµίζει το δικό του οπερόνιο, το str οπερόνιο (Saito et al., 1994). Ένα βασικό επίπεδο της µετάφρασης της rps7, δηµιουργεί µια εν αναµονή κατάσταση. Όπως προαναφέρθηκε, η rps7 είναι µια πρωτεΐνη κλειδί για 35

49 τη συγκρότηση της µικρής ριβοσωµικής υποµονάδας. Σε περίπτωση αύξησης της σύνθεσης του rrna, το συγκεκριµένο σύστηµα της ρύθµισης της µετάφρασης, παρέχει µια αρχική ποσότητα rps7, για την άµεση συγκρότηση των ριβοσωµάτων (Spiridonova et al., 1999). Το οπερόνιο της στρεπτοµυκίνης, str, ανήκει στα περισσότερο συντηρηµένα οπερόνια, κατά τη διάρκεια της εξέλιξης των προκαρυωτικών οργανισµών. Το str οπερόνιο της E.coli, το οποίο είναι και το περισσότερο µελετηµένο, αποτελείται από τέσσερα γονίδια: το rpsl, το οποίο κωδικοποιεί τη ριβοσωµική πρωτεΐνη S12, το rpsg, το οποίο κωδικοποιεί την S7, το fus και το tufa, που κωδικοποιούν τους παράγοντες επιµήκυνσης EF-G και EF-Tu, αντίστοιχα, (Krasny et al., 2000). Η ρύθµιση αυτού του οπερονίου γίνεται εν µέρει µε την αλληλεπίδραση της rps7 µε ένα διακιστρονικό τµήµα του mrna, ακριβώς άνωθεν της περιοχής όπου κωδικοποιεί την rps7. Η rps7 ρυθµίζει την έκφραση καθενός από τα προϊόντα του str οπερονίου, αλλά σε διαφορετικό βαθµό. Τα σηµεία του 16S rrna και mrna, µε τα οποία αλληλεπιδρά η rps7, αν και δεν παρουσιάζουν οµοιότητες, σε επίπεδο δευτεροταγούς δοµής, βρέθηκε πως αποτελούν δύο πανοµοιότυπες ακολουθίες, τις οποίες αναγνωρίζει η rps7 προκειµένου να δεσµευθεί. Επίσης, η rps7 χρησιµοποιεί τα ίδια σηµεία προκειµένου να δεσµευθεί τόσο στο 16S rrna, όσο και στο mrna της. Αυτό αντιπροσωπεύει µια άµεση συσχέτιση της ικανότητας της πρωτεΐνης να αλληλεπιδρά µε το δικό της mrna, και της δυνατότητας που έχει, να παρεµβαίνει στην κυτταρική ανάπτυξη (Robert et al., 2000, 2001). Όπως αναφέρθηκε και προηγούµενα, η rps7 εντοπίζεται στην κεφαλή της 30S υποµονάδας, πολύ κοντά στα σηµεία Α-, P- και E-, όπου δεσµεύεται το trna. Αυτό έρχεται σε πλήρη συµφωνία µε ευρήµατα που θέλουν την rps7 να είναι η µοναδική ριβοσωµική πρωτεΐνη της µικρής υποµονάδας που συνδέεται οµοιοπολικά µε το trna, στα Α- και Ρ- σηµεία. Η αναδίπλωση αντικωδικονίου του trna γειτνιάζει µε διαφορετικό τµήµα της rps7 σε καθένα από τα σηµεία (Sylvers et al., 1992). Επίσης, η rps7 έχει βρεθεί να αλληλεπιδρά µε τον παράγοντα έναρξης της πρωτεϊνικής σύνθεσης, IF-3 (Ehresmann et al., 1986). Κατά συνέπεια, η πρωτεΐνη αυτή είναι δυνατό να παίζει άµεσο λειτουργικό ρόλο στο µηχανισµό της µετάφρασης. Η rps7 έχει βρεθεί, µαζί µε κάποιες άλλες πρωτεΐνες της µικρής υποµονάδας, να αλληλεπιδρά µε την τετρακυκλίνη, ένα αντιβιοτικό που συνδέεται στο σηµείο Α- (Buck et al., 1990). Εκτός από την τετρακυκλίνη, η rps7 έχει βρεθεί να συνδέεται και 36

50 µε την πουροµυκίνη, έναν άλλο αναστολέα της πρωτεϊνικής σύνθεσης, που αλληλεπιδρά µε το A- σηµείο (Bischof et al., 1994). Έχει βρεθεί πως η υπερέκφραση της rps7 προκαλεί πρόβληµα στην ανάπτυξη των κυττάρων, ενώ η πλευρική αλυσίδα της Κ35 της πρωτεΐνης, απαιτείται για ικανοποιητική συγκρότηση της πρωτεΐνης στην 30S υποµονάδα, in vivo, ενώ άλλα τουλάχιστον 17 συντηρηµένα και εκτεθειµένα αµινοξέα δεν απαιτούνται για το σκοπό αυτό. Ένα παράγωγο της rps7, από το οποίο λείπουν τα 17 αµινοξέα του Ν- τελικού άκρου, οδηγεί τα ριβοσώµατα στο να συσσωρεύονται µε το mrna σε µη φυσιολογικά επίπεδα, κι εποµένως να παρουσιάζεται ελάττωµα στην επιµήκυνση ή στον τερµατισµό της µετάφρασης (Fredrick et al., 2000). Τέλος, η αλληλεπίδραση της rps7 µε την rps11, φαίνεται να είναι πολύ σηµαντική για τη σωστή λειτουργία του ριβοσώµατος, αφού µεταλλάξεις στη µια ή την άλλη πρωτεΐνη, οι οποίες διασπούν την αλληλεπίδραση των δυο πρωτεϊνών, έχουν σαν αποτέλεσµα το ριβόσωµα να είναι επιρρεπές σε λάθη κατά τη µετάφραση. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το εύρηµα, πως µεταλλάξεις στην rps7 που οδηγούν σε διάσπαση της αλληλεπίδρασης µε την rps11, έχουν επίσης σαν αποτέλεσµα τη διατάραξη της συγκρότησης της υποµονάδας, ενώ το αντίθετο δεν συµβαίνει. Η αλληλεπίδραση της rps7 µε την rps11, δεν είναι συντηρηµένη στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς (Robert et al., 2003). Α.4.2. Η S7 ριβοσωµική πρωτεΐνη των αρχαιοβακτηρίων Οι Hosaka et al., (2001), δηµοσίευσαν την κρυσταλλική δοµή της ριβοσωµικής πρωτεΐνης rps7 από το αρχαιοβακτήριο Pyrococcus horikoshii, µε ευκρίνεια 2.1 Å. Όπως φάνηκε, η S7 πρωτεΐνη των αρχαιοβακτηρίων, έχει µια προέκταση περίπου 60 αµινοξέων στο Ν-τελικό της άκρο, η οποία δεν υπάρχει στην οµόλογη πρωτεΐνη των βακτηρίων, ενώ υπάρχει σε αυτή των ευκαρυωτικών οργανισµών. Αυτό έρχεται σε συµφωνία µε τη διαπίστωση πως οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες των αρχαιοβακτηρίων οµοιάζουν περισσότερο µε τις οµόλογες πρωτεΐνες των ευκαρυωτικών. Στο σχήµα Α.14, παριστάνεται η rps7 από τον οργανισµό Pyrococcus horikoshii, ενώ φαίνεται η χαρακτηριστική προέκταση στο Ν-τελικό άκρο. 37

51 Hosaka et al., 2001 Σχήµα Α.14. ιαγραµµατική αναπαράσταση της δοµής της πρωτεΐνης S7 από τον οργανισµό Pyrococcus horikoshii, όπως προέκυψε µετά από κρυστάλλωση. Α.4.3. Η S5 ριβοσωµική πρωτεΐνη των ευκαρυωτικών Η οµόλογη ευκαρυωτική πρωτεΐνη, της S7 ριβοσωµικής πρωτεΐνης των βακτηρίων και των αρχαιοβακτηρίων, είναι η rps5. Στο σχήµα Α.15, παρουσιάζεται η πρωτοταγής δοµή των S7 και S5 ριβοσωµικών πρωτεϊνών, από διάφορους οργανισµούς. Σχήµα Α.15. Αντιστοίχηση πρωτοταγούς δοµής ριβοσωµικών πρωτεϊνών της οικογένειας S7 από διάφορους οργανισµούς. 38

52 Όπως φαίνεται καθαρά από το πιο πάνω σχήµα, η οµολογία όλων των πρωτεϊνών στο C- τελικό άκρο του µορίου είναι αρκετά υψηλή, µικρότερη στις εσωτερικές ακολουθίες, ενώ στο N- τελικό άκρο υπάρχει οµολογία µεταξύ των πρωτεϊνών των θηλαστικών και των αρχαιοβακτηρίων. Παρατηρείται δηλαδή και στα ευκαρυωτικά, η προέκταση στο N-τελικό άκρο που αναφέρθηκε στην παράγραφο Α.4.2, για τα αρχαιοβακτήρια. Η νουκλεοτιδική ακολουθία της S5 ριβοσωµικής πρωτεΐνης από ποντίκι, ανέρχεται σε 93% και 88% οµολογία, συγκρινόµενη µε τις αντίστοιχες νουκλεοτιδικές ακολουθίες από επίµυ και άνθρωπο, αντίστοιχα. Η οµολογία της αµινοξικής ακολουθίας ανέρχεται και για τους δύο οργανισµούς στο 97%. Η πρωτεΐνη S5 και στους τρεις οργανισµούς αποτελείται από 204 αµινοξέα και αυτή του ποντικού έχει µοριακό µέγεθος Da και θεωρητικό ισοηλεκτρικό σηµείο Πρόκειται εποµένως για µια βασική πρωτεΐνη, από τις λιγότερο όµως βασικές. Μια ενδιαφέρουσα παρατήρηση αφορά στην S5 πρωτεΐνη του επίµυ. Βρέθηκε πως είναι η µοναδική ριβοσωµική πρωτεΐνη που το γονίδιό της βρίσκεται σε ένα και µόνο αντίγραφο. Οι αντίστοιχες πρωτεΐνες στον άνθρωπο και το ποντίκι απαντώνται σε 5 µε 6 και 3 µε 4 αντίγραφα, αντίστοιχα. Επίσης, έχει βρεθεί στον επίµυ µια πρωτεΐνη, η S5a, η οποία είναι ταυτόσηµη µε την rps5, µε τη διαφορά ότι λείπουν τα 5 πρώτα αµινοξέα. Οι δυο πρωτεΐνες προέρχονται από το ίδιο cdna µεταγράφηµα και πιθανώς η S5a προκύπτει από την S5, έπειτα από πρωτεόλυση (Kuwano και Wool, 1992). Η S5 ριβοσωµική πρωτεΐνη από ανθρώπινο πλακούντα, έχει βρεθεί πως αλληλεπιδρά µε ένα ολιγονουκλεοτίδιo που είναι συµπληρωµατικό της περιοχής του 18S rrna, , οµόλογη της υψηλά συντηρηµένης περιοχής του 16S rrna 530 stem loop. Έτσι, φαίνεται πως και η πρωτεΐνη S5, όπως και η οµόλογή της S7 από βακτήρια, βρίσκεται κοντά στο κέντρο αποκωδίκευσης του ανθρώπινου ριβοσώµατος (Malygin et al., 1999). Επίσης, για την rps5 έχει βρεθεί πως η αλληλεπίδρασή της µε την IRES, (Internal Ribosome Entry Site), του ιού της ηπατίτιδας C, είναι καθοριστική για τη µετέπειτα αλληλεπίδραση µεταξύ της IRES περιοχής και της 40S υποµονάδας του ριβοσώµατος, γεγονός που αποτελεί µοναδικό χαρακτηριστικό της µετάφρασης του ιού HCV. Είναι γνωστό πως οι πικο-rna-ιοί, αφού δεν διαθέτουν καλυµµένο το 5 - άκρο του mrna τους, προκειµένου να συνδεθεί ο παράγοντας έναρξης της επιµήκυνσης eif-4, συνδέονται µε τη 40S υποµονάδα µέσω υψηλά δοµηµένων 39

53 περιοχών στο 5' της µη µεταφράσιµης περιοχής, (Non Translated Region, NTR), του mrna (Fukushi et al., 2001, Hellen et al., 2001). Ένα ακόµα χαρακτηριστικό της rps5, είναι ότι η οµόλογη πρωτεΐνη στο S. cerevisiae, έχει βρεθεί να είναι φωσφορυλιωµένη (Ignatovich et al., 1995). Η rps5, αποτελεί µια από τις πρωτεΐνες του ανθρώπου, το γονίδιο των οποίων επάγεται από τα myc ογκογονίδια, τα οποία αποτελούν µια κατηγορία µεταγραφικών παραγόντων που πολύ συχνά ενεργοποιούνται σε ανθρώπινους όγκους και παίζουν κυρίαρχο ρόλο στον καρκίνο. Η πλειοψηφία των γονιδίων που επάγονται από τα myc ογκογονίδια, έχουν κυρίαρχο ρόλο στη συγκρότηση και δραστικότητα του ριβοσώµατος (Boon et al., 2001). Η έκφραση της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5, έχει µελετηθεί κατά τη διάρκεια της επαγόµενης διαφοροποίησης και απόπτωσης ερυθρολευχαιµικών κυττάρων ποντικού, (Murine ErythroLeukemia Cells, MEL). Σύµφωνα µε τις µελέτες αυτές, το γονίδιο της ριβοσωµικής πρωτεΐνης σε επίπεδο mrna σταδιακά καταστέλλεται κατά τη διαφοροποίηση, ενώ δεν επηρεάζεται στα αποπτωτικά MEL κύτταρα, γεγονός που είναι αρκετά ενδιαφέρον, αφού η διαφοροποίηση και απόπτωση αποτελούν δυο διαδικασίες στενά ενορχηστρωµένες κατά τη διάρκεια της ερυθράς ωρίµανσης, προκειµένου να ισορροπήσει ο αριθµός των ερυθρών κυττάρων στο αίµα (Vizirianakis et al., 1999). Αντίθετα, το γονίδιο της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5 έχει βρεθεί να υπερεκφράζεται σε διάφορες µορφές καρκίνου, συµπεριλαµβανοµένου του καρκίνου του εντέρου, (Atlas Select Human Tumor Array Gene List, atlas.clontech.com). Τέλος, έχει βρεθεί πως η κινητικότητα της rps5 στον πυρηνίσκο και στο πυρηνόπλασµα είναι σηµαντικά πιο αργή σε σχέση µε άλλες πρωτεΐνες που συµµετέχουν σε άλλα στάδια της βιογένεσης των ριβοσωµάτων, όπως ο UBF, (Upstream Binding Factor), η νουκλεολίνη, η φιµπριλλαρίνη, η πρωτεΐνη Rpp29. Το γεγονός αυτό, φαίνεται να δηλώνει πως η συσχέτιση διαφόρων πρωτεϊνών µε τον πυρηνίσκο, οφείλεται σε συγκεκριµένους λειτουργικούς τους ρόλους, παρά απλά σε συγκεκριµένα γεγονότα που στοχεύουν σε αυτόν (Chen και Huang, 2001). Αξίζει σε αυτό το σηµείο να τονιστεί, πως η rps5 είναι από τις πρόδροµες πρωτεΐνες που συνδέονται µε το 18S rrna, προκειµένου να αρχίσει η συγκρότηση της µικρής υποµονάδας του ευκαρυωτικού ριβοσώµατος (Kressler et al., 1999). 40

54 Α.5. Το σύστηµα των ερυθρολευχαιµικών κυττάρων ποντικού, MEL: ένα πρότυπο σύστηµα µελέτης, σε µοριακό και κυτταρικό επίπεδο, της ερυθροδιαφοροποίησης των αιµοποιητικών κυττάρων in vitro Α.5.1. ιαφοροποίηση των φυσιολογικών αιµοποιητικών κυττάρων Τα πολυδύναµα αιµοποιητικά αρχέγονα κύτταρα, τα οποία αποτελούν ένα εξαιρετικά µικρό ποσοστό, (< 0.1 %), των εµπύρηνων κυττάρων του µυελού των οστών, παίρνουν την απόφαση είτε να αυτοαντικατασταθούν και να παραµείνουν πολυδύναµα, είτε να διαφοροποιηθούν σε ανώριµα αλλά δροµολογηµένα πρόγονα κύτταρα. Αυτά τα πρόγονα κύτταρα, διαφοροποιούνται σε λειτουργικά διακριτά ώριµα κύτταρα του αίµατος, συµπεριλαµβανοµένων των ερυθρών αιµοσφαιρίων, των αιµοπεταλίων, των ουδετεροφίλων, των ηωσινοφίλων, των βασεοφίλων, των µονοκυττάρων/µακροφάγων και των λεµφοκυττάρων Τ- και Β- (Wu et al., 1967, Metcalf, 1998). Τα πολυδύναµα ανθρώπινα αρχέγονα κύτταρα, (HSC), παρουσιάζουν υψηλό βαθµό πολλαπλασιασµού και εκφράζουν υποδοχείς για συγκεκριµένους εξωτερικούς αναπτυξιακούς παράγοντες, οι οποίοι κρατούν σε ισορροπία την κυτταρική ανάπτυξη, τη διαφοροποίηση και τον προγραµµατισµένο κυτταρικό θάνατο, (απόπτωση), στο µυελό των οστών (Socolovsky et al., 1998, Cantor και Orkin, 2001). έσµευση των HSC στα µονοπάτια της διαφοροποίησης, συνοδεύεται από µη αναστρέψιµη ωρίµανση, παύση στην ανάπτυξη του κυτταρικού κύκλου ή απόπτωση (Metcalf, 1998). Στο σχήµα Α.16, φαίνεται η ανάπτυξη των αιµοποιητικών κυττάρων. Σχήµα Α.16. ιαγραµµατική απεικόνιση της αιµοποίησης. Socolovsky et al.,

55 Πολυδύναµα αρχέγονα κύτταρα του µυελού των οστών µπορούν να αυτοαντικατασταθούν ή να διαφοροποιηθούν προς 8 διαφορετικές αιµοποιητικές σειρές, µε µια σταδιακή διαδικασία. Παρουσιάζονται και οι αναπτυξιακοί παράγοντες που επηρεάζουν διάφορα στάδια αυτής της διαδικασίας. Όπως φαίνεται στο πιο πάνω σχήµα, η αιµοποίηση ελέγχεται από ένα µεγάλο αριθµό µακροµοριακών παραγόντων, ενδογενούς ή εξωγενούς προέλευσης, οι οποίοι αποτελούν στόχο εκτεταµένης έρευνας για την κλινική τους εφαρµογή σε παθολογικές καταστάσεις, που έχουν σχέση µε διαταραχές της αιµοποίησης. Α.5.2. Λευχαιµικά κύτταρα Οι λευχαιµίες, αποτελούν ένα µεγάλο ποσοστό των αιµατολογικών κακοηθειών, που εκδηλώνονται σαν οξείες ή χρόνιες αρρώστιες µε σχετικά µικρή συχνότητα, (5-8/10 5 ). Στις λευχαιµίες, τα αρχικά προγονικά κύτταρα, δεν ανταποκρίνονται σε εξωτερικά ερεθίσµατα στο µικροπεριβάλλον του µυελού των οστών και ενώ αναπαράγονται, δεν µπορούν να διαφοροποιηθούν σε διακριτούς τύπους των κυττάρων του αίµατος. Τα λευχαιµικά κύτταρα, που µοιάζουν σε σηµαντικό βαθµό µε τα αντίστοιχα φυσιολογικά αιµοποιητικά κύτταρα, φαίνεται ότι έχουν υποστεί ουσιαστικές µεταβολές στο αναπτυξιακό τους πρόγραµµα. Τα κύτταρα αυτά αποκτούν αθανασία, αυτοδιαιωνίζονται, µεγαλώνουν σε υψηλό ποσοστό στο µυελό των οστών εις βάρος άλλων κυττάρων, δεν διαφοροποιούνται και δεν αποπίπτουν (Sachs, 1980, Domen, 2001). Παρόλο που έχει σηµειωθεί µεγάλη πρόοδος στην πειραµατική αιµατολογία και βιολογία της νεοπλασίας, οι µηχανισµοί που συµβάλλουν στη φυσιολογική αιµοποίηση και οι οποίοι αλλοιώνονται κατά τη λευχαιµιογένεση, δεν έχουν διευκρινιστεί και αποσαφηνιστεί πλήρως. Μια λεπτοµερής µελέτη των σχέσεων µεταξύ κυτταροδιαφοροποίησης και νεοπλασίας, θα µπορούσε να οδηγήσει στην κατανόηση των παραγόντων που συµβάλλουν στην ανάπτυξη και διατήρηση του λευχαιµικού φαινοτύπου. Αυτό όµως απαιτεί µελέτη γεγονότων που συµβαίνουν στο µικροπεριβάλλον του µυελού των οστών. Αρχικές µελέτες που σχεδιάστηκαν προκειµένου να αναλυθεί η αιµοποίηση στο µυελό των οστών in vivo, δεν ήταν επιτυχείς, εξαιτίας της ετερογένειας και πολυπλοκότητας του συστήµατος αυτού (Tsiftsoglou et al., 2003 a). Έτσι, µε το πέρασµα των χρόνων, αποµονώθηκαν διάφορα λευχαιµικά κύτταρα, που αναπαράγονται σε ιστοκαλλιέργειες, διατηρώντας 42

56 το νεοπλασµατικό φαινότυπό τους και σχηµατίζουν σχετικά οµοιογενείς πληθυσµούς. Οι πρότυπες αυτές καλλιέργειες, (models), είναι κατάλληλες για την ανάλυση των σχέσεων διαφοροποίησης και νεοπλασίας. Σε κάποιες από αυτές τις κυτταρικές σειρές, υπήρξε δυνατότητα µετατροπής των λευχαιµικών κυττάρων σε κύτταρα που µοιάζουν µε τα φυσιολογικά ώριµα αιµοποιητικά κύτταρα, έπειτα από επώαση µε χηµικούς ή βιολογικούς επαγωγείς της διαφοροποίησης, (Collins et al., 1978). Έτσι, άνοιξε ο δρόµος για αυτό που ονοµάζεται σήµερα θεραπεία της νεοπλασίας µέσω της διαφοροποίησης, ο σχεδιασµός δηλαδή αντινεοπλασµατικών φαρµάκων, που έχουν την ικανότητα να επάγουν τη διαφοροποίηση νεοπλασµατικών κυττάρων in vitro (Leszczyniecka et al., 2001). Α.5.3. Γενικά χαρακτηριστικά των ερυθρολευχαιµικών κυττάρων (MEL) Τα ερυθρολευχαιµικά κύτταρα ποντικού MEL, (Murine ErythroLeukemia Cells), ή κύτταρα Friend, αποµονώθηκαν αρχικά από τη Charlotte Friend το 1966, από κυτταρικές αποικίες που εµφανίστηκαν σε διογκωµένο σπλήνα πειραµατόζωων, (ποντίκια του είδους DAB/2J), τα οποία είχαν εµβολιασθεί προηγούµενα µε ιό τύπου FLV, (Friend Leukemia Virus) (Harrison, 1976). Τα κύτταρα αυτά, έχουν τα µορφολογικά χαρακτηριστικά των προερυθροβλαστών, των πρόδροµων δηλαδή ερυθροκυττάρων, µε τη διαφορά ότι παραµένουν σε αυτό το αναπτυξιακό στάδιο, χωρίς να έχουν τη δυνατότητα περαιτέρω διαφοροποίησης. Α ιαφοροποίηση των MEL κυττάρων και επαγωγείς της διαφοροποίησης Η C. Friend και οι συνεργάτες της, το 1971, παρατήρησαν πως τα MEL κύτταρα µπορούν να διαφοροποιηθούν, µε προσθήκη στην καλλιέργεια µιας χηµικής ένωσης, του διµεθυλοσουλφοξειδίου, (DMSO). Από τότε, εκτεταµένες µελέτες έδειξαν πως πληθώρα παραγόντων, (χηµικοί, φυσικοί, φαρµακολογικοί και βιολογικοί), µπορούν να επάγουν τη διαφοροποίηση των MEL κυττάρων. Οι παράγοντες αυτοί, περιλαµβάνουν ανάλογα πουρίνης και πυριµιδίνης, πολικές ενώσεις, βουτυρικό οξύ, ανάλογα ουρίας και θειουρίας, bis-ακεταµίδια, παράγωγα πυριδίνης, ιντερφερόνες, ουσίες που αναδοµούν τη χρωµατίνη και άλλα (Tsiftsoglou et al., 2003 a). Όλοι αυτοί οι παράγοντες έχουν διαφορετική δοµή. Εποµένως, θα πρέπει να υπάρχουν περισσότεροι του ενός µηχανισµοί οι οποίοι οδηγούν τα κύτταρα στο ίδιο τελικό αποτέλεσµα, δηλαδή στον ίδιο φαινότυπο. Εκτεταµένη ανάλυση της δράσης διαφόρων κατηγοριών επαγωγέων, οδήγησε σε τρεις πιθανούς µηχανισµούς: 43

57 α) αλλαγή της φυσικοχηµικής κατάστασης της κυτταρικής µεµβράνης, β) διατάραξη της διαδικασίας µεταφοράς ιόντων δια µέσου της µεµβράνης και γ) µεταβολή της φυσικής, δοµικής και λειτουργικής κατάστασης του γονιδιώµατος (Tsiftsoglou και Wong, 1985). Η δέσµευση των MEL κυττάρων, προκειµένου να εισαχθούν στο πρόγραµµα διαφοροποίησης, αρχίζει από µια διαδικασία που έχει να κάνει µε αλληλεπίδραση του επαγωγέα µε κάποιον υποδοχέα. Αυτό ενισχύεται από το εύρηµα πως η ριβοσωµική πρωτεΐνη της µικρής υποµονάδας, S3, πιθανώς να αλληλεπιδρά µε τον παράγοντα SAHA, ο οποίος είναι ένας επαγωγέας της ερυθράς ωρίµανσης των MEL κυττάρων (Webb et al., 1999). Επίσης, υπάρχουν ενδείξεις, πως αναστολείς της αποακετυλάσης των ιστονών, αλληλεπιδρώντας µε το ένζυµο αυτό, επάγουν τη διαφοροποίηση (Marks et al., 2001). Τέλος, πρόσφατα δηµοσιεύθηκαν ερευνητικά αποτελέσµατα, που παρουσιάζουν την αποµόνωση της πρωτεΐνης p38, µε ικανότητα σύνδεσης µε τους χηµικούς επαγωγείς, κυρίως των UDPs, το οποίο αποτελεί ένα ενδιαφέρον στοιχείο στο συγκεκριµένο ερευνητικό χώρο (Pappas et al., 2005). Α Μορφολογικές και βιοχηµικές αλλαγές κατά τη διαφοροποίηση των MEL κυττάρων in vitro Όπως αναφέρθηκε ήδη, η επώαση των MEL κυττάρων µε χηµικούς επαγωγείς οδηγεί στη διαφοροποίηση των κυττάρων αυτών µέσω µιας συντονισµένης διαδικασίας, η οποία οµοιάζει µε τη φυσιολογική διαφοροποίηση των προερυθροβλαστών προς ορθοχρωµατικούς νορµοβλάστες (Tsiftsoglou et al., 1979). Κατά τη διαδικασία της διαφοροποίησης, τα κύτταρα υπόκεινται σε µια ακολουθία ενορχηστρωµένων βιοχηµικών και κυτταρικών αλλαγών. Αυτές συµπεριλαµβάνουν ανάµεσα σε άλλες, µείωση στο µέγεθος του κυττάρου, µεταβολές στη µεµβράνη, ενεργοποίηση της µεταφοράς σιδήρου, de novo βιοσύνθεση αίµης, συσσώρευση του mrna της αιµοσφαιρίνης και παραγωγή αυτής, έκφραση σπεκτρίνης και αντιγόνων χαρακτηριστικών των ερυθροκυττάρων, συµπύκνωση πυρηνικού υλικού και περιορισµό στην ικανότητα πολλαπλασιασµού, µεταγραφική ενεργοποίηση κάποιων γονιδίων και εκλεκτική καταστολή κάποιων άλλων (Tsiftsoglou και Wong, 1985). Κάτω από συγκεκριµένες συνθήκες, τα MEL κύτταρα είναι δυνατό να εκδιώξουν τον πυρήνα τους και να δώσουν κύτταρα που µοιάζουν µε τα δικτυοκύτταρα (Tsiftsoglou et al., 1979, Volloch και Housman, 1982). 44

58 A Χαρακτηριστικά του προγράµµατος διαφοροποίησης των MEL κυττάρων Η διαφοροποίηση των MEL κυττάρων συµβαίνει στοχαστικά, µε µια συγκεκριµένη πιθανότητα P, που σηµαίνει πως σε κάθε γενιά, µόνο ένας καθορισµένος αριθµός κυττάρων διαφοροποιείται µόνιµα. Τα διαφοροποιηµένα κύτταρα υπόκεινται σε 4-5 διαιρέσεις (Gusella et al., 1976) όπως φαίνεται στο σχήµα Α.17. Η ανάλυση της διαφοροποίησης των MEL κυττάρων επιτεύχθηκε µε µεγαλύτερη επιτυχία µε τη χρησιµοποίηση της τεχνικής των θρόµβων πλάσµατος (Gusella et al., 1976). Σύµφωνα µε αυτήν, κύτταρα MEL επωάζονται σε υγρή καλλιέργεια παρουσία επαγωγέα για ορισµένο χρονικό διάστηµα, και στη συνέχεια µεταφέρονται απουσία του επαγωγέα στη µικροκαλλιέργεια θρόµβων πλάσµατος. Κάθε συγκεκριµένο κύτταρο αναπτύσσει αποικία συγκεκριµένης µορφολογίας, που σχετίζεται µε το στάδιο της διαφοροποίησης. Με την τεχνική αυτή, δόθηκε η δυνατότητα διαχωρισµού των µεταβολών που λαµβάνουν χώρα κατά τη διαφοροποίηση των MEL κυττάρων, σε αντιστρεπτές, που δεν οδηγούν σε διαφοροποίηση, αφού µετά την αποµάκρυνση του επαγωγέα τα κύτταρα δεν οδηγούνται σε διαφοροποίηση, και σε µόνιµες, που παρατηρούνται µετά από ορισµένο χρόνο επώασης των κυττάρων µε τον επαγωγέα και είναι ανεξάρτητες της παρουσίας ή απουσίας αυτού. Υπάρχει εποµένως ένα χρονικό διάστηµα ωρών, (λανθάνουσα περίοδος), η οποία προηγείται της συσσώρευσης των δροµολογηµένων κυττάρων στη διαφοροποίηση και κατά την οποία είναι απαραίτητη η παρουσία του επαγωγέα. Από το χρονικό αυτό σηµείο και µετά, η παρουσία του επαγωγέα δεν κρίνεται απαραίτητη για το κύτταρο, προκειµένου να φτάσει σε υψηλά ποσοστά σύνθεσης αιµοσφαιρίνης και να περιορίσει το δυναµικό πολλαπλασιασµού του, ενώ τα κύτταρα δροµολογούνται για διαφοροποίηση. Η λανθάνουσα περίοδος, δεν εξαρτάται από τη συγκέντρωση του επαγωγέα, ενώ από αυτήν εξαρτάται ο ρυθµός συσσώρευσης των δροµολογηµένων κυττάρων (Tsiftsoglou και Wong, 1985). Ένα άλλο χαρακτηριστικό του προγράµµατος διαφοροποίησης των MEL κυττάρων, είναι το φαινόµενο της µνήµης. Επώαση MEL κυττάρων µε DMSO, στη συνέχεια ανάπτυξη των καλλιεργειών απουσία του χηµικού επαγωγέα και τέλος επανέκθεση των καλλιεργειών σε θρεπτικό υλικό παρουσία DMSO, είχε σαν αποτέλεσµα τα κύτταρα να αρχίσουν να διαφοροποιούνται χωρίς καθυστέρηση. Φαίνεται πως τα κύτταρα έχουν τη δυνατότητα να θυµούνται την προηγούµενη έκθεση στον επαγωγέα (Levenson και Housman, 1979). Η έκφραση της µνήµης 45

59 αρχίζει στη λανθάνουσα περίοδο και φθίνει µε το χρόνο, ενώ διαρκεί περίπου 18 ώρες και εξαρτάται από τους κλώνους των MEL κυττάρων. Το γεγονός ότι η µνήµη µπορεί να διαρκέσει για περισσότερες από µια ή δυο γενιές κυττάρων, δείχνει ότι αυτή µεταβιβάζεται από τα µητρικά στα θυγατρικά κύτταρα και δεν επηρεάζεται από την αντιγραφή και τη σύνθεση του DNA. Έχουν βρεθεί διάφορες ουσίες που έχουν την ιδιότητα να σβήνουν τη µνήµη των MEL κυττάρων, αναστέλλοντας συγχρόνως και τη διαφοροποίηση (Levenson και Housman, 1981, Tsiftsoglou et al., 1983). Με βάση αυτά τα δεδοµένα, είναι λογικό να θεωρηθεί πως είτε ένα µόριο mrna, είτε ένα πρωτεϊνικό µόριο, είναι πιθανώς υπεύθυνο για την έκφραση της µνήµης των MEL κυττάρων σε µοριακό επίπεδο (Tsiftsoglou και Wong, 1985). Στο σύστηµα της διαφοροποίησης των MEL κυττάρων, έχει παρατηρηθεί, όπως αναφέρθηκε και προηγούµενα, πως τα κύτταρα που έχουν δροµολογηθεί να διαφοροποιηθούν υπόκεινται σε αµετάκλητη απώλεια της ικανότητας πολλαπλασιασµού, ενώ ταυτόχρονα συνθέτουν δείκτες που είναι χαρακτηριστικοί των τελικά διαφοροποιηµένων ερυθροκυττάρων. εν ήταν όµως ξεκάθαρο, αν η δροµολόγηση των κυττάρων, µπορεί να συµβεί σε κύτταρα χωρίς την έκφραση των δεικτών της ερυθροδιαφοροποίησης και αντίστροφα. Για το σκοπό αυτό, χρησιµοποιήθηκαν διάφορες χηµικές ουσίες που έχουν γνωστό µηχανισµό δράσης και προσδιορίστηκε αν αυτές αναστέλλουν τη διαφοροποίηση και σε ποια συγκεκριµένη φάση. Η εύρεση ότι η αίµη, η οποία είναι ένας παράγοντας που ενεργοποιεί τη σύνθεση του mrna της αιµοσφαιρίνης, δεν προκαλεί δροµολόγηση των κυττάρων, οδήγησε για πρώτη φορά στη διαπίστωση πως η έκφραση των δεικτών της ερυθροδιαφοροποίησης δεν είναι απαραίτητο να συνδέεται µε τη δροµολόγηση για την τελική ωρίµανση, (Gusella et al., 1980). Περαιτέρω πειράµατα µε το ιµιδαζόλιο, το οποίο είναι ένας αναστολέας της συσσώρευσης της αιµοσφαιρίνης, αλλά δεν σταµατά τη δροµολόγηση των κυττάρων και την παύση του πολλαπλασιασµού, ενίσχυσαν την άποψη πως η σύνθεση της αιµοσφαιρίνης ρυθµίζεται ανεξάρτητα από τη δροµολόγηση των κυττάρων, (Gusella et al., 1982, Tsiftsoglou et al., 1983 a,b). Με βάση τα παραπάνω, προτείνεται πως το πρόγραµµα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων αποτελείται από δυο υποπρογράµµατα. (Τσιφτσόγλου, 1989). Το ένα διεγείρεται από την αίµη και είναι υπεύθυνο για την ενεργοποίηση της µεταφοράς των ιόντων Fe +++, τη βιοσύνθεση της αίµης, τη σύνθεση του mrna της αιµοσφαιρίνης, ενώ το άλλο, καθορίζει την ελάττωση του δυναµικού κυτταρικής αναπαραγωγής, την ικανότητα του DNA να µεταγράφεται και τη συµπύκνωση του 46

60 πυρηνικού υλικού. Στο σχήµα Α.17, φαίνεται το αναπτυξιακό πρόγραµµα των MEL κυττάρων. Tsiftsoglou et al., 2003 a Σχήµα Α.17. Σχηµατική αναπαράσταση των κυριοτέρων σταδίων του αναπτυξιακού προγράµµατος των MEL κυττάρων. Ο επαγωγέας, (I), αλληλεπιδρά εκλεκτικά µε έναν κυτταροπλασµατικό υποδοχέα, (R), και διεγείρει την έναρξη της κυτταρικής διαφοροποίησης, που συµβαίνει µε µια πιθανότητα P. Μια λανθάνουσα περίοδος απαιτείται πριν τα κύτταρα δροµολογηθούν µη αντιστρεπτά στην ερυθρά ωρίµανση και ελαττωθεί το δυναµικό κυτταρικής αναπαραγωγής, (4-5 διαιρέσεις). Υπάρχουν ουσίες που µπορούν να σβήσουν την ιδιότητα της µνήµης. Με τη χρήση διαφόρων ουσιών, το πρόγραµµα θεωρητικά διαχωρίστηκε σε δυο υποπρογράµµατα που λαµβάνουν χώρα ανεξάρτητα το ένα από το άλλο. A Η δροµολόγηση των MEL κυττάρων σαν κεντρικό γεγονός της τελικής διαφοροποίησης, οδηγεί σε αµετάκλητη παύση της κυτταρικής ανάπτυξης και σε ασυνεχείς τύπους έκφρασης γονιδίων Η κινητική µελέτη της έκφρασης γονιδίων σε κύτταρα MEL παρουσία επαγωγέα, έδειξε ότι η έκφραση ενός µεγάλου αριθµού γονιδίων αλλάζει κατά τη διάρκεια της λανθάνουσας περιόδου, πριν και µετά την έναρξη της δροµολόγησης των κυττάρων. Αυτές οι αλλαγές αφορούν σε γονίδια που έχουν να κάνουν µε την κυτταρική οικονοµία, (housekeeping genes), που κωδικοποιούν προϊόντα ογκογονιδίων και µεταγραφικούς παράγοντες, ένζυµα του κυτταρικού κύκλου, 47

61 µιτοχονδριακές αιµοπρωτεΐνες και αρκετές άλλες πρωτεΐνες του πυρήνα, όπως είναι οι ιστόνες. Από τις µελέτες αυτές έγινε κατανοητό, πως γεγονότα της έκφρασης κάποιων γονιδίων προηγούνται της δροµολόγησης των MEL κυττάρων και µπορεί να είναι υπεύθυνα για αυτή, ενώ κάποια άλλα, µπορεί να αποτελούν συνέπεια αυτής. Οι αλλαγές είναι δυνατό να συµβαίνουν σε διάφορα κυτταρικά επίπεδα. Στην προκείµενη διδακτορική διατριβή, αναφέρεται ενδεικτικά η συµπεριφορά κάποιων γονιδίων. Έτσι, τα επίπεδα των γονιδίων β major και β minor των σφαιρινών, έχει βρεθεί πως πριν από τη δροµολόγηση είναι σταθερά, ενώ µετά από αυτή, αυξάνονται (Curtis et al., 1980). Η GATA-1, η οποία αποτελεί ένα µεταγραφικό διεγέρτη της διαφοροποίησης των ερυθρών αιµοσφαιρίων και είναι υπεύθυνη για την αρχική και οριστική ερυθροποίηση, παρουσιάζει µια διφασική συµπεριφορά, (πτώση και αύξηση των επιπέδων), πριν από τη δροµολόγηση, ενώ µετά από αυτή, παρατηρείται αύξηση (Green et al., 1992). Την ίδια διφασική συµπεριφορά, αλλά µε τελική πτώση των επιπέδων, παρουσιάζουν το ογκογονίδιο c-myc (Lachman και Skoultchi, 1984) και ο ογοκαταστολέας p53 (Tsiftsoglou et al., 1987). Τα επίπεδα της πρωτεΐνης του ρετινοβλαστώµατος, (prb), αυξάνονται µετά την έναρξη της δροµολόγησης (Copppola et al., 1990), ενώ δεν υπάρχουν στοιχεία που να αναφέρουν τι συµβαίνει πριν από αυτή. Τα επίπεδα των κινασών του κυτταρικού κύκλου, Cdk2, Cdk4, παραµένουν σταθερά και στη συνέχεια πέφτουν, πριν και µετά τη δροµολόγηση των κυττάρων (Hsieh et al., 2000). Την ίδια συµπεριφορά παρουσιάζουν και οι ριβοσωµικές πρωτεΐνες S5 και L35a (Vizirianakis et al., 1999, Pappas et al., 2001). Τέλος, τα επίπεδα των ριβοσωµικών RNAs, (rrnas), φαίνεται να πέφτουν, τόσο πριν, όσο και µετά από τη δροµολόγηση των MEL κυττάρων (Tsiftsoglou et al., 1982). Λεπτοµερής πίνακας µε τη συµπεριφορά ενός µεγάλου αριθµού γονιδίων παρουσιάζεται στα άρθρα ανασκόπησης των Tsiftsoglou et al., 2003 a,b. Έχει βρεθεί, πως η έναρξη της διαφοροποίησης πιθανώς να συµβαίνει κατά τη G 1 /S φάση του κυτταρικού κύκλου (Friedman και Schildkraut, 1977, Geller et al., 1978), ενώ τα κύτταρα που βρίσκονται στο τελικό στάδιο της διαφοροποίησης, φαίνεται να έχουν σταµατήσει στη G 1 /G 0 φάση του κυτταρικού κύκλου (Marks et al., 1996, Rifkind et al., 1996). Όλα αυτά δείχνουν, πως η κυτταρική αναπαραγωγή και η διαφοροποίηση είναι διαδικασίες στενά εναρµονισµένες κατά την ερυθροποίηση. 48

62 Α.6. Ο κυτταρικός κύκλος Α.6.1. Γενικά για τον κυτταρικό κύκλο Σε όλους τους ζωντανούς οργανισµούς, η ικανότητα του πολλαπλασιασµού εξαρτάται από διεργασίες που γίνονται στο κυτταρικό επίπεδο. Η αναπαραγωγή των κυττάρων, καθιστά αναγκαία την αντιγραφή του DNA, ακολουθούµενη από τη διαίρεση του πυρήνα και το χωρισµό του κυτταροπλάσµατος, προκειµένου να δηµιουργηθούν δυο θυγατρικά κύτταρα. Αυτή η διαδοχική ενορχηστρωµένη διαδικασία, είναι γνωστή σαν κυτταρικός κύκλος και αποτελεί ένα φαινόµενο και συνάµα ένα πρόβληµα που συναρπάζει τους επιστήµονες από τα µέσα του 19 ου αιώνα (Θωµόπουλος, 1995, Molecular Biology of the Cell, 3 rd edition, 1994). Στα αρχικά έµβρυα, τα κύτταρα ακολουθούν επαναλαµβανόµενους κύκλους αντιγραφής του DNA, (φάση S), και πυρηνικής και κυτταρικής διαίρεσης, (φάση µίτωσης, Μ), µε πολύ µεγάλη ταχύτητα. Η αντιγραφή του DNA, αρχίζει αµέσως µόλις σταµατήσει η µίτωση και ένας κυτταρικός κύκλος κυτταρικής διαίρεσης ολοκληρώνεται, το πολύ σε µισή ώρα. Καθώς όµως η εµβρυογένεση εκτυλίσσεται, οι ανάγκες της κυτταρικής ζωής σε ένα περισσότερο πολύπλοκο περιβάλλον, µεγαλώνουν. Έτσι, εµφανίζονται και άλλες φάσεις στον κυτταρικό κύκλο, η φάση G 1, η οποία παρεµβάλλεται ανάµεσα στην πυρηνική διαίρεση, (Μ φάση), και στη σύνθεση του DNA, (S φάση) και η φάση G 2, η οποία λαµβάνει χώρα µεταξύ S και Μ φάσης. Η δηµιουργία των δυο επιπλέον φάσεων, προέκυψε από την ανάγκη ελέγχου της σωστής διαµόρφωσης του DNA και ενδεχόµενης επιδιόρθωσης αυτού, (φάση G 1 ) και ελέγχου και επιδιόρθωσης σφαλµάτων κατά την αντιγραφή του DNA, (φάση G 2 ), (Massague, 2004). Οι επιπλέον φάσεις, έχουν σα συνέπεια την αύξηση κατά πολύ του χρόνου ολοκλήρωσης ενός κυτταρικού κύκλου. Στο σχήµα Α.18, παριστάνεται διαγραµµατικά ο κυτταρικός κύκλος και οι φάσεις που τον απαρτίζουν. Οι χρόνοι που αναφέρονται είναι ενδεικτικοί και υποδεικνύουν τη σχετική διάρκεια της κάθε φάσης. 49

63 Israels και Israels, 2000 Σχήµα Α.18. Απλουστευµένη διαγραµµατική αναπαράσταση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου. Α.6.2. Ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου µέσω των Cdks Ένα από τα σπουδαιότερα χαρακτηριστικά του κυτταρικού κύκλου, αποτελεί η µεγάλη του ακρίβεια. Η αξιοθαύµαστη αυτή πιστότητα στην αναπαραγωγή, επιτυγχάνεται µε έναν µεγάλο αριθµό µονοπατιών µεταγωγής σήµατος, που είναι γνωστά σαν σηµεία ελέγχου, (checkpoints). Τα σηµεία αυτά, ελέγχουν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, εξασφαλίζοντας την αλληλεξάρτηση της S φάσης µε τη µίτωση, την ακεραιότητα του γονιδιώµατος και την πιστότητα του διαχωρισµού των χρωµοσωµάτων. Η ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου, πρέπει να εξασφαλίζει την ολοκλήρωση γεγονότων σε κάθε φάση, πριν πραγµατοποιηθεί η είσοδος στην επόµενη (Hoffmann et al., 2003). Σήµερα γνωρίζουµε πως το σύστηµα ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, βασίζεται σε δυο οικογένειες πρωτεϊνών, τις κυκλίνες και τις πρωτεϊνικές κινάσες που εξαρτώνται από αυτές, (Cdks).Ο πρώτος που έκανε λόγο για τις κυκλίνες και τη σύνδεσή τους µε τον κυτταρικό κύκλο, ήταν ο Hunt, το Αυτός και οι συνεργάτες του, παρατηρώντας την αύξηση και την πτώση των επιπέδων µιας πρωτεΐνης, διατύπωσαν την άποψη, πως η σύνθεσή της οδηγεί τα κύτταρα στη µίτωση και η αποικοδόµηση της, επιτρέπει στα κύτταρα να ολοκληρώσουν έναν κυτταρικό κύκλο και να προχωρήσουν στον επόµενο (Evans et al., 1983). Οι κυκλίνες αποτελούν µια συνεχώς αυξανόµενη οικογένεια πρωτεϊνών, οι οποίες όλες παρουσιάζουν οµολογία σε µια περιοχή ~100 αµινοξέων, που ονοµάζεται κουτί κυκλίνης, (cyclin box). Η περιοχή αυτή των κυκλινών, δεσµεύεται σε µέλη 50

64 µιας οικογένειας πρωτεϊνικών κινασών, που παρουσιάζουν υψηλή συντήρηση και έχουν την ξεχωριστή ιδιότητα να χρειάζονται την αντίστοιχη κυκλίνη, προκειµένου να ενεργοποιηθούν. Η ενεργοποίηση πραγµατοποιείται µε τη φωσφορυλίωση µιας συντηρηµένης θρεονίνης, περίπου στη θέση 160, από τη CAK, (Cdk Activating Kinase). Το ετεροδιµερές µόριο, αποτελεί µια οικογένεια κινασών σερίνης/θρεονίνης, και απαρτίζεται από µια καταλυτική υποµονάδα. (Cdk, cyclin dependent kinase), και µια ρυθµιστική υποµονάδα, (κυκλίνη) (Pines, 1995, Nabel, 2002). Η ενζυµική δράση των Cdks ελέγχεται σε διάφορα επίπεδα: µε την αλληλεπίδραση της κυκλίνης, µε την ενεργοποίηση από τη CAK, µε φωσφορυλίωση και αποφωσφορυλίωση και επίσης µε την αλληλεπίδραση αναστολέων των Cdks, (CDKIs, CDK inhibitors), όπως φαίνεται στο σχήµα Α.19. Οι CDKIs που έχουν ταυτοποιηθεί µέχρι σήµερα, ανήκουν σε δυο οικογένειες: την INK4, της οποίας µέλη είναι οι p16 INK4A, p15 INK4B, p18 INK4C και p19 INK4D και την KIP, µε µέλη τους p21 CIP, p27 KIP1 και p57 KIP2. Οι δυο οικογένειες αναστολέων, διαφέρουν ως προς την εξειδίκευση και το µηχανισµό αναστολής (Harper et al., 1996, Sherr et al., 1999). ww.ncbi.nlm.nih.gov/books Pavletich, 1999 Σχήµα Α.19. Έλεγχος της ενζυµικής δράσης των Cdks σε διάφορα επίπεδα. Στον πίνακα 3, φαίνονται διάφοροι τύποι κυκλινών, ο ρόλος τους στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου, οι Cdks και κάποιες άλλες πρωτεΐνες, συµπεριλαµβανοµένων των CDKIs, µε τις οποίες αλληλεπιδρούν. 51

65 Πίνακας 3. Κατηγορίες κυκλινών και χαρακτηριστικά τους. Pines, 1995 Στους περισσότερους ευκαρυωτικούς οργανισµούς, όπως φαίνεται και από τον παραπάνω πίνακα, διαφορετικές Cdks, ελέγχουν διαφορετικά στάδια του κυτταρικού κύκλου. Οι Cdks έχουν την ιδιότητα να συντονίζουν τον κυτταρικό κύκλο, λειτουργώντας ως µοριακοί διακόπτες. Όταν είναι ενεργές, ο κυτταρικός κύκλος προχωρά στο στάδιο που ελέγχει η συγκεκριµένη Cdk, ενώ το αντίθετο συµβαίνει όταν αυτές είναι ανενεργές. Επίσης, αποτελούν αυτά τα µόρια που δέχονται και στη συνέχεια ενσωµατώνουν τα διάφορα ρυθµιστικά σήµατα ανάπτυξης που στοχεύουν στον κυτταρικό κύκλο (Pavletich, 1999). Α Σηµεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, (checkpoints) A) Το σηµείο ελέγχου G 1 Το σηµείο µεταξύ της αρχικής και της τελικής G 1 φάσης, το οποίο αντιπροσωπεύει την αµετάκλητη δροµολόγηση του κυττάρου προκειµένου να διαιρεθεί, ονοµάζεται σηµείο περιορισµού. Είναι πολύ σηµαντικό το γεγονός πως το σηµείο αυτό, χωρίζει τον κυτταρικό κύκλο στην εξαρτώµενη από παράγοντες ανάπτυξης, αρχική φάση G 1 και στις µη εξαρτώµενες φάσεις, από την τελική G 1, µέχρι τη µίτωση. Η µεταγωγή σηµάτων από τους διάφορους παράγοντες ανάπτυξης, οδηγεί τα κύτταρα που βρίσκονται στην αρχική φάση G 1, είτε να περάσουν το σηµείο περιορισµού και να διαιρεθούν, είτε, εξαιτίας ανεπαρκών σηµάτων, να βγουν από τον κυτταρικό κύκλο και να οδηγηθούν στο σηµείο G 0 (Ho και Dowdy, 2002). Τελικά, 52

66 κατά τη διάρκεια της G 1 φάσης, το κύτταρο παίρνει την απόφαση να διαιρεθεί, να διαφοροποιηθεί ή να πεθάνει. Όπως γίνεται κατανοητό, η διεκπεραίωση της σωστής απόφασης, είναι µία πολύ λεπτεπίλεπτη διαδικασία και λάθη µπορούν να οδηγήσουν στον καρκίνο. Πολλά ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια, όπως και οι θεραπείες που στοχεύουν σε αυτά, µπορούν να συνδεθούν µε λάθη στο σηµείο αυτό ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Οι Cdks της G 1 φάσης, είναι αυτές που οδηγούν στην αντιγραφή του DNA. Στα ανώτερα θηλαστικά, στις Cdks της G 1 φάσης συµπεριλαµβάνεται η Cdk2, η οποία αλληλεπιδρά µε τις κυκλίνες τύπου Ε-, (Ε1 και Ε2), καθώς και µε την κυκλίνη Α. Η ενεργοποίηση της Cdk2, οδηγεί στη στρατολόγηση ελικασών, πριµασών και πολυµερασών στο προ-αντιγραφικό σύµπλοκο, προκαλώντας ξεδίπλωµα της διπλής έλικας του DNA και τελικά, την αντιγραφή αυτού. Ένας από τους µηχανισµούς, ο οποίος ελέγχει τη δραστικότητα της Cdk2, είναι αυτός που βασίζεται στον περιορισµό της παροχής κυκλίνης Ε. Η έκφραση της κυκλίνης αυτής εξαρτάται από τους µεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας Ε2F, (Early gene Factor 2) (Massague, 2004). Στα κύτταρα που βρίσκονται στη φάση της µίτωσης ή µόλις έχουν βγει από αυτή, οι παράγοντες Ε2F, αλληλεπιδρούν µε την πρωτεΐνη Rb, (retinoblastoma), ή µε µέλη της οικογένειας στην οποία ανήκει. Η οικογένεια αυτή, ονοµάζεται πρωτεΐνες τσέπης και εκτός από την Rb, περιλαµβάνει τις πρωτεΐνες p107 και p130 (Stevaux και Dyson, 2002). Μιτογόνα ερεθίσµατα αλλάζουν την κατάσταση των σχέσεων µεταξύ των παραπάνω µορίων, αυξάνοντας το ποσό των κυκλινών τύπου D-, (D1, D2 και D3). Οι κυκλίνες αυτές, αλληλεπιδρούν µε τις Cdk4, Cdk6, δηµιουργώντας ολοένζυµα, που παρουσιάζουν ιδιαίτερη προτίµηση για το υπόστρωµα Rb (Sherr, 1995). Η φωσφορυλίωση της Rb από τις παραπάνω κινάσες, έχει σαν αποτέλεσµα την αποδέσµευσή της από τους E2F, επιτρέποντας έτσι την εξαρτώµενη από αυτούς, µεταγραφή. Οι E2F, εκτός από την κυκλίνη E, ενεργοποιούν τη µεταγραφή πολλών µορίων που βοηθούν στην αντιγραφή του DNA. Η Rb, είναι δυνατό να φωσφορυλιωθεί και από την κυκλίνη Ε-Cdk2, δηµιουργώντας έτσι, ένα µηχανισµό ανάδρασης, που βοηθάει στην είσοδο στη φάση S, όταν υπάρχει αρκετή ποσότητα ενεργούς Cdk2 (Massague, 2004). Στο σχήµα Α.20, παρουσιάζεται διαγραµµατικά το σηµείο ελέγχου G 1. 53

67 Israels και Israels, 2000 Sears και Nevins, 2002 Σχήµα Α.20. ιαγραµµατική αναπαράσταση του G1 σηµείου ελέγχου. Θα ήταν αφέλεια να πιστέψει κάποιος πως το µονοπάτι Rb/E2F, είναι το µοναδικό που παίζει κύριο ρόλο στη µετάβαση του κυττάρου από τη G 1 στην S φάση. Το παραπάνω σχήµα αποτελεί µια υπεραπλούστευση των γεγονότων και διαδικασιών που συµβαίνουν σε αυτό το σηµείο ελέγχου. Στην πραγµατικότητα, ένας µεγάλος αριθµός µονοπατιών µεταγωγής σήµατος, παίρνει µέρος στην απόφαση του κυττάρου να διαιρεθεί ή όχι. Ενδεικτικά αναφέρεται η εµπλοκή του ογκογονιδίου c-myc και του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53, τα οποία επηρεάζουν άµεσα τις διαδικασίες στο σηµείο αυτό, (βλέπε σχήµα Α.21). Περαιτέρω ανάλυση, ξεφεύγει από το σκοπό της προκείµενης διδακτορικής διατριβής. Sears και Nevins, 2002 Σχήµα Α.21. Εµπλοκή περισσότερων µονοπατιών µεταγωγής σήµατος, στο G 1 σηµείο ελέγχου. 54

68 Β) Το σηµείο ελέγχου G 2 Το σηµείο ελέγχου G 2, γνωστό και σαν G 2 -M, εµποδίζει τα κύτταρα να αρχίσουν τη διαδικασία της µίτωσης, εάν έχουν υποστεί κάποια βλάβη κατά τη διάρκεια της G 2 φάσης ή εάν έχουν εισέλθει στη φάση αυτή µε κάποια βλάβη από τις προηγούµενες, S ή G 1. Η συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G 2, µπορεί επίσης να αντανακλά το σηµείο ελέγχου της αντιγραφής του DNA, (που χαρακτηρίζεται και σαν S/M), και κατά το οποίο, γίνονται αντιληπτά τµήµατα DNA που στην προηγούµενη φάση S, δεν αντιγράφηκαν σωστά ή πλήρως. Ο κυρίαρχος στόχος του G 2 σηµείου ελέγχου είναι η cyclinb/cdk1,(cdc2), κινάση, η ενεργή µορφή της οποίας οδηγεί τα κύτταρα στη µίτωση. Υπάρχουν τουλάχιστον δυο είδη κυκλίνης Β, στα κύτταρα των θηλαστικών. Το σύµπλοκο κυκλίνης Β1/cdc2, συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασµα κατά τη µεσόφαση, (G 1,S), και στη συνέχεια ενεργοποιείται και µεταφέρεται στον πυρήνα, κατά τη διάρκεια της µίτωσης. Η ενεργοποίηση του παραπάνω συµπλόκου, παρεµποδίζεται από διάφορα µόρια και µεταγραφικά προγράµµατα, όπως η απενεργοποίηση της cdc25 οικογένειας φωσφατασών, που φυσιολογικά ενεργοποιεί τη cdc2 και η ενεργοποίηση του CDKI, p21, από το ογκοκατασταλτικό γονίδιο, p53. Η κυκλίνη Β, αποικοδοµείται κατά τη µετάβαση από τη µετάφαση στην ανάφαση, απενεργοποιώντας τη cdc2, γεγονός απαραίτητο για την έξοδο από τη µίτωση (Pines, 1995, Kastan και Bartek, 2004). Στο σχήµα Α.22, παριστάνονται διαγραµµατικά τα διαφορετικά µονοπάτια που στοχεύουν στη ρύθµιση της cyclinb/cdk1,(cdc2). Σχήµα Α.22. ιαγραµµατική αναπαράσταση του G 2 σηµείου ελέγχου. 55

69 Από όλα τα παραπάνω γίνεται κατανοητό, πως υπάρχουν πάρα πολλά κυτταρικά µονοπάτια που αλληλοσυνδέονται ελέγχοντας τον πολλαπλασιασµό, την απόπτωση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων. Εποµένως, είναι αναγκαία η κατανόηση τους, προκείµενου να γίνει αντιληπτός ο µηχανισµός της καρκινογένεσης και της ανάπτυξης κατάλληλων θεραπευτικών αγωγών. Α.7. Το ριβόσωµα συναντά τον κυτταρικό κύκλο Η βιογένεση ώριµων ριβοσωµάτων, τα οποία είναι ικανά να µεταφράζουν mrnas, δεν αποτελεί ένα απλό, γραµµικό µονοπάτι. Αντίθετα, πολλαπλές διαδικασίες λαµβάνουν χώρα παράλληλα. Στη βιβλιογραφία υπάρχει ένας µεγάλος αριθµός εργασιών, σύµφωνα µε τις οποίες, µια πλειάδα παραγόντων που συµµετέχουν σε διάφορα στάδια της βιογένεσης των ριβοσωµάτων αλληλεπιδρούν άµεσα ή έµµεσα µε διάφορους παράγοντες που ρυθµίζουν τον κυτταρικό κύκλο (Dez και Tollervey, 2004). Το ριβόσωµα, έχει επωµιστεί το τεράστιο φορτίο της σωστής και αποτελεσµατικής παραγωγής των πρωτεϊνών του κυττάρου. Αν και είναι γνωστό αρκετά χρόνια, πως στα καρκινικά κύτταρα, συστατικά του ριβοσώµατος απορυθµίζονται ή δεν εκφράζονται σωστά, είχε παραβλεφθεί ο ρόλος τους στην ογκογένεση. Σήµερα όµως, αν και πολλές ερωτήσεις περιµένουν απάντηση, είναι πια φανερό πως η ρύθµιση της λειτουργίας του ριβισώµατος χάνεται στα καρκινικά κύτταρα. Μια πολύ ενδιαφέρουσα και λεπτοµερής ανασκόπηση (Ruggero και Pandolfi, 2003), περιέχει κατατοπιστικές πληροφορίες σχετικά µε το κατά πόσο το ριβόσωµα είναι δυνατόν να µεταφράζει καρκίνο. Το τελευταίο αυτό στοιχείο, ανοίγει νέους ορίζοντες στο χώρο της επιστηµονικής έρευνας της λειτουργίας του ριβοσώµατος και των συστατικών του, µια πτυχή την οποία αποτελεί και η συγκεκριµένη διδακτορική διατριβή, µε την προσπάθεια διερεύνησης του ρόλου της rps5, στην κυτταρική διαφοροποίηση και ανάπτυξη. 56

70 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΒΗΣ Η προκείµενη διδακτορική διατριβή, αποτελεί αναπόσπαστο τµήµα της πολύχρονης και συστηµατικής δραστηριότητας, της συγκεκριµένης ερευνητικής οµάδας, σε θέµατα που αφορούν στο ριβόσωµα. Παράλληλα όµως, αποτελεί και ένα καινούριο πεδίο ερευνητικού ενδιαφέροντος, αφού µελετήθηκε ο ρόλος της ριβοσωµικής πρωτεΐνης rps5, της 40S υποµονάδας του ευκαρυωτικού ριβοσώµατος, σε συγκεκριµένες κυτταρικές λειτουργίες, σε αντίθεση µε τις περισσότερες προηγούµενες µελέτες που είχαν να κάνουν κυρίως µε τη µελέτη του ριβοσώµατος των βακτηρίων. Όπως ήδη αναφέρθηκε στην εισαγωγή, η rps5, ανήκει στην οικογένεια των S7 ριβοσωµικών πρωτεϊνών. Η οµόλογή της, rps7 της E.coli, παρουσιάζει πολύ σπουδαίες ιδιότητες και είναι η πρωτεΐνη αυτή που ουσιαστικά συµβάλλει στη συγκρότηση της µικρής υποµονάδας του ριβοσώµατος. Ένας στόχος της συγκεκριµένης διδακτορικής διατριβής αφορούσε στην ετερόλογη έκφραση της rps5 από ποντίκι στην E.coli, ο καθαρισµός της, και κατόπιν η συσχέτιση δοµής και διαφόρων λειτουργιών της πρωτεΐνης. Με βάση επίσης το γεγονός, ότι η φωσφορυλίωση αποτελεί µια από τις κύριες µεταµεταφραστικές τροποποιήσεις των ριβοσωµικών πρωτεϊνών, προέκυψαν πειράµατα µελέτης της in vitro φωσφορυλίωσης της rps5. Κατόπιν, η συγκεκριµένη ερευνητική προσέγγιση αφορούσε και στην προσπάθεια διερεύνησης της ρύθµισης, τόσο της δράσης, όσο και της υποκυτταρικής εντόπισης της µελετούµενης πρωτεΐνης. Στα πλαίσια της αναζήτησης µη ριβοσωµικών ιδιοτήτων της rps5, ένας επιπλέον στόχος της προκείµενης διδακτορικής διατριβής, υπήρξε η διερεύνηση του βιολογικού ρόλου του γονιδίου της rps5, και της αντίστοιχης πρωτεΐνης, σε in vitro συστήµατα αιµοποιητικών κυττάρων που αναπτύσσονται υπό κατάλληλες συνθήκες καλλιέργειας, που επιτρέπουν την αναπαραγωγή και διαφοροποίησή τους. Στα πλαίσια αυτά διερευνήθηκε η ρύθµιση της έκφρασης του γονιδίου της rps5 και στο βαθµό που αυτή επηρεάζει ή και επηρεάζεται από την έναρξη της κυτταρικής διαφοροποίησης, από παράγοντες ερυθροποίησης και από ρυθµιστές του κυτταρικού κύκλου. Στην κατεύθυνση αυτή προσανατολίστηκε η προσπάθεια γενετικής τροποποίησης των κυττάρων µε επιµόλυνση, (παροδική ή/και µόνιµη), έτσι ώστε να εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα των προϊόντων του γονιδίου της rps5, (mrna), για να αποσαφηνιστεί, αν τα υψηλά επίπεδα του mrna, οδηγούν σε υψηλότερη παραγωγή της πρωτεΐνης και φαινοτυπική µεταβολή των κυττάρων, δηλαδή σε 57

71 µεταβολή της ικανότητας κυτταρικής διαίρεσης και της ευαισθησίας τους σε σήµατα διαφοροποίησης. 58

72 B. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Β.1. ΥΛΙΚΑ Β.1.1. Βιολογικά υλικά Χρησιµοποιήθηκαν ερυθρολευχαιµικά κύτταρα MEL-745 AC από ποντίκι, και επίσης ανθρώπινα ηπατικά καρκινικά κύτταρα 293T. Η κυτταρική σειρά MEL παραχωρήθηκε από το εργαστήριο Φαρµακολογίας, του Τµήµατος Φαρµακευτικής, (Dr.Ι.Βιζιριανάκης). Από το ίδιο εργαστήριο, παραχωρήθηκαν και κύτταρα MEL επιµολυσµένα µε τον πλασµιδιακό φορέα pcdna-3.1, (MEL mock) και κύτταρα MEL ανθεκτικά στην κυτταρική διαφοροποίηση παρουσία του χηµικού επαγωγέα διµεθυλοσουλφοξείδιο DMSO, (MEL 8R Resistant). Τα κύτταρα 293Τ ήταν προσφορά της Dr. Ε. Νικολακάκη. Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκαν τα στελέχη E.coli XL1, BL21 (DE3), καθώς επίσης και τα TOP10. Β.1.2. Χηµικά αντιδραστήρια Όλα τα χηµικά αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν ήταν αναλυτικής καθαρότητας και προµηθεύτηκαν από τους οίκους Merck (Darmstadt, Germany), Sigma-Aldrich(St.Louis, USA), Serva (Heidelberg, Germany), Riedel de Haen (Hannover, Germany). Οι µεµβράνες νιτροκυτταρίνης ήταν της εταιρείας Schleicher & Schuell (Dassel, Germany) και οι µεµβράνες PVDF, (Polyvinylidene difluoride-immobilon), της εταιρείας Millipore, (Bedford, USA). Η µεµβράνη νάϊλον για τους υβριδισµούς ήταν προϊόν της εταιρείας Schleicher & Schuell. Το ισότοπο [γ- 32 Ρ] ΑΤΡ, ειδικής ραδιενέργειας 6000 Ci/mmol ήταν του οίκου ICN Pharmaceuticals Ltd, UK, ενώ το ισότοπο [γ- 32 Ρ] CΤΡ, ειδικής ραδιενέργειας 111 TBq/mmol παρασκευάστηκε από την εταιρεία Izotop, Institute of Isotopes Co., Ltd, Budapest. Για τις αυτοραδιογραφίες χρησιµοποιήθηκαν ακτινογραφικά φιλµ τύπου Kodak-X-Omat S film, της εταιρείας Kodak, ενώ της ίδιας εταιρείας ήταν και τα υλικά εµφάνισης και στερέωσης των ακτινογραφικών φιλµ X-Ray developer και X- Ray fixer, αντίστοιχα. 59

73 Β.1.3. Υλικά χρωµατογραφίας Για τον καθαρισµό των πρωτεϊνών σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης, (GST), χρησιµοποιήθηκε υλικό χρωµατογραφίας αγχιστείας, (σφαιρίδια σεφαρόζης-γλουταθειόνης), της εταιρείας Amersham Biosciences, AB. B.1.4. Ένζυµα-Αντιδραστήρια Μοριακής Βιολογίας Η κινάση της καζεΐνης ΙΙ, (CKII), που χρησιµοποιήθηκε για τα πειράµατα της in vitro φωσφορυλίωσης ήταν προϊόν των εταιρειών Promega καθώς και NEBiolabs. Οι ενδονουκλεάσες περιορισµού προµηθεύτηκαν από την NEBiolabs, (Beverly, USA), και η Expand long polymerase και το Rapid DNA ligation kit, από την εταιρεία Roche. Επίσης, χρησιµοποιήθηκε πολυµεράση, καθώς και το RT PCR kit της εταιρείας FINZYMES. Τα θρεπτικά υλικά ανάπτυξης των βακτηρίων ήταν της εταιρείας DIFCO Laboratories, (Detroit, USA). Για την ανάπτυξη των ευκαρυωτικών κυττάρων χρησιµοποιήθηκε το θρεπτικό υγρό DMEM, ορός από µοσχάρι, (FBS) και αντιβιοτικό πενικιλίνης-στρεπτοµυκίνης, από την εταιρεία Gibco- BRL. Επίσης, το αντιβιοτικό επιλογής νεοµυκίνη G-418, ήταν της ίδιας εταιρείας. Για την επιµόλυνση των κυττάρων MEL χρησιµοποιήθηκε λιποφεκταµίνη από την εταιρεία Invitrogen. Για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης, (GST) χρησιµοποιήθηκε ο πλασµιδιακός φορέας pgex-2t της εταιρείας Amersham Pharmacia Biotech, ενώ για την έκφραση πρωτεϊνών σύντηξης µε την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη, (GFP), χρησιµοποιήθηκε ο πλασµιδιακός φορέας pegfp-c1, της εταιρείας Clontech Laboratories. Για την επιµόλυνση των ερυθρολευχαιµικών κυττάρων MEL, χρησιµοποιήθηκε ο φορέας κλωνοποίησης pcdna-3.1, της εταιρείας Invitrogen. Το σύστηµα υπερέκφρασης πρωτεϊνών pet11a ήταν της εταιρείας Novagen. Η υπερπαραγόµενη rps5 χρησιµοποιήθηκε για την ανοσοποίηση κουνελιού και την παραγωγή πολυκλωνικού αντισώµατος. Το γονίδιο της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5 από ποντίκι, κλωνοποιηµένο στον πλασµιδιακό φορέα pbluescript, παραχωρήθηκε από το εργαστήριο Φαρµακολογίας του Τµήµατος Φαρµακευτικής, (Dr.Ι.Βιζιριανάκης). Επίσης, παραχωρήθηκε ευγενικά από τους Dr.Huang και Dr.Danyang το γονίδιο της ίδιας πρωτεΐνης κλωνοποιηµένο στον ευκαρυωτικό φορέα pegfpc1. 60

74 Το µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι του myc επιτόπου ήταν από την εταιρεία Invitrogen, ενώ τα µονοκλωνικά αντισώµατα έναντι των πρωτεϊνών Cdk4, Cdk6, Cdk2, GATA-1, ήταν των εταιρειών Cell Signaling, Transduction Bioscience(BD) και Santa Cruz, αντίστοιχα. Τα δεύτερα αντισώµατα anti mouse, anti rat και anti rabbit ήταν από τις Santa Cruz και Cell Signaling. Τέλος, το πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι του C-τελικού άκρου της rps5, ήταν ευγενική προσφορά του Dr.Fukushi και των συνεργατών του. Β.2. ΜΕΘΟ ΟΙ Β.2.1. Καλλιέργειες βακτηρίων Β Καλλιέργεια κυττάρων E. coli Τα στελέχη E. coli XL1, BL21(DE3) και TOP 10, αναπτύσσονται σε θρεπτικό υπόστρωµα LB, (Luria- Bertani) (Sambrook J. et al., 1989), του οποίου η σύσταση είναι η ακόλουθη: Θρεπτικό υλικό LB Εκχύλισµα ζύµης 0.5 % w/v Τρυπτόνη 1.0 % w/v NaCl 1.0 % w/v Η ρύθµιση της οξύτητας γίνεται µε τη χρήση NaOH. Ακολουθεί αποστείρωση του θρεπτικού υλικού στους 120 ο C, υπό πίεση µιας Atm, για 30 λεπτά. Η ανάπτυξη των κυττάρων γίνεται στους 37 ο C, µε έντονη ανάδευση, χρησιµοποιώντας κάθε φορά το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής, όταν είναι απαραίτητο. Για την παρασκευή των επιδεκτικών κυττάρων (competent cells), η ανάπτυξη των κυττάρων TOP 10 γίνεται σε θρεπτικό υλικό TYM, του οποίου η σύσταση φαίνεται παρακάτω: Θρεπτικό υλικό TYM Εκχύλισµα ζύµης 0.5 % w/v Τρυπτόνη 2.0 % w/v NaCl 0.1 M MgSO 4 10 mm 61

75 Β.2.2. Καλλιέργειες των ερυθρολευχαιµικών κυττάρων ποντικού (MEL) Τα ερυθρολευχαιµικά κύτταρα ποντικού MEL, (murine erythroleukemia cells), ή κύτταρα Friend, αποµονώθηκαν αρχικά από την Dr.Charlotte Friend και τους συνεργάτες της το 1966, από κυτταρικές αποικίες, (foci), που εµφανίστηκαν στη διογκωµένη σπλήνα πειραµατόζωων, (ποντίκια DAB/ 2J), τα οποία είχαν εµβολιαστεί µε τον λευχαιµικό ιό Friend. Ο κλώνος που χρησιµοποιήθηκε στην προκείµενη διδακτορική διατριβή είναι ο MEL-745 PC-4. Ο κλώνος αυτός αποµονώθηκε από τον αρχικό κλώνο της Charlotte Friend, από τους Gusella και Housman, το Τα κύτταρα αυτά έχουν την ιδιότητα να αναπτύσσονται σε καλλιέργειες χωρίς να προσκολλώνται στο στερεό υπόστρωµα των φιαλών. Οι πλαστικές φιάλες που χρησιµοποιήθηκαν, (tissue culture flasks), ήταν διαφόρων µεγεθών και προµηθεύτηκαν από την Costar (U.S.A.) και Corning. Προκειµένου να διατηρηθούν τα κύτταρα σε εκθετική φάση ανάπτυξης, γίνονταν κατάλληλες αραιώσεις των καλλιεργειών κάθε 48 ή 72 ώρες µε καινούριο θρεπτικό υγρό. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν και αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υγρό DMEM, (Dulbeco s Modified eagle medium), εµπλουτισµένο µε 10% v/v ορό εµβρύου µόσχου, (fetal bovine serum, FBS), 100 µg/ml βένζυλο πενικικιλλίνης και 100µg/ml στρεπτοµυκίνης, σε κατάλληλο επωαστήρα, (water-jacketed incubator της Forma Scientific, Inc., U.S.A.), στους 37 ο C, σε ατµόσφαιρα κορεσµένη µε υδρατµούς και µε σταθερή παροχή 5% CO 2. Στα επιµολυσµένα κύτταρα προστέθηκε επιπλέον το αντιβιοτικό επιλογής νεοµυκίνη, (geneticin, G-418 σε συγκέντρωση 0.6 mg/ml). B.2.3. Μέθοδοι προσδιορισµού πρωτεϊνών Β Χρωµατοµετρική µέθοδος κατά Bradford, τροποποιηµένη από τον Bearden Η αρχή της µεθόδου αυτής στηρίζεται στην ιδιότητα που έχει η χρωστική ουσία Coomasie Brilliant Blue (CBB) G-250 να δεσµεύεται στα µόρια των πρωτεϊνών. Η χρωστική αυτή, όταν βρίσκεται σε ελεύθερη κατάσταση και σε όξινο περιβάλλον, απορροφά στα 465 nm και το χρώµα της είναι καστανό. Η δηµιουργία του συµπλόκου πρωτεΐνης-χρωστικής, έχει ως αποτέλεσµα την εµφάνιση κυανού χρώµατος και τη µεταβολή του µεγίστου απορρόφησης στα 595 nm, όπου και µετράται φωτοµετρικά. 62

76 Το αντιδραστήριο Bradford παρασκευάζεται ως εξής: Αντιδραστήριο Bradford CBB G-250 1mg/ml H 3 PO 4 85 % 200 ml Ακολουθεί ανάδευση για ώρες. Στη συνέχεια γίνεται αραίωση του διαλύµατος µε απιονισµένο νερό στο 1 λίτρο. Το αντιδραστήριο είναι φωτοευαίσθητο και για το λόγο αυτό, φυλάσσεται σε σκουρόχρωµη φιάλη. Προκειµένου να προσδιοριστεί η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στα δείγµατα, γίνεται ανάµιξη του κάθε δείγµατος, (αραιωµένου στα 2 ml µε απιονισµένο νερό), µε 2 ml αντιδραστηρίου Bradford και ακολουθεί µέτρηση της απορρόφησης στα 595 nm. Ο υπολογισµός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών γίνεται χρησιµοποιώντας πρότυπη καµπύλη αναφοράς µε αλβουµίνη, (BSA) (Bradford, 1976, Bearden, 1978). Β.2.4.Ηλεκτροφόρηση Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαµιδίου Οι πρωτεΐνες, ως φορτισµένα σωµατίδια, έχουν την ιδιότητα να διαχωρίζονται καθώς κινούνται δια µέσου των πόρων µιας πηκτής, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Η ταχύτητα µε την οποία κινούνται οι πρωτεΐνες στην πηκτή, (v), εξαρτάται από τη διαφορά δυναµικού του ηλεκτρικού πεδίου, (Ε) και από το φορτίο της πρωτεΐνης, (q), σχέση που δίνεται από την ακόλουθη εξίσωση: v = E * q / f f: παράγοντας της εξίσωσης που εκφράζει την εξάρτηση από τη µάζα και το σχήµα της πρωτεΐνης, όπως επίσης και το ιξώδες της πηκτής όπου κινείται η πρωτεΐνη. Το πολυακρυλαµίδιο, που χρησιµοποιείται συνήθως για τις ηλεκτροφορήσεις πρωτεϊνών, παρουσιάζει αρκετά πλεονεκτήµατα, όπως είναι η χηµική αδράνεια, η αντοχή σε υψηλή θερµοκρασία, και τα αποτελέσµατα των ηλεκτροφορήσεων µε πολυακρυλαµίδιο είναι επαναλήψιµα. Η δηµιουργία των πηκτών πολυακρυλαµιδίου επιτυγχάνεται µε τον πολυµερισµό του ακρυλαµιδίου, (CH 2 =CH-CO-NH 2 ), και του Ν,Ν-µεθυλενο-δις-ακρυλαµιδίου, (bis-ακρυλαµιδίου) (CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 -NH- CO-CH=CH 2 ). Η αναλογία µε την οποία χρησιµοποιούνται τα δυο υλικά είναι 30:1 w/w. Το bis-ακρυλαµίδιο, συντελεί στο σχηµατισµό γεφυρών µεταξύ των αλυσίδων των πολυµερών του ακρυλαµιδίου. Κατ αυτόν τον τρόπο, δηµιουργείται ένα τριδιάστατο πολυµερές πλέγµα, το µέγεθος των πόρων του οποίου εξαρτάται από το 63

77 βαθµό πολυµερισµού και είναι αντιστρόφως ανάλογο της συγκέντρωσης των µονοµερών του ακρυλαµιδίου. Ο πολυµερισµός πραγµατοποιείται µε το µηχανισµό των ελευθέρων ριζών. Σαν δότης των ελευθέρων ριζών χρησιµοποιείται το υπερθειϊκό αµµώνιο, (Ammonium PerSulfate, APS, (NH 4 ) 2 S 2 O 8 ). Στη συνέχεια προστίθεται ο φωτοχηµικός καταλύτης Ν,Ν,-τετραµεθυλοαιθυλενοδιαµίνη, (TEMED), ο οποίος αποσυνθέτει το υπερθειϊκό ιόν και δίνει µια ελεύθερη ρίζα, (S 2 O 2-8 +e - SO SO4 -. ), η οποία διαδίδεται σε άλλα µόρια ακρυλαµιδίου προς σχηµατισµό του πολυµερούς. Η ηλεκτροφόρηση γίνεται απουσία ή παρουσία µετουσιωτικών παραγόντων, όπως είναι το ανιονικό απορρυπαντικό SDS, (µετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου), ή η ουρία. Στην πρώτη περίπτωση οι πρωτεΐνες διατηρούν τις ανώτερες διαµορφώσεις τους και παραµένουν ενεργές, ενώ στην περίπτωση προσθήκης µετουσιωτικών παραγόντων, οι πρωτεΐνες αποδιατάσσονται και λαµβάνουν τυχαία διαµόρφωση. Το σύστηµα της ηλεκτροφόρησης µπορεί να είναι συνεχές ή ασυνεχές. Στο συνεχές σύστηµα, χρησιµοποιείται το ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα τόσο στην πηκτή, όσο και στα δοχεία των ηλεκτροδίων. Στο ασυνεχές σύστηµα, χρησιµοποιούνται δύο διαφορετικές πηκτές: η πηκτή επιστοίβαξης, όπου γίνεται συµπύκνωση των πρωτεϊνών του δείγµατος σε µια λεπτή στοιβάδα, (χαµηλή συγκέντρωση ακρυλαµιδίου, ph ~7), και η πηκτή διαχωρισµού, όπου οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται σε λεπτές ζώνες, ανάλογα µε το µοριακό τους µέγεθος, (υψηλή συγκέντρωση ακρυλαµιδίου, ph~9). Το διάλυµα ηλεκτροδίων διαφέρει από τα δυο προηγούµενα, (Andrews, 1968). Β Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών κάτω από αποδιατακτικές συνθήκες (SDSηλεκτροφόρηση) Η αρχή της µεθόδου αυτής στηρίζεται στο διαχωρισµό των πρωτεϊνών ανάλογα µε το µοριακό τους µέγεθος. Στο συγκεκριµένο είδος ηλεκτροφόρησης ως αποδιατακτικό µέσο χρησιµοποιείται το ανιονικό απορρυπαντικό SDS, (µετά νατρίου άλας του θειικού δωδεκυλίου). Το SDS δεσµεύεται στις πρωτεΐνες µε υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις και τις αποδιατάσσει. Έτσι, δηµιουργούνται επιµήκη µόρια, αρνητικά φορτισµένα, µε σαφή και καθορισµένη δοµή. Το ποσό του SDS που δεσµεύεται είναι αρκετά σταθερό, (1.4 gr SDS /gr πρωτ.). Επειδή το φορτίο ανά 64

78 µονάδα µάζας είναι περίπου σταθερό και οι υδροδυναµικές ιδιότητες είναι συνάρτηση µόνο του µοριακού µεγέθους, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πολυπεπτιδικών αλυσίδων, κάτω από αυτές τις συνθήκες, εξαρτάται αποκλειστικά από το µοριακό µέγεθος. Η παραδοχή αυτή δεν ισχύει απόλυτα στις περιπτώσεις πρωτεϊνών που είναι πολύ βασικές ή πολύ όξινες, καθώς και πρωτεϊνών που παρουσιάζουν µεγάλο ποσοστό γλυκοσυλίωσης, Οι πρωτεΐνες αυτές, δεσµεύουν µικρότερα ποσά SDS ανά µονάδα βάρους και έτσι κινούνται πιο αργά στην πηκτή διαχωρισµού µε αποτέλεσµα να παρουσιάζουν φαινόµενο µοριακό βάρος υψηλότερο του πραγµατικού. Το σύστηµα που χρησιµοποιείται για το διαχωρισµό των διαφόρων πρωτεϊνικών παρασκευασµάτων, αποτελείται από την πηκτή διαχωρισµού, ύψους 7.5 cm και πάχους 1.5 mm, καθώς και την πηκτή επιστοίβαξης, όπου οι πρωτεΐνες διανύουν απόσταση 1 cm περίπου, πριν εισέλθουν στην πηκτή διαχωρισµού. Οι θέσεις εισαγωγής του κάθε δείγµατος, δηµιουργούνται µε τη βοήθεια πλαστικής οδοντωτής µήτρας, η οποία αφαιρείται προσεκτικά, αφού ολοκληρωθεί ο πολυµερισµός της πηκτής επιστοίβαξης. Η σύσταση των πηκτών διαχωρισµού και επιστοίβαξης είναι η ακόλουθη: Πηκτή επιστοίβαξης (Συνολικός όγκος 5 ml) Ακρυλαµίδιο 5 % w/v bis- ακρυλαµίδιο 0.17 % w/v SDS 0.50 % w/v Tris-HCl ph M APS 0.08 % w/v TEMED 0.20 % v/v Πηκτή διαχωρισµού (Συνολικός όγκος 10 ml) Ακρυλαµίδιο 12 % w/v bis-ακρυλαµίδιο 0.4 % w/v SDS Tris-HCl ph 8.9 APS TEMED 0.5 % w/v M 0.08 % w/v 0.20 % v/v 65

79 Επίσης χρησιµοποιείται διάλυµα ηλεκτροδίων µε την παρακάτω σύσταση: ιάλυµα ηλεκτροδίων ph 8.9 Tris 25 mm Γλυκίνη M SDS 0.1 % w/v Τα δείγµατα πριν εισέλθουν στην πηκτή επιστοίβαξης αναµιγνύονται µε το εξής διάλυµα : ιάλυµα δειγµάτων SDS 2 % w/v Tris-HCl ph mm β- µερκαπτοαιθανόλη 1 % v/v Γλυκερόλη 10 % v/v Κυανούν της βρωµοφαινόλης 0,02 % w/v Το αρχικό διάλυµα των ηλεκτροδίων είναι τέσσερις φορές πυκνότερο, (4x). Τα δείγµατα, πριν την επιστοίβαξή τους θερµαίνονται στους 100 ο C για 5 λεπτά. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών, καθώς και η δηµιουργία συµπλόκων πρωτεΐνης- SDS. Η β- µερκαπτοαιθανόλη προστίθεται για την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσµών και το διαχωρισµό των υποµονάδων των πρωτεϊνών, αν υπάρχουν. Αρχικά εφαρµόζεται σταθερή τάση 50 V, µέχρι τα δείγµατα να εισέλθουν στην πηκτή διαχωρισµού και κατόπιν εφαρµόζεται σταθερή τάση 120 V, µέχρι το τέλος της ηλεκτροφόρησης. Για την ηλεκτροφόρηση αυτού του τύπου χρησιµοποιήθηκαν οι επίπεδες συσκευές πάχους 1,5 mm και µήκους 7.5 cm, που κατασκευάστηκαν στο Ινστιτούτο Max-Panck Μοριακής Γενετικής του Βερολίνου. Στα πειράµατα χρησιµοποιήθηκε σύστηµα ασυνεχές (Laemmli, 1970). Β.2.5. Στερέωση και βαφή πρωτεϊνών σε πηκτές πολυακρυλαµιδίου Η βαφή των πρωτεΐνών έγινε µε Coommassie Blue ή µε νιτρικό άργυρο. Β Βαφή µε Coomassie Brilliant Blue (CBB) R-250 Η αρχή της µεθόδου αυτής στηρίζεται στη δηµιουργία συµπλόκου κυανού χρώµατος, µεταξύ των πρωτεϊνών και της χρωστικής CBB R-250. Τα διαλύµατα που χρησιµοποιούνται έχουν την εξής σύσταση: 66

80 ιάλυµα χρώσης CBB R % w/v Μεθανόλη 50 % v/v Οξικό οξύ 10 % v/v ιάλυµα αποχρωµατισµού Μεθανόλη 50 % v/v Οξικό οξύ 10 % v/v Προκειµένου να δηµιουργηθεί το σύµπλοκο, η πηκτή εµβαπτίζεται στο διάλυµα χρώσης και αφήνεται για µια ώρα περίπου. Με το διάλυµα αυτό, γίνεται συγχρόνως και στερέωση των πρωτεϊνικών ζωνών στην πηκτή. Ακολούθως, η πηκτή τοποθετείται στο διάλυµα αποχρωµατισµού και ανακινείται για αρκετές ώρες. Με τη µέθοδο αυτή είναι δυνατή η ανίχνευση µέχρι και 0.1 µg πρωτεΐνης. Β Βαφή µε νιτρικό άργυρο (AgNO 3 ) Το χαρακτηριστικό της τεχνικής αυτής είναι η µεγαλύτερη ευαισθησία που παρουσιάζει στην ανίχνευση πρωτεϊνών σε σχέση µε τη χρώση µε CBB. Η ποσότητα της πρωτεΐνης που µπορεί να ανιχνευθεί είναι µέχρι και 0.1 ng. Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα των ιόντων αργύρου να αντιδρούν µε πρωτεΐνες και ιδιαίτερα µε τις ελεύθερες αµινοµάδες και τις θειούχες οµάδες αυτών. Η σύσταση των διαλυµάτων που χρησιµοποιούνται είναι η ακόλουθη: ιάλυµα στερέωσης Μεθανόλη Οξικό οξύ 50 % v/v 12 % v/v ιάλυµα θειοθειικού νατρίου Na 2 S 2 O % w/v ιάλυµα νιτρικού αργύρου AgNO 3 Φορµαλδεΰδη 0.2 % w/v % v/v ιάλυµα εµφάνισης Na 2 CO 3 Φορµαλδεΰδη Na 2 S 2 O 3 6% w/v % v/v 0.02 % w/v 67

81 Η διαδικασία έχει ως εξής: Αρχικά η πηκτή εµβαπτίζεται στο διάλυµα στερέωσης για τουλάχιστον δυο ώρες, προκειµένου να στερεωθούν οι ζώνες των πρωτεϊνών στην πηκτή. Ακολουθούν 3 πλύσεις των 15 λεπτών µε 50% αιθανόλη και µία πλύση των 20 λεπτών µε 30% αιθανόλη. Κατόπιν γίνεται µια πλύση του ενός λεπτού µε απιονισµένο νερό και στη συνέχεια η πηκτή εµβαπτίζεται για 1 λεπτό στο διάλυµα του θειοθειϊκού νατρίου, (Na 2 S 2 O 3 ), το οποίο ακολούθως αποµακρύνεται µε 3 πλύσεις των 20 δευτερολέπτων µε απιονισµένο νερό. Στη συνέχεια η πηκτή εµβαπτίζεται για 20 λεπτά στο διάλυµα του νιτρικού αργύρου, (AgNO 3) και ξεπλένεται δύο φορές µε απιονισµένο νερό. Ακολουθεί εµβάπτιση της πηκτής στο διάλυµα εµφάνισης, οπότε και εµφανίζονται οι πρωτεϊνικές ζώνες. Η αντίδραση σταµατά µε την εµβάπτιση της πηκτής στο διάλυµα στερέωσης για 10 λεπτά. Η πηκτή ξεπλένεται και φυλάσσεται σε απιονισµένο νερό (Blum et al., 1987). B.2.6. Παρασκευή πολυκλωνικού αντισώµατος έναντι της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5 Η παρασκευή αντισώµατος έναντι της ριβοσωµικής πρωτεΐνη S5, έγινε µε τη χρήση ενός ανοσολογικά ώριµου κουνελιού, (12 εβδοµάδων). Η ανοσοποίηση γίνεται µε εµβολιασµό του ζώου µε κοµµάτι πηκτής ακρυλαµιδίου που περιέχει την rps5, έπειτα από διαδικασία υπερέκφρασης στον πλασµιδιακό φορέα pet11a. Η πηκτή, αφού ξηραθεί, οµογενοποιείται µε ισότονο διάλυµα PBS και στη συνέχεια αναµιγνύεται µε ίσο όγκο CFA, (Complete Freund s Adjuvant-πλήρες ανοσοενισχυτικό). Για τη δεύτερη δόση χρησιµοποιείται ο αντίστοιχος όγκος IFA, (Incomplete Freund s Adjuvant-µη πλήρες ανοσοενισχυτικό), ενώ στην τρίτη δόση δεν γίνεται προσθήκη ανοσοενισχυτικού. Τα µίγµατα που προκύπτουν, χορηγούνται µε υποδόριες ενέσεις στην αυχενική περιοχή του κουνελιού ως εξής: 1 η δόση ~ 100 µg πρωτεΐνης 2 η δόση (µετά από 14 ηµέρες) ~ 100 µg πρωτεΐνης 3 η δόση (µετά από 1 µήνα) ~ 100 µg πρωτεΐνης Μετά το πέρας δυο εβδοµάδων από την κάθε δόση, συλλέγεται αίµα από το αφτί του ζώου, (~ 8-10 ml). Το αίµα αφήνεται για 60 λεπτά στους 37 C, προκειµένου να υποστεί θρόµβωση. Η κατακρήµνιση του θρόµβου γίνεται µε φυγοκέντρηση σε 3000 x g για 10 λεπτά σε κεφαλή Swing Out. Το υπερκείµενο αποτελεί τον αντιορό, 68

82 ο οποίος φυλάσσεται στους 20 C για αποθήκευση, ή στους 4 C για άµεση χρήση (Harlow και Lane, 1988). B.2.7. Ηλεκτροµεταφορά πρωτεϊνών από πηκτή SDS σε µεµβράνη Η µεταφορά των πρωτεϊνών, (western blotting), από πηκτή πολυακρυλαµιδίου σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF (Immobilon), βασίζεται στην κίνηση των πρωτεϊνών, από την πηκτή προς τη µεµβράνη. Η κίνηση επιτυγχάνεται µε την εφαρµογή διαφοράς δυναµικού. Οι πρωτεΐνες βρίσκονται µε τη µορφή συµπλόκου µε το SDS, οπότε το σύµπλοκο είναι αρνητικά φορτισµένο. Εποµένως, µε την εφαρµογή ηλεκτρικού πεδίου, το σύµπλοκο κινείται προς την άνοδο, εξέρχεται από την πηκτή και τελικά καθηλώνεται στο πλέγµα της µεµβράνης, εξαιτίας υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων. Η τεχνική αυτή επιτρέπει την ανίχνευση των καθηλωµένων πρωτεϊνών µε χρήση κατάλληλων πολυκλωνικών ή µονοκλωνικών αντισωµάτων. Επίσης, µπορεί να γίνει προσδιορισµός της αµινοτελικής ακολουθίας τους, χρησιµοποιώντας αυτόµατο αναλυτή ( για το σκοπό αυτό χρησιµοποιείται αποκλειστικά η µεµβράνη PVDF). Το διάλυµα που χρησιµοποιείται είναι το εξής: ιάλυµα µεταφοράς (transfer buffer) Tris 12.5 mm H 3 BO mm SDS 0.02 % w/v DTT 0.5 mm Αναλυτικά η διαδικασία µεταφοράς των πρωτεϊνών σε µεµβράνη έχει ως εξής: Αφού ολοκληρωθεί η ηλεκτροφόρηση των πρωτεϊνών σε πηκτή SDS-PAGE, γίνεται εµβάπτιση τόσο της πηκτής, όσο και της µεµβράνης, στο διάλυµα της µεταφοράς, (transfer buffer). Αν χρησιµοποιείται η µεµβράνη PVDF, είναι απαραίτητη η ενεργοποίησή της µε µεθανόλη 100% για ένα λεπτό, πριν την εµβάπτιση στο διάλυµα της µεταφοράς. Στη συσκευή της ηλεκτροµεταφοράς τοποθετείται πρώτα ένα φύλλο Whatmann 3MM, διαβρεγµένο στο πιο πάνω ρυθµιστικό διάλυµα, η µεµβράνη, η πηκτή και τέλος άλλο ένα φύλλο Whatmann. H µεµβράνη τοποθετείται στην πάνω πλευρά της ανόδου, και η πηκτή στην πλευρά της καθόδου. ίνεται ιδιαίτερη προσοχή, ώστε η επαφή µεταξύ της πηκτής και της µεµβράνης να είναι άµεση και χωρίς την παρεµβολή φυσαλίδων, που παρεµποδίζουν τη διέλευση του ηλεκτρικού ρεύµατος. Η συσκευή που χρησιµοποιείται είναι το µοντέλο TE-70 Semi-Dry Blotter 69

83 της εταιρίας Hoeffer. Η ηλεκτροµεταφορά γίνεται µε ρεύµα σταθερής έντασης 60mA, για 30 λεπτά (Choli et al., 1990, Gershoni και Palade, 1983). B.2.8. Ανοσοανίχνευση Η ανοσοανίχνευση αποτελεί µια τεχνική, η οποία επιτρέπει τον εντοπισµό µιας πρωτεΐνης που βρίσκεται καθηλωµένη σε µεµβράνη, µε τη βοήθεια πολυκλωνικού ή µονοκλωνικού αντισώµατος. Η αρχή της τεχνικής στηρίζεται ουσιαστικά στην αλληλεπίδραση της καθηλωµένης πρωτεΐνης-αντιγόνου µε το κατάλληλο αντίσωµα. Η αλληλεπίδραση αυτή ανιχνεύεται µε ένα δεύτερο αντίσωµα, το οποίο εκτός του ότι αναγνωρίζει και δεσµεύεται µε τις ανοσοσφαιρίνες IgG του πρώτου αντισώµατος, συζευγνύεται µε ένα ένζυµο-δείκτη το οποίο αντιδρώντας µε το εξωγενώς προστιθέµενο υπόστρωµα, δίνει χαρακτηριστική χρωµοαντίδραση της ζώνης της πρωτεΐνης- αντιγόνου. Στην προκείµενη εργασία, η τεχνική της ανοσοανίχνευσης χρησιµοποιήθηκε για την ταυτοποίηση της rps5 ποντικού από διάφορα εκχυλίσµατα, τόσο βακτηριακά, όσο και ευκαρυωτικά, (καλλιέργειες MEL κυττάρων, 293Τ κυττάρων). Επίσης, στις καλλιέργειες των MEL κυττάρων, ελέγχθηκαν οι πρωτεΐνες Cdk2, Cdk4, Cdk6 και GATA-1. Για την ανίχνευση της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5, χρησιµοποιήθηκε πολυκλωνικό αντίσωµα, το οποίο παραχωρήθηκε από τον Dr.Fukushi. Το συγκεκριµένο αντίσωµα, αναπτύχθηκε έναντι ενός πεπτιδίου της καρβοξυτελικής περιοχής της πρωτεΐνης. Η ανίχνευση των πρωτεϊνών Cdk2, Cdk4, Cdk6 και GATA- 1, έγινε µε κατάλληλα µονοκλωνικά αντισώµατα. Τα δεύτερα αντισώµατα έναντι στις ανοσοσφαιρίνες IgG κουνελιού, ποντικού και αρουραίου, ήταν συζευγµένα µε αλκαλική φωσφατάση. Χρησιµοποιήθηκαν τα πιο κάτω διαλύµατα: ιάλυµα κορεσµού Ζελατίνη 1 % w/v ή Γάλα χωρίς λιπαρά 5 % w/v PBS 1X (8.0 gr/l NaCl, 0.2 gr/l KCl, 1.15 gr/l Na 2 HPO 4, 0.2 gr/l KH 2 PO 4 ) ιάλυµα αλκαλικής φωσφατάσης (AP) Tris-Cl ph 9.5 NaCl MgCl mm 100 mm 5 mm 70

84 Η µεθοδολογία είναι κοινή για όλες τις περιπτώσεις και αναλυτικά έχει ως εξής : Μετά το τέλος της ηλεκτροµεταφοράς, η µεµβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF εµβαπτίζεται στο διάλυµα κορεσµού και ανακινείται για µια ώρα. Αυτό γίνεται για τον κορεσµό της µεµβράνης, έτσι ώστε οι ελεύθερες υδρόφοβες οµάδες της να µην αλληλεπιδράσουν µε το αντίσωµα. Κατόπιν, η µεµβράνη επωάζεται µε το κατάλληλο αντίσωµα σε καθορισµένη αραίωση, σε 10 ml διαλύµατος κορεσµού, υπό συνεχή ανακίνηση για 16 ώρες στους 4 C ή για 2 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου. Ακολουθούν τρεις δεκάλεπτες πλύσεις της µεµβράνης µε διάλυµα PBS που περιέχει 0.03% Tween-20 και στη συνέχεια, η µεµβράνη επωάζεται µε το δεύτερο αντίσωµα, κατάλληλα αραιωµένο σε διάλυµα κορεσµού, για µια ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου, υπό συνεχή ανακίνηση. Κατόπιν, ακολουθούν δυο πλύσεις των 10 λεπτών η καθεµιά µε διάλυµα PBS/Tween-20. Τελικά, η µεµβράνη εµβαπτίζεται σε 10 ml διαλύµατος αλκαλικής φωσφατάσης, στο οποίο έχουν προστεθεί 30µl από το καθένα από τα χρωµογόνα υποστρώµατα, BCIP, (Bromochloroindolyl phosphate) και NBT, (Nitro Blue Tetrazolium). Η χρωµοαντίδραση εκτελείται σε θερµοκρασία δωµατίου µε ανακίνηση, έως ότου εµφανιστεί η ζώνη της πρωτεΐνης. Η µεµβράνη πλένεται µε διςαπεσταγµένο νερό και αφού στεγνώσει φυλάσσεται σε σκοτεινό χώρο (Harlow E. και Lane D., 1988). B.2.9. Αυτοραδιογραφία Η τεχνική αυτή στηρίζεται στην ιδιότητα του ακτινογραφικού film, να προσβάλλεται από την εκπεµπόµενη β-ακτινοβολία του ισοτόπου 32 Ρ, που χρησιµοποιείται για την επισήµανση διάφορων πρωτεϊνικών µορίων και τµηµάτων DNA, τα οποία υβριδίζονται µε τα συµπληρωµατικά mrnas. Στην περίπτωση πρωτεϊνικών µορίων που έχουν στερεωθεί σε πηκτή, η πηκτή ανακινείται σε δις-απεσταγµένο νερό για 30 λεπτά, ώστε να ξεπλυθεί, ξηραίνεται υπό κενό σε χαρτί Whatmann 3MM για µια ώρα, τοποθετείται σε φωτοπολλαπλασιαστικούς θαλάµους, όπου γίνεται και η έκθεση του film Στην περίπτωση των µεµβρανών ύστερα από µεταφορά κατά Northern, όπου τµήµα DNA έχει υβριδιστεί µε αντίστοιχο τµήµα mrna που ήταν καθηλωµένο στη µεµβράνη και έχει ραδιοεπισηµανθεί, η µεµβράνη τοποθετείται επίσης σε αντίστοιχους φωτοπολλαπλασιαστικούς θαλάµους, για να γίνει η έκθεση του film. 71

85 Και στις δυο περιπτώσεις, µια πρώτη εκτίµηση του χρόνου έκθεσης που απαιτείται, µας δίνει η µέτρηση των κρούσεων της πηκτής ή της µεµβράνης, σε συσκευή Geiger. Η εµφάνιση και στερέωση του film γίνεται µε εµβάπτιση υπό ανακίνηση σε X-Ray developer και X-Ray fixer αντίστοιχα (Garrison, 1983). B Έκφραση και καθαρισµός πρωτεϊνών σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης (GST) Η συγκεκριµένη τεχνική επιτρέπει την έκφραση πρωτεϊνών µε υψηλή απόδοση σε βακτηριακά κύτταρα και τον εύκολο διαχωρισµό τους από το πρωτεϊνικό εκχύλισµα. Τα γονίδια των πρωτεϊνών που πρόκειται να εκφραστούν, κλωνοποιούνται σε κατάλληλους πλασµιδιακούς φορείς, οι οποίοι περιέχουν στο µόριο τους προαγωγείς τέτοιους, ώστε να επιτρέπουν υψηλά επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών και της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST), ώστε η πρωτεΐνη που θα προκύψει να αποτελεί το προϊόν σύντηξης µ αυτή. Ο καθαρισµός της πρωτεΐνης σύντηξης επιτυγχάνεται χρησιµοποιώντας στήλη αγχιστείας, που περιέχει γλουταθειόνη καθηλωµένη σε αδρανές υλικό (σεφαρόζη). Κατά συνέπεια, ο διαχωρισµός της πρωτεΐνης από το ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισµα γίνεται εφικτός λόγω της αλληλεπίδρασης της GST µε τη γλουταθειόνη, µε αποτέλεσµα, την καθήλωση της, στα σφαιρίδια της στήλης. Η έκλουση της πρωτεΐνης από τη στήλη γίνεται µε την προσθήκη διαλύµατος αναγµένης γλουταθειόνης, σε περίσσεια. Με αυτόν τον τρόπο, αφενός µεν είναι δυνατή η εύκολη και ποσοτική ανάκτηση της πρωτεΐνης από τη στήλη, αφετέρου δε οι συνθήκες που χρησιµοποιούνται είναι πολύ ήπιες, έτσι ώστε ο κίνδυνος αλλαγών στη δοµή και τη δράση της πρωτεΐνης σύντηξης να είναι µηδαµινός. Συγκεκριµένα, οι πρωτεΐνες που εκφράστηκαν µε τον τρόπο αυτό είναι η rps5 από ποντίκι, η πρωτεΐνη rps5 1-37, η rps και η rps , καθώς και τα µεταλλάγµατα της rps5, Τ(8)G, T(14)G. Ο πλασµιδιακός φορέας στον οποίο έγινε η κλωνοποίηση των παραπάνω γονιδίων είναι ο pgex-2t, (Pharmacia), ο οποίος φέρει το γονίδιο της GST. Τα διαλύµατα που χρησιµοποιούνται είναι τα εξής: 72

86 ιάλυµα αιώρησης των κυττάρων PBS 1X Triton X % v/v β-µερκαπταιθανόλη 0.1% v/v PMSF 1 mm ιάλυµα έκλουσης Αναγµένη Γλουταθειόνη 10mM Tris-Cl ph mm ιάλυµα όξινο ph 4.5 CH 3 COONa 0.1 M NaCl 0.5 M ιάλυµα βασικό ph 8.5 Tris-Cl NaCl 0.1 M 0.1 M ιάλυµα εξισορρόπησης PBS 1X Triton X % v/v Η διαδικασία που ακολουθείται είναι κοινή για όλες τις περιπτώσεις. Τα βακτηριακά κύτταρα, (BL21-DH3), που έχουν µεταµορφωθεί µε τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα, απλώνονται σε τρυβλία µε θρεπτικό υλικό LB/άγαρ που περιέχει 100 µg/ml αµπικιλλίνη και επωάζονται για 16 ώρες στους 37 C. Ακολουθεί εµβολιασµός 50 ml υγρού θρεπτικού υλικού LB, (100 µg/ml αµπικιλλίνη), µε µια αποικία η οποία επιλέγεται από το τρυβλίο. Κατόπιν, η καλλιέργεια αυτή επωάζεται υπό ανάδευση για 16 ώρες στους 37 C. 10 ml από την καλλιέργεια που προκύπτει, χρησιµοποιούνται για τον εµβολιασµό 500 ml θρεπτικού υλικού LB που περιέχουν 100 µg/ml αµπικιλλίνη. Η καλλιέργεια αναπτύσσεται υπό ισχυρή ανάδευση στους 37 C µέχρις ότου η απορρόφηση του αιωρήµατος των κυττάρων φτάσει σε OD Στην πιο πάνω απορρόφηση, γίνεται προσθήκη 1 mm IPTG και ελάττωση της θερµοκρασίας επώασης στους 28 C, για περιορισµό τυχόν δράσεων πρωτεολυτικών ενζύµων, καθώς επίσης και για την ελαχιστοποίηση της δηµιουργίας εγκλείστων σωµατιδίων, (inclusion bodies). Η προσθήκη του IPTG, 73

87 ευνοεί την έκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης σε σχέση µε τις άλλες κυτταρικές λειτουργίες. Η επώαση συνεχίζεται για 1.5-2ώρες και τελικά, τα κύτταρα συλλέγονται µε φυγοκέντρηση 15 λεπτών σε 4500 x g. Μετά την απόχυση του υπερκειµένου, το ίζηµα των κυττάρων αιωρείται σε 6 ml διαλύµατος αιώρησης των κυττάρων. Ακολουθεί λύση των κυττάρων µε υπερήχους, για 5 χρονικά διαστήµατα των 20 δευτερολέπτων, ενώ ενδιάµεσα µεσολαβεί κάθε φορά µία παύση 40 δευτερολέπτων σε παγόλουτρο, ώστε να αποφεύγεται η υπερθέρµανση. Το τελικό αιώρηµα φυγοκεντρείται για 20 λεπτά σε 8500 x g και λαµβάνεται το υπερκείµενο εκχύλισµα των πρωτεϊνών, το οποίο αναµιγνύεται µε το αιώρηµα των σφαιριδίων της στήλης. Ακολουθεί ανάδευση για 30 λεπτά στους 4 C, ώστε να επιτευχθεί η δέσµευση της πρωτεΐνης σύντηξης στη γλουταθειόνη της στήλης. Στη συνέχεια, τα σφαιρίδια φυγοκεντρούνται για 2 λεπτά σε 3000 x g και αφού αποµακρυνθεί το υπερκείµενο, η στήλη πλένεται 3 φορές µε διάλυµα PBST για 10 λεπτά, στους 4 C υπό ανάδευση. Στο τέλος, µετά από φυγοκέντρηση 2 λεπτών σε 3000 x g, γίνονται 2 συνεχόµενες εκλούσεις των 5 λεπτών η κάθε µία, σε θερµοκρασία περιβάλλοντος, µε διάλυµα έκλουσης. Τα εκλούσµατα που περιέχουν την πρωτεΐνη σύντηξης, φυλάσσονται στους -20 C. Η στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης, µετά από κάθε χρήση, προκειµένου να επαναχρησιµοποιηθεί για τον καθαρισµό της ίδιας πρωτεΐνης σύντηξης, αναγεννάται µε τρεις διαδοχικές πλύσεις στους 4 C, χρησιµοποιώντας για 30 λεπτά όξινο και για άλλα 30 λεπτά βασικό διάλυµα. Τελικά, η στήλη εξισορροπείται µε διάλυµα PBST και φυλάσσεται σε αυτό στους 4 C (Sambrook et al., 1989, Smith, 1993). B Πειράµατα συγκατακρήµνισης (pulldown assays) Με τα πειράµατα συγκατακρήµνισης µελετάται η δυνατότητα των πρωτεϊνών να αλληλεπιδρούν µεταξύ τους και δίνουν ενδείξεις για το µέγεθος της ισχύος της αλληλεπίδρασης αυτής. Η αρχή της τεχνικής στηρίζεται στην ιδιότητα διαφόρων πρωτεϊνών σύντηξης, (π.χ. µε GST ή 6xHis), να καθηλώνονται στα σφαιρίδια των αντίστοιχων στηλών χρωµατογραφίας, (γλουταθειόνη-σεφαρόζη, Ni 2+ -αγαρόζη), µε τις οποίες παρουσιάζουν αγχιστεία. Οι καθηλωµένες πλέον πρωτεΐνες µπορούν να δεσµεύσουν άλλες πρωτεΐνες, οι οποίες είτε βρίσκονται σε καθαρή µορφή, είτε περιέχονται σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα. Η όλη διαδικασία πραγµατοποιείται παρουσία 74

88 σχετικά υψηλών συγκεντρώσεων αλάτων ή/και απορρυπαντικών, έτσι ώστε να αποφεύγονται οι τυχαίες αλληλεπιδράσεις µεταξύ των πρωτεϊνών που υπάρχουν στα εκχυλίσµατα, οι οποίες ενδέχεται να οδηγήσουν σε εσφαλµένα συµπεράσµατα ή σε τεχνήµατα, (artifacts). Στη συγκεκριµένη εργασία, ως µέσο καθήλωσης χρησιµοποιήθηκε η στήλη σεφαρόζης-γλουταθειόνης, προκειµένου να δεσµευθούν οι πρωτεΐνες που είχαν εκφραστεί ως πρωτεΐνες σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης, (GST). Για τα πειράµατα αναφοράς, χρησιµοποιήθηκε η τρανσφεράση της γλουταθειόνης, (GST), η οποία δεσµεύθηκε στα σφαιρίδια. Η διαδικασία έχει αναλυτικά ως εξής: Αρχικά γίνεται η εξισορρόπηση των σφαιριδίων της στήλης µε ρυθµιστικό διάλυµα PBST. Γίνονται τρεις διαδοχικές πλύσεις των 10 λεπτών η κάθε µία, στους 4 C. Η πρωτεΐνη σύντηξης µε την GST, (ή µόνο η GST), δεσµεύεται στα σφαιρίδια παρουσία του ίδιου ρυθµιστικού διαλύµατος, υπό ανακίνηση, στους 4 C, για µια ώρα. Κατόπιν, γίνεται φυγοκέντρηση στις x g για 10 λεπτά και το υπερκείµενο της στήλης αποµακρύνεται. Τα σφαιρίδια της στήλης πλένονται 2 φορές µε το ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα, για 10 λεπτά στους 4 C. Στη συνέχεια, µία συγκεκριµένη ποσότητα από τις πρωτεΐνες των οποίων η αλληλεπίδραση µε τη µελετούµενη πρωτεΐνη πρόκειται να ελεγχθεί, (είτε πρόκειται για κυτταρικά εκχυλίσµατα, είτε για καθαρές κυτταρικές πρωτεΐνες), αραιώνεται στο ρυθµιστικό διάλυµα που χρησιµοποιείται και επωάζεται µε τα σφαιρίδια της στήλης, όπου είναι καθηλωµένη η GST-πρωτεΐνη, υπό ανακίνηση, για µια ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Μετά από φυγοκέντρηση στις x g για 10 λεπτά και αποµάκρυνση του υπερκειµένου, ακολουθούν 3 πλύσεις των σφαιριδίων των 10 λεπτών η κάθε µία, στους 4 C, στο ίδιο ρυθµιστικό διάλυµα. Κατόπιν, αποµακρύνεται όλο το υγρό από τα σφαιρίδια της στήλης και αυτά επαναιωρούνται σε 24 µl διςαπεσταγµένο νερό. Στη συνέχεια προστίθενται στα δείγµατα 8 µl από το διάλυµα διαλυτοποίησης των δειγµάτων, θερµαίνονται για πέντε λεπτά στους 100 C και ηλεκτροφορούνται σε πηκτή SDS-PAGE. Η ανίχνευση των πρωτεϊνικών ζωνών, είναι δυνατό να γίνει µε δυο τρόπους. Όταν πρόκειται για καθαρές πρωτεΐνες, η πηκτή µετά την ηλεκτροφόρηση βάφεται µε τη χρωστική Coomassie Brilliant Blue R-250 και οι πρωτεϊνικές ζώνες ανιχνεύονται µε τη χρώση, όπως έχει περιγραφεί στις παραγράφους Β και Β Όταν πρόκειται για πρωτεΐνες, από εκχυλίσµατα ευκαρυωτικών κυττάρων, µετά την ηλεκτροφόρηση ακολουθεί µεταφορά των 75

89 πρωτεϊνικών ζωνών σε µεµβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF και ανοσοανίχνευση µε µονοκλωνικό ή πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι της πρωτεΐνης στόχου. Σε ορισµένες περιπτώσεις, όταν η GST-πρωτεΐνη αποτελεί υπόστρωµα κινάσης πρωτεϊνών, γίνεται έλεγχος της δυνατότητας της να φωσφορυλιωθεί εφ όσον έχει δεσµευθεί στο µόριο της η αντίστοιχη κινάση. Σε αυτήν την περίπτωση, µετά τις πλύσεις, προστίθεται στα σφαιρίδια το διάλυµα της κινάσης, (assay buffer: NaCl 80mM, MgCl2 10mM, Tris- HCl ph mM, ATP ψυχρό 25µΜ και ATP* 0.6 fmol), και γίνεται ραδιενεργός επισήµανση της GST-πρωτεΐνης µε [γ- 32 P] ATP. Η ύπαρξη ή όχι ραδιενεργούς ζώνης πάνω στο φιλµ αυτοραδιογραφίας, αποτελεί ένδειξη αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης σύντηξης µε τη συγκεκριµένη κινάση ή/και τη δυνατότητα φωσφορυλίωσης της από αυτή. Β Ηλεκτροφόρηση τµηµάτων DNA σε πηκτή αγαρόζης Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στην παρασκευή πηκτών µε τήξη της αγαρόζης, η οποία είναι ένας πολυσακχαρίτης υψηλού µοριακού µεγέθους. Πρόκειται για ένα γραµµικό πολυµερές, µε βασική µονάδα τη D-γαλακτοζυλο-3,6-ανυδρο-Lγαλακτόζη. Η τήξη της αγαρόζης επιτυγχάνεται µε θέρµανση, παρουσία κατάλληλου ρυθµιστικού διαλύµατος. Η ηλεκτροφόρηση τµηµάτων DNA σε πηκτές αγαρόζης, βασίζεται στη µετακίνηση των αρνητικά φορτισµένων µορίων DNA σε ουδέτερο ph, προς την άνοδο. Η ταχύτητα µετακίνησης των τµηµάτων DNA εξαρτάται από το µέγεθός τους, (για γραµµικά δίκλωνα µόρια είναι αντιστρόφως ανάλογη του δεκαδικού λογαρίθµου του αριθµού των βάσεών τους), τη διαµόρφωσή τους, (γραµµικά, κυκλικά ή υπερελικωµένα), τη συγκέντρωση της αγαρόζης, το δυναµικό που εφαρµόζεται, καθώς επίσης και από τη σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος που χρησιµοποιείται. Στη συγκεκριµένη εργασία χρησιµοποιήθηκαν πηκτές αγαρόζης συγκέντρωσης από % w/v και τα εξής διαλύµατα: Ρυθµιστικό διάλυµα TBE Tris Η 3 ΒΟ 3 89mM 0.45 M EDTA ph mm. ιάλυµα δειγµάτων 6Χ 76

90 γλυκερόλη κυανούν του ξυλενίου 30 % v/v 0.25% w/v κυανούν της βρωµοφαινόλης 0.25% w/v Αρχικά, γίνεται διάλυση της αγαρόζης στο ρυθµιστικό διάλυµα µε θέρµανση στους 100 ο C, ακολουθεί ελάττωση της θερµοκρασίας, (µέχρι τους 60 ο C περίπου), προσθήκη του βρωµιούχου αιθιδίου, (EtBr), σε συγκέντρωση 0.5 µg/ml και απόχυση στην ειδική συσκευή. Το διάλυµα ηλεκτροφόρησης είναι το TBE, σε τελική συγκέντρωση 1X. Η εµφάνιση των ζωνών των µορίων του DNA στην αγαρόζη, επιτυγχάνεται µε την προσθήκη βρωµιούχου αιθιδίου στο διάλυµα της πηκτής ή/και στο διάλυµα των ηλεκτροδίων. Πρόκειται για µια φθορίζουσα ένωση, η οποία παρεµβάλλεται µεταξύ των βάσεων του DNA και έχει την ιδιότητα να απορροφά την υπεριώδη ακτινοβολία στα 302 και 366 nm και να την επανεκπέµπει στην περιοχή του κόκκινου ορατού φάσµατος. Η ένταση της ακτινοβολίας είναι ανάλογη της ποσότητας του DNA. Η ένταση φθορισµού του ελεύθερου EtBr είναι πολύ µικρότερη από αυτή του συµπλόκου EtBr-DNA, εποµένως είναι δυνατή η ανίχνευση µικρών ποσοτήτων DNA (Sambrook et al., 1989, Sharp et al., 1973). Β Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης (PCR) Η τεχνική αυτή χρησιµοποιείται για τον πολλαπλασιασµό ενός τµήµατος DNA, καθώς και για τον πολλαπλασιασµό ενός τµήµατος DNA εισάγοντας παράλληλα σε αυτό θέσεις για πέψη µε ενδονουκλεάσες περιορισµού, προκειµένου να κλωνοποιηθεί σε κατάλληλους πλασµιδιακούς φορείς. Επίσης, χρησιµοποιείται για την εισαγωγή µεταλλάξεων, καθώς και για την ραδιοεπισήµανση µιας συγκεκριµένης ακολουθίας νουκλεοτιδίων, προκειµένου να πραγµατοποιηθεί νουκλεοτιδική ανάλυση, (sequencing). Η τεχνική αυτή µπορεί να θεωρηθεί ανάλογη της διαδικασίας αντιγραφής του DNA, διαδικασία που συµβαίνει στα κύτταρα, αφού το αποτέλεσµα είναι το ίδιο, η παραγωγή δηλαδή συµπληρωµατικών κλώνων DNA από κάποιον ήδη υπάρχοντα κλώνο. Η αρχή της µεθόδου στηρίζεται στη χρήση µιας θερµοάντοχης DNA πολυµεράσης, η οποία χρησιµοποιεί µονόκλωνο DNA ως εκµαγείο, για τη σύνθεση ενός νέου συµπληρωµατικού κλώνου. Προκειµένου να δράσει η πολυµεράση, είναι απαραίτητη η ύπαρξη ενός µικρού τµήµατος δίκλωνου DNA. Για το σκοπό αυτό, 77

91 σχεδιάζονται κατάλληλα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), τα οποία είναι συµπληρωµατικά µιας περιοχής της επιθυµητής ακολουθίας. Η τεχνική της PCR γίνεται σε τρία στάδια: Στάδιο 1 ο : Αποδιάταξη Το δίκλωνο µόριο του DNA αποδιατάσσεται µε θέρµανση σε 90 ο C-95 ο C. Με αυτόν τον τρόπο, δηµιουργούνται δυο µονόκλωνες αλυσίδες και το τµήµα που πρόκειται να πολλαπλασιαστεί, µπορεί πλέον να χρησιµοποιηθεί για τα επόµενα στάδια. Κατά τη διάρκεια αυτού του σταδίου, σταµατούν όλες οι ενζυµικές δραστηριότητες, όπως για παράδειγµα, η επιµήκυνση της νεοσυντιθέµενης αλυσίδας. Στάδιο 2 ο :Υβριδισµός Η θερµοκρασία στο στάδιο αυτό µειώνεται στους ο C και τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), υβριδίζονται µε το εκµαγείο συµπληρωµατικά, µε δεσµούς υδρογόνου. Η επιλογή της θερµοκρασίας υβριδισµού είναι πολύ σηµαντική και εξαρτάται από τη σύσταση καθώς και από το µήκος των εκκινητών. Αν η επιλεγµένη θερµοκρασία δεν είναι η σωστή, είναι δυνατό να µην παραχθούν προϊόντα ή να παραχθούν παραπροϊόντα. Στάδιο 3 ο : Πολυµερισµός Στο στάδιο αυτό η DNA πολυµεράση χρησιµοποιώντας ως εκµαγείο την µονόκλωνη αλυσίδα και αναγνωρίζοντας την ελεύθερη ΟΗ οµάδα, συνθέτει τη συµπληρωµατική αλυσίδα, προσθέτοντας νουκλεοτίδια στο 3' άκρο του εκκινητή. Η σύνθεση του DNA συνεχίζεται έως ότου οι δυο νεοσυντιθέµενες αλυσίδες επιµηκυνθούν τόσο ώστε να περιέχουν περισσότερα νουκλεοτίδια από το επιθυµητό τµήµα του DNA. Η διάρκεια του πολυµερισµού εξαρτάται από το µήκος της πολλαπλασιαζόµενης ακολουθίας. Η πολυµεράση που χρησιµοποιείται είναι θερµοάντοχη, ώστε να είναι λειτουργική στις υψηλές θερµοκρασίες των προηγούµενων σταδίων. Ο κύκλος αυτός επαναλαµβάνεται φορές και παράγονται 2n µόρια DNA, όπου n είναι ο αριθµός των διεξαγόµενων κύκλων. Στο τέλος των κύκλων, το µίγµα της αντίδρασης παραµένει στους 72 C για 5 min, ώστε να συνεχιστεί ο πολυµερισµός (Innis et al., 1990). Τα συστατικά του µίγµατος της αντίδρασης φαίνονται στον πιο κάτω πίνακα. 78

92 Πίνακας 1. Σύσταση µίγµατος και ποσότητες για κάθε αντίδραση PCR. DNA εκµαγείο ng Εκκινητής νοηµατικός (up) 20 pmol Εκκινητής αντινοηµατικός (low) 20 pmol Μίγµα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) 3.5 mm Ρυθµιστικό διάλυµα πολυµεράσης 10 x 5 µl Πολυµεράση (Taq) 1 µl H 2 0 Έως 50 µl Στην προκείµενη εργασία πολλαπλασιάστηκαν το γονίδιο της rps5, το τµήµα του γονιδίου της rps5 που περιλαµβάνει τα αµινοξέα 1 έως 37, το τµήµα του γονιδίου της S5 που περιλαµβάνει τα αµινοξέα 3 έως 204 και 38 έως 204. Οι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν για κάθε τµήµα, τα ένζυµα περιορισµού και ο πλασµιδιακός φορέας στον οποίο έγινε η κλωνοποίηση αναφέρονται στον πίνακα 2. Πίνακας 2. Ακολουθία εκκινητών, γονίδιο, ένζυµα περιορισµού και πλασµιδιακός φορέας. Εκκινητής Γονίδιο Ένζυµο Πλασµίδιο Περιορισµού 5' CTGAAT TCA TAT GAC TGA GTG GGA AGCΑ 3' rps5w/t NdeI /EcoRI pet11a (up) 1. 5' CGC GGA TCC TCA GCG GTT AGA CTT GGC 3' rps5w/t BamHI pet11a (low) 1. 5' GCG GGA TCC ATG ACT GAG TGG GAA GCA 3' rps5w/t BamHI pgex-2t (up) 2. 5' GCG GAA TTC TCA GCG GTT AGA CTT GGC 3' (low) 2. rps5w/t EcoRI pgex-2t 5' CGG AAT TCG TGG TCC ACG CCG AGC 3' (up) 3. 5' GCG GAT CCA CGC GGT TAG ACT TGG 3' (low) 3. 5' GCC GGA TCC ATG ACT GAG TGG GAA GCA 3' (up) 4. rps5w/t EcoRI pcdna- 3.1 rps5w/t BamHI pcdna- 3.1 rps5 BamHI pgex-2t

93 5' GCG GAA TTC TCA GCG GTT AGA CTT GGC 3' rps5 EcoRI pgex-2t (low) ' GCG GGA TCC TAC ATT GCT GTG AAG GAG 3' rps5 BamHI pgex-2t (up) ' GCG GAA TTC TCA GCG GTT AGA CTT GGC 3' rps5 EcoRI pgex-2t (low) ' CGC GGA TCC GAG TGG GAA GCA GCC ACA 3' rps5 BamHI pgex-2t (up) ' GCG GAA TTC TCA GCG GTT AGA CTT GCG 3' rps5 EcoRI pgex-2t (low) ' CGG GGT ACC TAC ATT GCT GTG AAG GAG 3' rps5 KpnI pegfp- (up) C1 5' CGC GGA TCC TCA GCG GTT AGA CTT GCG 3' rps5 BamHI pegfp- (low) C1 5' CGG GGT ACC GAG TGG GAA GCA GCC ACA 3' rps5 KpnI pegfp- (up) C1 5' CGC GGA TCC TCA GCG GTT AGA CTT GCG 3' rps5 BamHI pegfp- (low) C1 Στον πίνακα 3, φαίνονται αναλυτικά οι συνθήκες που χρησιµοποιήθηκαν για κάθε αντίδραση. Πίνακας 3. Συνθήκες PCR. Θερµ. Χρόνος Θερµ. Χρόνος Θερµ. Χρόνος Κύκλοι αποδιάταξης αποδιάταξης Υβριδισµού Υβριδισµού πολυµερισµού πολυµερισµού ο C 1 min 68 ο C 1 min 72 ο C 1 min ο C 1 min 62 ο C/60 ο C 40sec/40 sec 70 ο C 50 sec 15/ ο C 1 min 57 ο C/55 ο C 40sec/40 sec 72 ο C 50 sec 15/ ο C 1 min 64 ο C/62 ο C 30sec/30 sec 72 ο C 30 sec 15/ ο C 1 min 64 ο C/62 ο C 30sec/30 sec 72 ο C 30 sec 15/ ο C 1 min 62 ο C 30sec 68 ο C 30sec ο C 1 min 60 ο C/62 ο C 30sec/30 sec 68 ο C 30 sec 15/ ο C 1 min 62 ο C 30sec 68 ο C 30sec 30 80

94 Β Αντίστροφης Τρανσκριπτάσης Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης (RT-PCR) Η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης, (PCR), µπορεί να χρησιµοποιηθεί και για τον πολλαπλασιασµό τµηµάτων RNA. Η διαδικασία αυτή ονοµάζεται Αντίστροφης Τρανσκριπτάσης Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης, (RT-PCR). Αρχικά γίνεται µια αντίδραση αντίστροφης µεταγραφής, η οποία επιτρέπει τη µετατροπή του RNA σε cdna. Για την αντίδραση αυτή χρησιµοποιείται το ένζυµο αντίστροφη τρανσκριπτάση. Από τη στιγµή που θα δηµιουργηθεί το cdna, πραγµατοποιείται η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης όπως περιγράφηκε στην παράγραφο Β Η µέθοδος αυτή αποτελεί την πιο ευαίσθητη τεχνική για την ανίχνευση mrna, έστω και σε ίχνη. Είναι δε, περισσότερο ευαίσθητη και από την τεχνική του υβριδισµού κατά Northern (Innis et al., 1990). Στην παρούσα εργασία χρησιµοποιήθηκε η τεχνική της RT-PCR για την ανίχνευση mrna που αποµονώθηκε από µόνιµα επιµολυσµένους κλώνους MEL κυττάρων µε το γονίδιο της rps5. Τα συστατικά του µίγµατος της αντίδρασης φαίνονται στον πιο κάτω πίνακα. Πίνακας 4. Σύσταση µίγµατος και ποσότητες για κάθε αντίδραση PCR. RNA εκµαγείο 10-20ng Εκκινητής νοηµατικός 15pmol Εκκινητής αντινοηµατικός 15pmol Μίγµα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) 2mM Ρυθµιστικό διάλυµα πολυµεράσης 10x 5µl MgCl2 50mM 1.5mM Αντίστροφη Τρανσκριπτάση (RT) 1µl Πολυµεράση (Taq) 2µl H 2 0 Έως 50µl Οι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν φαίνονται στον πίνακα 5. 81

95 Πίνακας 5. Ακολουθία εκκινητών για RT PCR. Εκκινητής 5' GCG GGA TCC ATG ACT GAG TGG GAA GCA 3' (up) 5' TAG AAG GCA CAG TCG AGG 3' (low) Θα πρέπει να τονιστεί ότι ο αντινοηµατικός εκκινητής, (low), είναι σχεδιασµένος έτσι ώστε να περιλαµβάνει την περιοχή του πλασµιδιακού φορέα pcdna-3.1, µε τον οποίο έγινε η επιµόλυνση των κυττάρων MEL, η οποία κωδικοποιεί τα γονίδια για το myc επιτόπο και την ουρά των έξι ιστιδινών. Έτσι, είναι δυνατή η διάκριση του mrna της εξωγενούς rps5, από αυτό της ενδογενούς, λόγω µεγαλύτερης µοριακής µάζας. Οι συνθήκες της αντίδρασης φαίνονται στον πιο κάτω πίνακα. Πίνακας 6. Συνθήκες RT PCR. Θερµοκρασίες αντίστροφης µεταγραφής Χρόνος αντίστροφης µεταγραφής 68 o C -50 o C -55 o C 2min -10min -10min Θερµ. Χρόνος Θερµ. Χρόνος Θερµ. Χρόνος Κύκλοι αποδιάταξης αποδιάταξης Υβριδισµού Υβριδισµού πολυµερισµού πολυµερισµού ο C 40sec 60 ο C/58 ο C 40sec/40sec 72 ο C 1 min 20/20 Β Εισαγωγή σηµειακής µετάλλαξης µε την τεχνική του σχεδιασµού megaprimer Όπως αναφέρθηκε στην παράγραφο Β.2.12, η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης, (PCR), χρησιµοποιείται και για την εισαγωγή σηµειακών µεταλλάξεων σε ένα τµήµα DNA. Στην περίπτωση αυτή, απαιτείται ο σχεδιασµός και η χρήση τριών συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων. Το πλεονέκτηµα της συγκεκριµένης τεχνικής έγκειται στο ότι επιτρέπει τη γρήγορη και αποτελεσµατική εισαγωγή σηµειακής µετάλλαξης, χωρίς να είναι απαραίτητος ο καθαρισµός των ενδιάµεσων προϊόντων. Τα τρία ολιγονουκλεοτίδια, (εκκινητές), που απαιτούνται είναι: ο 5'-εκκινητής (συµπληρωµατικός ως προς το 5'-άκρο του εκµαγείου), ο 3'-εκκινητής 82

96 (συµπληρωµατικός ως προς το 3'-άκρο του εκµαγείου) και ο megaprimer (συµπληρωµατικός µιας ακολουθίας περίπου 10 κωδικονίων της περιοχής του γονιδίου στην οποία πρόκειται να εισαχθεί η µετάλλαξη, που περιέχει όµως αλλαγµένη τη βάση ή τις βάσεις). Η PCR γίνεται σε τρεις φάσεις. Φάση 1 η : Το µίγµα της αντίδρασης αποτελείται από τα συστατικά που φαίνονται στον παρακάτω πίνακα. Πίνακας 7. Σύσταση µίγµατος και ποσότητες για κάθε αντίδραση PCR. DNA εκµαγείο 10-20ng Εκκινητής νοηµατικός (5 ) 10 pmol Εκκινητής megaprimer 10pmol Μίγµα δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps) 3.5mM Ρυθµιστικό διάλυµα πολυµεράσης 10x 10µl Πολυµεράση (Taq) 2µl H 2 0 Έως τα 100µl Γίνονται 10 κύκλοι της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης, (αποδιάταξη, υβριδισµός, πολυµερισµός). Φάση 2 η : Όταν τελειώσουν οι 10 κύκλοι της 1 ης φάσης, προστίθεται στο µίγµα της αντίδρασης ο 3'-εκκινητής κι επαναλαµβάνονται άλλοι 10 κύκλοι της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης. Φάση 3 η : Mετά το τέλος της 2 ης φάσης, προστίθεται πάλι ο 5'-εκκινητής και εφαρµόζονται άλλοι 10 κύκλοι της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης. Στο τέλος, έχει πλέον συντεθεί το τµήµα του DNA µε την επιθυµητή µετάλλαξη. Η διαδοχική προσθήκη των εκκινητών, γίνεται προκειµένου να αυξηθεί το ποσοστό παρασκευής της µεταλλαγµένης ακολουθίας, σε σχέση µε την αρχική (Picard et al., 1994). Στην προκείµενη εργασία, χρησιµοποιήθηκε η συγκεκριµένη τεχνική προκειµένου να γίνει µετάλλαξη τεσσάρων αµινοξέων στο άµινοτελικό άκρο της rps5. Τα δυο από τα αµινοξέα είναι, σύµφωνα µε πληροφορίες από βάσεις δεδοµένων, πιθανοί στόχοι φωσφορυλίωσης από την κινάση της καζεΐνης ΙΙ, (CKII), [S(24)G, S(34)G]. Τα άλλα δυο, [T(8)G, T(14)G], υπάρχει πιθανότητα να 83

97 φωσφορυλιώνονται από την p38map κινάση το πρώτο και από µια άλλη κινάση, το δεύτερο. Οι εκκινητές, (megaprimers), που χρησιµοποιήθηκαν φαίνονται στον πίνακα που ακολουθεί. Πίνακας 8. Ακολουθία εκκινητών για την εισαγωγή σηµειακής µετάλλαξης. Εκκινητής Μετάλλαξη 5' CTC TGC CAC CGC TGG CCC GGC TGC TTC CCA 3' 1. T(8)G 1. 5' GAG CTT GAT GTC AGG CCC CTC TGC CAC CGC 3' 2. T(14)G 2. 5' CTG CAC GTC ATC AGT CCC CCA TTT CCC AAA GAG 3' 3. S(24)G 3. 5' AAT GTA ATC CTG CAG CCC AAT ATC GTT GAT CTG 3' 4. S(34)G 4. Οι συνθήκες της αντίδρασης φαίνονται στον πίνακα 9. Πίνακας 9. Συνθήκες της PCR για την εισαγωγή σηµειακής µετάλλαξης. Θερµ. Χρόνος Θερµ. Χρόνος Θερµ. Χρόνος Κύκλοι αποδιάταξης αποδιάταξης Υβριδισµού Υβριδισµού πολυµερισµού πολυµερισµού ο C 1min 59 ο C 1min 72 ο C 1 min ο C 1min 56 ο C 1min 72 ο C 1 min ο C 1min 56 ο C 1min 72 ο C 1 min ο C 1min 52 ο C 1min 72 ο C 1 min 10 B Καθαρισµός τµηµάτων DNA µετά από PCR Τα τµήµατα DNA που προκύπτουν από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης, (PCR), ή µετά από πέψη µε ενδονουκλεάσες περιορισµού, προκειµένου να χρησιµοποιηθούν σε άλλες αντιδράσεις, θα πρέπει να διαχωριστούν από τους εκκινητές, το εκµαγείο, τα δεοξυριβονουκλεοτίδια, τα άλατα και την πολυµεράση, ή τα αντίστοιχα ένζυµα. Ο καθαρισµός των τµηµάτων αυτών DNA γίνεται µε το σύστηµα Qiaquick PCR Purification Kit της εταιρείας Qiagen. Στο µίγµα της αντίδρασης προστίθενται 5 όγκοι διαλύµατος PB, το οποίο περιέχει έναν χαοτροπικό παράγοντα, ακολουθεί ανάµιξη και διαβίβαση του συνολικού όγκου στη στήλη Qiaquick. Κατόπιν, γίνεται φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο για ένα λεπτό σε x g. Το DNA δεσµεύεται στη στήλη, ενώ τα υπόλοιπα συστατικά αποµακρύνονται µε τη φυγοκέντρηση. Ακολουθεί πλύσιµο της στήλης µε το αιθανολικό διάλυµα PE και 84

98 τελικά γίνεται έκλουση του DNA µε µl αποστειρωµένου δις-απεσταγµένου νερού. Στη συνέχεια, ηλεκτροφορείται µια µικρή ποσότητα από το εκλουόµενο DNA, προκειµένου να ελεγχθεί για την καθαρότητά του, (Qiaquick Spin Handbook, Qiagen 1996). B Καθαρισµός τµηµάτων DNA από πηκτή αγαρόζης H µέθοδος αυτή χρησιµοποιείται όπως και η προηγούµενη, (Β.2.16.), για τον καθαρισµό τµηµάτων DNA µετά από πέψη µε ενδονουκλεάσες περιορισµού, όταν η πέψη γίνεται διαδοχικά ή έπειτα από τον πολλαπλασιασµό τους µε την Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης, (PCR). Χρησιµοποιείται το Qiaquick Gel Extraction Kit της εταιρείας Qiagen. Η αρχή του συστήµατος αυτού στηρίζεται στην ιδιότητα του DNA να προσροφάται σε µικρές στήλες που περιέχουν µεµβράνη από silica gel, παρουσία υψηλής συγκέντρωσης αλάτων, ενώ οι προσµίξεις διέρχονται από τις στήλες χωρίς να συγκρατηθούν. Η διαδικασία έχει ως εξής: Το επιθυµητό τµήµα του DNA αποκόπτεται από την πηκτή και τοποθετείται σε σωλήνα µικροφυγοκέντρησης, (eppendorf). Κατόπιν, προστίθεται διάλυµα διαλυτοποίησης της αγαρόζης, QG, σε αναλογία 300 µl/ 100mg πηκτής. Ακολουθεί θέρµανση στους 50 ο C για 10 λεπτά µε περιοδική ανάδευση, προκειµένου να διαλυτοποιηθεί η αγαρόζη. Στη συνέχεια, το µίγµα αυτό διαβιβάζεται σε στήλη Qiaquick και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο για ένα λεπτό σε x g. Το DNA συγκρατείται στη στήλη και ξεπλένεται από τις προσµίξεις µε τη διαβίβαση του αιθανολικού διαλύµατος PE. H έκλουση του DNA γίνεται µε µl αποστειρωµένου δις-απεσταγµένου νερού ή ΤΕ, (10 mm Tris- HCl, 1 mm EDTA ph 8.0). Κατόπιν, ηλεκτροφορείται µια µικρή ποσότητα από το εκλουόµενο DNA, προκειµένου να ελεγχθεί για την καθαρότητά του και για να διαπιστωθεί κατ εκτίµηση η ποσότητα του DNA που αποµονώθηκε, (Qiaquick Spin Handbook, Qiagen 1996). B Κλωνοποίηση τµηµάτων DNA σε πλασµιδιακούς φορείς Κατά την κλωνοποίηση, γίνεται εισαγωγή ενός τµήµατος DNA στο γονιδίωµα ενός αυτόνοµα πολλαπλασιαζόµενου γενετικού στοιχείου, ιού ή πλασµιδίου. Οι πλασµιδιακοί φορείς που χρησιµοποιούνται για την κλωνοποίηση είναι µικρά κυκλικά µόρια δίκλωνου DNA, που µπορούν να αναπτύσσονται ηµι-αυτόνοµα σε βακτήρια και φέρουν γονίδια που τους προσδίδουν αντίσταση σε συγκεκριµένα 85

99 αντιβιοτικά. Τόσο ο πλασµιδιακός φορέας, όσο και το ξένο τµήµα του DNA που πρόκειται να εισαχθεί σε αυτόν, επωάζονται µε τις ίδιες ενδονουκλεάσες περιορισµού και στη συνέχεια, επανακυκλοποιούνται συνδεόµενα οµοιοπολικά στα άκρα τους µε τη δηµιουργία φωσφοδιεστερικού δεσµού, αντίδραση που καταλύεται από µια DNA λιγάση (Sambrook et al., 1989). Οι πλασµιδιακοί φορείς που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία είναι οι εξής: pet11a, pgex-2t, pcdna-3.1 και pegfp-c1. Ο πλασµιδιακός φορέας pet11a, έχει µέγεθος 5900 ζεύγη βάσεων, και περιέχει στο µόριο του έναν tac προαγωγέα για την επαγωγή της έκφρασης του κλωνοποιηµένου γονιδίου, το γονίδιο laq I q που παράγει τον αναστολέα του οπερονίου της λακτόζης και το γονίδιο που του προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αµπικιλλίνη. Προκειµένου να γίνει εισαγωγή του τµήµατος DNA που µας ενδιαφέρει στο πλασµίδιο αυτό, γίνεται πέψη και των δυο µε τις ενδονουκλεάσες περιορισµού Nde I και BamH I. Ο πλασµιδιακός φορέας pgex-2t έχει µέγεθος 4948 ζεύγη βάσεων και περιέχει κι αυτός στο µόριο του έναν tac προαγωγέα για την επαγωγή της έκφρασης του κλωνοποιηµένου γονιδίου, το γονίδιο laq I q που παράγει τον αναστολέα του οπερονίου της λακτόζης, το γονίδιο ανθεκτικότητας στην αµπικιλλίνη καθώς και το γονίδιο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης, (GST). Η περιοχή κλωνοποίησης του πλασµιδίου, που βρίσκεται δίπλα στο γονίδιο της GST, περιέχει µεταξύ των άλλων θέσεις για τη διάσπαση του πλασµιδίου από τις ενδονουκλεάσες περιορισµού BamH I και EcoR I. Με τα δυο αυτά ένζυµα, γίνεται και η πέψη του τµήµατος DNA που προορίζεται για την κλωνοποίηση στο πλασµίδιο αυτό. Ο πλασµιδιακός φορέας pcdna-3.1, έχει µέγεθος 5500 ζεύγη βάσεων και επιτρέπει την έκφραση των κλωνοποιηµένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών, ως πρωτεΐνες σύντηξης στο καρβοξυτελικό τους άκρο µε την ακολουθία του myc επιτόπιου καθώς και µε έξι ιστιδίνες, προκειµένου να είναι δυνατή η ανίχνευση της παραγόµενης πρωτεΐνης. Ο φορέας αυτός είναι κατάλληλος για µόνιµη, καθώς και για παροδική επιµόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων µε το κλωνοποιηµένο τµήµα DNA. Η µεταγραφή των τµηµάτων DNA καθοδηγείται από τη ρυθµιστική περιοχή του προαγωγού του human cytomegalovirus, (CMV). Παρουσιάζει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό αµπικιλλίνη, ενώ περιέχει και γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στη νεοµυκίνη, έτσι ώστε να είναι δυνατή η επιλογή των κυττάρων στα οποία έχει γίνει η εισαγωγή του πλασµιδίου µε το τµήµα του 86

100 DNA. Η πέψη τόσο του πλασµιδίου όσο και του DNA, γίνεται χρησιµοποιώντας τα ένζυµα περιορισµού BamH I και EcoR I. Ο πλασµιδιακός φορέας pegfp-c1, έχει µέγεθος 4700 ζεύγη βάσεων και επιτρέπει την έκφραση των κλωνοποιηµένων γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα θηλαστικών ως πρωτεΐνες σύντηξης στο άµινοτελικό τους άκρο µε την GFP, (Green Fluorescent Protein). Ο φορέας αυτός, είναι κατάλληλος για παροδική επιµόλυνση ευκαρυωτικών κυττάρων µε το κλωνοποιηµένο τµήµα DNA. Η µεταγραφή των τµηµάτων DNA, καθοδηγείται από τη ρυθµιστική περιοχή του προαγωγού του human cytomegalovirus, (CMV) και παρουσιάζει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό καναµυκίνη. Προκειµένου να γίνει εισαγωγή του τµήµατος DNA που µας ενδιαφέρει στο πλασµίδιο αυτό, γίνεται πέψη και των δυο, µε τις ενδονουκλεάσες περιορισµού Kpn I και BamH I. Β Πέψη µε ενδονουκλεάσες περιορισµού Προκειµένου να γίνει πέψη µε ένζυµα περιορισµού, το µίγµα της αντίδρασης περιλαµβάνει: το DNA, (που µπορεί να είναι γενωµικό DNA, πλασµιδιακός φορέας, ή το τµήµα του DNA που πρόκειται να κλωνοποιηθεί), το κατάλληλο ρυθµιστικό διάλυµα στο οποίο τα ένζυµα περιορισµού εµφανίζουν τη βέλτιστη δράση, τα ένζυµα περιορισµού και σε ορισµένες περιπτώσεις, όταν αυτό απαιτείται, αλβουµίνη. Ο συνολικός όγκος του µίγµατος κυµαίνεται από 20 έως 50 µl. Η αντίδραση πραγµατοποιείται συνήθως στους 37 ο C, εκτός από πολύ λίγες εξαιρέσεις. Η ποσότητα των ενζύµων που χρησιµοποιούνται δεν πρέπει να ξεπερνά το 10% v/v του συνολικού όγκου της αντίδρασης, διαφορετικά, υπάρχει περίπτωση να γίνει µη εξειδικευµένη πέψη, εξαιτίας της υψηλής συγκέντρωσης των ενζύµων ή της υψηλής συγκέντρωσης γλυκερόλης στο µίγµα της αντίδρασης. Ο χρόνος επώασης είναι συνήθως δυο ώρες. Μερικές φορές όµως, για τα τµήµατα του DNA που προέρχονται από PCR και πρόκειται να κλωνοποιηθούν, απαιτείται µεγαλύτερος χρόνος επώασης, γιατί οι θέσεις αναγνώρισης από τα ένζυµα περιορισµού είναι πολύ κοντά στα άκρα, µε αποτέλεσµα να δυσχεραίνεται η πέψη. Στην προκείµενη εργασία κλωνοποιήθηκε το γονίδιο της rps5 στο πλασµίδιο pet11a. Το ίδιο γονίδιο κλωνοποιήθηκε στον πλασµιδιακό φορέα pgex-2t, ενώ στο πλασµίδιο αυτό κλωνοποιήθηκαν και τα τµήµατα του γονιδίου της rps5 που περιλαµβάνουν τα αµινοξέα 1-37, και , δηλαδή τα S5 1-37, S και S Στο πλασµίδιο pcdna-3.1 κλωνοποιήθηκε το γονίδιο της rps5, ενώ στον 87

101 πλασµιδιακό φορέα pegfp-c1, έγινε η κλωνοποίηση των S και S Τέλος, στα δυο πλασµίδια pgex-2t και pegfp-c1, κλωνοποιήθηκαν και 2 µεταλλαγµένες µορφές της S5. Οι συνθήκες της αντίδρασης για κάθε πλασµίδιο και για κάθε τµήµα DNA που επρόκειτο να κλωνοποιηθεί στο εκάστοτε πλασµίδιο φαίνονται παρακάτω: Nde I (10 U/µl) : 20 U BamH I (20 U/µl) : 20 U pet11a/τµήµα DNA : 10/20 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 2/5 µl BSA (10x) : 2/5 µl H 2 O : µέχρι 20/50 µl Επώαση στους 37 ο C για 2 ώρες ή περισσότερες από δυο ώρες. Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος 10 x είναι : 1.5 Μ ΝaCl, 100 mm Tris-HCl ph 7.9, 100 mm MgCl 2, 10 mm DTT. Το ρυθµιστικό διάλυµα είναι εκείνο που συνοδεύει το ένζυµο περιορισµού BamH I. EcoR I (20 U/µl) : 20 U BamH I (20 U/µl) : 20 U pgex-2t/ τµήµα DNA : 10/20 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 2/5 µl BSA(10x) : 2/5 µl H 2 O : µέχρι 20/50 µl Επώαση στους 37 ο C για 2 ώρες ή περισσότερες από δυο ώρες. Η σύσταση του ρυθµιστικού διαλύµατος 10x είναι : 500 mm NaCl, 1 M Tris-HCl ph 7.5, 100 mm MgCl 2, 0,25% Triton X-100. Το συγκεκριµένο διάλυµα είναι αυτό που συνοδεύει το ένζυµο περιορισµού EcoR I. EcoR I (20 U/µl) : 20 U BamH I (20 U/µl) : 20 U pcdna-3.1/ τµήµα DNA : 10/20 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 2/5 µl BSA (10x) : 2/5 µl H 2 O : µέχρι 20/50 µl 88

102 Επώαση στους 37 ο C για 2 ώρες ή περισσότερες από δυο ώρες. Το ρυθµιστικό διάλυµα που χρησιµοποιείται είναι αυτό που συνοδεύει το ένζυµο περιορισµού EcoR I. Kpn I (10 U/µl) : 20 U pegfp-c1/ τµήµα DNA : 10/20 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 2/5 µl BSA (10x) : 2/5 µl H 2 O : µέχρι 20/50 µl Επώαση στους 37 ο C για 2 ώρες ή περισσότερες από δυο ώρες. Το ρυθµιστικό διάλυµα που χρησιµοποιείται είναι αυτό που συνοδεύει την Kpn I, (I) και η σύστασή του είναι η εξής: 100mM Bis Tris Propane-HCl ph 7.0, 100mM MgCL 2, 10mM DDT. Στη συνέχεια, το πλασµίδιο ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης και ακολουθεί καθαρισµός από την πηκτή, (Β.2.17.). Το τµήµα του DNA καθαρίζεται όπως περιγράφηκε στην παράγραφο Β Κατόπιν, γίνεται επώαση τόσο του πλασµιδίου, όσο και του DNA µε το δεύτερο ένζυµο περιορισµού. BamH I (20 U/µl) : 20 U pegfp-c1/ τµήµα DNA : 10/20 µg Ρυθµιστικό διάλυµα 10x : 2/5 µl BSA (10x) : 2/5 µl H 2 O : µέχρι 20/50 µl Επώαση στους 37 ο C για 2 ώρες ή περισσότερες από δυο ώρες. Το ρυθµιστικό διάλυµα είναι αυτό που συνοδεύει την BamH I. Όταν πρόκειται για πέψη πλασµιδίων, γίνεται επώαση πρώτα µε το ένα ένζυµο, ακολουθεί καθαρισµός από την πηκτή αγαρόζης και µετά επώαση µε το δεύτερο ένζυµο. Ο λόγος που γίνεται η διαδοχική πέψη, είναι προκειµένου να επιβεβαιωθεί ότι µετά την πέψη µε το πρώτο ένζυµο, το πλασµίδιο δεν είναι πια κυκλικό, αλλά γραµµικό, κι αυτό πιστοποιείται από τη διαφορετική ηλεκτροφορητική εικόνα που παρουσιάζουν οι δυο µορφές του πλασµιδίου. ιαδοχική επώαση µε τα δυο ένζυµα γίνεται, όταν αυτά δεν είναι συµβατά για να γίνει ταυτόχρονη επώαση. Οι πληροφορίες αυτές δίνονται αναλυτικά στον κατάλογο της εταιρείας NEBiolabs, στο κεφάλαιο που αφορά στις ενδονουκλεάσες περιορισµού. 89

103 Β Αντίδραση λιγάσης Προκειµένου να γίνει η ενσωµάτωση του τµήµατος του DNA που µας ενδιαφέρει στον αντίστοιχο πλασµιδιακό φορέα, χρησιµοποιείται µια DNA λιγάση. Η αναλογία των δυο αντιδρώντων είναι συνήθως 6:1. Στην προκείµενη εργασία χρησιµοποιήθηκε το Rapid ligation kit, της εταιρείας Roche. Οι συνθήκες της αντίδρασης περιγράφονται αναλυτικά παρακάτω: DNA πλασµιδιακού φορέα : 10 ng DNA τµήµατος που θα ενσωµατωθεί : 60 ng Ρυθµιστικό διάλυµα αραίωσης του DNA 5x(DNA Dilution buffer): 2 µl H 2 O : µέχρι τα 10 µl Ανάµιξη των συστατικών κι αµέσως µετά προσθήκη στο ίδιο µίγµα Ρυθµιστικό διάλυµα της Τ4 DNA λιγάσης 2x : 10 µl T4 DNA λιγάση (5 units/µl) : 1 µl Ο συνολικός όγκος της αντίδρασης µετά από την προσθήκη της λιγάσης είναι 21 µl. H επώαση γίνεται για 45 λεπτά, σε θερµοκρασία δωµατίου. Η πιο πάνω αντίδραση της λιγάσης γίνεται και απουσία του τµήµατος DNA που πρόκειται να ενσωµατωθεί στο πλασµίδιο, προκειµένου να ελεγχθεί το ποσοστό επανακυκλοποίησης του πλασµιδιακού φορέα, χωρίς την παρεµβολή του ξένου DNA. Αν παρατηρηθεί µεγάλο τέτοιο ποσοστό, κρίνεται σκόπιµο να γίνει αποφωσφορυλίωση του πλασµιδίου πριν αυτό χρησιµοποιηθεί για την αντίδραση της λιγάσης. Στη συγκεκριµένη εργασία, η φωσφατάση που χρησιµοποιήθηκε είναι της εταιρείας Roche. Η αντίδραση αποφωσφορυλίωσης γίνεται ως εξής: DNA πλασµιδιακού φορέα : 100 ng Ρυθµιστικό διάλυµα φωσφατάσης 10x : 2/3 µl SAP : 1 µl H 2 O : µέχρι τα 20/30 µl Επώαση για 30 λεπτά στους 37 ο C. Μετά το τέλος της επώασης, ακολουθεί απενεργοποίηση του ενζύµου στους 65 ο C για 15 λεπτά. Τελικά, το πλασµίδιο καθαρίζεται όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.16, και µπορεί πλέον να χρησιµοποιηθεί για την αντίδραση της λιγάσης 90

104 B Προετοιµασία επιδεκτικών για µετασχηµατισµό βακτηρίων (competent cells) Η τεχνική αυτή έχει ως σκοπό να καταστήσει ικανά, (επιδεκτικά), τα βακτηριακά κύτταρα, προκειµένου να γίνει εισαγωγή του πλασµιδιακού DNA σε αυτά (Sambrook et al., 1989). B Μέθοδος των δυο διαλυµάτων CaCl 2 Η µέθοδος αυτή στηρίζεται στην παρατήρηση των Mandel και Higa ότι τα βακτήρια, έπειτα από κατεργασία µε ψυχρά διαλύµατα CaCl 2, είναι ικανά να προσλάβουν DNA προερχόµενο από διάφορες πηγές. Η συγκεκριµένη τεχνική εφαρµόστηκε στα στελέχη E.coli XL1 και BL21(DE3) και αναλυτικά έχει ως εξής: 3 ml θρεπτικού υλικού LB, (Tryptone 1% w/v, Yeast extract 0.5% w/v, NaCl 1%), εµβολιάζονται µε κύτταρα Ε. coli, (XL1 ή BL21), και αφήνονται να αναπτυχθούν µε ανακίνηση στους 37 ο C για ώρες. Στη συνέχεια, 10 ml LB εµβολιάζονται µε 100 µl αυτής της καλλιέργειας και ακολουθεί επώαση στους 37 ο C, µέχρις ότου η απορρόφηση φθάσει ~ 0,3, (αρχή της λογαριθµικής φάσης), στα 600 nm. Αµέσως µετά η καλλιέργεια τοποθετείται στον πάγο για 10 λεπτά, προκειµένου να σταµατήσει η ανάπτυξη των κυττάρων κι ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 9000 x g για 10 λεπτά. Κατόπιν, αφού γίνει απόχυση του υπερκειµένου, τα κύτταρα αιωρούνται σε 5 ml CaCl mm, (1/2 του αρχικού όγκου της καλλιέργειας). Τα κύτταρα παραµένουν για 20 λεπτά στον πάγο και ακολουθεί νέα φυγοκέντρηση σε 9000 x g για άλλα 10 λεπτά. Τo υπερκείµενο αποµακρύνεται προσεκτικά και τελικά τα κύτταρα αιωρούνται σε 1 ml CaCl 2 50 mm και παραµένουν στον πάγο για 45 λεπτά, οπότε και είναι έτοιµα να δεχθούν το DNA. Για κάθε δείγµα DNA χρησιµοποιούνται 200 µl επιδεκτικών κυττάρων (Mandel και Higa, 1970). B Μέθοδος CaCl 2 Η µέθοδος αυτή στηρίζεται, όπως και αυτή της παραγράφου Β , στην ιδιότητα του CaCl 2 να δηµιουργεί επιδεκτικά βακτηριακά κύτταρα για την εισαγωγή DNA. Μπορεί να εφαρµοστεί στα στελέχη E.coli XL1, BL21(DE3) και TOP 10. Τα διαλύµατα που χρησιµοποιούνται είναι τα εξής: 91

105 ιάλυµα TFB-I ph 7.0 CH 3 COOK MnCl 2 KCl CaCl 2 30mM 50mM 100mM 10mM Γλυκερόλη 15 % v/v ιάλυµα TFB-II ph7.0 MOPS CaCl 2 KCl Γλυκερόλη 10mM 75mM 100mM 15 % v/v 3 ml θρεπτικού υλικού LB ή TYM εµβολιάζονται µε βακτηριακά κύτταρα, παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού, [15 µg/ml τετρακυκλίνη, (XL1), 20 µg/ml στρεπτοµυκίνη (TOP 10)]. Η καλλιέργεια αυτή επωάζεται για ώρες στους 37 C, υπό ανακίνηση. Ακολούθως, εµβολιάζονται 3ml θρεπτικού υλικού, παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού, µε 150 µl από την προηγούµενη καλλιέργεια. Κατόπιν, εµβολιάζονται 50 ml θρεπτικού υλικού που περιέχουν το κατάλληλο αντιβιοτικό, ανάλογα µε το είδος των κυττάρων που χρησιµοποιούνται, µε 1 ml από την καλλιέργεια αυτή. Ακολουθεί επώαση της καλλιέργειας στους 37 C, µέχρις ότου η απορρόφηση στα 600 nm να φθάσει το Η καλλιέργεια στη συνέχεια ψύχεται στον πάγο για 10 λεπτά, και ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 5000 x g για 20 λεπτά, στους 4 C. Το υπερκείµενο αποχύνεται και τα κύτταρα αιωρούνται σε 25 ml, (που αντιστοιχούν στο 1/2 του όγκου της καλλιέργειας), διαλύµατος TFB-I και αφήνονται στον πάγο για 10 λεπτά. Κατόπιν, φυγοκεντρούνται για 20 λεπτά σε 4000 x g και τα κύτταρα αιωρούνται τελικά σε 1 ml διαλύµατος TFB-II. Το αιώρηµα που προκύπτει, χωρίζεται σε σωλήνες µικροφυγοκέντρου, (eppendorf), σε κλάσµατα των µl και αυτά εµβαπτίζονται για µικρό χρονικό διάστηµα σε λουτρό, στο οποίο έχει προστεθεί ξηρός πάγος/αιθανόλη. Με τη διαδικασία αυτή, επιτυγχάνεται η άµεση ψύξη των κλασµάτων, τα οποία µπορούν κατόπιν να διατηρηθούν για µεγάλο χρονικό διάστηµα στους 70 C και να χρησιµοποιούνται όταν απαιτείται. 92

106 Β Εισαγωγή πλασµιδίου σε κύτταρα E. coli (µετασχηµατισµός) Τα επιδεκτικά κύτταρα µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την εισαγωγή σε αυτά πλασµιδιακού DNA, (καθαρού ή προϊόντος κλωνοποίησης). Στο αιώρηµα των επιδεκτικών βακτηρίων, ( µl), προστίθενται ng πλασµιδιακού DNA ή 7-10 µl του µίγµατος της αντίδρασης της λιγάσης και ακολουθεί επώαση για 45 λεπτά στον πάγο. Στη συνέχεια, το µίγµα των κυττάρων µε το DNA υπόκειται σε θερµικό σοκ στους 42 ο C για 2 λεπτά και αµέσως µετά ψύχεται για 1 λεπτό. Στο µίγµα προστίθενται µl LB και γίνεται επώαση για 30 λεπτά στους 37 ο C, προκειµένου να αρχίσει η ανάπτυξη των κυττάρων. Κατόπιν, το µίγµα της επώασης φυγοκεντρείται σε 6000 x g για 2 λεπτά και αποµακρύνεται το υπερκείµενο, ( µl), ενώ τα κύτταρα αιωρούνται στα υπόλοιπα µl του LB. Το αιώρηµα µε τα µετασχηµατισµένα βακτηριακά κύτταρα, απλώνεται στην επιφάνεια τρυβλίου µε θρεπτικό υλικό LB-άγαρ και το κατάλληλο αντιβιοτικό. Κατόπιν, τα τρυβλία επωάζονται στους 37 ο C για ώρες. Τα πλασµίδια προσδίδουν στα κύτταρα ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό, µε αποτέλεσµα οι αποικίες που εµφανίζονται στα τρυβλία να αποτελούνται αποκλειστικά και µόνο από κύτταρα που περιέχουν τον πλασµιδιακό φορέα, (µόνο του ή ανασυνδυασµένο) (Sambrook et al., 1989). Β Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA Β Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µε αλκαλική λύση και καθαρισµός µε φαινόλη/χλωροφόρµιο / ισοαλυλική αλκοόλη Μια αποικία από τα µετασχηµατισµένα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε στερεό θρεπτικό υπόστρωµα παρουσία κατάλληλου αντιβιοτικού, χρησιµοποιείται για τον εµβολιασµό 3 ml θρεπτικού υλικού, στο οποίο έχει προστεθεί επίσης αντιβιοτικό. Η καλλιέργεια αφήνεται να αναπτυχθεί µε ανάδευση, για ώρες στους 37 ο C. 1.5 ml από την καλλιέργεια µεταφέρεται σε σωλήνα µικροφυγοκέντρου, (eppendorf), και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g. Ακολουθεί απόχυση του υπερκειµένου και στο ίζηµα προστίθενται 50 µl ψυχρού διαλύµατος που περιέχει 50mM γλυκόζη, 25mM Tris-HCl ph 8.0 και 10mM EDTA ph 8.0. Μετά από έντονη ανάδευση, στο ίδιο διάλυµα προστίθενται 100µl πρόσφατα παρασκευασµένου διαλύµατος 0.2Ν NaOH και 1% w/v SDS. Το µίγµα οµογενοποιείται µε απλή ανακίνηση του σωλήνα και αφήνεται για 5 λεπτά σε θερµοκρασία περιβάλλοντος. 93

107 Κατόπιν, ακολουθεί προσθήκη 80µl ψυχρού διαλύµατος CH 3 COOK 5M και έπειτα από έντονη ανάδευση ακολουθεί φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε x g. Με τη φυγοκέντρηση αποµακρύνονται τα µεµβρανικά συστατικά, οι πρωτεΐνες, το χρωµοσωµικό DNA και το SDS. Στο υπερκείµενο προστίθενται 2.5 όγκοι ψυχρής EtOH 100% και στη συνέχεια αυτό αφήνεται στους -20 ο C για 30 λεπτά. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η κατακρήµνιση του DNA. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε x g. Το ίζηµα αιωρείται σε 50 µl διαλύµατος ΤΕ, (10 mm Tris-ΗCl, 10 mm EDTA, ph 8.0), παρουσία RNase A, (20 µg/ml), και επωάζεται στους 37 C για 30 λεπτά. Ακολουθεί προσθήκη 50 µl επιπλέον TE και κατόπιν, γίνεται εκχύλιση του DNA µε προσθήκη 1 όγκου µίγµατος φαινόλης/ χλωροφορµίου/ ισοαµυλικής αλκοόλης, σε αναλογία 25:24:1. Η διαδικασία αυτή επαναλαµβάνεται άλλη µια φορά. Στο τέλος γίνεται µια ακόµη εκχύλιση µε την προσθήκη 1 όγκου χλωροφορµίου/ ισοαµυλικής αλκοόλης σε αναλογία 24:1, για την αποµάκρυνση της εναποµένουσας φαινόλης. Κάθε φορά αποµονώνεται η υδατική στοιβάδα έπειτα από φυγοκέντρηση για 2 λεπτά σε x g. Στο τέλος, προστίθενται 1/10 όγκου CH 3 COONa 3M ph 5.2 και 2.5 όγκοι ψυχρής EtOH 100% και ύστερα από παραµονή στους -20 ο C για 30 λεπτά και φυγοκέντρηση, το DNA διαλύεται τελικά σε 20 µl αποστειρωµένου διςαπεσταγµένου νερού και φυλάσσεται στους -20 C µέχρι τη χρησιµοποίηση του (Sambrook et al., 1989). Β Αποµόνωση πλασµιδιακού DNA χρησιµοποιώντας kit της εταιρείας Qiagen (mini prep) Σε 3 ml θρεπτικού υλικού LB παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού, προστίθεται µια αποικία και η καλλιέργεια αναπτύσσεται µε ανάδευση στους 37 ο C για ώρες. 1.5 ml της πλήρους ανεπτυγµένης καλλιέργειας, µεταφέρονται σε σωλήνα µικροφυγοκέντρου, (eppendorf), και φυγοκεντρείται στις x g για 1 λεπτό. Ακολουθεί απόχυση του υπερκειµένου και αιώρηση των κυττάρων σε 250 µl διαλύµατος P1. Στη συνέχεια γίνεται προσθήκη 250 µl διαλύµατος P2 και ήπια ανάδευση. Έπειτα από παραµονή 5 λεπτών σε θερµοκρασία δωµατίου, προστίθενται 350 µl διαλύµατος Ν3 και έπειτα από εντονότερη ανάδευση γίνεται φυγοκέντρηση σε x g για 10 λεπτά, για το διαχωρισµό του χρωµοσωµικού από το πλασµιδιακό DNA των βακτηρίων. Το υπερκείµενο διαβιβάζεται στη στήλη Qiagen tip-10 και γίνεται φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε x g. Το DNA συγκρατείται στη στήλη, 94

108 ενώ οι πρωτεΐνες διέρχονται. Για την αποµάκρυνση τυχόν προσµίξεων γίνεται πλύση µε αιθανολικό διάλυµα PB. Το διάλυµα αποµακρύνεται µε διπλή φυγοκέντρηση σε x g, για 1 λεπτό. Η έκλουση του πλασµιδιακού DNA από τη στήλη γίνεται µε 30µl αποστειρωµένου δις-απεσταγµένου νερού. Για την αποµόνωση πλασµιδιακού DNA σε µεγάλες ποσότητες, χρησιµοποιούνται οι στήλες Qiagen tip-100. Στην περίπτωση αυτή, γίνεται εµβολιασµός 50 ή 100 ml θρεπτικού υλικού LB, παρουσία του κατάλληλου αντιβιοτικού, από µια µικρότερη καλλιέργεια. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι ανάλογη αυτής που περιγράφηκε πιο πάνω, (Qiagen Plasmid Purification Handbook, 1997). Β Προσδιορισµός του ρυθµού της κυτταρικής ανάπτυξης Για τον προσδιορισµό του ρυθµού της κυτταρικής αναπαραγωγής των κυττάρων MEL στις καλλιέργειες, γίνεται µέτρηση του αριθµού των κυττάρων ανά µονάδα όγκου, (ml), θρεπτικού υγρού σε διάφορες χρονικές στιγµές (0.2,4,8,12,16,24,48,72,96 ώρες). Η µέτρηση των κυττάρων γίνεται σε κοινό µικροσκόπιο, (100x), (American Optical Corp., U.S.A.), και χρησιµοποιείται η µέθοδος του αιµακυτταρόµετρου, (πλάκα Neubauer). Β Προσδιορισµός των διαφοροποιηµένων κυττάρων MEL µε τη χρώση βενζιδίνης-h 2 O 2 Η µέθοδος στηρίζεται στην εκλεκτική ιστοχηµική αντίδραση και χρώση των κυττάρων MEL µε διάλυµα βενζιδίνης και H 2 O 2, έτσι ώστε τα κύτταρα που περιέχουν αιµοσφαιρίνη, (διαφοροποιηµένα), βάφονται κυανά, (Bz + ), ενώ τα αδιαφοροποίητα, δε χρωµατίζονται. Για τη µέθοδο αυτή, η οποία αποτελεί τροποποίηση της µεθόδου που έχει προταθεί από τον Orkin et al., (1975), χρησιµοποιούνται τα πιο κάτω διαλύµατα: ιάλυµα Α Υδροχλωρική βενζιδίνη 0,1 gr Παγόµορφο CH 3 COOH 1,5 ml H 2 O µέχρι 50 ml Το διάλυµα Α φυλάσσεται σε σκοτεινόχρωµο φιαλίδιο στους 4 ο C και µπορεί να διατηρηθεί 1-2- µήνες. 95

109 ιάλυµα Β H 2 O 2 30% µl H 2 O 500 µl Το διάλυµα Β χρησιµοποιείται φρέσκο και παρασκευάζεται πριν από κάθε προσδιορισµό. Η χρώση των κυττάρων γίνεται ως εξής: Μια σταγόνα κυττάρων, (~1x 10 6 /ml), προστίθεται σε κατάλληλη υποδοχή, (96 well plate). Στη συνέχεια, προστίθεται µια σταγόνα από το διάλυµα Α και µια από το διάλυµα Β και ακολουθεί ανακίνηση. Κατόπιν, το διάλυµα αφήνεται σε θερµοκρασία δωµατίου για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, το 96 well plate τοποθετείται στο ιµβερτοσκόπιο και µετρείται τόσο ο συνολικός αριθµός των κυττάρων, (τουλάχιστον κύτταρα), όσο και ο αριθµός των κυττάρων που χρωµατίζονται κυανά. Θεωρώντας ότι τα κυανά κύτταρα αντιστοιχούν σε εκείνα που περιέχουν αιµοσφαιρίνη, (διαφοροποιηµένα), υπολογίζεται το % ποσοστό των διαφοροποιηµένων κυττάρων στην καλλιέργεια, (% Bz + ). Β Εισαγωγή πλασµιδιακού DNA σε ευκαρυωτικά κύτταρα (Επιµόλυνση) Μετά την κλωνοποίηση ενός γονιδίου σε κατάλληλο πλασµιδιακό φορέα, πολλές φορές είναι επιθυµητό να αναλυθούν τα χαρακτηριστικά του, εισάγοντάς το σε διάφορα είδη κυττάρων. Αυτό γίνεται προκειµένου να εξεταστούν οι επιπτώσεις που µπορεί να επιφέρει το συγκεκριµένο γονίδιο στην κυτταρική ανάπτυξη ή διαφοροποίηση των κυττάρων. Επίσης, µε αυτόν τον τρόπο παράγονται κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν το γονίδιο, επιτρέποντας τον καθαρισµό του τελικού προϊόντος, για βιοχηµικό χαρακτηρισµό, ή την παραγωγή του σε µεγάλη κλίµακα, προκειµένου να χρησιµοποιηθεί για φαρµακευτικούς σκοπούς. Β Επιµόλυνση (transfection) MEL κυττάρων µε χρήση λιποσωµάτων Η χρήση λιποσωµάτων για την εισαγωγή DNA σε διαφορετικά ευκαρυωτικά κύτταρα, αποτελεί ίσως την καλύτερη µέθοδο επιµόλυνσης, εξαιτίας της µεγάλης απόδοσης και αποτελεσµατικότητας. Ο µηχανισµός µε τον οποίο γίνεται η εισαγωγή του DNA δεν είναι απόλυτα κατανοητός. Αυτό που είναι πιο πιθανό να συµβαίνει, είναι οι αρνητικά φορτισµένες φωσφορικές οµάδες του DNA να δεσµεύονται στη θετικά φορτισµένη επιφάνεια των λιποσωµάτων και το υπολειπόµενο θετικό φορτίο, στη συνέχεια να δεσµεύεται στο αρνητικά φορτισµένο σιαλικό οξύ, της επιφάνειας των κυττάρων. 96

110 Η διαδικασία που ακολουθείται αναλυτικά έχει ως εξής: Για κάθε αντίδραση επιµόλυνσης, 5x10 5 κύτταρα αραιώνονται µε 1ml θρεπτικού µέσου, (Opti-MEM), χωρίς προσθήκη ορού και αντιβιοτικών και τοποθετούνται σε 24 υποδοχείς µικροτρυβλίου, (24-well plate). Επίσης, για κάθε αντίδραση επιµόλυνσης, συγκεκριµένη ποσότητα πλασµιδιακού DNA αραιώνεται σε 50 µl θρεπτικού µέσου, (Opti-MEM), χωρίς ορό και αντιβιοτικά. Η λιποφεκταµίνη, (Lipofectamine TM Reagent, Invitrogen), αραιώνεται, (8µl σε συνολικό όγκο 50µl Opti-MEM), και αφήνεται 5 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου. Στη συνέχεια, λιποφεκταµίνη και πλασµιδιακό DNA αναµιγνύονται και επωάζονται σε θερµοκρασία δωµατίου για 45 λεπτά, προκειµένου να σχηµατιστούν τα σύµπλοκα DNA:λιποφεκταµίνης. Τέλος, στο µίγµα αυτό προστίθενται 300 µl Opti-MEM και αυτό µεταφέρεται στα κύτταρα µε ελαφρά ανάδευση. Ακολουθεί επώαση για 5 ώρες σε θάλαµο κυτταροκαλλιεργειών (37 ο C, 5% CO 2 ). Στη συνέχεια, προστίθενται 3.5ml θρεπτικού µέσου DMEM, παρουσία ορού, (10%FCS). Τα κύτταρα συνεχίζουν να αναπτύσσονται για άλλες 24 ώρες οπότε και το θρεπτικό µέσο αντικαθίσταται µε DMEM, παρουσία ορού (10% FCS) και 100 µg/ml βένζυλο πενικικιλλίνης και 100µg/ml στρεπτοµυκίνης, (PS) (Sambrook et al., 1989). α. Παροδική επιµόλυνση, (transient transfection) MEL κυττάρων Τα κύτταρα συνεχίζουν να αναπτύσσονται για άλλες 24 ώρες, οπότε και συλλέγονται µε φυγοκέντρηση και χρησιµοποιούνται για βιολογικό έλεγχο. β. Μόνιµη επιµόλυνση (stable transfection) MEL κυττάρων Τα κύτταρα, συνεχίζουν να αναπτύσσονται για άλλες 24 ώρες και στη συνέχεια το θρεπτικό µέσο αντικαθίσταται µε DMEM, παρουσία ορού (10% FCS) και 100 µg/ml βένζυλο πενικικιλλίνης και 100µg/ml στρεπτοµυκίνης, (PS), καθώς και του αντιβιοτικού επιλογής νεοµυκίνη (G-418, 0.6 mg/ml). Ακολουθεί η διαδικασία επιλογής θετικών κλώνων. Β Παροδική επιµόλυνση (transfection) 293Τ κυττάρων µε τη µέθοδο του CaCL 2 Η παροδική επιµόλυνση κυττάρων βασίζεται στην αργή µίξη του πλασµιδιακού DNA που βρίσκεται σε διάλυµα CaCl 2, µε ρυθµιστικό διάλυµα HEPES, που περιέχει φωσφορικά άλατα. Το αποτέλεσµα της ανάµιξης είναι η δηµιουργία 97

111 κατακρηµνισµάτων DNA µε φωσφορικό ασβέστιο. Το κατακρηµνίσµατα αυτά διαπερνούν την κυτταροπλασµατική µεµβράνη, πιθανώς µε ενδοκύττωση. Η µέθοδος αυτή είναι πολύ ευαίσθητη στις µεταβολές του ph, (βέλτιστο ph ), καθώς και στην καθαρότητα του DNA, (τα εµπορικά kit καθαρισµού DNA δίνουν DNA επαρκούς καθαρότητας για την εφαρµογή της µεθόδου). Τα χαρακτηριστικά της µεθόδου είναι η εντόπιση του κλωνοποιηµένου πλασµιδιακού φορέα εκτός του γενώµατος των κυττάρων, καθώς και η ανίχνευση και παραµονή του προϊόντος του κλωνοποιηµένου γονιδίου για χρονικό διάστηµα 1-4 ηµερών. Επίσης, σε κάθε κυτταρική διαίρεση, µόνο τα µισά από τα θυγατρικά κύτταρα είναι φορείς του πλασµιδιακού DNA, που εισήχθη κατά την επιµόλυνση. Στην προκείµενη εργασία χρησιµοποιήθηκαν τα ανθρώπινα 293Τ κύτταρα, τα οποία επιµολύνθηκαν παροδικά µε το γονίδιο της rps5, κλωνοποιηµένο στον πλασµιδιακό φορέα pcdna-3.1. Η καλλιέργεια των κυττάρων πριν την επιµόλυνση πρέπει να καταλαµβάνει το 50-60% της επιφάνειας του τριβλύου. Το διάλυµα του DNA µε το CaCl 2, (250 mm CaCl 2 ), προστίθεται στάγδην σε ίσο όγκο ρυθµιστικού διαλύµατος HEPES-φωσφορικών, (136 mm NaCl, 5 mm KCl, 11.2 mm γλυκόζη, 42 mm HEPES, 1.4 mm Na 2 HPO 4 ph 7.1). Στη συνέχεια, το µίγµα αναδεύεται ήπια και αφήνεται για λεπτά, ώστε να ολοκληρωθεί η κατακρήµνιση του DNA µε το φωσφορικό ασβέστιο. Ακολούθως, αποµακρύνεται το θρεπτικό υγρό από τα κύτταρα και προστίθεται το 1ml του αιωρήµατος DNA-φωσφορικού ασβεστίου στάγδην στο τρυβλίο της καλλιέργειας. Τα τρυβλία αφήνονται για 20 λεπτά µε παροδική ανακίνηση κάθε 10 λεπτά και στη συνέχεια προστίθενται 4 ml DMEM, παρουσία 10% v/v FCS, µε 5 µl χλωροκίνης, (0.1 M), η οποία αναστέλλει τα ένζυµα που διασπούν το DNA, καθώς και µίγµατος αντιβιοτικών, (PS), που αναστέλλει την ανάπτυξη µυκήτων και µικροβίων. Τα κύτταρα συνεχίζουν να αναπτύσσονται για άλλες 4 ώρες στους 37 C, παρουσία 5% CO 2. Ακολούθως, τα 5 ml του υγρού που έγινε η επιµόλυνση, αφαιρούνται, και προστίθενται εκ νέου 10 ml από το θρεπτικό υγρό. Η καλλιέργεια αφήνεται να αναπτυχθεί µε επώαση στους 37 C, σε ατµόσφαιρα CO 2 για 24 ώρες και ακολουθεί ακόµη ένας κύκλος αφαίρεσης-προσθήκης θρεπτικού µέσου και επώασης για άλλες 24 ώρες. Με τη συµπλήρωση συνολικά 48 ωρών από τη στιγµή της επιµόλυνσης, τα κύτταρα συλλέγονται αφαιρώντας αρχικά το υγρό µέσο ανάπτυξης. Στη συνέχεια προστίθενται στο τρυβλίο των 100 mm, 200 µl από το ρυθµιστικό διάλυµα λύσης των κυττάρων, (1% Triton X-100, 50 mm Tris-Cl ph 7.5, 98

112 150 mm NaCl, 10 µg/ml απροτινίνη και 1 mm PMSF) και τα κύτταρα αφαιρούνται από την επιφάνεια του τρυβλίου µε τη βοήθεια σπάτουλας και αφήνονται σε αιώρηση για 30 λεπτά στους 4 C στο διάλυµα λύσης. Κατόπιν, διαβιβάζονται µέσα από σύριγγα πολύ στενής διαµέτρου, ώστε να γίνει πλήρης διάρρηξη των κυτταρικών µεµβρανών. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις x g, για 15 λεπτά στους 4 C και συλλέγεται το υπερκείµενο. Το κυτταρικό εκχύλισµα φυλάσσεται στους 70 C (Chen και Okayama, 1997). Β Αποµόνωση κυτταρικών εκχυλισµάτων από καλλιέργεια MEL κυττάρων Η διαδικασία που ακολουθείται προκειµένου να γίνει αποµόνωση κυτταρικών εκχυλισµάτων από MEL κύτταρα είναι η εξής: Αφού γίνει η συλλογή των κυττάρων, έπειτα από φυγοκέντρηση, αυτά ξεπλένονται µε ισότονο διάλυµα φωσφορικών PBS1X. Στη συνέχεια, ακολουθεί η λύση των κυττάρων. Το διάλυµα λύσης που χρησιµοποιείται έχει την εξής σύσταση: ιάλυµα λύσης κυττάρων (Lysis buffer) NaCl 150mM Tris-Cl ph 7.5 NP-40 50mM 0.5% v/v Deoxyholic acid (Na) 0.5% v/v Πριν από κάθε χρήση προστίθενται PMSF 1mM και αναστολείς πρωτεασών, (cocktail), 1µm. Για κάθε 1x10 7 κύτταρα, προστίθενται ~ 600µl από το διάλυµα λύσης των κυττάρων. Ακολουθεί µηχανική διάρρηξη των µεµβρανών, (µε τη χρήση potter), και φυγοκέντρηση σε x g, για 15 λεπτά. Στη συνέχεια, συλλέγεται το υπερκείµενο της φυγοκέντρησης, το οποίο και αποτελεί το ολικό κυτταροπλασµατικό εκχύλισµα που χρησιµοποιείται για βιολογικά πειράµατα. Β Αποµόνωση µεγαλοµοριακού DNA από ευκαρυωτικά κύτταρα Για τη µέθοδο αυτή χρησιµοποιείται το εξής διάλυµα: ιάλυµα πέψης κυττάρων NaCl 100mM 99

113 Τris-Cl ph 8.0 EDTA ph 8.0 SDS Πρωτεϊνάση K 10 mm 25 mm 0.5% w/v 0.2 mg/ml Η διαδικασία έχει αναλυτικά ως εξής: Καλλιέργεια κυττάρων MEL φυγοκεντρείται στα 700 x g για 5 λεπτά. Το υπερκείµενο θρεπτικό υγρό αποµακρύνεται, και τα κύτταρα ξεπλένονται δυο φορές µε ψυχρό ισότονο διάλυµα φωσφορικών ph 7.2, (PBS 1X). Στη συνέχεια, προστίθενται 1 ml από το διάλυµα πέψης, για κάθε 1x10 8 κύτταρα. Ακολουθεί επώαση, προκειµένου να γίνει λύση και πέψη των κυττάρων, στους 50 ο C για ώρες, µε ανακίνηση. Κατόπιν, τα νουκλεϊνικά οξέα εκχυλίζονται, µε προσθήκη ίσου όγκου φαινόλης και κατόπιν χλωροφορµίου. Η διαδικασία αυτή επαναλαµβάνεται µια φορά ακόµη και στην υδατική στοιβάδα που παραλαµβάνεται, (πάνω), προστίθεται RNάση απηλλαγµένη DNάσης, (20µg/ml). Ακολουθεί επώαση στους 37 ο C για 3 ώρες και στη συνέχεια εκ νέου εκχύλιση µε φαινόλη και χλωροφόρµιο. Το DNA που παραλαµβάνεται στην υδατική στοιβάδα, κατακρηµνίζεται µε προσθήκη 0.1M οξικού αµµωνίου και 2,5 όγκων ψυχρής απόλυτης αιθανόλης. Στη συνέχεια, το διάλυµα, αφού παραµείνει στους 4 ο C για 24 ώρες, φυγοκεντρείται στους 4 ο C, σε x g, για 15 λεπτά. Το DNA που παραλαµβάνεται σαν λευκό ίζηµα, ξεπλένεται µια φορά µε 70% αιθανόλη, αποξηραίνεται και στη συνέχεια διαλύεται σε αποστειρωµένο δις-απεσταγµένο νερό ή διάλυµα ΤΕ, (10mM Tris-Cl ph 8.0 και 1mM EDTA ph 8.0) (Sambrook et al., 1989). Β Αποµόνωση κυτταροπλασµατικού RNA Β Αποµόνωση κυτταροπλασµατικού RNA Για τη µέθοδο αυτή χρησιµοποιούνται τα εξής διαλύµατα: ιάλυµα λύσης κυττάρων (Lysis buffer) NaCl 0.14 M MgCl mm Τris-Cl ph mm NP % v/v Ριβονουκλεοζιτικά σύµπλοκα του βαναδίου, (VRC), 10 mm 100

114 ιάλυµα 2xPK Tris-Cl ph M EDTA ph mm NaCl 0.3 M SDS 2 % w/v Η διαδικασία αναλυτικά έχει ως εξής: Καλλιέργεια κυττάρων MEL φυγοκεντρείται στα 700 x g για 5 λεπτά. Το υπερκείµενο θρεπτικό υγρό αποµακρύνεται και τα κύτταρα ξεπλένονται δυο φορές µε ψυχρό ισότονο διάλυµα φωσφορικών ph 7.2, (PBS 1X). Στη συνέχεια, προστίθενται 0.25 ml διάλυµα λύσης, για κάθε 1x10 7 κύτταρα. Ακολουθεί µηχανική ανακίνηση, (vortex), για 10 δευτερόλεπτα και τα κύτταρα λύνονται ενώ παραµένουν στον πάγο. Κατόπιν, το αιώρηµα των κυττάρων προστίθεται προσεκτικά, (layered over), σε ίσο όγκο διαλύµατος λύσης που περιέχει επιπλέον 24% w/v σουκρόζη ελεύθερη RNάσης και 0,2 % v/v NP-40, αφήνεται στον πάγο για 5 λεπτά και αµέσως µετά φυγοκεντρείται στους 4 ο C, σε x g, για 15 λεπτά. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης, παραλαµβάνεται προσεκτικά η πάνω στοιβάδα και σε αυτήν προστίθεται ίσος όγκος διαλύµατος 2 x PK και πρωτεΐνάση Κ, σε συγκέντρωση 200µg/ml. Το διάλυµα που προκύπτει, επωάζεται στους 37 ο C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια, αποµακρύνονται οι πρωτεΐνες, εκχυλίζοντας το µίγµα δυο φορές µε ίσο όγκο φαινόλης/ χλωροφορµίου/ ισοαµυλικής αλκοόλης, (σε αναλογία 25:24:1), και µια φορά µε χλωροφόρµιο/ ισοαµυλική αλκοόλη, (24:1). Στην υδατική στοιβάδα που παραλαµβάνεται, (πάνω), προστίθεται διάλυµα CH 3 COONa ph 5.2, σε τελική συγκέντρωση 0.3 Μ, και 2.5 όγκοι ψυχρής απόλυτης αιθανόλης, προκειµένου να γίνει η κατακρήµνιση του RNA. Το διάλυµα αφήνεται στους -20 ο C για 24 ώρες και στη συνέχεια φυγοκεντρείται στους 4 ο C, σε x g, για 15 λεπτά. Το RNA που παραλαµβάνεται σαν λευκό ίζηµα, ξεπλένεται µια φορά µε 70% αιθανόλη, αποξηραίνεται και στη συνέχεια διαλύεται σε αποστειρωµένο δις-απεσταγµένο νερό, κατεργασµένο µε πυροανθρακικό διαιθυλεστέρα (DEPC) (Sambrook et al., 1989). B Αποµόνωση κυτταροπλασµατικού RNA µε τη µέθοδο της θειοκυανικής γουανιδίνης Για τη µέθοδο αυτή χρησιµοποιούνται τα εξής διαλύµατα: ιάλυµα λύσης κυττάρων (Lysis buffer) Θειοκυανική γουανιδίνη 4Μ 101

115 Κιτρικό Νάτριο ph mm N-lauroylsarcosine % v/v Το διάλυµα λύσης φυλάσσεται στους -20 ο C πριν από τη χρήση του. Όταν πρόκειται να χρησιµοποιηθεί, αφού ξεπαγώσει, ενεργοποιείται µε την προσθήκη µερκαπτοαιθανόλης 0.1 M, (0.72 ml για 100 ml διαλύµατος λύσης). Η διαδικασία αναλυτικά έχει ως εξής: Καλλιέργεια κυττάρων MEL φυγοκεντρείται στα 700 x g, για 5 λεπτά. Το υπερκείµενο θρεπτικό υγρό αποµακρύνεται και τα κύτταρα ξεπλένονται δυο φορές µε ψυχρό ισότονο διάλυµα φωσφορικών ph 7.2, (PBS 1Χ). Στη συνέχεια, προστίθενται 3ml διαλύµατος λύσης για κάθε 1x10 7 κύτταρα. Αφού γίνει η λύση των κύτταρων, προστίθενται 0.5ml CH 3 COONa 2Μ, ph 4.2, 3ml όξινης φαινόλης και 2ml διαλύµατος χλωροφορµίου/ ισοαµυλικής αλκοόλης, (24:1). Μετά την προσθήκη κάθε αντιδραστηρίου, ακολουθεί έντονη µηχανική ανακίνηση, (vortex), για 10 sec και τελικά τα κύτταρα αφήνονται να παραµείνουν στον πάγο για 15 λεπτά. Κατόπιν, ακολουθεί φυγοκέντρηση στους 4 ο C για 20 λεπτά σε φυγόκεντρο Sorvall, (SS34 rotor). Στη συνέχεια, η υδατική στιβάδα, (η οποία περιέχει το RNA), χωρίζεται σε µικρότερες ποσότητες και µεταφέρεται σε καινούριο σωλήνα, προστίθεται ίσος όγκος ισοπροπανόλης και τελικά το διάλυµα αφήνεται στους -20 ο C για 24 ώρες και κατόπιν φυγοκεντρείται στους 4 ο C, σε x g, για 15 λεπτά. Το RNA που παραλαµβάνεται σαν λευκό ίζηµα, ξεπλένεται µια φορά µε 70% αιθανόλη, αποξηραίνεται και στη συνέχεια διαλύεται σε αποστειρωµένο δις-απεσταγµένο νερό, κατεργασµένο µε πυροανθρακικό διαιθυλεστέρα (DEPC). B Φασµατοφωτοµετρικός ποσοτικός προσδιορισµός του DNA και του RNA Η αρχή του φασµατοφωτοµετρικού προσδιορισµού της ποσότητας του DNA ή του RNA σε υδατικά διαλύµατα, βασίζεται στο γεγονός ότι όλες οι βάσεις πουρίνης και πυριµιδίνης απορροφούν ισχυρά στην υπεριώδη περιοχή του φάσµατος, έτσι, τα διαλύµατα νουκλεϊνικών οξέων απορροφούν στο υπεριώδες, µε µέγιστο στα 260 nm. Η διαδικασία που ακολουθείται για τον ποσοτικό προσδιορισµό των δειγµάτων του DNA και του RNA είναι η εξής: Μια µικρή ποσότητα του προς ανάλυση δείγµατος, (1-10 µl), αραιώνεται µε αποστειρωµένο νερό, ( µl). Κατόπιν, µετρείται η απορρόφηση στα 260 και 280 nm. Είναι γνωστό (Sambrook et al., 1989), ότι µια µονάδα οπτικής πυκνότητας, (OD), στα 260 nm, αντιστοιχεί σε 50 µg/ml διαλύµατος DNA και 40 µg/ml διαλύµατος RNA. Με βάση τις δυο αυτές 102

116 σχέσεις, προσδιορίζεται η ποσότητα του DNA και RNA στο άγνωστο δείγµα. Επίσης, από το λόγο των οπτικών πυκνοτήτων στα 260 nm και στα 280 nm, (OD 260 / OD 280 ), µπορεί να εκτιµηθεί ο βαθµός καθαρότητας των δειγµάτων DNA και RNA, αφού είναι διεθνώς παραδεκτό ότι δείγµατα υψηλής καθαρότητας, έχουν λόγο OD 260 / OD 280, περίπου 2. B Ηλεκτροφόρηση RNA σε πηκτή αγαρόζης Η µέθοδος αυτή στηρίζεται σε αντίστοιχο πρωτόκολλο που έχει προταθεί από τον Sambrook et al., (1989). Τα διαλύµατα που χρησιµοποιούνται για τη µέθοδο αυτή είναι τα εξής: 10Χ ιάλυµα ηλεκτροφόρησης ( ιάλυµα Α) (gel running buffer) MOPS 20.9 gr CH 3 COONa 3.4 gr EDTA 0.5 M ph ml NaOH 10N 3.4 ml Το ph του διαλύµατος ρυθµίζεται στο 7.0 και στη συνέχεια αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο. ιάλυµα ειγµάτων ( ιάλυµα Β) Γλυκερόλη 50 % v/v EDTA ph mm Kυανούν της βρωµοφαινόλης 0.4 %w/v Kυανούν του ξυλενίου 0,4 % w/v α) Προετοιµασία της πηκτής αγαρόζης 2 gr αγαρόζης διαλύονται µε βρασµό σε 145 ml αποστειρωµένου ddh 2 O και το διάλυµα αφήνεται να ψυχθεί στους ο C. Κατόπιν, προστίθενται 20 ml διαλύµατος Α και 35 ml διαλύµατος φορµαλδεΰδης, 37% v/v. Το µίγµα αφού ανακινηθεί, τοποθετείται σε εκµαγείο της συσκευής ηλεκτροφόρησης και αφήνεται να πήξει. β) Προετοιµασία δειγµάτων RNA και ηλεκτροφόρηση Σε κάθε δείγµα RNA, (συνολικού όγκου 4.5 µl), που περιέχει µg RNA, προστίθενται: ιάλυµα ηλεκτροφόρησης 10Χ 2 µl ιάλυµα φορµαλδεΰδης 37% 3,5 µl Φορµαµίδιο 10 µl 103

117 Το διάλυµα θερµαίνεται στους 55 ο C για 15 λεπτά και στη συνέχεια, τα δείγµατα τοποθετούνται αµέσως στον πάγο. Κατόπιν, φυγοκεντρούνται για λίγα sec και προστίθενται στο κάθε δείγµα, 2 µl από το διάλυµα Β. Τελικά, το διάλυµα RNA τοποθετείται στις κυψελίδες της πηκτής και η ηλεκτροφόρηση γίνεται σε διάλυµα Α 1Χ, σε σταθερή τάση 60 Volt, για 3-4 ώρες. Β Μεταφορά RNA από πηκτή αγαρόζης σε νάιλον µεµβράνη, (υβριδισµός κατά Northern) Η τεχνική αυτή στηρίζεται σε αντίστοιχο πρωτόκολλο που έχει προταθεί από τον Sambrook et al., (1989). Το διάλυµα που χρησιµοποιείται είναι το εξής: ιάλυµα 20Χ SSC NaCl gr Κιτρικό Νάτριο 88.2 gr Συνολικός όγκος 1 lt, ph 7.0, (διόρθωση µε 10Ν NaOH) Αφού τελειώσει η ηλεκτροφόρηση, η πηκτή αφαιρείται από τη συσκευή και φωτογραφίζεται. Ταυτόχρονα, σηµειώνονται οι διαστάσεις της πηκτής, οι αποστάσεις που αντιστοιχούν στο 18S και 28S rrna, καθώς και οι αποστάσεις των δυο χρωστικών. Κατόπιν, η πηκτή ξεπλένεται αρκετές φορές µε αποστειρωµένο διςαπεσταγµένο νερό, κατεργασµένο µε DEPC, προκειµένου να φύγει η περίσσεια της φορµαλδεΰδης. Ταυτόχρονα, κόβεται η µεµβράνη, δυο χαρτιά Whatmann 3MM και αρκετές χαρτοπετσέτες, στις διαστάσεις της πηκτής. Αφού ολοκληρωθεί το ξέπλυµα µε το H 2 O, η πηκτή εµβαπτίζεται σε διάλυµα 6Χ SSC και ανακινείται για µερικά λεπτά. Στην ειδική συσκευή που είναι κατάλληλη για µεταφορά κατά Northern, στρώνεται ένα φύλλο Whatmann, το οποίο έχει διαβραχεί µε διάλυµα 6Χ SSC. Πάνω στο φύλλο αυτό τοποθετείται η πηκτή και κατόπιν η µεµβράνη, η οποία έχει διαβραχεί προηγουµένως, στο ίδιο διάλυµα. Σε αυτό το σηµείο δίνεται ιδιαίτερη προσοχή, ώστε να αποµακρυνθούν οι φυσαλίδες που τυχόν υπάρχουν µεταξύ της πηκτής και της µεµβράνης, γιατί σε αντίθετη περίπτωση θα υπάρξει πρόβληµα στη µεταφορά. Πάνω από τη µεµβράνη τοποθετούνται τα δυο χαρτιά Whatmann, διαβρεγµένα σε διάλυµα 6Χ SSC, οι χαρτοπετσέτες πάχους περίπου 12 εκατοστών και ένα βάρος 500gr περίπου. Τελικά, προστίθεται διάλυµα 20Χ SSC, τόση ποσότητα ώστε οι άκρες του φύλλου Whatmann στο κάτω µέρος να βρίσκονται στο 104

118 υγρό. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η µεταφορά του RNA από την πηκτή στη µεµβράνη, εξαιτίας των τριχοειδικών φαινοµένων που λαµβάνουν χώρα. Η µεταφορά διαρκεί ώρες. Β Χρώση της µεµβράνης µε τη µέθοδο κυανού του µεθυλενίου Τα διαλύµατα που χρησιµοποιούνται είναι τα εξής: ιάλυµα Α CH 3 COOH 5 % v/v ιάλυµα B CH 3 COONa ph M Kυανούν του µεθυλενίου 0.0 4% w/v Αφού ολοκληρωθεί η µεταφορά, η µεµβράνη ξεπλένεται δυο φορές µε 2Χ SSC, για περίπου20 λεπτά. Στη συνέχεια, εµβαπτίζεται στο διάλυµα Α για 2 λεπτά και τέλος στο διάλυµα Β, για 5 λεπτά. Ακολουθούν 3-4 πλυσίµατα µε διςαπεσταγµένο νερό, για να αποµακρυνθεί η περίσσεια της χρωστικής. Με τη συγκεκριµένη χρωστική είναι δυνατό να διακριθούν οι ζώνες των 18S και 28S rrnas, ενώ παράλληλα, ταυτοποιείται η ακεραιότητα του δείγµατος και η τοποθέτηση στην πηκτή ίσης ποσότητας από το κάθε δείγµα. Β Προετοιµασία της µεµβράνης για τον υβριδισµό µε το ραδιοεπισηµασµένο DNA ιχνηλάτη Τα διαλύµατα που χρησιµοποιούνται είναι τα πιο κάτω: ιάλυµα προκατεργασίας (wash buffer before hybridization) ιάλυµα φωσφορικών (PO 3-4 ) ph mm Το διάλυµα των φωσφορικών (PO 3-4 ) παρασκευάζεται µε την προσθήκη διαλύµατος NaH 2 PO 4 1M, σε διάλυµα Na 2 HPO 4 1Μ, µέχρις ότου το ph σταθεροποιηθεί στο 7.2. ιάλυµα υβριδισµού (church hybridization buffer) ιάλυµα φωσφορικών (PO 3-4 ) ph M EDTA ph mm SDS 7 % w/v Η µεµβράνη µετά τη χρώση της, εκτίθεται σε λάµπα UV, (30W, 365 nm), για 3 λεπτά, προκειµένου να ακινητοποιηθούν τα µόρια RNA που µεταφέρθηκαν στη µεµβράνη µε τη µέθοδο Northern. Στη συνέχεια, τοποθετείται στο διάλυµα προκατεργασίας για 5-10 λεπτά. Κατόπιν, η µεµβράνη µεταφέρεται στον ειδικό 105

119 κύλινδρο υβριδισµού, ο οποίος προηγουµένως έχει πλυθεί µε NaOH 1M και αποστειρωµένο δις-απεσταγµένο νερό, κατεργασµένο µε DEPC, και περιέχει ml από το διάλυµα υβριδισµού. Ακολουθεί προυβριδισµός της µεµβράνης, για 2 ώρες σε επωαστικό κλίβανο υβριδισµού, (Hybridization oven/shaker, Stuart Scientific, UK). B In vitro [ 32 -P] ραδιοεπισήµανση DNA ιχνηλάτη Προκειµένου να γίνει ραδιοεπισήµανση του DNA ιχνηλάτη, χρησιµοποιείται το σύστηµα πολλαπλής επισήµανσης µορίων, (multiprime DNA labeling system kit, Invitrogen). Η διαδικασία έχει ως εξής: ~1µg DNA, (συνολικός όγκος 1-12 µl), µετουσιώνεται στους 95 ο C για 5 λεπτά. Αµέσως µετά τοποθετείται στον πάγο και προστίθενται 3µl από το µίγµα των ψυχρών νουκλεοτιδίων, 20µl από το διάλυµα της αντίδρασης και τελικά ο όγκος συµπληρώνεται µέχρι τα 44 µl µε αποστειρωµένο δις-απεσταγµένο νερό, κατεργασµένο µε DEPC. Στο τέλος, προστίθενται 5µl [α 32 P] dctp,(~3000ci/mmol), και 1µl Klenow DNA πολυµεράση, (40U/µl). Ακολουθεί επώαση στους 37 ο C για 30 λεπτά. Στο ραδιοεπισηµασµένο πλέον DNA, προστίθενται 5µl από το stop buffer και στη συνέχεια θερµαίνεται στους 90 ο C για 5 λεπτά. Κατόπιν, αφού τοποθετηθεί στον πάγο, είναι έτοιµο για τον υβριδισµό της µεµβράνης. Β Υβριδισµός της µεµβράνης µε ραδιοεπισηµασµένο ιχνηλάτη (Μέθοδος Church) Μετά το τέλος προϋβριδισµού της µεµβράνης, το διάλυµα υβριδισµού αντικαθίσταται µε 10ml φρέσκου διαλύµατος και κατόπιν προστίθεται ο ραδιοεπισηµασµένος ιχνηλάτης. Ακολουθεί υβριδισµός στους 65 ο C για 24 ώρες. Β Ξέπλυµα της µεµβράνης και αυτοραδιογραφία Το διάλυµα που χρησιµοποιείται είναι το ακόλουθο: ιάλυµα ξεπλύµατος (wash buffer after hybridization) ιάλυµα φωσφορικών (PO 3-4 ) ph mm SDS 1 % w/v Αφού ολοκληρωθεί ο υβριδισµός, η µεµβράνη ξεπλένεται 4-6 φορές, ανά 15 λεπτά, µε το αντίστοιχο διάλυµα, έως ότου αποµακρυνθεί η ραδιενέργεια που 106

120 δεσµεύθηκε µη ειδικά στη µεµβράνη. Τέλος, η µεµβράνη τοποθετείται παρουσία φιλµ, (Kodak X-Omat), σε κασέτα και αφήνεται στους -70 ο C για 48 ώρες. 107

121 Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ.1. Έκφραση και παραγωγή της ανασυνδυασµένης S5 ριβοσωµικής πρωτεΐνης σε βακτηριακά κύτταρα και µελέτη της λειτουργικότητάς της Το πρώτο µέρος της προκείµενης διδακτορικής διατριβής, περιλαµβάνει πειράµατα που αφορούν στην έκφραση της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5, (rps5), σε βακτηριακά κύτταρα. Παράλληλα, εξετάζονται πιθανές µεταµεταφραστικές τροποποιήσεις στο µόριο της rps5, καθώς και ο ρόλος τους στη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης, ενδοκυτταρικά. Γ.1.1. Κλωνοποίηση του γονιδίου της rps5 του ποντικού στον πλασµιδιακό φορέα έκφρασης pet11a Με βάση την ήδη γνωστή ακολουθία της rps5, σχεδιάστηκαν δύο ολιγονουκλεοτίδια, τα οποία χρησιµοποιήθηκαν ως εκκινητές στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης, (PCR). Ο ένας εκκινητής, (5'), περιέχει την ακολουθία αναγνώρισης για το ένζυµο περιορισµού Nde I και ο άλλος, (3'), για το ένζυµο BamH I. Ως εκµαγείο χρησιµοποιήθηκε ο πλασµιδιακός φορέας pbluescript, στον οποίο ήταν κλωνοποιηµένο το γονίδιο της rps5, (προσφορά από το Εργαστήριο Φαρµακολογίας, Τµήµα Φαρµακευτικής, Dr. Βιζιριανάκης). Η ακολουθία των εκκινητών, καθώς και οι συνθήκες της PCR, αναφέρονται στην παράγραφο Β Μετά το τέλος της αντίδρασης, το µίγµα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Παράλληλα, πραγµατοποιήθηκε αντίδραση PCR, στις ίδιες συνθήκες, απουσία εκµαγείου, (διαδροµή 2). Στο σχήµα Γ.1, φαίνεται το προϊόν που προέκυψε στο αναµενόµενο µοριακό µέγεθος, περίπου 620bp, (διαδροµή 1). 108

122 Σχήµα Γ.1. Ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης των αντιδράσεων PCR για την αποµόνωση του πλήρους µεγέθους cdna της rps5. Ανάλυση των προϊόντων της PCR σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: µάρτυρες µοριακού µεγέθους 1kb, ιαδροµή 1: Αντίδραση παρουσία εκµαγείου, προϊόν στα ~620 bp, ιαδροµή 2: Αντίδραση απουσία εκµαγείου. Η ζώνη DNA στη διαδροµή 1, εκχυλίστηκε από την πηκτή αγαρόζης και στη συνέχεια ακολούθησε καθαρισµός µε το σύστηµα Gel Extraction Kit, (βλέπε παράγραφο B.2.17). Το DNA τµήµα που αποµονώθηκε, επωάστηκε στη συνέχεια µε τα ένζυµα περιορισµού Nde I και BamΗ Ι. Με τα ίδια ένζυµα επωάστηκε και το πλασµίδιο pet11a. Μετά το τέλος της επώασης, τόσο το γονίδιο της rps5, όσο και ο φορέας, καθαρίστηκαν µε το PCR Purification Kit, (βλέπε παράγραφο B.2.16). Ακολούθησε η αντίδραση της DNA λιγάσης, χρησιµοποιώντας το Rapid DNA Ligation Kit. Στη συνέχεια, έγινε εισαγωγή του ανασυνδυασµένου φορέα pet11a που φέρει το πλήρους µήκους cdna της rps5 του ποντικού, σε επιδεκτικά κύτταρα E.coli XL1, όπως περιγράφεται στη B Τα µετασχηµατισµένα πλέον κύτταρα, αναπτύχθηκαν στους 37 ο C σε στερεό υπόστρωµα LB και άγαρ, παρουσία του αντιβιοτικού αµπικιλλίνη, στο οποίο παρουσιάζει ανθεκτικότητα το συγκεκριµένο πλασµίδιο, (pet11a-rps5). Από τις αποικίες που προέκυψαν, προκειµένου να βρεθούν οι θετικές που φέρουν τον αναµενόµενο ανασυνδυασµένο φορέα, έγινε αποµόνωση πλασµιδιακού DNA µε τη µέθοδο της αλκαλικής λύσης (βλέπε παράγραφο B ). Το DNA που αποµονώθηκε από κάθε αποικία, επωάσθηκε µε τα ένζυµα περιορισµού NdeI και BamHI, προκειµένου να διαπιστωθούν οι θετικοί 109

123 κλώνοι, από την ύπαρξη του αναµενόµενου τµήµατος DNA στα ~620bp, που αντιστοιχεί στο cdna της rps5. Γ.1.2. Μεταµόρφωση των βακτηριακών κυττάρων E.coli BL21(DE3) µε το ανασυνδυασµένο πλασµιδίο pet11a-rps5 για την παραγωγή της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης rps5 Ο µετασχηµατισµός των επιδεκτικών κυττάρων E.coli BL21(DE3) µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pet11a-rps5, έγινε σύµφωνα µε την τεχνική που περιγράφεται στην παράγραφο B Μια αποικία, η οποία είχε αναπτυχθεί στο τρυβλίο µε τα µετασχηµατισµένα κύτταρα, επιλέχθηκε και µε αυτήν εµβολιάσθηκαν 3 ml θρεπτικού υποστρώµατος LB, παρουσία 100 µg/ml αµπικιλλίνης. Ακολούθησε επώαση στους 37 ο C για ώρες, µε ανακίνηση. Από την αρχική αυτή καλλιέργεια, έγινε ενοφθάλµισµα 1:50 σε κωνική φιάλη των 2 lt που περιείχε 200 ml αποστειρωµένου LB και αµπικιλλίνης. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναπτύχθηκαν στους 37 ο C µε ήπια ανάδευση µέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να φτάσει ~0.7 και προστέθηκε 1mM IPTG, προκειµένου να ενεργοποιηθεί η µεταγραφή του γονιδίου της Τ7 RNA πολυµεράσης και συνακόλουθα του γονιδίου της rps5. Η επώαση µετά, την προσθήκη του IPTG, συνεχίστηκε για 3 ώρες στην ίδια θερµοκρασία. Για τη βελτιστοποίηση της ενεργοποίησης των γονιδίων και την παραγωγή της ανασυνδυασµένης rps5, η ίδια διαδικασία επαναλήφθηκε αρκετές φορές µεταβάλλοντας το χρόνο ανάπτυξης των κυττάρων, και κατά συνέπεια την απορρόφηση, πριν από την προσθήκη του IPTG, καθώς και το χρόνο ανάπτυξης µετά την προσθήκη του επαγωγέα. Σε όλες τις περιπτώσεις ελήφθη 1ml δείγµατος πριν την επαγωγή και µετά το τέλος αυτής. Ακολούθησε λύση των κυττάρων που συλλέχθηκαν µετά από φυγοκέντρηση, µε την προσθήκη 6Μ ουρίας και Tris-HCl ph 7.5 και διαδοχικό πάγωµα ξεπάγωµα. Το ολικό εκχύλισµα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή SDS-PAGE 12% v/v. Στο σχήµα Γ.2, φαίνονται τρεις από τις προσπάθειες υπερέκφρασης, από τις οποίες η µια, (Γ), δίνει ένα ικανοποιητικό ποσοστό παραγωγής της rps5. 110

124 Σχήµα Γ.2. SDS- ηλεκτροφόρηση των ολικών εκχυλισµάτων κυττάρων E.coli BL21(DE3) µετασχηµατισµένων µε pet11a-rps5. Κύτταρα E.coli BL21(DE3), µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pet11a-rps5, αναπτύχθηκαν απoυσία και παρουσία του IPTG σε διαφορετικές συνθήκες. Τα κυτταρικά εκχυλίσµατα που προέκυψαν, ηλεκτροφορήθηκαν σε SDS-PAGE 12% v/v. Α. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, ιαδροµή 1: δείγµα πριν την προσθήκη IPTG, απορρόφηση 0.7, ιαδροµή 2: δείγµα µετά την προσθήκη IPTG και επώαση για 3 ώρες. Β. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, ιαδροµή 1: δείγµα πριν την προσθήκη IPTG, απορρόφηση 1.0, ιαδροµή 2: δείγµα µετά την προσθήκη IPTG και επώαση για 19 ώρες. Γ. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, ιαδροµή 1: δείγµα πριν την προσθήκη IPTG, απορρόφηση 0.780, ιαδροµή 2: δείγµα µετά την προσθήκη IPTG και επώαση για 19 ώρες στους 37 ο C, προϊόν rps5 στα ~ Da. Όπως προκύπτει από τα αποτελέσµατα του σχήµατος Γ.2, οι συνθήκες κάτω από τις οποίες εκφράζεται περισσότερο η rps5 είναι προσθήκη του IPTG σε απορρόφηση και επώαση στους 37 ο C για 19 ώρες. Το ποσό της πρωτεΐνης που παράγεται µε τις συγκεκριµένες συνθήκες υπερέκφρασης χρησιµοποιήθηκε για την παρασκευή πολυκλωνικού αντισώµατος, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.6, και όχι για τον καθαρισµό της πρωτεΐνης S5, µε τις κλασικές βιοχηµικές µεθόδους. Ακολούθησε προσπάθεια παραγωγής της ανασυνδυασµένης rps5, σε διαφορετικό προκαρυωτικό φορέα έκφρασης, που θα έδινε τη δυνατότητα καθαρισµού και αποµόνωσης σε ικανοποιητικό βαθµό, όπως αναφέρεται παρακάτω. 111

125 Γ.1.3. Κλωνοποίηση του γονιδίου της rps5 από ποντίκι στον πλασµιδιακό φορέα pgex-2t για την παραγωγή της ανασυδυασµένης πρωτεΐνης rps5 σαν πρωτεΐνη σύντηξης µε τη GST Προκειµένου να γίνουν πειράµατα που αφορούσαν στην αλληλεπίδραση της rps5 µε άλλες πρωτεΐνες, καθώς επίσης και πειράµατα in vitro φωσφορυλίωσης, χρησιµοποιήθηκε ο πλασµιδιακός φορέας pgex-2t. Η υπερπαραγόµενη πρωτεΐνη καθαρίζεται εύκολα µε στήλη αγχιστείας και η παραγωγή της σαν πρωτεΐνη σύντηξης µε τη GST, δεν δηµιουργεί προβλήµατα στα πειράµατα που αναφέρθηκαν πιο πάνω. Έτσι, σχεδιάστηκαν δύο ολιγονουκλεοτίδια, τα οποία χρησιµοποιήθηκαν ως εκκινητές στην αντίδραση PCR. Ο ένας εκκινητής (5'), περιέχει την ακολουθία αναγνώρισης για το ένζυµο περιορισµού BamH I και ο άλλος, (3'), για το ένζυµο EcoR I. Η ακολουθία των εκκινητών, καθώς και οι συνθήκες της PCR, αναφέρονται στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι. Μετά το τέλος της αντίδρασης, το µίγµα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Και στην περίπτωση αυτή έγινε αντίδραση PCR, στις ίδιες συνθήκες, απουσία εκµαγείου. Στο σχήµα Γ.3, φαίνεται το προϊόν που προέκυψε στο αναµενόµενο µοριακό µέγεθος, περίπου 620bp. Σχήµα Γ.3. Ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης των αντιδράσεων PCR για την αποµόνωση του πλήρους µεγέθους cdna της rps5. 112

126 Ανάλυση προϊόντων σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: µάρτυρες µοριακού µεγέθους 1kb, ιαδροµή 1: Αντίδραση παρουσία εκµαγείου, προϊόν στα ~620 bp, ιαδροµή 2: Αντίδραση απουσία εκµαγείου. Η ζώνη του DNA τµήµατος που αντιστοιχεί στα ~ 620bp, στη διαδροµή 1, εκχυλίστηκε από την πηκτή αγαρόζης και κατόπιν ακολούθησε η ίδια διαδικασία που αναφέρεται και στην παράγραφο Γ.1, προκειµένου να παραχθεί το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pgex-2t-rps5. Γ.1.4. Μετασχηµατισµός µε το ανασυνδυασµένο πλασµιδίο pgex-2t-rps5 των επιδεκτικών κυττάρων E.coli BL21(DE3) και έκφραση της rps5 ως πρωτεΐνης σύντηξης µε τη GST Ο µετασχηµατισµός των επιδεκτικών κυττάρων E.coli BL21(DE3) µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pgex-2t-rps5, έγινε σύµφωνα µε τη µεθοδολογία που περιγράφεται στην παράγραφο Β Η διαδικασία της υπερέκφρασης είναι η ίδια µε αυτή που περιγράφηκε στην παράγραφο Γ.1.2, µε τη διαφορά ότι τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ο C µέχρι η απορρόφηση στα 600 nm να φτάσει ~0.7 και µετά την προσθήκη του IPTG, η επώαση συνεχίστηκε για 1.5 ώρες στους 28 ο C. Οι βέλτιστες αυτές συνθήκες υπερέκφρασης, προέκυψαν έπειτα από δοκιµές µε διαφορετικούς χρόνους ανάπτυξης των κυττάρων πριν από την προσθήκη του επαγωγέα, διαφορετικούς χρόνους και διαφορετικές θερµοκρασίες επώασης µετά την επαγωγή. Επίσης, σε όλες τις περιπτώσεις ελήφθη 1ml δείγµατος πριν την επαγωγή και µετά το τέλος αυτής. Ακολούθησε παραλαβή των κυτταρικών εκχυλισµάτων και ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-PAGE 12% v/v. Στο σχήµα Γ.4, φαίνεται η υπερέκφραση της πρωτεΐνης σύντηξης GST-rpS5. 113

127 Σχήµα Γ.4. SDS- ηλεκτροφόρηση των ολικών εκχυλισµάτων κυττάρων E.coli BL21(DE3) µετασχηµατισµένων µε pgex-2t-rps5. Κύτταρα E.coli BL21(DE3), µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pgex-2t-rps5, αναπτύχθηκαν απoυσία και παρουσία του IPTG. Τα κυτταρικά εκχυλίσµατα που προέκυψαν, ηλεκτροφορήθηκαν σε SDS-PAGE 12% v/v. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, ιαδροµή 1: δείγµα πριν την προσθήκη IPTG σε απορρόφηση 0.700, ιαδροµή 2: δείγµα µετά την προσθήκη IPTG και επώαση για 1.5 ώρα στους 28 ο C, προϊόν GST-rpS5 στα ~ Da. Γ.1.5. Καθαρισµός της πρωτεΐνης σύντηξης GST-rpS5 µε τη χρήση χρωµατογραφίας αγχιστείας (σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης) Τα κύτταρα που συλλέχθηκαν µε φυγοκέντρηση, όπως αναφέρεται πιο πάνω, ύστερα από την υπερέκφραση λύθηκαν και ακολούθησε η διαδικασία παραλαβής του ολικού εκχυλίσµατος όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β Κατόπιν, το εκχύλισµα των κυττάρων επωάστηκε µε τα σφαιρίδια της γλουταθειόνης-σεφαρόζης, µε αποτέλεσµα η πρωτεΐνη σύντηξης GST-rpS5 να συζευχθεί σε αυτά. Ακολούθησε έκλουση, (δυο φορές), της πρωτεΐνης µε αναγµένη γλουταθειόνη και ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-PAGE 12% v/v, µιας µικρής ποσότητας του εκλούσµατος. Στο σχήµα Γ.5, φαίνεται ο επιτυχηµένος καθαρισµός της πρωτεΐνης GST-rpS5. 114

128 Σχήµα Γ.5. SDS-ηλεκτροφόρηση των δυο εκλουσµάτων έπειτα από στήλη γλουταθειόνηςσεφαρόζης. Τα ολικά εκχυλίσµατα που παρελήφθησαν µε λύση των κυττάρων, επωάστηκαν µε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και ακολούθησαν εκλούσεις µε αναγµένη γλουταθειόνη. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, ιαδροµή 1: 1 η έκλουση, ιαδροµή 2: 2 η έκλουση, προϊόν GST-rpS5 στα ~ Da και GST ~ Da. Όπως προκύπτει από το παραπάνω σχήµα, ο καθαρισµός µπορεί να θεωρηθεί επιτυχής, αφού η πρωτεΐνη GST-rpS5 είναι αυτή που παραλαµβάνεται στο µεγαλύτερο ποσοστό, µαζί µε το πρωτεόλυµα, τη GST. Γ.1.6. Παραλαβή της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης rps5 µετά από πέψη της πρωτεΐνης σύντηξης GST-rpS5 µε το ένζυµο θροµβίνη Η έκφραση πρωτεϊνών ως πρωτεΐνες σύντηξης µε την τρανσφεράση της γλουταθειόνης, (GST), παρέχει τη δυνατότητα, µετά τον εύκολο καθαρισµό της πρωτεΐνης σύντηξης µε τη στήλη αγχιστείας, να υπάρξει παραλαβή της πρωτεΐνης του ενδιαφέροντος σε καθαρή µορφή, έπειτα από πέψη µε το ένζυµο θροµβίνη. Η θροµβίνη, ως πρωτεολυτικό ένζυµο, αναγνωρίζει την ακολουθία αργινίνης-γλυκίνης, (Arg-Gly), που υπάρχει στο σηµείο σύντηξης και πρωτεολύει τον πεπτιδικό δεσµό µεταξύ των δυο αυτών αµινοξέων. Απαραίτητη προϋπόθεση για τη χρήση της 115

129 θροµβίνης, είναι να µην υπάρχει ακολουθία αργινίνης-γλυκίνης στην υπό καθαρισµό πρωτεΐνη. Στην περίπτωση της rps5, όπως φαίνεται στο σχήµα Γ.6, τέτοια ακολουθία δεν υπάρχει, εποµένως το ένζυµο θροµβίνη, ήταν δυνατό να χρησιµοποιηθεί για την αποµάκρυνση της GST. Στο σχήµα Γ.6, φαίνεται η πρωτεΐνη που αποµένει µετά την πέψη µε τη θροµβίνη, η οποία στο καρβοξυτελικό της άκρο έχει επιπλέον δυο αµινοξέα, γλυκίνη και σερίνη. MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFP NLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSR IAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDV VLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGD HPPKLVPRGSMTEWEAATPAVAETPDIKFGKWSTDDVQINDISLQDYIAVKEKY FTKYLPHSAGRYAAKRFRKAQCPIVERLTNSMMMHGRNNGKKLMTVRIVKHA FEIIHLLTFTGENPLQVLVNAIINSGPREDSTRIGRAGTVRRQAVDVSPLRRVNQA IWLLCTGAREAAFFTRNIKNIAECLADELINAAKGSSNSYAIKKKDELERVAKSN R Σχήµα Γ.6. Αµινοξική ακολουθία της πρωτεΐνης σύντηξης GST-rpS5 MSPILGYW πρωτεΐνη GST. MTEWEAAT πρωτεΐνη rps5. RG θέση πέψης θροµβίνης. Για την αποµόνωση της ανασυνδυασµένης rps5, από την πρωτεΐνη σύντηξης GST-rpS5, µετά τον καθαρισµό µε τη στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης της πρωτεΐνης σύντηξης, ποσότητα πρωτεΐνης ίση µε 40µg, τοποθετείται για διαπίδυση, στη συνέχεια συµπυκνώνεται µέχρι ξηρού και επαναδιαλύεται σε 100µl διαλύµατος πέψης, (150mM Tris-HCl ph8.0, 150mM NaCl και 2.5mM CaCL 2 ). Η ποσότητα αυτή χωρίζεται στα δυο ή χρησιµοποιείται ολόκληρη για την πέψη µε τη θροµβίνη. Κατόπιν, προστίθεται ποσότητα θροµβίνης σε αναλογία 1:50 ή 1:100 και το µίγµα επωάζεται στους 25 ο C ή στους 37 ο C για συγκεκριµένο χρονικό διάστηµα. Ακολούθως, προστίθεται η ανάλογη ποσότητα διαλύµατος δειγµάτων και β- µερκαπτοαιθανόλης, προκειµένου να σταµατήσει η αντίδραση και τελικά τα δείγµατα ηλεκτροφορούνται σε πηκτή SDS-PAGE 12% v/v. Στο σχήµα Γ.7, φαίνεται η ποσότητα της rps5 που λαµβάνεται, σε διαφορετικές συνθήκες πειράµατος. 116

130 Σχήµα Γ.7. SDS-ηλεκτροφόρηση της GST-rpS5 µετά από πέψη µε θροµβίνη σε διαφορετικές συνθήκες. Η πρωτεΐνη σύντηξης GST-rpS5, αφού αιωρηθεί στο κατάλληλο ρυθµιστικό διάλυµα, επωάζεται µε το πρωτεολυτικό ένζυµο θροµβίνη. M: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται δεξιά σε kda, ιαδροµή 1: 20 µg πρωτεΐνης, 1:100 θροµβίνη, επώαση 1h στους 25 ο C, ιαδροµή 2: 20 µg πρωτεΐνης, 1:50 θροµβίνη, επώαση 1h στους 25 ο C, ιαδροµή 3: 20 µg πρωτεΐνης, 1:100 θροµβίνη, επώαση 15min στους 37 ο C, ιαδροµή 4: 20 µg πρωτεΐνης, 1:100 θροµβίνη, επώαση 30min στους 37 ο C, ιαδροµή 5: 40 µg πρωτεΐνης, 1:50 θροµβίνη, επώαση 1.5h στους 25 ο C, προϊόν rps5 στα ~ Da. Από το σχήµα Γ.7, φαίνεται πως επωάζοντας την πρωτεΐνη σύντηξης GSTrpS5 στους 37 ο C για 30min και προσθέτοντας θροµβίνη σε αναλογία 1:100, λαµβάνεται µια ικανοποιητική ποσότητα καθαρής rps5. Η ζώνη που σηµειώνεται στο σχήµα Γ.7 σαν rps5, έχει επιβεβαιωθεί και µε αµινοξική ανάλυση, (sequencing), έπειτα από ηλεκτροφόρηση ίδιων δειγµάτων σε πηκτή SDS-PAGE 12% v/v και µεταφορά σε µεµβράνη Immobilon. 117

131 Γ.1.7. Έλεγχος αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης GST-rpS5 µε πρωτεΐνες κυτταρικού εκχυλίσµατος ανθρώπινων ερυθρολευχαιµικών κυττάρων Προκειµένου να διαπιστωθεί αν η rps5 αλληλεπιδρά µε κάποια πρωτεΐνη των ανθρώπινων ερυθρολευχαιµικών κυττάρων, έγινε πείραµα συγκατακρήµνισης. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β Συγκεκριµένα, έγινε δέσµευση σε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης των πρωτεϊνών GST και GST-rpS5, για 1 ώρα στους 4 ο C. Η καθήλωση έγινε σε ρυθµιστικό διάλυµα PBST. Στη συνέχεια, στο σωλήνα που έχει καθηλωθεί η GST προστέθηκε κυτταρικό εκχύλισµα και ακολούθησε επώαση µε ανακίνηση σε θερµοκρασία δωµατίου, για 1 ώρα. Μετά το πέρας της µιας ώρας, ακολούθησε φυγοκέντρηση και το υπερκείµενο, προστέθηκε στο σωλήνα όπου είχε καθηλωθεί η GST-rpS5. Στη συνέχεια, έλαβε χώρα επώαση µε ανακίνηση, για 1 ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου. Και στις δύο περιπτώσεις, αφού έγινε πλύσιµο των σφαιριδίων 3 φορές µε PBST, οι πρωτεΐνες που δεσµεύτηκαν στα σφαιρίδια της στήλης αναλύθηκαν σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE 12% v/v, όπως φαίνεται στο σχήµα Γ.8. Σχήµα Γ.8. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών που δεσµεύτηκαν σε σφαιρίδια γλουταθειόνηςσεφαρόζης. 118

132 Πρωτεϊνικό εκχύλισµα από ερυθρολευχαιµικά κύτταρα, επωάστηκε µε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης, στα οποία είχε καθηλωθεί GST. Ό,τι δεν δεσµεύθηκε ειδικά, επωάστηκε µε σφαιρίδια στήλης, στα οποία είχε καθηλωθεί GST-rpS5. Ακολούθησε ανάλυση των πρωτεϊνών σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE 12% v/v. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται δεξιά σε kda, ιαδροµή 1: πείραµα αναφοράς (control), ιαδροµή 2: πρωτεΐνες που δεσµεύτηκαν στη GST-rpS5, ζώνη προς διερεύνηση ~ Da. Όπως φαίνεται στο σχήµα Γ.8, η πρωτεϊνική ζώνη ~ Da στη διαδροµή 2, είτε αντιστοιχεί σε πρωτεΐνη του κυτταρικού εκχυλίσµατος των ερυθρολευχαιµικών κυττάρων, που δεσµεύεται εκλεκτικά στην rps5, είτε πρόκειται για κάποιο πρωτεόλυµα της GST-rpS5. Το ίδιο πείραµα επαναλήφθηκε χρησιµοποιώντας αυτή τη φορά εκτός από κυτταρικό εκχύλισµα και διάλυµα λύσης των κυττάρων, (Hepes 50mM, NaCl 150mM, Triton X-100 1%, PMSF 1mM και αναστολείς πρωτεασών). Στο σχήµα Γ.9, φαίνονται οι πρωτεΐνες που δεσµεύτηκαν στα σφαιρίδια της στήλης και αναλύθηκαν σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE 12% v/v. Σχήµα Γ.9. Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών που δεσµεύτηκαν σε σφαιρίδια γλουταθειόνηςσεφαρόζης. 119

133 Η διαδικασία είναι αυτή που περιγράφηκε στο σήµα Γ.8. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, ιαδροµή 1: πείραµα αναφοράς (control), ιαδροµή 2: πρωτεΐνες που δεσµεύτηκαν στη GSTrpS5. Στις διαδροµές 1,2 χρησιµοποιήθηκε κυτταρικό εκχύλισµα, ιαδροµή 3: πείραµα αναφοράς (control), ιαδροµή 4: πρωτεΐνες που δεσµεύτηκαν στη GST-rpS5. Στις διαδροµές 3,4 χρησιµοποιήθηκε µόνο διάλυµα λύσης, πρωτεϊνική ζώνη GST-N-terminal rps5 ~ Da. Από το σχήµα Γ.9, µπορεί κανείς να υποθέσει, πως η πρωτεϊνική ζώνη των Da αντιστοιχεί σε πρωτεόλυµα της GST-rpS5, παρά σε πρωτεΐνη του κυτταρικού εκχυλίσµατος. Το ίδιο πείραµα επαναλήφθηκε, και µετά την ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-PAGE 12% v/v, οι πρωτεΐνες µεταφέρθηκαν σε µεµβράνη Immobilon, η µεµβράνη χρωµατίστηκε µε Coomasie Brilliant Blue R-250 και η συγκεκριµένη ζώνη κόπηκε και έγινε ανάλυση της πρωτοταγούς ακολουθίας της N-τελικής περιοχής. Το αποτέλεσµα της ανάλυσης έδειξε πως πράγµατι πρόκειται για πρωτεόλυµα της GST-rpS5, αφού αποτελείται από τη GST και τα 35 περίπου πρώτα αµινοξέα της rps5. Το γεγονός αυτό φαίνεται να συµφωνεί µε το εύρηµα από Τράπεζες εδοµένων, (Data Banks), ότι στην rps5, και συγκεκριµένα στα 18 πρώτα αµινοξέα υπάρχει µια ακολουθία σήµα, η οποία οδηγεί την πρωτεΐνη σε αυτοπρωτεόλυση, (MTEWEAATPAVAETPDIK). Οι ακολουθίες αυτές ονοµάζονται PEST, (Proline, Glutamic acid, Serine, Threonine), διότι περιέχουν συνήθως τα τέσσερα αµινοξέα προλίνη, γλουταµινικό οξύ, σερίνη και θρεονίνη, όχι απαραίτητα µε αυτή τη σειρά. Γ.1.8. Έλεγχος δοµικών στοιχείων στο µόριο της rps5 και µελέτη του ρόλου τους στη λειτουργία της πρωτεΐνης ενδοκυτταρικά Όπως αναφέρθηκε και στην προηγούµενη παράγραφο, Γ.1.7, στην αµινοτελική περιοχή της rps5, υπάρχει ένδειξη για πιθανή ύπαρξη µιας PEST ακολουθίας και επίσης φάνηκε η πρωτεΐνη να αυτοπρωτεολύεται, αποβάλλοντας τα πρώτα 35 πρώτα αµινοξέα. Σύµφωνα µε τους Chen και Huang, (2001), η ριβοσωµική πρωτεΐνη S5 µετακινείται από τον πυρηνίσκο, όπου γίνεται η συγκρότηση των ριβοσωµικών υποµονάδων, στο πυρηνόπλασµα, µε πολύ αργό ρυθµό. Το γεγονός αυτό 120

134 επιβεβαιώνει την ενεργή και παράλληλα ουσιώδη συµµετοχή της πρωτεΐνης αυτής στη διαδικασία της βιογένεσης των ριβοσωµάτων. Λαµβάνοντας όλα τα παραπάνω υπόψη, θα ήταν ενδιαφέρον να µελετηθεί η υποκυτταρική εντόπιση της rps5, καθώς και του τµήµατος της πρωτεΐνης αυτής, το οποίο δεν περιλαµβάνει τα 37 πρώτα αµινοξέα. Η περιοχή αυτή φαίνεται να παίζει σπουδαίο ρόλο για την πρωτεΐνη και είναι συντηρηµένη στα αρχαιοβακτήρια και τους ευκαρυωτικούς οργανισµούς. Γ Κλωνοποίηση της περιοχής του γονιδίου της S5 ριβοσωµικής πρωτεΐνης από ποντίκι που κωδικοποιεί τα αµινοξέα , στον πλασµιδιακό φορέα pegfp-c1 προκειµένου να µελετηθεί η υποκυτταρική της εντόπιση Από την ερευνητική οµάδα του Dr. Huang, στάλθηκε το γονίδιο της rps5 του ποντικού κλωνοποιηµένο στον ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pegfp-c1. Το πλασµίδιο αυτό παρέχει τη δυνατότητα να παραχθεί η πρωτεΐνη του ενδιαφέροντος, σαν πρωτεΐνη σύντηξης µε τη GFP, (Green Fluorescent Protein), προκειµένου να γίνει δυνατή η υποκυτταρική εντόπιση µε πειράµατα ανοσοφθορισµού και χρησιµοποιώντας τη µικροσκοπία συνεστίασης. Παράλληλα, σχεδιάστηκαν εκκινητές, για την κλωνοποίηση της περιοχής του γονιδίου που κωδικοποιεί τα αµινοξέα , στον ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pegfp-c1. Ο ένας εκκινητής, (5'), περιέχει την ακολουθία αναγνώρισης για το ένζυµο περιορισµού Kpn I και ο άλλος, (3'), για το ένζυµο BamH I. Η ακολουθία των εκκινητών, καθώς και οι συνθήκες της PCR, αναφέρονται στην παράγραφο B Μετά το τέλος της αντίδρασης ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Παράλληλα, πραγµατοποιήθηκε και µια αντίδραση απουσία εκµαγείου, σαν αρνητικός έλεγχος. Στο σχήµα Γ.10, στη διαδροµή 1, φαίνεται το προϊόν που προέκυψε στο αναµενόµενο µοριακό µέγεθος, στα ~ 500bp. 121

135 Σχήµα Γ.10. Ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης των αντιδράσεων PCR για την αποµόνωση του cdna της rps5 που κωδικοποιεί τα αµινοξέα Ανάλυση προϊόντων σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: µάρτυρες µοριακού µεγέθους 1kb, ιαδροµή 1: Αντίδραση παρουσία εκµαγείου, προϊόν στα ~ 500bp, ιαδροµή 2: Αντίδραση απουσία εκµαγείου. Η ζώνη του DNA τµήµατος που αντιστοιχεί στα ~ 500bp, στη διαδροµή 1, εκχυλίστηκε από την πηκτή αγαρόζης και κατόπιν ακολούθησε η ίδια διαδικασία που αναφέρεται και στην παράγραφο Γ.1, προκειµένου να παραχθεί το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pegfp-c1-rps Στη συνέχεια αποµονώθηκε πλασµιδιακό DNA από το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο, για να χρησιµοποιηθεί στα πειράµατα που ακολουθούν. Γ Πειράµατα ανοσοφθορισµού Στη συνέχεια, το ανασυνδυασµένο αυτό πλασµίδιο, pegfpc1-rps , καθώς και αυτό που είχε δοθεί από τον Dr. Huang, pegfpc1-rps5 w/t, (πλήρους αλληλουχίας), χρησιµοποιήθηκαν προκειµένου να γίνουν πειράµατα ανοσοφθορισµού, σε συνεργασία µε το Εργαστήριο Βιολογικής Χηµείας, του Τµήµατος Ιατρικής του Πανεπιστηµίου Ιωαννίνων, (Dr. Θ. Παπαµαρκάκη). Η τεχνική 122

136 που χρησιµοποιήθηκε είναι συνοπτικά η εξής: Κύτταρα Hela, επιµολύνθηκαν παροδικά µε τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια µε τη µέθοδο της λιποφεκταµίνης. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 40 ώρες µετά τη διαµόλυνση. Στη συνέχεια τα κύτταρα εκπλύθηκαν µε PBS και στερεώθηκαν πάνω σε ειδικές πλάκες µε 4% παραφορµαλεδεΰδη. Ακολούθησε σβέση µε 50 mm NH 4 Cl και οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε αντικειµενοφόρο πλάκα, χρησιµοποιώντας Moviol που περιείχε 100 mg/ml DABCO. Τα δείγµατα εξετάστηκαν σε µικροσκόπιο συνεστιακής µικροσκοπίας, (Confocal, Leica) και κατέστη δυνατή η κυτταρική εντόπιση των δυο παραγόµενων πρωτεϊνών σύντηξης GFP-rpS5 w/t και GFP-rpS Το σχήµα Γ.11, δείχνει δυο χαρακτηριστικές φωτογραφίες των αποτελεσµάτων που πάρθηκαν και που απεικονίζουν χαρακτηριστικά την κύρια υποκυτταρική εντόπιση των δυο πρωτεϊνών, της πλήρους µήκους rps5 και της µεταλλαγµένης. Σχήµα Γ.11. Φωτογραφίες από µικροσκόπιο συνεστίασης. Κύτταρα Hela, επιµολύνθηκαν παροδικά µε τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια µε τη µέθοδο της λιποφεκταµίνης. Στη συνέχεια, τα κύτταρα στερεώθηκαν πάνω σε ειδικές πλάκες, οπότε και ήταν δυνατή η εντόπιση των πρωτεϊνών σύντηξης µε τη GFP. Α. Πρωτεΐνη σύντηξης GFP-rpS5 w/t. Β. Πρωτεΐνη σύντηξης GFP-rpS Όπως χαρακτηριστικά φαίνεται στο πιο πάνω σχήµα, η πρωτεΐνη σύντηξης GFP-rpS5 w/t, εντοπίζεται κυρίως στους πυρηνίσκους των κυττάρων, ενώ η πρωτεΐνη σύντηξης GFP-rpS , εντοπίζεται παντού στον πυρήνα. Το εύρηµα αυτό έρχεται να ενισχύσει την άποψη για το σπουδαίο βιολογικό ρόλο που φαίνεται να 123

137 διαδραµατίζει το τµήµα της πρωτεΐνης, που περιλαµβάνει τα πρώτα αµινοτελικά αµινοξέα, Γ.1.9. In vitro φωσφορυλίωση της GST-rpS5 από την κινάση της καζεΐνης II, (CKII) Έχοντας ενισχύσει την άποψη για την πιθανή σπουδαιότητα του αρχικού αµινοτελικού τµήµατος της rps5, που περιλαµβάνει τα 37 πρώτα αµινοξέα, (1-37), θεωρήθηκε ενδιαφέρον η αναζήτηση πιθανών µεταµεταφραστικών τροποποιήσεων στο τµήµα αυτό της πρωτεΐνης µε τη βοήθεια κατάλληλων βιοπληροφοριακών εργαλείων. Μετά από αναζήτηση σε βάσεις δεδοµένων, προέκυψε, όπως φαίνεται και στο σχήµα Γ.12, ότι υπάρχουν τρεις πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης από την κινάση της καζεΐνης ΙΙ, (CKII), µια θέση φωσφορυλίωσης από την p38mapk κινάση και µια άλλη θέση, από µια κινάση που δεν ήταν δυνατό να βρεθεί µε το συγκεκριµένο πρόγραµµα βιοπληροφορικής. MTEWEAATPAVAETPDIKLFGKWSTDDVQINDISLQDYIAVKEKYFTAKYLPHS AGRYAAKRFRKAQCPIVERLTNSMMMHGRNNGKKLMTVRIVKHAFEIIHLLTF TGENPLQVLVNAIINSGPREDSTRIGRAGTVRRQAVDVSPLRRVNQAIWLLCTGA REAAFFTRNIKNIAECLADELINAAKGSSNSYAIKKKDELERVAKSNR Σχήµα Γ.12. Αµινοξική ακολουθία της rps5 µε τη χρήση του προγράµµατος NetPhos, TEWE, STDD, SLQD : πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης από την CKII. ATPAV: πιθανή θέση φωσφορυλίωσης από την p38mapk κινάση. ETPDI: πιθανή θέση φωσφορυλίωσης από άγνωστη κινάση. Αρχικά, θεωρήθηκε σκόπιµο να εξεταστεί αν η rps5 φωσφορυλιώνεται από την CKII in vitro. Συγκεκριµένα, η πρωτεΐνη σύντηξης GST-rpS5 ελέγχθηκε αρχικά ως προς τη φωσφορυλίωσή της από την κινάση της καζεΐνης II, (CKII). Η µέθοδος που ακολουθήθηκε περιγράφεται στην παράγραφο Β Μετά το τέλος της επώασης, παρουσία θερµού ATP, τα δείγµατα ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή SDS- PAGE 10% v/v. Σαν πείραµα αναφοράς χρησιµοποιήθηκαν η GST και η καζεΐνη, η οποία αποτελεί το πιο διαδεδοµένο υπόστρωµα της κινάσης αυτής. Μετά το τέλος της ηλεκτροφόρησης, ακολούθησε χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών µε τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue R-250, αποχρωµατισµός και ξήρανση της πηκτής. Η 124

138 ξηραµένη πηκτή τοποθετήθηκε στον ειδικό θάλαµο παρουσία φιλµ, οπότε προέκυψε η αυτοραδιογραφία που φαίνεται στο σχήµα Γ.13. Σχήµα Γ.13. Αυτοραδιογραφία in vitro φωσφορυλίωσης της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης GST-rpS5, από την CKII. H GST, η καζεΐνη και η GST-rpS5, επωάστηκαν µε την CKII, παρουσία θερµού και ψυχρού ATP. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-PAGE 10% v/v, χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών, ξήρανση της πηκτής και αυτοραδιογραφία. ιαδροµή 1: πείραµα αναφοράς, (αρνητικό control), GST σαν υπόστρωµα, ιαδροµή 2: πείραµα αναφοράς, (θετικό control), καζεΐνη σαν υπόστρωµα, ιαδροµή 3: GST-rpS5 σαν υπόστρωµα. Στην αυτοραδιογραφία αυτή φαίνεται πως η GST δεν φωσφορυλιώνεται, η καζεΐνη φωσφορυλιώνεται, όπως άλλωστε ήταν αναµενόµενο, ενώ παρατηρείται και φωσφορυλίωση της GST-rpS5, η οποία φωσφορυλίωση αποδίδεται στην rps5. Το αποτέλεσµα αυτό επαναλήφθηκε, οπότε το in vitro αυτό πείραµα συνηγορεί υπέρ της άποψης για φωσφορυλίωση της rps5 από την CKII. Γ Κλωνοποίηση των περιοχών του γονιδίου της rps5 που κωδικοποιούν τα αµινοξέα 1-37 και , στον πλασµιδιακό φορέα pgex-2t προκειµένου να γίνουν πειράµατα in vitro φωσφορυλίωσης εδοµένου ότι βρέθηκε πιθανή in vitro φωσφορυλίωση της rps5 από την CKII, και οι θέσεις φωσφορυλίωσης από την κινάση αυτή περιορίζονται στα

139 πρώτα αµινοξέα, σχεδιάστηκαν κατάλληλοι εκκινητές προκειµένου να κλωνοποιηθούν στον πλασµιδιακό φορέα pgex-2t οι περιοχές του γονιδίου της rps5 που κωδικοποιούν τα αµινοξέα 1-37 και , να παραχθούν οι πρωτεΐνες σύντηξης GST-rpS και GST-rpS και να ελεγχθούν ως προς τη φωσφορυλίωση, από την CKII. Η ακολουθία των εκκινητών, καθώς και οι συνθήκες της PCR, περιγράφονται αναλυτικά στην παράγραφο Β Μετά το τέλος της αντίδρασης PCR µε τους κατάλληλους εκκινητές, όπως αναφέρθηκε πιο πάνω, το µίγµα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Επίσης, έγινε αντίδραση PCR, στις ίδιες συνθήκες, απουσία εκµαγείου. Στο σχήµα Γ.14, φαίνονται τα προϊόντα που προέκυψαν στο αναµενόµενο µοριακό µέγεθος, περίπου 110bp και 500bp, στις διαδροµές 1 και 3, που αφορούν στα cdnas που κωδικοποιούν τα 1-37aa και aa, αντίστοιχα. Σχήµα Γ.14. Ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης των αντιδράσεων PCR για την αποµόνωση των περιοχών του γονιδίου της rps5 που κωδικοποιούν τα αµινοξέα 1-37 και Ανάλυση προϊόντων σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: µάρτυρες µοριακού µεγέθους 1kb, ιαδροµή 1: Αντίδραση παρουσία εκµαγείου, προϊόν στα ~ 110bp, ιαδροµή 2: Αντίδραση απουσία εκµαγείου, ιαδροµή 3: Αντίδραση παρουσία εκµαγείου, προϊόν στα ~ 500bp, ιαδροµή 4: Αντίδραση απουσία εκµαγείου. 126

140 Οι ζώνες DNA των τµηµάτων που αντιστοιχούν στα ~ 110bp, στη διαδροµή 1 και στα ~ 500bp στη διαδροµή 3, εκχυλίστηκαν από την πηκτή αγαρόζης και κατόπιν ακολούθησε η ίδια διαδικασία που αναφέρεται και στην παράγραφο Γ.1, προκειµένου να παραχθούν τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια pgex-2t-rps και pgex-2trps , για να χρησιµοποιηθούν στα επόµενα πειράµατα παραγωγής και καθαρισµού των ανασυνδυασµένων χιµαιρικών πρωτεϊνών GST-rpS GST-rpS Γ Μετασχηµατισµός µε τα ανασυνδυασµένα πλασµιδία pgex-2t-rps και pgex-2τ-rps των επιδεκτικών κυττάρων E.coli BL21(DE3), έκφραση των πρωτεϊνών σύντηξης GST-rpS GST-rpS και καθαρισµός µε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης Ο µετασχηµατισµός των επιδεκτικών κυττάρων E.coli BL21(DE3) µε τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια pgex-2τ-rps και pgex-2τ-rps , έγινε σύµφωνα µε την τεχνική που περιγράφεται στην παράγραφο Β Ακολούθησε παραγωγή των πρωτεϊνών σύντηξης GST-rpS και GSTrpS και καθαρισµός τους χρησιµοποιώντας τις συνθήκες για την έκφραση και τον καθαρισµό της GST-rpS5, που αναφέρεται στις παραγράφους Γ.1.4. και Γ.1.5. Στο σχήµα Γ.15, φαίνεται ο καθαρισµός της πρωτεΐνης σύντηξης GST-rpS στη διαδροµή 1 και της GST-rpS στη διαδροµή 3. Σχήµα Γ.15. SDS-ηλεκτροφόρηση των εκλουσµάτων των πρωτεϊνών σύντηξης GST-rpS και GST-rpS έπειτα από στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης. 127

141 Αφού έγινε υπερέκφραση των ανασυνδυασµένων χιµαιρικών πρωτεϊνών, τα ολικά εκχυλίσµατα που παρελήφθησαν µε λύση των κυττάρων, επωάστηκαν µε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και ακολούθησαν εκλούσεις µε αναγµένη γλουταθειόνη. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται δεξιά σε kda, ιαδροµή 1: 1 η έκλουση GST-rpS5 1-37, ιαδροµή 2: 1 η έκλουση GST-rpS , προϊόντα στα ~ και ~ 48.00Da αντίστοιχα. Γ Έλεγχος της in vitro φωσφορυλίωσης της GST-rpS και GST-rpS από την κινάση της καζεΐνης II Στην παράγραφο Γ.1.9, περιγράφεται ο έλεγχος της GSΤ-rpS5 ως προς τη φωσφορυλίωσή της από την CKII και φάνηκε πως πράγµατι φωσφορυλιώνεται in vitro. Μετά την παραγωγή και αποµόνωση των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών GSTrpS και GST-rpS , εξετάστηκαν οι συγκεκριµένες πρωτεΐνες ως προς τη φωσφορυλίωσή τους από την κινάση αυτή. Το πείραµα πραγµατοποιήθηκε όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.11 και παρουσιάστηκε στην παράγραφο Γ.1.9, για την GST-rpS5. Η αυτοραδιογραφία που προέκυψε φαίνεται στο σχήµα Γ.16. Σχήµα Γ.16. Αυτοραδιογραφία πειραµάτων φωσφορυλίωσης των ανασυνδυασµένων χιµαιρικών πρωτεϊνών GST-rpS και GST-rpS , από την CKII. H GST, η καζεΐνη, η GST-rpS5, η GST-rpS και η GST-rpS , επωάστηκαν µε την CKII, παρουσία θερµού και ψυχρού ATP. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS- PAGE 10% v/v, χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών, ξήρανση της πηκτής και αυτοραδιογραφία. ιαδροµή 1: πείραµα αναφοράς, (αρνητικό control), GST σαν υπόστρωµα, ιαδροµή 2: πείραµα αναφοράς, (θετικό control), καζεΐνη σαν υπόστρωµα, ιαδροµή 3: GST-rpS σαν 128

142 υπόστρωµα, ιαδροµή 4: GST-rpS σαν υπόστρωµα, ιαδροµή 5: GST-rpS σαν υπόστρωµα. Στην αυτοραδιογραφία αυτή φαίνεται, όπως και στο πείραµα που αναφέρεται στην παράγραφο Γ.1.9, πως η GST δεν φωσφορυλιώνεται από την CKII, η καζεΐνη φωσφορυλιώνεται, όπως ήταν αναµενόµενο, η GST-rpS , (rps5 πλήρους αλληλουχίας), φωσφορυλιώνεται, όπως είχε δειχθεί και στο προηγούµενο πείραµα, (σχήµα Γ.13.), όπως επίσης και η GST-rpS5 1-37, όχι όµως η GST-rpS (διαδροµή 5). Εποµένως, το συµπέρασµα που προκύπτει από τα παραπάνω πειραµατικά αποτελέσµατα, είναι ότι η rps5 φωσφορυλιώνεται από την CKII in vitro και η φωσφορυλίωση αυτή οφείλεται σε κάποιο αµινοξύ ή αµινοξέα που εντοπίζονται στα 37 πρώτα αµινοξέα. Γ Απάλειψη ή µετάλλαξη των αµινοξέων που εµφανίζονται ως πιθανοί στόχοι φωσφορυλίωσης στο τµήµα της rps5, 1-37 Όπως φαίνεται στο σχήµα Γ.12, (ακολουθία της rps5 και πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης), στην αµινοτελική περιοχή των 37 πρώτων αµινοξέων της rps5, υπάρχουν τρεις πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης από την CKII, όπως προκύπτουν µετά από έλεγχο µε το υπολογιστικό πρόγραµµα NetPhos, και αυτές είναι η θρεονίνη στη θέση 2, [Τ (2)], η σερίνη στη θέση 24, [S(24)] και η σερίνη στη θέση 34, [S(34)]. Επίσης, στην ίδια περιοχή υπάρχουν και άλλες δυο πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης, η θρεονίνη στη θέση 8, [Τ(8)], από την p38mapk και η θρεονίνη στη θέση 14, [Τ(14)]. Με βάση τα προηγούµενα αποτελέσµατα in vitro φωσφορυλίωσης της rps5, αλλά και εκείνα του υποκυτταρικού εντοπισµού της, θα ήταν ενδιαφέρον, κάνοντας απάλειψη ή µετάλλαξη σε καθένα από αυτά τα αµινοξέα, να εξεταστεί η δυνατότητα φωσφορυλίωσης της µεταλλαγµένης rps5 από την CKII, καθώς και η κυτταρική της εντόπιση. Γ Σχεδιασµός, παραγωγή και κλωνοποίηση των µεταλλαγµάτων της rps5 στους πλασµιδιακούς φορείς pegfp-c1 για τα πειράµατα υποκυτταρικής εντόπισης και pgex-2t για τα πειράµατα in vitro φωσφορυλίωσης και αποµόνωση των αντίστοιχων πρωτεϊνών σύντηξης µε τη GST Σχεδιάστηκαν κατάλληλοι εκκινητές για την κλωνοποίηση του τµήµατος του γονιδίου της rps5 που κωδικοποιεί τα αµινοξέα στους πλασµιδιακούς φορείς 129

143 pgex-2t και pegfp-c1, οπότε θα απαλείφονταν τα δυο πρώτα αµινοξέα, [Τ(2) del]. Η µετάλλαξη των S(24), S(34), T(8) και Τ(14) σε γλυκίνη,(g), η οποία αποτελεί ένα ουδέτερο αµινοξύ, έγινε χρησιµοποιώντας την τεχνική του megaprimer για την εισαγωγή σηµειακών µεταλλάξεων, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β Σχεδιάστηκαν εποµένως οι κατάλληλοι εκκινητές οι οποίοι έφεραν τη µετάλλαξη για κάθε περίπτωση και χρησιµοποιώντας τους κατάλληλους 5' και 3' εκκινητές για κλωνοποίηση στους πλασµιδιακούς φορείς pgex-2t και pegfp-c1, πραγµατοποιήθηκε η αντίδραση PCR. Η ακολουθία του κάθε εκκινητή, καθώς και οι συνθήκες της κάθε αντίδρασης περιγράφονται αναλυτικά στην παράγραφο Β και Β Μετά το τέλος της κάθε αντίδρασης το µίγµα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Για κάθε περίπτωση πραγµατοποιήθηκε αντίδραση PCR, στις ίδιες συνθήκες, απουσία εκµαγείου. Στο σχήµα Γ.17, φαίνεται το κύριο προϊόν που προέκυψε στο αναµενόµενο µοριακό µέγεθος, ~ 620bp. Σχήµα Γ.17. Ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης των αντιδράσεων PCR για την αποµόνωση του cdna της rps5 που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη χωρίς τα πρώτα δυο αµινοξέα και για την αποµόνωση του cdna της rps5, µε την εισαγωγή δυο µεταλλάξεων. Ανάλυση προϊόντων σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. 130

144 A. T(2) del. Μ: µάρτυρες µοριακού µεγέθους 1kb, ιαδροµές 1,3: Αντίδραση παρουσία εκµαγείου για pegfp-c1 και pgex-2t, προϊόν στα ~620 bp, ιαδροµές 2,4: Αντίδραση απουσία εκµαγείου. Β. Τ(8) mut. Μ: µάρτυρες µοριακού µεγέθους 1kb, ιαδροµές 1,3: Αντίδραση παρουσία εκµαγείου για pegfp-c1 και pgex-2t, προϊόν στα ~620 bp, ιαδροµές 2,4: Αντίδραση απουσία εκµαγείου. Γ. Τ(14) mut. Μ: µάρτυρες µοριακού µεγέθους 1kb, ιαδροµές 1,2: Αντίδραση παρουσία εκµαγείου για pegfp-c1 και pgex-2t, προϊόν στα ~620 bp, ιαδροµές 3,4: Αντίδραση απουσία εκµαγείου. Οι ζώνες των DNA τµηµάτων που αντιστοιχούν στα ~ 620bp, εκχυλίστηκαν από την πηκτή αγαρόζης και κατόπιν ακολούθησε η ίδια διαδικασία που αναφέρεται και στην παράγραφο Γ.1, προκειµένου να παραχθούν τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια pgex-2t-rps5 Τ(2) del., T(8) mut. και T(14) mut., όπως επίσης και τα pegfp-c1- rps5 Τ(2) del., T(8) mut. και T(14) mut. Μετά την αποµόνωση των κατάλληλων ανασυνδυασµένων πλασµιδίων, ακολούθησε ανάλυση της νουκλεοτιδικής ακολουθίας τους, για την επιβεβαίωση των αντίστοιχων µεταλλάξεων. Πράγµατι, διαπιστώθηκε ότι πραγµατοποιήθηκε η επιθυµητή απάλειψη των δυο πρώτων αµινοξέων, [Τ(2) del.], καθώς και η µετάλλαξη της θρεονίνης στις θέσεις 8 και 14 σε γλυκίνη, [T(8) mut. και T(14) mut.] Παρά τις συνεχείς προσπάθειες που καταβλήθηκαν, δεν κατέστη δυνατή η µετάλλαξη της σερίνης στις θέσεις 24 και 34,σε γλυκίνη, [S(24) mut. και S(34) mut.]. Έτσι, προέκυψαν τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια pgex-2t-rps5 Τ(2) del., T(8) mut. και T(14) mut., για την παραγωγή των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών rps5 ως προϊόντων σύντηξης µε την GST, και τα pegfp-c1-rps5 Τ(2) del., T(8) mut. και T(14) mut., για την παραγωγή των ανασυνδυασµένων πρωτεϊνών rps5 ως προϊόντων σύντηξης µε την GFP. Τα τελευταία στάλθηκαν στο Εργαστήριο Βιολογικής Χηµείας, του Τµήµατος Ιατρικής του Πανεπιστηµίου Ιωαννίνων, (Dr. Παπαµαρκάκη). προκειµένου να γίνουν τα πειράµατα κυτταρικής εντόπισης, όπως περιγράφονται στην παράγραφο Γ Το σχήµα Γ.18, δείχνει χαρακτηριστικές φωτογραφίες των αποτελεσµάτων που πάρθηκαν και που απεικονίζουν την κύρια υποκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών. 131

145 Σχήµα Γ.18. Φωτογραφίες από µικροσκόπιο συνεστίασης. Κύτταρα Hela, επιµολύνθηκαν παροδικά µε τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια µε τη µέθοδο της λιποφεκταµίνης. Στη συνέχεια, τα κύτταρα στερεώθηκαν πάνω σε ειδικές πλάκες, οπότε και ήταν δυνατή η εντόπιση των πρωτεϊνών σύντηξης µε την GFP. Α. Πρωτεΐνη σύντηξης GFP-rpS5 T(2) del. Β. Πρωτεΐνη σύντηξης GFP-rpS5 T(8) mut. Γ. Πρωτεΐνη σύντηξης GFP-rpS5 T(14) mut. Όπως χαρακτηριστικά φαίνεται στο πιο πάνω σχήµα, οι πρωτεΐνες σύντηξης GFP-rpS5 Τ(2) del., GFP-rpS5 Τ(8) mut. και GFP-rpS5 Τ(14) mut., παρουσιάζουν κοινό φαινότυπο, εντοπίζονται δηλαδή στο κυτταρόπλασµα, ή/και στη µεµβράνη των κυττάρων, και σε λίγες περιπτώσεις και στους πυρηνίσκους. Είναι χαρακτηριστικό όµως το γεγονός πως ο πυρήνας, σε όλες τις περιπτώσεις, είναι άδειος. 132

146 Ο µετασχηµατισµός των επιδεκτικών κυττάρων E.coli BL21(DE3) µε τα ανασυνδυασµένα πλασµίδια pgex-2τ-rps5 T(2)del., T(8)mut., έγινε σύµφωνα µε την τεχνική που περιγράφεται στην παράγραφο Β Ακολούθησε, όπως και στα προηγούµενα πειράµατα, παραγωγή των πρωτεϊνών σύντηξης GST-rpS5 Τ(2)del και GST-rpS5 T(8)mut. και καθαρισµός τους µε στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης, χρησιµοποιώντας τις συνθήκες για την έκφραση και τον καθαρισµό της GST-rpS5. Στο σχήµα Γ.19, φαίνεται ο καθαρισµός των δυο πρωτεϊνών σύντηξης GSTrpS5 Τ(2)del. και GST-rpS5 T(8)mut. Σχήµα Γ.19. SDS-ηλεκτροφόρηση των δυο εκλουσµάτων των δυο µεταλλαγµένων πρωτεϊνών έπειτα από στήλη γλουταθειόνης-σεφαρόζης. Τα ολικά εκχυλίσµατα που παρελήφθησαν µε λύση των κυττάρων, επωάστηκαν µε σφαιρίδια γλουταθειόνης-σεφαρόζης και ακολούθησαν εκλούσεις µε αναγµένη γλουταθειόνη. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, ιαδροµές 1, 3: 1 η έκλουση GST-rpS5 Τ(2)del. και GST-rpS5 Τ(8)mut., ιαδροµές 2, 4: 2 η έκλουση GST-rpS5 Τ(2)del. και GST-rpS5 Τ(8)mut., προϊόντα στα ~ 52.00Da. 133

147 Γ In vitro φωσφορυλίωση της GST-rpS5 T(2)del. και T(8)mut. από την κινάση της καζεΐνης II (CKII) Μετά την παραγωγή και αποµόνωση της πρωτεΐνης GST-rpS5 Τ(2)del., όπως αναφέρθηκε παραπάνω, αυτή εξετάστηκε ως προς τη φωσφορυλίωσή της από την CKII. Παράλληλα εξετάστηκε και η GST-rpS5 T(8)mut., αν και όπως έχει αναφερθεί στην παράγραφο Γ.1.9, η θεωρητική πρόβλεψη για φωσφορυλίωση της θρεονίνης στη θέση 8, Τ(8), είναι από άλλη κινάση. Τα πειράµατα της φωσφορυλίωσης περιγράφονται στην παράγραφο Β Η αυτοραδιογραφία που προέκυψε φαίνεται στο σχήµα Γ.20. Σχήµα Γ.20. Αυτοραδιογραφία πειραµάτων φωσφορυλίωσης των ανασυνδυασµένων χιµαιρικών πρωτεϊνών GST-rpS5 T(2) del. και GST-rpS5 T(8) mut., από την CKII. H GST, η καζεΐνη, η GST-rpS5, η GST-rpS5 1-37, η GST-rpS , GST-rpS5 T(2) del. και GST-rpS5 T(8) mut., επωάστηκαν µε την CKII, παρουσία θερµού και ψυχρού ATP. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-PAGE 10% v/v, χρώση των πρωτεϊνικών ζωνών, ξήρανση της πηκτής και αυτοραδιογραφία. Α. a. Αυτοραδιογραφία. ιαδροµή 1: πείραµα αναφοράς, (θετικό control), καζεΐνη ως υπόστρωµα, ιαδροµή 2: GST-rpS5 Τ(2)del. ως υπόστρωµα, ιαδροµή 3: GST-rpS5 T(8)mut. ως υπόστρωµα, ιαδροµή 4: GST-rpS5 w/t ως υπόστρωµα. 134

148 Α. b. Πηκτή SDS-PAGE 10% v/v, δείκτης ισόποσου φορτώµατος. B. a. Αυτοραδιογραφία. ιαδροµή 1: GST-rpS5 w/t ως υπόστρωµα, ιαδροµή 2: GST-rpS5 Τ(2)del. ως υπόστρωµα, ιαδροµή 3: GST-rpS5 T(8)mut. ως υπόστρωµα, ιαδροµή 4: GSTrpS ως υπόστρωµα, ιαδροµή 5: GST-rpS ως υπόστρωµα. Β. b. Πηκτή SDS-PAGE 10% v/v, δείκτης ισόποσου φορτώµατος. Στην αυτοραδιογραφία του πιο πάνω σχήµατος, φαίνεται πως η καζεΐνη φωσφορυλιώνεται όπως αναµένεται, η GST-rpS5 w/t, (πλήρους µήκους), φωσφορυλιώνεται και η GST-rpS51-37 φωσφορυλιώνεται, όπως φάνηκε και στα προηγούµενα πειράµατα, ενώ επίσης φωσφορυλιώνονται και οι GST-rpS5 T(2)del. και GST-rpS5 Τ(8)mut. Εποµένως, το συµπέρασµα που µπορεί να εξαχθεί είναι ότι η θρεονίνη στη θέση 2, Τ(2), πιθανώς δεν αποτελεί το αµινοξύ στο οποίο η CKII φωσφορυλιώνει την rps5. Το παράδοξο όµως είναι πως τόσο η GST-rpS5 T(2)del., όσο και η GST-rpS5 T(8)mut, φωσφορυλιώνονται σε µεγαλύτερο ποσοστό από ότι η GST-S5w/t και πολύ περισσότερο η δεύτερη, αν και όπως φαίνεται στο πιο πάνω σχήµα, η ποσότητα της πρωτεΐνης είναι ίδια σε όλες τις περιπτώσεις. Εποµένως, οι µεταλλαγµένες πρωτεΐνες ίσως αποκτούν µια τέτοια διαµόρφωση η οποία επιτρέπει στην κινάση CKII να τις φωσφορυλιώνει περισσότερο από ότι την GST-rpS5 w/t, (πλήρους µήκους). 135

149 Γ.2. Έκφραση της rps5 σε ευκαρυωτικά κύτταρα και µελέτη των ιδιοτήτων της Κατά την in vitro διαφοροποίηση των ερυθρολευχαιµικών κυττάρων MEL µε το χηµικό επαγωγέα διµεθυλοσουλφοξείδιο, (DMSO), παρατηρήθηκε η έκφραση του γονιδίου της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5 να καταστέλλεται, κατά την ανάλυση του επιπέδου του αντίστοιχου mrna, µε πειράµατα κατά Northern, (Vizirianakis, et al., 1999). Με βάση λοιπόν αυτό το γεγονός, αλλά και τα πειραµατικά δεδοµένα που αναφέρθηκαν στις προηγούµενες ενότητες, εµφανίστηκε το ενδιαφέρον διευκρίνησης πιθανών ρόλων της rps5 στο πρόγραµµα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων. Κατά τη δεύτερη φάση λοιπόν της εκπόνησης της συγκεκριµένης διδακτορικής διατριβής, έγινε προσπάθεια να απαντηθεί το ερώτηµα αυτό, κατά πόσο η υπερέκφραση της rps5 σε ευκαρυωτικά κύτταρα, (MEL), επιφέρει αλλαγές στην κυτταρική ανάπτυξη τους, αλλά και στην έναρξη του προγράµµατος διαφοροποίησης τους. Γ.2.1. Κλωνοποίηση του πλήρους µήκους cdna rps5 του ποντικού στον ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pcdna-3.1(-) Myc/His Β Με βάση την ήδη γνωστή ακολουθία της rps5, σχεδιάστηκαν δύο ολιγονουκλεοτίδια, τα οποία χρησιµοποιήθηκαν ως εκκινητές στην αντίδραση PCR, προκειµένου να γίνει κλωνοποίηση της rps5 στον ευκαρυωτικό φορέα έκφρασης pcdna-3.1. Ο σχεδιασµός των εκκινητών έγινε µε τέτοιο τρόπο, έτσι ώστε να καταστραφεί το κωδικόνιο τερµατισµού στο mrna της rps5, και να επιτραπεί η εισαγωγή του Myc/His επιτόπου του φορέα. Με αυτόν τον τρόπο είναι δυνατή η διαφοροποίηση της ενδογενούς και εξωγενούς παραγόµενης rps5, αλλά και των αντίστοιχων mrnas. Ο ένας εκκινητής, (5'), περιέχει την ακολουθία αναγνώρισης για το ένζυµο περιορισµού EcoR I και ο άλλος, (3'), για το ένζυµο BamH I. Ως εκµαγείο χρησιµοποιήθηκε ο πλασµιδιακός φορέας pbluescript, στον οποίο ήταν κλωνοποιηµένο το γονίδιο της rps5. Η ακολουθία των εκκινητών, καθώς και οι συνθήκες της PCR, αναφέρονται στην παράγραφο Β Μετά το τέλος της αντίδρασης, το µίγµα ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1%w/v. Παράλληλα, πραγµατοποιήθηκε και αντίδραση στις ίδιες συνθήκες, απουσία εκµαγείου. Στο σχήµα Γ.21, φαίνεται το προϊόν που προέκυψε στο αναµενόµενο µοριακό µέγεθος, ~ 620bp. 136

150 . Σχήµα Γ.21. Ηλεκτροφορητική ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης των αντιδράσεων PCR για την αποµόνωση του πλήρους µεγέθους cdna της rps5. Ανάλυση προϊόντων σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. Μ: µάρτυρες µοριακού µεγέθους 1kb, ιαδροµές 1, 3: Αντίδραση παρουσία εκµαγείου, προϊόν στα ~ 620 bp, ιαδροµή 2, 4: Αντίδραση απουσία εκµαγείου. Η ζώνη του DNA τµήµατος που αντιστοιχεί στα ~ 620bp, στις διαδροµές 1 κ 3, εκχυλίστηκε από την πηκτή αγαρόζης και κατόπιν ακολούθησε η ίδια διαδικασία που αναφέρεται και στην παράγραφο Γ.1, προκειµένου να παραχθεί το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pcdna-3.1-rps5. Η πιστοποίηση πως το cdna της rps5, είχε εισαχθεί στο πλασµίδιο µε τον σωστό, (νοηµατικό), προσανατολισµό, σε σχέση µε τον CMV προαγωγέα σταθερής έκφρασης, έγινε µε νουκλεοτιδική ανάλυση, (sequencing). Γ.2.2. Μόνιµη επιµόλυνση των ερυθρολευχαιµικών κυττάρων MEL (stable transfection) Για τη διερεύνηση του ρόλου της rps5 στην κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση, ακολούθησε η προσπάθεια µόνιµης επιµόλυνσης των κυττάρων MEL µε το ανασυνδυασµένο cdna της rps5 και η δηµιουργία µόνιµης κυτταρικής καλλιέργειας. Συγκεκριµένα, στα MEL κύτταρα έγινε η εισαγωγή χωριστά και σε διαφορετικές καλλιέργειες µε γονιδιακή µεταφορά, (transfection), των πλασµιδίων που αναφέρονται παρακάτω: του ανασυνδυασµένου φορέα pcdna3.1-rps5 sense, για 137

151 τη δηµιουργία µόνιµης καλλιέργειας MEL κυττάρων, που θα παράγει το ανασυνδυασµένο cdna της rps5 και του ανασυνδυασµέου φορέα pcdna3.1-rps5 antisense, στον οποίο το γονίδιο της rps5 ήταν κλωνοποιηµένο στο φορέα pcdna3.1, σε αντινοηµατικό προσανατολισµό ως προς τον CMV προαγωγέα, (προσφορά από το Εργαστήριο Φαρµακολογίας, από τον Dr. Βιζιριανάκη). Η διαδικασία που ακολουθήθηκε περιγράφεται στην παράγραφο Β β, και οι καλλιέργειες που τελικά προέκυψαν, αποτέλεσαν τη δεξαµενή, (pool),από την οποία χρησιµοποιήθηκαν κύτταρα για τα πειράµατα που ακολούθησαν. Έτσι, δηµιουργήθηκαν οι κυτταρικές καλλιέργειες MEL-pcDNA-3.1-rpS5 sense και MELpcDNA-3.1-rpS5 antisense. Γ.2.3. Αποµόνωση, έλεγχος της έκφρασης και τελική επιλογή κλώνων από τα MEL επιµολυσµένα κύτταρα µε τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα MELpcDNA-3.1-rpS5 sense Η µεθοδική και ταυτόχρονα µακροχρόνια µελέτη των MEL κυττάρων στο Εργαστήριο Φαρµακολογίας, εξασφάλισε πολύτιµη εµπειρία στο χώρο των καλλιεργειών. Απόρροια αυτής της εµπειρίας, είναι και η διαπίστωση ότι η συνεχής καλλιέργεια των επιµολυσµένων κυττάρων µε ανασυνδυασµένο πλασµίδιο, µπορεί να οδηγήσει προοδευτικά σε µικρότερη ικανότητα έκφρασης του γονιδίου, στην περίπτωση επίδρασης στην κυτταρική ανάπτυξη του εκφραζόµενου γονιδίου. Εξαιτίας αυτού, εφαρµόσθηκε η διεθνής πρακτική της επιλογής κλώνων, οι οποίοι θα εκφράζουν µόνιµα και σταθερά το γονίδιο µε το οποίο επιµολύνθηκαν τα κύτταρα, και της δηµιουργίας ανεξαρτήτων κυτταρικών καλλιεργειών. Στην παρούσα διατριβή, η διαδικασία αυτή ακολουθήθηκε για τα επιµολυσµένα κύτταρα MEL µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pcdna-3.1-rps5 sense. Η διαδικασία της επιλογής έχει ως εξής: MEL κύτταρα επιµολυσµένα µε το pcdna-3.1-rps5 sense, (pool κυττάρων), αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό µέσο DMEM που περιείχε 10% v/v ορό εµβρύου µόσχου, (FCS), 1% v/v αντιβιοτικό πενικιλίνης-στρεπτοµυκίνης, (PS), και το αντιβιοτικό επιλογής νεοµυκίνη, (G-418, 0.6 mg/ml), για το φορέα pcdna-3.1. Καλλιέργεια 8x10 5 κύτταρα/ml αραιώθηκε διαδοχικά, ( ), ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 10 1 κύτταρα/ml. Στη συνέχεια, τοποθετήθηκε 0.1ml από το εναιώρηµα αυτό των κυττάρων σε κάθε υποδοχή ενός µικροτρυβλίου 96 υποδοχέων, (96-well-plate), έτσι ώστε δυνητικά να υπάρχει ένα µόνο κύτταρο σε 138

152 κάθε υποδοχέα. Τα κύτταρα σε κάθε υποδοχέα ελέγχθηκαν ως προς τον αριθµό τους, αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε επωαστήρα καλλιεργειών, (37 ο C, 5% CO 2 ), για µια εβδοµάδα περίπου και τελικά επιλέχθηκαν οι κλώνοι εκείνοι στους οποίους υπήρχε µια και µοναδική αποικία κυττάρων, (ένδειξη ότι αρχικά είχε τοποθετηθεί στον εκάστοτε υποδοχέα ένα µόνο κύτταρο). Με τον τρόπο αυτό αποµονώθηκαν 50 κλώνοι, από τους οποίους δηµιουργήθηκαν αποθέµατα, τα οποία φυλάχτηκαν σε δεξαµενή υγρού αζώτου. Γ.2.4. Έλεγχος των αποµονωµένων κλώνων ως προς την ικανότητα έκφρασης του mrna της εξωγενούς rps5 Προκειµένου να ελεγχθεί ποιοι από τους κλώνους που αποµονώθηκαν και έδωσαν την ανάπτυξη των αντίστοιχων καλλιεργειών, εκφράζουν το ανασυνδυασµένο cdna της rps5, αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υγρό DMEM, παρουσία όλων των απαραίτητων παραγόντων και του αντιβιοτικού επιλογής, (G-418, 0.6mg/ml). Κατόπιν, έγινε αποµόνωση ολικού κυτταροπλασµατικού RNA, σύµφωνα µε την τεχνική που περιγράφεται στην παράγραφο Β Ολικό κυτταροπλασµατικό RNA αποµονώθηκε και από MEL κύτταρα που δεν επιµολύνθηκαν µε πλασµιδιακό φορέα, προκειµένου το RNA αυτό να χρησιµοποιηθεί ως µάρτυρας. Στη συνέχεια, ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης-φορµαλδεΰδης, (παράγραφος Β.2.29), 10µg ολικού κυτταροπλασµατικού RNA από το κάθε δείγµα, και µεταφορά κατά Northern, (παράγραφος Β.2.30). Κατόπιν, πραγµατοποιήθηκε in vitro [ 32 -P] ραδιοεπισήµανση DNA ιχνηλάτη, χρησιµοποιώντας το multiprime DNA labeling system kit, (παράγραφος Β.2.33). Ως DNA ιχνηλάτης χρησιµοποιήθηκε το cdna της rps5, το οποίο προέκυψε έπειτα από πέψη του ανασυνδυασµένου πλασµιδίου pbluescript-rps5, µε τα ένζυµα περιορισµού EcoR I και Xho I και εκχύλιση του αντίστοιχου DNA τµήµατος από την πηκτή αγαρόζης µε βάση τον καθαρισµό της µε το σύστηµα Gel Extraction Kit, όπως φαίνεται στο σχήµα Γ

153 Σχήµα Γ.22. Ηλεκτροφορητική ανάλυση και αποµόνωση του DNA τµήµατος που αντιστοιχεί στο cdna της rps5 και χρησιµοποιήθηκε για τον υβριδισµό των µεµβρανών στην ανάλυση κατά Northern. Πέψη του ανασυνδυασµένου πλασµιδίου pbluescript-rps5 µε τα ένζυµα περιορισµού EcoR I, Xho I, εκχύλιση του τµήµατος DNA από την πηκτή. Ανάλυση προϊόντων σε πηκτή αγαρόζης 1% w/v. A. Μ: µάρτυρες µοριακού µεγέθους 1kb, ιαδροµές 1, 2: προϊόν στα ~ 700 bp. Β. Μ: µάρτυρες µοριακού µεγέθους 1kb, ιαδροµή 1: Ιχνηλάτης rps5. Στη συνέχεια, πραγµατοποιήθηκε υβριδισµός των µεµβρανών µε τον ραδιοεπισηµασµένο ιχνηλάτη, ενώ το αποτέλεσµα της αυτοραδιογραφίας φαίνεται στο σχήµα Γ

154 Σχήµα Γ.23. Αυτοραδιογραφία µετά από Northern ανάλυση για την επιλογή των MEL κλώνων µε τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα pcdna-3.1-rps5. Αποµόνωση ολικού κυτταροπλασµατικού RNA, (10µg), και ανάλυση µε υβριδισµό κατά Northern. Για την ανάλυση χρησιµοποιήθηκε ο ιχνηλάτης του γονιδίου της rps5, που φαίνεται στο σχήµα Γ.22. Το 18S και το 28S, χρησιµοποιήθηκαν ως πρότυποι ιχνηλάτες. ιαδροµή 1: ολικό κυτταροπλασµατικό RNA από MEL κύτταρα, ιαδροµές 2-14: ολικό κυτταροπλασµατικό RNA από 13 κλώνους, ένας από αυτούς θετικός, ο C 14. Όπως φαίνεται στο σχήµα Γ.23, από τους 13 κλώνους, στον ένα µόνο, τον C 14, (διαδροµή 2), εκφράζονται δυο µετάγραφα για το γονίδιο της S5 ριβοσωµικής πρωτεΐνης: το µετάγραφο του ενδογενούς γονιδίου, ( mrna rps5 ενδογ.), µε µέγεθος ~715 bp και ένα µεγαλύτερου µεγέθους, (mrna rps5 εξωγ.), που αντιστοιχεί στο ανασυνδυασµένο cdna που ενσωµατώθηκε µε τη βοήθεια του ανασυνδυασµένου φορέα pcdna-3.1-rps5. Η διαφορά στο µέγεθος οφείλεται στο ότι το ανασυνδυασµένο cdna της rps5 περιέχει αλληλουχίες του πλασµιδιακού φορέα για την πολυαδενυλίωση του mrna, οι οποίες διαφέρουν από τις αντίστοιχες του ενδογενούς γονιδίου. Από τις αυτοραδιογραφίες των υπολοίπων κλώνων, πέραν αυτών που φαίνονται στο σχήµα Γ.23, δεν προέκυψε κάποιος άλλος θετικός, να εκφράζει δηλαδή δυο µετάγραφα για το γονίδιο της rps5, (τα σχήµατα αυτά δεν παρουσιάζονται). 141

155 Γ.2.5. Επιβεβαίωση της ύπαρξης του θετικού κλώνου C14 µε την τεχνική της Αντίστροφης Τρανσκριπτάσης PCR (RT-PCR) Στην παράγραφο Γ.2.4, επιβεβαιώθηκε, µε Northern ανάλυση, η ύπαρξη ενός θετικού κλώνου, του C14, ο οποίος εκφράζει δυο µετάγραφα του γονιδίου της rps5. Η ύπαρξη του κλώνου αυτού πιστοποιήθηκε επίσης µε την τεχνική της RT-PCR. Σύµφωνα µε την τεχνική αυτή, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.14, το mrna ενός γονιδίου µετατρέπεται σε cdna, µε τη βοήθεια του ενζύµου αντίστροφη τρανσκριπτάση και στη συνέχεια αυτό πολλαπλασιάζεται µε τη χρήση µιας πολυµεράσης. Οι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν και η συνθήκες της αντίδρασης περιγράφονται αναλυτικά στην παράγραφο Β Στο σχήµα Γ.24, φαίνεται η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1.5% w/v, των προϊόντων των αντιδράσεων της RT-PCR. Σχήµα Γ.24. RT-PCR σε ολικό κυτταροπλασµατικό RNA για την επιβεβαίωση της έκφρασης του ανασυνδυασµένου cdna της rps5 στον κλώνο C 14. Ολικό κυτταροπλασµατικό RNA, (0.5 µg), από MEL parental κύτταρα και κύτταρα MELrpS5 C14, χρησιµοποιήθηκε σαν εκµαγείο για τις αντιδράσεις της RT-PCR. Τα ζευγάρια των εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν ήταν δυο: µε το πρώτο λαµβάνεται προϊόν που αντιστοιχεί στην ενδογενή rps5, ενώ µε το δεύτερο, λαµβάνεται προϊόν που αντιστοιχεί στην εξωγενή rps5. 142

156 Ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR σε πηκτή αγαρόζης 1.5% w/v. Μ: µάρτυρες µοριακού µεγέθους 1kb, ιαδροµή 1: PCR αντίδραση µε εκµαγείο ολικό κυτταροπλασµατικό RNA των MEL κυττάρων µε τη χρήση εκκινητών σχεδιασµένων για ανίχνευση του ενδογενούς µεταγραφήµατος της rps5, (προϊόν-dna fragment στα ~ 620 bp), ιαδροµή 2: PCR αντίδραση µε εκµαγείο ολικό κυτταροπλασµατικό RNA των MEL κυττάρων, µε τη χρήση εκκινητών σχεδιασµένων για ανίχνευση του εξωγενούς ανασυνδυασµένου µεταγραφήµατος της rps5, (καθόλου προϊόν, όπως αναµένεται), ιαδροµή 3: PCR αντίδραση µε εκµαγείο ολικό κυτταροπλασµατικό RNA των MEL-rpS5 C14 κυττάρων, µε τη χρήση εκκινητών σχεδιασµένων για ανίχνευση του ενδογενούς µεταγραφήµατος της rps5, (προϊόν-dna fragment στα ~ 620 bp, όπως και στην περίπτωση των MEL κυττάρων, διαδροµή 1), ιαδροµές 4, 5: PCR αντίδραση µε εκµαγείο ολικό κυτταροπλασµατικό RNA MEL-rpS5 C14 κυττάρων που αποµονώθηκε σε διαφορετικές χρονικές στιγµές, µε τη χρήση εκκινητών σχεδιασµένων για ανίχνευση του εξωγενούς ανασυνδυασµένου µεταγραφήµατος της rps5, (προϊόν στα ~ 700bp, όπως αναµένεται µε βάση τον αρχικό σχεδιασµό του ανασυνδυασµένου φορέα pcdna-3.1-rps5). Όπως φαίνεται στο πιο πάνω σχήµα, ανάλογα µε την επιλογή των εκκινητών και του εκµαγείου, λαµβάνεται προϊόν διαφορετικού µοριακού µεγέθους για το ενδογενές και το ανασυνδυασµένο mrna της rps5 του ποντικού, γεγονός που έρχεται να επιβεβαιώσει την ύπαρξη του θετικού κλώνου C14, όπως υπήρξε µε βάση την ανάλυση κατά Northern. Γ.2.6. Ανάπτυξη πολυκλωνικού αντισώµατος για την ανίχνευση της rps5 Για την ανίχνευση της rps5, αναπτύχθηκε πολυκλωνικό αντίσωµα, (αντιορός), στο εργαστήριο µας, µε την ανοσοποίηση κουνελιού, ακολουθώντας την τεχνική που περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.6. Παράλληλα, µας χορηγήθηκε από τον Dr. Fukushi, (Research and Development Center, Biomedical Laboratories, Matoba Kawagoe, Saitama, Japan), πολυκλωνικό αντίσωµα που είχε παρασκευάσει στο εργαστήριό του, µε ανοσοποίηση κουνελιού έναντι ενός πεπτιδίου, της C-τελικής περιοχής της rps5. Προκειµένου να ελεγχθούν τα δυο αντισώµατα ως προς την ικανότητα ανίχνευσης της rps5, ποσότητα πρωτεΐνης που αποµονώθηκε από κύτταρα E.coli και MEL, ηλεκτροφορήθηκε σε πηκτή SDS-PAGE 12 %v/v και ακολούθησε µεταφορά σε µεµβράνη, (Western blot) και τελικά, µε τη χρήση των αντισωµάτων χωριστά, έγινε ανοσοανίχνευση της rps5. Οι τεχνικές αυτές περιγράφονται στις 143

157 παραγράφους Β.2.7 και Β.2.8. Στο σχήµα Γ.25, φαίνονται τα αποτελέσµατα που πάρθηκαν έπειτα από την ανοσοανίχνευση της rps5, µε τα δυο αντισώµατα. Σχήµα Γ.25. Ανάλυση κατά Western και ανοσοανίχνευση της rps5 µε πολυκλωνικά αντισώµατα. είγµατα ολικής κυτταροπλασµατικής πρωτεΐνης που αποµονώθηκε από βακτηριακά και ευκαρυωτικά κύτταρα, αναλύθηκαν κατά Western. Τα πολυκλωνικά αντισώµατα χρησιµοποιήθηκαν σε αραίωση 1:1000. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, ιαδροµή 1: ανοσοανίχνευση της rps5 από κυτταρικό εκχύλισµα E.coli, χρησιµοποιώντας το αντίσωµα, που παρασκευάστηκε στο εργαστήριο µας, πρωτεϊνική ζώνη στο αναµενόµενο µοριακό µέγεθος ~ Da, άγνωστη ζώνη στα ~ Da, ιαδροµή 2: ανοσοανίχνευση της GSΤ-rpS5, πρωτεϊνική ζώνη στο αναµενόµενο µοριακό µέγεθος ~ Da, ιαδροµή 3: ανοσοανίχνευση της rps5 από κυτταρικό εκχύλισµα MEL κυττάρων, πρωτεϊνική ζώνη στο αναµενόµενο µοριακό µέγεθος ~ Da, το αντίσωµα που χρησιµοποιήθηκε ήταν του Dr. Fukushi. Όπως φαίνεται στο σχήµα Γ.25, τόσο το αντίσωµα που παρασκευάστηκε στο εργαστήριο µας, όσο και αυτό του Dr. Fukushi, ανιχνεύουν ικανοποιητικά την rps5. Το πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι της C-τελικής περιοχής, αναγνωρίζει µια ζώνη, η οποία ταυτόχρονα είναι και έντονη. Για το λόγο αυτό στα πειράµατα ανίχνευσης της rps5, χρησιµοποιήθηκε αυτό το αντίσωµα και όχι εκείνο που παρασκευάσαµε στο εργαστήριο. 144

158 Γ.2.7. Ανίχνευση της rps5 πρωτεΐνης στον κλώνο MEL-rpS5 C14, που είναι κύτταρα µόνιµα επιµολυσµένα µε τον ανασυνδυασµένο πλασµιδιακό φορέα pcdna-3.1-rps5 Προκειµένου να διαπιστωθεί αν η rps5 υπερεκφράζεται στον κλώνο C14, ο οποίος εµφάνισε αυξηµένη έκφραση του mrna της ανασυνδυασµένης, (εξωγενούς), rps5, αναλύθηκαν οι πρωτεΐνες κατά Western, για την ανοσοανίχνευση της rps5 στα κυτταρικά εκχυλίσµατα. Οι προαναφερθείσες τεχνικές περιγράφονται στην παράγραφο Β.2.7 και Β.2.8. Συγκεκριµένα, τα αποτελέσµατα αυτής της ανάλυσης φαίνονται στο σχήµα Γ.26, ύστερα από την παραπάνω διαδικασία. Σχήµα Γ.26. Ανάλυση κατά Western και ανοσοανίχνευση της rps5. είγµατα ολικής κυτταροπλασµατικής πρωτεΐνης που αποµονώθηκε από κύτταρα MEL και MEL-rpS5 C14 αναλύθηκαν κατά Western. Τα πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι της C-τελικής περιοχής χρησιµοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, ιαδροµές 1, 3, 5, 7: ανοσοανίχνευση της rps5 από 10µg, 20µg, 30µg, 40µg ολικής κυτταροπλασµατικής πρωτεΐνης MEL κυττάρων, πρωτεϊνική ζώνη στο αναµενόµενο µοριακό µέγεθος ~ Da, ιαδροµές 2, 4, 6, 8: ανοσοανίχνευση της rps5 από 10µg, 20µg, 30µg, 40µg ολικής κυτταροπλασµατικής πρωτεΐνης κυττάρων MEL-rpS5 C14, πρωτεϊνική ζώνη στο αναµενόµενο µοριακό µέγεθος ~ Da, (ενδογενής πρωτεΐνη). Σύµφωνα λοιπόν µε αυτά τα αποτελέσµατα, φαίνεται πως στον κλώνο C14, στον οποίο παρατηρήθηκε αυξηµένη έκφραση του mrna της εξωγενούς rps5, δεν ανιχνεύεται η εξωγενής πρωτεΐνη σε µοριακό βάρος ~ Da, (σε αναµενόµενο µεγαλύτερο µοριακό βάρος από την ενδογενή πρωτεΐνη S5, εξαιτίας του myc επιτόπου και της ουράς των έξι ιστιδινών που προστέθηκαν κατά το σχεδιασµό της ανασυνδυασµένης rps5), όπως ήταν αναµενόµενο. Αυτό που πιθανά µπορεί να 145

159 συµβαίνει είναι η έκφραση της εξωγενούς πρωτεΐνης να είναι τόσο µικρή, ώστε να µην µπορεί να ανιχνευθεί από 40µg ολικής κυτταροπλασµατικής πρωτεΐνης. Προκειµένου να διερευνηθεί περαιτέρω η ανίχνευσης της εξωγενούς rps5, σχεδιάστηκαν τα πειράµατα που περιγράφονται στις παραγράφους Γ.2.9 και Γ Γ.2.8. Ανίχνευση της rps5 σε κύτταρα 293Τ, παροδικά επιµολυσµένα µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pcdna-3.1-rps5 Προκειµένου να επιβεβαιωθεί πως το σύστηµα που είχε επιλεγεί, (δηλαδή ο συγκεκριµένος πλασµιδιακός φορέας, pcdna-3.1), είναι λειτουργικό, έγινε παροδική επιµόλυνση των 293Τ κυττάρων, (ανθρώπινα εµβρυϊκά, νεφρικά κύτταρα), µε τη µέθοδο του CaCl 2, η οποία περιγράφεται αναλυτικά στην παράγραφο Β Στη συνέχεια, ακολούθησε ανάλυση κατά Western και ανοσοανίχνευση, χρησιµοποιώντας δυο αντισώµατα, το anti-myc, (έναντι του myc επιτόπου) και το anti S5, (έναντι της C-τελικής περιοχής της rps5). Στο σχήµα Γ.27, φαίνονται τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από την παραπάνω διαδικασία. Σχήµα Γ.27. Ανάλυση κατά Western και ανοσοανίχνευση της rps5 στα ανθρώπινα εµβρυϊκά, νεφρικά κύτταρα, 293Τ. είγµατα ολικής κυτταροπλασµατικής πρωτεΐνης, (40µg), που αποµονώθηκε από κύτταρα 293Τ επιµολυσµένα µε τον φορέα pcdna-3.1 και µε τον ανασυνδυασµένο φορέα pcdna- 3.1-rpS5, αναλύθηκαν κατά Western. Το πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι της C-τελικής περιοχής χρησιµοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000, ενώ το µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι του myc επιτόπου, χρησιµοποιήθηκε σε αραίωση 1:2500. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, 146

160 Α. ιαδροµή 1: ανοσοανίχνευση της rps5 εξωγενούς πρωτεΐνης σύντηξης µε το myc επίτοπο, από ολικό κυτταροπλασµατικό εκχύλισµα 293Τ κυττάρων, παροδικά επιµολυσµένων µε το pcdna-3.1-rps5, χρησιµοποιώντας anti-myc αντίσωµα, πρωτεϊνική ζώνη στο αναµενόµενο µοριακό µέγεθος ~ Da, ιαδροµή 2: ολική κυτταροπλασµατική πρωτεΐνη, 293Τ κυττάρων, παροδικά επιµολυσµένων µε το pcdna-3.1, χρησιµοποιώντας anti-myc αντίσωµα, δείγµα αναφοράς, (control), καµία πρωτεϊνική ζώνη δεν ανιχνεύεται. Β. ιαδροµή 1: ανοσοανίχνευση της rps5 εξωγενούς πρωτεΐνης από ολικό κυτταροπλασµατικό εκχύλισµα 293Τ κυττάρων, παροδικά επιµολυσµένων µε το pcdna-3.1- rps5, χρησιµοποιώντας anti S5 αντίσωµα, δυο πρωτεϊνικές ζώνες στα ~ Da, (εξωγενής), και στα ~ Da, (ενδογενής), ιαδροµή 2: ολική κυτταροπλασµατική πρωτεΐνη, 293Τ κυττάρων παροδικά επιµολυσµένων µε το pcdna-3.1 χρησιµοποιώντας anti S5 αντίσωµα, δείγµα αναφοράς, (control), µια πρωτεϊνική ζώνη στο αναµενόµενο µοριακό µέγεθος ~ Da, (ενδογενής). Όπως προκύπτει από τα αποτελέσµατα που πάρθηκαν, η ανίχνευση της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης έγινε δυνατή στα 293Τ κύτταρα, γεγονός που αποδεικνύει πως ο ανασυνδυασµένος φορέας που δηµιουργήθηκε είναι λειτουργικός, αφού χρησιµοποιώντας µια άλλη κυτταρική σειρά και επιµολύνοντας τα κύτταρα αυτά µε το γονίδιο της rps5, είναι δυνατή η ανίχνευση της εξωγενούς πρωτεΐνης, µε τη χρήση διαφορετικών αντισωµάτων. Η µη δυνατότητα ανίχνευσης της ανασυνδυασµένης πρωτεΐνης στα MEL κύτταρα, που είχαν µόνιµα επιµολυνθεί µε τον ανασυνδυασµένο φορέα pcdna-3.1-rps5, οφείλεται είτε σε µειωµένη ποσότητα παραγωγής της πρωτεΐνης, είτε αφορά στη φύση των ίδιων των κυττάρων. Γ.2.9. Ανίχνευση της rps5 πρωτεΐνης σε κύτταρα MEL, παροδικά επιµολυσµένα µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pcdna-3.1-rps5 Το γεγονός ότι η εξωγενής πρωτεΐνη rps5 δεν ανιχνεύεται στον κλώνο C14, (MEL κύτταρα µόνιµα επιµολυσµένα µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pcdna-3.1- rps5), ενώ ανιχνεύεται µετά την παροδική επιµόλυνση των κυττάρων 293Τ µε το ίδιο ανασυνδυασµένο πλασµίδιο, οδήγησε στην εξέταση µιας ακόµη παραµέτρου, αυτής που αφορά σε µόνιµη ή παροδική έκφραση του φορέα. Για το σκοπό αυτό, κύτταρα MEL επιµολύνθηκαν παροδικά,, παράλληλα µε τα κύτταρα 293Τ, µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pcdna-3.1-rps5, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β α. Στη συνέχεια, ακολούθησε παραλαβή των κυτταρικών εκχυλισµάτων, 147

161 ανάλυση κατά Western και ανοσοανίχνευση, χρησιµοποιώντας το αντίσωµα anti S5. Στο σχήµα Γ.28, φαίνονται τα αποτελέσµατα που πάρθηκαν. Σχήµα Γ.28. Ανάλυση κατά Western και ανοσοανίχνευση µε το αντίσωµα anti S5 των κυτταρικών εκχυλισµάτων µετά την παροδική επιµόλυνση MEL και 293Τ κυττάρων. είγµατα ολικής κυτταροπλασµατικής πρωτεΐνης, (60µg), που αποµονώθηκε από κύτταρα 293Τ και MEL, επιµολυσµένα µε τον ανασυνδυασµένο φορέα pcdna-3.1-rps5, αναλύθηκαν κατά Western. Το πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι της C-τελικής περιοχής χρησιµοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. ιαδροµή 1: ανοσοανίχνευση της rps5 από ολικό κυτταροπλασµατικό εκχύλισµα 293Τ κυττάρων, παροδικά επιµολυσµένων µε το pcdna-3.1-rps5, (1.0µg), χρησιµοποιώντας anti S5 αντίσωµα, δυο πρωτεϊνικές ζώνες στα ~ Da, (εξωγενής), και στα ~ Da, (ενδογενής), ιαδροµές 2, 3, 4: ανοσοανίχνευση της rps5 από ολικό κυτταροπλασµατικό εκχύλισµα MEL κυττάρων, παροδικά επιµολυσµένων µε το pcdna-3.1-rps5 σε αναλογία 0.5µg, 1.0 µg και 2.0 µg χρησιµοποιώντας anti S5 αντίσωµα, µια πρωτεϊνική ζώνη στα ~ Da, (ενδογενής). Συνοψίζοντας τα αποτελέσµατα που προέκυψαν από τα πειράµατα παροδικής επιµόλυνσης των κυττάρων 293Τ και MEL, καταλήγουµε στις πιο κάτω υποθέσεις: Η εξωγενής rps5, εκφράζεται και αναγνωρίζεται από τα αντισώµατα µόνο στην κυτταρική σειρά 293Τ και όχι στα MEL κύτταρα, ανεξαρτήτου µεθόδου επιµόλυνσης, (παροδικής ή µόνιµης). Λαµβάνοντας υπόψη τα αποτελέσµατα της παραγράφου Γ.2.5, υποθέτουµε πως το γονίδιο της rps5, στα µόνιµα επιµολυσµένα MEL κύτταρα, 148

162 έχει ενσωµατωθεί στο γονιδίωµα σε κάποια θέση, έτσι ώστε να µην υπάρχει πρόβληµα έκφρασής του. Σε επίπεδο πρωτεΐνης, η ανίχνευση δεν είναι δυνατή ίσως διότι το ποσό είναι πού µικρό, ή διότι το mrna δεν µεταφράζεται. Γ Μελέτη της συµπεριφοράς των µόνιµα επιµολυσµένων κυττάρων MEL µε το ανασυνδυασµένο πλασµίδιο pcdna-3.1-rps5, (καλλιέργεια του κλώνου C14), ως προς την κυτταρική ανάπτυξη Από τη στιγµή που βρέθηκε ένας κλώνος να εκφράζει το mrna της εξωγενούς πρωτεΐνης S5, το πρώτο πείραµα που έλαβε χώρα ήταν η διερεύνηση της κυτταρικής ανάπτυξης της συγκεκριµένης καλλιέργειας σε σχέση µε καλλιέργειες αναφοράς, (control). Στο συγκεκριµένο πείραµα χρησιµοποιήθηκαν οι εξής καλλιέργειες: MEL κύτταρα (parental), MEL rps5 antisense, (κύτταρα επιµολυσµένα µε το γονίδιο της S5 σε αντινοηµατική κατεύθυνση ως προς τον προαγωγέα), MEL rps5 C14, (θετικός κλώνος), MEL mock, (κύτταρα επιµολυσµένα µε τον πλασµιδιακό φορέα pcdna- 3.1) και MEL 8R resistant, (κλώνος των MEL κυττάρων ο οποίος παρουσιάζει ανθεκτικότητα στην επαγώµενη διαφοροποίηση µε DMSO). Οι δύο τελευταίοι κλώνοι δόθηκαν από το Εργαστήριο Φαρµακολογίας, (Dr. Βιζιριανάκης). Ετοιµάστηκαν καλλιέργειες αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml και αφέθηκαν να αναπτυχθούν παρουσία θρεπτικού µέσου DMEM που περιείχε 10% v/v FCS και 100 µg/ml από κάθε αντιβιοτικό πενικιλίνης και στρεπτοµυκίνης. Στις καλλιέργειες MEL rps5 antisense, MEL rps5 C14 και MEL mock, προστέθηκε και το αντιβιοτικό επιλογής, (G-418), σε συγκέντρωση 0.6 mg/ml. Ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγµα από την κάθε καλλιέργεια και στη συνέχεια γινόταν µέτρηση των κυττάρων, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β Στο σχήµα Γ.29, φαίνεται η κινητική της ανάπτυξης των συγκεκριµένων καλλιεργειών. 149

163 1000 x10 4 κύτταρα/ml Χρόνος (Ηµέρες) MEL parental MELrpS5 C14 MEl 8R resistant MEL rps5 antisense MEL mock Σχήµα Γ.29. Κινητική ανάπτυξης της καλλιέργειας MEL rps5 C14 και των καλλιεργειών αναφοράς, (control). Κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14 και των καλλιεργειών αναφοράς, αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml, αναπτύχθηκαν για 4 µέρες, (96 ώρες), σε κατάλληλο θρεπτικό µέσο. Ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγµα και γινόταν µέτρηση των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο πιο πάνω διάγραµµα, τα κύτταρα στην καλλιέργεια MEL rps5 C14, αναπτύσσονται µε µικρότερο ρυθµό από τις καλλιέργειες αναφοράς, φτάνουν όµως στα επίπεδα των καλλιεργειών αναφοράς, την τέταρτη µέρα της ανάπτυξής τους. Το επόµενο που εξετάστηκε, ήταν η συµπεριφορά της καλλιέργειας MEL rps5 C14, ως προς την κινητική ανάπτυξης των κυττάρων, παρουσία του χηµικού επαγωγέα DMSO. Παράλληλα, προσδιορίστηκε το ποσοστό διαφοροποίησης της συγκεκριµένης καλλιέργειας. Έτσι, όπως και στο προηγούµενο πείραµα, ετοιµάστηκαν οι ίδιες καλλιέργειες, µε τη διαφορά ότι προστέθηκε στην κάθε µια ο χηµικός επαγωγέας DMSO, (1.5% v/v). Ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγµα από την κάθε καλλιέργεια και στη συνέχεια γινόταν µέτρηση των κυττάρων όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.22, καθώς και προσδιορισµός του ποσοστού κυτταρικής διαφοροποίησης, µε τη µέθοδο βενζιδίνης-h 2 O 2, (παράγραφος Β.2.23.). Στο σχήµα Γ.30, φαίνεται η κινητική της ανάπτυξης των καλλιεργειών, καθώς και η κινητική διαφοροποίησης των κυττάρων κάτω από αυτές τις συνθήκες. 150

164 A x10 4 κύτταρα/ml Χρόνος (Ηµέρες) MEL parental MELrpS5 antisense MELrpS5 C14 MEL mock MEL8R resistant B. Bz+ (% of control) Χρόνος (Ηµέρες) MEL parental MEL rps5 C14 Mel 8R resistant MEL rps5 antisense MEL mock Σχήµα Γ.30. Κινητική ανάπτυξης της καλλιέργειας C14 σε σχέση µε τις καλλιέργειες αναφοράς, (control). Κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14 και των καλλιεργειών αναφοράς, αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml, αναπτύχθηκαν για 4 ηµέρες, (96 ώρες), σε κατάλληλο θρεπτικό µέσο, παρουσία του χηµικού επαγωγέα DMSO, 1.5% v/v. Ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγµα και γινόταν συνολική µέτρηση των κυττάρων, καθώς και µέτρηση των κυττάρων που χρωµατίζονταν µπλε µε τη µέθοδο βενζιδίνης-h 2 O 2, (παράγραφος Β.2.23). A. Κυτταρική ανάπτυξη. Β. Ποσοστό διαφοροποίησης %. Παρατηρώντας το πιο πάνω σχήµα συµπεραίνουµε τα εξής: Αναφορικά µε την κυτταρική ανάπτυξη, (Σχήµα Γ.30Α), δεν παρατηρείται καµία ουσιαστική διαφορά 151

165 ανάµεσα στην καλλιέργεια MEL rps5 C14 και στις καλλιέργειες αναφοράς, παρουσία του επαγωγέα DMSO. Αντίθετα, όσον αφορά την ικανότητα διαφοροποίησης των κυττάρων παρουσία του επαγωγέα DMSO, όπως φαίνεται στο σχήµα Γ.30Β, η καλλιέργεια MEL rps5 C14, επιτυγχάνει ποσοστό διαφοροποίησης ~50% µετά από 4 ηµέρες, ενώ οι καλλιέργειες αναφοράς MEL parental και MEL mock, επιτυγχάνουν ~80% το ίδιο χρονικό διάστηµα. Τα κύτταρα της καλλιέργειας MEL 8R resistant δεν διαφοροποιούνται, όπως ήταν αναµενόµενο, ενώ ενδιαφέρον φαίνεται να παρουσιάζει και η καλλιέργεια MEL rps5 antisense, η οποία ενώ ουσιαστικά χρησιµοποιήθηκε σαν καλλιέργεια αναφοράς, παρόλα αυτά συµπεριφέρεται διαφορετικά από τις υπόλοιπες καλλιέργειες αναφοράς, αφού εµφανίζει ποσοστά διαφοροποίησης ~40% µετά από 4 ηµέρες. Το στοιχείο αυτό αξίζει περαιτέρω διερεύνησης και ανάλυσης. Είναι γνωστό πως η διαφοροποίηση και η απόπτωση είναι στενά συνδεδεµένες κατά την ερυθρά ωρίµανση, προκειµένου ο αριθµός των ερυθρών κυττάρων στο αίµα να βρίσκεται σε ισορροπία. Έχει βρεθεί πως το γονίδιο της rps5 δεν παρουσιάζει ίδια συµπεριφορά σε διαφοροποιηµένα MEL κύτταρα, παρουσία χηµικού επαγωγέα και σε αποπτωτικά κύτταρα, µε συνθήκες αποστέρησης ορού. Έτσι, ενώ κατά τη διαφοροποίηση των MEL κυττάρων το γονίδιο της rps5, καταστέλλεται, δεν συµβαίνει το ίδιο κατά την απόπτωση. Το γεγονός αυτό έδωσε το έναυσµα για διερεύνηση της συµπεριφοράς του γονιδίου αυτού, στην καλλιέργεια MEL rps5 C14, και υπό συνθήκες όπου ο κυτταρικός θάνατος διαδέχεται τη στατικότητα των κυττάρων, (φαινόµενο απόπτωσης). Έτσι, έγινε ένα πείραµα για τη µελέτη της έκφρασης του γονιδίου της rps5, κατά την επαγωγή της απόπτωσης µε αποστέρηση των απαραίτητων αυξητικών παραγόντων, (έλλειψη του ορού FCS). Η διαδικασία έχει ως εξής: Κύτταρα, (1x10 5 κύτταρα/ml), των καλλιεργειών MEL rps5 C14, MEL parental, MEL rps5 antisense και MEL mock επωάσθηκαν και αναπτύχθηκαν: α. Σε κανονικές συνθήκες, (10% FCS) και β. Σε συνθήκες αποστέρησης ορού, (0.25% FCS). Κατόπιν, και για τις δυο περιπτώσεις συλλέγονταν δείγµα από την κάθε καλλιέργεια ανά 12 ώρες, (µέχρι τις 72), και αφού γινόταν µέτρηση του αριθµού των κυττάρων, ακολουθούσε αποµόνωση DNA, όπως περιγράφεται στην παράγραφο Β.2.26, και ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1.5% w/v. Τα αποτελέσµατα όµως δεν ήταν τα αναµενόµενα, αφού δε φάνηκε κατακερµατισµός του DNA, (DNA ladder), που είναι χαρακτηριστικό των κυττάρων που αποπίπτουν και δεν παρουσιάζονται. 152

166 Γ Έλεγχος της κυτταρικής ανάπτυξης των κυττάρων MEL rps5 C14 παρουσία ή απουσία χηµικών επαγωγέων της διαφοροποίησης Όπως αναφέρθηκε και στην εισαγωγή, το πρόγραµµα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων, αποτελείται ουσιαστικά από δύο υποπρογράµµατα. Το πρώτο έχει να κάνει µε την ικανότητα των κυττάρων να πολλαπλασιάζονται και το δεύτερο µε την ικανότητά τους να παράγουν κάποιους πρωτεϊνικούς δείκτες, οι οποίοι είναι χαρακτηριστικοί των τελικά διαφοροποιηµένων κυττάρων, όπως είναι η αιµοσφαιρίνη. Προκειµένου λοιπόν να εξεταστεί αν τα κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14, ολοκληρώνουν το πρόγραµµα της διαφοροποίησης και ως προς τα δυο υποπρογράµµατα, οι προαναφερθείσες καλλιέργειες αραιώθηκαν, (για να φύγουν τα κύτταρα από τη στατική φάση και να µπουν στην εκθετική φάση ανάπτυξης), αφότου είχε αρχίσει η διαφοροποίηση των κυττάρων. 1. Αραίωση της καλλιέργειας την τέταρτη ηµέρα Για το πείραµα αυτό χρησιµοποιήθηκαν οι τρεις καλλιέργειες που παρουσιάζουν το µεγαλύτερο ενδιαφέρον: MEL parental, MEL rps5 antisense και MEL rps5 C14. Οι καλλιέργειες αυτές επωάστηκαν σε θρεπτικό υγρό DMEM που περιείχε 10% v/v FCS και 100 µg/ml από κάθε αντιβιοτικό πενικιλίνης και στρεπτοµυκίνης. Στις καλλιέργειες MEL rps5 antisense, MEL rps5 C14, προστέθηκε και το αντιβιοτικό επιλογής, (G-418), σε συγκέντρωση 0.6 mg/ml. Οι καλλιέργειες αυτές αναπτύχθηκαν τόσο απουσία, όσο και παρουσία, (1.5% v/v), του χηµικού επαγωγέα DMSO. Την τέταρτη ηµέρα από την αρχή του πειράµατος, οι καλλιέργειες αραιώθηκαν 1:10, µε προσθήκη φρέσκου θρεπτικού υγρού, απουσία του χηµικού επαγωγέα. Στο σχήµα Γ.31, φαίνεται η κινητική της ανάπτυξης των καλλιεργειών στις οποίες δεν είχε προστεθεί DMSΟ καθώς και η κινητική αυτών, στις οποίες είχε προστεθεί ο επαγωγέας. Επίσης, παρουσιάζεται και το διάγραµµα του ποσοστού της διαφοροποίησης, µετά την αραίωση. 153

167 Α. Αραίωση 1:10 x10 4 κύτταρα/ml Χρόνος (Ηµέρες) Χωρίς DMSO Αραίωση 1: Ηµέρες Β Αραίωση 1:10 x 10 4 κύτταρα/ml % DMSO Αραίωση 1:10 Θρεπτικό υγρό χωρίς DMSO Ηµέρες Χρόνος (Ηµέρες) Γ. Bz+ (% of control) Αραίωση 1: Χρόνος (Ηµέρες) MEL parental MEL rps5 antisense MEL rps5 C14 Σχήµα Γ.31. Κινητική ανάπτυξης της καλλιέργειας C14 σε σχέση µε τις καλλιέργειες αναφοράς, (control), µετά από αραίωση την τέταρτη ηµέρα. 154

168 Κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14 και των καλλιεργειών αναφοράς, MEL parental και MEL rps5 antisense, αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml, αναπτύχθηκαν για 4 ηµέρες, (96 ώρες), σε κατάλληλο θρεπτικό µέσο, απουσία και παρουσία του χηµικού επαγωγέα DMSO, 1.5% v/v. Την τέταρτη ηµέρα οι καλλιέργειες αραιώθηκαν 1:10, µε την προσθήκη θρεπτικού υγρού, απουσία του DMSO. Ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγµα και γινόταν συνολική µέτρηση των κυττάρων, καθώς και µέτρηση των κυττάρων που χρωµατίζονταν µπλε µε τη µέθοδο βενζιδίνης-h 2 O 2, (παράγραφος Β.2.23). A. Κυτταρική ανάπτυξη καλλιεργειών χωρίς προσθήκη DMSO, µε αραίωση την τέταρτη ηµέρα, που φαίνεται µε το βέλος. Β. Κυτταρική ανάπτυξη καλλιεργειών µε προσθήκη 1.5% v/v DMSO, µε αραίωση την τέταρτη ηµέρα, που φαίνεται µε το βέλος. Γ. Ποσοστό διαφοροποίησης %, καλλιεργειών. Όπως φαίνεται στο σχήµα Γ.31Α, τα κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14, καθώς και τα κύτταρα των καλλιεργειών MEL parental και MEL rps5 antisense, συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται, µετά την αραίωση την τέταρτη ηµέρα. Στο σχήµα Γ.31Γ φαίνεται πως τα κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14, παρά την αρχική υστέρηση στην έναρξη του προγράµµατος διαφοροποίησης, φτάνουν την έκτη ηµέρα στο ποσοστό διαφοροποίησης των MEL parental κυττάρων. Στη συνέχεια το ποσοστό αρχίζει και φθίνει, αφού τα διαφοροποιηµένα κύτταρα πεθαίνουν, όπως αναµένεται. Όσον αφορά την κυτταρική ανάπτυξη, στο σχήµα Γ.31Β φαίνεται πως τα κύτταρα της συγκεκριµένης καλλιέργειας παύουν να πολλαπλασιάζονται µετά την έκτη ηµέρα, συµπεριφορά που είναι παρόµοια µε αυτήν των κυττάρων MEL parental. Το συµπέρασµα λοιπόν που µπορεί να εξαχθεί από όλα αυτά είναι πως τα κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14, ολοκληρώνουν το πρόγραµµα διαφοροποίησης και ως προς τα δυο υποπρογράµµατα, όπως και τα κύτταρα της καλλιέργειας MEL parental, παρουσιάζεται όµως µια υστέρηση ως προς την έναρξη του προγράµµατος. Αντίθετα, η καλλιέργεια MEL rps5 antisense, φαίνεται να µην ολοκληρώνει το πρόγραµµα διαφοροποίησης και ως προς τα δύο υποπρογράµµατα, αφού το ποσοστό των διαφοροποιηµένων κυττάρων παραµένει χαµηλό, ενώ µετά την αραίωση την τέταρτη µέρα, τα κύτταρα, αφού µπουν στην εκθετική φάση ανάπτυξης συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται. 2. Αραίωση της καλλιέργειας την τρίτη ηµέρα Στο προηγούµενο πείραµα, έγινε αραίωση των καλλιεργειών την τέταρτη ηµέρα, αφότου τα κύτταρα είχαν εισέλθει στη στατική φάση. Προκειµένου να ελεγχθεί η συµπεριφορά των καλλιεργειών, εφόσον ήταν ακόµη στη λογαριθµική 155

169 φάση, έγινε το ίδιο πείραµα µε αραίωση των καλλιεργειών την τρίτη ηµέρα. Οι καλλιέργειες αυτές επωάστηκαν σε θρεπτικό υγρό DMEM που περιείχε 10% v/v FCS και 100 µg/ml από κάθε αντιβιοτικό πενικιλίνης και στρεπτοµυκίνης. Στις καλλιέργειες MEL rps5 antisense, MEL rps5 C14, προστέθηκε και το αντιβιοτικό επιλογής, (G-418), σε συγκέντρωση 0.6 mg/ml. Οι καλλιέργειες αυτές αναπτύχθηκαν τόσο απουσία, όσο και παρουσία, (1.5% v/v), του χηµικού επαγωγέα DMSO. Την τρίτη ηµέρα από την αρχή του πειράµατος, οι καλλιέργειες στις οποίες δεν είχε προστεθεί το DMSO, αραιώθηκαν 1:10, µε προσθήκη φρέσκου θρεπτικού υγρού, απουσία του χηµικού επαγωγέα. Οι καλλιέργειες στις οποίες είχε προστεθεί DMSO, την τρίτη ηµέρα χωρίστηκαν στα δύο και αραιώθηκαν 1:10, τόσο απουσία, όσο και παρουσία 1.5% v/v DMSO, προκειµένου να διαπιστωθεί η αν η ύπαρξη του επαγωγέα είναι απαραίτητη για την ολοκλήρωση του προγράµµατος διαφοροποίησης. Στο σχήµα Γ.32, φαίνεται η κινητική της ανάπτυξης των συγκεκριµένων καλλιεργειών, καθώς επίσης και το διάγραµµα του ποσοστού της διαφοροποίησης µετά την αραίωση και για τις δυο περιπτώσεις. Α. Αραίωση 1: x 10 4 κύτταρα/ml Χωρίς DMSO Αραίωση 1: Ηµέρες Χρόνος (Ηµέρες) MEL parental MEL rps5 antisense MEL rp S5 C14 156

170 Β. Αραίωση 1: x 10 4 κύτταρα/ml Χρόνος (Ηµέρες) 1.5% v/v DMSO Αραίωση 1:10 Θρεπτικό υγρό χωρίς DMSO Γ. Αραίωση 1: Ηµέρες Bz+ (% of control) Χρόνος (Ηµέρες) MEL parental MEL rps5 C14 MEL rps5 antisense 157

171 . Αραίωση 1: x 10 4 κύτταρα/ml Χρόνος (Ηµέρες) 1.5% v/v DMSO Αραίωση 1:10 Θρεπτικό υγρό µε 1.5% v/v DMSO Αραίωση 1:10 Ε Ηµέρες Bz+ (% of control) Χρόνος (Ηµέρες) MEL parental MEL rps5 C14 MEL rps5 antisense Σχήµα Γ.32. Κινητική ανάπτυξης της καλλιέργειας C14 σε σχέση µε τις καλλιέργειες αναφοράς, (control), µετά από αραίωση την τρίτη ηµέρα. Κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14 και των καλλιεργειών αναφοράς, MEL parental και MEL rps5 antisense, αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml, αναπτύχθηκαν για 3 ηµέρες, (72 ώρες), σε κατάλληλο θρεπτικό µέσο, απουσία και παρουσία του χηµικού επαγωγέα DMSO, 1.5% v/v. Την τρίτη ηµέρα οι καλλιέργειες στις οποίες δεν είχε προστεθεί ο επαγωγέας, αραιώθηκαν 1:10, µε την προσθήκη θρεπτικού υγρού, απουσία του DMSO. Οι καλλιέργειες στις οποίες είχε προστεθεί DMSO, χωρίστηκαν στα δύο, και αραιώθηκαν 1:10, απουσία και παρουσία 1.5% v/v DMSO. Ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγµα και γινόταν συνολική µέτρηση των κυττάρων, καθώς και µέτρηση των κυττάρων που χρωµατίζονταν µπλε µε τη µέθοδο βενζιδίνης-h 2 O 2, (παράγραφος Β.2.23). 158

172 A. Κυτταρική ανάπτυξη καλλιεργειών χωρίς προσθήκη DMSO, µε αραίωση την τρίτη ηµέρα. Β. Κυτταρική ανάπτυξη καλλιεργειών µε προσθήκη 1.5% v/v DMSO, µε αραίωση την τρίτη ηµέρα, χωρίς προσθήκη DMSO. Γ. Ποσοστό διαφοροποίησης %, καλλιεργειών, χωρίς προσθήκη DMSO, µετά την αραίωση την τρίτη ηµέρα.. Κυτταρική ανάπτυξη καλλιεργειών µε προσθήκη 1.5% v/v DMSO, µε αραίωση την τρίτη ηµέρα, µε προσθήκη εκ νέου 1.5% v/v DMSO. Ε.. Ποσοστό διαφοροποίησης %, καλλιεργειών, µε προσθήκη 1.5% v/v DMSO, µετά την αραίωση την τρίτη ηµέρα. Όπως φαίνεται στο σχήµα Γ.32Α, στην περίπτωση απουσίας του χηµικού επαγωγέα καθ όλη τη διάρκεια του πειράµατος, τα κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14, παρουσιάζουν παρόµοια κινητική κυτταρικής ανάπτυξης µε τις άλλες δυο καλλιέργειες, µετά την αραίωση την τρίτη ηµέρα. Στα κύτταρα, (MEL rps5 C14), στα οποία αρχικά µεν είχε προστεθεί DMSO, ενώ µετά την αραίωση δεν επαναπροστέθηκε, σχήµα Γ.32Β, παρατηρείται µείωση στην κυτταρική ανάπτυξη µετά την αραίωση, η οποία έρχεται σε συµφωνία µε την αύξηση του ποσοστού της διαφοροποίησης, σχήµα Γ.32Γ. Τέλος, στις καλλιέργειες που είχαν αναπτυχθεί αρχικά παρουσία DMSO και µετά την αραίωση προστέθηκε πάλι ο επαγωγέας, παρατηρείται παρόµοια συµπεριφορά της MEL rps5 C14, σε σχέση µε τις καλλιέργειες αναφοράς, ως προς την κυτταρική ανάπτυξη, σχήµα Γ.32. Το πρόγραµµα της διαφοροποίησης φαίνεται να ολοκληρώνεται κι εδώ και ως προς τα δυο υποπρογράµµατα, αφού η καλλιέργεια φτάνει σε υψηλά ποσοστά διαφοροποίησης, σχήµα Γ.32Ε. Το συµπέρασµα που µπορεί να εξαχθεί από τα δύο προηγούµενα πειράµατα είναι ότι τα κύτταρα MEL rps5c14, παρουσιάζουν µια υστέρηση ως προς την έναρξη του προγράµµατος διαφοροποίησης των ~ ωρών, ενώ φαίνεται να ολοκληρώνουν το πρόγραµµα διαφοροποίησης και ως προς τα δυο υποπρογράµµατα, αφού, τόσο µετά την αραίωση την τρίτη, όσο και µετά την αραίωση την τέταρτη ηµέρα, τα κύτταρα σταµατούν την κυτταρική τους ανάπτυξη και παύουν να πολλαπλασιάζονται. Επίσης, φαίνεται πως η παρουσία του DMSO, µετά την τρίτη µέρα, δεν είναι απαραίτητη για την ολοκλήρωση του προγράµµατος διαφοροποίησης, αφού τα κύτταρα, όπως είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία, παρουσιάζουν την ιδιότητα της µνήµης, και ολοκληρώνουν το πρόγραµµα διαφοροποίησης, απουσία του χηµικού επαγωγέα. 159

173 Γ Έλεγχος της ικανότητας in vitro διαφοροποίησης των κυττάρων MEL rps5 C14 από διαφορετικούς χηµικούς επαγωγείς Σύµφωνα µε τα πειράµατα που έχουν παρουσιαστεί πιο πάνω, στην καλλιέργεια MEL rps5 C14, παρατηρείται µια υστέρηση ως προς την έναρξη του προγράµµατος διαφοροποίησης, µε τη χρήση του χηµικού επαγωγέα DMSO. Προκειµένου να διαπιστωθεί πως η υστέρηση αυτή δεν εξαρτάται από το συγκεκριµένο χηµικό επαγωγέα, χρησιµοποιήθηκαν άλλες δυο χηµικές ουσίες, οι οποίες έχει διαπιστωθεί ότι επάγουν την κυτταρική διαφοροποίηση των MEL κυττάρων. Οι ουσίες αυτές είναι το HMBA και το UDP-4. Για το πείραµα αυτό χρησιµοποιήθηκε η καλλιέργεια MEL rps5 C14 και η καλλιέργεια αναφοράς, MEL parental. Ετοιµάστηκαν καλλιέργειες αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml και αφέθηκαν να αναπτυχθούν σε θρεπτικό µέσο DMEM, παρουσία είτε DMSO 1.5% v/v, είτε HMBA 5mM, είτε UDP mM. Στη συνέχεια ελέγχθηκε η κυτταρική ανάπτυξη και η ικανότητα διαφοροποίησης των κυττάρων. Στο σχήµατα Γ.33, Γ.34 και Γ.35, παρουσιάζονται τα αποτελέσµατα των πειραµάτων. Α. x 10 4 κύτταρα/ml Χρόνος (Ώρες) Β. Bz+ (% of control) Χρόνος (Ώρες) MEL parental MEL rps5 C14 160

174 Σχήµα Γ.33. Κινητική ανάπτυξης της καλλιέργειας MEL rps5 C14 σε σχέση µε την καλλιέργεια αναφοράς MEL parental, παρουσία 1.5% v/v DMSO. Κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14 και της καλλιέργειας MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml, αναπτύχθηκαν για 4 ηµέρες, (96 ώρες), σε κατάλληλο θρεπτικό µέσο, παρουσία του χηµικού επαγωγέα DMSO, 1.5% v/v. Ανά 12 ώρες συλλέγονταν δείγµα και γινόταν µέτρηση των κυττάρων που χρωµατίζονταν µπλε µε τη µέθοδο βενζιδίνης-h 2 O 2, (παράγραφος Β.2.23), ενώ ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγµα και γινόταν συνολική µέτρηση των κυττάρων. A. Κυτταρική ανάπτυξη. Β. Ποσοστό κυτταρικής διαφοροποίησης %. A. 100 x 10 4 κύτταρα/ml Χρόνος (Ώρες) Β. Bz+ ( % of control) B Χρόνος (Ώρες) MEL parental MEL rps5 C14 Σχήµα Γ.34. Κινητική ανάπτυξης της καλλιέργειας MEL rps5 C14 σε σχέση µε την καλλιέργεια αναφοράς MEL parental, παρουσία 5mM HMBA. 161

175 Κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14 και της καλλιέργειας MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml, αναπτύχθηκαν για 4 ηµέρες, (96 ώρες), σε κατάλληλο θρεπτικό µέσο, παρουσία του χηµικού επαγωγέα HMBA, 5mM. Ανά 12 ώρες συλλέγονταν δείγµα και γινόταν µέτρηση των κυττάρων που χρωµατίζονταν µπλε µε τη µέθοδο βενζιδίνης-h 2 O 2, (παράγραφος Β.2.23), ενώ ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγµα και γινόταν συνολική µέτρηση των κυττάρων. A. Κυτταρική ανάπτυξη. Β. Ποσοστό κυτταρικής διαφοροποίησης %. A. 100 x 10 4 κύτταρα/ml Χρόνος (Ώρες) B. Bz+ (% of control) Χρόνος (Ώρες) MEL parental MEL rps5 C14 Σχήµα Γ.35. Κινητική ανάπτυξης της καλλιέργειας MEL rps5 C14 σε σχέση µε την καλλιέργεια αναφοράς MEL parental, παρουσία 0.25mM UDP-4. Κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14 και της καλλιέργειας MEL parental αρχικής συγκέντρωσης 5x10 4 κύτταρα/ml, αναπτύχθηκαν για 4 ηµέρες, (96 ώρες), σε κατάλληλο 162

176 θρεπτικό µέσο, παρουσία του χηµικού επαγωγέα UDP-4, 0.25 mm. Ανά 12 ώρες συλλέγονταν δείγµα και γινόταν µέτρηση των κυττάρων που χρωµατίζονταν µπλε µε τη µέθοδο βενζιδίνης-h 2 O 2, (παράγραφος Β.2.23), ενώ ανά 24 ώρες συλλέγονταν δείγµα και γινόταν συνολική µέτρηση των κυττάρων. A. Κυτταρική ανάπτυξη. Β. Ποσοστό κυτταρικής διαφοροποίησης %. Το συµπέρασµα που µπορεί να εξαχθεί από τα πιο πάνω τρία σχήµατα, Γ.33, Γ.34 και Γ.35, είναι ότι χρησιµοποιώντας τους τρεις διαφορετικούς επαγωγείς, (DMSO, HMBA και UDP-4), δεν παρατηρείται καµία ουσιαστική διαφορά στην κυτταρική ανάπτυξη της καλλιέργειας MEL rps5 C14, σε σχέση µε την καλλιέργεια αναφοράς, MEL parental. Όσον αφορά όµως την κυτταρική διαφοροποίηση που προκαλείται από οποιοδήποτε χηµικό επαγωγέα, τα κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14, παρουσιάζουν µια χρονική υστέρηση ως προς την έναρξη του προγράµµατος διαφοροποίησης. Αυτό δείχνει ότι το φαινόµενο αυτό δεν οφείλεται στο χηµικό επαγωγέα, αλλά αφορά σε µια εγγενή ικανότητα των MEL rps5 C14 κυττάρων. Η υστέρηση αυτή είναι µεγαλύτερη, όταν χρησιµοποιείται το DMSO, (~18 ώρες), µε το HMBA γίνεται ~15 ώρες και τέλος, µε τη χρήση του UDP-4 παρατηρείται η µικρότερη υστέρηση, (~8 ώρες). Το τελευταίο στοιχείο αξίζει να διερευνηθεί περαιτέρω µε µεγαλύτερη προσοχή και τη διερεύνηση περισσότερων χηµικών επαγωγέων, µε διαφορετικούς µηχανισµούς δράσης και δοµική συγκρότηση. Γ Ανάλυση των επιπέδων συσσώρευσης του mrna της ριβοσωµικής πρωτεΐνης S5 και της β- αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, (β major ), σε κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14, καθώς και σε κύτταρα των καλλιεργειών αναφοράς, (control) Προκειµένου να γίνει ανάλυση των επιπέδων συσσώρευσης του mrna της rps5 και του αντίστοιχου της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, έγινε αποµόνωση ολικού κυτταροπλασµατικού RNA, (όπως περιγράφεται στις παραγράφους Β και Β ), από τις καλλιέργειες MEL parental, MEL mock, MEL rps5 antisense, MEL 8R resistant και MEL rps5 C14, σε τακτά χρονικά διαστήµατα, τόσο παρουσία, όσο και απουσία του χηµικού επαγωγέα της διαφοροποίησης DMSO. Στη συνέχεια, 10 µg ολικού κυτταροπλασµατικού RNA ηλεκτροφορήθηκαν σε πηκτή αγαρόζηςφορµαλδεΰδης. Κατόπιν, ακολούθησε µεταφορά σε µεµβράνη κατά Northern, 163

177 υβριδισµός, χρησιµοποιώντας ως ιχνηλάτη το ραδιοεπισηµασµένο µε 32 P cdna της rps5 από ποντίκι, (σχήµα Γ.22) και στο τέλος αυτοραδιογραφία. Στη συνέχεια, στην ίδια µεµβράνη, αφού έγινε έκπλυση από τον προηγούµενο ραδιοεπισηµασµένο ιχνηλάτη, ακολούθησε εκ νέου υβριδισµός χρησιµοποιώντας ως ιχνηλάτη ένα γενωµικό DNA τµήµα που κωδικοποιεί το γονίδιο της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, ως δείκτη ερυθροδιαφοροποίησης και τελικά έγινε αυτοραδιογραφία. Η διαδικασία που περιγράφηκε παραπάνω, ακολουθήθηκε για όλες της καλλιέργειες που εξετάστηκαν. 1. Καλλιέργεια MEL parental Κύτταρα της καλλιέργειας MEL parental επωάστηκαν παρουσία και απουσία DMSO και έγινε αποµόνωση ολικού κυτταροπλασµατικού RNA σε τακτά χρονικά διαστήµατα. Οι αυτοραδιογραφίες που τελικά προέκυψαν από την ανάλυση κατά Northern φαίνονται στο σχήµα Γ

178 Σχήµα Γ.36. Κινητική συσσώρευσης του mrna της rps5 και της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης σε κύτταρα MEL parental, απουσία και παρουσία 1.5%v/v DMSO. Σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα που απεικονίζονται στο σχήµα µε αριθµούς 0,12,,96, αποµονώθηκε ολικό κυτταροπλασµατικό RNA, (10µg), και αναλύθηκε µε τη µέθοδο υβριδισµού κατά Northern. Για την ανάλυση χρησιµοποιήθηκε ο ιχνηλάτης του γονιδίου της rps5 και της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, ως δείκτη ερυθροδιαφοροποίησης. Το 18S και το 28S, χρησιµοποιήθηκαν ως πρότυποι ιχνηλάτες. Α. Αυτοραδιογραφία, mrna ενδογενούς rps5, απουσία DMSO. B. Πηκτή αγαρόζης-φορµαλδεΰδης, χρώση µε EtBr, 18S και 28S rrna, απουσία DMSO. ιαδροµές 1,2,3,4,5,6,7 : 0,12,24,48,72,84,96 ώρες, αντίστοιχα. C. Αυτοραδιογραφία, mrna ενδογενούς rps5, παρουσία DMSO. D. Πηκτή αγαρόζης-φορµαλδεΰδης, χρώση µε EtBr, 18S και 28S rrna, παρουσία DMSO. ιαδροµές 1,2,3,4,5,6,7,8,9: 0, 12,24,36, 48,60,72,84,96 ώρες, αντίστοιχα. E. Αυτοραδιογραφία, mrna β major της αιµοσφαιρίνης, ως δείκτης ερυθροδιαφοροποίησης, παρουσία DMSO. F. Πηκτή αγαρόζης-φορµαλδεΰδης, χρώση µε EtBr, 18S και 28S rrna, παρουσία DMSO. ιαδροµές 1,2,3,4,5,6,7,8: 0, 12,36,48, 72,84,96 ώρες, αντίστοιχα. Από το παραπάνω σχήµα προκύπτει, πως στη συγκεκριµένη καλλιέργεια τα επίπεδα του mrna της rps5 διατηρούνται σταθερά, απουσία DMSO, καθώς τα κύτταρα αφήνονται να αναπτυχθούν για 96 ώρες. Αντίθετα, όταν στην καλλιέργεια προστεθεί ο χηµικός επαγωγέας, καθώς τα κύτταρα αρχίζουν να διαφοροποιούνται, τα επίπεδα του mrna της rps5, αρχίζουν και πέφτουν, γεγονός που παρατηρείται ήδη από τις 24 ώρες και µετά. Τα επίπεδα του mrna της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, φαίνεται να συσσωρεύονται από τις 36 ώρες, µετά την προσθήκη του DMSO. 2. Καλλιέργεια MEL mock Κύτταρα της καλλιέργειας MEL mock επωάστηκαν παρουσία και απουσία DMSO και ακολούθως έγινε αποµόνωση ολικού κυτταροπλασµατικού RNA σε τακτά χρονικά διαστήµατα. Οι αυτοραδιογραφίες που τελικά προέκυψαν από την ανάλυση κατά Northern φαίνονται στο σχήµα Γ

179 Σχήµα Γ.37. Κινητική συσσώρευσης του mrna της rps5 και του mrna της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, σε κύτταρα MEL mock, απουσία και παρουσία 1.5% v/v DMSO. Σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα που απεικονίζονται στο σχήµα µε αριθµούς 0,12,,96, αποµονώθηκε ολικό κυτταροπλασµατικό RNA, (10µg), και αναλύθηκε µε τη µέθοδο υβριδισµού κατά Northern. Για την ανάλυση χρησιµοποιήθηκε ο ιχνηλάτης του γονιδίου της rps5 και της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, ως δείκτη ερυθροδιαφοροποίησης. Το 18S και το 28S, χρησιµοποιήθηκαν ως πρότυποι ιχνηλάτες. A. Αυτοραδιογραφία, mrna ενδογενούς rps5, απουσία DMSO. B. Πηκτή αγαρόζης-φορµαλδεΰδης, χρώση µε EtBr, 18S και 28S rrna, απουσία DMSO. ιαδροµές 1,2,3,4,5,6,7 : 0,12,24,48,72,84,96 ώρες, αντίστοιχα. C. Αυτοραδιογραφία, mrna ενδογενούς rps5, παρουσία DMSO. D. Αυτοραδιογραφία, mrna β major της αιµοσφαιρίνης, ως δείκτης ερυθροδιαφοροποίησης, παρουσία DMSO. E. Πηκτή αγαρόζης-φορµαλδεΰδης, χρώση µε EtBr, 18S και 28S rrna, παρουσία DMSO. ιαδροµές 1,2,3,4,5,6,7: 0,12, 24,48,72,84,96 ώρες, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο παραπάνω σχήµα, τα επίπεδα του mrna της rps5 διατηρούνται σταθερά, απουσία DMSO, καθώς τα κύτταρα αφήνονται να αναπτυχθούν για 96 ώρες. Όταν στην καλλιέργεια προστεθεί ο χηµικός επαγωγέας, καθώς τα κύτταρα αρχίζουν να διαφοροποιούνται, τα επίπεδα του mrna της rps5, 166

180 φαίνεται να παραµένουν σχετικά σταθερά, ενώ παράλληλα το mrna της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, συσσωρεύεται κυρίως µετά τις 72 ώρες. 3. Καλλιέργεια MEL rps5 antisense Κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 antisense, επωάστηκαν, όπως και προηγουµένως, παρουσία και απουσία DMSO και ακολούθως έγινε αποµόνωση ολικού κυτταροπλασµατικού RNA σε τακτά χρονικά διαστήµατα. Οι αυτοραδιογραφίες που τελικά προέκυψαν από την ανάλυση κατά Northern φαίνονται στο σχήµα Γ.38. Σχήµα Γ.38. Κινητική συσσώρευσης του mrna της rps5 και του mrna της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, σε κύτταρα MEL rps5 antisense, απουσία και παρουσία 1.5% v/v DMSO. Σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα που απεικονίζονται στο σχήµα µε αριθµούς 0,12,,96, αποµονώθηκε ολικό κυτταροπλασµατικό RNA, (10µg), και αναλύθηκε µε τη µέθοδο υβριδισµού κατά Northern. Για την ανάλυση χρησιµοποιήθηκε ο ιχνηλάτης του γονιδίου της rps5 και της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, ως δείκτη ερυθροδιαφοροποίησης. Το 18S και το 28S, χρησιµοποιήθηκαν ως πρότυποι ιχνηλάτες. 167

181 A. Αυτοραδιογραφία, mrna ενδογενούς rps5, απουσία DMSO. B. Πηκτή αγαρόζης-φορµαλδεΰδης, χρώση µε EtBr, 18S και 28S rrna, απουσία DMSO. ιαδροµές 1,2,3,4,5,6,7 : 0,12,24,48,72,84,96 ώρες, αντίστοιχα. C. Αυτοραδιογραφία, mrna ενδογενούς rps5, παρουσία DMSO. D. Αυτοραδιογραφία, mrna β major της αιµοσφαιρίνης, ως δείκτης ερυθροδιαφοροποίησης, παρουσία DMSO. E. Πηκτή αγαρόζης-φορµαλδεΰδης, χρώση µε EtBr, 18S και 28S rrna, παρουσία DMSO. ιαδροµές 1,2,3,4,5,6,: 0,12, 24,48,72,96 ώρες, αντίστοιχα. Όπως προκύπτει από το παραπάνω σχήµα, τα επίπεδα του mrna της rps5 διατηρούνται σταθερά χωρίς σηµαντική µείωση, τόσο απουσία όσο και παρουσία DMSO, καθώς τα κύτταρα αφήνονται να αναπτυχθούν για 96 ώρες. Όταν στην καλλιέργεια προστεθεί ο χηµικός επαγωγέας, το mrna της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, συσσωρεύεται κυρίως µετά τις 72 ώρες, στοιχείο που δείχνει ότι τα κύτταρα της συγκεκριµένης καλλιέργειας διαφοροποιούνται, όπως άλλωστε είχε φανεί και στο πείραµα που φαίνεται στο σχήµα Γ Καλλιέργεια MEL 8R resistant Κύτταρα της καλλιέργειας MEL 8R resistant, επωάστηκαν, όπως και προηγούµενα, παρουσία και απουσία DMSO και ακολούθως έγινε αποµόνωση ολικού κυτταροπλασµατικού RNA σε τακτά χρονικά διαστήµατα. H αυτοραδιογραφία που τελικά προέκυψε από την ανάλυση κατά Northern, φαίνεται στο πιο κάτω σχήµα. 168

182 Σχήµα Γ.39. Κινητική συσσώρευσης του mrna της rps5, σε κύτταρα MEL 8R resistant, απουσία και παρουσία 1.5% v/v DMSO. Σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα που απεικονίζονται στο σχήµα µε αριθµούς 0,12,,96, αποµονώθηκε ολικό κυτταροπλασµατικό RNA, (10µg), και αναλύθηκε µε τη µέθοδο υβριδισµού κατά Northern. Για την ανάλυση χρησιµοποιήθηκε ο ιχνηλάτης του γονιδίου της rps5. Το 18S και το 28S, χρησιµοποιήθηκαν ως πρότυποι ιχνηλάτες. Α. Αυτοραδιογραφία, mrna ενδογενούς rps5. B. Πηκτή αγαρόζης-φορµαλδεΰδης, χρώση µε EtBr, 18S και 28S rrna. ιαδροµές 1,2,3,4,5,: 0,12,48,72,96 ώρες, αντίστοιχα, παρουσία 1.5% v/v DMSO, ιαδροµές 6,7,8,9: 12,48,72,96 ώρες, αντίστοιχα, απουσία DMSO. Όπως φαίνεται στο σχήµα Γ.39, τα επίπεδα του mrna της rps5 διατηρούνται σταθερά, τόσο απουσία όσο και παρουσία DMSO, καθώς τα κύτταρα αφήνονται να αναπτυχθούν για 96 ώρες. Τα κύτταρα αυτά δεν διαφοροποιούνται, παρουσία του DMSO, όπως φαίνεται στο σχήµα Γ.30, γεγονός που επιβεβαιώθηκε µε κατά Northern ανάλυση των επιπέδων του mrna της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης. 169

183 5. Καλλιέργεια MEL rps5 C14 Κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14, επωάστηκαν, όπως και προηγουµένως, παρουσία και απουσία DMSO και ακολούθως έγινε αποµόνωση ολικού κυτταροπλασµατικού RNA σε τακτά χρονικά διαστήµατα. Οι αυτοραδιογραφίες που προέκυψαν από την ανάλυση κατά Northern, φαίνονται στο πιο κάτω σχήµα. Σχήµα Γ.40. Κινητική συσσώρευσης του mrna της rps5 και του mrna της β major της αιµοσφαιρίνης, σε κύτταρα MEL rps5 C14, απουσία και παρουσία 1.5% v/v DMSO. Σε συγκεκριµένα χρονικά διαστήµατα που απεικονίζονται στο σχήµα µε αριθµούς 0,12,,96, αποµονώθηκε ολικό κυτταροπλασµατικό RNA, (10µg), και αναλύθηκε µε τη µέθοδο υβριδισµού κατά Northern. Για την ανάλυση χρησιµοποιήθηκε ο ιχνηλάτης του γονιδίου της 170

184 rps5 και της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, ως δείκτη ερυθροδιαφοροποίησης. Το 18S και το 28S, χρησιµοποιήθηκαν ως πρότυποι ιχνηλάτες. Α. Αυτοραδιογραφία, mrna ενδογενούς rps5, απουσία DMSO. B. Πηκτή αγαρόζης-φορµαλδεΰδης, χρώση µε EtBr, 18S και 28S rrna, απουσία DMSO. ιαδροµές 1,2,3,4,5,6,7 : 0,12,24,48,72,84,96 ώρες, αντίστοιχα. C. Αυτοραδιογραφία, mrna ενδογενούς rps5, παρουσία DMSO. D. Πηκτή αγαρόζης-φορµαλδεΰδης, χρώση µε EtBr, 18S και 28S rrna, παρουσία DMSO. ιαδροµές 1,2,3,4,5,6,7,8,9: 0, 12,24,36, 48,60,72,84,96 ώρες, αντίστοιχα. E. Αυτοραδιογραφία, mrna β major της αιµοσφαιρίνης, ως δείκτης ερυθροδιαφοροποίησης, παρουσία DMSO. F. Πηκτή αγαρόζης-φορµαλδεΰδης, χρώση µε EtBr, 18S και 28S rrna, παρουσία DMSO. ιαδροµές 1,2,3,4,5,6,7,8: 0, 12,36,48,72,84,96 ώρες, αντίστοιχα. Όπως προκύπτει από το πιο πάνω σχήµα, τα επίπεδα του mrna της ενδογενούς rps5 διατηρούνται σταθερά, τόσο απουσία όσο και παρουσία DMSO, καθώς τα κύτταρα αφήνονται να αναπτυχθούν για 96 ώρες. εν ανιχνεύεται το mrna της εξωγενούς πρωτεΐνης. Όταν στην καλλιέργεια προστεθεί ο χηµικός επαγωγέας, το mrna της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης συσσωρεύεται κυρίως µετά τις 72 ώρες. Το γεγονός αυτό έρχεται σε συµφωνία µε την υστέρηση στην έναρξη της διαφοροποίησης, σε σχέση µε την καλλιέργεια κυττάρων MEL, όπως προέκυψε από τις κινητικές µελέτες. Γ Μελέτη κατά Western των επιπέδων διαφόρων πρωτεϊνών που εµπλέκονται στο πρόγραµµα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων, σε κύτταρα της καλλιέργειας MEL rps5 C14 και σε κύτταρα των καλλιεργειών αναφοράς Μετά τον έλεγχο των επιπέδων mrna της rps5 και της β major αλυσίδας της αιµοσφαιρίνης, εξετάστηκαν τα επίπεδα πρωτεϊνών, (rps5, GATA-1, Cdk2, Cdk4 και Cdk6), οι οποίες, άµεσα ή έµµεσα εµπλέκονται στο πρόγραµµα διαφοροποίησης των MEL κυττάρων. Για να γίνει αυτό, καλλιέργειες αναπτύχθηκαν παρουσία του χηµικού επαγωγέα DMSO και σε τακτά χρονικά διαστήµατα συλλέγονταν κύτταρα. Στη συνέχεια, έγινε αποµόνωση κυτταρικών εκχυλισµάτων, σύµφωνα µε τη µέθοδο που περιγράφεται στην παράγραφο Β Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή SDS-PAGE 12% v/v, µεταφορά σε µεµβράνη, (Western blot) και τέλος ανοσοανίχνευση χρησιµοποιώντας κάθε φορά συγκεκριµένο αντίσωµα έναντι της 171

185 εκάστοτε υπό έλεγχο πρωτεΐνης. Η πιο πάνω διαδικασία ακολουθήθηκε για όλες τις περιπτώσεις. 1. Μελέτη των επιπέδων της rps5 Από τα κύτταρα που είχαν συλλεχθεί από τις καλλιέργειες MEL parental, MEL rps5 C14, MEL rps5 antisense και MEL mock, αποµονώθηκαν κυτταρικά εκχυλίσµατα. Στη συνέχεια 30 µg ολικής κυτταροπλασµατικής πρωτεΐνης από το κάθε δείγµα, αναλύθηκαν κατά Western και ακολούθησε ανοσοανίχνευση µε πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι της rps5, το οποίο χρησιµοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. Στο σχήµα που ακολουθεί φαίνονται οι µεµβράνες, έπειτα από την εµφάνιση µε τη µέθοδο της αλκαλικής φωσφατάσης. Σχήµα Γ.41. Ανάλυση κατά Western και ανοσοανίχνευση των επιπέδων της rps5. είγµατα ολικής κυτταροπλασµατικής πρωτεΐνης, (30µg), αποµονώθηκαν από κύτταρα MEL parental, MEL rps5 C14, MEL rps5 antisense και MEL mock και αναλύθηκαν κατά Western. Το πολυκλωνικό αντίσωµα έναντι της C-τελικής περιοχής της rps5 χρησιµοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, 172

186 A. Κυτταρικά εκχυλίσµατα από την καλλιέργεια MEL parental. B. Κυτταρικά εκχυλίσµατα από την καλλιέργεια MEL rps5 C14. Γ. Κυτταρικά εκχυλίσµατα από την καλλιέργεια MEL rps5 antisense.. Κυτταρικά εκχυλίσµατα από την καλλιέργεια MEL mock. ιαδροµές 1,2,3,4,5,6,7,8: 0,2,8,16,24,48,72,96 ώρες, αντίστοιχα., πρωτεϊνική ζώνη στα ~ Da. Όπως φαίνεται στο σχήµα Γ.41, τα επίπεδα της rps5 πρωτεΐνης, αρχίζουν να µειώνονται µετά από 48 ώρες επώασης µε DMSO, στην καλλιέργεια MEL parental, (panel A). Κάτι τέτοιο έρχεται σε συµφωνία µε τα αποτελέσµατα της ανάλυσης κατά Northern, όπου είχε βρεθεί πως κατά τη διαφοροποίηση των MEL κυττάρων η rps5 καταστέλλεται, σε επίπεδο mrna, (σχήµα Γ.36C). Στο ίδιο συµπέρασµα καταλήγουµε όσον αφορά και τις άλλες καλλιέργειες αναφοράς, (control), MEL rps5 antisense και MEL mock. Παρατηρώντας όµως την καλλιέργεια MEL rps5 C14, µπορεί κάποιος να διαπιστώσει πως τα επίπεδα της rps5 παραµένουν σταθερά και µάλιστα η πρωτεΐνη φαίνεται να εκφράζεται σε µεγαλύτερο ποσό στην καλλιέργεια αυτή σε σχέση µε τις καλλιέργειες αναφοράς. Στο σηµείο αυτό πρέπει να τονιστεί πάλι πως ανιχνεύεται η ενδογενής πρωτεΐνη και µόνο αυτή. 2. Μελέτη των επιπέδων της GATA-1 πρωτεΐνης Από τα κυτταρικά εκχυλίσµατα που αποµονώθηκαν από τις καλλιέργειες MEL parental, MEL rps5 C14, MEL rps5 antisense και MEL mock, όπως αναφέρθηκε πιο πάνω κατά την ανάλυση των επιπέδων της rps5, χρησιµοποιήθηκαν 50 µg ολικής κυτταροπλασµατικής πρωτεΐνης από το κάθε δείγµα για ανάλυση σε πηκτή SDS-PAGE 12% v/v. Ακολούθησε µεταφορά κατά Western, για να υπάρξει στη συνέχεια ανοσοανίχνευση µε µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι της GATA-1, η οποία όπως έχει αναφερθεί, είναι απαραίτητη προκειµένου να λάβει χώρα η ερυθροδιαφοροποίηση των κυττάρων MEL in vitro. Το αντίσωµα χρησιµοποιήθηκε σε αραίωση 1:400. Στο σχήµα Γ.42, φαίνονται οι µεµβράνες, έπειτα από την εµφάνιση µε τη µέθοδο της αλκαλικής φωσφατάσης. 173

187 Σχήµα Γ.42. Ανάλυση κατά Western και ανοσοανίχνευση των επιπέδων της GATA-1. είγµατα ολικής κυτταροπλασµατικής πρωτεΐνης, (50µg), αποµονώθηκαν από κύτταρα MEL parental, MEL rps5 C14, MEL rps5 antisense και MEL mock και αναλύθηκαν κατά Western. Το µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι της GATA-1, χρησιµοποιήθηκε σε αραίωση 1:400. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, A. Κυτταρικά εκχυλίσµατα από την καλλιέργεια MEL parental. B. Κυτταρικά εκχυλίσµατα από την καλλιέργεια MEL rps5 C14. Γ. Κυτταρικά εκχυλίσµατα από την καλλιέργεια MEL rps5 antisense.. Κυτταρικά εκχυλίσµατα από την καλλιέργεια MEL mock. ιαδροµές 1,2,3,4,5,6,7,8: 0,2,8,16,24,48,72,96 ώρες, αντίστοιχα., πρωτεϊνική ζώνη στα ~ Da.Western ανάλυση των επιπέδων της GATA-1. Όπως φαίνεται στο πιο πάνω σχήµα, τα επίπεδα της GATA-1 πρωτεΐνης, παραµένουν σταθερά στις καλλιέργειες αναφοράς, MEL parental, MEL rps5 antisense και MEL mock, (ίσως µε µια µικρή πτώση στις 72 ώρες). Το ίδιο σταθερά 174

188 φαίνονται να παραµένουν τα επίπεδα της συγκεκριµένης πρωτεΐνης και στην καλλιέργεια MEL rps5 C Μελέτη των επιπέδων των Cdks πρωτεϊνών Όπως αναφέρθηκε και στην εισαγωγή, οι Cdks, είναι µια ειδική οµάδα πρωτεϊνικών κινασών, οι οποίες συµπλέκονται µε κυκλίνες προκειµένου να φωσφορυλιώσουν συγκεκριµένες πρωτεΐνες στόχους. Οι Cdks 2,4,6 είναι αυτές που οδηγούν τα κύτταρα στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου, πριν την είσοδό τους στην S φάση. εδοµένου ότι τα MEL κύτταρα σταµατούν στην G1 φάση και δεν εισέρχονται στην S προκειµένου να διαφοροποιηθούν, θα ήταν ενδιαφέρον να µελετηθούν τα επίπεδα των πρωτεϊνών αυτών στις διάφορες καλλιέργειες των MEL κυττάρων, (MEL parental, MEL rps5 C14, MEL rps5 antisense και MEL mock.) α Μελέτη των επιπέδων της Cdk2 πρωτεΐνης Από τα κύτταρα που είχαν συλλεχθεί από τις καλλιέργειες MEL parental, MEL rps5 C14, MEL rps5 antisense και MEL mock, αποµονώθηκαν κυτταρικά εκχυλίσµατα. Στη συνέχεια 100 µg ολικής κυτταροπλασµατικής πρωτεΐνης από το κάθε δείγµα, αναλύθηκαν κατά Western και ακολούθησε ανοσοανίχνευση µε µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι της Cdk2, το οποίο χρησιµοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. Στο σχήµα Γ.43, φαίνονται οι µεµβράνες, έπειτα από την εµφάνιση µε τη µέθοδο της αλκαλικής φωσφατάσης. 175

189 Σχήµα Γ.43. Ανάλυση κατά Western και ανοσοανίχνευση των επιπέδων της Cdk2. είγµατα ολικής κυτταροπλασµατικής πρωτεΐνης, (100µg), αποµονώθηκαν από κύτταρα MEL parental, MEL rps5 C14, MEL rps5 antisense και MEL mock και αναλύθηκαν κατά Western. Το µονοκλωνικό αντίσωµα έναντι της Cdk2, χρησιµοποιήθηκε σε αραίωση 1:1000. Μ: πρωτεϊνικοί µάρτυρες των οποίων το µοριακό µέγεθος φαίνεται αριστερά σε kda, A. Κυτταρικά εκχυλίσµατα από την καλλιέργεια MEL parental. B. Κυτταρικά εκχυλίσµατα από την καλλιέργεια MEL rps5 C14. Γ. Κυτταρικά εκχυλίσµατα από την καλλιέργεια MEL rps5 antisense.. Κυτταρικά εκχυλίσµατα από την καλλιέργεια MEL mock. ιαδροµές 1,2,3,4,5,6,7,8: 0,2,8,16,24,48,72,96 ώρες, αντίστοιχα., πρωτεϊνική ζώνη στα ~ Da. Όπως φαίνεται στο παραπάνω σχήµα, τα επίπεδα της Cdk2 πρωτεΐνης, µειώνονται µετά από 4 ώρες επώασης µε DMSO στις καλλιέργειες αναφοράς, MEL parental, MEL rps5 antisense και MEL mock. Αντίθετα, φαίνεται να παραµένουν τα επίπεδα της συγκεκριµένης πρωτεΐνης σταθερά στην καλλιέργεια MEL rps5 C14. Ένα πολύ ενδιαφέρον σηµείο είναι η εµφάνιση µιας δεύτερης ζώνης σε µικρότερο 176